BR112012006388B1

BR112012006388B1 - Método para produzir uma molécula, e, método para produzir uma proteína

Info

Publication number: BR112012006388B1
Application number: BR112012006388-0A
Authority: BR
Inventors: Hans Henning Von Horsten; Christiane Ogorek
Original assignee: Probiogen Ag
Priority date: 2009-09-22
Filing date: 2010-09-21
Publication date: 2022-01-04
Also published as: JP2013505028A; AU2010297580A1; CN102648280A; US20120214975A1; SG178925A1; CA2773240C; US8642292B2; EA201200516A1; CA2773240A1; MX2012003404A; CN102648280B; JP5746183B2; EP2480671B8; BR112012006388A2; EP2480671A1; EP2480671B1; AU2010297580B2; KR101545914B1; MY160680A; IL218485A

Abstract

célula de vertebrado para produzir uma mólecula, método para produzir uma molécula, molécula, composição, proteína ou lipídeo, unidade de expressão, célula eucariótica para produzir uma proteína, e, método para produzir uma proteína. a presente invenção diz respeito às células para produzir uma molécula que carece de fucose, tendo uma quantidade reduzida de fucose, ou tendo outros açúcares atípicos nas suas glicoporções. a mesma também diz respeito a métodos para produzir uma molécula que carece de fucose, tendo uma quantidade reduzida de fucose, ou tendo outros açúcares atípicos nas suas glicoporções usando as ditas células e às moléculas obteníveis pelos ditos métodos. a presente invenção diz respeito ainda às moléculas tendo um padrão de glicosilação artificial.

Description

[001] A presente invenção diz respeito a células para produzir uma molécula que carece de fucose, tendo uma quantidade reduzida de fucose, ou tendo outros açúcares atípicos nas suas glicoporções. A mesma também diz respeito a métodos para produzir uma molécula que carece de fucose, tendo uma quantidade reduzida de fucose, ou tendo outros açúcares atípicos nas suas glicoporções que usam as ditas células e às moléculas obteníveis pelos ditos métodos. A presente invenção diz respeito ainda às moléculas tendo um padrão de glicosilação artificial.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[002] As moléculas glicosiladas terapêuticas intencionadas para o uso em seres humanos devem ter padrões de glicosilação complexos similares a aqueles encontrados nos seres humanos. Portanto, as células de animal são no geral usadas para produzir moléculas glicosiladas terapêuticas, tais como proteínas, ou lipídeos, onde é desejável que as moléculas glicosiladas têm um padrão de glicosilação complexo, equivalente ao humano. A estrutura e complexidade de glicanos severamente afeta a função in vivo da biomolécula por intermédio da modulação da meia vida, ligação de receptor, indução ou supressão de reações imunes.

[003] As cadeias de açúcar dos glicolipídeos são complexas e podem conter uma quantidade significante de fucose (PNAS 1985; 82: 3045-3049). As cadeias de açúcar de glicoproteínas são a grosso modo divididas em dois tipos, a saber cadeias de açúcar que se ligam a asparagina (cadeia de açúcar ligada a N-glicosídeo) e cadeias de açúcar que se ligam a outro aminoácido tal como serina, treonina (cadeia de açúcar ligada a O-glicosídeo), com base na forma de ligação à porção de proteína.

[004] As cadeias de açúcar ligadas a N-glicosídeo têm várias estruturas (Biochemical Experimentation Method 23 - Method for Studying Glycoprotein Sugar Chain (Gakujutsu Shuppan Center), editado por Reiko Takahashi (1989)), mas é conhecido que elas têm uma estrutura de núcleo comum básica. O terminal da cadeia de açúcar que se liga à asparagina é chamado de uma extremidade redutora, e o lado oposto é chamado de uma extremidade não redutora. A cadeia de açúcar ligada a N-glicosídeo inclui um tipo de manose alta em que a manose sozinha se liga à extremidade não redutora da estrutura de núcleo; um tipo complexo em que o lado da extremidade não redutora do núcleo de trimanose tipicamente tem pelo menos uma galactose-N-acetil-glicosamina (daqui em diante aludida como Gal- GlcNAc) ligada a cada um dos dois ramos (1,3 e 1,6) da manose. O lado da extremidade não redutora de Gal-GlcNAc pode conter galactose e ácido siálico, dividindo ao meio a N-acetilglicosamina ou seu semelhante. Em um tipo híbrido o lado da extremidade não redutora da estrutura de núcleo tem ramificações tanto do tipo de manose alta quanto do tipo complexo. Em glicanos de células de vertebrado a fucose pode ser ligada ao GlcNAc de antena por intermédio de uma ligação alfa 1,3 (fucose terminal) ou ao GlcNAc ligado à asparagina por intermédio de uma ligação alfa 1,6 (fucose de núcleo). As células de inseto produzem glicanos que podem conter fucose de núcleo ligada em 1,3.

[005] A porção de oligossacarídeo de proteínas N-glicosiladas é inicialmente biossintetizada a partir de oligossacarídeos ligados a lipídeo para formar um Glc3Man9GlcNAc2-pirofosforil-dolichol que é depois transferido para asparagina que ocorre na sequência de tripeptídeo Asn-X-Ser ou Thr, onde X pode ser qualquer aminoácido exceto Pro, de uma proteína no retículo endoplasmático (ER). Depois disso, a proteína é transportada para o aparelho de Golgi, onde a porção de oligossacarídeo é processada ainda na seguinte sequência: Primeiro, todos os três resíduos de glicose (Glc) são removidos pelas glicosidases I e II para produzir a Man9GlcNAc2-proteína. A estrutura Man9GlcNAc2 pode ser processada ainda pela remoção de vários resíduos de manose (Man). Inicialmente, quatro manoses ligadas em α-1,2 são removidas para dar uma Man5GlcNAc2-proteína que é depois encompridada pela adição de um resíduo de N-acetilglicosamina (GlcNAc). Esta nova estrutura, a GlcNAcMan5GlcNAc2-proteína, é o substrato para a manosidase II que remove as manoses ligadas em α-1,3- e α-1,6-. Depois disso, os outros açúcares, GlcNAc, galactose, fucose e ácido siálico, são adicionados sequencialmente para dar os tipos complexos de estruturas frequentemente encontradas nas proteínas N-glicosiladas.

[006] Uma molécula de IgG, por exemplo, contém um oligossacarídeo ligado em N covalentemente ligado na Asn297 conservada de cada um dos domínios CH2 na região Fc. Os oligossacarídeos encontrados na região Fc de IgGs séricas são principalmente glicanos biantenários do tipo complexo. As variações de padrões de glicosilação de IgG que incluem a ligação de ácido siálico terminal (NeuAc), um terceiro ramo GlcNac (GlcNAc dividido em duas partes), uma galactosilação terminal (G), e fucosilação de núcleo ligado em α-1,6 (F) à estrutura de núcleo: 2x N-Acetilglicosamina (GlcNAc) e 3x manose (Man) (GlcNAc2Man3). O padrão exato de glicosilação depende das propriedades estruturais de subcomponentes de IgG, em particular, os domínios CH2 e CH3 (Lund et al. (2000) Eur. J. Biochem., 267: 7246-7257).

[007] As células de animal e humanas têm fucosiltransferases que adicionam um resíduo de fucose ao resíduo de GlcNAc na extremidade redutora dos N-glicanos em uma proteína ou a outras glicoestruturas nascentes nos glicolipídeos. A fucosilação de glicoporções ligadas a proteína ou lipídeo requer um açúcar de nucleotídeo, GDP-L-fucose, como um doador e também a presença de fucosil transferases particulares, que transferem o resíduo de fucosila do doador para a molécula aceitadora (Becker e Lowe, 1999). Nas células eucarióticas de GDP-L-fucose podem ser sintetizadas por intermédio de dois caminhos diferentes, pelo caminho da fucose mais proeminente de novo ou pelo caminho de recuperação menor (Becker e Lowe, 1999). O caminho de recuperação ou caminho “limpador” é uma fonte menor de GDP-L-fucose (cerca de 10 %) que pode ser facilmente bloqueada pela omissão de fucose livre e glicoproteínas fucosiladas do meio de cultura. O caminho de recuperação começa da Fucose extracelular que pode ser transportada no compartimento citossólico por intermédio de transportadores de membrana plasmática específica de fucose. Alternativamente, a fucose clivada das glicoproteínas submetidas à endocitose podem entrar no citosol. A L-fucose citossólica é fosforilada pela fucocinase para fucose-1-fosfato e depois convertida pela GDP-Fucose Pirofosforilase para GDP-L-fucose (Fig. 1, painel à direita). Experimentos de cultura de célula sugerem que o caminho de recuperação realiza uma contribuição relativamente menor para as reuniões de GDP-L-fucose citossólica (Becker e Lowe, 1999).

[008] O caminho de novo da fucose mais proeminente começa da GDP-D-manose e consiste de uma GDP-manose desidratase (GMD) e GDP- ceto-desóxi-manose-epimerase/GDP-ceto-desóxi-galactose-redutase (GMER, também conhecido como Fx nos seres humanos), ambos localizados no citoplasma, que de comum acordo converte GDP-manose para GDP-L-fucose (Fig. 1, painel à esquerda). Mais tarde, a GDP-L-fucose é transportada no complexo de Golgi por intermédio de um transportador de GDP-fucose localizado na membrana do complexo de complexo de Golgi. Uma vez que a GDP-L-fucose tenha entrado no compartimento luminal do complexo de Golgi, as fucosiltransferases podem covalentemente ligar a GDP-L-fucose às glicoporções nascentes dentro do complexo de Golgi. Em particular, a Fucosiltransferase (Fut8) transfere o resíduo de fucose por meio de uma ligação 1,6 para a posição 6 do resíduo de GlcNAc na extremidade redutora do N-glicano.

[009] A falta de fucose nas glicoproteínas foram mostradas ter vantagens específicas. Por exemplo, em anticorpos monoclonais, imunoglobulinas, e moléculas relacionadas, foi mostrado que a ausência do açúcar de fucose de núcleo do N-glicano ligado a Asn297 da porção Fc (domínio CH2) de imunoglobulinas aumenta ou altera a sua ligação aos receptores Fc. Os tipos diferentes de regiões constantes ligam receptores Fc diferentes. Os exemplos incluem a ligação dos domínios IgG1 Fc aos receptores Fc cognatos CD16 (FCYRIII), CD32 (FCYRII-B1 e -B2), ou CD64 (FCYRI), a ligação de domínios Fc de IgA ao receptor de Fc cognato CD89 (FcαRI), e a ligação dos domínios de IgE aos receptores de Fc cognatos FcεFR1 ou CD23. A ligação ao FCYRIII que está presente na superfície de uma das células NK é fortemente aumentada. (Shields et al. JBC 277 (30): 26733. (2002)).

[0010] Um modo dominante de ação de anticorpos terapêuticos é a citotoxicidade Dependente de Anticorpo (daqui em diante aludida como “atividade ADCC”). A ligação de anticorpo a uma célula alvo (uma célula de tumor ou uma célula infectada com um patógeno) com a sua porção de Fab é reconhecido na sua porção de Fc pelo receptor de Fc de uma célula efetora, tipicamente uma célula NK. Uma vez ligada a célula efetora libera citocinas tais como IFN-Y, e grânulos citotóxicos contendo perforina e granzimas que entram na célula alvo induzindo a morte da célula. A afinidade de ligação ao FcyRIII é crítica para os anticorpos que atuam através da ATCC. Os carregadores de um alelo de baixa afinidade do receptor respondem insuficientemente aos anticorpos terapêuticos tais como Rituximab (Cartron et al. Blood 99: 754-758).

[0011] Consequentemente, a afinidade mais alta para FcyRIII mediada pela ausência de fucose de núcleo no glicano Fc pode aumentar a potência ou reduzir a dose eficaz de produto bioterapêutico com implicações maiores para o benefício clínico e custo.

[0012] De modo a modificar a estrutura da cadeia de açúcar da glicoproteína produzida, vários métodos foram tentados, tais como 1) aplicação de um inibidor contra uma enzima relacionada com a modificação de uma cadeia de açúcar, 2) silenciamento homozigoto de um gene envolvido na síntese ou transferência de açúcar 3) seleção de um mutante, 3) introdução de um gene que codifica uma enzima relacionada com a modificação de um cadeia de açúcar, e os seus semelhantes. Os exemplos específicos são descritos abaixo.

