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CN114703094B - 一株假蕈状芽胞杆菌及在制备植物病原菌抑菌剂中的应用 - Google Patents

一株假蕈状芽胞杆菌及在制备植物病原菌抑菌剂中的应用 Download PDF

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张新龙
贾忠清
苏善柱
杨少周
刘永高
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Abstract

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株假蕈状芽胞杆菌FJH2及在制备植物病原菌抑菌剂中的应用，本发明涉及到的假蕈状芽胞杆菌FJH2，保藏编号为CCTCC NO:M2022049。该菌株具有抗植物病原菌等功能；能在pH6.0‑pH8.0，1%‑6%盐浓度，20℃‑40℃中生长，对几种植物病原菌抑制效果较好，其中对尖孢镰刀菌抑菌率高达91.47%，具备制备成生防菌的潜在应用价值。

Description

一株假蕈状芽胞杆菌及在制备植物病原菌抑菌剂中的应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株假蕈状芽胞杆菌及在制备植物病原菌抑菌剂中的应用。
背景技术
镰刀菌属广泛存在于土壤和植物中，主要作用于植物根部及根茎交界处，破坏其维管束组织，并在代谢过程中产生酶、酚类等代谢产物，影响寄主植物生长发育。植物枯萎病在夏季发生最为严重，感染植株主要表现为发育迟缓、叶片发黄、枯萎落叶死亡，根茎腐烂等。目前农业上暂无治疗枯萎病十分有效的化学农药，所以治疗枯萎病主要依靠生物防治法。研究表明假蕈状芽胞杆菌能产纤溶酶，增加作物对钾的吸收，但对该菌在抑菌方面的报道极少。
本发明筛选出了一株假蕈状芽胞杆菌，该菌株对尖孢镰刀菌和茄病镰刀菌具有很好的抑制效果，且抑菌率也非常高，对尖孢镰刀菌的抑制率达到了91.47％；可对植物病害起到一定的防治作用，具有极大的开发成生防菌的潜力。
发明内容
本发明的目的在于提供一株假蕈状芽胞杆菌(Bacilluspseudomycoides)FJH2，所述细菌的保藏编号为：CCTCC NO:M2022049。
本发明的另一个目的在于提供一株假蕈状芽胞杆菌的在制备植物病原菌抑菌剂中的应用。
为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
申请人自陕西渭南市蒲城县土样中，分离出一株假蕈状芽胞杆菌，对尖孢镰刀菌及茄病镰刀菌等病原菌具有抑菌作用，且抑菌率较高，经鉴定为假蕈状芽胞杆菌，该细菌已于2022年1月10日送至中国典型培养物保藏中心保藏，地址:中国武汉武汉大学，分类命名：Bacillus pseudomycoides FJH2，保藏编号为：CCTCC NO:M2022049。
分离得到的假蕈状芽胞杆菌(Bacillus pseudomycoides)，在LB固体培养基上的菌落形态如图1所示，菌落形态呈米白色较扁平的根状。生理生化表现为革兰氏染色阳性，不可水解淀粉，不可水解纤维素，甲基红试验为阴性，乙酰甲基甲醇实验为阴性，过氧化氢酶阳性。
一株假蕈状芽胞杆菌FJH2在制备成植物病原菌抑菌剂中的应用，所述的植物病原菌为香蕉枯萎病菌(Fusarium oxysporum F.sp.Cubense)、尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)、巴西青霉(Penicillium brasilianum)、茄病镰刀菌(Fusarium solani)、厚垣镰刀菌(Fusarium chlamydosporum)、青霉菌(Penicillium glaucum)和毛霉菌(Mucor)。
与现有技术相比，本发明具有以下特点：
本发明首次公布了一种假蕈状芽胞杆菌，该细菌对导致植物枯萎病的几种致病菌有较好的抑菌效果。
附图说明
图1为假蕈状芽胞杆菌FJH2的培养性状图。
图2为假蕈状芽胞杆菌FJH2对尖孢镰刀菌的抑制作用示意图。
图3为假蕈状芽胞杆菌FJH2对茄病镰刀菌的抑制作用示意图。
图4为假蕈状芽胞杆菌FJH2对毛霉的抑制作用示意图。
具体实施方式
本发明所述技术方案，如未特别说明，均为常规技术；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。
实施例1：
假蕈状芽胞杆菌的分离及鉴定：
来自于陕西渭南市蒲城县土样2.5g置于50ml的无菌水中，30℃250rpm摇1h，之后取500μl土壤悬液在装有4.5ml无菌水的PA瓶中进行梯度稀释。取10-1、10-2、10-3、10-4、10-5这几个稀释度的土壤悬液分别加在培养基中进行涂布，培养24h、48h、72h、96h后观察平板菌落生长情况，将所有长出来的菌落分别挑出来，进行抑菌活性实验；选择抑菌率高且抑菌谱广的细菌；最终筛选出了假蕈状芽胞杆菌FJH2。
(1)形态特征
分离得到的假蕈状芽胞杆菌，在LB固体培养基上的菌落形态如图1所示，菌落呈米白色较扁平的根状。
(2)生理生化实验
生理生化表现为革兰氏染色显示呈阳性，不可水解淀粉，不可水解纤维素，甲基红试验为阴性，乙酰甲基甲醇实验为阴性，过氧化氢酶阳性。
(3)假蕈状芽胞杆菌的基因鉴定
用细菌DNA抽提试剂盒提取待测菌株的基因组DNA，具体操作步骤参照说明书。以提取的细菌基组DNA作为模板，对细菌进行扩增，扩增16S rRNA的引物：
27F:5＇-gtttgatcctggctcag-3＇
1492R:5＇-tacggctaccttgttacgactt-3＇；
