CN115786218B

CN115786218B - 一株贝莱斯芽孢杆菌及其应用

Info

Publication number: CN115786218B
Application number: CN202310011217.1A
Authority: CN
Inventors: 李立新; 王茂淋; 徐嘉莉; 薛逢伯; 冯献忠; 王东梅; 黄咏雪; 李忠悦
Original assignee: Northeast Forestry University
Current assignee: Northeast Forestry University
Priority date: 2023-01-05
Filing date: 2023-01-05
Publication date: 2024-06-25
Anticipated expiration: 2043-01-05
Also published as: CN115786218A

Abstract

本发明公开了一株贝莱斯芽孢杆菌及其应用，属于微生物技术领域。本发明公开了芽孢杆菌，所述芽孢杆菌为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)，其菌株编号为YJD‑SF2，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCCNo.25978。本发明还公开了所述芽孢杆菌在细极链格孢菌、立枯丝核菌和大豆疫霉病菌防治中的应用。本发明的贝莱斯芽孢杆菌YJD‑SF2具有稳定、广谱的抗菌性能，对细极链格孢菌、大豆疫霉病菌和立枯丝核菌三种植物病原真菌具有抑制作用。

Description

一株贝莱斯芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，尤其是涉及一株贝莱斯芽孢杆菌及其应用。

背景技术

植物在生长过程中会受到各种生物胁迫和非生物胁迫的影响，常见的胁迫，比如：病虫害、盐碱、干旱等，通常会威胁到作物的正常生长并造成严重减产，严重制约了我国的农业生产。生物防治作为近年来兴起的一种环保的替代方法，使用能够缓解土壤盐碱胁迫以促进作物生长发育的促生菌或者抑制病原体种群的菌剂，有效提升农作物产量或者治理植物病害。然而，目前还没有如何使用生防菌促进植物的生长和提高植物抗逆性，实现生物防治植物病害方面的研究。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：如何使用生防菌促进植物的生长和抗逆性，实现生物防治植物病害。

为了解决以上技术问题，本发明首先提供了一种芽孢杆菌，具体为一种贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)。

本发明所提供贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)，其菌株编号为YJD-SF2，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.25978。以下简称贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)YJD-SF2。

本发明还提供了一种芽孢杆菌的培养物，是将前述芽孢杆菌在微生物培养基中培养得到的物质。

所述培养物含有贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)YJD-SF2。

上述培养物中，所述培养物是将贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)YJD-SF2在微生物培养基中培养得到的发酵产物。

上述培养物中，所述物质包括所述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)YJD-SF2和贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)YJD-SF2的代谢物。

上述培养物中，所述微生物培养基可为固体培养基或液体培养基。

术语“培养物”是指经人工接种和培养后，长有微生物群体的液体或固体产物(培养容器内的所有物质即发酵产物)的统称。即通过将微生物进行生长和/或扩增而获得的产物，其可以是微生物的生物学纯培养物，也可以含有一定量的培养基、代谢物和/或培养过程中产生的其他成分。术语“培养物”还包括通过将微生物传代而获得的传代培养物，其可以是某一代的培养物，也可以是若干代的混合物。

本发明还提供了一种菌剂，所述菌剂含有前述贝莱斯芽孢杆菌或/和前述贝莱斯芽孢杆菌的代谢物或/和前所述的培养物。

具体而言，本发明中的YJD-SF2菌剂的制备方法可包括：挑取LB固体培养基培养三天的单菌落接种于100mL LB液体培养基中，28℃、140r/min培养48h，得到OD_600nm值约为1.0的菌液(2×10⁸·CFU/mL)。

本文中，所述代谢物可从贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)YJD-SF2的发酵液中获得。所述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)YJD-SF2的代谢物可为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)YJD-SF2的无菌代谢物或贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)YJD-SF2的含菌代谢物。贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)YJD-SF2的无菌代谢物(无菌发酵滤液)具体可按照如下方法制备，在液体培养基中培养贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)YJD-SF2，过滤除去液体培养物(发酵液)中的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)YJD-SF2即得到贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)YJD-SF2的无菌代谢物。贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)YJD-SF2的含菌代谢物具体可按照如下方法制备，在液体发酵培养基中培养贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)YJD-SF2，收集发酵液(含有贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)YJD-SF2和分泌到液体培养基内的物质)，该发酵液即为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)YJD-SF2的含菌代谢物。

上述菌剂的活性成分可为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)YJD-SF2或/和贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)YJD-SF2的代谢物或/和上述培养物，上述菌剂的活性成分还可含有其他生物成分或非生物成分，上述菌剂的其他活性成分本领域技术人员可根据菌剂的效果确定。

上述菌剂中，所述菌剂还可包括载体。所述载体可为固体载体或液体载体。

所述固体载体可为矿物材料、生物材料；所述矿物材料可为草炭、粘土、滑石、高岭土、蒙脱石、白碳、沸石、硅石和硅藻土中的至少一种；所述生物材料可为各类作物的秸秆、松壳、稻草、花生壳、玉米粉、豆粉、淀粉、草炭和动物的粪便中的至少一种；所述液体载体可为水；所述菌剂中，贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)YJD-SF2或/和贝莱斯芽孢杆菌(Ba cillus velezensis)YJD-SF2的代谢物可以以被培养的活细胞、活细胞的发酵液、细胞培养物的滤液或细胞与滤液的混合物的形式存在。所述菌剂的剂型可为多种剂型，如液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂或水分散粒剂。

根据需要，所述菌剂中还可添加表面活性剂(如吐温20、吐温80等)、粘合剂、稳定剂(如抗氧化剂)、pH调节剂等。

进一步地，上述菌剂抑制立枯丝核菌、细极链格孢菌和大豆疫霉菌中的至少一种。

本发明还提供了一种抗盐和/碱胁迫制剂，所述抗盐胁迫制剂含有前述的芽孢杆菌或/和前述的芽孢杆菌的代谢物或/和前述的培养物或/和前述的菌剂。

本发明还提供了一种前述的芽孢杆菌、前述的芽孢杆菌的代谢物、前述的培养物、前述的菌剂、前述的抗盐和/碱胁迫制剂的下述任意一种应用：

A1)、促进植物生长；

A2)、制备促进植物生长的产品；

A3)、抑制植物病原菌；

A4)、制备植物病原菌的产品；

A5)、预防和/或治疗植物病害；

A6)、制备预防和/或治疗植物病害的产品；

A7)、提高植物抗逆性中的应用；

A8)、制备提高植物抗逆性的产品中的应用；

A9)、生产蛋白酶；

A10)、生产淀粉酶；

A11)、生产脂肽；

A12)、生产ACC脱氨酶；

A13)、生产吲哚乙酸；

A14)、植物固氮；

A15)、制备用于植物固氮的产品；

A16)、制备挥发性抑菌物质；

A17)、制备挥发性促生物质。

A1)和A2)所述的促进植物生长具体可为促进植物根的生长。

A7)和A8)所述的所述的提高植物抗逆性，具体可为提高植物的耐盐碱能力。

A3)或A4)所述病原菌可为真菌，具体可为水稻纹枯病菌-立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、大豆疫霉病菌(Phytophthora sojae)、细极链格孢菌(Alternariatenuissima)中的至少一种。

