CN116769607B

CN116769607B - 内生真菌a21-1-1在防治水稻稻瘟病中的应用

Info

Publication number: CN116769607B
Application number: CN202310060377.5A
Authority: CN
Inventors: 苏珍珠; 林福呈; 曾宇兰
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2023-01-16
Filing date: 2023-01-16
Publication date: 2024-03-08
Anticipated expiration: 2043-01-16
Also published as: CN116769607A

Abstract

本发明公开了内生真菌A21‑1‑1在防治水稻稻瘟病中的应用，属于微生物应用技术领域。本发明利用保藏号为CCTCC NO：M 2021278的内生真菌Acrocalymma vagum A21‑1‑1通过包衣剂与菌肥育秧的方式与水稻共培养，菌种定殖于水稻根部，可以显著增强水稻对稻瘟病的抗病性，对苗期叶瘟和穗颈瘟均有防效，尤其针对穗颈瘟，防治效果达到70.39％‑83.24％，病情指数下降了67.53‑82.23。内生真菌Acrocalymma vagum A21‑1‑1对水稻稻瘟病的生物防治作用在农业领域内的推广应用具有巨大价值。

Description

内生真菌A21-1-1在防治水稻稻瘟病中的应用

技术领域

本发明涉及微生物应用技术领域，具体涉及内生真菌Acrocalymma vagum A21-1-1在防治水稻稻瘟病中的应用。

背景技术

稻瘟病是水稻重要病害之一，可引起大幅度减产，严重时减产40％～50％，甚至颗粒无收。该病为通过气流传播的流行病，对水稻生产威胁极大，危害程度因品种、栽培技术以及气候条件不同有差别，稻瘟病在整个水稻生育期都会发生，特别是苗期、分蘖盛期、抽穗初期易感病，根据受害时间不同和部位不同，可以分为苗瘟、叶瘟、叶枕瘟、节瘟、穗颈瘟、枝梗瘟和谷粒瘟等，其中穗颈瘟对产量影响最大。穗颈瘟发生在主梗(穗轴)至第一枝梗分枝的穗颈部，抽穗后感染，发病早而重的穗子枯死呈白穗，发病晚的秕谷增加，千粒重降低。

目前，预防稻瘟病发生的最经济有效的途径是种植水稻抗病品种，但是长期种植抗病基因单一的水稻品种，抗病性会因为病菌小种变异或适应而丧失，造成病害再次流行。此外，化学药剂防治也是防治稻瘟病的常用方法，但是长期过量使用化学农药不仅提高水稻生产成本，而且还会造成稻米质量安全与生态环境的污染。因此，寻求高效、环保、绿色、安全的生物防治措施已成为植物病害防控的研究热点。

生物防治是利用有益微生物对病原菌产生各种不利作用，来减少病原物的数量和削弱其致病性，或诱导或增强植物抗病性，改变植物与病原物的相互关系，抑制病害发生。在水稻生产过程中经常用于稻瘟病防治的生防微生物主要有木霉(Trichoderma)、芽孢杆菌(Bacillus)、假单胞菌(Pseudomonas)、放线菌(Actinomycetes)、毛壳霉(Chaetomium)、平脐蠕孢(Bipolaris)和黏质沙雷氏菌(Serratia marcescens)(生物农药在稻瘟病防治中的应用及前景分析，植物保护，2017,43(5):27-34)。

在自然生态系统中藏匿着大量的有益微生物，其中植物内生真菌就是其中之一。植物内生真菌是指至少生活史的一部分能侵染定殖在健康植物组织中，宿主无明显病症的一类真菌，普遍存在于生态系统中，且与宿主植物进行着非常稳定的长期互作关系。课题组前期从野生稻分离的内生真菌稻镰状瓶霉(Falciphora oryzae)，实验室试管接种试验证明，稻镰状瓶霉对稻瘟病产生诱导抗性，田间试验证明施用菌剂的处理对叶瘟的防效达到70％以上，对穗颈瘟的防效亦达70％以上(内生真菌稻镰状瓶霉对直播稻稻瘟病的防治效果，中国稻米，2019,25(4):68-69)。

