CN110452832B

CN110452832B - 一株耐酸性解淀粉芽孢杆菌Kc-5及其应用

Info

Publication number: CN110452832B
Application number: CN201910598477.7A
Authority: CN
Inventors: 孙宪昀; 李少杰; 张振颖
Original assignee: Institute of Microbiology of CAS
Current assignee: Institute of Microbiology of CAS
Priority date: 2019-07-04
Filing date: 2019-07-04
Publication date: 2021-07-06
Anticipated expiration: 2039-07-04
Also published as: CN110452832A

Abstract

本发明提供了一株耐酸性解淀粉芽孢杆菌Kc‑5及其应用。解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)Kc‑5，已于2019年4月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称为CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，其保藏编号为CGMCC No.17654。本发明的解淀粉芽孢杆菌Kc‑5具有广泛的pH适生范围(pH4‑10)和较好的耐酸性；该菌抑菌谱广，对瓜类枯萎病菌、香蕉枯萎病菌、辣椒疫霉病、蔬菜灰霉病菌和小麦根腐病菌等多种植物病原真菌都具有很好的拮抗作用，盆栽和田间试验显示该菌对酸性土壤中的香蕉枯萎病具有很好的防病促生效果。该菌株适生性强，抑菌活性强，可以在中性和酸性土壤中使用，用于真菌病害的高效防控；该菌亦适用于酸性土壤的改良。

Description

一株耐酸性解淀粉芽孢杆菌Kc-5及其应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域。

背景技术

真菌性病害占植物侵染性病害的70％以上，是造成农作物和果木产量和品质降低的最主要原因。化学农药的频繁使用导致一些病原真菌抗药性急剧增强、造成环境与农产品的污染，以及破坏植物体内外微生物平衡而加剧病害的爆发流行等(余凤玉等2005)。利用微生物进行真菌病原菌的生物防治是一条理想的替代途径。生物防治无残留无污染，病原菌不会产生抗性，成本低，增产增收，有利于农业的可持续发展，具有广阔的前景。

芽孢杆菌是最具潜力和商业价值的生防菌之一，具有抗菌谱广、生长迅速、易培养、抗逆性强、生物安全性高以及防治效果稳定等优点，其对植物病害的防治研究一直以来是一个热点和难点。多年来人们已经筛选到了很多具有生防潜力的芽孢杆菌菌株并开发成商品制剂应用于生产实践。如美国商品化的芽孢杆菌生防菌株QST713、GB03、MB1600和FZB24等，以及国内的芽孢杆菌商品制剂亚宝、百抗、麦丰宁、纹曲宁等用于植物病害的防控(叶晶晶等2016)。这些生防菌株虽然都具有较强的抗真菌活性，并有一定的田间应用效果，但存在环境适应性窄，在应用中通常有一定的地域局限性(Neeraja et al.2010)。尤其是细菌的最适生长pH范围在弱酸、中性至碱性。很多生防芽孢杆菌在弱酸和中性土壤中对真菌病害有很好的防控作用，但对酸性土壤中植物病害则没有防控效果，这通常是由于这些芽孢杆菌无法在酸性土壤定殖所致。近年来，人们也从动物肠道中分离到一些耐酸性的芽孢杆菌作为作为微生态制剂或饲料添加剂用于改善畜禽肠道环境，提高饲料利用率和动物免疫力(陈雅茜等2018；张雪等2018；毛晴等2018)。但目前还没有耐酸性芽孢杆菌用于植物病害生防和土壤改良的报道，限制了芽孢杆菌对植物病害生防的应用范围。

解淀粉芽孢杆菌Kc-5是我们从酸性土壤中分离的具有环境适用性宽、广谱抗真菌活性和生防应用潜力的芽孢杆菌，通过分子鉴定其为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)。研究表明解淀粉芽孢杆菌是一种具有广谱抑菌活性的细菌，能产生多种抑菌物质，同时其还具有促进植物生长的功能，在环保、种植业、养殖业具有广泛的应用前景(关晓欢&姜华2012；王继华等2017)。但耐酸性芽孢杆菌及以其为材料制备的微生物制剂、微生物肥料或土壤改良剂用于植物病害生防和土壤改良尚未见报道。

发明内容

本发明的第一目的是提供解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)Kc-5，其已于2019年4月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称为CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCC No.17654。

