Nothing Special   »   [go: up one dir, main page]

HU231090B1 - Antitest-kompozíciót termelő sejt - Google Patents

Antitest-kompozíciót termelő sejt Download PDF

Info

Publication number
HU231090B1
HU231090B1 HU0402066A HUP0402066A HU231090B1 HU 231090 B1 HU231090 B1 HU 231090B1 HU 0402066 A HU0402066 A HU 0402066A HU P0402066 A HUP0402066 A HU P0402066A HU 231090 B1 HU231090 B1 HU 231090B1
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
antibody
cell
activity
sugar chain
dna
Prior art date
Application number
HU0402066A
Other languages
English (en)
Inventor
Yutaka Kanda
Mitsuo Satoh
Kazuyasu Nakamura
Kazuhisa Uchida
Toyohide Shinkawa
Naoko Yamane
Emi Hosaka
Kazuya Yamano
Motoo Yamasaki
Nobuo Hanai
Original Assignee
Kyowa Kirin Co., Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=18788817&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=HU231090(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Kyowa Kirin Co., Ltd. filed Critical Kyowa Kirin Co., Ltd.
Publication of HUP0402066A2 publication Critical patent/HUP0402066A2/hu
Publication of HUP0402066A3 publication Critical patent/HUP0402066A3/hu
Publication of HU231090B1 publication Critical patent/HU231090B1/hu
Priority to HUS2000035C priority Critical patent/HUS2000035I1/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
    • C12N5/16—Animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3076—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells against structure-related tumour-associated moieties
    • C07K16/3084—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells against structure-related tumour-associated moieties against tumour-associated gangliosides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/06—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies from serum
    • C07K16/065—Purification, fragmentation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/90—Isomerases (5.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/005—Glycopeptides, glycoproteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