进一步的，上述应用中所述植物科为单子叶植物或双子叶植物，所述单子叶植物可为下述b1)、b2)或b3)：

b1)、禾本科；

b2)、稻属或玉蜀黍属；

b3)、水稻或玉米。

所述植物为双子叶植物，所述双子叶植物为下述a1)、a2)或a3)：

a1)、十字花科；

a2)、拟南芥属；

a3)、拟南芥。

本发明还提供了一种提高植物抗逆性或/和促进植物生长的方法，所述方法包括用前述芽孢杆菌、前述芽孢杆菌的代谢物、前述培养物、前述抗盐和/碱胁迫制剂处理植物或植物的培养基质。

所述用前述芽孢杆菌、前述芽孢杆菌的代谢物、前述培养物、前述抗盐和/碱胁迫制剂处理植物或植物的培养基质包括将所述芽孢杆菌、前述芽孢杆菌的代谢物、前述培养物、前述抗盐和/碱胁迫制剂添加到植物的培养基质中。

所述抗逆性可为提高植物的耐盐碱能力。所述促进植物生长可为促进植物根的生长。

本发明还提供了一种预防和/或治疗植物病害的方法，所述方法包括用前述芽孢杆菌、前述芽孢杆菌的代谢物、前述培养物、前述菌剂处理植物。

进一步地，上述方法中所述病害由立枯丝核菌、细极链格孢菌和大豆疫霉菌中的至少一种病原菌引起。

本发明取得的有益技术效果如下：

1、本发明的贝莱斯芽孢杆菌YJD-SF2具有稳定、高效、广谱的抗菌性能，对细极链格孢菌、大豆疫霉病菌和立枯丝核菌三种植物病原菌具有抑制作用。贝莱斯芽孢杆菌YJD-SF2对细极链格孢菌的抑制率达55.23％,对大豆疫霉病菌的抑制率达74.52％，对立枯丝核菌的抑制率达51.28％。

2、贝莱斯芽孢杆菌YJD-SF2能够产生脂肽、蛋白水解酶、淀粉酶和挥发性抑菌物质以及无菌发酵液，抑制病原菌菌丝的生长和孢子萌发。

3、贝莱斯芽孢杆菌YJD-SF2能够提高拟南芥、玉米、水稻在盐碱胁迫下的抗性，促进拟南芥在盐碱胁迫下主根的生长。

4、贝莱斯芽孢杆菌YJD-SF2能产生植物生长素(吲哚乙酸或IAA)、ACC脱氨酶、铁载体、挥发性促生物质并具有固氮能力，促进植物生长，提高植物生物量。

保藏说明

贝莱斯芽孢杆菌拉丁名：Bacillus velezensis

菌株编号：YJD-SF2

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏机构简称：CGMCC

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2022年10月28日

保藏中心登记入册编号：CGMCC No.25978。

附图说明

图1为贝莱斯芽孢杆菌YJD-SF2的菌体形态。

图2为不同pH条件下贝莱斯芽孢杆菌YJD-SF2的生长曲线。

图3为不同氯化钠浓度下贝莱斯芽孢杆菌YJD-SF2的生长曲线。

图4为不同碳酸氢钠浓度下贝莱斯芽孢杆菌YJD-SF2的生长曲线。

图5为贝莱斯芽孢杆菌YJD-SF2产氢能力检测。

图6为贝莱斯芽孢杆菌YJD-SF2的系统发育树。

图7为贝莱斯芽孢杆菌YJD-SF2能产生蛋白酶的检测。

图8为贝莱斯芽孢杆菌YJD-SF2能产生淀粉酶的检测。

图9为贝莱斯芽孢杆菌YJD-SF2能产生IAA的检测。

图10为贝莱斯芽孢杆菌YJD-SF2能产生ACC脱氨酶的检测。

图11为贝莱斯芽孢杆菌YJD-SF2产生脂肽的检测。

图12为贝莱斯芽孢杆菌YJD-SF2具有固氮能力的检测。

图13为贝莱斯芽孢杆菌YJD-SF2不具有产生脂肪酶能力的检测。

图14为贝莱斯芽孢杆菌YJD-SF2不具有产生磷酸酶能力的检测。

图15为贝莱斯芽孢杆菌YJD-SF2具有产生铁载体能力的检测。

图16为贝莱斯芽孢杆菌YJD-SF2的抑菌谱。

图17为贝莱斯芽孢杆菌YJD-SF2产生抑制性挥发物质的检测。

图18为贝莱斯芽孢杆菌YJD-SF2产生无菌发酵液的检测。

图19为贝莱斯芽孢杆菌YJD-SF2离体叶片实验的结果一。

图20为贝莱斯芽孢杆菌YJD-SF2离体叶片实验的结果二。

图21为贝莱斯芽孢杆菌具有产生挥发性促生物质的检测。

图22为贝莱斯芽孢杆菌YJD-SF2提高拟南芥盐碱胁迫抗性的检测。

图23为贝莱斯芽孢杆菌YJD-SF2提高玉米盐碱胁迫抗性的结果一。

图24为贝莱斯芽孢杆菌YJD-SF2提高玉米盐碱胁迫抗性的结果二。

图25为贝莱斯芽孢杆菌YJD-SF2提高水稻碱胁迫抗性的结果一。

图26为贝莱斯芽孢杆菌YJD-SF2提高水稻碱胁迫抗性的结果二。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

PDA培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，用蒸馏水定容至1000mL，121℃灭菌15min。

LB液体培养基：酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，NaCl 10g，用蒸馏水定容至1000mL，调节pH至7.0-7.2，121℃灭菌15min。

LB固体培养基：酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，NaCl 10g，琼脂20g，用蒸馏水定容至1000mL，调节pH至7.0-7.2，121℃灭菌15min。

水稻纹枯病菌-立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)由中国科学院分子植物科学卓越创新中心何祖华团队提供，在文献“DongdongNiu,Xin Zhang,Xiaoou Song,ZhihuiWang,Yanqiang Li,Lulu Qiao,Zhaoyun Wang,Junzhong Liu,Yiwen Deng,Zuhua He,Donglei Yang,Renyi Liu,Yanli Wang,Hongwei Zhao.Deep Sequencing Uncovers RiceLong siRNAs and Its Involvement in Immunity Against Rhizoctoniasolani.Phytopathology.2017-09-07,DOI:10.1094/phyto-03-17-0119-r”中公开(菌株号为AG1-IA，下述实施例中简称为立枯丝核菌)，公众可从申请人获得上述生物材料，所得上述生物材料只为重复本发明的实验所用，不可作为其它用途使用。

大豆疫霉病菌(Phytophthora sojae)由东北地理与农业生态研究所冯献忠实验室提供，在文献“Dongmei Wang,Xiangxiu Liang,Yazhou Bao,Suxin Yang,Xiong Zhang,Hui Yu,Qian Zhang,Guangyuan Xu,Xianzhong Feng,Daolong Dou.A malectin-likereceptor kinase regulates cell death and pattern-triggered immunity insoybean.EMBO Reports.2020-09-14.DOI:10.15252/embr.202050442”中公开(菌株号为XEG1，下述实施例中简称为立枯丝核菌)，公众可从申请人获得上述生物材料，所得上述生物材料只为重复本发明的实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的细极链格孢菌由本实验室保存，其菌株编号为CBS 118809_2，细极链格孢菌CBS 118809_2的5.8s序列在NCBI中Genbank编号为ON231780.130(2022-04-19)，下述实施例中简称为细极链格孢菌或者链格孢菌，公众可从申请人获得上述生物材料，所得上述生物材料只为重复本发明的实验所用，不可作为其他用途使用。