本发明的第二目的是提供一种微生物制剂，其活性成分为解淀粉芽孢杆菌Kc-5。

本发明的第三目的是提供解淀粉芽孢杆菌Kc-5在制备微生物肥料和生物农药中的应用。

本发明的第四目的是提供解淀粉芽孢杆菌Kc-5在制备防治香蕉枯萎病的肥料或农药中的应用。

本发明的第五目的是提供解淀粉芽孢杆菌Kc-5在制备香蕉促生剂或肥料中的应用。

本发明所保护的是解淀粉芽孢杆菌Kc-5以及以该菌制备的微生物制剂、微生物肥料或土壤改良剂及其应用技术。

本发明的解淀粉芽孢杆菌Kc-5具有广泛的pH适生范围(pH4-10)和较好的耐酸性；该菌抑菌谱广，对瓜类枯萎病菌、香蕉枯萎病菌、辣椒疫霉病、蔬菜灰霉病菌和小麦根腐病菌等多种植物病原真菌都具有很好的拮抗作用，盆栽和田间试验显示该菌对酸性土壤中的香蕉枯萎病具有很好的防病促生效果。该菌株适生性强，抑菌活性强，可以在中性和酸性土壤中使用，用于真菌病害的高效防控；该菌亦适用于酸性土壤的改良。

附图说明

图1为解淀粉芽孢杆菌Kc-5形态特征及适宜生长的pH范围图。其中，A为菌株Kc-5在LB平板上的菌落形态(左)和革兰氏染色(右)，B为菌株Kc-5在不同pH培养基上的生长情况。

图2为解淀粉芽孢杆菌Kc-5对多种植物病原菌的拮抗作用图。

图3为解淀粉芽孢杆菌Kc-5防控香蕉枯萎病的盆栽试验结果图。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

PDA培养基：马铃薯葡萄糖琼脂培养基，马铃薯200g煮沸30分钟后过滤取滤液，葡萄糖20g，琼脂15-20g，用水定容到1000ml，自然pH；115℃高温灭菌30min。

LB培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 5g，琼脂15-20g(固体培养基)，用水定容到1000ml，用1mol/L NaOH调pH至7.4，115℃高温灭菌30min。

实施例1

菌株的分离、鉴定及生物学特性

一、菌株的分离和纯化

本实验从广西酸性土壤中分离得到了若干株细菌，过程如下：1g样品加于装有小玻璃珠和100ml无菌生理盐水的三角瓶中，28℃摇床富集培养30min左右。取1m悬液，采用梯度稀释的方法稀释到10^-4，取原液、10^-2稀释液和10^-4稀释液分别涂板后培养至少两周。长出菌落采用平板划线法于LB平板上进行纯化后，挑单菌落接种于LB平板上。利用20％甘油保存所得纯化菌株于-80℃冰箱。

二、菌株的鉴定

1、分子鉴定

PCR扩增16S rDNA采用通用引物27F和1492R(退火温度为56℃，靶序列约为1500bp)。

引物序列如下：27F:AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3；1492R:TACGGCTACCTTACGACTT。

扩增DNA促旋酶A亚基编码基因gyrA采用的通用引物p-gyrA-f和p-gyrA-r(退火温度为60℃，靶序列约为1017bp)。

引物序列如下：p-gyrA-f:CAGTCAGGAAATGCGTACGTCCTT；p-gyrA-r:CAAGGTAATGCTCCAGGCATTGCT。

PCR反应程序为：95℃5min；95℃30s，56℃/60℃90s，72℃60s(33cycles)；72℃10min；4℃。

扩增的DNA片段进行纯化后进行序列测定，通过NCBI的Blastn程序进行序列比对。通过16S rDNA(SEQ ID NO.1)和DNA促旋酶A亚基编码基因gyrA(SEQ ID NO.2)序列分析鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，命名为解淀粉芽孢杆菌Kc-5。

2、形态学及生理生化特性

运用平板划线的方法在LB培养基接种培养后进行形态观察；通过革兰氏染色分析菌体为革兰氏阴性菌还是阳性菌，并同时观察菌体和芽胞的形态。

早期菌落水渍状，中后期菌落乳白色，有火山口状隆起，边缘不整齐。菌株Kc-5为革兰氏阳性菌，杆状，内生芽孢，无鞭毛。适宜生长的pH为4-10。适宜生长温度为28-38℃。

三、菌株的生物学特性

菌株的生物学特性主要分析适宜生长的pH和温度范围。

用不同缓冲体系的缓冲液配制不同pH(pH3-10)的液体LB培养基，接种淀粉芽孢杆菌Kc-5于装有不同pH液体培养基的试管中，在30℃摇床培养24小时候观测菌体量的变化以分析菌株Kc-5适宜生长的pH范围。

