CN115927051B

CN115927051B - 一种生防细菌、生防复配菌剂及其应用

Info

Publication number: CN115927051B
Application number: CN202210864655.8A
Authority: CN
Inventors: 王傲雪; 李英慧; 陈秀玲; 李天天; 张瑶; 程谟帧; 仇有文; 冯明芳; 王迎春
Original assignee: Northeast Agricultural University
Current assignee: Northeast Agricultural University
Priority date: 2022-07-21
Filing date: 2022-07-21
Publication date: 2024-05-07
Anticipated expiration: 2042-07-21
Also published as: CN115927051A

Abstract

本发明涉及一种生防细菌、生防复配菌剂及其应用，属于农业生物防治技术领域。为解决现有生防细菌防治植物病害能力单一、防治效果不稳定的问题，本发明提供了一种生防细菌，其分类命名为枯草芽孢杆菌亚种，抑菌谱广、拮抗作用强，能够有效抑制番茄灰霉病菌等多种作物致病菌的生长。本发明还提供了一种生防复配菌剂，包括枯草芽孢杆菌亚种Bs‑6、产氮假单胞菌WXCDD51、解淀粉芽孢杆菌Ba和枯草芽孢杆菌Bswy‑1；所述生防复配菌剂能够促进种子发芽和幼苗生长，抑菌谱广、拮抗作用强、生产成本低，不但能够有效抑制农作物病原真菌的生长，还能增强植物的抗病性，从不同防治机理出发，获得更全面高效的防治效果、防治范围更广。

Description

一种生防细菌、生防复配菌剂及其应用

技术领域

本发明属于农业生物防治技术领域，尤其涉及一种生防细菌、生防复配菌剂及其应用。

背景技术

番茄灰霉病是番茄植株以及果实经常遭受的病害之一，不仅在植物生长过程中侵染严重，在采后贮藏、运输等方面也严重存在，给番茄品种的加工贮藏以及运输都带来了极大的困难。番茄灰霉病是番茄保护地栽培中的一种主要病害。在我国北方，由于温室、塑料大棚以及陆地栽培的存在，番茄灰霉病侵染得更加严重，传播得也更为广泛。

目前，防治番茄灰霉病的方法有化学防治、物理防治和生物防治等。随着生活水平的提高以及人们对自然无公害食品的追求，化学防治已然不能满足人们对健康无污染食品的需求，再加上化学药剂的大量使用，已经使植物和土壤中有了更多的残留，而物理防治耗材耗力，并且有时耗资昂贵，并不是有效的防治手段，因此，生物防治就成了现在应用越来越广泛的防治方法。生物防治应用广泛，能保护和改善农田生态条件，不污染环境，对人类的身体健康有保障。但是现有大多数生防细菌防治植物病害的能力较为单一，在田间的防治效果不稳定，在生产中难以推广使用。

发明内容

为解决现有生防细菌防治植物病害能力单一、防治效果不稳定的问题，本发明提供了一种生防细菌、生防复配菌剂及其应用。

本发明的技术方案：

一种生防细菌，所述生防细菌的分类命名为枯草芽孢杆菌亚种(Bacillussubtilis subsp.subtilis)，于2022年6月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.25087。

进一步的，所述生防细菌的16S rDNA的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。

一种生防细菌在农业生物防治方面的应用。

进一步的，所述农业生物防治包括将所述生防细菌用于防治黄瓜枯萎病、西瓜枯萎病、甜瓜枯萎病、玉米茎基腐病、黄瓜炭疽病、叶霉病，以及木贼镰刀菌、尖孢镰刀菌、轮支镰刀菌或葵花柱菌引起的作物病害。

一种生防复配菌剂，包括枯草芽孢杆菌亚种Bs-6、产氮假单胞菌WXCDD51、解淀粉芽孢杆菌Ba和枯草芽孢杆菌Bs wy-1，所述枯草芽孢杆菌亚种Bs-6的菌种保藏编号为CGMCCNo.25087；所述产氮假单胞菌WXCDD51的菌种保藏编号为CGMCCNo.12760；所述解淀粉芽孢杆菌Ba的菌种保藏编号为ACCC10147；所述枯草芽孢杆菌Bs wy-1的菌种保藏编号为ACCC10655。

