CN109971656B - 一株生姜内生绿色木霉及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株生姜内生绿色木霉及其应用。本发明所述的菌株为绿色木霉(Trichoderma viride)BJM‑11，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2019年3月21日，保藏编号为CGMCC No.17196。本发明的菌株BJM‑11对生姜茎腐菌群结腐霉和香蕉枯萎病菌尖孢镰孢菌有较强的拮抗作用，能够用于生姜茎腐病和香蕉枯萎病的防治。
Description
技术领域
本发明属于生物防治技术领域，具体涉及一株生姜内生绿色木霉及其应用。
背景技术
生姜，是一种重要的经济型作物，生姜营养价值较高，既是重要调味品也是良好的中药材。香蕉是国内外市场上经济效益显著的水果产品之一，随着现代科技的不断发展、香蕉产业将在市场经济中发挥越来越重要的作用。生姜茎腐病和香蕉枯萎病，分别是影响生姜和香蕉生长的主要病害，严重影响了产业发展。
目前对生姜茎腐病和香蕉枯萎病的防治方法主要是化学药剂防治，但大量使用化学药剂给环境生态、人畜安全带来很多问题，同时很容易使病原菌产生抗药性。生防微生物因环保安全，不易产生抗药性等优点，是目前国内外研究热点。
植物内生真菌可分布于植物不同组织中，不使宿主植物产生明显症状，受植物组织的保护，不受外部环境的影响，具有稳定的生态环境。因此，内生真菌更易发挥生防作用，其防病机理主要表现有与病原菌竞争营养物质或空间，产生抗生素类、水解酶类、植物生长调节剂等物质，促进宿主植物生长，增强诱导宿主植物抗逆能力，使其产生系统抗性等途径防治病害。如果能从植物中分离出对生姜茎腐病菌和香蕉枯萎病菌具有拮抗作用的内生真菌，那么对于生姜茎腐病菌和香蕉枯萎病的防治将具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一株生姜内生绿色木霉及其应用。本发明的生姜内生绿色木霉菌株BJM-11，生长速度快，孢子繁殖速度快，量也大，能够在短时间内占据生存空间，对生姜茎腐菌群结腐霉和香蕉枯萎病菌尖孢镰孢菌有较强的拮抗作用，对生姜和香蕉病害的生物防控及生姜和香蕉的正常生长具有重要意义。
本发明的一株生姜内生绿色木霉，命名为绿色木霉(Trichoderma viride)BJM-11，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2019年3月21日，保藏编号为CGMCC No.17196。
进一步的，所述的生姜内生绿色木霉BJM-11的ITS序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供所述的生姜内生绿色木霉的应用，具体为所述菌株BJM-11在防治生姜茎腐病和香蕉枯萎病中的应用。
进一步的，所述菌株BJM-11可用于制备防治生姜茎腐病或香蕉枯萎病的孢子悬浮液。
进一步的，所述孢子悬浮液的制备方法包括如下步骤：将菌株BJM-11接种于PDA平板上，28℃培养5d，以无菌水冲洗平板表面，获得菌株BJM-11孢子悬浮液。
进一步的，所述菌株BJM-11孢子悬浮液经稀释后，以沟施或灌根的方式用于防治生姜茎腐病或香蕉枯萎病。
进一步的，所述菌株BJM-11孢子悬浮液以血球计数法确定菌液浓度，调节孢子浓度为107个孢子/mL；生姜种植前，将调节好浓度的菌株BJM-11孢子悬浮液按10L/亩兑水1000倍进行沟施，出苗后按同样用量再施用一次，共施药两次；用于防治生姜茎腐病。
有益效果：
本发明的生姜内生绿色木霉菌株BJM-11，生长速度快，孢子繁殖速度快，量也大，能够在短时间内占据生存空间，对生姜茎腐菌群结腐霉和香蕉枯萎病菌尖孢镰孢菌有较强的拮抗作用，为生姜和香蕉病害的生物防控提供了依据。经试验，本发明的生姜内生绿色木霉菌株BJM-11对生姜茎腐病菌抑制率达到92.72％，对香蕉枯萎病菌抑制率达到82.38％；在生姜种植的过程中，菌株BJM-11能对植株进行有效防护，大大降低生姜茎腐病发病程度，提高生姜产量。本发明提供的菌株BJM-11可以制备成孢子悬浮液，在生姜和香蕉种植过程中施用，可大大减少化学药剂的使用，保护生态环境和人畜安全。