Antitest-kompozíciót tenaelö sejt
A találmány területe tn találmány egy antitest molekula, mint pl. különféle betegségekhez felhasználható .antitest, egy antitest-fragmens. és tartalmazó fúziós fehérje és hasonlók, termelésére alkalmas sejtre vonatkozik, valamint egy eljárásra antxtest~kompozició termelésére az. említett sejt felhasználásával, az antitest-kompozícióra és annak, alkalmazására.
A találmány háttere .Mivel az antitestek nagy kötő-aktivitással, kőtő-specifitással és nagy stabilitással rendelkeznek a vérben, megkísérelték alkalmazásukat diagnózisra, különféle humán betegségek megelőzésére es kezelésére [Monoclonal Antibodies: Principles- and Applications., Wiley-Liss, Inc,, 2.1 kötet (1995)]. Egy humanizált antitest termelését, mint pl. humán kiméra antitest vagy egy humán komplementaritást meghatározó régió-beillesztett (az aisomiakban CDR~g ratted” -ként hivatkozunk rá) antitest, amely egy embertől eltérő állatból származó- antitestből származik, szintén megkísérelték genetikai rekombináns technikákkal. A. hu man kamera antitest egy olyan antitest., amelyben az antitest variáotlis régióba (az alábbiakban ”V” régió) egy nem-humán antis..hő.^. sz.<s..:,maüjc es a Konstans régiója íaz alábbiakban MC^ ré—
Kimutatták, hogy az emlősökből származó antitestekben öt osztály, nevezetesen az IgM, IgD, IgG, IgA és IgE van jelen. A humán IgG osztály antitestje.it alkalmazzák főként diagnózisra., különböző humán betegségek megelőzésére és kezelésére, mivel azok funkcionális jellemzőkkel rendelkeznek, mint pl. hosszú fél-életidő a vérben., különböző ef faktor funkciók és hasonlók [Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Wiley-Liss, xnc., x. kötet (χύνο) j . A numán. IgG osztály antitestjeit tovanb osztályozták négy alosztályba: IgGl, IgG2, IgG3 és IgG4. Nagyszámé tanulmányt folytattak eddig az antitest-függő sejtközvetitett eitotoxikus aktivitás (az alábbiakban ADCC aktivitás') és a kompiement-dependens citotoxikus aktivitás (az alábbiakban CDC aktivitás)· mint .az IgG osztályú antitestek effektor funkcióinak vizsgálatára, és azt közölték,, hogy a humán IgG osztály antitestjei között az IgGl alosztály rendelkezik a legnagyobb ADCC aktivitással és CDC aktivitással (Chemical Immunology 65, 88 1:997)]. A fentieket tekintve a leotöbb tumorellenes humanizált antitest, beleértve a kereskedelemben kapható Rituxant és Herceptint, amelyek, nagy effektor funkciókat igényelnek saját hatásaik kifejeződéséhez, a humán IgGl alosztályba tartozik..
A humán IgGl alosztályba tartozó antitestek ADCC aktivitásának és CDC aktivitásának kifejeződéséhez szükséges az antitest Fc-régió j ának kötődése egy antitest-receptorhoz, amely az eite-ktor sejt felszínén van. jelen, mint pl. ölősejt, természetes Oxósej. u, ~gy «xtxvalt maxrotag vagy na somok. (az axábbiakoan FcyR”-ként hivatkozunk rá), és különböző komplement komponensek
kötöttek, A kötődést tekintve feltehető, hogy bizonyos aminosav maradékok az antitest kapocs (hinge) régiójában és a C-régió második. dóménjében (az alábbiakban. ”Cy2 dómén) fontosak [Eur. J< Immunoi. 23, 1098 (1993), Immunology 86, 319 (1995), Chemical Immunology 65, 88 (1997)], és hogy a Cy2 doménhez kötődő cukorlánc [Chemical Immunology 65, 88 (1997)] is fontos szerepet játszik,
A cukor!áncot tekintve, Soyd és mtsai megvizsgálták a cukorlánc hatását az A.DCC aktivitásra és CDC aktivitásra egy humán CDR-grafted CAMPATH-1H antitesttel (humán IgGl alosztály) történő kezeléssel, melyet kínai hörcsög petefészek sejt által. (CHO sejt) vagy egér miéi óma NSO sejt (NSO sejt) által termeltek kü~ .xönbözc· cukor—nidrolrzaló őtíziíeskks j. , és azt közölték, hogy a nem-redukáló sziálsav vég eliminálása nem befolyásolja ezeket az aktivitásokat, de a CDC aktivitásra önmagában hatással van a galaktóz-maradék további eltávolítása és az aktivitás kb. 50%-ra csökkent, továbbá, hogy a cukorlánc komplett eltávolítása mindkét aktivitás eltűnését eredményezte [Molecular Immunoi. 32, 1311 (1995)j, Lifely és mtsa.i szintén analizálták a cukorlánc kötődését a CAMPATH”1H humán CDR-grafted antitesthez (humán IgGl alosztály)., amelyet CHö sejttel, NSO sejttel vagy patkány mielóma YO sejttel termeltek, mérték az ADCC aktivitását és megállapították, hogy a γ-ó sejtből származó CAMPATH-1H mutatta a legnagyobb ADCC aktivitást, ami azt sugallja, hogy az d-acetilglükózamin (az alábbiakban GlcNAc-ként hivatkozunk rá) a felező pozícióban felelős az aktivitásért [Glycoboplogy _5, 813 (1995)], zek a cikkek azt jelzik, hogy a cukorlánc szerkezete szerepet játszik az IgGl alosztály antitestjei effekto.r funkcióiban, és hogy lehetséges a cukorlánc szerkezetének megváltoztatásával egy olyan antitest előállítása, amely nagyobb effektor funxciovax brr. Azonban, jelenleg a cuk.orl.anc szerkezetei eltérők és komplexek., és nem lehet azt mondani, hogy az efrektor x.unKCxóhoz szüKseges lényeges szerkezeturet azonosítottak»
A glikoproteinek. cukorláncait durván két típusba osztották a fehérje-egység kötés-képzése alapján, nevezetesen egy a.szparegínhoz kötődő cukorláncra (b-glikozid-kapcsolt cukorlánc) és egy más aminosavhoz, mint pl., szerin, treonin kötődő cukor.láncra (C~ -glikozid-kapcsolt cukorlánc). Az Μ-glikozid-kapcsolt cukorláncok különféle szerkezetűek [Biochemical Experimentation Method 23 - Method for Studying Glycoprotein Sugar Chain (Gakujutsu Shuppan Center), kiadó: Reiko Takahashi (1989)], de az ismert, hogy egy alábbi (I) szerkezeti képlefű közös alap mag(core)szerkezettel rendelkeznek.
Mánál
Manpl-------► 4GloNAcpl------------------------► 4GlcNAc
Mánál (I) szerkezeti képlet
A cukorlánc terminálisát., amely az aszparaginhoz kötődik, redukáló· vegnek nevezzük, és az ellenkező oldalt nem-redukáló· végnek. Ismert., hogy az M-gl.ik.ozid-kapcsolt cukorláncba beletartozik egy magasan mannóz típus, amelyben a mannóz önmagában kötődik a mag-szerkezet nem-redukáló végéhez; egy komplex típus.
amelyben a mag-szerkezet nem~reduká.lcs vége a galaktóz-h’-acetilglükóz dia m leg-aiacb egy parnuzaisos agát tartalmazza (az alábbi—· aknan ’’Gai-GlcNAc-ként hivatkozunk rá) és a Gal~G.lcN'Ac nemredukáló végén, van egy sziálsav-szerkezet, felező Ar-acetil-giükő-zamin vagy hasonló; egy hibrid-típus, amelyben a magszer kezet nem-redukáló vége hordozza, mind a magasan .mannóz típust mind a komplex típust; és hasonlók.
Egy IgG-tipusú antitest Ec-régiójában két N-glikozidkapcsolt cuKorla.no kötőhely van jelen. igG szérumban a cukorlánc Kötőhelyhez általában egy komplex-típusú, több-ágú cukorlánc kötődik, és amelyben a sziálsav vagy a felező &~acetil-glükózamin hozzáadása alacsony. Ismert, hogy a változatosság van a galaktóz hozzáadását tekintve a komplex-típusú cukorlánc nem-redukáló végéhez és a fruktóz hozzáadását az IZ-acetil-glükózamin redukáló végéhez [Biochemistry 36,. 130 (1997; ] .
Tekintetbe vettük, hogy egy ilyen cukorlánc szerkezetét a cukorlánc gének határozzák meg, nevezetesen egy glikoziltranszreráz gén, amely a cukorláncot szintetizálja és egy gli.kolitikus enzim génje, amely hidrolizá.lja a. cukorláncot .
Az h-glikozid-kapcsolt cukorlánc szintézisét az alábbiakban ismertetjük.
A glikoproteínek egy cukorlánccal az endoplazmikus retikulum (az alá.bbla..kba.n”ER”-ként említjük) üregben módosulnak. Az A-glxkozid-Kapcsolt cukor.lánc bioszintézis lépése során, egy relatíve nagy cukorlánc szállítódik a polipeptid-lánchoz, amely megnos-szaob-odiK az E.R. üregben.. A transzformációban a cukörlánc először sikeresen hozzáadódik egy hosszú láncú lioid hordozó foszfát-csoportjaihoz, amely kb. 2ö <x-izoprén-egységet tartalmaz, amelyet dolic.hol-foszf átnak nevezünk (az alábbiakban ”PDől'-ként hivatkozunk rá} . Azaz az λ-acetil-glükózamin átszáll!tódik a dolichol-fosztáthoz, ezáltal GlcNAc-P-P-Dol képződik és ezután még egy GlcNAc transzferál GlcNAc-GlcNAc-P-P-Dol-t képezve. Ezt követően Öt mannóz (ez alábbiakban ”Man”~ként említjük} transzferál, így (Man) 5-(GlcNAcH-P-P-Dol képződik és ezután négy mannóz és három glükóz (melyre, az alábbiakban Glc^-ként hivatkozunk) transzferál. így egy cukorlánc-prekurzor, (Glc)y-(Man)s- (GlcNAc) 2-P-P-bol képződik, melyet oligoszacharid-magnak nevezünk. A 14 cukorrészt tartalmazó cukorlánc-prekurzor egy tömegként szállitódik a polipeptidhez, amelynek egy aszparagin-X-szerin- vagy aszpa.ragin-X-treonin-szekvenciá.ja van az ER üregben. A reakcióban az oligoszacharid-maghoz kötött dolichol-pirofoszfát (P-P-Dol) felszabadul, de ismét doliohol-foszfáttá alakul pirofoszfatázzal történő hidrolízissel és reciklizálódik. A cukorlánc nyitása (trimmelése) azonnal megkezdődik, miután a cukor lánc a polipeptidhez kötődik. Azaz 3 Glc és 1 vagy 2 Man eliminálódik az ER-n és ismert, hogy az a-1,2—glükozidáz I, a-l f 3-^glükozidáz II és az -g-1,2-mannozidáz kapcsolatban van az eliminálással.
A glikoprotein, amely alá van vetve a trimmelésnek az ERben, atnelyeződik a Golgi-testbe, és különböző módon módosul.. A. Golgr-test ciaz-t észében AT-acetil-glükozamin-foszf otranszferáz, amely részt vesz a mannóz-foszfát hozzáadásában, iV-acetil-giukózamin-1-f ősz födi észter a- &’-acetil-glükó zárni n idéz és a
-man.n.ozi.d.áz X vannak jelen, és a Man-részeket 5-re csökkentik. A
Gdgi-test középső részében N-acetil-glükózamin-tran.
komplex-típusú A'-glikozid-kapcsolt cukorlánc el ső külső GlcNAc-nek hozzáadásában vesz részt, a-mannczidáz II, amely 2 Man-t eliminál, A^acetil-gltikózamin-transzf eráz II íGnTII) , a kívülről a második Gloh’Ac hozzáadásában vesz részt, és λζ xx— 1 f t— lU-koz.r 1 tramzx.eraz, ame.x v a reoukacó vég acetax— -.glűkózaminjához egy fukóz hozzáadásában vesz részt, vannak jelen. A Golgi-test transz-részében galaktóz transzferár, amely a galaktóz hozzáadásában vesz részt és szialiItranszferáz, amelv a
Általában a legtöbb humanizált antitestet, amely gyógyszerhez történő felhasználáshoz tekintetbe vehető, genetikai rekombináns technikákkal állítják elő, és kínai hörcsög petéiészex szövet-eredetű. CHO—sejtben, vu-ir··*·. gazdaseá tben termelik. Azonban, amint a fentiekben leírtuk, mivel a cukorlánc szerkezete iigyelemreméltóan jelentős szerepet játszik az antitestek et.tektor funkciójában, és eltéréseket állapítottak meg a gazdasejtek által expresszált glikoproteinek cukorláncának szerkezetéten, kívánatos egy olyan gazdasejt kifejlesztése, amely felhasználható magasabb effektor funkcióval rendelkező antitest
Abból a célból, hogy a termelt glikoprotein cukorlánc& zei Kereté r mcdosxtsak, .tulonzeie e.i garasokat kíséreltek meg, xgy például 1) egy inhibitor alkalmazása a cukorlánc módosítására vonatkozó enzimmel szemben, 2) egy mutáns szelektálása, 3) a cukorlánc módosításáért felelős enzimet. kódoló gén bevezetése és hasonlók. Specifikus példákat az alábbiakban ismertetünk.
A cukorlánc módosításáért felelős enzim elleni inhibitorokra példaként szolgálnak a tunicárnycin, amely -szelektíven gátolja a GlcNAc-P-P-Dol képződését, mely az U-glikozid-kapcsolt cukorlánc prekurzorának, a mag cligoszacharid képződésének első lépése; a castanospermin és az N-metil-l-dezoxinojirimicin^ melyek a glikozidáz X inhibitorai; bromocondulitol, amely a glikozidáz II inhibitora; l~dezoxi.no jirimi cin és 1 f 4-dioxi-l, 4-imino-D-mannitz melyek a manno zidáz I inhibitorai; swainso.n.in, amely a mannozídáz II inhibitora és hasonlók. A glikozil-t.ranszferázra specifikus inhibitorok példái közé tartoznak az Ar-aoetil~ -glükózamin transzferét V (GnTV) elleni szubsztrátok dezoxiszármazékai és hasonlók [Glyoobíology Series 1 ~ Destiny of Sugar Chain ín Cell (Kodan-sha Scientific), kiadó: Katsutaka Nagai, Senichiro Hakomori és Akira Kobata (1993)]. Az is ismert, hogy az l~dezoxinajirimicin gátolja a komplex-típusú cukorlánc szintézisét és növeli a magas mannóz-típusü e.s hibrid-típusú láncok arányát. Jelenleg azt közölték, hogy az IgG cukorlánc szerkezete megváltozott -és a tulajdonságok, mint pl. antigénkötő aktivitás és hasonlók változott., -amikor Inhibitorokat adtak a tápközeghez [Molecular Immunol. 26, 1113 (1989)].
A cukorlánc módosításáért felelős enzim aktivitását tekintve a mutánsokat többnyire szelektálták és lektin-rez.iszte.ns sejt.vonalként kapták. Például, különböző cukorlánc szerkezetű CHO sejt mutánsokat egy lektIn-rezisztens sejtvonalként kapták egy lektín, mint pl. WGA. (T. vulgaris-ból. származó búzacsíra agglutinin), ConA (C. ensiform!a eredetű, cocanavalin A), RIC UP. comuni s eredetű, toxin), L-PHA (P. vulgaris eredetű leucoagglutinin), LOA (L. cuiin-aris eredetű lentil agglutinin), PSA >P. sativum eredetű borsó lektin) vagy hasonlók felhasználásával (Somatic Cell Mol. Genet. 12, 51 (198 6;].
Példaként egy cukorlánc módosításáért felelés enzim génjének egy gazdasajtba történő bevezetése, által kapott termék cukorláncának módosítására, azt közölték, hogy egy fehérje, amelyben nagyszámú sziálsavat adtak a cukorlánc nem-redukáló végéhez, termelhető a patkány B-galaktozidáz--a-2,6-sziál-tr.anszferáz CHO sejtbe történő bevezetésével [J. Bioi. Ch.em. 2.61, 13848 (1989) ] .
Azt is megállapították, hogy egy H antigén (Fucal-2Galbl~;, amelyben f-ukózt fa továbbiakban fuc) adtak a cukorlánc nemredukáló végéhez, expresszálható humán h-galaktozidaz-l-a-fukozíl-transzferáz egér L sejtbe- történő bevezetésével [Science 252, 1668 (1991)]. Továbbá annak, ismeretében, hogy az 27—gli ko-zid-kapcsolt cukor Lánc felező-helyzetű. M-acetilglőkózaminja lényeges az antitest ADCC aktivitása szempontjából,· Umana és mtsai előállítottak olyan CHO sejtet, amely $-1,4-17sceti.1 -glükózamin transzferár III-1 (GnTITI) expresszál és őszszeha.sonlitottá.k azt a szőlősejtvonal GnTIII expressziójával, Megállapították, hogy a GnTIII-expressziót nem lehetett megfigyelni a CHO sejt szülő sejútvonalában (J. Biol. Chem. 261, 13370 (1-984) j, és hogy annak az antitestnek az ADCC aktivitása, amelyet GnTIH-at expresszaló CHO sejttel termeltek, 16-szor magasabb, mint a szülő sejtvonal segítségével expresszált antitesté [Glycobiology 5, 813 (1995), WC 99/543421. Ugyanakkor Umana és .mtsai előállítottak olyan CHO sejtet .is, amelybe a β-Ι,-4-Nacetir glukozamin transzreraz V—t νύπϊν) vezet tex ce, es azt kö zölték, hogy a GnTIII vagz GnTV túlzott expressziója toxikus a
CHO sejtre.
A találmány összefoglalása így tehát, abból acélból, hogy módosítsuk a termelni kívánt glikoprotein cukor.lánc szerkezetét, megkíséreltük a gazdasejtben a cukorlánc módosításáért felelős enzim aktivitásának szabályozását, de jelenleg, a cukorláncok szerkezetei különbözőek és Komplexek, és a cukorláncok fiziológiai szerepeinek ismerete még nem kielégítő, úgyhogy a kísérlet és a hiba ismétlődik. Különösen, bár azt mutatták ki lassanként, hogy az antitestek effektor funkcióját nagymértékben befoyásolja a cukorlánc szerkezete, egy valóban jelentős cukorlánc szerkezetet még nem sikerült azonosíucixxx. íuZek »zeu.nt euv cukorianc szerKszet azonosítása, amelv ··· * .J befolyásolja az antitestek effektor funkcióját és a gazdasejt kifejlődését, amelyhez egy ilyen cukorlánc szerkezetet hozzáadunk, várhatólag kifejleszthető gyógyszerré.
A találmány rendelkezésre bocsát egy gazdasejtet, amely egy antitest-kompozíciót termel és képes szabályozni az antitest molekulához kötődő cukorlánc szerkezetet., egy sejtet, amely magas A11CC aktivitású antitest-kompo-zíciót tud termelni, egy antitestKompozíciót termelő eljárást, a. sejt felhasználásával és a termelő eljárással termelt antitest-komooziciót.
A jelen találmány az alábbi (1)--(61) pontban megadottakra (1) Kínai hörcsög petefészek-eredetű CHO sejt, amelybe egy antitest molekulát kódoló gént bevezettünk, amely egy antitestkompozíciót termel, amely egy Fc-régióhoz kötött komplex Δ7glikozi'd~kapc.:solt cukorláncokat hordozó antitest molekulát tartalmas, ahol a kompozícióban az Fc-régióhoz kötött összes komplex b-glikozid-kapcsolt cukorlánc között annak a cu.korláncnak az aránya, melyben a fukóz nem kötődik az Jv-acetí 1-qlükózaminhoz a redukáló végen a cukorláncban, 20% vagy még több.
(2· Az íl) szerinti CEO sejt, amelvben a cukorlánc, melyhez a fukóz nem kötődik, egy komplex E-giikozid-kapcsclt cukorlánc, amexyben az i— neryzetü ^ukoz nem Xuuödix. a u—hej.vzecn b—acetzz — glükózaminhoz α-kötéssel a redukáló végen.
(3) Az (1) vagy (2) szerinti CHO sejt, amelyben az antitest molekula egy IgG osztályba tartozik>
(4) Az (1)-(3) szerinti C.HO sejt, amelyben egy intracelluiárts cukor nukleotid, a GDP-fukóz szintéziséért felelős enzim, aktivitása és/vagy azon eukorlánc módosításáért felelős enzim aktivitása, amelyben az 1~ es helyzetű fukóz a komplex ,V— glikozid-kapcsclt cukorláncban alfa-kötésen keresztül kötődik az AJ-acati1-glükózamin 6-os helyzetéhez a redukáló végen, csökkentett vagy beletelt géntechnológiai technikákkal.
(5) A (4) szerinti CHC sejt, amelyben az intraoelluláris cukor nukleotid, a GDP-fukóz szintéziséért felelős enzimet az aiaobz (a), (b) és (c) csoportból választjuk ki:
(a) GMD (GDP-mannóz 4,6-dehidratáz) (b; Fx(GDP-keto-6-dezoximannóz 3,5-epimeráx,4-reduktáz) (ej GFPP íGDr-béta-L-fukóz pircfoszforiláz·.
(6) Az (5) szerinti CH-0 sejt, amelyben a GMD egy fehérje, melyet az alábbi is) vagy (b· DNS kódol:
(a) DNS, mely a SEQ ID NO:65 által bemutatott nukleotid-szekvenciát tartalmazza.;
(b) DNS, amely a SEQ ID NO: 6'5 által bemutatott nukleotíd-stskvenciával szigorú körülmények között hibridizál és egy GMD aktivitású fehérjét kódol.
<7) Az (5; szerinti CHO sejt, amelyben a GMD egy fehérje, melyet az alábbi (a), (b; és (o> csoportból választunk ki:
(a) fehérje, amely a SEQ ID NO:71-ben bemutatott aminos a v - s z e k ve ne iát t a r t a Ima z z a ;
(b) fehérje., amely egy SEQ ID NO: 71 szerinti aminosavszekvenciát. tartalmaz, amelyben legalább egy aminosav deistáit, helyettesített, inszártáit és/vagy hozzáadott, és GMD aktivitású;
[c) fehérje, amely a SEQ ID N0:71 szerinti aminosavszekvenciával legalább 80%-ban homológ aminosav-szekvenciát tartalmaz és GMD aktivitású.
(8) Az: (5) szerinti CHO sejt, amelyben az Ex egy fehérje, melyet egy, az alábbi (a) vagy tbí csoportból kiválasztott DNS kódol:
(a) DNS, amely a SEQ ID NO:48 által bemutatott nukleotid-szekvenciát tartalmazza;
íb) DNS, amely a SEQ ID NO: 48 által bemutatott nukleotid-szekvenciával szigorú körülmények között hibridizál és egy Ex aktivitású fehérjét kódol.
(9) Az (5) szerinti CRO sejt, amelyben az Fx egy fehérje, melyet az alábbi (a), (b)· és (c) csoportból választunk ki:
(a) fehérje, amely a SEQ ID NO:72-ben bemutatott aminosav-szekvenciát tartalmazza;
(r>) fehérje, ame.lv eoy SEQ ID NO: 72 szerinti aminosav— szekvenciát tartalmaz, amelyben legalább egy aminosav deletált, helyettesített, insze.rtált és/vagy hozzáadott, és Fz aktivitású;
(c) fehérje, amely a SEQ l.D NO: 72 szerinti aminosavszekvenciával legalább 80%-ban homológ aminosav-szekvenciát tartalmaz és Ex aktivitású.
(lú) Az (5) szerinti CHO sejt, amelyben az GFPP egy fehérje, melyet egy, az alábbi (a) vagy (b) csoportból kiválasztott DNS kódo1:
(a) DNS, amely a SEQ ID NO:51 által bemutatott nu k 1 e o t i ,d~ s z e k véne i á t tarts Ima z z a ;
(b) DNS, amely a SEQ ID NO: 51 által bemutatott nukleotid-szekvenciával szigorú körülmények között hibridizál és egy GFPP aktivitású fehérjét kódol.
(Hí Az (5} -szerinti CHO sejt, amelyben a GFPP egy fehérje, melyet az alábbi (a), (b) és (c) csoportból választunk ki:
(a) fenerje, amely a SEy ID NO:/3—ban bemutatott amino— s av-s zekveηoiát tártálma z z a;
(b) fehérje, amely egy SEQ ID NO:73 szerinti aminosavszekvenciát tartalmaz, amelyben legalább egy aminosav deletált, helyettesített, inszertált és/vagy hozzáadott, és GFPP aktivitá- (c) fehérje, amely a SEQ ID NO: 73 szerinti aminosavs zekvenciáva 1 legalább 8 0%-ban homo 1ό·α ami no sav-szekvenciát tartalmaz és GEPP aktivitású.
(12) A (4) szerinti CHO sejt, amelyben azon cukorlánc módosításáért. felelős enzim, amelyben az 1-es helyzetű fükóz az W~ glikozid-kapcsolt. cukor láncban «-kötéssel kötődik a redukáló végen a komplex Iv—acetil —giú.kózam.in. fe—os helyzetéhez., az cc-1,6— fukozil-transzferáz.
(13) A (12) szerinti CHO sejt, amelyben az a-1,6-fukoziltranszferaz egy teherje, melyet az (a) vagy í.e) DNS kódol:
(a) DNS, amely a SEQ ID NO:1 által bemutatott n uk 1 ect rd s ze kvenc iá c tartalma zz a (b) DNS, amely a SEQ ID NO: 1 által bemutatott nukleotid-szekvenciával szigorú körülmények között h.ibridizá.1 és egy a-1,δ-fukozil-transzferáz aktivitású fehérjét kódol» (14) A (12) szerinti CHO sejt, amelyben az a-1,6-fukoziltranszferáz egy fehérje, melyet az alábbi (a), (b) és (c) csoportból választunk ki:
(a) fehérje, amely a SEQ ID NO:2 3-ban bemutatott aminos av-s z ekve n c i át tartaima zz a;
(b) fehérje, amely egy SEQ ID NO:23 szerinti aminosavszekvenciát tartalmaz, amelyben legalább egy aminosav deletált, helyettesített, inszertá.lt és/vagy hozzáadott, és a-1, δ-f ukoz.iltranszferáz aktivitású;
(c) fehérje, amely a SEQ ID NO:23 szerinti aminosavszekvenciával legalább 80%-ban homológ aminosav-szekvenciát tartalmaz és a-1,6-fukozll-transzferáz aktivitású.
(15) A (4)-(14) bármelyike szerinti CHO sejt, amelyben az enzimaktivitást csökkentettük vagy eltávolitottuk az alábbi (a), (b) , (c)f (d) vagy (e) technikák valamelyikével:
(a) gén-díszrupciós technika megcélozva az enzimet kó·· (b) technika az enzimet kódoló gén domináns negatív mu- tánsán a k bevez et ésér e, technika mutáció bevezetésére (d) technika az enzimet kódoló gén transzkripciójának vagy l zans z iácu,ó j snaκ ga t .Lasara t (e) technika egy lektinnel szemben rezisztens sejtvonal szelektálására, amely felismer egy cukorláncot, amelyben az 1-es helyzetű fukóz az /V-acetil-glükózamin 6-os helyzetéhez kötődik a redukáló végen, alfa-kötésen keresztül, a komplex N-glikozidkapcsolt cukorláncban.
(16) A (4)-(15) bármelyike szerinti CHO sejt, amely rezisztens legalább egy lektinre, amely felismer egy cukorláncot, amelyben az 1-es helyzetű fukóz az N-acetil-glükózamin 6-os helyzetéhez kötődik alfa-kötésen keresztül a redukáló végen a komplex IJ-glikozid-kapcsolt cukorláncban.
(1/) A (4)-(16.) bármelyike szerinti CHO sejt, amely egy antitest-kompozíciót termel, mely nagyobb antitest-függő sejtközvetített citotoxikus aktvitással rendelkezik, mint a szülő
CHO sejtje által termelt antitest-kompozíció.
(18) A (17) szerinti CHO sejt, amely nagyobb antitest-függő sejt-közvetített citotoxikus aktivitással rendelkező antitest5-ΉΤ. X X Θ S tS KOfXp O S.l C X ó ? ΧΠ'ιΧ X y Ο Χ Γί
vty.
•<b,í DNS, amely a SEQ ID NO: 65 által bemutatott nukleotíd-szekvenciával szigorú körülmények között hibridizál és egy GMD aktivitású fehérjét kódol.
•'2€) A (24) szerinti sejt, amelyben a GMD egy fehérje, melyet az alábbi (a), íbj és (o) csoportból választunk ki:
(a) fehérje, amely a SEQ ID N0:71-ben bemutatott aminosav—szakveπclat tertalma zza;
(bj fehérje, amely egy SEQ ID NO;71 szerinti aminosavszervsnciat tartalmaz, amelyben legalább egy aminosav deletált, helyettesített, inszertált és/vagy hozzáadott, és GMD aktivitá(c) rehérje, amely a SEDQ ID N0:71 szerinti aminosavszekvenciavai legalább 80%-ban homológ aminosav-szekvenciát tart-aimaz és GMD aktivitású.
(27) A (24) szerinti sejt, amelyben az Fx egy fehérje, melyet· sz arabba (,a} vagy (c) csoportból kiválasztott DNS kódol;
(a) DNS, amely a SEQ ID NO:48 által bemutatott nukl.eot.id-szekvenciát tartalmazza;
(b) DNS, amely a SEQ ID NO: 48 által bemutatott nukleotid-S'zekvenciával szigorú körülmények között hibridizál és egy Fx aktivitású, fehérjét kódol.
(28) A (24) szerinti sejt, amelyben az Fx egy fehérje, melyet az alábbi (a), (b) és (c) csoportból választunk ki:
(a) fehérje, amely a SEQ ID NO:72-ben bemutatott aminoS-SV~ S2.Κ,νθΠΟ.ί á 2. C3 ΓT 3 X&··&'£ 2./· (b) fehérje, amely egy SEQ ID NO:72 szerinti aminosavszekvenciát tartalmaz, amelyben legalább egy aminosav deletált, helyettesített, inszertált és/vagy hozzáadott, és Fx aktivitású;
(c) fehérje, amely a SEQ ID NO;72 szerinti aminosavszekvenciával legalább 80%-ban homológ amínosav-szekvenciát tartalmaz és Fx aktivitású.
<zva <24; szerinti sejt, ameryoen az OFPr egy fehérje, melyet az alábbi (a) vagy (b) csoportból kiválasztott. DNS kódol:
(a) DNS, amely a SEQ ID NO;51 által bemutatott nuk1eotí d-s z ekvenci át tártálma. z z a;
(b) DNS, amely a SEQ ID NO: 51 által bemutatott nukleotid-szek.venciával szigorú körülmények között hibridizál és egy GFPP aktivitású fehérjét, kódol.
(a) fehérje, amely a SEQ ID NO:73-ban bemutatott aminosav-szekvenciát tartalmasza;
(b) fehérje, amely egy SEQ ID NO:73 szerinti aminosavszekvenciát tartalmaz, amelyben legalább egy aminosav deletált, nelyet t esete tt, mszertárt és /vagy hozzáadott és C.5EPP aktivitású;
(c) fehérje, amely a SEQ ID NO:73 szerinti aminosavszekvenciával legalább 80%-ban homológ aminosav-szekvenciát tartalmaz és GFPP aktivitású.
(31) Ά (23) szerinti sejt, amelyben azon cukorlánc módosításáért felelős enzim, amelyben az 1-es helyzetű fukar az íl-glikozid-kapcsölt cukorláncban a-kötéssel kötődik a redukáló végen az N-aceti 1-glükózamin β-os helyzetéhez., az a-1,6-fukoziltranszf erá.z.
(32; A (31) szerinti sejt, amelyben az a-1,6-fuk.oziit ran s.zf eráz egy fehérje, melyet az alábbi (a), (bj , (c; vagy (d) DNS kódol:
(a) DNS, amely a SEQ ID NQ:1 által bemutatott nukleotid-szekvenciát tartalmazza;
(b) DNS, amely a SEQ ID NO:2 által bemutatott nukieotid-szekvenciát t a r t aImazza;
(c) DNS, amely a SEQ ID NO:1 által bemutatott nuklectid-szekvenciával szigorú körülmények között hibridizál és egy «-!, β-fukozi 1-transzferéz aktivitású fehérjét kódol, (d) DNS, amely a SEQ ID NO: 2 által bemutatott nukleotid—szekvenciával szigorú körülmények között hibridizál és egy a-1, β-fukozil-transzf.eráz aktivitású fehérjét kódol.
íc,! renérge, amely egy SEQ ID N0:z.3 szekvenciát tartalmaz., amelyben legalább egy he.xy et tesztet t, ins zert a it es / v agy ho z zaacot t, t r a n s z: f e r á z a k t. i v i t á s ú;
(d) fehérje, amely egy SEQ ID NO:24 szekvenciát tartalmaz, amelyben legalább egy helyettesített, inszertált és./vagy hozzáadott, transzferáz aktivitású;
(e) fehétie, amely a SEQ ID NO: 23 (33) Ά (31) szerinti sej t, amelyben az a-1,6-fuk.Gzi.ltranszferár egy fehérje, melyet az alábbi (a), (b), (c) , (d).
(e) és (f; csoportból választunk ki:
(a) fehérje, amely a SEQ ID NO:23-ban bemutatott arai.nos a v - s z e k v e ne i á t tartalmazza;
(b) fehérje, amely a SEQ ID NO: 24-ben bemutatott aminosat-s ze. k v e.n cint t a r t a Ima z z a;
szerinti aminosavaminosav deletált, és a-1,6-fukozílszerinti aminosavaminosav deletált, és a-1,6-fukozilszerinti aminosav szekvenciaval legalább 80%-ban homológ aminosav-szekvenc.iát tartalmaz és a-1,6-fukozil-transzferáz aktivitású, íf) fehérje, amely a. SEQ ID NO·:24 szerinti aminosavszekvenciával legalább 80%-ban homológ arain.osav-szekvenc-iát tarta 1 maz es α~ 1,6-f'u.kozil-transzferáz aktivitású >
r>. λs; — <wn$irmeiyike szerinti segt, ameivten az en— zimaktivitást csökkentettük vagy eltávolítottuk az alábbi (a) , (b),. (a) vag-y (d) technikák valamelyikével:
(a) gén-díszrupciós technika megcélozva az enzimet kódoló· gént;
(b) technika az enzimet kódoló gén domináns negatív mu-
a tenyészetben; és az antitest-kompozíció kinyerését a tenyészet bo i.
(40) A (39.) szerinti eljárás, amely nagyobb antitest-függő se J t-kózvet 1 tett citotoxikus aktivitással rendelkező antitestkompozíciót termel, mint a szülő sejtvonalából kapott antitestkompozíció.
(41) Antitest-kompozíció, amelyet a (39) vagy (40) szerinti eljárással termeltünk.
(42) Egy transzgenikus nem-humán állat vagy növény vagy ezek utódai, amelyek tartalmaznak egy genomot, melyet ügy módosítottunk, hogy egy intracelluiáris cukor nukleotid, a GDP-fukóz szintéziséért felelős enzim aktivitása és/vagy azon cukorláno módosításának aktivitásáért felelős enzim aktivitása, amelyben az 1-es helyzetű fukóz az M-glikozid-kapcsolt cukorláncban akötésen keresztül kötődik az N-acetil-glükózamin 6-os helyzetéhez a. redukáló végen, csökkentett.
(43) Egy transzgenikus nem-humán állat vagy növény vagy ezek utódai, amelyekben egy intracelluiáris cukor nukleotid, a GDPf'UKOz szintéziséért felelős enzimet kódoló gént vagv azon cukorlánc módosításának aktivitásáért felelős enzimet kódoló gént, amelyben az 1-es helyzetű fukóz az N-gIikozid~kapcso.lt cukorrancnan α-kötésen keresztül kötődik az N-acetil-glükózamin 6~os helyzetéhez a redukáló végen, kiütöttük.
(44) A (42) vagy (43) szerinti transzgenikus nem-humán állat vagy n9vény vagy ezek utódai, amelyben az intracelluiáris cukor nukleotid, a GDP-fukóz szintéziséért felelős enzimet az alábbi, (a), (b) és (c) csoportból választiuk ki:
ía> GMD (GDP-mannóz 4,6:~dehid.ratáz) (b) Fz (GDP~.ket-o~6-dezoximannóz 3,5-epimeráz, 4-reduktá.z) (c) GFP'P (GDP-béta~L-fukóz pirofoszforiláz} ,
(a) DNS, mely a SuQ ID NO: 65 által bemutatott nukleotid-szekvenciát tartalmazza;
(b) DNS, amely a SEQ ID NO: 65 által bemutatott nukleotid-szekvenciával szigorú körülmények között hibridizál és egy GMD aktivitású fehérjét kódol.
(•46) A (44) szerinti transzgenikus nem-humán állat vagy növény vagy ezek utódai, amelyben az Fx egy fehérje, melyet egy, az alábbi (a) vagy (b) csoportból kiválasztott DNS kódol:
(a; DNS, amely a SEQ ID NO: 48 által bemutatott nukleotid-székvéneiát tartalmazza;
(b) DNS, amely a SEQ ID NO: 48 által bemutatott nukleotid-szekvenciával szigorú körülmények között hibridizál és egy Fx aktivitású fehérjét kódol.
b>) A >44) szerinti transzgenikus nem-humán ál.lat vagy növény vagy ezek utódai, amelyben az GFPP egy fehérje, melyet egy, az alábbi (a) vagy (b) csoportból kiválasztott DNS kódol:
•a) DNS, amely a SEQ ID NO:51 által bemutatott nukleotid-szekvenciát tartalmazza;
íb) DNS, amely a SEQ ID NO: 51 által bemutatott nukleotid-szekvenoiával szigorú körülmények között hibridizál és a kt a v z t: a su f eh ér lét kogo 1.
állatból vagy növényből szövet vagy testfolyadék izolálását amely az antitest-kompozíciót tartalmazza; és az antitestKompozíció KÍnyeres-ét az izolált, szövetből vagy testtolyadé-kbó-i <
(c) a SEQ ID NO:-72 által bemutatott aminosav-szekvenciát tartalmazó fehérje;
id) fehérje, amely olyan SEQ ID NO:72 által bemutatott cimxnosav-szekvenciát tartalmaz, amelyben legalább egy aminosav beletelt, helyettesített, inszertált és /vagy hozzáadott, és Fx aktivitású;
>e) a SEQ ID NO:73 által bemutatott aminosavszekvenoiát tartalmazó fehérje;
if) fehérje, amely olyan SEQ ID NO:73 által bemutatott asmosav-szekvenciát tartalmaz, amelyben legalább egv amínosav aeletált, helyettesített, inszertált és /vagy hozzáadott, és c· E P D a k r i vitás u;
(g; a SEQ ID NO:23 által bemutatott aminosavszekvenciát tartalmazó fehérje;
(h) fehérje, amely olyan SEQ ID NO:23 által bemutatott aminosav-szekvenciát tartalmaz, amelyben legalább egy amínosav oeietait, helyettesített, inszertált és /vagy hozzáadott, és a
1,β-fukozil-transzferáz aktivitású;
ír) a SEQ ID NO:21 által bemutatott amínosavszekvenciát tartalmazd fehérje;
(j) fehérje, amely olyan SEQ ID NO:24 által bemutatott aminosav-szekvenciát tartalmaz, amelyben legalább egv amínosav aeletált, helyettesített, inszertált és /vagy hozzáadott, és ai.; 11.z.Í6ráz cikxivitásd (58) DNS, amely az (57) szerinti fehérjét kódolja.
' 5s · DNu, melyet az ala.obi táj:, ib? , (ο.} , (d) és {eJ csoportokból választunk, ki:
(a> DNS, amely a SEQ ID NO:1 .által bemutatott nukleotid-szekvenciát tartalmazza;
íb) DNS, amely a SEQ ID NO: 2 által bemutatott n u k 1 eo t i d - s z e k y e n c i.á t tártál ma z z a;
(c) DNS, amely a SEQ: ID NO: 65 által bemutatott nuk.lectid~s.zek vénei át tartalmazza;
(d; DNS, amely a SEQ ID NO: 48 által, bemutatott nuk1eo11d-s z ekvenci á t tartalmazza;
(e) DNS, amely a SEQ ID NO: 51 által bemutatott nu.kleotid-szekvenciát tartalmazza.
(60) Egy genom DNS, amelyet az alábbi (a), (b) és (c) csoportból választunk ki:
' a J genom oNí>, améry a my ru No: o slts.; bemutatóit nukleotid-szekvenciát tartalmazza;
(b) genom DNS, amely a SEQ ID NO: 67 által, bemutatott nukreot .to - szekvenciát tarta Ima zza;
(c) genom DNS, amely a SEQ ID NO:70 által bemutatott n u k1eoti d-s zakvenci á t tartalmazza.
661) Target vektor homológ- rekombinációhoz, amely az (58í(bQi bármelyike szerinti teljes hosszúságú DNS-t vagy annak egy részét tartalmazza.
A kínai norcsóg petefészek szövet .-eredetű CHO seit, amelybe a találmány szerinti antitest molekulát kódoló gént bevezetjük,, bármely CHO sejt lehet mindaddig, amíg a kínai hörcsög petefészek-ereoetű CHO sejt, amelybe az antitest molekulát kódoló gént
bevezettük, termel egy olyan antitest-kompozíciót, amely az antitest molekula. Fc-régiójához kötött komplex hT~glikozid~kapcsolt cukc-rláncokat tartalmaz, ahol a kompozícióban az Fc-régióhoz kötött összes komplex N-glikozid-kapcsolt cukorlánc között, annak a cukorláncnak az aránya, amelyben a fukóz nem kötődik a cukörlánc redukáló vegén az N-acetil-glükó'zaminhoz, 20% vagy ennél több.
A jelen találmányban az antitest molekulába beleértünk bármely molekulát mindaddig,· amíg tartalmazza egy antitest Fcxegioja.t. Az antitest például ®gy antitest—f ragmens, egy Fc— régiót tartalmazó fúziós fehérje és hasonlók.
Az antitest egy fehérje, amely az élő szervezetben immunrea kei óban termelődik exo-gén antigén stimuláció eredményeképpen és az antigén-specifikus kötő-aktivitással rendelkezik. Antitestre példaként szolgálnak, a következők:, egy híbridóma sejt által kiválasztott antitest, amelyet egy antigénnel immunizált, állat xépsejtjéből állítottunk elő; egy rekombinációs géntechnikával előállított antitest, nevezetesen egy antitest,· melyet egy antitest gé.n-inszertált antitest expressziós vektor gazdasejtbe történő bevezetésével kaptunk; és hasonlók. Az .antitest specifikus példái közé tartozik egy híbridóma által termelt, antitest, egy humanizált antitest, e.gy humán antitest és hasonlók.
A híbridóma egy olyan sejt, amelyet egy embertől eltérő emlős antigénnel való immunizálásával kapott B-sejt és egérből származó mieloma sejt vagy hasonló sejtfúziójával kaptunk, és képes a kívánt an.tigén-specifleírású monoklonális antitest ter melésére.
Humanizált antitestre példaként szolgál a humán kimére anti-
test, human CDR-grafted antitest és hasonlók.·
megfelelő helyére.
A humán CDR-g.rafte-d antitestet ügy termelhetjük, hogy megszerkesztünk V régiókat kódoló cDNS-eket, amelyekben embertől eltérő: állati eredetű antitest VH és VL CDR-jei vannak betoldva egy humán antitest VH és VL CDR-jelbe, behelyezzük azokat egy expressziós vektorba humán antitest CH-t és humán antitest CL-t kódoló géneket tartalmazó gazdasejéhez, ezáltal megszerkesztünk egy numán kiméra antitest expressziós- vektort, és ezután bevezetjük a vektor a gazdasejtbe, hogy expresszálja a humán CDRgrafted antitestet.
A- humán CDR-grafted antitestben CH-ként bármely CH~t alkalmazhatunk mindaddig, amíg az az hig-be tartozik, de a hlgG osztályba tartozók az előnyösek, és bármely alosztályhoz tartozót, -GY pl- hlgGl, hlgG2, hIgG.3 és hIgG4, alkalmazhatunk. A humán CDR-grafted antitest CL-jóként is bármely CL~t használhatunk amíg az az híg osztályba tartozik, és a κ osztályba vagy λ osztályba tartozók is alkalmazhatók.
Egy humán antitest eredetileg egy humán szervezetben természetesen előforduló antitest, de az magában foglalja a humán antitest rág könyvtárból, humán antitestet termelő transzgenikus állatból és humán antitestet termelő transzgenikus növényből kapott antitesteket, amelyeket géntechnológiában, sejt technológiában és a fejlesztő géntechnológiában rejlő jelenlegi előnyök alapján állítunk elő.
A humán szervezetben előforduló antitestet tekintve, egy antitest-termelésére képes limfocitát tenyészthetünk úgv, hogy egv humán perifériás vér limfocitát izolálunk, immortal!záljuk egy
EB vírussal vagy hasonlóval megfertőzve és ezután klónozzuk,
x««« ««
X ♦ X * ♦ *
Egyik antitestben az Fc-régiónak olyan helyzetei vannak, amezyeknez M-giikozid-kapcsc.lt cukorlánc kötődik, ezt később rogjuk ismertetni. Ezek szerint két cukorlánc kötődik egy antitest molekulához, Mivel az M-gliközid-kapcsolt cukorlánc, amely az antitesthez kötődik, bármely oukorlánc lehet, amely az (I) uuerxez.ei.j. kepietu magszerK.ezetet hordozza, a cu Körtáncok nagyszámú kombinációja lehetséges két, antitesthez-kötődő MgxiKOZid-kapcsolt cukorlánc esetén. Ezek szerint az anyagok azonosítása a Fc-régióhoz kötött cukor-szerkezet szempontjából tör
körláncban a redukáló végen, egy olyan cukorlánc, amelyben a fukóz nem a-kötésen keresztül kötött az .N-acetil-glükózaminhoz a komplex 77-glikozid-kapcsolt cukorláncban. Komplex fZ-glikozidkapcsolt cukorláncra példaként szolgálnak azok, melyekben a tukóz 1-es helyzetben nem kötődik az N-acetil-glükózamin δ-os helyzetéhez a-kötássel.
Az antitest-kompozíció magas ADCC aktivitást mutat, ha annak a cukorláncnak az aránya, amelyben a tukóz nem kötött az Araoetil-giükó-zaminhoz. a cukorlánc redukáló végén az összes komplex N-giikozid-kapcsolt cukorlánc között, amely az Fc-régiohoz totönt, a találmány szerinti antitest-kompozícióban előnyösen 20% vagy ennél több, még előnyösebben 25% vagy több, még előnyösebben 30% vagy ennél több, meg előnyösebben 40% vagy ennél több és legelőnyösebben 50% vagy ennél több. Amikor az antitestKoncentrációt csökkentjük az ADCC aktivitás csökken, azonban magas ADCC aktivitás figyelhető meg még akkor is, ha az antitestkoncentráció alacsony mindaddig, amíg annak a cukorláncnak az aránya, amelyben a fukóz nem-kötött az W-acetil-glükózaminhoz a cukorlánc redukáló·, végén, 20% vagy épnél több.
Annak a cukorláncnak az arányát, amelyben a fukóz nem-kötött az A-acetil-glükózaminhoz a cukorlánc redukáló végén abban a kompozícióban, amely az Fc-régióban komplex N-gl.ikoz.id-kapcsolt cukorláncokat, hordozó antitest molekulát tartalmaz, meghatároznacjuk az antitest molekulából a cukorlánc felszabadításával ismert módszerek alkalmazásával, mint pl. hidrazinolizis, enzimes emésztés vagy hasonlók [Biochemical Experimentation Methods 23 Method x.oí wtucymg ^iycoprote.:.n sugar Cnain (oagan Scientific ies. Press), kiadó: Reiko Takahashi (1989)], a felszabadult •cukorián fluoreszcens jelzésével vagy radicűzotóp jelzésével és ezt követően a jelzett cukorláne kromatográfiás elválasztásával. A felszabadított, cukorláncot meghatározhatjuk HPAED-PAD módszerrei történő anarzzísevex. is [j. i>rg. Chromatogr. 6, 1557 (1983) ] ..
A jelen találmányban a kínai hörcsög petefészek szöveteredetű CHO sejt magában foglal bármely sejtet, amely egy kínai norcsög (Crlcetulus griseus) ovárium szövetéből létrehozott sejtvonal. CHO sejtekre példákat írtak le az alábbi dokumentumokban,· mint pl. Journal of Experimental Medicine 108, 945 (1 s58; ; Proc»· Natx. Acac. Sex» USA 60, 127ö (1968) ; Genetics 55, ölt (1s6ö); Chromosoma 41, 129 (1973); Methods in Cell Science 18, 115 (1996); Radiation Research 148, 260 (1997) ; Proc. Nafi . Acad. Sci. USA 77, 4216 (1980); Proc. Natl. Acad. Sói. 60, 1275 (1968); Coll 6, 121 (1975); Molecular Cell Genetics, Appendix I, II (883-900 o.) és hasonlók. Emellett CHO-ΚΙ (ATCC CCL-61), DUXB11 ;ATCC CCL-9096) és Pro~5 (ATCC CCL-1781) ATCC-nél regisztrált sejtvonalak és a kereskedelemben kaoható CH-O-S f'Life Technologies, Kát. szám: 11619) vagy szub-sejtvonalak, melyek a segtvonalak adaptálásával kaphatók különböző tápközegek felhasznalasavai, szintén példaként említhetők.
A jelen találmányban az intracelluiáris cukor nukleotid, a GDP-fukóz szintéziséért felelős enzim bármely olyan enzim lehet mindaddig, amíg az egy intracelluiáris cukor nukleotid, GDPfukóz szintézisére vonatkozó enzim, mint fukóz-ellátó forrás egy cukorlánchoz. Az intracelluiáris cukor nukleotid, a GDP-fukóz szintéziséért felelős enzim egy olyan enzim, amely befolyásolja az intracelluláris cukor nukleotid, GDP-fukóz szintézisét.
Az int .racelluláris cukor nukleotid, GDP-fukóz. a de novo szintézis útvonalon vagy egy mentő szintézis útvonalon pótlódik, így az összes enzim, amely a biológiai szintézis utakkal kapcsolatos, beleértendő az intracelluláris cukor nukleotid, GDP-fukózzal kapcsolatos enzimbe.
Az intracelluláris cukor nukleotid, GDP-fukóz de .novo szin.~ tezis útvonalával kapcsolatos enzimekre példaként szolgálnak a GDP-mannóz 4,6-dehidratáz (alábbiakban GND), GDP-keto-6:-dezoxi~mannóz 3, ö-epimeráz 4, n-reduktaz (alábbiakban '’‘E’x”) és hasonAz intracelluláris cukor nukleotid, GDP-fukóz mentő szintézis ótvcnatávai. enzimekre példaként szolgál, a GDP-béta-L—fukózprrotoszforiláz (alábbiakban ”GFPPÍ!), fukokináz és hasonlók.
az enzimbe, amely befolyásolja az intracelluláris cukor nuuleotid, GDP-fukóz szintézisét, egy olyan enzim, amely befolyásolná az mracelluláris cukor nukleotid, GDP-fukóz szintézisével kapcsolatos enzim aktivitását és egy olyan enzim, amely berolyásolja az enzim szubsztrátként szereplő anyagok szerkezetét, szintén beleértendő.
A jelen találmányban a GMD példái közé tartozik:
egy fehérje, amelyet az alábbi (a) vagy (bj DNS kódol:
(a) DNS, amely a SEQ ID NO : 65 által bemutatótt nurleotid-szekvenciát tartalmazza;
(ο: DNS, amely a SEQ ID NO : 65 szerinti nukleotidszekvenciát tartalmazó DNS-sel szigorú körülmények között hibri di-zax es egy sKivitásu ie.hsi]ét. κοόοζ;
(ej fehérje, amely a SEQ ID NO:71 által bemutatott amincsav--szekvenciát tartalmazza;
id) fehérje, amely olyan SEQ ID NO: 71 által bemutatott, aminosav-szekvenciát tartalmaz, amelyben legalább egy aminosav deletált, helyettesített, inszertált és /vagy hozzáadott, és GMD a kt i v r t á s ύ r (ej fehérje, amely a SEQ ID NO:71 által bemutatott amino-sav-szekvenciávai legalább 80%—ban homológ aminosav-szekvenciát tartalmaz és GMD aktivitású, és hasonlók.
Tanát a GMD amanosav-szekvenciáját kódoló DNS-ek példái közé tartozik egy DNS, amely a SEQ ID .NO: 65 által bemutatott. nukxeoiiQ-s z-e rvenoiat tartalmazza és egy DNS, amely a SEQ ID NQ:6a szerinti nukle-ot íd-szekvenciával szigorú körülmények között hibridizál és GMD aktivitású aminosav-szekvenciát kódol.
A jelen találmányban az Ex példái közé tartozik:
egy fehérje, amelyet az alábbi (a) vagy (b) DNS kódol:
(a) DNS, amely a SEQ ID NO: 48 által bemutatott nuk1eotid-székvenciát tartalmazza;
(b) DNS, amely a SEQ ID NO: 43 szerinti nukleot.idszekvenciát tartalmazó DNS-sel szigorú körülmények között hibridizál és egy Ex aktivitású fehérjét kódol;
(c) fehérje, amely a SEQ ID NO:72 által bemutatott aminő sav-szekvenciát tartalmazza;
(ο; fehérje, amely olyan SEQ. ID NO:72 által bemutatott
(s; fehérje, amely a SEQ ID NO:72 által bemutatott aminosav-szekvenciával legalább 80%-ha.n homológ amincsav-saekvenci«i tart a .ima z es cKtivitasu, ss has-ontok.
Tanát az Fx aminosav-szekvenciáját kódoló DNS-ek példái közé tartozik egy DNS, amely a SEQ ID NO: 48 által bemutatott nukleotid-szekvenciát tartalmazza és egy DNS, amely a SEQ ID NO: 48 szerinti nukleotid-szekvenciával szigorú körülmények között hibridizái és egy Fx aktivitású aminosav-szekvenciát kódol.
A jelen találmányban a GFPP példái közé tartozik::
egy fehérje, amelyet az alábbi (a) vagy (b) DNS kódol:
fa) DNS, amely a SEQ ID NO:51 által bemutatott nuk le o t id - szekvenciát tartalmazza;
(b) DNS, amely a SEQ: ID NO: 51 szerinti nukleotidszexvenciát tartalmazó DNS—sel szigorú körülmények között hibridizái és egy GFPP aktivitású fehérjét kódol;
(íz) fehérje, amely a SEQ ID NO: 73 által bemutatott aminosav-8zekvenciát tartalmazza;
(d) fehérje, amely olyan SEQ ID NO:73 által bemutatott aminosav-szekvenciát tartalmaz, amelyben legalább egy aminosav ceietalt, helyettesített, inszertált és /vagy hozzáadott, és GFPP aktivitású;
íe) fehérje, amely a SEQ ID NO:73 által bemutatott aminosav-szekvenciával legalább 80%-ban homológ aminosav-szekvenciát tartalmaz és GFPP aktivitású, és hasonlók.
nuxleo t 1 u— s zcKvsnci ár. taríalniazzE s.s egy oNS,
NO: 51 szerinti nukleotid-szekvenciával szigorú körülmények kö zött hibridizál és GFPP aktivitású aminosa-v-szekvenciát kódol.
A jelen találmányban a-z enzimbe, amely felelős annak a cu korláncnak a módosításáért, amelyben a fukóz 1-es helyzetben kö tődik sz N-auetil-glükózamin 6-os resztül a komplex N-glikozid-kapcsolt cukorlánc redukáló végén, beletartozik bármely enzim mindaddig, amíg az enzim összefüggés ben van az 1-es helyzetű tukoz kötődési reakciójával a 6—os helyzetű M-acstn-glükózaminhoz alfa-kötésen keresztül a komplex 20-gií kczid-kapcsolt cukorlánc redukáló végén. Az enzim, amely összefüggésben van az 1-es helyzetű fukóz kötődési reakciójával a 6.-os helyzetű Ac-acetil-glükóxaminhoz alfa-kötésen keresztül a komplex W-glikozid-kapcsolt cukorlánc redukáló végén egy olyan enzimet jelent, amely befolyásolja az 1-es helyzetű fukóz kötődési reakcióját a 6~os helyzetű AT-acetil~glükózaminhoz alfakötésen keresztül a komplex N-glikozid-kapcsolt cukcrlánc reduká16 Végén.
Enzimre, amely összefüggésben van az 1-es helyzetű fukóz kötődési reakciójával a 6-os helyzetű N-acetil-glükózaminhoz alfakötésen keresztül a komplex ,V-glikozid-kapcsolt cukorlánc redukáló végén példaként szolgálnak, az: a-1, β-fukoziltranszferáz, aL-fukozidáz és hasonlók.
A példák közé tartozik egy olyan enzim is, amely befolyásolja annak az enzimnek az aktivitását, amely összefüggésben van az 1-es helyzetű fukóz kötődési reakciójával a 6-os helyzetű
N-gliko zid-kapcsolt cukor!ánc redukáló végén, és- egy olyan enzim is, amely befolyásolja az enzim-szubsztrátként szóba jövő anyagok szerkezetét.
A jelen találmányban az a-1, v-fukozil-transzferáz példái közé tartozik:
(á; DNS, amely a SEQ ID NO: 2 által bemutatott nukleotid-szekvenciával szigorú körülmények között hibridizál és '-Dy <x—r, b~iükozii~txanszi8.iaz aztrvitasu ranérjet koool, (ej fehérje, amely a SEQ ID NO:23-ban bemutatott aminosav-szekvenciát tartalmazza;
(f) fehérje, amely a SEQ ID NO:24-ben bemutatott aminoS ci v S S 6 K V Θ Γ1C X -S T- t‘ cl .Γ t. Ή .1TR 3 z. a 3 (g) fehérje, amely egy SEQ ID NO:23 szerinti aminosavszekvenoiát tartalmaz, amelyben legalább egy aminosav deistáit, helyettesített, inszertált és/vagy hozzáadott, és u-1,6-fukoziltranszferáz aktivitású;
(h) fehérje, amely egy SEQ ID NO:24 szerinti -aminosav-
transzferáz aktivitású;
(i) fehérje, amely a. SEQ ID NO: 23' szerinti aminosavszekvenciával legalább 8-0%-ban homológ am.ínosav-szekvenciá.t tartalmaz és a-1,6~fukozil-transzferáz aktivitású, •i) fehérje, amely a SEQ ID NO:24 szerinti aminosav™ szekvenciával, legalább 80%~ban homológ amínosav-szekvenciát tartalmaz· és a-1,6-fukozil-transzferáz aktivitású.
Tehát az a-1,6-fukozil-transzferáz aminosav-szekvenciáját kódoló DNS-ek példái közé tartozik egy DNS, amely a SEQ ID NO:1 vagy 2 által bemutatott nukleotid-szekvenciát tartalmazza és egy DNS, amely a SEQ ID NO:1 vagy 2 szerinti nukleotid-szekvenciával szigorú körülmények között hibridizál és egy a-1,6-fukoziltranszferáz aktivitású aminosav-szekvenciát kódol..
A jelen találmányban a DNS, amely szigorú körülmények között hibriaizai, egy olyan DNS, amely egy alábbi módszerrel kapható meg, mint pl. kolónia hibridizáció, plakk hibridizáció vagy Soutnern-blot hibridizáció felhasználva egy DNS—t., mint pl< a SEQ ID NO:1, 2, 48, 51 vagy 65: szerinti nukleotid-szekvenciát vagy egy részleges fragmensét próbaként, és specifikusan magában foglal, egy DNS-t, amelyet úgy azonosítottunk, hogy 65°C-on 0,71,0 M nátrium-klorid jelenlétében hibridizéltunk egy szűrő segitsegévei, amelyhez kolónia- vagy plakk-eredetű DNSfragmenseket immobilizáitunk: és ezután a szűrőt mostuk 65°C-on 0,1-2 x SSC oldat segítségével (IxSSC oldat kompozíciója, amely 150 mM nátrium-kiőridot és 15 mN nátrium-citrátot tartalmaz;. A hibridizációt leírt módszerekkel összhangban kiviteleztük, pl < Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. kiadás, Cold Spring
Harbor Laboratory Press (1989) (alábbiakban “Molecular Cloning, 2. kiadás”-ként hivatkozunk rá), Current Protocols in Molecular Biology, John Kiley and Sons, 1987-1997 (az alábbiakban Current Protocols in Molecular Siology-ként említjük); DMA Cloning 1; Core Techniques, A Practical Approach, 2. kiadás, Oxford University (1995) és hasonlók. A hibridízálődó DNS-ek közé tartozik egy olyan DNS, amely legalább 60% vagy több., előnyösen 70% vagy több,meg előnyösebben 8 0% vagy több, még előnyösebben 90% vagy több, még előnyösebben 95% vagy több és legelőnyösebben 98% vagy ennél magasabb homolőgiát mutat a SEQ ID ))0:1, 2, 48, 51 vagy 65 szerinti nuklectid-szekvenciával.
A. jelen találmányban a fehérje, amely egy olyan SEQ ID NO:23, 24, 71, 72 vagy 73 szerinti aminosav-szekvenciát tartalmaz, amelyben legalább egy aminosav deletált, helyettesitett, inszert ált. és/vagy hozzáadott, és a-i, 6~f ukozil-tra.nszzeráz aktivitású, GMD aktivitású, Fx aktivitású vagy GFPP aktivitású, megkapható például egy helyre-irányított mutáció bevezetésével a SEQ ID NO:23, 24, 71, 72 vagy 73 szerinti aminosav-szekvenciát kódoló DNS-be, helyre-irányított mutagenezis technikák alkalmazásával, melyeket leírtak pl. az alábbi szakirodalmi helyeken: Molecular Cloning, 2. kiadás; Current Protocols in Molecular Biology; Nucleic Acids Research 10, 6487 (1982); Proc. Natl. Acad. Sei. UEA 7X 6409 (1982); Gene 34, 315 (1985); Nucleic Acids Research 13, 4431 (1985); Proc. Natl. Acad. Sci... USA 82, 488 (1985) és hasonlók. Az aminosavak száma, melyeket deletálunk, szabsztituálunk, inszertáiunk és/vagy addicionálunk, egy vagy több és nem. különösen korlátozott, de az aminosavak
száma, amelyek deletálhatók, helyettesíthetők vagy hozzáadhatok ismert technikákkal, mint pl. helyre-irányított mutagene-zissel, 1 és néhányszor tíz közötti, előnyösen 1-20, még előnyösebben ΙΙΟ és legelőnyösebben 1-5.
Ahhoz tehát, hogy fenntartsuk a találmány alkalmazni kívánt fehérje a-1,6-fukozil-transzferáz aktivitását, GMD aktivitását, Fx aktivitását vagy GFPP aktivitását, annak legalább 80% vagy több, előnyösen 85% vagy több, még előnyösebben 90% vagy több, még előnyösebben 95% vagy több, meg előnyösebben 97% vagy több és legelőnyösebben 99% vagy ennél magasabb homológiát kell mutatni a SEQ ID NO:23, 24, 71, 72 vagy 73 által bemutatott aminosav-szekvenciával, amikor kiszámítjuk egy analizáló soft ver., mint pi. BLAST [J. Mól. Bioi. 215, 403 (1990}] segítségével vagy hasonlóval.
A találmány szerinti CHö sejt példái közé tartozik egy sejt, amelyben az enzímaktívitás csökkent vagv hiányzik.
A .sejt, amelyben az enzimaktívitás csökkent vagy hiányzik, magában foglal olyan sejteket, amelyekben az intracelluláris cukor nukleotid, GDP-fukóz szintézisével kapcsolatos enzim aktivitása vagy annak a cukorláncnak a módosításáért felelős enzim aktivitása, amelyben a fukőz 1-es helyzetben kötődik az N-acetilglüKózamln β-os helyzetéhez alfa-kötésen keresztül a komplex N~ glikozid—kapcsolt cukorlánc redukáló végén, csökkentett vagy hiányzik. Ilyen sejtek előállításához bármely módszer alkalmazható mindaddig, amíg az csökkenti vagy törli a kívánt enzimaktivitást. Ilyen enzimaktivítást csökkentő vagy elimináló technikák
kötésen keresztül a komplex N-glikozid-kapcsolt cukorlánc redukáló végén,, és hasonlók.
A találmány szerint a lektin-rezisztens sejtvonalat megkaphatjuk egy sejtvonal tápközegben való tenyésztésével, amely előre meghatározott, koncentrációjú lektint tartalmaz, és ezt kővetően a sej ivonai szexeKtarásávax, amely meg kő ve ten. azt a: tuis'j” donságot, hegy a túlélési aránya legalább kétszeresére növekedjen, előnyösen háromszorosára és még előnyösebben ötszörösére vagy többszörösére, mint. a szülő sejtvonalé statisztikus azignifikanalával. Megkaphatjuk azt egy sejtvonal lektint tartalmazó tápközegben történő tenyésztésével és ezután azon sejtvonal szelektálásával, amely bizonyos túlélési aránnyal tenyészthető, pl. 8 0% túlélési aránnyal, legalább 2-szeres, előnyösen ő-szörös, még előnyösebben 10-szeres és legelőnyösebben 20-szoros vagy még több, mint a szülő sejtvonal esetében.
A lektin, amely felismeri a cukorláncot, amelyben az l-es helyzetű fukóz kötődik a 6-os helyzetű A-aoetil-glükőzaminhoz alfa-kötésen keresztül a komplex AZ-glikozid-kapcsolt cukorlánc redukáló végén, bármely lekéin lehet, amely felismeri a cukorláncot. Ezekre példaként szolgál a Lens calínaris lektin LCa (.lens óulInari s-ból származó lentil agglutinin), borsó lektin SPA (Pisum sar.ívum-ból származó borsó lektin) , széles bab lektin VFA (V'foia faba-ból származó agglutinin), Aleuria aurantia lektin AAL (Aleuria aurantia-ból származó lektin) és hasonlók.
A találmány szerinti C.HO sejt egy magasabb ADCC aktivitású antitest-kompozíciót termelhet, mint a szülő CHO sejt által térse.it ant. $. uest—tompazzero aKtrvitasa a k.tvant enzzm.akt.xvm.ás csökkentésére vagy deletálására szolgáló technika alkalmazása előtt.
A találmány szerinti CHO sejt tehát képes termelni egy magasabb ADCC aktivitású antitest-kompozíciót, mint annak az antitest-kompozíciónak az aktivitása, amelyben az összes Fa-régióhoz kötött komplex N-glikozid-kapcsolt cukorlánack között annak a aukorláncnak az aránya, amelyben a fukóz a cukorlánc redukáló végen az A^-acetil-glükózaminhoz nem kötött, kevesebb mint 20%.
A talarmányoan alkalmazott szülő sejtvonalra, példa egy sejt, amelyben az int race Hűl ár í.s cukor nukleotid, -GDP-fukóz. szintézisével kapcsolatos enzim aktivitása vagy annak a cukörláncnak a módosításáért felelős enzim, aktivitása, amelyben a fukóz 1-es helyzetben kötődik az H-acetil-glükózamin 6-os helyzetéhez alfakötésen keresztül a komplex K-glikozid-kapcsol.t cukor lánc redukáló végén nem csökkentett. Közelebbről egy olyan sejtet alkalmazunk, amelyet nem kezeltünk az intracelluláris cukor nukleotid, GDP-fukóz szintézisével kapcsolatos enzim aktivitásé nak vagy annak a cukorláncnak a módosításáért felelős enzim tivitásának a csökkentésére vagy törlésére, amelyben a fukóz 1es helyzetben kötődik az AFaceti .1-glükózamin 6-os helyzetéhez alfa-kötésen keresztül a komplex N-glikozid-kapcsolt cukorlánc redukáló végén.
A jelen találmányban az ADCC aktivitás egy citotoxikus aktivitás, amelyben egy antitest,, amely az élő szervezetben a tumorsejten egy sejtfelszíni antigénhez kötött, aktivál egy effektor sejtet az Fc-receptoron keresztül, amely az Fc-régióban és az effektor sejt felszínén található, és ezáltal gátolja a tumorsejtet és hasonlókat [Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Wiley-Liss, Inc., 2.1. kötet (1955) ] .. Effektor sejtre példaként szolgál az ölő sejt, természetes ölő sejt, aktivált makrofág és hasonlók.
A jelen találmány tehát egy sejtre vonatkozik, amelyben az mtracelluiáris cukor nukleotid, GDP—fukóz szintézisével kapcsolatos enzim aktivitását vagy annak a cukorláncnak a módosításáért felelős enzim aktivitását, amelyben a fukóz 1-es helyzetben kötődik az .ív-acetil-glükózamin 6-o-s helyzetéhez alfa-kötésen keresztül a komplex Λ'-glikozid—kapcsolt cukorlánc redukáló végén csökkentettük géntechnológiai technikákkal (az alábbiakban ’'találmány szerinti g.azdasejf'-ként említjük) . A találmány szerinti gazdasejt felhasználható gazdasejtként nagy ADCC aktivitású antitest-kompozíció termelésére.
A találmány szerinti gazdasejt bármely gazdasejt lehet mindaddig, amíg képes expresszálni egy antitest molekulát. Erre példaként szolgál egy élesztő sejt, egy állati, sejt, egy rovarsejt,
egy növényi sejt és hasonlók. A sejtek közé tartoznak mindazok, melyexet későob a 3. pontban tárgyalunk. Az állati sejtek között előnyös a kínai hörcsög petefészek szövet eredetű CHO sejt, patkány mielóma sejtvonal YB2/3HL..P2G11.16'Ag. 20 sejt, egér mielóma sejtvonal NSO-sejt, egér mi el óma S'P270-Agl4 sejt, sziriai hörcsög vese szövet eredetű BHK sejt, egy antitestet termelő híbridóma sejt, humán leukémia sejtvonal Namalwa sejt, egy magzati őssejt, egy megtermékenyített petesejt és hasonlók.
A jelen találmányt az alábbiakban részletesen ismertetjük.
1. A találmány szerinti gazdasejt előállítása
A találmány szerinti gazdasejtet az alábbi technikákkal állíthatjuk elő.
(1? Gén-diszrupciós technika megcélozva az enzimet kódoló gént
A találmány szerinti gazdasejtet létrehozhatjuk géntioziupcxos (gén—s ze t tőre se s) tecnnxka -segrtsegevei, ameuyben az intraoeiiuláris cukor nukleotid, GD'P-fuk.óz szintézisével kapcsolatos enzimet vagy annak a cukorláncnak a módosításáért felelős enzimet célozzuk meg, amelyben a fukóz 1-es helyzetben kötődik az xv~öcs 11. j. — gl u k.o zamin S—os neiyzerénez a.J.ra—not esen keresztül a komplex N-glikozid-kapcsolt cukorlánc redukáló végén. Az. intracelluláris cukor nukleotid, -GDP-fukóz szintézisével kapcsolatos enzimre példák a GMD, Fx, GFPP, fuko kinéz és hasonlók. Enzimre, amely kapcsolatban van a cukorlánc módosításával, amelyoen az i~es helyzetű lukóz kötődik a ő-os helyzetű jV~acet.ilglükózaminhoz alfa-kötésen keresztül a komplex xV-glikozid-
kapcsolt cukorlánc redukáló végén példaként szolgálnak az a-1,6fukoziltranszferáz, a-L-fukozidáz. és hasonlók.
A gén, amint itt használjuk, magában foglalja a DNS~t és RNS-t.
A gén-disz.rupciós módszer bármely módszer lehet mindaddig, amíg a cél enzim génjét képes széttörni. Ezek közé tartozik az antiszenz módszer, ribozim módszer, homológ rekombináció módsze re, EDO módszer, RNAi módszer, retrovírust alkalmazó módszer, tran.szpozo.nt
Ikalmazó módszer és hasonlók. Ά módszereket rész letesen az alábbiakban írjuk le.
(a) A találmány szerinti gazdasejt előállítása antiszenz módszerrel vagy ribozim módszerrel
A találmány szerinti gazdasejtet ribozim módszerrel a Cell Technology 12, 239 (1993); BIO/'TECHNOLOGY 1.7, 1097 (1999); Hum. Mol. Genet. 5, 1083 (1995); Cell Technology 13, 255 (1994); Proc. Natl. Acad. Ser. uEa 96, 1886 (1999) cikkekben vagy hasonlókban leírtak szerint állíthatjuk elő, megcélozva az intracellular!s cukor nukieotid, GDP-fukóz szintézisével kapcsolatos enzimet vagy annak a cukorláncnak a módosításával kapcsolatos enzimet, amelyben a fukóz 1-es helyzetben kötődik az Nacetil-glükózamin 6-os helyzetéhez alfa-kötésen keresztül a komplex ?J-olikoz id-kapcsolt cukorlánc redukáló vécén.
Egy cDNS-t vagy genom iái is- DNS-t preparálunk, amely az mtracelluiaris cukor nukleotid, GDP—fuzóz szintézisével kapcsolatos enzimet vagy annak a cukorláncnak a. módosításáért felelős enzimet kódolja, amelyben a fukóz 1-es helyzetben kötődik az N~
komplex. I7-glikozid-kapcsolt cukorlánc redukáló végén.
A preparált cDNS vagy genomiális DNS nukleotid-szekvenciáját meghatározzuk.
A meghatározott DNS-szekvencia alapján megtervezünk egy megfelelő hosszúságú antiszenz gént vagy ríbozim konstrukciót, amely tartalmazza azt a DNS egységet, amely az intracelluláris cukor nukleotid, GDP-fukóz szintézisével kapcsolatos enzimet vagy annak a cukorláncnak a módosításáért felelős enzimet, amelyben a fukóz 1-es helyzetben kötődik az M-aoetil-glükózamin 8-os helyzetéhez alfa-kötésen keresztül a komplex áZ-glikozidkapcsolt cukorlánc redukáló végén, és a nem-transzlatálódő régió vagy egy intron egy részét kódolja.
Abból a célból, hogy az antiszenz gént vagy ribozimot egy sejtben expresszáljuk, egy rekombináns vektort szerkesztünk úgy, hogy a teljes hosszúságú preparált DNS-t vagy agy fragmensét behelyezzük egy alkalmas expressziós vektorba a promotertől downstream irányba.
A rákoméináns vektor behelyezésével az expressziós vektorhoz alkalmas gaadasejtbe egy transzformánst kapunk.
A találmány szerinti gazdasejtet megkaphatjuk a transzaormósok szelektálásával az intracelluláris cukor nukleotid, GDPfukóz szintézisével kapcsolatos enzim vagy annak a cukorláncnak a módosításáért felelős enzim aktivitásának az alapján, amelyben a fukóz 1-es helyzetben kötődik az D-acetil—glükózamin 6-os helyzetéhez alfa-kötésen keresztül a komplex M~glikozid~kapcso.lt cukorxönc reouxáio vegén. A. tacaimany szerinti .csazdasent **«.. XX * * » χ-χχ.
* * * * * * κ * ♦ *Λ *ν XX <Κ· hatjuk ügy is, Hogy a transzf. ormánsokat. a sejtmembránon lévő grxkoprot-exn cukorranc szerkezete aiapjan vagy a termelt asti~ test molekula cukorlánc szerkezete alapján szelektáljuk.
Ami. a találmány szerinti gazdasejt termelésére használt gazdasejtet illeti, bármely sejt, mint pl. élesztő, állati, rovar vagy növényi sejt alkalmazható mindaddig, amíg tartalmazza az intracelluiáris cukor .nukleotid, GDP-fukóz szintézisével, kapcsolatos- cél enzimet vagy annak -a cukörláncnak a módosításáért felelős cél enzimet kódoló gént, amelyben a fukóz 1-es helyzetben kötőcik az N-aceti.l-glűkózamln 6-os helyzetéhez alfa-kötésen ke resztül a komplex N-glikozid-kapcsolt cukörlánc redukáló végén.
Gazda-sejtekre példákat az alábbi 3. pontban adunk meg.
Példádat az expressziós vektorokra később a 3. pontban írunk le.
A gén oevezer,e.si eljárást tekintve a különböző gazdasejtekbe, a rekomblnáns vektorok különböző gazdasejtekbe történő bevezetésére szolgáló, a későbbiekben a 3. pontban leírt módszereket a1kaImazhatjuk.
Az alábbi módszert példaképpen adjuk meg egy transz formális szelektálására az intracelluiáris cukor nukleotid, GDP-fukóz szintézisévé! kapcsolatos enzim aktivitása vagy annak a cukorláncnak a módosításáért, felelős enzim aktivitása alapján, amelyben a .faxos 1-es helyzetben, kötődik az N-acetil-glükózamin 6-os neiyze.tenez alfa-kötésen keresztül a komplex N-glikozid-kapcso.lt ekkoriánc redukáló φ ·ν £«.>«'«« » ft «*«)<
* * * * *·· ** ** <r* »«.,>
Módszer transzformán.s szelektálására:
Sejt-szelektáló módszerre példaként, amelyben az iátiS vukuí nukxegtxd,, GDP tűhöz szittézisével repess ratos enzrm aktivitását vagy annak a cuk-orláncnak a módosításáért felelős enzim aktivitását csökkentjük, amelyben a fukóz l~es helyzetben kötődik az N-acetil-glükózamin 6-cs helyzetéhez alfa-kötésen keresztül a komplex N-glikozid-kapcsolt cukorlánc redukáló végén, beleértjük a biokémiai módszereket vagy géntechnológiai technikákat, melyeket az alábbi helyeken Írtak le: New Biochemical Experimentation Series 3 - Saccharides I, Glycoprotein (Tokyo Kaga ku. Do jin), kiadó: Japanese Biochemical Society (1988·); Cell Engineering, Supplement, Experimental Protocol Series, Glycobiology Experimental Protocol, Glycoprotein, Glycolipid and rroteogiycan ithujun—sna) , kiadó: Naoyuki Tamgucnr, Akemix Suzu— kr, niyoshi surukawa és: Kctzuyuu?:. Sugawara (1996) ; Molecular Cloning, 2. kiadas; Current Protocols in Molecular Biology; és hasonlók. Biokémiai módszerre példa egy olyan módszer, amelyben az enzim aktivitást egy specifikus enzim szubsztrattal fejlesztjük ki, ss hasonlók. Géntechnológiai technikákra példa a Nortnern analízis, RT-PCP. és hasonlók.., amelyek mérik az enzimet kódoló gén mRNS-ének mennyiségét.
Transzformáns szelektálására szolgáló módszerre a sejtmembránon lévő glikopretein cukorlánc szerkezete alapján példaként szolgálnak azok a módszerek, amelyeket a későbbiekben az 1(5) pontban ismertetünk. Transzformáns szelektálására szolgáló módszerre a termelt antitest molekula cukorlánc szerkezete alapján .*“» *«*».·* *·ί. h t··, 4k £* példaként szolgálnak azok, a módszerek, melyeket az alábbi 5. és 6. pontban írunk le.
A CüN.b prepa zasára szoigáio módszert, amely az i n trace. üu— láris cukor nukleotid, GDP-fukóz szintézisével kapcsolatos enzimet. vagy annak a cukorláncnak a. módosításáért felelős enzimet kódolja, amelyben a fukóz l~es helyzetben kötődik az N-acetilgiükozamin 6-os helyzetéhez alfa-kötésen keresztül a komplex Nglikozid-kapcsolt cukorlánc redukáló végén, az alábbiakban részletesen ismertetjük.
DNS prenarálása:
Egy terjes RNS-t vagy mRNS-t preparálunk egy humán vagy nemhumán állati szövetből vagy sejtből.
Egy DNS könyvtárat készítünk a preparált teljes RNS-ből vagy mRNS-ből.
Degeneratív primereket állítunk elő annak az enzimnek az aminosav-szekvenoiája alapján, amely kapcsolatos az intraceliuláris cukor nukleotid, GDP-fukóz szintézisével vagy annak az enzimnek az aminosav-szekvenciaja alapján, amely kapcsolatban áll a cukorlánc módosításával, amelyben a fukóz l~es helyzetben kötődik az N-acetil-glükózamín 6-os helyzetéhez alfakötésen keresztül a komplex N-glikozid-kapcsolt cukarlánc redukáló végén, és egy gén-fragmenst, amely kódolja az íntracelluláris cukor nukleotid, GDP-fukóz szintéziséért felelős enzimet vagy annar a GUKorlancnak a módosításáért felelős enzimet, amelyben a fukóz 1-es helyzetben kötődik az .N-acetílglükózamin 6-os helyzetéhez alfa-kötésen keresztül a komplex N53 * « « » «
Μ» f** glikozid-kaposo-lt cukorlánc redukáló végén, PCR-ral kinyerünk templátként az. előállított cDNS könyvtárat alkalmazva.
A DNS~t, amely az intracelluláris cukor nukleotid, GDP-fukóz szintéziséért felelős enzimet vagy annak a cukorláncnak a módosításáért felelős enzimet kódolja, amelyben a fukóz l~es helyzetben kötődik az xV-acetil-glükózamin 6-os helyzetéhez alfakötésen keresztül a komplex N-glikozid-kapcsolt cukorlánc redukáló végén, megkaphatjuk a cDNS könyvtár szkrinelésévei, próbaként. a kapott gén~fragmenst alkalmazva.
A humán vagy nem-humán szövet vagy sejt mRNS~t tekintve egy kereskedelemben kapható terméket (pl. gyártó: Clontech.) alkalmazhatunk vagy előállítónjuk azt egy humán vagy nem-humán szövetből vagy sejtből a következő módon. Egy humán vagy nem-humán szövetből vagy sejtből történő teljes RNS preparálásának módszerei közé, tartozik a guanidín-tíocíanát-cézíum-trifluoracetát módszer (Metnods in Enzymology 154, 3 (1987)], a savas quanídin— tiocianát-xenol-kloroform (AGPC) módszer [Analytical Biochemistry 162, 156 (1987); Experimental Medicine 9, 1937 (1991)] és hasonlók.
A teiges RNS—bői, mint poll (A) ~RNS a rnRNS preparálására szolgáló módszerek közé tartozik az oligo(dT)-immofcilizált cellulóz oszlop módszer {Molecular Cloning, 2. kiadás) és hasonlók.
Emellett a mRNS előállítható egy kit segítségével is, mint pl. Fast Track mRNA Isolation Kit (gyártó: Invitrogen), Quick Prep mRNA Purification Kit. (gyártó: Pharmacia) és hasonlók.
A cDNS könyvtárat elkészíthetjük a. humán vagy nem-humán szövetből vagy sejtből preparált mRNS-ből. A cDNS könyvtárakat elő-
Α eDNS könyvtárat, alkalmazhatjuk -egymást követő analízisben, és abból a célból, hegy egy teljes hosszúságú cDNS-t kapjunk Cx y an nai.ékvnyan áment lehet a nem—teljes Hosszúságú cDNS ara— nyanak csökkentésével, agy cDNS könyvtárat, amelyet oligo cap módszer segítségével készítettünk Sugano és mt.sai által kidolgozott módszerrel iGene 13s, l/i (1994) ; Gene 200, 149 (1997; ; Protein, Nucleic Acid and. Protein 41, 603 (1996); Experimental Medicine 11, 2491 (1993); cDNA Cloninc (Yodo-sha) (1996);
Methods for Preparing Gene Libraries (Yodo-sha) (1994)] használnatunx a Követ K.ező analízisben.
szekvenciájához specifikus degeneratív prímereket készítettünk az mtraceliuláris cukor nukleotid, GDP-fukóz szintéziséért felelős enzim vagy annak a cukoriáncnak a módosításáért felelős enzim aminosav-szekvenciája alapján, amelyben a fukóz l~es helyzetben kötődik az N-acetil-glükózamin 6-os helyzetéhez alfakötésen keresztül a komplex M-glikozid-kapcsolt cukorlánc redukáló végén, és a DNS-t amplifikáltuk PCR-ral [PCR Protocols, Academic Press (1990)] tempi át ként a preparált. cDNS könyvtárat használtuk, hogy egy gén-f .ragmen st kapjunk, amely az zncracelluláris cukor nukleotid, GDP-fukóz szintéziséért felelős enzimet vagy annak a cukoriáncnak a módosításáért felelős enzi met kódolja, amelyben a fukóz 1-es helyzetben kötődik az auetil-giükózamin 6-os helyzetéhez alfa-kötésen keresztül .komplex M-glikczid-kapcsolt cukorláno redukáló végén.
Azt lehetett igazolni, hogy az így-kapott .gén-fragmens egy uNo, ameuy az i.ntra-ceilulárxs cukor nukleotid, GDP-fukóz szintéziséért felelős enzimet vagy annak a cukor.láncnak a módosításáért felelős enzimet kódolja, amelyben a fukóz 1-es helyzetben kötődik az N-acetil-glükózamín 6-os helyzetéhez alfa-kötésen keresztül a komplex N~glikozid-kapcsolt cukorlánc redukáló végén, a nukleotidők analizálására, .szokásosan használt módszerrel, mint pl. S:anger-féle didezoxí-módszerrel [Proc. Natl. Acad. Sci.. USA 74, 5463 (1377)}, egv nukleotid-szekvencia analizátorral, mint pl. ABIPRXSM 377 DMA Sequencer (gyártó: PE Biosystems) vagy hasonlókkal ,
A DNS-t, amely az intracellular is cukor nukle.otid, GDP-fukóz szintéziséért, felelős enzimet vagy annak a cukorláncnak. a. módosításáért felelős enzimet kódolja, amelyben a fukóz 1-es helyzetben kötődik az N~acetil .-glükózamin β-os helyzetéhez alfakötésen keresztül a komplex N-gli.kozi.d-kapcsolt cukorlánc reduKaió- végén, megkaphatjuk kolónia-hibridizáció vagy plakkhibridizáció kivitelezésével (Molecular Cloning, 2. kiadás) a humán vagy nem-humán szövetben vagy sejtben lévő mRNS-ből. szintetizált cDNs-ből vagy cDNS könyvtárból, felhasználva a génrragmenst DNs—próbakent>
A DNS-t, amely az intracellularis cukor nukleotid, GDP-fukóz szintéziséért felelős enzimet vagy annak a cukorláncnak a módosításáért felelős enzimet kódolja, amelyben, a. fukóz 1-es helyzetben kötődik az N-acetil-glükózamin β-os helyzetéhez alfakötésen keresztül a komplex N-glikozid-kapcsolt .cukorlánc redukáló vegén, megxapnattűk PCn—rax torteno szkr.inelésse.1 is felhasználva a cDNS-t vagy cDNS könyvtárat, amelyet humán vagy nem-
enzimet vagy annak a cukorláncnak a módosításáért felelős en.zi-
d.iK az AA-acetr 1—gl.ükózamin fe~os helyzetéhez alfa-kötésen kérész-
nyérésénél alkalmaztunk
At így-kapott DNS, amely az int.racel.luláris cukor nukleotid
GDP-fukóz szintéziséért felelős enzimet vagy annak a cukor-láncnak a moaosításaert felelős- enzimet kódolja, amelyben a fukóz .1es helyzetben kötődik az iA-acetil-glükózamin €~os helyzetéhez aira-köt-ésen keresztül a komplex AAglikozid~kapcso.lt. cukorlánc redukáló végén, nukleotíd-szekvenciáját analizáltuk a terminálisától kezdve és meghatároztuk egy nukleotid analizálására hasznait szokásos módszerrel, mint pl. Sanger--féle didezoxi-módszer tProc. Natl. head. Sói. USA 7 4, 5463 (1.977) ], egy nukleotidszekvencia analizátorral, mint pl. ABIPRISM 377 DNA Sequencer
PE Biosystems)· vagy hasonlókkal.
nukiectid-szekvencia adatbázisok kutatásával, mint pl. GenBank,
EMBL, DD-BJ és hasonlók, felhasználva a homológia. visszakereső programot, mint pl, BLAST, a meghatározott eDNS nukleotidszekvencia alapján.
A fenti módszerrel kapott gén, amely az intracelluláris cukor nukleotid, GDP-fukóz szintéziséért felelős enzimet kódolja, nukleotid-szekvenciájára példaként szolgálnak a SEQ ID NO:48, 51 vagy 6h aital bemutatott nukleotid-szekvenelák. Azon gén, amely cimaK a cukor, ránona k a. módosításáért teieios enzimet kodoiga, amelyben a fukóz 1-es helyzetben kötődik az N-aeetil-olükózamin ·*
6-os helyzetéhez alfa-kötésen keresztül, a komplex N-glikozídkapcsolt cukorlánc redukáló végén, nukleotid-szekvencíájára példaként szolgál a SEQ ID NO:1 vagy 2-ben bemutatott nukleotidGenomiális DNS előállítására, amely az intracelluláris cukor nukleotid, GDP-fukóz szintéziséért felelős enzimet vagy annak a cukorláncnak a módosításáért felelős enzimet kódolja, amelyben a fukóz 1-es helyzetben kötődik az W~acet 1.1 -glükózamin 6-os helyzetéhez alfa-kötésen keresztül a komplex N-glikozid-kapcsolt cuedukáló végén, szolgáló módszerre példaként az alábbiakban leírtat említjük meg.
Genomiális DNS előállítása:
A genomiális DNS előállítására szolgáló módszerek magukban foglalják a Molecular Cloning, 2. kiadás; Current Protocols in Molecular Biology irodalmi helyeken leirt ismertmődszereket és nasoniokat. Emellett a genomiális DNS-t, amely az intracellucukor nukleotid, GDP-fukóz szintéziséért felelős enzimet kódolja vagy annak a cukorláncnak a módosításáért felelős enzi-
met, amelyben a fukóz 1-es helyzetben kötődik az N-acetilglükózamin 6-os helyzetéhez alfa-kötésen keresztül a komplex. Λ’gixkozxd·’· kapcsolt cukorlánc redukált végen, izoiamat 3 uk egy Kit segítségével is, mint pl. Genome DMA Library Screening System (gyártó: Genome Systems), Universal Genome Walker™ Kits (gyártó: Clantech; vagy hasonlóval.
Az így kapott, intracelluláris cukor nukleotid, GDP-fukóz szintéziséért felelős enzimet kódoló genomiális DNS nukleotidszekvenciára példaként .s-zoxgál a SEQ 1D NO: 6/ vagy /u szerinti nukleotid-szekvencia. Annak a cukorláncnak, amelyben a fukóz 1es helyzetben kötődik az Αΐ-acetil-glükózamin 6-os helyzetéhez alfa-kötésen keresztül a komplex M-gli.kozid~kapcso.lt cukorlánc redukáló végén, módosításáért felelős enzimet kódoló genomiális DNS nukleotid-szekvenciára példaként szolgál a SEQ ID NQ:3-ban bemutat o 11. nu k1e otid-sz e kve nc i a.
Továbbá a találmány szerinti gazdasejtet megkaphatjuk expresszibe vektor alkalmazása nélkül is oly módon, hogy közvetlenül bevezetünk egy antíszenz o.l.igo.nukleotidot vagy ribozimot egy gazdasejtbe, amelyet az intracellu.láris cukor nukleotid, GDP-fukóz szintéziséért felelős enzimet kódoló nukleotidszekvencia alapján vagy annak a cukorláncnak, amelyben a fukóz 1-es helyzetben kötődik az M-acetil.-glükózamin 6-os helyzetéhez alfa-kötésen keresztül a komplex .M-g.likozid-k.apcsolt cukorlánc redukáló végén, módosításáért felelős enzimet kódoló nukleotidszekvencia alapján terveztünk meg.
Az antiszenz oligonukleotidot vagy ribozimot szokásos módszerrel. vagy egy DNS-szintetizátor segítségével megszintetizál h-atjuk. Közelebbről, előállíthatjuk egy oligonukleotid szekvencia-információja alapján, amely egy megfelelő, 5-150 egymást követő bázisból, előnyösen 5-60 bázisból, még előnyösebben 10-40 bázisból álló szekvencia, köztük egy cDNS nukleotid-szekvencia és egy genomiális DNS, amely az intracelluláris cukor nukieotid, GDP-fukóz szintéziséért felelős -enzimet kódolja vagy annak a cukorláncnak a módosításáért felelős enzimet kódolja, amelyben a fukóz 1-es helyzetben kötődik az N-acetil-glüközamin 6-os helyzetéhez alfa-kötésen keresztül a komplex .N-glikozid-kapcsolt cukorlánc redukáló végén, úgy, hogy megszintetizálunk egy oligonukleotidot, amely megfelel a nukleotid-szekvenciával komplementer szekvenciának (antiszenz oligonukleotid; vagy egy ribozimot, amely az oligonukleotid-szekvenciát tartalmazza.
Az oligonukleotid példái közé tartoznak az oligo RNS és az oligonukleotid származékai (az alábbiakban oligonukleotidszármáz ékok’’-ként hivatkozunk rá; .
Az oligonukleotid—származékok közé tartoznak azok az oligonukleotid-származékok, amelyekben agy foszfodiésxter-kötést az oligonukleotidban egy foszforotioát-kötéssé alakítottunk át, az az oligonuklsotid-származék, amelyben egy foszfodiészterkötést az oligonukleotidban N3’-P5!-foszfoamidát kötéssé konvertáltunk, az az oligonukleotid-származék, amelyben ribózt és egy foszfodiészter-kötést az oligonukleotidban pentid-nukleínsav kötéssé alakítottunk át, az az oligonukleotid-származék, amelyben az uracilt az oligonukleotidban C-5 propinil-uracillal helyettesítettük, az az oligonukleotid—származék, amelyben az uracilt az oligonukleotidban C-5 tiazol-uracillal helyettesitettük, az az
:b.) A találmány szerinti gazdassj t előállítása hoinológ rekosíbináA találmány szerinti gazdasejtet előállíthatjuk a. cél gén módosításával a kromoszómán homológ rekombinációs technikával, felhasználva egy gént, amely az intracelluláris cukor nukleotid, teUfiUKóz 3 2101.6 0.13001.0. xelelos enzimet koctoija vagy annak a cu— körláncnak a módosításáért felelős enzimet kódolja, amelyben a fukóz 1-es helyzetben kötődik az .M-aoetil-glükózamin 6-os helyzetéhez alfa-kötésen keresztül a komplex N-glikozid-kapcsolt cukorlánc redukáló végén, cél génként..
A kromoszómán a cél gént az alábbi irodalmi helyeken leírt módszerek alkalmazásával vagy hasonlóval, vagy az alábbiakban leírtak szerint módosíthatjuk: Manipulating the Mouse Embryo, A Laboratory Manual, 2. kiadás, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1994; (alábbiakban ’’Manipulating the Mouse Embryo, A
Manual-ként hivatkozunk rá)·;· Gene Targeting,
Practical Approach, IRL Press at Oxford. University Press (.1993· ;
Biomanuai Series 3, Gene Targeting, Preparation of Mutant Mice using EG Cells, Yodo-she (1995) (alábbiakban Preparation of Mutant Mice using ES CelIs-ként hivatkozunk rá).
Egy genomiális DNS-t preparálunk., amely az intracelluiáris cukor nukleotid, GDP-fukóz szintéziséért felelős enzimet vagy annak a cukorláncnak a. módosításáért felelős enzimet kódolja, amelyben a. fukóz 1-es helyzetben kötődik az N-acetil-glükózamín 6-os helyzetéhez alfa-kötésen keresztül a komplex N-glikozidkapcsolt cukorlánc redukáló végén.
A. genomiális DNS nukleotid—szekvenciája alapján egy cél vektort szerkesztünk a módosítani kívánt target gén homológ rekombinációjához (pl. az az intracelluiáris cukor nukleotid, GDPiukoz szintéziséért teleios enzimet xodoió vagy anna.'<. a cukor— láncnak a módosításáért felelős enzimet kódoló scruktúr gén, amelyben a fukóz 1-es helyzetben kötődik az N-acé.til-glükózamin 6-os helyzetéhez alfa-kötésen keresztül a komplex N-glik.ozi.d~ kapcsolt cukorlánc redukáló végén, vagy egy promoter gén).
A találmány szerinti gazdasejtet előállíthatjuk a megszerxesztett cél vektor gazdaseátbe történő bevezetésével és azon sejtek szelektálásával., amelyekben homológ rekombináció végbement a cél gén és a cél vektor között.
Gazdasejtként bármely sejtet, mint pl. élesztő, állati sejt, rovar sejt vagy növényi sejt, használhatunk mindaddig, amíg az tartalmaz egy, az intracelluiáris cukor nukleotid, GDP-fukóz szintéziséért ieielos enzimet kocolo gént vagy annak a cukorláncnak a módosításáért felelős enzimet kódoló gént, amelyben a fukóz 1-es helyzetben kötődik az N~aceti 1-olükózami.n 6-os hely setéhez alfa-kötésen keresztül a komplex M-glikozid-.kapc-solt cukorlánc redukáló végén. Gazdasejtekre példákat később s 3. fejezetben fogunk megadni.
Az i.nKraCenulá.Ii-S CUKO-X uukiSGildy GjJí?* ÍUKÓZ S Z LR’C^ x títerelos enzimet vagy annak a cukorláncnak « módosírásáért felelős enzimet, amelyben a fukóz 1-es helyzetben kötődik az 7/acetil-glükczamin 6-os helyzetéhez alfa-kötésen keresztül a komplex £/-glikozid-kapcsolt cukor lánc redukáló végén, kódoló genomiális DNS preparálására szolgáló módszerekre példaként szolgainak azok a módszerek, melyeket a genomiális DNS preparálásánál az 1(1)(a) fejezetben irtunk le és Hasonlók.
A.z intracelluláris cukor nukleotid, GDP-fukóz szintéziséért felelős: ' enzimet kódoló genomiális DNS nukleotid-szekvenciáiára példaként megemlítjük a SEQ ID NO : 67 vagy 70 szerinti nukleotidszekvenciát. Annak a. cukorláncnak a módosításáért felelős enzimet, amelyben a fukóz 1-es helyzetben kötődik, az N-acetilg.lü.kóz.am.in 6-css helyzetéhez alfa-kötésen keresztül a komplex Λ'gl.lkozid kapcsolt cukor lánc redukáló végén, kódoló genomiális DNS nukleotíd-szekvenciájára példaként megemlítjük a SEQ ID NO: 3 szerinti nukleotid-szekvenciát.
A célgén homológ rekombinációjához a cél vektort megszerkeszthetjük. a Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1993); Biomanual Series 8, Gene Targeting, Preparation of Mutant Mice using ES Cells, Yodo-sha. (1995) kézikönyvekben vagy hasonlókban leírt módszerrel. A cél vektort helyettesítő típusú vagy ínszerciós típusú lehet.
/’x <.eí vextox ravszaiásars a xuronbözo gamasc': cekm, a m— lönfele gazdasejtekhez alkalmazott rekcmbináns vektorok résére szolgáló módszereket használhatjuk, amelyeket a későbbiekben. a 3. fejezetben írunk le.
A homológ rekcmbináns hatékony szelektálására szolgáló módszerek közé tartoznak a pozitív szelekció, promoter szelekció, negatív szelekció vagy poliA szelekció vagy hasonlók [lásd Gene Targeting, A Practical Approach, I RI, Press at Oxford University Press (1993); Biomanual Series 8, Gene Targeting, Preparation of Mutant Mice using E.'S Cells, Yodo-sha (1995)]. A szelektált sejtvonalamét az erdekes homolog rekcmbináns szelektálására szolgáló módszerek közé tartozik a Southern hibridizációs módszer a genomiális DNS-hez (Molecular- Cloning, 2. kiadás), a PCR [PCR
Protocols, Academic Press )1990)] ej A találmány szerinti gazda.sejt előállítása RDO módszerrel
A találmány szerinti, gazcasejtet előállíthatjuk RDO (.RNS— DNS-oligonukleotid) módszerrel egy gén megcélzásával, amely az intxacelluláris cukor nuk1eotid, GDP-fukóz szintéziséért fele1ős enzimet vagy annak a cukorláncnak a módosításáért felelős enzimet kódolja, amelyben a fakor 1-es helyzetben kötődik az A’~ acetil~glükőzamin 6-os helyzetéhez alfa-kötésen keresztül a komplex N-glikozid-kapcsolt cukorlánc redukáló végén, például az aiaobzat szerint.
Egy cDNS-t vagy egy genomiális DNS-t preparálunk, amely az intracelluláris cukor nukleotid, GDP-fukóz szintéziséért felelős enzimet vagy annak a cukorláncnak a módosításáért felelős enzimet kódolja, amelyben a fukoz 1-es helyzetben kötődik az N acet i.l-glükózamin β-os helyzetéhez alfa-kötésen keresztül a komplex N-glikozid-kapcsolt cukorlánc redukáló végén.
Meghatározzuk a preparált cDNS vagy genomiális DNS nukleotid-szekvenciáját.
A .meghatározott DNS-szekvencia. alapján egy megfelelő hosszúságú RDO konstrukciót, amely tartalmazza a.z intracelluláris- cukor nukleotid, GDP~.fukó.z szintéziséért felelős enzimet kódoló vagy annak, a cukorlánonak a módosításáért felelős enzimet kódoló DNS egységet, amelyben a. fukóz 1-es helyzetben kötődik az Nacetrl-glükózamin 6-os helyzetéhez alfa-kötésen keresztül a komplex N-glikozid-kapcsolt cukorlánc redukáló végén, tervezünk és szintetizálunk..
A találmány szerinti gazdasejtet előállíthatjuk a megszintetizált. RDÖ gazdasejtbe történő bevezetésével és ezután egy transzformáns- szelektálásával, amelyben mutáció történt a megcélzott enzimben, nevezetesen az intra-cellu.láris cukor nukleotid, GDP-.fukóz szintéziséért felelős enzimben vagy annak a cukorláncnak a módosításáért felelős enzimben, amelyben a fukóz 1-es helyzetben kötődik az A-acetil-glükózamín 6-os. helyzetéhez alfa-kötésen keresztül a komplex N'-gli'kozid-kapcsolt cukorlánc redukáló végén.
Gazdasejtként bármely sejtet, mint pl. élesztő, állati sejt, rovar sejt vagy növényi sejt, használhatunk mindaddig, amíg az tartalmazza az intracellulárís cukor nukleotid, GDP-fukóz szintéziséért felelős target enzimet kódoló gént, vagy annak a cukorláncnak a módosításáért felelős target enzimet kódoló gént.
amelyben a fukóz 1-es helyzetben kötődik az N-acetil—glükózamin
6-os helyzetéhez alfa-kötésen keresztül a komplex iV-glikozid kapcso -It cukor lánc, redukáló végén.. Gazdasejtekre példákat később fejezetben focunk meaadni
Az RDO bevezetésére a. különböző gazdaseitekbe, a különféle ga.zdasejte.khez alkalmazott rekombináns vektorok bevezetésére szolgáló módszereket használhatjuk, amelyeket a későbbiekben a
Az intracelluláris cukor nukleotid, GDP-fukóz szintéziséért felelős enzimet vagy annak a cukorláncnak a módosításáért fele nzimet, amelyben a fukóz 1-es helyzetben kötődik az acetri-giükózárain 6—os helyzetéhez alfa-kötésen, keresztül a komplex N-glikozid-kapcsolt cukorlánc redukáló végén, kódoló cDNS preparálására szolgáló módszerekre példaként szolgálnak azok a módszerek, melyeket a DNS preparálásánál az 1(1)(a) fejezetben írtunk le és hasonlók.
Az intrace Halár is cukor nukleotid, GDP-fukóz szintéziséért reieros. enzimet vagy annak a. cukorláncnak, a módosításáért felelős enzimet, amelyben a .fukóz 1-es helyzetben kötődik az Maceti1-giu:kozamin 6-os helyzetéhez alfa-kötésen keresztül a komplex A'-glikozict- kapcsolt cukorlánc redukáló végén, kódoló ge-nomiális DNS preparálására szolgáló módszerekre példaként szolgálnak azok a módszerek, melyeket a genomiá.lis DNS preparálásánál az 1(1)(a; fejezetben írtunk le és hasonlók.
A DNS nukleotid-szekvenciáját meghatározhatjuk úgy, hogy alkalmas restrikciós enzimekkel emésztjük, a fragmenseket egy pla.zmi.dba, mint pl. pBluescript SK(-) (gyártó: Stratagene) vagy hasonlóba klónozzuk, a klánokat olyan reakciónak vetjük alá, me lyet szokásosan alkalmaznak a nukleotxd-szekvencia analizálására, mint pl. -Sanger—f éra oidezoxx—módszer [Proc. Natx. Aca-d.. Sci. USA 74,- 5463 (1977) J, és- ezután analizáljuk a kiónokat automata nukleotid-szekvencia analizátor segítségével, mint pl. a.l.F. DNb Sequencer (gyártó: Pnarmacxa) vagy hasonlóval.
Az RDO-t egy szokásos módszerrel vagy DNS-szintetizátorral anxtnatguK sió.
Azon sejtek szelektálására, amelyekben mutáció előfordul az RDO gazdasejtbe történő bevezetésével az intraeelluiáris cukor nukleotid, GDP-fukóz szintéziséért felelős enzimet vagy annak a cukorláncnak a módosításáért felelős enzimet kódoló génben, amelyben a fukóz 1-es helyzetben kötődik, az N-acetil-glUkózamin 6-os helyzetéhez, alfa-kötésen keresztül a komplex glikozidkapcsolt cukorlánc redukáló végén, szolgáló módszerek közé tartoznak a .kromoszómáiig génekben levő mutációk közvetlen detektálására szolgáló módszerek, melyeket a Molecular Cloning, 2. kiadás, a Current Protocols in Molecular Biology kézikönyben ismertettek, és hasonlók.
Egy transzformáns szelektálására példaként szolgál az l(.l)(a} fejezetben, leírt módszer a bevezetett, intracelluláris cuK-or n.ukieotxd, ocP—fuKOz sz.xntézxséért felelős enzim, vagy annak a cukorláncnak a módosításáért felelős enzim aktivitásának kifejlesztésén keresztül, amelyben a fukóz 1-es helyzetben kötődik az N-acetil-glükózamín 6-os helyzetéhez alfa-kötésen keresztül a komplex íJ-glikozid-'kapcsolt cukorlánc redukáló végén; egy transzformáns szelektálására szolgáló módszer a. sejtmembránon cukor szerkezetének felhasználásával, melvet
{Q? λ taxazmany szerinti ^azdasejt exoáxlitasa .RMSz /módszerrel
A találmány szerinti gazdasejtet előállíthatjuk RNSi (RNSinterferencia) módszerrel az intracelluláris cukor nukleotid, GDP-fukóz szintéziséért felelős enzim génjének vagy annak a cukor láncnak a módosításáért felelős enzim génjének megcéÍrásával, amelyben a fukóz 1-es helyzetben kötődik az. N-acetil-glükózamin 6-os helyzetéhez alfa-kötésen keresztül a komplex M-glikozidkapcsolt cukor'lán.c redukáló végén, például, az alábbiak szerint.
Egy c-DNS—t preparálunk, amely az intracelluláris cukor nukleotid, GDP-fukóz szintéziséért felelős enzimet vagy annak a cukorláncnak a módosításáért felelős enzimet kódolja, amelyben a fukóz 1-es helyzetben kötődik az N-acetil-glükőzamin 6-os helyzetéhez alfa-kötésen keresztül a komplex N-gli.koz.id-kapcsO.lt cu69
korránc reotakáic νβ^εη.
Meghatározzuk a preparált eDNS nukleotid-szekvenciáját
A meghatározott DNS--szekvencia alapján egy megfelelő hosszú ságú RNSi gén-szerkezetet tervezünk, amely tartalmazza az intracelluláris cukor nukleotid, GDP-fukóz szintéziséért felelős enzimet kódoló vagy annak a cukorláncnak a módosításáért felelős enzimet kódoló DNS egységet, amelyben a fukóz 1-es helyzetben kötődik az xV~acet.il-glükózamin 6-os helyzetéhez alfa-kötésen keresztül a komplex M-glikozid-kapcsolt cukorlánc redukáló végén.
Abból a célból, hogy a RNSi gént egy sejtben exprssszáljuk, egy rekombináns vektort készítünk behelyezve a preparált teljes hosszúságú DNS-t vagy egy fragmensét egy alkalmas expresszibe vektor promoterétől downstream irányba.
A rekombináns vektornak egy, az expresszibe vektornak megfelelő gazda-sejtbe történő bevezetésével egy t ranszformánst kaA l. a xá amdny szerinti gazoa.se g tét megmphat yur egy transzformáns szelektálásával az intracelluláris cukor nukleotid, GDP-fukóz szintéziséért felelős enzim vagy annak a cukorláncnak a módosításáért felelős enzim aktivitásának alapján, amelyben a fukóz 1-es helyzetben kötődik az N-acetilglükózamin 6-os helyzetéhez alfa-kötésen keresztül a komplex xV~ gizkozid-kapcsolt cukorlánc redukáló végén, vagy a sejtmembránon tévő gnkoprctezn cukorlánc szerkezete vagy a termelt antitest molekula alapján.
Gazdasejtként bármely sejtet, mint pl. élesztő, állati sejt, rovar sejt vagy növényi sejt, használhatunk mindaddig, amíg az tartalmazza az intracelluláris cukor nukleotid, GDP-fu.kóz szin téziséért relelős target enzimet kódoló gént vagy annak a cukorláncnak a módosításáért felelős target enzimet, kódoló gént, amelyben a fukóz 1-es helyzetben kötődik az A-aceti1-glükózamin 6~os helyzetéhez alfa-kötésen keresztül a komplex: N-glikozidkapcsolt cukorlánc redukáló végén. Gazdasejtekre példákat később a 3, fejezetben fogunk megadni.
Expressziós vektorként egy olyan vektort alkalmazhatunk, amely autonóm módon replik'álódik a. gazdasejtben vagy képes integrálódni a kromoszómába és egy promotert tartalmaz olyan helyzetben, hogy a tervezett RNSi gén áthelyeződhessen. Expressziós vcKtorokra példaként szolgálnak azok a vektorok., melyeket a későbbiekben a 3, fejezetben írunk le.
a. trans zformáns szelektálására szolgáló módszerre az intracelluláris cukor nukleotid, GDP-fukóz szintéziséért felelős enzim aktivitása vagy annak a cukor láncnak a. módosításáért felelős enzim aktivitása alapján, amelyben a fukóz 1-es helyzetben kötődik az M-acetil-glükózamin 6-os helyzetéhez alfa-kötésen keresztül a komplex M-glikozíd-kapcsolt cukorlánc redukáló vécén, példaként szólóéinak azok a módszerek, meIvekét az lílHal feje cetben írtunk le.
agy vrenszxormans szelektaiasara szolgáló módszerre a sejt — memoránon lévő glikoprotein cukorlánc szerkezete alapján példaként szolgálnak azok a módszerek, melyeket később az 1 (5) fejezetben írunk le, Egy transzformáns szelektálására szolgáló módszerre a termelt antitest-molekula cukorlánc szerkezete alapján példaként szolgálnak azok a módszerek, melyeket később az 5.
vagy 6.. fejezetben .ismertetünk.
Az intraceiluláris cukor nukleotid, GDP-fukóz szintéziséért felelős enzimet vagy annak a cukorláncnak a módosításáért felelős enzimet, amelyben a fukóz 1-es helyzetben kötődik az A’~ acetil-glükózamin 6-os helyzetéhez alfa-kötésen keresztül a komplex M-glíkozid-kapcsolt cukorlánc redukáló végén, kódoló cDNS preparálására, szolgáló módszerekre példaként szolgálnak azon a .mooszerek, melyeket a DNS preparálásánál az 1(1)(a) feje zet öen irtunk le és hasonlók.
Emellett a találmány szerinti gazdasejtet megkaphatjuk expressziós vektor alkalmazása nélkül is, közvetlenül egy RNSi gén nevezetesével, melyet az intracelluláris cukor nukleotid, GDP-fukóz szintéziséért felelős enzimet vagy annak a cukorlá.ncnak a módosításáért felelős enzimet, amelyben a fukóz 1-es helyzetben kötődik az xV-acetil-glükózamín 6-os helyzetéhez alfakötésen keresztül a komplex N-gli'kozid-kapcsolt cukorlánc redukáló végén, kóstoló nukleotid-szekvencia alapján terveztünk meg.
Az RNSi gént szokásos módszerrel vagy egy DNS szintetizátorral au.Latnat vük elő.
Az RNSi gén-szerkezetet a következő irodalmi helyeken leírt módszerekkel összhangban tervezhetjük meg: Nature 391, 80S (1998); Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 15502 (1993); Nature 395, 854 (1998); Proc. Natl, Acad. Sci. USA 96, 5049 (1999); Cell 95. 101'7 (1998); Proc. Natl, Acad. Sci. (ISA 96, 1451 (1999); Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 13959 (1998); Nature Cell Biol. 2, 70 (2000) és hasonlók.
íe.J A találmány szerinti gazdasejt előállítása transzporont alka.imaző: módszerrel
A találmány szerinti gazdasejtet előállíthatjuk mutáció bevezetésével a Nature Genet, 2.5, 35 (2000) cikkben .leírt transzporon rendszert alkalmazó módszerrel vagy hasonlóval, és ezt kővetően egy mutáns szelektálásával az intracelluiáris cukor .nukleotid, GDP-tukóz szintéziséért felelős enzim vagy annak a cukorláncnak a módosításáért felelős enzim aktivitásának alapján, amelyben a fukóz 1-es helyzetben kötődik az N-acetilglükózamin. 6-os helyzetéhez alfa-kötésen keresztül a komplex Ngiikozid—kapcsolt cukorlánc redukáló végén, vagy a termelt antitest molekula glikoprotein jének vagy a. sejtmembránon lévő glikoprotein eukorlánc szerkezete alapján.
A transzporon rendszer egy olyan rendszer, amelyben egy mutációt váltunk ki egy exogén gén random inszertálá.sáva.1 a kromoszómába, ahol az exogén gén beékelődik a transzpozonok közé. Ezt a rendszert szokásosan. alkalmazzák vektorként mutációk előidézésére, és egy transzpozáz expresszíós vektort vezetnek be. ugyanakkor a sejtbe a. gén random .inszertá.lásá.ra a kromoszómába.
Bármely transzporért alkalmazhatunk mindaddig, amíg az megfelel a használni kívánt transzporon szekvenciájának»·
Exogéii génként bármely gént alkalmazhatunk mindaddig, amíg az kivált egy mutációt a gazdasejt DNS-ében.»·
Gazdasejtként bármely sejtet, mint pl. élesztő, állati sejt, rovar sejt vagy növényi sejt, használhatunk mindaddig, amíg az tartalmazza az intracelluiáris cukor nukleotid, GDP-fukóz szintéziséért felelős target enzimet kódoló gént vagy annak a cukor-
Egy mutáns szelektálására szolgáló módszerre a sejtmembránon lévő glikoprotein oukorlá.nc szerkezete alapján példaként szolgálnak azok a módszerek, melyeket később az 1(51 fejezetben .lzuíiK xe. Egy mutáns sze.Lektaj.asára szorgaio moctszerre a termelt antitest-molekula cukorlánc· szerkezete alapján példaként szolgálnak azok a módszerek, melyeket később az 5. vagy 6. fejezetben ismertetünk.
(2) Módszer az enzimet kódoló gén domináns negatív mutánsának bevezet e s é re
A találmány szerinti gazdasejtet létrehozhatjuk az intra-
c-eiluláris cukor nukleotid, GDP-fukóz szintézisével kapcsolatos enzimet kódoló gén vagy annak a. cukorláncnak a módosításáért felelős enzimet kódoló gén megcélzásával, amelyben a fukóz 1-es helyzetben kötődik az A-acetil-’glükózamin 6-os helyzetéhez alfakötésen keresztül a komplex A3-gii koz id-kapcsolt cukorlánc redukáló végén, felhasználva egy technikát az enzim domináns negatív mutánsának bevezetésére. A.z intracelluláris cukor nukleotid, GDP-fukóz szintézisével kapcsolatos enzimre példák a GMD, Fx, GFPP, fukokináz és hasonlók. Enzimre, amely kapcsolatban van a cukorlánc módosításával, amelyben az 1-es helyzetű fukóz kötődik a 6-os helyzetű IJ-acetil-glükózaminhoz alfa-kötésen keresztül a komplex N-glikozid-kapcsolt cukorlánc redukáló végén példaként szolgálnak az a-1,6-fukoziltranszferáz, α-L-fukozidáz és hasonlók.
Az enzimek specifikus, szubsztrát specificitássa.l bíró reakciókat katalizálnak, és az enzimek domináns negatív mutaánsait előállíthatjuk az enzimek aktív centrumának szétrombolásával, amely katalizálja a szubsztrát-specificitású katalitikus aktivitást. A domináns negatív mutáns előállítására szolgáló módszert részletesebben a megcélzott enzimek között a GMD-re való hivatkozással az alábbiakban írjuk le.
A.z E. coll-eredetű GMD három-dimenziós szerkezetének analízise eredményeként kimutatták, hogy 4 aminosav (a treonin a 133. pozícióban, glutaminsav a 135. pozícióban, tirozin a 157. pozícióban és .lizín a 161, pozícióban) lényeges funkcióval rendelkezik az enzimektivitás szempontjából (Structure 8, .2, 2000) . Azaz, amikor mutánsokat készítünk a 4 aminosav más eltérő amínosa-
vakkal történő helyettesítésével a három-dimenziós szerkezet információ alapján, az Összes mutáns enzimakti vitása szignifikánsan -csökken. Másrészről, változásokat a GMD azon képességében, hogy kotodzk a GMD koe.nzi.rn NAD.P-hoz és a. GDP-mannóz szubsztrátjóhoz, alig figyeltek meg a mutánsokban. Ennek megfelelően egy domináns negatív mutánst -előállíthatunk annak a 4 amin-osavnak a helyettesítésével, amelyek szabályozzák a GMD enzimaktivítását. így például a CHO sejtből származó GMD-ben (SEQ ID NO;65) egy domináns negatív mutánst készíthetünk a 155. helyzete trsonin, a 157. helyzetű glutaminsav, a 179. helyzetű t oroz in és a 18 3. helyzetű lizín más aminosava.kk.al történő helyettesítésével, összehasonlítva a homológiát és megjósolva a három-dimenziós szerkezetet az E. coli-eredetű GMD eredményein alapuló aminosav-szekvencia információ felhasználásával. Egy ilyen gén, amelyben amínosav—helyettesítést végeztünk, előállítható helyre-irányított mutagenezissel, melyet a Molecular Cloning, 2. kiadás, Current Protocols in Molecular Biology kiadványokban ismertetnek és hasonlókkal.
A találmány szerinti gazdasejtet a Molecular Cloning, 2. kiadás, Current Protocols ín Molecular Biology és hasonló kiadványé Kban leírt módszerekkel összhangban állíthatjuk elő, felhasználva a. cél enzim preparált domináns negatív mutáns génjét, például az alábbiak szerint.
Az intracelluláris cukor nukleotid, GDP-fukóz szintéziséért fe.ie.Lcs enzim vagy annak a cukorláncnak a módosításáért felelős enzim, amelyben a fukóz 1-es helyzetben kötődik az N-acetilglükózamin 6-os helyzetéhez alfa-kötésen keresztül a komplex xV**$ ί » **** «» ♦ A
99 ***» ***
I” giikozid-kapcsolt cukorlánc redukáló végén, domináns negatív mutánsát kódoló gént (az alábbiakban ’’domináns negatív mutáns gén) előállítjuk.
A domináns negatív mutáns gén teljes hosszúságú DNS-e alapján, ha szükséges, egy megfelelő hosszúságú DNS-fragmenst készítünk, amely tartalmazza a proteint kódoló egységet.
Egy rekombináns vektort készítünk behelyezve a preparált teljes hosszúságú DNS-t vagy fragmensét egy alkalmas expresszi-ős vektor promoterétől downstream irányba.
A rekombináns vektornak egy, az expre.ssziós vektornak megfelelő gazdassjtbe történő bevezetésével egy transz formánét, kapun k.
A találmány szerinti gazdasejtet megkaphatjuk egy transzformáns szelektálásával az: intracelluláris cukor nukleotid, GDP-fukóz szintéziséért felelős enzim vagy annak a cukorláncnak a módosításáért felelős enzim aktivitásának alapján, amelyben a fukóz 1-es helyzetben kötődik az N-acetilglükózamin 6-os helyzetéhez alfa-kötesen keresztül a komplen Nglzkoziu-kapcsolt cukorlánc redukáló végén, vagy a termelt antitest molekula glikoproteinjenek vagy a sejtmembránon lévő glikoprotein cukorlánc szerkezete alapján.
