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CN116083297A - 一种防治草莓根腐病的微生物菌剂及其制备方法 - Google Patents

一种防治草莓根腐病的微生物菌剂及其制备方法 Download PDF

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CN116083297A CN202211532735.XA CN202211532735A CN116083297A CN 116083297 A CN116083297 A CN 116083297A CN 202211532735 A CN202211532735 A CN 202211532735A CN 116083297 A CN116083297 A CN 116083297A
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卢明媚
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Abstract

一种防治草莓根腐病的微生物菌剂及其制备方法，微生物菌剂由多粘类芽孢杆菌Paenibacillus polymyxa、假真菌样芽孢杆菌Bacillus pseudomycoides复配而成，多粘类芽孢杆菌Paenibacillus polymyxa的保藏编号为CGMCC No.25858，假真菌样芽孢杆菌Bacillus pseudomycoides的保藏编号为CGMCC No.25859。制备方法：将上述两种菌发酵培养后，按1：1比例复配为可湿性粉剂，其施用方式为根部浇灌。本发明制备的微生物菌剂可有效防治草莓根腐病，促进草莓植株生长，并且在使用后不会引起致病菌抗药性产生及农药残留和环境污染。

Description

一种防治草莓根腐病的微生物菌剂及其制备方法
技术领域
本发明涉及农业微生物技术领域，具体涉及一种防治草莓根腐病的微生物菌剂及其制备方法。
背景技术
草莓是一种重要的经济作物，近年来，随着种植面积的提高、种植结构的调整，草莓从单一的露地栽培模式转变为设施栽培模式。但是，由于草莓设施栽培过程中低温、高湿、封闭、连茬种植及周年生产的特点，导致种植土壤理化性质恶化，病原菌数量累积增加，造成病害发生日趋严重，严重影响了草莓的品质和产量，制约草莓产业的可持续发展。
草莓根腐病是一种危害严重、影响范围广泛的土传病害，是导致草莓产量和质量降低的主要因素。草莓根腐病田间发病症状复杂，引起发病的病原菌种类较多，在草莓的整个生育期均可引起发病，其具有突发性和毁灭性的特点，一旦发生，便很难防治，给草莓生产带来巨大损失。当前因缺少高抗根腐病的草莓品种，因此草莓根腐病的防治仍以化学防治为主，以生物防治为核心的绿色防控技术还缺乏高效的菌剂产品及其应用技术。
近年来，化学药剂防治作物病害产生的农药残留问题，以及由此导致的相关食品安全问题非常突出，而生防菌剂由于其广谱防病效果、多重抗病机制及对环境友好的特点，被越来越多的应用到作物病害防控中，成为减少或替代农药的重要资源。因此亟待开发一种高效的生防菌剂，并将其应用于草莓根腐病的绿色防控中，有力推动草莓产业的可持续发展。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种防治草莓根腐病的微生物菌剂及其制备方法，该微生物菌剂能够高效防治草莓根腐病，从而促进草莓植株生长；另外，使用该微生物菌剂具有绿色环保、无农药残留的特点，在使用后可避免致病菌产生抗药性。
为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：