附图说明
图1为菌株BJM-11的菌落形态图；
图2为菌株BJM-11的孢子及分生孢子梗形态图；
图3为基于rDNA-ITS序列特征构建的菌株BJM-11的系统发育树图；
图4为菌株BJM-11与生姜茎腐病菌群结腐霉的平板对峙培养图，图中的A为菌株BJM-11处理，B为CK(对照)；
图5为菌株BJM-11与香蕉枯萎病菌尖孢镰刀菌的平板对峙培养图，图中的A为菌株BJM-11处理，B为CK(对照)；
图6为菌株BJM-11对生姜茎腐病菌的盆栽防治效果图，图中的A为CK(对照)，B为菌株BJM-11处理；
图7为菌株BJM-11对生姜茎腐病菌的田间防治效果图，图中的A为CK(对照)，B为菌株BJM-11处理。
具体实施方式
下面结合附图及具体的实施例对本发明作进一步说明。
实施例
(一)菌株获得及命名：
本发明从广西健康生姜根系中分离到一株内生真菌，经微生物分类学鉴定、命名为绿色木霉(Trichoderma viride)BJM-11，该菌株已保藏，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏编号为CGMCCNo.17196，保藏日期为2019年3月21日。
(二)形态特征：
本发明的生姜内生绿色木霉BJM-11的形态特征为：如图1所示，在PDA培养基上28℃培养3d就可以长满整个平板，初呈白色，培养第3d明显可见有孢子产生，逐渐增多，使菌落呈现黄绿色；菌落表明疏松、平坦，外观干燥，有轮纹。如图2所示，显微镜观察发现其分生孢子梗有二级和三级分枝，对生，在分枝末端形成瓶状小梗。分生孢子球形、椭圆形，孢子壁光滑，孢子直径为2-5μm。
(三)本发明的生姜内生绿色木霉BJM-11的ITS序列如下所示：
ggggatttccggagtttcactgcaaacccaatgtgaacgttaccaaactgttgcctcggcgggatctctgccccgggtgcgtcgcagccccggaccaaggcgcccgccggaggaccaaccaaaactcttattgtataccccctcgcgggtttttttactatctgagccatctcggcgcccctcgtgggcgtttcgaaaatgaatcaaaactttcaacaacggatctcttggttctggcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgataagtaatgtgaattgcagaattcagtgaatcatcgaatctttgaacgcacattgcgcccgccagtattctggcgggcatgcctgtccgagcgtcatttcaaccctcgaacccctccggggggtcggcgttggggatcggccctttacggggccggccccgaaatacagtggcggtctcgccgcagcctctcctgcgcagtagtttgcacactcgcatcgggagcgcggcgcgtccacagccgttaaacaccccaaacttctgaaatgttgacctcggatcaggtaggaatacccgctgaacttaagcatatcaataagcggaggaa
(四)本发明的生姜内生绿色木霉BJM-11的ITS序列分析：
ITS序列在NCBI数据库中进行Blast比对及同源性比较分析。通过CLUSTAL软件进行多序列比对，利用MEGA6.0软件构建系统发育树进行聚类分析，如图3所示。根据系统发育树中的组群关系并结合形态学鉴定结果对菌株进行分类鉴定。
(五)本发明的生姜内生绿色木霉BJM-11分别与生姜茎腐病菌和香蕉枯萎病菌的对峙培养：
在PDA平板中央放置直径为4mm指示菌菌饼，再在其两端相距3cm处各放置一块内生真菌菌饼，每处理4次重复，以4mm不接菌琼脂块为对照，28℃黑暗培养，5d后，十字交叉法测量病原菌的菌落直径，计算供试菌株对病原菌的生长抑制率。
抑制率＝[(对照菌落直径-处理菌落直径)/对照菌落直径]×100％。