Gazdasejtként bármely sejtet, mint pl. élesztő, állati sejt, rovar sejt vagy növényi sejt, használhatunk mindaddig, amíg az tartalmazza az intracelluláris cukor nukleotid, GDP-fukóz szintéziséért felelős target enzimet kódoló gént vagy annak a cukorláncnak a módosításáért felelős target enzimet kódoló gént, amelyben a fukóz 1-es helyzetben kötődik az AP-aueti 1 -glükózamin
Az. intracelluláris cukor nukleotid, GDP-fukóz szintéziséért felelős enzim aktivitásának vagy annak a cukorláncnak a módostfásáért felelős enzim aktivitásának, amelyben a fukóz 1-es helyzetben kötődik az 2V~acet.il-glükőzamin 6-os helyzetéhez alfakötésen keresztül a komplex. N-glikozid-kapcsolt cukorlánc redukáló végén, mérésére szolgáló módszerekre példaként .szolgálnak azok a módszerek, melyeket az 1(1) (a) fejezetben írtunk le. A termelt antitest molekula cukorlánc szerkezetének megkülönböztetésére szolgáló módszerre példaként szolgálnak azok a módszerek, melyeket később az 5. vagy 6. fejezetben ismertetünk. A. sejtmembránon lévő giikoprotein cukorlánc szerkezetének megkülönböztetésére szolgáló módszerre példaként szolgálnak azok, melyeket később az 1(5) fejezetben ismertetünk.
(4) Módszer az enzimet kódoló gén transzkripcióiénak és/vagy transzlációi ának gátlására
A találmány szerinti gazdasejtet létrehozhatjuk' a cél-gén transzkripciójának és/vagy transzlációjának gátlásával egy módszerrel,· mint pl. antiszenz RNS/DNS technikával ÍBioscience and Industry 5.0, 322 (1992); Chemistry 46, 681 (1991); Biotechnology 9, 358 (1992); Trends in Biotechnology 10, 87 (1992); Trends in Biotechnology 10, 152 (1992); Cell Engineering 1 6,. 1463 (1997)1 vagy hasonlóval, felhasználva az intracelluláris cukor nukieotid, GDP-fukóz: szintéziséért felelős enzimet kódoló és/vagy annak a cukorláncnak a módosításáért felelős enzimet kódoló gént cél-génként, amelyben a fukóz. 1-es helyzetben kötődik az N-acetíl-glükózamín 6-os helyzetéhez alfa-kötésen keresztül a komplex N-glikozid-kapcsolt cukorlánc redukáló végén.
Az intracelluláris cukor nukleotid, GDP-fukóz. szintézisével kapcsolatos enzimre példák ,a GMD, Fx, GFFP, fukokinéz és hasonlók. .Enzimre, .amely kapcsolatban van a cukorlánc módosításával, amelyben az 1-es helyzetű fukőz kötődik a €-os· helyzetű Nacetil-glükózamírihoz alfa-kötésen keresztül a komplex glikozid-kapcsolt cukorlánc redukáló végén példaként szolgálnak az a-1,6-fukoziltranszferáz, a-L-fukozidáz és hasonlók.
(5) Módszer lektinre-rezisztens sejtvona.l szelektálására, amely felismer egy cukorlánc szerkezetet, amelyben az 1-es helyzetű fu'köz a. -6-os helyzetű N-acetil-glükózamínhoz kötődik alfa-kötésen keresztül, az M-qli.kozi.d-kapcso.lt cukorlánc redukáló vécén
A találmány szerinti sejtvonalat előállíthatjuk egy módszerrel, melyben egy lektinre-rezisztens sejtvonalat szelektálunk, amely felismer egy cukorlánc szerkezetet, amelyben az 1-es helyzetű fokoz a 6-os helyzetű M-acetíl-glükózaminhoz kötődik alfakötésen keresztül az N-glikozid-kapcsolt cukorlánc redukáló végén.
Lektx.nre-rezisztens sejtvonal, amely felismer egy cukorlánc szerkezetet, amelyben az 1-es helyzetű fukóz a 6-os helyzetű Nacetil-glükózaminhoz kötődik alfa-kötésen keresztül az N~ glikozid-kapcsolt cukorlánc redukáló végén, szelektálására szolgáló módszerek közé tartoznak például a lektint alkalmazó módszerek [Somatic Cell Mol. Genet. 12, 51 (1986)} és hasonlók. Lektinként bármely lektint használhatunk mindaddig, amíg az képes felismerni egy cukorlánc szerkezetet, amelyben az 1-es helyzetű fukóz a 6-os helyzetű M-acetil-glükózamínhoz kötődik alfa-
kötésen keresztül az N-glikozid-kapcsolt cukorlánc redukáló vég^n. —éloan erre a uens culmarzs .lektin .atA (a .tens culin^ris— bői származó lentil agglutinin), a borsó lektin PSA (Pisára sativum eredetű, borsó lektin), a széles bab lektin VFA (Viola ram ereeetu. aggxutinm; , az Aiea'rirí áuránriá lektin AAn (az Aleuria aursnti.a eredetű lektin) és hasonlók.
Pontosabban, a találmány szerinti lektinre-rezisztens sejtvonalat, amely -felismer egy cukor lánc szerkezetet, amelyben az 1-es helyzetű fukóz a β-os helyzetű AC-acetil-glükózaminhoz kötődik. alfa-kötésen keresztül az N—glikozid~kapcso.lt cukorlánc redukaio végen, úgy szeleKca.matjuk, hogy a sejteket i naptol z hétig tenyésztjük, előnyösen 1 naptól 1 hétig, egy tápközegben, amely 1 ug/ml - 1 mg/ml lektint tartalmaz, a túlélő sejteket altenyésztjük vagy a kolóniákat felszedjük és átvisszük, egy tenyésztő ecenyoe, es ezt követően folytatjuk a tenyésztést lektin-tartalmú tápközegben. Ezzel a módszerrelkapott sejtvonalra példaként szolgál a CHö/CCRá-LCA Nega-13 (FERM BP-7756), melyet a 14(2; példában kaptunk,amit későbbiekben írunk le.
2. A találmány szerinti transagenikus nem-humán állat vagy nö vény vagy ezek utódainak előállítása
A találmány szerinti transzgenikas nem-humán állat vagy növény vagy ezek utódai egy olyan transzgenikus nem-humán állat vagy növény vagy ezek utódai, amelyekben egy genomiális gént mó dosítottunk oly módon, hogy egy antitest molekula cukorláncának módosításáért felelős enzim aktivitását szabályozzuk, és azt az
1. fejezetben leírt módszerrel analóq módon .állíthatjuk elő cél használva egy gént, amely az intracelluláris cukor nukleotid, GDP-fukőz szintéziséért felelős enzimet és/vagy annak a cukorláncnak a módosításáért felelős enzimet kódolja, amelyben a fukóz 1-es helyzetben kötődik az N-acetil-glükőzamin 6’-as helyzetéhez alfa-kötésen keresztül a komplex Az-glikozid-kapcsolt cukorlánc redukáló végén.
A transzgenikus- nem-humán, állatban a találmány szerinti embrionális őssejtet, amelyben az intracelluláris cukor nukleotid, GDP-fukóz. szintéziséért felelős enzim aktivitását vagy annak a cukörláncnak a módosításáért felelős enzim aktivitását szabályoztuk, amelyben a fukóz 1-es helyzetben kötődik az W-acetilglüközamin- 6-os helyzetéhez alfa-kötésen keresztül a komplex Ngl.iko.zid~ kapcsolt cukorlánc redukáló végén, előállíthatjuk az 1. fejezetben ismertetett módszert .alkalmazva az átalakítani kívánt nem-humán állat, mint pl. marha, juh, kecske, sertés, ló, egér, patkány, szárnyas, majom, nyúl és hasonló embrionális őssejtjéRészletesebben, egy mutáns kiónt készítünk, amelyben az intracelluláris cukor nukleotid, GDP-fukóz szintéziséért felelős enzimet kódoló vagy annak a cukorláncnak a módosításáért felelős enzimet kódoló gént, amelyben a fukóz. 1-es helyzetben kötődik az N-acetll-glükózamin 6-os helyzetéhez alfa-kötésen .keresztül a komplex h-glikozíd-kapcsolt cukorlánc redukáló végén, inaktiváljuk vagy helyettesítjük bármely szekvenciával, ismert homológ rekombinációs technikával [pl. Nature 326, €110, 295 (1987); Cell 51, 3, 5G3 (1987} és hasonlók] . A preparált mutáns klón feInasznáiasávai. egy embrionális őssejt kiont es. egv norma—
cukor nukleotid, GDP-fukóz szintéziséért felelős enzim aktivitása vagy annak, a cukorláncnak a módosításáért felelős enzim akti-
acetíl-glükózamin €-os helyzetéhez alfa-kötésen keresztül komplex N-glikczid-kapcsolt cukorlánc redukáló végén, csökkent • ♦ ♦ ♦ * X vagy hiányzik, előállíthatjuk a preparált megtermékenyített oe tesejt transzplantálásával a pszeudoterh.es nőstény petevezetéké be vagy méhébe embrió-transzplantációs módszerrel, melyet a Manipulating Mouse Embryo, 2. kiadásban vagy hasonlóban Írtak re, majd az állat ezt követó szülésével.
Egy transzgenikus növényben, a találmány szerinti ballaszt, amelyben az intracelluláris cukor nukleotid, GDP-fukóz szintéziséért felelős enzim aktivitása vagy annak a cukorláncnak a módosításért felelős enzim aktivitása, amelyben a fukóz 1-es helyzetben kötődik az N-acetil-glükózamin 6-os helyzetéhez alfakötésen keresztül a komplex N-glikozid-kapcsolt cukorlánc redukáló vegén, csökkent vagy hiányzik, előállíthatjuk az 1. fejezetben leuit modszernez nasonió módszert alkalmazva az érdesces növény kalluszához vagy sejtjéhez.
A transzgenikus növényt, amelyben az intracelluláris cukor nukleotid:, --..70-9-.... u koz szintéziséért relelos enzrm sktivitass vagy annak a cuköriáncnak a módosítás-árt felelős enzim aktivitása, amelyben a fukóz 1-es helyzetben kötődik az M-aoeti1-glükczamln 6-os helyzetéhez alfa-kötésen keresztül a komplex N-glikozídkapcsolt cukorlánc redukáló végén, csókként vagy hiányzik, előáll .itnatjuk a preparált kallusz tenyésztésével felhasználva: egy auxint és citokinínt tartalmazó tápközeget, hogy ismét megkülönböztessük azt egy ismert módszerrel [-Tissue Culture 20 (1994) ; Tissue Culture 21 (1995); Trends in Biotechnology 15, 45 (19 97} ] .
3. Bljárás antitest-kömpozíció termelésére
Az antitest--kompozíciót megkaphatjuk egy gazdasejtben törtéexp:'esszxovax ismert módszerek aixaamazasavaa, melyeset a kö vetkező helyeken írtak le: Molecular Cloning, 2. kiadás; Current
Protocols ín Molecular Biology; Antibodies, A Laboratory Manual, toxa r.<prj.ng narocr uaoöratory, v88 : alabbiaknan ’’Antibodies*·’ — ként említjük); Monoclonal Antibodies:: Principles and Practice, 3«. kiadás, Acad. Press, 199'3 (az alábbiakban Monoclonal Antibodies”-ként hivatkozunk rá;; és Antibody Engineering, A Practical. Approach, iRi, Press at Oxford University Press (az axápbxakban Anczbooy nngrneerrng—kent emut jük; , peidam a ko— vetkezők szerint.
Egy antitest molekulát kódoló, teljes hosszúságú cDNS-t készítünk és egy alkalmas hosszúságú, az antitest molekulát kódoló egységet tartalmazó DNS--f ragmenst preparálunk.
Egy rekombináns vektort szerkesztünk behelyezve a DNStragmenst vagy a teljes hosszúságú eDNS-t egy megfelelő expressziós vektor promoterétől downstream: irányba..
Egy antitest molekulát termelő transzformánst úgy kaphatunk meg, hogy a rekombináns vektort bevezetjük egy, az expressziós vektor számára megfelelő gazdasejtbe.
Gazdasejtként élesztő sejtet, állati sejtet, rovarsejtet, növényi sejtet vagy hasonlót alkalmazhatunk mindaddig, amíg az képes a kívánt gént exp.r esszéin!.
Egy sejtet, mint pl. élesztő, állati sejt,, rovarsejt, növényi sejt vagy hasonló, amelybe egy N—glikozid-kapósolt cukorlánc módosításáért felelős enzimet, amely az antitest molekula Fc κ ♦ * ♦·«♦ « » * Φ κ * * * * * » « φ« Φ-Κ Μ» «'« régiójához kötődik, bevezettünk géntechnológiai módszerekkel, szintén, használhatunk gazda-sejtként.
Expressziós vektorként, egy olyan vektort alkalmazunk, amely autonóm módon replikálódik a gazdasejtben vagy integrálódik akromoszómába és egy promotert tartalmaz olyan helyzetben, hogy a kívánt antitest molekulát kódoló DNS képes áthelyeződni.
A cDNS~t előállíthatjuk egy humán vagy nem-humán szövetből vagy sejtből például az érdekes antitest molekulára specifikus primer próba segítségével összhangban az 1(1) <a) fejezetben a DNS preparálására leírt módszerrel.
Amikor egy élesztőt alkalmazunk gazdasejtként, az expressziós vektorra példaként szolgálnak a YEP13 (ATCC 37115), ΪΕρ24 (ATCC 37051), YCpSO (ATCC 37419) és hasonlók.
Bármely promoter! alkalmazhatunk amíg az az élesztőben funkcionál. Erre példa a glikolítikus pathway génjének, mint pl. hexóz-kináz gén promotere, stb., PH05 promoter, EGK promoter, GAP promoter, ADH promoter, gal 1 promoter, gal 10 promoter, hősokk fehérje promoter, MF al.fal promoter, CUP 1 promoter és hasonlók.
Gazdasejtre példaként szolgálnak azok a mikroorganizmusok, melyek a Sacoharomyces nemzetségbe, a Sonizosaccharomyoes nemzetségbe, a Aluyveromyoes nemzetségbe, a .Früchosporon nemzetségbe, a Schttanniornyces nemzetségbe és hasonlókba tartoznak, így pl. Saccharornyces- cerevisiae, SuAí zoaacohaxomyae.s pombe, Kluyveromyces lactis, Trzchospcron pulluians és Son wa na i ernyőé s a.l.luvívs, stb.
A rekombináns vektor bevezetésére szolgáló módszerként bármely módszer alkalmazható mindaddig, amíg az bevezeti a. DNS-t az élesztőbe. Ilyenek például az elektroporáció [Methodsin
Enzymology 194, 182 (1990)], szferoplaszt módszer [Proc. Natl.
Aoad, Sói. USA 84_, 1929 (1978) ], 1 ítium-acetátos módszer[J.
Bactexiol. 153, 163 (1983) }, a Proc. Natl. Acad. Sói. USA75,
1929 (1978) cikkben leírt módszer és hasonlók.
Amikor állati sejtet alkalmazunk gazdasejtként, az expressziós vektor példái közé tartoznak a pc.DNAI, pcDM8 (beszerezhető r’unaKosní—tői) , pAGE'lO? (22979/91 sz. japán közzétett vizsgáit szabadalmi bejelentés; Cytot.echnoloav 3, 133 íiGág)? pAS3-3 (227075/90 sz. japán közzétett vizsgált szabadalmi bejerentes;, pCDM8 [.Nature 329, 840 (1987)], pcDNAI/Amp (gyártó: ínvitrogen), pREP4 (gyártó: ínvitrogen), pAGE103 [J.
Biochemistry 101, 1307 (1987)], pAGEiíO és hasonlók.
tiáxmej,y promoLeru alkalma.<.natunk, -s-mig az egy ansti segtben funkcionál. Prompterre példaként szolgál a citomegaIovirus (CMV) 1E (azonnali korai) génjének promoters, az SV40 korai promoters, a retrovirus promoters, a metallothionéin promoters, a hősokk promoter, az S.Ra promoter és hasonlók.. A humán CMV I..E génjének enhanoerét is használhatjuk egy promoterrel együtt.
A gazaasegmek példái közé tartozik egy humán .sejt, mint pl. Namalwa sejt, egy majom sejt, mint pl. COS sejt, egy kinaí hörcsög sejt, mint pl. CüQ sejt vagy HBT5637 (299/88 sz. japán közzétett vizsgált szabadalmi bejelentés), egy patkány mielóma sejt, egér mielóma sejt, szíriaí hörcsög vese-eredetű sejt, egy embrionális őssejt, egy megtermékenyített petesejt és hasonlók.
A rekombináns vektor bevezetésére szolgáló módszerként bármely módszert, hasznaihatunk mindaddig, amíg az a DNS-t. bejuttat-
ja az állati sejtbe. Ilyen módszer például az elekt napórádé (Cytotechnology 3, 1.33 (1990) 1, a kalciuia-f eszi átos módszer (22/075/90 sz. japán közzétett vizsgált szabadalmi bejelentés), a liporekciós módszer [Free. Natl. Acad. Sai. USA 84, 7 413 (198/)1, az injekciós módszer (.Manipulating the Mouse Enbryo, A Laboratory Manual] , részecske bcmbázásos módszer (gén-bombázás) (2606856 és 2517813 sz. japán szabadalmi leírások), a DEA.Edextran módszer (Siomanua.l .Series 4-Gene Transfer and Expression Analysis (Yodo-sha), kiadó:: Takashi Yokota és Kenichi Arai (1994)1, a vírus vektor módszer (Manipulating Mouse Embryo, 2. k.i a da s / e s π ásom ό k.
Amikor egy rovarsejtet használunk gazdasejtként, a fehérjét az alábbi helyeken leirt módszerekkel vagy hasonlókkal expresszál.hat juk: Current Protocols in Molecular Biology, Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, N.H. Freeman and Company, New York (1992), Bio/Technology 6, 47 (1988).
Azaz a fehérjét expresszálhatjuk egy rekombináns gén.oevezeto vektor es egy baculcvírus sgyideiű bevezetésével egy rovarsejtbe, hogy a reversejt-tenyészet felülúszójában egy rekombináns vírust kapjunk és ezután fertőzzük .a rovarsejtet a rekombináns vírussal.
Az eljárásban használt gén-bevezető vektorra példaként szolgái a pVL1392, pVL1393, pBlueBacIlI (összes gyártója az anvitrogen) és hasonlók.
Bacul.ovirusra példaként szolgál az nukleáris polihedrózis vírus, amelyet megf ertőzünk eav Sara tara családba tartozó rovar
Rovar-sejt, példái közé tartozik a Stodoptera rrugiperda
[Current Protocols ín Molecular Biology,
Bacuiovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, W.H. Freeman and Company, New York (1992)j, a Tríchoplusía ni oocita High 5 (gyártó:: Invitrogenj és hasonlók.
A rekombináns gén-bejuttató vektor és baculovírus egyidejű bevezetésére szolgáló módszerre rekombináns virus előállításához példa a kalcium-foszfátos módszer (227075/90 sz. japán publikált vizsgált szabadalmi bejelentés), a lipofekciós módszer [Proc. Nad. Acad. Sor. USA 84, 7413 (1987)] és hasonlók.
Amikor egy növényi sejtet alkalmazunk gazdasejtként, expressziéi vektorra példa a Ti plazmád, dohány mozaik virus és hasonló.
Premoterként bármely promoter használhatunk mindaddig, amíg az képes egy növényi sejtben funkcionálni. Ilyenek például a karfiol mozaik virus (CaMV) 35.S promoter, rizs aktin 1 promoter es hasonlók.
A gazdasejtre példaként megemlítjük a dohány, burgonya, paradicsom, sárgarépa, szójabab, répa, lucerna, rizs, búza, árpa, stb. növényi sejtjeit és hasonlókat.
A rekombináns vextor bevezetésére szolgáló módszerként bármely módszert használhatunk mindaddig, amíg az képes a DNS-t bejuttatni egy növényi sejtbe. Ilyen módszer például, amely AgrouaotervL?m-c>t alkalmaz (140885/84 es 70080/85 sz. japán közzétett vizsgált szabadalmi bejelentés, WO 94/00977) , az elektroporáuíó (251887/85 sz. japán közzétett vizsgált szabadal
m.:. pOjőíSírLes) d. részecske oonibszásos mocszer {gen— bomoaz>ás) (2606356 és 2517813- sz.. japán szabadalom; és hasonlók.
A gén expressziéjára, a termék szekretálá.sára, az Fc-régió más teherjével alkotott fúziós proteinjének expressziójára és hasonlókra szolgáló módszert kivitelezhetjük a Molecular Cloning, 2. kiadásban leírt módszerrel összhangban, ezenkívül dírekt expresszióval.
Amikor a gént egy baktériummal, egy élesztővel, egy állati sejttel, egy rovarsejttel vagy egy növényi sejttel expressszáljuk, amelybe, a cukorlánc szintéziséért felelős gént bevezettük, egy olyan, antitest molekulát kapunk, amelyhez egy cukrot vagy egy cukorláncot adtunk hozzá a bevezetett génnel.
Egy antitest-kompozíciót a kapott transzformáns tápközegben történő tenyésztésévé! kaphatunk, hogy termeljük és felhalmozzuk az antitest molekulát a tenyészetben, és ezután kinyerjük azt a maradék tenyészetből. A transzformáns tenyésztését egy tápközegben általános módszer szerint kivitelezhetjük, melyet a gazdasejtek tenyésztésére használnak.
A kapott transzformáns tenyésztésére szolgáló tápközegként felhasználva egy prokaríótát, mint pl. Escherichia coli stb. vagy eukaríótát, mint pl. élesztőt gazdasejtként, a tápközeg va':iy természetes medium vagy szintetikus médium lehet mindaddig., amíg olyan anyagokat tartalmaz, mint pl. szénforrás, nitrogénforrás, szervetlen sók és hasonlók, amelyeket az organizmus képes asszimilálni és a transzformáns tenyésztését hatékonyan kivitelezhetjük.
Szénforrásként azokat alkalmazhat j uk, melyeket az organizmus képes asszimilálni. így például szénhidrátokat, mint. pl. glükóz, fruktóz, szacharóz, ezeket tartalmazó melasz, keményítő, kéményítő-hidrolizátum, stb.; szerves savak.,. mint pl. ecetsav,· .propi-onsav, stb.; alkoholok, mint pl. etanol, propanol, stb.; és hasonlók.
Nitrogénforrásra példaként szolgálnak az ammónia; szervetlen vagy szerves savak ammónium sói, mint pl. ammónium-klorid, ammóniám.- szulfát, ammónium-acetát, ammónium-foszfát, stb.; egyéb nitrogén-tartalmú vegyületek; pepton; hús-kivonat; élesztőkivonat; gabona-áztatólé; kazein-hidro.lizátum; szójaliszt; szó3aiiszt-hidrol .1satum; különböző fermentált sejtek és ezek hidrolizátumai; és hasonlók.
Szervetlen anyagra példaként szolgálnak a kálium-dihidrogénfoszfát, dikálium-hidrogén-foszfát, magnézium-foszfát, magnézium-szulfát, nátrium-klorid, vas(II)-szulfát, mangán-szulfát, réz-szulfát, kalcium-karbonát és hasonlók.
A tenyésztést általában aerob körülmények között, mint pl. razatott tenyészet, süllyesztett levegőztetett kevert tenyészet és hasonlók, formájában kivitelezzük. A. tenyésztés hőmérséklete előnyösen 15 — 4O‘‘C és a tenyésztés ideje rendszerint 16 érától 7 napig terjed. A tenyésztés alatt a PH-t 3,0 és 9,0 közötti értéken tartjuk. A pH-t szervetlen vagy szerves savval, egy alkáli oldattal, karbamiddal, kalcium-karbonáttal, ammóniával és hasonlóval állítjuk be.
Ha szükséges egy antibiotikumot, mint pl. ampicillin, tetraciklin vagy hasonló is adhatunk a tápközeghez a tenyésztés folyamán.
X Φ ♦ » * * 4
jük, ráadásul közvetlen expresszióval.
άζ antitest-kompozíció termelésére szolgáló módszerek közé tartoznak az intracelluláris expresszió egy gazdasejeben, az extracelluláris szekréció egy gazdasejtből és egy gazdasejt membrán külső burkán (envelope) termeld módszer. A módszer kiválasztása az alkalmazott gazdasejttől vagy a termelt antitestkompozíció szerkezetétől függhet.
Amikor a találmány szerinti antitest-kompozíciót egy gazdasejtben vagy egy gazdasejt membrán külső burkán termeljük, az pozitiven szekretálódnat extracellulárisan. Paulson és mtsai módszerevei [J. Bioi. Chem. 264, 17619 (1989) ], Lowe és mtsai módszerével [Proc. Natl. Acad.. Sci USA 86, 8227 (1989), Genes Develop. 4_, 1288 (1990)), a 336913/93 és 823021/94 sz. japán közzétett vizsgált szabadalmi bejelentésekben leírt módszerekkel és hasonlókkal összhangban.
Azaz egy kívánt antitest molekula pozitívan szekretálódhat extracellulárisan egy gazdasejtből, az antitest molekulát kódoló DNS és egy szignál peptidet kódoló DNS, amely alkalmas az antitest molekula expresszálására, inszertálásával egy expressziéi vektorba gén rekombinációs technika segítségével, az expressziós vertor gazdasejtbe történő bevezetésével és ezután az antitest mo 1 e k u 1 a e z p re s s z á 1 á s á v a 1.
A termelés mennyiségét is növelhetjük a 227075/90 sz«. japán publikált vizsgált szabadalmi bejelentésben, leirt. módszer alkalmazásával, felhasználva egy dihidrofolát reduktáz gént alkalmazó amplifikáeiós rendszert.
Emellett az antitest-kompozíciót egy gén-bevezetett állati egyeddel (transzgenikus nem-humán állat; vagy növényi egyeddel (transzgenikus növény) is termelhetjük, amelyet az állati vagy növényi sejt, melybe a gént bevezettük, újra differenciálódásáv a .i. η o z u η κ lét re ♦
Amikor a transzformáns egy állati egyed vagy növényi egyed, az antitest-kompozíciót általános módszer szerint neveléssel vagy tenyésztéssel termelhetjük, miáltal az antitest-kompozíció termelődik és felhalmozódik, és azután kinyerjük az állati vagy növényi egyedből.
Állati, egyedet használó antitest-kompozíciót termelő eljárások közé tartozik egy eljárás, amelyben az érdekes antitestKorapoziciot egy olyan, álxatoan termerjuk, amelyet, a gén oeveze— késével ismert módon hoztunk létre [American Journal of Clinical Nutrition 63, 627S (1996? ; Bio/Technology 9, 830 (1991? j.
Állati egyed esetében egy antitest-kompozíciót termelhetünk egy transzgenikus nem-humán állat felnevelésével, amelybe az antitest molekulát kódoló DNS-t bevezettük, hogy ezáltal, termeljük és felhalmozzuk az antitest-kompozíciót az állatban, és ezután kinyerjük az antitest-kompozíciót az állatból. Az állatban a helyek, ahol a kompozíciót termeljük és felhalmozzak a tej (309192(88 sz. japán közzétett vizsgált szabadalmi bejelentés? és a tojás. Amikor promotert használunk ebben az esetben, bármely promotert használhatjuk mindaddig, amíg az funkcionál az állatban. Előnyösek a tejmirigy sejt-specifikus promoterek, mint pl. α-kazeín promoter, β-kazein promoter, β-laktoglobulin promoter, savó savas fehérje promoter és hasonlók.
Növényi egyedet 'használó antitest-kompozíciót termelő eljárások közé tartozik egy eljárás, amelyben az érdekes antitestkompozíciót egy olyan transzgenikus növény termesztésével termeijuk, ameiyoe az antitest molekulát kodolo DNS-t bevezettük ismert módon [Tissue Culture 20 (1994); Tissue Culture 21 (1995); Trends in Biotechnology 15, 45 (1997)], hogy termeljük és reihalmozzuk az antitest-kompozíciót, és ezután kinyerjük az antitest-kompozíciót a növényből.
Agy nranszrormanssai, amelybe- az antitest molekulát kódoló gént bevezettük, előállított antitest-kompozíció tisztítását tepéldául, amikor az antitest-kompozíció intracellular!san expresszálódík oldott állapotban, enyésztés után a sejteket centrifugálassal kinyerjük, vizes pufferben szuszpendál juk ezután ultrahang oszcillátorral, francia préssel, Manton Gaulin homogeni.zátorral, dyncmalommal vagy hasonlókkal széttörjük, hogy sejt-mentes extraktumot kapjunk. Az antitest-kompozíció tisztított termékét megkaphatjuk a sejtmentes extraktam centrifugáiésavai kapott felülúszóból felhasználva egy általános enzim izolációs tisztítási technikát, mint pl. oldószeres extrakció; kisózás; sötalanltás ammonium-szültáttal; sth.; kicsapás egy szerves oloöszerre-1; anion-cserélő kromatográfia felhasználva egy gyantát, mint pl. dietí1-amino-etil (DEAE)-Sepharose, DIAION H.PA-75 (gyártó: Mitsubishi Chemical), stb.; kation-cseré.lő kromatográtxa reihasznaiva egy gyantát, mint ni.. S~ Sepharose FF (gyártó: Pharmacia·, stb.; nidrofób kromatográfia felhasználva egy gyantát, mint pl. butil-Sepharose, fenil-Sepharo.se, stb<; gélszűrés felhasználva egy molekulaszűrőt; affinitás kromatográ*. ·ίΜ·'· ·*♦ » « * » ♦Si £ Λ 4$ matofókuszálás.; elektroforézis, mint pl. izoelektromos
Amikor pedig az antitest-· kompozíciót intracellulárisan expresszálódík egy oldhatatlan testecske formájában, a sejteket kinyejük, széttörjük és centrifugáljuk hasonló módon és az oldhatatlan antitest-kompozíció testeket csapadék frakció formájában kinyerjük. A kinyert oldhatatlan antitest-kompozíció testeket feloldjuk, egy fehérje denaturáló szer segítségével, Az antitest-kompozíciót normál három-dimenziós szerkezetűvé tesszük oldással és az szc-lubilízált oldat dialízisével, és ezután megkapjuk az antitest-kompozíciót tisztított termékét ugyanolyan izolációs tisztítási módszerrel.
Amikor az antitest-kompozíció extraoellulárisan szekretálódik, az antitest-kompozíciót vagy származékait kinyerhetjük a tenyészet felülúszójábcl. Azaz a tenyészetet kezeljük egy technikával, mint pl. centrifugálás vagy hasonló, hogy egy oldható frakciót kapjunk, és az antitest-kompozíció tisztított preparátumát megkaphatjuk az oldható frakcióból ugyanolyan tisztítási módszerrel.
Az így-tisztított antitest-kompozíció példái közé tartozik az antitest, az antitest fragmense, az antitest Fc régióját tartalmazó fúziós fehérje és hasonlók.
az. .zt.est — Kompozíció eioái.ii saséra oéldakent ew numam— zált antitest-kompozíció termelésének eljárását Írjuk le: az alábbiakban részletesen, de más antitest-kompozíciókat is előállíthatunk ehhez az eljáráshoz hasonló módon.
[< 7 1 7 (j yθ 5 V T &Ι'ΐώ qv'yí'í ló k x-y nuntö n .1. z § ír. 3 π x r. o s t 6 χρ i s .s z i. o s v θ k t o r v 3 m y 3 '5 y ο λ v 3 n 11 ~ pusú lehet, amelybe az antitest H- és L-lánoát kódoló gének elkülönített vektorokban vannak elhelyezve vagy olyan típusú, melyben mindkét gén ugyanabban a vektorban exisztál (tandem típusú). A humanizált expressziós vektor megszerkesztésének köny~ nyűségét tekintve a bevezetés könnyűsége az állati sejtekbe és az íngaoozas az alias.··. sejtekben az antitest H— és L-láncai expressziós mennyisége között, a tandem típusú humanizált expressziós vektor esetében az előnyösebb [>J. Immunol,. Methods 167, 271 (1994)].
A megszerkesztett humanizált antitest expressziós vektort humán kimére antitest és humán CDR-grafted antitest expressziójára használhatjuk állati sejtekben.
cDNS előállítása
Egy embertől eltérő állatból, mint pl. egérből származó- an~ t V-régióinak H-láncát és h-lánoát kódoló oDNS-t az alábbi módon kaphatluk mécs úgy nibridóma -sejtből, amely az érdekes egér antitestet termelt, a mRNS extrakció javai cDNS-t szintetizálunk.. A szintetizált eDNS~t vektorba klónozzuk, mint pl. rág vagy pla.zmid vektorra, hogy cDNS könyvtárat kapjunk. Az egyes rekombináns fúgákat vagy plazmídokat, melyek a V-régi.ó H-láncot kódoló cDNSt tartalmazzák és azt a rekombináns ragot és rekombináns plazraidot, amely a V-régió L-láncot kódoló cDNS-t tartalmazza, izoláljuk a. könyvtárból felhasználva a meglévő egér antitest Crégiójának vagy V··· régiójának egy .részét próbaként. Az érdekes egér antitest V~régiói H-lancának és .L-lancának teljes nukleotid-szekvenciá ját a rekombináns tágon vagy rekombináns piasnudcan megn-ataroz-zuk, és a V~régiók H~láncának és L-láncának tea η es amínosav-székvéneiáját a nukleotid-szekvenciából kikövetkeztet jók.
Az emoertol elterö állat bármely állat, mint pl. egér, patkány, -hörcsög, nyúl vagy hasonló lehet mindaddig, amíg abban hibridóma sejtvonalat lehet termelni.
Egy hibridóma sertvonalból a teljes RNS preparálására szolgáló módszerek közé tartozik a guanidin-tiocianát-céziumtrifluor-acetátos módszer [.Methods in Enzymolo-qy 154, 3 (1987)1 es hasonlók, és a teljes RNS-ből a mRNS preparálására szolgáló aoűszerre példa az oligo(díj-immobolizált cellulóz oszlop módszer .(Molexular Cloning, 2. kiadás) és hasonlók. Továbbá a hibridóma sejtből a m.RNS preparálására szolgáló kít-re példa a Fast Track mRNA IsolationKit (gyártó: Invitrogen), Quick Prep mRNA Purification Kit (gyártó: Pharmacia) és hasonlók.
cuNS szintetizálására és cDNS könyvtár elkészítésére szolgá,·.ο modszere-κ közé tartoznak a szokásos módszerek (Molecular Cloning, 2» kiadás, Current Protocols in Molecular Biolooy, Suppl. 1-34), a kereskedelemben kapható kiteket, mint pl. SuperScri.pt™, Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning (gyártó: GIBCO ERL) vagy ZAP-cBNA Synthesis Kit (.gyártó: Strat&gene) alkalmazó módszerek és hasonlók.
)NS könyvtár elkészítésében a vektor, amelybe a hibridóma ϊ
η ρ 9
A eDNS nukleotid-szekvenciáját. meghatározhatjuk a szelektált cDNS-k alkalmas restrikciós enzimekkel történő emésztésével, a fragmensek egy plazmádba, mint pl. pSlueseript SK(-) (gyártó: Stratagene) vagy hasonló klónozásával, általánosan alkalmazott nukleotid-szekvencia analizáló módszer reakciójának kivitelezésével, mint pl. Sanger-féle didezoxi-módszer [Proc. Natl. Acad. Sói. USA '74, 5463 (1977) ] vagy hasonló és a kapott kiónok automata nukleotid-szekvenát.orral való analízisével, mint pl. A.L.F. DNA Sequencer (gyártó: Pharmacia). vagy hasonló. Hogy vajon a kapott cDN:S-k kódolják-e az antitest V-régiói H-láncának és L-láncának teljes aminosav-szekvenciáját, amely a kiválasztó szignál-szekvenciát tartalmazza., megállapíthatjuk a meghatározott nukleotid—szekvenciából a V-régiók H-lánca és L-lánca teljes aminosav-szekvenciájának kikövetkeztetésével és azok összehasonntasavai. az ismert antitestek V—régiói H—láncának és L— láncának teljes aminosav-s-zekveneiájavai [Sequences of Proteins of immunological intsrsst, NS Deo. Health and Human Services :1991}1 (3) Embertől eltérő állatból származó antitest V-régiója aminosa v— s ze uveu c ran an au anal i z i. se
A kiválasztó szignál-szekvenciát, tartalmazó, az antitest Vrégiói H-láncának és L-láncának teljes aminosav-szekvenciáít tekintve, a kiválasztó szignál-szekvencia hosszúsága és az Nterminális amino-sav-szekvenciák kikövetkeztethetők és az alcsoportok, amelybe beletartoznak megtalálhatók, ha összehasonlítjuk azokat az ismert antitestek V-régiói H-lánca és L-lánca teljes aminosav-szskvenciáival [Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dep. Health and Human Services (1991;]. Továbbá, az egyes CDR-ek V-régiói H-láncának és L-láncának aminosavszekvenciái szintén megtalálhatók, ha összehasonlítjuk azokat ismert antitestek V-régiői H-láncának és L-láncának teljes aminosav-szekvenciáival [Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dep. Health and Human Services (1991}].
(4) Humán k.iméra antitest express elás vektor megszerkesztése
Egy humán kiméra antitest expressziós vektort megszerkeszthetünk az embertől eltérő állatból származó antitest V-régiői Hés L-láncát kódoló cDNS-nek a 3(1} pont szerint a humanizált antitest expressziójára megszerkesztett vektorba történő klónozásával a humán antitest C-régiói H-láncát és L-láncát kódoló génektől upstream irányba. Például egy humán kiméra antitest expressziős vektort megszerkeszthetünk az állatból származó antitest V-régiói H-láncát és L-láncát kódoló cDNS mindegy!kének hozzákapcsolásával egy szintetikus DNS-hez, amely az állatból származó antitest V-régiői H-lánoának és L-láncának 3’terminális nukleotid-szekvenciait és egy humán antitest C-régiói H-láncának és L-láncának 5’-terminális nukleotid-szekvencíáit és alkalmas restrikciós enzim, számára felismerő szekvenciát tartalmaz mindkét terminálison, és ezek klónozásával egy 3(1) pontban leírtak szerint, humánizált antitest expressziójához megszerkesztett vektorba a humán antitest C-régiói H-láncát és L-láncát kódoló génektől upstream irányba.
késztés
DR-grafted antitest V-régiói fí-Iáncát és L-láncát kódoló cDNS-eket az alábbiak, szerint kaphatjuk meg. Először a humán antitest v-régiói H-láncának és L.~láncána.k. keret (framework, a továbbiakban FR”) aminosav-szekvenciáit szelektáljuk egy állati antitest V-régiói H-lánca és L-lánca C.DR-jenek beültetéséhez. Humán antitest V-régió H-lánca és L-lánca FRjének aminosav-szekvenciájaként bármely aminosav-szekvenciát alkalmazhatunk. mindaddig, amíg az egy humán antitestből származik. Humán antitestek V—régiói H-lánca és L-lánca E'R-jének aminc-savszekvenciáira példákat regisztráltak adatbázisokban, mint cl. a Protein Data Bank-ban, stb., az aminosay-szekvenciák közösek a humán antitestek V-régiói H-lánca és L-lánca FR-jének egyes alcsoport ja.iban [Sequences of Proteins of Immunological Interest, ős cep. Health and Human Services (1.931)] és hasonlók. De abból a óéiból, hogy egy nagy-aktivitású humán CDR-grafted antitestet termeljünk, előnyös, ha olyan aminosav-szekvenciát szelektálunk, ameiy a lenetó legmagasabb .homológiát mutatja (legalább 60% vagy több} az állatból származó érdekes antitest V-régiói H-lánca és i-xanca ammosav-szekvenciaival.
A következő lépésben az állatból származó érdekes antitest V-regiói H-lánca és L-lánoa CDR-jelnek aminosav-szekvenciáit beültetjük a humán antitest V-régiói H-lánca. és L-lánca FR-jének szelektált aminosav-szekvenciáihoz, hogy megtervezzük a humán CDR-grafted antitest V-régiói H-lánca és L-lánca aminosavszekvenciáit. A megtervezett aminosav-szekvenciákat DNS szekvenciákká konvertáljuk tekintetbe véve az antitest gének nukleotid-szskvenciáiban talált kodon gyakoriságot [Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Pep. Health and Human Services (1991)), és a humán CDR-grafted antitest V-régiőí Hlánca és L-lánca aminosav-szekvenciáit kódoló DNS-szekvenciákát tervezünk. A tervezett DNS-sre.kvenciák alapján néhány, körülbelül 100 bázis hosszúságú szintetikus DNS-fragmenst szintetizálunk es PCR-t kivitelezünk ezek felhasználásával. Ebben az eset ben előnyös, ha a H-iánc és a L-lánc mindegyikéhez 6 szintetikus DNS-t tervezünk tekintettel a PCR-reakció hatékonyságára és szintetizálandó DNS-ek hosszúságára.
Továbbá ezeket könnyen klónozhat j uk. humanizált, antitest expressziójához a 3(1) szerint megszerkesztett vektorba egy alkalmas restrikciós enzim felismerő szekvenciáinak bevezetésével a. szintetikus DNS 5'-terminálisaira mindkét terminálison. POR után azamolxfikált terméket egy plazmádba, mint pl. p81uescri.pt SK(~) (gyártó: Stratagene) vagy hasonlóba kiónozzuk, és a nukreotid-szekvenoiákat meghatározzuk a 3(2) pontban leírt módszerrel abból a óéiból, hogy megkapjuk a kívánt humán CDRgratted antitest V-régxói H-lánoa és L-lánca amínosavszekvenoaáit kódoló DNS-szekvenoiákat tartalmazó plazmidot.
C$' -óumán CDR~gra:fted antitest expressziós. vektor megszerkesztése
Egy humán CDR-grafted antitest expressziós vektort megszerkeszthetünk oly módon, hogy az 3(5) pontban kapott humán CDRgrafted. antitest V-régiói H~láncát és L-láncát kódoló oDNS-eket
1OROZZUK ant ítest expressziéjára szolgáló vektorba a humán antitest C~rég:iői H~ láncát és L-láncát kódoló géntől upstream irányba. Például a humán CDR-grafted antitest expressziős vektort megszerkeszthetjük egy megfelelő restrikciós enzim felismerő szekvenciáinak bevezetésevei egy szintet ikus DNS-fracmens mindkét terminálisának 5' vegere, a szintetikus DNS-fragmenst azok közül, választjuk ki, melyeket PCR-hoz alkalmazunk a 3(5) pontban a humán CDR-grafted antitest V-régiói H-láncának és L-láncának megszerkesztésére, úgy hogy klónozzuk azokat egy humán antitest C-reqiói H—láncát és L-láncát kódoló génektől upstream irányba oly módon, hogy alkalmas formában tudjanak expresszálódni.
Ilyenek például az egér mielóma sejtek, mint pl. NSO sejt és SP2/0 sejt, kínai hörcsög petefészek sejtek, mint cl. CHO/dhfr” sejt és CHO/DG44 sejt, patkány mielóma sejtek., mint pl. YB2/0 sejt és IR983F sejt, sziríai hörcsög vesébőlszármazó 8HK sejt, humán mielóma sejt, mint pl. Namalwa sejt és hasonlók,előnyösek a kínai hörcsög petefészek CHO/DGsé sejt, patkány mielóma Y.B2/0 sejt és az b. fejezetben leírt találmány szerinti gazdasejtek.
A humanizált antitest expressziós vektor bevezetése után, a humanizált antitest stabil termelésére képes transzformánst szelektálhatjuk egy állati sejt tenyésztésére használt tápközeggel, amely pl. G418 szulfátot (a továbbiakban ”GÍ18, gyártó: Sigma) as .nasonlokat tartalmaz, összhangban a 2b7891/90 sz. japán közzétett vizsgált szabadalmi bejelentésben leírt eljárással. Az állati sejt tenyésztésére alkalmas tápközegek közé tartozik a Ri-Mr it>4y tapkbzeg ;gyártó:: Nissui Pharmaceutical), GIT tápközeg (gyártó: Nihon Pharmaceutical) , EX—CELL 302 tápközeg (gyártó:
mint pl. .oorjú magzati szérum (alábbiakban FBS”) hozzáadásával nyerünk ezekből a tápközegekből és: hasonlók. A humanizált antitestet termelhetjük és felhalmozhatjuk, a. kapott transzformáns tenyésztésével a tenyészet felülúszójában. A humanizált antitest expressziós .szintjét és antigén-kötő aktivitását mérhetjük a tenyészet feiüiúszójáóan például enzim-kapcso.lt immunszorbens módszerrel [alábbiakban “ELISA”; Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 4. kötet (1998), Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press Limited
109 (1996)] vagy hasonlók. A humanizált antitest expressziós szintjét növelhetjük is egy DHFR gén amplífikációs rendszer alkalmazásával a 2578.91/90 sz. japán közzétett vizsgált szabadalmi bejelentésben leirt módszer szerint.
A humanizált antitestet tisztíthatjuk a transzformáns tenyészet felülúszójából egy fehérje A oszloppal [Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 8. kötet (1988), Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press Limited (1996)]. Lmellett a fehérjék tisztítására általánosan alkalmazott módszereket is használhatjuk. Például a tisztítást kivitelezhetjükgélszürés, ioncserélő kromatográfia és ultraszűrés kombinálásával. A H-lánc, L-lánc vagy az antitest molekula molekula-tömegét mint a tisztított humanizált antitest egészet mérhetjük, pl. poliakrilamid géleiektroforézissel [alábbiakban ” SDS-PAGE*’ — ként hibvat kozunk rá; Nature 227, 680 íls/Oj], Western-blottal [Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 2. kötet (1988), Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press Limited (1996)) v a g y n a s ο n ok.
így az antitest-kompozíció termelésére szolgáló módszert állati sejtben mint gazdaszervezetben ismertettük, azonban - amint a fentiekben leírtuk - az antitest-kompozíció termelhető élesztőben, rovarsejtben, állati egyedben vagy egy növényi egyedben ugyanolyan módszerekkel, mint az állati sejtben.
Amikor egy állati sejt, amelyképes antitest molekulát expresszálni innately, a találmány szerinti antitest-kompozíciót termelhetjük egy antitest molekulát expresszálc sejt előállító-
sával felhasználva az 1. fejezetben 'leirt módszert, majd a sejt tenyésztésével és ezt kővetően a kívánt, antitest - kompoz! ciö tisztításával a kapott tenyészetből.
4. Az antitestkompozíció aktivitásának kiértékelése
A tisztított antitest-kompozíció mennyiségének mérésére szolgáló módszerként az antitest-kompozíció egy antitesthez való kötődése aktivitásának és effektor funkciójának mérése használható ismert módszerrel, melyet a Monoclonal Antibodies, Antibody Engineering-ben írtak le és hasonlókkal.
Példaképpen, amikor az antitest-kompozíció egy humanizált antitest, a kötő-aktivitást egy antigénnel és a kötő-aktivitást egy antigen-pozitív tenyésztett sejtvonallal ELISA módszerrel, immunotluoreszoens módszerrel [Cancer Immunoi. Immunother. 36, 373 (1993)1 és hasonlókkal mérhetjük. Egy antigén-pozitív tenyésztett sejtvonallal szembeni citotoxíkus aktivitást kiértékelne tjük a CDC aktivitás, ADCC aktivitás mérésével [Cancer Immunoi, immunother. 36, 373 (1993)] és hasonlóval.
Tehát az antitest-kompozíció biztonságát és terápiás hatását egy emberben megbecsülhetjük egy megfelelő állati modell alkalmazásával, amely szorosan rokon az emberrel, mint pl. Macaca fasczeula.r.is vagy hasonlók.
5. Cukorláncok különböző sejtekben, expzesszált antitest moleku lához való kötődésének analízise
A cuKorlánc szerkezet különböző sejtekben expresszált anti test molekulához való kötődését analizálhatíuk .eqv qlikoprotein
Ill cukoriáne szerkezetének általános analízisével Összhangban. Például a cux.ori.anc, ameiy az IgG molekulához kötődik, tartalmaz egy neutrális cukrot, mint pl. gala kt óz, mannóz, fukóz vagy hasonló, egy aminocukrot, mint pl. M-acet11-glükózamin vagy hasonló és egy savas cukrot, mint pl. sziálsav vagy hasonló, és analizálhatjuk egy cukorlánc analízisére szolgáló módszerrel vagy hasonlóval, felhasználva egy cukor-kompoz!dós analízist, kétdimenziós cukorlánc térképezést vagy hasonlót.
Egy antitest-molekulához kötődő cukorlánc—kompozíciót, analizálhatjuk a cukorláncok savas .hidrolízisével egy savval, mint pi. trixiuorecetsav vagy hasonló, hogy felszabadítsuk a semleges cukrot vagy aminocukrot és mérjük a kompoz! ció-s arányt.
Ilyen módszerre példa a cukor-kompozíció· analizátort (BioLC;
(gyártó: Dionez; alkalmazó módszer. A BioLC egy készülék, amely a cukor-kompozíciót HPAEC-PAD-dai (nagy nyomású ani.oncse.réló kromatograzia-puxzálo amperemet rxkus detektálás)- [J. Lig. Chromatogr. 6, 1577 {19-.83)] analizálja.
A kompozíciós arányt meghatározhatjuk fluoreszcens jelzett módszerrel 2-amirxo-piridín alkalmazásával. Specifikusan a kompozlciős arányt kiszámíthatjuk ismert módszerrel összhangban [Agrxc. Bioi. Chem. 5b (1), 2.83-4 (1991; ], egv sav-hidrolizált minta fluoreszcens jelzésével z-amino-piridilációval és ezután a kompozíció· HPLC-vel történő analízisével.
'·. X ) Ό ki KOX rii.tC S 'X& X kX Θ31XH.X XZ X SXS z kötődő cukorlánc szerkezetet két-
tel érés ével
113 **e* ·“< «Ά ***Ί «*♦ „ . £ - *'«« « frflíx , “ p ♦ W * ♦ Ar ** χ.**
6. Az antitest molekula diszkriminált cukorlánc szerkezetének immunológiai maghatározására szolgáló módszer
Az anti test “kompozíció egy olyan, antitest molekulát tartalmaz, amelyben az antitest E'c-régiójához kötődő cukorláncok szerkezetükben eltérnek egymástól. Az az antitest-kompozíció, amelyben annak a cukorláncnak az aránya, amelyben a fukóz nem kötődik az h’-acetil-glükózaminhoz a. redukáló végen a cukor láncban 20% vagy enne.! több az antitest-kompozíció redukáló végén az Fc~ régióhoz kötődő összes komplex M-glik.ozid-kapcsolt cukorláncok között, jelentős ADCC' aktivitással rendelkezik. Az antitestkompozíciót azonosíthatjuk a 6. pontban leírt, antitest molekula cukorlanc szerkezetének analízisére szolgáló módszer segítségévei. lehat azt azonosíthatjuk egy lektínt alkalmazó immunológiai me g határo z ó módsz erre1.
az antitest molekula cukorlánc szerkezetét azonosíthatjuk, immunológiái meghatározó módszerrel egy lektin segítségével ismert immunológiai, meghatározásokkal összhangban, mint pl. Western testes, IRA (radíoimmunoiassay.), VIA (viroimmunoassay} , EIA íenzimoammunoassay), FIA <fluoroimmunoassay), MIA (metalloimmunoassay) és hasonlók, melyeket az alábbi helyeken írtak le: Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Wiley-Liss, me. (iü9ó); Immunoassay, 3. kiadás, Igakushoin (1987); Enzyme Antibody Method, bővített kiadás, Gakusai Ki. ka ku (1985) .
Egy lektin, amely felismeri az anti test-kompozícióban lévő antitest molekula cukorlánc szerkezetét, jelzett és a jelzett lektin lehetővé teszi, hogy reagáljon az antitest-kompozícióval, /1 *4
♦» c « (lentil agglutinin a Lens cullnaris-bol; , borsó lektin PSA (borsó lektin a Pi sum sativtun-ból) , széles bab lektin VFA (agglutinin a Vicia. fabí.a-ból)· és Aleuria- aurantia lektin AAL (lektin az Aleuria aurantia-ból) .
1, A találmány szerinti antitest molekula alkalmazása
A találmány szerinti antitest-kompozíció· jelentékeny anti test-függó sejt-közvetített citotoxikus aktivitással rendelkezik. Egy antitest, amely jelentős antitest-függő sejtközvetített citotoxikus aktivitással bír, felhasználható különféle betegségek megelőzésére és kezelésére beleértve a rákot, gyulladásos betegségeket, immun-betegségeket, mint pl. autoimmun betegségek, allergiák és hasonlók, keringési szerv betegségek és vrrális vagy bakteriális fertőzések.
Rákok esetében, nevezetesen rosszindulatú tumorokról, rákos sejtek növekedéséről van szó. Általános tumor-ellenes szerek gátolják a rákos sejtek növekedését. Ezzel ellentétben, egy jelentékeny antitest-függő sejt-közvetített cítotoxikus aktivitással renaelkező antitest képes a rákok kezelésére a rákos sejtek károsításával sejtölő hatásán keresztül, és ezáltal még hatásosabb terápiás szer, mint az általános tumor-ellenes szerek. Jelenleg a rákok elleni terápiás szerben egy tumor-ellenes hatású antitest gyógyszer önmagában nem eléggé hatékony, úgyhogy kombinációs terápiában alkalmazzák kemoterápiával együtt [Science 280, 1197 (1998)]. Ha még hatásosabb tumor-ellenes hatást találunk a találmány szerinti antítest-kompozícióval önmagában, a kemoterápiától való függőség csökken és a mellékhatások is nmun-beteősegekben, mint p gyulladásos betegségek, autoimmun betegségek, allergiák és hasonlók, a betegségek in vivő reakciói az immunociták által egy mediator molekula felszabadulása által indukálódnak, úgy hogy az allergiás reakció gátolható az immuriociták eliminálásával felhasználva egy antitestet, amely jelentős antitest-függő sejt-közvetített citotoxikus aktivitással rendelkezik.
A keringési szerv megbetegdésekre példaként szolgálnak az arterioszkierözís és hasonlók. Az arterioszklerózíst jelenleg ballon-katéterrel kezelik, de a keringési szerv beteoséqeket megelőzhetjük vagy kezelhetjük az artériáiig sejtek növekedésének gátlásával a restrikturában a kezelés után felhasználva egy jelentős antitest-függő sejt-közvetített citotoxikus aktivitású ant ítestet.
Kuionooző betegségek, beleértve a vizái is és bakteriális fertőzéseket megelőzhetők és kezelhetők a vírussal vagy baktériummal· fertőzött sejtek proli relációjának gátlásával felhasználva egy hatékony antitest-függő sejt-közvetített citotoxikus aktivitású antitestet.
Példákat antitestekre, melyek fel.ismernek egy tumor—kapcsolt antigént, egy allergia- vagy gyulladás-kapcsolt antigént, egy keringési szerv cetegség-kapcsolt antigént vagy egy vírusos vagy bakteriális fertőzés-kapcsait antigént, az alábbiakban írunk le.
Azokra az antitestekre, melyek felismernek egy tumorkapcsolt antigént, példaként szolgál az antí-GD? antitest [Ohta et ax.: Ant.icancer Res. 13, 331-33 6 (1993), ant.i-GD3 antitest [Ohta et al.: Cancer Immunol. Immunother. 36, 260-266 (1-993) ], anti-GM2 antitest [Nakamura et al,: Cancer Res, 54, 1511-1516 (1994)], a.nti-HER2 antitest [Carter et al.: Proc. Natl, Acad. 3c.i. USA 89, 4285-4289 (1992)1, anti-CD52 antitest [Carter et a.:.,: Proc. Natl, Acad, 8ci. USA 89, 4285-4289 (1992)], anti-MAGE eni.λζ.est [uun-goluth et al . : tsritisn J, Cancer 83, 4 93—4 97 (2000)1, anti-HM1.24 antitest [Ono et al.: Molecular Immunol. 36, -18/--395 (1999)], anti-pgratiroid hormcn-kapcsclt fehérje (eiriirantitest [Ogata et. al. : Cancer 88, 2909-2911 (2000)), áuui“ba4XA.ut> iibiobxaszt növexedesr factor antitest és anti—FGF8 antitest (Matsuzaki et al.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 99119915 (1989)], anti-bázikus fibroblaszt növekedési faktor receptor antitest és anti-FGF8 receptor antitest (Kuo et al. : J. Βίοι, unem, 265, 164.5b—1.6463 (1990)1 , anti—inzulin—szerű növekedési faktor antitest [Yao et al.: J. Neurosci. Res. 4G, 647-659 ;ia90)j, anci-inzulin-szerü növekedési faktor receptor antitest [Yao et ai. : u. Neurosci. Res. 4G, 64 )-639 (1995) 1, anti-FMSA antitest [Murphy et al.: J. Urology 160, 2396-2401 (1998)], antivaszkuláris endotelíális sejt növekedési faktor antitest (Presta et al.: Cancer Res. 57, 4 593-4599 /199711, ant vaszruiáris endotelíális sejt növekedési faktor receptor antitest [Kanno et al, : Oncogene 19, 2.138-2146 (2800)] és hasonlók.
Azokra az antitestekre, melyek felismernek egy allergiavaCy gyuiladás-kapcsolt antigént, példaként szolgál az antiinterleukin-6 antitest [Abrams et al.: Immunol. Rév. 127, 5-24 (1992)], anti-interleukin-6 receptor antitest [Sato et al,:
X *
Ezeket az antitesteket beszerezhetjük publikus szervezetek től, mint pl. ATCC (The American Type Culture Collection), Rí KEN Gene Bank at The Institute of. Physical and Chemical Research, National. Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of industrial Science and Tecnolecy ( jelenleg.!. név: International Patent Organism Depositary, National Institute cf Advanced Industrial Science and Technology) és hasonlók, vagy privát reagenst forgalmazó cégektől, mint pl. Dainipoon Pharmaceutical. R & D SYSTEMS, PharMingen, Cosmo Bio, Funakoshi és hasonlók.
A találmány szerinti antitest-kompozíciót tartalmazó gyógyszert beadhatjuk terápiás szerként önmagában, de rendszerint az az előnyös, ha gyógyszerkészítmény formájában adjuk be, melyet a gyógyszergyártás- területén jól ismert alkalmas módszerrel állítunk elő összekeverve legalább egy gyogyszereszetileg el.fo-qadha—
Kívánatos .xenet, hogy kíva.-.asszuk a oeacas mcojat, amely a legnatéKonyább a kezelésben. Példák a beadási módokra az orális és parenterális beadás, mint pl. bukkális, tracheális, rektális, szubkután, intramuszkulárís, intravénás vagy hasonlók. Az antitest készítmény esetén az intravénás beadás az előnvos«
A dózisformák közé tartoznak a spray-k, kapszulák, tabletták, granulátumok, szirupok, emulziók, végbélkúpok, injekciók, Kenccsok, tap-asz.o-K. és hasonlók.
Orális beadásra alkalmas gyógyszerkészítményekre példák az emulziók, szirupok, kapszulák, tabletták, porok, granulátumok és hasonlók.
Folyékony készítmények, mint pl. az emulziók és szirupok előállíthatok segédanyagok, víz; szacharídok, mint pl> szacharóz, szóróit, fruktóz., stb.; glíkolok, mint. pl. polietilénglikol, propilénglikol, stb.; olajok, mint pl. szezámolaj, olívaolaj, szójaolaj, stb.; anti-szeptikumok, mint pl, p-hídroxíbenzoesav-eszterek, stb.; ízesítők, mint pl. eper íz, menta, stb.; és hasonlók hozzáadásával.
Kapszulákat, tablettákat, porokat, granulátumokat és hasonlókat előállíthatjuk segédanyagok, mint pl. laktőz, glükóz, szacharóz, mann.it, stb.; dezintegránsok, mint pl. keményítő, nátrium-alginát, stb.; lubrikánsok, mint pl. magnézlum-sztearát, tálkám,· stb.; kötőanyagok, mint pl. polivinil-alkohol, hidroxipropiú-ceilulöz, zselatin, stb.; felületaktív anyagok, mint pl. zsírsav-észter, stb.; plasztifikálók, mint pl. glicerin, stb.; es hasonj.óK nozzaadásaval.
P a r e.n t e r a 1 r s o e a d á s r a a 1 ka 1 más g y ó g y s z e r ké s z i tmén y e k k ö z é tartoznak az injekciók, végbélkúpok, spray—k és hasonlók.
Az injekciókat elkészíthetjük, egy .hordozó, mint pl. sóoldat, glükóz-oldat, ezek keverékének és hasonlóknak segítségével. Por injekciókat is előállíthatunk az antitest-kompozíció fagyasztvaszáritásóval szokásos módon és nátrium-klorid hozzáadásával.
A végbélkúpokat egy hordozó, mint pl. kakaóvaj, hidrogénezett zsír, karbonsav vagy hasonlók segítségével állíthatjuk elő.
Spray-ket is készíthetünk az antitest-kompozícióból önmagában vagy egy hordozó segítségével, amely nem stimulálja a beteg bukkális vagy légúti mukózus membránját és megkönnyíti az anti test-kompozíció abszorpcióját finom részecskékké történő diszperzióval .
A. hordozóra példaként megemlítjük a laktózt, glicerint és hasonlókát> Az antítest-kompozíció és a hordozó tulajdonságaitól tüggoen lehetséges, hogy előállítsunk olyan gyógyszerkészítményeket, mint az aeroszolok, száraz porok és hasonlók. Ezen túlmenően az orális készítményekhez példaként megnevezett segédanyag komponenseket is hozzáadhatjuk a parentaráiis készitményékhez>
OuiL ex ΚΐιΠΙΚδί CiÓulXS 'V:3<jy· S x>í23<ááS <2·k'OX XShJQdi l’.'U'QCj 3 X OO™ jektív terápiás hatástól, a beadás módjától, a kezelési időtől, a kortól, testtömegtől és hasonlóktól, az rendszerint IC pg/kg zü mg/kg naponta és felnőttek, esetében.
AóCC aktivitást mérő módszer és hasonlók, az ín vivő tesztek köze tartoznak az antitumor kísérletek, melyek tumor rendszereket alkalmaznak kísérletes állatokban, mint pl. egér, stb. és hasonΊ A k
A CbC aktivitás és ADCC aktvitás mérését és az antitumor kíkλ.viterezhetj ük az axabox cikxsKDsn 1 eirtakraz összhangban: cancer ammuno-iogy Immunotherapy 36, 373 (19-93) ; Cancer Research u4, .1511 (1994) és hasonlók.
A találmányt az alábbiakban részletesen ismertetjük a péloakoan, azonoan a példák csak egyszerű illusztrálásra szolgálnak és nem korlátozzák a találmánv oltalmi körét.
XX
Az ábrák rövid leírása
1. ábra bemutatja öt tisztított anti-GD3 kimére antitest SDS-PAG-& elekt.roíorézis mintázatát (4-15% gradiens gél alkalmazásával·) . Az 1A és 1B ábra bemutatja a nem-redukáló illetve redukált körülmények közötti elektroforézis eredményeket. Az 1-7 savók a nagy moiekuiatömegü markerek mintázatát mutatják be, ϊό·2/0—GD3 kimére antitest, CHO/DG44-GD3 kimére antitest, SP2/0GD3 kínéra antitest, NS0-GD3 kínéra antitest (302), NSQ-GD3 kimére antitest (GIT), illetve a kas molekulatömegű markereket.
2. ábra bemutatja öt tisztított anti~GD3 kínéra antitest kötö-aktivitasat a GD3-hoz az antitest-koncentráció függvényében. Az ordináta és az abszcissza a kötő-aktivitást a GD3-mal, illetve az antitest-koncentrációt ábrázolja. Az ”o, ’W és “Δ a Yb2/0-GD3 kimére antitest, CHO/DG44-GD3 kínéra antitest, SP2/0-GD3 kínéra antitest, NS0-GD3 kimére antitest (302), NS0GD3 kínéra antitest (GIT; aktivitását ábrázolja.
3. ábra bemutatja öt tisztított anti-G.D3 kínéra antitest A öC C - a k 11 v 11 á s á t G 3 61 h urn a n me 1 an óm s sett v ο n a 11 a 1 s z emb e n. A z ordináta és az abszcissza a cítotoxikus aktivitást, illetve az antitest-koncentrációt ábrázolja, Az ”o, ”D”, és Δ a
Yr>2/u~oD.5 kamera antitest, CHO/DG44-GD3: kínéra antitest, SP2/0GD3 kínéra, antitest, NS0-GD3 kínéra antitest (302) , NSO-GD3 kínéra antitest (GIT) aktivitását ábrázolja.
4. ábra bemutatja három tisztított anti-hlL-SRa CDR-grafted antitest SDS-PAGE elektroforézis mintázatát (4-.15% gradiens gél alkalmazásával) . Az 4A és 4B ábra bemutatja a nem-redukáló il letve redukáló körü.í.ménvek. közötti elektroforézis eredményeket.
Az l-ö sávok a nagy molekulatömege markerek, vb2/0-hIL~5R CDR antitest, CHO/d-hIL-5'R CDR antitest, NSO-hlL-SR CDR antitest, illetve a kis molekulatömege markerek mintázatát mutatják be.
t. ábra bemutatja három tisztított antÍ-hil-5Ra CDR-grafted antitest kötő-aktivitását a hIL~5Ra~hoz az antitest-koncentráció függvényében. Az ordináta és az abszcissza a kötő-aktivitást a hfL~5Ra-val, illetve az antitest-koncentrációt ábrázolja. Az c”, és ”□·' a. Yb2/0-híL~5R CDR antitest, CHO/d-hIL-5R CDR antitest és az NS0-hIL-5R CDR: antitest aktivitását ábrázolja.
6. ábra bemutatja három tisztított an.tl-hIL-5Ra CDR-grafted antitest ADCC-aktivitását egy hIL-5R-t expresszáló egér CTLL~2(h5R} eger T-sej-t vonallal szemben. Az ordináta és az abszelszsza a eitotoxikus aktivitást, illetve az anti test-koncentrációt ábrázolja. Az o, és az Yb2/0-hIL-5R CDR antitest, CHC/d-hIL~5R CDR antitest és az NSO-hlL-SR CDR antitest aktivitásat ao r a z o .1 j a.
7. ábra bemutatja három tisztított anti-hIL-5Ra CDR-grafted antitest gátló aktivitását egy hIL-5-indukált eoz-inofilt nevelő Ms cans haséi oula rí s modellben. Az ordináta az eozi.no fii ek számát mutatja a perifériás vérben és az abszcissza a napok számát (az antitest elkezdésének a napját és a hIL-5 beadás napját határoztuk meg 0. napként). A 101 és 102, 301, 302 és 303, 401, 402 és 403 és 501, 502 és 503 mutatja az antitestet nem-kapó csoport, az Y82/0~hIL~5R CDR antitestet kapó csoport, a CHO/dhlL-öR CDR antitestet kapó csoport, illetve a. NSO-hlL-SR CDR antitestet kapó csoport eredményeit.
ο. abra egy PA~kezeit cukorlánc reverz fázisú HPLC-jének elucros mintázatát (bal oldali.) és egy PA- kezelt cukor lánc Cf-Lfuk.o z í o.tí szál vaxo kezeiesévsi Kapott és re ver z fázisú. HPLC—vei. analizált elúciós mintázatát (jobb oldali), az YB2/0 által termeit, tisztított anti~hIL~5Ra CDR-gr-afted antitest esetében [8A ábra) és a NSO által termelt, tisztított anti-hlL-óRu CDR-grafted antitest esetében (8B ábra). Az ordináták és az abszcisszák a relatív fluoreszcens intenzitást és az elúciós időt mutatják.
9. ábra bemutatja CHO/d sejt által termelt, tisztított antinin-5Ra CD.R-gratted antitestből egy PA~keze.lt cukoriánc preparálásával és revere fázisú HPLC analízisével kapott elúciós mintázatot. Az ordináta és az abszcissza a relatív fluoreszcens ín tenzatast illetve az elúciós időt adja meo.
A 10. ábrában a IGA ábra egy nem-adszorbeálődott frakció és egy .adszorbeálődott frakció egy részének GD3-köto aktivitását mutatja, melyet az antitest-koncentráció változásával mértünk.
Az ordináta és abszcissza a GD3-kőtő aktivitást és az antitestKoncentrációt ábrázol ja. A és ”o a nem—adszorbeálődott frakciót, .illetve az adszorbeálődott frakció egy részét mutatja. .A löS ábra a nem-adszorbeálódott frakció- és az adszorbeálődott frakció egyrészének ADCC aktivitását mutatja humán melanoma G~ 361 sejtvcnallal szemben. Az ordináta és abszcissza a. citotoxíkus aktivitást és az antitest-koncentrációt ábrázolja. A ·” és no” a nem-adszorbeálódott frakcióval, illetve az adszorbeáloűott frakció egy részével kapott eredményeket mutatja be..
11. aora. reverz fázisú HPLC-vel nyert nem-adszorbeálódott frakcióból és egy adszorbeálódott frakció-részből. preparált PA— kezeit cukorlánc analízisével kapott elúciós mintázatot mutatja ce. A ti A és 11B ábra a nem-adszorbeálódott frakciót illetve az adszorbeálódott frakció-részt szemlélteti. Az ordináták és abszcissza k a relatív fluoreszcens erősséget és az elúciós időt maiz. ábra bemutatja hat GD3 kimére antitestből (12A - 12F ábra) kinyert PA-kezelt cukorlánc elúciós görbéét, melyeket reverz fázisú HPLC-vel történő analízissel kantunk.
x3.. acra oeiBuvatja hat anti—eD3 Kiméra antitest GD3—Kötőaktivitását, melyek különböző arányú a-1,6~fukóz-mentes cukorláncot tartalmaznak., az antitest-koncentráció függvényében. A.z ordináta és az abszcissza a kötő-aktivitást a GDŐ-mal, illetve az antitest-koncentrációt ábrázolja. Az A”, ”a és x” az anti-GD3 kiméra antitest (50%)·, anti-GD3 kiméra antitest (-45%), anti~GD3 kiméra antitest (29%), anti-GD3 kiméra an-
14. ábra bemutatja hat fajta a-nti-GD3 kiméra antitest ADCCaktivitását, melyek különböző arányú a-1,6-fúk-óz-mentes cukorláncot tartalmaznak, a humán melanoma G-361 sejtvonallal szemben. Az ordináta és az abszcissza a citotoxikus aktivitást, illetve az .antitest-koncentrációt ábrázolja. Az ”A’f, T és x” az anti-GD3 kiméra antitest (50%), anti-GD3 kiméra antitest (45%), anti-GD3 kiméra antitest .(29%), anti-GD3 kiméra
antitest (.24%), anti~GD3 kimér a antitest (.13%) és anti-GD3 ki inéra antitest (/%) aktivitását ábrázolja.
15. ábra bemutatja hat fajta anti--GD3 kíméra antitest ADCCaktivitását, melyek különböző arányú α- -1,6~fukóz-mentes eukoxláncot tartalmaznak, a humán melanóma G-.361 sejtvonallal szemben felhasználva a B donor egy effaktor sejtjét. Az ordináta és az abszcissza a citotoxikus aktivitást, illetve az antitestkoncentrációt ábrázolja. .Az D, ’’Δ, !>A!t és ,!x,? az anti-GD3 kíméra antitest (46%), anti-GD3 kiméra antitest (39%), anti-btu kiméra antitest (27%;, anti-GD3 kiméra antitest (18%), anti-GD3 kíméra antitest (9%) és anti-GD3 kiméra antitest (8%) aktivitását ábrázolja.
16. ábra bemutatja hat GD3 kiméra antitestből (16A - 16F ábra) kinyert PA-Kezelt cukorlánc elúciós görbéit, melyeket reverz fázisú HP.LC-vel történő analízissel kaptunk. Az ordináták és az abszcisszák a relatív fluoreszcens intenzitást, illetve az elúciós időt ábrázolják.
17. ábra bemutatja hat fajta anti-CCR4 kiméra antitest CCR4kötő-aktzvitását, melyek különböző arányú a-1,6-fukóz-mentes cu~ körtáncot tartalmaznak, az antitest“koncentráció függvényében. Az orpmata és az abszcissza a xöto—aktivitást a CC.R4-gyei, illetve: az antitest-koncentrációt ábrázolja. Az ”A”, Δ”, ”·” és o az antí-CCR4 kiméra antitest (46%), antí-CCR4 kiméia aiat-L r — at a .; , 00^..1-0.0.^.4 krmera antitest. íz / %,>, ancz— t.cR4 kiméra antitest (18%), anti-CCR4 kiméra antitest (9%) és antiCCR4 kiméra antitest (8%) aktivitását ábrázolja.
±fe. öbiá ββκΐΰ i_at j a 32 anti—ócR4 Kimer a ant.itesteK, melyek különböző arányú a-1 , 6-fukóz-mentes cukorláncot tartalmaznak, ADCC-aktzvitását CCR4/EL-4 sejttel szemben, felhasználva azA donor effektor sejtjét. Az ordináta és az abszcisszaa cxtotoxikus aktivitást, illetve az antitest-koncentrációt ábrá7 Λ 1·'ι;:ι A-? »»Μ|«· ΓΤ ’· Α” «Λ·» »··»’ Αο « a ~ _____~ ΓΠΟΖ b : ,-,Α ..~
4Vají». Λ Λ, as , Ui , A , .'Λ , * es ö d4 a«'wi~tvM ΚιΜΘΙα «ηtitest (46%;, anti-CCR4 kimér a antitest (39%), anti -CCR4 kimér a antitest >z./%,· , anti-CCR4 kimér a antitest (18%) , anti—CCR4 kimé—
19. abra bemutatja az anti-CCR4 kimére antitestek, melyek különböző arányi u-1,6-fukóz-mentes cukorláncot tartalmaznak, ADCC-aktivitását CCR4/EL-4 sejttel szemben, felhasználva a B donor effektor sejtjét. Az ordináta és az abszcissza a citotoxikus aktivitást, illetve az antitest“koncentrációt ábrázolja. Az í«r**pr n j, rí n >* - η n — ft Λ » > ζ-·->τκ λ .. .. . , . .......
új Λ A f Λ y « βο kj 3ζ ik-L.R4 Kimei'ci srit/ixest. ?
anti”CCR4 kiméra antitest (39%), anti~CCR4 kimére antitest (27%), anti-CCR4 kiméra antitest (18%;, anti-CCR4 kiméra antitest (u%; es anti-CCR4 kiméra antitest. (8%) aktivitását ábrázol-
20, ábra bemutatja a CHFT8-p€R2.1 és az ¥BBT8-pCR2.1 plazmidok megszerkesztését.
.21. ábra bemutatja, a CHAc-pBS és YBAc-pBS plazmidok megszer- zi. ábra bemutatja a CHET8d~pCR2.1 és YBFT8d-pCR2.1 plazmi dok megszerkesztését.
128
2u. abra a CHAcd-pBS és YBA.cd—pBS plazmidok megszerkesztését mutatja be.
24. abra bemutatja az FUT8 transzkripciós termék meghatározásana.k. eredményeit az egyes gazda sejtvonalakban kompetitiv RTPCR-rai. Megadjuk az FUT8 transzkripciós termék mennyiségeit az egyes gazcta sejtvonalakban, amikor patkány FUT 8- szekvenciát alkalmazunk standardként és belső kontrollt. s'®!! és bemutatják az eredményeket, amikor CHO sejtvonalat és YB2/0 sejtvonalat has znaltunk gaz das ej t. ként.
2b. ábra bemutatja az mfEUT8-pCR2.1 plazmid megszerkesztését.
2n. abra bemutatja, a pBSmtFUT8 plazmid megszerkesztését.
i! < abra bemutatja a pAGEmtFUTb plazmid megszerkesztését..
2.8 . ábra bemutatja az FUT8 gén expresszibe szintjeinek analízisét ogy olyan sejtvonallal, amely feleslegben expresszálja a gént, kompetitiv RT-PCR-ral. Az ordináta az FUT8 transzkrioció
segtvonalxal termelt, illetve a pAGE24^bevezetett sejtvonallal termeit antitestből preparált PA-Kézélt cukcrláncok elúciós mintázatait ábrázolja.
31. ábra bemutatja a Herceptinből preparált PA-kezelt cukorláncok elúciósmintá.zatá.t, melyet revem fázisú HPLC-vel való analízissel kaptunk. Az ordináta és az abszcissza a relati.lv fluoreszcens intenzitást illetve az elúciós időt ábrázolja.
32. abra bemutatja a CHtFüTS—pCR2.1 plazmád, megszerkesztését .
rxoza uemui.atja ριοχχ-Puro piazma megszerkesztését.
34. ábra bemutatja a pKOFüT8gE2-l plazmid megszerkesztését.
33. ábra bemutatja a pKOFUTSgE2-2 plazmid megszerkesztését.
36. ábra bemutatja a pscFUT8gE.2-3 plazmid megszerkesztését. 3/. acra bemutatja a pK.OFUT8gE2—3 plazmid megszerkesztését. 3a. ábra bemutatja a pKOFUT8gE2~4 plazmid megszerkesztését.
39. ábra bemutatja a pKOFUT8gE2-5 plazmád megszerkesztését. 40« ábra bemutatja a pKOFÜT8Puro plazmid megszerkesztését.
41. ábra bemutatja az ist.áFUTS 2-46-1 és Ist.áFUTÖ 2-46 mint a-1,6-fukozil~transzferáz gén-megszakított CHO sejtvonalak genom Southern-analiziseinek eredményeit.
42. ábra bemutatja egy ΐ'ΌΤ8 al.xel qen-megszakitott sejtve— nal.oől tisztított antí-CCR4 kimére antitest ADCC-akt.ivitását. Az ordináta és- az abszcissza mutatja a citotoxikus aktivitást illetve az antitest-koncentrációt. és egy anti-CCRá kimére antitest-termelő CHQ sejt 5-03-ból származó tisztított antitest a.kcxvicasac illetve egy Ist.áFUTS 2—46-1— bői származó tisztított antitest aktivitását szemlélteti.
43. ábra bemutatja egy lektin-rezisztens sejtvonallal termelt anti-CCR4 humán kimére antitest ADGC-aktivitása. Az ordináta és abszcissza mutatja a citotoxikus aktivitást illetve az antitest-koncentrációt. ”□'% és ”Á'r az 5-03, a CHO/CCR4-
LCA, CHO/CCR4-AAL és CHO/CCR4-PHA törzzsel termelt antitestek a. η1i vitásait mu ta t ja.
44. ábra bemutatja loktin-rezisztens sejtvonalakkal termelt anti-CCR4 humán kimére antitestek ADCC-aktivitását. Az ordináta és az abszcissza a citotoxikus aktivitást illetve az antitestkoncentrációt ábrázolja. A ”A” és n·” az YB2/0 (KM2760 #5835-16), 5-03 és CHO/CCR4-LCA által termelt antitestek aktivitását mutatja be.
45. ábra tisztított anti-CCR.4 humán kimére antitestekből preparált, PA.-kezelt cukorláncok elúcíós mintázatait mutatja, melyeket reverz fázisú H.PLC analízissel kaptunk. A 45A, 453, 45C és 4öD ábrák a 5-03 törzzsel, a CHO/CCR4-LCA törzzsel, a omö/'..<.R4-haL törzzsel, illetve a CHO/CCR4 — PHA törzzsel termelt antitest analízisének, eredményeit szemléltetik.
46. ábra a CHO sejt-eredetű GMD expresszi.ós vektor megszerkesztésének első lépését mutatja (Összesen 6 lépés;.
4/. áora a CHO sejt—eredetű GMD expressziós vektor megszerkesztésének 2, lépését mutatja (összesen 6 lépés).
4b. ábra a CHO sejt-eredetű GMD expresszi.ós vektor megszerkesztésének 3:.. lépését mutatja (összesen 6 lépés) .
49« ábra a CHO sejt-eredetű GMD expresszíós vektor megszerkesztésének 4. lépését mutatja (összesen 6 lépés).
1.. példa
Axiti-ganglioxíd GD3 humán kiméra antitest előállítása
1. pChi.LHGM 4 tandem exgresszíós vektor megszerkesztése az antiqangliozid GD3 humán, kiméra antitesthez
Egy pChfG41LGM40 plazmidot úgy szerkesztünk meg az antigangliozid Gö3 humán kiméra antitesthez (az alábbiakban úgy hivatkozunk rá,· mint !íariti-GD3 kimére antitest”), hogy egy Llánc cDNS-t tartalmazó kb. 4,03 kb fragmenst, amelyet egy pCh.i-641L.GM4L. [J. Immunol. Methods 167, 271 (1994) ] L-lánc expressziás vektor emésztésével kaptunk Miül restrikciós enzim, (gyártó: Takara Shuzo) és Sail restrikciós enzim (gyártó: Takara Shuzo) segítségével, egy kb. 3,40 kb nagyságú, egy G418rezísztens gént és egy splicing szignált tartalmazó fragmenssel, melyet egy állati sejthez megszerkesztett pAGElO? [Cytotechnology 3, 133 (1990)] expressziós vektor Miül restrikciós enzimmel (gyártó: Takara Shuzo) és Sáli restrikciós enzimmel (gyártó: Takara Shuzo) történő emésztésével kaptunk, ligáljuk egy DNA Ligation Kit alkalmazásával (gyártó: Takara Shuzo), majd a ligáit termékkel. E. coli HB101 sejtet (Molecular Cloning, Second Edition) transzéormalünk.
Ezt követően egy L-láno oDNS-t tartalmazó, kb. 5,38 kb fragmenst, amelyet a megszerkesztett pCi.641LGM40 plazmád Cia.I restrikciós enzimmel (gyártó: Takara Shuzo) történő emésztésével kaptunk, DNA Elunting Kit (gyártó: Takara Shuzo) felhasználásával tompavégűvé tettünk és Mlul-val (gyártó: Takara Shuzo) tovább emésztettünk, egy H-lánc cDNS-t tartalmazó, kb. 3,40 kb fragmenssel, amelyet a pChx.641HGM4 an.ti-GD3 kiméra antitest H lánc expressziós vektor [J. Immunol. Methods 167, 271 (1994)]
Xhol restrikciós .enzimmel (gyártó: Takara Shuzo) történő emésztésével kaptunk, DNA Blunting Kit (-gyártó: Takara Shuzo) alkalmazásával tompavégűvé tettünk, és -Mini.-vei (gyártó: Takara .Sh.uzo) tovább emésztettünk., ligáijuk DMA Ligation Kit (gyártó: Takara
Shuzo) segítségével, majd a ligáit termékkel coli HB101 sejtet (Molecular Cloning, Second Edition) transzformálunk, ezáltal egy pChi641LHGM4 tandem expressziős vektort szerkesztünk az anti-GD3 kiméra antitesthez.
2. Anti-GD3 kiméra antitesteket stabilan termelő sejtek előáll!-
Azokat a sejteket, amelyek képesek anti-GD3 kiméra antitestet stabilan termelni, az 1. példa 1. pontja szerinti, anti-GDS kiméra antitesthez megszerkesztett pChi641LHGM4 tandem expressziós vektor felhasználásával állítjuk elő az alábbiak szerint.
(1) An titent-terziedő- sejt előállítása patkány mieloma YB2/0 sejt fe 1 h a. s z n á Iá s á va 2 pg pChi6-41LHGM4. anti-GD3 kiméra expressziós vektort 4x10* patkány mieloma YB2/0 sejtekbe [ATC.C CRL-l662, J. V. Ki Ima rin et al.: -J. Cell. Bioi. 93, 576-582 (1982)1 elektroporációval·
[Cytoteohnology 3, 133 (1990) ] bevezetünk, majd, a sejteket 40 ml RPMI1640-FBS(10)-ben [10% FBS-t tartalmazó RRM11640 tápközeg (gyártó: GIBCO BRLj] szuszpendáljuk és egy 96-lyukü tenyésztő lemezen (gyártó: Sumitomo Bakelite) lyukanként 200 ul mennyiségszetoszttuz. 5% CO·—··tartalmú inkubátorban 3 / C—on, 24 oran á tenyésztjük, majd G418-t adunk, hozzá 0,5 mg/ml koncentráció eléréséig és ezt kővetően. 1-2 hétig tenyésztjük. A lyukakból a tenyészet felülúszóját, amelyben G418 rezisztenciát mutató transztormáns Kolóniák képződték és a kolóniák noveKeoese figyelhető meg, eltávolítjuk és a felülúszóban az anti-GD3 kiméra antitest antigén-kötő aktivitását ELISA-val merjük, amelyet az 1. példa. 3. pontjában mutatunk be.
A transzformánsokat tekintve azokban a lyukakban, ahol a tenyészet felülúszójában anti~GD3 kiméra antitest--termelést figyeltünk meg, acélból·, hogy az antitest-termelés mennyiségét növeljük egy DHFR gén-amplífikációs rendszert alkalmazásával, a transzformánsok mindegyikét 0,5 mg/ml G418-t és 50 nM DHFR inhibitort, metotrexátot (az alábbiakban. *’MTX0~ként hivatkozunk rá; gyártó: SIGMA) tartalmazó RPMI164O-FBS(10) táptalajban szuszpendál juk 1-2x105’ sejt /ml sűrűségben, és a szuszpenziót egy 24-lyuk-ú lemezen (gyártó: Greiner) lyukanként 2 ml mennyiségben szétosztjuk. Az 50 nM MTX-rsziszzeneiét mutató transzformánsokat 8% CO2 inkubátorban, 37°C-on, 1-2 hétig történő tenyésztéssel indukáljuk. A tenyészet felülúszójában azon lyukakban, ahol, transzfor-mánsok növekedését figyeltük meg, az anti-GD3 kiméra antitest antigén-kötő aktivitását ELISA-val mérjük, melyet az 1. példa 3. pontjában mutatunk be. Tekintve a transzformánsokat a lyukamban, ahox a tenyészet teluluszojaban antx—uD3 Kiméra antitest-termelést figyeltünk meg, az MTX-koneentráciőt 100 nM ra, majd 200 nM-ra növeljük, és azokat a transzf ormánsokat amelyek a 0,5 mg/ml G418~t és 200 nM MTX-t tartalmazó RPMI164 0·
ERE(10) táptalajban növekedésre képesek és nagy mennyiségű antiGD3 kiméra antitest-termelésre kénesek, végül a fent leírt antitest-termelésre képesek, végül a fent leírt eljárással a
s.os módon kapiUK meg. A kapott' transztoraansok kozni az aikanuas sejtvonalakat kiszelektáljuk, és limitáló kétszeres hígítással egyetlen sejtet >( kiónt) hozunk létre. A 9. példában bemutatott o-l,6-flukozíl-t.ranszferáz gén transzkripciós termékének meghatározására szolgáló eljárás felhasználásával szintén szelektálunk egy relatív kis mennyiségű transzkripciós terméket termeld sejtvonalat és használunk alkalmas sejtvonalként.
A kapott. 7-9-51 jelű anti-GD3 kiméra antitest-termelő transzéomált sejtklónt 1999. április 5-én letétbe helyeztük, FERM BP-6691 letéti számon a National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology (Higashi 3-1-3, Tsukuba, Ibaraki, Japan) (jelenlegi név: International Patent Organism Depositary, National
Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST Tsukuba Central. 6, 1-1, Higashi 1-Chome Tsukuba-shi, Ibarakiken, Japan)) letéteményes szervnél.
(2j An éltes t- tense.Iő sejt előállítása. €110/0044 sejt felhasználáS <:J V<2 J, pg pChí641LHGM4 a.nti-G.D3 kiméra expressziós vektort 1,. 6xlOb CHO/DG44 sej tekbe [G. Urlaub and L. A. Chasín: Proc. Natl. Acad. Bei, USA 7 7, 4216-4220 (1980) ] elektroporációval (Cyt©technology 3, 133 (.1990)'] bevezetünk, majd a sejteket 10 ml IMDM-FBS(10)-ben [10% FBS-t és 1 x koncentrációjú BT kiegészítést tartalmazó IMDM tápköxeg (gyártó: G1BCO BRL) ] .szuszpendál juk és egy 96-lyukú tenyésztő lemezen (.gyártó: Iwaki Glass) iyuKanként 2űü ui xnennvisécíOen szétosztjuk. o% uou—tartaimu inkuba— torban 37®C~on, 24 órán át tenyésztjük, majd 0,5 mg /ml .koncent ráció eléréséig G418-t adunk hozzá és ezt követően 1-2 hétig te nyésztjük. A lyukakból, a tenyészet felülúszóját, amelyben G41.8 rezisztenciát mutató transzformáns kolóniák képződtek és a koló niák növekedése figyelhető meg, eltávolítjuk és a felülúszcban anti-GD3 kimére antitest antigén-kötő aktivitását ELISA-val mérjük, amelyet az 1. példa 3. pontjában mutatunk, be.
Tekintve a transzfcrmánsokat a lyukakban, ahol a tenyészet felülúszójában. antí~GD3 kiméra antitest-termelés figyelhető meg, acélból, hogy az antitest-termelés mennyiségét növeljük egy DHFR gén-amplifíkáoiós rendszert alkalmazásával, a transzfcrmánsok mindegyikét egy 0,5 mg/ml G418-t és 10 nM MTX tartalmazó IMDMdFBS(ÍO) tápközegben [10% -dlalizált magzati borjú szérumot tartalmazó IMDM tápközeg (az alábbiakban dFBS-ként hivatkozunk rá; gyártó: GIBCO BRL)] szuszpen.dál juk 1-2x10“ sejt/ml sűrűségben és a szuszpenziót egy 24-lyukű lemezen (gyártó: Iwaki Glass) lyukanként 0,5 ml mennyiségben szétosztjuk. Az 10 nM MTX rezisztenciát mutató transzformánsokat 5% CO2 inkubátorban, 3?öC-on, 12 hétig történő tenyésztéssel indukáljuk. Tekintve a transzfermánsokat a lyukakban, ahol a növekedésük megfigyelhető, az MTXkoncentrációt .100 nM-ra növeljük és azokat a transzformánsokat, amelyek a 0,5 mg/ml G418-t és 10-0 nM MTX-t tartalmazó IMDMdFBSilü) tápközegben növekedésre képesek és nagy mennyiségű
GD3 kiméra antitest-termelésre képesek, a fent ismertetett eljárással megegyező módon kapjuk meg. A kapott transzformánsok közül az alkalmas sejtvonalakat kiszelektáljuk é-s limitáló két szeres hídfással euvetlen seήtét (kiónt) hozunk létre. Ugyan csak egy, a 9. példában bemutatott a-1,6~f.luk.ozi.l~ transzferár gén transzkripciós te.r®ékenedκ meghatározására szoigalo eljárást felhasználásával egy relatív kis mennyiségű transzkripciós ter méket termelő sejtvonalat szelektálunk és ezt használjuk alkáliként .
főj1 An ti test termelő sejt előállítása egér mie.loraa NS'Ö sejt .felhő s z ná 1 á a á va .2 pg pChi.641L'HGM4 ant.i.~GD3 kiméra expressziós vektort 4x10* egér miélomé NSO sejtekbe elektroperációval [Cyt©technology 3, 133 (1990)1 bevezetünk, majd a sejteket 40 ml EX-CELL302-
FBS(10)-ben (10% FBS-t és 2 mM L-glutamint [az alábbiakban úgy hivatkozunk rá, mint L-Gln; gyártó: GIBCO BRL1 tartalmazó EXCELL3Q2 tápközeg)· szuszpendálju.k és egy 9-6~lyukú-tenyésztő lemezen (gyártó: Sumitomo Bakelite) lyukanként 200 μΐ mennyiségben szétosztjuk.. 5% CCu-tartalmú inkubátorban. 37°C-on, 24 órán át tenyésztjük, majd 0,5 mg/ml koncentráció- eléréséig G418-t adunk hozzá és ezt követően 1-2 hétig tenyésztjük. A lyukakból a tenyészet felülúszóját, amelyben G418 rezisztenciát mutató transzformáns kolóniák képződtek és a kolóniák növekedése figyelhető meg, eltávolítjuk, és a felülűszóban az anti~GD3 kiméra antitest antigén-kötő aktivitását EUSA-val mérjük, amelyet az .... pei.da 3. pontyacan mutatunk be.
A transzformánsokat. tekintve azokban a lyukakban, ahol, a tenyészet felülúszój'ában antí-GD3 kiméra antitest-termelés figyelhető meg, acélból, hogy az antitest-termelés· mennnyiségét növeljük egy DHFR gén-amplífikációs rendszert alkalmazásával, a transzf órmánsok mindegyikét 0,5 mg /ml G418~t és 50 nM tíTX-t tar talmazó EX-CELL302-dFBS(lőj tápkö xeq.be (10% dFBS-t és 2 mM LGln-t tartalmazó EX-CELL302 tápközeg) szuszpendáljuk l-2xlCF sejt/ml sűrűségben, és a szuszpenziót, egy 24-lyukú lemezen (gyártó: Greiner) lyukanként 2 ml mennyiségben szétosztjuk. Az 50 nM MTX-re.zisztenciát mutató transzformánsokát 5% CO?-tartalmú inkubátorban, 37°C-on, 1-2 hétig történő tenyésztéssel indukáljuk. A tenyészet felülúszójában azokban a lyukakban, ahol a transzfozmánsok növekedését megfigyeltük, az anti-GD3 kiméra antitest antigén-kötő aktivitást ELISA-val mérjük, melyet, az 1. példa 3. pontjában mutatunk be. Tekintve a transzformán-sokat a lyukakban, ahol a tenyészet felülúszójában antí-G-D3 kiméra antitest-termelést figyeltünk meg, az MTX-koncentrációt 100 nM-ra, majd 200 nM-ra növeljük és azokat a transzformánsokat, amelyek a 0,5 mg/ml G418-t és 200 nM MTX-t tartalmazó EX-CELL302-ÜFB.S (:10) táptalajban növekedésre képesek és nagy mennyiségű -anti-GD3 kiméra antitest-termelésre képesek, a fent ismeretett eljárással megegyező módon kapjuk meg. A kapott transzformánsok közül az alkalmas sejtvonalakat kiszelektáljuk, és limitáló kétszeres hígítással egyetlen sejtet (kiónt) hozunk létre. Ugyancsak, egy,
9. példában bemutatott ο-1, δ-flukozi 1.-transzferáz gén transz kripciós termékének meghatározására szolgáló eljárás felhaszná lásával egy relatív kis mennyiségű transzkripciós terméket ter melő sejtvonalat szelektálunk és ezt használjuk alkalmas sejtvo- .» Az antitest kötő-aktivitásának mérése a GD3-hoz (ELISA
Az antitest kötődési aktivitását a GC-3-hoz az alábbiakban.
.ismertetett módon mérjük etanéiban, amely 10 ug· dípalmít-oil-foszfatidi 1-kolint (gyártó: SIGMA) és 5 pg koleszterint (gyártó: SIGMA) tartalmaz, nmol GD3-t oldunk, ELISA-hoz gyártott 96-lyukú lemez (gyártó: Greiner) mindegyik lyukába 20 pl oldatot. (4ü pmol/lyuk. végső koncentráció) szétosztunk, majd levegővel szárítjuk, 1% szarvasmarha szérum albumint (az alábbiakban úgy hivatkozunk rá, mint ”BSA.”; gyártó: SIGMA) tartalmazó PBS-t (az alábbiakban úgy hivatkozunk rá, mint ’1% BSA-PBS”) lyukanként 100 pl mennyiségben szétosztunk, majd a reakciót szobahőmérsékleten 1 órán át kivitelezzük a megmaradt aktív csoportok blokkolására. Az 1% BSAPBS-t döntjük, majd szobahőmérsékleten 1 órán át tartó reakcióhoz egy transzformáns fdülúszóját vagy egy humán kiméra antitest hígított oldatát 50 pl/lyuk, mennyiségben szétosztjuk. A reakció után mindegyik, lyukat 0,05% Tween 20-t (gyártó: Wa'ko Pure Chemical Industries) tartalmazó PBS-vel (az alábbiakban úgy hivatkozunk rá, mint ”Tween-PBS”) kimossuk és 1% BSA.···PBS-vel 3000szeresen hígított peroxidáz jelzett kecske anti-humán IgG (H & L) antitest oldatot (gyártó: American Qnalex) második, antitest oldatként, 50 pl/lyuk mennyiségben szétosztunk, majd, a reakciót szobahőmérsékleten 1 órán át kivitelezzük. A reakció és azt követő Tween-PB.S-vel történő kimosás után lyukanként 50 pl mennyiségben ABTS szubsztrát oldatot [az oldatot úgy állítjuk elő, hogy 0,55 g 2,2'-azino-bisz(3~etil~benzotiazolín-6-szulfonsav)ammónium-sót 1 liter 0,1 14 citrát-pufferben (pH 4,2) feloldunk és 1 pl/ml hidrogén-peroxidot adunk az oldathoz közvetlenül a felhasználás előtt (az alábbiakban ugyanezt az oldatot alkalmaz-
zuk; 1 osztunk szét a szín kifej lesztésere, majd. az abszorbancíav. 415 rm-en (az alábbiakban úgy hivatkozunk rá, mint ”OD415”) mérjük.
. Anti-GD3 .kiméra antitest tisztítása (Ί) YB2/0 sejtekből. származó antitest-termelő sejtek tenyésztése és az antitestek: tisztítása
Az 1. példa 2(1.) pontjában Kapott anti-GD3 kiméra antitesttermelő transzformált sejtklónt 0,2% BSA-t, 200 nM. MTX~t és 100 nM tri jód-tironint (az alábbiakban úgy hivatkozunk rá., mint ”T3”; gyártó: SIGMA} tartalmazó Hybrídoma-SFM tápközegben szuszpendáljuk 3x10” sejt/ml sűrűségben, és 2,0 liter kapacitású centrifuga palackban (gyártó: Iwaki Glass) rázatás közben (50 ford/perc) tenyésztjük. A tenyésztést 3T*C~on, 10 napig, hőmérséklet-szabályozott szobában végezzük, majd a tenyészet felülúszóját kinyerjük. Az anti-GD3 kiméra antitestet a tenyészet fe~ lülúszójáböl egy Prosep-A (gyártó: Bioprocessing} oszlop alkalmazásával tisztítjuk a gyártó utasítása szerint. A tisztított ant.i-GD3 kiméra antitestet YB2/0-GD3 kiméra antitestnek neveztük (2) CHO/DG44 sejtekből származó anti test-termelő sejtek tenyésztése és az antitestek tisztítása
Az 1. példa 2(2} pontjában kapott anti-GD3 kiméra antitesttermelő transzformált sejtklónt 3 mM L-Gln-t, 0,5% zsírsav kon centrált oldatot (az alábbiakban úgy hivatkozunk rá, mint
CDLC; gyártó: GIBCO-BRL) és 0,3% Pluronic F68~t (az alábbiaktarts fiazó EX-CELL302 táoközeoben szuszoendáliuk
ben és a szuszpenziót 50 ml-ként 175 mz-es tenyésztő lombikokba· szétosztjuk. ó% COa-tartalmú inkubátorban,
37cC-on, 4 napig tenyésztjük, majd a tenyészet felülúszóját ki nyerjük. Az anti—GD3 kiméra anti.tester, a tenyészet xeluluszoja egy Prosep-A {gyártó: Biop.roces-síng) oszlop alkalmazásával tisztítjuk a gyártó utasítása szerint. A tisztított a.nti-GD3 kimér a antitestet OHO/DG44-GD3 kiméra antitestnek neveztük el.
(3) NSO sejtekből származó antitest-termelő sejtek tenyésztése és az antitestek tisztítása
Az 1. példa 2(3) pontjában kapott anti-GD3 kiméra antitesttermelő transzformált sejtklónt 2 mM L-Gln-t, 0,5 mg/ml G418-t, 200 nM MTX-t és 1% FBS-t tartalmazó EX-CELL3Ö2 tápkozegben szuszpendáljuk. lxlO<; sejt/ml sűrűségben és a szuszpenziót 200 miként. 175 mm2-es tenyésztő lombikokba (gyártó: Greiner) szétosztjuk. 0% 00-2—tartalmú inkubátorban, 1/ C—on, 4 napig tenyésztjük., majd a tenyészet felülúszójár kinyerjük. Az anti~GD3 kiméra antitestet a tenyészet felülúszójából egy Prosep-A (gyártó: Bioprocessinq) oszlop alkalmazásával tisztítjuk, a gyártó utasítása szerint. A. tisztított anti-GD3 kiméra antitestet NS0-GD3 kiméra antitestnek (302) neveztük el.
boyancsak a transztormázt sejtklónt u, 5 mg/mj. G4i8~1 es 2u0 nM MTX-t tartalmazó GIT tápközegben szuszpendáljuk .3x10s sejt/ml sűrűségben és a szuszpenziót 200 mi-ként 175 mirr-es tenyésztő lombikokba (gyártó: Greiner) szétosztjuk. 5% CO2-tartalmú inkubátorban 37°C-on, 10 napig tenyésztjük, majd a tenyészet felülúszóját kinyerjük. Az antx— GD3 Kamera antitestet a tenyészet, telülászojából egy Prosep-A (gyártó: Bioprocessing) oszlop alkal-
mazásával tisztítjuk a gyártó utasítása, szerint. A tisztított antí-GD3 kiméra antitestet NSQ-GD3 kiméra antitestnek (GIT) neveztük el.
(4) SP2/G sejtekből származó an titest-termelő sejtek tenyésztése és az antitestek tisztítása
A 304989/93 (EP 5-33199) számú japán közzétett, nem-ví zsgál.t szabadalmi bejelentésben, ismertetett anti-GD3 kiméra antitesttermelő transzformált sejtkiónt (KM-871 (FERM BP-3512)) 0,5 mg/mi G418-t és 200 nM MTX-t tartalmazó GIT tápközegben szuszpendálunk 3x10 sejt/ml sűrűségben és a sznszpensiót 200 ml-ként 175 mná-es tenyésztő lombikokba (gyártó: Greiner) szétosztjuk. 5% CÖ2.-tartalmú inkubátorban 37!''C-onf 1.0 napig tenyésztjük, majd a tenyészet f-elülúszóját kinyerjük. Az anti-GD-3 kiméra antitestet a tenyészet felülúszőjáb-ól egy Prosep-A (gyártó: Bioproaessing) oszlop alkalmazásával tisztítjuk a gyártó utasítása szerint.. A iszritott antl-GD3 kiméra antitestet SP2/0-GD3 kiméra antitest nek neveztük el.
A tisztított anti-GD3 kiméra antitestek analízise
sávot találunk redukáló körülmények között mindegyik tisztított anti-GD3 kiméra antitest esetében. A molekulatömegek majdnem
L-lánoának cDNS nukleotid szekvenciájából, levezetett molekulatömegekkel (H-lánc: kb. 49 Kd, L-lánc: kb. 23 Kd, teljes molekula: kb. 144 Kd) és egyezésben vannak azokkal a közleményekkel, amelyek azt állítják, hogy az IgG antitest kb. 150 Kd molskulatömegű nem-redukáló körülmények között és kb. 50 Kd molekulatömegű H-láncokká és kb. 2 5 Kd molekulatömegü L-lánookká degradálódik redukáló körülmények között, a molekulában lévő diszulfid-kötés (az alábbiakban úgy hivatkozunk rá, mint S-S kötés) hasadásának köszönhetően (Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Chapter 14 (1998); Monoclonal. Antibodies: Principles and Practice, Academic Press Limited (1996)1, így azt igazoltuk, hogy mindegyik anti-GD3 kiméra antitest oly módon expresszálódott és tisztítódott, mint a valós szerkezettel, ren delkező antitest molekula.
2. példa
Anti-GDS kiméra antitest aktivitásának kiértékelése
1. Anti-GD3 kiméra antitest kötődési aktivitása a GD3-hoz (ELISA)
Az 1. példa 4. pontjában kapott, öt fajta tisztított antiGD3 kiméra antitest GD3-hoz (gyártó: Snow Brand Milk Products) történő kötődési aktivitását az 1. példa 3. pontjában bemutatott EnüSA—var merzur. h z. aora a kőtöoes.i. akr.i.vitás vizsgazatanau eredményeit mutatja, amit úgy mérünk, hogy az adagolt anti-GD3
kiméra antitest koncentrációját változtatjuk. Amint a 2. ábrán bemutatjuk az öt fajta anti-GD3 kimére -antitest a GD3-hoz majdnem azonos kötődési aktivitást mutat. Az eredmények azt mutatják, hogy ezen antitestek antigén-kötő aktivitása állandó az. antitest-termelő állati sejttől és tenyésztési eljárástól függetlenül. Tehát a NS0-GD3 kiméra antitest (302) és NS0-GD3 kiméra antitest (GiT) összehasonlításából arra lehet következtetni, hogy az antigén-kötő aktivitás a tenyésztés során alkalmazott tápközegtől függetlenül állandó.
2. Anti-GD3 kiméra antitest ín vitro citotoxikus aktivitása (ADC C a k t i v í t á s)
Abból a célbői, hogy az 1. példa 4. pontjában kapott öt fajta tisztított antí-GD3 kiméra antitest ín vitro citotoxikus aktivitását kiértékeljük, az ADCC aktivitást az alábbi eljárások szerint mérjük.
CoJ-seit — olctaε előállítása
A G-3vl humán melanoma tenyésztett sejtvonalat (ATCC CRL 1424) RPMI164 0--FBS(10) tápközeg felhasználásával tenyésztjük 1x10° sejt előállítására, és a sejteket radio izotóppal. jelöljük oly módon, hogy 3,7 MBq ekvivalens Nag'^Crö^ radioaktív anyaggal, Sl^C-on, 1. órán át reagálhatjuk. A reakció után a sejtszaszpenzíót háromszor RRMI1640-FS.S (10) tápközegben átmossuk és centrifugáljuk, a tápközegben újraszuszpendáljak, majd 4 °C-on, 3-0 percig .égben inkubaljuic a rscuoekciv anyag spontán oisszoc.x — áciőjanoz. A centrifugai, ás ur.au a csapaoexot o mi KrMl. .i wü — FBS{10} tápközeogel 2x10 sejt/ml—re beállítjuk és ezt az oldatot
célsejt—oldatként alkalmazzuk.
(2) Eli:tektorsaj t-oldat előállítása
Egy egészséges emberből 50 ml vénás vért gyűjtünk és 0,5 ml heparin-nátrlommal (gyártó: Takeda Pharmaceutical) óvatosan elegyítjük. Az elegyet centrifugáljuk, hogy egy mononukleáris sejtréteget izoláljunk Lympheprep (gyártó: Nycomed Pharma AS) alkalmazásával a gyártó utasításai szerint. Miután a sejtréteget RPMI1640-FBS(10) tápközeggel háromszori centrífugálással mostuk, a kapott csapadekot. 2xlV sejr/mi -sűrűségben ujraszuszpsnctaijuK a tápközegben, és ezt az oldatét használjuk effektorsejtoldatként.
/5) ADCC aktivitás mérése
96-lyukú U-aiakü mélyedésekkel ellátott lemez (gyártó: Falcon) minden egyes lyukába 50 μΐ fenti, (1) pont szerint előállított célsejt-oldatot (IxlO4 sejt/lyuk) észtünk szét. Ezután 100 pl fenti (2) pont szerint előállított effektorsejt-oldatot adunk hozzá (zxlO* sejt/lyuk, az effektorsejtek és célsejtek aránya 20:1). Ezt követően a lyukakhoz mindegyik anti~GD3 kimére antitestet hozzáadjuk 0,0025-2,5 gg/ml vég koncentrációban, majd 37*C-on, 4 órán át reagálhatjuk. A reakció után a lemezt centrifugáljuk és a felülúszóban a *‘Cr mennyiségét γ-számlálóval mérjük... A spontán felszabadult 01Cr mennyiségét ugyanezzel a művelettel határozzuk meg, azonban az effektorsejt-oldat és az antitest-oldat helyett csak tápközeget alkalmazunk és mérjük a lCr mennyiségét a felülúszóban. Az összes felszabadult 3!'Cr mennyiségét ugyanilyen művelettel határozzuk meg, azonban az antitest oldat nelvett csak tanközecjet aiKarmazuriK ss az erfektorse
oldat helyett 1 N sósavat adagolunk, és mérjük a SiCr mennyiségét a fel ülés tóban < Az. ADCC aktivitást az alábbi (II) egyenletből számoljak ki:
-1 Cr a minta felülúszóban - spontán felszabadultkor ADCC aktivitás (%) =.......................................-........................................ xlOO összes felszabádult?;C.r - spontán. fslszabadulV’Cr
Az eredményeket a 3. ábrán mutatjuk be. Amint a 3·. ábrán látható, az ötféle anti-GD3 kiméra antitest között a YS2/Q-GD3 kamera ant-inest mutatja a legriagyoob ADuu. aktivitást, majd ezt követi sorrendben a SB2/0-GD3 kiméra antitest, NS0-GD3 kiméra antitest és CHO-GD3 kiméra antitest. A NSD-GD3 kiméra antitest (302) és NS0-GD3 kiméra antitest (GIT) között, amelyeket a tenyésztés során különböző tápközeg felhasználásával, állítottunk elő, az ADCC aktivitásban nem volt megfigyelhető különbség. A fenti eredmények azt mutatják, hogy az antitestek ADCC aktivitása na a ymerré keen valt.oz.ir az sioali utasukban rexhasznaxt axlati sejt, típusától függően. A mechanizmust illetően, mivel antigénkötő aktivitásaik azonosak, azt figyeltük meg, hogy azt az antitest Fc-régiójához való kötődés szerkezetében lévő különbség okozza
3. példa
Anti-humán interleukin-5 receptor «-lánc humán CDR-grafted antitest előállítása
1. Anti-humán interleukin-5 receptor a-lánc humán CDR-grafted antitestet stabilan termelő sejtek előállítása fl > An rí test - tersiefő salt előállítása natkánv ®2ei®a YB2/0 oszt
Azokat a sejteket, amelyek képesek anti~hlL~5Ba CDR-grafted antitestet stabilan termelni, a WO 97/10354 számú közrebocsátás! iratban ismertetett pKANTEX1259HV3LV0 anti-humán interleuki.n.~5 receptor a-lánc humán CDR-grafted antitest (az alábbiakban úgy hivatkozunk rá, mint anti-hlL-SRo CRD-grafted antitest) expresszi—ós vektor rethasznaiasaval arlxtguK elő az araodak sze— pg pKANTEX1259HV3LV0 anti-hIL-5Ru CDR-grafted antitest expressziós vektort 4xl0':‘ patkány mielema YB2/0 sejtekbe eloktroporációval [Cytotechnology 3> 133 (1990) ] bevezetünk, majd a sejteket 40 ml RPMI1640-FBS(10)-ben szuszpendáljuk és egy 96-lyukú tenyésztő lemezen (gyártó: Sumitomo Bakelite) lyukanként 200 pl mennyiségben szétosztjuk. 5% Cö?-tartalmú inkubátorban 37 °C-on, 24 órán át tenyészt j ük, majd 0,5 mg/ml koncentráció eléréséig G418-t adunk hozzá és ezt követően 1-2 hétig tenyésztjük. A lyukakból a tenyészet felüldszóját, amelyben G418 rezisztenciát mutató transzformáné kolóniák képződtek és a kolóniák növekedése figyelhető meg, eltávolítjuk, és a felülúszóban az anti-h'IL-ÓRa CDR-grafted antitest antigén-kötő aktivitását ELISA-val mérjük, amelyet a 3. példa 2. pontjában mutatunk be.
A transzformánsokat tekintve azokban a lyukakban, ahol a tenyészet felülúsző jában anti-hlL-SRoi CDR-grafted antitest termelés figyelhető meg, acélból, hogy az antitest-termelés .ennyiségét növeljük egy DHFR gén-amplifikációs rendszert alkal mazásával, a transzformánsok midegyikét 0,5 mg/ml G418-t és 5( nM MTX-t tartalmazó RPMI164Q-FBSQ0) t ápt a1a j ban szus zpe ndá1j u k
2x10* sejt /ml sűrűségben, és a szuszpenziót egy 24-lyukú .lemezen (gyártó: Greiner) lyukanként 2 ml mennyiségben szétosztjuk. Az 50 nM MTX~rezisztenciá.t mutató transzformánsokat 5% CCn-tartalmú inkubátorban, 37°C~on, 1-2 hétig történő tenyésztéssel indukáljuk. A tenyészet felülúszöjában azokban a lyukakban, ahol a transzformánsok növekedését megfigyeltük, az anti~hIL~5Ro CDRgrafted antitest antigén-kötő aktivitását ELISA-val mérjük, melyet. -a 3. példa 2. pontjában mutatunk be. Tekintve a transzformánsokat a lyukakban, ahol a tenyészet felülúszöjában anti-hIL-5R« CUR-grafted antitest-termelést figyeltünk meg, az MTX-koncentrációt 100 nM-ra, majd 200 πΜ-ra növeljük és azokat a transzformánsokat, amelyek a 0,5 mg/ml G4.18-t és 200 nM MTX-t tartalmazó RPM11640-FBS(10) táptalajban növekedésre és nagy mennyiségű. anti-hIL-5.Ra CDR-grafted antitest-termelésre képesek, a fent ismertetett eljárással azonos módon kapjuk meg. A kapott transzf ormánsok közül az alkalmas sejtvonalaka.t kiszelektáljuk, és limitáló kétszeres hígítással egyetlen sejtet (kiónt) hozunk létre. Egy, a 9. példában, bemutatott u-1, 6~flukozi 1-transzferáz gén transzkripciós termékének meghatározására szolgáló eljárás felhasználásával ugyancsak egy viszonylag kismennyiségü transzkripciós terméket termelő sejtvonalat szelektálunk, és használunk alkalmas sejtvonalként.. A kapott antí-nlL-FRa CDR-grafted anti test-termelő transzformált No.3 sejtklónt 1999. ápril tétbe helyeztük FERM BP—6590 letéti számon a National Inst
Agency of industrial Science név: International Patent Organism Depositary, Nations
Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIS
Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi
I-Chome Tsukuba~shi, Ibarakiken, Japan)) letéteményes szervnél.
(2; Anti test-termelő sejt előállítása. CLO/dhtr' sejt félhasznála4 pg a WO 97/10354 számú közrebocsátási iratban ismertetett pKANTEX1259.HV3LV0 anti~h.IL~5Ru CDR-grafted antitest expressziős vektort 1,6x10° CHO/dhfr sejtekbe elektroporációval [Cytotechnology £, 133 (1990)1 bevezetünk, majd a sejteket 10 ml IMDMFBS(10)-ben szuszpendáljuk és egy 96-lyukú tenyésztő lemezen (gyártó: Iwaki Glass) lyukanként 200 μΐ mennyiségben szétosztjuk.. 5% COa-tartalmú inkubátorban 37cC-on, 24 órán át tenyésztjük, majd 0,5 mg/ml koncentrációban G418-t adunk hozzá és ezt követően 1-2 hétig tenyésztjük. A lyukakból a tenyészet felülúszóját, amelyben G418 rezisztenciát mutató transzformáns kolóniák képződtek és a kolóniák növekedése figyelhető meg, eltávolítjuk, és a felülüszóban az anti-hIL-5Ro CDR-grafted antitest antigén-kötő aktivitását ELISA-val mérjük, amelyet a 3. példa 2. pontjában mutatunk be.
A transzformánsokat tekintve azokban a lyukakban, ahol a tenyészet felülúszójában. anti-hIL-5Ra CDR-grafted antitesttermelés figyelhető^ meg, acélból, hogy az antitest-termelés mennyiségét növeljük egy DHFR gén-amplifíkácíós rendszert alkalmazásával, a transzformánsok mindegyikét 0,5 mg/ml G.418-t és 10 n£4 MTX-t tartalmazó iMüM-dFBS (10) táptalajban szuszpendáljuk
2x10° sejt/ml sűrűségben, és a szuszpenziót egy 2.4-lyukú lemezen
Iwaki Glass) lyukanként 0,5 ml mennyiségben szétoszt* Φ x -y v ♦ » * * e -J <t ♦ ♦. « *♦ !>£· + > «efr K>« juk. A 10 nM MTX-rezísztencíát mutató transzformánsokat 5% CC»2~ tartalmú inkubátorban, 37*C-on, 1-2 hétig történő tenyésztéssel indukáljuk. Tekintve a transzformánsokat a lyukakban, ahol a növekedésüket figyeltük meg, az MTX-koncentráoiót 100 nM-ra, majd 500 nM-ra növeljük, és azokat a transzformánsokat, amelyek a 0,5 mg/ml G418-t és 500 nM MTX-t tartalmazó IMDM-dFBS (1G) táptalajban növekedésre képesek és nagy mennyiségű anti-hlL-SRa CDRgrafted antitest-termelésre képesek, végül a fent leírt eljárással azonos módon kapjuk meg. A kapott transzformánsok közül az alkalmas sejtvonalakat kiszelektáljuk, és limitáló kétszeres hígítással egyetlen sejtet (kiónt) hozunk létre. A 9. példában bemutatott a-1,6-flukozil-transzferáz gén transzkripciós terméké nek meghatározására szolgáló eljárás felhasználásával ugyancsak egy relatív kis mennyiségű transzkripciós terméket termelő sejt vonalat szelektálunk és használunk alkalmas sejtvonalként.
(3/ .Antitest— termelo sejt doaüifcása egsr mfe.ioma nba sejt Ιόλ.— használásáv.s.1
Az anti-hlL-öRa CDR-grafted antitest expressziós vektort Yarranton és mtsai eljárása szerint [BIO/TECHNOLOG’/' 10, 169 (1992)} és a WO 97/10354 számú közrebocsátási iratban ismertetett pKANTEX1259HV3LV0 anti-hlh-SRa CDR-grafted antitest expressziós vektor H-lánc cDKS-ét és L-lánc cDNS-ét felhasználva állítjuk elő és az NSO sejtet úgy transzformáljuk, hogy az antihIL-5RaCDR-arafted antitest nagy mennyiségű termelésére képes transzformánsokat kapunk. A kapott transzformánsok közül az alkalmas sejtvonalakat kiszelektáljuk, és limitáló kétszeres higí-
zással egyetlen -sejtet (kiónt}· hozunk, létre. A 9. példában bemutatott a-1,6-flukozíl-transzferáz gén transzkripcióé termékének mégha tarozása re. szol gá i.o el. τ s m s t e .1 nas znal ás a va 1 eg y re i a t ív kis mennyiségű transzkripciós terméket termeld sejtvonalat sze lektálunk és használunk alkalmas sejtvonalként.
2. Az antitest kötő-aktivitásának mérése a hIL-oRa-hoz (ELISA)
Az antitest kötődési aktivitását a hIL-5Ro-hoz az alábbiakban ismertetett módon merjük.
Egy oldatot úgy állítunk elő, hogy a WO 97/10354 kőzrebocsátási iratban ismertetett KM1257 anti-hlL-SRo egér antitestet PBS-vel 10 gg/mi koncentrációra hígítjuk és ELISA-hoz
BSA-PBS-t lyukanként 100» μΐ mennyiségben szétosztunk, majd a WO 97/10354. közrebocsátásí iratban ismertetett, oldható 'nI.L-5.Ra 1% BSA-PBS-vel hígított 0,5 ug/ml koncentrációjú oldatát 50 ul/lyuk mennyiségben szétosztjuk, majd a reakciót 40C~an 20 órán át kivitelezzük. A reakció és azt követő Tween-PBS-vei történő mosás után lyukanként 50 pl mennyiségben a -t ranszf. ormánsok tenyészetének felülúszóját vagy tisztított humán CDR-gra.ft.ed antitestek hígított oldatát osztjuk szét a. reakció szobahőmérsékleten 2 órán át történő kivitelezéséhez. A reakció után mindegyik lyukat Tween-PBS-vel kimossuk és 1% BSA-PBS-vel 3000-szeresre hígított peroxidáz jelzett kecske anti-humán IgG (H & L) antitest oldatot (gyártó: American Qualez) 50 pl/lyuk mennyxsegnen szetosztunK masocmk antitest groatrent, mage a reakciót szobahőmérsékleten 1 órán át kivitelezzük. A. reakció és órán át kivitelezzük. A reakció és azt követő ’Tween-PBS-vei
.3 . Anti~hIL~5Ra CDR-grafted antitest tisztítása (Ί) YS2/ö sejtekből szármázd antitest-termelő sejtek tenyésztése es az az?t.xtestek t zszt.z tasa
Az 3. példa 1(1) pontjában kapott anti~hIL~5Ra. CDR-grafted antitest-termelő transzformált sejtklónt 0,5 mg/ml G418-t és 200 nM MTX-t tartalmazó GI.T tápközegben szuszpendáljuk .3x10 ssjt/ml sűrűségben és 2.00 ml-ként 173 mm^-es tenyésztő lombikokba (gyártó: Greiner) szétosztjuk. 37VC—on, 8 napig, 5% CCn-tartalmú inkubátorban tenyésztjük, majd a tenyészet felülúszóját kinyerjük. Az antí-hl'L~5Ra CDR-grafted antitestet a tenyészet felülúszójábol ioncserélő-kromatográfiával és gélsxűréssel tisztítjuk. A tisztított anti-hIL-5Ra CDR-grafted antitestet YB2/0-hIL-5R CDR antitestnek neveztük el.