下述实施例采用GraphPad Prism 8统计软件对数据进行处理，实验结果以平均值±标准偏差表示，*表示具有显著性差异(P＜0.05)，**表示具有极显著性差异(P＜0.01)，***表示具有极显著性差异(P＜0.001)。

实施例1、贝莱斯芽孢杆菌(Bacillussp.)YJD-SF2的分离、鉴定与保藏

一、菌株YJD-SF2的分离

在45mL无菌蒸馏水中加入5g土壤样品(采自黑龙江省绥化市安达市经济技术开发区安发大道6号附近盐碱地植物根际土壤)，搅拌15min，静止放置10min，然后取上清液1mL，加入盛有9mL无菌水中的无菌试管中充分混匀(此时稀释度记为10^-1)，然后从此试管中吸取1mL加入到另一盛有9mL无菌水的无菌试管中混合均匀，以此类推制成10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6不同稀释度的菌悬液。将各稀释度取0.1mL均匀涂布在LB固体培养基上，30℃恒温静置培养2-3d。

挑取LB固体培养基上的单菌落，反复纯化3次以上直到出现的都是同样形态特征的菌落，得到纯菌落。将筛选到的一株细菌命名为菌株YJD-SF2。

二、菌株YJD-SF2的鉴定

1、形态学鉴定

(1)将菌株YJD-SF2接种至LB固体培养基上，30℃培养3天后观察单菌落形态；菌落表面略粗糙，乳白色。

(2)菌株YJD-SF2经染色后，鉴定为革兰氏阳性菌；

(3)采用光学显微镜观察菌株YJD-SF2的形态。结果如图1所示，YJD-SF2呈杆状，长度在1-3μm之间，无纤毛或者鞭毛。

2、生理生化实验

2.1、贝莱斯芽孢杆菌YJD-SF2的种子液制备

配置5ml液体LB，挑取适量YJD-SF2菌剂加入到液体LB中，置于37℃130rpm的摇床中培养12h，调整OD_600nm＝1.0，即为YJD-SF2的种子液。

2.2、贝莱斯芽孢杆菌YJD-SF2的pH生长特性

配置液体LB，并调节液体LB的pH分别为3、4、5、6、7、8、9、10。每个pH梯度需要液体LB 10ml，将100μL的OD_600nm＝1.0的菌株YJD-SF2种子液(由液体LB培养基和菌株YJD-SF2组成)加入到10ml LB液体中后置于37℃130rpm的摇床中培养，每隔2h测量一次OD_600nm。

实验结果如图2，结果表明，菌株YJD-SF2在pH＝5-9的条件下能够正常生长，在pH＝10的条件下无法生长，且最适的生长pH为6-7之间，生长达到10-14h时达到最大值。菌株YJD-SF2的生长pH范围很广。

2.3、贝莱斯芽孢杆菌YJD-SF2在不同氯化钠浓度下的生长

配置液体LB，并向液体LB加入氯化钠得到氯化钠含量分别为0.4M、0.8M、1.2M、1.6M和2.0M的6种含氯化钠的液体培养基，将100μL的OD_600nm＝1.0的菌株YJD-SF2种子液(由液体LB培养基和菌株YJD-SF2组成)分别加入到10ml含氯化钠的液体培养基中后置于37℃130rpm的摇床中培养。每隔2h测量一次OD_600nm。每个处理设3个重复。

实验结果如图3，结果表明，菌株YJD-SF2在氯化钠浓度为2.0M的条件下无法生长，在浓度为0-1.6M的条件下能够生长，说明YJD-SF2具有耐盐的能力。

2.4、贝莱斯芽孢杆菌YJD-SF2在不同碳酸氢钠浓度下的生长

配置液体LB，并向液体LB中加入碳酸氢钠得到碳酸氢钠含量分别为10mM、20mM、30mM、40mM、50mM的6种含碳酸氢钠的液体培养基，将100μL的OD_600nm＝1.0的菌株YJD-SF2种子液(由液体LB培养基和菌株YJD-SF2组成)分别加入到10mL 6种含碳酸氢钠的液体培养基中后置于37℃130rpm的摇床中培养。每隔2h测量一次OD_600nm。每个处理设3个重复。

实验结果如图4，结果表明，贝莱斯芽孢杆菌YJD-SF2在每个碳酸氢钠浓度下都能生长，说明YJD-SF2具有良好的耐碱能力。

2.5、贝莱斯芽孢杆菌YJD-SF2分泌氢离子的能力检测

配置200ml的液体LB，加入10ml的OD_600nm＝1.0的菌株YJD-SF2种子液(由液体LB培养基和菌株YJD-SF2组成)(接种量为5％)，置于37℃130rpm的摇床中培养。每隔2h取2ml的液体，离心后测量pH。实验设3个重复。

实验结果如图5，结果表明：从加入菌株YJD-SF2菌液开始，溶液的pH逐渐下降，在5h左右降至最低。说明菌株YJD-SF2具有产生氢离子的能力。

三、16S rDNA序列同源性分析

菌株YJD-SF2的16S rDNA如SEQ ID No.1所示：

SEQ ID No.1：

TGTAGTCGAGCGGAAGATGGGAGCTTGCTCCCTNATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTNTGAACCGCATGGTTCAGACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCNACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCAAATAGGGCGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGKGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGYAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTNANANNNGAAGTCGGTGAGGTAACCTTATG

利用Clustal X软件将SEQ ID No.1所示的序列和GenBank的16S ribosomal RNAsequences(Bacteria andArchaea)数据库中的序列进行比对。结果表明，菌株YJD-SF2与Bacillus velezensis strain CBMB205的同源性最高，达到99.14％。构建系统发育树结果如图6所示，贝莱斯芽孢杆菌YJD-SF2与贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis strainCBMB205的亲缘性最高，故鉴定其为贝莱斯芽孢杆菌。

四、贝莱斯芽孢杆菌YJD-SF2的保藏

菌种保存：将贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)YJD-SF2的单菌落接种至LB液体培养基，30℃培养16h，得到培养菌液。将1体积份培养菌液和1体积份80％(v/v)甘油水溶液混匀，-80℃保存。

根据上述形态学、生理生化特性和16S rDNA序列同源性分析结果，将步骤一中分离纯化得到的菌株YJD-SF2鉴定为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)。贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)YJD-SF2已于2022年10月28日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(China General Microbiological Culture Collection Center,简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC No25978。以下简称贝莱斯芽孢杆菌YJD-SF2、菌株YJD-SF2或YJD-SF2。

实施例2、贝莱斯芽孢杆菌YJD-SF2产酶能力及其它能力测定

一、贝莱斯芽孢杆菌YJD-SF2产生蛋白酶能力的检测

1、培养基配制

脱脂奶粉培养基：称取脱脂奶粉15.0g，琼脂15.0g，纯水定容至1.0L，121℃灭菌15min。

2、实验过程及结果

将实施例1中制备的贝莱斯芽孢杆菌YJD-SF2种子液点接到脱脂奶粉培养基上，设置三个重复，28℃培养5-7天。若能产生明显的透明圈，则证明能够产生蛋白酶，且透明圈越大证明产蛋白酶的能力越强。