试验结果为：如表1所示，菌株BJM-11对生姜茎腐病菌抑制率达到92.72％，对香蕉枯萎病菌抑制率达到82.38％；如图4、图5所示，在BJM-11菌株与两种病原菌的对峙培养的PDA平板上，BJM-11菌丝生长迅速，在接种5d时几乎完全覆盖包裹了整个平板。
(六)本发明的生姜内生绿色木霉BJM-11发酵液对生姜茎腐病菌和香蕉枯萎病菌抑制试验：
无菌条件下，将BJM-11接种到300mLPDB培养基中，于28℃、180r·min-1培养10d后，5000r·min-1离心5min取上清液，使用0.22μm的微孔滤膜进行抽滤去除菌体，收集滤液备用；拮抗活性测定采用生长速率法，取拮抗菌滤液10mL与90mL灭菌PDA培养基混匀后倒平板，对照组加等量的无菌水；用直径4mm的打孔器在培养4d的茎腐病菌菌落边缘取菌饼，菌丝面朝下接种到含内生真菌发酵液的平板上；每个处理设4次重复，28℃恒温黑暗培养7d，采用十字交叉法测量病原菌的菌落直径，计算抑制率。
抑制率＝[(对照菌落直径-处理菌落直径)/对照菌落直径]×100％。
结果：如表1所示，菌株BJM-11发酵液对生姜茎腐病菌和香蕉枯萎病菌抑制率分别为81.99％、73.18％。
表1菌株BJM-11对指示菌的抑菌活性
(七)本发明的生姜内生绿色木霉BJM-11防治生姜茎腐病盆栽试验：
1.生防菌剂及病原接种体的制备
菌株BJM-11孢子悬浮液准备：将菌株BJM-11接种于PDA平板上，28℃培养5d，以无菌水冲洗平板表面，获得孢子悬浮液，以血球计数法确定菌液浓度，调节孢子浓度为107个孢子/mL，备用。
生姜茎腐病病原菌准备：将生姜茎腐病菌群结腐霉接种于PDA平板，培养5d后用打孔器打菌块备用。
2.试验设计及方法
表2菌株BJM-11盆栽防治生姜茎腐病试验设计及不同处理
首先将土壤、沙子与基质以重量比1：1：1混匀后120℃灭菌2h，分装到花盆里；再根据上述不同处理，将配制好的菌株BJM-11孢子悬浮液按每盆10ml与1000ml水混匀，灌入土壤；三天后，栽种无病姜苗，每处理4盆，每盆3株；生长7d后，每株姜苗茎基部接种一块生姜茎腐病菌菌块。
接种7d后，用相同浓度菌株BJM-11孢子悬浮液再次灌根，25d后观察并测定各处理发病级别，按照病害分级标准计算病情指数与防病效果，以清水处理为对照(CK)。根据茎基部及整株病情按以下分级标准统计病情指数，计算防治效果。
0级：无症状；
1级：仅茎基部或根部产生水渍状病斑；
2级：茎基部病斑扩大蔓延至绕茎一周，整株的三分之一以下表现系统症状(枯萎、死亡、萎蔫等)；
3级：整株的三分之二以下表现系统症状；
4级：整株的三分之二以上表现系统症状，死亡植株按4级计算。
3.试验结果
如表3所示，菌株BJM-11处理的发病率和病情指数均明显低于对照，防效达到了67.44％；如图6所示，CK组全部发病，叶片枯黄并且一半以上已经死亡；而经菌株BJM-11处理后的盆栽大部分正常，极少数出现黄叶枯叶现象。
表3菌株BJM-11盆栽防治生姜茎腐病试验
(八)本发明的生姜内生绿色木霉BJM-11防治生姜茎腐病田间试验：
1.按(七)步骤1方法制备相同浓度菌株BJM-11孢子悬浮液。
2.试验方法
田间试验地块设置在广西南宁市武鸣县广西农业科学院里建基地。地块为自然病地，连年种植生姜。试验设计为随机区组设计，共设置2个处理，分别是绿色木霉BJM-11处理和无处理空白对照CK，每个处理4次重复，共8个小区，小区宽2.5m，长8m种植，行距35cm，株距25cm，所有试验小区的栽培条件(土壤类型、施肥、播栽期、生育阶段、株行距等)均匀一致，田间常规管理。BJM-11处理：生姜种植前，将配制好的菌株BJM-11孢子悬浮液按10L/亩兑水1000倍进行沟施，出苗后按同样用量再施用一次，共施药两次。
3.在生姜收获期按(七)步骤2的方法统计生姜茎腐病病情指数，计算防治效果，同时对生姜生长指标及产量进行调查，计算增产效果。
4.试验结果：如表4所示，田间试验调查结果显示BJM-11处理对生姜茎腐病的防效相比于对照达到了76.37％；如图7所示，经BJM-11处理后植株生长茂盛，枝叶翠绿，而CK组因发生病害出现较多的枝叶枯黄现象；如表4所示，BJM-11处理的平均每株生姜分枝数和株高均高于对照，且表现出较好的增产效果，相比对照增产达到了33.72％，试验证明，经BJM-11处理后产出的姜块多且大，而CK组的则相对较少且较小。
