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CN116179430A - 一种贝莱斯芽孢杆菌b31及其应用 - Google Patents

一种贝莱斯芽孢杆菌b31及其应用 Download PDF

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CN116179430A
CN116179430A CN202310012674.2A CN202310012674A CN116179430A CN 116179430 A CN116179430 A CN 116179430A CN 202310012674 A CN202310012674 A CN 202310012674A CN 116179430 A CN116179430 A CN 116179430A
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strain
bacillus
wilt
tomato
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CN202310012674.2A
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郭庆港
李世鑫
马平
董丽红
苏振贺
曲远航
李社增
鹿秀云
张晓云
赵卫松
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Plant Protection Institute hebei Academy Of Agricultural And Forestry Sciences
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Abstract

本发明公开了一种贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)菌株B31，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No.24599。本发明还公开了含有B31的微生物菌剂，以及它们的用途。本发明菌株B31防效高。对番茄枯萎病等枯萎病的防效为87.53％‑97.12％；其次，防治谱广，对尖孢镰刀菌引起的番茄枯萎病、西瓜枯萎病、黄瓜等枯萎病都有较高的防效。此外，本发明菌株B31专化性强，药效持久性好、不易产生抗药性且环境友好。

Description

一种贝莱斯芽孢杆菌B31及其应用
技术领域
本发明属于生防微生物领域，具体涉及一种贝莱斯芽孢杆菌，还涉及利用该菌生产的微生物菌剂，以及它们的用途。
背景技术
尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)是一种世界性分布的土传病原真菌，其寄主范围十分广泛，可引起瓜类、茄科、香蕉、棉、豆科及花卉等100多种植物枯萎病的发生，且多年连作还会导致逐年加重，给瓜类等经济作物生产造成巨大损失。
目前，生产上主要依赖土壤熏蒸、嫁接技术及化学药剂防治设施蔬菜的枯萎病。但是这些防治方法存在以下问题：(1)土壤熏蒸方法不仅破坏土壤微生物区系平衡，而且造成严重的土壤及生态环境污染。(2)利用嫁接技术来对西瓜及黄瓜枯萎病的防治虽有一定的效果，但直接影响果实的品质及口感，且该方法费时费力。(3)利用化学农药防治存在易产生抗药性和环境污染问题。而利用生防微生物对植物病害进行生物防治因具有防效高、药效持久期长、专化性强、不易产生抗药性和对环境友好等优点而受到越来越多的重视。
目前，用于防治尖孢镰刀菌引起的枯萎病的生防微生物主要有哈茨木霉等木霉类真菌(张河庆等.四川农业科技.2020(05):35-37)、以及多粘类芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌等芽孢杆菌类细菌，其对枯萎病的防效一般为60％-79％。由于在不同的生态环境和不同作物条件下，存在的尖孢镰刀菌的类型不同，因此，必须不断筛选能防治对应环境条件下的尖孢镰刀菌的菌株，才能有针对性地解决问题。芽孢杆菌是自然界环境中的优势菌种，由于能产生多种抑菌活性物质(李宝庆等.中国农业科学.2010,43(017)：3547-3554)，并且能形成耐逆、抗热的芽孢而利于产品的开发和货架期的延长，安全性评价良好，易于规模化生产，因此成为开发微生物杀菌剂的重要资源。
