CN112342173B

CN112342173B - 贝莱斯芽孢杆菌及其应用

Info

Publication number: CN112342173B
Application number: CN202011400935.0A
Authority: CN
Inventors: 李美佳; 张亚玉; 孙海; 张正海; 邵财; 雷慧霞
Original assignee: Institute Special Animal and Plant Sciences CAAS
Current assignee: Institute Special Animal and Plant Sciences CAAS
Priority date: 2020-12-02
Filing date: 2020-12-02
Publication date: 2022-11-29
Anticipated expiration: 2040-12-02
Also published as: CN112342173A

Abstract

本发明属于微生物领域，具体公开了贝莱斯芽孢杆菌及其应用。本发明所述贝莱斯芽孢杆菌G1S3504，其保藏编号为CGMCC No.20629，该菌株分离自人参根内。室内平板实验表明，该菌株贝对人参根腐病、人参锈腐病、人参黑斑病、龙胆根腐病，柑橘果实软腐病等13种真菌都有较强的拮抗作用，抑制率均高于64.37％，且具有溶磷特性，极具开发前景。大田生防实验表明，G1S3504菌株可有效防治人参根腐病，同时对人参具有明显的促生作用。

Description

贝莱斯芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明属于微生物领域，具体涉及贝莱斯芽孢杆菌及其应用。

背景技术

人参(Panax ginseng C.A.Mey)为五加科人参属多年生宿根草本植物，具有较高的药用价值和经济价值，是我国传统的名贵中药材。我国人参栽培历史悠久，然而由于人参栽培技术不够完善，导致人参真菌性病害问题频发，使人参产量明显下降，质量降低，病害发生加重，甚至造成绝收。

目前，人参病害的防治主要为化学防治，虽然见效快、效果好，但很容易造成农药残留、环境污染、生态平衡破坏及病菌抗药性的产生，尤其是农药残留问题对我国人参产品质量影响很大，造成我国人参产量世界第一，但产值远不及韩国的尴尬局面。因此，减少人参化学农药的使用，寻找和开发能够替代化学农药的生物农药是非常必要的，也是响应农业部提出的到2020年实现农药化肥使用零增长的重要举措。

人参的真菌性病害主要有根腐病、锈腐病、黑斑病等等。其中，根腐病对人参的危害尤为严重。人参根腐病由镰孢菌(Fusarium sp.)引起，在人参园内发生较为普遍，可以导致根部腐烂，严重影响产量。目前中国主要采用化学药剂进行防治，如代森锰锌、烯唑醇、三唑酮等，生物防治除了有报道采用大作物使用的药剂进行防治外，尚无商品化的人参专用生防制剂。长期施用化学农药可以导致农残超标，并易使病原菌产生抗药性，导致防治效果下降。此外，长期、反复和大量使用化学农药可引起土壤、水体和大气的污染，同时也杀伤了其他有益微生物，破坏了生态平衡。因此，通过生物防治筛选对人参真菌性病害的高效菌株，同时筛选生防细菌对人参有防病促生作用的菌株迫在眉睫。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于针对现有技术中存在的问题提供贝莱斯芽孢杆菌及其应用，本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌能够防治人参根腐病、人参锈腐病、人参黑斑病，对人参根腐病的抑制作用为67.97％，人参黑斑病的抑制作用为68.41％，对人参锈腐病的相对防效达64.37％，同时对人参具有明显的促生作用，且具有溶磷特性。

为实现本发明的目的本发明采用了如下技术方案。

本发明提供了一株菌株，贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)，其保藏编号为CGMCC No.20629。

本发明所述贝莱斯芽孢杆菌分离自吉林省长春市中国农业科学院特产研究所左家试验基地的人参的根内部，命名为G1S3504，其分离方法为：

将处理后的人参根组织块按每皿7块均匀放置于含有NA的培养基上，每种组织重复30皿，放置于28℃恒温培养箱中培养。分别于第2、5、7天观察人参组织周围新长出的菌落，挑取单一菌落进行分离纯化，观察纯化后的菌株形态进行编号，并转接至PDA斜面培养基置于28C°的恒温培养箱中培养，通过平板对峙实验筛选对人参根腐病、人参锈腐病、人参黑斑病致病菌具有明显抑制作用的菌株，其命名为G1S3504。

G1S3504菌株的形态学特征：革兰氏染色反应阳性，芽孢杆状，单生或两个串生，大小为0.8-(1.2)-1.3×2.3-(3.0)-4.2μm(见图1)。在NA平板上，菌株的菌落呈不规则圆形，淡黄色，有褶皱，不透明，菌落边缘常不整齐(见图2)。