进一步的，包括等体积混合的枯草芽孢杆菌亚种Bs-6菌悬液、产氮假单胞菌WXCDD51菌悬液、解淀粉芽孢杆菌Ba菌悬液和枯草芽孢杆菌Bs wy-1菌悬液，其中枯草芽孢杆菌亚种Bs-6菌悬液的活菌数均为0.5×10⁶cfu/mL、产氮假单胞菌WXCDD51菌悬液的活菌数均为1×10⁷cfu/mL、解淀粉芽孢杆菌Ba菌悬液的活菌数均为1×10⁶cfu/mL和枯草芽孢杆菌Bs wy-1菌悬液的活菌数均为1×10⁶cfu/mL。

一种生防复配菌剂在农业生物防治方面的应用。

进一步的，所述农业生物防治包括将所述生防复配菌剂用于防治番茄灰霉病，还包括将所述生防复配菌剂用于提高作物抗病能力。

一种生防复配菌剂在农作物种子及幼苗促生方面的应用。

一种生防复配菌剂在水果蔬菜防腐保鲜方面的应用。

本发明的有益效果：

本发明从植物根基土分离出的对番茄灰霉病具有较好防治作用的生防细菌Bs-6，通过生理生化鉴定、形态观察、16S rDNA基因序列分析，将该菌株鉴定为枯草芽孢杆菌亚种(Bacillus subtilis subsp.subtilis)。本发明提供的生防细菌抑菌谱广、拮抗作用强，能够有效抑制番茄灰霉病菌等多种作物致病菌的生长，能够广泛应用于农业生物防治领域。

本发明将枯草芽孢杆菌亚种Bs-6、产氮假单胞菌WXCDD51、解淀粉芽孢杆菌Ba和枯草芽孢杆菌Bs wy-1复配制备了生防复配菌剂。本发明的生防复配菌剂能够促进种子发芽和幼苗生长，抑菌谱广、拮抗作用强、生产成本低，能够减缓化学农药对环境的污染，广泛应用于农业生物防治领域。本发明生防菌复配菌剂不但能够有效抑制农作物病原真菌的生长，还能诱导植物相关防御酶活性，从而增强植物的抗病性，能够从不同防治机理出发，获得更全面高效的防治效果、防治范围更广。

附图说明

图1为本发明提供的枯草芽孢杆菌亚种Bs-6的菌落形态照片；

图2为本发明提供的枯草芽孢杆菌亚种Bs-6的显微形态照片；

图3为本发明提供的枯草芽孢杆菌亚种Bs-6分泌IAA能力的检测照片；

图4为本发明提供的枯草芽孢杆菌亚种Bs-6分泌嗜铁素能力的检测照片；

图5为本发明提供的枯草芽孢杆菌亚种Bs-6分泌蛋白酶能力的检测照片；

图6为本发明提供的枯草芽孢杆菌亚种Bs-6的系统发育树；

图7为实施例3中四种生防细菌交叉生长效果图；

图8为实施例5中不同处理下番茄种子发芽率的对比图；

图9为实施例5中不同处理下番茄胚根长度的对比图；

图10为实施例5中不同处理下番茄幼苗根系扫描图；

图11为实施例5中不同处理下番茄幼苗促生效果照片；

图12为实施例6中不同处理下番茄果实腐烂率对比图；

图13为实施例6中不同处理下番茄果实硬度对比图；

图14为实施例7中不同处理下番茄幼苗光合系统Y[II]的实际效率对比图；

图15为实施例7中不同处理下番茄幼苗光化学猝灭qP的实际效率对比图；

图16为实施例7中不同处理下番茄幼苗光系统II非调节性能量耗散量子产量Y[NO]的对比图；

图17为实施例7中不同处理下番茄幼苗光系统Ⅱ的相对电子传递率ETRⅡ的对比图；

图18为实施例7中不同处理下番茄幼苗最大光量子效率Fv/Fm的对比图；

图19为实施例9中不同处理下番茄叶片SOD活性变化对比图；

图20为实施例9中不同处理下番茄叶片MDA活性变化对比图；

图21为实施例9中不同处理下番茄叶片POD活性变化对比图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。下列实施例中未具体注明的工艺设备或装置均采用本领域内的常规设备或装置，若未特别指明，本发明实施例中所用的原料等均可市售获得；若未具体指明，本发明实施例中所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1