因此，从植物内生真菌中挖掘对稻瘟病具有防效的有益微生物，对于水稻稻瘟病防治具有重要意义。目前尚无报道指出Acrocalymma属真菌在防治水稻稻瘟病方面的功能。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够提高水稻对稻瘟病抗性的内生真菌，将其应用到水稻稻瘟病的防治当中。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了内生真菌Acrocalymma vagum A21-1-1在防治水稻稻瘟病中的应用。内生真菌Acrocalymma vagum A21-1-1分离自云南野生稻根系，属于真菌界(Fungi)，子囊菌门(Ascomycota)，座囊菌纲(Dothideomycetes)，格孢菌目(Pleosporales)，畸腔菌科(Morosphaeriaceae)，Acrocalymma属。该菌株于2021年3月25日保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：中国武汉、武汉大学)，保藏号为CCTCC NO：M 2021278。

本发明研究发现，将内生真菌Acrocalymma vagum A21-1-1定殖于水稻根部组织中，可以显著增强水稻对稻瘟病的抗病性。

所述应用包括：将内生真菌Acrocalymma vagum A21-1-1与水稻共培养，使其定殖于水稻根部组织中。研究表明，A21-1-1与水稻共培养后，其菌丝和分生孢子定殖于根部的表皮层、皮层、内皮层以及维管束部分。

进一步的，所述稻瘟病为苗期叶瘟、穗颈瘟。本发明研究表明，A21-1-1定殖于水稻根部组织后，可以显著增强水稻对苗期叶瘟以及穗颈瘟的抗病性，其中对穗颈瘟的防效更为显著，防治效果达到70.39％-83.24％。

进一步的，所述应用包括：将内生真菌Acrocalymma vagum A21-1-1菌丝与壳聚糖溶液混匀后制备成种衣剂，再与水稻种子混合，置于阴凉通风处晾干制得包衣种子，然后将包衣种子通过直播的方式播种于大田，培育至收获。

基于种衣剂用量少，方便使用，便于推广的优点，本发明将内生真菌Acrocalymmavagum A21-1-1以种衣剂的形式应用于水稻种子上，显著提高定殖效果，包衣种子通过直播的方式施用大田，操作简单便捷。

优选的，将活化的内生真菌Acrocalymma vagum A21-1-1接种于液体发酵培养基中，25℃培养，获得菌丝，然后菌丝与质量百比分浓度为1％的壳聚糖溶液按照1g：10L的比例混合制得种衣剂；将消毒后的种子与种衣剂按照2.5g：1mL的比例混合；

所述液体发酵培养基以质量百分比计，每250mL含0.4％豆饼粉、1％玉米粉、0.05％硫酸镁、0.1％磷酸氢二钾。

液体发酵之前，将内生真菌Acrocalymma vagum A21-1-1菌株接种于PDA培养基进行活化培养，25℃黑暗培养7天。

进一步的，所述应用包括：将内生真菌Acrocalymma vagum A21-1-1接种于无菌大麦粒上，黑暗培养至菌丝生长布满麦粒，制得A21固体菌肥，再混合到育苗基质中制得混合基质，水稻种子萌发后播种于混合基质中育苗，然后水稻秧苗移栽至大田，培育至收获。

本发明将Acrocalymma vagum A21-1-1制备成固体菌肥，通过基质育秧的方式施用到水稻根部，使其定殖于水稻根部。

优选的，将活化的内生真菌Acrocalymma vagum A21-1-1接种于液体发酵培养基中，25℃培养，获得发酵液，发酵液与无菌大麦粒按照100mL：500g的比例混合，25℃黑暗培养至菌丝生长布满麦粒，即得A21固体菌肥；

制备混合基质中，固体菌肥与育苗基质按照质量比1:9进行混合。

本发明还提供了一种提高水稻对稻瘟病抗性的方法，包括：将所述内生真菌Acrocalymma vagum A21-1-1与水稻共培养，使其定殖于水稻根部组织中，以提高水稻对稻瘟病的抗病性。