[0013] Os exemplos de inibidores contra enzimas relacionadas com a modificação de uma cadeia de açúcar incluem castanospermina e N-metil-1- desoxinojirimicina que são inibidores da glicosidase I, bromocondulitol que é um inibidor da glicosidase II, 1-desoxinojirimicina e 1,4-dióxi-1,4-imino-D- manitol que são inibidores de manosidase I, suainsonina que é um inibidor da manosidase II e os seus semelhantes. Os exemplos de um inibidor específico para uma glicosiltransferase incluem derivados de desóxi de substratos contra a N-acetilglicosamina transferase V (GnTV) e os seus semelhantes.

[0014] Mutantes de enzimas relacionadas com a modificação de cadeias de açúcar foram principalmente selecionados e obtidos a partir de uma linhagem de célula resistente à lectina. Por exemplo, mutantes de célula CHO foram obtidos de uma linhagem de célula resistente à lectina que usa uma lectina tal como WGA (aglutinina de germe de trigo derivada de T. vulgaris), ConA (cocanavalina um derivado de C. ensiformis), RIC (uma toxina derivada de R. communis), L-PHA (leucoaglutinina derivada de P. vulgaris), LCA (aglutinina de lentilha derivada de L. culinaris), PSA (lectina de ervilha derivada de P. sativum) ou seu semelhante.

[0015] Além disso, vários métodos para produzir anticorpos recombinantes que carecem de fucose foram relatados. Uma das enzimas mais importantes que permitem a fucosilação de núcleo de N-glicoporções é a α- 1,6-fucosiltransferase 8 (Fut8). A dita enzima catalisa a ligação de fucose à posição 6 de N-acetilglicosamina na extremidade redutora através de uma ligação α em um pentanúcleo de cadeia de açúcar ligada a N-glicosídeo de um N-glicano de tipo complexo (WO 00/61739). Os anticorpos com teor de fucose reduzido também foram obtidos usando uma célula em que a expressão dos genes transportadores de fucose é artificialmente suprimido (US 20090061485). A introdução de RNA capaz de suprimir a função de α- 1,6-fucosiltransferase também foi descrito para levar à produção de moléculas de anticorpo que carece de fucose (EP 1 792 987 A1).

[0016] Muitas das células ou métodos propostos para produzir moléculas tendo um padrão de glicosilação modificado, que podem ser usados para indicações terapêuticas, têm desvantagens significantes. Por exemplo, o tratamento de anticorpos com enzimas que removem glicosilações, por exemplo fucosidases para remover resíduos de fucose, envolve as etapas de fabricação adicionais com são caras, demoradas e que têm riscos econômicos e de compatibilidade de medicamento potencialmente significantes. Além disso, o engendramento molecular da linhagem de células para silenciar as enzimas chaves envolvidas na síntese de glicoproteínas é entediante, caro e nem sempre coroado com sucesso. Além disso, as ditas linhagens de célula têm a desvantagem de que elas não permitem a produção “ajustável” de moléculas com potência de ADCC ou CDC variáveis para otimizar a eficácia e segurança para um uso terapêutico. O tratamento de linhagens de célula com RNAi ou moléculas de anti-sentido para silenciar o nível de enzimas chave envolvidas na síntese de glicoproteínas pode ter efeitos fora do alvo não prognosticáveis, é caro e parece ser impraticável para implementação na escala de fabricação.

[0017] Assim, existe uma necessidade quanto a novas células e métodos vantajosos para a produção de moléculas com um padrão de glicosilação modificado tendo propriedades melhoradas para usos terapêuticos.

[0018] A presente invenção fornece células para a produção de moléculas tendo um padrão de glicosilação modificado, isto é, moléculas que carecem de fucose, têm uma quantidade reduzida de fucose ou têm outros açúcares atípicos nas suas estruturas de glicano. A mesma também fornece métodos para a produção de moléculas tendo um padrão de glicosilação modificado, isto é, moléculas que carecem de fucose, têm uma quantidade reduzida de fucose ou têm outros açúcares artificiais nas suas estruturas de glicano, que usam as ditas células. As ditas moléculas têm propriedades melhoradas para usos terapêuticos, por exemplo atividade de ADCC ou CDC aumentada, capacidade realçada para inibir eventos de sinalização, capacidade aumentada para induzir a apoptose, e/ou capacidade aumentada para a terapia imune. Além disso, as células e métodos fornecidos pela presente invenção permitem a produção ajustável, confiável, barata e direta de moléculas tendo um padrão de glicosilação modificado, isto é, moléculas que carecem de fucose, tendo uma quantidade reduzida de fucose ou tendo outros açúcares artificiais nas suas estruturas de glicano. Além disso, a presente invenção fornece métodos que são adequados para aumentar a fabricação.

[0019] Em muitos casos, tempo considerável tem sido investido e esforços imensos têm sido feitos para gerar e desenvolver linhagens de célula produtoras eficazes que expressem o transgene de interesse em níveis desejáveis. Em casos onde o transgene de interesse é um anticorpo terapêuticos que pode se beneficiar da função efetora de ADCC realçada, seria desejável manipular ainda a linhagem de célula produtora em um tal modo que a célula produtora alta seja incapaz de ligar a fucose de núcleo às N-glicoporções ou seja capaz de ligar açúcares artificiais às N-glicoporções.

[0020] A presente invenção fornece uma unidade de expressão que pode ser facilmente aplicada às células geneticamente engendradas já existentes em um modo que as tornam incapazes de ligar fucose às glicoestruturas nascentes de glicoproteínas ou que as tornam capazes de ligar outros açúcares artificiais além da fucose às glicoestruturas nascentes de glicoproteínas, por exemplo de modo a produzir anticorpos tendo uma atividade ADCC melhorada.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0021] Em um primeiro aspecto, a presente invenção diz respeito a uma célula de vertebrado para produzir uma molécula, que naturalmente compreende fucose nas suas glicoporções, que carece de fucose ou tendo uma quantidade reduzida de fucose nas suas glicoporções que compreende pelo menos uma enzima que usa GDP-6-desóxi-D-lixo-4-hexulose como um substrato, em que a enzima não catalisa a reação que converte GDP-6-desóxi- D-lixo-4-hexulose na GDP-L-fucose.

[0022] Em um segundo aspecto, a presente invenção diz respeito a um método para produzir uma molécula, que naturalmente compreende fucose nas suas glicoporções, que carece de fucose ou tendo uma quantidade reduzida de fucose nas suas glicoporções que compreendem as etapas de: i) fornecer uma célula de vertebrado de acordo com o primeiro aspecto, ii) isolar a molécula que é capaz de ser um substrato para uma fucosiltransferase, preferivelmente uma proteína ou lipídeo, da célula em i).

[0023] Em um terceiro aspecto, a presente invenção diz respeito a uma molécula que carece de fucose ou tendo uma quantidade reduzida de fucose nas suas glicoporções obteníveis pelo método do segundo aspecto.

[0024] Em um quarto aspecto, a presente invenção diz respeito a uma molécula que compreende glicoporções contendo D-ramnose, D-perosamina, desóxi-D-talose, 6-desóxi-D-altrose, 4-ceto-3,6-didesóxi-D-manose, e/ou L- colitose obteníveis pelo método do segundo aspecto.

[0025] Em um quinto aspecto, a presente invenção diz respeito a uma composição que compreende glicoproteínas que compreendem i) entre 70 e 95 % de N-glicanos do tipo complexo G0 - GlcNac, G0, G1, e/ou G2, e ii) entre 5 e 30 % N-glicanos do tipo manose alta, em que os N-glicanos do tipo complexo são isentos de fucose ou substancialmente isentos de fucose.

[0026] Em um sexto aspecto, a presente invenção diz respeito a uma proteína ou lipídeo que compreende glicoporções contendo D-ramnose, D- perosamina, desóxi-D-talose, 6-desóxi-D-altrose, 4-ceto-3,6-didesóxi-D- manose, e/ou L-colitose.

[0027] Em um sétimo aspecto, a presente invenção diz respeito a uma unidade de expressão que compreende: i) uma ou mais sequências de controle de expressão de vertebrado, e ii) um polinucleotídeo que compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica uma enzima que usa GDP-6-desóxi-D-lixo-4- hexulose como um substrato, em que a enzima não catalisa a reação que converte GDP-6- desóxi-D-lixo-4-hexulose na GDP-L-fucose.

[0028] Em um oitavo aspecto, a presente invenção diz respeito a uma célula eucariótica para produzir uma proteína, que normalmente compreende fucose nas suas glicoporções, que carece de fucose ou tendo uma quantidade reduzida de fucose nas suas glicoporções que compreende: i) um primeiro polinucleotídeo que compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica uma enzima que usa GDP-6-desóxi- D-lixo-4-hexulose como um substrato, e ii) um segundo polinucleotídeo que compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína, em que a enzima não catalisa a reação que converte GDP-6- desóxi-D-lixo-4-hexulose na GDP-L-fucose.

[0029] Em um nono aspecto, a presente invenção diz respeito a um método para produzir uma proteína, que normalmente compreende fucose nas suas glicoporções, que carece de fucose ou tendo uma quantidade reduzida de fucose nas suas glicoporções que compreende: i) fornecer uma célula eucariótica de acordo com o oitavo aspecto, ii) expressar a enzima codificada pelo primeiro polinucleotídeo e a proteína codificada pelo segundo polinucleotídeo na dita célula, e iii) isolar a proteína da dita célula.

[0030] Em um décimo aspecto, a presente invenção diz respeito a uma proteína que carece de fucose ou tendo uma quantidade reduzida de fucose nas suas glicoporções obteníveis pelo método do nono aspecto.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0031] Antes que a presente invenção seja descrita em detalhes abaixo, deve ser entendido que esta invenção não é limitada à metodologia, protocolos e reagentes particulares aqui descritos visto que estes podem variar. Também deve ser entendido que a terminologia aqui usada é apenas para o propósito de descrever formas de realização particulares, e não é intencionada a limitar o escopo da presente invenção que será limitada apenas pelas reivindicações anexas. A menos que de outro modo definido, todos os termos técnicos e científicos aqui usados têm os mesmos significados como habitualmente entendidos por uma pessoa de habilidade comum na técnica.

[0032] Preferivelmente, os termos aqui usados são definidos como descrito em “A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)”, Leuenberger, H.G.W, Nagel, B. e Kolbl, H. eds. (1995), Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Suíça).

[0033] Por todo este relatório descritivo e as reivindicações que seguem, a menos que o contexto requeira de outro modo, a palavra “compreender”, e variações tais como “compreende” e “que compreende”, serão entendidas implicar a inclusão de um número inteiro estabelecido ou etapa ou grupo de números inteiros ou etapas mas não a exclusão de nenhum outro número inteiro ou etapa ou grupo de número inteiro ou etapa.

[0034] Vários documentos são citados por todo o texto deste relatório descritivo. Cada um dos documentos aqui citados (que incluem todas as patentes, pedidos de patente, publicações científicas, especificações do fabricante, instruções, Submissões de sequência de Número de Acesso no GenBank, etc.), seja supra ou infra, é por meio deste incorporado por referência em sua totalidade. Nada aqui deve ser interpretado como uma admissão de que a invenção não é intitulada to antedate tal divulgação em virtude da invenção anterior.

[0035] No que segue, os elementos da presente invenção serão descritos. Estes elementos são listados com as formas de realização específicas, entretanto, deve ser entendido que os mesmos podem ser combinados de qualquer maneira e em qualquer número para criar formas de realização adicionais. Os exemplos e formas de realização preferidas variadamente descritos não devem ser interpretados como limitando a presente invenção apenas às formas de realização explicitamente descritas. Esta descrição deve ser entendida sustentar e abranger as formas de realização que combinam as formas de realização explicitamente descritas com qualquer número dos elementos divulgados e/ou preferidos. Além disso, quaisquer permutas e combinações de todos os elementos descritos neste pedido devem ser consideradas divulgadas pela descrição do presente pedido a menos que o contexto indique de outro modo.