Az 3. példa 1(2) pontjában kapott an.ti.~h.IL~.5Ra CDR-grafted antitest-termelő transzformált, sejtklónt 3 mM L-Gln-t, 0,5% CDLC-t és PFű3-t tartalmazó EX-CELL302 tápközegben szuszpendáljuk 3x10” sejt/mi sűrűségben és a szuszpenzíót 4,0 liter kapacitású. centrifuga palackban (gyártó: Iwaki Glass) rázatás közben (100 ford/perc) tenyésztjük. A tenyésztést 37°C-on, 10 napig, hőmérséklet-szabályozott szobában végezzük, majd a tenyészet lülüszóját kinyerjük.
* $ * « « s .· * * · Λ « <
*♦ «Ρ κ*
A tenyészet felülúszó·ától az anti—nlL—öRoí
CDR-grafted antitestet ioncserélő-kromatográfiával és gélszűréssel tisztítjuk meg. A tisztított anti-hIL-5Ra CDR-grafted antitestet CHü/d—mii—5R CDR antitestnek nevező ű.ú ex.
(3 ) &SŰ sejtekből származó anti test-termelő sejtek tenyésztése és az antitestek tisztítása
Az 3. példa 1(3). pontjában kapott anti-hlL-SRa CDR-grafted antitest-termelő transzformált sejtkiónt Yarrantoa és mtsai eljárása szerint [BXO/TECHNOLOGY 10, 169 (1992)] tenyésztjük, majd a tenyészet felűlüszóját kinyerjük. Az anti-hlL-SRa CDR-grafted antitestet a tenyészet felülúszójából ioncserélő kromatográfiával és gélszűréssel tisztítjuk meg. A tisztított antí-hIL-5Ra CDR-grafted antitestet NS0-hIL-5R CDR antitestnek neveztük el.
. A tisztított anti-hlL-SRa CDR-grafted antitestek _a.na 1 izise
Egy ismert eljárás szerint [Nature 227 680 (1970)1 az 3. példa 3. pontjában kapott, megfelelő állati sejtekben előállított és ezekből tisztított három fajta anti-hIL-5Ro CDR-grafted antitest 4 pg-ját SDS-PAGE-nek vetjük alá a molekulatömeg és tisztasági fok analizálására. Az eredményeket a 4. árán mutatjuk be. Amint a 4. ábrán látható, egyetlen kb. 150 Kd molekulatömegü sávot találunk nem-redukáló körülmények között, és két kb. 50 Kd és kb. 2.5 Kd sávot találunk redukáló körülmények között mindegyik tisztított anti.-hIL-5Ro: CDR-grafted antitest esetében. A molekulatömegek majdnem megegyeznek az antitest H-láncának és Lláncának cDNS nukieotId-szekvenciájából levezetett molekulatömegekkel (H-lánc: kb. 49 Kd, L-lánc: kb. 23 Kd, teljes molekula:
ft* «« «ft Mft ft * -ft ft ft » ♦ « >· £«« t « ft ♦ λ ♦ ft v'* ft* ft? ft.* kb. 144 Kd) és egyezésben vannak azokkal a közleményekkel, amelyek azt állítják, hogy az IgG antitest kb. 150 Kd molekulátÖmegű nem-redukálő körülmények között és kb. 50 Kd molekulatömegű H~láncokká és kb. 25 Kd molekulatömegű L-láncokká degradálódik redukáló körülmények között, a molekulában lévő S-S kötés hasadásának köszönhetően [Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Chapter 14 (1998); Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press Limited (1996)], így azt igazoltuk, hogy mindegyik antí-hlL-SRo CDRgrafted antitest oly módon expresszálődott és tisztitódott, mint a valós szerkezettel rendelkező antitest molekula
4. példa
Anti-hXI»-5Ra CDR-grafted antitest aktivitásának kiértékelése
1. Anti-hIL-5Ro CDR-grafted antitest kötődési aktivitása a hlL5.Ra-hoz (ELISA)
Az 3. példa 3» pontjában kapott, három, fajta tisztított an.ti-hIL~5Ra CDR-grafted antitest hlL-SRa-hoz történő kötődési aktivitását a 3. példa 2. pontjában bemutatott ELISA-val mérjük. Az 5. ábra a kötődési aktivitás -vizsgálatának eredményeit mutatja be, amit ügy mérünk, hogy az adagolt an.ti-hIL.~5Ra CDR-grafted antitest koncentrációját változtatjuk. Amint az 5. ábrán bemutatjuk a három fajta antí-hIL-5Ra CDR-grafted antitest a hILSRa-hoz majdnem azonos kötődési aktivitást mutat. Az eredmények azt mutatják, hogy ezen antitestek antigén-kötő aktivitása állandó az antitest-termelő állati sejttől és tenyésztési eljárástól függetlenül, a 2. példa 1. pontjában kapott eredményhez ha-
Anti~n 1.a—3-Rot CDk—grarteo a.ntitesr zn vxt.ro citotoxikus akti.— vitása (ADCC aktivitás)
Abból a célból, hogy a 3. példa 3. pontjában, kapott három fajta tisztított anti-hlL-SRo CDR-grafted antitest ín vitro citotoxikus aktivitását kiértékeljük, az ADCC aktivitást az alabbr eljárások sze.r.r.nt merjük.
(1) Célsejt-oldat előállítása
A WG 97/10354 közrebocsátás! iratban ismertetett, CTLL2(h5R) egér T sejtvonalat, amely hlL-SRu-lánoot és β-láncot expresszál, RP.MI.1640-FBS(.10) tápközeg felhasználásával tenyésztjük 1κ10°/0,5 ml sűrűségben, és a sejteket radioizotóppal jelöljük oly módon, hogy 3,7 MBq ekvivalens Ma^CrCc radioaktív anyaggal, 37'‘'C-on, .1,5 órán át reagál tat juk. A reakció után a se j tszuszpenziót háromszor RPMI1640-FBS{10) tápközegben átmossuk és centrifugáljuk., a tápközegben új raszuszpendál j ak, majd VC-on, 30 percig jégben inkabál-juk a radioaktív anyag spontán disszociációjához. A centrifugális után a csapadékot 5 ml RPM.I.1640~ FBS(10) tápközeggel 2x10 sejt/ml.-re beállítjuk és ezt az oldatot célsej t-oldat ként aIkaimé,zzuk.
(IC £)/tekt-orseg c-ordát e.í.oá..£.:...? tasa
Egy egészséges emberből 50 ml vénás vért gyűjtünk és 0,5 ml heoarin-nátriummal (gyártó: Takeda Pharmaceutical) óvatosan elegyítjük. Az elegyet centrifugáljuk, hogy egy mononukleáris sejtréteget izoláljunk Polymorphprep (gyártó: Nycomed Pharma AS) alkalmazásával a gyártó utasításai szerint. Miután a sejtréteget
RFMI1640-FBS(10; tápközeggel háromszor i centrifugálással mostuk, a kapott csapadékot 2x10* sejt/ml sűrűségben újraszuszpendáljuk a
96-lyukú U-alakü .mélyedésekkel ellátott lemez (gyártó: Falcon} minden egyes lyukába 50 μΐ. fenti, (1) pont szerint előállított célsejt-oldatot (1x10’ sejt/lyuk) osztunk szét, Ezután 100 μ! fenti (2) pont szerint előállított ef fektorsejt-oldatot adunk hozzá (9x10* sejt/lyuk, az effektorsejtek és célsejtek aránya 90:1). Ezt követően a lyukakhoz mindegyik anti-hlL-őRc CDRgrafted antitestet hozzáadjuk egy Cg 001-0,1 pg/ml végkoncentrációban, majd 37öC-on, 4 órán át reagálhatjuk. A reakció után a lemezt centrifugáljuk és a felüiúszóban a *lCr mennyiségét γ— számlálóval mérjük. A spontán felszabadult *1Cr mennyiségét ugyanezzel a művelettel határozzuk meg, azonban az effektorsejtoldat es az antitestóidat helyett csak tapkozeget használunk és mérjük a SiCr mennyiségét a felüiúszóban. Az összes felszabadult “'lCr mennyiségét ugyanilyen művelettel, határozzuk meg, azonban az antitest-oldat helyett csak tápközeget alkalmazunk és az effektorsejt-oldat helyett 1 N sósavat adagolunk, és mérjük a ilCr -mennyiségét a felüiúszóban.
Az ADCC aktivitást a fenti (XX) egyenletből, számoljuk ki.
Az eredmények a 6. ábrán láthatók. Amint a 6. ábrán bemutatjuk a háromféle anti-hlL-SRo CDR-grafted antitest között a YB2/0-hIL-5R CDR antitest mutatja a legnagyobb ADCC aktivitást, majd ezt követi a CHO/d-hlL-öR CDR antitest és NS0~hIL-5.R CDR antitest ebben a sorrendben. Hasonlóan a 2. példa 2. pontjának eredményéhez a fenti eredmények azt mutatják, hegy az antitestek
ADCC aktivitása nagymértékben változik az előállításukban felhasznált állati sejt típusától függően. Továbbá mivel az YB2/0 sejt által termelt antitestek mutatják, a legnagyobb ADCC aktivitást a két fajta humanizált antitest esetében, beigazolódott, hogy nagy .ADCC aktivitást mutató antitest termelhető YB2/0 sejt felhasználásával.
3. Antí-hIL-5Ra CDR-grafted antitest ín vivo aktivitásának mié r t é ke j. ése
Abból a célból, hogy a 3. példa 3. pontjában kapott három, fajta tisztított antÍ-hIL 5Ro CDR-grafted antitest in vivő aktivitását kiértékeljük a Macaca xaseioula.rís egy hIL-5-indukált eozinofil növekedési modelljében a gátlás! aktivitást mérjük az a.i.áooz eljárás szermt.
Macaoa fasefou.Iarrs-nak a dorzális bőr alá hIL-5-t (előállítási eljárást a WO 97/10354 közzétételi irat ismerteti) adagolunk 1 gg/kg dózisban, az első napon kezdve, naponta egyszer, összesen 14 napon keresztül. Mindegyik anti.-hIL.-5Ro: CDR-grafted antitestet intravénásán adagoljuk 0,3 mg/kg dózisban, egy órával a hIL-5 adagolása előtt a nulladik napon. Egy antitestet-nemkapó csoportot alkalmazunk kontrollként. Az antitest-adagolt csoportok mindegyikében három Macaca fase.ieula.ris állatot (No. 301, No. 303, No. 4 01, No.. 4 02, No. 403, Ne. 501, No. 502 és No. 503) és az antítesret-nem-kapő csoportban két állatot alkalmazunk (No. 101 és No. 102). Kezdve 7 nappal az adagolás megkezdése előtt és 42 nappal az adagolás utánig folytatva a vena
saphenaból vagy vena f©morálisból vért gyűjtünk és az eozinofilek számát 1 pl perifériás vérben mérjük.
Az eredményeket a /. ábrán .mutatjuk be.. Amint a /.. ábrán látnato a vér eozinofil növekedése abban a csoportban, amelynek YB2/0hIL-5R CDR antitestet adagoltunk, teljesen gátolt. Másrészről teljes gátlást találtunk egy állat esetében a CHG/d-hIL-5R CDR antitestet kapó csoportból, de a gátlás! aktivitás nem volt kielégítő két állatban. Abban a csoportban, ahol NSO-hIL-5R CDR antitestet adagoltunk, nem találunk teljes gátlás! aktivitást és a hatása nem kielégítő.
A fenti eredmények azt .mutatják, hogy .az antitestek ín vivő aktvitása nagymértékben változik az előállításukban felhasznált állati sejt típusától függően. Továbbá mivel pozitív összefüggést találtunk az anti-hIL-5Ra CDR-grafted antitest ín vivő- aktivitásának mértéke és a 4. példa 2. pontjában ismertetett ADCC aktivitás mértéke között, ez azt mutatja, hogy az ADCC aktivitás mértéke rendkívül fontos- az aktivitás expresszálódásához.
Zi fenti eredmények alapján várható, hogy egy erős ADCC aktivitással rendelkező, antitest hasznos a különféle betegségek kli nikai területén emberben.
5. példa
Az ADCC aktivitást növelő cukorlánc analízise
1. 2-ami no-pir.idin-jelzett cukorlánc __ölőál11tása (PA-kezelt
.a ;C.ien taiaxmanv szerinti humamzaxt antitestet sósavval sav-hldrolizáljuk a sziálsav eltávolításához. A sósavat teljesen
eltávolítjuk., majd, a cukorláncot a proteinről hidrazinolízissel leha.sitjuk [Method of Enzymology 83, 283 (1982) ] . A hidrazint eltávolítjuk és vizes ammónium-acetát oldat és ecetsav-anhidrid hozzáadásával .V-acetilálást kivitelezünk.. Liofilizálás után 2amino-piridínnel fluoreszcens jelölést végzünk fű. Biochem. 95, 197 (1984)].. A fluoreszcens-jelölt cukorláncot (PA-kezelt cukorlánc) -a szennyeződésektől Surperdex Peptide HR 10/30 oszloppal (gyártó: Pharmacia) elválasztjuk. A cukorlánc frakciót dúsító centrifugával szárítjuk és tisztított. PA-kezelt cukorláncként alkalmazzuk.
2... Tisztított anti-hlL-SPo CDR-grafted antitest PA-kezelt cukorláncának reverz fázisú HPLC analízise
Az 5. példa 1. pontjában ismertetett eljárás szerint, a 3. példában előállított különféle anti-hIL-SRo CDR-grafted antitesteket PA-kezelt cukorlánc kezelésnek vetjük alá és CLC-ODS oszloppal (gyártó: Shimadzu) reverz fázisú HPLC analízist kivitelezünk. Felesleges mennyiségű a-L-fukozidázt (szarvasmarha veséből származó, gyártó: CIGNA) adunk a PA-kézélt cukorlánc emésztésre (+37 °C, 15 óra), majd a termékeket reverz fázisú HPLC-vel (8. ábra) analizáljak. Beigazolódott, hogy az aszparagín-kapcsolt cukorlánc 30-80 percig eluálódik PA-kezelt cukorlánc standard (gyártó: Taka.ra Shuzo) felhasználásával. Azon cukorláncok arányát, amelyek reverz fázisú HPLC elúciós helyzete az <x-L fukozidáz emésztés miatt változott, kiszámoltuk. Az eredményeket
3. Tisztított an.ti-hIL-5Ra CDR-grafted antitest mnoszscharid készítményének analízise
Az YB2/0 sejt, NSO sejt és CHO/d sejt által termelt antihIL~5Rcf CDR-grafted antitestek cukorláncaít monoszacharidokk.á hidrolizál jut triflu-or-ecetsavval történő sav-hidrolízissel és a monoszacharid készítmény analízisét BioLC (gyártó: Díonex) felhasználásával kivitelezzük.
iV-qlikozid-kapcsolt cukorláncok kozott három mannóz-egység van e-qv cukorláncban a komplex típusú A— gliKozio-kapoao.it cukor láncokoan.. .A monoszacharidok. relatív aranyát, srasiysKst a mannoz számát 3-nak véve számolunk ki, a 2. táblázatban mutatjuk be.
2. táblását
iAntitast- itermelő sejt Ά Μ1 Glc NAc Gál | Man i—...... í a é H··'· c írt Γ; is»- a ! ö! ·. c. ·. ifcti-i (%)*
)¥B2/ 0 ΐ 0,60 4, Q >< 0,30 J 3,00 I 42, 27
|.NS0 ..... 1, u ο Λ 94 Q f-'.é ) a na J $ z dl
|CHO/dhFr 0,85 0? 5 9 0,49 j 3,00 J X 73
|cHO/dhFr 0,91 3, is Ω 0,27 (.............3,00...... .....J...........25, Ί 3
Antitest-koncentráció: 0,01 ug/ml
Mivel a fukóz relatív aránya a következő sorrendet követi:
YB2/0<CHO/d<NS0, az YB2/0 sejt által termelt antitestben termelt cukorlánc mutatja a legkisebb fukóz-tartalmat, amint a jelen bemutatjuk.
4. CHO/dh.fr ~ sejt által termelt antitest cukorlánc-analírise
PA-keselt cukorláncokat CHO/dhfr sejt által termelt tisztított anti-nlL-SRö CDR-grafted antitestből állítjuk elő és reverz fázisú HPLC analízist kivitelezünk CLC-ODS oszlop (gyártő: Shimadzu) felhasználásával (9. ábra). A 9. ábrán a 35-45 perc elúciós idő megfelel a fukózza.1. nem-rendelkező cukorláncoknak és 45-90 perc elúciós idő a fukózt-tartalmazó cukor!áncoknak felel meg. Hasonlóan az egér mieloma NSO sejt által termelt antitest esetében, a CHO/dhfr sejt által termelt anti-.hIL-5Ra CDR-grafted antitest kevesebb fukóz-mentes cukorláncot. tartalmas, mint a patkány mielóma ¥82/0 sejt által termelt antitest.
6. példa
Nagy ADCC aktivitású antitest elválasztása
A patkány mieloma. YB2/Q sejt által termelt anti-hIL-.5Ra CDRgrafted antitestet lektin-oszlopot alkalmazva elválasztjuk, amely a fukózzal nem-rendelkező· cukorláncokhoz kötődik. A HPLC-t LC-6A felhasználásával kivitelezzük (gyártó: Shimadzu) 1 m.l/perc átfolyási sebességnél szobahőmérsékleten, mint oszlophőmérsékleten. Miután az oszlopot 5Q mM Tris-szulfát pufferrel (pH 7,3} kiegyensúlyozástuk, a tisztított anti-hXL-5Ra CDR-grafted antitestet beinjektál juk, majd 0,2 M o-metil -mannozi.d (gyártó: Nacalal Tesque) lineáris sűrűség gradienssel (60 perc) elváljak. Az anti-hIL-őRa CDR-grafted antitestet nem-adszorbeálódó és adszorbeálódó frakciókra választjuk szét. Amikor a nemadszorbeálódó frakcióból, és az adszorbeálódó frakció egy részéből. mintát veszünk és a kötődési-aktivitásukat a hIL-5Rn-hes mérjük, hasonló kötődési-aktivitást mutatnak (IDA. ábra). Amikor az ADCC aktivitást mérjük, a nem-adszorbeálódó frakció erősebb ADCC aktivitást mutat (1G0-1000-szeres) , mint az adszorbeálódó frakció része (1QB. ábra). Továbbá, a nem-adszorbeálódó frakcióból és az .adszorbeálódó frakció egy részéből PA-kezelt cukorláncokat állítunk elő és reverz HPLC analízist kivitelezünk CLC-ODS oszlop felhasználásával (gyártó: Shimadzu) (11. ábra). A nemadszorbeálódó frakcióban egy a fu.kóz-me.ntes cukor láncokhoz kötődő antitest van főként jelen és az adszorbeálódó frakció egy részében egy a fukó-zzal rendelkező cukorláncokhoz kötődő antitest
Ί. példa
Άκ α-1,6“fukéz~mentes cukorláncot különböző arányban tartalmazó anti-GD3 kiméra antitest aktivitásának kiértékelése
1. Az «“1,6-fukóz-mentes cukorláncot különböző arányban tarta 1 mazó anti-GD3 kiméra antitestek előállítása példa 2(1) pontjában ismertetett eljárás szerin
GD3 kiméra antitest termelésre képes YB2/0 sejtből szárma transzformált kiónokat állítunk elő·. A. YB-2/0 sejtből származó transzformált klónokból antitesteket állítunk elő és lot 1, lot 2 és lot 3-nak nevezzük őket. Mindegyik a lot 1, lot 2 és lot 3 anti-GD3 kiméra antitestekhez, kötődő cukorláncot a 1.1(6) példa eljárása szerint analizáltuk és azt találtuk, hogy az «-1,6fukóz-mentes cu körláncok. aránya 50%, 45% illetve .28%. Az alaobxakban ezekre a mintákra ügy hivatkozunk, mint anti-GD3 kiméra antitest (50%), anti-GD3 kiméra antitest (45%) és antí-GD3 kiméra antitest (29%).
Az 1. példa 2(2) pontjában előállított CHO/DG44 sejtből származó anti-GD3 kiméra antitest, cukorlánoait a 11 (6) példa eljárása szerint analizáltuk és azt találtuk, hogy a a-1,6-f.ukózmentes cukorláncok aránya 7%.. Az alábbiakban a mintára úgy hivatkozunk, mint anti-GD.3 kiméra antitest (7%).
Az anti-GD3 kiméra antitest (45%)-t és anti-G)D3 kiméra antitest (7%)-t az alábbi arányban elegyítjük: anti-GD.3 kiméra antitest (4.5%) :anti-GD3 kiméra antitest (7%) = 5:3 vagy 1:7. A minták cukorláncait a 10(6) példa eljárása szerint analizáljuk és azt találtuk, hogy ct-1, β-f ukó-z-mentes cukorláncot 24% és 13% arányban tartalmazó mintákat állítottunk elő. Az alábbiakban ezekre úgy hivatkozunk, mint anti-GD3 kiméra antitest (24¾} és anti-GD3 kiméra antitest (13%).
Mindegyik minta cukoraanc analízisének ereoményet a Íz. ábrán ffiütaz.ak ds. Az u—a,b—runoz—mentes cukorlancox arányát úgy adjuk meg, mint két cukorlánc analízis eredményének átlagérté két
2. Kötő-aktivitás kiértékelése a GD3-hoz _(EI>LSA)
A 7. példa 1. pontjában, előállított, nt-1,6-fukóz-mentes cukor láncokat különböző arányban tartalmazd, hat fajta a.nfci~GD3. kiméra antitest a GD3~val szembeni kötő-aktivitását (gyártó: Snow Brand Milk Broducts) az 1. példa 3. pontjában bemutatott ELXSA-val mérjük. Ennek eredményeként a hat fajta anti-GD3 kiméra antitest mindegyike szinte azonos GD3-kötő-aktivitás mutat, amint a 13. ábrán bemutatjuk és azt találtuk, hogy a o~l,6~ fűkor-mentes cukorláncok aránya az antitest antigén kötő a kt i. v .i t a s a t nem be z o 1 ya s o 1 j a.
3. Az ADCC aktivitás kiértékelése humán melanoma sejtvonalon
Az anti-GD3 kiméra antitestek ADCC aktvitását G-361 humán melanoma sejtvonalon ÍA.TCC CRL 1424) az alábbiak szerint mérjük.
(j./ t’eisej zus zp&iz j.q ezoa a.i1 tasa
G-361 humán melanöma sejtvcnal 1x10° sejtet állítunk elő, 3,7 MBq ekvivalens Nad'CrCg radioaktív anyagot adunk hozzá és az elegyet 37*C-on, 1 órán át reagáltakjuk a sejtek rádióizotőpos
A reakció után a sejt-szuszpenziót egy tápközegben háromszor átmossuk és centrifugáljuk, a táokőzeoben újraszuszpendáÍjuk, májd 4”C-on,
percig jégben inkubáljuk a radioaktív anyag spontán disszociációjához, A centrífugálás után, a sejteket ml tápközeggel 2x10” sejt/ml-re beállítjuk és ezt a szuszpenzíót célsejt-szuszpenzióként alkalmazzuk.
(2J Human sfie)cr.o.rse'/t -szuszpőJízio előd 21. tasa
Egy egészséges emberből. SO ml vénás vért gyűjtünk és 0,5 ml heparin-nátriumma1 (gyártó: Takeda Pharmaceutical) óvatosan elegyítjük. Az elegyet centrifugáljuk (800 g, 20 perc), hogy egy mononukleáris, sejt-réteget válasszunk el Lymphoprep (gyártó: AXIS SHIELD) alkalmazásával a gyártó utasításai szerint. A sejteket egy tápközeggel háromszori centrifugálással (1200 ford.,. 5 perc) mossuk, majd 2x10* sejt/ml sűrűségben a tápközegben, újraszuszpendál.juk és ezt a szuszpenziót használjuk humán efféktorsejt”szuszpenzióként.
(3} ADCC aktivitás mérése
9-6-lyukú U-al.akü mélyedésekkel, ellátott lemez (gyártó: Falcon) minden egyes lyukába 50 pl. fenti, (1) pont szerint előállított célsejt-szuszpenzíót (Ixlö4 sejt/lyuk) osztunk szét. Ezután 100 pl fenti (2) pont szerint előállított effektcrsejtszuszpenziót adunk hozzá (2x10 sejt/lyuk, az effektorsejtek és célsejtek aránya 20:1). Ezt követően a lyukakhoz mindegyik antiGD3 kiméra antitestet hozzáadjuk egy 0,0005-5 pg/ml végkoncentracrooan, majd 3.·· C—on, 4 oran at reagaj-tanjuK. A reakció után a lemezt centriruqaijuk es a teluluszónán a ~tr mennyiségét y-szám.lálóval mérjük. A spontán felszabadult. :Cr mennyiségét ugyanezzel a művelettel határozzuk meg, azonban a humán effektorsejt-szuszpenzió és az antitest-oldat helyett csak tápφφ«» ♦·♦· φφ * Φ ·Φ * Φ * * χ φ X *ΦΦ ♦ Φ«Χ φ φ Φ φ φ Φ X Φ Φ
Φ* Φ-Φ *<Φ ΦΦ asználunk és mérjük a '5:Cr mennyiségét a felülúszóban.
Az összes felszabadult °ACr mennyiségét ugyanilyen művelettel ha tározzuk. meg, azonban az antitest-oldat helyett csak tápközeget alkalmazunk és a humán effektorsejt-szuszpenzió helyett 1 mol/1 sósavat adagolunk, és mérjük a 3iCr mennyiségét a felülúszóban. A citotoxikus aktivitást (%) a (Ili egyenletből számoljuk ki.
Az cr-1,6-fukóz-mentes cukor láncokat különböző arányban tartalmazó, hat fajta anti-GD3· kiméra antitest ADCC aktivitás mérésének eredményeit a 14. és 15. ábra mutatja különböző koncentrációknál (ö, 0005 - 5 pg/ml) két egészséges donor (A és S) effektorsejtjelt alkalmazva. Amint a 14. és 15. ábrán bemutatjuk az anti-GDC kiméra antitestek ADCC aktivitása, mindegyik antitest koncentráció esetében növekedési tendenciát mutat az a-.1,6fukóz-mentes cukorláncok arányával arányosan. Az ADCC aktivitás csökken, amikor az antitest koncentráció alacsony. 0,05 ug/ml antitest koncentrációnál az antitest, amelyben az n-1,6-fukózmentes cukorlánc aránya 24%, 29%, 45% vagy 50% szinte azonos erősségű ADCC aktivitást mutat, de az ADCC aktivitás alacsony volt az antitest (13%) vagy (7%)-ban. ahol az a~l, 6~fukóz-mentes cukorlánc aránya kevesebb, mint 20%. Ezek az eredmények azonosak voltak, amikor az effektorsejt donort megváltoztattuk.
8. példa
Az <x-l,6-tűkor-mentes cukorláncot különböző arányban tartalmazó anti~CCR4 kiméra antitest aktivitásának kiértékelése
Ant.i-CCR4 kiméra antitestet stabilan termelő sejtek előálli-
Azokat a sejteket, amelyek képesek anti-GD3 kiméra antitestet stabilan termelni, az anti-CCRá kiméra antitesthez megszerkesztett pKANTEX2160 tandem expresssiós vektor felhasználásával állítjuk elő a WQ 01/64754 közzétételi iratban ismertetettek szerint.
(1) Anti test-termelő sejt előállítása patkány mieloma FBú/í? sejt felhasználásával pg pKANTEX2160 anti-CCR4. kiméra antitest expresszién vektort 4x10c patkány mieloma /32/Q sejtekbe (ATCC CRL-1662) elektroporácíóval (Oyt ©technology 3, 133 (1990)] bevezetünk, majd a sejteket 40 ml Hybridoma-SFM-FBS(S)-ben [10% FSS-t (gyártó: PAA Laboratories) tartalmazó Hybridoma-SFM tápközeg (gyártó: Invitrogen) ] szuszpendálj-uk és egy 96-lyukú tenyésztő lemezen (gyártó: Sumitomo Bakelite) lyukanként 200 μΐ mennyiségben szétosztjuk. 5% CO?--tartalmú inkubátorban 37°C-on, 24 órán át tenyésztjük, majd 1 mg/ml G413-t adunk hozzá és ezt követően 1-2 hétig tenyésztjük. A lyukakból a tenyészet felülúszőját, amelyben G418 rezisztenciát mutató transzformáns kolóniák képződtek és a kolóniák növekedése figyelhető meg, eltávolítjuk és a fe~ lülúszóban az anti~CCR4 kiméra antitest antigén-kötő aktivitását ELISA.-val mérjük, amelyet a 8. példa 2. pontjában mutatunk be.
A transzformánsokat tekintve azokban a lyukakban, ahol a tenyészet felülúszójában anti-CCR4 kiméra antitest-termelést figyeltünk meg, acélból, hogy az antitest-termelés mennyiségét növeljük egy DHFR gén-amplifíkációs rendszer alkalmazásával, a transzformánsok mindegyikét 1 mg/ml G418-t és 50 nM DHFR inhibitor MTX-t (gyártó: SIGMA) tartalmazó Hyhridoma-SFX-FBS(5) tápta4 *f
lajban szuszpendáljuk 1-2x10 sejt./ml sűrűségben, és a szuszpe.
ziót egy 24-lyukú lemezen (gyártó: Greiner) lyukanként 1 ml mennyiségben szétosztjuk. Az 50 nM MTX-rezisztenciát mutató transzformánsokat 5% CCt-t tartalmazó inkubátorban, 37MC-on, 1-2 hétig történő tenyésztéssel indukáljuk. A tenyészet felülúszójában, a lyukakban, ahol a transzformánsok növekedését figyeltük meg, az antl~CCR4 kiméra antitest antigén-kötő aktivitást EL.T.SAval mérjük, melyet a 8. példa 2. pontjában mutatunk be.
Tekintve a transzformánsokat a lyukakban, ahol a tenyészet felülúszöjában anti-CCR4 kiméra antitest-termelést figyeltünk meg, az MTX-koncentrációt. ugyanezzel a módszerrel növeljük, és azokat a transzformánsokat, amelyek 200 nM MTX-f tartalmazó Hybridoma-SFM-FBS(5) táptalajban növekedésre képesek és nagy mennyiségű anti-CCR4 kiméra antitest-termelésre képesek, végül megkapjuk.. A kapott transzformánsokból limitáló kétszeres hígítással. egyetlen sejtet (kiónt) hozunk létre és a kapott klónozott sejtvonalat KM2760 #58-35-16-nak nevezzük.. Ebben az esetben a 9. példában bemutatott a-1,6-flukozil-transzferáz gén transzkripciós termékének meghatározására szolgáló eljárás felhasználásával egy relatív kis mennyiségű transzkripciós terméket termelő sejtvonalat szelektálunk és használunk alkalmas sejtvonalként ..
(2) Antitest-termelő sejt előállítása CHO/DG44 sejt felhasználásává 1 pg PKANTEX2160 anti-CCR4 kiméra expressziős vektort 1,6x10* CHO/DG44 sejtekbe elektroporációval ICytotechnology 3, 13.3 (1990) 1 bevezetünk, majd a sejteket 10 ml iM'DM-dFBS (10) ·
HT(l)~ben. [10% dFBS-t (gyártó: Invitrogen) és. 1 x koncentrációjú HT kiegészítést tartalmazó IMDM tápközeg (gyártó: Invitrogen)l szuszpendáljuk és egy 96-lyukú tenyésztő lemezen (gyártó: Iwaki Glass) lyukanként 100 μΧ mennyiségben szétosztjuk. 5% CO?.~ tartalmú inkubátorban 37°C-on, 24 órán át tenyésztjük, majd a tápközegst ÍMDM-dFBS(10}-re cseréljük (10% dializált FBS-t tartalmazó IM'OM tápközeg) és ezt követően 1-2 hétig tenyésztjük. A lyukakból a tenyészet felülúszóját, amelyben HT-független növekedést mutató transzformáns kolóniák képződtek és a kolóniák növekedése figyelhető- meg, eltávolítjuk és a felül úszóban, az antiCCR4 kimére antitest antigén-kötő aktivitását ELISA-val mérjük, amelyet a 8. példa 2. pontjában mutatunk be.
Tekintve a transzformánso-kat a lyukakban, ahol a tenyészet felűlúszójában anti~CCR4 kiméra antitest-termelés figyelhető meg, acélból, hogy az antitest-termelés mennyiségét növeljük, egy DHFR gén-amplifikációs rendszert alkalmazva, a transzé ormánsok mindegyikét egy 50 n.M MTX-t tartalmazó IMDMdFBS(10) tápközegbe szuszpendáljuk 1-2x10'' sejt/ml sűrűségben és a szuszpenziót egy 24-lyukú, lemezen (gyártó: Iwaki Glass) lyukanként 0,5 ml mennyiségben szétosztjuk. Az 50 nb MTX rezisztenciát matató transzéormánsokat 5% GOe-tartalmú inkubátorban, 37*Con, 1-2 hétig történő tenyésztéssel indukáljuk. Tekintve a transzéormánsokat a lyukakban, ahol a növekedésük megfigyelhető, az MTX-koncentrácíót 200 nM-ra növeljük és azokat a transzformánsokat, amelyek a 200 nM MTX-t tartalmazó IMüM-dFBS(10) tápközegben növekedésre képesek és nagy mennyiségű anti-CCRá kiméra antitest-termelésre képesek, megkapjuk. A kapott
transzformánst 5-0,3-nak nevazzük el. Ebben, az esetben a 9. pél dában bemutatott n-1,6-flukozil-transzferáz gén transzkripciós termékének meghatározására szolgáló eljárást, felhasználásával egy relatív kis mennyiségű transzkripciós terméket termelő sejtvonalat szelektálunk és ezt. használjuk alkalmas sejtvonalként.
2. Antitest kötő-aktivitás CCR4 részleges pepiidhez (ELISA)
1. vegyűletet (SEQ ID NO: 25} úgy választjuk ki, mint egy humán CCR4 extracelluláris régió pepiidet, amely kepes az antiCCR4 kiméta antitesttel reagálni. Ahhoz, hogy ezt a pepiidet ELISA-val. történő aktivitás mérésében alkalmazzuk, egy BSA-vel (szarvasmarha szérum albumin) alkotott konjugátumot (gyártó: Kanalai Tesque) állítunk elő az alábbi módon és antigénként alkalmazzuk. Ez az eljárás a következő: 900 ml, 10 mg BSA-t tartalmazó PBS oldathoz keverés közben, botkeverőt alkalmazva, 100 ml, 25 ma/ml SMCC—t (4—(áí-mta leírni do-met.il) -ciklohexan-1— karbonsav~hÍ-hidroxíSzukcin.imid-é.sz~tex} (gyártó: Sigma) tartalmazó DMS'O oldatot adunk cseppen ként, majd 30 percig óvatosan keverjük. A reakciooldat i m.i részletét gelszu.rés osziopnoz, mint pl. NAP-10 oszlop vagy hasonlók használjuk, melyet 25 ml PBS—vei kiegyensúlyoztunk, majd 1,5 ml PBS-vel eluáljuk és a kapott eluáiumot öSA— SMCC oldatként alkalmazzuk (BSA konoe.ntrac.iot Ag$o mérés alapján számítjuk}. Ezt kővetően 0,u mg 1. vegyülethez 250 ml PBS'-t adunk és 250 ml DMF hozzáadásával teljesen feloldjuk és botkeverővei történő keverés közben HSA-SMCC oldatot adunk hozza, majd 3 órán át óvatosan keverjük. A reakcióelegyet PBS-vel szemben 4öC-on, egy éjszakán át díalizáljuk, majd nátrium-azidot
adunk hozzá 0,05% vég koncentrációban és az elegyek 0,22 » szűrőn átszűrjük, hogy ezt az oldatot BSA-1. vegyület oldatként alkalmazzuk.
Az előállított konjugátumot 96-lyukú EIA lemezen (gyártó: Greiner; 0,05 pg/mi koncentrációban és lyukanként 50 pl mennyiségben szétosztjuk és 4öC~on egy éjszakán át inkubálj.u.k az adóésióhoz. Mindegyik lyukat PBS-vel kimossuk, majd lyukanként 100 μΐ mennyiségben 1% BSA-PBS-t adunk hozzá és szobahőmérsékleten hagyjuk reagálni a megmaradt aktív csoportok blokkolására. Mindegyik lyukat 0,05% Tween 20-t tartalmazó PBS-vel (az alábbiakban úgy hivatkozunk rá, mint Tween-PBS’j kimossuk és 1% BSA-PBS-vel OOOOx hígított peroxidáz jelzett kecske anti-humán IgG (H & L) antitest oldatot (gyártó: American Qualex) 50 μΐ/lyuk mennyiségben szétosztunk, mint egy másodlagos antitest oldat, majd a reakciót szobahőmérsékleten 1 órán át kivitelezzük. A reakció és azt követő Tween-PBS-vel történő kimosás után lyukanként 50 pl mennyiségben ABTS szubsztrát oldatot adunk hozzá a szín kifejlesztésére, majd 20 perccel később a reakciót 50 ul/lyuk mennyiségű 5% SDS oldat hozzáadásával leállítjuk. Ezt követően az abszorbanciát ODais-nél mérjük. A 8. példa 1. pontjában kapott anti-CC.R4 kíméra antitest mutat kötő-aktivitást a CCRá-hez.
3. Anti-CCRi kiméra antitest tisztítása (1) YB2/0 sejtekből származó anti test-termelő sejtek tenyésztése és az antitestek tisztítása
A 8. példa 1(1) pontjában kapott anti-CCRé kiméra antitestexpxesszáló transzformált KM2760 t 58-35-16 sejtklónt 200 nM
MTX-t és 5% Daígo-féle GF21-t (gyártó: Wako Pure Chemical Industries) tartalmazó Hybrídoma-SFM (gyártó: Invitrogen) tápközegben. szuszpe nd áljuk 2x10 sejt/ml sűrűségben és süllysztetf, záratott tenyésztést végzünk egy centrifuga palackban (gyártó: Iwaki Glass) konstans 37 °C kamra.h.őmérsékleten. 8-10 napos tenyésztést követően az anti~CCR4 kiméra antitestet a tenyészet felülúszójából egy Prosep-A oszlop és gélszűrés (gyártó: Millipore) alkalmazásával tisztítjuk. A tisztított antí-CCR4 kiméra antitestet KM2?6ö-l~nek neveztük el.
(2) CHŰ/DG44 sejtekből származó antitest-termelő sejtek tenyésztése és az antitestek tisztítása
Az 8. példa 1(2) pontjában kapott antí-CCB.4 kiméra antitesttermelő transzformált 5-03 sejtklónt 5% CO?-t tartalmazó inkubátorban 37cC-on, IMEM-dFBS (10) tápközeget alkalmazva. 182 cmf-es tenyésztő lombikokban (gyártó: Greiner) tenyésztjük. Amikor néhány nap után a sejtsűrűség elérte az összefolyást, a tenyészet felülúszóját elöntjük és a sejteket 2.5 ml PBS-puffezre! mossuk, majd 35 ml EXCELL 301 tápközeggel (gyártó: JRH) elegyítjük. 5% CO.s-tartalmú inkubátorban, 37,;‘C-on 7 napig tenyésztjük és a tenyészet felülúszóját kinyerjük. Az anti-CCRé kiméra antitestet a tenyészet felülúszójáböl egy Prosep-A (gyártó: Píillipore) oszlop alkalmazásával tisztítjuk a gyártó utasítása szerint. A tisztított anti-C'CR4 kiméra antitestet KM3060 kiméra antitestnek neveztük el.
Amikor a KM2760-1 és a KM3060 kötő-aktivitását a CCR4-.hez ELISA-val mérjük, ezek azonos kötő-aktivitást mutatnak.
Í .»* *:;··$♦ -$Φ — ' - φ ψ i ψ <·· » ♦ * *** » « 9 » * * * & %
Φ> βΦ* ** Λ ftS
4. A tisztított anti-CCR4 kiméra antitestek analízise
Egy is mert eljárás szerint (.Nature 2 2 i f útO (19/0)j ennek a példának az 1. pontjában kapott, különböző állati sejtekben előállított és ezekből tisztított két fajta. anti-CCR4 kiméra antitest 4 pg-ját SDS-PAGE-nek vetjük alá a molekulatömeg és tisztasági fok analizálására. Mindegyik tisztított anti--CCR4 kiméra antitest esetében egyetlen kb. 150 Kd molekula.tömegű sávot találunk nem-redukáló körülmények között, és két kb. 50 Kd és kb. 25 Kd sávot találunk redukáló körülmények között. A molekulatömegek majdnem megegyeznek az antitest H-láncának és L-láncának oDNS nukleotid szekvenciájából levezetett molekulatömegekkel (H-lánc: kb. 49 Kd, L-lá.nc: kb. 23 Kd, teljes molekula: kb, 144 Kd) és egyezésben vannak azokkal a közleményekkel, amelyek azt állítják, hogy az IgG antitest kb. 150 Kd molekulatömegű nem-redukáló körülmények között és kb. 50 Kd molekulatömegé H-láncokká és kb. 25 Kd molekulatömegű L-láncokká degradálódik redukáló körülmények között, a molekulában lévő S-S kötés hasadásának köszönhetően [Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Chapter 14 (1995); Monoclonal. Antibodies: Principles and Practice, Academic Press Limited -(1996}}, így azt igazoltuk, hogy mindegyik anti-O' kiméra antitest oly módon expresszáés tisztitódott., mint a valós szerkezettel rendelkező antitest molekula.
5. Az o-l, 6-fukóz-mentes cuko-rláncot különböző arányban tartal mazó an.tí~CCR4 kiméra antitest előállítása
A 8.. példa 3).:.) pont j a hun eioali ított, jb2/0 sejt end ő.t szar— mazó KM2760-1 anti~CCR4 kiméra antitesthez és a 8. példa 3(2) pontjában előállított, CHG/DG44 sejtből származó KM3Q60 antiCC.R4 kiméra antitesthez kötődő cukor láncokat, a 10(6) példa eljárása szerint analizáljuk. A KM276Q-ban és KM3060-ban az a-1,6fukóz-mentes cukorláncok aránya 87% illetve 8%. Itt a mintákra úgy hivatkozunk, mint antí-CCR4 kiméra antitest (87%) és antiOCR 4 kiméra antitest (8%).
A.z anti-CCRí kiméra antitest (87%)-t és anti-CCRá kiméra antitest (8%)-t az alábbi arányban elegyítjük: anti-CCR.4 kiméra antitest (87%) : antí~CCR4 kiméra antitest (8%) - 1:39, 16;67, 22:57, 32:47 vagy 42:37. Ezen minták .cukor lánca it a 10(6) példa eljárása szerint analizáljuk. Az o-l,6-fukóz-mentes cukorláncok aránya 9%, 18%, 27%, 39% és 46%. Itt ezekre a mintákra úgy hivatkozunk, mint antí-CCR4 kiméra antitest (9%), anti-CCR4 kiméra antitest (18%), anti-CCR4 kiméra antitest (27%), anti—CCR4 kiméra antitest (39%) és anti~CCR4 kiméra. antitest (46%) .
Mindegyik minta cukorlánc analízisének eredményét a 16. ábrán mutatjuk be. Az o-l, 6-.tükóz~men.tes· cukorláncok arányát úgy mutatjuk be, mint a két cukorlánc analízis eredményének átlag
6, Kötő-aktivitás kiértékelése a CCR4. részleges pepiidhez (ELISA)
A 8. példa 5. pontjában előállított, különböző o-l,6-fukózmentes cukorláncot tartalmazó, hat fajta antl-CCR4 kiméra antitest kötő-aktivitását a CCR4 részleges pepiidhez a 8. példa 2. pontjában ismertetett eljárás szerint mérjük.
7. AOCC aktivitás- kiértékelése humán CCR4-t nagy mértékben expresszáló sejtvcnalon
Az anti-CCR4 kimére antitestek ADCC aktvitását egy humán CC.R4~t nagy mértékben expresszáló sejtvonal CCR4/EL-4 sejttel szemben íWO 01/64754» az alábbiak szerint mérjük, fi) Céísejt-szuszpenzző előállítása
Egy humán melanóma CCR4-t expresszáló sejtből, a CCR4/EL-4 sejtből 1,5κ10δ sejtet állítunk erő és 5,55 MBq ekvivalens Na/^CrOí radioaktív anyagot adunk hozzá és az ©legyet 37°C-on, 1,5 órán át reagáltatjuk a sejtek rádióizotópos megjelöléséhez. A reakció után a se jt-szus-zpenziót egy tápközegben háromszor átmossuk és centrifugál, juk, a táp közegben uj raszuszpendál j uk, majo: 4°C-on, 30 percig jégben inkubáljuk a radioaktív anyag spontán disszociációjához. A centrifugális után a sejteket 7,5 ml tápközeggel· 2x1ο0 sejt/ml-re beállítjuk és ezt a szuszpenzíót célsejtsz.uszpensióként alkaImazzuk.
f 2!) ΗιΐΐίΐβΓί e.t .text or .sej t --szusz,penzió eioa 1 r z tasa
Egy egészséges emberből 60 ml. vénás vert gyűjtünk és 0,6 ml heparin-nátrlummal (gyártó: Shimizu Pharmaceutical) óvatosan elegyítjük. Az elegyet centrifugáljuk (800 g, 20 perc) , hogy egy mononukleáris sejt-réteget, válasszunk el Lymphoprep (gyártó: AXlb SíiiEuD} ai&aamazasavai a gyártó utasításai szerint. A. sej — φφ » * S' $ 9 $
Φ.
* φ Φ « β ’ φφ φβΦ <£ φφ teket egy tápközeggel háromszori centrifugáiLássál (1400 ford/perc, 5 perc) mossuk, majd. 5x10* sejt/ml sűrűségben a tápközegben uj raszuszpenda1juk es- ezt a. szuszpenziot nasznaig uk numán eífektorsejt-szuszpenziöként, (3) ADCC aktivitás mérése .9o-lyukú U-alakú mélyedésekkel ellátott lemez (gyártó: Falcon; minden egyes lyukába 50 pl fenti, (.1) pont szerint előállított cél sej t-szus-zpenziót (IxiCF sejt/lyuk) osztunk szét. Ezután 100 pl fenti (2) pont szerint előállított effektorsejtszuszpenziót adunk hozzá (5x10° sejt/lyuk, az effektorsejtek és célsejtek aránya 50:1). Ezt követően a lyukakhoz mindegyik antiCCR4 kiméra antitestet hozzáadjuk egy 0,0001-10 ug/ml végkoncentrációban, majd 37*C-on, 4 órán át reagáltakjuk. A reakció után, a lemezt centrifugáljuk és a felülúszóban a °lCr mennyiségét γ-számlálóval mérnök. A snontán felszabadult °°Cr mennviséaét ugyanezzel a művelettel határozzuk, meg, azonban a humán effektorsejt-szuszpenzíó és az antitest-oldat helyett csak tápközeget használunk és mérjük a blCr mennyiségét a felulüszöban. Az összes felszabadult slCr mennyiségét ugyanilyen művelettel határozzuk meg, azonban az antitest-oldat helyett és a humán effektorsejt-szuszpenzió helyett 1 mol/1 sósavat alkalmazunk, és mérjük a 'x0r mennyiségét a felülúszóban. Az ADCC aktivitást (%) a (II) egyenletből számoljuk ki.
Az a~l,6-fukóz-mentes cukcrláncokat különböző arányban tartalmazó, anti—CCR4 kamera antitestek AuoC akt.í.vi.tás mérésének ábra mutatja különböző koncentrációknál (0,001- Í0 yg/ml) két egészséges donor (A és B) etrextorsegtjeit alkalmazva. Amint a 18. és 19. ábrán bemutatjuk az anti~CC«4 ki méra antitestek ADCC aktivitása mindegyik antitest koncentráció esetében növekedési tendenciát mutat az a-1,ő-fukóz-mentes cukorláncok arányával párhuzamosan. Az ADCC aktivitás csökken, amikor az antitest Ko.ncentracio alacsony, u,ül pg/mi. a.n.ti.tesc koncentrációnál az antitest, amelyben az n-1,S-fukóz-mentes cukorlánc aránya 27%, 39% vagy 46% szinte azonos erősségű ADCC aktivitást mutat, de az ADCC aktivitás alacsony volt abban az antitestben, amelyben az a-1,6-fukóz-mentes cukorlánc aránya kevesebb, mint 20%. Ugyanilyen eredményeket kaptunk, amikor az effektorsejt donort megváltoztattuk.
9. példa
Az u-1,ő-fukozil-transsfexáz gén transzkripciós termékének meghatározása gazda sejtvonalban (1) .Sgvssálú oDMS előállítása különböző sejcvonalakból
Az egyszálú cDN-S mintákat dihidrofolát-reduktáz gén (dhfr)hiányos CHO/DG44 sejtekből állítjuk elő, amely kínai hörcsög petefészekből és patkány mieloma YS2/0 sejtekből származik., az arabor eljárás szerint.
A CHO/DG44 sejteket 10% magzati borjú szérummal (gyártó: Life Technologies) és Ixkcncent ráció HT-vel (gyártó: Life Technologies). kiegészített TMDM tápközegben (gyártó:: Life Technologies) szuszpendáljuk és 15 ml szuszpenziót T75 adhéziós sejttenyésztő lombikba oltjuk '.gyártó: Greener) zxlü” sejt/ml sűrűségben. A TB2/0 sejteket 10% magzati borjú szérummal (gyártó:
Life Technoluies) és 4 mmol/1 L-GLN-vel ícvártó:
echnologies) kiegészített RPMI 1640 tapközegbe (gyártó:
Teohnolgies) szuszpendáljuk és 15 ml .szuszpenziót T75 lombikba oltjuk a szuszpenzió ssijtt.enyeszet.uez (gyártó: Geiaet) 2xlu sejt /ml sűrűségben. 5%· CQ?-t tartalmazó inkubátorban, 37°C-on tenyésztjük, és 1x10·’ megfelelő gazdasejtet a tenyésztés 1., 2., 3., 4. és 5. napján kivonunk a teljes RNS· extrahálásához RNAeasy (gyártó: QIAGEN) felhasználásával a gyártó utasításai szerint.
A teljes RNS~t 4 5 pl steril vízben oldjuk és 1 ul RO1 RNázszabad DNázt (gyártó: Erómega), 5 pl csatolt 10 x DNáz puffért és 0,5 pl RNazin Ribonukleáz Inhibitort (gyártó: Promega) adunk hozzá, majd 37°C-an 30 percig reagáltatjuk a mintában felhalmozódott DNS genom degradálására. A reakció után a teljes RNS-t RNAeasy alkalmazásával tisztítjuk (gyártó: QIAGEN) és 50 ul steril vízben oldjuk.
pl reakcioeieqvben egyszalú cDNS — t .szintet izalunk oligo(dl) felhasználásával, mint primer a kapott teljes RNS minták mindegyikének 3 pg-ból reverz transzripcíós reakcióval SUPERSCRIPT^ Preamplification System alkalmazásával a First Strand cDNA Synthesis (gyártó: Life Technologies) és a gyártó utasításai szerint. A reakcióoldat 1 x koncentráció oldatát al kalmazzuk. az ο-1,-6-.fuközi 1-crunszferáz klónozásához (az *j.ab.o.iakban ügy hivatkozunk rá, mint „FUTÓ; és B-aktin a megfelelő gazdasejtből származtatva és a reakcióoldat 50 fold-hígított vi-
·; 9
Kínai hörcsög FUT8 és patkány FUT8 cDNS részleges fragmenseit az alábbi eljárás szerint (20. ábra) állítjuk elő.
Először nukleotid-szekvenciákra specifikus primereket (SEQ ID No: 4 és 5-ben bemutatott) tervezünk humán FUT8 oDNS-hez [J. Biochem.· 121, 626 (1997) J és sertés FUT8 cDNS'-hez [0. Bioi.. Chem.. 271, 27810 (1995) ] .
Ezt követően 25 ul reakcióoldatot [ExTáq puffer (gyártó: Takara Shuzo), 0,2 mmol/1 dNTP-ket és 0,5 umol/1 gén-specifikus or.imereKet vSEQ 1D b<0: 4 es 5) ΐ , ame.iy az egyes uDNu ékből — px — t tartalmaz, amelyeket CHO sejtekből és ΥΒ2/Ό sejtből állítunk elő, mindkettőt az (I) pontban kapjuk meg 2 nappal a tenyésztést követően, és pelímeráz láncreakciót (PCR) kivitelezünk DNS polimeráz ExTaq (gyártó: Takara Shuzo) felhasználásával. A PCR-t úgy kivitelezzük, hogy 9-4°C-on 1 percig melegítjük, ezt követi 30 melegítési ciklus, ciklusonként 94'>'C-on 30 másodpercig, 55°Con. 30 másodpercig és 7 2°C-on 2 percig és egy végső melegítés 72°C-on 10 nercig.
A PCR után a reaKCrooioatot agaroz gelelektroforézísííők vetjük alá és egy specifikus amplifikált 979 bp .fragmenst tisztítunk GENECLEAN Spin Kit t-gyártó: BzG lui) teihasznaiasavai és 10 ul steril vízzel elváljak (az alábbiakban a módszert a DNS fragmensek tisztításához alkalmazzuk agarózgélből). Egy PCR2.1 plazmidba, 4. pl amplifikált fragmenst alkalmazunk a beillesztéshez a gyártó utasításai szerint TOPO TA Cloning Kit (gyártó:: Invitroqen) és E. coli Xhl-Slve-ba transzformáljuk a reakció ol dattal Cohen és mtsaí eljárása, szerint [Proc. Natl. Acad. Set. USA 69, 2110 (.1972)]: (az alábbiakban, ezt. az eljárást az F. coli transzformációhoz alkalmazzuk) . Plazmid DNS mintákat egy ismert eljárás szerint izoláljuk [Nucleic Acids Research l_f 1513 (197 9] (az alábbiakban a plazmid izolációhoz alkalmazzuk) a cDNSinszertált 6 klánból a kanamicin-rezisztens kolóniák közül.
A plazmi-dba inszertált egyes cDNS nukleotid-szekvenciá ját DNS Sequencer 377 felhasználásával határozzuk meg (gyártó: Parkin Elmer) és BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction kit-tel (gyártó: Parkin Elmer) a gyártó utasításai szerint. Igazoltuk, hogy az összes insertált cDNS, amelyek szekvenciáját a módszerrel meghatároztuk, a kínai hörcsög FUT 8 vagy patkány FUTÓ (SEO? ID ΝΌ. 6 és 7-ben bemutatva) parciális szekvenciájának nyílt leolvasási keretét (OR.F) kódolja. Ezek közül azon DNS mintákat, amelyek egyáltalán nem tartalmaznak leolvasási hibát PCR-ral a szekvenciában, kiválasztjuk. Az alábbiakban ezek a plazmidokra úgy hivatkozunk, mint CHFÜT8-pCR2.1 és YBFUT8pCR2.1.
f.3.): Kínai hörcsög 3-aktin és patkány ^--aktin c£WS előállítása
Kínai hörcsög h-aktin és patkány D-aktín cDNS~t preparálunk a következő eljárással (21. ábra).
Először egy transzlációs iníci.áci-ós kodont tartalmazó általános szekvenciára (bemutatva a SEQ ID NO:8-ban) specifikus forward prímért és transzlációs- terminációs kodont tartalmazó megfelelő szekvenciákra (bemutatva SEQ 1D -NÖ:9 és IG-ben) specifikus revert prímereket tervezünk kínai hörcsög B-aktin genomiális szekvenciából (GenSank, Ü20114) és patkány β-aktin genomiális szekvenciából [Nucisic Acids Researcn 11, 17os (1983)].
Ezt követően zó pl reascciooluatot [KOD pufrer -(gyártó: Toyobo) t 0,2 wíol/1 dNTP-ket, 1 mmol/1 MgCl.2-ot, 0,4 pmol/l génsnecifíkus prímeteket (SEQ ID NO: 3 és 9 vagy 2EQ ID NO: 8 és 10; és 5% DMSO], amely as egyes cDNS-ek 1 μί-ét tartalmazza, amelyeket. CHO sejtből és IB2/0 ssjtoői ainmnk elő, minorettoc az (i.j pontban kapjuk meg 2 .nappal a tenyésztést követően., és .PCR~t kivitelezünk DNS polimeráz KOD (gyártó: Toyobo) felhasználásával. A PCR-t ügy kivitelezzük, hogy 94°C-on 1 percig melegítjük, ezt követi 25 melegítési ciklus, ciklusonként 98*0-on 15 másodpercig, 65°C-on 2 másodpercig és 74°C-on 30 másodpercig.
.A POR után, a reakcíóoldatot 0,8% agaróz gélelektroforézisnek vetjük alá és egy specifikus amplífíkált 1.128 bp fragmenst tisztítunk. A DNS-fragmenst alávetjük DNS 5’-terminális foszfor!látásnak MEGALABEL (gyártó: Takara Shuzo) felhasználásával a gyártó utasításai szerint. A DNS-fragmenst a reakció oldatból etancios kicsapassai nyergük ki es iu μι stem vizoen uyra feloldjuk.
Elkülönítve 3 ug pBluescript II KSH) plazmidot (gyártó: Stratagene) 35 μί NEBuffer 2-ben feloldunk (gyártó: New .England Biolabs) , és 16 egység EcoRV restrikciós enzimet, (gyártó: Takara Shuzo) adunk hozzá 37°C-on, 3 -órás emésztési reakcióhoz. A reakció oldathoz ezután 35 μί 1 mmol/1 Tris-HCl puffért adunk (pH 3,0} és 3,5 μί E. coli 015-eredetü alkálikus foszfátéit (gyártó: Takara Shuzo), hegy az ezt követő reakcióban 65'C-on 30 percig
defoszforilálink a DNS terminálisát. A reakció oldatot fenol /kloroformmal extraháljuk, majd etanollal kicsapjuk és a kinyert DNS-fragmenst 100 pl steril vízben újra feloldjak.
p.l kínai hörcsög cDNS-ből preparált ampliflkait fragmenst vagy 4 pl patkány cDNS-ből preparált ampliflkait fragmenst (1192 bp) összekeverünk a pBluescript II KS(+) p.l.a.zm.idbó.l kinyert 1 pl EcoRV-EcoRV fragmenssel (kb. 3,0 Kb) és 5 pl Ligation High-al (gyártó: Toyobo'j ligálási reakcióhoz, melyet 16°C~on 30 percig kivitelezünk. Ennek a reakció oldatnak a xelhasználásával E. coli XLl-Blue-t transzformálunk, és a plazmid DNS mintákat egy ismert eljárás szerint izoláljuk a kapott amplerllin-rezisztens klótokból.
A plazmrdba ínszertált egyes cDNS nukleotid-sxekvenciáját DNS Sequencer 377 felhasználásával (gyártó: Parkin Elmerj és BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction kit-tel (gyártó: Parkin Elmer; határozzuk meg a gyártó utasításai szerint. Igazoltuk, hogy az összes insertált cDNS, amelyek szekvenciáját a módszerrel meghatároztuk, a kínai hörcsög β-aktin vagy patkány &~aktin ORF-jenek teljes szekvenciaját kódolja. Ezek közül azon DNS mintákat, amelyek egyáltalán nem tartalmazzák a bá zisok leolvasási hibáját PCR-ral a szekvenciákban, kiválasztjuk.
Az alábbiakban ezek a piazmidókra úgy hivatkozunk, mint CHAc-pBS /4) FUTí? standard és belső kontroll előállítása
Abból a célból, hogy az FOTO gén mRNS transzkripciós szintiét mérniük az euves sejtekben, a CHFT8-pCP2.1 vaqv YBFT8-nCR2\l
plazmídokat, melyekbe a cDNS parciális fragmenseket a (2) pont szerint a kínai hörcsög FUTS-ból vagy a patkány FtTS-bói insze.rtáltuk a pCR2.1-be, EcoRI restrikciós enzimmel emésztjük és a kapott lineáris DNS-eket használjuk standardként kalibrációs görbe felvételéhez. A CHFT8d-pCR2.1 és YB.FT8d-pCR2.1 plazmidókat, melyeket a CHFT8-pCR2. 1 és YBFT8-pCR2..1 plazmátokból kaptunk 203 be deletálásával a Seal, és Hindii! között, amelv egy belső nukleotid-szekvenciája a kínai hörcsög FUT8-nak illetve a patkány FUT8-nak, ScoRI' restrikciós enzimmel emésztjük, és kapott .lineáris DNS-eket használjuk belső standardként az FUT8 mennyiségi meghatározásához. Az eljárást részletesen az
Kínai hörcsög FUT8 és patkány FUT8 standardokat, készítünk az alábbi módon. 2 ug CHFT8-pCR2.1 plazmidot 40 μΐ NEBuffer 2-k feloldunk (gyártó: Kew England Biclabs) , és .24 egység ŰcoRI restrikciós enzimet (gyártó: Takara S.huzo) adunk hozzá 37*C-on, 3 órás emésztési reakcióhoz. Elkülönítve 2 pg YBET8~pCR2.1 plazmidot 40 pl NEBuffer 2-ben feloldunk (gyártó: Hew England Bio-labs), és 24 egység EcoRT restrikciós enzimet (gyártó: Takara Shuzo) adunk hozzá 37'*C-o.n, 3 órás emésztési reakcióhoz. Mindegyik reakció oldat egy részét 0,.8%-os agaróz gélelektroforézisnek vetjük alá, ami azt igazolta, hogy egy kb. 1 Kb méretű EcoRI-EccRI fragme.nst, mely az egyes cDNS-fragmenseket tartalmazza a kínai hörcsög FUT8-ból és patkány FUTS-ból, lehetett elkülöníteni a CHFT8-pCE2.1 és YBFT8-pCR2.1 plazmidókból restrikciós emésztéssel. Az egyes reakció oldatokat meghigítjuk. 1 gg/ml sűtőélesztő t-RNS-sel (gyártó: SIGMA.) 0,02 fg/μΐ, .0,2 fg/μΐ, fg/μΐ, 10 fg/nl, 20 fg/μΐ és 100 fg/ul koncentrációra, és ezt használjuk kínai hörcsög FOTO és patkány FUT8 standardokként.
A kínai hörcsög FDT8 és patkány EUT8 belső standardokat az alábbiak szerint készítjük el [22. ábra). 'Reakció-oldatot készítünk [KOD puffer #1 (gyártó: Toyobo), 0,2 »1/1 dNTP-ket, 1 mmol/1 MgCls, 0,4 umol/l gén-specifikus primerek (SEQ ID NO: 11 és 12} és 5% DMSG], amely 5 ng CHFT8-pCR2.1-et vagy Y3FT8pCR2.1-et. tartalmaz és PCR-t kivitelezünk DNS polímeráz KOD segítségével (gyártó: Toyobo') . A PCR-t ügy kivitelezzük, hogy 94'‘C~on 4 percig melegítjük, ezt követi 25 melegítési ciklus, ciklusonként 9S°C-on 15 másodpercig, 65°'C-on 2 másodpercig és 74°C-on 30 másodpercig. A PCR után a reakció oldatot 0,8% agaróz gélelektroforézi-snek vetjük alá, és egy kb. 4,7 Kb méretű specifikus amplifikéit fragmenst tisztítunk. A DNS 5’-terminális foszforiláljuk MEGALABEL felhasználásával (gyártó: Takara Shuzo) a gyártó utasításai szerint, és ezután a DNS-fr.agmen.st etanolos kicsapással kinyerjük a reakcióelegybol és feleljük 50 μΐ steril vízben. A kapott. DNS-f ragmenst (5 μΐ, kb. 4,7 kb) és 5 μΐ Ligation Hígh-t (gyártó: Toyobo) összekeverünk, majd önciklizáljuk 16'°'C-on 30 percig.
Ennek a reakció oldatnak a felhasználásával E. coli DH5a-t transzformálunk, és a plazmád DNS-mintákat a kapott ampicillinrezisztens kiónokból ismert módszerrel izoláljuk. Az egyes plazmád DNS-ek nukleotid-szekvencíáját meghatározzuk DNA Sequencer 377 (gyártő: Parkin Elmer) és BigDue Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit (gyártó: Parkin Elmer) segítségével, és azt. találtuk, hogy a kínai hörcsög EUT8 vagy a patkány
FUT 8 5a cl és H.índI.T.1 közötti belső- 203 bp nukleotids z e kvenci á ~j a t töröltük. A Kapor, t pl azm.rooK.ra a tovaoDiawan CHFT8d-pCR2.1 illetve YBFT8d~pCR2.1-ként hivatkozunk.
Ezt követően 2 ug CHFT8d-pCR2.1 plazmidot 40 μΐ NEBuffer 2ben feloldunk (gyártó: New England Biolabs), és 24 egység EcoRI restrikciós enzimet (gyártő: Takara Shuzo) adunk hozzá 3?*C~on, 3 órás emésztési reakcióhoz. Elkülönítve 2 pg ¥BFT8d-pCR2.1 plazmidot 40 pl NEBuffer 2-ben feloldunk (gyártó: New England Biolabs), és 24 egység E'coRI restrikciós enzimet (gyártó: Takara Shuzo) adunk hozzá 37°C~on, 3 órás emésztési reakcióhoz. Mindegyik reakció oldat egy részét 0,8%-os agaróz gélelektroforézisnek vetjük alá, ami azt igazolta, hogy egy kb. 800 bp méretű EcoRl-EcoRl rragmenst, amelyből a kínai norcsog FuT8 vagy a patkány FUT8 203 bp méretű belső nukleotid-szekvencíáját töröltük, lehetett elkülöníteni a CHFT8d-pCR2.1 vagy az YBFT8d-pCR2.1 plazmídokból restrikciós emésztéssel. 2 fg/pl hígításokat készítünk úgy, hogy az egyes reakció oldatokat meghigítjuk 1 gg/ml sütőélesztö t-RNS-sel (gyártó: SIGMA), és ezt használjuk kínai hörcsög FUT8 és patkány FÜT8 belső koncrollokként.
(5) β-aktin standard és belső kontroll előállítása
Abból a célból, hogy a B-aktín gén mRNS transzkripciós szintjét mérjük a különböző gazdasejtekben, a CHAc-pBS és YBAcpP-S plazmidókat, melyekbe a kínai hörcsög B-aktin és patkány &aktin egyes cDNS-einek teljes hosszúságú ORF-jét a (:3) pont szerint inszertáltuk a pSluescript II KS(+)-be, Hindii! és Páti restrikciós enzimekkel illetve HindiII és Khpl restrikciós encímmel emésztjük .e
St daruként kalibrációs görbe fel vételéhez. A CHAcd-pSS és YBAcd pBS plazmidókat, melyeket a CHAc-pBS és YBAc-pBS plazmidokból kaptunk 180 bp deletálásával a DraI.II és Drain. között, amely egy belső nukleotíd-szekvencíája a kínai hörcsög β-aktinnak il letve a patkány B-aktinnak, Hindin és PstI illetve HindiII és .Kupi restrikciós enzimekkel emésztjük, és kapott lineáris Dicseket használjuk belső standardként a β-aktin mennyiségi meghatározásához. Az eljárást részletesen az alábbiakban írjuk le.
Kínai hörcsög β-aktin és patkány β·~aktín standardokat készítünk az alábbi módon. 2 tg CHAc-pBS plazmidot 4 0 pl NE'Buffer 2ben feloldunk. {gyártő: New England Biolabs'), és 25 egység HindiII restrikciós enzimet (gyártó: Takara Snuzo) es 2-u egyseg Pstl-et (gyártó:: takar a Shuzo) adunk hozzá 37 °C-on, 3 órás emésztési reakcióhoz. Elkülönítve 2 gg YBAc-pBS plazmádat 40 ul NEBuffer 2-ben feloldunk (gyártó: New England Hiolaos) , es 2b egység Hindi’ll restrikciós enzimet . gyár to; Takara S-huzo; es zo egység .'Khpl-et (gyártó: Takara Shuzo) adunk hozzá 37°C-on, 3 órás emésztési reakcióhoz. Mindegyik reakció oldat, egy részét 0,8·%-os aga.róz gélelektroforézis-nek vetjük alá, ami azt igazolta, hogy egy Kb. .:.,2 to .merei.u 1— nst.I fragmenst es egy
HindlII-KhpX fra.gmen.st, amely az egyes cDNS-ek teljes hosszúságú ORf—lét tarr.a rmazza a kmat norcscg fa-aKtuiboi és pamany — aktínből, lehetett elkülöníteni a CHAc-pBS és YBAc-pBS plazmidokból restrikciós emésztéssel. Az egyes reakció oldatokat meghigítjuk 1 pg/ml sütőélesztő t-RNS-sel (gyártó: SIGMA) 2 pg/μΐ, 1 pg/μΐ, 200 fg/ul, 100 fg/μΐ és 20 fg/μΐ koncentrációk-
transzformálunk, és a plazmid DNS •••mintákat a kapott ampieilli
« * * *M 4 4*sí * * ♦ 4 * * ♦ »
4« rezisztens kIónokból ismert módszerrel izoláljuk. Az egyes plazmid DNS-ek nukleotid-szekvencriáját meghatározzuk DNA
Sequencer 377 (gyártó: Parkin Elmer) és BigDue Terminator Cycle
Sequencing ε'Β xeady reaction Rix (gyártó: sarkin Eumer) segítségével, és azt találtuk, hogy a kínai hörcsög ú-aktin DraXII
DralTI
180 bp nukleotid-szekvencia.
melyet a plazmidba
í.nsze.rtáltunk., deletálódott. A kapott plazmádra a továbbiakban
CHAcd-pBS-ként hivatkozunk.
Egy plazmido-t, amelyben a patkány B-aktin. DralIX-DraXIX X8ö bp-t deletáltuk, ugyanezekkel a lépésekkel állítjuk elő, mint a CHAcd-pB-S esetén. A kapott plazmidra ygAcd-pBS-ként hivatkozunk a továbbiakban.
Ezt követően 2 pg CHAcd-pBS plazmidot 4 0 pl NEBuffer 2-ben feloldunk (gyártó: New England Bíolabs), és 25 egység .Hindi IX restrikciós enzimet (gyártó: Takara Shuzo) és 20 egység PstX-et (gyártó: Takara Shuzo) adunk hozzá 37°C~on, 3 órás emésztési reakcióhoz. Elkülönítve, 2 ug iBAcd-pBS plazmidot 40 μ.1 NEBuffer 2-ben feloldunk (gyártó: New England Bíolabs), és 25 egység Hindii! restrikciós enzimet (gyártót Takara Shuzo) és 24 egység Knpl-et (gyártó: Takara Shuzo) adunk hozza 37eC-on, 3 órás emésztési reakcióhoz. Mindegyik reakció oldat egy részét 0,8%-os agaroz gé.leleKtxotorezxsnec vetjük ala, ami az— igazolta, nogy egy kb. .1,0 Kp méretű HindIIX-Pst.1 fragmenst és egy HindlIL-KnpI fragmenst, amelyek tartalmaznak egy olyan fragmenst, amelyből a kínai hörcsög B-aktín és a patkány β-aktin. cDNS teljes hosszúsá gú QRF-jének ISO bp méretű belső nukleotld-szekveneiáját töröl tük., lehetett elkülöníteni a CHAcd-pBS és
( 67 Transzkripciós színt mégha tározása kompétiti v PCR-veí
Kompetitiv PCR-t kivitelezünk a (4) pont szerint előállított FÜT8 belső kontroll DNS és az (1; pontban kapott gazda-sejt.eredetű cDNS mint terápiátok felhaszná.lásáva.1, a gazda sejtvonalban az FÜT8 transzkripciós termék meghatározott értékét az egyes templátokből származó amplifikált termék mennyiségének relatív értékéből számítjuk. Másrészről, mivel úgy tekinthető, hogy a B~ aktin gén folyamatosan át íródik az egyes sejtekben és transzkripciós szintje megközelítőleg ugyanaz a sejtek között, a ísaktin transzkripciós szintjét úgy határozzuk meg, mint az egyes gazda sejtvonalakban a cDNS szintézis reakció hatékonyságának mértékét. Azaz PCR-t kivitelezünk az (5) pontban előállított Baktin belső kontroll DNS és az (1) pontban kapott gazdasejt eredetű mint terápiátok ban a fii-akt in transzkripciós termék meghatározott értékét az egyes tempnaturbói szármázó amp.ii.tr kait uetmer mennyzsegériek relatív értékéből számítjuk ki. Ennek részleteit az alábbiakban, ismertetjük.
Az FUT8 transzkripciós terméket az alábbi eljárással határozzuk' meg. Először szekvencia-specifikus primerek egy sorozatát (bemutatva a SEQ ID NO: 13 és .14-ben) tervezzük meg a (2) pontban kapott kínai hörcsög FUT8 és patkány FUT8 ORF parciális szekven* ♦
csak belső szekvenciainoz.
Ezt követően PCR-t kivitelezünk DNS polímeráz ExTaq (gyártó: Takara Shuzo·) felhasználásával 20 pl össztérfogat.ú. reakció oldatban (ExTag puffer (gyártó: Takara. Shuzo), 0,2 mmol/1 d'NTP-k, 0,5 pmol/l gén-specifikus primerek (SEQ ID NO: 13 és 14) és 5% DMSQ], amely 5 pl 50-szeresre. hígított cDNS oldatot tartalmaz, melyet az egyes illető gazda sejt.vonalakbó'1 készítettünk az (1) pont szerint és 5 pl (10 fg) plazmidct belső kontrollként. A PCR-t a következőképpen kivitelezzük: 3 perc 94°C-on, ezt követ). 32 ciklus ciklusonként 1 perc 94°0-οη, 1 perc βΟΎ'-οη és 1 perc 72 °C-on.
Egy másik PCR-t. is 'kivitelezünk, reakció-szériában, ahol 5 pl (0,1 fg, 1 fg, 5 fg, 10 fg, 50 fg, 100 fg, 500 fg vagy 1 pg) (4) pont szerint kapott FUT8 standard plazmidct adunk az egyes gazda segtvonal-eredetű cDNS-ek helyett, és használjuk az FUT8 transzkripciós szintjéhez egy kalibrációs görbe elkészítésében.
A β-aktin transzkripciós terméket az alábbi eljárással határozzuk meg. Először szekvencia-specifikus primerek két sorozatát tervezzük meg a (3) pontban kapott, kínai hörcsög B-aktin és patkány β-aktin teljes hosszúságú ORF-ének belső szekvenciáihoz (az előző a SEQ ID NO: 15 és 1.6-ban bemutatva, az utóbbi a SEQ ID NO:17 és 18-ban bemutatva).
Ezt követően PCR-t kivitelezünk DNS polimeré-z ExTaq (gyártó: Takara Shuzo) felhasználásával 20 pl össztérfogatú reakció oldatban [ExTaq puffer (gyártó: Takara Shuzo), 0,2 mmol/'l dNTP-k., 0,5 pmol/l gén-specifikus primerek (SEQ ID NO: 1.5 és 16 vagy SEQ
ID NO: 17 és 18) és 5% DMSOi , amely 5 u.l 50-szeresre hígított .“% **·: ,*· . % í : ♦ « ** ** «ec eDNS oldatot tartalmaz, melyet az egyes illető gazda sejtvonalakból készítettünk az (1) pont szerint és 5 pl (1 pg) plazmidot belső kontrollként♦ A PCR-t a következőképpen kivitelezzük: 3 perc '94°C-on, ezt követi 17 ciklus ciklusonként 30 másodperc 94°C~on, 1 perc 65*C-on és 2 perc 72'>C~on.
Egy másik PCR-t. is kivitelezünk reakció-szériában, ahol 5 ul (10 pg, 5 pg, 1 pg, 500 fg vagy 190 tg) (S) pont szerint kapott β-aktin standard plazmidot adunk az egyes gazda sejtvonaleredetű cDNS-ek helyett, és használjuk a il-aktin transzkripciós szintjéhez egy kalibrációs görbe elkészítésében.
3. táblázat
Target (cél) gén Prímerek s orozata* PCR sKipli.fikáéios termék mérete (op) Target Kompétitor
FüT8 F: 5’-GTCCATGGTGATCCTGCAGTGTGG-3’ R; 5’-CACCAATGATATCTCCAGGTTCC-3' .638 431
β-Aktin (kínai hörcsög) F: 5 ’-GATATGGCTGCGCTCGTTGTCGA-C-3 * R; 5 ‘ -CAGGAAGGAAGGCTGGA.AAAGAGC-35 789 609
B-Aktin (patkány) F: 5 ' -GATATCGC’EíKCGCTCGTCGTCGAG·-· 3 ’ R: 5’-CAGGAAGGAAGGCTGGAAGAGAGC- 3‘ 789 6Ö9
*F: forward primer; R: reverz primer
A 3. táblázatban bemutatott primer-sorozattal kivitelezett PCR-ral a 3. táblázat target oszlopában megadott méretű DNSfragmenst lehet amplifikálni az egyes gén transzkripciós termékekből és egyes standardokból, és egy DKS-fragmenst lehet amplifikálni az egyes belső kontrollókból, melynek méretét a kompétitítor oszlopban adtuk meg.
PCR után az egyes oldatokból 7 pl-t alávetünk 1,75% agaróz gélelektroforézisnek, és ezután a gélt megfestjük 30 perces áztatással Ixkoncentrációjú SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stainben (gyártó: Molecular Probes). Az amplifikált DNS-fragmens mennyiségét az egyes amplifikált DNS~k lumineszcens intenzitásának kiszámításával mérjük egy fluoro-leképező segítségével (Fiuorlmager Sí; gyártó: Molecular Dynamics).
A standard plazmáddal mint templáttal végzett PCR-ral kapott amplifikált termék mennyiségét az eljárással mérjük, és egy kalibrációs görbét készítünk a mért értékek pontozásával a standard plazmád mennyiségével szemben. A kalibrációs görbe segítségével az egyes sejtvonalakba inszertált gén cDNS-ének mennyisége kiszámítható az amplifikált termék mennyiségéből, amikor az egyes expressziós se jtvonal-eredetű cDNS-t. használjuk tempi á tként , és a mennyiséget úgy definiáljuk, mint a mRNS transzkripciós szintjét az egyes sejtvonalakban.
Amikor patkány FUT8 szekvenciát használunk a standard és belső kontroliokban, a FUT8 transzkripciós termék mennyiségét az egyes gazda sejtvonalakban a 24. ábrán mutatjuk be. Végig a tenyésztési periódus alatt a CHO sejtvonal 10-s-zer vagy még magasabb transzkripciós szintet mutatott, mint az ΎΒ2/0 sejtvonal. Ezt a tendenciát találtuk akkor is, amikor kínai hörcsög FUT8 szekvenciát alkalmaztunk a standard és belső kontroliban.
A 4. táblázatban bemutatott FUT8 transzkripciós szintek tehát relatív értékek a B-aktín transzkripciós termék mennyiségére vonatkozóan. Végig a tenyésztési periódus alatt a FUT8 transzkripciós szint az YB2/0 sejtvonalban körülbelül 0,1% b-aktin volt, míg a CHO sejtvonalban 0,5% - 2%.
ázat
10. példa
As; >u-l, 6~fukozil~t.ranssferáz gén transzkripciós termékének meg határozása antigangliozid GD3 kiméra antitest-termelő sejtvonal ban (2} Egyszálü cD.ES előállítása különböző anti test-termelő sejtveEgyszálú cDNS-t állítunk elő anti-gangliozíd GD3 kiméra antitest-termelő DCHIO 1-2.0 és 61-33 .sejtvonalakból az alábbiak szerint. A DCHI01-20 egy transzformáns klón, mely az 1. példa 2(2) pontjában leírt CHO/DG44 sejtből származik. A €1-33 is egy klón, melyet az YB270-eredetü 7-9-51 transzformáns sejt (FERM BP-6691, International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced IndustrialScience and Technology (AI ST Tsukuba Central 6, 1-1., Higashi 1-Chome Tsuk.uba.-sni, Ibaraki-ken 305-8566 Japan) szérum-mentes adaptációjával kapunk, és ezután egyetlen sejtet izolálunk két limitáló hígítással.
A DCHI01-20 sejteket EXCELT 302 tápközegben (gyártó: JRH BIOSCIENCES) szuszpendáljuk, melyet 3 mmol/1 L-GLN-nel (gyártó: life Technologies), 0,3% PLÜRO.NIC F-68-cal (gyártó: Life L’echnolo-gíes) és 0,5% zsírsav-kcnoentrátummal (gyártó: Life rechnologies; egészítünk ki, és 15 ml szuszpenziót T75 tenyésztő •ί :.·> Λ Ιό'ί **** ** χ< * * * ♦ 1c in v ♦ ♦ ♦«f x *»* * ί » * ««*««» ♦ < «« «* lombikba (gyártó: Greinex) inokulálunk 2 x 10·' sejt/ml sűrűségben a szuszpenzió sejttenyésztéséhez. A 01-33 sejteket is szuszpenbáljuk. Hybridoma-SFM tápközegben (gyártő: Life Technologies) , melyet 0,2% borjú szérum, albumin V frakcióval egészítünk ki (.gyártó: Life Technolo-gies) (továbbiakban: !ÍBSA”) , és 15 ml szuszpenziót T75 lombikba inokulálunk (gyártó: Greiner) 2 χ 103 sejt/ml sűrűségben tenyésztéshez. A tenyésztést 37°C-on, 5% COztartalmú mrunasorban végezzük, és a tenyésztés utáni 1., 2 ., 3., 4. és 5. napon 1 x 10' illető gazdasejtet kinyerünk, hogy a teljes RNS~t extraháljuk RNAeasy-vel (gyártó: QIAGEN) a gyártó utasításai szerint.
A teljes RNS~t feloldjuk 45 pl steril vízben és 1 pl RQ1 RNáz-mentes DNáz-t (gyártó: Promega), 5 pl kapcsolt 10 x DNáz puffért és 0,5 pl RNasin ribonukleáz inhibitort (gyártó: Promega) adunk hozzá, ezt követően 37 '’C-on 30 percig reagáltak j uk, hogy lebontsuk a mintában lévő genomiális DNS-szennyezéseket. A reakció után a teljes RNS-t ismét RNAeasy segítségével (gyártó: QIAGEN) tisztítjuk és feloldjuk. 50 pl steril vízben.
te 1111 v FCR ··· ra 1 * β * > «- 5 $r
Az (1) pontban kapott antitest-termelő sejtvonalból származó cDN'S-n lévő egyes gének transzkripciós szintjét kompét.it ív PCRral határozzuk meg a 9(6) példa szerint.
A FUT8 gén-eredetű mRKS transzkripciós szintjét, az egyes antitest-termelő sejtvonalakban a következő eljárással határozzuk
A CHFT8-pCR2.1 és YBFT8-pCR2.1 plazmátokat, melyekben a kínai hörcsög FUT8-ból és a patkány FUT8-ból a 9(2) példában preparált cDNS parciális fragmenseket a pCR2.1-be inszerháltuk, EcoRI restrikciós enzimmel emésztjük, és a kapott lineáris DNSeket használjuk standardként egy kalibrációs görbe megszerkesztéséhez a FUT8 transzkripciós szintjének meghatározásához.
A CHFT8d-pCR2.1 és YBFT8d-pCR2.1 plazmidokat, melyeket a kínai hörcsög FUT8 és patkány FUT8 belső nukleotid-szekvencia Seal és Hindii! közötti 203 bp deletálásával kaptunk a 9(4) pálcában, EcoRI restrikciós enzimmel emésztjük, és a kapott lineáris DNSeket használjuk belső standardként a FUT8 mennyiségi meghatározásához .
PCR-t kivitelezünk DNS polimeréz ExTag (gyártó: Takara Shuzo) felhasználásával 20 pl össztérfogatú reakció oldatban [ExTaq puffer (gyártó: Takara Shuzo), 0,2 mmo.l./l dNTP~k, 0,5 pmol/l gén-specifikus primerek (SEQ ID Nö:13 és 14) és 5% DMSOj, amely 5 pl 50-~szeresre hígított cDNS oldatot tartalmaz, melyet az egyes illető gazda sejtvonalakból készítettünk az (1) pont szerint és 5 pl (lü fg) plazmidot belső kontrollként. A PCR-t a következőképpen kivitelezzük: 3 perc 94*C-on, ezt követi 32 ciklus, ciklusonként 1 perc Oí^C-on, 1 perc űO^C—on és 1 perc 72v€-
,. * ·» '«IT* φ t « ♦ φ ί > φ κ φ ·♦♦ Φφ «* **
Egy másik ,PCR~t is kivitelezünk reakció-szériában, ahol 5 μΐ (0,1 fg, 1 fg, 5 fg,
100 fg, 500 fg vagy 1 pg)
FUT8 standard plazmidot adunk az egyes gazda sejtvonal-eredetű cDNS-ek helyett, és használjuk az FUT8 transzkripciós szintjéhez egy kalibrációs görbe elkészítésében. Ebben az esetten 1 pg/ml sütőélesztő t~RNS~t (gyártó: SIGMA.) használunk a standard plazmid hígítására.
Másrészről, mivel úgy tekinthető, hogy a B-aktin gén folyamatosan átíródik az egyes sejtekben és transzkripciós szintje körülbelül azonos a sejtek között, a B-aktin gén transzkripciós szintiét a cDNS szintézis reakció hatékonyságának indexeként határozzuk meg az egyes antitest-termelő sejtvonalakban.
CHAc-pBS és YBAc-pPS plazmidokat, melyekbe a kínai hörcsög β-aktin. és patkány B-akt in egyes cDNS-einek teljes hosszúságú ORF-jét a 9(3) példa szerint inszertáltuk a pBluescript II KS(t)-be, Hindin és Knpl restrikciós enzimmel emésztjük, és a kapott lineáris DNS mintákat használjuk standardként kalibrációs görbe felvételéhez a β-aktin transzkripciós szintjének meghatározásához .
A CHAcd-pBS és YBAcd-pBS plazmidokat, melyeket a UHAc-pBS és YBAc-pSS plazmidokból kaptunk a 9(5) példában 180 bp deletálásával a Drain és Drain között, amely egy belső nukleotid— szekvenciája a kínai hörcsög B-aktinnak illetve a patkány 15aktinnak, Hindin és Knpl restrikciós enzimekkel emésztjük, és kapott lineáris DNS-eket használjuk belső·· standardként a B-aktín meghatározásához.
*Μ· « Λ **
PCR-t kivitelezünk DNS polimeráz ExTaq (gyártó: Takara
Shuzo) felhasználásával. 20 μί össztérfogatú reakció oldatban (ExTaq puffer (gyártó: Takara Shuzo), 0,2 mmol/1 dNTP-k, 0,5 pmol/l gén-specifikus primerek (SEQ ID NO: 17 és 1.8) és 5% DMSO1 , amely 5 μί 50-szeresre hígított cDNS oldatot tartalmaz, melyet az egyes illető gazda sejtvonalakból készítettünk és 5 μί (1 pg) plazmidot belső kontrollként. A PCR-t a következőképpen kivitelezzük: 3 perc 94°C-on., ezt követi 17 ciklus ciklusonként 30 másodperc 94*C-on, 1 perc 65°C~on és 2 perc 72*C~on. Egy másik PCR-t. is kivitelezünk reakció-szériában, ahol 10 pg, 5 pg, 1 pg, 500- fg vagy 100 fg O-aktin standard plazmidot adunk az egyes gazda sejtvonal-eredetű cDNS-ek helyett, és használjuk, a h-aktin transzkripciós szintjéhez egy kalibrációs görbe elkészítésében. Ebben az esetben 1 pg/mi sütőélesztő t-RNS-t (gyártó: SIGMA.) használunk a standard plazmid hígítására.
A 3. táblázatban bemutatott primer-sorozattal kivitelezett PCR-ral a 3. táblázat target” oszlopában megadott méretű DNSfragmenst lehet ampl.ifíkálni az egyes gén transzkripciós termékekből és egyes standardokból, és egy DNS-fragmenst lehet amplifíkálni az egyes belső kontrollomból, melynek méretét a ”kompétitor oszlopban adtuk meg.
PCR után az egyes oldatokból 7 μί-t alávetünk 1,75% agarőz gélelektrcforézisnek, és ezután a gélt megfestjük 30 perces áztatással Ixkoncentrációj 0 SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stainben (gyártó: Molecular Probes). Az am.pl ifiké it DNS-fragmens mennyiségét az egyes amplifikáit DNS-k lumineszcens intenzitásénam. kzszamitásavar mérj urn egy r .t.uoro— lekepezo seg zzsegevez
* « * « X ♦••Λ» Λ * < * -J * «-*
Fluorimager SI; gyártó: Molecular Dynamics).
A standard olazmiddal mint temoláttal vészeit PCR-ral kapott ált termék mennyiségét az eljárással mérjük, és egy ka1/bracxos gömet· kssziíuhk a mért értések pontozásával a stan dard plazmád mennyiségével szemben. A kalibrációs görbe segítőé gével az egyes sejtvonalakba inszertált érdekes gén cDNS—ének mennyisége kiszámítható az amplifikált termek mennyiségéből, amikor az egyes expressziós seútvonal-eredetű cDNS-t használjuk templátként, és a mennyiséget úgy definiáljuk, mint a raRNS transzkripciós szintjét az egyes sejtvonalakban.
A FUT8 transzkripciós szinteket az 5. táblázatban mutatjuk be, mint a B-aktin transzkripciós termék mennyiségére vonatkozó relatív értékeket. Végig a tenyésztési periódus alatt a FUTÓ transzkripciós szint az YB2/0 sejt-eredetű antitest-termelő 6133 sejtvonalban 0,3% vagy ennél kevesebb B-aktin., míg a CHO sejt-eredetű antitest-termelő sejtvonalban 0,7% - 1,5%.
5. táblázat
Tenyésztés napja
Sejtvonal 1. 2. 3. 4.5.
DCHIQ1-2O 0,75 0,73 0,99 1,311,36
61-33 0,16 0,19 0,24 0,30<0,10
11. példa
Egér a~l,6-fukozil-transzferás (FÜT8) gént tül-expresszáló sejt vonal előállítása fi/ Egér a-l,6-fukozíi-transzfe.rázt (2UT8) expresszáló plazmi megszerkesztése ·**? «** ft#* Λ ftftft * ft ♦·*♦ *'*· \ #»
Teljes RNS-t extrahálunk 1 x 10' egér mielóma NSQ: sejtekből (RCB0213, Cell Bank at The Institute of Physical and Chemic?
Research), melyeket IMDM tápközegben (gyártó: Life Technologies), amely 10% magzati borqu szérumot tartalmazott (Gyártó: Life Technologies) altenyésztettünk, R.NAeasy felhasználásával (gyártó: QIAGEN) a gyártó utasításai szerint. A teljes RNS-t feloldjuk 45 μΐ steril vízben és 1 pl RQ1 RNáz-mentes DNázt (gyártó: Promega), 5 μ! kapcsolt 10 x DNáz puffért és 0,5 pl RNasin ríbonuk.leáz inhibitort (gyártó: Promega) adunk hozzá, ezt követően 37°C-on 30 percig reagálhatjuk, hogy lebontsuk a mintában lévő genomiális DNS-szennyezéseket. A reakció után a teljes RNS-t ismét RNAeasy segítségével (gyártó: QIAGEN) tisztítjuk és feloldjuk 50 pl steril vízben. Printerként oligo(dT) felhasználásával, 20 pl reakcióelegyben egyszálú cDNS-t szintetizálunk egyenként 3 pg fentiek szerint kapott teljes RNS mintából reverz transzkripcióval SUPERSCRIPT™ Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis (gyártó: Life Technologies) alkalmazásával a gyártó utasításai szerint.
Egér FUT8 cDNS-t az alábbi, eljárással állítjuk elő (25. ábra) . Először megtervezünk egy forward prímért, amely specifikus egy transzlációs ini.ciáeiós kodont tartalmazó szekvenciára (bemutatva SEQ ID NO:19-ben) és egy reverz: prímért, amely specifikus egy transzlációs termináciős kodont tartalmazó szekvenciára (bemutatva SEQ ID NO:20-ban) egy egér FUT8 cDNS-szekvcnciábóI (GenBank, AB025198).
Ezután 25 μΐ reakcióoldatot (ExTaq purser (gyártó: Taxara Shuzo) , 0,2 mmol/1 dNTF-k, 4% .DMSO és 0,5 umol/l gén-specifikus
véneiával összehasonlítottuk. Az alábbiakban erre a plazmidra m.fFUT8-pCR2.l~ként hivatkozunk.
Ezt-követően az egér FUT8 teljes ORF szekvenciáját tartalmazó pBSm.tF>űT8 plazmidot szerkeszt·*)uk meg az axáobxak szerint (26. ábra). .Először 1 pg pBluescript II KS(ej plazmidot -gyártó: Stratag-ene) feloldunk 35 pl NEBuffer 2-ben (gyártó: New England Biolabs) és 20 egység EcoRI restrikciós enzimet, (gyártó: Takara Shuzo) adunk hozzá 37°C-on, 2 órás emésztési reakcióhoz. A reakció oldathoz 35 pl 1 mo.1/1 Tris-HCl puffért (pH 8,0) és 3,5 pl £. co.lí C1..5~eredetű alkálikus foszfátért (gyártó: Takara Shuzo) adunk, majd 65:>C--on 30 percig a DNS-terminálisokat defoszforxlaljuk. A uNS-rragmensr. a seioszioriiáiesi reaKc.ro végén re— nol/kioroformos extrakólóval, majd etanolos kicsapással kinyerjük és ezután 10 pl steril vízben feloldjuk.
Elkülönítve .1 pg mfFüT8-pCR2.1 plazmidot feloldunk 35 ul
órás emésztési reakcióhoz:. A reakció oldatot. 0,8% agaröz gélelektroforézisnek vetjük alá, hogy egy kb. 1,7 Kb DNSfragmenst tisztítsunk, amely az egér FUT 8 cDNS teljes ORF szék.vénexa )at tart axmaz za.
melyet, a mfFDTS-pCR2.1 plazmádból készítettünk és 5 pl Ligation High-t (gyártó: Toyobo) Összekeverünk, és 16'°C-on 30 percig ligálunk. Ennek a reakció oldatnak a felhasználásával £. coli DH5<x-t transzformálunk, és a plazmád DNS-mintákat a kapott ampicíllin-rezisztens kiónokból· .ismert módszerrel izoláljuk. Erre a plazmádra a továbbiakban pBSmfFUTB-ként hivatkozunk..
A pBSmf'FUTS és a pAGE249 felhasználásával, egy egér FUT 8 expressziós vektort (pAGEmfFUT8} szerkesztünk a.z alábbi eljárással (27. ábra). A pAG£249 vektor a pAGE240 egyik származéka [J. Biol. Chem.. 269, 147 30 (1.9.94)1, amelyben egy, a cLi.h.zarof ólat reduktáz gén (dhfr) expressziós egységet tartalmazó Sphl-Sptl fragmenst (2,7 Kb) a pAGE248-ból eltávolítottunk.
pl Universal Buffer H-ban (gyártó: Takara Shuzo) 1 pg pAGE249-t feloldunk és 20 egység Sáli restrikciós enzimet (gyártó: New England Biolabs) adunk hozzá, majd 37°C-on 2 órán át emésztjük. Egy DNS-fragmenst nyerünk ki. a reakció oldatból etacolos kicsapással és feloldjuk 35 pl NEBuffer 2-ben (gyártó: New England Biolabs) , és 20 egység Ba.mHI restrikciós enzimet (New England Bio labs) adunk hozzá, majd 2 órán, át 37'’‘C-on emésztjük. Az emésztési reakció után a: reakció oldathoz 35 pl 1 mol/1 TrisHCl puffért (pH 8,0) és 3,5 pl E. coli C15~eredetü alkáli kus foszfatázt (gyártó: Takara Shuzo) adunk, majd 65*C-on 30 percig a DNS—terminálisokat de fos zf őri Iái juk. A DNS-fragmenst a defoszforilálási reakció végen fenol/kloroformos extrakcióval, majd etanolos kicsapással kinyerjük és ezután 10 μΐ steril vízben feloldjuk.
Elkülönítve, 1 pg pBSmfFUT8-at feloldunk 50 μΐ Universal· Buffer H-ban (gyártó: Takara Shuzo) és 20 egység Sáli restrikciós enzimet (gyártó: New England Bíolabs) adunk hozzá, majd 37°Co.n 2 órán át emésztjük. Egy DNS-fragmenst nyerünk ki a reakció oldatból etanolos kicsapással és feloldjuk 35 pl NEButier 2-ben (gyártó: New England Biolabs), és 20 egység .BamHI restrikciós enzimet (New England Biolabs) adunk hozzá, majd 2 órán át 37°Con emésztjük. Az emésztési reakció után az oldatot 0,8% agaróz gél-elektroforézis-nek vetjük alá, hogy egy kb. 1,7 Kb méretű DNSfragmenst tisztítsunk, amely az egér FUT8 cDNS-ének teljes O.RF szekvenciáját tartalmazza.
A kapott pAGE249 plazmid-eredetű BamHI-Sall fragmenst (1 ül, 6,5 Kb) , 4 ul BamHI-SalI fragmenst (1,7 Kb) , melyet a pBSmfFUTS plazmádból készítettünk és 5 al Ligation High-t (gyártó: Toyobo) összekeverünk, és 16°C-on 30 percig ligálunk. Ennek a reakció oldatnak a felhasználásával E. coli DH5a-t transzformálunk, és egy plazmád DNS-t izolálunk a kapott ampioillin-rezisztens kiónokból ismert módszerrel. Erre a plazmádra a továbbiakban pAGE'mfFUT8- ként hivatkozunk.
(2) Egér , E-Eu.kozíÍ-transxEeráz (FUT8j gént túl -express zá.ló sejt vonal előállítása
Egy stabil FUT8 gén-expresszáló sejtvonalat kapunk az (1) pontban megszerkesztett pAGEmfFUTS egér FUT8 expressziós vektor bevezetésével a 61-33-ba. A 61-33 egy klón, melyet egy antigangliozid GD3 kiméra antitestet nagymértékben termelő YB2/U sejtből származó 7-9-51 transzformáns sejt (FERM BP-6691, International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology) szérum-mentes adaptációjának kivitelezésével kaptunk, és ezután egyetlen sejtet izolálunk két limitáló hígítással.
A pAGEmfFUTS plazmádét átvisszük a. 61-33-ba elektropo-ráoióval [Cytc·technology 3, 133 (1990)] a következő eljárással. Először 30 pg pAGEmfEOTO plazmádét feloldunk 600 μΐ NEBuffer 4-ben (gyártó: New England Biolabs), és 100: egység Fsp.T. restrikciós enzimet (gyártó: New England Biolabs) adunk hozzá, majd 37öC-on 2 órán át emésztjük, hogy egy lineáris fragmenst kapjunk. A reakció oldatot etanolos kicsapásnak vetjük alá és a kinyert lineáris plazmídot. 1 ug/ul vizes oldattá alakítjuk. Ezt követően a 6.1-33-at K-PBS pufferben (137 mol/1 KC1, 2,7 mol/1. NaCl, 8,1 mol/1 Na2HP0d, 1,5 mol/1 4,0 mol/1 MgClg) szuszpendáljuk 2 x 10z sejt/ml sűrűségben, és 200 pl sejt-szuszpenziót (4 x 10 sejt) összekeverünk 10 pl (10 pg) lineáris plazmáddal. A sejt-DNS elegyek átvásszük Gene Pulser Cuvette-be (belsőelektród távolság 2 mm) (gyártó: BIO-RAD), és ezután elektroporációt kivitelezünk egy Gene Pulser sejtfúziós készülék (gyártó: BIO-RAD) alkalmazásával 0,2 KV pulzáló feszültségnél és 250 pF elektromos kapacitásnál. A sejt-szuszpenziót 10 ml Hybridoma-SFM tápközeggel elegyítjük (gyártó: Life Technologies), melyet. 5% magzati borjú dializált szérummal és 0,2% BSA-val (gyártó: Life Technologies) kiegészítettünk, és 100 ul-s részletekben szétosztjuk egy 96-lyu.kú tenyésztő lemezen (gyártó: Greiner) . Tenyésztés- után (37°C, 24 óra, 5% COg) 50 pl felűlüszót eltávolítunk és 100-100 pl Hybridoma-SFM tápközeget szétosztunk, melyet 0,5 mg/ml Hygromycin B-vel (gyártó: %’ako Pure Chemical Industries), 5% magzati borjú dializált szérummal (gyártó: Life Technologies) és 0,2% BSA-val (gyártó: Life Technologies) egészítettünk ki. Három hétig tenyésztjük, mialatt a tápközeg cseréjét 3-4 napos időközökben megismételjük, és így higromicín··· rezisztenciát mutató sejtvonalat kapunk.
Másrészről, egy negatív kontroll sejtvonalat készítünk, a P-AGE24 9 plazmidnak, mint a pAGEmfFUTB szülő vektorának a bevezetésével a 61-33-ba. A fenti eljárás szerint 10 ug pAGE249 plazmidot, melyet lineáris formába konvertáltunk Fspl restrikciós enzimmel, bevezetünk 4 x 10-' 61-33 sejtbe elsktroporácioval. A sejteket elegyítjük Hybridoma-SFM tápközeggel (gyártó: Life Technologies), melyet 5% magzati borjú dializált szérummal és 0,2% BSA-val (mindkettő gyártója Life Technologies) kiegészítettünk, átvisszük T75 tenyésztő lombikba (gyártó: Greiner) és 37°C-on 24 órán át 5% CCb atmoszférában tenyésztjük. Tenyésztés után a tenyészet felének felülúszóját (7,5 ml) eltávolítjuk centrifugálással (800 ford/perc, 4 percig}, és a sejteket 7,5 ml Hybridoma-SFM tápközegben szuszpendál juk, melyet 0,5 m.g/ml Hygromycin S-vel. (gyártó: Wako Pure Chemical Industries), 5% magzati borjú dializált szérummal és 0,2% BSA-val (mindkettő gyártója: Life Technologies) egészítettünk ki, és átvisszük T75 tenyésztő lombikba (gyártó: Greiner). Három hétig tenyésztjük, mialatt a tápközeget 3-4 naponként kicseréljük, így egy higromicin-rezisztens sejtvonalat kapunk.
(3) Az u-1,.6-f.uközii-transzferál (PUTS; gén expresaziós szintjének analízise a gént tál-expresszáló sej tvona lakban
A 61-33-ból a (2) pont szerint előállított 14 egér FUTS-t túl-ezpresszáló sejtvonalból adott esetben szelektált 6 sejtvonal és a negatív kontroll sejtvonal felhasználásával a FUT 8 expressziós szinteket összehasonlítottuk, kompét it ív RT-PCu al.~ kalmazásával.
Ezeknek a tül-expresszáló sejtvonalaknak. mindegyikét Hybridoma-SFM tápközegben (gyártó: Life Technologies), melyet 0, 5 mg/ml Hygromycin B-vel (gyártó: Wako Pure Chemical Industries; , 5% magzati borjú dializált szérummal és 0,2·% BSAval (mindkettő gyártója Life Technologies) kiegészítettünk,· szuszpen.dál juk 3 x 10 .sejt/ml sűrűségben és ezután átvisszük T7S tenyésztő lombikba (gyártó: Greiner).. 3'7°C~on 24 órán át 5% COj atmoszférában végzett tenyésztés után, 1 x 10' intakt sejtet kinyerünk, hogy extraháljuk a teljes RNS-t RNAeasy segítségével (gyártó: QIAGEN· a gyártó utasításai szerint. A teljes RNS-t feloldjuk 45 pl steril vízben és 0,5 U/pl RQ1 RNase-Free DNase-t (gyártó: Promega), 5 pl kapcsolt 1.0 x DN-á.z puffért és 0,5 pl RNasin ríbonukleáz inhibitort (gyártó: Promega) adunk hozzá, a reakciót 37°C-on 30 percig hagyjuk lejátszódni, hogy .lebontsuk a genom-DNS szennyezéseket a mintában. A reakció után a teljes RNS-t tisztítjuk ismét RNAeasy-vel (gyártó: QIAGEN) és feloldjuk 50 pl steril vízben.
pl reakcíóelegyben egyszálú cDNS-t szintetizálunk oligo(d.T) mint primer felhasználásával a kapott teljes RNS minták mindegyikének 2.,5 pg-jáből revere, transzripciós reakcióval SUPERSCRIPTító Preamplifíoatíon System for First Strand cDNA Synthesis (gyártó: Life Technologies) felhasználásával a gyártó utasításai szerint. A reakció oldat 50—szeresre: meghigítjuk vízzel, és az egyes gének transzkripciós szintjét meghatározzuk kompetitiv PCR-vel a 9(6) példa szerint.
A FüTS gén-eredetű mRNS transzkripciós szintjét az egyes expressziós sej t vonal· a kb.a.n az aiaobi el járással határozzuk meg.
íBFT8~pCR2.1 plazmidot, amelyben a patkány FUT8-b
9(2) példában előállított cDNS parciális fragmenst behelyeztük a pCP2.i—be, EcoRI restrikciós enzimmel emészt ju-κ, és a Kapott lineáris DRS-t használjuk standardként a FUT 8 transzkripciós szintjének meghatározásához egy kalibrációs görbe felvételéhez.
A 9(4) példában előállított Y8FT8-pCR2.1 közül az YBFT8d~ pCR2.1-t, melyet a patkány FÜT8 belső nukleot.id-szekvenciájának SacI és Hindii! közötti 203 bp-jének deletálásával kaptunk., EcoRI restrikciós enzimmel emésztjük, és a kapott lineáris DNS-t használjuk belső kontrollként a FUT8 meghatározására..
PCR-t kivitelezünk DNS polimeráz EzTaq (gyártó: Takara Shuzo) felhasználásával 20 pl össztérfogatú reakció oldatban [ExTaq puffer (gyártó: Takara Shuzo), 0,2 mmol/1 dNTF-k, 0,3 pmol/l FUT8 gén-specifikus primerek (SEQ ID NO: 13 és 14) és 5% DMSO] , amely a megfelelő sejtvonalból előállított 5 pl böszeresre hígított cDNS-oldatot tartalmaz és 5 μΐ (10 fg) plazmidot belső kontrollként. A PCR-t úgy kivitelezzük, hogy 94*C-on 3 percig melegítjük, ezt követi 32 melegítési ciklus, ciklusonként 94*C-on 1 percig, 60°C-on 1 percig és 72*C-ou 1
Másik PCR-t is kivitelezünk reakció-sorozatban, ahol 5 ul (0,1 fg, 1 fg, 5 fg, 10 fg, 50 fg, 100 fg, 500 fg vagy 1 pg) FUT8 standard plazmidot adunk az egyes expressziós sejtvonaleredetű cDNS-k helyett, és ezt használjuk kalibrációs görbe felvételéhez a FUT8 transzkripciós szinthez. Ebben az esetben 1 pg/ml sütőélesztő t-PNS-t (gyártó: SIGMA) használunk a standard plazmid hígítására.
Másrészről, mivel· tekintetbe vesszük, hogy a B-aktm gén. r.oIvamatosan át.íródik az egyes sejtekben és a transzkripciós szintje megközelítőleg azonos a segtexben, a B—akcrn gén transzkripciós szintjét az egyes expressziós sejtvonalakban a cDNS— szintézis hatékonyságának, indexeként határozzuk meg.
Az YBAc-pBS plazmidot, amelyben a patkány B-aktin cDNS-ener teljes ORE szekvenciáját inszertáltűk a 9(3) példában előállított pBluescri'pt II KS(. + )~be, Hindii! és .kupi restrikciós enzimekkel emésztjük, és a kapott linearis DNS—t nasz.naiguk standardként a β-aktin gén transzkripciós szintjének meghatározásához egy kalibrációs görbe felvételéhez.
Az YBAc-pBS-ből a patkány B-aktín belső nukleotídszekvencíáiának Dral és Kral közötti 180 bp-jének deletálásával kapott IBAcd-pBS-t, Hindi II és .Enpl restrikciós enzimekkel emésztjük, és a kapott lineáris DNS-t használjuk belső kontrollként a B-aktin mennyiségi meghatározására.
PCR-t kivitelezünk DNS polimeráz ExTaq (gyártó; Takara. Shuzo) felhasználásával 20 ni össztérfogatú reakció oldatban [ExTaq puffer (gyártó: Takara Shuzo), 0,2 mmol/1 dNTP~k, 0,5 pmol/l B-aktin gén-specifikus primerek (SEQ ID NO: 17 és 18) és 5% DMSO1, amely a megfelelő sejtvonalból előállított 5 pl 50szeresre hígított cDNS-oldatot tartalmaz és 5 pl (1 pg) plazmidot belső kontrollként. A PCR-t ügy kivitelezzük, hogy 94QC-cn 3 percig melegítjük, ezt követi 17 melegítési ciklus, ciklusonként 9'CC-on 30 másodpercig, 65°C-on 1 percig és 72'°C-on s kivitelezünk reakció-sorozatban, ahol 10 pg, pg, 1 pg, S00 fg vagy 100 fg B-aktin standard plazmidot adunk az egyes expresszles sejtvonal-eredetű cDNS-k helyett, és ezt használjuk kalibrációs görbe felvételéhez a B-aktin transzkripciós szinthez. Ebben, az esetben 1. pg/ml sütőélesztő t-RNS-t (gyártó: SIGMA) használunk a standard plazmid hígítására.
A 3. táblázatban bemutatott primer-sorozattal kivitelezett PCR-ral a 3. táblázat “target51 oszlopában megadott, méretű DNSfragmenst lehet amplifikálni az egyes gén transzkripciós termékekből és egyes standardokból, és egy DNS-fragmenst lehet amplífikálni az egyes belső kontroliokból, melynek méretét a ”kompét.ítor” oszlopban adtuk meg.
PCR után az egyes oldatokból 7 μί-t alávetünk 1,-75¾ agaróz gél.elektroforézisnek, és ezután a gélt megfestjük 30 perces áztatassal ixKcncentracró^u .SYBR Green I Nuclei, c Acid Gel Stam— ben (gyártó: Molecular Probes). Az amplif lkait. DNS-fragmens mennyiségét az egyes amplifikáit DNS-k lumineszcens intenzitásának kiszámításával mérjük egy fluoro-leképező segítségével (FluorXmager Sí; gyártó: Molecular Dynamics).
A standard plazmáddal mint templáttal végzett PCR-ral kapott amplifikáit termek mennyiségét az eljárással mérjük, és egy kalibrációs görbét készítünk a mért értékek pontozásával a standard plazmid mennyiségével szemben. A kalibrációs görbe segítségével ez egyes sejtvonalakban az érdekes gén c.DNS-ének mennyisége kiszámítható az amplifikált termék mennyiségéből, amikor az egyes express ziós. sej tvonal-eredetü cDNS~t használjuk temp.látként, és a. mennyiséget úgy definiáljuk, mint a m.RNS transzkripciós szintjét az egyes sejtvonalasban.
A 28. ábra bemutatja a FUT8 transzkripciós, szinteken, mint a ö-aktin transzkripciós termék mennyiségére vonatkozó relatív értékeket. Hárem sejtvonal, az mfF(JT9-l, mfFUT8-2 és mfFUT8~4 és a pAGE.2:4 9·-bevezetett sejt vonalak relative kicsi FUT8 transzkripciós szinttel rendelkeznek, ami 0,3% - .10% S-aktin transzkripciós szintnek felel meg. Másrészről, a három másik sejtvonal, az mfFUT8-3, mfFUT8-0 és mfFUT8-7 relatíve nagy FHT8 transzkripciós szinttel, bíró sejtvonalak, ami 20% - 40% β-aktin transzkripciós szintnek felel meg.
(4) Az a-l,6-fukozi 1··-transzferár {LF77T81 gént tú.l---axpresazáló seitvonai által termelt antitest tisztítása.
A í 2) pont szerint kapott hat FUT8 gént túl-ezpresszalo sejtvonalat és a negatív Kontroli sejtvonaiat bvoimcrna uxM ia.p~ közegben {gyártó: Life Technologies), melyet 0,5 mg/ml Hyerom vciη B~ve 1 (gyartó: Wakο ι·?ure Cnemica .·. I.noostx issés 0,% B.SA-val {mindkettő gyártója Life Technologies) kiegészítettünk, szuszpendáljuk 2 x 10” sejt/ml sűrűségben és ezután a teljes ssuszpenz iót átvesszük három 1'2 rt tenyésztő lonDÍkoa '.gyártó:
37ÖC—on 7 — 9 napos 8% CO2 atmoszférában mKubátorban vég
a kinyert felülúszót. centrifugáljuk (10000 ford/perc, 4:'C, 1 óra· és ezután egy 0,22 pm pórusátmérőjű, 150 ml kapacitású PES Filter IJ.ri.it~tai (gyártó: NALGENE) szűrjük.
:;sep-A High-Capacity-1 (gyártó: bio PROCESSING) betoltunk egy 0,8 cm átmérőjű oszlopba 2 cm vastag rétegben és 10 ml 0,1 mol/1 citrát-pufferrel (pH .3,0) és 10 ml 1 mol/1 glícin/NaOH0,15 mol/1 NaCl pufferrel (pH 8,6} mossuk, hogy a hordozót kiegyensúlyozzuk. Ezt követően az egyes tenyésztési felülúszókból 100 ml-et átengedünk az oszlopon, és 50 ml 1 mol/1 glicin/NaOH0,15 mol/1 NaCl pufferrel (pH 8,6) mossuk, Mosás után a ProsepA-hoz abszorbeált antitestet 2,5 ml 0,1 mol/1 citrát-pufferrel (pH 3,0} eluáljuk, az eluátumot 500 μί-re f rakcxcriál juk és az egyes frakciókat 100 μ.1 2 mol/1 Trisz-HCl-lel (pH 8,5) neutralizáljuk. Két, az antitestet nagy koncentrációban tartalmazó (1,2 ml összesen) frakciót BCA-módszerrel [Anal. Sioohem. 150, 76 (1.985)] kiválasztunk, egyesítünk és ezután 10 .mo.1/1 citrátpuf ferrel (pH 6,0) szemben 4°C~on egy nap és egy éjjel dializálunk. Dialízis után az antitest-oldatot kinyerjük és stezűrösnek vetjük alá egy 0,2'2 pm. pórusméretű Millex GV (gyár tó: MILLIPORE) alkalmazásával
Abból a célból, hogy a (4) pontban tisztított anti-GDS kimére antitestek in vitro citotoxikus aktivitását kiértékeljük, az ADCC aktivitást egy GD3-pozitiv sejttel, a G-361 humán melanoma tenyésztett sejtvonallal (RCR0091, Cell Bank at The Institute of
A G-361 sejteket, amelyeket 10% magzati borjú szérumot (gyártó: Life Technologies) tartalmazó RPMI1640 tápközegben (az alábbiakban úgy hivatkozunk rá, mint „RPMI1Ú40-FBS (10)tenyésztünk, 500 μΐ RPMI1640-FBS(10) tápközegben szus.zpendáÍjuk lxlOö sejt sűrűségben és 3,7 MBq ekvivalens Nab'CrCú-t adunk hozzá, majd 37“C-on, 30 percig tenyésztjük a sejtek rádióizctóppal történő jelzéséhez. Centrifugálás után (1200 ford/perc, 5 perc) a tenyészet felülúszó ját eldobjuk, és a célsejteket 5 ml RFMI1640-FBS(10)-ben szuszpendá1juk. A mosási lépést háromszor megismételjük és a sejtszuszpenziót 30 percig jégben inkubaijuk a radioaktív anyag spontán disszociációjához. A mosási lépést kétszer újra megismételjük, majd a sejteket 5 ml RFMI1640FBS(lü) tápközegben szuszpendáljuk, ezáltal 2x10*- sejt/ml sűrűségű célsejt szuszpenziót állítunk elő.
Másrészről, egy egészséges emberből 30 ml. vénás vért gyűjtünk és 0,5 ml heparín-nátriummal (gyártó: Shimizu Pharmaceutical) óvatosan, elegyítjük, majd 30 ml fiziológiás sóoldattal (gyártó: Otsuka Pharmaceutical) elegyítjük. Az elegyítés után 10 ml elegyet óvatosan 4 ml Lymphoprep-re rétegezünk {gyártó: NYCOMED PHARMA AS) és szobahőmérsékleten 2000 ford/perocel 30 percig- centrifugáljuk. A centrifuga csövekből az elválasztott mononukleózis sejt-frakciókat összegyűjtjük, egyesítjük, majd 30 ml RPMI1040-FBS(10)-ben szuszpendáljuk. Miután szobahőmérsékleten centrifugáltuk .(.1.200 ford/perc, 5 perc), a fel ül úszót eltávolítjuk és a sejteket 20 ml RPMI1640-FBS(10)-ben szuszpendáljuk. A mosási lépést kétszer megismételjük, majd 2x.l0° sejt/ml ef fektetne jt-szuszpenzict. ' á.llí tünk elő RPMI164O-FSS(10) tápközeg . %: : **:, *. í‘\ ** ** felhasználásával.
96-lyukú U-alakú .mélyedésekkel ellátott lemez (gyártó; Falcon) minden egyes lyukába 50 ul célsejt-szuszpenziót (IxIO'5 sejt/lyuk) osztunk szét. Ezután 100 pl effektorsejt-szusxpenziőt adunk mindegyik lyukhoz (2x1.0s sejt/lyuk), hogy ezáltal az effektorsejtek. és célsejtek arányát 20:1-re beállítsuk. Ezt követően 10 5) cítrát-puffért (pH 6,0) alkalmazásával a {«} pontban kapott egyes anti~GD3 kiméra antitestek 0,01 pg/ml, 0,1 pg/ml, 1 pg/ml és 10 pg/ml koncentrációjú higításí sorozatát állítjuk elő, és a hígított oldatokat lyukanként 50 pl mennyiségben szétosztjuk 0, 0025 pg/ml, 0, 625 pg/ml, 0,25 pg/ml és 2, 5 ug/ml végkoncentráció eléréséhez. Miután 5% COZ-tartalmú inkubátorban 37cC-on, 4 órán, át reagálhatjuk, a lemezt centrifugáljuk (1.200 ford/perc, 5 perc). Egy 12 mm átmérőjű RIA csőbe (gyártó IWAKI) mindegyik lyuk felülúszóiából 50 pl~t átviszunk, és a disszociált SACr mennyiségét ΜΙΝΑΧ-γ autó-gamma számlálóval 5550 (gyártó: PACKARD) mérjük.
A spontán felszabadult slCr mennyiségét ugyanezzel a reakcióval határozzuk meg egy olyan reakcióé légyben., amelyben, az effektorsejt-oldat és az antitest-oldat helyett 150 pl RFMI1640FBS(10) tápközeget adagolunk. Az összes felszabadult. •‘i,Cr mennyiségét. ugyanilyen művelettel határozzuk meg egy reakcíóelegybsn, amelyben az ef f'ektorsejt-oldat és az anti test-oldat helyett 100 pl IN sósavat és 50 pl RPMI1640-FBS(10) tápközeget adagolunk. Ezeket az értékeket felhasználva az ADCC aktivitást a 2. példa 2(3) pontjában Ismertetett (II) egyenletből számoljuk ki.
A 29. ábra az. antí-GD3 antitestek G-361 sejttel szembeni
ADCC aktivitását mutatja. Amint a 28. ábrán látható három, ala csony FUT8 ezpressziős szinttel rendelkező sejtvonal, az m.fFÜT81, m.fFUT8-2 és mfFUT8~<1 erős ADCC aktivitást mutatnak, amely ekvivalens a negatív kontroll pAGE249-bevezetett sejtvonal esetében mérttel. Másrészről, amint a 28.ábrán bemutatjuk, további három, magas FUT8 expresszíós szinttel rendelkező sejtvonal, az mfFUT8~3, mfFUT8-6 és mfFUT8-7 alacsony ADCC aktivitást mutat, amely ekvivalens a CHO sejtből előállított anti-GD3 antitest esetében mérttel. Ezen eredmények alapján látható, hogy az FUT8 expresszíős szint szabályozásával az előállított antitestek ADCC aktivitása kontrollálható a gazdasejtben.
(6/ .Egér a~l z 6-fukoziI-traxnszferá.z (t'UT8) gént túl-expresszáló sejtvonau áltál ter.melr. antitest CO.corláncának anaizzz.se
A (4) pontban tisztított anti-GD3 antitestek cukorláncait a na xz z a x j u κ. A mrFUT8—r> es peo.u219— nevezetett sszi.von.axaK artax termelt antitestekhez kötődő cukorláncokat a fehérjékről hidra.z ina- líz issei lehasítjuk [Method of Enzymology 83, 263 (198.2} 1 . A hidrazint csökkentett nyomás alatt bepárlással eltávolítjuk és vizes ammonium-acetát-oldat és ecetsav-anhidrid hozzáadásával iV-acet ilezünk . Liof i.li zá.lás után 2~amíno-piridlnnel fluoreszcens jelölést végzünk [J. Biochem. 95, 197 (1984)] . A fluoreszoens-jelölt cukorlánc csoportot (PA-kezelt cukorlánc csoport) a szennyeződésektől Surperdex Peptide HR 10/30 oszloppal (gyártó: Pharmacia) elválasztjuk. A cukorlánc~frakodókat dúsító centrífugálássai szárítjuk és tisztított, PA-kezelt cukorlánc-csoportként alkalmazzuk. Ezután a tisztított, PA-kezelt cn kor lánc-csoportot reverz fázisú HPLC analízisnek vetjük alá egy
CLC-ODS oszlop (gyártó: Shimadzu) felhasználásával (30. ábra). Amikor a csúcs területből számolunk, az mfPOTS-6-ban az α-1,0fukóz-mentes cukorlánc-tartalom .10% és az a-l.z 6-fukóz-kötött cukorlánc-tartalom. 90%. A pAGE249-ben az a-1,6-fukóz-mentes cukorlánc -tart alom. 20% és az c-1,6-fukőz-kötött cukorlánc-tartalom 80%. Ezen eredmények alapján azt találtuk, hogy egy termelt antitest a-1,6-fukóz-kötött cukorlánc tartalma az FUT3 gén túl— expresszálásáva.1 növekedett.
A 30. ábrán a mfFOTS-O és pAGE249-bnvezetett sejtvonalakkal előállított anitestekből előállított, PA-kezelt cukorláncok reverz fázisú HPLC analízisével kapott elúcíós mintázatokat mutatjuk be. A 30A. és 30F. ábra az mfFUT8~6 és pAGE24 9 elúcíós mintázatát mutatja, külön-külön. Az ordinátára a relatív fluoreszcens intenzitást és az abszcisszára az elúcíós időt vittük fel. ”A” puff érként egy nátr ium~f oszf át-puf fért. (pH 3,8) és δ” puffer ként nátríum-fosz.f át-puf fért (pH 3,8) + 0,5% 1-butano.lt alkalmazunk és az analízist az alábbi gradienssel kivitelezzük.
A 30. és 31. ábrán bemutatott (i)-(íx) csúcsok az alábbi (i)
GeNAc^l
Afen β1 —4QcNAc3 1 —OlcNAc—PA (i j) Gál β 1. ™4GIcNAc ff 1 ™2Afen α 1 6 Wa ff 1 -~4GlcNAc ff 1 ”4GlcNAc -PA
GIcNAc£l“2Mana1.
(iii)
Afen£ 1 -4GkNAc.S 1 —IGlcNAc-PA
Gál ff 1 ~~4GlcNAc ff 1 —2Ata 0? 1, ívfen 3 1”<3cNAc/3 1 -~<31d^Ac~~PA
Glcmc3l~-2Mmü'1
FucQ?I, ö Man31 ~<lcNAc 31 -~4GcNAc-PA
GeNAc^WAfeal
Gal jg l^Wl~2fctaal
Man/3 1”<1cNAcj8 1 —4GcNAc—PA
GcNAc31^2Mmal (vi 1)
Fucal^
Ms» j81 ~<3cNAe £ 1 ™4GIcNAc~PA
Gal j8 HOW
(vili) cWl-Ma<RAcjSl-2NtaaI \- ' 6
Kfe 31 g 1 -<&MAc-PA /3
Gá $ l-<&NAe31 ~2Man αΓ
GcNAc£l~2Nfena1
V 6 qchW1~“4 M®£1-^cNAc£ 1—4GcNAc-™PA /3
GkNAcj3WM»alz
A GlcNAc, Gal, Man, Fuc és PA az ΔΡ-acet il-glukozamint, galaktózt, mannózt, fukózt, illetve egy piridil-amino-csoportot jelent, A 30. ábrán, és 31.. ábrán az n-l, δ-fukóz-mentes cukorlánc csoport arányát az (í)-(ix) között a (í)-(iv) csúcsok által elfoglalt területből számoljuk és az a~l,6-fukóz-kötött cukorlánc csoport arányát az (i)-(ix) között az (v)-(ix) csúcsok által elfoglalt területből számoljuk.
12, példa
CHO sejt a~l,ő-fukö^il-transsferáz (FUT8) gén előállítása (1) CHO sejt előallí tása.
IHO/DG44 sejtekből a 9(1) példa szerint a tenyésztés 2. nap ján preparált egyszálú cDNS-ből kínai hörcsög FUT8 cDNS-t nyerünk ki az alábbi eljárással (32. ábra).
Először egy 5’-terminális nem-transzlációs régióra specifikus forward prímért (bemutatva SEQ ID NO:21~ben) és egy 3’ terminális nem-transzlációs régióra specifikus reverz prímért (bemutatva, a SEQ ID NO: 22-ben) tervezünk az egér FUT8 cDNSszekvenciából (GenBank, AB025193).
Ezt követően 25 μ.1 reakcióoldatot (ExTag puffer (gyártó: Takara Shuzo), 0,2 mmol/1 dNTP-k, 4% DMSO és 0,5 pmol/1 specifikus primerek (SEQ ID NG:21 és 22)), amely a CHO/DG44 sejteredetű cDNS-böl 1 μ 1-t tartalmaz, állítunk elő' és polimeréé láncreakciót (PCD) kivitelezünk DNS polimeréz ExTaq (gyártó: Takara Shuzo) felhasználásával. A PC'R-t úgy kivitelezzük, hegy 94°C-ön 1 percig melegítjük, ezt követi 30 melegítési, ciklus *4 ♦ ··» β· ♦ 4 Κ · «* 4 « Μ 6 »»;.* ·44 X « » 4 X 4* 4 S
4 «4 ♦:». β· *4
94cC-on 30 másodpercig, 55°C-on 30 másodpercig és egy ciklus 72°C-öfí 2 percig és egy végső melegítés. 72°C-on 10 percig.
A PC.R után a reakcióoldatot 0,8% aga ró z gélelektroforézisnek vetjük alá és egy specifikus amplifikált kb. 2 Kb fragmenst tisztítunk. Egy PCR2.1 plazmádba, 4 pl DNS “-fragmenst beillesztünk a gyártó utasításai szerint TOPO TA Cloning Kit (gyártó: Invítrogen) alkalmazásával, és E. coli DH5a-ba transzformáljuk a reakció oldattal. A plazmád DNS-eket. ismert eljárással izoláljuk a cDNS-inszertált 8 kiónból a kanamícin-rezísztens kolóniák közül .
A plazmádba ínszertált egyes cDNS nukleotid-szekvenciáját DNS Sequencer 377 segítségével (gyártó: Parkin Elmer) és BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit-tel (gyártó: Parkin Elmer) határozzuk meg a gyártó utasításai szerint. Igazoltuk, hogy ezzel a módszerrel meghatározott összes ínszertált eDNS a CHO sejt FUT8 teljes ORF-jét tartalmazó szekvenciát kódolja. Ezek közül egy plazmád DNS-t, amely egyáltalán nem tartalmaz leolvasási bábát PCR-ral a szekvenciában, kiválasztunk. Az alábbiakban erre a plazmádra ügy hivatkozunk, mint CHfFUTSpCP.2.1. A CHO FUT8 cDNS-ének meghatározott nukleotidszekvenciáját a SEQ ID NO:1-ben és amánosav-szekvenciáját a SEQ
ID NO:23-ban mutatjuk be (2) CHO sejt 6-fukQZil~t.ranszferáz (FUT8) g&nomiális székía élőéi
Felhasználva próbaként pontban kapott CHO sejt FÜT8
QRF teljes hosszúságú oDNS-fragmensét, egy CHO sejt FUT8 genomiális kión.t. kapunk egy· ismert génemet szkrmelo módszerrei., pl. Molecular Cloning, 2. kiadás, Current Protocols in Molecular Biology, A Laboratory Manual, 2. kiadás (1989). A kapott •genomiális klen különböző restrikciós enzimekkel történő emésztés sután, Southern-hibridizációt kivitelezünk próbaként egy AfaI~Saü3AI fragmens (kb. 280 bp) segítségével, amely a CHO sejt FUT8 cDNS iníciációs kodonját tartalmazza, és ezután egy XbalXbaü fragmenst (kb. 2,5 Kb) és egy SacI-SacI fragmenst (kb. 6,5 Kb) szelektálunk a pozitív reakciót mutató- restrikciós enzim fragmens-ek közül, behelyezve pBluescript II KS ( + ) vektorba (gyártó: Stratagene).