本发明具备的有益效果：

本发明利用Acrocalymma vagum A21-1-1与水稻共培养，在培育过程中，菌种定殖于水稻根部，可以显著增强水稻对稻瘟病的抗病性，对苗期叶瘟和穗颈瘟均有防效，尤其针对穗颈瘟，防治效果达到70.39％-83.24％，病情指数下降了67.53-82.23。内生真菌Acrocalymma vagum A21-1-1对水稻稻瘟病的生物防治作用在农业领域内的推广应用具有巨大价值。

附图说明

图1为异形畸腔菌A21菌落形态以及镜下菌丝形态，其中a和b分别为异形畸腔菌在PDA培养基上25℃培养7天后菌落形态的正面与背面；c为显微镜下异形畸腔菌菌丝形态，Bars,20μm；d为扫描电镜下异形畸腔菌菌丝形态，箭头所指为孢子。

图2为畸形腔孢菌A21在水稻根部的定殖模式，其中a和b为扫描电镜下大量的菌丝(蓝色箭号)和分生孢子(绿色箭号)附着在根系的表面；c为扫描电镜下根部的横切面中可以看到大量的菌丝和分生孢子分布在表皮层、皮层、内皮层以及维管束部分；d为扫描电镜下分生孢子分布在根系的韧皮部；e为光学显微镜下根系内的畸形腔孢菌A21被苯胺蓝染色，Bar,40μm；f为光学显微镜下根系纵轴方向观察畸形腔孢菌的定殖模式，蓝色部分为被苯胺蓝染色的畸形腔孢菌，Bars,20μm；g为畸形腔孢菌在水稻根部的动态生物定殖量。

图3为畸形腔孢菌A21对水稻叶瘟的防效，其中a,b,c为畸形腔孢菌与水稻组培瓶共培养后对稻瘟病叶瘟的防效，a为叶片感病，b为叶部感病面积比例，c为病情指数；d,e,f为畸形腔孢菌菌肥与水稻盆栽共培养后对稻瘟病叶瘟的防效，d为叶片感病，e为叶部感病面积比例，f为病情指数。显著性(t-test):**,P<0.01；****,P<0.0001。

图4为畸形腔孢菌A21包衣剂对水稻穗颈瘟的防效，其中a为对照水稻穗部发病情况；b为畸形腔孢菌包衣处理水稻穗颈瘟发病情况；c为病级分布频率；d为病情指数。显著性(t-test):***,P<0.001。

图5为畸形腔孢菌A21菌肥对水稻穗颈瘟的防效，其中a为对照水稻穗颈瘟发病情况；b为畸形腔孢菌菌肥处理的水稻穗颈瘟发病情况；c为病级分布频率；d为病情指数。显著性(t-test):***,P<0.001。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。以下实施例仅用于说明本发明，不用来限制本发明的适用范围。在不背离本发明精神和本质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所做的修改或替换，均属于本发明的范围。

下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

内生真菌Acrocalymma vagum A21-1-1(以下简称A21)由课题组前期从云南野生稻根系中分离得到。

具体分离方法为：首先，用自来水连续冲洗野生稻根系，仔细去除土壤颗粒和附属物。选取健康根组织，进行表面消毒处理，75％乙醇浸泡1-2min，1％次氯酸钠4-5min，再用无菌去离子水清洗3次。将根组织块切成0.5cm小段，然后放入2％麦芽粉琼脂培养基(MEA，malt extract agar，OXOID；培养基中加入50mg/L的氯霉素抑制内生细菌的生长)平板上孵育，25℃黑暗培养。培养至第5天，从组织切口边缘处长出内生真菌菌丝，用接种针小心将其挑出后转接到新鲜PDA培养基上纯化培养并记录菌株编号A21-1-1。

PDA培养基：葡萄糖20g/L，马铃薯200g/L，琼脂15g/L。根据待配培养基的体积称取所需马铃薯(200g/L)，水煮后捣碎溶解过滤，加入葡萄糖和琼脂，121℃高压蒸汽灭菌20min。