根据G1S3504结合16S rDNA序列(16S rDNA序列如SEQ ID NO:1所示)分析结果，鉴定G1S3504菌株为贝莱斯芽孢杆菌，该菌株在进行保藏时的分类名为芽孢杆菌Bacillussp。

本发明还提供一种发酵液，由本发明贝莱斯芽孢杆菌G1S3504发酵获得。

本发明还提供了所述发酵液的制备方法，将贝莱斯芽孢杆菌G1S3504接种于PDA斜面培养基，28℃下培养48h；挑取斜面上的菌落，放入PDB培养基30℃下摇床培养48h获得种子悬浮液；将所述种子悬浮液接种于发酵培养基25～32℃，0.5kg/cm²，200r/min条件下发酵36h。

一些具体实施方案中，以质量百分比计，所述发酵培养基由以下组分组成：酵母浸粉2.5％、葡萄糖1％、磷酸氢二钾1.5％、硫酸铵2.5％和余量水。

本发明通过对峙培养方法验证了该菌株为广谱生防细菌，对人参根腐病、人参锈腐病、人参黑斑病抑制作用较强，且对龙胆根腐病，柑橘果实软腐病，香樟叶斑病，百日菊紫斑病，桃树枝枯病，大叶仙茅叶斑病，橙子灰霉病，山白树叶斑病，胡萝卜黑斑病，水稻稻瘟病也具有生防效果。田间生防试验结果显示该菌株制成的生防菌剂具有较强的生防能力，同时提高皂苷含量。

本发明还提供了所述的贝莱斯芽孢杆菌G1S3504或其发酵液在防治植物病害中的应用。

一些实施方案中，所述植物病害为人参根腐病、人参锈腐病、人参黑斑病、龙胆根腐病、柑橘果实软腐病、香樟叶斑病、百日菊紫斑病、桃树枝枯病、大叶仙茅叶斑病、橙子灰霉病、山白树叶斑病、胡萝卜黑斑病或水稻稻瘟病。

大田生防实验结果显示，所述贝莱斯芽孢杆菌G1S3504对人参具有明显的促生作用，因此，本发明还提供了所述贝莱斯芽孢杆菌或其发酵液在制备促进植物生长中的应用。

微生物的溶磷特性，是指将土壤中的难溶性磷酸盐转化为植物可吸收利用的水溶性磷。不仅可以提高肥料的利用率，还可以防止磷肥引起的土壤板结，避免土壤酸化和有害物质的累积，可用作土壤调节剂。经实验证实，本发明贝莱斯芽孢杆菌G1S3504具有良好的溶磷特性。

基于以上结果，本发明还提供了所述贝莱斯芽孢杆菌或其发酵液在溶磷中的作用，以及所述贝莱斯芽孢杆菌或其发酵液在制备土壤调节剂中的应用。其中，所述土壤调节剂的调节作用为调节土壤环境避免磷肥引起的土壤板结、有害物质积累、酸化等问题。

一些实施方案中，在上述应用中，所述贝莱斯芽孢杆菌G1S3504的有效浓度1×10⁵-1×10⁸cfu/mL，优选为1×10⁵-1×10⁶cfu/mL，施用量为0.5-0.8L/m²。一些具体实施例中，贝莱斯芽孢杆菌G1S3504的有效浓度为1×10⁵cfu/mL。一些具体实施例中，贝莱斯芽孢杆菌G1S3504的有效浓度为1×10⁶cfu/mL，施用量为0.6L/m²。

本发明还提供一种生防菌剂，包含贝莱斯芽孢杆菌G1S3504或其发酵液以及可接受的辅料。

本领域技术人员可以选择适宜的本领域可接受的辅料将贝莱斯芽孢杆菌G1S3504或其发酵液制成水剂、可湿性粉剂或包衣剂。也可根据实际需要选取合适的辅料制成其他各种剂型。

本发明还提供一种防治植物病害的方法，施用芽孢杆菌、或其发酵液或其生防菌剂，施用的活菌浓度1×10⁶cfu/mL，施用量为0.7L/m²。

本发明所述贝莱斯芽孢杆菌其保藏编号为CGMCC No.20629，该菌株分离自人参根内。室内平板实验表明，该菌株能够防治人参根腐病、锈腐病、黑斑病，对人参根腐病的抑制作用为67.18-70.49％，人参黑斑病的抑制作用为71.14-73.02％，对人参锈腐病的相对防效达64.37％，同时对人参具有明显的促生作用，且具有溶磷特性，极具开发前景。此外，对龙胆根腐病，柑橘果实软腐病，香樟叶斑病，百日菊紫斑病，桃树枝枯病，大叶仙茅叶斑病，橙子灰霉病，山白树叶斑病，胡萝卜黑斑病，水稻稻瘟病也具有生防效果。