表4菌株BJM-11田间防治生姜茎腐病及对生姜产量影响试验
虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然其并非用以限制本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，当可做些许的修改和完善，因此本发明的保护范围当以权利要求书所界定的为准。
序列表
<110> 广西壮族自治区农业科学院微生物研究所
<120> 一株生姜内生绿色木霉及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 592
<212> DNA
<213> 绿色木霉(Trichoderma viride)
<400> 1
ggggatttcc ggagtttcac tgcaaaccca atgtgaacgt taccaaactg ttgcctcggc 60
gggatctctg ccccgggtgc gtcgcagccc cggaccaagg cgcccgccgg aggaccaacc 120
aaaactctta ttgtataccc cctcgcgggt ttttttacta tctgagccat ctcggcgccc 180
ctcgtgggcg tttcgaaaat gaatcaaaac tttcaacaac ggatctcttg gttctggcat 240
cgatgaagaa cgcagcgaaa tgcgataagt aatgtgaatt gcagaattca gtgaatcatc 300
gaatctttga acgcacattg cgcccgccag tattctggcg ggcatgcctg tccgagcgtc 360
atttcaaccc tcgaacccct ccggggggtc ggcgttgggg atcggccctt tacggggccg 420
gccccgaaat acagtggcgg tctcgccgca gcctctcctg cgcagtagtt tgcacactcg 480
catcgggagc gcggcgcgtc cacagccgtt aaacacccca aacttctgaa atgttgacct 540
cggatcaggt aggaataccc gctgaactta agcatatcaa taagcggagg aa 592
Claims (6)
1.一株生姜内生绿色木霉，其特征在于：命名为绿色木霉(Trichoderma viride)BJM-11，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2019年3月21日，保藏编号为CGMCC No.17196。
2.权利要求1所述的生姜内生绿色木霉的应用，其特征在于：所述菌株BJM-11在防治生姜茎腐病和香蕉枯萎病中的应用。
3.如权利要求2所述生姜内生绿色木霉的应用，其特征在于：所述菌株BJM-11用于制备防治生姜茎腐病或香蕉枯萎病的孢子悬浮液。
4.如权利要求3所述生姜内生绿色木霉的应用，其特征在于：所述孢子悬浮液的制备方法包括如下步骤：将菌株BJM-11接种于PDA平板上，28℃培养5d，以无菌水冲洗平板表面，获得菌株BJM-11孢子悬浮液。
5.如权利要求3或4所述生姜内生绿色木霉的应用，其特征在于：所述菌株BJM-11孢子悬浮液经稀释后，以沟施或灌根的方式用于防治生姜茎腐病或香蕉枯萎病。
6.如权利要求5所述生姜内生绿色木霉的应用，其特征在于：所述菌株BJM-11孢子悬浮液以血球计数法确定菌液浓度，调节孢子浓度为107个孢子/mL；生姜种植前，将调节好浓度的菌株BJM-11孢子悬浮液按10L/亩兑水1000倍进行沟施，出苗后按同样用量再施用一次，共施药两次；用于防治生姜茎腐病。
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