镰刀菌酸(5-丁基-2-吡啶甲酸)为尖孢镰刀菌分泌的非专化型毒素，可增加寄主植物细胞膜的通透性，降低寄主细胞内的线粒体活性氧含量，阻碍ATP的合成，引起植物代谢紊乱，致使植物萎蔫死亡(张嘉城等.草业科学.2021,38(08):1513-1524)。同时镰刀菌酸能抑制多种微生物，包括有益微生物的生长和代谢(Bacon C W等.Journal of appliedmicrobiology.2006,100(1):185-194；Raza W,et al.Plant Pathology.2015,64(5):1041-1052)。因此，植物根际大量存在的尖孢镰刀菌通过产生镰刀菌酸而抑制根际生防细菌(陈巧环等.中国实验方剂学杂志.2021,27(11):7)，尤其是芽孢杆菌的生长和定殖(郭庆港等.植物保护学报.2013,40(1):45-50)，从而降低生防菌的生防效果。因此，筛选既耐受镰刀菌酸，又对尖孢镰刀菌具有较强拮抗活性的芽孢杆菌，将有望成为防治作物枯萎病的生防细菌，进而用于防治尖孢镰刀菌引起的植物枯萎病的有效手段。
发明内容
为解决尖孢镰刀菌所引起的植物枯萎病问题，本发明目的在于提供一种贝莱斯芽孢杆菌B31。
本发明另一目的在于提供含有上述贝莱斯芽孢杆菌B31的微生物菌剂。
本发明第三目的在于提供上述贝莱斯芽孢杆菌B31及其菌剂的用途。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案来实现。
本发明一种贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)菌株B31，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCCNo.24599。
本发明还提供了上述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)菌株B31在防治番茄枯萎病、西瓜枯萎病或黄瓜枯萎病上的应用。
本发明还提供了一种微生物菌剂，所述微生物菌剂含有上述贝莱斯芽孢杆菌菌株B31。
本发明还提供了上述微生物菌剂在防治番茄枯萎病、西瓜枯萎病或黄瓜枯萎病上的应用。
所述番茄枯萎病的病原菌为尖孢镰刀菌番茄专化型(Fusarium oxysporumf.sp.lycopersici Snyder et Hansen)。
所述西瓜枯萎病的病原菌为尖孢镰刀菌西瓜专化型(Fusarium oxysporumf.sp.Hiveum(E.F.Smith)Wollen)。
所述黄瓜枯萎病的病原菌为尖孢镰刀菌黄瓜专化型(Fusarium oxysporum(Schl.)F.sp cucumerinum Owen)。
一种基因工程菌，所述基因工程菌的出发菌株为上述贝莱斯芽孢杆菌菌株B31，且所述的基因工程菌具有防治番茄枯萎病、西瓜枯萎病或黄瓜枯萎病的功能。
与现有技术相比，本发明所具有的有益技术效果：(1)防效高。对番茄枯萎病的防效为97.12％，对西瓜枯萎病的防效为92.09％，对黄瓜枯萎病的防效为87.53％。(2)防治谱广，对尖孢镰刀菌引起的番茄枯萎病、西瓜枯萎病、黄瓜等枯萎病都有较高的防效。(3)本发明菌株B31是经过80℃高温处理后筛选出来的菌株，其耐高温，能形成耐逆抗热的芽孢而利于产品的开发和货架期的延长。(4)本发明菌株专化性强，药效持久性好、不易产生抗药性且环境友好。
生物保藏：本发明贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)菌株B31是本发明人于2021年3月在河北邯郸肥乡县发病大棚的健康番茄植株及其土壤中采集的样品，并经过80℃水浴筛选获得的，已于2022年3月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；其保藏编号为CGMCCNo.24599。
附图说明
图1为菌株B31的16S rDNA基因的PCR扩增电泳图谱。
图2为基于16S rDNA基因序列构建的菌株的B31系统发育树图。
图3为菌株B31的gyrB基因的PCR扩增电泳图谱。
图4为基于gyrB基因序列构建的菌株B31的系统发育树图。
图5为经过B31菌株处理的番茄产量柱形图。
具体实施方式
下面以具体实施例对本发明做进一步说明，但不对本发明保护范围构成任何限制。