[0036] O termo “compreender” ou variações tais como “compreende” ou “que compreende” de acordo com a presente invenção significam a inclusão de um número inteiro estabelecido ou grupo de números inteiros mas não a exclusão de qualquer outro número inteiro ou grupo de números inteiros. O termo “que consiste essencialmente de” de acordo com a presente invenção significa a inclusão de um número inteiro estabelecido ou grupo de números inteiros, enquanto se exclui modificações ou outros números inteiros que materialmente afetariam ou alterariam o número inteiro estabelecido. O termo “consistindo de” ou variações tais como “consiste de” de acordo com a presente invenção significa a inclusão de um número inteiro estabelecido ou grupo de números inteiros e a exclusão de qualquer outro número inteiro ou grupo de números inteiros.

[0037] No contexto da presente invenção, o termo “oligopeptídeo” refere-se a uma cadeia ligada a peptídeo curta de aminoácidos, por exemplo um que é tipicamente menor do que cerca de 50 aminoácidos de comprimento e mais tipicamente menor do que cerca de 30 aminoácidos de comprimento.

[0038] Os termos “polipeptídeo” e “proteína” são usados intercambiavelmente no contexto da presente invenção e refere-se a uma cadeia ligada a peptídeo longa de aminoácidos, por exemplo uma que tenha tipicamente 50 aminoácidos de comprimento ou mais longa do que 50 aminoácidos.

[0039] O termo “fragmento de polipeptídeo” como usado no contexto da presente invenção refere-se a um polipeptídeo que tem uma deleção, por exemplo uma deleção de terminal amino, e/ou uma deleção de terminal carbóxi, e/ou uma deleção internamente comparada a um polipeptídeo de tamanho natural.

[0040] No contexto da presente invenção, o termo “proteína de fusão” refere-se a um polipeptídeo que compreende um polipeptídeo ou fragmento de polipeptídeo ligado às sequências de aminoácido heterólogas. As proteínas de fusão são úteis porque elas podem ser construídas para conter dois ou mais elementos funcionais desejados de duas ou mais proteínas diferentes.

[0041] Os termos “anticorpo”, “imunoglobulina”, “Ig” e “molécula de Ig” são usados intercambiavelmente no contexto da presente invenção. O domínio CH2 de cada cadeia pesada contém um único sítio para a glicosilação ligada a N em um resíduo de asparagina que liga um N-glicano à molécula de anticorpo, usualmente em resíduo Asn-297 (Kabat et al., Sequence of proteins of immunological interest, Quinto Ed., U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication NO 91-3242). Incluído dentro do escopo do termo estão as classes de Igs, a saber, IgG, IgA, IgE, IgM, e IgD. Também incluído dentro do escopo dos termos são os subtipos de IgGs, a saber, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Os termos são usados no seu sentido mais amplo e incluem anticorpos monoclonais (que incluem anticorpos monoclonais de tamanho natural), anticorpos policlonais, anticorpos de cadeia única, e anticorpos multiespecíficos (por exemplo anticorpos biespecíficos).

[0042] O termo “fragmento de anticorpo” como usado no contexto da presente invenção refere-se a um fragmento de um anticorpo que contém pelo menos a porção do domínio CH2 da região constante de cadeia pesada da imunoglobulina que compreende um sítio de glicosilação ligado em N do domínio CH2 e é capaz de ligação específica a um antígeno, isto é cadeias de pelo menos uma cadeia de VL e/ou VH ou parte de ligação destas.

[0043] Os termos “domínio Fc” e “região Fc” refere-se a uma porção de terminal C de uma cadeia pesada de anticorpo que interage com os receptores de superfície celular chamados de receptores Fc e algumas proteínas do sistema de complemento. Esta propriedade permite que os anticorpos ativem o sistema imune.

[0044] No contexto da presente invenção, o termo “glicoproteína” refere-se às proteínas que contêm cadeias de oligossacarídeo (glicanos) covalentemente ligadas às suas cadeias laterais de polipeptídeo. O carboidrato é ligado à proteína em uma modificação co-translacional ou pós-translacional. Este processo é conhecido como glicosilação tal como N-glicosilação ou O- glicosilação.

[0045] A “N-glicosilação” significa a adição de cadeias de açúcar ao nitrogênio da amida na cadeia lateral de asparagina. A “O-glicosilação” significa a adição de cadeias de açúcar no oxigênio da hidroxila na cadeia lateral de hidroxilisina, hidroxiprolina, serina, ou treonina.

[0046] O termo “glicolipídeo” como usado no contexto da presente invenção refere-se a lipídeos ligados a carboidrato. Eles ocorrem onde uma cadeia de carboidrato está associada com fosfolipídeos na superfície exoplásmica da membrana celular. Os carboidratos são encontrados na superfície externa de todas as membranas de célula eucariótica. A estrutura do carboidrato do glicolipídeo é controlada pelas glicosiltransferases que adicionam os lipídeos e glicosilhidrolases que modificam o glicano depois da adição. Os glicolipídeos também ocorrem na superfície de vírus envelopados que incluem aqueles usados como vacinas vivas atenuadas.

[0047] Os termos “glicano” ou “glicoporção” são usados intercambiavelmente no contexto da presente invenção para se referir a um polissacarídeo ou oligossacarídeo. O termo “oligossacarídeo” significa um polímero de sacarídeo contendo um número pequeno (tipicamente de três a dez) de açúcares componentes, também conhecidos como açúcares simples ou monossacarídeos. O termo “polissacarídeo” significa uma estrutura de carboidrato polimérico, formada de unidades de repetição (mono- ou dissacarídeos, tipicamente > 10) unidos entre si pelas uniões glicosídicas. Os glicanos podem ser encontrados ligados às proteínas como nas glicoproteínas ou ligados a lipídeos como nos glicolipídeos. Os termos abrangem N- glicanos, tais como N-glicanos do tipo manose alta, N-glicanos do tipo complexo ou N-glicanos tipo híbrido, O-glicanos ou

[0048] No contexto da presente invenção, os seguintes monossacarídeos são abreviados como segue: Glicose = Glc, Galactose = Gal, Manose = Man, Fucose = Fuc ou F, N-acetilgalactosamina = GalNAc, ou N- acetilglicosamina = GlcNAc.

[0049] Um “N-glicano” significa um polissacarídeo ou oligossacarídeo ligado em N. Um oligossacarídeo ligado em N é por exemplo um que é ou foi ligado por um resíduo de N-acetilglicosamina ligado ao nitrogênio da amida de um resíduo de asparagina em uma proteína. Os açúcares predominantes encontrados nas N-glicoproteínas são glicose, galactose, manose, fucose, N-acetilgalactosamina (GalNAc), N- acetilglicosamina (GlcNAc) e ácido siálico (por exemplo, ácido N-acetil- neuramínico (NANA)). O processamento dos grupos de açúcar ocorre co- translacionalmente no lúmen do ER e continua no complexo de Golgi for ligado em N glicoproteínas. N-glicanos têm um núcleo de pentassacarídeo de núcleo de Man3GlcNAc2 (“Man” refere-se a manose; “Glc” refere-se a glicose; e “NAc” refere-se a N-acetila; GlcNAc refere-se a N- acetilglicosamina). Os N-glicanos diferem com respeito ao número de ramificações (antenas) que compreendem açúcares periféricos (por exemplo, GlcNAc, galactose, fucose e ácido siálico) que são adicionados à estrutura de núcleo Man3GIcNAc2 que é também aludida como o “núcleo de trimanose”, o “núcleo de pentassacarídeo” ou o “núcleo de paucimanose”. Os N-glicanos são classificados de acordo com seus constituintes ramificados (por exemplo, manose alta, complexo ou híbrido).

[0050] Um “N-glicano tipo manose alta” significa um polissacarídeo ou oligossacarídeo ligados em N que tem cinco resíduos de manose (Man5), ou mais resíduos de manose (por exemplo Man6, Man7, ou Man8).

[0051] Um “N-glicano tipo complexo” significa um polissacarídeo ou oligossacarídeo ligados em N que tipicamente tem pelo menos um GlcNAc ligado à ramificação em manose 1,3 e pelo menos um GlcNAc ligado à ramificação de manose 1,6 de um núcleo de “trimanose”. Os N-glicanos também podem ter galactose (“Gal”) ou resíduos de N-acetil-galactosamina (“GalNAc”) que são opcionalmente modificados com ácido siálico ou derivados (por exemplo, “NANA” ou “NeuAc”, onde “Neu” refere-se ao ácido neuramínico e “Ac” refere-se a acetila). Os N-glicanos complexos também podem ter substituições que compreendem “dividir em duas partes” GlcNAc e fucose de núcleo (“Fuc”). Os N-glicanos do tipo complexo no contexto da presente invenção podem conter zero (G0), uma (G1), ou duas (G2) galactoses assim como uma fucose ligada à primeira GlcNAc na extremidade redutora (indicada como G0F, G1F, G2F, respectivamente).

[0052] Um “N-glicano tipo híbrido” significa um polissacarídeo ou oligossacarídeo ligados em N que tem pelo menos uma GlcNAc no terminal da ramificação de manose 1,3 do núcleo de trimanose e zero ou mais manoses na ramificação de manose 1,6 do núcleo de trimanose.

[0053] As abreviações usadas no contexto da presente invenção para descrever as glicoestruturas são definidas como segue: núcleo = Man3 GlcNAc2 G0 = GlcNAc2 Man3 GlcNAc2 G0-GlcNAc = estrutura G0 que perde uma GlcNAc (isto é, GlcNAc Man3 GlcNAc2) G1 = estrutura G0 contendo um resíduo de Galactose adicional (isto é, Gal GlcNAc2 Man3 GlcNAc2) G2 = estrutura G0 contendo dois resíduos de Galactose adicional (isto é, Gal2 GlcNAc2 Man3 GlcNAc2) G0F = Estrutura G0 contendo um resíduo de fucose adicional que é conectada ao primeiro resíduo de GlcNAc do núcleo de pentassacarídeo (isto é, GlcNAc2 Man3 GlcNAc2 Fuc) G0F-GlcNAc = estrutura G0-GlcNAc contendo um resíduo de fucose adicional que é conectado ao primeiro resíduo de GlcNAc do núcleo de pentassacarídeo (isto é, GlcNAc Man3 GlcNAc2 Fuc) G1F = estrutura G1 contendo um resíduo de fucose adicional que é conectado ao primeiro resíduo de GlcNAc do núcleo de pentassacarídeo (isto é, Gal GlcNAc2 Man3 GlcNAc2 Fuc) G2F = estrutura G2 contendo um resíduo de fucose adicional que é conectado ao primeiro resíduo de GlcNAc do núcleo de pentassacarídeo (isto é, Gal2 GlcNAc2 Man3 GlcNAc2 Fuc) Man4 = estrutura de núcleo contendo um resíduo de Manose adicional (isto é, Man Man3 GlcNAc2) Man5 = estrutura de núcleo contendo dois resíduos de Manose adicional (isto é, Man2 Man3 GlcNAc2) Man6 = estrutura de núcleo contendo três resíduos de Manose adicionais (isto é, Man3 Man3 GlcNAc2) Man7 = estrutura de núcleo contendo quatro resíduos de Manose adicionais (isto é, Man4 Man3 GlcNAc2) Man8 = (estrutura de núcleo contendo cinco resíduos de Manose adicionais (isto é, Man5 Man3 GlcNAc2)

[0054] Um “O-glicano” significa um polissacarídeo ou oligossacarídeo ligados em O. Os glicanos ligados em O são usualmente ligados à cadeia de peptídeo através de resíduos de serina ou treonina. A glicosilação ligada em O é um evento pós translacional verdadeiro que ocorre no complexo de Golgi e que não requer uma sequência de consenso e nenhum precursor de oligossacarídeo é requerido para a transferência de proteína. O tipo mais comum de glicanos ligados em O contém um resíduo de GalNAc inicial (ou epítopo Tn), estes são habitualmente aludidos como glicanos do tipo mucina. Outros glicanos ligados em O incluem glicosamina, xilose, galactose, fucose, ou manose como o açúcar inicial ligado aos resíduos Ser/Thr. As glicoproteínas ligadas em O são usualmente proteínas grandes (> 200 kDa) que são habitualmente biantenárias com comparativamente menos ramificações do que os N-glicanos.