解淀粉芽孢杆菌Kc-5在LB培养基上早期菌落水渍状，中后期菌落乳白色，有火山口状隆起，边缘不整齐(图1)。生理生化试验显示，菌株Kc-5为革兰氏阳性菌，杆状，内生芽孢。适宜生长的pH为4-10(图1)。适宜生长温度为28-38℃。

四、菌株的保藏

分离自酸性土壤的耐酸性解淀粉芽孢杆菌Kc-5，于2019年4月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称为CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCC No.17654。

实施例2

耐酸性解淀粉芽孢杆菌Kc-5的抗真菌活性分析

1、解淀粉芽孢杆菌Kc-5培养及收集

利用划线法接种Kc-5于LB平板上，待长出单菌落后，挑取单菌落接种于液体LB培养基中30℃培养24小时后备用。

2、病原菌的培养

接种香蕉枯萎病菌、黄瓜枯萎病菌、小麦根腐平脐孺孢菌、辣椒疫霉病菌、蔬菜灰霉病菌于PDA平板上，28℃培养一周后使用。

3、平板对峙实验结果

分别接种病原菌培养物菌块于PDA平板中央，在距离病原菌2.0cm左右接种解淀粉芽孢杆菌Kc-5菌悬液，28℃培养3-5天，观察病原菌生长情况。

分离自酸性土壤的耐酸性解淀粉芽孢杆菌Kc-5具有广谱的抗真菌活性。

平板对峙实验显示，Kc-5对对尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusariun oxysporunf.sp.cubense)、尖孢镰刀菌黄瓜专化型(F.oxysporum f.sp.cucumerinum)、辣椒疫霉(Phytophthora capsici)、灰葡萄孢菌(Botrytis cinereal)、平脐孺孢菌(Bipolarissorokiniana)等多种植物病原真菌都具有很好的拮抗作用。

实施例3

耐酸性解淀粉芽孢杆菌Kc-5菌剂的制备

1.种子液的制备

挑取在LB平板上生长24小时的Kc-5单菌落，接种至含有150ml液体LB培养基的500ml三角瓶中，37℃，180rpm培养23小时。然后按照3-5％比例转接至新的含有150ml液体LB培养基的l三角瓶中，再摇培6小时，作为种子液使用。

2.液体发酵微生物菌剂的制备

50L发酵罐中含有30L培养基：酵母粉3g/l，蛋白胨5g/L，牛肉膏2g/L，氯化钠2g/L，MnSO₄ 0.005g/L，K₂HPO₄ 3g/L，MgSO₄ 0.02g/L。pH：保持pH为7.0，发酵过程用氨水调节。

DO：溶氧与转速关联，保持30％上下。

罐压：0.04Mpa。

流加葡萄糖：在残糖含量降低时(约4-5小时)开始流加，基本保持在5g/L上下。

37℃发酵至40小时结束发酵，镜检芽孢率>90％。

液体发酵结束后，将发酵液离心，收集菌体。

按照发酵液体积的3％加入硅藻土吸附菌体，混合物通过流化床烘干，温度控制在60℃以下，水分控制在10％以内，过80目筛，得到通过液体发酵方式制备的微生物菌剂。

3.固体发酵微生物菌剂的制备

以玉米粉、麸皮、豆粕为基本原料，添加一定比例的K₂HPO₄、MnSO₄、MgSO₄，料水比1:0.8。按照1％的比例接种种子液。37℃培养4-5天，芽孢浓度可以达到1×10¹⁰亿/g，作为固体菌剂使用。

实施例4

耐酸性解淀粉芽孢杆菌Kc-5的应用

一、耐酸性解淀粉芽孢杆菌Kc-5对香蕉枯萎病的盆栽防控实验

1、实验材料与方法

1)盆栽实验采用粘土与营养基质混合土，pH5.5左右，每盆装土1kg。香蕉苗品种为桂蕉6号，株高30cm左右。

2)香蕉枯萎病菌(F.oxysporun f.sp.cubense)4号生理小种在PDA培养基上培养至产孢，然后用生理盐水配成浓度为10⁷个/ml的孢子悬浮液备用。

3)按照实施例3准备解淀粉芽孢杆菌Kc-5菌剂，用生理盐水配成浓度为10⁸CFU/ml的孢子悬浮液备用。

4)每个处理6盆，每盆种植2株香蕉苗。除了空白对照外，其余处理将香蕉枯萎病菌4号生理小种菌悬液混进土壤中，使其终浓度为10⁵个/g。

5)移栽时，将香蕉苗用生防菌蘸根处理10-15分钟后种在土壤中。再将生防菌液均匀淋进含菌土中，使其终浓度为10⁷CFU/g。实验中设置空白对照和不施生防菌的发病对照。所有处理的香蕉苗在大棚温室培养。每隔7d调查外部症状发病情况，计算病情指数。待对照发病明显，剖开香蕉苗茎基部调查内部症状发病情况，计算病情指数。