本实施例提供了生防细菌的筛选和鉴定结果。

本实施例采用平板稀释涂布法和平板划线法从植物的根际土中分离纯化得到多株细菌，以番茄灰霉病菌作为指示菌，采用平板对峙法，获得一株对番茄灰霉病菌具有拮抗作用的细菌，将其编号为Bs-6，对该菌株进行形态特性、生理生化特性及分子生物学鉴定。

(1)形态学特征

将该菌种接种于LB固体培养基上划线培养，37℃培养48h，细菌成米白色分布，表面湿润，表皮褶皱，菌落边缘不平整，不透明，其菌落形态见图1；经显微镜油镜观察，菌株Bs-6呈杆状，单个或成对排列，芽孢圆柱形，中生或近端生，胞囊不膨大，革兰氏阳性，其微观形态见图2。

(2)生理生化特性

通过甲基红反应试验、葡萄糖氧化发酵试验、淀粉水解试验、接触酶反应试验、好氧或厌氧性试验、明胶液化试验、V.P.试验鉴定菌株Bs-6生理生化特性。结果表明，菌株Bs-6为好氧型细菌，甲基红反应和V.P.试验表现为阴性，淀粉水解、接触酶反应和明胶液化等试验均表现为阳性。

(3)菌株分泌物检测

IAA：将生防菌株Bs-6接种至LB液体培养基中，放入摇床中振荡48h，制成发酵液后备用。取Bs-6发酵液于离心管中，10000rpm离心20min，取1mL上清液于试管中，加入2mLSalkowaski试剂，在加入两滴正磷酸后放入28℃水浴中2h，观察溶液颜色变化。若溶液变紫红，则有IAA产生，反之则没有，3次重复。

结果如图3所示，生防细菌Bs-6的试管中，液体变为紫红色，说明生防细菌Bs-6能产生IAA。

嗜铁素：将生防菌株Bs-6接种至LB培养基中，放入摇床中振荡48h，制成发酵液后划线培养。将划线后的单菌落接种至嗜铁素培养基上，5d后观察是否有透明圆圈产生。若有透明圆圈产生，则证明产生嗜铁素，反之则没有，3次重复。

结果如图4所示，生防细菌Bs-6菌落周围形成了一层透明的圆圈，说明生防细菌Bs-6能产生嗜铁素。

蛋白酶：将生防菌株Bs-6接种至LB培养基中，放入摇床中振荡48h，制成发酵液后划线培养。将划线后的单菌落接种至蛋白酶培养基上，5d后观察是否有透明圆圈产生。若有透明圆圈产生，则证明产生蛋白酶，反之则没有，3次重复。

结果如图5所示，生防细菌Bs-6菌落周围形成了一层透明的圆圈，说明生防细菌Bs-6能产生蛋白酶。

(4)16SrDNA序列测定及系统进化分析：

以Bs-6基因组DNA为模板，扩增为16S rDNA的通用引物，得到约1368bp的PCR产物，扩增所得片段符合常规的16S rDNA序列长度。对PCR扩增产物进行回收，纯化回收后产物送到CICC进行测序。

将菌株Bs-6的16S rDNA序列提交到NCBI的GenBanK数据库中并进行Blast比对，并与已报道的序列进行同源性比对。用MEGA5.0软件分析，将“Bs-6”和相应物种16S rDNA序列的系统发生树进行了1000次重复运算，构建得到由图6所示的系统发育树，结果表明，生长树节点仅显示Bootstrap值超过50％，“T”为模式菌株。

通过对菌株Bs-6的形态观察、生理生化等指标鉴定和16S rDNA序列分析，将菌株Bs-6鉴定为枯草芽孢杆菌亚种(Bacillus subtilis subsp.subtilis)，并于2022年6月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.25087。