[0055] O termo “uma molécula que naturalmente compreende fucose nas suas glicoporções” como usado no contexto da presente invenção refere- se a qualquer composto que na produção em uma célula eucariótica, preferivelmente célula de vertebrado, capaz de adicionar fucose às glicoporções, isto é com uma capacidade inalterada para adicionar fucose às glicoporções, compreende glicoporções que compreende pelo menos um resíduo de fucose. Tais moléculas compreendem pelo menos um ou mais motivos de sequência reconhecidos por uma enzima que transfere glicano, por exemplo que compreende um resíduo de Asp, Ser ou Thr, preferivelmente uma sequência de tripeptídeo Asn-X-Ser/Thr, em que X é qualquer aminoácido exceto Pro. Os exemplos preferidos de células eucarióticas (por exemplo células de vertebrado) que produzem moléculas que compreendem glicoporções com fucose são CHO, AGE1.HN, AGE1.CR, AGE1.CR.PIX, ou AGE1.CS. Preferivelmente Tais compostos são proteínas de fusão ou lipídeos. Preferivelmente as proteínas são de origem eucariótica, preferivelmente de vertebrado mais preferivelmente de origem mamífera ou derivadas destes.

[0056] O termo “uma molécula que carece de fucose nas suas glicoporções” no contexto da presente invenção significa que em uma molécula que naturalmente compreende fucose nas suas glicoporções, nenhuma quantidade detectável de fucose está presente. Expressado em termos de pureza, “uma molécula que carece de fucose nas suas glicoporções” significa que uma molécula que naturalmente compreende fucose nas suas glicoporções é 100 % isenta do resíduo de açúcar de fucose nas suas glicoporções.

[0057] O termo “uma molécula com uma quantidade reduzida de fucose nas suas glicoporções” refere-se a uma molécula, em que a quantidade de fucose nas glicoporções é reduzida do número (n) quando expressada em uma célula capaz de adicionar fucose às glicoporções, isto é, com uma capacidade inalterada para adicionar fucose às glicoporções. Assim, o estado reduzido é n-x, em que n tem o significado indicado acima e x é um número inteiro de 1 a (n-1). Preferivelmente, se n é 2 no estado natural o mesmo é reduzido para 1. Similarmente, se n é 3 no estado natural, o mesmo é preferivelmente reduzido para 2, ou 1; se n é 4 no estado natural, o mesmo é preferivelmente reduzido para 3, 2, ou 1; se n é 5 no estado natural, o mesmo é preferivelmente reduzido para 4, 3, 2, ou 1; ou se n é 6 no estado natural, o mesmo é preferivelmente reduzido para 5, 4, 3, 2, ou 1.

[0058] O termo “uma composição de moléculas com uma quantidade reduzida de fucose nas suas glicoporções” é usado no contexto da presente invenção para indicar que as moléculas de uma composição que naturalmente compreende fucose nas suas glicoporções têm um número reduzido de fucose nas suas glicoporções. Tal comparação é preferivelmente realizada que usa moléculas produzidas pelas linhagens de célula indicadas acima. Expressado em termos de redução isto significa que de um dado número de moléculas de uma composição, preferivelmente de 1, 10, 100 ou 1000 pmol de moléculas de uma composição, o número de resíduos de fucose é reduzido entre 10 % a 95 %, preferivelmente cerca de 15 %, cerca de 20 %, cerca de 25 %, cerca de 30 %, cerca de 35 %, 40 %, cerca de 45 %, cerca de 50 %, cerca de 55 %, cerca de 60 %, cerca de 65 %, cerca de 70 %, cerca de 75 %, cerca de 80 %, cerca de 85 %, cerca de 86 %, cerca de 87 %, cerca de 88 %, cerca de 89 %, cerca de 90 %, cerca de 91 %, cerca de 92 %, cerca de 93 %, ou cerca de 94 %. A redução global pode ser devida a um aumento de moléculas na composição que carece de fucose nas suas glicoporções e/ou tendo uma quantidade reduzida de fucose nas suas glicoporções.

[0059] O termo “uma composição de moléculas que é substancialmente isenta de fucose nas suas glicoporções” é usado no contexto da presente invenção para indicar que moléculas de uma composição, que naturalmente compreendem fucose nas suas glicoporções, são essencialmente destituídas do resíduo de açúcar fucose nas suas glicoporções. Expressado em termos de pureza, o termo “uma composição de moléculas que é substancialmente isenta de fucose nas suas glicoporções” significa que de um dado número de moléculas de uma composição, preferivelmente de 1, 10, 100 ou 1000 pmol de moléculas de uma composição, pelo menos cerca de 95 %, cerca de 96 %, cerca de 97 %, cerca de 98 %, cerca de 99 %, cerca de 99,1 %, cerca de 99,2 %, cerca de 99,3 %, cerca de 99,4 %, cerca de 99,5 %, cerca de 99,6 %, cerca de 99,7 %, cerca de 99,8 %, ou pelo menos cerca de 99,9 % das ditas moléculas são isentos do resíduo de açúcar fucose nas suas glicoporções.

[0060] A pessoa habilitada pode facilmente determinar experimentalmente a quantidade reduzida de fucose nas glicoporções de uma molécula particular, por exemplo uma molécula de anticorpo, (i) cultivando- se as células da presente invenção sob condições em que a molécula de interesse é produzida, (ii) isolando-se a dita molécula das ditas células e (iii) analisando-se a estrutura de cadeia de açúcar da dita molécula com respeito aos resíduos de fucose ligados às suas glicoporções e calculando o valor médio dos resíduos de fucose presentes na estrutura de cadeia de açúcar da dita molécula, e (iv) comparando-se o resultado com o resultado da mesma molécula, por exemplo uma molécula de anticorpo, produzida nas células, em que a molécula é produzida com um padrão de glicosilação não reduzido de fucose. Preferivelmente, as células usadas nos dois experimentos são idênticas mas para a diferença que uma célula compreende pelo menos uma enzima que usa GDP-6-desóxi-D-lixo-4-hexulose como um substrato, em que a enzima não catalisa a reação que converte GDP-6-desóxi-D-lixo-4-hexulose na GDP- L-fucose. Preferivelmente ambas as células são cultivadas sob condições de cultura idênticas para excluir variações na fucosilação que possam ser devido às diferenças nas condições de cultura.

[0061] A estrutura de cadeia de açúcar em uma molécula, por exemplo molécula de anticorpo, pode simplesmente ser analisada pelo método de mapeamento de cadeia de açúcar bidimensional (Anal. Biochem., 171, 73 (1988), Biochemical Experimentation Methods 23 - Methods for Studying Glycoprotein Sugar Chains (Japan Scientific Societies Press) editado pela Reiko Takahashi (1989)). A estrutura deduzida pelo método de mapeamento de cadeia de açúcar bidimensional pode ser determinada pela realização da espectrometria de massa tal como MALDI (Dessorção/Ionização a Laser Auxiliado por Matriz) -TOF-MS de cada cadeia de açúcar.

[0062] A fucosilação de moléculas, por exemplo proteínas ou lipídeos, que compreende glicoporções em células eucarióticas (por exemplo células de vertebrado) requer um açúcar de nucleotídeo, GDP-L-fucose, como um doador e também a presença de fucosiltransferases particulares, que transferem o resíduo de fucosila da molécula doador para a aceitadora. Nas células eucarióticas (por exemplo células de vertebrado) a GDP-L-fucose pode ser sintetizada por intermédio de dois caminhos diferentes, pelo caminho de novo da fucose mais proeminente ou pelo caminho da recuperação menor.

[0063] Os inventores da presente invenção descobriram que a presença de uma enzima (enzima defletora) em uma célula eucariótica (por exemplo uma célula de vertebrado) que eficazmente utiliza a GDP-6-desóxi- D-lixo-4-hexulose como um substrato, mas que não catalisa a reação que converte GDP-6-desóxi-D-lixo-4-hexulose em GDP-L-fucose, leva à produção de uma molécula, por exemplo proteína ou lipídeo, que carece de fucose ou com uma quantidade reduzida de fucose nas suas glicoporções. O termo “GDP-6-desóxi-D-lixo-4-hexulose” é sinônimo com o termo “GDP-4- ceto-6-desóxi-D-manose”. Ambos os termos são aqui usados intercambiavelmente.

[0064] Assim, em um primeiro aspecto, a presente invenção fornece uma célula de vertebrado (modificada) para produzir uma molécula, que naturalmente compreende fucose nas suas glicoporções, que carece de fucose ou com uma quantidade reduzida de fucose nas suas glicoporções que compreende pelo menos uma enzima que usa GDP-6-desóxi-D-lixo-4- hexulose como um substrato, em que a enzima não catalisa a reação que converte GDP-6-desóxi-D-lixo-4-hexulose em GDP-L-fucose.

[0065] A enzima presente na célula de vertebrado do primeiro aspecto da invenção pode ser qualquer enzima que usa GDP-6-desóxi-D-lixo-4- hexulose como um substrato sob a condição de que a dita enzima não catalisa a reação que converte GDP-6-desóxi-D-lixo-4-hexulose em GDP-L-fucose. Ao invés a dita enzima converte GDP-6-desóxi-D-lixo-4-hexulose em um produto que não pode ser mais utilizado para a síntese de GDP-L-fucose em uma célula de vertebrado.

[0066] A enzima que está compreendida na célula de vertebrado do primeiro aspecto da presente invenção é uma enzima que é normalmente não está presente na célula de vertebrado, isto é uma enzima heteróloga ou artificial, por exemplo uma enzima de um organismo de um outro reino, tal como de procariotas, preferivelmente bactérias. Alternativamente a dita enzima também pode ser uma enzima que está normalmente presente em uma célula de vertebrado, mas que não converte o substrato GDP-6-desóxi-D-lixo- 4-hexulose em GDP-L-fucose mas ao invés em um produto diferente, por exemplo devido à presença de mutações.

[0067] A enzima, que está presente na célula de vertebrado do primeiro aspecto da presente invenção, foi introduzida na célula de vertebrado, por exemplo, por intermédio da microinjeção de proteína, eletroporação de proteína ou lipofecção de proteína. Também é possível introduzir a sequência de ácido nucleico que codifica a enzima, preferivelmente integrada em um vetor de expressão, na célula de vertebrado, por exemplo por intermédio da microinjeção de DNA, eletroporação de DNA ou lipofecção de DNA, que é subsequentemente transcrita e traduzida na respectiva proteína na célula de vertebrado. A pessoa habilitada na técnica está bem informada a cerca das técnicas da biologia molecular, tais como microinjeção, eletroporação ou lipofecção, para introduzir proteínas ou sequências de ácido nucleico que codificam as proteínas em uma célula de vertebrado e sabem como realizar estas técnicas.

[0068] É preferido que duas ou mais enzimas, isto é 2, 3, 4, 5, 6 ou 7, que usam GDP-6-desóxi-D-lixo-4-hexulose como um substrato e que não catalisam a conversão de GDP-6-desóxi-D-lixo-4-hexulose em GDP-L-fucose estão presentes em uma célula de vertebrado para bloquear eficazmente o caminho de novo da fucose na dita célula.

[0069] Preferivelmente, a enzima que usa GDP-6-desóxi-D-lixo-4- hexulose como um substrato é selecionada do grupo que consiste de GDP-6- desóxi-D-lixo-4-hexulose redutase (sinônimo com GDP-4-ceto-6-desóxi-D- manose redutase, abreviado RMD), GDP-perosamina sintetase (Per), GDP-6- desóxi-D-talose sintetase (GTS), mutante da GDP-Fucose sintetase Cys109Ser-(GFS-Cys109Ser), GDP-4-ceto-6-desoximanose-3-desidratase (ColD), preferivelmente GDP-4-ceto-6-desoximanose-3-desidratase (ColD) em combinação com GDP-L-colitose sintase (ColC), e variantes destas, preferivelmente a enzima é de bactérias ou derivada de uma tal enzima bacteriana. Mais preferivelmente, a enzima que usa GDP-6-desóxi-D-lixo-4- hexulose como um substrato é uma GDP-6-desóxi-D-lixo-4-hexulose redutase (RMD), mutante da GDP-Fucose sintetase Cys109Ser-(GFS-Cys109Ser), e/ou uma GDP-perosamina sintetase (Per).