形态鉴定：A21在PDA培养基上25℃培养7天后菌落形态、菌丝、孢子形态见图1。

分子鉴定：提取A21基因组DNA进行ITS序列的PCR扩增，上游引物ITS1序列为：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′，下游引物ITS4序列为：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。PCR产物回收纯化后送至上海生工用ABIPRISMA377型自动测序仪进行测序。测序结果经过严格核对后，得到如SEQ ID No.1所示的长度为364bp的DNA片段序列。

结合生物学特征以及ITS rDNA基因比对，鉴定A21为真菌界(Fungi)，子囊菌门(Ascomycota)，座囊菌纲(Dothideomycetes)，格孢菌目(Pleosporales)，畸腔菌科(Morosphaeriaceae)，Acrocalymma属。将其命名为Acrocalymma vagum A21-1-1，于2021年3月25日保藏于中国典型培养物保藏中心(中国武汉、武汉大学)，保藏号为CCTCC NO:M2021278，并于2021年4月1鉴定为存活。

实施例1：A21菌株对水稻苗期叶瘟的防效

供试植物：水稻Oryza sativa L.，常规品种，CO39。

1、A21菌株与水稻组培瓶共培养

将保存于滤纸片上的A21菌株接种于马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)固体培养基上进行活化培养，25℃，黑暗培养7d，备用。

将水稻种子去壳后放置在三角瓶中，用1％的NaClO表面消毒15min，用无菌水清洗3次后备用。将消毒后的种子均匀平铺在1/2MS(Murashige and Skoog)培养基上，用Parafilm封口膜封口，置于25℃植物培养箱(16h光照/8h黑暗)。3天后种子露白，将其移入含1/2MS培养基的组培瓶中，每瓶10颗种子。同时接入3块A21菌饼(直径为0.5cm)。对照组为无菌PDA琼脂块。设3个重复。待水稻苗长至三叶一心期(15-20天)，后续用于叶部接种稻瘟病菌。

同时，为确保真菌能够定殖于根部，清洗根系，剪少量样品，置于LSM780荧光共聚焦显微镜(Carl Zeiss Inc.,Jena，Germany)下进行观察，镜检根部A21真菌定殖情况如图2所示。

2、A21菌株与水稻盆栽共培养

将A21菌株接种于无菌大麦粒上进行培养，25℃，黑暗培养7d，制备发酵菌肥。

将水稻种子用1％的NaClO表面消毒15min，用无菌水清洗3次后平铺于培养皿中，置于30℃植物培养箱黑暗催芽2天待种子露白。第3天将其移入含A21菌肥的盆栽中，每盆20颗种子，10g菌肥。待水稻苗长至三叶一心期(15-20天)，后续用于叶部接种稻瘟病菌。

3、稻瘟病菌分生孢子的喷施

将稻瘟病菌菌株Guy11接种于CM固体培养基中，25℃光照培养10-12天。用无菌水将Guy11分生孢子洗下，三层滤纸过滤，配置成孢子悬浮液，浓度为1×10⁵。随后，配置0.4％明胶溶液，按体积比1:1与孢子悬浮液混合，使稻瘟病菌孢子悬浮液终浓度为5×10⁴。

CM培养基(1L)：Yeast Extract(1g)，Casamino acid(1g)，D-glucose(10g)，KH₂PO₄(1.52g)，NaNO₃(6g)，Peptone140(2g)，KCl(0.52g)，MgSO₄·7H₂O(0.52g)，0.1％(v/v)Vitamin solution，0.1％(v/v)Trace Element。用NaOH调节PH至6.5，固体培养基中加入15g/L琼脂。采用高压蒸汽灭菌，条件为121℃，15min。

用喷雾器将孢子悬浮液均匀地喷洒到水稻苗叶片上，每瓶/盆用量1mL。然后，将组培瓶置于25℃植物培养箱，黑暗培养2天。2天后，补充光照，16h光照/8h黑暗，培养4-5天，记录叶片发病等级，统计病情指数。

如图3a-c所示，组培瓶中对照组苗叶瘟发病严重，叶片发病等级主要集中在7-9级，病斑面积比例为72.6％，病情指数为96.8。然而A21菌株处理的处理组叶片病斑零星，病斑面积比例为33.4％，病情指数为75.2。