结果如图7所示，贝莱斯芽孢杆菌YJD-SF2能够产生明显的透明圈，表明贝莱斯芽孢杆菌YJD-SF2能够具有较好的产生蛋白酶的能力。

二、贝莱斯芽孢杆菌YJD-SF2产生淀粉酶能力的检测

1、培养基配制

淀粉酶培养基：可溶性淀粉2.5g，蛋白胨5g，硫酸铵2.5g，磷酸二氢钾3g，六水氯化钙0.25g，琼脂20g，用蒸馏水定容至1.0L，121℃灭菌15min。

2、实验过程及结果

将实施例1中制备的贝莱斯芽孢杆菌YJD-SF2种子液点接到淀粉酶培养基上，三个重复，28℃培养3天。然后使用碘液进行染色后，观察是否出现透明圈。透明圈越大则证明产生淀粉酶的能力越强。

结果如图8所示，图中所显示的产生了黄色的透明圈，表明贝莱斯芽孢杆菌YJD-SF2能够分泌淀粉酶。

三、贝莱斯芽孢杆菌YJD-SF2产生IAA(吲哚乙酸)能力的检测

1、培养基配制

Salkowski溶液(250mL)：浓H₂SO₄150mL，0.5M FeCl₃37.5mL，用蒸馏水定容至250ml，121℃灭菌15min。

2、实验过程及结果

将实施例1中制备的贝莱斯芽孢杆菌YJD-SF2种子液接种于1mL含200mg/L的L-色氨酸(L-tryptophan)的LB液体培养基中作为实验组，以不接种贝莱斯芽孢杆菌YJD-SF2为对照组，每个处理设置三个重复。在30℃，180r/min培养2天后取200μl菌悬液到96孔板上，加入800μl的Salkowski显色液，并以加入200μl未接菌的LB液体培养基与800μl显色液为对照。室温避光放置20min后，颜色变红为阳性，表明能分泌IAA，颜色越深分泌能力越强。

结果如图9所示，左图为未添加菌剂的对照组，右图为加入YJD-SF2菌剂的实验组。图中右侧的实验组红色很浓，证明YJD-SF2菌剂具有较强的产生IAA能力。

四、贝莱斯芽孢杆菌YJD-SF2产生ACC脱氨酶能力的检测

1、培养基配制

DF培养基(1L)：组分a 0.1mL，组分b 0.1mL，KH₂PO₄ 4.0g，Na₂HPO₄6.0g，MgSO₄·7H₂O0.2g，葡萄糖2.0g，50％D-葡糖酸溶液(上海源叶公司，货号是s11155)4mL，柠檬酸2.0g，(NH₄)₂SO₄2.0g，将所有组分配置好后用蒸馏水水定容至1L，调节pH7.0-7.2，121℃灭菌15min。

组分a(100mL)：H₃BO₃10 mg，MnSO₄·H₂O 11.19mg，ZnSO₄·7H₂O 124.6mg，CuSO₄·5H₂O78.22mg，MoO₃10mg，用蒸馏水定容至100ml。

组分b(10mL)：FeSO₄·7H₂O 100mg，用蒸馏水定容至100ml。

ADF培养基(1L)：将DF培养基中的(NH₄)₂SO₄替换成0.5M 1-氨基环丙烷基-1-羧酸(ACC)，其余组分保持不变。

2、实验过程及结果

将实施例1中制备的贝莱斯芽孢杆菌YJD-SF2种子液点接在DF固体培养基(在上述DF液体培养基组分基础上增加了10％琼脂)上，培养3-4d后将菌株转接到ADF固体培养基(在上述ADF液体培养基组分基础上增加了10％琼脂)上，将平板放置28℃培养箱中倒置培养，并设置三次重复，观察菌株是否生长。

结果如图10所示，图中左侧为DF培养基，右侧为ADF培养基。结果表明，贝莱斯芽孢杆菌YJD-SF2在ADF培养基上仍能生长，说明此YJD-SF2能够产生ACC脱氨酶。

五、贝莱斯芽孢杆菌产生脂肽类物质能力的检测

1、培养基配置

MMSM培养基：葡萄糖40.0g，NH₄NO₃4.0g，KH₂PO₄4.1g，Na₂HPO₄·12H₂O 14.33g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，FeSO₄·7H₂O 1.1mg，CaCl₂·2H₂O 0.8mg，EDTA 1.3mg，蒸馏水1000ml，pH＝7.0。

2、实验方法及过程

将实验例1中制备的种子液(OD_600nm＝1.0)以5％的接种量接种到100mL液体MMSM培养基中，并在37℃，130rpm的条件下培养48h，收集发酵液，该发酵液为YJD-SF2的发酵液。将发酵液在4℃、12000r/min下离心10min，去除菌体后得到上清液，上清液用6mol/LHCl溶液调节至pH＝2，在4℃冰箱中放置过夜。在4℃、12000r/min下离心收集褐色沉淀，沉淀自然风干后加入10mL的50％甲醇超声提取2次，合并提取液即得到脂肽类物质。

实验组：向平板中加入100μL-500μL的前述脂肽提取液，再向平皿中心接入病原菌(细极链格孢菌、立枯丝核菌或大豆疫霉病菌)菌饼，将培养皿置于28℃。分别记录对照及处理菌落直径，计算脂肽类物质的抑制率，每个处理重复3次。

对照组：向平板中加入100μL-500μL的无菌水，再向平皿中心接入病原菌(细极链格孢菌、立枯丝核菌或大豆疫霉病菌)菌饼，将培养皿置于28℃。分别记录对照及处理菌落直径，计算脂肽类物质的抑制率，每个处理重复3次。

抑制率＝(对照病原菌直径-接种生防菌的病原菌直径)/对照病原菌直径×100％。

结果如图11所示：

图11中A(对照组)、图11中B(实验组)为贝莱斯芽孢杆菌YJD-SF2产生的脂肽类物质对细极链格孢菌的抑制实验，与对照相比，实验组的菌丝直径显著减小，且菌丝表面产生了绿色的孢子，说明了较好的抑制作用，经计算，抑制率达到50.79％。

图11中C(对照组)、图11中D(实验组)为贝莱斯芽孢杆菌YJD-SF2产生的脂肽类物质对立枯丝核菌的抑制实验。结果表明：在培养第七天，贝莱斯芽孢杆菌YJD-SF2产生的挥发性物质对立枯丝核菌的在菌丝直径上虽然没有很大影响，但是实验组的立枯丝核菌菌丝变稀疏且厚度变薄。说明贝莱斯芽孢杆菌YJD-SF2对立枯丝核菌会产生一定的抑制效果。

图11中E(对照组)、图11中F(实验组)为贝莱斯芽孢杆菌YJD-SF2产生的脂肽类物质对大豆疫霉病菌的抑制实验。与对照相比，实验组的菌丝直径显著减小，经计算，抑制率为22.84％。

六、贝莱斯芽孢杆菌YJD-SF2固氮能力的检测

1、培养基配制

Ashby培养基(1L)：KH₂PO₄0.2g，NaCl 0.2g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，K₂SO₄·2H₂O 0.2g，CaCO₃5g，葡萄糖5g，甘露醇5g，用蒸馏水定容至1L，pH7.0，121℃灭菌15min。