[0070] A GDP-6-desóxi-D-lixo-4-hexulose redutase (RMD) reduz o substrato GDP-6-desóxi-D-lixo-4-hexulose para GDP-D-ramnose. GDP-D- Ramnose é um açúcar de nucleotídeo doador para a D-ramnosilação em bactérias e não ocorre em vertebrados. As células de vertebrado também carecem das ramnosiltransferases específicas de modo que a GDP-D- Ramnose pode não ser incorporada nas glicoestruturas nascentes de glicoproteínas ou glicolipídeos dentro das células de vertebrado.

[0071] A enzima GDP-6-desóxi-D-talose sintetase (GTS) reduz o substrato GDP-6-desóxi-D-lixo-4-hexulose para GDP-desóxi-D-talose. A GDP-desóxi-D-talose é um açúcar de nucleotídeo doador para 6-desóxi-D- talosilação em bactérias e não ocorre em vertebrados. As células de vertebrado também carecem das desoxitalosiltransferases específicas de modo que a GDP-desóxi-D-talose pode não ser incorporada nas glicoestruturas nascentes dentro das células de vertebrado.

[0072] Além disso, a enzima GDP-perosamina sintetase (Per) reduz e transamina o substrato GDP-6-desóxi-D-lixo-4-hexulose para GDP-D- perosamina. A GDP-D-perosamina é um açúcar de nucleotídeo doador para a perosaminilação em bactérias, por exemplo E. coli. A GDP-D-perosamina normalmente não está presente nas células de vertebrado. As células de vertebrado também carecem de perosaminiltransferases específicas de modo que a GDP-D-perosamina pode não ser ligada às glicoestruturas nascentes dentro das células de vertebrado.

[0073] Portanto, as enzimas heterólogas GTS e/ou Per (i) esgotam o substrato GDP-6-desóxi-D-lixo-4-hexulose na célula de vertebrado, e (ii) levam à síntese de produtos artificiais (isto é GDP-desóxi-D-talose no caso de GTS e GDP-D-perosamina no caso de Per) que não pode ser mais utilizado para a síntese de GDP-L-fucose. Consequentemente, as moléculas, que normalmente compreendem fucose nas suas glicoporções, produzidas na célula de vertebrado que compreende GTS e/ou Per, carecem de fucose ou com uma quantidade reduzida de fucose nas suas glicoporções.

[0074] A enzima GDP-4-ceto-6-desoximanose-3-desidratase (ColD) usa o substrato GDP-6-desóxi-D-lixo-4-hexulose e o converte em GDP-4- ceto-3,6-didesóxi-D-manose. Visto que o intermediário GDP-4-ceto-3,6- didesóxi-D-manose pode ser instável em células de vertebrado, ColD é preferivelmente usado em combinação com a enzima GDP-L-colitose sintase (ColC). A enzima ColC pertence à classe de GDP-4-dehidro-6-desóxi-D- manose epimerases/redutases. A enzima ColC converte ainda o intermediário GDP-4-ceto-3,6-didesóxi-D-manose no produto final instável GDP-L- colitose. Ambos os produtos não podem ser incorporados nas glicoestruturas nascentes dentro das células de vertebrado visto que as ditas células carecem da respectiva glicosiltransferase para transferir GDP-4-ceto-3,6-didesóxi-D- manose e/ou GDP-L-colitose para as glicoporções de moléculas presentes nas ditas células. Assim, é preferido que ColD esteja presente na célula de vertebrado em combinação com ColC.

[0075] A enzima GDP-Fucose sintetase (GFS) (também conhecida como GDP-4-ceto-6-desóxi-D-manose epimerase/redutase, GMER) converte GDP-4-ceto-6-desóxi-D-manose em GDP-L-fucose nas células de vertebrado. A reação de GFS envolve epimerizações tanto em C-3” quanto em C-5” seguidas por uma redução dependente de NADPH da carbonila em C-4. Um mutante de sítio ativo, preferivelmente GFS-Cys109Ser, é usado na presente invenção, que converte GDP-4-ceto-6-desóxi-D-manose em um produto diferente da GDP-L-fucose, a saber GDP-6-desóxi-D-altrose (ver Lau S.T.B., Tanner, M.E. 2008. Mechanism and active site residues of GDP-Fucose Synthase, Journal of the American Chemical Society, Vol. 130, No. 51, pp. 17593-17602).

[0076] Preferivelmente, duas ou mais enzimas, isto é 2, 3, 4, 5, 6, ou 7, selecionadas do grupo que consiste de GDP-6-desóxi-D-lixo-4-hexulose redutase (RMD), GDP-perosamina sintetase (Per), GDP-6-desóxi-D-talose sintetase (GTS), mutante de GDP-Fucose sintetase Cys109Ser-(GFS- Cys109Ser), GDP-4-ceto-6-desoximanose-3-desidratase (ColD), preferivelmente GDP-4-ceto-6-desoximanose-3-desidratase (ColD) em combinação com GDP-L-colitose sintase (ColC), e variantes destas estão presentes na célula de vertebrado.

[0077] Uma variante de enzima de RMD, Per, GTS, GFS-Cys109Ser, ColD, ou ColC que é preferida na presente invenção difere da enzima RMD, Per, GTS, GFS-Cys109Ser, ColD, ou ColC a partir da qual a mesma é derivada em até 150 (isto é até 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, ou 150) mudanças de aminoácido na sequência de aminoácido (isto é mudanças, inserções, deleções, truncagens de terminal N e/ou truncagens de terminal C). As mudanças de aminoácido podem ser conservativas ou não conservativas. Uma variante de enzima RMD, Per, GTS, GFS-Cys109Ser, ColD, ou ColC, que é preferida na presente invenção pode ser alternativa ou adicionalmente caracterizada por um certo grau de identidade de sequência com as enzimas de RMD, Per, GTS, GFS-Cys109Ser, ColD, ou ColC a partir das quais a mesma é derivada. Assim, as variantes de enzima de RMD, Per, GTS, GFS- Cys109Ser, ColD, ou ColC, que são preferidas na presente invenção têm uma identidade de sequência de pelo menos 80 %, pelo menos 81 %, pelo menos 82 %, pelo menos 83 %, pelo menos 84 %, pelo menos 85 %, pelo menos 86 %, pelo menos 87 %, pelo menos 88 %, pelo menos 89 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, ou pelo menos 99 % com as respectivas enzimas de RMD, Per, GTS, GFS- Cys109Ser, ColD, ou ColC de referência. Preferivelmente, a identidade de sequência diz respeito a um trecho contínuo de 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300 ou mais aminoácidos, preferivelmente em relação ao comprimento inteiro da respectiva enzima de RMD, Per, GTS, GFS- Cys109Ser, ColD, ou ColC de referência. É particularmente preferido que a identidade de sequência seja de pelo menos 80 % em relação ao comprimento inteiro, seja de pelo menos 85 % em relação ao comprimento inteiro, seja de pelo menos 90 % em relação ao comprimento inteiro, seja de pelo menos 95 % em relação ao comprimento inteiro, seja de pelo menos 98 % em relação ao comprimento inteiro, ou seja de pelo menos 99,5 % em relação ao comprimento inteiro da respectiva enzima de RMD, Per, GTS, GFS- Cys109Ser, ColD, ou ColC de referência. Também é particularmente preferido que a identidade de sequência seja de pelo menos 80 % em relação a pelo menos 200 ou 250 aminoácidos, seja de pelo menos 85 % em relação a pelo menos 200 ou 250 aminoácidos, seja de pelo menos 90 % em relação a pelo menos 200 ou 250 aminoácidos, seja de pelo menos 95 % em relação a pelo menos 200 ou 250 aminoácidos, seja de pelo menos 98 % em relação a pelo menos 200 ou 250 aminoácidos, ou seja de pelo menos 99,5 % em relação a pelo menos 200 ou 250 aminoácidos da respectiva enzima de RMD, Per, GTS, GFS-Cys109Ser, ColD, ou ColC de referência.

[0078] Um fragmento (ou variante de deleção) da enzima de RMD, Per, GTS, GFS-Cys109Ser, ColD, ou ColC tem preferivelmente uma deleção de até 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, ou 150 aminoácidos no seu terminal N e/ou no seu terminal C e/ou internamente.

[0079] Adicionalmente, uma enzima de RMD, Per, GTS, GFS- Cys109Ser, ColD, ou ColC tendo o grau indicado acima de relacionabilidade com a enzima de referência é apenas considerada como uma variante, se a mesma exibe a atividade biológica relevante a um grau de pelo menos 30 % da atividade da respectiva enzima de referência. A “atividade biológica” relevante no contexto da presente invenção é a “atividade de enzima”, isto é a atividade da variante de enzima de RMD, Per, GTS, GFS-Cys109Ser, ColD, ou ColC para utilizar o substrato GDP-6-desóxi-D-lixo-4-hexulose e covertê- lo em GDP-D-ramnose, GDP-D-perosamina, GDP-desóxi-D-talose, GDP-6- desóxi-D-altrose, GDP-4-ceto-3,6-didesóxi-D-manose ou GDP-L-colitose, respectivamente. A pessoa habilitada pode facilmente avaliar se uma variante de enzima de RMD, Per, GTS, GFS-Cys109Ser, ColD, ou ColC tem uma atividade de enzima de pelo menos 30 % da atividade de enzima da respectiva enzima RMD, Per, GTS, GFS-Cys109Ser, ColD, ou ColC de referência. Os ensaios adequados, por exemplo ensaios de atividade de enzima, para determinar a “atividade de enzima” da variante de enzima comparada com a atividade de enzima da respectiva enzima de referência são conhecidos pela pessoa habilitada na técnica.

[0080] Preferivelmente, a enzima GDP-6-desóxi-D-lixo-4-hexulose redutase (RMD) é da Pseudomonas aeruginosa (SEQ ID NO: 1). A enzima GDP-6-desóxi-D-talose sintetase (GTS) é preferivelmente da Actinobacillus actinomycetemcomitans (SEQ ID NO: 2). É preferido que a enzima GDP- perosamina sintetase (Per) seja da Vibrio cholerae (SEQ ID NO: 3). Preferivelmente, a GDP-4-ceto-6-desoximanose-3-desidratase (ColD) seja da E. coli (SEQ ID NO: 4). O uso de GDP-L-colitose sintase (ColC) da E. coli também é preferido (SEQ ID NO: 7). A GDP-Fucose sintetase (GFS) do tipo selvagem é de Cricetulus griseus (hamster chinês) (SEQ ID NO: 5). O mutante GDP-Fucose sintetase Cys109Ser-(GFS-Cys109Ser) de Cricetulus griseus (hamster chinês) tem a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 6.

[0081] Como mencionado acima, a invenção abrange variantes das enzimas que usa GDP-6-desóxi-D-lixo-4-hexulose como um substrato. Assim, a presente invenção também abrange variantes dos números identificadores da sequência mencionada acima, isto é variantes da SEQ ID NO: 1, variantes da SEQ ID NO: 2, variantes da SEQ ID NO: 3, variantes da SEQ ID NO: 3, variantes da SEQ ID NO: 4, variantes da SEQ ID NO: 5, variantes da SEQ ID NO: 6, e variantes da SEQ ID NO: 7. Como para a definição estrutural e/ou funcional das ditas variantes, é aludido os parágrafos anteriormente mencionados.

[0082] Preferivelmente, as sequências de ácido nucleico de RMD, Per, GTS, ColD, ColC, ou GFS-Cys109Ser são otimizadas no códon. O termo “otimizada no códon” como usado no contexto da presente invenção significa, por exemplo, a remoção das caixas Tata internas, sítios chi, sítios de entrada de ribossoma, motivos de instabilidade de RNA, sequências de repetição, estruturas secundárias de RNA intensas e sítios de junção crípticas assim como o uso de códons de utilização superior em células eucarióticas (por exemplo de vertebrado) ou de genes altamente expressados em células eucarióticas (por exemplo de vertebrado).

[0083] É mais preferido que adicionalmente o caminho de recuperação da fucose seja bloqueado na célula de vertebrado. Assim, é preferido usar meio de cultivo isento de fucose e de glicoproteínas fucosiladas, quando do cultivo das células da presente invenção.

