CN118207129B - 一株婴儿芽孢杆菌hn01及其在防治植物根结线虫病中的应用 - Google Patents
一株婴儿芽孢杆菌hn01及其在防治植物根结线虫病中的应用 Download PDFInfo
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- A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
- A01N63/20—Bacteria; Substances produced thereby or obtained therefrom
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-
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- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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-
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Abstract
本发明提供了一株婴儿芽孢杆菌HN01及其应用，其命名为婴儿芽孢杆菌HN01(Bacillus infantis)，其保藏编号为CGMCC NO.28378。该菌株对根结线虫二龄幼虫及卵有很好毒杀效果，是对植物寄生线虫具有高毒力的生防菌株，不但丰富植物寄生线虫生防菌资源，更重要的是对开发杀线虫绿色农药或药肥具有十分重要的意义。
Description
技术领域
本发明涉及微生物学技术领域，特别涉及一株婴儿芽孢杆菌HN01及其在防治植物根结线虫病中的应用。
背景技术
目前，已报道的根结线虫有80多种，主要寄生在粮食作物、经济作物等2000多种寄主上。其中，南方根结线虫(Meloidogyne incognita)是分布最广、危害最重的植物寄生线虫，主要分布在热带和亚热带地区，根结线虫侵染影响植物光合作用、植物防御活性酶和内源激素分泌，同时，根结线虫在植物根部取食造成许多伤口，从而为从伤口入侵的真菌和细菌病害提供方便，一些根结线虫还是某些病毒和细菌的传播介体。根结线虫侵染植物根系后，地上部分表现为生长发育迟缓，叶片黄化和植株萎蔫，进而导致产量、品质下降。根结线虫侵染作物一般年份减产10％～15％，严重时达30％～40％，甚至绝收。每年造成的经济损失高达1000亿美元，是世界范围内主要的植物卫生问题之一，对根结线虫病的防治工作迫在眉睫。
施用化学药剂为目前防治根结线虫的主要措施，尽管其效果较为显著，但是长期使用化学农药会导致线虫产生抗药性、破坏生态平衡以及危害人畜健康。近年来寻求生物防治代替化学防治成为国内外的大趋势。生物防治主要是利用生防微生物及代谢产物来杀死或抑制病原，以达到控制病害的目的。生物防治具有高效、无污染的特点，符合现阶段农业可持续发展的绿色理念。因此，生物防治越来越受到人们的重视。并且很多生防菌在抑制根结线虫的同时还拥有促进植株生长的作用。于是，如何从土壤或植株材料中筛选、鉴定生防菌，可以为根结线虫病的生防菌开发和绿色防控提供新的依据和思路。
因此，有必要从土壤或植株材料中筛选、鉴定一种可以防治根结线虫的菌株，可以为根结线虫病的生防菌开发和绿色防控提供新的依据和思路。
发明内容
本发明目的是提供一株婴儿芽孢杆菌HN01及其应用，该株婴儿芽孢杆菌HN01对根结线虫具有较好的杀灭效果，能应用于多种植株的根结线虫生物防治中。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
在本发明的第一方面，提供了一株婴儿芽孢杆菌HN01，所述婴儿芽孢杆菌HN01的分类命名为Bacillus infantis，保藏编号为：CGMCC NO.28378。
在本发明的第二方面，提供了一种发酵菌剂，所述发酵菌剂包括：
将所述的婴儿芽孢杆菌HN01进行发酵培养获得的发酵液或菌悬液；
或将所述发酵液经喷雾干燥获得干粉菌剂。
进一步地，所述菌悬液的制备方法包括：
将所述的婴儿芽孢杆菌HN01接种于液体培养基进行发酵培养获得的发酵液。
进一步地，所述发酵培养的条件包括：温度为30～35℃，pH为5～9。