一种防治草莓根腐病的微生物菌剂，由多粘类芽孢杆菌Paenibacillus polymyxa和假真菌样芽孢杆菌Bacillus pseudomycoides复配而成，均为本实验分离保存。所述多粘类芽孢杆菌Paenibacillus polymyxa于2022年09月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.25858，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号；假真菌样芽孢杆菌Bacillus pseudomycoides于2022年09月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.25859，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
优选地，所述多粘类芽孢杆菌菌剂和假真菌样芽孢杆菌菌剂的质量比为1：1。
进一步地，所述多粘类芽孢杆菌Paenibacillus polymyxa和假真菌样芽孢杆菌Bacillus pseudomycoides有效活菌数均不少于1.0×1010CFU/g。
为实现本发明目的，本发明还提供一种上述防治草莓根腐病的微生物菌剂的制备方法，包括如下步骤：
S1菌株筛选鉴定
将草莓根腐病病原菌拟盘多毛孢菌及尖孢镰刀菌接种至马铃薯葡萄糖琼脂培养基中央，将待筛选菌株接种于培养基边缘，28℃恒温培养箱培养5天后，观察拮抗细菌对草莓根腐病原菌的抑菌状况，根据实验结果筛选鉴定获得抑菌效果明显的多粘类芽孢杆菌Paenibacillus polymyxa菌株和假真菌样芽孢杆菌Bacillus pseudomycoides；
S2菌株发酵
(1)菌种培养：将低温保存的所述多粘类芽孢杆菌Paenibacillus polymyxa和假真菌样芽孢杆菌Bacillus pseudomycoides分别接种于NA固体培养基上，培养得到单菌落，接种至NB培养基中，于30℃、180r/min振荡培养18-24h后获得种子液，其浓度不低于1.0×108CFU/mL；
(2)发酵培养：将步骤(1)得到的多粘类芽孢杆菌种子液和假真菌样芽孢杆菌种子液按5％的接种量分别接种于发酵罐中，于30℃、转速180r/min、溶氧量20％～22％的条件下培养36h，完成发酵，保证发酵液中菌体浓度为1.0×1010CFU/mL，芽孢产生率达90％以上；
(3)芽孢杆菌菌剂制备：向将步骤(2)得到的多粘类芽孢杆菌发酵液和假真菌样芽孢杆菌发酵液中分别添加5％的可溶性淀粉，搅拌均匀，直接进行喷雾干燥，得到多粘类芽孢杆菌菌剂和假真菌样芽孢杆菌菌剂；
(4)微生物菌剂的制备：将步骤(3)得到的多粘类芽孢杆菌菌剂和假真菌样芽孢杆菌菌剂按质量比1：1进行混合得到防治草莓根腐病的微生物菌剂。
优选的，步骤(2)中，发酵培养的培养基配方(g/L)：牛肉浸粉5，蛋白胨10，酵母浸粉5，氯化钠5，葡萄糖10，pH 7.0。
与现有技术相比，本发明有益效果如下：
本发明中将多粘类芽孢杆菌菌剂和假真菌样芽孢杆菌菌剂复配作为微生物菌剂，不仅显著降低了草莓根腐病的发病率，而且多粘类芽孢杆菌和假真菌样芽孢杆菌复配菌剂效果要优于单独接种多粘类芽孢杆菌和假真菌样芽孢杆菌菌剂，二者在防治草莓根腐病方面存在协同作用，可高效稳定的应用于草莓根腐病的绿色防控。本发明能够高效防治草莓根腐病，从而促进草莓植株生长；另外，使用该微生物菌剂具有绿色环保、无农药残留的特点，在使用后避免了致病菌产生抗药性。
附图说明
图1多粘类芽孢杆菌Paenibacillus polymyxa对草莓根腐病原菌拟盘多毛孢菌(a)及尖孢镰刀菌(b)的拮抗作用；
图2假真菌样芽孢杆菌Bacillus pseudomycoides对草莓根腐病草莓根腐病原菌拟盘多毛孢菌(a)及尖孢镰刀菌(b)的拮抗作用；
图3多粘类芽孢杆菌Paenibacillus polymyxa菌剂处理已经接种草莓根腐病原菌盆栽的前后草莓的生长状况对比图；(a)接种根腐病原菌+多粘类芽孢杆菌Paenibacilluspolymyxa菌剂；(b)接种根腐病原菌；
图4假真菌样芽孢杆菌Bacillus pseudomycoides菌剂处理已经接种草莓根腐病原菌盆栽的前后草莓的生长状况对比图；(a)接种根腐病原菌+假真菌样芽孢杆菌Bacilluspseudomycoides；(b)接种根腐病原菌；