[0084] As células de vertebrado além disso ou alternativamente à enzima compreende GDP-D-ramnose, GDP-D-perosamina, GDP-desóxi-D- talose, GDP-6-desóxi-D-altrose, GDP-4-ceto-3,6-didesóxi-D-manose, e/ou GDP-L-colitose para inibir ou prevenir a síntese de GDP-L-fucose visto que os inventores da presente invenção inesperadamente informaram que a suplementação, particularmente a suplementação citossólica, por exemplo pela injeção intracitoplasmática, dos açúcares artificiais GDP-D-ramnose, GDP-D-perosamina, GDP-desóxi-D-talose, GDP-6-desóxi-D-altrose, GDP-4- ceto-3,6-didesóxi-D-manose, e/ou GDP-L-colitose positivamente contribui para a inibição da transferência de fucose nas células de vertebrado. A suplementação do(s) açúcar(es) artificial(is) GDP-6-desóxi-D-altrose, GDP- D-ramnose, e/ou GDP-D-perosamina é (são) particularmente preferido(s).

[0085] É preferido que a enzima que usa GDP-6-desóxi-D-lixo-4- hexulose como um substrato e que não catalisa a reação que converte GDP-6- desóxi-D-lixo-4-hexulose em GDP-L-fucose seja expressada a partir de uma sequência de ácido nucleico transitoriamente presente ou estavelmente mantida na célula de vertebrado epissômica ou cromossomicamente.

[0086] A sequência de ácido nucleico que codifica a enzima, preferivelmente a GDP-6-desóxi-D-lixo-4-hexulose redutase (RMD), GDP- perosamina sintetase (Per), GDP-6-desóxi-D-talose sintetase (GTS), mutante de GDP-Fucose sintetase Cys109Ser-(GFS-Cys109Ser), GDP-4-ceto-6- desoximanose-3-desidratase (ColD), ou GDP-L-colitose sintase (ColC) é integrada em um vetor de expressão, que é usado para transformar a célula.

[0087] Os vetores de expressão adequados compreendem cosmídeos plasmídicos, cromossomas artificiais bacterianos (BAC) e vetores virais. Preferivelmente, vetores de expressão não virais são usados.

[0088] A expressão do ácido nucleico que codifica a enzima é controlada pelas sequências de controle de expressão.

[0089] Os termos “sequências de controle de expressão” referem-se às sequências de nucleotídeo que são afetadas pela expressão em células eucarióticas (por exemplo células de vertebrado) de sequências codificadoras às quais elas são operavelmente ligadas. As sequências de controle de expressão são sequências que controlam a transcrição, por exemplo promotores, caixa TATA, realçadores; eventos pós-transcricionais, por exemplo poliadenilação, e tradução de sequências de ácido nucleico.

[0090] Os promotores preferidos são promotores constitutivos que incluem o promotor do gene inicial imediato de citomegalovírus hCMV, os promotores iniciais ou tardios de SV40 ou promotores regulados que incluem o promotor CUP-1, o repressor tet como utilizado, por exemplo, nos sistemas tet-on ou tet-off, o promotor para a 3-fosfoglicerato cinase (PGK), os promotores da fosfatase ácida, e os promotores dos fatores de α- ou a-união de levedura, por exemplo, o promotor do gene inicial imediato de CMV constitutivo, o promotor de SV 40 inicial ou tardio, o promotor da poliedrina, LTRs retrovirais, promotor PGK, fator de alongamento 1-α (EF1-α.), EF2 e fosfoenolpiruvato carbóxi cinase (PEPCK). Os promotores particularmente preferidos são promotores que sustentam apenas a expressão de enzima intermediária ou fraca para evitar problemas de toxicidade potenciais. A força de expressão de um dado promotor pode ser normalizada pela comparação da expressão com a força de expressão do promotor constitutivo forte que direciona a expressão de GAPDH endógeno. Um promotor que direciona a expressão da enzima em uma concentração de 10 % a 1 % de GAPDH é considerado um promotor que direciona a expressão intermediário e um promotor com direção da expressão da enzima em uma concentração de menos do que 1 % é considerado um promotor fraco. A força de expressão pode ser avaliada pelos métodos conhecidos na técnica que incluem, por exemplo PCR em tempo real.

[0091] Os rótulos de marcador também podem ser usados nas formas de realização da presente invenção. Preferivelmente, a sequência de ácido nucleico do rótulo marcador é operavelmente ligada à sequência de ácido nucleico que codifica a proteína (por exemplo enzima, anticorpo) a ser rotulada. Preferivelmente o rótulo marcador é uma proteína fluorescente selecionada do grupo que consiste de GFP e variantes destas; que inclui, mas limitada a, GFP. Como aqui usado “operavelmente ligado” significa que um ácido nucleico é ligado a um segundo ácido nucleico em um tal modo que a expressão na matriz de uma proteína de fusão correspondente pode ser afetada evitando mudanças de matriz ou códons de parada. Estes termos também significam que a ligação de sequências de controle de expressão a uma sequência de ácido nucleico codificadora de interesse (por exemplo enzima, anticorpo) para controlar eficazmente a expressão da dita sequência. Estes termos também referem-se à ligação de sequências de ácido nucleico que codificam um rótulo de afinidade ou rótulo marcador a uma sequência de ácido nucleico codificadora de interesse (por exemplo enzima, anticorpo).

[0092] É preferido que a sequência de ácido nucleico que codifica a enzima RMD, Per, GTS, GFS-Cys109Ser, ColD ou ColC no vetor de expressão seja operavelmente ligada às sequências de controle de expressão de específicas de vertebrado, que permitem a expressão da sequência de ácido nucleico que codifica a enzima RMD, Per, GTS, GFS-Cys109Ser, ColD ou ColC na célula de vertebrado.

[0093] Como um resultado, a(s) enzima(s) RMD, Per, GTS, GFS- Cys109Ser, e/ou ColD, ColD preferivelmente em combinação com ColC, são expressadas na célula de vertebrado da presente invenção em rendimentos ótimos parra o efeito desejado. Dependendo da natureza da enzima e da célula usada para a expressão destes rendimentos pode ser alta, moderada ou baixa. É fácil para aqueles habilitados na técnica escolher sequências de controle de expressão específicas de vertebrado apropriadas para se obter níveis altos, moderados ou baixos de expressão.

[0094] A expressão da(s) enzima(s) RMD, Per, GTS, GFS- Cys109Ser, e/ou ColD, ColD preferivelmente em combinação com ColC, na célula de vertebrado tem o efeito que o mesmo bloqueia eficazmente a síntese de GDP-L-fucose e, assim, leva à produção de moléculas, que naturalmente compreendem fucose nas suas glicoporções, mas que devido à sua expressão carecem de fucose ou têm uma quantidade reduzida de fucose nas suas glicoporções.

[0095] Para a produção de longa duração, alto rendimento de uma das proteínas recombinantes, a expressão estável é preferida. Por exemplo, as células eucarióticas (por exemplo células de vertebrado) que estavelmente expressam ácidos nucleicos que codificam a enzima que usa GDP-6-desóxi- D-lixo-4-hexulose como um substrato, em que a enzima não catalisa a reação que converte GDP-6-desóxi-D-lixo-4-hexulose na GDP-L-fucose e a proteína, por exemplo um anticorpo, pode ser engendrado. Ao invés de usar vetores de expressão que contenham origens virais de replicação, células eucarióticas (por exemplo células de vertebrado) podem ser transformadas com vetores controlados pelas sequências de controle de expressão apropriadas (por exemplo, sequências promotoras, realçadoras, terminadores de transcrição, sítios de poliadenilação, etc.) e opcionalmente um marcador selecionável. A seguir da introdução de DNA estranho, as células transformadas podem ser detectadas analisando-se ácidos nucleicos a partir de tais células, pela detecção do efeito de expressão (por exemplo a falta de fucose usando a ligação de lectina) ou pode ser selecionada pela aplicação da pressão seletiva. Os sistemas de seleção adequados são bem conhecidos na técnica.

[0096] Preferivelmente, a célula de vertebrado compreende ainda pelo menos uma molécula (aceitadora) que é capaz de ser um substrato para uma fucosiltransferase. O termo “molécula (aceitadora) capaz de ser um substrato para uma fucosiltransferase” como usado no contexto da presente invenção refere-se a qualquer composto de interesse, por exemplo uma proteína, um polipeptídeo, um oligopeptídeo, um lipídeo, um fragmento de lipídeo, ou uma proteína de fusão, tendo ou compreendendo glicoporções às quais pelo menos um resíduo de fucose é ligado, se produzido em uma célula tendo uma atividade de fucosilação inalterada. Um tal composto é um substrato adequado para uma fucosiltransferase. Uma molécula aceitadora preferida é consequentemente uma glicoproteína, um glicopolipeptídeo, um glicooligopeptídeo, um glicolipídeo, um fragmento de glicolipídeo, ou uma proteína de fusão glicosilada. O termo “molécula (aceitadora) capaz de ser um substrato para uma fucosiltransferase” como usado no contexto da presente invenção também refere-se a qualquer proteína ou lipídeo, contanto que a mesma seja uma glicoproteína ou glicolipídeo esperados aos quais pelo menos um resíduo de fucose pode ser ligado, isto é uma proteína ou lipídeo aos quais as estruturas de oligossacarídeo são ligadas compreendendo um monossacarídeo ao qual a fucose pode ser ligada pela fucosiltransferase depois da sua produção pela célula de vertebrado. Preferivelmente a proteína não é de origem procariótica. É particularmente preferido que a proteína seja uma proteína de mamífero ou derivada deste.

[0097] A presença de uma molécula capaz de ser um substrato para uma fucosiltransferase, por exemplo uma proteína ou lipídeo que compreende glicoporções às quais pelo menos um resíduo de fucose pode ser ligado, em uma célula de vertebrado da invenção, leva à produção desta molécula que não compreende fucose nas suas glicoporções ou que tem uma quantidade reduzida de fucose nas suas glicoporções, a despeito do fato de que resíduos de fucose podem ser ligados.

[0098] É preferido que a molécula capaz de ser um substrato para uma fucosiltransferase seja uma proteína, preferivelmente uma proteína endógena ou exógena. O termo “proteína exógena” significa qualquer proteína que está vindo do lado de fora da respectiva célula ou que é expressada dentro da célula de um ácido nucleico introduzido na respectiva célula. O termo “proteína endógena” refere-se a qualquer proteína que é codificada pelo genoma da célula. Preferivelmente, a proteína de interesse, a saber a glicoproteína esperada, é recombinantemente expressada na célula de vertebrado. É preferido que a dita proteína seja expressada a partir de uma sequência de ácido nucleico transitoriamente presente ou estavelmente mantida na célula de vertebrado. Os vetores de expressão adequados e sequências de controle de expressão foram descritas acima com respeito à enzima. Estas podem ser igualmente usadas no contexto da expressão do ácido nucleico que codifica a proteína de interesse.

[0099] Assim, em uma forma de realização preferida da presente invenção, a célula de vertebrado compreende (i) pelo menos um polinucleotídeo que compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica a enzima GDP-6-desóxi-D-lixo-4- hexulose redutase (RMD), GDP-perosamina sintetase (Per), GDP-6-desóxi-D- talose sintetase (GTS), mutante de GDP-Fucose sintetase Cys109Ser- (GFS- Cys109Ser), GDP-4-ceto-6-desoximanose-3-desidratase (ColD), ou GDP-L- colitose sintase (ColC), operavelmente ligada às sequências de controle de expressão específicas de vertebrado, que permitem a expressão da sequência de ácido nucleico que codifica a respectiva enzima, e (ii) pelo menos um polinucleotídeo que compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica a proteína de interesse, a saber a glicoproteína esperada, por exemplo um anticorpo, tal como IgG1, operavelmente ligada às sequências de controle de expressão específicas de vertebrado, que levam à expressão da sequência de ácido nucleico que codifica a proteína de interesse, por exemplo um anticorpo, tal como IgG1, na dita célula.

[00100] Como um resultado, (i) a(s) enzima(s) RMD, Per, GTS, GFS- Cys109Ser, e/ou ColD, ColD preferivelmente em combinação com ColC, e (ii) a(s) proteína(s) de interesse, a saber a(s) glicoproteína(s) esperada(s), por exemplo um anticorpo, tal como IgG1, é/são expressada(s) na célula de vertebrado da presente invenção.