实施例1耐受镰刀菌酸且对尖孢镰刀菌具有拮抗作用的生防微生物的筛选
按照如下方法进行：
(1)、在黄瓜、番茄、西瓜枯萎病发生地，在健康植株根际共采集采集土壤样品48份，每份土壤样品1g，分别将土壤样品加入到装有10mL蒸馏水的三角瓶中，在30℃、180rpm条件下震荡30min，取出后室温静置30min；再取上清液1mL，置于80℃下处理15min，室温下冷却，分别获得以芽孢状态存在的芽孢杆菌的土壤悬浮液。
(2)、将步骤(1)获得的土壤悬浮液用蒸馏水稀释100倍；取稀释后的土壤悬浮液100μL，均匀地涂布在含有20μg/mL镰刀菌酸的LB培养基(按照常规方法制备LB培养基，)上，并在37℃培养12h，挑选生长旺盛的菌落，即为耐受镰刀菌酸的芽孢杆菌。
(2)抑菌试验：分别以保存于河北省农林科学院植物保护研究所植物病害生物防治实验室的番茄、西瓜和黄瓜枯萎病病原菌尖孢镰刀菌番茄专化型(Fusarium oxysporumf.sp.lycopersici FQ143)、尖孢镰刀菌西瓜专化型(Fusarium oxysporum f.sp.NiveumXG0010)和尖孢镰刀菌黄瓜专化型为靶标菌(Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum FOC1-2-11)，将病原菌提前接种于PDA平板上，25℃恒温培养，直至平板上菌丝长满整个培养皿，然后用打孔器打取直径6mm的菌块，接种在新的预先倒好的直径为9cm的PDA平板中央。在距离其2.5cm处接种上述筛选出来的耐受镰刀菌酸的细菌，25℃培养箱培养5d，筛选耐镰刀菌酸且三次抑菌活性测定抑菌带均在0.5cm以上的细菌。
结果从500个微生物中筛选出68个对三种病原菌都有抑菌效果(抑菌带>0.5cm)并且耐受镰刀菌酸的生防菌菌株。
实施例2生防菌发酵液的制备
将实施例1中所得的68个生防菌分别接种于5mL液体LB培养基中，180rpm、37℃振荡培养12h，按1％的比例转接于200mL LB液体培养基中，180rpm、37℃振荡培养48h，得到不同菌株的发酵液，利用平板计数法计算发酵液中的菌体浓度(CFU/mL)。
实施例3对黄瓜枯萎病具有防效的生防菌株的筛选试验
按照如下方法进行：
(1)黄瓜(中农6号，高感黄瓜枯萎病)种子催芽及育苗：将黄瓜种子在55℃温水中浸泡30min，清水冲洗，再用清水浸泡8h，浸泡后用湿纱布包裹，在25℃温箱中催芽过夜，后在蛭石中育苗。
(2)生防菌发酵液施用：在黄瓜长出两叶一心时，施第一次生防菌(实施例2制备的生防菌发酵液)，每棵苗根部施3mL菌液。
(3)病原菌FOC 1-2-11(黄瓜专化型)菌液的制备及拌土：用打孔器打取直径6mm的尖孢镰刀菌菌块，接种在PDB液体培养基中，25℃，180rpm摇培5天，经过灭菌纱布过滤后对孢子计数，1L病原菌菌液与20kg灭菌土在拌土机中拌匀，最终浓度在5.0×105孢子/克土。
(4)移苗：接生防菌3天后移苗，移苗过程中黄瓜苗根部对齐，用剪刀剪去须根(留下两厘米)，做伤根处理，后移栽到小花盆中，每个处理设置三个重复。
(5)施第二次生防菌：移苗三天后施第二次生防菌(实施例2制备的生防菌发酵液)，用法用量同第一次施用生防菌，按时浇水观察，10天后调查病情。
苗期黄瓜枯萎病的分级标准(参考周红梅，毛爱军等报道的标准进行病情调查)。
病情指数＝∑(各级病株数×各级代表值)/(调查总株数×最高级代表值)×100(以下同)。
防治效果(％)＝[(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数]×100(以下同)。
(6)挑选防效在60％以上的菌株进行复筛，最终挑选出5株防效高的生防菌。
结果在68株耐受镰刀菌酸的拮抗细菌中，有个菌株B31对黄瓜枯萎病的初筛防治效果为87.53％，复筛防治效果为85.72％。说明B31菌株对黄瓜枯萎病的防效高并且稳定。
实施例4对番茄枯萎病具有防效的生防菌的筛选试验
按照如下方法进行：
(1)番茄种子(娜美，高感番茄枯萎病)催芽及育苗：番茄种子清水冲洗，清洗后用湿纱布包裹，在25℃温箱中催芽过夜，后在蛭石中育苗。
(2)生防菌发酵液施用：在番茄长出两叶一心时，施第一次生防菌(实施例2制备的生防菌发酵液)，将150mL发酵液稀释一倍，灌入育苗盘中。
(3)病原菌FQ 143(番茄专化型)菌液的制备：用打孔器打取直径6mm的尖孢镰刀菌菌块，接种在PDB培养基中，25℃，180rpm摇培5d，经灭菌纱布过滤后对孢子计数，浓度为4.×107孢子/毫升。