2、实验过程及结果

将实施例1中制备的贝莱斯芽孢杆菌YJD-SF2种子液点接在Ashby固体培养基(在上述Ashby液体培养基基础上增加了10％琼脂)上，设置重复三次，放置在28℃培养箱中倒置培养，观察菌株是否能够在Assby上生长。在此实验中，贝莱斯芽孢杆菌YJD-SF2可以生长(图12)，因此贝莱斯芽孢杆菌YJD-SF2具有固氮的特性。

七、贝莱斯芽孢杆菌YJD-SF2产生脂肪酶能力的检测

1、培养基配制

脂肪酶检测培养基(罗丹明B培养基)：花生油10g，(NH₄)₂SO₄5.0 g，Na₂HPO₄·7H₂O3.5g，KH₂PO₄0.5 g，NaCl 0.5g，酵母膏0.2g，罗丹明B 0.05g，琼脂15g，用蒸馏水定容至1L，调节pH6.0，灭菌后充分乳化再倒平板。

2、实验过程及结果

将实施例1中制备的贝莱斯芽孢杆菌YJD-SF2种子液点接在罗丹明B培养基上，设置重复三次，放置在28℃培养箱中倒置培养，观察菌株是否产生透明圈。在此实验中，贝莱斯芽孢杆菌YJD-SF2并没有产生透明圈(图13)，贝莱斯芽孢杆菌YJD-SF2不具有产生脂肪酶的能力。

八、贝莱斯芽孢杆菌YJD-SF2产生磷脂酶能力的检测

1、培养基配制

蒙金娜有机磷培养基：葡萄糖10g，(NH₄)₂SO₄0.5g，MgS0₄·7H₂O 0.3g，NaCl 0.3g，KCl0.3g，FeSO₄·7H₂O 0.036g，MnSO₄·7H₂O 0.03g，CaCO₃5g，琼脂20g，用蒸馏水定容至1L。冷却至50℃后立即加入无菌卵黄(每1000mL加入50mL的无菌卵黄)摇匀后再倒平板。

2、实验过程及结果

将实施例1中制备的贝莱斯芽孢杆菌YJD-SF2种子液点接在蒙金娜有机磷培养基上，设置重复三次，放置在28℃培养箱中倒置培养，观察菌株是否产生透明圈。在此实验中，贝莱斯芽孢杆菌YJD-SF2没有产生透明圈(图14)，说明贝莱斯芽孢杆菌YJD-SF2不具有产生磷脂酶的能力。

九、贝莱斯芽孢杆菌YJD-SF2产生铁载体能力的分析

1、培养基配制

溶液a：取0.012g刃天青(CAS)溶于10mL双蒸水中，并与2mL 1mM FeCl₃溶液混匀；

溶液b：取0.015g十六烷基三甲基溴化铵溶解在8mL的水中；

染液c：将a液缓慢加入b液中，充分混匀即为染液c。

培养基d：10×MM9盐溶液20mL，用150mL蒸馏水溶解6.04g哌嗪二乙醇磺酸，两者混匀后用50％的NaOH调节pH至6.8，加入琼脂粉，即得培养基d。

15.2、实验过程及结果

将已灭菌的培养基d中加入已分别灭菌的0.2mL 1mM CaCl₂，4mL的1mM MgSO₄·7H₂O，2mL 20％葡萄糖、6mL 10％酸水解酪蛋白混匀，再加入已单独灭菌的染液c，混匀后，即得到CAS检测培养基。

将实施例1中制备的贝莱斯芽孢杆菌YJD-SF2种子液点接在CAS培养基上，设置重复三次，放置在28℃培养箱中倒置培养，观察菌株是否产生橙色透明圈。

在此实验中，贝莱斯芽孢杆菌YJD-SF2并没有产生橙色的透明圈(图15)，说明贝莱斯芽孢杆菌YJD-SF2不具有产生铁载体的能力。

实施例3、贝莱斯芽孢杆菌YJD-SF2抑菌广谱性的测定

1、供试植物病原菌：

水稻纹枯病菌-立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)(简称立枯丝核菌)、大豆疫霉病菌(Phytophthora sojae)、细极链格孢菌(Alternaria tenuissima)

2、采用平板对峙培养法对上述供试植物病原菌分别进行抑菌实验

具体操作如下：将实施例1中制备的贝莱斯芽孢杆菌YJD-SF2种子液点接在LB固体培养基上28℃恒温培养48h。上述供试植物病原菌分别在PDA平板上25℃-28℃恒温培养3-4天，自菌落边缘用直径0.6cm的无菌不锈钢打孔器制成病原菌琼脂片(水稻纹枯病菌-立枯丝核菌琼脂片、或大豆疫霉病菌琼脂片、或细极链格孢菌琼脂片)；用无菌镊子挑取病原菌菌片，菌丝面朝下接种于PDA平板中心处，同时在距病原菌菌片两侧均约2.50cm处用无菌接种环划线实施例1中制备的YJD-SF2种子液(实验组)，以仅接病原菌的平板为对照(对照组)，每个处理三次重复，25℃-28℃恒温培养7天，测量病原菌的直径，并计算抑制率。抑制率＝(对照病原菌直径-接种生防菌的病原菌直径)/对照病原菌直径×100％。

实验结果如图16所示，结果表明：在第7天的时候，仅接种细极链格孢菌、立枯丝核菌和大豆疫霉病菌的平板上菌丝直径分别为5.45cm、7.15cm和7.50m，与贝莱斯芽孢杆菌YJD-SF2对峙培养的细极链格孢菌、立枯丝核菌和大豆疫霉病菌的菌丝直径分别为1.34cm、2.29cm和2.32cm，抑制率分别为75.47％、75.47％和69.11％。

三次重复该试验均得到同样的稳定抑菌效果，因此表明贝莱斯芽孢杆菌YJD-SF2对细极链格孢菌、水稻纹枯、大豆疫霉病菌具有稳定、高效广谱抗菌性能。

实验例4、贝莱斯芽孢杆菌YJD-SF2产生挥发性抑菌物质能力的检测

采用平板倒扣法测定挥发性气体的抑菌活性。供试植物病原菌为水稻纹枯病菌-立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)(简称立枯丝核菌)、大豆疫霉病菌(Phytophthorasojae)、细极链格孢菌(Alternaria tenuissima)。

实验组：将直径0.6cm病原菌琼脂片(水稻纹枯病菌-立枯丝核菌、或大豆疫霉病菌、或细极链格孢菌)放置在PDA培养基平板中央。另取LB培养基平板，取实验例1中制备的OD_600nm约为1.0的YJD-SF2种子液100μL于平板上均匀涂布。然后将前述处理后的PDA和LB两平板对扣，其中带病原菌的PDA培养基向下倒置，封口膜密封。设置三个重复。置于28℃培养7天。

对照组：将直径0.6cm病原菌琼脂片(水稻纹枯病菌-立枯丝核菌琼脂片、或大豆疫霉病菌琼脂片、或细极链格孢菌琼脂片)放置在PDA培养基平板中央。另取LB培养基平板，取无菌水100μL于平板上均匀涂布。然后将前述处理后的PDA和LB两平板对扣，其中带病原菌的PDA培养基向下倒置，封口膜密封。设置三个重复。置于28℃培养7天。抑制率＝(对照病原菌直径-接种生防菌的病原菌直径)/对照病原菌直径×100％。