进一步地，所述液体培养基的配方为：蔗糖4wt％～12wt％，牛肉浸膏4wt％～10wt％，碳酸钙2wt％～5wt％，硫酸镁2wt％～5wt％，去离子水1000mL，用盐酸调解初始pH为7.0～7.2，120℃，20～25min灭菌。
进一步地，所述干粉菌剂的制备方法包括：
将所述发酵液300mL～600mL加入350g-550g载体材料中，35～40℃，80～200r/min搅拌至载体材料成絮状，置于30～40℃烘干，经气流粉碎，过筛，获得婴儿芽孢杆菌HN01的干粉菌剂；
所述载体材料的制备方法包括：将载体、润湿剂、分散剂和保护剂按照质量比50％～70％：10％～25％：1％～4％：1％～4％混合后喷雾干燥后过筛获得，其中，所述喷雾干燥中进风温度为170～190℃，出风温度为55～65℃。
进一步地，所述载体包括白炭黑、硅藻土、高岭土、膨润土中的至少一种；
所述润湿剂包括脂肪醇聚氧乙烯醚(AEO)、蔗糖脂肪酸酯、吐温80、乙氧基化烷基硫酸钠、十二烷基苯磺酸钠、木质素磺酸钠中的至少一种；
所述分散剂包括氯化钙、聚乙烯醇、三聚磷酸钠(STPP)、可溶性淀粉、硫酸铵、聚乙二醇中的至少一种；
所述保护剂包括糊精、二氧化硅、羟甲基纤维素、羟甲基纤维素钠、L-抗坏血酸中的至少一种。
在本发明的第三方面，提供了所述的婴儿芽孢杆菌HN01或所述的发酵菌剂在防治植物根结线虫病中的应用。
进一步地，所述植物根结线虫病包括烟草根结线虫病、辣椒根结线虫病、黄瓜根结线虫病、花生根结线虫病中的至少一种。
本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：
1、本发明提供的一株婴儿芽孢杆菌HN01及其在防治植物根结线虫病中的应用，从土壤中分离筛选出一株婴儿芽孢杆菌Bacillus infantis，该菌株对根结线虫二龄幼虫及卵有很好毒杀效果，是对植物寄生线虫具有高毒力的生防菌株，不但丰富植物寄生线虫生防菌资源，更重要的是对开发杀线虫绿色农药或药肥具有十分重要的意义。
2、本发明制备的微生物生防菌剂可为生防菌定殖提供营养物质和定殖环境，延长生防菌使用寿命，且用量少、对植株安全性好。其在使用过程中环保、无污染，具有环境友好、施用简单、用量少、持效期长等优点，且易于工业化生产。
3、本发明提供的一株婴儿芽孢杆菌HN01对线虫病害具有广谱性，实验室已测定对烟草根结线虫病、番茄根结线虫病、花生根结线虫病等多种植物的根结线虫病均具有较好的防治效果，且菌株稳定。
本发明的婴儿芽孢杆菌HN01的保藏日期为2023年9月7日，保藏编号为CGMCCNO.28378。其分类命名为婴儿芽孢杆菌Bacillus infantis，保藏单位名称为中国普通微生物菌种保藏管理中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院，邮编：100101。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1为本发明的菌株HN01的多基因联合系统发育树；
图2为本发明的菌株HN01培养液对烟草根结线虫病的盆栽防治效果。
具体实施方式
下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买获得或者可通过现有方法获得。
下面将结合实施例及实验数据对本申请的一株婴儿芽孢杆菌HN01及其在防治植物根结线虫病中的应用进行详细说明。
实施例1、婴儿芽孢杆菌HN01的分离、纯化与鉴定
1、菌株HN01的分离与纯化
称取海南番茄根结线虫发病较重地块土样10g，用90mL无菌水充分混匀，置于28℃恒温摇床2h，获得土壤悬浊液。用无菌水依次稀释成105、106、107、108，用涂布棒涂到固体无菌NA平板上。放置在30℃培养箱里培养3d后，挑取平板上形态不同的单菌落到固体无菌NA平板进行划线纯化。将纯化好的单菌落保存于4℃冰箱中，用于菌株筛选。
2、菌株HN01的筛选
取分离得到的菌株500μL发酵液分别加入到48孔板中，再向每孔加入50μL二龄幼虫悬浮液(100条)。设液体NA培养基为对照，3次重复。于25℃培养箱内培养24h后，在显微镜下观察线虫活性，用1mol/L NaOH刺激线虫，僵直视为死亡。计算线虫死亡率和校正死亡率，死亡率(％)＝线虫死亡数/线虫总数×100，校正死亡率(％)＝(处理组线虫的死亡率-对照组线虫死亡率)/(1-对照组线虫死亡率)×100。结果如表1所示.