[00101] Preferivelmente, no primeiro aspecto da invenção a proteína é um anticorpo, um fragmento de anticorpo, uma proteína de fusão, uma proteína viral, um fragmento de proteína viral, um antígeno, ou um hormônio. O mais preferivelmente, o anticorpo ou o fragmento de anticorpo é selecionado do grupo que consiste de IgG, preferivelmente IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA, IgD e IgE. O mais preferivelmente, a proteína de fusão compreende a região Fc de um anticorpo, por exemplo a região Fc de IgG, tal como a região Fc de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA, IgD ou IgE. O mais preferivelmente, o hormônio é o hormônio que estimula folículo (FSH), hormônio gonadotrópico, hormônio que estimula a tireóide, interleucina-2, interleucina-6, interleucina-10, interleucina-11, interleucina-4 solúvel, eritropoetina, ou trombopoietina. Preferivelmente, a proteína viral ou fragmento de proteína viral está compreendida na membrana de envelope de um vírus envelopado. É particularmente preferido que a proteína viral seja a proteína G ou F do Vírus Sincicial Respiratório e que o fragmento de proteína viral seja o fragmento extracelular da dita proteína.

[00102] Um outro aspecto da invenção é um vírus que compreende a dita proteína viral ou fragmento de proteína viral.

[00103] É preferido que a molécula capaz de ser um substrato para uma fucosiltransferase seja um lipídeo. Preferivelmente, o lipídeo é um gliceroglicolipídeo, mais preferivelmente um galactolipídeo, um sulfolipídeo (SQDG), ou um glicoesfingolipídeo, o mais preferivelmente um cerebrosídeo (por exemplo um galactocerebrosídeo ou um glicocerebrosídeo), um gangliosídeo, um globosídeo, um sulfatídeo ou um glicofosfoesfingolipídeo. É particularmente preferido que o lipídeo esteja compreendido na membrana de envelope de um vírus envelopado.

[00104] O glicoesfingolipídeo (GSL) é particularmente preferido. Os glicoesfingolipídeos contêm uma âncora de ceramida hidrofóbica de N- acilesfingosina e um grupo de ponta hidrofílico composto de sacarídeos. Eles são normalmente encontrados na superfície externa das membranas celulares. A composição da porção de sacarídeo é específica do tipo de célula e depende do estágio de desenvolvimento do organismo ou pode mudar com o estado oncogênico de uma célula.

[00105] O mais preferivelmente, a proteína viral e/ou lipídeo são compreendidos no envelope de um vírus envelopado.

[00106] Como já mencionado acima, a proteína pode ser uma proteína viral que está compreendida na membrana de envelope de um vírus envelopado. O lipídeo também pode ser lipídeo compreendido na membrana de envelope de um vírus envelopado.

[00107] Um outro aspecto da invenção é um vírus que compreende o dito lipídeo.

[00108] O vírus mencionado acima pode ser introduzido na célula de vertebrado por intermédio de infecção viral. O vírus também pode ser introduzido na célula de vertebrado pela introdução de ácidos nucleicos que codificam todo ou parte do vírus a ser produzido. No caso será necessário fornecer as proteínas requeridas para a replicação, montagem etc., isto é usualmente obtido pelo uso de linhagens de célula produtoras de vírus capazes de expressar uma ou mais proteínas virais. Por exemplo, as células HEK293, Per.C6 e AGE1.HN expressam as proteínas E1A de adenovírus e são, assim, capazes de complementar o DNA que carece das regiões codificadoras de E1.

[00109] Preferivelmente, a célula de vertebrado é uma célula de mamífero, uma de peixe, uma de anfíbio, uma de réptil ou uma célula aviária.

[00110] É particularmente preferido que i) a célula de mamífero seja uma célula humana, de hamster, canina ou de macaco, preferivelmente uma célula do ovário do hamster chinês (CHO), uma célula renal do macaco verde africano (VERO-76) (ATCC CRL- 1587), uma célula de carcinoma cervical humana (HeLa) (ATCC CCL 2), uma célula renal canina de Madin Darbin (MDCK) (ATCC CCL 34), uma célula PER.C6 humana (célula comercial da Crucell, Leiden, Países Baixos), ou uma célula AGE1.HN humana (homo sapiens) (célula comercial da ProBioGen, Berlim, Alemanha); ii) a célula de peixe é uma célula ovariana (CCO) de Ictalurus punctatus (peixe gato de canal) (ATCC CRL-2772), iii) a célula de anfíbio é uma célula renal de Xenopus laevis (ATCC CCL-102); iv) a célula de réptil é uma célula cardíaca de Iguana iguana (IgH-2) (ATCC CCL-108); ou v) a célula aviária é uma célula de retina aviária AGE1.CR ou AGE1.CR.PIX, ou uma célula somite aviária AGE1.CS (todas as células derivadas do pato Muscovy, Cairina moschata). estas linhagens de célula são todas comercialmente disponíveis da ProBioGen AG.

[00111] A linhagem de célula AGE1.CR.PIX (17a11b) foi depositada pela ProBioGen AG, Goethestr. 54, 13086 Berlim, Alemanha com a DSMZ- Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig, Alemanha em 24 de novembro de 2005 sob o número de acesso DSM ACC2749. A linhagem de célula AGE1.HN (NC5T11#34) foi depositada pela ProBioGen AG, Goethestr. 54, 13086 Berlim, Alemanha com a DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig, Alemanha em 4 de novembro de 2005 sob o número de acesso DSM ACC2744. A linhagem de célula AGE1.CR.PIX (17a11b) é derivada de células retinais embrionárias do pato Muscovy (Cairina moschata). A linhagem de célula AGE1.HN (NC5T11#34) é derivada de uma região neural periventricular de um feto humano (Homo sapiens). Ambas as linhagens de célula são imortalizadas pela integração e expressão estáveis das proteínas E1A e E1B de adenovírus.

[00112] Uma outra célula de vertebrado preferida é a célula EB14 aviária que é uma célula comercial de VIVALIS (Nantes, França). Outras células de vertebrado preferidas estão resumidas na Tabela 1 que segue: TABELA 1

[00113] As células de vertebrado naturalmente não compreendem uma glicosiltransferase para GDP-D-ramnose, GDP-D-perosamina, GDP-desóxi- D-talose, GDP-6-desóxi-D-altrose, GDP-4-ceto-3,6-didesóxi-D-manose, ou GDP-L-colitose visto que os ditos açúcares normalmente não são sintetizados ou presentes nas células de vertebrado. Assim, mesmo se os açúcares artificiais GDP-D-ramnose, GDP-D-perosamina, GDP-desóxi-D-talose, GDP- 6-desóxi-D-altrose, GDP-4-ceto-3,6-didesóxi-D-manose, ou GDP-L-colitose sejam artificialmente produzidos na célula de vertebrado de acordo com o primeiro aspecto da presente invenção, eles não podem ser incorporados nas glicoestruturas nascentes de proteínas ou lipídeos.

[00114] Os inventores da presente invenção, entretanto, inesperadamente descobriram que os açúcares artificiais GDP-D-ramnose, GDP-D-perosamina, GDP-desóxi-D-talose, GDP-6-desóxi-D-altrose, GDP-4- ceto-3,6-didesóxi-D-manose, ou GDP-L-colitose podem ser integrados em estruturas de glicano de proteínas ou lipídeos sob a condição de que as respectivas glicosiltransferase heterólogas, e opcionalmente um respectivo transportador de nucleotídeo de açúcar de GDP-Desoxihexose heterólogo também esteja presente na célula de vertebrado.

[00115] Consequentemente, em uma forma de realização preferida, a célula de vertebrado de acordo com o primeiro aspecto da presente invenção compreende ainda pelo menos uma glicosiltransferase para GDP-D-ramnose, GDP-D-perosamina, GDP-desóxi-D-talose, GDP-6-desóxi-D-altrose, GDP-4- ceto-3,6-didesóxi-D-manose, ou GDP-L-colitose, preferivelmente codificada por um ácido nucleico compreendido na célula de vertebrado e operavelmente ligada às sequências de controle de expressão específicas de vertebrado, que permitam a expressão da dita sequência de ácido nucleico, e opcionalmente pelo menos um transportador de nucleotídeo de açúcar de GDP-desoxihexose para GDP-D-ramnose, GDP-D-perosamina, GDP-desóxi-D-talose, GDP-6- desóxi-D-altrose, GDP-4-ceto-3,6-didesóxi-D-manose, ou GDP-L-colitose, preferivelmente codificado por um ácido nucleico compreendido na célula de vertebrado e operavelmente ligado às sequências de controle de expressão específicas de vertebrado, que permitam a expressão da dita sequência de ácido nucleico. Em uma forma de realização mais preferida, a célula de vertebrado de acordo com o primeiro aspecto da presente invenção compreende ainda uma glicosiltransferase para GDP-D-ramnose, GDP-D- perosamina, e/ou GDP-6-desóxi-D-altrose.

[00116] É particularmente preferido que duas ou mais, por exemplo 2, 3, 4, 5, 6, ou 7, das glicosiltransferases mencionadas acima, e opcionalmente dois ou mais, por exemplo 2, 3, 4, 5, 6, ou 7, do transportador de nucleotídeo de açúcar de GDP-desoxihexose mencionados acima estejam presentes na célula de vertebrado, por exemplo célula eucariótica.

[00117] Os sistemas adequados para a expressão transitória ou estável de tais ácidos nucleicos são conhecidos pela pessoa habilitada e aqueles preferidos são descritos acima e podem ser similarmente usados no contexto de expressar glicosiltransferase, e opcionalmente transportador de nucleotídeo de açúcar de GDP-desoxihexose.

[00118] Preferivelmente, a glicosiltransferase para GDP-D-ramnose, GDP-D-perosamina, GDP-desóxi-D-talose, GDP-6-desóxi-D-altrose, GDP-4- ceto-3,6-didesóxi-D-manose, ou GDP-L-colitose é recombinantemente expressada na célula de vertebrado. A glicosiltransferase para GDP-D- ramnose, GDP-D-perosamina, GDP-desóxi-D-talose, GDP-6-desóxi-D- altrose, GDP-4-ceto-3,6-didesóxi-D-manose, ou GDP-L-colitose pode ser expressada a partir de uma sequência de ácido nucleico transitoriamente presente ou estavelmente mantida na célula de vertebrado. Também é preferido que o transportador de nucleotídeo de açúcar de GDP-desoxihexose mencionado acima seja recombinantemente expressado na célula de vertebrado. O dito transportador de nucleotídeo de açúcar de GDP- desoxihexose pode ser expressado a partir de uma sequência de ácido nucleico transitoriamente presente ou estavelmente mantida na célula de vertebrado.

[00119] Assim, em uma outra forma de realização preferida da presente invenção, a célula de vertebrado compreende (i) pelo menos um polinucleotídeo que compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica a enzima GDP-6-desóxi-D-lixo-4- hexulose redutase (RMD), GDP-perosamina sintetase (Per), GDP-6-desóxi-D- talose sintetase (GTS), mutante de GDP-Fucose sintetase Cys109Ser-(GFS- Cys109Ser), GDP-4-ceto-6-desoximanose-3-desidratase (ColD), ou GDP-L- colitose sintase (ColC) operavelmente ligada às sequências de controle de expressão específicas de vertebrado, (ii) pelo menos um polinucleotídeo que compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína de interesse, a saber uma glicoproteína esperada, por exemplo um anticorpo, tal como IgG1, operavelmente ligado às sequências de controle de expressão específicas de vertebrado, que permitem a expressão da sequência de ácido nucleico que codifica a dita proteína na dita célula, e (iii)pelo menos um polinucleotídeo que compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica a glicosiltransferase para GDP-D- ramnose, GDP-D-perosamina, GDP-desóxi-D-talose, GDP-6-desóxi-D- altrose, GDP-4-ceto-3,6-didesóxi-D-manose, ou GDP-L-colitose operativamente ligada às sequências de controle de expressão específicas de vertebrado, que permitem a expressão da sequência de ácido nucleico que codifica a dita proteína na dita célula, e opcionalmente (i) pelo menos um polinucleotídeo que compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica o transportador de nucleotídeo de açúcar de GDP-desoxihexose para GDP-D-ramnose, GDP-D-perosamina, GDP-desóxi-D-talose, GDP-6-desóxi-D-altrose, GDP-4-ceto-3,6-didesóxi-D- manose, ou GDP-L-colitose operativamente ligado às sequências de controle de expressão específicas de vertebrado, que permitem a expressão da sequência de ácido nucleico que codifica a dita proteína na dita célula.