图5本发明微生物菌剂处理后已经接种草莓根腐病原菌盆栽的前后草莓的生长状况对比图；(a)接种根腐病原菌+多粘类芽孢杆菌Paenibacillus polymyxa菌剂+假真菌样芽孢杆菌Bacillus pseudomycoides；(b)接种根腐病原菌。
具体实施方式
本发明提供的多粘类芽孢杆菌Paenibacillus polymyxa和假真菌样芽孢杆菌Bacillus pseudomycoides均已2022年09月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号分别为CGMCC No.25858和CGMCC No.25859，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
为对本发明有益效果作进一步阐述，进行了以下具体实施例，特别说明的是，以下具体实施例旨在帮助更好的理解本发明，绝不仅限于本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均是可通过正规渠道商购买得到的常规产品。
实施例中的草莓根腐病原菌由河南省洛阳市孟津区一草莓种植基地发病根部组织分离得到，实施例中的微生物菌株由该草莓种植基地健康草莓根际土壤及根部组织分离得到。
实施例1
一种防治草莓根腐病的微生物菌剂的制备方法，包括如下步骤：
S1菌株筛选鉴定
①生防菌株的筛选
活化分离自健康草莓根际土壤及根部组织中的细菌，平板对峙培养法测定细菌菌株对草莓根腐病原菌拟盘多毛孢菌及尖孢镰刀菌的拮抗作用，具体实施方法为在直径9cm的改良PDA培养基平板中央接直径为5mm的草莓根腐病原菌菌菌丝块，在距培养皿边缘9mm处对称点接细菌菌株，对照组只接病原菌菌丝块，28℃恒温培养5d后，测量抑菌带宽度，计算抑菌率。
试验结果如表1、图1和图2所示，菌株CMS5对草莓根腐病原菌拟盘多毛孢菌和尖孢镰刀菌抑菌带宽度分别为8.2mm和2.5mm，菌株CMR12对草莓根腐病原菌拟盘多毛孢菌和尖孢镰刀菌抑菌带宽度分别为7.6mm和3.6mm；菌株CMS5对草莓根腐病原菌拟盘多毛孢菌和尖孢镰刀菌抑菌率分别为57.1％和38.4％，菌株CMR12对草莓根腐病原菌拟盘多毛孢菌和尖孢镰刀菌抑菌率分别为24.4％和30.0％。
表1菌株CMS5和CMR12对草莓根腐病原菌的平板拮抗作用
本实施方式中马铃薯葡萄糖培养基(PDA)由土豆200g、葡萄糖20g、琼脂17g和1000mL蒸馏水组成，自然pH值。
②生防菌株CMS5和CMR12鉴定
本发明的实施主要采用菌体形态观察、生理生化特征测定和分子生物学手段相结合的方法对菌株CMS5和CMR12进行鉴定。试验结果如图2所示，菌株CMS5和CMR12在NA培养基上生长良好，其菌落平铺、干燥、不透明、白色，经革兰氏染色后，均为阳性，菌体为杆状，产生芽孢。16S rRNA的PCR扩增结果表明，菌株CMS5和CMR12扩增产物分别为1426bp和1436bp，委托上海生工生物工程公司测序，获得菌株CMS5和CMR1216S rRNA基因全序列，利用GenBank中的BLAST软件对菌株的16S rRNA基因序列进行分析，菌株CMS5的16S rRNA序列与多粘类芽孢杆菌具有较高的同源性，菌株CMR12的16S rRNA序列与假真菌样芽孢杆菌具有较高的同源性，其相似性都高达99％。结合形态特征、生理生化特征和16S rRNA基因序列分析，将菌株CMS5和CMR12分别鉴定为多粘类芽孢杆菌Paenibacillus polymyxa和假真菌样芽孢杆菌Bacillus pseudomycoides。
菌株CMS5和CMR12的16S rDNA基因序列如序列表SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
本实施方式中牛肉膏蛋白胨培养基(NA)由牛肉膏3g、蛋白胨5g、葡萄糖2.5g、琼脂17g和1000mL蒸馏水组成，pH7.2。
S2菌株发酵
(1)菌种培养：将低温保存的所述多粘类芽孢杆菌Paenibacillus polymyxa和假真菌样芽孢杆菌Bacillus pseudomycoides分别接种于NA固体培养基上，培养得到单菌落，接种至NB培养基中，于30℃、180r/min振荡培养18-24h后获得种子液，其浓度不低于1.0×108CFU/mL；