实施例2

本实施例将实施例1筛选得到的生防细菌Bs-6与多种植物病原菌进行平板对峙试验，测定生防细菌Bs-6的抑菌谱。

测试植物病原菌包括：禾谷镰刀菌F14013、木贼镰刀菌、黄瓜枯萎病病菌、玉米基瘤病菌、西瓜枯萎病病菌、尖孢镰刀菌、甜瓜枯萎病、玉米茎基腐病菌、葵花柱菌、黄瓜炭疽病、轮支镰刀菌和叶霉病菌；均保存于东北农业大学园艺生物技术实验室。

具体测试方法如下：

生防细菌Bs-628℃恒温，200r/min培养24h，得到菌悬液。将斜面培养的12种病原菌取出，采用平板对峙法，用无菌的接种环挑出少量菌丝至PDA培养基中，28℃培养，活化培养6d后取出。将长满病原菌的平板放入超净工作台中，用灭菌枪头打孔(直径5mm)制成直径5mm的病原菌琼脂块，再用无菌的接种针将病原菌块放在新的PDA培养基中央，在距离中心3cm处接种生防细菌。以滴加灭菌水的培养基作为对照。在28℃恒温箱培养6d后测量透明抑菌带的宽度，3次重复，结果如表1所示。

表1

由表1数据可以看出，Bs-6对12中植物病原真菌均能产生抑菌带，抑菌距离在2.9mm-4.5mm之间。生防细菌Bs-6对上述病原真菌的生长均具有较强的拮抗作用，这充分说明生防细菌Bs-6作为生防菌的抑菌谱较广、抑菌作用较强。

实施例3

本实施例检测了枯草芽孢杆菌亚种Bs-6、产氮假单胞菌WXCDD51、解淀粉芽孢杆菌Ba和枯草芽孢杆菌Bs wy-1的生物相容性。

本实施例中枯草芽孢杆菌亚种Bs-6由番茄根际土壤分离纯化所得，于2022年6月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.25087；

产氮假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)WXCDD51已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.12760；

解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)Ba购自中国农业微生物保藏管理中心，保藏编号为ACCC10147；

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Bs wy-1购自中国农业微生物保藏管理中心，保藏编号为ACCC10655。

将四种生防细菌纯化培养，用消毒的接种环挑取单菌落于LB液体培养基中，将LB培养基放入摇床中振荡2d后备用。将摇好的细菌发酵液用接种环蘸取少许，在平板上两两划“井”字状，2d后观察其生长情况。

结果如图8所示，四种生防细菌均可以正常生长，说明四种生防细菌之间彼此不会抑制生长。

实施例4

本实施例提供了一种生防复配菌剂，包括等体积混合的枯草芽孢杆菌亚种Bs-6菌悬液、产氮假单胞菌WXCDD51菌悬液、解淀粉芽孢杆菌Ba菌悬液和枯草芽孢杆菌Bs wy-1菌悬液，其中枯草芽孢杆菌亚种Bs-6菌悬液的活菌数均为0.5×10⁶cfu/mL、产氮假单胞菌WXCDD51菌悬液的活菌数均为1×10⁷cfu/mL、解淀粉芽孢杆菌Ba菌悬液的活菌数均为1×10⁶cfu/mL和枯草芽孢杆菌Bs wy-1菌悬液的活菌数均为1×10⁶cfu/mL。

对比例1

本对比例提供了一种生防复配菌剂，包括等体积混合的枯草芽孢杆菌Bs wy-1菌悬液和枯草芽孢杆菌亚种Bs-6菌悬液，其中枯草芽孢杆菌Bs wy-1菌悬液的活菌数均为0.2×10⁷cfu/mL，枯草芽孢杆菌亚种Bs-6菌悬液的活菌数均为0.5×10⁶cfu/mL。

对比例2

本对比例提供了一种生防复配菌剂，包括等体积混合的枯草芽孢杆菌Bs wy-1菌悬液、产氮假单胞菌WXCDD51菌悬液和枯草芽孢杆菌亚种Bs-6菌悬液，其中枯草芽孢杆菌Bswy-1菌悬液的活菌数均为0.2×10⁷cfu/mL，产氮假单胞菌WXCDD51菌悬液的活菌数均为1×10⁷cfu/mL，枯草芽孢杆菌亚种Bs-6菌悬液的活菌数均为0.2×10⁷cfu/mL。