(4)移苗：接生防菌3天后移苗，移苗过程中番茄苗根部对齐，用剪刀剪去须根(留下两厘米)，做伤根处理，病原菌菌液浸泡根部以下60min，后移栽到花盆中，每个处理设置三个重复。
按时浇水观察，约7天后第一次调查病情，两周后第二次。
苗期番茄枯萎病的分级标准(参考柏敏战，郑贵彬等报道的标准进行病情调查)。
结果在68株耐受镰刀菌酸的拮抗细菌中发现菌株B31对番茄枯萎病的7天防治效果为97.12％，15天防治效果为100％。说明B31菌株对番茄枯萎病的防治效果好。
实施例5对西瓜枯萎病具有防效的生防菌株的筛选试验
按照如下方法进行：
(1)西瓜种子(早佳84-24，高感西瓜枯萎病)催芽及育苗：将西瓜种子在55℃温水中浸泡30min，期间不断搅拌，清水冲洗，再用清水浸泡8h，浸泡后用湿纱布包裹，在25℃温箱中催芽过夜，后在蛭石中育苗。
(2)生防菌发酵液施用：在西瓜长出两叶一心时，施第一次生防菌(实施例2制备的生防菌发酵液)，每棵苗根部施3mL菌液。
(3)病原菌XG0010(西瓜专化型)菌液的制备及拌土：用打孔器打取直径6mm的尖孢镰刀菌打菌块，接种在PDB培养基中，25℃，180rpm摇培5d，经灭菌纱布过滤后对孢子计数，1L菌液与20kg灭菌土在拌土机中拌匀，最终浓度在5.0×105孢/克土。
(4)移苗：接生防菌3天后移苗，移苗过程中西瓜苗根部对齐，用剪刀剪去须根(留下两厘米)，做伤根处理，后移栽到花盆中，每个处理设置三个重复。
(4)施第二次生防菌：移苗3天后施第二次生防菌(实施例2制备的生防菌发酵液)，用法用量同第一次施用生防菌，按时浇水观察，10天后调查病情。
苗期西瓜枯萎病的分级标准(参考闫闻、王喜庆等报道的标准进行病情调查)。
结果在68株耐受镰刀菌酸的拮抗细菌中发现菌株B31对西瓜枯萎病的7天防治效果为92.09％，15天防治效果分别为84.26％，说明B31对西瓜枯萎病的防治效果高。
实施例6本发明所选菌株B31的分类鉴定
按照如下方法进行：
采用改良的CTAB法提取菌株B31基因组；分别采用16SrDNA、gyrB基因序列的通用引物对B31进行扩增，其中16S rDNA序列的通用引物为：27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；1492R：5'-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3'。gyrB基因的通用引物为：gyrB-F：5'-TTGRCGGHRGYGGHTATAAAGT-3'，gyrB-R：5'-TCCDCCSTCAGARTCWCCCTC-3'。PCR产物经1％琼脂糖凝胶进行电泳检测，委托上海生工生物工程有限公司进行测序。所的序列见序列表(SEQID No.1和SEQ ID No.2)；将所得序列在NCBI的GenBank数据库中进行同源性分析和多序列比对，根据比对结果应用MEGA软件构建系统发育树。
结果PCR扩增所得B31菌株的16SrDNA基因是大小为1515bp的DNA分子片段(见图1)；PCR扩增所得B31菌株的gyrB基因是大小为984bp的DNA分子片段(见图2)。BLAST比对结果菌株B3116SrDNA基因序列与贝莱斯芽孢杆菌的16SrDNA基因序列相似度最高，可达99.93％；菌株B31gyrB基因序列与贝莱斯芽孢杆菌的gyrB基因序列相似度最高，可达97.56％。结合系统发育树图(见图2和图4)可知B31菌株属于芽孢杆菌属贝莱斯芽孢杆菌种，并且与任何已知的贝莱斯芽孢杆菌菌株不同，是一个新的贝莱斯芽孢杆菌菌株。
实施例7B31发酵液、菌体悬浮液及上清液对番茄枯萎病的室内防效试验
按照如下方法进行：
(1)番茄种子催芽及育苗：番茄种子清水冲洗，清洗后用湿纱布包裹，在25℃温箱中催芽过夜，后在蛭石中育苗。
(2)B31生防菌发酵液、菌体及上清的制备：将生防菌接种于5mL液体LB培养基中，180rpm、37℃振荡培养12h，按1％的比例转接于300mL LB液体培养基中，180rpm、37℃振荡培养48h，得到发酵液，利用平板计数法计算发酵液中的菌体浓度(CFU/mL)。取150mL生防菌发酵液离心，重悬菌体后，和上清分别定容到150mL。
(3)B31发酵液、菌体及上清的施用：在番茄长出两叶一心时，将150ml发酵液、菌体及上清稀释一倍，灌入育苗盘中利于根部充分定殖B31菌株或者吸收抑菌物质等活性成分。