生物保藏说明

生物材料G1S3504，分类命名：芽孢杆菌Bacillus sp，于2020年9月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.20629。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示贝莱斯芽孢杆菌G1S3504的菌落形态图；

图2示贝莱斯芽孢杆菌G1S3504于透射电镜下的形态图；

图3示贝莱斯芽孢杆菌G1S3504的溶磷效果图；

图4示基于16s rDNA基因构建的Neighbor-Joining系统发育树；

图5～6示G1S3504菌株对病原菌的抑菌活性，其中，各序号代表的病原菌：1：人参根腐病；2：人参黑斑病；3：人参锈腐病；4：龙胆根腐病；5：柑橘果实软腐病；6：水稻稻瘟病；7：香樟叶斑病；8：山白树叶斑病；9：大叶仙茅叶斑病；10：橙子灰霉病；11：胡萝卜黑斑病；12：百日菊紫斑病；13：桃树枝枯病。

具体实施方式

本发明公开了贝莱斯芽孢杆菌及其应用。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及产品已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

为了进一步理解本发明，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明。

实施例1贝莱斯芽孢杆菌G1S3504的分离、鉴定

贝莱斯芽孢杆菌G1S3504分离自吉林省长春市中国农业科学院特产研究所左家试验基地人参的根内部，分离方法为：

将处理后的人参根组织块按每皿7块均匀放置于含有NA培养基上，每种组织重复30皿，放置于28℃恒温培养箱中培养。分别于第2、5、7天观察人参组织周围新长出的菌落，挑取单一菌落进行分离纯化，观察纯化后的菌株形态进行编号，并转接至PDA斜面培养基置于28C°的恒温培养箱中培养，通过平板对峙实验筛选到对人参根腐病、人参锈腐病、人参黑斑病同时具有拮抗作用的菌株G1S3504。

G1S3504菌株的形态学特征：革兰氏染色反应阳性，芽孢杆状，单生或两个串生，大小为0.8-(1.2)-1.3×2.3-(3.0)-4.2μm。在NA平板上，菌株的菌落呈不规则圆形，淡黄色，有褶皱，不透明，菌落边缘常不整齐(见图1)。置于透镜下观察该菌株的形态，结果见图2。于溶磷培养基上培养可观察到明显的溶磷圈(见图3)。

对菌株G1S3504进行序列16S rRNA分析研究。采用划线培养法，将代表菌株在NA培养基上28℃恒温黑暗培养24h后，用移液枪挑取单菌落至1.5mL离心管加40μL ddH20旋涡震荡，作为PCR扩增的模板。PCR扩增：用细菌通用引物27F(5‘-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3’)和1492R(5‘-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)对扩增16S rRNA基因。反应体系为25μL：2μL基因组DNA，1.25μL正向和反向引物，12.5μL 2×Taq PCR StarMix(Genstar，北京)，8μL ddH₂O。扩增参数：95℃预变性3min，94℃变性30s，52℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环，72℃伸长10min。PCR产物经含有核酸染料的1％琼脂凝胶检测后，送至上海生工股份有限公司进行纯化测序。

序列分析方法于真菌序列分析方法相同。校正过后的序列在EZtaxon(http://eztaxon-e.ezbiocloud.net/)数据库中进行同源性对比分析。并将同源性高的菌株下载至Phydit软件中进行比较分析。最后构建系统发育树(见图4)，鉴定其种类。

根据G1S3504菌株的形态学特征结合16S rRNA序列分析结果，鉴定G1S3504菌株为贝莱斯芽孢杆菌。

实施例2贝莱斯芽孢杆菌发酵液的制备

(1)菌种培养

试管种培养(以下均为重量百分比)

将PDA培养基(葡萄糖20g，马铃薯浸出粉4g，琼脂粉15g)放入试管中，用蒸馏水补足到1000mL，灭菌，做成平板，接种贝莱斯芽孢杆菌G1S3504菌株，28℃培养48h。