实施例5

本实施例考察了实施例4、对比例1和对比例2提供的生防复配菌剂对番茄种子发芽率、胚根生长及幼苗生长的影响。

本实施例以番茄品种为“Glamour”为实验番茄品种，由东北农业大学园艺生物技术课题组提供。

设置4组处理，对比例1生防复配菌剂-A组、对比例2生防复配菌剂-B组、实施例4生防复配菌剂-C组和蒸馏水处理-D组，蒸馏水设为空白对照CK。

(一)种子发芽率和胚根长度：

先用75％的酒精浸泡种子3min，再用1％次氯酸钠溶液浸泡番茄种子1min，接着用无菌水冲洗5-7次，洗去种子表面溶液。分别取15mL各组生防复配菌剂倒入试管中没过番茄种子(每组200粒)，浸泡3h后取出，将浸过的种子置于无菌滤纸上的无菌培养皿中进行培养。将50颗经处理过的种子放在一个培养皿中，放在28℃的培养箱中4d。每日用无菌水喷洒过滤纸，在第2d计算发芽率，结果如图8所示；在第4d记录发芽番茄种子的胚根长，3次重复，结果如图9所示。

图8显示，不同处理下，番茄种子发芽数不同，48h番茄种子发芽率为C＞B＞A＞CK，实施例4生防复配菌剂浸泡下的番茄种子发芽率为77.7％，对比例2生防复配菌剂浸泡下的番茄种子发芽率为57.7％，对比例1生防复配菌剂浸泡下的番茄种子发芽率为41％，对照组发芽率为32.3％。

图9显示，不同处理下番茄种子萌发后4d的胚根长不同，表现为C＞B＞A＞CK，对比例1生防复配菌剂浸泡后的番茄胚根长度为0.67cm，对比例2生防复配菌剂浸泡种子得到的胚根长为0.71cm，实施例4生防复配菌剂浸泡处理后的种子胚根长为0.84cm，对照组胚根长为0.56cm。

(二)番茄幼苗根系指标及形态

番茄种子表面消毒后(方法同上)，用蒸馏水浸泡3h后中在培养皿中，待番茄幼苗长至两叶一心时，用A组、B组、C组以及蒸馏水4种处理分别做灌根处理，每组20mL，待番茄幼苗长至4-5叶时，将番茄幼苗根部剪下洗净，再将4种处理的根做根扫检测，测定表面积等指标，结果如图10所示和表2所示。

表2

由图10和表2可以看出，四种处理后的番茄幼苗根的总长度分别为C＞A＞B＞CK，实施例4生防复配菌剂处理下番茄幼苗生长最快，对比例1生防复配菌剂处理下的番茄幼苗根的生长优于对比例2生防复配菌剂；4-5叶时番茄幼苗根的表面积为A＞C＞B＞CK，对比例1生防复配菌剂灌根后的番茄幼苗更表面积最大，实施例4生防复配菌剂处理下根的表面积优于对比例2生防复配菌剂，对照组根的表面积最小；番茄幼苗根的节点数为C＞B＞A＞CK，实施例4生防复配菌剂灌根处理后的番茄幼苗根节点最多，对比例2生防复配菌剂处理后的根节点优于对比例1生防复配菌剂处理后根节点数；根尖数与番茄幼苗根的数量成正比，四种处理下的根尖数为C≈B＞CK＞A，实施例4生防复配菌剂处理后的番茄幼苗根尖数与对比例2生防复配菌剂处理后的根尖数相似，对照组优于对比例1生防复配菌剂处理后的番茄幼苗根尖数。

(三)番茄幼苗生长

将番茄种子用蒸馏水催芽后播种，待幼苗长至两叶一心时移至培养钵中30℃室温培养，实施例4、对比例1、对比例2三种生防复配菌剂对番茄幼苗进行灌根处理，每个培养钵30mL，无菌水作为对照，待番茄幼苗长至4-5叶时，对其株高、茎粗、干重、鲜重等指标进行测定，每个处理30株苗，3次重复。结果如图11和表3所示。