(4)病原菌菌液的制备：用打孔器打取直径6mm的尖孢镰刀菌菌块，接种在PDB培养基中，25℃，180rpm摇培5d，经灭菌纱布过滤后对孢子计数，浓度为4.5×107孢子/毫升。
(5)移苗：接生防菌发酵液、菌体及上清3天后移苗，移苗过程中番茄苗根部对齐，用剪刀剪去须根(留下两厘米)，做伤根处理，病原菌菌液浸泡根部以下60min，后移栽到花盆中。
(6)按时浇水观察，约10天后调查病情。约20天后第二次调查病情。
结果(见表1)菌株B31发酵液、菌体悬浮液及无菌体上清液对番茄枯萎病的防治效果分别为90.01％、89.73％、62.03％。说明B31对番茄枯萎病的防效高。
表1 B31菌体悬浮液、无菌体上清液和发酵液对番茄枯萎病的防治结果
序号 处理 病情指数 防效(％)
1 CK 73.15±24.25a
2 B31菌体悬浮液 7.51±11.64b 89.73
3 B31发酵液 7.31±3.46b 90.01
4 B31无菌体上清液 27.78±3.46b 62.03
注ab：表中数据为平均数±标准误。同列数据后不同字母表示Duncan式新复极差法检验在P＜0.05水平差异显著。
实施例8本发明菌株B31对番茄枯萎病的田间防效及增产试验
按照如下方法进行：
在河北省保定市定兴县设施大棚番茄枯萎病发病严重地块评价了B31对番茄枯萎病的田间防效。番茄品种为普林旺斯，在番茄移栽之前，每株番茄苗穴施20mL生防菌B31发酵液，处理12h后进行移栽。移栽后采用滴灌的方式施用B31发酵液(浓度1亿CFU/mL)，施用量为500L/亩；每个处理5行，4次重复。设清水处理为对照。在番茄开花挂果期调查枯萎病的发病率，生长期结束后测产比较B31处理区和非处理区番茄产量及红果率。
成熟期番茄枯萎病的分级标准：0级：植株健康，无病叶，生长正常；1级：植株四分之一以下叶片黄化或萎蔫；2级：植株四分之一以上、二分之一以下叶片黄化或萎蔫下垂；3级：植株二分之一以上、四分之三以下叶片黄化或萎蔫下垂；4级：四分之三以下叶片黄化或萎蔫下垂，或者全株严重萎蔫以致枯死。
结果本发明菌株B31处理区番茄枯萎病的病情指数为13.28，对照区病情指数为54.27，其在田间对番茄枯萎病的防效为75.53％。经过B31处理后(见图5)，番茄产量增加17.23％，并且促进番茄由青果转为红果，红果率增加35.60％。说明菌株B31对番茄枯萎病的田间防效高，大大提高了番茄产量，红果率更是显著增加。

Claims (8)

1.一种贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)菌株B31，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No.24599。
2.权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)菌株B31在防治番茄枯萎病、西瓜枯萎病或黄瓜枯萎病上的应用。
3.一种微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂含有权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌菌株B31。
4.权利要求3所述的微生物菌剂在防治番茄枯萎病、西瓜枯萎病或黄瓜枯萎病上的应用。
5.根据权利要求2或4所述的应用，其特征在于，所述番茄枯萎病的病原菌为尖孢镰刀菌番茄专化型(Fusarium oxysporum f.sp.lycopersici Snyder et Hansen)。
6.根据权利要求2或4所述的应用，其特征在于，所述西瓜枯萎病的病原菌为尖孢镰刀菌西瓜专化型(Fusarium oxysporum f.sp.Hiveum (E.F.Smith)Wollen)。
7.根据权利要求2或4所述的应用，其特征在于，所述黄瓜枯萎病的病原菌为尖孢镰刀菌黄瓜专化型(Fusarium oxysporum(Schl.)F.sp cucumerinum Owen)。
8.一种基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌的出发菌株为权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌菌株B31，且所述的基因工程菌具有防治番茄枯萎病、西瓜枯萎病或黄瓜枯萎病的功能。
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