序列经Blast16SrDNA序列进行同源性比对分析，结果分析表明其与菌株发现其与菌株Bacillus pseudomycoide的16SrDNA基因序列相似性最高，属于一株假蕈状芽胞杆菌，该细菌已于2022年1月10日送至中国典型培养物保藏中心保藏，地址:中国武汉武汉大学，分类命名：Bacillus pseudomycoides FJH2，保藏编号为：CCTCC NO:M2022049。
实施例2：
假蕈状芽胞杆菌的耐受性测试：
(1)耐pH范围实验：
将假蕈状芽胞杆菌种子液按照2％的接种量分别接种于初始pH不同的LB培养基中，在30℃、200r/min条件下培养，培养16h后取样测OD600。培养基的初始pH梯度设置为3、4、5、6、7、8、9、10(初始0D为0)。
LB培养基：蛋白胨10g，酵母浸粉5g，NaCl 10g，蒸馏水1000mL，pH7.0，121℃高压蒸汽灭菌20min。
PH 3 4 5 6 7 8 9 10
OD600 0 0 0 4.712 5.356 4.504 0 0
(2)耐盐浓度试验：
将假蕈状芽胞杆菌种子液按照2％的量分别接种于盐浓度不同的LB培养基中，在30℃、200r/min条件下培养，培养16h后取样测OD600。培养基的盐浓度梯度设置为1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％(初始0D为0)。
LB培养基：蛋白胨10g，酵母浸粉5g，NaCl 10g，蒸馏水1000mL，pH7.0，121℃高压蒸汽灭菌20min。
盐浓度 1％ 2％ 3％ 4％ 5％ 6％ 7％ 8％
OD600 3.298 3.51 4.5 3.122 2.248 1.516 0 0
(3)生长温度实验：
将假蕈状芽胞杆菌种子液按照2％的量接种于LB培养基中，在不同温度条件下200r/min摇床培养，培养16h后取样测OD600。培养基的温度梯度设置为20℃、28℃、37℃、40℃、45℃(初始0D为0)。
温度(℃) 20℃ 25℃ 30℃ 35℃ 40℃ 45℃
OD600 0.3 2.728 6.28 5.176 4.892 0
实施例3：
假蕈状芽胞杆菌对植物病原菌的抑制作用：
采用抑菌圈法测定假蕈状芽胞杆菌对病原菌的抑制能力。用LB活化假蕈状芽胞杆菌，将种子液适当稀释后涂布到PDA平板上，以涂布无菌水作为对照试验组。在长满病原真菌的PDA平板上用枪头进行打孔，挑取真菌菌块倒置接种在涂有假蕈状芽胞杆菌的PDA平板上，将平板置于37℃培养4d，测量真菌菌落直径，计算抑菌率，从而分析抑菌的效果。
本实验选取的植物病原菌有香蕉枯萎病菌(Fusarium oxysporumF.sp.Cubense)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、巴西青霉(Penicillium brasilianum)、茄病镰刀菌(Fusarium solani)、厚垣镰刀菌(Fusariumchlamydosporum)、青霉菌(Penicilliumglaucum)和毛霉菌(Mucor)。
PDA培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，蒸馏水1 000mL，pH为自然pH，115℃高压蒸汽灭菌30min。
注：D，对照平板菌落直径(mm)；d，实验平板菌落直径(mm)。
假蕈状芽胞杆菌对尖孢镰刀菌有非常好的防治效果，对引起这种植物病害的致病菌的抑制率达到91.47％；对茄病镰刀菌及毛霉也有一定的抑制效果，抑菌率达到了69.48％和59.76％。对青霉、厚垣镰刀菌、香蕉枯萎病菌、腐皮镰刀菌的抑制效果不佳。对各菌的抑菌率如下表所示。
由以上实施例可知，本发明提供了一株假蕈状芽胞杆菌FJH2，对于防治由尖孢镰刀菌及茄病镰刀菌引起的植物枯萎病具有良好的防治效果。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术邻域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应该视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 山东野田生物科技有限公司
<120> 一株假蕈状芽胞杆菌及在制备植物病原菌抑菌剂中的应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gtttgatcct ggctcag 17
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tacggctacc ttgttacgac tt 22

Claims (2)

1. 一株分离的假蕈状芽胞杆菌（Bacillus pseudomycoides），所述的假蕈状芽胞杆菌保藏编号为：CCTCC NO: M2022049。
2. 权利要求1所述的假蕈状芽胞杆菌在制备植物病原菌抑菌剂中的应用，所述的植物病原菌为香蕉枯萎病菌（Fusarium oxysporum F.sp. Cubense）、尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）、巴西青霉（Penicillium brasilianum）、茄病镰刀菌（Fusarium solani）、厚垣镰刀菌（Fusarium chlamydosporum）、灰绿青霉（Penicillium glaucum）和毛霉菌（Mucor）。
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