结果如图17所示，图17中A(对照组)、图18中B(实验组)为贝莱斯芽孢杆菌YJD-SF2产生的挥发性物质对细极链格孢菌的抑制实验，与对照相比，实验组的菌丝直径显著减小，且菌丝表面产生了绿色的孢子，说明了较好的抑制作用，经计算，抑制率达到39.2％，

图17中C(对照组)、图17中D(实验组)为贝莱斯芽孢杆菌YJD-SF2产生的挥发性物质对立枯丝核菌的抑制实验。结果表明：在培养第七天，贝莱斯芽孢杆菌YJD-SF2产生的挥发性物质对立枯丝核菌的在菌丝直径上虽然没有很大影响，但是实验组的立枯丝核菌菌丝变稀疏且厚度变薄。说明贝莱斯芽孢杆菌YJD-SF2对立枯丝核菌会产生一定的抑制效果。

图17中E(对照组)、图17中F(实验组)为贝莱斯芽孢杆菌YJD-SF2产生的挥发性物质对大豆疫霉病菌的抑制实验。结果表明：在培养第七天，贝莱斯芽孢杆菌YJD-SF2产生的挥发性物质对菌丝直径虽然没有明显影响，但是实验组的大豆疫霉病菌的菌层厚度减小、菌丝分布变得稀疏，说明菌丝生长受到一定程度的抑制。

实验例5、贝莱斯芽孢杆菌YJD-SF2分泌无菌发酵液的能力

供试植物病原菌为水稻纹枯病菌-立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)(简称立枯丝核菌)、大豆疫霉病菌(Phytophthora sojae)、细极链格孢菌(Alternaria tenuissima)。

发酵液制备：采取对峙培养法以激发生防菌的抗菌能力，对峙方法参照实验例3，挑取适量对峙培养的生防菌于100ml LB液体中，37℃130rpm培养5d，即为YJD-SF2发酵液。

实验组：将发酵液在12000rpm条件下离心10min后，收集上清液，将上清液采用0.22μm微孔滤膜过滤，收集滤液，该滤液为无菌发酵液。将100μL无菌发酵液均匀涂布到LB固体培养基中，将病原菌(水稻纹枯病菌-立枯丝核菌、或大豆疫霉病菌、或细极链格孢菌)菌饼点接到培养基中央，在28℃下培养7d。

对照组：将100μL无菌水涂布到LB固体培养基中，将病原菌(水稻纹枯病菌-立枯丝核菌、或大豆疫霉病菌、或细极链格孢菌)菌饼点接到培养基中央，在28℃下培养7d。

结果如图18所示，图18中A(对照组)、图19中B(实验组)为贝莱斯芽孢杆菌YJD-SF2产生的无菌发酵液对细极链格孢菌的抑制实验，与对照相比，实验组的菌丝直径显著减小，产生了较好的抑制作用，经计算，抑制率达到61.33％，

图18中C(对照组)、图18中D(实验组)为贝莱斯芽孢杆菌YJD-SF2产生的无菌发酵液对立枯丝核菌的抑制实验。与对照相比，实验组的菌丝直径有减少，经计算，抑制率为17.18％。

图18中E(对照组)、图18中F(实验组)为贝莱斯芽孢杆菌YJD-SF2产生的无菌发酵液对大豆疫霉病菌的抑制实验。与对照相比，实验组的菌丝直径减小，经计算，抑制率为9.37％。

实施例6、贝莱斯芽孢杆菌YJD-SF2的叶片离体培养实验检测生防效果

1、实验材料

日本晴水稻叶片、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、细极链格孢菌(Alternariatenuissima)、YJD-SF2菌剂。

按实施例3中所述方法制备病原菌琼脂片(水稻纹枯病菌-立枯丝核菌琼脂片、或细极链格孢菌琼脂片)。

水琼脂培养基(称取20g琼脂于1L蒸馏水中，灭菌后倒板，常温凝固)。

OD_600nm＝0.8的YJD-SF2菌剂、OD_600nm＝0.6的YJD-SF2菌剂和OD_600nm＝0.4的YJD-SF2菌剂制备：按照实验例1中的方法制备YJD-SF2的种子液，用无菌水将种子液稀释至OD_600nm值为0.8(以LB液体培养基为空白对照)得到OD_600nm＝0.8的YJD-SF2菌剂，用无菌水将菌液稀释至OD_600nm值为0.6(以LB液体培养基为空白对照)得到OD_600nm＝0.6的YJD-SF2菌剂，用无菌水将菌液稀释至OD_600nm值为0.4(以LB液体培养基为空白对照)得到OD_600nm＝0.4的YJD-SF2菌剂。

2、叶片离体培养流程

采集生长良好且状态一致的日本晴水稻叶片，将叶片用蒸馏水清洗2-3次，晾干水分后，放入75％酒精1分钟进行消毒，晾干。进行下述处理。

YJD-SF2菌剂抑制立枯丝核菌：

A、立枯丝核菌空白对照组处理：将前述日本晴水稻叶片叶片浸泡在LB液体培养基中10min后向叶片中心放一块立枯丝核菌琼脂片，然后将处理后的叶片放置在水琼脂培养基上光照培养3-4天。设置3个重复，每个重复处理3个叶片。利用imageJ软件对病斑面积进行测量，根据病斑面积计算每个叶片病情指数。

B、立枯丝核菌处理：将前述日本晴水稻叶片用LB液体培养基浸泡10min后向叶片中心放一块立枯丝核菌琼脂片，其他操作同立枯丝核菌空白对照组处理；

C、YJD-SF2菌剂+细极链格孢菌处理：将前述日本晴水稻叶片分别经过OD_600nm＝0.8的YJD-SF2菌剂、OD_600nm＝0.6的YJD-SF2菌剂和OD_600nm＝0.4的YJD-SF2菌剂浸泡10min后再向叶片中心接细极链格孢菌琼脂片，其他操作同细极链格孢菌空白对照组处理。

YJD-SF2菌剂抑制细极链格孢菌：

A、细极链格孢菌空白对照组处理：将前述日本晴水稻叶片浸泡在LB液体培养基中10min后向叶片中心放一块细极链格孢菌琼脂片，然后将处理后的叶片放置在水琼脂培养基上光照培养5-6天。设置3个重复，每个重复处理3个叶片。利用imageJ软件对病斑面积进行测量，根据病斑面积计算每个叶片病情指数。

B、细极链格孢菌处理：将前述日本晴水稻叶片用LB液体浸泡10min后向叶片中心放一块细极链格孢菌琼脂片，其他操作同细极链格孢菌空白对照组处理；

C、YJD-SF2菌剂+立枯丝核菌处理：将前述日本晴水稻叶片分别经过OD_600nm＝0.8的YJD-SF2菌剂、OD_600nm＝0.6的YJD-SF2菌剂和OD_600nm＝0.4的YJD-SF2菌剂浸泡10min后再向叶片中心接立枯丝核菌琼脂片，其他操作同立枯丝核菌空白对照组处理。

计算公式如下：病情指数＝(叶片患病面积/叶片总面积)×100％

细极链格孢菌的防治效果如图19所示：细极链格孢菌空白对照组处理(CK)病情指数为94.40％，OD_600nm＝0.4的YJD-SF2菌剂(OD_600nm＝0.4)为78.67％，OD_600nm＝0.6的YJD-SF2菌剂(OD_600nm＝0.6)为73.62％，OD_600nm＝0.8的YJD-SF2菌剂(OD_600nm＝0.8)为39.98％。