如图3d-f所示，盆栽中对照组苗叶瘟发病严重，叶片发病等级主要集中在7-9级，病斑面积比例为70.1％，病情指数为98.5。然而A21菌株处理的处理组叶片病斑零星，病斑面积比例为31.4％，病情指数为71.9。

实施例2：A21菌株包衣剂在防治水稻穗颈瘟中的作用

供试植物：水稻Oryza sativa L.，常规品种，沪软1212。

1、A21菌株培养与液体发酵

将保存于滤纸片上的A21菌株接种于马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)固体培养基(葡萄糖20g/L，马铃薯200g/L，琼脂15g/L)上进行活化培养，25℃，黑暗培养7d。用直径0.5cm的打孔器打取菌饼，将菌饼(5个)接种至含有500mL液体发酵培养基的三角瓶中，置于摇床中(25℃，转速150)培养7d。然后将液体发酵液真空抽滤，去除培养基，得到菌丝。称取0.1g菌丝，测定含水率为80％，以备计算菌丝干重。

液体发酵培养基：豆饼粉0.4％，玉米粉1％，硫酸镁0.05％，磷酸氢二钾0.1％，按比例配制，加水至250mL；120℃湿热灭菌15min。

2、A21种衣剂制备：将菌丝与1％壳聚糖溶液按照1：10000的比例(干重：体积)混合均匀，即干重为1g的菌丝与10L 1％壳聚糖溶液混合，制成种衣剂。因真空抽滤后的菌丝含水率不同，所以每次制备种衣剂按照菌丝干重来计算。

1％壳聚糖溶液配方如下：1g壳聚糖溶于100mL的1％醋酸溶液。

3、种子包衣处理：用1％次氯酸钠对水稻种子表面消毒10分钟，清水冲洗干净，沥干，然后将消毒后的种子与种衣剂按照2.5：1的比例(重量：体积)混匀，即每2.5g种子使用1mL种衣剂，得到包衣种子。将包衣后的种子平铺于无菌纱布上，置于阴凉通风处(15-28℃)晾干2-3天。

4、将包衣种子通过人工直播方式均匀播种于大田，正常水肥管理，整个生育期不施用任何杀菌剂，培育至收获。种子每亩用量为4kg。

5、穗颈瘟防效调查

待水稻生长至成熟期调查。每小区对角线三点取样调查，总共调查900穗，以穗为单位记载分级。

病情指数和防治效果计算公式为：

按照方中达等(1990)的标准(表1)对病穗进行分级统计，并计算病情指数和防治效果。

表1水稻穗颈瘟病情分级标准

病级	病害严重度
		0	无病
1	节或穗部发病，平均损失5％；
		3	节或穗部发病，平均损失20％；
5	节或穗部发病，平均损失50％；
		7	节或穗部发病，平均损失70％
9	节或穗部发病，颗粒无收

结果如图4所示，通过对水稻穗颈瘟发病情况调查，发现：对照组水稻植株穗颈瘟发病严重(图4a)，穗颈部变褐，造成枯白穗或秕谷。仅有1.44％的水稻植株没有感病(图4c)，88.56％的水稻植株感病病级为9级，病情指数为95.94(图4d)。

相比之下，根部接种A21菌株的水稻植株发病较轻(图4b)，64.33％的水稻植株没有发病，仅有23％的水稻穗颈瘟病级为9级(图4c)，伴随少量白穗或秕谷，病情指数仅为28.41(图4d)，对水稻穗颈瘟的防治效果达到70.39％。

实施例3：A21固体菌肥在防治水稻穗颈瘟中的作用

供试植物：水稻Oryza sativa L.，常规品种，沪软1212。

1、A21菌株培养与发酵

将保存于滤纸片上的A21菌株接种于马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)固体培养基上进行活化培养，25℃，黑暗培养7d。用直径0.5cm的打孔器打取菌饼，将菌饼(5个)接种至含有500mL液体发酵培养基的三角瓶中，置于摇床中(25℃，转速150)培养7d。然后将液体发酵液接种于装有无菌麦粒培养瓶中(500g麦粒/瓶，100mL发酵液：500g麦粒)，25℃黑暗培养箱中培养10-15d，待菌丝生长布满麦粒，备用。