病情分级标准参照Saravanan等(2003)的病情调查分级标准，对发病香蕉苗的外部症状和球茎症状，进行病级统计，分级标准见表1。

表1外部症状和球茎症状的分级标准

按常规公式计算病情指数：

病情指数＝情(各级病株数×该病级值)/(调查总株数×最高级值)×高级值

相对防治效果(％)＝(对照病情指数—处理病情指数)/对照病情指数×照病情。

2、实验结果

移栽3个月后，发病对照组发病严重，病情指数79，死苗率58.3％。而耐酸性解淀粉芽孢杆菌Kc-5处理组病情指数38，死苗率仅为25％，对香蕉枯萎病菌的防效达到51％以上(图3)。同时Kc-5还具有一定的促生作用，Kc-5菌剂处理的植株的株高和叶面积均明显优于对照组(图3)。

分离自酸性土壤的耐酸性解淀粉芽孢杆菌Kc-5对香蕉枯萎病(F.oxysporunf.sp.cubense)的防控效果。在对香蕉枯萎病防治的盆栽试验中，盆栽土壤pH为6左右，香蕉幼苗移栽时采用Kc-5菌剂蘸根和灌根处理，可显著减轻香蕉枯萎病的发病程度。并且Kc-5菌剂还具有一定的促生作用，Kc-5菌剂处理的植株的株高和叶面积均明显优于对照组。

二、耐酸性解淀粉芽孢杆菌Kc-5对香蕉枯萎病的的田间试验

1、实验材料与方法

1)试验地点及环境条件：该实验设在广西南宁金陵镇和坛洛镇。两块试验田土壤pH均在4.5-5.0之间，属于偏酸性土壤，这两块田块种植香蕉多年，香蕉枯萎病发病率50％以上，积累了大量的香蕉枯萎病菌。

2)小区面积与处理排列：每个田块设置对照(施用菌剂)0.5亩，菌剂Kc-5处理0.5亩，每个处理种植香蕉60株(0.5亩)。

3)菌剂施用方法：试验前土地进行了翻耕，试验所用香蕉苗品种为易于感染香蕉枯萎病的品种威廉斯。移苗时设置对照(不施用菌剂)和菌剂Kc-5处理。菌剂处理的样品进行穴施，每穴挖出的部分土与10g菌剂(100亿/g)混合，然后回填栽苗。6个月后在香蕉根系四周通过穴施方法补施一次菌剂(每株10g菌剂)。

4)结果统计：10个月后进行发病情况调查和产量统计。

2实验结果

表2解淀粉芽孢杆菌Kc-5防控香蕉枯萎病的田间试验结果

调查结果显示(表2)，金陵镇田块对照发病率51.72％，亩产仅为1737公斤；菌剂Kc-5处理发病率仅为2.78％，防效为94.62％，亩产为3500公斤，较对照增产101％。坛洛镇田块对照发病率高达64.79％，亩产仅为1267公斤；菌剂Kc-5处理发病率仅为27.59％，防效为57.42％，亩产为2607公斤，较对照增产106％。通过两地试验结果显示，对于香蕉枯萎病发病率50％及以下的香蕉田块，菌剂Kc-5能达到94％以上的防效，增产100％以上，是一种能在酸性土壤定殖并发挥作用。

序列表

<110> 中国科学院微生物研究所

<120> 一株耐酸性解淀粉芽孢杆菌Kc-5及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1378

<212> DNA

<213> 解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)

<400> 1

gagcttgctc cctgatgtta gcggcggacg ggtgagtaac acgtgggtaa cctgcctgta 60

agactgggat aactccggga aaccggggct aataccggat ggttgtctga accgcatggt 120

tcagacataa aaggtggctt cggctaccac ttacagatgg acccgcggcg cattagctag 180

ttggtgaggt aacggctcac caaggcgacg atgcgtagcc gacctgagag ggtgatcggc 240

cacactggga ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg cagcagtagg gaatcttccg 300

caatggacga aagtctgacg gagcaacgcc gcgtgagtga tgaaggtttt cggatcgtaa 360

agctctgttg ttagggaaga acaagtgccg ttcaaatagg gcggcacctt gacggtacct 420

aaccagaaag ccacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag gtggcaagcg 480