(2)发酵培养：将步骤(1)得到的芽孢杆菌种子液按5％的接种量分别接种于发酵罐中，于30℃、转速180r/min、溶氧量20％～22％的条件下培养36h，完成发酵，保证发酵液中菌体浓度为1.0×1010CFU/mL，芽孢产生率达90％以上；
(3)芽孢杆菌菌剂制备：将步骤(2)得到的多粘类芽孢杆菌和假真菌样芽孢杆菌发酵液中分别添加5％的可溶性淀粉，搅拌均匀，直接进行喷雾干燥，得到多粘类芽孢杆菌和假真菌样芽孢杆菌菌剂；
(4)微生物菌剂的制备:将步骤(3)得到的两种芽孢杆菌菌剂，按所述多粘类芽孢杆菌和假真菌样芽孢杆菌菌剂的质量比为1:1进行混合，得到所述微生物菌剂。
本实施例中菌株发酵培养所用培养基为BPY培养基，由牛肉浸粉5g，蛋白胨10g，酵母浸粉5g，氯化钠5g，葡萄糖10g组成，pH7.0。
实施例2
微生物菌剂的在防治草莓根腐病中的应用
(1)试验材料
供试草莓品种为红颜，移栽种苗由孟津区十里香草莓基地提供。
供试微生物制剂为本实施例1所制备的微生物菌剂。
(2)试验设计
选取长势较好且大小一致的健康草莓幼苗(红颜)，移栽于盆钵中，盆口直径20cm，所有土壤为基质土，160℃灭菌2h，每盆1株，常规管理。
试验设4个处理：T1(草莓苗+根腐病原菌)；T2(草莓苗+根腐病原菌+多粘类芽孢杆菌Paenibacillus polymyxa菌剂)；T3(草莓苗+根腐病原菌+假真菌样芽孢杆菌Bacilluspseudomycoides菌剂)；T4(草莓苗+根腐病原菌+本发明微生物菌剂)。
(3)试验方法
在草莓移栽缓苗1月后，对草莓幼苗进行伤根处理，用75％乙醇消毒后刀片割断草莓不定根2-3根，进行病原菌孢子悬浮液灌根法处理，在幼苗根部分别接种50mL浓度为1×107的拟盘多毛孢菌和尖孢镰刀菌孢子悬浮液。在接入病原菌5d天后，采用灌根法接入生防菌剂，将菌剂用清水稀释100倍液后，每株浇灌100mL，每处理5盆，设置3个重复，2个月后结束盆栽试验，统计发病率并计算菌剂防效。
(4)试验结果及统计
盆栽发病率及菌剂防治效果计算公式如下：
盆栽发病率(％)＝发病的盆栽数/调查的总盆栽数×100
病情指数按下列公式计算：
病情指数＝∑(各级病苗数×各级)/(调查总植株数×最高病级)×100
表2草莓根腐病盆栽试验病情分级
病级 病情描述
0级 无发病
1级 发病的盆栽数占调查总盆栽数1％～5％
2级 发病的盆栽数占调查总盆栽数5％～15％
3级 发病的盆栽数占调查总盆栽数15％～25％
4级 发病的盆栽数占调查总盆栽数25％～50％
5级 发病的盆栽数占调查总盆栽数50％～100％
防治效果(％)＝(对照组病情指数-处理组病情指数)/对照组病情指数×100
(5)试验结果
如图3-图5所示，不同菌剂处理盆栽草莓植株后2月后，对照组T1与处理组(T2、T3、T4)草莓植株出现不同程度的发病症状，未接种菌剂的对照组T1草莓盆栽发病症状为草莓叶片叶缘干枯卷曲，草莓植株出现萎蔫倒伏现象，接种菌剂处理组(T2、T3、T4)盆栽草莓植株发病症状相对较轻，其叶部病斑无扩散或基本无叶部病斑。其中对照组T1发病率为83.3％，病情指数为83.3；其次为多粘类芽孢杆菌Paenibacillus polymyxa菌剂T2处理和假真菌样芽孢杆菌Bacillus pseudomycoides菌剂T3处理的发病率分别为38.9％和33.3％，病情指数分别为28.9和26.7；本发明微生物菌剂T4处理后盆栽草莓根腐病的发病率为16.7％，病情指数为10.0。根据病情指数计算，不同菌剂处理的相对防治效果，其中多粘类芽孢杆菌Paenibacillus polymyxa菌剂处理后相对防治效果为65.3％，假真菌样芽孢杆菌Bacillus pseudomycoides菌剂处理后的相对防治效果为68.0％，本发明微生物菌剂处理后对盆栽草莓根腐病的防治效果为88.0％，其防效明显优于单一菌剂处理。
表3不同处理对草莓根腐病发病率的影响
处理 发病率 病情指数 相对防治效果
T1 83.3％ 83.3 /
T2 38.9％ 28.9 65.3％
T3 33.3％ 26.7 68.0％