表1不同细菌培养液对南方根结线虫死亡率的影响
由表1可知，在发生根结线虫病较严重的海南红土中共分离到8株细菌菌株，其中4号菌株培养液处理24h对二龄幼虫的校正死亡率最高，为92.85％，显著高于其他菌株处理。因此，4号菌株作为下一步研究的试验菌株。接下来对4号菌株命名为菌株HN01进行下一步的实验。
2、菌株HN01的鉴定
(1)菌株HN01的形态学特征：菌株HN01在NA固体平板上的菌落呈圆形，浅黄色；革兰氏染色为阳性反应，为革兰氏阳性菌。
(2)菌株HN01的生理生化特性：菌株HN01的生长温度为25～37℃，pH为5～9，最适生长温度32℃，最适pH为7。
(3)菌株的16S rDNA序列测定及分析：利用Bacteria Genomic DNA Kit试剂盒(北京全式金生物技术有限公司)提取菌株基因组DNA，测定16S rDNA(通用引物27F/1492R)及rpoB和rpoD基因进行PCR扩增。PCR反应条件：94℃5min；94℃1min，56℃1min，72℃90s，35次循环；72℃7min。PCR扩增产物由青岛派森诺基因科技有限公司测序，将序列递交GenBank并BLAST比对，MEGA6.0软件系统发育分析。
将测序结果(如SEQ ID NO.1所示)在NCBI进行BLAST比对分析，发现该菌株与Bacillus infantis的序列同源性为99.6％，结合该菌株形态及生理生化特性，确定菌株为婴儿芽孢杆菌Bacillus infantis。该菌株已保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC NO.28378。
实施例2、菌株HN01不同浓度发酵液对根结线虫室内离体活性测定
将菌株HN01接种于液体培养基中，液体培养基的配方为：蔗糖10wt％，牛肉浸膏5wt％，碳酸钙4wt％，硫酸镁4wt％，去离子水1000mL，用盐酸调解初始pH为7.2，120℃灭菌20min。在32℃、180r/min培养16-28h后，检测菌液浓度，当菌液含量超过1×108cfu/mL时，即为菌株HN01发酵液，用无菌水稀释成5倍和10倍稀释液。分别吸取500μL发酵液原液、5倍稀释液和10倍稀释液加入48孔板中，向每孔加入50μL(100条)二龄幼虫悬浮液。设NA培养基为对照，3次重复。24和48h后分别观察二龄幼虫死亡情况，计算线虫死亡率和校正死亡率。结果如表2所示。
表2菌株HN01不同浓度发酵液对线虫虫卵孵化率的影响
由表2可知，不同浓度的HN01发酵液对根结线虫的校正死亡率随着稀释倍数的增加显著降低。HN01发酵滤液原液、5倍稀释液和10倍稀释液处理24h以后，二龄幼虫的校正死亡率分别为94.82％、76.80％和56.19％。处理48h后，二龄幼虫的校正死亡率分别为96.77％、78.43％和59.86％。
实施例3、婴儿芽孢杆菌HN01粉剂制备
将硅藻土70％，木质素磺酸钠20％，聚乙烯醇3％，蔗糖5％和羟甲基纤维素2％混合均匀，并进行喷雾干燥，进风温度180℃，出风温度60℃，所得粉末过200目筛，制备得到粉剂载体。将菌株HN01发酵液按300mL～600mL加入350g-550g载体材料中混合(具体选用500mL：500g)，32℃，150r/min搅拌30min，置于40℃电热恒温鼓风干燥箱烘干，经气流粉碎机粉碎，过200目筛，即为HN01粉剂。
实施例4、婴儿芽孢杆菌HN01防治植物根结线虫病中的应用
待烟草出苗4周后，将烟草苗移栽于直径为10cm装有300g土的塑料盆中。盆栽试验设置以下处理：