表3

处理组	株高(cm)	茎粗(mm)	根重(g)	鲜重(g)	干重(g)
						A	7.20±0.96ab	0.25±0.02ab	0.11±0.02b	0.08±0.01c	0.05±0.01bc
B	7.23±1.17ab	0.27±0,01a	0.17±0.01a	0.14±0.01b	0.07±0.01ab
						C	8.67±0.39a	0.29±0.03a	0.19±0.01a	0.25±0.03a	0.009±0.01a
CK	5.50±0.54b	0.21±0.02b	0.10±0.02b	0.05±0.02c	0.03±0.01c

图11和表3显示，对株高的影响为C＞B≈A＞CK，实施例4生防复配菌剂对番茄幼苗株高促进作用最好；对比例1生防复配菌剂与对比例2生防复配菌剂对番茄株高影响差不多，对茎粗的影响表现为C＞B＞A＞CK，与清水对照相比，其他三种处理后的番茄幼苗均无明显差异，实施例4生防复配菌剂对番茄幼苗茎粗的影响相对较高；四种处理对鲜重的影响表现为C＞B＞A＞CK；对番茄幼苗干重的影响表现为C＞B＞A＞CK。

实施例6

本实施例考察了实施例4、对比例1和对比例2提供的生防复配菌剂对番茄果实品质的影响。

选择外形尺寸一致、表面光洁、硬度相近、无病害的小番茄进行试验。用消毒水冲洗后，晒干，称量，然后分别加入4种不同的处理方法，即对比例1生防复配菌剂、对比例2生防复配菌剂、实施例4生防复配菌剂和蒸馏水中浸泡5min，经干燥处理后，用保鲜袋保存，在室温下保存12d，观察3d后的结果，各30个果实，3次重复，结果如图12所示。

每隔3d取番茄果实最大直径处削去果皮，用无菌水调零的GY-4果实硬度计测试过时的硬度并记录数据。多次取样测试，计算平均值，结果如图13所示。

由图12可以看出，实施例4生防复配菌剂能使番茄腐烂率达到最小化，为13.3％，从而有利于番茄的保鲜，对比例2生防复配菌剂使番茄腐烂率达20％，对比例1生防复配菌剂使番茄腐烂率达到26.67％，对照组的番茄腐烂率34.33％。

由图13可以看出，12d后番茄硬度均有所下降，但是不同处理下的番茄硬度变化不同，对比例2生防复配菌剂处理过的番茄果实在12d的硬度变化最小，对比例1生防复配菌剂与清水处理过的番茄果实硬度变化最大。可以说明，生防细菌混合发酵液喷施番茄果实，能在一定程度上减少番茄果实水分的流失，增加了番茄的保鲜时间，有利于番茄的保存。

实施例7

本实施例考察了实施例4、对比例1和对比例2提供的生防复配菌剂对番茄光合作用的影响。

将清水浸泡后的种子种至培养皿中，待番茄幼苗长至4-5叶时，将4种处理液喷施在番茄幼苗表面，将各处理组的番茄幼苗进行3h黑暗适应后，利用IMAAGING-PAM叶绿素成像系统测定各处理组的叶绿素荧光参数。叶绿素荧光参数如表4所示。

表4

(一)生防复配菌剂对番茄幼苗Y[II]的影响

如图14所示，实施例4生防复配菌剂的番茄幼苗对光合系统的实际效率影响最大，为0.74，对比例2生防复配菌剂处理的番茄幼苗对光合系统的实际效率影响为0.73，两者相差不大，对照组影响最小，为0.56。

(二)生防复配菌剂对番茄幼苗qP的影响

如图15所示，四种处理对番茄幼苗光化学猝灭的影响为C＞B＞A＞CK，实施例4生防复配菌剂处理对番茄幼苗光化学猝灭影响最大，为0.68，对比例2生防复配菌剂与对比例1生防复配菌剂对番茄幼苗光化学猝灭的影响分别为0.58和0.42，对照组对qP影响最小。

(三)生防复配菌剂对番茄幼苗Y[NO]的影响

如图16所示，对照组影响最大，说明光系统II非调节性能量耗散量子产量增加，处理后番茄幼苗产生胁迫，实施例4生防复配菌剂处理的番茄幼苗对Y[NO]影响最小，说明处理后的番茄并未产生胁迫。