ttgtccggaa ttattgggcg taaagggctc gcaggcggtt tcttaagtct gatgtgaaag 540

cccccggctc aaccggggag ggtcattgga aactggggaa cttgagtgca gaagaggaga 600

gtggaattcc acgtgtagcg gtgaaatgcg tagagatgtg gaggaacacc agtggcgaag 660

gcgactctct ggtctgtaac tgacgctgag gagcgaaagc gtggggagcg aacaggatta 720

gataccctgg tagtccacgc cgtaaacgat gagtgctaag tgttaggggg tttccgcccc 780

ttagtgctgc agctaacgca ttaagcactc cgcctgggga gtacggtcgc aagactgaaa 840

ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa ttcgaagcaa 900

cgcgaagaac cttaccaggt cttgacatcc tctgacaatc ctagagatag gacgtcccct 960

tcgggggcag agtgacaggt ggtgcatggt tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg 1020

ttaagtcccg caacgagcgc aacccttgat cttagttgcc agcattcagt tgggcactct 1080

aaggtgactg ccggtgacaa accggaggaa ggtggggatg acgtcaaatc atcatgcccc 1140

ttatgacctg ggctacacac gtgctacaat ggacagaaca aagggcagcg aaaccgcgag 1200

gttaagccaa tcccacaaat ctgttctcag ttcggatcgc agtctgcaac tcgactgcgt 1260

gaagctggaa tcgctagtaa tcgcggatca gcatgccgcg gtgaatacgt tcccgggcct 1320

tgtacacacc gcccgtcaca ccacgagagt ttgtaacacc cgaagtcggt gaggtaac 1378

<210> 2

<211> 1017

<212> DNA

<213> 解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)

<400> 2

tcagtcagga aaagcgtacg tccttcctgg actatgcaat gagcgttatc gtatcccggg 60

cgcttccgga tgtgcgtgac ggtctgaagc cggttcacag gcggattttg tacgcaatga 120

atgatttagg catgaccagt gacaaaccat ataaaaaatc tgcccgtatc gtcggtgaag 180

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cgcaggattt taactaccgc tacatgcttg ttgacggaca cggcaacttc ggttcggttg 300

acggcgactc agcggccgcg atgcgttaca cagaagcgag aatgtcaaaa atcgcaatgg 360

aaatcctccg ggacattacg aaagatacga ttgattatca agataactat gacggcgcag 420

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cgggcccgga ttttccgact gcaggtcaga ttttgggccg gagcggcatc cgcaaggcat 660

atgaatccgg acggggatcc attacgatcc gggctaaggc tgaaatcgaa gagacatcat 720

cgggaaaaga aagaattatt gtcacagaac ttccttatca ggtgaacaaa gcgagattaa 780

ttgaaaaaat cgcagatctt gtccgggaca aaaaaatcga aggaattacc gatctgcgtg 840

acgaatccga ccgtaacgga atgagaatcg tcattgagat ccgccgtgac gccaatgctc 900

acgtcatttt gaataacctg tacaaacaaa cggccctgca gacgtctttc ggaatcaacc 960

tgctggcgct cgttgacgga cagccgaagg tactaagcct gaagcaatgc ctggagc 1017

Claims

1.一株解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）Kc-5，其保藏编号为CGMCCNo.17654。

2.一种微生物制剂，其活性成分为如权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）Kc-5。

3.如权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）Kc-5在制备防治植物病原真菌制剂中的应用，其中所述植物病原真菌为：尖孢镰刀菌古巴专化型（Fusariun oxysporun f.sp. cubense）、尖孢镰刀菌黄瓜专化型（F. oxysporum f.sp.cucumerinum）、灰葡萄孢菌（Botrytis cinereal）、平脐孺孢菌（Bipolaris sorokiniana）和辣椒疫霉病菌（Phytophthora capsici）。

4.如权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）Kc-5在制备防治植物病原真菌肥料中的应用，其中所述植物病原真菌为：尖孢镰刀菌古巴专化型（Fusariun oxysporun f.sp. cubense）、尖孢镰刀菌黄瓜专化型（F. oxysporum f.sp.cucumerinum）、灰葡萄孢菌（Botrytis cinereal）、平脐孺孢菌（Bipolaris sorokiniana）和辣椒疫霉病菌（Phytophthora capsici）。

5.如权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）Kc-5在制备防治植物病原真菌农药中的应用，其中所述植物病原真菌为：尖孢镰刀菌古巴专化型（Fusariun oxysporun f.sp. cubense）、尖孢镰刀菌黄瓜专化型（F. oxysporum f.sp.cucumerinum）、灰葡萄孢菌（Botrytis cinereal）、平脐孺孢菌（Bipolaris sorokiniana）和辣椒疫霉病菌（Phytophthora capsici）。