Az egyes genomiális fragmens-ek nukleotid-szekvenciáját meghatározzuk DNA Sequencer 377 (gyártó: ParklnElmer) és BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit (gyártó: Parkin Elmer) segítségével a gyártó utasításai szerint eljárva. Ezáltal igazoltuk, hogy az Xoal-Xbal fragmens a CHO sejt FUT8nak exon 2-t tartalmazó kb. 2,5 Kb upstream intronját kódolja, és a SacI-SacI fragmens a CHO sejt FUT8~nak exon 2-t tartalmazókb. 6,5 Kb donwstream intronját kódolja. A továbbiakban az XóalXbal frag-me.nst tartalmazó plazmádra pFdSf gE2-2 jelöléssel és- -a SacI-SacI fragmenst tartalmazó plazmádra pFUT8fgE2-4 jelöléssel hivatkozunk. A CHO sejt FUT8 ezen 2-t tartalmazó genom régiójá nak -nukleotid-szekve-nciáját (kb. 9, 0 Kb) a SEQ ID NO:3-ban mu13. példa.
CHO sejt előállítása, amelyben az a-1,ő-fukoxil-transzferál gén
4 4 X V X 4 » 4 4 K
XX 4* *4 szétszakított és antitest előállítása ezen sejt felhasználásával
Egy CHG sejtet állítunk elő, amelyből a CHO sejt a-1,6~ fukozil-transzferáz (FUT8) gén exon 2-t tartalmazó genom-régiót töröljük, és kiértékeljük ezzel a sejttel termelt antitest ADCC aktivitását.
A ploxPPurc plazmidot az alábbi eljárással szerkesztjük meg (33. ábra.) .
pl NEBuffer 4-ben (gyártó: New England Biolabs) 1 μα pKOSelect .Puro-t (gyártó: Lexicon) feloldunk és 20 egység .Asci restrikciós enzimet (gyártó: New England Biolabs} adunk hozzá,· majd 37“C-on. 2 órán át emésztjük.. Az emésztési, reakció után az oldatot 08% (t/tf) agaróz gélelektroforézisnek vetjük alá, hogy egy kb. 1,5 K.b DNS-fragmenst tisztítsunk, amely a puromicinrezisztencia gén expressziós egységet tartalmazza.
Másrészről., 1 gg pl.ozP plazmidot (leírták a 314512/99 sz. japán közzétett vizsgált szabadalmi, bejelentésben) feloldunk 35 ul NEBuffer 4-ben és 20 egység As cl restrikciós enzimet (gyártó: New England Biolabs) adunk hozzá, majd 37QC~on 2 órán át emésztjük. Az emésztési reakció után az oldatot 08% (t/tf) agaróz gélelektroforézisnek vetjük alá, hogy egy kb. 2,0 Kb DNSf ragmen st. tisztítsunk.
A kapott pKOSelectPuro plazmid-eredetü AscT-AscI fragmenst (4,5 pl, kb. 1,5 Kb) , 0,5 pl plozP-eredetű AscI-Ascl fragmenst (kb. 2,0 Kb) és 5 pl Ligation High-t (gyártó: Toyobo) összekeverönk és 16°C-on 30 percig ligálunk. Ennek a reakció oldatnak a felhasználásával E. toll DH5a--t transzformálunk, és agy plazmid
DNS-t izolálunk a kapott ampici n~rez.isztens kiónokból ismert módszerrel. Erre a plazmádra a továbbiakban pploxPPuro-ként hi vatkozunk (2) pK02UT8gE2-l plazmád megszerkesztése
A pKOFUT8gE2-I plazmidot az alábbi eljárással szerkesztjük meg (34. ábra} a 12(2} példában kapott pFET8fgE2-2 plazmid segítségével, amely a kínai hörcsög FUT 8 exon 2-jót tartalmazó genom régiót hordozza.
pl NEBuffer 1-ben (gyártó: New England Biolabs), mely 100 pg/ml BSA-t tartalmaz (gyártó: New England Bioiabs), feloldunk 2 pg pFOT8fgE2-2 plazmidot és 20 egység Saul restrikciós enzimet (gyártó: New England Biolabs) adunk hozzá, majd 37°C-cn 2 órán at emésztjük. Egy DNS — r ragmenst nyerünk, Ki a reakció ouriatooi. etano.los kiosapással és feloldjuk 35 pl, 100 ug/ml BSA-t tartalmazó NEBuffer 2-ben (gyártó: New England Biolabs), és 20 egység EocRv restrikciós enzimet (New England Bioiabs) adunk hozzá, majd 2 órán át 37&C~on emésztjük. Az emésztési reakció után az oldatot 0,8% (t/tf) agaró-z gélelektroforézisnek vetjük alá, hogy egy kb. 1,5 Kb DNS-fragmenst tisztítsunk.
Elkülönítve 1 pg LITMUS28 plazmidot (gyártó: New England Bioiabs) feloldunk NEBuffer 1-ben, mely 100 ug/ml BSA-t tartalmaz ;mindre11ónéj. gyártó: New mgiand aioiaps) , és z-j egység Saul restrikciós enzimet (gyártó: New England Bioiabs) adunk hozzá, majd 37*C-on 2 órán át emésztjük. Egy DNS-fragmenst nye rünk ki a reakció oldatból etanolos Elcsapással és feloldjuk 35.
pl, 100 pg/ml BSA-t tartalmazó NEBuffer 2-ben (gyártó:: New England Biolabs;, és 20 egység EcoRV restrikciós enzimet (New England Biolabs) adunk hozzá, majd. 2 órán át 37*C-on emésztjük. Az emésztési reakció után az oldatot 0,8% ít/tf) agaróz gélelektroforé-zisnek vetjük alá, hogy egy kb. 2,8 Kb DNSfragmenst tisztítsunk.
A kapott pFüT8fgE2-2 plazmid-eredetű Eco'RV-Sacl fragmenst (4,5 pl, kb. 1,5 Kb), 0,5 pl LITMÜS28 plazmid-eredetű EcoRV-SacI fragmenst (kb. 2,8 Kb) és 5 pl Ligation High-t (gyártó: T-oyobo) összekeverünk, és 16°C-on 30 percig ligálunk. Ennek a reakció oldatnak a felhasználásával E. coli DH5a~t transzformálunk, és egy plazmád DNS~t izolálunk a kapott ampioillin-rezisztens klánokból ismert módszerrel. Erre a plazmádra a továbbiakban pKO FiJ T 8 g £ 2 -1 - ként hivatkozunk.
f.3) pAOFUi’SgEF-E plazmád megszerkesztése
A pKOFUT8gE2~2 plazmádét az alábbi eljárással szerkesztjük meg (35. ábra) a (2) pontban kapott pKOFUT8gE2-l plazmád felhas z π á 1 á s á v a 1.
pl NEBuffer 2'-ben (gyártó: New England Biolabs), amely 100 pg/ml BSA-t tartalmaz, 2,0 pg pKOFUT8gE2-l plazmidot feloldunk és 20 egység EcoRV restrikciós enzimet (gyártó: New England Biolabs) adunk hozzá, majd 37°C-on 2 órán át emésztjük. Egy DNSfragmenst nyerünk ki a reakció oldatból etanolos kicsapással és feloldjuk 30 pl, 100 ug/ml BSA-t tartalmazó NEBuffer l-ben (gyártó: New England Biolabs), és 20 egység Khpl restrikciós entimet (New England Biolabs) adunk, hozzá., majd 2 órán át 37°C~ori emésztjük. Az emésztési reakció után az oldatot 0,8% (t/tf) agaróz gélelektroforé-zisnek vetjük alá, hogy egy kb. 1,5 Kb DN S-f ragmen s t t i s z t í t sunk.
majd 37°C~on. 2 órán, át emésztjük. Egy DNS-fragmenst nyerünk ki a reakció oldatból etanolos kicsapással és feloldjuk 30 μΐ, 100 pg/ml BSA~t tartalmazó NEBuffer 1-ben (gyártó: New England Biolabs·, és 20 egység Kpnl restrikciós enzimet (New England Biolabs} adunk hozzá, majd 2 órán át 37°C-on. emésztjük. Az. emésztési reakció után, az oldatot 0,8% (t/tf) agaróz gélelektroforézisnek vetjük alá, hogy egy kb. 3,5 Kb méretű DNS-fragmenst kapott pKQFBl’8gE2-l plazmíd-eredetű tcoRV-Kpnl fragmenst.
szekeverünk, és 16°C-on 30 percig 1ágálunk. Ennek a reakció oldatnak a felhasználásával E. coli DH5a-t transzformálunk, és egy plazmid DN.S-t izolálunk a kapott ampícillin-rezisztens klór i sme rt mód szerrel.
Erre a plazmidra a továbbiakba iá) pscF3T3gS2-3 plazmid megszerkesztése scFUT8gE2~3 plazmidot az alábbi eljárással szerkesztjük lóra; a 12(2) példában kapott pFUT§fgE2—4 plazmid fel*κ· «« avax, amexy a xj.na. γ<λχ3 exon 2 <. taxualmciZo genom-régiót hordozza μϊ NEBuffer 1-ben (gyártó: Takara Shuzo) 2,0 ug pFÜT8fgE2-4~et feloldunk és 20 egység RpaXX restrikciós enzimet (gyártó:: New England Biolabs) adunk hozzá, majd 37vC-on 2 órán át emésztjük. Egy DNS-fragmenst nyerünk ki a reakció oldatból etanolos- kicsapással, és ezután a DNS-terminál!sokat tompa végűvé tesszük Blunting High segítségével (gyártó: Toyobo) a gyártó utasításai szerint. A DNS-fragmenst fenol-kloroformos extrakci.óval és etanolos kicsapással kinyerjük, 35 pl NEBuffer 2-ben feloldjuk (gyártó: New England Biolabs) és 20 egység HxndXII restrikciós enzimet (New England Biolabs) adunk hozzá, majd 2 órán át 37°C-on emésztjük. Az emésztési reakció után az oldatot 0,8% (t/tf) agaróz gélelektroforézisnek vetjük alá, hogy egy kb. 3,5 Kb DNS-fragmenst tisztítsunk.
Másrészről, 1 pg LITMUS39 plazmidot. (gyártó: New England Biolabs) feloldunk 35 pl. NEBuffer 2-ben (gyártó: New England Biolabs), és az oldatot összekeverjük 20 egység EcoRV restrikciós enzimmel (gyártó: New England Biolabs) és 20 egység HindiII restrikciós enzimmel (gyártó: New England Biolabs), majd 37°C-on 2 órán, át emésztjük. Az emésztési reakció után az oldatot 0,8% (t/tf) .agaróz gélelektroforézisnek vetjük alá, hogy egy kb. 2,8 Kb méretű DNS-fragmenst tisztítsunk..
A kapott pFUT8fgE2-4 plazmid-eredetű Hpall-HindiII fragmenst (4 pl, kb. 3,5 Kb), 1 ul LITMUS39 plazmid-eredetű EcoRV-ffindlI.I fragmenst (kb. 2,8 Kb) és 5 pl Ligation High-t (gyártó: Toyobo) összekeverünk és IS^C-on 30 percig ligálunk. Ennek a reakció plazmíd DN'S-t izolálunk, a kapott ampicillín-rezisztens ki ónokból ismert módszerrel. Erre a plazmádra a továbbiakban psoFOT8gE2-3 jelöléssel hivatkozunk.
f'5) pKöFUT8gE2~3 plasmid megszerkesztése
A pKOFUT8g.E2-3 plazmidot az alábbi eljárással szerkesztjük meg (37. ábra) a 12(2) példában kapott pFUT8fgE2~4 plazmid felhasználásával, amely a kínai hörcsög FUT8 exon 2-t tartalmazó genom-régiót hordozza.
pl EcoRI~hez alkalmas NEBuffar-ben (gyártó: New England Biolabs ) 2,0 ug pFUT8f.gE2.~4 p.l azmidot feloldunk és 20 egység EcoRT restrikciós enzimet (gyártó: New England Biolabs) és 20 egység HindiII restrikciós enzimet adunk hozzá, majd Sl^C-on 2 órán át emésztjük. Az emésztési reakció után az oldatot 0,8% (t./tf) agaróz gélelektroforézísnek vetjük alá, hogy egy kb. 1,8 Kb DNS-fragmenst tisztitsunk.
Elkülönítve, 1 pg pBluescript TI KS(a) plazmidot feloldunk 35 pl E'coRI-he.z alkalmas NERuf fer-ben (gyártó: New England Biolabs) és 20 egység EcoRI restrikciós enzimet (gyártó: New England biolabs) és 20 egység Hindii! restrikciós enzimet adunk hozzá, majd 37°C~on 2 órán át emésztjük. Az emésztési reakció után az oldatot 0,8% (t/tf) agaróz gélelektroforézísnek. vetjük alá, hogy egy kb. 3,0 Kb méretű DNS-fragmenst tisztítsunk.
A kapott pFUT8fcE2-4 plazmid-eredetü HindiII-EcoRI fragmenst (4 pl, kb. 1,8 Kb) , 1 pl HindiII-EeoRI fragmenst (kb. 3,0 Kb) , melyet a pBluescript II KSH) plazmádból. készítettünk és 5 μΐ
Ligation Hígh-t (gyártó: .Toyobo) összekeverünk, és 16°C-on 30 percig ligálunk. Ennek a reakció oldatnak a felhasználásával coli ,l>H5cx~c transztormálunK, es egy plazmid uNb~t azolaiu.uk a kapott ampicillin.-reziszt.ens· klánokból ismert módszerrel. Erre a piazmid-ra. a továbbiakban pKOE;UT8gE2~3 jelöléssel hivatkozunk.
fid pKOFUT8gE2~4 pl a sít id megszerkesztése
A pKQFUT8gE2-4 plazmidot az alábbi eljárással szerkesztjük meg (38. ábra) a (4) illetve (5) pontban kapott pscFUT8fgE2-3 és pKOFüT8gE2-3 plazmidok felhasználásával.
pl Sacl-hez alkalmas NEBuffar-ben (gyártó: New England Biolabs.), amely 100 pg/ml BSA-t (gyártó: New England Biolabs) tartalmaz, 1,0 pg pscFUT8.gE.2-3 plazmisdot feloldunk, és 20 egység Sáli restrikciós enzimet (gyártó: New England Biolabs) adunk hozzá, majd 37°C-on 2 órán át emésztjük. Egy DNS-fragmenst nyerünk ki a reakció oldatból et.ano.los kicsapással és feloldjuk 30 pl, 100 pg/ml BSA-t tartalmazó NEBuffer 2-ben (gyártó: New England Biolabs), és 20 egység Hindii! restrikciós enzimet (New England Biolabs) adunk hozzá, majd 2 órán át 37vC-o.n emésztjük. Az emésztési reakció után az oldatot. 0,8% (t/tf) agaróz gélelektroforé-zisnek vetjük alá, hogy egy kb. 3,6 Kb DNSfragmenst tisztítsunk.
Elkülönítve, 1,0 pg pKOFUT8gE2-3 plazmidot feloldunk 35 pl Sáli-hez alkalmas NEBuffe-r-ben (gyártó: New England Biolabs), és 20 egység Sail restrikciós enzimet (gyártó: New England Biolabs) adunk hozzá, majd 37*C-on 2 órán át emésztjük. Egy DNS-fragmenst nyerünk ki a reakció oldatból etanolos kicsapással és feloldjuk * *· . t: :
*·Χ pl NEBuffer 2-ben (gyártó: New England Biolabs), és 20 egység Hindin restrikciós enzimet (New England Biolabs) adunk hozzá, majd 2 órán át 37°C~on. emésztjük. Az emésztési reakció után a reakció oldathoz 35 μΐ 1 mol/1 Tris-HCl puffért (pH 3,0) és 3,5 pl E. coli C15~eredetű alkálikus foszfatázt (gyártó: Takara Shuzo) adunk, majd 65*C-on 30 percig a DNS-terminál ásókat defoszforiléljuk. A DNS-fragmenst a defosztorilálasi reakció végén fencl/klorcformos extrakcióval, majd etanolos kicsapással kinyerjük és ezután 10 pl steril vízben feloldjuk.
A. kapott p»cFDT8gE2-3 pl.azmi.d-eredetű Sa.11 -HindiII fragmenst (4,0 pl, kb. 3,1 Kb), 1,0 ul pKOFUT8g£2-3 eredetű Sa 11-HindiII fragmenst (kb. 4,8 Kb) és 5 pl Id. gáti on High-t (gyártó: Toyobo) összekeverünk, és Í6°C~on 30 percig ligálunk. Ennek, a reakció oldatnak a felhasználásával ,E. coli DH5a~t transzf orrnálunk, és egy plazmád DNS-t izolálunk a kapott ampicillin-rezisztens klótokból ismert módszerrel. Erre a plazmidra a továbbiakban pKOFUT8gE2~4-ként hivatkozunk.
(7) pKOFUT8g£2-5 plazmid megszerkesztése
A pKOFüT8gE.2-5 plazmádét. az alábbi, eljárással szerkesztjük meg (39. ábra) a (3) illetve (6) pontban kapott pKDEUT8gE2-2 és pKQFUT8gE2-4 plazmidok felhasználásával.
ul NEBuffer 4-ben (gyártó: New England Biolabs) 1 ug pKOFUT8gE2~2 pia zm időt feloldunk és 20 egység Smal restrikciós enzimet (gyártó: New England Biolabs) adunk hozzá, majd 25°C--on 2 órán át emésztjük. Egy DNS-fragmenst nyerünk ki a reakció oldatból etanolo-s Elcsapással és feloldjuk 30 pl NEBuffer 2-ben (gyártó: New England Biolabs)·, és 20 egység B'amHI restrikciós enzimet (New England Biolabs) adunk hozzá, majd 2 órán át Simeon emésztjük. Az emésztési reakció után a .reakció oldathoz 30 pl 1 mol/1 Trís-HCl puffért (pH 8,0) és 3,5 pl E. coli C15-eredetü alkálikus foszfatázt (gyártó: Takara Shuzo) adunk, majd 85*C-on 30 percig a DN'S-termin.álisokat defoszforiláljuk. A DNS-fragmenst a def oszt őri ~1 á lás-i reakció végén fenol/klorof ormos extrakcíóval, majd etanolos kicsapással kinyerjük és ezután 10 pl steril vízben feloldjuk.
Elkülönítve, 1 pg pKOFUTSgE2-4 plazmidot feloldunk 30 p.l NSBuffer 4-ben (gyártó: Takara Shuzo),· és 20 egység Smal restrikciós enzimet (gyártó: Nev: England tíiolabs) adunx .nozza, majd 37*C-on 2 órán át emésztjük. Egy DNS-fragmenst nyerünk ki a reakció oldatból etanolos kicsapással és feloldjuk 30 pl NEBuffer 2-ben (gyártó: New England Eíolabs), és 20 egység BamHI restrikciós enzimet (New England Biolabs) adunk hozzá, majd 2 órán át 37°C-on emésztjük. Az emésztési reakció után az oldatot 0,8%; (t/tf) agaróz gélelektroforézisnek vetjük alá, hogy egy kb. 5,2 Kb méretű DNS-fragmenst tisztítsunk.
A. kapott pKOFUT8gE2-2 plazmid-eredetű Smal-EamX fragmenst (0,5 pl, kb. 5,05 Kb) , 4,5 pl Sm-al-öam’I fragmenst (kb. 5,4 Kb) , melyet a p.KOFOT8gE2-4 plazmádból készítettünk, és 5 pl Ligation High-t (gyártó: Toyobo) összekeverünk, és .l€?*C-on 15 órán keresztül lígálunk. Ennek a. reakció oldatnak a felhasználásával E. coli DH5a-t transzformálunk, és egy plazmád DNS-t izolálunk a kapott ampíeillín-rezisztens kiónokból· ismert módszerrel. Erre a olazmíd-ra a továbbiakban pKOFűT8gE2-5“ként hivatkozunk.
fő) pHOFDTSPuro plazmid' megszerkesztése
A pKQ.FUT8Pu.ro plazmidot az alábbi eljárással (40. ábra) a (7) pontban kapott pKOFUT8gE2-5 plazmid felhasználásával szerkesztjük meg.
5-.Q μΐ NEBuffer 4-ben (gyártó: New England Biolabs) 1,0 pg pKOSelectDT plazmádét (gyártó: Lexicon) feloldunk, és 16 egység ssrll restrikciós enzimet (gyártó: New England Biolabs) adunk hozzá, majd 37°'C~on 2 órán át emésztjük. Az emésztési reakció után az oldatot 0,8% (t/tf) agaróz gélelektroforézisnek vetjük alá, hogy egy kb. 1,2 Kb DNS-fragmenst tisztítsunk, amely a diftárra toxin expressziós egyseget, certaunazzaElkülönítve, 1,0 pg pKOEUT8gE2-5 plazmldot feloldunk 50 ul NEBuffer 5-ben (gyártó: New England Biolabs) és 16 egység Rsrll restrikciós enzimet (gyártó: New England Biolabs) adunk hozzá, majd 37aC-on 2 órán át emésztjük. Az emésztési reakció után a reakció oldathoz: 30 pl 1 mol/1 Tris-HCl puffért (pH 8,0) és 3,5 μΐ E. coli C15-eredetű alkálikus foszfátért (gyártó: Takara Snuzo) adunk, majd B5*C-on 1 órán át a DNS-terminál!sokat defoszf ori.lál-’juk, A DNS-fragmenst a def oszt orilálási reakció végén fenol/kloro-formos extrakcióval, majd etanolos kicsapással kinyerjük és ezután 10 pl steril vízben feloldjuk.
A kapott pKOSelectDT plazmid-eredetű AsrlI-Asrlí fragmenst (1,0 μΐ, kb. 1,2 Kb), 1,0 μΐ pKOEDT8gE2-5 plazmid-eredetű Rsrllssrll fragmenst (kb. 10,4 Kb) , 3,0 pl steril vizet és 5 μΐ Ligation High-t (gyártó: Toy-obo) összekeverünk, és 16°C--on 30 percig .i.iga.Lunx. Ennex. a resKCiö o.i.cxatnaK a femasznarasával öli DH5a-t transzformálunk, és egy plazmid. DNS-t izolálunk a kapott ampicállin-rezisztens kiónokból ismert módszerrel. Erre a plazmid-ra a továbbiakban pKOFUTSPuro—ként hivatkozunk.
sejt előállítása, amelyben- az a~l,6-f ukoz.il-transzferáz gén ezen 2-t tartalmazó gencm-régi.ó egy másolata, széttördelt (1) Target vektor bevezetése
A kínai hörcsög FUT8 genom-régió célzó pKQEüTSPurö vektort, melyet ennek a példának az (1- pontja szerint szerkesztettünk meg, bevezetjük a 8. példa 1(2) pontja szerint előállított 5-03 törzsbe.
A pKOFUT8Pu.ro plazmád génjét az 5-03 törzsbe az alábbiakban ismertetett elektroporációval fCytotechnology 3, 133 (1990)] vezetjük be. Először 150 pg pK0FUT8Puro plazmidot feloldunk 1,8 ml Sa.H~hez alkalmas NEBuffer-ben (gyártó: New England Biolabs}, és 600 egység Sa.II restrikciós enzimet (gyártó: New England Biolabs) adunk hozzá, majd 37°C-on 5 órán át emésztjük, hogy egy lineáris fragmenst kapjunk. A reakció oldatot etanolos kicsapásnak vetjük alá és a kinyert lineáris plazmidot 1 gg/ul vizes oldattá alakítjuk. Elkülönítve az 5-03 törzset K--P3S puf serben (137 mol/1 KC1, 2/7 mol/1 NaCl, 8,1 mol/1 NajHPO^, 1,5 mol/1. KH2PO4, 4,0 mol/1 MgCl/) szuszpendál juk 8 x 10' sejt/ml sűrűségben. Miután 200 pl sejt-szuszpenziót (1,6 x 10!> sejt.) összekevertünk 4 pl (4 pg) lineáris plazmáddal, a teljes sejt-DNS elegyet átvisszük Gene Pulser Cuvette-be (belső-elektród távolság 2 mm) (gyártó: BIO-RAD), és ezután elektrcpcrációt kivitelezünk egy Gene Pulser sejtfúziős készülék (gyártó: BIO-RAD) alkalmazásával 350 V pulzáló feszültségnél és 250 uF elektromos kapacitásnál.
Miután az elektropoxációt 30 követ tá.ban ugyanilyen módon kivite lestük, a sejt-szuszpenzíót IMDM tápközegben szuszpendáljuk (gyártó: Life Technologies), melyet 10% magzati borjú szérummal és 1 x koncentráció HT-vel (gyártó: Life Technologies) kiegészítettünk, és 30 darab 10 cm átmérőjű adhéziós sejttenyésztő edénybe (gyártó: Falcon) inokuláljuk. Tenyésztés után (37°C, 24 óra, 5% CO2) a tenyészet felülúszóját. eltávolítjuk, és 10-10 ml IMDM. tápközeget szétosztunk, melyet 15 pg/ml puromicinnel (gyártó: S.IGMA) és 10% magzati borjú dializált szérummal (gyártó: Life Technologies) egészítettünk ki. Tíz napig tenyésztjük, mia latt a tápközeg cseréjét napos időközökben megismételjük, így puromicin-rezisztens sejtvonalakat kapunk (2) Target vektor-bevezetett sejtvonal. előállítása
Tetszőlegesen 900 kolóniát nyerünk a fenti (1) pontban leírt puromicin-rezísztens sejtvonalakból az alábbiak szerint.
Először a felülúszót eltávolítjuk a 10 cm-es edényekből, melyekben a puromicín-rezisztens .sejtvonal-kolóniák képződtek, és 7 ml foszfát-puffért adunk az edényekbe, melyeket ezután, sztereoszkőp mikroszkóp alá helyezünk. Majd az egyes kolóniákat körülhatároljuk és kivesszük egy Pipetteman segítségével (gyártó: GILSON) és átvisszük egy 96-lyukú kerekaljú lemezre (gyártó: Falcon). Tripszines kezelés után az egyes kolóniákat egy 96lyukú sikaljú, adhéziós sejttenyésztéshez használt lemezre •inokuláljuk (gyártó: Iwaki Glass) és 1 hétig IMDM tápközegben (gyártó: Life Técnologies) tenyésztjük, melyet 15 pg/ml puromicinnel (gyártó: STGMA) és 10% magzati borjú dializált szé«♦•«iví «V «*··.*« *♦
rummal (gyártó: Life Tecnologíes) egészítettünk ki.
Tenyésztés után az egyes kolóniákat a lemezen tripszines ke zelésnek vetjük alá, majd összekeverjük két térfogatnyi fagyasztva-szárított tápközeggel (103 DMSG, 40% magzati borjú szérum, 40% IMDM) . Az elegy felét egy 96-lyukú síkaljú adhéziós sejttenyésztő lemezre (gyártó: Iwaki Glass) inokuláljuk ismétlő lemezként, míg az elegy másik felét krioprezervációnak vetjük alá eredeti lemezekként. Az ismétlő lemezt 1 hétig tenyésztjük IMDM tápközegben (gyártó: Life Technologies), melyet 15 pg/ml puromicínnel (gyártó: SIGMA) és 10% magzati borjú dializált szé rummal (gyártó: Life Technologies) egészítettünk ki.
(3; Homológ rekombináció diagnózisa genomiális R
A (2) pontban kapott 900 kiónban a homológ rekombináció diagnózisát genomiális PCR-ral végezzük.
Első lépésként az egyes klórok genom. DNS-t preparáljuk a (2) pontban előállított ismétlő lemezből ismert módszerrel [Analytical Biochemistry 201, 331 -(1.992)), és egy éjszakán át feloldjuk 30 pl TE-RNáz pufferben (pH 8,0) (10 mmol/1 Trisz-HCl, 1 mmol/1 EpTA, 200 pg/ml RNáz A). Egy prímért (bemutatva SEQ ID NO:.26~ban), amely a 12. példában kapott F0T8 genom-régió között a célzó vektor homológ régióján kívüli szekvenciához kötődik és eoy másik prímért i.s (bemutatva SEQ ID NO: 27-ben) tervezünk, amely a vektorban, a lox.P szekvenciához kötődik.
DNS polimeréz ExTaq (gyártó: Takara Shuzo), 25 pl reakció oldat [] felhasználásával, amely az egyes fenti módon preparált genom. DNS-oldato-kból 10 pl-t tartalmaz, polímeráz láncreakciót
ezzel a módszerrel (4) Homológ rekombináció diagnózisa genom Southorn-blottinggal
Ά homológ rekombináció diagnózisát ax 1 kIónban, melynek pozitív szignálját a (3) pontban azonosítottuk, genom Southernblot t i n g g a 1 vé g e z z ü k.
A (2) pontban krío-prezervált eredeti lemezek közül egy 96lyukú lemezt, mely a (3) pontban talált pozitív kiónt tartalmazza, szelektáljuk és 37°C-o-n 10 percig 5% CCn-tartalomnál inkubáljuk. Inkubalás után a sejteket a pozitív ki ónnak megfelelő lyukból összegyűjtjük, és egy 24-lyukú síkaljú, adhéziós sejtekhez alkalmas lemezre (gyártó: -Greiner) inokuláljuk. Egy hétig IMDM tápközegben (gyártó: Life Technologies) tenyésztjük, melyet 15 ug/ml puromicínnel (gyártó: SIGMA) és 10% magzati borjú oia .t i za .1 r. s zérumma< gyár to: 1,.:. re '1 ecnnologzes} r leges z.:. t entünr, majd a sejteket egy 6-lyukú síkaljú adhéziós sejtekre szolgáló lemezre (gyártó: Greiner) inokuláljuk. Genom DNS-t preparálunk a lemezen lévő kiónból ismert módszerrel [Nucleic Acids Research 3, 2303 (1976)] és ISO μί TE-RNáz pufferben (pH 8,0) (10 mmol/1 v «X * * λ, * > ¢. a *#·# λ *'♦'♦♦ * Λ *· * ' »t .e· #> e# *.*>
z —nCi, 1 mmol/1 EDTa, zOU ug/m.i t<Naz A) egy ejszaxan át
A kapott genom DNS 12 μο-já.t 120 μΐ NEBuffer 3-ban (gyártó:
New England Biolabs) feloldjuk, és 25 egység PstI restrikciós enzimet (gyártó: New England Biolabs) adunk hozzá, majd 37°C-on egy éjszakán át emésztjük. A reakció oldatból, egy DNS~fragmenst kinyerünk etanolos kiesapással, 20 pl. TE-puffezben (pH 8,0) (10 mmol/1 Trisz-HCl, 1 mmol/1 EDTA) feloldjuk, és ezután 0,8% (t/tf) agaróz gélelektroforézisnek vetjük alá. Elektroforézis után a genom DNS-t átvisszük egy nylon membránra ismert módszerrel [Proc. Natl. Acad. Sci USA 76, 3683 (1979)]. A transzfer teljessé válása után a nylon membránt 80cC~on melegítjük 2 órán keresztül.
Elkülönítve, egy próbát állítunk elő az alábbi módon, melyet a Southern-blottingban alkalmazunk. Először primereket tervezünk (SEQ ID NO: 2.8 és 29), amelyek a 12. példában kapott, a FUT 8 genom-régíóval homológ célzó vektor régión kívüli szekvenciához kötődnek. Ezután DNS polimeréz ExTaq (gyártó: Takara Shuzo) felhasználásával 20 pl reakció oldatot készítünk [EzTaq puffer (gyártó: TakaraShuzo) , 0,2 mmol/1 dNTP-k és 0,5 pmol/l génspecifikus primerek (SEQ ID NO:28 és 29)1, amely 4,0 ng 12(2) példában kapott pFUTSgfE2-2 plazmidot tartalmaz, és polimerét láncreakciót (PCP) kivitelezünk. A PCR-t úgy végezzük, hogy melegítés 94cC-on 1 percig, majd 25 ciklus, ciklusonként 94“C 30 másodpercig, 55yC 30 másodpercig és 74*C 1 percig. PCR után a reakció oldatot 1,75% (t/tf) agaróz gélelektroforézisnek vetjük alá, hogy egy kb. 230 bp DNS-f ragmenst tisztítsunk. A kapott próba .DNS-oldatot (5 pd.) radio! zotéppal jelezzük 1,75 MBq ía *i:P]dCTP és Me gap rime TINA Labeling System, dC'TP (gyártó: Amersham Pharmacia Biotech) alkalmazásával.
A hibridizációt az alábbiak szerint hajtjuk végre. Először a nylon membránt lezárjuk egy hengeralakú palackba és prehibrid!zárást végzünk 65uC-on 3 órán át 15 ml hibridizációs oldat hozzáaádásaval [5 x SSPE, 50 x Denhaldt-féle oldat, 0,5% (t/tf) SDS, 100 pg/ml lazac sperma DNS]. Ezt követően a ~ΖΡjelzett próba DNS-t hővel denaturáljuk és a palackba helyezzük. Ezután a nylon membránt 65°C-on melegítjük egy éjszakán át.
Hibridizálás után a nylon membránt 50 ml 2 x SSC-0,1% (t/tf) SDS-ben áztatjuk és SS^C-n melegítjük 15 percig. Miután a mosási lépést kétszer megismételtük, a membránt 50 ml 0,2 x SSC-0,1% (t/tf) SDS-ben áztatjuk és 65°C-on melegítjük 15 percig. Mosás után a membránt röntgen-filmnek tesszük ki -80oC-on két éjszakán át kifejlesztésre.
A FstI restrikciós enzimes kezelés egy kb. 4,4 Kb DNSfragmenst képez a vadtípusú FUT8 alléiból. Másrészről, egy kb. 6,0 Kb DNS-fragmenst képzőnk az alléiból, amelyben a célzó vektorral homológ rekombinációt, hoztunk létre.
Ezzel a módszerrel ilyen specifikus kb. 4,4 Kb és kb, 6,0 Kb fragmenseket kapunk a (3) pont szerinti pozitív klón genom DNSböl. Mivel mindkét fragmens kvantitatív aránya 1:1, azt igazoltuk, hogy a klón egy olyan klón, amelyben a FUT8 alléi 1. kópiája széttördelt. Az alábbiakban erre a kiónra mint a íst.AFÜTS 2-46 törzsre hivatkozunk.
A pBS185 Cre rekombináz expressziós vektort
Technologies) bevezetjük ennek a példának 2, pontjában előállított Ist.AFUTS 2-46 törzsbe.
A p3S185 plazmíd génjét a Ist.ÁEüTS 2-46 törzsbe elektrcporációval visszük be (Cytotechnology 3, 123 (1990)] a következő eljárással. Először a lst,ÁF.UT8 2-46 törzset K-PBS pufferben (137 mol/1 KC1, 2,7 mol/1 NaCl,. 8,1 mol/.l. NajHPO^, 1,5 mol/1 KHaPOa, 4,0 mol/1 MgClJ szuszpendáljak 8 x 10' sejt/ml sűrűségben. Miután 200 pl sejt-szuszpenzíót (1,6 x 10€ sejt) összekevertünk 4 pg pBS185 plazmáddal, a teljes sejt-DNS elegyet átvisszük Gene Pulser Cuvette-be (belső-elektród távolság 2 m) (gyártó: BIO-RÁD), és ezután elektroporációt kivitelezünk egy Gene Pulser sejtfúziós készülék (gyártó: SIO-RAD) alkalmazásával 330 V pulzáló feszültségnél és 250 uF elektromos kapacitásnál. Géntranszfer után a sejt-szuszpenziót 10 mi IMDM. tápközegben szuszpendáljuk (gyártó: Life Technologies), melyet 10·% magzati borjú szérummal és 1 z .koncentráció RT-vel (gyártó: Life Technologies) kiegészítettünk, és tovább hígítjuk 20,000-szeresre ugyanezzel, a tápközeggel. A sejteket 7 darab 10 cm átmérőjű adhéziós sejttenyésztő edényre inokuláljuk (gyártó: Falcon) és 37°C-on, 24 órán át, 5% CCb-tartalomnál tenyésztjük. Tenyésztés után a felűlúszót eltávolítjuk és 1.0% magzati borjú dializált szérummal (gyártó: Life Technologies) kiegészített IMDM tápközeget (gyártó: Life Technologies) osztunk szét 10 ml-enként. Tíz napig tenyésztjük.
mialatt a tápközeg cseréjét 3-4 napos időközökben .megismételjük.
(2} Cre rekcmbináz expresszá.ló vektor-bevezetett sejtvonalak előállítása
Tetszőleges 400 kolóniát kapunk az alábbiak szerint az (1) pontban előállított sejtvonalból.
Először a felü.lúszót eltávolítjuk a 10 cm-es edényekből és 7 ml foszfát-puffért adunk az edényekbe, melyeket ezután sztereoszkóp mikroszkóp alá helyezünk. Majd az egyes kolóniákat körülhatároljuk és kivesszük egy Pipettémán segítségével (gyártó: omSON) és átvi.sszür egv 96 — lyuku kereke.J.’;u .i.emezre (gyártó : Falcon). Tripszines kezelés után az egyes kolóniákat egy 96lyuk.ú síkaljú, adhéziós sejttenyésztő lemezre inokuláljuk (gyártó: Xwaki Glass) és 1 hétig I.MDM tápközegben (gyártó: Life Tecnologies) tenyésztjük, melyet 10% magzati borjú dializált szérummal (gyártó: Life TecnoLogies) egészítettünk ki.
Tenyésztés után az egyes kolóniákat a lemezen tripszines kezelésnek vetjük alá, majd összekeverjük két térfogatnyi fagyasztva-szárltott tápközeggel (20% DMSO, 40% magzati borjú szérum, 40% IMDM) . Az elegy felét egy ön-lyukú síkaljú adhéziós sejttenyésztő lemezre (gyártó: Iwaki Glass) inokuláljuk ismétlő lemezként, míg az elegy másik felét krioprezervációnak vetjük alá eredeti lemezként.
szérumma 1.
Technologies) egészítettünk oozitív kiónt. meÍvből a ΙοκΡ szekvenciák közé beékelődő
(.3) Gyógyszer-rezisztencia gén eliminációjónak diagnózisa genom Sou them ~r?i ο t t mg a.2ka ama za sővs 2
A gyógyszer-rezisztencia gén eliminációjának diagnózisát a >2) pontban talált pozitív kiónok közül 6 adott kiónon genom Southern-b1otfinggal végezzük.
A (2) pontban krio-prezervált eredeti lemezek közül 9-6-lyukú lemezeket, melyek a 6 pozitív kiónt tartalmazzák, szelektáljuk és 37°c~on 10 percig 5% COg-tartalomnal ínkubáljuk. Xnkubálás után a sejteket az egyes pozitív kiónoknak megfelelő lyukból összegyűjtjük, és egy 24-lyu.kú síkaljú, adhéziós sejttenyésztő lemezre (gyártó: Greiner) inoknláijuk. Egy hétig IMDM tápközegben (gyártó: Life Technologies) tenyésztjük, melyet 10% magzati borjú dializált szérummal (gyártó: Life Technologies) kiegészítettünk, majd a sejteket egy 6-lyukú síkaljú adhéziós sejttenyésztő lemezre (gyártó: Greiner) inokuláljuk. Genom DNS-t preparálunk az egyes lemezen lévő kiónokból ismert módszerrel [Nucleic Acids Research 3, 2303 (1976)1 és 150 pl TE-RNáz pufferben (pH 8,0) (10 mmol/1 Trisz-HCl, 1 mmol/1 EDTA, 200 pg/ml RNaz A) egy éi szaka π át íeio.idjuk,
A kapott genom DNS 12 pg-ját. 120 pl SamHI-hez alkalmas NEBuffer-ben (gyártó: New .England Biolabs) feloldjuk, és 20 -egység BamHI restrikciós enzimmel (gyártó: New England Biolabs) összekeverjük·, majd 37aC-on egy éjszakán át emésztjük. A reakció oldatból egy DNS-fragmenst kinyer link etanolos kicsapással, 20 pl
st végzünk βδ^ϋ-οη 3 órán át 15 ml hibridizációs dat hozzáa-ádásával [5 x SSPE, 50 x Denhaldt-féle oldat, 0,5% (t/tf) SDS, 100 pg/ml lazac sperma DNS]. Ezt követőén a jelzett próba DNS-t hővel denaturáljuk és a palackba helyezzük. Ezután a nylon membránt. 65°C-on melegítjük egy éjszakán át.
Hibridizálás után a nylon membránt 50 ml 2 x SSC-0,1% (t/tf) SDS-ben áztatjuk és 65cC-on melegítjük 15 percig. Miután a mosási lépést kétszer megismételtük, a membránt 50 ml 0,2 x SSC-0,1% (t/tf) SDS-ben áztatjuk és 65°C-on melegítjük 15 percig. Mosás után a membránt röntgen-filmnek tesszük ki -80°C’-on két éjszakán át kifejlesztésre.
A SamHI restrikciós enzimes kezelés egy kb. 19,0 Kb DNSfragmenst képez a vadtípusú FUT8 alléiból. Másrészről, egy kb. 12,5 Kb DNS-fragmenst képzőnk az alléiból, amelyben a célzó vektorral homológ rekombinációt Létrehoztuk. Ráadásul, amikor a puromicín-rezisztencia gént (kb. 1,5 Kb) deletáltuk az alléiból, amelyben a homológ rekombinációt lérehoztuk., egy kb. 11,0 Kb DNS-fragmenst képzőnk ugyanilyen kezeléssel.
Ezzel a módszerrel ilyen kb. 19,0 Kb és kb. 11,0 Kb specifikus fragmenseket kapunk a 6 klón közül 5 klón genom DNS-éből. Mível mindkét f ragmens kvantitatív aránya 1:1, azt igazoltuk, hogy a puromicín-rezisztencia gént deletáltuk azokból a sejtvonalakból, melyekben a FUT8 genom-régió 1 kópiája széttördelt. Az alábbiakban ezt a kiónt Ist.ÁFUTB· 2-46-1 kIónnak nevezzük. A 1st,ÁFUT8 2-46-1, lst.éFUT8 2-46 és 5-03 törzsek genom Southernblotting eredményeit a 41. ábrán mutatjuk be. A lst.AFUT8 2-46-1 törzset letétbe is helyeztük 2001. szeptember 26-án, PERM BP/ / 5 o .5.01.0171. számon az Int ernat lonai Patent organism Depositary, National Institute of .Advanced Industrial Science and Technology (AIST Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome Tsukuba-shi,
Xbaraki-ken 305-8566 Jacan) le-téteménves szervnél.
4. A széttördelt u-1, β-fukozil-transzferáz (FUT8) gén-kópiát hordozó sejtvonal által termelt antitest tisztítása
Ezen példa 3. pontjában a FUT8 alléi egy kópiájának széttörésével kapott Ist.ÁFUTS 2-46-1-et I.MDM tápközegben (gyártó: Life Technologies;, melyet 15 pg/ml puromicinnei (gyártó: SIGMA)és 10% magzati borjú dializált szérummal (gyártó: Life Technolo-gies) egészítettünk ki, szuazpendáljuk 3 x 103 sejt/ml. sűrűségben, és a. 60 ml teljes szuszpenziót két T182 .adhézióssejttenyésztéshez alkalmas lombikba (gyártó: -Greiner) ínol-uláljuk.. Három napos tenyésztés után a felülüszót eldobjuk, és a teljes 60 ml-t EXCELL301 tápközegre (gyártó: JRH Biosciences) kicseréljük.
Tenyésztés után (7 nap, 37 °C, 5% COL-tartalmú inkubátorban) az intakt sejtek számát meghatározzuk annak igazolására, hogy élet képességük ma jdnem azonos (mindegyik 30% vagy kevesebb), és ezután mindegyik sejtszuszpenzíót kinyerjük. A sejt-szuszpenzíót centrifugáljuk (3000 ford/'perc, 4°C, 10 perc), majd a kinyert felülüszót centrifugáljuk (10000 ford/perc, 1 óra), é-s ezután szűrjük egy 0,22 pm pörusméretű, 150 ml k.apcitású LES Filter Unit (gyártó: NALGENE) segítségével.
Prosep-A HighCapacity-t (gyártó: bioPROCESSING) betörtünk 0,8 cm átmérőjű oszlopba 2 cm vastag réteuben és
mol/1. citrát-pufferrel (pH 3,0) és 10 ml 1 mol/1 glicin/NaOH0,15 mol/1 NaCl pufferrel (pH 8,6) mossuk, hogy a hordozót kiegyensúlyozzuk. Ezt követően az egyes tenyésztési felülúszókból 100 m.l-et átengedünk az oszlopon, és 50 ml 1 mol/1 glicin/NaOH0,15 mol/1 NaCl pufferrel (pH 8,6) mossuk. Mosás után a ProsepA-hoz abszorbeált antitestet 2,5 ml 0,1 mol/1 citrát-pufferrel (pH 3,0) eluáljuk, az eluátumot 500 μί-re frakciónáljuk és az egyes frakciókat 100 μί 2 mol/1 Trisz.-HCl.-lel (pH 8,5} neutralizáljuk. Két, az antitestet nagy koncentrációban tartalmazó (1,2 ml összesen) frakciót BCA-módszerrel (Anal. Biochem. 150, 76 (1985) 1 kiválasztunk, egyesitűnk és ezután. 10 mol/1 citrát-0,15 m.el/1 NaCl-pufferrel (pH 6,0) szemben «°C~on egy nap és egy éj jel diai izéinek. Dialízis után az antitest-oldatot kinyerjük és steril szűrésnek vetjük alá egy 0,22 pm pórusméretü Mlllex GV (gyártó: MILLIPORE) alkalmazásával.
5. Az o-l, β-fukozil-transzf eráz (FUT 8.) széttördelt gén-kópiát hordozó sejtvonal által termelt antitest in vitro citotoxikus aktivitása (ADCC aktivitás)
Abból a célból, hogy ennek a példának a 4. pontjában tisztított anti-CCR4 antitest in vitro citotoxikus aktivitását kiértékeljük, az ADCC aktivitást a 8. példában ismertetett CCR4pozitív sejtvonal CCR4/EL-4 felhasználásával mérjük.
A CCR4/EL-4 sejteket, amelyeket 10% magzati borjú szérumot (gyártó: Life Technologies) tartalmazó RRMI1640 tápközegben (az alábbiakban úgy hivatkozunk rá, mint „RPMI1640-EBS (10)) altenyésztünk, 500 pl RPMI1640-FBS(10) tápközegben szuszpendálΚ X
juk 1x10* sejt sűrűségben es 3, / MBq exvivalens Nai^Crthj—ot. adunk hozzá, majd 37cC-on, 90 percig tenyésztjük a sejtek radioízotóp pal történő jelzéshez. Centríf ugálás után (1200 f-ord/perc, perc) a tenyészet felülüszóját eldobjuk és a célsejteket 5 ml RPM11640-FBS(10)-ben szuszpendáljuk. A mosási lépést háromszor megismételjük és a s-ejtszuszpenziót 30 percig jégben inkubáljuk a. radioaktív anyag spontán disszociációjához. Az átmosás! lépést kétszer újra megismételjük, majd a sejteket 5 ml RPMI1640FBS(lú) tápközegben szuszpendáljuk, ezáltal 2x10° sejt/ml sűrűségű célsejt szuszpenziót állítunk elő.
Elkülönítve, egy egészséges- emberből 30 ml vénás vért gyűjtünk és 0,5 ml heparin-nátrlommal (gyártó: Shimizu Pharmaceutical) -óvatosan elegyítjük, majd. 30 ml fiziológiás sóoldattal (gyártó: Otsuka Pharmaceutical) elegyítjük. Az elegyítés után 10 ml elegyet óvatosan 4 mi Lymphoprep-re rétegzünk (gyártó: NYCOMED PHARMA. AS) és szobahőmérsékleten 2000 ford/perccel 30 percig centrifugáljuk. A centrifuga csövekből az elválasztott mononukleáris sejt-frakciókat összegyűjtjük, egyesítjük majd 30 mi RPMI1640-FBS(10)-ben szuszpendáljuk. Miután szobahőmérsékleten 1200 ford/perccel 15 percig centrifugáljuk, a tenyészet felülűszóját eldobjuk és a sejteket 20 ml RPMI1640-F8S (10) -ben szuszpendáljuk. A mosási lépést kétszer megismételjük, majd 2xl06 sejt/ml effektorsejt .szuszpenziót állítunk elő RPM11640-FBB (.10) tápközeg felnasznalasavai.
sejt/lyuk) osztunk szét. Ezután 100 pl effektorsejt-szuszpenzíót
adunk mindegyik, lyukh (2,5 x 10 sejt/lyu.k), hogy ezált
r.e.mtorssj teκ ss -csissitsk aranyat z5:i—re beailicsuk. ezt kö vetően RPMX1640-FBS (1.0) ~t alkalmazva, a 13. példa 5. pontjában kapott anti-CCR4 antitestek. 0,01 pg/m.l, 0,1 gg/ml, 1 ug/ml és 10 pg/ml koncentrációjú higítási sorozatát állítjuk elő, és a hígított oldatokat lyukanként 50 μΐ mennyiségben szétosztjuk, hogy 0,0025 ug/ml, 0,025 μα/ml, 0,25 pg/ml, illetve 2,5 gg/ml végkoncentrációt kapjunk. Miután 5% CCy-tartalmú inkubátorban 37“Con, 4 órán át reagálástjuk, a lemezt 1200 ford/perccel 5 percig centrifugáljuk. Egy 12 mm átmérőjű RIA csőbe (gyártó IWAKI) mindegyik lyuk, felülúszójából 7 5 μ 1-t juttatunk, és a felszabadult slCr mennyiségét ΜΙΝΑΧ-γ autó-gamma számlálóval 5550 (gyárt ó: PACKARD) mérjük.
A spontán felszabadult ^Cr mennyiségét ugyanezzel a művelettel határozzuk meg egy reakcióelegyben, amelyben az effektorsejt-oldat és az antitest-oldat helyett 150 μΐ RPMI1640FBS(10) tápközeget adagolunk. Az összes felszabadult ^Cr mennyiségét ugyanilyen művelettel határozzuk meg egy reakcióelegyben, amelyben az ef.fektorsejt~o.ldat és az antitest-oldat helyett 100 pl IN sósavat és 50 μΐ RPMI1640-FBS(10) tápközeget adagolunk. Ezeket, az értékeket felhasználva az ADCC aktivitást a (II) egyenletből számoljuk ki.
A 42, ábra az egyes an.ti-CCR4 antitestek ADCC aktivitását mutatja be. A Ist.AFUTÖ 2-46-1 törzsből kapott antitest, amelyben a FUTÓ alléi egy másolata széttördelt, jelentősen erősebb ADCC aktivitást mutat, mint az 5-03 törzs által előállított antitest, amely a gén-díszruncló előtti CHO seétvonal. Ezen anti* * ♦ « * ·.
• · J : Sx: . », ♦»» * * ** φφ. * testek antigén-kötő aktivitásában nem figyeltünk meg változást. Az eredmények alapján megállapítottuk, hogy az előállított antitestek ADCC aktivitása növelhető az FUT8 alléi széttörésével a ga zda sej t ekben.
14. példa
Aektin-rezisztens CTO/DG44 sejt előállítása és antitest termelés a sejt felhasználásával fi) Lektin-reziaztens CHO/DG44 előállítása.
A CHO/DG44 sejteket 15 o;t adhéziós tenyésztő lombikban (gyártó: Greiner) IMDM-FBS(IO) tápközegben [IMDM tápközeg, amely 10% magzati borjú szérumot (DBS) és 1 x koncentráció HTkiegészitőt tartalmaz (gyártó: GIBCO BRL)1 tenyésztve addig növesztjük, amíg éppen elérik az összefolyás előtti állapotot. Miután a sejteket 5 ml DULBECCO PBS-sel (gyártó: Invitrogen) mostuk, 1,5 ml 0,05%-os Dulbecco PBS-sel hígított tripszint (gyártó: Invitrogen) adunk hozzá és 3'7°C-on 5 percig in kubaijuk, hogy a lombik aljáról a sejteket leváljanak. A levált sejteket a szokásosan használt centrifugálási. művelettel, kinyerjük, .és IMDMFBS(10) tápközegben szuszpendá1juk 1 z 1G3 sejt/ml sűrűségben, és ezután 0,1 ug/ml M-metil-N ’ -nitro-Aí-nítrozo-guanídín alkilező szert (alábiakban MNNGr~ként· ivatkozunk rá) adunk illetve nem adunk hozzá. Miután. 37'C-on 3 napig CO? inkubátorban, (gyártó: ΤΑΒΑΣ) inkubáltuk, a tenyészet felülúszójátelön.tjük és a sejteket ismét mossuk., leválasztjuk ugyanezekkel a műveletekkel, IMDM-FHS(10) tápközegben szuszpendáljuk, és egy só-lyukú adhéziós tenyésztő lemezre (gyártó: IWAKI Glass) inokulátjuk, hogy «* «.** * * * ♦
1000 sejt/lyuk sűrűséget érjünk el. Mindegyik lyukhoz, vég- koncent, rációként a tapkozegoen, i mg/m.i. .'..-ens culinarfs agg.:,utinint {továbbiakban LCA, gyártó: Vector), 1 mg/ml Aleuria aurantia agglutinint (Aleuria aurantia lektin; továbbiakban AAL, gyártó: Vector.) vagy 1 mg7ml vese bab agglut inint (Phaseoius vulgáris leucoagglutinin, alábbiakban L-PHA”, gyártó: Vector) adunk hozzá.. Miután 2 hétig 37'°'C-on CO;> inkubátorban, tenyésztettük ezeket, a megjelent kolóniákat 1-ektin-rezisztens CHO/DG44ként kapjuk. Tekintve a kapott lektin-rezisztens CHO/DG44-t, egy LCA.-reziszte.ns sejtvonalat CHO-LCA-nak, egy AAL-rezisztens sejtvonalat CHO-AA.L-nak és egy L~PHA~rezisztens sejtvonalat CHO-P.HAnak neveztünk el. Amikor ezeknek a sejtvonalaknak a reziztencíáját különböző lektinekkel szemben megvizsgáljuk, azt talál ink, hocv a CHO-LCA rezi sztens az AAL—ra is és a CHO-AA1< re.zísztens- az LCA-ra is. Ráadásul a CHO-LCA. és a CHO-AAL rezisztenciát mutat egy olyan lektlnnél szemben is, amely felismer egy cukorlánc szerkezetet, mely azonos az LCA és AAL által felismert cukorlánc szerkezettel, nevezetesen az a lektin, amely felismeri azt cukorlánc szerkezetet,melyben az 1-es helyzetű fukóz: az Nacetil-glükózamin maradék 6-os helyzetéhez alfa-kötésen keresztül kötődik a redukáló végen az N-glikozid-kapcsolt cukorláncban. Pontosabban azt találtuk, hogy a CHO-LCA és a CHO-AAL rezisztenciát és túlélést mutat még az 1 mg/ml végkoncentrációjú borsó aggluti.n.innel {Pisám sativum agglutinin; a továbbiakban
se'? t vona ,ia tat kacnatunr a xe zerenöo settek
számának növekedésével. Az alábbiakban ezeket a sejtvonalakat használjuk az analízish (z.í Antz—Cc.R4 mman kiméra antxtest—termelő sejt eioázlutása
Az anti-CCR4 humán kiméra antitest expressziós pKANTEX216ö plazmádat bevezetjük az (1) pontban kapott három lektin-rezi tens sejtvonalba a példában leírt módszerrel, és gén amplifikálást végzünk MTX-el, hogy anti-CCR4 humán kiméra antitestet termelő sejtvonalat állítsunk elő. Az antitest expresszié mennyiségének a 8-2 példában leírt ELISA módszerrel való mérésével, antitest-expresszáló transzformánsokat kapunk az egyes CHO-LCA, CHO-AAL és CHO-PHA sejtvonalakból. A kapott transzformánsokat tekintve a CRC—LCA-bél. származó transzformánst CHO/CCR4 -LCA-nak, a CHO-AAL-ből származó transzformánst CHO/CCR4-AAL-nak és a. CHO-PHA-ból származó transzformánst CHQ/CCR4-PHA-nak nevezzük el. A CHO/CCR4-LCA-t Nega-1.3 néven deponáltuk 2001. szeptember 2€~án FERM BP-7756 letéti számon az International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305-8566 Japan) .I. e t ét emén ye s s z e r x·- né r /3) Hagy ADCC aktfvl tású antifest el da .1..1.1 fása lekt.in-z
A (2| pontban kapott három transxformáns felhasználásával tisztított antitesteket készítünk a 8-3 példában leirt módszerrel. Az egyes tisztított anti-CCR4 humán kiméra antitestek anti-
gén-kötő aktivitását a 8-2 példában leirt ELISA-val értékeljük ki. As összes transz formáns által termelt antitest hasonló anti gén-kötő aktivitást mutat a 3. példában előállított rekombináns sejtvonallal {5-03 törzs) termelt antitestéhez gazdaként az általános CHO/DG44 sejtet alkalmazva. Ezeknek a tisztított antitesteknek felhasználásával az egyes tisztított antí-CCR4 humán kiméra antitestek ADCC aktivitását a 8-7 példában leírt módszerrel értékeljük ki. A kapott eredményeket a 43. ábrán mutatjuk be. összehasonlítva az 5-03 törzzsel termelt antitesttel,, kb. 100-szorosra. növekedett ADCC aktivitást figyeltünk meg a CHO/CCR-4-LCA-va.l és CnO/CCR4-AAL-val termelt antitestekben. Másrészről, semmilyen szignifikáns növekedést nem tapasztaltunk az ADCC aktivitásban a CHO/CCR4-PHA-val termelt antitestben. Amikor pedig a CHO/CCR4-LCA és YB2/0 által termelt antitestek ADCC aktivitását hasonlítjuk össze a 8-7 példában leírt módszerrel, azt találjuk, hogy a CHO/CCR4-LCA által termelt antitest még erősebb ADCC aktivitást mutat., mint az 5-03 törzzsel termelt antitest, hasonlóan a 8-1 példában előállított YB2/0 sejtvonallal termelt
KM2760-1 antitest (4) zektin-rezisztens CHO sejt által termelt antitestek cukorlánc analízise
A (3) pontban tisztított anti-CC.R4 humán kiméra antitestek cukorláncait analizáljuk. Az egyes tisztított antitestek oldatát kicseréljük 10 mM KH?Pth-~ra Ultra Free 0,5-10K (gyártó: Millipore) felhasználásával. A cserét úgy kivitelezzük, hogy kicserélési aránv 80-szoros vaov méq több. Az antitestek koncent-
rációját az oldatcsere után UV-1600 (gyártó: Shimadzu) alkalmazásával mérjük. A moláris abszorpciós koefficienst az egyes antitestek aminosav-szekvenciájából számítjuk ki az alábbi (III) képlet alapján (Advances in Protein Chemistry 12, 303 (1962)], és a koncentrációt a 280 nm-n mért abszorbancía definiálásával
1,38 mg/ml-nek határozzuk, meg.
Sitaoi/i- A x n.l + B x n2 e C x n3 (III)
Eisiíol/srd::: Eiac.'../1/MW
Eimoi/i: abszorpciós koefficiens 280 nm-en (mg^ailcnf
EiKiai/jn: moláris abszorpciós koefficiens 280 nm~en (M~;'cm'·1}
A: a triptofán moláris abszorpciós koefficiense 280 nm-en = 5550 (PPcm'h
3: tirczín moláris abszorpciós koefficiense 280 nm-en = 1340 (M’^cm1)
C: a cisztin moláris abszorpciós koefficiense 280 nmen (200 (M“Acm“!'} ni: triptof'ánok száma per 1 antitest molekula
n.2: tirozinok száma per 1 antitest molekula n3: tisztinek száma per 1 antitest molekula
MW: antitest moleklulatömege (g/mol)
Hydraclub S-204 teszt csőbe az egyes antitestek 100 μα-ját behelyezzük és centrifugális bepárlóban szárítjuk. A szárított mintát a teszt csőben hidrazinolízisnek vetjük alá Hydraclub (gyártó: Hohnenj segítségével. A mintát a hidrazinnal .110°C-on 1 órán át reagáltakjuk egy Hohnen által gyártott hídrazinolizis
reagens segítségével [Method of Enzymology 83, 263 (1982) I .
reakció után a hídrazint csökkentett nyomáson bepároljak, és a reakció csövet hagyjuk 30 perc alatt szobahőmérsékletre melegedni.. Ezt követően 250 pl acetilező reagenst (gyártó: Hohnen) és 25 pl ecetsav-anhidrídet adunk hozzá,· majd folyamatosan keverjük szobahőmérsékleten 30 percig. Ezután további 250 μΐ acetilező reagenst és 25 pl ecetsav-anhidrídet adunk hozzá, majd folyamatosan keverjük szobahőmérsékleten 1 órán keresztül. A mintát. -80cC-on lefagyasztjuk és kb. 17 órán át fagyasztva szárítjuk. A cukorláncokat a fagyasztva-száritott mintából Cellulose Cartridge Glycan Preparation. Kit (gyártó: Takara Shuzo; segítségével nyerjük ki. A. minta cukorlánc-oldatot centrifugális bepárlóban szárítjuk, és ezután 2-amino-piridínnel fluoreszcens jelölést végzünk [J. Biochem. 95, 197 (1984)]. A 2-amíno-piridin-oldatot úgy állítjuk elő, hogy minden 1 g 2-amino-piridinre 760 pl HCl-t adunk (1 x PA. oldat) és tízszeresre hígítjuk reverz ozmózissal tisztított vízzel (tízszeresre hígított PA-oldat). Nátriumcíano-bórhidrid-oldatot készítünk 20 pl 1 x PA-oldat és 430 pl reverz ozmózissal tisztított víz/10 mg nátrium-bórhidrid hozzáadásával. A mintához 67 pl 10-szeresre hígított PA-oldatot adunk, ezt követően. lG0cC-on 15 percig reagálhatjuk és spontán, lehűtjük, majd 2 pl nátríum-ciano-bórhidridet adunk hozzá, ezt követően 90oC-on 12 órán át reagálhatjuk a mintában levő cukorláncok fluoreszcens jelöléséhez. A fluoreszcens-jelölt cukorlánccsoportot (PA-kezelh cukorlánc-csoport) a reagens-feleslegtől
Surperdex Peptide HR 10/30 oszloppal (gyártó: Pharmacia) vá lasztjuk el. Ezt a lépést eluensként 10 mM ammóuíum-hidrooén-
karbonáttal 0,5 ml/perc átfolyási sebességnél és szobahőmérsék letű oszloppal kivitelezzük, és egy fluoreszcens detektor alkalmazásával 320 nm gerjesztési hullámhosszon és 400 nm fluoreszcens hullámhosszon. Az eluátumot a minta hozzáadása után 20-30 percig gyűjtjük, centrifugális bepárlőban szárítjuk és tisztított PA-kezelt cukorláncként alkalmazzuk. Ezt követően a tisztított PA-kezelt cukor.lán-cok reverz fázisú HPLC analízisét elvégezzük CLC-ODS oszlop segítségével (gyártó: Shimadzu.) . Ebben a lépésben az oszlop hőmérséklete 55&C és az átfolyási arány 1 ml/perc, és az alkalmazott fluoreszcens detektor gerjesztési hullámhossza 320 nm és fluoreszcens hullámhossza 400 nm. Az oszlopot 10 mM nátrium-fesztát-pufferre! kiegyensúlyozzuk (pH 3,8), és az elúciót 80 perc alatt 0,5% 1-butanol lineáris sűrűség gradienssel végezzük. Minden egyes PA-kezelt cukorláncot azonosítunk a szétválasztott PA-kezelt cukorláncok egyes csúcsainak post source decay” analízisével flight tömeg spektremetría matrix-assisted lézer ionizációs idő (MALDI-TOF-MS analízis) segítségével, az elúciós helyzetek PA-kezelt cukorlánc standardokkal. (gyártó: Takara Shuzc) történd összehasonlításával, és reverz fázisú HPLC analízissel az egyes PA-kezelt cukorláncok különböző enzimekkel való emésztése után (45. ábra). Az egyes cukorlánc-tartalmakat a reverz HPLC analízissel kapott PA-kezelt cukorláncok csúcs alatti területeiből számítjuk ki. Egy PAkezelt cukorlánc, melynek redukáló vége nem N-acetil-glükózamin, ki van zárva a csúcs alatti területből számításból, mert, az egy szennyezés vagy a PA··· Kezelt cukor lánc előállítás egy mellékterméke .
Az analízist ugyanolyan módon végezzük, mint a 11(6) példában nátrium-fesztát-puffér (pH 3,8} alkalmazásával A-pufférként, és nátri.um-foszfát-puf.fér (pH 3,8} + 0,5% 1-butanol felhasználásával B-pu f fe rként.
A 45. ábrán az a-1,6-fukóz-mentes cukorlánc--csoport arányát az (i)-(viii) közül az (i)-(iv) csúcsok által elfoglalt területből számítjuk ki, és az a-1,6-fukóz-kötött cukorlánc-csoport arányát az (i)-(viíi) közül az (v)-(viií) csúcsok alatti területből kalkuláljuk.
A lektin-rezísztens sejtvonalakkal termelt, tisztított antiCCR4 humán kiméra antitestek cukorlánc-analizisének eredményeit a 6. táblázatban mutatjuk be. Az eredmények a lektin-rezísztens sejtvonalakkal termelt anti-CCR4 humán kiméra antitest cukoriáncainak analízisét mutatják. Az a-1,6—fukóz-mentes cukorlánook arányát (%i , melyet a csúcs-területekből a 4 (d) példában leírt analízis módszerrel számítottunk ki, adjuk meg a 6. táblázatban.
6. táblazat
Antitestet termelő sejtek a-1,6-fukóz-mentes komplex kettős-láncú cukorlánc (%;
5-0.3 törzs 9
CHO/CCR4-LCA törzs 48
CHO/CCR4-AAL törzs 27
CHO/CCR4-PHA törzs 3
Összehasonlítva az 5-03 törzzsel termelt antitesttel az a-1,6-fukóz-mentes cukorláncok aránya megnő 9%-ról 48%-ra a
CHO/CCR4-LCA-val termelt antitestben, amikor az analizált csúcs-
r-ületből számoltunk. Az a~l,. 6-fukóz-mentes cu.korláncok aránya
98-ról 27%-ra nő a. CHO/CCR4-AAL- Lal termelt antitestben. Másrészről a cukörlánc mintázatokban és az a-1,6-fukóz-mentes cukorláncok arányában alig találhatók változások a PHA-rezisztens sejtvonalal termelt antitestben, amikor az 5—03 törzzsel hasonlítjuk össze.
15. példa
Lektin-rezisrtens CHO sejtvonal analízise
1. A GMD enzim expressziós szintjének analízise- a CHÖ/CCR4-LCA anti-CCRé humán kimér a antitest-termelő s-ej tvo-nalban
Az egyes fukó-z-bioszin.tézis enzimek, azaz a GMD (GDP-mannó-z 4, 6-dehídratáz),a GFPP (GDP-keto-6-dezoximannőz 3,5-epimeráz, 4 reduktáz) és az FX (GDP-béta-L-fukóz pírofoszforiláz) génjeinek és fukóz. transzferárként a FUT8 (alfa-1,6-fukózií-transzferár) génjének, expressziős szintjét a 14. példában kapott CHÖ/CCR4-LCA anti-CCR4 humán kimére antitest-termelő sejtvonalban RT-PCR módS Γ SCQ.1 V'vJ .1 rlilci .1 .c '] UK-* (1) S22Λ Ü-á'S-3 ΧΉ.ί ÖDjOQZO S'Öj t.i.jS A’.feo.i
Az egyes CHO/DG-4 4 sejteket, a 8-1 (2) példában kapott 5-03 anti-CCR4 humán kimére antitest-termelő sejtvonalat és a 1.4(2) példában kapott CHÖ/CCR4-LCA antíCCR4 humán kimére antitesttermelő sejt-vonalat 37*C-on 5% Ctn-tartalmú inkubátorban altenyésztjük és ezután 4 napig tenyésztjük. Tenyésztés után a teljes RNS-t az egyes sejtvonalak 1 x 10; sejtjéből kipreparáljuk RNeasy Protect Mini Kit segítségével (gyártó: QIAGEN) a gyártó utasításai szerint. Ezt követően eoyszálú DNS-t szintetizálunk
(2,) GW gén expressziós színtjén&k analízise RT~PCR~ral
a SEQ ID NO:32~ben. mutatjuk be, és egy 26-mer szintetikus DNS prímért, melynek nukleotid-szekvencíájáta SEQ ID NO:33-ban mutatjuk be, állítunk elő a 17-1. példában megadott CHO sejteredetű GMD cDNS-sze'kvencia alapján.
Ezután 20 pl reakció oldatot készítünk (IxEx Tag puffer (gyártó: Takara Shuzo) , 0,2 mM dNTP-k, 0,5 egység Ex Tag polimerét (gyártó: Takara Shuzo) és 0,5 pM SEQ ID NO:.32 és 33 szekvencia szerinti DNS primerek], amely az (1; pontban az egyes sejt vonalakból preparált egyszálú cDNS-ekből 0,5 pl-t tartalmaz templátként, és PCR-t kivitelezünk DNA Thermal Cycler 48Ό (gyártó: Perkin Elmer) alkalmazásával ügy, hogy 94°C-on melegítés 5 percig, ezt követi 30 ciklus, ciklusonként 94 °C 1 percig és 08cC 2 percig. Miután a PCR reakció oldat 10 pl-ét alávetettük agaróz gélelektrof©tézisnek, a DNS-fragmenseket megfestjük Cyber Greennel (gyártó: BMA) , és a kb. 350 bp DNS-fragmens mennyiségét Flu or Imager SI készülékkel (gyártó: Molecular Dynamics.) mérjük.
(37 GF.P.P gén expressziós szintjenek analízise RT-FCR feihasznáAbból a célból, hogy a GFPP cDN'S-t PCR-rai amolifikáljuk
1>V
egy 27-mer szintetikus. DNS prímért., melynek nukleotidszekvenciáját a SEQ ID NQ: 34 -ben. mutatjuk be, és egy 23-mer szintetikus DNS prímért, melynek nukleotid-szekvencíájáta SEQ ID NO:35-ban mutatjuk be, állítunk elő a 16-2 példában kapott CHO sejt-eredetű GFPP cDNS-szekvencia alapján.
Ezután 20 pl reakció oldatot készítünk [1 z Εκ Tag puffer (gyártó: Takara Shuzo), 0,2 mM. dNTP-k, 0,5 egység Ez Tag polimeráz (gyártó: Takara Shuzo) és 0,5 μΜ .SEQ ID NO:'34 és- 35 szekvencia szerinti szintetikus DNS primerek]., amely az (1) pontban az egyes sejtvonalakból preparált egyszálú cDNS-ekből 0,5 μΐ-t tartalmaz templátként, és PCR-t kivitelezünk DNA Thermal Cycler 480 (gyártó: Perkin Elmer) alkalmazásával úgy, hogy 94 °Con melegítés 5 percig, ezt követi 22 ciklus, ciklusonként 94~'C 1 percig és 63°C 2: percig. Miután a POR reakció oldat 10 μί-ét alávetettük agaróz géíelektroforézisnek, a DNS-fragmenseket megfestjük Cyber Green-nel (gyártó: BMA) , és a kb. 300 bp DNSfragmen.s mennyiségét Fluor Imager SI készülékkel (gyártó: Molecular Dynamics) mérjük.
/4) EX gén expressziós szintjének analízise RT-ECE-rsl
Abból a célból, hogy az EX cDNS-t PCR-ral ampleIikáljnk, egy 28~mer szintetikus DNS prímért, melynek nukleotíd-szekvenciáját a SEQ ID NO:36-ban mutatjuk, be, és egy 2 8-mer szintetikus DNS prímért, melynek nukleotíd-szekvenciájáta SEQ ID NO:37-ben mutatjuk be, állítunk elő a 16-1 példában megadott CHO sejteredetű EX cDNS-szekvencia alapján.
Ezután 20 pl reakció oldatot készítünk [1 x Ex Tag puffer
(5J FUT8 epén expr-essziós szintiének analízise .RT— PCR felhaszná 1Ő53VŐ! .A
Abból a. célból, hogy a FUT8 cDNS-t PCR-ral amplifikáljuk, 20 μΐ reakció oldatot készítünk (1 >: Ex Tag puffer (gyártó: Takara Shuzo), 0,2 mM dNTP~k, 0,5 -egység Ez Tag polimeréz (gyártó: Takara Shuzo) és 0,5 μΜ SEQ TE N0:13 és 14 szekvencia szerinti szintetikus DNS primerek], amely az (.1) pontban az egyes sejtveHalakból preparált egyszáiú cDNS-ekbcl 0,5 μΐ-t tartalmaz templátként, és PCR-t kivitelezünk DNA Thermal Cycler 480 (gyártó: Perkin Elmer) alkalmazásával ügy, hogy 94cC~on melegítés 5 percig, ezt követi 20 ciklus, ciklusonként 94^0 1 percig és 68°C 2 percig. Miután a PCR reakció oldat 10 μΐ-ét alávetettük agaróz gélelektroforézis-nek, a DNS-fragmenseket megfestjük Cyber Green-riel (gyártó: BEA), és a kb. 600 bp DNS~.fragme.ns- mennyiséFluor Imager SI készülékkel (gyártó: Molecular Dynam5.cs) (S) β-aktín gén expressziös szintjének analízise RT---.PC.R---.ral
Abból a célból, hogy a h-aktin cDNS-t PCR-ral amplifikáljuk, 20 pl reakció oldatot készítünk [1 x Ex Tag puffer (gyártó: Takara Shuzo), 0,2 mM dNTP-k, 0,5 egység Ex Tag polímeráz (gyártó: Takara Shuzo) és 0,5 pM SEQ ID Nö:15 és 16 szekvencia szerinti szintetikus DNS primerek], amely az (1) pontban az egyes sejtvonalakból preparált agyszálú cDNS-ekböl 0,5 μΐ-t tartalmaz tempiátként, és PCR-t kivitelezünk DFA Thermal Cycler 480 (gyártó: Perkin Elmer) alkalmazásával úgy, hogy 94°C-on melegítés 5 percig, ezt követi 14 ciklus, ciklusonként 94 °C 1 percig és 68 °C 2 percig. Miután a PCR reakció oldat 10 pl-ét alávetettük agaróz gélelektroforézisnek, a DNS-fragmenseket megfestjük Cyber Greennel (gyártó: ΒΜΆ) , és a kb. .800 bp DNS-fragmens mennyiségét Fluor Imager SI készülékkel (gyártó: Molecular Dynamics) mérjük.
/'?) GMD, GFPP, FA' és FDT8 gének fixpresszzós szintjei az egyes ú? 7 t Vpíi ct J. íS Xj3c3 fi
Az egyes gének PCR-ampliflkait f ragmen.se inek. mennyiségét az 5-03 törzsben és a CHQ/CCR4-LCA“ban úgy számítjuk ki, hogy elosztjuk a 5.2/-5.6/ pontoan az egyes segtvonaiakban a eMu·, GFi?P, .FX és FUT cDRS-ből származó PCR-ampliflkait fragmens mennyiségének értékeit az egyes sejtvonalakban a íi-aktin cDNS-ból származó PCR~am.plifikáit fragmens mennyiségének értékével, és a CHO/DG44 sejtben a PCR-amnlifikáit fraomensek mennvíséoét 1-nek határoz-
i. Analízis anti-CCR4 humán kiméra antitest-termelő CH0/CCR4-LCA sejtvonal felhasználásával, amelyben a GMD gén ezpressziója e ró .1t e t e 11
A 17-1 példában kapott C.HO sejt-eredetű GMD cDNS-szekvencia alapján egy 28-mer prímért, melynek nukleotid-szekvenciáját a SEQ ID NQ:38-ban mutatjuk be, és egy 29-mer prímért, melynek nukleotid-szekvenciáját a SEQ ID NO:.39-ben mutatjuk be, állítunk elő. Ezután 20 μΐ reakció oldatot készítünk Γ1 x Ex Tag puffer (gyártó: Takara Shuzo), 0,2 mM dNTP-k, 0,5 egység Ex Taq polimeréz (gyártó: Takara Shuzo) és 0,5 iiM SEQ ID NO ::38 és 39 szekvencia szerinti szintetikus DNS primerek.], amely az ezen példa 1(1} pontjában előállított CHQ sejt-eredetű GMD egyszálú cDNS-ből. 0,5 μΐ-t tartalmaz templátként, és PCR-t kivitelezünk * · ι·*. w ** «» ' > % <► *»
DNA. Thermal. Cycler 480 (-gyártó: Perkín Elmer) alkalmazásával úgy, hogy 94°C-cn melegítés 5 percig, ezt követi 8 ciklus, ciklusonként 94°C 1 percig, 58 cC 1 percig és 72“C 1 percig, majd 22 ciklus, ciklusonként 94°C 1 percig és 68®C 2 percig. A reakció teljessé válása után a PCR reakció oldatöt frakciónáljuk agaróz gélelektroforézissel, és egy kb, 600 bp DNS-fragmenst kinyerünk Gene Clean II Kit-tel (gyártó: ΒΊΟ 101) a gyártó utasításai szerint. A kinyert DNS-fragmenst összekapcsoljuk, a pUBlue(P) vektorral (gyártó: Novagen) DNA Ligation Kit-tel (gyártó: Takara Shuzo), és £. coli DH5a-t (gyártó: Toyobo) transzformálunk a kapott rekombináns plazmid DNS-sel, hogy az mt-C plazmidot (lásd 46. ábra) megkapjuk.
Ezt követően a 17-1 példában kapott CHO sejt-eredetű GMD ciíNS—sze k vencia a tápján egy 4o— mer prímért, melynek nuxleotid— szekvenciáját a SEQ ID NO: 40-ben mutatjuk be, és egy 31-mer prímért, melynek nukleotid-szekvencíáját a SEQ ID NO:41-ben mutatjuk be, állítunk elő. Ezután 20 μΐ reakció oldatot készítünk [1 x Ex Tag puffer (gyártó: Takara Shuzo), 0,2 mM dNTP-k, 0,5 egység Ex Tag p-olimeráz (gyártó: Takara Shuzo) és 0,5 u.M SEQ ID NO:40 és 41 szekvencia szerinti szintetikus DNS primerek}, amely az ezen példa 1(1) pontjában előállított CHO sejt-eredetű GMD egyszálú. cDNS-ből 0,5 μΐ-t tartalmaz templátként, és PCR-t kivitelezünk DNA Thermal Cycler 480 (gyártó: Perkin Elmer) alkalmazásával ügy, hogy 94°C-on melegítés 5 percig, ezt követi 8 ciklus, ciklusonként 94 °C 1 percig, 57K'C Ϊ percig és ?2°C 1 percig, majd 22 ciklus, ciklusonként 94 VC 1 percig és 68 VC 2 percig.. A.. reakció teljessé valasa után a POR reakció oldatot frakciónáljuk agaroz
TO.
gélelekt.roforézl.ssel, és egy kb. 150 bp DNS-fragmenst kinyerünk Gene Clean II Kit-tel (gyártó: BIO 1015 a gyártó utasításai szerint. A kinyert DNS~fragmenst összekapcsoljuk a pT7Blue(R) vektorral (gyártó: Novagen) DNA Ligation Kit-tel (gyártó: Takara Shuzc), és E. coli DK5a-t (gyártó: Toyobo) transzformálunk a kapott rek.ombináns plazmád DNS-sel, hogy az ATG plazmidot (lásd 47. ábra) megkapjuk.
Ezután 3 pg 17-1. példában előállított CHö-GMD plazmádét hagyunk S'acI restrikciós enzimmel (gyártó: lakara Shuzo) reagálni 37°C-on 16 órán keresztül, fenol/klorof ormos extra kaiéval és etanolos ki csapással kinyerünk egy DNS-t és hagyjuk reagálni EcoRI restrikciós enzimmel (gyártó: Takara Shuzo) 37°C-cn 16 órán át, az emésztett DNS~t agaróz gélelektroforézissel frakciónál juk, és ezután egy kb. 900 bp DNS-fragmenst kinyerünk Gene Clean II Kit-tel. (gyártó: BIO 101) a gyártó utasításai szerint. Az mt-C plazmidot (1,4 pgj hagyjuk reagálni Gael restrikciós enzimmel (gyártó: Takara Shuzo) 37*C-on 16 órán keresztül, fenol/kloroformos extrakcióval es etanolos kicsapással kinyerünk egy DNS~t és hagyjuk reagálni E’coRI restrikciós enzimmel (gyártó: Takara Shuzo) 37oC-on 16 órán át, az emésztett DNS-t agaróz gélelektroforézissel frakciónál juk, és ezután egy kb. .3,1 Kb DNS-.f ragmen st kinyerünk Gene Clean II Kit-tel (gyártó; BIO 101) a gyártó utasításai szerint. A kinyert DNS-.f ragmenseket DNA Ligation Kit-tel (gyártó: Takara Shuzo) ligáljuk, és E. coli DH5a-t (gyártó: Toyobo) transzformálunk a kapott rekombináns plazmád DNS-sel, hogy a WT-NÍ-· plazmidot (lásd 48. ábra) megkapj uk.
Ezután 2 μα WT-N(-) plazmidct hagyunk BamHI restrikciós en zimmel (gyártó: Takara Shuzo) reagálni 37°C-on 16 órán keresztül., fenol/kloroformos extrakcíóval és etanolos kicsapással kinyerünk egy DNS-t és hagyjuk reagálni EcoRI restrikciós enzimmel (gyártó: Takara .Shuzo·) 37°C-on .16 órán át, az emésztett DNS-t. agaróz gélelektroforézissei frakciónáljak, és ezután egy kb. I Kb DNS-fragmenst kinyerünk Gene Clean II Kit-tel. (gyártó: BIO 101} a gyártó utasításai szerint. A pBluescript SK(-) plazmádét (3 pg; gyártó: Stratagene) hagyjak reagálni BamHI restrikciós enzimmel. (gyártó:. Takara Shuzo) 37°C-on 16 órán keresztül, fenol/ kloroformos extrakelóval és etanolos kicsapással kinyerünk egy DNS-t és hagyjuk reagálni EcoRI restrikciós enzimmel (gyártó: Takara .Shuzo) 37°C-on 16 órán át, az emésztett DNS-t agaróz gélelektroforézissel frakciónáljuk, és ezután egy kb. 3 Kb DNSfragmenst kinyerünk Gene Clean IT Kit-tel (gyártó: BIO 101) a gyártó utasításai szerint. A kinyert DNS-fragmensekét DNA Ligation Kit-tel (gyártó; Takara Shuzo) 1 Ágáljuk,, és E. coli DHSa-t (gyártó: Toyobo) transzformálunk a kapott rekombináns plazmid DNS-sel, hogy pBS-ben egy WT-N(-) plazmidot (..lásd 49, ábra) kapjunk.
Ezután 2 pg WT-N{~) plazmidot pBS-ben hagyunk HindiII restrikciós enzimmel (gyártó: Takara Shuzo) reagálni 37°C-on 16 órán keresztül, fenol/kloroformos extrakcióval és etanolos kicsapással kinyerünk egy DNS-t és hagyjuk reagálni EcoRI restrikciós enzimmel (gyártó: Takara Shuzo) 37°C-on 16 órán át, az emésztett DNS—t agaróz geieiektrororéz.iss-ei rraxc.tona.t. gaz, ss ezután egy kb, 4 kb DNS —rragmanst rmyerunK cene Crean ir Kit —tea i gyártó:
BIO 101} a gyártó utasításai szerint. 2 pg ATG plazmidot hagyunk reagálni .Hzndl.II restrikciós enzimmel (gyártó: Takara Shuzc) 37°C-on 16 órán keresztül, fenol/klorof ormos extrakcióval és etanolos kicsapással kinyerünk egy DNS-t és hagyjuk reagálni EcoBI restrikciós enzimmel (gyártó: Takara Shuzc) 3-7 °C-on 16 órán át, az emésztett DNS-t agaróz gélelektroforézíssel frakciónáljuk, és ezután egy kb. 150 bp D.NS-fragmenst kinyerünk Gene Clean II Kit-tel (gyártó: BIO 101) a gyártó utasításai szerint. A kinyert DNS-fragmenseket DMA Ligation Kit-tel (gyártó: Takara Shuzc) lígáljuk, és E. coli D.H5a-t (gyártó: Toyo.bo) transzformálunk a kapott rekombináns plazmid DNS-sel, hogy pBS-ben egy WT plazmádét (lásd 50. ábra) kapjunk.
Ezután 2 pg pAGE24 9 plazmádat hagyunk Hino’III és SamHI restrikciós enzimekkel (mindkettő gyártója: Takara Shuzo) reagálni 37°C--on 16 órán keresztül, az emésztést, agaróz gélelektroforézissel frakcíonáljuk, és ezután egy kb. 6,5 Kb DNS-fragmenst kinyerünk Gene Clean II Kit-tel (gyártó:: BIO 101) a gyártó utasításai szerint. 2 pg WT plazmidot pBS-ben hagyunk reagálni HindiII és Samui restrikciós enzimekkel (gyártó: Takara Shuzc) 37MC-on 16 órán keresztül,· az emésztést aga.ro z geleiek.tx'ofozezissei frakciónáljuk, és ezután egy kb. 1,2 Kb DNS-fragmenst kinyerünk Gene Clean II Kit-tel (gyártó: BIO 101) a gyártó utasításai szerint. A kinyert DNS-fragmenseket ONA Ligation Kit-tel. (gyártó: Takara Shuzc) lígáljuk, és E. coli DH.S-a-t (gyártó: Toyobo) transzformálunk a kapott rekombináns plazmid DNS-sel, hogy egy
PAGE2.4 9GMD nlazmidot (lásd 51. ábra) kapjunk.
(2) GMD cpssí stem expresszioja ChO/C(2R4~LCA sejtvonáioan
A pAGE249GMD CHO -sejt-eredetű GMD gén expressziós vektort pg) lineáris formába hozzuk Fspl restrikciós enzimmel (gyártó: New England Biolabs) történő emésztéssel, amit bevezetünk 1,6 x 10“ CHO/CCR4-LCA sejtbe elektroporációval (Cytotechnology 3, 133 (1390)]. Ezután a sejteket 30 ml IMDM-dFB.S8'10) tápközegben szuszpendál.juk [ΧΜΏΜ tápközeg (gyártó: GIBCO BRL) , kiegészítve 10% dFBS-sel], amely 200 nM MTX-et (gyártó: SIGMA) tartalmaz és 182 ca,; lombikban (gyártó: Greiner) tenyésztjük 37“θ-οη 24 órán át 5% CO?;~ tartalmú inkubátorban. Tenyésztés után a táp közeget kicseréljük 0,5 mg/mi higromioint és 200 nM MTX-et tartalmazó IMDM-dFBS(10)-re, majd 19 napig tenyésztjük, hogy higromioinrezisztens kolóniákat kaojunk..
Ugyanilyen módon a pAGE249 vektort bevezetjük. CHO/CCR4-LCA sejtekbe, hogy higromicin-rezi-sztens transzformánsokat kapjunk.
(j.) GMD gén-expresszá1t CuO/CCRá-TCA tenyésztése és az antitest, tisztítása
200 nM MTX-et (gyártó: .SIGMA) és 0,5 mg/ml nigromicint tartalmazó IMDM-dFBS(10) felhasználásával a (2) pontban kapott GMD-expresszáló transzformánsokat 182 cm' lombik segítségével (gyártó: Greiner) 37 °C-on. 5% CO^-tartalmú inkubátorban tenyésztjük. Néhány nappal később, amikor a sejtsűrűség elérte az összefolyást, a tenyészet felülúszóját elöntjük és a sejteket 2 5 ml FBS-puf f errel (gyártó: GINCO BRL)· mossuk, és öss eke verj ük 35 ml EXCELL301 tápközeggel (gyártó: URH). Tenyésztés után (37“c, 5% CO.2, 7 nap) a tenyészet felülúszóját kinyerjük. Az anti-CCR4 kiméra antitestet a felülúszóből Prosep-A (gyártó:
méra antitestet a felülúszóból Prosep-A (gyártó: Míllipore) segítségével tisztítjuk a gyártó utasításai szerint.
Ugyanezzel a módszerrel a pAGE249 vektor-bevezetett transzformáns sejteket tenyésztjük és ezután az a.nti-CCR.4 kiméra antitestet kinyerjük és a tenyészet felülűszőjából tisztítjuk.
(4) Lektin-rezisztencia π/érése transzformált sejtekben
A (2) pontban kapott GMD-expresszáló transzformáns sejteket 200- nM MTX-et (gyártó:; SIGMA) és 0,5 mg/ml hígromicint tartalmazó tápközegben szuszpendáljuk 6 z 104 sejt/ml sűrűségig, és a szuszpenziót egy 96-lyukú tenyésztő lemezre (gyártó:; Iwaki Glass) 50 μΐ/lynk részletekben szétosztjuk. Ezt követően egy tápközeget, melyet úgy állítunk elő, hogy 0 mg/ml, 0,4 mg /ml, 1,6 mg/m.1 vagy 4 mg/ml LCA-t (fens culínaris agglutinin, gyártó: Vector Laboratories) szuszpendálunk 200 nM MTX-et és 0,5 mg/ml hígromícint tartalmazó IMDM-dFBS(10) tápközegben, adunk a lemezhez 50 pl/lyuk mennyiségben, majd tenyésztjük 37*C-on 96 órán, át 5% COs-tartalmú inkubátorban. Tenyésztés után WST-I-t (gyártó: Boehringer) adunk 10 pl ./.lyuk sűrűségben és 3?°C-on 30 percig inkubáljuk 5% CCt-tartalmú inkubátorban a szín kifejlesztésére, és ezután az abszorbanciát mérjük 450 nm-en és 595 nm-en (az alábbiakban mint •’00450”-re és OD595s'-re hivatkozunk) egy Microplate Reader (gyártó ΒΙΌ-RAD) lemez-leolvasó segítségével. Ugyanilyen módon a pAGE249 vektor-bevezetett transzformáns sejt két is mérjük.. A tesztet két független kísérletben végezzük.
Az 52. ábrán bemutatjuk az egyes lyukakban a túlélő sejtek számát százalékosan, ahol egy értéket (melyet ügy számoltunk ki hogy a fent mért OD595~t kivontuk az 0D4'50-ből) használunk: minden sejt csoport túlélési számaként és az LCA-mentes lyukak egyikében a túlélő sejtek számát 100%-ként definiáltuk.. Amint az 52. ábrán látható, az LCA-rezisztenciában csökkenést figyeltünk meg a GMD-expresszált CHG/CCR4-LCA-ban, és a túlélési arány kb. 40% 0,2 mg/ml LCA jelenlétében, és a túlélési arány kb. 20% 0,8 mg/m.l LCA jelenlétében. Másrésztol a pAGE249 vektor-bevezetett CHO/CCR4~LCA~ban a túlélési arány 100% 0,2 mg/ml LCA jelenlétében és a túlélési arány kb. 80% még 0,8 mg/ml LCA jelenlétében is. Ezen eredmények alapján feltételezhető, hogy a GMD gén expressziós szintje a CHG/CCR4-LCA-ban csökkent és ennek eredmé nyeképpen LCA-vai szembeni rezisztenciát kaptunk.
(5/ GáíD'“axp.ress'zá 11 CHCVCCR^—LCA—hot kapott ánti.-CCR4 kamera an~ fatest rn vicro catotox.i.kus aktivitása (ADCC aktivá tas/
anyag spontán disszociációjához. A centrífugálás után a sejteket 5 mi RFMI1640-FBS (10) tápközeggel 2,5 x 10’ sejt./ml-re beállítjuk és ezt a szuszpenziőt célsejt-szuszpenzióként alkalmazzuk.
liz Ef.fektorsej t-szuszpenzió előállítása
Egy egészséges emberből 50 ml vénás vért gyűjtünk és 0,5 ml heparin-nátriummal (gyártó: Takeda Pharmaceutical) óvatosan elegyítjük. Lymphoprep alkalmazásával (gyártót Nycomed Pharma AS) az elegyek centrifugáljuk a gyártó utasításai szerint, hogy egy manonukleár.ís sejt-réteget válasszunk el. A sejteket RPMI1640-
Az összes felszabadult 3:Cr mennyiségét ugyanilyen művelettel tározzuk meg, azonban az antitest-oldat helyett csak tápközeget alkalmazunk és az effektorsejt-szuszpenzió helyett 1 N sósavat adagolunk, és mérjük az '^Cr mennyiségét a felülúszóban. Az ADCC aktivitást a (II) egyenletből számoljuk ki.
Az ADCC aktivitás mérés eredményeit az 53. ábrán mutatjuk be. Amint az 53. ábrán látható, a GMD-expresszált CHO/CCR4-LCA.ból kapott, tisztított anti-CCRé kiméra antitestek ADCC aktivitása ugyanolyan mértékben csökkent, mint a 8. példában kapott KM306G esetén. Másrészről a pAGE249 vektor-bevezetett CHO/CCRéLCA-bŐl kapott, tisztított anti~CCR4 kiméra antitest ADCC aktivitása hasonló mértékű ADCC aktivitás, mint a CHO/CCR4.LCA-ból kapott., tisztított anti-CCR4 kiméra antitesté. Ezeknek az eredményeknek az alapján feltételezhető, hogy a GMD gén expresszíós szintje a CH0/CCR4-LCA-ban csökken,, és ennek következtében erős ADCC aktivitású antitest termelhető.
('6/ GMD-expresszált CHG/CCR4-LCA--bód származó anti-CCR4 kiméra a n t .ϊ. t es c cukor an c -an« Ixz i se
A (3) pontban kapott tisztított anti-CCR4 kiméra antitesthez kötődő cukorláncokat, a 14(4) -példában bemutatott eljárással analizáljuk, és az analízis eredményeit az 55. példában mutatjuk be. összehasonlítva a 14. példában kapott CH0/CC.R4-LCA-ból származó, tisztított antí-CCR4 kiméra antitesttel, az o~l,G-fukózt nem tartalmazó cukorlánc aránya a GMD-expresszált CHC/CCR4-LCAból származó, tisztított. anti~CCR4 kiméra antitestben 9%-ra sokkén, amikor a. csúcs alatti területből számolunk, luv az lát4X X X ««
ható, hogy ezzel a sejttel termelt antitestben, az a-1,6-fukózt nem tartalmazó cukörlánc arány ugyanarra a szintre csökken, mint az 5-03 törzzsel termelt antitest esetén, a GMD ezpresszálásával a CH0/CCR.4-LCA-ban.
16. példa
CHO sejtben a cukorlánc-ssintézissel kapcsolatos enzimeket ködo ló különböző gének előállítása
1. CHO sejt-eredetű EX cDNS-szekvencia meghatározása (2) Teljes RNS extrakclőja CHÖ/DG44 .sejtből
CHO/DG44 sejteket 10% magzati borjú szérumot (gyártó: Life
Technologies) és 1 x koncentárció HT kiegészítőt (gyártó: Life Technologies) tartalmazó IMDM tápközegben szuszpendálunk, és 15 ml szuszpenziót adhéziós sejttenyésztő T75 lombikba (gyártó: Greiner) inokulálunk 2 x 10’ sejt/.ml sűrűségben. A tenyésztést 37°C-o.n 5% COs-tartalmű inkubátorban végezzük, a tenyésztés 2. napján 1 x 10; sejtet eltávolítunk, és a teljes RNS-t RNAeasy segítségével extraháljuk a gyártó utasításai ff) Teljes e-gyszálú cDMS preparálása CH'cyiXSsá sejtből
Az (1) pontban kinyert teljes RNS-t 45 pl steril vízben feloldjuk és 1 pl RQ.1 RNase-Free DNase-t (gyártó: Fromega), 5 pl kapcsolt 10 x DNase puffért és 0,5 pl. RNasi.n Ribonuclease. Inhibitor'-t (gyártó: Promega) adunk hozzá, majd SJ^C-on 30 percig reagál tatjuk, hegy lebontsuk a mintában lévő genom DNS-t. A reakció után a teljes RNS-t tisztít!uk ismét RNeasy segítségével és fel oldjuk 50 μΐ steril vízben.
μΐ reakcióelegyben, primőrként clígo(dT) felhasználásával egy szálú oDN.S-t szintetizálunk a kapott teljes RNS mintákból (3 μ-q) reverz transzkripciós reakcióval SUPERSCRIPT™ Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis (gyártó: Life Technologist) alkalmazásával a gyártó utasításai szerint. A reakcióelegy 5-0-szeresre hígított vizes oldatát használjuk a GFPP és FX klónozásában. Ezt az oldatot felhasználásig -80°C-on tároljuk.
(3) Kínai hörcsög-eredetű FX cDNS parciális fragment ének elóál1.1 fása
A kínai hörcsög-eredetű EX cDNS parciális fragmenst az aláb.01 eljár a s s a 1 a 11 i.t j u k . e i o.
Először publíkus adatbankban regisztrált hozzáférhető nukleotid-szekvenciákra, nevezetesen a humán EX cDNS-re (Genebank. Accession No. U58766) és egy egér cDNS~re (Genebak Accession No. 143012 7) specifikus prime rezet (uEQ lu No: 42 es 43-ban bemutatva) tervezünk.
Ezt követően 25 pl reakcióoldatot [ExTag puffer (gyártó: Takara Shuzo), 0,2 mmol/1 dNTP-k és 0,5 pmol/l gén—specifikus primerek (SEQ ID NO: 42 és 43)], amely a (2) pontban előállított CHO/DG44-eredetü egyszálú cDNS-bői 1 μΐ-t tartalmaz, állítunk elő, és polimeráz .láncreakciót (FCR) kivitelezünk DNS polimeráz ExTaq (gyártó: Takara Shuzo) felhasználásával. A PCR-t ügy kivitelezzük, hogy 94 °C-on 5 percig melegítjük, ezt követi 30 melegítési. ciklus, ciklusonként 94°C 1 percig, 584C 2 percig és 72°C percig és egy végső melegítés 72°C-on 10 percig.
A PCR után a reakcióoldatot 2% agaróz gélelektroforézisnek vetjük alá és egy specifikus amplifikált 301 bp fragmenst tisztítunk QuieexII Gel Extraction Kit (gyártó: QDIAGEN) segítségével, és 20 pl steril vízzel eluáljuk (az alábbiakban a módszert a DNS fragmens-ek tisztításához alkalmazzuk agarózgélből). Egy PCR2.1 plazmádba 4 pl amplifikált fragmenst beillesztünk a gyártó» utasításai szerint TGPö TA Cloning Kit-tel (gyártó: Invitrogen) és E. coli DH5a-ba transzformáljuk a reakció oldattal Cohen és mtsai eljárása szerint [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 2110 (1972}j (az alábbiakban ezt az eljárást az Eb coli transzformációhoz alkalmazzuk). A plazmid DNS-t ismert eljárással izoláljuk [Nucleic Acids Research 7, 1513 (1979] (az alábbiakban a plazmid izolációhoz alkalmazzuk) a kapott néhány kanamicin-rezisztens kolóniából, így 2 kiónhoz jutunk, melyekbe az FX cDNS parciális fragmenseket. beépítettük. Ezekre az alábbiakban pCRFX klón 8-ként és pCRFX klón 12-ként hivatkozunk.
A pCRFX klón 8-ba és a pCRFX klón 12-be inszertáít cDNS nukleotid-szekvencíáját DNS Sequencer 377 felhasználásával határozzuk meg (gyártó: Parkin Elmer) és BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction kit-tel (gyártó: Parkin Elmer) a gyártó utasításai szerint. Igazoltuk, hogy az inszertáít cDNS-k mindegyike, amelyek, szekvenciáját meghatároztuk, a kínai hörcsög FX parciális szekvenciájának nyílt leolvasási keretét (ORF) kódolja.
(4/ Fgyszálú cDNS szintézise RACE-hozEgyszáiú cDNS mintákat készítünk 5' és 3' RACE-hoz az (1) pontban extrahált CHÖ/CCR4 teljes RNS-ből SMART™ RACE cDNA Amplification Kit (gyártó: Clontech) segítségével a gyártó utasításai szerint. Ebben az esetben a PowerScript™ Reverse Transcriptase-t (gyártó: Clontech} alkalmazzuk revert transzkx'iptázként. Az előállítás után minden egyes egyszáiú cDNS-t 10-szeresre hígítunk a. kithez kapcsolt Tríein-EDTA. puf ferrel, és ezt használjuk templátként a PCR-hoz.
fáj Kínai .hörcsög-eredetű .FX teljes hosszúságú oíWS mégha tarozása RACE módszerrel
ID NO: 45) prímereket tervezünk kínai hörcsög hX-specifikus 5’ RACE-hez, és FXGSP2-1 (SEQ ID NQ:4 6) és EXGSP2-2 (SEQ ID NO:47) prímereket a kínai hörcsög FX-specifikus 3’ RACE-hez.
Ezt követően polimerét láncreakciót (PCR) kivitelezünk Advantage! PCR Kit-tel (gyártó: Clontech) 50 pl reákeióoldat készítésével (Advantage2 PCR puffér (gyártó: Clontech), 0,2 mM dNTP-k és 0,2 pmol/l kínai hörcsög FX-specif.ikus primerek RACEhez és 1 x koncentráció univerzális primerek (gyártó; Clontech)}, amely 1 pl (4) pontban RACE-hoz előállított CHO/DC44-eredetü egyszáiú cDNS-t tartalmaz.
A PCR-t 20 ciklus megismétlésével kivitelezzük, ciklusonként 94°C 5 másodpercig, 68 *C 10 másodpercig és 72°C 2 percig.
A reakció teljessé válása után 1 pl reakció oldatot 50szeresre hígítunk T.ricin-EDTA puff erről, és 1 pl hígított oldatot. használunκ remoiát kent. ismét rea.te.io orca tót kész.Ltunk és
PCR-t végzünk ugyanilyen körülmények között. A tereplátokat, az első és második PCR-ban alkalmazott primerek kombinációját és a PCR által amplifikált DNS-f.ragmensek hosszát a 3. táblázatban mutatjuk be.
8. táblázat
Kínai hörcsög FX eDNS RACE PCR-ban alkalmazott primerek kombinációja és a. PCR-termékek mérete
5' RACE FX-speeifikus primerek Univerzális primerek PCR- amp 1 i f i k.á 11 termék .mérete
Első Második ( X V í m í m V l··1 t i X X UPM (Universal primer mix) NüP (Nested Universal primer) 300 bp
3' RACE FX-spécifi kus primerek Uni ve r zá1ís prime rek PC R-amp1ifikéit ( termék mérete !
Első Második. FXGSP2-1 FXGSP2-2 UPM (Universal primer mix) NÜP (Nested Universal primer) 1,1ÜQ bp !
A PCR után a reakcióoldatot 1% agaróz gélelektroforézisnek vetjük alá és a specifikus amplifikált fragmenst tisztítjuk QuiaexII Gel Extraction Kit (gyártó: QVIAGEN) segítségével, és 20 pl steril viszel eluáljuk, PCR2>1 plazmádba 4 pl amplifikált fragmenst inszertálunk, és E. coli Di-lSa-t transzformálunk a reakció oldattal a TOFQ TA Cloning Kit-hez kapcsolt utasítások szerint (gyártó: Inv.itrogen) .
Plazmid DNS-eket izolálunk a megjelent néhány kanamicinrezísztens kolóniából, hogy kínai hörcsög FX 5'-régiót tartalmazó 6 kiónt kapjunk. Ezekre az alábbiakban FX5 ’ klón 25-.ként, FX5! klón 2S-ként , FX5‘ klón 27-ként, EX5' klón 28—ként, FX.5’ klón 31-ként és F.X5* klón 32-ként hivatkozunk.
Ugyanilyen módon 5 eDNS kiónt kapunk, melyek a kínai hörcsög FX 3’ régiót tartalmazzák. .Ezekre az alábbiakban FX3’ klón 1, FX3 ! klón 3, FX3 ’ klón 6, FX3' klón 8 és FX3! klón 9-ként hivatkozunk.
Az egyes, 5’ és 3' RACE módszerrel kapott kiónok cDNS egységének nukleotid-szekvenciáját DNS Sequencer 377 felhasználásával határozzuk meg (gyártó: Parkin Elmer) a. gyártó utasításai szerint. A meghatározott cDNS nukleotid-szekvenciák összehasonlításával, a PCR-r.a visszevezethető nukleotid bázisok leolvasási hibáját kizártuk és a kínai hörcsög FX cDNS-ének teljes hosszúságú nnkleot.id-sxekvenciáját meghatároztuk. A meghatározott szekvenciát a SEQ ID NO:48-ban mutatjuk be.
· vüO sejt-eredetű GFPP jzDNS-szekvencia, mégha tá r ozás a (I) Kínai hörcsög-eredetű GFPP cDFS parciális f ragmensének előállítása
A kínai hörcsög-eredetű GFPP cDNS parciális fragmenst a következő eljárással állítjuk, elő.
Először egy humán. GFPP cDNS nukleotíd-szekvenclát (Genebank Accession No. AF017445), ezzel nagy homológiát mutató egér EST szekvenciákat (Genebak Accession Nos. AI4 6'7195, AA422658,
BE304325 és AI466474) és patkány EST szekvenciákat (Genebank Accession Nos. BF54.6372, AI0-58 4-00 és Abl44783), melyeket publikus adatbázisokban regisztráltak, összehasonlítunk és GFPP FN9 és GFPP PV9 (SEQ ID NO: 49 és 50; patkány GFPP-re specifikus prímeteket tervezünk a három faj közötti magasan konzerválódott régió alapján.
Ezt követően 25 μΐ reakcióoldatot készítünk. [ExTaq puffer (gyártó: Takara Shuzo)., 0,2 mmol/1 dNTP-k és ü,5 pmöl/l GFPPspecifikus primerek GFPP FW9 és GFPP RV9 (SEQ ID NO·: 49 és 50) ], amely az 1(2) pontban előállított CHÜ/DG44-eredetű egyszálű -cDNS 1 μΐ-ét tartalmazza. PCR-t kivitelezünk úgy, hogy 94cC-on 5 percig melegítjük, ezt követi 30 melegítési ciklus, ciklusonként 94 yC 1 percig, .58 °C 2 percig és 72°C 3 percig és egy végső melegítés 72’C-on 10 percig.
A PCP. után a reakcióoldatot 2% agaróz gélelektroforézisnek vetjük alá és egy specifikus amplifikált 1,4 Kbp fragmenst tisztítunk QuiaexII Gel Extraction Kit (gyártó: QüIAGEN) segítségével, és 20 μΐ steril vízzel eluáljuk. Egy PCR2.1 plazmidba 4 pl amplifikált fragmenst beillesztünk a gyártó utasításai szerint TOPG TA Cloning Kit-tel (gyártó: Invitrogen) és E. coli. DH5a~ba transzformáljuk a reakció oldattal.
A plazmid DNS-eket a megjelent néhány kanamicin.-reziszt.ens kolóniából izoláljuk, így 3 kiónhoz jutunk, melyekbe a GFPP cDNS parciális fragmenseket integráltuk. Ezekre az alábbiakban GFPP klón 8~ként, GFPP klón. 11-ként és GFPP klón .12-ként hivatkozunk.
A GFPP klón 8-ba, GFPP klón 11-be és GFPP klón 12-be inszertált c'DNS nukleot id-szekvencíáj át DNS Sequencer 377 felhasználásával (gyártó: Parkín Elmer} és Bigöye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction kit-tel (gyártó: Parkin Elmer) határozzuk meg a gyártó utasításai szerint. Igazoltuk, hogy az inszertált cDN'S, amelynek szekvenciáját meghatároztuk, a kínai hörcsög GFPP parciális szekvenciáiának nyílt leolvasási keretét í kodo a t a <
(2) Kínai n.örcso4~6red€tti GEm·' terves hosszúságú CiDNS meghatározása RACE módszerrel
A 2(1) pontban meghatározott kínai hörcsög GFPP parciális szekvencia alapján, GFPP G-SP1-1 (SEQ ID NO:52) és GFPP GSP1-2 (SEQ ID NO:53) prímereket tervezünk kínai hörcsög GFPPspecifikus 5 ’ RACE-hez, és GFPP GSP2-1 (SEQ ID NO: 54) és GFPP GSP2-2 (SEQ ID NO:55) prímereket a kínai hörcsög GFPP-specifikus 3' RACE-hez.
Ezt követően polimeréz láncreakciót (PCR) kivitelezünk Advantages PCR Kit-tel (gyártó: Clontech) 50 pl reakcióoldat készítésével [Advantages PCR puffer (gyártó: Clontech), 0,2 mM dNTP-k és 0,2 pmol/l kínai hörcsög GEPP-specífikus primerek RACE-hez és 1 x koncentráció univerzális primerek (gyártó: Clontech)], amely 1 pl (4) pontban RACE-hoz előállított CHO/DG44-eredetű egyszálú cDNS-t tartalmaz.
A PCR-t 20 ciklus megismétlésével kivitelezzük, ciklusonként 94 *C 5 másodpercig, 68’C 10 másodpercig és 7 2°C 2 percig.
A reakció teljessé válása után 1 pl reakció oldatot 50szeresre hígítunk Tricin-EDTA pufferrel, és 1 pl hígított oldatot használunk tempiátként. Ismét reakció oldatot készítünk és PCR-t végzünk ugyanilyen körülmények között. A templátokat, az első és második PCR-ban alkalmazott, primerek kombinációját és a PCR által amplifikált DNS-fragmensek hosszát a 9. táblázatban mutatjuk be.
*“S ♦*·. .·% —$ /· . % 5 : . %:««.
** ».<. .♦* eet- **
9. táblázat
Kínai hörcsög GFPP eDNS RACE PCR-ban alkalmazott primerek korrtb-ínációja és a PCR-termékek mérete
5' RACE GrPP- specifikus primerek □niversális primerek PCP - amp 1 i fi ká 11 termék mérete-
Első Második GFPRGSP'i-1 GXPPGSF1-2 UFM (Universal primer mix) NUP (Nested Universal primer) 1100 bp
3’ RACE GFPP-speoifikus primerek Univerzál í.s primerek PCR-ampl ifikéit, termék mérete
Első Második GFPPGSP2-1 GFPPGSP2-2 UPM (universal primer mix) NUP (Nested Universal primer) 1400 bp
A PCR után a. reakcióoldatot 1% agaróz gélelektroforézisnek vetjük alá és a specifikus amp-lí fikáit fragmenst tisztítjuk QuíaexII Gel Extraction Kit (gyártó: QüTAGÉN) segítségével, és 20 pl steril vízzel eluáljuk. PCR2.1 plazmádba 4 pl amplifikált fragmenst inszertá.lunk, és E. coll DH5a~t transzformálunk a reakció oldattal a TÖPO TA Cloning Kit-h-e,z kapcsolt utasítások szerint (gyártó: Invitrogen).
Plazmid DNS-eket izolálunk a kapott néhány kanamicinrezisztens kolóniából, hogy kínai hörcsög GFPP 5’-régiót tartalmazó 6 kiónt kapjunk. Ezekre az alábbiakban GFPP5* klón l-ként, GFPP5’ klón 2-ként, GFPP5’ klón 3-ként és GFPP5' klón 4-ként hivatkozunk.
Ugyanilyen módon 3 cDNS ki-ónt kapunk, melyek a kínai hörcsög GFPP 3'-régiót tartalmazzák. Ezekre az alábbiakban GFPP3! klón 10, GFPP3’ klón 16 és GFPP3’ klón 20-ként hivatkozunk.
Az egyes, 5’ és 3’ RACE módszerrel kapott kiónok cDNS-ének nukleotid-szekvenciáját DNS Sequencer 377 felhasználásával hatá-
rozzuk meg (gyártó: Parkin Elmerj a gyártó utasításai szerint. A. meghatározott. cDNS nukleotid-szekvencíák összehasonlításával, a PCR-ra visszevezethető nukleotid bázisok leolvasási hibáját kizártuk és a kínai hörcsög GFPP c.DNS-ének teljes hosszúságú nukle-otid-szekvenciáját meghatároztuk. A meghatározott szekvenciát a SEQ I'D ND:51-ben mutatjuk be.
17, példa
CHO sejt-eredetű GMD gén előállítása
l.CHO sejt-eredetű GMD cDNS-szekvencia meghatározása flj CHG sejt-eredetű GMD gén cDMS előállítása (részleges cDNS előállítása 5'- és 3·'-terminális szekvenciák kivételével)
Rágcsáló-eredetű GMD cDNS-t kutattuk egy publikus adatbázisban (BLAST) egy humán-eredetű GMD cDNS-szekvencia felhasználásával (GenBank Accession No. AF0423-77)·, melyet a génbanknál kérdésnél regisztráltunk és három fajta egér EST-szekvenciát kaptunk (GenBank Accession Mos. BE986>9b6, BF158988 és BE284/8O). Ezeknek az EST-szekvenciáknak a ligálásával egy kikövetkeztetett egér GMD cDNS-szekvenciát határoztunk meg.
Az egér-eredetű GMD cDNS-szekvencia alapján egy 28-mer prímért, melynek nukleotid-szekvenciáját a SEQ ID NO:56-ban mutatjuk be, és egy 27-mer prímért, melynek nukleotid—szekvenciáját a .SEQ ID NO: 5-7-ben mutat juk be, egy 25-mer prímért, melynek nukleotid-szekvenciáját a SEQ ID NO:58-ban mutatjuk be, egy 24mer prímért és egy 25-mer prímért, melyek nukleotidszekvenciáját a SEQ ID NO:59-ben illetve 60-ban mutatjuk be, ál lítunk elő.
Ezután a CHO sejt-eredetű GMD cDNS amplifikálása- céljából, PCR-t kivitelezünk az alábbi módon. 20 pl reakció oldatot készítünk [1 x Ex Tag puffer (gyártó: Takara Shuzo), 0,2 niM dNTP-k, 0,5 egység Ez Taq polimeráz (gyártó: Takara Shuzo) és 0,5 pH két szintetikus DNS primer], amely 0,5 pl, a 15-1(1) példában előállított CHO sejt-eredetű egyszálú cDNS-t tartalmaz templát-ként. Ebben az esetben a SEQ ID NO::56 és 57 kombinációját, a SEQ ID NÖ:58 és 57 kombinációját, a SEQ ID NO: 56 és 59 kombinációját, és a SEQ ID NO: 56 és 60 kombinációját alkalmazzuk szintetikus DNS primerekként. A reakciót DNA Thermal Cycler 480 (gyártó: Perkin. Elmer) alkalmazásával végezzük ügy, hogy 940:C-on melegítés 5 percig, ezt követi 30 ciklus, ciklusonként 94 °C 1 percig és 68QC 2 percig.
A PCR reakció oldatot frakciónáljuk aga.róz gélelektroforézissel, hogy kimutassuk, hogy egy kb. 1,2 Kb DNS-f ragmenst ampli f i kálunk a PCR-termékben, amikor a SEQ ID NO: 56 és 57 szintetikus DNS prímérekét használjuk, egy kb. 1,1 Kb frogmens, amikor a SEQ ID NO:57 és 59 szintetikus DNS primereket alkalmazzuk, egy kb. 350 bp fragmenst amplifika lünk a PCR termékben, amikor SEQ ID NO:56 és 59 szintetikus DNS primereket használunk, és egy kb. 1 Kb fragmenst ampiifíkálunk a PCR termékben, amikor SEQ ID NO:56 és 60 szerinti szintetikus DNS primereket használunk. A DNS-fragmenseket Gene Clean II Kit-tel (gyártó: BIO 101} nyerjük ki a gyártó utasításai szerint. A kinyert DNSfragmenseket a pTlBlue(R) vektorba (gyártó: Novagen) ligáijuk DNA Ligation Kit-tel (gyártó: Takara Shuzo), és E. coli DH-t (gyártó: Toyobo) transzformálunk a kapott rekombináns plazmád
DNS mintákkal. Ezáltal a következő plazmidokat kapjuk: 22-8 jelű (kb. 1,2 Kb DNS-fragmens a SEQ ID NO: 56 és 57 szintetikus DNS primerekből amplifikálva), 23-3 jelű (kb. 1,1 Kb DNS-fragmens a SEQ ID NO: 58 és 57 szintetikus DNS primerekből amplifikálva · , 31-5 jelű (kb. 350 bp DNS-fragmens a SEQ ID NO: 56 és 59 szintetikus DNS prímetekből amplifikálva) és 34-2 jelű (kb. 1 Kb DNSfragmens a SEQ ID NO: 56 és 60 szintetikus DNS prímetekből amplifikálva). Ezeket a plazmidokat tartalmazó CHO sejt-eredetű GM.D cDNS-szekvenciát a szokásos módon egy ABI. PRISM 377 DNS .szekvenátorral (gyártó: Parkin Elmer) határozzuk meg (mivel egy 28 bázisán szekvencia az inicíációs kodon metionintől downstream irányban az 5’-terminális végen és egy 27 bázison szekvencia a termináció-s kodontól upstream irányban a 3’-terminális végen a szintetikus oligo- DNS-szekvenciákból ered, azok egér GMD cDNSszekvenciák) .
A további lépéseket abból a célból kivitelezzük, hogy egy olyan pla.zm.idot állítsunk elő, amelyben a 22-8 és 34-2. plazraidokban lévő CHO sejt-eredetű GMD cDNS-fragmenseket kombináljuk. A 22-8 plazmidöt (1 μα) EcoRI restrikciós enzimmel (gyártó: Takara Shuzo) reagálhatjuk 37cC-on 16 órán keresztül, az emésztést agaróz gélelektroforézisnek vetjük alá, és ezután egy kb. 4 Kb DNS-fragmenst Gene Clean II Kit-tel (gyártó: BIO 101) kinyerünk a gyártó utasításai szerint. A 34-2p.lazmi.dot (2 pg) EcoRI restrikciós enzimmel (gyártó: Takara Shuzo) reagál tatjuk 37°'C-on 16 órán keresztül, az emésztést agaróz gélel-ektruf ©tézisnek vetjük alá, és ezután egy kb. 150 bp DNS-fragmenst Gene Clean II Kit-tel (gyártó: BIO 101) kinyerünk a gyártó utasításai
szerint. A kinyert DNS-fragmenseket terminális defosztőrile.zés nek vetjük alá Calf Intestine Alkaline Phosphatase, (gyártó:
Takara Shuzo) alkalmazásával, ezután DNA Ligation Kit-tel lígáljuk (gyártó: Takara Share) és a kapott rek-ombináns plazmád
DNS-sei corf DH5a-t (gyártó: Toyobo) transzformálunk, és igy a CHO-GMD piazmidot kapjuk (vő. 54. ábra).
ff) CHO sejt-eredetű
S £ QK. ΪΛϊί',Γ.ί C<3 ’/ rS 73 ..¾-
Egy 24-mer prímért, melynek nukleotid-szekvenciáját a SEQ ID
NO: 61.-ben mutatjuk be, állítunk elő a CHO sejt-eredetű humán é egér GMD cDNS 5’-terminális nem-kódoló régióinak nukleotidszekvenciájából, és egy 32-mer prímért, melynek nukleotidszekvenciáját a SEQ ID NO:62-ben mutatjuk be, a CHO sejt.-eredetű GMD cDNS szekvenciából, és PCR-t kivitelezünk az alábbi módon, hogy a cDNS—t amplitxKáljuk... 2.0 ul reakcrooldat. készítünk. |i x Ez Tag puffer (gyártó: Takara Shuzo), 0,2 mM dNTP-k, 0,5 egység Tag polimeréz (gyártó: Takara Shuzo) és 0,5 μΜ szintetikus DNS primerek: SEQ ID NO: 61 és SEQ ID NO: 621, amely 0,5 ul 15-1(1) példában előállított egyszálü cDNS-t tartalmaz kompiakként, és a reakciót egy DNA Thermal Cycler 480 segítségével (gyártó: Perkin Elmer) kivitelezzük 94’C-on melegítve 5 percig, ezt követően 20 ciklus megismétlésével, ciklusonként .94aC 1 percig, 55’C 1 percig és 72*C .2 percig, és további 18 ciklus, -ciklusonként 94*C 1 percig és 68 °C 2 percig. A PCR reakció oldat agaróz geieaeK.troforezissel történő fraKCíonarasa star, agy kb. 30ö ορ DNS-f ragmen st nyerünk, ki Gene Clean II Kít-tel (gyártó: BIO 101) gyártó utasításai szerint.
A kinyert DNS-fragmenst pT7Blu.e(R) vektorba lígáljuk (gyártó: Novagen) DNA Ligation Kit-tel (gyártó: Takara Shuzo) és E> coll DH5a-t (gyártó: Toyobo) transzformálunk a kapott rekombinán-s DNS plazmáddal, ezáltal az 5'GMD plazmádhoz jutunk. DNA Sequencer 377 (gyártó: Parkin Elmer) se gítségével meghatározzuk a plazmádban a CHO sejt-eredetű GMD oDNS íniciácíóa metioninjátől downstream irányban lévő 28 bázisú nukleotid-szekvenciát(3J CHO sejt-eredetű GMD oDMS 3'-terminális szekvenciájának mégha tarozása
A CHO sejt-eredetű GMD 3 ’ —terminális cDNS —szekvenciájának kinyerése céljából RACE módszert kivitelezünk az alábbi módon.
Egyszálú cDNS mintákat készítünk 3’ RACE-hoz a 15-1(1) példában. kapott CHO sejt-eredetű RNS-ből SMART™ RACE cDNA Amplification Kit (gyártó: Clonteeh) segítségével a gyártó utasításai szerint. Ebben az esetben a PowerScrípf™ Reverse Transcriptase-t (gyártó: Clontech) alkalmazzuk revem transzkriptánként. Az előállítás után minden egyes egyszálü cDNS-t 10szeresre hígítunk a kithez kapcsolt Tricin-EDTA pufferrel, és ezt használjuk templátként a PCR-hoz.
Ezt követően 20 pl reakcióoldatot készítünk [ExTaq puffer (gyártó: Takara Shuzo), 0,2 mM dNTP-k, 0,5 egység EX Taq polimerá.z (gyártó: Takara Shuzo), 0,5 uM 25~mer szintetikus primer (SEQ 1D NO:63, melyet az (1) pontban meghatározott CHO sejteredetű GMD oDNS-szekvencia alapján hoztunk létre) és 1 x koncentráció Universal Primer Mix (kapcsolódik a SMART™ RACE eDNS
Takura Shuzo), 0,2 mN dNTP-k, 0,5 egység EX Tag polimerei (gyártó: Takara Shuzo),
0,5 μΜ 25-mer szintetikus primer {SEQ
NO:64, melyet az (1; pontban meghatározott CHO sejt-eredetű GMD cDNS-szekvencia alapján hoztunk létre) és 0, t· uM Nested. Universal Primer (kapcsolódik a SMARTλΜ RACE eDNS Amplification Kit-hez; gyártó: Clontech], amely 1 μ.Ι 20-szorosra hígított vizes oldatot tartalmaz tempiétként, és PCR-t kivitelezünk DNA Thermal Cycler 480-nal {gyártó: Perkín Elmer) 94°C-on történő melegítéssel 5 percig és ezt követő Jü ciklus megismétleseve.1, ciklusonként 94 0C 1 percig és 68°C 2 percig.
A PCP után a reakcióoldatot agaróz gélelektroforézíssel frakciónál!uk, és egy kb. 700 bp DNS-fragmenst nyerünk ki Gene Clean II Kit-tel (gyártó: ΒΙΟ 101) a gyártó utasításai szerint. A kinyert DNS-fragmenst pT7Slue(R) vektorba ligáijuk (gyártó: Novagen) DNA Ligation Kit-tel (gyártó: Takara Shuzo) és E. coli DH5a-t (gyártó: Toyobo) transzformálunk a kapott rekombináns DNS plazmáddal, ezáltal a 3'GMD plazmádhoz jutunk. DNA Sequencer 377 (gyártó: Parkin Elmer) segítségével meghatározzuk a plazmádban a CHO se)t-eredetű GMD cDNS terminációs kodonjától upstream irány* # $ fr *» ^x·^ » · * # $ r> » <>* ban lévő 27 bázisú nukleotid-szekvenciát.
Az (I), (2) és (3) pontban meghatározott CHO sejt-eredetű GMD gén teljes hosszúságú cDNS-szekvenciájá.t a SEQ ID NO: 65-ben és SEQ ID NO:71-ben mutatjuk be.
Az (1), (2) és (3) pontban meghatározott CHO sejt-eredetű GMD gén. teljes hosszúságú cDNS-szekvenciáját és a megfelelő amisósav-szekvenciát a SEQ ID NO: 65-ben illetve SEQ ID NO:71-ben mutatjuk be.
2. CHO/DG44-eredetű. sejt GMD gént tartalmazó genomiális szekvencia meghatározása
Egy 25-mer prímért, melynek nukleotid-szekvenciáját a SEQ ID NO:66~ban mutatjuk be, állítunk elő a 1.7-1 példában meghatározott egér GMD cDNS-szekvenciából. Ezután egy CHO sejt-eredetű genom DNS-t készítünk az alábbi eljárással. A CHO/DG44 sejteredetű KC861-t IMDM-dFBS (10). -HT (1) tápközegben f IMDM-dFBS (10} tápközeg, amely 1 x koncentráció RT kiegészítőt (gyártó: Invitrogen) tartalmaz] szuszpendálunk 3 κ ΙΟ-' sejt/ml sűrűségben és a szuszpenzíót 2 ml/lyuk mennyiségben szétosztjuk egy 6-lyuku adhéziós sejttenyésztő lemezre (gyártó: Greiner). A tenyésztést 37cc-on, 5% CCy-tartalmú inkubátorban addig folytatjuk, amíg a sejtek kontinenssé válnak a lemezen, majd a sejtekből a genom DNS-t ismert módszerrel kipreparáljuk [Nucleic Acids Research 3, 2303 (19876)], és egy éjszakán át 150 μΐ TE-RNáz pufferben (pH 8,0) (10 mmol/1 Tris-RCl, 1 mmol/1 EDTA, 200 pg/ml RNáz A) feloldjuk.
Reakcióoldatot (20 μΐ) készítünk [1 x ExTaq puffer (gyártó:
Takara Shuzo), 0,2 mM dNTP-k, 0,5 egység EX Tag polimeráz. (gyártó: Takara Shuzo), 0,5 μΧ szintetikus primerek (SEQ ID NO:59 és SEQ ID NÖ:66], amely 100 ng kapott CHO/DG44 sejt-eredetű genom DNS-t tartalmaz, és PCR-t kivitelezünk DNA Thermal Cycler 480nal (gyártó: Perkin Elmer) 94®C-on történő melegítéssel 5 percig és ezt követő 30 ciklus meg ismét lésével, ciklusonként 94'^C 1 percig és 68 °C 2 percig. A reakció teljessé válása után a PCRreakcióoldatot agaróz gélelektroforé-zissel frakciónáljuk, és egy kb. 100 bp DNS-fragmenst nyerünk ki Gene Clean II Kit-tel (gyártó: 310 101) a gyártó utasításai szerint. A kinyert DNSf ragmens t pT7Blue(R) vektorba ligái juk. (gyártó: Novagen) DNA Ligation Kit-tel (gyártó: Takara Shuzo) és E. coli DH5a-t (gyártó: To-yobo) transzformálunk a kapott rekombináns DNS plazmáddal, ezáltal az ex3 plazmádhoz jutunk. DRA Sequencer 377 (gyártó: Parkin Elmer) segítségévei meghatározzuk a plazmádban a CHQ sejt-eredetű genom DNS nukleotid-szekvencíáját. Az eredményt a SEQ ID NG:67-ben mutatjuk be.
Ezt követően egy 25-mer prímért, melynek nukleotid-szekvenciáját a. SEQ ID NO: 68-ban mutat juk be melynek nukleotid-szekvenciáját
SEQ ID NG:69-ben mutatjuk be, készítünk
17-1 példában meghatározott cDNS-szekvencia alapján. Ezt követően 20 ul reakcióoldatot szitunk [1 x ExTaq puffer (gyártó: Takara Shuzo), 0,2 mM dNTP0,5 egység EX Tag polimeráz. (gyártó: Takara Shuzo), 0,5 μΜ szintetikus primerek (SEQ ID NG:68 és SEQ ID NO:69], amely 100 ng kapott CHO/DG44 sejt-eredetű genom DNS-t tartalmaz, és PCR-t kivitelezünk DMA Thermal Cycler 480-nal (gyártó: Perkin Elmer)
DNS nukleotid-szekve-nciáját.
Az eredményt a SEQ ID NO:70-ben ®u-
18. példa
Kereskedelemben beszerezhet© antitestek cukörlánc-analízise
A. CEO sejt, mint gazdasejt által termelt., konvencionálisán beszerezhető, Herceptin anti-HER2/új antitesthez (gyártó: Genentech .és Roche) kötődő cukorláncokat analizáljuk a 10(6) példa szerinti módszerrel (31. ábra). Amikor az elúciós. diagram egyes csúcs aratta ceruietsibö.i számolunk, a Hercepuzn íx—.i., 6— fukóz-mentes cukorlánc-tartalma 16% és az a~l,6~fukóz-kötótt cukorlánc-tartalma 84%. Ugyanezt az analízist elvégeztük más kereskedelemben beszerezhető antitesteken, R.ituxan -(gyártó: Genentech, Roche és IDEG) és Zenapaz. (gyártó: Roche és PDL), és azt. találtuk, hogy az a-l., 6-fukóz-mentes cukorlánc-tartalom kevesebb, mint a Herceptinnél.
A 31. ábra grafikonja a Herceptínből készített PA-kezelt cu kor láncok elúciós mintázatait mulatja be, melyeket reverz fázisú
HPLC analízissel kaptunk. A relatív fluoreszcens intenzitást és reverz fázisú HPLC analízis körülményeket, a cukorlánc szerkezet analízisét és az a-1,6-fukóz-mentes cukorlánc-csoport arányának kiszámítását a 11(6) példában, leírt módszerekkel. végeztük.
Ipari alkalmazhatóság
A jelen találmány egy ant st-kompozició termelésére alkal mas sejtet, a sejt, felhasználásával az antitest-kompozíció elő állítására szolgáló eljárást, az antitest-kompozíciót és ennek alkalmazasat bocsátja rendelkezésre.
A Szekvencia Lista szabad szövege <223>:
SEQ ID NO: 4 - Szintetikus szekvencia leírása: szintetikusDNS
SEQ ID NO: 5 - Szintetikus szekvencia leírása: szintetikusDNS
SEQ ID NO:8 - Szintetikus szekvencia leírása: szintetikusDNS
SEQ ID NO:9 - Szintetikus szekvencia leírása: szintetikusDNS
SEQ ID NO:44 — Szintetikus szekvencia leírass: szintetikus uNS
SEQ ID NO:45 - Szintetikus szekvencia leírása: szintetikus DNS
SEQ ID NG:46 - Szintetikus szekvencia leírása: szintetikus DNS
SEQ ID NO:47 - Szintetikus szekvencia leírása: szintetikusDNS
SEQ ID NO: 49 - Szintetikus szekvencia leírása: szintetikusDNS
SEQ ID NO: 50 - Szintetikus- szekvencia leírása: szintetikusDNS
SEQ ID NO:52 ~ Szintetikus szekvencia leírása: szintetikusDNS
SEQ ID NO: 53 - Szintetikus szekvencia leírása: szintetikusDNS
SEQ ID NO:54 ~ Szintetikus szekvencia leírása: szintetikusDNS
SEQ 1D NOíbu ~ azmtetikus szsKvencia learass: szintecxku-sDNS
SEQ ID NO : 5 6 ~ Szintetikus szekvencia leírása: szintetikusDNS
SEQ ID NO:57 - Szintetikus szekvencia leírása: szintetikusDNS
SEQ ID NO:5-8 ~ Szintetikus szekvencia leírása: szintetikusDNS
SEQ ID NO: 59 ··· Szintetikus szekvencia leírása: szintetikusDNS
SEQ ID NO:60 - Szintetikus szekvencia leírása: szintetikusDNS
SEQ ID NO:61 - Szintetikus szekvencia leírása: szintetikusDNS
SEQ ID NO:63 - Szintetikus szekvencia leírása: szintetikusDNS
SEQ ID NO:64 - Szintetikus szekvencia leírása: szintetikusDNS
SEQ ID NO:66 ~ Szintetikus szekvencia leírása: szintetikusDNS
SEQ ID NO::68 ~ Szintetikus szekvencia leírása: szintetikusDNS
SEQ ID NO:69 - Szintetikus szekvencia leírása: szintetikusDNS