立枯丝核菌的防治效果如图20所示：立枯丝核菌空白对照组处理(CK)的病情指数为63.51％，OD_600nm＝0.4的YJD-SF2菌剂(OD_600nm＝0.4)为47.74％，OD_600nm＝0.6的YJD-SF2菌剂(OD_600nm＝0.6)为19.11％，OD_600nm＝0.8的YJD-SF2菌剂(OD_600nm＝0.8)为13.20％。从叶片离体的实验效果来看，YJD-SF2菌剂对病原菌起到了良好的抑制作用，且在一定范围内，菌液浓度越高，生防效果越好。

实验例7、贝莱斯芽孢杆菌YJD-SF2产生挥发性促生物质的能力

1、培养基制备

碱固体培养基：称取2.2g MS粉末，20g蔗糖，蒸馏水定容至1L后，调节pH值至8.0，再加入12g琼脂后，121℃15min灭菌；待培养基冷却至55℃时加入NaHCO₃至终浓度为1.5mM，将约55℃的培养基倒入培养皿(每个培养皿25mL)，常温冷却。

碱+菌固体培养基：取装有碱固体培养基的培养皿，在培养基下方四分之一以下的部位划一条YJD-SF2菌线。(进行挥发性促生物质鉴定的培养基，菌线和种子之间的培养基应划开，让菌线和种子无法接触。)

灭菌的拟南芥种子：取拟南芥(野生型拟南芥Columbia-0亚型，简称Col-0)种子，用2.6％(v/v)次氯酸钠水溶液灭菌10min，然后用灭菌水清洗三次备用。

2、YJD-SF2菌剂分泌挥发性促生物质的检测

将灭菌的拟南芥种子播种于碱固体培养基(对照组)、碱+菌固体培养基(实验组)，对照组和实验组各3个培养皿，每个培养皿播种5-17粒种子，三个重复。4℃春化三天。种子播种于固体培养基上方四分之一以上部分，不与菌剂直接接触(分析YJD-SF2菌剂分泌物对拟南芥根系生长的影响)。春化后光照竖直培养10天。观察菌剂的分泌物对拟南芥根部生长的影响。培养条件为：22℃；12h光照/12h黑暗；光照强度为5000Lx。培养7天后统计拟南芥幼苗的主根长。

表1、拟南芥主根长统计

结果如图21所示，结果表明：盐碱胁迫条件下，接种YJD-SF2的实验组拟南芥幼苗的平均主根长显著高于对照组。由此可见，贝莱斯芽孢杆菌YJD-SF2能够产生挥发性促生物质以促进盐碱条件下拟南芥的生长。

实验例8、贝莱斯芽孢杆菌YJD-SF2提高拟南芥盐碱胁迫抗性的检测

1、培养基的制备

碱固体培养基与碱+菌固体培养基的制备参照实验例7中的方法制备，唯一区别是此实验中碱+菌培养基不需要划开。

灭菌的拟南芥种子参照实验例7的方法进行灭菌。

2、YJD-SF2菌剂提高拟南芥盐碱胁迫抗性的检测

将灭菌的拟南芥种子Col-0播种于碱固体培养基(对照组)、碱+菌固体培养基(实验组)，对照组和实验组各3个培养皿，每个培养皿播种5-17粒种子，三个重复。4℃春化三天。种子播种于固体培养基上方四分之一以上部分，不与菌剂直接接触。培养条件为：22℃；12h光照/12h黑暗；光照强度为5000Lx。春化后光照竖直培养7天。观察拟南芥的生长状态并统计拟南芥幼苗的主根长。

表2、拟南芥主根长统计

结果如图21所示和表1所示，盐碱胁迫条件下，接种YJD-SF2菌剂的实验组拟南芥幼苗的平均主根长显著高于对照组，即YJD-SF2菌剂分泌物可存进盐碱胁迫条件下拟南芥幼苗主根的生长。由此可见，贝莱斯芽孢杆菌YJD-SF2大幅度提高拟南芥盐碱胁迫抗性。

实施例9、贝莱斯芽孢杆菌YJD-SF2在提高玉米抗盐碱胁迫中的应用

YJD-SF2菌剂的制备：采取与实验例1相同的方法制备种子液。

琼脂固体培养基：将5g琼脂粉溶于500mL蒸馏水，121℃灭菌15min。将约55℃琼脂培养基倒入培养皿，自然冷却。

碱液(80mM)：用Na₂CO₃：NaHCO₃按1:9的比例配置(Na₂CO₃8mM，NaHCO₃72mM)，即将0.848g Na₂CO₃和6.048gNaHCO₃溶于1L去离子水，备用。

玉米样品培养条件：28℃；12h光照/12h黑暗；光照强度为5000Lx。

1、取120粒玉米自交系B73种子，先用70％(v/v)乙醇水溶液灭菌5min，灭菌水清洗1次；再用2.6％(v/v)次氯酸钠水溶液灭菌15min，灭菌水清洗5次。

2、将玉米幼苗播种在装有营养土的盆中(每盆5棵)，得到20盆玉米幼苗共100棵。将20盆玉米幼苗随机分为四组，每组5盆，每组按如下方式处理：

①碱液菌剂组：在种植后的第3天(即步骤2中所述的“将玉米幼苗播种在装有营养土的盆中”，为第1天)均匀的向每株玉米幼苗根部滴加1mLYJD-SF2菌剂，按如下培养方式总计培养6周(即步骤2中所述的“将玉米幼苗播种在装有营养土的盆中”，为第1天，统计玉米幼苗干重信息为最后一天)，第1～3周每周按100mL/盆浇灌一次碱液，第4～6周每周按100mL/盆浇灌一次去离子水。

②碱液对照组：与碱液菌剂组的区别仅在于不施加菌剂，按照碱液菌剂组所述培养方式培养6周。

③水菌剂组：在种植后的第3天均匀的向每株玉米幼苗根部滴加1mLYJD-SF2菌剂，按如下培养方式总计培养6周，每周按100mL/盆浇灌一次去离子水，共浇灌6周。

④水对照组：与水菌剂组的区别仅在于不施加菌剂，按照水菌剂组所述培养方式培养6周。

3、观察分析各组玉米生长发育的表型，并记录各组玉米幼苗根系形态。

4、统计碱胁迫条件下YJD-SF2菌剂处理6周后各株玉米幼苗的干重、鲜重和株长。

玉米幼苗地上部分和全苗的表型见图23(1为水对照组；2为水菌剂组；3为碱液对照组；4为碱液菌剂组)。玉米根部形态见图24(1为水对照组，2为水菌剂组，3为碱液对照组，4为碱液菌剂组)。

从图23和图24可以看出，在碱液(80mM)和水处理条件下，含有YJD-SF2菌剂的玉米幼苗均株高更高、叶片长度更长、叶片总表面积更大以及总根长更长。

玉米幼苗的干重、鲜重和株长结果见表2。水处理条件下，施加YJD-SF2菌剂的水菌剂组中的玉米幼苗的平均干重、平均鲜重和平均株长均高于未施加YJD-SF2菌剂的水对照组的玉米幼苗；碱胁迫条件下，施加YJD-SF2菌剂的碱液菌剂组中的玉米幼苗的平均干重、平均鲜重和平均株长均高于未施加YJD-SF2菌剂的碱液对照组中的玉米幼苗。由此可见，YJD-SF2能够提高玉米的抗碱胁迫能力。