T4 16.7％ 10.0 88.0％
同时，通过比较不同处理草莓长势状况，发现施用了微生物菌剂的盆栽草莓与对照组相比，植株长势旺盛，叶片发绿，植株根系粗壮，显著优于清水处理对照，表明该微生物菌剂对草莓也具有一定的促生作用。
由此可知，本发明制备的一种适用于草莓根腐病的微生物菌剂，具有高效稳定，对病原菌拮抗性强，且协同效果显著，应用于草莓根腐病的防治过程，菌株能够稳定定植，有效降低草莓根腐病的发病率，有效改善草莓的生长状况。
以上所述的仅是本发明的一些实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的创造构思的前提下，还可以做出其它变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种防治草莓根腐病的微生物菌剂，其特征在于，由多粘类芽孢杆菌Paenibacilluspolymyxa和假真菌样芽孢杆菌Bacillus pseudomycoides复配而成，所述多粘类芽孢杆菌Bacillus pseudomycoides于2022年09月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.25858；假真菌样芽孢杆菌Bacillus pseudomycoides于2022年09月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.25859。
2.根据权利要求1所述的一种防治草莓根腐病的微生物菌剂，其特征在于，多粘类芽孢杆菌菌剂和假真菌样芽孢杆菌菌剂的质量比为1：1。
3.根据权利要求1或2所述的一种防治草莓根腐病的微生物菌剂，其特征在于，所述多粘类芽孢杆菌Paenibacillus polymyxa和假真菌样芽孢杆菌Bacillus pseudomycoides有效活菌数均不少于1.0×1010CFU/g。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的一种防治草莓根腐病的微生物菌剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1菌株筛选鉴定
将草莓根腐病病原菌拟盘多毛孢菌及尖孢镰刀菌接种至马铃薯葡萄糖琼脂培养基中央，将待筛选菌株接种于培养基边缘，28℃恒温培养箱培养5天后，观察拮抗细菌对草莓根腐病原菌的抑菌状况，根据实验结果筛选鉴定获得抑菌效果明显的多粘类芽孢杆菌Paenibacillus polymyxa菌株和假真菌样芽孢杆菌Bacillus pseudomycoides；
S2菌株发酵
(1)菌种培养：将低温保存的所述多粘类芽孢杆菌Paenibacillus polymyxa和假真菌样芽孢杆菌Bacillus pseudomycoides分别接种于NA固体培养基上，培养得到单菌落，接种至NB培养基中，于30℃、180r/min振荡培养18-24h后获得种子液，其浓度不低于1.0×108CFU/mL；
(2)发酵培养：将步骤(1)得到的多粘类芽孢杆菌种子液和假真菌样芽孢杆菌种子液按5％的接种量分别接种于发酵罐中，于30℃、转速180r/min、溶氧量20％～22％的条件下培养36h，完成发酵，保证发酵液中菌体浓度为1.0×1010CFU/mL，芽孢产生率达90％以上；
(3)芽孢杆菌菌剂制备：向步骤(2)得到的多粘类芽孢杆菌发酵液和假真菌样芽孢杆菌发酵液中分别添加5％的可溶性淀粉，搅拌均匀，直接进行喷雾干燥，得到多粘类芽孢杆菌菌剂和假真菌样芽孢杆菌菌剂；
(4)微生物菌剂的制备：将步骤(3)得到多粘类芽孢杆菌菌剂和假真菌样芽孢杆菌菌剂按质量比1：1进行混合得到防治草莓根腐病的微生物菌剂。
5.根据权利要求4所述的一种防治草莓根腐病的微生物菌剂的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，发酵培养的培养基配方(g/L)为：牛肉浸粉5，蛋白胨10，酵母浸粉5，氯化钠5，葡萄糖10g，pH7.0。
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