Claims (29)

  1. Szabadalmi igénypontok
    1, Kínai hörcsög petefészek-eredetű (CHO) sejt, amelybe egy antitest molekulát kódoló gént építünk be, amely egy olyan antitest kompozíciót termel, amely az Fc-régíóhoz kötött komplex Nglikozid-kapcsolt cukorláncokkal rendelkező antitest molekulát tartalmaz;
    amelyben az a-1,δ-fukozil-transzferáz aktivitása, deletált;
    ahol a cukorlánc egy olyan komplex N-glíkozid-kapcsolt cukorlánc, amelyben a redukáló végen az 1-es helyzetű fukóz nem kötődik α-kötéssel a 6-helyzetű N-acetil-glükózaminhoz.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti CHO sejt, amelyben az antitest molekula az IgG osztályba tartozik.
  3. 3. Az 1. vagy 2. igénypontok egyike szer inti. CHO sejt, amelyben az a-1,6-fukozil-transzferáz egy olyan fehérje, amelyet az (a) vagy (b) DNS kódol;
    (a) DNS, amely a SEQ ID NO:1 azonosító számú nukleotid szekvenciát tartalmaz za ,· (b) DNS, amely szigorú körülmények között a SEQ ID NO:1 azonosító számú nukleotid szekvenciát tartalmazó DNS-sel híbridizál és egy a-1>,6-fukozil-transzferál aktivitású fehérjét kódol.
  4. 4. Az 1-3. igénypontok egyike szerinti CHO sejt, amelyben az a-1,6-fukozil-transzferét egy olyan fehérje, amelyet az alábbi (a), (hí és (c)-ből álló csoportból választunk ki;
    íaj fehérje, amely a SEQ id NO:2-3 azonosító számú amínosav szekvenciát tartalmazza;
    SZTN1M00251867
    291 (1)} fehérje, amely egy SEQ id NO:23 azonosító számú aminosav szekvenciát tartalmazza, amelyben legalább egy aminosav delebált, helyettesített, inszertált és/vagy hozzáadott, és a1,6-fukozil-transzferáz aktivitással rendelkezik.,* (c) fehérje, amely a SEQ ID NO:23 azonosító számú aminosav szekvenciával legalább 80%-ban homológ aminosav-szekvenciát tartalmaz és a-1,6-fukozil-transzferáz aktivitással rendelke-
  5. 5. Az 1-4. igénypontok egyike szerinti CHO sejt, amelyben az enzimaktivitást megszüntettük egy, az alábbi (a) , (b), (c) és (d) pontokból álló csoportból kiválasztott módszer segítségével: (a) gén-megszakításos módszer, amely az a-1,6-fukoziltranszferázt kódoló gént célozza; (b) az a-1,6-fukoziltranszferált kódoló gén domináns negatív mutánsának beépítésére alkalmas módszer; (c) módszer mutáció a-1,6-fukoziltranszf erázba történő beépítésére; (d) módszer az a-1,6-fukoziltranszferázt kódoló gén transzkripciójának és/vagy transzlációj ának gátlására.
  6. 6. Az 1-5. igénypontok egyike szerinti CHO sejt, amely egy antitest-kompozíciót termel, amely nagyobb antitest-függő sejtközvetített citotoxikus aktvitással rendelkezik, mint a szülő CHO sejtje által termelt antitest-kompozíció.
  7. 7. A 6. igénypont szerinti CHO sejt, amely egy antitestkompozíciót termel, amely nagyobb antitest-függő sejt-közvetített citotoxikus aktivitással rendelkezik, mint egy olyan antitest-kompozíció, amelyben az Fc-régióhoz kötött összes komplex. N-glikozid~kapcsolt cukorlánc közül azoknak a cukorláncoknak az aránya, amelyekben a cukorláncban a redukáló végen nem kötődik az l'í-acetil-glükózaminhoz fukóz, kevesebb mint 20%.
  8. 8. Eljárás antitest-kompozíció termelésére, amely magában foglalja az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti CHO sejt tenyésztését egy tápközegben az antitest-kompozíció tenyészetben történő termelése és felhalmozása érdekében; és az antitestkompozíció kinyerését a tenyészetből.
  9. 9. Antitest-kompozíció, amelyet a 8. igénypont szerinti eljárással t er me1unk.
  10. 10. Antitest-kompozíció, amely egy, az Fc-régióhoz kötött komplex ΑΓ-glíkozid-kapcsolt cukorláncokat hordozó antitest molekulát tartalmaz, amelyet egy CHO sejt termel;
    amelyben az a-1,6-fukozil-transzferár aktivitása deletált;
    ahol a cukorlánc egy olyan komplex AF-glikozid-kapcsolt cukorlánc, amelyben a redukáló végen az 1-es helyzetű fukóz nem kötődik α-kötéssel a δ-helyzetű AT-acetil-glükózaminhoz.
  11. 11. Egy emlős sejt, amelyben az a-1,δ-fukozil-transzferáz aktiv11ása deletált;
    ahol a sejt termel egy antitest kompozíciót, amely tartalmaz egy, az Fc-régióhoz kötött komplex l/-glikozi.d~kapcsolt cukorláncokkal rendelkező antitest molekulát, ahol a cukorlánc egy olyan komplex xV-glikozid-kapcsolt cukor lánc, amelyben a redukáló végen az 1-es helyzetű fukóz nem kötődik α-kötéssel a 6~helyzetü N~ acetil-glükózaminhoz.
  12. 12. A 11. igénypont szerinti sejt, amelyben az a-1,6-fukozil-transzferáz egy olyan fehérje, amelyet az alábbi (a),
    293 (b) , (c) és (d) elemekből álló csoportból kiválasztott DNS kódol:
    (a) DNS, amely a SEQ ID NO:1 azonosító számú nukleotid székvéne i á t tar ta .1 ma z z a;
    (b) DNS, amely a SEQ ID NO:2 azonosító számú nukleotid szekvenciát tartalmazza;
    (c) DNS, amely szigorú körülmények között a SEQ ID NO;1 azonosító számú nukleotid szekvenciával hibridizál és a-1,6fukozil-transzferár aktivitású fehérjét kódol, (d) DNS, amely szigorú körülmények között a SEQ ID NO:2 azonosító számú nukleotid szekvenciával hibridizál és a-1,6fukozil-transzferáz aktivitású fehérjét kódol.
  13. 13. A 12, igénypont szerinti sejt, amelyben az a-1,6-fukozil-transzferár egy olyan fehérje, amelyet az alábbi (a) , (b) , (c), (d) , (e) és (f; elemekből álló csoportból választunk ki:
    (a) fehérje, amely a SEQ ID NO:23 azonosító számú aminosav szekvenciát tartalmazza;
    (b) fehérje, amely a SEQ ID NO:24 azonosító számú aminosav szekvenciát tartalmazza;
    (c) fehérje, amely egy olyan SEQ ID NO;23 azonosító számú aminosav szekvenciát tartalmaz, amelyben legalább egy aminosav deletált, helyettesített, ínszertált és/vagy hozzáadott, és a-1,6-fukozíl-transzferáz aktivitással rendelkezik;
    (d) fehérje, amely egy olyan SEQ ID NO:24 azonosító számú aminosav szekvenciát tartalmaz, amelyben legalább egy aminosav deletált, helyettesített, ínszertált és/vagy hozzáadott, és -transzferár aktivitással rendelkezik;
    a-1,S-fukozil (e) fehérje, amely a SEQ id NO:23 azonosító számú aminosav szekvenciával legalább 80%-ban homológ aminosav szekvenciát tartalmaz és a-1,6-fukozil-transzferár aktivitással rendelkezik, (i) fehérje, amely a SEQ xd NO:24- azonosító számú aminosav szekvenciával legalább 80%-ban homológ aminosav szekvenciát tartalmaz és a-1,6-fükozil-transzferáz aktivitással rendelkezik.
  14. 14. A 11-13. igénypontok bármelyike szerinti sejt, amelyet a következők közül választunk: kínai hörcsög petefészek-szövetből származó CHO sejt és patkány mielóma sejtvonal, YB2/3HL,P2.G11.16Ag.20 sej t.
  15. 15. Eljárás egy antitest kompozíció termelésére, amely magában foglalja egy 11-14. igénypont szerinti sejt tenyésztését egy tápközegben az anti test-kompozíció tenyészetben történő termelése és felhalmozása érdekében; és az antitest-kompozíció kinyerését a tenyészetből.
  16. 16. A 1'5. igénypont szerinti eljárás, amely nagyobb antitest-függő sejt-közvetített citotoxikus aktivitással rendelkező antitest kompozíciót termel, mint a szülő sejtvonalból kapott an ti test kompozí c ió.
  17. 17. Antitest kompozíció, amelyet a IS. vagy 16. igénypont szerinti eljárással termelünk, amelyben az antitest molekula Βοή ágidhoz kötött komplex N-glikozid-kapcsolt cukorláncokat hordoz, ahol a cukcrlánc egy olyan komplex N-gli.kozid~ kapcsolt cukorlánc, amelyben a redukáló végen az 1-es helyzetű fukóz nem kötődik o-kötéssel a 6-helyzetű N-acetil-glükózaminhoz.
    295
  18. 18. Egy transzgenikus nem-humán állat vagy ezek utódai, amelyek tartalmasnak egy génemet, melyet úgy módosítottunk,, hogy az a-1, 6-fukozil-transzferáz aktivitása csökkentett vagy deletált, és amelyben a transzgenikus nem-humán állat vagy ezek utódai olyan antitest kompozíciót termelnek, amely egy Fc-régióhoz kötött komplex W-glikozid-kapcsolt cukorláncokat hordozó antitest molekulát tartalmaz, ahol a kompozícióban az Fc-régióhoz kötött összes komplex N~glikozid~kapcsolt cukorlánc közül azoknak a cukorláncoknak az aránya, amelyekben a cukorláncban a redukáló végen .nem kötődik az íV-acetil-glükózaminhoz fukóz, 20% vagy ennél több.
  19. 19, A 18. igénypont szerinti transzgenikus nem-humán állat vagy ezek utódai, amelyekben az a-1,6-fukozil-transzferázt kódoló gént kiütöttük, amelyben a transzgenikus nem-humán állat vagy ezek utódai olyan antitest kompozíciót termelnek, amely egy Fcrégióhoz kötött, komplex AT-glikozid-kapcsolt cukorláncokat hordozó antitest molekulát tartalmaz, ahol a kompozícióban ahol az Fc-régióhoz kötött összes komplex .N-glikozid-kapcsolt cukorlánc közül azoknak a cukorláncoknak az aránya, amelyekben a cukorláncban a redukáló végen nem kötődik az M-acetil-glükózaminhóz fukóz, 20% vagy ennél több,
  20. 20. A 18. igénypont szerinti transzgenikus nem-humán állat vagy ezek utódai, amelyben az a-1,6-fukozil-transzferáz egy olyan fehérje, a melyet az (a) , (b), (c) és (d) közül kiválasztott DNS kódol:
    (a) DNS, amely a SEQ ID NO:1 azonosító számú nukleotid szekv en c i á t t a r t a Ima z z a
    296 (b) DNS, amely a SEQ ID NO;2 azonosító számú nukleotid szekvenciát tartalmazza;
    (c) DNS, amely szigorú körülmények között a SEQ ID NO:1 azonosító számú nukleotid szekvenciával hibridizál és a-1,6fukozil-transzferáz aktivitású fehérjét kódol, (d) DNS, amely szigorú körülmények között a SEQ ID NO:2 azonosító számú nukleotid szekvenciával hibridizál és ct-1,6fukozil-transzferáz aktivitású fehérjét kódol,
  21. 21. A 18-20. igénypontok bármelyike szerinti transzgenikus nem-humán állat vagy ezek utódai, amelyben a transzgenikus nemhumán állat szarvasmarha, juh, kecske, sertés, ló, egér, patkány,. baromfi, majom vagy nyúl.
  22. 22, Eljárás antitest-kompozíció termelésére, amely magában foglalja egy 18-21. igénypontok bármelyike szerinti transzgenikus nem-humán állat vagy ezek utódának nevelését; a felnevelt állatból olyan szövet vagy testfolyadék kinyerését, amely tartalmazza az antitestet; és az antitest kinyerését az izolált szövetből vagy testfolyadékból.
  23. 23» A 22. igénypont szerinti eljárás, amelyben az antitest molekula az igG osztályba tartozik.
  24. 24. A 22» vagy 23. igénypont szerinti eljárás, amely nagyobb antitest-függő sejt-közvetített citotoxikus aktivitással rendelkező antitest kompozíciót termel, mint az az antitest kompozíció, amelyet olyan nem-humán állatból vagy ezek utódaiból kapunk, amelyek genomját nem módosítottuk.
  25. 25. Antitest kompozíció, amelyet a 22-24. igénypontok bármelyike szerinti eljárással termelünk, amelyben egy antitest mole
    297 kula az Fc-régióhoz kötött komplex iv-glikozid-kapcsolt cukorláncokat hordoz, ahol a cukorlánc egy olyan komplex JV-glikozidkapcsolt cukorlánc, amelyben a redukáló végen az 1-es helyzetű fukóz nem kötődik o-kőtéssel a β-helyzetű íf-acetilglükózaminhoz-.
  26. 26. Gyógyszer kész ítmény, amely hatóanyagként a 9., 10., '17. és 25. igénypont bármelyike szerinti antitest kompozíciót tartalmazza .
  27. 27. a 26. igénypont szerinti gyógyszerkészítmény, amelyben a gyógyszer egy terápiás szer tumorokkal kísért betegségekre, allergiákkal kísért betegségekre, gyulladásokkal kísért betegségekre, autoimmun betegségekre, keringési szerv betegségekre, vírusfertőzésekkel vagy bakteriális fertőzésekkel kísért betegségekre .
  28. 28. Diagnosztikum, amely hatóanyagként a 9., 10., 17. és 25. igénypont bármelyike szerinti antitest kompozíciót tartalmazza.
  29. 29. A 28. igénypont szerinti diagnosztikum, amelyben a dianosztikum egy diagnosztikai szex tumorokkal kísért betegségekre, allergiákkal kísért betegségekre, gyulladásokkal kísért betegségekre, autoimmun betegségekre, keringési szerv betegségekre, vírusfertőzésekkel vagy bakteriális fertőzésekkel kísért betegségekre .
HU0402066A 2000-10-06 2001-10-05 Antitest-kompozíciót termelő sejt HU231090B1 (hu)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
HUS2000035C HUS2000035I1 (hu) 2000-10-06 2020-08-27 Antitest-kompozíciót termelõ sejt