表3、玉米幼苗的干重、鲜重和平均株长统计结果

	平均干重(g)	平均鲜重(g)	平均株长(cm)
				水对照组	0.88	3.88	109.07
水菌剂组	1.01	7.00	110.83
				碱液对照组	0.30	4.44	69.63
碱液菌剂组	1.29	8.34	86.26

实施例10、贝莱斯芽孢杆菌YJD-SF2菌剂在提高水稻抗碱胁迫中的应用

YJD-SF2菌剂的制备：采取与实验例1相同的方法制备种子液。

培养条件：28℃；12h光照/12h黑暗；光照强度为5000Lx。

碱液(40mM)：用Na₂CO₃：NaHCO₃按1:9的比例配置(Na₂CO₃4mM，NaHCO₃36mM)将0.424gNa₂CO₃和3.024gNaHCO₃溶于1L去离子水，备用。

1、将120粒水稻品种日本晴种子放入培养皿，用同实验例9的方法给种子消毒后，加入少量水，然后置于28℃恒温培养箱培养至种子发出芽及短根。

2、将发芽的水稻幼苗移栽至装有营养土的盆中(每盆5棵)，得到20盆水稻幼苗共100棵。将20盆水稻幼苗随机分为四组，每组5盆，每组按如下方式处理：

①碱液菌剂组：在种植后3天(即步骤2中所述的“将发芽的水稻幼苗移栽至装有营养土的盆中”，为第1天)均匀的向每株水稻幼苗根部滴加1mLYJD-SF2菌剂，按如下培养方式总计培养6周(即步骤2中所述的“将发芽的水稻幼苗移栽至装有营养土的盆中”，为第1天，统计水稻幼苗的鲜重等信息时为最后一天)，第1～3周每周按100mL/盆浇灌一次碱液，第4～6周每周按100mL/盆浇灌一次去离子水。

②碱液对照组：不施加菌剂，按照碱液菌剂组所述培养方式培养6周。

③水菌剂组：种植后3天就均匀的向每株水稻幼苗根部滴加1mLYJD-SF2菌剂，按如下培养方式总计培养6周，每周按100mL/盆浇灌一次去离子水，共浇灌6周。

④水对照组：不施加菌剂，按照水菌剂组所述培养方式培养6周。

3、观察分析各组水稻生长发育的表型，并记录各组水稻幼苗根系形态。

4、碱胁迫条件下YJD-SF2菌剂处理6周后对各株水稻幼苗的鲜重、株长、干重进行统计。

水稻幼苗地上部分和全苗的表型见图25(1为水处理组全苗水对照组；2为水处理组水菌剂组；3为碱液处理组全苗碱液对照组；4为碱液处理组全苗碱液菌剂组)。水稻根部形态见图26(1为水对照组，2为水菌剂组，3为碱液对照组，4为碱液菌剂组)。

从图25和图26可以看出，在碱液(40mM)和水处理条件下，均为YJD-SF2菌剂组水稻幼苗株高更高、叶片长度更长、叶片总表面积更大以及总根长更长；在碱液(40mM)条件下，YJD-SF2菌剂组水稻幼苗的枯萎程度大大降低。

由表3可知，水处理条件下，施加YJD-SF2菌剂的水菌剂组和未施加YJD-SF2菌剂的水对照组的水稻幼苗的平均鲜重、平均株高以及平均干重均有差异；碱胁迫条件下，施加YJD-SF2菌剂的碱液菌剂组水稻幼苗的平均鲜重、平均株高以及平均干重均高于未施加YJD-SF2菌剂的碱液对照组水稻幼苗。由此可见，YJD-SF2菌剂能够提高水稻的抗盐碱性碱胁迫能力。

表4、水稻幼苗的鲜重和平均株高统计结果

	平均鲜重(g)	平均株高(cm)	平均干重(g)
				水对照组1	0.37	37.73	0.035
水菌剂组2	0.63	42.93	0.054
				碱液对照组3	0.05	19.13	0.002
碱液菌剂组4	0.36	40.3	0.038

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims

1.芽孢杆菌，其特征在于：所述芽孢杆菌为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)，其菌株编号为YJD-SF2，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No. 25978。

2.菌剂，其特征在于：所述菌剂含有权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌和权利要求1所述的芽孢杆菌的代谢物或/和培养物。

3.抗盐和/碱胁迫制剂，其特征在于，所述抗盐胁迫制剂含有权利要求1所述的芽孢杆菌和权利要求1所述的芽孢杆菌的代谢物或/和培养物或/和权利要求2所述的菌剂。

4.权利要求1所述的芽孢杆菌、权利要求2所述的菌剂、权利要求3所述的抗盐和/碱胁迫制剂的下述任意一种应用：

A1)、促进植物生长；

A2)、制备促进植物生长的产品；

A3)、抑制植物病原菌；

A4)、制备抑制植物病原菌的产品；

A5)、预防和/或治疗植物病害；

A6)、制备预防和/或治疗植物病害的产品；

A7)、提高植物抗逆性中的应用；

A8)、制备提高植物抗逆性的产品中的应用；

A9)、生产蛋白酶；

A10)、生产淀粉酶；

A11)、生产脂肽；

A12)、生产ACC脱氨酶；

A13)、生产吲哚乙酸；

A14)、植物固氮；

A15)、制备用于植物固氮的产品；

A16)、制备挥发性抑菌物质；

A17)、制备挥发性促生物质；

A3）或A4）所述植物病原菌为水稻纹枯病菌-立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、大豆疫霉病菌(Phytophthora sojae)和细极链格孢菌(Alternaria tenuissima)中的一种或多种；

A5)或A6)所述植物病害为水稻纹枯病菌-立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、大豆疫霉病菌(Phytophthora sojae)或细极链格孢菌(Alternaria tenuissima)引起的病害；

A7)和A8)所述的提高植物抗逆性为提高植物的耐盐碱能力；

A16)所述抑菌物质为抑制水稻纹枯病菌-立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、大豆疫霉病菌(Phytophthora sojae)和细极链格孢菌(Alternaria tenuissima)中的至少一种菌的物质；

A17)所述挥发性促生物质是促进盐碱条件下的拟南芥生长的物质。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述植物为单子叶植物或双子叶植物。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述单子叶植物为禾本科植物，所述双子叶植物为十字花科植物。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述禾本科植物为稻属植物或玉蜀黍属植物，所述十字花科植物为拟南芥属植物。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述植物稻属植物为水稻，所述玉蜀黍属植物为玉米，所述拟南芥属植物为拟南芥。

9.提高植物抗逆性或/和促进植物生长的方法，其特征在于：所述方法包括用权利要求1所述的芽孢杆菌、权利要求3所述的抗盐和/碱胁迫制剂处理植物或植物的培养基质；所述提高植物抗逆性为提高植物的耐盐碱能力。

10.预防和/或治疗植物病害的方法，其特征在于：所述方法包括用权利要求1所述的芽孢杆菌、权利要求2所述的菌剂处理植物；所述病害由水稻纹枯病菌-立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、细极链格孢菌(Alternaria tenuissima)和大豆疫霉菌(Phytophthora sojae)中的至少一种病原菌引起。