(2)发酵

具体发酵生产过程如下：

a.种子悬浮液的制备：挑取斜面上的菌落，放入PDB培养基(葡萄糖20g，马铃薯浸出粉4g放入试管中用蒸馏水补足到1000mL，灭菌)30℃下摇床培养48h,得到种子悬浮液；

b.接种：将种子悬浮液通过接种口，利用压差接入发酵罐(发酵罐的培养基配方为：酵母浸粉2.5％，葡萄糖1％，磷酸氢二钾1.5％，硫酸铵2.5％，用蒸馏水补足到1000mL，灭菌前pH 8.0；发酵罐的罐温为25-32℃，罐压为0.5kg/cm²，罐内搅拌速度为200r/min)，注意避免污染；升压时罐压不能超过1.5kg/cm²；

c.液体发酵：

发酵罐在接种后，培养36小时，至菌数不再增加，立即放罐，经平板计数测定含菌量，含菌量达180亿cfu/mL。

实施例3生防菌剂-可湿性粉剂的制备

(1)发酵液的制备同实施例2，得发酵液；

(2)添加填充剂：将发酵液压入贮罐，根据以下计算公式加入硅藻土(轻质碳酸钙)作为填充剂，搅拌30min；

填充剂的加入量(公斤)＝[发酵液菌数(亿/毫升)X放罐体积(升)X收率]/成品菌数—发酵液中的残存物(公斤)。然后经、板框压滤、打浆、干燥、粉碎、制成可湿性粉剂，供大田用。

(3)板框过滤：用2kg/cm²的压力，将物料由贮罐压入板框，通过7号滤布过滤，压力随时调节，使滤液中的含菌量不超过0.2亿/毫升，得滤饼和滤液；

(4)打浆：将滤饼卸入打浆罐中，按加入碳酸钙量的8％加入浓乳100号，或按3％加入SDS，再加入辅助剂(CPL)以及适量的滤液均匀搅拌30min；

(5)干燥：将浆液置于60℃以下的烘干房内通风干燥至含水量为5％-8％，得半成品；

(6)粉碎：将半成品进行粉碎，粉碎时出料温度≤60℃；

(7)成品质量指标测定：含菌量、含水量、悬浮率、细度的测定均参照国家企业标准(Q/KWL02-2003)进行，含菌量18亿/克，其余各项指标均符合标准。

实施例4平板对峙试验测试贝莱斯芽孢杆菌的抑菌作用

将G1S3504菌株及十三株病原真菌活化培养，用打孔器在真菌菌落边缘分别取直径为6mm的菌饼，将病原菌菌饼置于90mm的PDA培养基中心，在距离15mm处上各转接散珠不同的G1S3504单菌落，剩余一处为空白处为对照，每个处理重复3次。然后将培养皿放置于25℃恒温黑暗培养箱培养，带对照长满菌丝，测定抑菌距离(病原菌菌落边缘与内生菌菌落边缘的距离)，确定各内生菌的抑菌活性。

以只接种病原菌为对照，菌落平均直径为接种后第7天观察结果，测量并计算G1S3504菌株对病原菌的抑制率。

抑菌率计算公式如下：

抑菌率(％)＝(对照病原菌菌落直径-处理病原菌菌落直径)/对照病原菌菌落直径×100％

实验结果如图5～6和表1所示。图5～6中，各序号代表的病原菌为：1：人参根腐病；2：人参黑斑病；3：人参锈腐病；4：龙胆根腐病；5：柑橘果实软腐病；6：水稻稻瘟病；7：香樟叶斑病；8：山白树叶斑病；9：大叶仙茅叶斑病；10：橙子灰霉病；11：胡萝卜黑斑病；12：百日菊紫斑病；13：桃树枝枯病。

3试验结果与分析

表1 G1S3504菌株对病原菌的抑菌活性

由表1、图5～6结果可知，贝莱斯芽孢杆菌G1S3504对13种真菌都有较强的拮抗作用，抑制率均高于64.37％，具有广谱抑菌活性。其中，对人参根腐病的抑制效果最强，抑制率达68.65％；对人参黑斑病的抑制作用次之，抑制率为68.52％；人参锈腐病的抑制作用较其它病原菌的拮抗作用最弱，抑制率为64.37％。

实施例5盆栽试验检测G1S3504菌株对人参根腐病的防治效果

温室的条件控制为温度28℃-30℃，湿度为80％-90％，自然光照，选取长势一致的、二年生人参苗，营养钵装1kg/钵，将人参苗栽入其中。试验设7个处理：

处理1：用伤根浸渍法剪伤人参根部，浸泡清水30min，种入装有1kg的土壤的花盆中。浇500mL清水定根，并每7d浇一次清水。

处理2：用伤根浸渍法剪伤人参根部，浸泡根腐病菌液(孢子浓度调节为1×10⁵cfu/mL)30min，种入装有1kg的土壤的花盆中。浇500mL清水定根，并每7d浇一次清水。每处理30株。