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2000-308526 2000-10-06
JP2000308526 2000-10-06
PCT/JP2001/008804 WO2002031140A1 (fr) 2000-10-06 2001-10-05 Cellules produisant des compositions d'anticorps

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HUP0402066A2 HUP0402066A2 (hu) 2005-01-28
HUP0402066A3 HUP0402066A3 (en) 2012-09-28
HU231090B1 true HU231090B1 (hu) 2020-07-28

Family

ID=18788817

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU0402066A HU231090B1 (hu) 2000-10-06 2001-10-05 Antitest-kompozíciót termelő sejt
HUS2000035C HUS2000035I1 (hu) 2000-10-06 2020-08-27 Antitest-kompozíciót termelõ sejt

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HUS2000035C HUS2000035I1 (hu) 2000-10-06 2020-08-27 Antitest-kompozíciót termelõ sejt

Country Status (14)

Country Link
EP (5) EP3263702A1 (hu)
JP (12) JP4290423B2 (hu)
KR (1) KR100877676B1 (hu)
CN (3) CN1894406A (hu)
AU (2) AU2001294198C1 (hu)
BR (1) BR0114475A (hu)
CA (3) CA2424602C (hu)
DK (1) DK2314686T4 (hu)
EA (2) EA013224B1 (hu)
ES (3) ES2620359T3 (hu)
HU (2) HU231090B1 (hu)
MX (1) MXPA03002974A (hu)
PL (1) PL218428B1 (hu)
WO (1) WO2002031140A1 (hu)