(四)生防复配菌剂对番茄幼苗ETRⅡ的影响

如图17所示，四种处理均对ETRⅡ有影响，实施例4生防复配菌剂对ETRⅡ的影响最大，为23.6％，对比例2生防复配菌剂对ETRⅡ的影响与对比例1生防复配菌剂对光系统Ⅱ的影响大致相同，对照组影响最小。由此可见，生防细菌复配在一定程度上增加了植物的光合系统中的电子传递效率。

(五)生防复配菌剂对番茄幼苗Fv/Fm的影响

如图18所示，对比例2生防复配菌剂在处理后对番茄幼苗Fv/Fm影响最大，为0.76；实施例4生防复配菌剂次之，为0.74；其中对照组影响最小，为0.47。实施例4生防复配菌剂和对比例2生防复配菌剂在促进番茄光合效率以及光能转换率方面发挥着重要的作用。

实施例8

本实施例考察了实施例4、对比例1和对比例2提供的生防复配菌剂对番茄灰霉病温室防效的影响。

具体试验设计：

将4℃冰箱里保存的番茄灰霉病病原菌(Botrytis cinerea)纯化培养，用消过毒的接种环挑取菌丝至灭过菌的平板中，5-7d之后，待病原菌长满平板之后，将灭菌水倒至平板中，少量多次，同时用灭菌枪头不停搅拌，使灰霉孢子充分散落在无菌水中，将搅拌过后的浑浊液用纱布过滤，得到灰霉病原菌孢子液。用病原菌的孢子液喷施1d后，用4组不同处理25℃进行湿润培养，15天后记录病原菌的发病。

番茄灰霉病分级标准：

番茄在遭受灰霉病侵害后，会出现叶片褪绿现象。在离体叶片实验中，用番茄离体叶片褪绿面积为发病等级指标；温室盆栽实验中，依照叶片病斑面积计算植株发病情况，病害等级如表5所示。

表5

计算公式：

结果如表6所示。

表6

由表6可以看出，实施例4生防复配菌剂发病率最低，为26.7％，病情指数为0.6，防治效果为0.9％；对比例2生防复配菌剂发病率为33.3％，防治效果0.7％，比实施例4生防复配菌剂对灰霉病防治效果稍差；对比例1生防复配菌剂的发病率以及防治效果均低于对比例2生防复配菌剂和实施例4生防复配菌剂，但其防治效果比对照组好，说明细菌复配在一定程度上抑制了番茄灰霉病的发生，四种细菌混合发酵液效果要优于三种和两种细菌发酵液

实施例9

本实施例考察了实施例4、对比例1和对比例2提供的生防复配菌剂对番茄叶片防御酶含量变化的影响。

选取培养一个月、生长一致的番茄叶片，喷施灰霉病原菌孢子液，喷施1d后，分组喷施对比例1、对比例2、实施例4的生防复配菌剂和蒸馏水对照，继续培养7天，7天内每天定时取样检测防御酶含量。

准确称取同一部位，生长较一致的叶片0.1g，加入1mL提取液，4℃低温破碎研磨机充分研磨，4℃低温8000g离心10min，后取上清液于新的离心管中，按本领域常规方法测定相关酶活，结果如图19、图20和图21所示。

(一)超氧化物歧化酶(SOD)

图19是番茄叶片在7d内防御酶SOD的含量变化，从图中可以看出，各种处理在番茄灰霉病处理下都能诱导SOD活性增强，4种处理SOD的变化均是先上升后下降，生防细菌混合发酵液处理的番茄叶片SOD含量均高于CK，其中对比例2生防复配菌剂的叶片SOD含量在第二天中达到了最高点，为116.61U/g，实施例4生防复配菌剂次于对比例2生防复配菌剂，为97U/g，对比例1生防复配菌剂在第二天叶片SOD含量为87.08U/g，CK最低，为48.43U/g，从第三天到第七天番茄叶片中SOD酶含量变化趋于平稳。因此，整体看来，对比例2生防复配菌剂在7d中对SOD含量影响最大。

(二)丙二醛(MDA)