处理3：用伤根浸渍法剪伤人参根部，浸泡根腐病菌液(孢子浓度调节为1×10⁵cfu/mL)30min，种入装有1kg的土壤的花盆中。用清水稀释50倍的G1S3504初始菌剂后，浇灌500mL稀释液定根，并每7d浇一次500mL用清水稀释10倍的实施例2发酵液，每处理30株。

处理4：用伤根浸渍法剪伤人参根部，浸泡G1S3504菌液(孢子浓度调节为1×10⁵cfu/mL)30min，种入装有1kg的加入生防菌剂的土壤花盆中。将植株入后浇450mL用清水定根，并每7d浇一次500mL用清水稀释50倍的G1S3504初始菌剂。每处理30株。

处理5：用伤根浸渍法剪伤人参根部，浸泡根腐病菌液(孢子浓度调节为1×10⁵cfu/mL)30min，种入装有1kg的加入生防菌剂的土壤花盆中。将植株入后浇450mL用清水定根，并每7d浇一次500mL清水。每处理30株。

处理6：用伤根浸渍法剪伤人参根部，浸泡根腐菌菌液(孢子浓度调节为1×10⁵cfu/mL)30min，种入装有1kg的加入生防菌剂的土壤的花盆中。其中土壤处理方法为：取10mL初始菌剂稀释5倍后用蚯蚓粪100g拌匀，而后拌入土壤中。将植株入后浇450mL用清水定根，并每7d浇一次500mL用清水稀释50倍的G1S3504初始菌剂。每处理30株。

处理7：用伤根浸渍法剪伤人参根部，浸泡根腐菌菌液(孢子浓度调节为1×10⁵cfu/mL)30min，种入装有1kg的加入生防菌剂的土壤花盆中。其中该土壤处理方法为：取50mL清水用蚯蚓粪100g拌匀，而后拌入土壤中。将植株入后浇450mL用清水定根，并每7d浇一次500mL清水。每处理30株。病原菌处理方法为：

将根腐菌在PDA平板上活化培养5d，采用无菌水冲洗的方法洗出病原菌孢子，制成孢子悬浮液，镜检并将孢子悬浮液稀释为1×10⁵cfu/mL浓度。试验期间，各处理其他管理措施一致。在人参移栽第90d时，取样并记录各处理每株人参烂根程度和正常人参数并计算病情指数等级。

病情指数及防病效果按照以下公式进行计算:

病情指数＝∑(病害的级别×该级别的植株数)/供试植株

病情分级：0级参根完全无病；1级为参根有小病斑或稍有烧须；2级为病斑占1/5或部分烧须；3级为参根病斑各1/3并开始烂或大部分烧须；4级为烂根达1/2或仅剩部分主侧根；5级为烂根大于1/2或仅剩部分主根。

实验结果见表2。

表2

处理	病情指数
		CK	0
G1S3504	0
		根腐病菌	4.9
G1S3504+根腐病菌	1.7

实施例6大田生防试验

试验地点：吉林省左家市中国农业科学院特产研究所左家实验基地大田防效试验。选用人参在历年发病重的田块种植，开展生防细菌防控人参根腐病病害的试验，统一化水肥管理。小区为一畦2行区，面积20平方米，每处理设3个重复，随机排列。

按照实施例2制备G1S3504处理液用于以下处理：

设置生G1S3504处理液、农药多菌灵和清水对照共3个处理，以G1S3504处理液稀释100倍后对人参进行灌根处理，每20平方米施用G1S3504处理液，每隔7天施用一次，连续施用3次。

同时，设置原液、稀释10倍、100倍浓度的G1S3504处理液对人参浇苗和清水对照多个处理，每隔7天施用一次，连续施用5次。

调查标准如下：

人参根腐病病级标准：

病情指数＝Σ(各级病株数×相对级数值)×100/(调查总株数×最高级数值)

相对防效＝(对照区病指增长率-处理区病指增长率)/对照区病指增长率×100％

试验结果见表3～4。

表3吉林省中国农业科学院特产研究所左家试验基地人参根腐病的防治结果

编号	处理方式	病情指数	防治效果％
				1	CK	73.6±4.5a	--
2	G1S3504处理液	23.5±1.2c	54.93±2.3a
				3	多菌灵	43.4±0.9b	36.34±1.7b