Families Citing this family (917)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7183387B1 (en) 1999-01-15 2007-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
DK2270147T4 (da) 1999-04-09 2020-08-31 Kyowa Kirin Co Ltd Fremgangsmåde til at kontrollere aktiviteten af immunologisk funktionelt molekyle
FR2807767B1 (fr) 2000-04-12 2005-01-14 Lab Francais Du Fractionnement Anticorps monoclonaux anti-d
EP3263702A1 (en) 2000-10-06 2018-01-03 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Cells producing antibody compositions
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
US20040093621A1 (en) * 2001-12-25 2004-05-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Antibody composition which specifically binds to CD20
US7662925B2 (en) 2002-03-01 2010-02-16 Xencor, Inc. Optimized Fc variants and methods for their generation
US20040132101A1 (en) 2002-09-27 2004-07-08 Xencor Optimized Fc variants and methods for their generation
US8188231B2 (en) 2002-09-27 2012-05-29 Xencor, Inc. Optimized FC variants
US7317091B2 (en) 2002-03-01 2008-01-08 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
AU2003236015A1 (en) * 2002-04-09 2003-10-20 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Process for producing antibody composition
CA2481657A1 (en) * 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells of which genome is modified
JPWO2003085119A1 (ja) * 2002-04-09 2005-08-11 協和醗酵工業株式会社 抗体組成物のＦｃγ受容体ＩＩＩａに対する結合活性を高める方法
CA2481920A1 (en) * 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Antibody composition-containing medicament
CA2481925A1 (en) * 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Therapeutic agent for patients having human fc.gamma.riiia
US7749753B2 (en) 2002-04-09 2010-07-06 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd Cells in which activity of the protein involved in transportation of GDP-fucose is reduced or lost
AU2002338020A1 (en) 2002-09-04 2004-03-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody against blood-solubilized n-terminal peptide in gpc3
EP3502133A1 (en) 2002-09-27 2019-06-26 Xencor, Inc. Optimized fc variants and methods for their generation
AR042145A1 (es) * 2002-11-27 2005-06-08 Dow Agrociences Llc Produccion de inmunoglobulinas en plantas con una fucocilacion reducida
US20090010920A1 (en) 2003-03-03 2009-01-08 Xencor, Inc. Fc Variants Having Decreased Affinity for FcyRIIb
US8084582B2 (en) 2003-03-03 2011-12-27 Xencor, Inc. Optimized anti-CD20 monoclonal antibodies having Fc variants
US8388955B2 (en) 2003-03-03 2013-03-05 Xencor, Inc. Fc variants
EP1616880A4 (en) 2003-03-13 2006-07-26 Chugai Pharmaceutical Co Ltd LIGAND WITH AGONISTIC ACTIVITY AGAINST A MUTED RECEPTOR
JP2004298180A (ja) * 2003-03-18 2004-10-28 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd ゲノムが改変されたマウス
JP2010220615A (ja) * 2003-03-18 2010-10-07 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd ゲノムが改変されたマウス
US9051373B2 (en) 2003-05-02 2015-06-09 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
ES2348008T3 (es) 2003-06-18 2010-11-26 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Transportador de fucosa.
FR2858235B1 (fr) 2003-07-31 2006-02-17 Lab Francais Du Fractionnement Utilisation d'anticorps optimises en adcc pour traiter les patients faibles repondeurs
WO2005014651A1 (ja) 2003-08-11 2005-02-17 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 糖鎖改変抗hm1.24抗体
US20080153104A1 (en) 2003-08-08 2008-06-26 Hiroyuki Aburantai Gene Overexpressed in Cancer
US8399618B2 (en) 2004-10-21 2013-03-19 Xencor, Inc. Immunoglobulin insertions, deletions, and substitutions
US8883147B2 (en) 2004-10-21 2014-11-11 Xencor, Inc. Immunoglobulins insertions, deletions, and substitutions
US9714282B2 (en) 2003-09-26 2017-07-25 Xencor, Inc. Optimized Fc variants and methods for their generation
EP1688439A4 (en) * 2003-10-08 2007-12-19 Kyowa Hakko Kogyo Kk HYBRID PROTEIN COMPOSITION
JPWO2005035577A1 (ja) * 2003-10-08 2007-11-22 協和醗酵工業株式会社 ガングリオシドｇｄ３に特異的に結合する抗体組成物
JPWO2005035583A1 (ja) * 2003-10-08 2007-11-22 協和醗酵工業株式会社 Ｉｌ−５受容体に特異的に結合する抗体組成物
WO2005035582A1 (ja) * 2003-10-08 2005-04-21 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Ｃｃｒ４に特異的に結合する抗体組成物
WO2005035740A1 (ja) * 2003-10-09 2005-04-21 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. 無血清馴化したゲノム改変細胞
US7691810B2 (en) * 2003-10-09 2010-04-06 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd Method of producing recombinant antithrombin III composition
AU2004280066A1 (en) * 2003-10-09 2005-04-21 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Genomically modified cell
AU2004280065A1 (en) * 2003-10-09 2005-04-21 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Process for producing antibody composition by using RNA inhibiting the function of alpha1,6-fucosyltransferase
EP1676860B1 (en) * 2003-10-09 2012-04-18 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Process for producing antithrombin III composition
JPWO2005035581A1 (ja) * 2003-10-09 2007-11-22 協和醗酵工業株式会社 ヒトＶＥＧＦ受容体Ｆｌｔ−１に特異的に結合する抗体組成物
JPWO2005035578A1 (ja) * 2003-10-09 2007-11-22 協和醗酵工業株式会社 ガングリオシドｇｍ２に特異的に結合する抗体組成物
FR2861395B1 (fr) 2003-10-23 2006-02-17 Lab Francais Du Fractionnement Facteur viii viralement securise a faible teneur en multimeres superieurs
WO2005053741A1 (ja) 2003-12-04 2005-06-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. ケモカイン受容体ｃｃｒ４に対する遺伝子組換え抗体を含む医薬
WO2005056759A2 (en) 2003-12-04 2005-06-23 Xencor, Inc. Methods of generating variant proteins with increased host string content and compositions thereof
JPWO2005053742A1 (ja) * 2003-12-04 2007-06-28 協和醗酵工業株式会社 抗体組成物を含有する医薬
US7329353B2 (en) 2004-01-23 2008-02-12 Amgen Inc. LC/MS method of analyzing high molecular weight proteins
AU2005227326B2 (en) 2004-03-24 2009-12-03 Xencor, Inc. Immunoglobulin variants outside the Fc region
EP1674111B1 (en) 2004-07-09 2010-11-03 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-glypican 3 antibody
EP2471813B1 (en) 2004-07-15 2014-12-31 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
US20150010550A1 (en) 2004-07-15 2015-01-08 Xencor, Inc. OPTIMIZED Fc VARIANTS
US20060223147A1 (en) * 2004-08-05 2006-10-05 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd., Process for producing glycoprotein composition
SI1800693T1 (sl) 2004-08-24 2013-11-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Adjuvantna terapija z uporabo protitelesa proti glipikanu 3
CN101068836B (zh) * 2004-10-26 2013-08-14 中外制药株式会社 糖链改变的抗磷脂酰肌醇聚糖3抗体
US8367805B2 (en) 2004-11-12 2013-02-05 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to FcRn
KR101027427B1 (ko) 2004-11-12 2011-04-11 젠코어 인코포레이티드 ＦcRn에 대하여 증가된 결합력을 갖는 Ｆc 변이체
US8546543B2 (en) 2004-11-12 2013-10-01 Xencor, Inc. Fc variants that extend antibody half-life
US8802820B2 (en) 2004-11-12 2014-08-12 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to FcRn
DK1853718T3 (en) 2005-02-15 2015-11-09 Univ Duke ANTI-CD19 ANTIBODIES AND THEIR USE IN ONCOLOGY
WO2006109696A1 (ja) * 2005-04-06 2006-10-19 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. 遺伝子組換え卵胞刺激ホルモン組成物
WO2006109698A1 (ja) * 2005-04-06 2006-10-19 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. 遺伝子組換えエリスロポイエチン組成物
WO2006109695A1 (ja) * 2005-04-06 2006-10-19 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. 遺伝子組換えハプトグロビン組成物
WO2010080538A1 (en) 2008-12-19 2010-07-15 Macrogenics, Inc. Covalent diabodies and uses thereof
WO2012018687A1 (en) 2010-08-02 2012-02-09 Macrogenics, Inc. Covalent diabodies and uses thereof
WO2006121852A2 (en) 2005-05-05 2006-11-16 Duke University Anti-cd19 antibody therapy for autoimmune disease
ES2526811T3 (es) 2005-08-10 2015-01-15 Macrogenics, Inc. Identificación y modificación de anticuerpos con regiones Fc variantes y métodos de uso de estos
WO2007041635A2 (en) 2005-10-03 2007-04-12 Xencor, Inc. Fc variants with optimized fc receptor binding properties
WO2007044616A2 (en) 2005-10-06 2007-04-19 Xencor, Inc. Optimized anti-cd30 antibodies
US20070087005A1 (en) 2005-10-14 2007-04-19 Lazar Gregory A Anti-glypican-3 antibody
KR20080094918A (ko) 2006-01-17 2008-10-27 바이오렉스 쎄라퓨틱스, 인코포레이티드 식물에서 ｎ-글리칸의 인간화 및 최적화 조성물 및 방법
EP2540741A1 (en) 2006-03-06 2013-01-02 Aeres Biomedical Limited Humanized anti-CD22 antibodies and their use in treatment of oncology, transplantation and autoimmune disease
US20080118978A1 (en) 2006-04-28 2008-05-22 Takashi Sato Anti-tumor agent
EA020324B1 (ru) 2006-07-18 2014-10-30 Санофи-Авентис АНТИТЕЛА К РЕЦЕПТОРУ ЭФРИНА EphA2 И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
EP2050466B1 (en) 2006-08-14 2015-10-28 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Diagnosis and treatment of cancer using anti-desmoglein-3 antibodies
DK2059536T3 (da) 2006-08-14 2014-04-14 Xencor Inc Optimerede antistoffer, der er rettet mod cd19
US8394374B2 (en) 2006-09-18 2013-03-12 Xencor, Inc. Optimized antibodies that target HM1.24
CN103396486A (zh) 2006-10-12 2013-11-20 中外制药株式会社 使用抗ereg抗体的癌症的诊断和治疗
EP1914242A1 (en) 2006-10-19 2008-04-23 Sanofi-Aventis Novel anti-CD38 antibodies for the treatment of cancer
CA2666559A1 (en) 2006-10-20 2008-04-24 Forerunner Pharma Research Co., Ltd. Pharmaceutical composition comprising anti-hb-egf antibody as active ingredient
AR063975A1 (es) 2006-11-28 2009-03-04 Centelion Fusiones fc con receptor para fgf soluble modificadas con actividad biologica mejorada
EP2103628A4 (en) 2006-12-14 2012-02-22 Forerunner Pharma Res Co Ltd MONOCLONAL ANTIBODY ANTI-CLAUDIN 3, AND TREATMENT AND DIAGNOSIS OF CANCER USING SUCH ANTIBODY
JP2010512765A (ja) * 2006-12-22 2010-04-30 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー 選択方法
US20100111851A1 (en) 2007-01-05 2010-05-06 The University Of Tokyo Diagnosis and treatment of cancer by using anti-prg-3 antibody
WO2008090959A1 (ja) 2007-01-24 2008-07-31 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. エフェクター活性が増強された遺伝子組換え抗体組成物
EP2107115A1 (en) 2007-01-24 2009-10-07 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Genetically recombinant antibody composition capable of binding specifically to ganglioside gm2
PE20081760A1 (es) 2007-02-09 2009-01-01 Genentech Inc Anticuerpos anti-robo4 y sus usos
EP3118221B1 (en) 2007-02-26 2019-08-21 Oxford BioTherapeutics Ltd Proteins
WO2008104803A2 (en) 2007-02-26 2008-09-04 Oxford Genome Sciences (Uk) Limited Proteins
PT3199180T (pt) 2007-03-08 2022-04-01 Univ Monash Anticorpos epha3 para o tratamento de tumores sólidos
JPWO2008114733A1 (ja) 2007-03-16 2010-07-01 協和発酵キリン株式会社 抗Ｃｌａｕｄｉｎ−４抗体
US20080279851A1 (en) 2007-05-07 2008-11-13 Medlmmune, Llc Anti-icos antibodies and their use in treatment of oncology, transplantation and autoimmune disease
KR101588061B1 (ko) 2007-05-14 2016-01-25 메디뮨 엘엘씨 호산구 수준을 감소시키는 방법
DK2176298T3 (en) 2007-05-30 2018-02-12 Xencor Inc Methods and compositions for inhibiting CD32B-expressing cells
PL2158221T3 (pl) 2007-06-21 2019-02-28 Macrogenics, Inc. Kowalencyjne diaciała i ich zastosowania
JP5469456B2 (ja) 2007-06-25 2014-04-16 中外製薬株式会社 ＡＤＣＣ活性又はＣＤＣ活性を有する抗Ｐｒｏｍｉｎｉｎ−１抗体
CN101883850B (zh) * 2007-07-12 2014-11-12 桑格摩生物科学股份有限公司 用于失活α-1,6岩藻糖基转移酶(FUT8)基因表达的方法和组合物
AU2008282218A1 (en) 2007-07-31 2009-02-05 Medimmune, Llc Multispecific epitope binding proteins and uses thereof
ES2618316T3 (es) 2007-08-30 2017-06-21 Daiichi Sankyo Company, Limited Anticuerpo anti EPHA2
KR101922788B1 (ko) 2007-09-26 2018-11-27 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 항체 정상영역 개변체
US8680243B2 (en) 2007-11-14 2014-03-25 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Diagnosis and treatment of cancer using anti-GPR49 antibody
AR069501A1 (es) 2007-11-30 2010-01-27 Genentech Inc Anticuerpos anti- vegf (factor de crecimiento endotelial vascular)
ES2518415T3 (es) 2007-12-21 2014-11-05 Medimmune Limited Elementos de unión para receptor alfa de interleucina-4 (IL-4Ralfa)
US8092804B2 (en) 2007-12-21 2012-01-10 Medimmune Limited Binding members for interleukin-4 receptor alpha (IL-4Rα)-173
ES2532461T3 (es) 2007-12-26 2015-03-27 Xencor, Inc. Variantes de FC con enlazamiento alterado a FCRN
SG187457A1 (en) 2008-01-11 2013-02-28 Univ Tokyo Anti-cldn6 antibody
CN102083460A (zh) 2008-01-18 2011-06-01 米迪缪尼有限公司 用于位点特异性偶联的半胱氨酸工程化抗体
ES2589912T3 (es) 2008-04-02 2016-11-17 Macrogenics, Inc. Anticuerpos específicos para el complejo BCR y procedimientos de uso de los mismos
US8802093B2 (en) 2008-04-02 2014-08-12 Macrogenics, Inc. HER2/neu-specific antibodies and methods of using same
CL2009000647A1 (es) 2008-04-04 2010-06-04 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Composicion farmaceutica para tratar o prevenir cancer hepatico que comprende una combinacion de un agente quimioterapeutico y un anticuerpo anti-glipicano 3; agente para atenuar un efecto secundario que comprende dicho anticuerpo; metodo para tratar o prevenir un cancer hepatico de un sujeto.
KR102057826B1 (ko) 2008-04-11 2019-12-20 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 복수 분자의 항원에 반복 결합하는 항원 결합 분자
ES2828627T3 (es) 2008-04-25 2021-05-27 Kyowa Kirin Co Ltd Anticuerpo multivalente estable
EP2311493A4 (en) * 2008-05-20 2012-09-26 Kaneka Corp CYTOTOXIC COMPOSITION
US9226934B2 (en) 2008-06-02 2016-01-05 The University Of Tokyo Anti-cancer drug
CA2726845C (en) 2008-06-04 2017-09-26 Macrogenics, Inc. Antibodies with altered binding to fcrn and methods of using same
WO2010001908A1 (ja) 2008-06-30 2010-01-07 協和発酵キリン株式会社 抗cd27抗体
CN103172735B (zh) 2008-07-17 2014-12-10 协和发酵麒麟株式会社 抗-系统asc氨基酸转运蛋白2(asct2)抗体
JP5662149B2 (ja) 2008-08-13 2015-01-28 協和発酵キリン株式会社 遺伝子組換えプロテインｓ組成物
EP3581588B1 (en) 2008-09-17 2022-06-15 Xencor, Inc. Novel compositions and methods for treating ige-mediated disorders
JP5778577B2 (ja) 2008-09-19 2015-09-16 メディミューン，エルエルシー Ｄｌｌ４に対する抗体およびその使用
JP2012503656A (ja) 2008-09-26 2012-02-09 エウレカ セラピューティクス，インコーポレイテッド 変異体グリコシル化パターンを有する細胞株およびタンパク質
JP5913980B2 (ja) 2008-10-14 2016-05-11 ジェネンテック， インコーポレイテッド 免疫グロブリン変異体及びその用途
EP2358392B1 (en) 2008-11-12 2019-01-09 MedImmune, LLC Antibody formulation
EP2388320B1 (en) 2008-12-22 2017-02-15 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-hs6st2 antibodies and uses thereof
KR101812811B1 (ko) 2008-12-23 2017-12-27 제넨테크, 인크. 단백질 ａ에 대해 변경된 결합을 갖는 이뮤노글로불린 변이체
WO2010073694A1 (ja) 2008-12-25 2010-07-01 国立大学法人東京大学 抗tm4sf20抗体を用いた癌の診断と治療
AU2009331178A1 (en) 2008-12-26 2011-08-11 Forerunner Pharma Research Co., Ltd. Diagnosis and treatment of cancer using anti-LGR7 antibody
JP5511686B2 (ja) 2008-12-26 2014-06-04 協和発酵キリン株式会社 抗ｃｄ４抗体
CA2750581A1 (en) 2009-01-21 2010-07-29 Oxford Biotherapeutics Ltd. Pta089 protein
EA201101241A1 (ru) 2009-03-06 2012-04-30 Калобайос Фармасьютиклз, Инк. Лечение лейкозов и хронических миелопролиферативных болезней антителами к ерна3
NZ594665A (en) 2009-03-20 2013-08-30 Genentech Inc Bispecific anti-her antibodies
EP2233500A1 (en) 2009-03-20 2010-09-29 LFB Biotechnologies Optimized Fc variants
UA108199C2 (uk) 2009-03-25 2015-04-10 АНТИТІЛО ПРОТИ α5β1 І ЙОГО ЗАСТОСУВАННЯ
US20100256340A1 (en) 2009-04-07 2010-10-07 Ulrich Brinkmann Trivalent, bispecific antibodies
EP2377932B1 (en) 2009-04-09 2020-11-18 Daiichi Sankyo Company, Limited ANTI-Siglec-15 ANTIBODY
WO2010117057A1 (ja) 2009-04-10 2010-10-14 協和発酵キリン株式会社 抗tim-3抗体を用いた血液腫瘍治療法
WO2010119691A1 (ja) 2009-04-16 2010-10-21 国立大学法人東京大学 抗tmprss11e抗体を用いた癌の診断と治療
CA2759146C (en) 2009-04-20 2017-06-13 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Agonist anti-cd40 antibody
CN104558179A (zh) 2009-04-27 2015-04-29 协和发酵麒麟株式会社 用于治疗血液肿瘤的抗IL-3Rα抗体
AR076875A1 (es) 2009-05-15 2011-07-13 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anticuerpo contra receptor de la tirosina quinasa (anti-axl)
US20120141501A1 (en) 2009-05-29 2012-06-07 Forerunner Pharma Research Co. Ltd Pharmaceutical Composition Containing Antagonist of EGF Family Ligand as Component
WO2010141478A1 (en) * 2009-06-02 2010-12-09 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Fucosylation-deficient cells
KR101812348B1 (ko) 2009-06-11 2017-12-26 다이가쿠쿄도리요우키칸호우진 죠우호우시스테무 겡큐키코우 단백질의 생산 방법
US9676845B2 (en) 2009-06-16 2017-06-13 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific antigen binding proteins
EP2445520A4 (en) 2009-06-22 2013-03-06 Medimmune Llc MANIPULATED FC REGIONS FOR LOCAL SPECIFIC CONJUGATION
AR077595A1 (es) 2009-07-27 2011-09-07 Genentech Inc Tratamientos de combinacion
US9345661B2 (en) 2009-07-31 2016-05-24 Genentech, Inc. Subcutaneous anti-HER2 antibody formulations and uses thereof
JP5692073B2 (ja) 2009-08-07 2015-04-01 協和発酵キリン株式会社 抗アミロイドβオリゴマーヒト化抗体
CA2769464C (en) 2009-08-07 2017-11-21 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Humanized anti-amyloid-.beta. oligomer antibody
CA2771436A1 (en) 2009-08-17 2011-02-24 Forerunner Pharma Research Co., Ltd. Pharmaceutical composition comprising anti-hb-egf antibody as active ingredient
CA2772715C (en) 2009-09-02 2019-03-26 Genentech, Inc. Mutant smoothened and methods of using the same
US9493578B2 (en) 2009-09-02 2016-11-15 Xencor, Inc. Compositions and methods for simultaneous bivalent and monovalent co-engagement of antigens
CA2773579C (en) 2009-09-10 2019-01-15 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Medicament including antibody composition specifically bound to human cc chemokine receptor 4 (ccr4)
AR078161A1 (es) 2009-09-11 2011-10-19 Hoffmann La Roche Formulaciones farmaceuticas muy concentradas de un anticuerpo anti cd20. uso de la formulacion. metodo de tratamiento.
BR112012006388B1 (pt) * 2009-09-22 2022-01-04 Probiogen Ag Método para produzir uma molécula, e, método para produzir uma proteína
EP2484697B1 (en) 2009-09-30 2016-09-14 Fujifilm RI Pharma Co., Ltd. Anti-podoplanin antibody, and pharmaceutical composition containing anti-podoplanin antibody
UY32914A (es) 2009-10-02 2011-04-29 Sanofi Aventis Anticuerpos que se usan específicamente al receptor epha2
ES2672121T3 (es) 2009-10-07 2018-06-12 Macrogenics, Inc. Polipéptidos que contienen región Fc que presentan una función efectora mejorada debido a alteraciones del grado de fucosilación, y métodos para su uso
EP2496605A1 (en) 2009-11-02 2012-09-12 Oxford Biotherapeutics Ltd. Ror1 as therapeutic and diagnostic target
PL3279215T3 (pl) 2009-11-24 2020-06-29 Medimmune Limited Ukierunkowane środki wiążące przeciwko B7-H1
AR078377A1 (es) 2009-12-11 2011-11-02 Genentech Inc Anticuerpos anti-vegf-c (factor de crecimiento endotelial anti-vascular aislado c) y sus metodos de uso
BR112012015575A2 (pt) 2009-12-23 2020-09-08 Genentech, Inc. "anticorpo anti-bv8, anticorpo, ácido nucleico, vetor, composição, método para produzir um anticorpo anti-bv8 e usos de um anticorpo
US8362210B2 (en) 2010-01-19 2013-01-29 Xencor, Inc. Antibody variants with enhanced complement activity
DK2530091T3 (en) 2010-01-29 2018-05-28 Chugai Pharmaceutical Co Ltd ANTI-DLL3 ANTIBODY
WO2011097527A2 (en) 2010-02-04 2011-08-11 Xencor, Inc. Immunoprotection of therapeutic moieties using enhanced fc regions
CN105001334A (zh) 2010-02-10 2015-10-28 伊缪诺金公司 Cd20抗体及其用途
PT2535358T (pt) 2010-02-10 2018-02-23 Perseus Proteomics Inc Anticorpo anti-caderina marcado com metal radioativo
PL2536748T3 (pl) 2010-02-18 2015-01-30 Genentech Inc Antagoniści neureguliny i ich zastosowanie w leczeniu nowotworu
JPWO2011105573A1 (ja) 2010-02-26 2013-06-20 株式会社 未来創薬研究所 抗ｉｃａｍ３抗体およびその用途
CN102782131B (zh) 2010-03-02 2015-08-05 协和发酵麒麟株式会社 修饰抗体组合物
PT2542256T (pt) 2010-03-04 2019-09-05 Macrogenics Inc Anticorpos reativos com b7-h3, fragmentos imunologicamente ativos dos mesmos e sua utilização
RU2587625C2 (ru) 2010-03-24 2016-06-20 Дженентек, Инк. Анти-lrp6 антитела
JP5767207B2 (ja) 2010-03-26 2015-08-19 協和発酵キリン株式会社 新規修飾部位導入抗体および抗体フラグメント
RU2012145183A (ru) 2010-03-29 2014-05-10 Займворкс, Инк. Антитела с повышенной или пониженной эффекторной функцией
TWI667346B (zh) 2010-03-30 2019-08-01 中外製藥股份有限公司 促進抗原消失之具有經修飾的FcRn親和力之抗體
WO2011147834A1 (en) 2010-05-26 2011-12-01 Roche Glycart Ag Antibodies against cd19 and uses thereof
JP2013534515A (ja) 2010-06-01 2013-09-05 モナシュ ユニバーシティ プロセシングされていない受容体型チロシンキナーゼｃ−ＭＥＴに対する抗体
WO2011155607A1 (ja) 2010-06-11 2011-12-15 協和発酵キリン株式会社 抗ｔｉｍ－３抗体
TW201204388A (en) 2010-06-18 2012-02-01 Genentech Inc Anti-Axl antibodies and methods of use
CN103347894B (zh) 2010-06-19 2017-05-10 纪念斯隆-凯特林癌症中心 抗gd2抗体
WO2011161119A1 (en) 2010-06-22 2011-12-29 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies against insulin-like growth factor i receptor and uses thereof
WO2011161189A1 (en) 2010-06-24 2011-12-29 F. Hoffmann-La Roche Ag Anti-hepsin antibodies and methods of use
US9485812B2 (en) 2010-07-08 2016-11-01 Honda Motor Co., Ltd. High frequency heating coil
CA2803792A1 (en) 2010-07-09 2012-01-12 Genentech, Inc. Anti-neuropilin antibodies and methods of use
WO2012010582A1 (en) 2010-07-21 2012-01-26 Roche Glycart Ag Anti-cxcr5 antibodies and methods of use
JP5953303B2 (ja) 2010-07-29 2016-07-20 ゼンコア インコーポレイテッド 改変された等電点を有する抗体
EP2600895A1 (en) 2010-08-03 2013-06-12 Hoffmann-La Roche AG Chronic lymphocytic leukemia (cll) biomarkers
WO2012019061A2 (en) 2010-08-05 2012-02-09 Stem Centrx, Inc. Novel effectors and methods of use
CN103209709A (zh) 2010-08-05 2013-07-17 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 抗mhc抗体抗病毒性细胞因子融合蛋白
MX2013001336A (es) 2010-08-13 2013-03-08 Roche Glycart Ag Anticuerpos ani-tenascina c a2 y metodos de utilizacion.
EP3333194B1 (en) 2010-08-13 2021-03-17 Roche Glycart AG Anti-fap antibodies and methods of use
CA2805054A1 (en) 2010-08-25 2012-03-01 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies against il-18r1 and uses thereof
EP2608807A1 (en) 2010-08-27 2013-07-03 Stem Centrx, Inc. Notum protein modulators and methods of use
ES2641916T3 (es) 2010-08-31 2017-11-14 Genentech, Inc. Biomarcadores y métodos de tratamiento
AU2011295715B9 (en) 2010-09-03 2017-02-23 Abbvie Stemcentrx Llc Novel modulators and methods of use
EP2623119B1 (en) 2010-09-30 2017-06-14 Riken Drug used in glioma treatment method, glioma examination method, method of delivering a desired material to a glioma
US9228023B2 (en) 2010-10-01 2016-01-05 Oxford Biotherapeutics Ltd. Anti-ROR1 antibodies and methods of use for treatment of cancer
EP2625197B1 (en) 2010-10-05 2016-06-29 Genentech, Inc. Mutant smoothened and methods of using the same
WO2012057288A1 (ja) 2010-10-29 2012-05-03 第一三共株式会社 新規抗ｄｒ５抗体
KR20130133205A (ko) 2010-11-10 2013-12-06 제넨테크, 인크. 신경계 질환 면역요법을 위한 방법 및 조성물
CN103298937B (zh) 2010-11-17 2016-05-25 中外制药株式会社 具有代替凝血因子viii的功能的功能的多特异性抗原结合分子
JP6030452B2 (ja) 2010-11-30 2016-11-24 中外製薬株式会社 複数分子の抗原に繰り返し結合する抗原結合分子
NZ611428A (en) 2010-12-08 2015-07-31 Stemcentrx Inc Novel modulators and methods of use
EP2653540B9 (en) 2010-12-15 2018-05-16 Inter-University Research Institute Corporation Research Organization of Information and Systems Protein production method
CN103339255A (zh) 2010-12-15 2013-10-02 协和发酵麒麟株式会社 蛋白质的生产方法
AR084342A1 (es) 2010-12-16 2013-05-08 Genentech Inc Diagnostico y tratamientos relacionados con la inhibicion de th2
US8911732B2 (en) 2010-12-20 2014-12-16 Genentech, Inc. Anti-mesothelin antibodies and immunoconjugates
TW201307391A (zh) 2010-12-22 2013-02-16 Genentech Inc 抗－ｐｃｓｋ９抗體及其使用方法
EP2659910B1 (en) 2010-12-27 2016-11-09 National University Corporation Nagoya University Screening method for a compound capable of suppressing receptor tyrosine kinase-mediated pro-survival signaling in a cancer cell
JOP20210044A1 (ar) 2010-12-30 2017-06-16 Takeda Pharmaceuticals Co الأجسام المضادة لـ cd38
FR2971250A1 (fr) 2011-02-07 2012-08-10 Univ Nantes Anticorps anti-gb3 utiles dans le traitement des maladies associees a l'angiogenese
SA112330278B1 (ar) 2011-02-18 2015-10-09 ستيم سينتركس، انك. مواد ضابطة جديدة وطرق للاستخدام
KR101638224B1 (ko) 2011-02-28 2016-07-08 에프. 호프만-라 로슈 아게 항원 결합 단백질
RU2013141078A (ru) 2011-02-28 2015-04-10 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Одновалентные антигенсвязывающие белки
AU2012226398B9 (en) * 2011-03-06 2017-04-13 Merck Serono S.A. Low fucose cell lines and uses thereof
HUE041335T2 (hu) 2011-03-29 2019-05-28 Roche Glycart Ag Antitest FC-variánsok
RU2013143358A (ru) 2011-04-07 2015-05-20 Дженентек, Инк. Анти-fgfr4 антитела и способы их применения
US20140193420A1 (en) 2011-04-18 2014-07-10 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Diagnosis and treatment of cancer using anti-itm2a antibody
KR101517320B1 (ko) 2011-04-19 2015-05-28 메리맥 파마슈티컬즈, 인크. 단일특이적 및 이중특이적 항-igf-1r 및 항 erbb3 항체
LT2703486T (lt) 2011-04-25 2018-05-25 Daiichi Sankyo Company, Limited Anti-b7-h3 antikūnas
WO2012146630A1 (en) 2011-04-29 2012-11-01 F. Hoffmann-La Roche Ag N-terminal acylated polypeptides, methods for their production and uses thereof
RU2638806C2 (ru) 2011-05-12 2017-12-15 Дженентек, Инк. Lc-ms/ms способ мониторинга множественных реакций для выявления терапевтических антител в образцах животных с помощью каркасных сигнатурных пептидов
LT2710035T (lt) 2011-05-16 2017-06-26 F. Hoffmann-La Roche Ag Fgfr1 agonistai ir jų naudojimo būdai
SG195073A1 (en) 2011-05-21 2013-12-30 Macrogenics Inc Deimmunized serum-binding domains and their use for extending serum half-life
CA2840461A1 (en) 2011-06-20 2012-12-27 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Anti-erbb3 antibody
BR112013029746B1 (pt) 2011-06-22 2021-02-02 F. Hoffmann-La Roche Ag método para a produção recombinante de um complexo, complexo, formulação farmacêutica e uso do complexo
LT2726094T (lt) 2011-06-28 2017-02-10 Oxford Biotherapeutics Ltd Gydymo ir diagnozavimo objektas
BR112013030472A2 (pt) 2011-06-30 2019-09-24 Genentech Inc formulação farmacêutica, artigo de fabricação e método
UA117901C2 (uk) 2011-07-06 2018-10-25 Ґенмаб Б.В. Спосіб посилення ефекторної функції вихідного поліпептиду, його варіанти та їх застосування
WO2013022855A1 (en) 2011-08-05 2013-02-14 Xencor, Inc. Antibodies with modified isoelectric points and immunofiltering
US20140363438A1 (en) 2011-08-17 2014-12-11 Genentech, Inc. Neuregulin antibodies and uses thereof
CA2844141A1 (en) 2011-08-23 2013-02-28 Roche Glycart Ag Anti-mcsp antibodies
WO2013033008A2 (en) 2011-08-26 2013-03-07 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Tandem fc bispecific antibodies
KR20140068062A (ko) 2011-09-15 2014-06-05 제넨테크, 인크. 분화의 촉진 방법
SG11201400724SA (en) 2011-09-19 2014-04-28 Genentech Inc Combination treatments comprising c-met antagonists and b-raf antagonists
JP6322411B2 (ja) 2011-09-30 2018-05-09 中外製薬株式会社 複数の生理活性を有する抗原の消失を促進する抗原結合分子
TW201326209A (zh) 2011-09-30 2013-07-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd 具有促進抗原清除之ＦｃＲｎ結合域的治療性抗原結合分子
WO2013047729A1 (ja) 2011-09-30 2013-04-04 中外製薬株式会社 標的抗原に対する免疫応答を誘導する抗原結合分子
WO2013052155A1 (en) 2011-10-05 2013-04-11 Genentech, Inc. Methods of treating liver conditions using notch2 antagonists
EP2766392B1 (en) 2011-10-10 2019-07-17 Xencor, Inc. A method for purifying antibodies
US10851178B2 (en) 2011-10-10 2020-12-01 Xencor, Inc. Heterodimeric human IgG1 polypeptides with isoelectric point modifications
AU2012322618A1 (en) 2011-10-14 2014-05-29 Genentech, Inc. Anti-HtrA1 antibodies and methods of use
KR20140084164A (ko) 2011-10-15 2014-07-04 제넨테크, 인크. 암의 치료를 위한 scd1 길항제
WO2013059531A1 (en) 2011-10-20 2013-04-25 Genentech, Inc. Anti-gcgr antibodies and uses thereof
EA201490879A1 (ru) 2011-10-28 2014-08-29 Дженентек, Инк. Терапевтические комбинации и способы лечения меланомы
EP2772268B8 (en) 2011-10-28 2020-01-08 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Cancer stem cell-specific molecule
RS62689B1 (sr) 2011-11-04 2021-12-31 Zymeworks Inc Dizajn stabilnog heterodimernog antitela sa mutacijama u fc domenu
JP2014533700A (ja) 2011-11-21 2014-12-15 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ｃ−ＭＥＴ抗体の精製
EP2788024A1 (en) 2011-12-06 2014-10-15 F.Hoffmann-La Roche Ag Antibody formulation
WO2013087789A1 (en) 2011-12-13 2013-06-20 Glykos Finland Ltd. Antibody isoform arrays and methods thereof
CA2854249C (en) 2011-12-22 2022-05-03 F. Hoffmann-La Roche Ag Expression vector element combinations, novel production cell generation methods and their use for the recombinant production of polypeptides
SG10201601882PA (en) 2011-12-22 2016-04-28 Hoffmann La Roche Expression Vector Organization, Novel Production Cell Generation Methods And Their Use For The Recombinant Production Of Polypeptides
KR20140107295A (ko) 2011-12-22 2014-09-04 에프. 호프만-라 로슈 아게 진핵 세포용 전장 항체 표시 시스템 및 그것의 용도
US11147852B2 (en) 2011-12-23 2021-10-19 Pfizer Inc. Engineered antibody constant regions for site-specific conjugation and methods and uses therefor
AR089434A1 (es) 2011-12-23 2014-08-20 Genentech Inc Procedimiento para preparar formulaciones con alta concentracion de proteinas
TWI593705B (zh) 2011-12-28 2017-08-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Humanized anti-epiregulin antibody and cancer therapeutic agent containing the antibody as an active ingredient
AU2013209707A1 (en) 2012-01-18 2014-07-24 Genentech, Inc. Anti-LRP5 antibodies and methods of use
CA2862424A1 (en) 2012-01-18 2013-07-25 Genentech, Inc. Methods of using fgf19 modulators
SG11201404486QA (en) 2012-01-31 2014-11-27 Genentech Inc Anti-ig-e m1' antibodies and methods using same
SG11201404751UA (en) 2012-02-09 2014-09-26 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Modified fc region of antibody
KR102148303B1 (ko) 2012-02-11 2020-08-26 제넨테크, 인크. R-스폰딘 전위 및 그의 사용 방법
ES2676031T3 (es) 2012-02-15 2018-07-16 F. Hoffmann-La Roche Ag Cromatografía de afinidad basada en el receptor Fc
AU2013234046B2 (en) 2012-03-16 2017-09-07 University Health Network Methods and compositions for modulating Toso activity
EP2831115A1 (en) 2012-03-27 2015-02-04 F. Hoffmann-La Roche AG Diagnosis and treatments relating to her3 inhibitors
EP2832856A4 (en) 2012-03-29 2016-01-27 Chugai Pharmaceutical Co Ltd ANTI-LAMP5 ANTIBODIES AND USE THEREOF
AR090549A1 (es) 2012-03-30 2014-11-19 Genentech Inc Anticuerpos anti-lgr5 e inmunoconjugados
KR20150003170A (ko) 2012-03-30 2015-01-08 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 ＣＤＲ 개변 항 Ｓｉｇｌｅｃ-15 항체
KR20140138215A (ko) 2012-03-30 2014-12-03 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 신규 항 Ｓｉｇｌｅｃ-15 항체
CA2870126C (en) 2012-04-09 2020-10-27 Daiichi Sankyo Company, Limited Anti-fgfr2 antibody
US10385395B2 (en) 2012-04-11 2019-08-20 The Regents Of The University Of California Diagnostic tools for response to 6-thiopurine therapy
TWI606065B (zh) 2012-04-27 2017-11-21 第一三共股份有限公司 抗ｒｏｂｏ４抗體
AR090903A1 (es) 2012-05-01 2014-12-17 Genentech Inc Anticuerpos e inmunoconjugados anti-pmel17
CA2872540A1 (en) 2012-05-10 2013-11-14 Zymeworks Inc. Heteromultimer constructs of immunoglobulin heavy chains with mutations in the fc domain
EP2848633B1 (en) 2012-05-11 2019-02-06 Microbial Chemistry Research Foundation Anti-cxadr antibody
WO2013170191A1 (en) 2012-05-11 2013-11-14 Genentech, Inc. Methods of using antagonists of nad biosynthesis from nicotinamide
CA2870876C (en) 2012-05-23 2019-10-01 Genentech, Inc. Selection method for therapeutic agents
KR20150016579A (ko) 2012-05-30 2015-02-12 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 표적 조직 특이적 항원 결합 분자
KR101566538B1 (ko) 2012-06-08 2015-11-05 국립암센터 신규한 Ｔｈ17 세포 전환용 에피토프 및 이의 용도
EP2861624A1 (en) 2012-06-15 2015-04-22 F. Hoffmann-La Roche AG Anti-pcsk9 antibodies, formulations, dosing, and methods of use
WO2014004549A2 (en) 2012-06-27 2014-01-03 Amgen Inc. Anti-mesothelin binding proteins
JP6298762B2 (ja) 2012-07-02 2018-03-20 協和発酵キリン株式会社 抗ｂｍｐ９抗体を有効成分とする、腎性貧血、がん性貧血などの貧血に対する治療剤
RU2017128512A (ru) 2012-07-04 2019-02-15 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Антитела к теофиллину и способы их применения
BR112014030844A2 (pt) 2012-07-04 2019-10-15 Hoffmann La Roche anticorpo anti-biotina humanizado, formulação farmacêutica e uso do anticorpo
KR102090849B1 (ko) 2012-07-04 2020-03-19 에프. 호프만-라 로슈 아게 공유 결합된 항원-항체 접합체
CA3188124A1 (en) 2012-07-05 2014-01-09 Genentech, Inc. Expression and secretion system
EP2870973B1 (en) 2012-07-06 2022-08-31 St. Marianna University School of Medicine Remedy for htlv-1-associated myelopathy patients
SG11201500096YA (en) 2012-07-09 2015-02-27 Genentech Inc Immunoconjugates comprising anti - cd79b antibodies
PE20150615A1 (es) 2012-07-09 2015-05-28 Genentech Inc Inmunoconjugados que comprenden un anticuerpo anti-cd22 ligado a una pirrolobenzodiazepina
CA2874904A1 (en) 2012-07-09 2014-01-16 Genentech, Inc. Immunoconjugates comprising anti-cd22 antibodies
SG11201500093TA (en) 2012-07-09 2015-02-27 Genentech Inc Immunoconjugates comprising anti-cd79b antibodies
CN104428315B (zh) 2012-07-13 2017-09-29 罗氏格黎卡特股份公司 双特异性抗‑vegf/抗‑ang‑2抗体及其在治疗眼血管疾病中的应用
BR112015001459B1 (pt) 2012-07-25 2023-02-14 Celldex Therapeutics, Inc Anticorpo isolado ou fragmento do mesmo, conjugado, usos dos mesmos, composição farmacêutica, polinucleotídeo, vetor, célula hospedeira, célula isolada, kit, método in vitro para inibir atividade da kit, método para produzir um anticorpo
GB201213652D0 (en) 2012-08-01 2012-09-12 Oxford Biotherapeutics Ltd Therapeutic and diagnostic target
SG11201502455TA (en) 2012-09-27 2015-05-28 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Fgfr3 fusion gene and pharmaceutical drug targeting same
US9714291B2 (en) 2012-10-05 2017-07-25 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd Heterodimer protein composition
AU2013328111B2 (en) 2012-10-11 2017-11-02 Daiichi Sankyo Company, Limited Antibody-drug conjugate
US9872924B2 (en) 2012-10-19 2018-01-23 Daiichi Sankyo Company, Limited Antibody-drug conjugate produced by binding through linker having hydrophilic structure
EP2914621B1 (en) 2012-11-05 2023-06-07 Foundation Medicine, Inc. Novel ntrk1 fusion molecules and uses thereof
CA2884431A1 (en) 2012-11-08 2014-05-15 F. Hoffmann-La Roche Ag Her3 antigen binding proteins binding to the beta-hairpin of her3
WO2014078268A2 (en) 2012-11-13 2014-05-22 Genentech, Inc. Anti-hemagglutinin antibodies and methods of use
KR20150090107A (ko) 2012-12-06 2015-08-05 도쿠리츠다이가쿠호징 가나자와다이가쿠 중피종의 치료 방법
CN104884617B (zh) 2012-12-07 2019-02-19 协和发酵麒麟株式会社 抗folr1抗体
TWI693073B (zh) 2012-12-21 2020-05-11 日商中外製藥股份有限公司 對ｇｐｃ３標的治療劑療法為有效之患者投與的ｇｐｃ３標的治療劑
EP3557260B1 (en) 2012-12-21 2022-05-18 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Gpc3-targeting drug which is administered to patient responsive to gpc3-targeting drug therapy
EP2935328B1 (en) 2012-12-21 2018-10-10 F.Hoffmann-La Roche Ag Disulfide-linked multivalent mhc class i comprising multi-function proteins
KR20160007478A (ko) 2013-01-10 2016-01-20 젠맵 비. 브이 인간 IgG1 Fc 영역 변이체 및 그의 용도
US10131710B2 (en) 2013-01-14 2018-11-20 Xencor, Inc. Optimized antibody variable regions
US10487155B2 (en) 2013-01-14 2019-11-26 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US11053316B2 (en) 2013-01-14 2021-07-06 Xencor, Inc. Optimized antibody variable regions
US9605084B2 (en) 2013-03-15 2017-03-28 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US10968276B2 (en) 2013-03-12 2021-04-06 Xencor, Inc. Optimized anti-CD3 variable regions
US9701759B2 (en) 2013-01-14 2017-07-11 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
KR102391731B1 (ko) 2013-01-14 2022-04-27 젠코어 인코포레이티드 신규한 이형이량체 단백질
WO2014113510A1 (en) 2013-01-15 2014-07-24 Xencor, Inc. Rapid clearance of antigen complexes using novel antibodies
AU2014207342C1 (en) 2013-01-18 2019-04-04 Foundation Medicine, Inc. Methods of treating cholangiocarcinoma
WO2014116749A1 (en) 2013-01-23 2014-07-31 Genentech, Inc. Anti-hcv antibodies and methods of using thereof
US9963513B2 (en) 2013-02-05 2018-05-08 Engmab Sàrl Method for the selection of antibodies against BCMA
EP2762496A1 (en) 2013-02-05 2014-08-06 EngMab AG Method for the selection of antibodies against BCMA
JP6357113B2 (ja) 2013-02-08 2018-07-11 株式会社医学生物学研究所 ヒトｎｒｇ１タンパク質に対する抗体
GB201302447D0 (en) 2013-02-12 2013-03-27 Oxford Biotherapeutics Ltd Therapeutic and diagnostic target
KR20150118159A (ko) 2013-02-22 2015-10-21 에프. 호프만-라 로슈 아게 암의 치료 방법 및 약물 내성의 예방 방법
MX2015010789A (es) 2013-02-26 2015-11-26 Roche Glycart Ag Anticuerpos anti-pcsm.
US9925240B2 (en) 2013-03-06 2018-03-27 Genentech, Inc. Methods of treating and preventing cancer drug resistance
CA2902505A1 (en) 2013-03-06 2014-09-12 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Anti-c-met tandem fc bispecific antibodies
EA201591750A1 (ru) 2013-03-14 2016-05-31 Дженентек, Инк. Антитела против b7-h4 и иммуноконъюгаты
WO2014152358A2 (en) 2013-03-14 2014-09-25 Genentech, Inc. Combinations of a mek inhibitor compound with an her3/egfr inhibitor compound and methods of use
US9562099B2 (en) 2013-03-14 2017-02-07 Genentech, Inc. Anti-B7-H4 antibodies and immunoconjugates
MX2015011606A (es) 2013-03-14 2016-05-17 Genentech Inc Metodo para tratar cancer y prevenir resistencia a farmacos contra cancer.
US10519242B2 (en) 2013-03-15 2019-12-31 Xencor, Inc. Targeting regulatory T cells with heterodimeric proteins
US9598485B2 (en) 2013-03-15 2017-03-21 Ac Immune S.A. Anti-tau antibodies and methods of use
SI2970422T1 (en) 2013-03-15 2018-07-31 F. Hoffmann-La Roche Ag IL-22 polypeptides and IL-22-Fc fusion proteins and procedures for use
KR102211176B1 (ko) 2013-03-15 2021-02-01 젠코어 인코포레이티드 이형이량체 단백질
WO2014151006A2 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Genentech, Inc. Biomarkers and methods of treating pd-1 and pd-l1 related conditions
US10106624B2 (en) 2013-03-15 2018-10-23 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
CA2902765A1 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Genentech, Inc. Compositions and methods for diagnosis and treatment of hepatic cancers
US20140328849A1 (en) 2013-03-15 2014-11-06 Genentech, Inc. Anti-crth2 antibodies and methods of use
CA2906927C (en) 2013-03-15 2021-07-13 Xencor, Inc. Modulation of t cells with bispecific antibodies and fc fusions
KR102207859B1 (ko) 2013-03-15 2021-01-27 메모리얼 슬로안 케터링 캔서 센터 고 친화도 항-gd2 항체
US10858417B2 (en) 2013-03-15 2020-12-08 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
RU2015143437A (ru) 2013-03-15 2017-04-27 Дженентек, Инк. Способы лечения рака и предотвращения устойчивости к лекарственным препаратам для лечения рака
US9260527B2 (en) 2013-03-15 2016-02-16 Sdix, Llc Anti-human CXCR4 antibodies and methods of making same
UA118028C2 (uk) 2013-04-03 2018-11-12 Рош Глікарт Аг Біспецифічне антитіло, специфічне щодо fap і dr5, антитіло, специфічне щодо dr5, і спосіб їх застосування
WO2014174596A1 (ja) 2013-04-23 2014-10-30 株式会社医学生物学研究所 ヘパリン結合上皮増殖因子様増殖因子に対する機能性モノクローナル抗体
PL2992010T3 (pl) 2013-04-29 2021-08-23 F.Hoffmann-La Roche Ag Modyfikowane asymetryczne przeciwciała wiążące receptor Fc i sposoby ich stosowania
WO2014177461A1 (en) 2013-04-29 2014-11-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Fcrn-binding abolished anti-igf-1r antibodies and their use in the treatment of vascular eye diseases
UA118029C2 (uk) 2013-04-29 2018-11-12 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Модифіковане антитіло, що зв'язується з людським fcrn, й способи його застосування
WO2014189973A2 (en) 2013-05-20 2014-11-27 Genentech, Inc. Anti-transferrin receptor antibodies and methods of use
LT3004162T (lt) 2013-05-31 2020-06-10 Genentech, Inc. Antikūnai prieš ląstelės sienelės teicho rūgštį ir konjugatai
US9884126B2 (en) 2013-05-31 2018-02-06 Genentech, Inc. Anti-wall teichoic antibodies and conjugates
JPWO2014208482A1 (ja) 2013-06-24 2017-02-23 中外製薬株式会社 ヒト化抗Ｅｐｉｒｅｇｕｌｉｎ抗体を有効成分として含む腺癌以外の非小細胞肺癌の治療剤
PL3708583T3 (pl) 2013-08-01 2022-06-06 Five Prime Therapeutics, Inc. Afukozylowane przeciwciała anty-fgfr2iiib
AR097685A1 (es) 2013-09-17 2016-04-06 Genentech Inc Métodos de uso de anticuerpos anti-lgr5
SG11201602490UA (en) 2013-09-30 2016-04-28 Daiichi Sankyo Co Ltd Anti-lps o11 antibody
TWI664977B (zh) 2013-10-08 2019-07-11 第一三共股份有限公司 抗ｆｇｆｒ２抗體及其與其他藥劑之組合
EP3055329B1 (en) 2013-10-11 2018-06-13 F. Hoffmann-La Roche AG Multispecific domain exchanged common variable light chain antibodies
CA3178299A1 (en) 2013-10-11 2015-04-16 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Tem8 antibodies and their use
MX365742B (es) 2013-10-11 2019-06-12 Oxford Biotherapeutics Ltd Anticuerpos conjugados contra ly75 para el tratamiento del cancer.
WO2015054670A1 (en) 2013-10-11 2015-04-16 Genentech, Inc. Nsp4 inhibitors and methods of use
CN105744954B (zh) 2013-10-18 2021-03-05 豪夫迈·罗氏有限公司 抗rspo2和/或抗rspo3抗体及其用途
JP6715767B2 (ja) 2013-10-23 2020-07-01 ジェネンテック， インコーポレイテッド 好酸球性疾患の診断及び治療方法
EP3070167A4 (en) 2013-11-06 2017-06-07 Osaka University Antibody having broad neutralizing activity in group 1 influenza a virus
CA2924268C (en) 2013-11-21 2021-05-18 F. Hoffmann-La Roche Ag Anti-alpha-synuclein antibodies and methods of use
KR102284503B1 (ko) 2013-12-04 2021-07-30 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 화합물의 농도에 따라 항원 결합능이 변화되는 항원 결합 분자 및 그의 라이브러리
CN105814084B (zh) 2013-12-13 2019-09-24 基因泰克公司 抗cd33抗体和免疫缀合物
US8986691B1 (en) 2014-07-15 2015-03-24 Kymab Limited Method of treating atopic dermatitis or asthma using antibody to IL4RA
DK3736292T3 (da) 2013-12-17 2024-07-22 Genentech Inc Anti-CD3-antistoffer og fremgangsmåder til anvendelse
SG11201604995YA (en) 2013-12-17 2016-07-28 Genentech Inc Methods of treating her2-positive cancers using pd-1 axis binding antagonists and anti-her2 antibodies
US8980273B1 (en) 2014-07-15 2015-03-17 Kymab Limited Method of treating atopic dermatitis or asthma using antibody to IL4RA
WO2015095423A2 (en) 2013-12-17 2015-06-25 Genentech, Inc. Combination therapy comprising ox40 binding agonists and pd-1 axis binding antagonists
RU2016128726A (ru) 2013-12-17 2018-01-23 Дженентек, Инк. Способы лечения злокачественных опухолей с использованием антагонистов связывания по оси pd-1 и антитела против cd20
TWI670283B (zh) 2013-12-23 2019-09-01 美商建南德克公司 抗體及使用方法
MY195162A (en) 2013-12-25 2023-01-11 Daiichi Sankyo Co Ltd Anti-Trop2 Antibody-Drug Conjugate
CA3190793A1 (en) 2013-12-26 2015-07-02 Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation Human anti-il-33 neutralizing monoclonal antibody
ES2756175T3 (es) 2013-12-27 2020-04-27 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Genes mutantes guardián de fgfr y fármacos que se dirigen a los mismos
WO2015103549A1 (en) 2014-01-03 2015-07-09 The United States Of America, As Represented By The Secretary Department Of Health And Human Services Neutralizing antibodies to hiv-1 env and their use
EP3089759B1 (en) 2014-01-03 2018-12-05 F. Hoffmann-La Roche AG Covalently linked polypeptide toxin-antibody conjugates
EP3960768A1 (en) 2014-01-03 2022-03-02 F. Hoffmann-La Roche AG Bispecific anti-hapten/anti-blood brain barrier receptor antibodies, complexes thereof and their use as blood brain barrier shuttles
EP3089758B1 (en) 2014-01-03 2021-01-27 F.Hoffmann-La Roche Ag Covalently linked helicar-anti-helicar antibody conjugates and uses thereof
MX2016008190A (es) 2014-01-06 2016-10-21 Hoffmann La Roche Modulos de lanzadera de barrera cerebral sanguinea monovalente.
RU2727639C2 (ru) 2014-01-15 2020-07-22 Ф.Хоффманн-Ля Рош Аг Варианты fc-области с модифицированной способностью связываться с fcrn и с сохраненной способностью связываться с белком а
EP3096797A1 (en) 2014-01-24 2016-11-30 F. Hoffmann-La Roche AG Methods of using anti-steap1 antibodies and immunoconjugates
LT3466976T (lt) 2014-01-31 2021-11-10 Daiichi Sankyo Company, Limited Anti-her2 antikūno-vaisto konjugatas
JP6736467B2 (ja) 2014-02-04 2020-08-05 ジェネンテック， インコーポレイテッド 平滑化変異体及びその使用方法
AU2015214058B2 (en) 2014-02-08 2020-07-09 Genentech, Inc. Methods of treating Alzheimer's Disease
MX2016010237A (es) 2014-02-08 2017-04-27 Genentech Inc Metodos de tratamiento de enfermedad de alzheimer.
CA2936565C (en) 2014-02-12 2020-08-11 Genentech, Inc. Anti-jagged1 antibodies and methods of use
JP2017507939A (ja) 2014-02-21 2017-03-23 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ｉｌ−１３／ｉｌ−１７二重特異性抗体及びその使用
CA2941697A1 (en) 2014-03-07 2015-09-11 University Health Network Methods and compositions for modifying the immune response
SG11201607519VA (en) 2014-03-14 2016-10-28 Genentech Inc Methods and compositions for secretion of heterologous polypeptides
WO2015140591A1 (en) 2014-03-21 2015-09-24 Nordlandssykehuset Hf Anti-cd14 antibodies and uses thereof
EP3122900A1 (en) 2014-03-24 2017-02-01 F. Hoffmann-La Roche AG Cancer treatment with c-met antagonists and correlation of the latter with hgf expression
ES2775431T3 (es) 2014-03-28 2020-07-27 Xencor Inc Anticuerpos biespecíficos que se unen a CD38 y CD3
RS59738B1 (sr) 2014-03-31 2020-02-28 Hoffmann La Roche Anti-ox40 antitela i postupci primene
BR112016022345A2 (pt) 2014-03-31 2017-10-10 Genentech Inc terapia de combinação compreendendo agentes antiangiogênese e agonistas de ligação de ox40
AU2015245122B2 (en) 2014-04-10 2019-10-24 Daiichi Sankyo Company, Limited Anti-HER3 antibody-drug conjugate
WO2015164615A1 (en) 2014-04-24 2015-10-29 University Of Oslo Anti-gluten antibodies and uses thereof
JP6827319B2 (ja) 2014-05-08 2021-02-10 中外製薬株式会社 Ｇｐｃ３標的治療剤療法が有効である患者に投与されるｇｐｃ３標的治療剤
MX2016015162A (es) 2014-05-22 2017-03-03 Genentech Inc Anticuerpos anti - gpc3 e inmunoconjugados.
KR20170005016A (ko) 2014-05-23 2017-01-11 제넨테크, 인크. MiT 바이오마커 및 그의 사용 방법
NZ726911A (en) 2014-06-03 2023-01-27 Xbiotech Inc Compositions and methods for treating and preventing staphylococcus aureus infections
EP3155015A1 (en) 2014-06-11 2017-04-19 F. Hoffmann-La Roche AG Anti-lgr5 antibodies and uses thereof
US20230190750A1 (en) 2014-06-13 2023-06-22 Genentech, Inc. Methods of treating and preventing cancer drug resistance
KR20170026362A (ko) 2014-06-26 2017-03-08 에프. 호프만-라 로슈 아게 항-ｂｒｄｕ 항체 및 사용 방법
MX2017000363A (es) 2014-07-11 2017-04-27 Genentech Inc Inhibicion de la via de notch.
JP7032929B2 (ja) 2014-07-11 2022-03-09 ヴェンタナ メディカル システムズ， インク． 抗ｐｄ－ｌ１抗体及びその診断上の使用
WO2016014984A1 (en) 2014-07-24 2016-01-28 Xencor, Inc. Rapid clearance of antigen complexes using novel antibodies
DK3186284T3 (da) 2014-08-28 2022-05-09 Bioatla Inc Betinget aktive kimæriske antigenreceptorer til modificerede t-celler
TWI805109B (zh) 2014-08-28 2023-06-11 美商奇諾治療有限公司 對cd19具專一性之抗體及嵌合抗原受體
WO2016040724A1 (en) 2014-09-12 2016-03-17 Genentech, Inc. Anti-b7-h4 antibodies and immunoconjugates
EA201790545A1 (ru) 2014-09-12 2017-07-31 Дженентек, Инк. Антитела и иммуноконъюгаты против her2
CR20170095A (es) 2014-09-12 2017-07-19 Genentech Inc Anticuerpos anti-cll-1 e inmunoconjugados referencias recíprocas con solicitudes relacionadas
KR20170055521A (ko) 2014-09-17 2017-05-19 제넨테크, 인크. 항-her2 항체를 포함하는 면역콘주게이트
HUE049175T2 (hu) 2014-09-23 2020-09-28 Hoffmann La Roche Eljárás anti-CD79b immunkonjugátumok alkalmazására
MA40764A (fr) 2014-09-26 2017-08-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Agent thérapeutique induisant une cytotoxicité
EP3207057A2 (en) 2014-10-16 2017-08-23 F. Hoffmann-La Roche AG Anti-alpha-synuclein antibodies and methods of use
EP3223865A4 (en) 2014-10-31 2018-10-03 Jounce Therapeutics, Inc. Methods of treating conditions with antibodies that bind b7-h4
CA2966523A1 (en) 2014-11-03 2016-05-12 Genentech, Inc. Assays for detecting t cell immune subsets and methods of use thereof
WO2016073380A1 (en) 2014-11-03 2016-05-12 Genentech, Inc. Method and biomarkers for predicting efficacy and evaluation of an ox40 agonist treatment
CN107073126A (zh) 2014-11-06 2017-08-18 豪夫迈·罗氏有限公司 包含ox40结合激动剂和tigit抑制剂的组合疗法
CA2960797A1 (en) 2014-11-06 2016-05-12 F. Hoffmann-La Roche Ag Fc-region variants with modified fcrn-binding and methods of use
CA2960569A1 (en) 2014-11-06 2016-05-12 F. Hoffmann-Laroche Ag Fc-region variants with modified fcrn- and protein a-binding properties
EP3783023A1 (en) 2014-11-10 2021-02-24 H. Hoffnabb-La Roche Ag Anti-interleukin-33 antibodies and uses thereof
WO2016077369A1 (en) 2014-11-10 2016-05-19 Genentech, Inc. Animal model for nephropathy and agents for treating the same
US10160795B2 (en) 2014-11-14 2018-12-25 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Neutralizing antibodies to Ebola virus glycoprotein and their use
MX2017006320A (es) 2014-11-17 2017-08-10 Genentech Inc Terapia combinada que comprende agonistas de unión de ox40 y antagonistas de unión del eje de pd-1.
US10882920B2 (en) 2014-11-19 2021-01-05 Genentech, Inc. Antibodies against BACE1 and use thereof for neural disease immunotherapy
US11008403B2 (en) 2014-11-19 2021-05-18 Genentech, Inc. Anti-transferrin receptor / anti-BACE1 multispecific antibodies and methods of use
WO2016081643A1 (en) 2014-11-19 2016-05-26 Genentech, Inc. Anti-transferrin receptor antibodies and methods of use
MY192999A (en) 2014-11-20 2022-09-20 Hoffmann La Roche Combination therapy of t cell activating bispecific antigen binding molecules and pd-1 axis binding antagonists
US10526417B2 (en) 2014-11-26 2020-01-07 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind CD3 and CD38
CA2967426A1 (en) 2014-11-26 2016-06-02 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind cd3 and tumor antigens
US10259887B2 (en) 2014-11-26 2019-04-16 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind CD3 and tumor antigens
JP6751393B2 (ja) 2014-12-03 2020-09-02 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ抗体リファマイシン抱合体及びその使用
MX2017007055A (es) 2014-12-03 2017-11-08 Genentech Inc Conjugados de anticuerpo rifamicina anti-staphylococcus aureus y usos de estos.
WO2016087416A1 (en) 2014-12-03 2016-06-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Multispecific antibodies
BR112017011326A2 (pt) 2014-12-05 2018-07-31 Genentech, Inc. anticorpo, ácido nucleico, vetor, célula hospedeira, método para produzir o anticorpo, imunoconjugado, composição farmacêutica, usos do anticorpo, métodos para tratar ou retardar a progressão de distúrbio proliferativo celular e para intensificar a função imune
SG11201703750XA (en) 2014-12-10 2017-06-29 Genentech Inc Blood brain barrier receptor antibodies and methods of use
MA41294A (fr) 2014-12-19 2017-11-08 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anticorps anti-myostatine, polypeptides contenant des variants de régions fc, et procédés d'utilisation
EP3233921B1 (en) 2014-12-19 2021-09-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-c5 antibodies and methods of use
EP3237449A2 (en) 2014-12-22 2017-11-01 Xencor, Inc. Trispecific antibodies
WO2016111947A2 (en) 2015-01-05 2016-07-14 Jounce Therapeutics, Inc. Antibodies that inhibit tim-3:lilrb2 interactions and uses thereof
EP3245231B1 (en) 2015-01-16 2020-08-12 Juno Therapeutics, Inc. Antibodies and chimeric antigen receptors specific for ror1
CN113956354A (zh) 2015-01-22 2022-01-21 中外制药株式会社 两种以上抗-c5抗体的组合与使用方法
CN107636170A (zh) 2015-02-04 2018-01-26 健泰科生物技术公司 突变型Smoothened及其使用方法
CN107108729A (zh) 2015-02-05 2017-08-29 中外制药株式会社 包含离子浓度依赖性的抗原结合结构域的抗体，fc区变体，il‑8‑结合抗体，及其应用
US10988534B2 (en) 2015-02-09 2021-04-27 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Multi-specific antibodies with affinity for human A33 antigen and DOTA metal complex and uses thereof
US10301377B2 (en) 2015-02-24 2019-05-28 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Middle east respiratory syndrome coronavirus immunogens, antibodies, and their use
WO2016141387A1 (en) 2015-03-05 2016-09-09 Xencor, Inc. Modulation of t cells with bispecific antibodies and fc fusions
CA2977285A1 (en) 2015-03-16 2016-09-22 F. Hoffmann-La Roche Ag Methods of detecting and quantifying il-13 and uses in diagnosing and treating th2-associated diseases
WO2016146833A1 (en) 2015-03-19 2016-09-22 F. Hoffmann-La Roche Ag Biomarkers for nad(+)-diphthamide adp ribosyltransferase resistance
CA2980005A1 (en) 2015-03-20 2016-09-29 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Neutralizing antibodies to gp120 and their use
CA2978185A1 (en) 2015-03-23 2016-09-29 Stephen Sazinsky Antibodies to icos
WO2016153572A1 (en) 2015-03-25 2016-09-29 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Bispecific multivalent fusion proteins
SG11201707490SA (en) 2015-04-03 2017-10-30 Eureka Therapeutics Inc Constructs targeting afp peptide/mhc complexes and uses thereof
ES2881694T3 (es) 2015-04-24 2021-11-30 Hoffmann La Roche Procedimientos de identificación de bacterias que comprenden polipéptidos de unión
CN113801225A (zh) 2015-04-28 2021-12-17 田边三菱制药株式会社 RGMa结合蛋白质及其使用
WO2016179003A1 (en) 2015-05-01 2016-11-10 Genentech, Inc. Masked anti-cd3 antibodies and methods of use
WO2016179194A1 (en) 2015-05-04 2016-11-10 Jounce Therapeutics, Inc. Lilra3 and method of using the same
CA2984794A1 (en) 2015-05-07 2016-11-10 Agenus Inc. Anti-ox40 antibodies and methods of use thereof
EP4238994A3 (en) 2015-05-11 2024-02-07 F. Hoffmann-La Roche AG Compositions and methods of treating lupus nephritis
KR20180008449A (ko) 2015-05-12 2018-01-24 제넨테크, 인크. 암에 대한 치료 및 진단 방법
US11267899B2 (en) * 2015-05-13 2022-03-08 Zumutor Biologics Inc. Afucosylated protein, cell expressing said protein and associated methods
CN107532217A (zh) 2015-05-29 2018-01-02 豪夫迈·罗氏有限公司 用于癌症的治疗和诊断方法
EP3302563A1 (en) 2015-05-29 2018-04-11 H. Hoffnabb-La Roche Ag Humanized anti-ebola virus glycoprotein antibodies and methods of use
CN107810012A (zh) 2015-06-02 2018-03-16 豪夫迈·罗氏有限公司 使用抗il‑34抗体治疗神经疾病的组合物和方法
WO2016196975A1 (en) 2015-06-03 2016-12-08 The United States Of America, As Represented By The Secretary Department Of Health & Human Services Neutralizing antibodies to hiv-1 env and their use
CR20180013A (es) 2015-06-05 2018-12-06 Ac Immune Sa Anticuerpos anti-tau y métodos de uso.
JP2018518483A (ja) 2015-06-08 2018-07-12 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ｏｘ４０抗体及びｐｄ−１軸結合アンタゴニストを使用して癌を治療する方法
JP2018521019A (ja) 2015-06-08 2018-08-02 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ｏｘ４０抗体を使用して癌を治療する方法
TW201709934A (zh) 2015-06-15 2017-03-16 建南德克公司 抗體及免疫結合物
AR105026A1 (es) 2015-06-16 2017-08-30 Genentech Inc ANTICUERPOS MADURADOS POR AFINIDAD Y HUMANIZADOS PARA FcRH5 Y MÉTODOS PARA SU USO
EP3916018A1 (en) 2015-06-16 2021-12-01 Genentech, Inc. Anti-cd3 antibodies and methods of use
TW201718647A (zh) 2015-06-16 2017-06-01 建南德克公司 抗-cll-1抗體及使用方法
CN116327953A (zh) 2015-06-17 2023-06-27 豪夫迈·罗氏有限公司 使用pd-1轴结合拮抗剂和紫杉烷治疗局部晚期或转移性乳腺癌的方法
CA2986592A1 (en) 2015-06-17 2016-12-22 Genentech, Inc. Anti-her2 antibodies and methods of use
EP4074730A1 (en) 2015-06-24 2022-10-19 F. Hoffmann-La Roche AG Anti-transferrin receptor antibodies with tailored affinity
WO2017001350A1 (en) 2015-06-29 2017-01-05 Ventana Medical Systems, Inc. Materials and methods for performing histochemical assays for human pro-epiregulin and amphiregulin
WO2017002776A1 (ja) 2015-06-29 2017-01-05 第一三共株式会社 抗体－薬物コンジュゲートの選択的製造方法
MX2017016645A (es) 2015-06-29 2018-11-09 Genentech Inc Anticuerpo anti-cd20 de tipo ii para su uso en el trasplante de órganos.
KR102717307B1 (ko) 2015-08-03 2024-10-15 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 Bcma에 대응하는 단일클론 항체
CN105384825B (zh) 2015-08-11 2018-06-01 南京传奇生物科技有限公司 一种基于单域抗体的双特异性嵌合抗原受体及其应用
EP3932953A1 (en) 2015-08-28 2022-01-05 F. Hoffmann-La Roche AG Anti-hypusine antibodies and uses thereof
RU2728430C2 (ru) 2015-09-18 2020-07-29 Чугаи Сейяку Кабусики Кайся Il-8-связывающие антитела и их применения
EP3353206A1 (en) 2015-09-22 2018-08-01 Spring Bioscience Corporation Anti-ox40 antibodies and diagnostic uses thereof
MY191756A (en) 2015-09-23 2022-07-14 Genentech Inc Optimized variants of anti-vegf antibodies
PL3354729T3 (pl) 2015-09-24 2024-05-20 Daiichi Sankyo Company, Limited Przeciwciało anty-garp
CA2999917A1 (en) 2015-09-24 2017-03-30 Abvitro Llc Hiv antibody compositions and methods of use
AU2016325610B2 (en) 2015-09-25 2019-10-10 Genentech, Inc. Anti-TIGIT antibodies and methods of use
MA43345A (fr) 2015-10-02 2018-08-08 Hoffmann La Roche Conjugués anticorps-médicaments de pyrrolobenzodiazépine et méthodes d'utilisation
AR106189A1 (es) 2015-10-02 2017-12-20 Hoffmann La Roche ANTICUERPOS BIESPECÍFICOS CONTRA EL A-b HUMANO Y EL RECEPTOR DE TRANSFERRINA HUMANO Y MÉTODOS DE USO
AR106230A1 (es) 2015-10-02 2017-12-27 Hoffmann La Roche Anticuerpos biespecíficos contra el cd20 humano y el receptor de transferrina humano y métodos de uso
EP3150636A1 (en) 2015-10-02 2017-04-05 F. Hoffmann-La Roche AG Tetravalent multispecific antibodies
WO2017062748A1 (en) 2015-10-07 2017-04-13 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Il-7r-alpha specific antibodies for treating acute lymphoblastic leukemia
TW201723190A (zh) 2015-10-22 2017-07-01 永斯醫療股份有限公司 用於測定icos表現之基因印記
EP3184547A1 (en) 2015-10-29 2017-06-28 F. Hoffmann-La Roche AG Anti-tpbg antibodies and methods of use
KR20180069065A (ko) 2015-10-29 2018-06-22 에프. 호프만-라 로슈 아게 항-변이체 fc-부위 항체 및 사용 방법
RU2750285C2 (ru) 2015-10-30 2021-06-25 Дженентек, Инк. АНТИТЕЛА ПРОТИВ НtrА1 И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
CN108289951A (zh) 2015-10-30 2018-07-17 豪夫迈·罗氏有限公司 抗-因子d抗体和缀合物
EP4011911A1 (en) 2015-11-03 2022-06-15 The United States of America as represented by The Secretary Department of Health and Human Services Neutralizing antibodies to hiv-1 gp41 and their use
CN108602884B (zh) 2015-11-08 2024-06-25 豪夫迈·罗氏有限公司 筛选多特异性抗体的方法
US11447553B2 (en) 2015-11-23 2022-09-20 Five Prime Therapeutics, Inc. FGFR2 inhibitors alone or in combination with immune stimulating agents in cancer treatment
JP7058219B2 (ja) 2015-12-07 2022-04-21 ゼンコア インコーポレイテッド Ｃｄ３及びｐｓｍａに結合するヘテロ二量体抗体
LT3390442T (lt) 2015-12-18 2023-12-11 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-c5 antikūnai ir jų panaudojimo būdai
AR107303A1 (es) 2016-01-08 2018-04-18 Hoffmann La Roche Métodos de tratamiento de cánceres positivos para ace utilizando antagonistas de unión a eje pd-1 y anticuerpos biespecíficos anti-ace / anti-cd3, uso, composición, kit
CN114113625A (zh) 2016-01-20 2022-03-01 基因泰克公司 用于阿尔茨海默氏病的高剂量治疗
EP3411396A1 (en) 2016-02-04 2018-12-12 Curis, Inc. Mutant smoothened and methods of using the same
EP4155415A1 (en) 2016-02-29 2023-03-29 Genentech, Inc. Therapeutic and diagnostic methods for cancer
EP4112641A1 (en) 2016-03-15 2023-01-04 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods of treating cancers using pd-1 axis binding antagonists and anti-gpc3 antibodies
US20170315132A1 (en) 2016-03-25 2017-11-02 Genentech, Inc. Multiplexed total antibody and antibody-conjugated drug quantification assay
JP6887613B2 (ja) * 2016-03-31 2021-06-16 国立大学法人東北大学 がん微小環境を標的とした抗ポドカリキシン抗体
WO2017180864A1 (en) 2016-04-14 2017-10-19 Genentech, Inc. Anti-rspo3 antibodies and methods of use
CA3019921A1 (en) 2016-04-15 2017-10-19 Genentech, Inc. Methods for monitoring and treating cancer
MX2018012493A (es) 2016-04-15 2019-06-06 Genentech Inc Métodos para controlar y tratar el cáncer.
CN109563164A (zh) 2016-04-15 2019-04-02 生物蛋白有限公司 抗axl抗体、抗体片段和它们的免疫缀合物以及其用途
MX2018013342A (es) 2016-05-02 2019-05-09 Hoffmann La Roche Polipeptido de fusion multicircular "contorsbody" - ligante de diana de cadena sencilla.
WO2017192589A1 (en) 2016-05-02 2017-11-09 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Neutralizing antibodies to influenza ha and their use and identification
JP7089483B2 (ja) 2016-05-11 2022-06-22 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 修飾された抗テネイシン抗体及び使用方法
JP7051715B2 (ja) 2016-05-13 2022-04-11 バイオアトラ、エルエルシー 抗Ｒｏｒ２抗体、抗体断片、それらの免疫コンジュゲートおよびそれらの使用
CN109475618A (zh) 2016-05-18 2019-03-15 根马布私人有限公司 抗体及其在治疗传染病中的使用方法
CN118436801A (zh) 2016-05-20 2024-08-06 豪夫迈·罗氏有限公司 Protac抗体缀合物及其使用方法
WO2017205741A1 (en) 2016-05-27 2017-11-30 Genentech, Inc. Bioanalytical method for the characterization of site-specific antibody-drug conjugates
PT3468997T (pt) 2016-06-08 2023-12-07 Debra Zack Tratamento de doenças relacionadas com igg4 com anticorpos anti-cd19 com ligação cruzada a cd32b
AU2017285218B2 (en) 2016-06-14 2024-08-22 Xencor, Inc. Bispecific checkpoint inhibitor antibodies
JP7133477B2 (ja) 2016-06-24 2022-09-08 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ポリユビキチン多重特異性抗体
WO2018005706A1 (en) 2016-06-28 2018-01-04 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind somatostatin receptor 2
US11613586B2 (en) 2016-07-15 2023-03-28 Takeda Pharmaceutical Company Limited Methods and materials for assessing response to plasmablast- and plasma cell-depleting therapies
WO2018014260A1 (en) 2016-07-20 2018-01-25 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Multispecific antigen binding proteins and methods of use thereof
MA45784A (fr) 2016-07-29 2019-06-05 Juno Therapeutics Inc Anticorps anti-idiotypes dirigés contre anti-cd19 anticorps
JP7050677B2 (ja) 2016-07-29 2022-04-08 中外製薬株式会社 増強されたｆｖｉｉｉ補因子機能代替活性を有する二重特異性抗体
NL2017270B1 (en) 2016-08-02 2018-02-09 Aduro Biotech Holdings Europe B V New anti-hCTLA-4 antibodies
KR102538749B1 (ko) 2016-08-05 2023-06-01 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 Il-8 관련 질환의 치료용 또는 예방용 조성물
JP7250674B2 (ja) 2016-08-08 2023-04-03 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト がんの治療及び診断方法
US10793632B2 (en) 2016-08-30 2020-10-06 Xencor, Inc. Bispecific immunomodulatory antibodies that bind costimulatory and checkpoint receptors
US11168148B2 (en) 2016-09-07 2021-11-09 The Regents Of The University Of California Antibodies to oxidation-specific epitopes
WO2018053032A1 (en) 2016-09-13 2018-03-22 Humanigen, Inc. Epha3 antibodies for the treatment of pulmonary fibrosis
SG10201607778XA (en) 2016-09-16 2018-04-27 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anti-Dengue Virus Antibodies, Polypeptides Containing Variant Fc Regions, And Methods Of Use
WO2018050878A1 (en) 2016-09-19 2018-03-22 F. Hoffmann-La Roche Ag Complement factor based affinity chromatography
PT3528838T (pt) 2016-09-23 2023-09-04 Hoffmann La Roche Utilizações de antagonistas de il-13 para tratamento de dermatite atópica
US11072660B2 (en) 2016-10-03 2021-07-27 Juno Therapeutics, Inc. HPV-specific binding molecules
JP7050770B2 (ja) 2016-10-05 2022-04-08 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 抗体薬物コンジュゲートの調製方法
EP3523451A1 (en) 2016-10-06 2019-08-14 Genentech, Inc. Therapeutic and diagnostic methods for cancer
US20190330368A1 (en) 2016-10-07 2019-10-31 Daiichi Sankyo Company, Limited Therapy for drug-resistant cancer by administration of anti-her2 antibody/drug conjugate
WO2018068201A1 (en) 2016-10-11 2018-04-19 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Single-domain antibodies and variants thereof against ctla-4
JP7273453B2 (ja) 2016-10-14 2023-05-15 ゼンコア インコーポレイテッド ＩＬ－１５／ＩＬ－１５ＲアルファＦｃ融合タンパク質およびＰＤ－１抗体の断片を含む二重特異性ヘテロ二量体融合タンパク質
EP3532091A2 (en) 2016-10-29 2019-09-04 H. Hoffnabb-La Roche Ag Anti-mic antibidies and methods of use
EP3535291A1 (en) 2016-11-01 2019-09-11 Genmab B.V. Polypeptide variants and uses thereof
WO2018083204A1 (en) 2016-11-02 2018-05-11 Engmab Sàrl Bispecific antibody against bcma and cd3 and an immunological drug for combined use in treating multiple myeloma
RS62589B1 (sr) 2016-11-02 2021-12-31 Jounce Therapeutics Inc Antitela na pd-1 i njihova upotreba
CA3042435A1 (en) 2016-11-15 2018-05-24 Genentech, Inc. Dosing for treatment with anti-cd20/anti-cd3 bispecific antibodies
JP7313684B2 (ja) 2016-11-21 2023-07-25 キュレアブ ゲーエムベーハー 抗ｇｐ７３抗体及びイムノコンジュゲート
WO2018101448A1 (en) 2016-11-30 2018-06-07 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Method of treating cancer using anti-ccr4 antibody and anti-pd-1 antibody
CR20230163A (es) 2016-12-07 2023-07-06 Genentech Inc ANTICUERPOS ANTITAU Y MÉTODOS DE USO (Divisional 2019-0271)
WO2018106776A2 (en) 2016-12-07 2018-06-14 Genentech, Inc. Anti-tau antibodies and methods of use
BR112019011199A2 (pt) 2016-12-12 2019-10-08 Genentech Inc método para tratar um indivíduo que tem um câncer de próstata e kits
US11273155B2 (en) 2016-12-12 2022-03-15 Daiichi Sankyo Company, Limited Combination of antibody-drug conjugate and immune checkpoint inhibitor
CA3048174A1 (en) 2016-12-22 2018-06-28 Daiichi Sankyo Company, Limited Anti-cd3 antibody and molecules comprising the antibody
JOP20190134A1 (ar) 2016-12-23 2019-06-02 Potenza Therapeutics Inc بروتينات رابطة لمولد ضد مضادة لنيوروبيلين وطرق استخدامها
CA3048601A1 (en) 2016-12-26 2018-07-05 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Antibody which binds to myelin oligodendrocyte glycoprotein
TW201825515A (zh) 2017-01-04 2018-07-16 美商伊繆諾金公司 Ｍｅｔ抗體以及其免疫結合物及用途
MX2019004692A (es) 2017-01-06 2019-11-08 Eutilex Co Ltd Anticuerpos 4-1bb anti-humano y usos de los mismos.
EP3568468A4 (en) 2017-01-12 2020-12-30 Eureka Therapeutics, Inc. RECOMBINATION PRODUCTS TARGETING PEPTIDE HISTONE H3 / MHC COMPLEXES AND THEIR USES
WO2018135501A1 (ja) 2017-01-17 2018-07-26 第一三共株式会社 抗ｇｐｒ２０抗体及び抗ｇｐｒ２０抗体－薬物コンジュゲート
WO2018139404A1 (ja) 2017-01-24 2018-08-02 協和発酵キリン株式会社 放射線障害の治療又は予防剤並びに治療又は予防方法
SG10201912368XA (en) 2017-02-07 2020-02-27 Daiichi Sankyo Co Ltd Anti-gprc5d antibody and molecule comprising the antibody
MX2019009485A (es) 2017-02-10 2019-11-05 Genentech Inc Anticuerpos contra triptasa, composiciones de estos y usos de estos.
WO2018148660A1 (en) 2017-02-10 2018-08-16 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Neutralizing antibodies to plasmodium falciparum circumsporozoite protein and their use
BR112019016513A2 (pt) 2017-02-10 2020-04-07 Eutilex Co Ltd anticorpo anticâncer conversível de célula t reguladora induzível por ifn-gama (irtca) e usos do mesmo
US20200181277A1 (en) 2017-02-10 2020-06-11 Genmab B.V. Polypeptide variants and uses thereof
JP7181181B2 (ja) 2017-02-28 2022-11-30 第一三共株式会社 抗ｈｅｒ３抗体－薬物コンジュゲート投与によるｅｇｆｒ－ｔｋｉ抵抗性の非小細胞肺癌の治療方法
ES2953595T3 (es) 2017-03-01 2023-11-14 Hoffmann La Roche Procedimientos diagnósticos y terapéuticos para el cáncer
JP6430082B1 (ja) 2017-03-02 2018-11-28 学校法人 聖マリアンナ医科大学 低用量抗ｃｃｒ４抗体を用いたｈｔｌｖ−１関連脊髄症の予防または治療剤
EP3600442A1 (en) 2017-03-22 2020-02-05 Genentech, Inc. Optimized antibody compositions for treatment of ocular disorders
JP2020515543A (ja) 2017-03-28 2020-05-28 ジェネンテック， インコーポレイテッド 神経変性疾患の治療方法
HUE054316T2 (hu) 2017-03-29 2021-08-30 Shionogi & Co Gyógyászati készítmény rák kezelésére
EP3674324A4 (en) 2017-03-30 2021-04-07 Tohoku University ANTI-PODOPLANIN ANTIBODIES
JOP20190203A1 (ar) 2017-03-30 2019-09-03 Potenza Therapeutics Inc بروتينات رابطة لمولد ضد مضادة لـ tigit وطرق استخدامها
KR20200005540A (ko) 2017-04-14 2020-01-15 제넨테크, 인크. 암의 진단 및 치료 방법
WO2018195472A1 (en) 2017-04-21 2018-10-25 Genentech, Inc. Use of klk5 antagonists for treatment of a disease
MY201065A (en) 2017-04-26 2024-02-01 Eureka Therapeutics Inc Constructs specifically recognizing glypican 3 and uses thereof
JP2020517695A (ja) 2017-04-27 2020-06-18 テサロ， インコーポレイテッド リンパ球活性化遺伝子−３（ｌａｇ−３）に対する抗体薬およびそれらの使用
WO2018209125A1 (en) 2017-05-10 2018-11-15 Fred Hutchinson Cancer Research Center Epstein barr virus antibodies, vaccines, and uses of the same
TWI794230B (zh) 2017-05-15 2023-03-01 日商第一三共股份有限公司 抗ｃｄｈ６抗體及抗ｃｄｈ６抗體-藥物結合物、以及其製造方法
SG10202112636SA (en) 2017-05-16 2021-12-30 Five Prime Therapeutics Inc Anti-fgfr2 antibodies in combination with chemotherapy agents in cancer treatment
CN111132733A (zh) 2017-06-30 2020-05-08 Xencor股份有限公司 含有IL-15/IL-15Rα和抗原结合结构域的靶向异源二聚体Fc融合蛋白
US11912775B2 (en) 2017-07-18 2024-02-27 Kyowa Kirin Co., Ltd. Anti-human CCR1 monoclonal antibody
IL271888B2 (en) 2017-07-21 2024-09-01 Genentech Inc Therapeutic and diagnostic methods for cancer
MX2020000957A (es) 2017-07-26 2020-07-22 Forty Seven Inc Anticuerpos anti-sirp-alfa y metodos relacionados.
BR112020001657A2 (pt) 2017-07-27 2020-07-21 Daiichi Sankyo Company, Limited Anticorpo contra cd147 humana, fragmento de ligação a antígeno do anticorpo, composição farmacêutica, uso do anticorpo ou do fragmento de ligação a antígeno,polinucleotídeo, vetor de expressão, célula hospedeira, método para produzir o anticorpo ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo, para prognosticar aresponsividade ao tratamento contra o câncer e para selecionar sujeitos para o tratamento contra o câncer, kit para determinar a responsividade ao tratamento contra o câncer, complexo de anticorpo-fármaco, e, anticorpo biespecífico
AU2018320470A1 (en) 2017-08-23 2020-02-13 Daiichi Sankyo Company, Limited Antibody-drug conjugate preparation and lyophilization for same
SG11202000387YA (en) 2017-08-25 2020-03-30 Five Prime Therapeutics Inc B7-h4 antibodies and methods of use thereof
IL272964B2 (en) 2017-08-31 2024-02-01 Daiichi Sankyo Co Ltd Production method for antibody-drug conjugates
CA3073924C (en) 2017-08-31 2023-10-17 Daiichi Sankyo Company, Limited Improved method for producing antibody-drug conjugate
EP3684413A1 (en) 2017-09-20 2020-07-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Dosage regimen for combination therapy using pd-1 axis binding antagonists and gpc3 targeting agent
CN116999572A (zh) 2017-09-29 2023-11-07 第一三共株式会社 抗体－药物偶联物、药物组合物及其在制备治疗肿瘤的药物中的应用
BR112020006643A2 (pt) 2017-10-03 2020-09-24 Juno Therapeutics Inc moléculas de ligação específica ao hpv
BR112020006860A2 (pt) 2017-10-05 2020-10-20 Daiichi Sankyo Company, Limited composição para depleção de células t citotóxicas
AU2018347521A1 (en) 2017-10-12 2020-05-07 Immunowake Inc. VEGFR-antibody light chain fusion protein
AU2018358067A1 (en) 2017-11-01 2020-05-07 Juno Therapeutics, Inc. Antibodies and chimeric antigen receptors specific for B-cell maturation antigen
CA3077664A1 (en) 2017-11-06 2019-05-09 Genentech, Inc. Diagnostic and therapeutic methods for cancer
EP3708589A4 (en) 2017-11-08 2021-08-11 Kyowa Kirin Co., Ltd. BIS SPECIFIC ANTIBODY BINDING TO CD40 AND EPCAM
WO2019094637A1 (en) 2017-11-08 2019-05-16 Xencor, Inc. Bispecific and monospecific antibodies using novel anti-pd-1 sequences
US10981992B2 (en) 2017-11-08 2021-04-20 Xencor, Inc. Bispecific immunomodulatory antibodies that bind costimulatory and checkpoint receptors
MX2020005662A (es) 2017-12-01 2020-08-20 Pfizer Anticuerpos anti-cxcr5 y composiciones y usos de los mismos.
CA3085563A1 (en) 2017-12-12 2019-06-20 Kyowa Kirin Co., Ltd. Anti-bmp10 antibody, and therapeutic agent for hypertension and hypertensive diseases comprising said antibody as an active ingredient
MA51184A (fr) 2017-12-15 2020-10-21 Juno Therapeutics Inc Molécules de liaison à l'anti-cct5 et procédés d'utilisation associés
EP3728302A1 (en) 2017-12-19 2020-10-28 Xencor, Inc. Engineered il-2 fc fusion proteins
WO2019126472A1 (en) 2017-12-22 2019-06-27 Genentech, Inc. Use of pilra binding agents for treatment of a disease
KR20200103706A (ko) 2017-12-22 2020-09-02 조운스 테라퓨틱스, 인크. Lilrb2에 대한 항체
SG11202004158QA (en) 2017-12-28 2020-06-29 Nanjing Legend Biotech Co Ltd Single-domain antibodies and variants thereof against tigit
SG11202005273XA (en) 2017-12-28 2020-07-29 Nanjing Legend Biotech Co Ltd Antibodies and variants thereof against pd-l1
US11976109B2 (en) 2018-01-02 2024-05-07 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Neutralizing antibodies to ebola virus glycoprotein and their use
MX2020006956A (es) 2018-01-05 2020-11-06 Ac Immune Sa Moleculas de union a tdp-43 mal plegadas.
AU2019207276A1 (en) 2018-01-15 2020-09-03 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Single-domain antibodies and variants thereof against PD-1
EP3740505A1 (en) 2018-01-16 2020-11-25 Lakepharma Inc. Bispecific antibody that binds cd3 and another target
PL3743088T3 (pl) 2018-01-26 2023-03-20 F. Hoffmann-La Roche Ag Kompozycje i sposoby stosowania il-22 fc
AR114565A1 (es) 2018-01-26 2020-09-23 Genentech Inc Proteínas de fusión fc il-22 y métodos de uso
TWI800854B (zh) 2018-02-01 2023-05-01 大陸商信達生物製藥（蘇州）有限公司 全人源的抗ｂ細胞成熟抗原（ｂｃｍａ）單鏈抗體及其應用
AR115360A1 (es) 2018-02-08 2021-01-13 Genentech Inc Moléculas de unión al antígeno y métodos de uso
MX2020008291A (es) 2018-02-09 2020-09-25 Genentech Inc Metodos terapeuticos y diagnosticos para enfermedades inflamatorias mediadas por mastocitos.
EP3752530A1 (en) 2018-02-14 2020-12-23 ABBA Therapeutics AG Anti-human pd-l2 antibodies
RU2020128111A (ru) 2018-02-21 2022-03-21 Дженентек, Инк. ВЕДЕНИЕ БЕЛКОВ СЛИЯНИЯ IL-22 Fc ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ
MX2020008736A (es) 2018-02-21 2020-12-07 Five Prime Therapeutics Inc Formulaciones de anticuerpos b7-h4.
KR20200123169A (ko) 2018-02-21 2020-10-28 파이브 프라임 테라퓨틱스, 인크. B7-h4 항체 투약 섭생법
AU2019226034A1 (en) 2018-02-21 2020-10-15 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Neutralizing antibodies to HIV-1 Env and their use
AU2019225249A1 (en) 2018-02-26 2020-09-17 Genentech, Inc. Dosing for treatment with anti-tigit and anti-PD-L1 antagonist antibodies
AU2019228600A1 (en) 2018-03-02 2020-09-24 Five Prime Therapeutics, Inc. B7-H4 antibodies and methods of use thereof
WO2019172165A1 (ja) 2018-03-05 2019-09-12 学校法人埼玉医科大学 異所性骨化の治療又は予防のための医薬組成物
US20200040103A1 (en) 2018-03-14 2020-02-06 Genentech, Inc. Anti-klk5 antibodies and methods of use
EP3765520A1 (en) 2018-03-14 2021-01-20 NovImmune SA Anti-cd3 epsilon antibodies and methods of use thereof
KR20200130831A (ko) 2018-03-14 2020-11-20 베이징 슈안이 파마사이언시스 컴퍼니, 리미티드 항-클라우딘 18.2 항체
EP3765494A4 (en) 2018-03-15 2022-03-23 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha ANTI-DENGUE VIRUS ANTIBODIES WITH CROSS-REACTIVITY AGAINST ZIKA VIRUS AND METHODS OF USE
EP3774917A4 (en) 2018-03-30 2022-01-19 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. SINGLE DOMAIN ANTIBODIES AGAINST LAG-3 AND USES THEREOF
TW202011029A (zh) 2018-04-04 2020-03-16 美商建南德克公司 偵測及定量fgf21之方法
US10982006B2 (en) 2018-04-04 2021-04-20 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind fibroblast activation protein
BR112020019313A2 (pt) 2018-04-05 2021-01-05 Juno Therapeutics Inc Receptores de células t e células modificadas que expressam os mesmos
CN110373374B (zh) * 2018-04-12 2023-07-07 上海颢哲信息科技有限公司 一种降低抗体核心岩藻糖基化的方法和组合物
US11505595B2 (en) 2018-04-18 2022-11-22 Xencor, Inc. TIM-3 targeted heterodimeric fusion proteins containing IL-15/IL-15RA Fc-fusion proteins and TIM-3 antigen binding domains
US11524991B2 (en) 2018-04-18 2022-12-13 Xencor, Inc. PD-1 targeted heterodimeric fusion proteins containing IL-15/IL-15Ra Fc-fusion proteins and PD-1 antigen binding domains and uses thereof
WO2019207159A1 (en) 2018-04-27 2019-10-31 Fondazione Ebri Rita Levi-Montalcini Antibody directed against a tau-derived neurotoxic peptide and uses thereof
MX2020011552A (es) 2018-05-03 2020-11-24 Genmab Bv Combinaciones de variantes de anticuerpos y usos de las mismas.
CA3101906A1 (en) 2018-05-28 2019-12-05 Daiichi Sankyo Company, Limited Treatment of her2-mutated cancer by administering anti-her2 antibody-drug conjugate
BR112020021266A2 (pt) 2018-05-31 2021-01-26 Daiichi Sankyo Company, Limited anticorpo anti-tlr7 humano
MX2020012613A (es) 2018-06-01 2021-04-13 Tayu Huaxia Biotech Medical Group Co Ltd Composiciones y usos de las mismas para el tratamiento de enfermedades o afecciones.
EP3805400A4 (en) 2018-06-04 2022-06-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule showing changed half-life in cytoplasm
EP3804512A4 (en) 2018-06-07 2022-04-06 Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology TRANSGENIC MOUSE FOR THE PRODUCTION OF AGLYCOSYLATED ANTIBODY AND USE OF AN AGLYCOSYLATED ANTIBODY PRODUCED THEREOF
CN112469440B (zh) 2018-06-18 2024-09-06 优瑞科生物技术公司 靶向前列腺特异性膜抗原(psma)的构建体和其用途
WO2019246557A1 (en) 2018-06-23 2019-12-26 Genentech, Inc. Methods of treating lung cancer with a pd-1 axis binding antagonist, a platinum agent, and a topoisomerase ii inhibitor
JP7397445B2 (ja) 2018-06-26 2023-12-13 協和キリン株式会社 Ｃｅｌｌ Ａｄｈｅｓｉｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ３に結合する抗体
CA3104997A1 (en) 2018-06-26 2020-01-02 Kyowa Kirin Co., Ltd. Antibody binding to chondroitin sulfate proteoglycan 5
AU2019299357A1 (en) 2018-07-02 2021-01-14 Amgen Inc. Anti-steap1 antigen-binding protein
WO2020014306A1 (en) 2018-07-10 2020-01-16 Immunogen, Inc. Met antibodies and immunoconjugates and uses thereof
JP7534281B2 (ja) 2018-07-13 2024-08-14 ジェンマブ エー／エス Ｃｄ３８抗体を使用したトロゴサイトーシスを介した治療
MA53122A (fr) 2018-07-13 2021-05-19 Genmab As Variants d'anticorps cd38 et leurs utilisations
TW202011991A (zh) 2018-07-18 2020-04-01 美商建南德克公司 用pd-1軸結合拮抗劑、抗代謝劑及鉑劑治療肺癌之方法
CN112584865A (zh) 2018-07-20 2021-03-30 表面肿瘤学公司 抗cd112r组合物和方法
SG11202100653YA (en) 2018-07-25 2021-02-25 Daiichi Sankyo Co Ltd Effective method for manufacturing antibody-drug conjugate
CA3108044A1 (en) 2018-07-31 2020-02-06 Daiichi Sankyo Company, Limited Treatment of metastatic brain tumor by administration of antibody-drug conjugate
JP7504027B2 (ja) 2018-08-03 2024-06-21 中外製薬株式会社 互いに連結された２つの抗原結合ドメインを含む抗原結合分子
EP3834843A4 (en) 2018-08-06 2022-05-11 Daiichi Sankyo Company, Limited COMBINATION OF ANTIBODY-DRUG CONJUGATE AND TUBULIN INHIBITOR
EP3608674A1 (en) 2018-08-09 2020-02-12 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for assessing binding affinity of an antibody variant to the neonatal fc receptor
EA202190451A1 (ru) 2018-08-10 2021-07-13 Чугаи Сейяку Кабусики Кайся Анти-cd137 антигенсвязывающие молекулы и их применение
TW202021618A (zh) 2018-08-17 2020-06-16 美商２３與我有限公司 抗ｉｌ１ｒａｐ抗體及其使用方法
CN112739826A (zh) 2018-08-23 2021-04-30 第一三共株式会社 抗体-药物缀合物的敏感性标志物
KR102596303B1 (ko) * 2018-08-29 2023-10-30 유나이티드 바이오파마, 인크. 비푸코실화된 항체 및 그의 제조법
GB201814281D0 (en) 2018-09-03 2018-10-17 Femtogenix Ltd Cytotoxic agents
CN112789293B (zh) 2018-09-10 2024-05-10 南京传奇生物科技有限公司 针对cll1的单结构域抗体及其构建体
WO2020056170A1 (en) 2018-09-12 2020-03-19 Fred Hutchinson Cancer Research Center Reducing cd33 expression to selectively protect therapeutic cells
CA3111401A1 (en) 2018-09-19 2020-03-26 Genentech, Inc. Therapeutic and diagnostic methods for bladder cancer
KR20210062005A (ko) 2018-09-20 2021-05-28 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 항 her3 항체-약물 콘쥬게이트 투여에 의한 her3 변이암의 치료
US20230038521A1 (en) 2018-09-21 2023-02-09 National University Corporation Tokyo Medical An D Dental University Human Monoclonal Antibody Binding Specifically to Human Hmgb1, and Pharmaceutical Composition for Treating or Preventing Alzheimer's Disease Containing Said Human Monoclonal Antibody
WO2020061349A1 (en) 2018-09-21 2020-03-26 Genentech, Inc. Diagnostic methods for triple-negative breast cancer
EP3858994A4 (en) 2018-09-28 2022-06-22 Kyowa Kirin Co., Ltd. ANTIBODY COMPOSITION
EP3861016A2 (en) 2018-10-03 2021-08-11 Xencor, Inc. Il-12 heterodimeric fc-fusion proteins
US20220010020A1 (en) 2018-10-05 2022-01-13 Five Prime Therapeutics, Inc. Anti-FGFR2 Antibody Formulations
EP3867274A1 (en) 2018-10-15 2021-08-25 Five Prime Therapeutics, Inc. Combination therapy for cancer
WO2020081493A1 (en) 2018-10-16 2020-04-23 Molecular Templates, Inc. Pd-l1 binding proteins
AU2019361983A1 (en) 2018-10-18 2021-05-20 Genentech, Inc. Diagnostic and therapeutic methods for sarcomatoid kidney cancer
WO2020089437A1 (en) 2018-10-31 2020-05-07 Engmab Sàrl Combination therapy
SG11202104993SA (en) 2018-11-14 2021-06-29 Daiichi Sankyo Co Ltd Anti-cdh6 antibody-pyrrolobenzodiazepine derivative conjugate
WO2020102555A1 (en) 2018-11-16 2020-05-22 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Antibodies to mucin-16 and methods of use thereof
AU2019394940A1 (en) 2018-12-05 2021-06-24 Genentech, Inc. Diagnostic methods and compositions for cancer immunotherapy
KR20210100668A (ko) 2018-12-06 2021-08-17 제넨테크, 인크. 항-CD79b 면역접합체, 알킬화제 및 항-CD20 항체를 포함하는 미만성 큰 B-세포 림프종의 조합 요법
JP2022513198A (ja) 2018-12-10 2022-02-07 ジェネンテック， インコーポレイテッド Ｆｃ含有タンパク質への部位特異的コンジュゲーションのための光架橋性ペプチド
CN113271942A (zh) 2018-12-11 2021-08-17 第一三共株式会社 抗体-药物缀合物与parp抑制剂的组合
AR117327A1 (es) 2018-12-20 2021-07-28 23Andme Inc Anticuerpos anti-cd96 y métodos de uso de estos
JP2022514290A (ja) 2018-12-20 2022-02-10 ジェネンテック， インコーポレイテッド 改変抗体ｆｃおよび使用方法
US20220089694A1 (en) 2018-12-20 2022-03-24 The U.S.A., As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Ebola virus glycoprotein-specific monoclonal antibodies and uses thereof
BR112021011894A2 (pt) 2018-12-21 2021-09-08 Daiichi Sankyo Company, Limited Composição farmacêutica
MX2021007589A (es) 2018-12-21 2021-12-10 23Andme Inc Anticuerpos anti il-36 y procedimientos de uso de estos.
KR20210108996A (ko) 2018-12-27 2021-09-03 시오노기세이야쿠가부시키가이샤 신규 항 ccr8 항체
AU2019413278A1 (en) 2018-12-28 2021-07-15 Kyowa Kirin Co., Ltd. Bispecific antibody binding to TfR
WO2020141145A1 (en) 2018-12-30 2020-07-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Anti-rabbit cd19 antibodies and methods of use
EP3911678A1 (en) 2019-01-14 2021-11-24 Genentech, Inc. Methods of treating cancer with a pd-1 axis binding antagonist and an rna vaccine
EP3915581A4 (en) 2019-01-24 2023-03-22 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha NOVEL CANCER ANTIGENS AND ANTIBODIES OF THESE ANTIGENS
PE20212198A1 (es) 2019-01-29 2021-11-16 Juno Therapeutics Inc Anticuerpos y receptores quimericos de antigenos especificos para receptor 1 huerfano tipo receptor tirosina-cinasa (ror1)
GB201901197D0 (en) 2019-01-29 2019-03-20 Femtogenix Ltd G-A Crosslinking cytotoxic agents
BR112021016923A2 (pt) 2019-02-27 2021-11-03 Genentech Inc Métodos para tratar um paciente com câncer hematológico, métodos para tratar um paciente com mm recidivante ou refratário, métodos para tratar um paciente tendo um lnh recidivante ou refratário e kits
US11472890B2 (en) 2019-03-01 2022-10-18 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind ENPP3 and CD3
MX2021010565A (es) 2019-03-08 2021-10-13 Genentech Inc Metodos para detectar y cuantificar proteinas asociadas a la membrana en vesiculas extracelulares.
WO2020186176A1 (en) 2019-03-14 2020-09-17 Genentech, Inc. Treatment of cancer with her2xcd3 bispecific antibodies in combination with anti-her2 mab
WO2020189748A1 (ja) 2019-03-19 2020-09-24 中外製薬株式会社 Ｍｔａ依存的に抗原に対する結合活性が変化する抗原結合ドメインを含む抗原結合分子及び当該抗原結合ドメイン取得用ライブラリ
US20220168440A1 (en) 2019-03-25 2022-06-02 Daiichi Sankyo Company, Limited Antibody-pyrrolobenzodiazepine deprivative conjugate
TW202102225A (zh) 2019-03-25 2021-01-16 日商第一三共股份有限公司 抗her2抗體-吡咯并苯二氮呯衍生物結合物
KR20210143839A (ko) 2019-03-27 2021-11-29 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 항체-피롤로벤조디아제핀 유도체 콘주게이트와 parp 저해제의 조합
US20220169706A1 (en) 2019-03-28 2022-06-02 Danisco Us Inc Engineered antibodies
TW202043291A (zh) 2019-04-19 2020-12-01 美商建南德克公司 抗mertk抗體及使用方法
CA3133821A1 (en) 2019-05-03 2020-11-12 Genentech, Inc. Methods of treating cancer with an anti-pd-l1 antibody
US20220227853A1 (en) 2019-05-03 2022-07-21 The United States Of America,As Represented By The Secretary,Department Of Health And Human Services Neutralizing antibodies to plasmodium falciparum circumsporozoite protein and their use
EP3968993A1 (en) 2019-05-14 2022-03-23 F. Hoffmann-La Roche AG Methods of using anti-cd79b immunoconjugates to treat follicular lymphoma
AU2020276931A1 (en) 2019-05-15 2021-12-16 Kyowa Kirin Co., Ltd. Bispecific antibody binding to CD40 and FAP
JP7502281B2 (ja) 2019-05-15 2024-06-18 協和キリン株式会社 Ｃｄ４０とｇｐｃ３に結合するバイスペシフィック抗体
US20230085439A1 (en) 2019-05-21 2023-03-16 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Antibodies that bind human metapneumovirus fusion protein and their use
KR20220012270A (ko) 2019-05-23 2022-02-03 에이씨 이뮨 에스.에이. 항-tdp-43 결합 분자 및 이의 용도
EP3976113A1 (en) 2019-05-29 2022-04-06 Daiichi Sankyo Company, Limited Dosage of an antibody-drug conjugate
CN114269783B (zh) 2019-07-02 2024-03-26 美国政府(由卫生和人类服务部的部长所代表) 结合egfrviii的单克隆抗体及其应用
JPWO2021020282A1 (hu) 2019-07-26 2021-02-04
AU2020325770B2 (en) 2019-08-06 2022-08-25 Aprinoia Therapeutics Limited Antibodies that bind to pathological tau species and uses thereof
EP4438056A2 (en) 2019-09-12 2024-10-02 F. Hoffmann-La Roche AG Compositions and methods of treating lupus nephritis
JPWO2021049606A1 (hu) 2019-09-13 2021-03-18
JP2022549218A (ja) 2019-09-20 2022-11-24 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗トリプターゼ抗体の投薬
KR20220070237A (ko) 2019-09-27 2022-05-30 제넨테크, 인크. 항-tigit 및 항-pd-l1 길항제 항체를 이용한 치료를 위한 투약
JP7413519B2 (ja) 2019-10-18 2024-01-15 ジェネンテック， インコーポレイテッド びまん性大細胞型ｂ細胞リンパ腫を処置するための抗ｃｄ７９ｂ免疫抱合体の使用方法
BR112022007632A2 (pt) 2019-10-25 2022-07-12 Daiichi Sankyo Co Ltd Composição farmacêutica e preparação de kit para tratamento de câncer, e, métodos para tratamento de câncer e de um paciente com câncer
IL292458A (en) 2019-11-06 2022-06-01 Genentech Inc Diagnostic and treatment methods for the treatment of hematological cancer
MX2022006709A (es) 2019-12-06 2022-09-12 Juno Therapeutics Inc Anticuerpos antiidiotípicos para dominios de unión dirigidos a bcma y métodos y composiciones relacionadas.
US20230192869A1 (en) 2019-12-06 2023-06-22 Juno Therapeutics, Inc. Anti-idiotypic antibodies to gprc5d-targeted binding domains and related compositions and methods
CR20230210A (es) 2019-12-13 2023-06-14 Genentech Inc ANTICUERPOS ANTI-LY6G6D Y MÉTODOS DE USO (Divisional 2022-0330)
JP2023507786A (ja) 2019-12-20 2023-02-27 ブリストル－マイヤーズ スクイブ カンパニー 脱フコシル化抗体を生成するためのフコシル化阻害剤の使用
AR120898A1 (es) 2019-12-26 2022-03-30 Univ Osaka Agente para tratar o prevenir neuromielitis óptica en fase aguda
CN113045655A (zh) 2019-12-27 2021-06-29 高诚生物医药(香港)有限公司 抗ox40抗体及其用途
MX2022007840A (es) 2019-12-27 2022-07-19 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anticuerpo anti antigeno-4 asociado al linfocito t citotoxico (ctla4) y uso del mismo.
CN110818795B (zh) 2020-01-10 2020-04-24 上海复宏汉霖生物技术股份有限公司 抗tigit抗体和使用方法
CN118697868A (zh) 2020-01-15 2024-09-27 国立大学法人大阪大学 糖尿病性自主神经障碍的预防或治疗剂
WO2021145435A1 (ja) 2020-01-15 2021-07-22 国立大学法人大阪大学 認知症の予防又は治療剤
US20230272105A1 (en) 2020-01-16 2023-08-31 Genmab A/S Formulations of cd38 antibodies and uses thereof
WO2021194481A1 (en) 2020-03-24 2021-09-30 Genentech, Inc. Dosing for treatment with anti-tigit and anti-pd-l1 antagonist antibodies
WO2022050954A1 (en) 2020-09-04 2022-03-10 Genentech, Inc. Dosing for treatment with anti-tigit and anti-pd-l1 antagonist antibodies
JP2023513059A (ja) 2020-01-31 2023-03-30 ザ クリーブランド クリニック ファウンデーション 抗ミューラー管ホルモン受容体２抗体及び使用方法
IL294859A (en) 2020-01-31 2022-09-01 Genentech Inc Methods for induction of neoepitope-specific t cells with spindle-binding antagonist 1-pd and RNA vaccine
TW202144395A (zh) 2020-02-12 2021-12-01 日商中外製藥股份有限公司 用於癌症之治療的抗cd137抗原結合分子
WO2021163064A2 (en) 2020-02-14 2021-08-19 Jounce Therapeutics, Inc. Antibodies and fusion proteins that bind to ccr8 and uses thereof
TW202140561A (zh) 2020-02-14 2021-11-01 日商協和麒麟股份有限公司 與cd3結合之雙特異性抗體
US20230348568A1 (en) 2020-02-20 2023-11-02 The U.S.A., As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Epstein-barr virus monoclonal antibodies and uses thereof
WO2021170067A1 (zh) 2020-02-28 2021-09-02 上海复宏汉霖生物技术股份有限公司 抗cd137构建体及其用途
AU2021228078A1 (en) 2020-02-28 2022-09-22 Shanghai Henlius Biotech, Inc. Anti-CD137 constructs, multispecific antibody and uses thereof
PE20230252A1 (es) 2020-03-13 2023-02-07 Genentech Inc Anticuerpos anti-interleucina-33 y sus usos de estos
BR112022018657A2 (pt) 2020-03-19 2022-11-01 Genentech Inc Anticorpos, ácido nucleico, célula hospedeira, imunoconjugado, formulação farmacêutica, usos de um anticorpo, métodos de produção de um anticorpo e de tratamento de um indivíduo, métodos para inibir a sinalização de smad e para diagnosticar um indivíduo como tendo ssc e kit
MX2022011752A (es) 2020-03-24 2022-10-18 Genentech Inc Agentes de fijacion a tie2 y metodos de uso.
CN115348971A (zh) 2020-03-30 2022-11-15 国立研究开发法人国立癌症研究中心 抗体-药物缀合物
CA3175577A1 (en) 2020-03-30 2021-10-07 Mie University Bispecific antibody
WO2021201236A1 (ja) 2020-04-01 2021-10-07 協和キリン株式会社 抗体組成物
WO2021202959A1 (en) 2020-04-03 2021-10-07 Genentech, Inc. Therapeutic and diagnostic methods for cancer
WO2021207662A1 (en) 2020-04-10 2021-10-14 Genentech, Inc. Use of il-22fc for the treatment or prevention of pneumonia, acute respiratory distress syndrome, or cytokine release syndrome
AU2021259861A1 (en) 2020-04-24 2022-11-17 Genentech, Inc. Methods of using anti-CD79b immunoconjugates
JP2023523145A (ja) 2020-04-27 2023-06-02 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア リポ蛋白（ａ）に対するイソ型非依存性抗体
EP4143345A1 (en) 2020-04-28 2023-03-08 Genentech, Inc. Methods and compositions for non-small cell lung cancer immunotherapy
TW202200212A (zh) 2020-05-03 2022-01-01 中國大陸商聯寧（蘇州）生物製藥有限公司 包含抗-trop-2抗體之抗體藥物結合物
WO2021231976A1 (en) 2020-05-14 2021-11-18 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind prostate specific membrane antigen (psma) and cd3
CR20220646A (es) 2020-05-17 2023-10-23 Astrazeneca Uk Ltd Anticuerpos contra el sars-cov-2 y métodos de selección y uso de los mismos
WO2021238886A1 (en) 2020-05-27 2021-12-02 Staidson (Beijing) Biopharmaceuticals Co., Ltd. Antibodies specifically recognizing nerve growth factor and uses thereof
US11787861B2 (en) 2020-05-29 2023-10-17 23Andme, Inc. Anti-CD200R1 antibodies and methods of use thereof
CN116529260A (zh) 2020-06-02 2023-08-01 当康生物技术有限责任公司 抗cd93构建体及其用途
AU2021283345A1 (en) 2020-06-02 2023-02-02 Dynamicure Biotechnology Llc Anti-CD93 constructs and uses thereof
EP4165415A1 (en) 2020-06-12 2023-04-19 Genentech, Inc. Methods and compositions for cancer immunotherapy
KR20230025691A (ko) 2020-06-16 2023-02-22 제넨테크, 인크. 삼중 음성 유방암을 치료하기 위한 방법과 조성물
EP4168118A1 (en) 2020-06-18 2023-04-26 Genentech, Inc. Treatment with anti-tigit antibodies and pd-1 axis binding antagonists
CN116234824A (zh) 2020-06-22 2023-06-06 阿尔米雷尔有限公司 抗il-36抗体及其使用方法
CN116670285A (zh) 2020-06-23 2023-08-29 江苏康缘药业股份有限公司 抗cd38抗体及其用途
WO2021260583A1 (en) 2020-06-24 2021-12-30 Astrazeneca Uk Limited Combination of antibody-drug conjugate and dna-pk inhibitor
CN116194109A (zh) 2020-06-24 2023-05-30 阿斯利康(英国)有限公司 抗体-药物缀合物和atm抑制剂的组合
AU2021298251A1 (en) 2020-06-24 2023-02-02 Astrazeneca Uk Limited Combination of antibody-drug conjugate and ATR inhibitor
WO2021260582A1 (en) 2020-06-24 2021-12-30 Astrazeneca Uk Limited Combination of antibody-drug conjugate and aurora b inhibitor
WO2021260578A1 (en) 2020-06-24 2021-12-30 Astrazeneca Uk Limited Combination of antibody-drug conjugate and cdk9 inhibitor
JPWO2022004760A1 (hu) 2020-06-30 2022-01-06
EP4183799A1 (en) 2020-07-17 2023-05-24 Daiichi Sankyo Company, Limited Method for producing antibody-drug conjugate
IL300030A (en) 2020-07-20 2023-03-01 Daiichi Sankyo Co Ltd Combination of an anti-2HER drug-antibody conjugate with a dimerization suppressor
GB2597532A (en) 2020-07-28 2022-02-02 Femtogenix Ltd Cytotoxic compounds
US20230322935A1 (en) 2020-07-29 2023-10-12 Dynamicure Biotechnology Llc Anti-cd93 constructs and uses thereof
CN116568824A (zh) 2020-08-03 2023-08-08 基因泰克公司 淋巴瘤的诊断和治疗方法
JP2023536326A (ja) 2020-08-05 2023-08-24 ジュノー セラピューティクス インコーポレイテッド Ｒｏｒ１標的結合ドメインに対する抗イディオタイプ抗体ならびに関連する組成物および方法
JP2023536655A (ja) 2020-08-07 2023-08-28 ジェネンテック， インコーポレイテッド Ｆｌｔ３リガンド融合タンパク質及び使用方法
AU2021325339A1 (en) 2020-08-10 2023-04-06 Astrazeneca Uk Limited SARS-CoV-2 antibodies for treatment and prevention of COVID-19
WO2022034228A1 (en) 2020-08-14 2022-02-17 Ac Immune Sa Humanized anti-tdp-43 binding molecules and uses thereof
JP2023538891A (ja) 2020-08-19 2023-09-12 ゼンコア インコーポレイテッド 抗ｃｄ２８組成物
WO2022043517A2 (en) 2020-08-27 2022-03-03 Cureab Gmbh Anti-golph2 antibodies for macrophage and dendritic cell differentiation
EP4211598A2 (en) 2020-09-12 2023-07-19 AstraZeneca UK Limited A scoring method for an anti-her2 antibody-drug conjugate therapy
WO2022053715A1 (en) 2020-09-14 2022-03-17 Ichnos Sciences SA Antibodies that bind to il1rap and uses thereof
JP2023544407A (ja) 2020-10-05 2023-10-23 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ＦｃＲＨ５／抗ＣＤ３二重特異性抗体による処置のための投与
CN116348115A (zh) 2020-10-09 2023-06-27 阿斯利康(英国)有限公司 抗体-药物缀合物和parp1选择性抑制剂的组合
AU2021366287A1 (en) 2020-10-20 2023-04-13 Kantonsspital St. Gallen Antibodies or antigen-binding fragments specifically binding to Gremlin-1 and uses thereof
KR20230091871A (ko) 2020-10-20 2023-06-23 에프. 호프만-라 로슈 아게 Pd-1 축 결합 길항제 및 lrrk2 억제제의 병용 요법
WO2022093981A1 (en) 2020-10-28 2022-05-05 Genentech, Inc. Combination therapy comprising ptpn22 inhibitors and pd-l1 binding antagonists
AU2021374594A1 (en) 2020-11-04 2023-06-01 Genentech, Inc. Dosing for treatment with anti-cd20/anti-cd3 bispecific antibodies and anti-cd79b antibody drug conjugates
TW202225192A (zh) 2020-11-04 2022-07-01 美商建南德克公司 用抗ｃｄ２０／抗ｃｄ３雙特異性抗體進行治療之給藥
MX2023005130A (es) 2020-11-04 2023-05-25 Genentech Inc Dosis subcutanea de anticuerpos biespecificos anti-cd20/anti-cd3.
WO2022102634A1 (ja) 2020-11-11 2022-05-19 第一三共株式会社 抗体－薬物コンジュゲートと抗ＳＩＲＰα抗体の組み合わせ
CN116615250A (zh) 2020-11-12 2023-08-18 第一三共株式会社 通过施用抗b7-h3抗体-药物缀合物的间皮瘤治疗
IL303154A (en) 2020-11-30 2023-07-01 Ono Pharmaceutical Co Factor against human epidermal growth factor receptor 2
TW202237639A (zh) 2020-12-09 2022-10-01 日商武田藥品工業股份有限公司 鳥苷酸環化酶ｃ（ｇｃｃ）抗原結合劑之組成物及其使用方法
TW202237638A (zh) 2020-12-09 2022-10-01 日商武田藥品工業股份有限公司 烏苷酸環化酶ｃ（ｇｃｃ）抗原結合劑之組成物及其使用方法
US20240025985A1 (en) 2020-12-09 2024-01-25 National University Corporation Tokyo Medical And Dental University Agent for Preventing or Treating Frontotemporal Lobar Degeneration
WO2022132904A1 (en) 2020-12-17 2022-06-23 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Human monoclonal antibodies targeting sars-cov-2
WO2022140797A1 (en) 2020-12-23 2022-06-30 Immunowake Inc. Immunocytokines and uses thereof
EP4277665A1 (en) 2021-01-13 2023-11-22 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Anti-dll3 antibody-drug conjugate
US20240115720A1 (en) 2021-01-13 2024-04-11 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Antibody-pyrrolobenzodiazepine derivative conjugate
CN117120084A (zh) 2021-01-28 2023-11-24 维肯芬特有限责任公司 用于调节b细胞介导的免疫应答的方法和手段
WO2022162203A1 (en) 2021-01-28 2022-08-04 Vaccinvent Gmbh Method and means for modulating b-cell mediated immune responses
CA3206395A1 (en) 2021-01-28 2022-08-04 Hassan JUMAA-WEINACHT Method and means for modulating b-cell mediated immune responses
AU2022220611A1 (en) 2021-02-09 2023-08-24 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Human monoclonal antibodies against pneumococcal antigens
JP2024506315A (ja) 2021-02-09 2024-02-13 ザ ユナイテッド ステイツ オブ アメリカ アズ リプリゼンテッド バイ ザ セクレタリー、デパートメント オブ ヘルス アンド ヒューマン サービシーズ コロナウイルスのスパイクタンパク質を標的とする抗体
AU2022219373A1 (en) 2021-02-15 2023-08-24 Takeda Pharmaceutical Company Limited Cell therapy compositions and methods for modulating tgf-b signaling
AR124914A1 (es) 2021-02-18 2023-05-17 Mitsubishi Tanabe Pharma Corp Nuevo anticuerpo anti-pad4
US20220378929A1 (en) 2021-02-25 2022-12-01 MediBoston Limted Anti-her2 antibody-drug conjugates and uses thereof
CN117440832A (zh) 2021-03-03 2024-01-23 索伦托药业有限公司 包括抗bcma抗体的抗体-药物缀合物
US20240141048A1 (en) 2021-03-05 2024-05-02 Dynamicure Biotechnology Llc Anti-vista constructs and uses thereof
MX2023010499A (es) 2021-03-09 2023-09-18 Xencor Inc Anticuerpos heterodimericos que se unen a cd3 y cldn6.
WO2022192898A2 (en) 2021-03-10 2022-09-15 Immunowake Inc. Immunomodulatory molecules and uses thereof
US11859012B2 (en) 2021-03-10 2024-01-02 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind CD3 and GPC3
TW202300521A (zh) 2021-03-15 2023-01-01 美商建南德克公司 治療狼瘡性腎炎的組成物及方法
WO2022197877A1 (en) 2021-03-19 2022-09-22 Genentech, Inc. Methods and compositions for time delayed bio-orthogonal release of cytotoxic agents
US20240150466A1 (en) 2021-03-25 2024-05-09 Dynamicure Biotechnology Llc Anti-igfbp7 constructs and uses thereof
JPWO2022210485A1 (hu) 2021-03-29 2022-10-06
AR125344A1 (es) 2021-04-15 2023-07-05 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anticuerpo anti-c1s
JP2024517535A (ja) 2021-04-30 2024-04-23 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 抗ｃｄ２０／抗ｃｄ３二重特異性抗体と抗ｃｄ７９ｂ抗体薬物コンジュゲートを用いた併用治療の投与
IL308351A (en) 2021-05-12 2024-01-01 Genentech Inc Methods for using anti-CD79B immunoconjugates to treat diffuse large B-cell lymphoma
KR20240007928A (ko) 2021-05-14 2024-01-17 제넨테크, 인크. Trem2의 효능제
TW202306994A (zh) 2021-06-04 2023-02-16 日商中外製藥股份有限公司 抗ddr2抗體及其用途
KR20240019109A (ko) 2021-06-09 2024-02-14 에프. 호프만-라 로슈 아게 암의 치료에 이용하기 위한 특정 braf 억제제(패러독스 브레이크) 및 pd-1 축 결합 길항제의 조합물
WO2022266660A1 (en) 2021-06-17 2022-12-22 Amberstone Biosciences, Inc. Anti-cd3 constructs and uses thereof
AR126236A1 (es) 2021-06-25 2023-10-04 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Uso del anticuerpo anti-ctla-4
AU2022299846B2 (en) 2021-06-25 2024-08-15 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti–ctla-4 antibody
TW202317633A (zh) 2021-07-08 2023-05-01 美商舒泰神（加州）生物科技有限公司 特異性識別ｔｎｆｒ２的抗體及其用途
JP2024525769A (ja) 2021-07-14 2024-07-12 舒泰神（北京）生物製薬股フン有限公司 Ｃｄ４０を特異的に認識する抗体およびその使用
JP2024526880A (ja) 2021-07-22 2024-07-19 ジェネンテック， インコーポレイテッド 脳標的化組成物及びその使用方法
US20240336697A1 (en) 2021-08-07 2024-10-10 Genentech, Inc. Methods of using anti-cd79b immunoconjugates to treat diffuse large b-cell lymphoma
CN117897409A (zh) 2021-08-13 2024-04-16 基因泰克公司 抗类胰蛋白酶抗体的给药
CN117858905A (zh) 2021-08-19 2024-04-09 豪夫迈·罗氏有限公司 多价抗变体fc区抗体及使用方法
KR20240049285A (ko) 2021-08-26 2024-04-16 쿄와 기린 가부시키가이샤 Cd116 및 cd131에 결합하는 이중 특이적 항체
IL310382A (en) 2021-08-27 2024-03-01 Genentech Inc Methods for treating tau pathologies
TW202325727A (zh) 2021-08-30 2023-07-01 美商建南德克公司 抗聚泛素多特異性抗體
EP4399227A1 (en) 2021-09-06 2024-07-17 Genmab A/S Antibodies capable of binding to cd27, variants thereof and uses thereof
EP4401791A1 (en) 2021-09-15 2024-07-24 Daiichi Sankyo Company, Limited Antibody-drug conjugate for use in methods of treating chemotherapy-resistant cancer
CA3232223A1 (en) 2021-09-17 2023-03-23 Ying Fu Synthetic humanized llama nanobody library and use thereof to identify sars-cov-2 neutralizing antibodies
WO2023056403A1 (en) 2021-09-30 2023-04-06 Genentech, Inc. Methods for treatment of hematologic cancers using anti-tigit antibodies, anti-cd38 antibodies, and pd-1 axis binding antagonists
IL311956A (en) 2021-10-08 2024-06-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Method for preparing a prefilled syringe formulation
CN118119408A (zh) 2021-10-18 2024-05-31 第一三共株式会社 抗cd37抗体-药物缀合物
WO2023081818A1 (en) 2021-11-05 2023-05-11 American Diagnostics & Therapy, Llc (Adxrx) Monoclonal antibodies against carcinoembryonic antigens, and their uses
TW202342095A (zh) 2021-11-05 2023-11-01 英商阿斯特捷利康英國股份有限公司 用於治療和預防ｃｏｖｉｄ—１９之組成物
EP4430072A1 (en) 2021-11-10 2024-09-18 Genentech, Inc. Anti-interleukin-33 antibodies and uses thereof
AU2022389969A1 (en) 2021-11-16 2024-05-02 Genentech, Inc. Methods and compositions for treating systemic lupus erythematosus (sle) with mosunetuzumab
EP4433167A1 (en) 2021-11-16 2024-09-25 AC Immune SA Novel molecules for therapy and diagnosis
CA3238116A1 (en) 2021-11-18 2023-05-25 Matthew Simon SUNG Combination of antibody-drug conjugate and parp1 selective inhibitor
JPWO2023100829A1 (hu) 2021-11-30 2023-06-08
EP4445911A1 (en) 2021-12-06 2024-10-16 Beijing SoloBio Genetechnology Co., Ltd. Bispecific antibody that specifically binds to klebsiella pneumoniae o2 and o1 antigens, and composition
WO2023109900A1 (en) 2021-12-17 2023-06-22 Shanghai Henlius Biotech, Inc. Anti-ox40 antibodies, multispecific antibodies and methods of use
CA3240565A1 (en) 2021-12-17 2023-06-22 Wenfeng Xu Anti-ox40 antibodies and methods of use
AU2022429904A1 (en) 2021-12-28 2024-06-06 Astrazeneca Uk Limited Combination of antibody-drug conjugate and atr inhibitor
WO2023126822A1 (en) 2021-12-28 2023-07-06 Astrazeneca Uk Limited Combination of antibody-drug conjugate and rasg12c inhibitor
AU2023206045A1 (en) 2022-01-07 2024-08-22 Johnson & Johnson Enterprise Innovation Inc. Materials and methods of il-1beta binding proteins.
WO2023139292A1 (en) 2022-01-24 2023-07-27 Cambridge Enterprise Limited Tau therapy
WO2023153471A1 (ja) 2022-02-09 2023-08-17 国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所 Ｆｃｒｌ１に結合する抗体又は該抗体断片
TW202342106A (zh) 2022-02-09 2023-11-01 日商第一三共股份有限公司 環境應答性遮蔽抗體及其利用
IL314799A (en) 2022-02-10 2024-10-01 Us Health Human monoclonal antibodies broadly targeting coronavirus
AR128540A1 (es) 2022-02-16 2024-05-22 Ac Immune Sa Moléculas de unión anti-tdp-43 humanizadas y usos de las mismas
TW202342510A (zh) 2022-02-18 2023-11-01 英商Ｒｑ生物科技有限公司 抗體
MX2024010003A (es) 2022-02-18 2024-09-30 Rakuten Medical Inc Moléculas de anticuerpo anti-ligando 1 de muerte programada (pd-l1), polinucleótidos que las codifican y métodos de uso.
WO2023171009A1 (ja) 2022-03-09 2023-09-14 株式会社Cured Ｅｖａ１タンパク質に結合する、ヒト化抗体又はその機能的断片、抗体薬物複合体及びキメラ抗原受容体
WO2023173026A1 (en) 2022-03-10 2023-09-14 Sorrento Therapeutics, Inc. Antibody-drug conjugates and uses thereof
WO2023175483A1 (en) 2022-03-16 2023-09-21 Astrazeneca Uk Limited A scoring method for an anti-trop2 antibody‑drug conjugate therapy
WO2023176881A1 (ja) 2022-03-16 2023-09-21 第一三共株式会社 多重特異的分子と免疫チェックポイント阻害剤の組み合わせ
US20230414750A1 (en) 2022-03-23 2023-12-28 Hoffmann-La Roche Inc. Combination treatment of an anti-cd20/anti-cd3 bispecific antibody and chemotherapy
WO2023179740A1 (en) 2022-03-25 2023-09-28 Shanghai Henlius Biotech , Inc. Anti-msln antibodies and methods of use
WO2023192827A1 (en) 2022-03-26 2023-10-05 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Bispecific antibodies to hiv-1 env and their use
WO2023192881A1 (en) 2022-03-28 2023-10-05 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Neutralizing antibodies to hiv-1 env and their use
AU2022450448A1 (en) 2022-04-01 2024-10-10 Genentech, Inc. Dosing for treatment with anti-fcrh5/anti-cd3 bispecific antibodies
WO2023194565A1 (en) 2022-04-08 2023-10-12 Ac Immune Sa Anti-tdp-43 binding molecules
AU2023253705A1 (en) 2022-04-13 2024-10-17 F. Hoffmann-La Roche Ag Pharmaceutical compositions of therapeutic proteins and methods of use
AU2023251832A1 (en) 2022-04-13 2024-10-17 F. Hoffmann-La Roche Ag Pharmaceutical compositions of anti-cd20/anti-cd3 bispecific antibodies and methods of use
WO2023203177A1 (en) 2022-04-20 2023-10-26 Kantonsspital St. Gallen Antibodies or antigen-binding fragments pan-specifically binding to gremlin-1 and gremlin-2 and uses thereof
WO2023209591A1 (en) 2022-04-27 2023-11-02 Daiichi Sankyo Company, Limited Combination of antibody-drug conjugate with ezh1 and/or ezh2 inhibitor
WO2023209177A1 (en) 2022-04-29 2023-11-02 Astrazeneca Uk Limited Sars-cov-2 antibodies and methods of using the same
TW202406934A (zh) 2022-05-03 2024-02-16 美商建南德克公司 抗Ｌｙ６Ｅ抗體、免疫結合物及其用途
WO2023218378A1 (en) 2022-05-11 2023-11-16 Daiichi Sankyo Company, Limited Combination of an antibody specific for a tumor antigen and a cd47 inhibitor
WO2023219613A1 (en) 2022-05-11 2023-11-16 Genentech, Inc. Dosing for treatment with anti-fcrh5/anti-cd3 bispecific antibodies
WO2023228095A1 (en) 2022-05-24 2023-11-30 Daiichi Sankyo Company, Limited Dosage regimen of an anti-cdh6 antibody-drug conjugate
WO2023235699A1 (en) 2022-05-31 2023-12-07 Jounce Therapeutics, Inc. Antibodies to lilrb4 and uses thereof
WO2023240058A2 (en) 2022-06-07 2023-12-14 Genentech, Inc. Prognostic and therapeutic methods for cancer
WO2023237706A2 (en) 2022-06-08 2023-12-14 Institute For Research In Biomedicine (Irb) Cross-specific antibodies, uses and methods for discovery thereof
WO2024015897A1 (en) 2022-07-13 2024-01-18 Genentech, Inc. Dosing for treatment with anti-fcrh5/anti-cd3 bispecific antibodies
WO2024020407A1 (en) 2022-07-19 2024-01-25 Staidson Biopharma Inc. Antibodies specifically recognizing b- and t-lymphocyte attenuator (btla) and uses thereof
TW202413433A (zh) 2022-07-19 2024-04-01 美商建南德克公司 用抗ｆｃｒｈ５／抗ｃｄ３雙特異性抗體進行治療之給藥
TW202417504A (zh) 2022-07-22 2024-05-01 美商建南德克公司 抗ｓｔｅａｐ１抗原結合分子及其用途
WO2024023750A1 (en) 2022-07-28 2024-02-01 Astrazeneca Uk Limited Combination of antibody-drug conjugate and bispecific checkpoint inhibitor
WO2024030829A1 (en) 2022-08-01 2024-02-08 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Monoclonal antibodies that bind to the underside of influenza viral neuraminidase
WO2024028731A1 (en) 2022-08-05 2024-02-08 Janssen Biotech, Inc. Transferrin receptor binding proteins for treating brain tumors
WO2024028732A1 (en) 2022-08-05 2024-02-08 Janssen Biotech, Inc. Cd98 binding constructs for treating brain tumors
WO2024037633A2 (en) 2022-08-19 2024-02-22 Evive Biotechnology (Shanghai) Ltd Formulations comprising g-csf and uses thereof
WO2024044779A2 (en) 2022-08-26 2024-02-29 Juno Therapeutics, Inc. Antibodies and chimeric antigen receptors specific for delta-like ligand 3 (dll3)
WO2024049949A1 (en) 2022-09-01 2024-03-07 Genentech, Inc. Therapeutic and diagnostic methods for bladder cancer
WO2024054822A1 (en) 2022-09-07 2024-03-14 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Engineered sars-cov-2 antibodies with increased neutralization breadth
WO2024054929A1 (en) 2022-09-07 2024-03-14 Dynamicure Biotechnology Llc Anti-vista constructs and uses thereof
WO2024064826A1 (en) 2022-09-22 2024-03-28 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Neutralizing antibodies to plasmodium falciparum circumsporozoite protein and their use
TW202426505A (zh) 2022-10-25 2024-07-01 美商建南德克公司 癌症之治療及診斷方法
US20240165227A1 (en) 2022-11-04 2024-05-23 Gilead Sciences, Inc. Anticancer therapies using anti-ccr8 antibody, chemo and immunotherapy combinations
WO2024102734A1 (en) 2022-11-08 2024-05-16 Genentech, Inc. Compositions and methods of treating childhood onset idiopathic nephrotic syndrome
WO2024100200A1 (en) 2022-11-09 2024-05-16 Cis Pharma Ag Anti-l1-cam antibodies and their uses for diagnostic and therapeutic applications
US20240226313A1 (en) 2022-11-17 2024-07-11 Sanofi Ceacam5 antibody-drug conjugates and methods of use thereof
WO2024116094A1 (en) 2022-11-30 2024-06-06 Daiichi Sankyo Company, Limited Combination of antibody-drug conjugates and dnmt inhibitors
WO2024137381A1 (en) 2022-12-19 2024-06-27 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Monoclonal antibodies for treating sars-cov-2 infection
CN116200329B (zh) * 2023-02-22 2023-08-29 洛阳赛奥生物工程技术有限公司 一种无血清昆虫培养基及应用
WO2024184494A1 (en) 2023-03-08 2024-09-12 Ac Immune Sa Anti-tdp-43 binding molecules and uses thereof
WO2024211235A1 (en) 2023-04-05 2024-10-10 Sorrento Therapeutics, Inc. Antibody-drug conjugates and uses thereof
WO2024211234A1 (en) 2023-04-05 2024-10-10 Sorrento Therapeutics, Inc. Antibody-drug conjugates and uses thereof
WO2024211236A2 (en) 2023-04-05 2024-10-10 Sorrento Therapeutics, Inc. Antibody-drug conjugates and uses thereof
WO2024212827A1 (en) 2023-04-12 2024-10-17 Shanghai Kangabio Co., Limited Multifunctional molecules comprising masked interleukin 12 and methods of use
WO2024220546A2 (en) 2023-04-17 2024-10-24 Peak Bio, Inc. Antibodies and antibody-drug conjugates and methods of use and synthetic processes and intermediates

Family Cites Families (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5613352A (en) 1979-07-02 1981-02-09 Tokan Kogyo Co Ltd Easily openable container
DE3382838T2 (de) 1983-01-13 2004-04-15 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Transgene dicotyledone Pflanzenzellen und Pflanzen
NL8300698A (nl) 1983-02-24 1984-09-17 Univ Leiden Werkwijze voor het inbouwen van vreemd dna in het genoom van tweezaadlobbige planten; agrobacterium tumefaciens bacterien en werkwijze voor het produceren daarvan; planten en plantecellen met gewijzigde genetische eigenschappen; werkwijze voor het bereiden van chemische en/of farmaceutische produkten.
JPS60123857A (ja) 1983-12-09 1985-07-02 Konishiroku Photo Ind Co Ltd 画像形成方法
DE3585638D1 (de) 1984-05-11 1992-04-23 Ciba Geigy Ag Transformation von pflanzenerbgut.
ZA872705B (en) 1986-04-22 1987-10-05 Immunex Corporation Human g-csf protein expression
IL84459A (en) 1986-12-05 1993-07-08 Agracetus Apparatus and method for the injection of carrier particles carrying genetic material into living cells
EP0832981A1 (en) 1987-02-17 1998-04-01 Pharming B.V. DNA sequences to target proteins to the mammary gland for efficient secretion
JP2928287B2 (ja) 1988-09-29 1999-08-03 協和醗酵工業株式会社 新規ポリペプチド
JPH02257891A (ja) 1989-03-31 1990-10-18 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd 組換え動物細胞による蛋白質の製造
JPH0322979A (ja) 1989-06-19 1991-01-31 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd 新規プラスミノーゲン活性化因子
US5204253A (en) 1990-05-29 1993-04-20 E. I. Du Pont De Nemours And Company Method and apparatus for introducing biological substances into living cells
AU669124B2 (en) 1991-09-18 1996-05-30 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Process for producing humanized chimera antibody
JP3131322B2 (ja) 1991-12-17 2001-01-31 協和醗酵工業株式会社 新規α２→３シアリルトランスフェラーゼ
DK0604662T3 (da) 1992-07-07 2008-10-20 Japan Tobacco Inc Fremgangsmåde til transformering af monocotyledon
JP3154564B2 (ja) * 1992-09-07 2001-04-09 科学技術振興事業団 モノクローナル抗体の改変方法
ATE283926T1 (de) 1995-09-11 2004-12-15 Kyowa Hakko Kogyo Kk Antikörper gegen die alpha-kette von humanem interleukin 5 rezeptor
US6054304A (en) * 1996-01-24 2000-04-25 Toyo Boseki Kabushiki Kaisha α1-6 fucosyltransferase
EP0904101B1 (en) * 1996-04-10 2006-01-18 Neose Technologies, Inc. Nucleic acids encoding gdp-fucose pyrophosphorylase
US5728568A (en) * 1996-11-22 1998-03-17 Genetics Institute, Inc. Human GDP-mannose 4,6 dehydratase
JP4550947B2 (ja) * 1997-03-19 2010-09-22 協和発酵キリン株式会社 ガングリオシドｇｍ２に対するヒト型相補性決定領域（ｃｄｒ）移植抗体
DE69942021D1 (de) 1998-04-20 2010-04-01 Glycart Biotechnology Ag Glykosylierungs-engineering von antikörpern zur verbesserung der antikörperabhängigen zellvermittelten zytotoxizität
JP3991294B2 (ja) 1998-05-06 2007-10-17 株式会社ヴァレオサーマルシステムズ 自動車用空気調和装置のファンユニット
US20020012979A1 (en) * 1998-06-08 2002-01-31 Alan Berry Vitamin c production in microorganisms and plants
DK2270147T4 (da) * 1999-04-09 2020-08-31 Kyowa Kirin Co Ltd Fremgangsmåde til at kontrollere aktiviteten af immunologisk funktionelt molekyle
JP2000308526A (ja) 1999-04-28 2000-11-07 Yoshihiro Inomura 鐙型ブラシ
EP1992644A1 (en) 2000-03-03 2008-11-19 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Antibodies against CCR4 and its fragments
JP5623683B2 (ja) * 2000-03-22 2014-11-12 フィトン ホールディングス，リミティド ライアビリティ カンパニー 動物型糖鎖付加機能をもつ植物細胞
EP3263702A1 (en) 2000-10-06 2018-01-03 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Cells producing antibody compositions
JPWO2005035578A1 (ja) * 2003-10-09 2007-11-22 協和醗酵工業株式会社 ガングリオシドｇｍ２に特異的に結合する抗体組成物
JP6109648B2 (ja) * 2013-05-29 2017-04-05 株式会社ぐるなび 鉄道を利用した商品販売支援システム

Also Published As

Publication number Publication date
ES2639222T5 (es) 2023-11-24
JP2011092203A (ja) 2011-05-12
JP6270930B2 (ja) 2018-01-31
EA200300443A1 (ru) 2003-10-30
CN103333860B (zh) 2015-07-08
JP5384677B2 (ja) 2014-01-08
EP2314686A1 (en) 2011-04-27
JP4741011B2 (ja) 2011-08-03
KR20030081312A (ko) 2003-10-17
HUP0402066A2 (hu) 2005-01-28
AU2001294198C1 (en) 2019-04-04
EP2314685B1 (en) 2017-09-20
EP2314686B2 (en) 2023-06-21
BR0114475A (pt) 2003-12-23
CA2424602C (en) 2012-09-18
CN1894406A (zh) 2007-01-10
HUS2000035I1 (hu) 2022-11-28
JP2009142288A (ja) 2009-07-02
JP6523404B2 (ja) 2019-05-29
ES2639222T3 (es) 2017-10-25
JP2016185163A (ja) 2016-10-27
JP6010147B2 (ja) 2016-10-19
CN102311986A (zh) 2012-01-11
JP5301525B2 (ja) 2013-09-25
EA200600469A1 (ru) 2006-08-25
CA2424602A1 (en) 2003-04-02
EP1331266A1 (en) 2003-07-30
PL362520A1 (en) 2004-11-02
EA013224B1 (ru) 2010-04-30
EP1331266A4 (en) 2005-07-13
EP2314686B1 (en) 2017-07-05
JP5547754B2 (ja) 2014-07-16
PL218428B1 (pl) 2014-12-31
DK2314686T3 (en) 2017-09-11
CN103333860A (zh) 2013-10-02
WO2002031140A1 (fr) 2002-04-18
JP5384601B2 (ja) 2014-01-08
CA2785941A1 (en) 2002-04-18
EP3263702A1 (en) 2018-01-03
ES2651952T3 (es) 2018-01-30
AU9419801A (en) 2002-04-22
CN102311986B (zh) 2015-08-19
JP2012087131A (ja) 2012-05-10
MXPA03002974A (es) 2004-05-05
JP5770783B2 (ja) 2015-08-26
CA2953239A1 (en) 2002-04-18
JP2012075441A (ja) 2012-04-19
ES2620359T3 (es) 2017-06-28
AU2001294198B2 (en) 2007-11-29
AU2001294198B9 (en) 2008-08-07
DK2314686T4 (da) 2023-08-21
KR100877676B1 (ko) 2009-01-09
EA013563B1 (ru) 2010-06-30
EP3690043A1 (en) 2020-08-05
JP4290423B2 (ja) 2009-07-08
EP1331266B1 (en) 2017-01-04
JP2013231032A (ja) 2013-11-14
CA2785941C (en) 2017-01-10
JP2015131807A (ja) 2015-07-23
JP5815641B2 (ja) 2015-11-17
HUP0402066A3 (en) 2012-09-28
JPWO2002031140A1 (ja) 2004-02-19
JP2012085655A (ja) 2012-05-10
JP2018078890A (ja) 2018-05-24
JP2014043455A (ja) 2014-03-13
JP4740931B2 (ja) 2011-08-03
JP2008113663A (ja) 2008-05-22
EP2314685A1 (en) 2011-04-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU231090B1 (hu) Antitest-kompozíciót termelő sejt
US7749753B2 (en) Cells in which activity of the protein involved in transportation of GDP-fucose is reduced or lost
US7741442B2 (en) Antibody composition exhibiting increased cellular cytotoxicity due to glycosylation
EP1498490A1 (en) Process for producing antibody composition
WO2003084569A1 (fr) Medicament contenant une composition anticorps
AU2003236018A1 (en) METHOD OF ENHANCING ACTIVITY OF ANTIBODY COMPOSITION OF BINDING TO FcGamma RECEPTOR IIIa
AU2008200981A1 (en) Cells producing antibody compositions

Legal Events

Date Code Title Description
HC9A Change of name, address

Owner name: KYOWA HAKKO KIRIN CO., LTD., JP

Free format text: FORMER OWNER(S): KYOWA HAKKO KOGYO CO. LTD., JP

HC9A Change of name, address

Owner name: KYOWA KIRIN CO., LTD., JP

Free format text: FORMER OWNER(S): KYOWA HAKKO KOGYO CO. LTD., JP; KYOWA HAKKO KIRIN CO., LTD., JP

AA1S Information on application for a supplementary protection certificate

Spc suppl protection certif: S2000035

Filing date: 20200827

Expiry date: 20211005

FG4S Grant of supplementary protection certificate

Spc suppl protection certif: S2000035

Filing date: 20200827

Expiry date: 20211005

Extension date: 20261005