图20是番茄叶片在7d内防御酶MDA的含量变化，从图中可以看出，4种处理MDA的变化均是先上升后下降，生防细菌混合发酵液处理的番茄叶片MDA含量均低于CK，其中CK的叶片MDA含量在第二天中达到了最高点，为60.84nmoL/g，对比例1生防复配菌剂、对比例2生防复配菌剂、实施例4生防复配菌剂在第二天叶片中MDA含量相似，对比例1生防复配菌剂为48.33nmoL/g，对比例2生防复配菌剂为50.91nmoL/g，实施例4生防复配菌剂为47.82nmoL/g，从第三天到第七天番茄叶片中MDA酶含量变化趋于平稳。整体看来，CK在7d中对MDA含量影响最大，说明植物在这个过程中受到的迫害越大；实施例4生防复配菌剂在7d内对番茄叶片MDA含量影响最小，MDA含量越高，植物细胞膜质氧化程度高，细胞膜受到的伤害越严重，因此生防细菌的施用有利于植物体内MDA含量稳定，有利于植物生长。

(三)过氧化物歧化酶(POD)

图21是番茄叶片7d内POD的含量变化，从图中可以看出，4种处理下POD的变化均是先上升后下降，三种组合生防细菌混合发酵液处理的番茄叶片POD含量均高于CK，其中对比例1生防复配菌剂、对比例2生防复配菌剂的叶片POD含量在第二天中达到了最高点，对比例2生防复配菌剂为15453U/g，对比例1生防复配菌剂为13253U/g，实施例4生防复配菌剂番茄叶片中POD含量在第三天达到了顶峰，为16333U/g，CK的叶片POD含量在第二天达到最高，为13760U/g，从第三天到第七天番茄叶片中POD酶含量变化趋于平稳。整体看来，实施例4生防复配菌剂在7d中对POD含量影响最大。

Claims

1.一种生防细菌，其特征在于，所述生防细菌的分类命名为枯草芽孢杆菌亚种（Bacillus subtilis subsp.subtilis），于2022年6月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCCNo. 25087。

2.一种如权利要求1所述生防细菌在农业生物防治方面的应用，其特征在于，所述农业生物防治为将所述生防细菌用于防治黄瓜枯萎病、西瓜枯萎病、甜瓜枯萎病、玉米茎基腐病、黄瓜炭疽病、叶霉病，以及木贼镰刀菌、尖孢镰刀菌或轮支镰刀菌引起的作物病害。

3.一种生防复配菌剂，其特征在于，包括枯草芽孢杆菌亚种Bs-6、产氮假单胞菌WXCDD51、解淀粉芽孢杆菌Ba和枯草芽孢杆菌Bs wy-1，所述枯草芽孢杆菌亚种Bs-6的菌种保藏编号为CGMCC No. 25087；所述产氮假单胞菌WXCDD51的菌种保藏编号为CGMCCNo.12760；所述解淀粉芽孢杆菌Ba的菌种保藏编号为ACCC10147；所述枯草芽孢杆菌Bs wy-1的菌种保藏编号为ACCC10655。

4.根据权利要求3所述一种生防复配菌剂，其特征在于，包括等体积混合的枯草芽孢杆菌亚种Bs-6菌悬液、产氮假单胞菌WXCDD51菌悬液、解淀粉芽孢杆菌Ba菌悬液和枯草芽孢杆菌Bs wy-1菌悬液，其中枯草芽孢杆菌亚种Bs-6菌悬液的活菌数为0.5×10⁶cfu/mL、产氮假单胞菌WXCDD51菌悬液的活菌数为1×10⁷cfu/mL、解淀粉芽孢杆菌Ba菌悬液的活菌数为1×10⁶cfu/mL和枯草芽孢杆菌Bs wy-1菌悬液的活菌数为1×10⁶cfu/mL。

5.一种如权利要求3或4所述生防复配菌剂在农业生物防治方面的应用，其特征在于，所述农业生物防治为将所述生防复配菌剂用于防治番茄灰霉病。

6.一种如权利要求3或4所述生防复配菌剂在农作物种子及幼苗促生方面的应用。

7.一种如权利要求3或4所述生防复配菌剂在番茄防腐保鲜方面的应用。