注：同列小写字母不同表示差异显著(P<0.05)。

表4生防菌G1S3504对人参的促生作用

注：同列小写字母不同表示差异显著(P<0.05)。

结果表明，G1S3504菌株可有效防治人参根腐病，同时对人参生长具有显著地促进作用。

实施例7

试验以3年生人参种苗为材料，每盆6株人参苗。对照(CK):接种灭过菌的PDB培养基30mL；处理组:接种G1S3504菌30mL(浓度为1×10⁵cfu/mL)，其中接种的巨大芽孢杆菌BM(Bacillus megaterium)，枯草芽孢杆菌(Bacillus substilis)采购于中国工业微生物菌种保藏管理中心。每盆装土1.5kg，3次重复，待人参完全展叶间苗，留取长势大致相同的人参苗，采用滴灌的方式将菌液接种在人参植株根部附近，在人参植株生长期间，每隔7d浇一次水。人参植株生长至红果期时(90d)取样测定各项生物量指标及人参皂苷含量。数据采用SAS9.2统计软件及Excel2010进行分析，结果见表5～6。

表5不同处理人参植株的生物量指标

注：同列不同小写字母表示P<0.05。

表6不同处理对人参根皂苷含量的影响(％)处理

注：同列不同小写字母表示P<0.05。

结果表明，相比其他芽孢杆菌，本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌G1S3504可促进人参生长，提高人参皂苷的含量(p<0.01)。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国农业科学院特产研究所

<120> 贝莱斯芽孢杆菌及其应用

<130> MP2027861

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1409

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 1

gtcgagcgga cagatgggag cttgctccct gatgttagcg gcggacgggt gagtaacacg 60

tgggtaacct gcctgtaaga ctgggataac tccgggaaac cggggctaat accggatggt 120

tgtttgaacc gcatggttca aacataaaag gtggcttcgg ctaccactta cagatggacc 180

cgcggcgcat tagctagttg gtgaggtaac ggctcaccaa ggcaacgatg cgtagccgac 240

ctgagagggt gatcggccac actgggactg aaacacggcc caaactccta cgggaggcag 300

cagtagggaa tcttccgcaa tggacgaaag tctgacggag caacgccgcg tgagtgatga 360

aggttttcgg atcgtaaagc tctgttgtta gggaagaaca agtgccgttc aaatagggcg 420

gcaccttgac ggtacctaac cagaaagcca cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa 480

tacgtaggtg gcaagcgttg tccggaatta ttgggcgtaa agggctcgca ggcggtttct 540

taagtctgat gtgaaagccc ccggctcaac cggggagggt cattggaaac tggggaactt 600

gagtgcagaa gaggagagtg gaattccacg tgtagcggtg aaatgcgtag agatgtggag 660

gaacaccagt ggcgaaggcg actctctggt ctgtaactga cgctgaggag cgaaagcgtg 720

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Claims

1.贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)，其保藏编号为CGMCC No. 20629。

2.一种发酵液，其特征在于，由权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌发酵获得。

3.权利要求2所述的发酵液的制备方法，其特征在于，将权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌接种于PDA斜面培养基，28℃下培养48h；挑取斜面上的菌落，放入PDB培养基30℃下摇床培养48h获得种子悬浮液；将所述种子悬浮液接种于发酵培养基28~34℃，160~200r/min条件下发酵36h。

4.权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌或权利要求2所述的发酵液在防治植物病害中的应用；所述植物病害为人参根腐病、人参锈腐病、人参黑斑病、龙胆根腐病、柑橘果实软腐病、香樟叶斑病、百日菊紫斑病、桃树枝枯病、大叶仙茅叶斑病、橙子灰霉病、山白树叶斑病、胡萝卜黑斑病或水稻稻瘟病。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述贝莱斯芽孢杆菌的有效浓度为1×10⁵~1×10⁸cfu/mL，施用量为0.5~1.0L/m²。

6.生防菌剂，其特征在于，包含权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌或权利要求2所述的发酵液以及可接受的辅料。

7.一种防治植物病害的方法，其特征在于，施用权利要求1所述的芽孢杆菌、权利要求2所述的发酵液或权利要求6所述的生防菌剂，施用的活菌浓度1×10⁶cfu/mL，施用量为0.5L/m²；

所述植物为人参；

所述植物病害为人参根腐病、人参锈腐病、人参黑斑病。