2、A21固体菌肥的基质育秧

将发酵好的固体菌肥与常规育苗基质混合后，平铺于育苗盘中，每育苗盘含有10g固体菌肥。将水稻种子用25％氰烯菌酯3000倍液浸泡2天进行种子消毒，随后放于30℃黑暗恒温箱中催芽1-2天。待种子露白，将其均匀播种于育苗盘中，放入秧田育苗培养，正常浇水管理。

3、水稻秧苗移栽

待秧苗在育苗盘中生长23-25天后，将秧苗拔出，移栽至大田。移栽时，每丛3株苗，每丛株距10-15cm，行距30cm。正常水肥管理，整个生育期内不施用任何杀菌剂，培育至收获。

4、穗颈瘟防效调查

待水稻生长至成熟期调查。每小区对角线三点取样调查，共查900穗，以穗为单位记载分级。按照表1对病穗进行分级统计，并计算病情指数和防治效果。

结果如图5所示，通过对水稻穗颈瘟发病情况调查，发现：对照组水稻植株穗颈瘟发病严重(图5a)，穗颈部变褐，造成枯白穗或秕谷全部植株感病(图5c)，94.56％的水稻植株感病病级为9级，病情指数为98.79(图5d)。

相比之下，根部接种A21菌株的水稻植株发病较轻(图5b)，82.11％的水稻植株没有发病，仅有15.22％的水稻穗颈瘟病级为9级(图5c)，伴随零星白穗或秕谷，病情指数仅为16.56(图5d)，对水稻穗颈瘟的防治效果达到83.24％。

Claims

1.内生真菌Acrocalymma vagum A21-1-1在防治水稻稻瘟病中的应用，其特征在于，内生真菌Acrocalymma vagum A21-1-1的保藏号为CCTCC NO：M 2021278；所述稻瘟病为苗期叶瘟、穗颈瘟。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，将内生真菌Acrocalymma vagum A21-1-1与水稻共培养，使其定殖于水稻根部组织中。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用包括：将内生真菌Acrocalymma vagum A21-1-1菌丝与壳聚糖溶液混匀后制备成种衣剂，再与水稻种子混合，置于阴凉通风处晾干制得包衣种子，然后将包衣种子通过直播的方式播种于大田，培育至收获。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，将活化的内生真菌Acrocalymma vagum A21-1-1接种于液体发酵培养基中，25℃培养，获得菌丝，然后菌丝与质量百分比浓度为1%的壳聚糖溶液按照1 g：10 L的比例混合制得种衣剂；将消毒后的种子与种衣剂按照2.5g：1 mL的比例混合；

所述液体发酵培养基以质量百分比计，每250 mL含0.4%豆饼粉、1%玉米粉、0.05%硫酸镁、0.1%磷酸氢二钾。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，液体发酵之前，将内生真菌Acrocalymma vagum A21-1-1菌株接种于PDA培养基进行活化培养，25℃黑暗培养7天。

6.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用包括：将活化的内生真菌Acrocalymma vagum A21-1-1接种于液体发酵培养基中，25℃培养，获得发酵液，发酵液与无菌大麦粒按照100 mL：500 g的比例混合，25℃黑暗培养至菌丝生长布满麦粒，制得A21固体菌肥；再混合到育苗基质中制得混合基质，水稻种子萌发后播种于混合基质中育苗，然后水稻秧苗移栽至大田，培育至收获；

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，制备混合基质中，固体菌肥与育苗基质按照质量比1:9进行混合。

8.一种提高水稻对稻瘟病抗性的方法，其特征在于，包括：将保藏号为CCTCC NO：M2021278的内生真菌Acrocalymma vagum A21-1-1与水稻共培养，使其定殖于水稻根部组织中，以提高水稻对稻瘟病的抗病性；所述稻瘟病为苗期叶瘟、穗颈瘟。