HN01发酵液(1×108cfu/mL)、HN01粉剂、2％阿维菌素乳油和清水4组处理。烟草移栽一周后，分别以HN01发酵液50mL/株灌根处理、HN01粉剂稀释500倍50mL/株、2％阿维菌素乳油稀释500倍50mL/株灌根处理，以清水50mL/株灌根处理为对照。10次重复，各处理灌根2d后，在距离烟株根2cm处对称打2个1cm深的小孔，注入线虫悬浮液5mL，每株接种1000条。30d后，统计烟草植株的株高和鲜重，计算根结指数和防治效果，根结指数＝Σ(病级数值×相应级病株数)/(调查总株数×最高病级)×100，防治效果(％)＝(对照组根结指数-处理组根结指数)/对照组根结指数×100。结果如表3所示。
表3菌株HN01对烟草根结线虫病的防治效果
由表3可知，菌株HN01发酵液和HN01粉剂稀释液灌根处理中烟草根结指数分别为12.4和19.6，显著低于对照的80.1，30d防治效果达到84.5％和75.5％；而2％阿维菌素乳油稀释液灌根处理根结指数为35.2，防治效果为56.1％，可见菌株HN01对根结线虫具有较好的防治作用。菌株HN01发酵液和HN01粉剂稀释液灌根处理的烟草株高和鲜重均显著高于对照组，均增加55％以上，说明菌株HN01具有较好的促生作用。
综上可知，本申请从海南省根结线虫病发病土壤中分离筛选出婴儿芽孢杆菌HN01，其发酵滤液对根结线虫二龄幼虫具有较高的致死作用，24h的校正死亡率为94.82％，48h的校正死亡率为96.77％，发酵液对烟草根结线虫病的室内盆栽防治效果30d达84.5％，制备的HN01粉剂达75.5％。本申请中婴儿芽孢杆菌HN01显著增加了烟草鲜重和株高，促进了烟草植株的生长和发育，对开发杀线虫绿色农药或药肥具有十分重要的意义。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已描述了本发明的实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (7)
1.一株婴儿芽孢杆菌(Bacillus infantis)HN01，其特征在于，所述婴儿芽孢杆菌(Bacillus infantis)HN01的保藏编号为：CGMCC NO.28378。
2.一种发酵菌剂，其特征在于，所述发酵菌剂包括：
将如权利要求1所述的婴儿芽孢杆菌HN01进行发酵培养获得的发酵液或菌悬液；
或将所述发酵液经喷雾干燥获得干粉菌剂。
3.根据权利要求2所述的发酵菌剂，其特征在于，所述菌悬液的制备方法包括：
将权利要求1所述的婴儿芽孢杆菌HN01接种于液体培养基进行发酵培养获得的发酵液。
4.根据权利要求3所述的发酵菌剂，其特征在于，所述发酵培养的条件包括：温度为30～35℃，pH为5～9。
5.根据权利要求3所述的发酵菌剂，其特征在于，所述液体培养基的配方为：蔗糖4wt％～12wt％，牛肉浸膏4wt％～10wt％，碳酸钙2wt％～5wt％，硫酸镁2wt％～5wt％，去离子水1000mL，用盐酸调解初始pH为7.0～7.2，120℃，20～25min灭菌。
6.根据权利要求2所述的发酵菌剂，其特征在于，所述干粉菌剂的制备方法包括：将所述发酵液300mL～600mL加入350g-550g载体材料中，35～40℃，80～200r/min搅拌至载体材料成絮状，置于30～40℃烘干，经气流粉碎，过筛，获得婴儿芽孢杆菌HN01的干粉菌剂；
所述载体材料的制备方法包括：将载体、润湿剂、分散剂和保护剂按照质量比50％～70％：10％～25％：1％～4％：1％～4％混合后喷雾干燥后过筛获得，其中，所述喷雾干燥中进风温度为170～190℃，出风温度为55～65℃；
所述载体为硅藻土；所述润湿剂为木质素磺酸钠；所述分散剂为聚乙烯醇；所述保护剂为羟甲基纤维素钠。
7.一种权利要求1所述的婴儿芽孢杆菌HN01或权利要求2-6所述的发酵菌剂在防治烟草根结线虫病中的应用。
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| GR01 | Patent grant | ||
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