[00120] Como um resultado, (i) a(s) enzima(s), (ii) a(s) proteína(s) de interesse, (iii) a(s) glicosiltransferase(s), e opcionalmente (iv) o transportador de nucleotídeo de açúcar de GDP-desoxihexose são superexpressados na célula de vertebrado da presente invenção.

[00121] A(s) dita(s) proteína(s) são modificada(s) ainda pela(s) glicosiltransferase(s) coexpressada(s), que faz(em) uso do(s) produto(s) final(is) da(s) enzima(s), a saber GDP-D-ramnose, GDP-D-perosamina, GDP- desóxi-D-talose, GDP-6-desóxi-D-altrose, GDP-4-ceto-3,6-didesóxi-D-manose, e/ou GDP-L-colitose, e a(s) integra(m) dentro das glicoestruturas da(s) proteína(s) que carece(m) de fucose ou com uma quantidade reduzida de fucose nas suas glicoporções. Isto leva à geração de nova(s) proteína(s) artificial(is) que compreende(m) D-ramnose, D-perosamina, desóxi-D-talose, 6-desóxi-D-altrose, 4-ceto-3,6-didesóxi-D-manose, e/ou L-colitose nas suas glicoporções.

[00122] Preferivelmente, o transportador de nucleotídeo de açúcar de GDP-desoxihexose mencionado acima é o transportador de nucleotídeo de açúcar de GDP-desoxihexose do complexo de Golgi, isto é o transportador que permite o transporte dos açúcares de nucleotídeo mencionados acima através da membrana do complexo de Golgi de uma célula de vertebrado, por exemplo célula eucariótica.

[00123] A célula (modificada) de vertebrado de acordo com a presente invenção pode ser usada para produzir vírus envelopados que compreendem glicoproteínas ou glicolipídeos de superfície de envelope não tendo nenhuma fucose nas suas glicoporções ou com uma quantidade reduzida de fucose nas suas glicoporções.

[00124] Preferivelmente, o vírus envelopado é usado totalmente ou em parte como um componente ativo de uma vacina viral. O termo “vacina viral” significa uma preparação de um vírus enfraquecido ou morto que na administração estimula a produção de anticorpo ou de imunidade celular contra o vírus mas é incapaz de causar infecções severas.

[00125] A célula (modificada) de vertebrado de acordo com a presente invenção também pode ser usada para produzir vírus envelopados que compreendem glicoproteínas ou glicolipídeos de superfície de envelope que compreendem D-ramnose, D-perosamina, desóxi-D-talose, 6-desóxi-D- altrose, 4-ceto-3,6-didesóxi-D-manose, e/ou L-colitose nas suas glicoporções.

[00126] Em um segundo aspecto, a presente invenção diz respeito a um método para produzir uma molécula, que naturalmente compreende fucose nas suas glicoporções, que carece de fucose ou com uma quantidade reduzida de fucose nas suas glicoporções que compreende as etapas de: i) fornecer uma célula de vertebrado de acordo com o primeiro aspecto, ii) isolar a molécula que é capaz de ser um substrato para uma fucosiltransferase, preferivelmente uma proteína ou lipídeo, da célula em i).

[00127] Preferivelmente, na etapa i), a molécula que é capaz de ser um substrato para uma fucosiltransferase, por exemplo uma proteína, é expressada na célula em i).

[00128] As ditas moléculas, por exemplo proteínas ou lipídeos que carecem de fucose ou com uma quantidade reduzida de fucose nas suas glicoporções, podem ser facilmente isoladas na etapa ii) da célula de vertebrado.

[00129] Vários procedimentos de isolação são conhecidos na técnica para moléculas incluídas dentro das células eucarióticas (por exemplo células de vertebrado) ou secretadas a partir de tais células que compreendem as moléculas modificadas, por exemplo proteínas que carecem de fucose ou com uma quantidade reduzida de fucose nas suas glicoporções. Tais métodos tipicamente envolvem colheita da célula, desintegração e fracionamento/purificação no caso de moléculas intracelulares e geração de um sobrenadante de cultura isento de célula seguidos pela purificação das moléculas secretadas.

[00130] Um procedimento de extração que é útil de acordo com a invenção não interfere com as moléculas modificadas a serem isoladas. Por exemplo, a extração é preferivelmente realizada na ausência de detergentes e agentes redutores fortes, ou qualquer agente que possa induzir a desnaturação da proteína.

[00131] Em um terceiro aspecto, a presente invenção fornece uma molécula que carece de fucose ou com uma quantidade reduzida de fucose nas suas glicoporções obteníveis pelo método do segundo aspecto. Preferivelmente, esta molécula é um lipídeo ou proteína.

[00132] É particularmente preferido que a proteína seja um anticorpo, um hormônio, um antígeno ou uma proteína viral como apresentada acima com respeito ao primeiro aspecto.

[00133] É particularmente preferido que o lipídeo seja um gliceroglicolipídeo, o mais preferivelmente um galactolipídeo, um sulfolipídeo (SQDG), ou um glicoesfingolipídeo, o mais preferivelmente um cerebrosídeo (por exemplo um galactocerebrosídeo ou um glicocerebrosídeo), um gangliosídeo, um globosídeo, um sulfatídeo ou um glicofosfoesfingolipídeo. Preferivelmente, o lipídeo, por exemplo gangliosídeo, está compreendido na membrana de um vírus envelopado.

[00134] O mais preferivelmente, a proteína viral e/ou lipídeo estão compreendidos no envelope de um vírus envelopado.

[00135] Em um outro aspecto, a presente invenção fornece uma composição de moléculas de acordo com o terceiro aspecto.

[00136] Em um quarto aspecto, a presente invenção fornece uma molécula que compreende glicoporções contendo D-ramnose, D-perosamina, desóxi-D-talose, 6-desóxi-D-altrose, 4-ceto-3,6-didesóxi-D-manose, e/ou L- colitose obteníveis pelo método do segundo aspecto.

[00137] É preferido que esta molécula não compreenda nenhuma ou uma quantidade reduzida L-fucose nas suas glicoporções. Preferivelmente, esta molécula é um lipídeo ou proteína. Adicionalmente células de vertebrado são fornecidas, preferivelmente células de tumor que expressem tais moléculas modificadas, preferivelmente lipídeos e/ou proteínas. Particularmente preferidas são as células de tumor contendo glicanos que compreendem D-ramnose. A D-ramnose é um bloco de construção de polissacarídeos de Ganoderma lucidum. Estes polissacarídeos são usados na medicina chinesa tradicional para realçar a atividade de células efetoras imunológicas: células NK e células matadoras ativadas por linfocina são ativadas e a fagocitose e a citotoxicidade de macrófagos são aumentadas (Zhu et al., 2007, Journal of Ethnopharmacology 111 (2), 219-226). Tais células podem ser usadas para aumentar a resposta imune contra uma dada célula de tumor, por exemplo como em um método de imunização ativa.

[00138] Em um outro aspecto, a presente invenção fornece uma composição de moléculas de acordo com o quarto aspecto.

[00139] Em um quinto aspecto, a presente invenção fornece uma composição que compreende glicoproteínas que compreendem i) entre 70 e 95 %, isto é 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, e 95 %, preferivelmente 80 % de G0 -GlcNac, G0, G1, e/ou G2 de N-glicanos do tipo complexo, e ii) entre 5 e 30 %, isto é 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 %, 21 %, 22 %, 23 %, 24 %, 25 %, 26 %, 27 %, 28 %, 29 %, e 30 %, preferivelmente 20 % de N- glicanos do tipo manose alta, em que os N-glicanos do tipo complexo das glicoproteínas são isentos de fucose ou substancialmente isentos de fucose. Preferivelmente as glicoproteínas da composição são as glicoproteínas preferidas indicadas acima, em particular anticorpos.

[00140] É particularmente preferido que dos N-glicanos do tipo complexo dentro da composição de 70 % a 80 %, preferivelmente cerca de 75 % sejam G0 e de 20 % a 30 %, preferivelmente cerca de 25 % sejam N- glicanos do tipo complexo G0 -GlcNac, G1 e/ou G2, e/ou que dos N-glicanos do tipo manose alta 45 % a 55 %, preferivelmente cerca de 50 % sejam glicanos man5 e 45 a 55 %, preferivelmente cerca de 50 % sejam N-glicanos man6, man7 e/ou man8. É entendido que os números em cada caso somam até 100 %.

[00141] Também é particularmente preferido que dos N-glicanos do tipo complexo dentro da composição de 70 % a 90 %, preferivelmente cerca de 80 % sejam G0 e de 10 % a 30 %, preferivelmente cerca de 20 % sejam N- glicanos do tipo complexo G0 -GlcNac, G1 e/ou G2, e/ou que dos N-glicanos do tipo manose alta de 60 % a 85 %, preferivelmente cerca de 70 % sejam glicanos man5 e de 15 a 40 %, preferivelmente cerca de 30 % sejam N- glicanos man6, man7 e/ou man8. É entendido que os números em cada caso somem até 100 %.

[00142] As glicoproteínas são preferivelmente aquelas indicadas como preferidas no contexto do primeiro aspecto da invenção, em particular anticorpos, por exemplo IgG1s, IgG2s, IgG3s ou IgG4s, em que estes anticorpos preferivelmente têm uma atividade de ADCC mais alta do que uma composição de anticorpo produzida em uma célula precursora, não modificada (por exemplo célula eucariótica, tal como célula de vertebrado).

[00143] ADCC é o mecanismo de dominação pelo qual os anticorpos direcionados contra as células de tumor (câncer) exibem seus efeitos). ADCC também pode ser usado para eliminar células imuno específicas para interromper a patogênese em doença autoimune.

[00144] Várias doenças que incluem infecções virais e bacterianas podem ser prevenidas e tratadas pela supressão da proliferação de células infectadas com um vírus ou bactéria que usam o anticorpo tendo alta atividade de ADCC de acordo com a presente invenção.

[00145] Em um sexto aspecto, a presente invenção fornece uma proteína, preferivelmente uma proteína não procariótica, preferivelmente uma proteína viral ou mamífera, ou um lipídeo, preferivelmente um lipídeo não procariótico, por exemplo um glicoesfingolipídeo, que compreende glicoporções contendo D-ramnose, D-perosamina, desóxi-D-talose, 6-desóxi- D-altrose, 4-ceto-3,6-didesóxi-D-manose, e/ou L-colitose. Preferivelmente, a proteína viral e/ou lipídeo são compreendidos no envelope de um vírus envelopado. Alternativamente, células eucarióticas, preferivelmente de vertebrado mais preferivelmente de mamífero e o mais preferivelmente humanas (células de tumor alogênicas ou autólogas) são fornecidas que compreendem tais proteínas e/ou lipídeos.

[00146] Preferivelmente, a proteína ou lipídeo compreende D-ramnose, D-perosamina, desóxi-D-talose, 6-desóxi-D-altrose, 4-ceto-3,6-didesóxi-D- manose, e/ou L-colitose, mais preferivelmente D-ramnose e/ou D-perosamina, nas suas glicoporções e nenhuma ou uma quantidade reduzida de L-fucose nas suas glicoporções. Está claro que as proteínas do sexto aspecto também podem ter todas as propriedades, que são a consequência de usar os aspectos preferidos e particularmente preferidos dos métodos da presente invenção.

[00147] É conhecido que açúcares artificiais, tais como D-ramnose, D- perosamina, desóxi-D-talose, 6-desóxi-D-altrose, 4-ceto-3,6-didesóxi-D- manose, e/ou L-colitose, conferem resistência aos peptídeos catiônicos, por exemplo polimixina B, defensinas, etc., por exemplo, pela neutralização da carga na superfície bacteriana (ver Breazeale et al., 2003, The Journal of Biological Chemistry, 278, 24731-24739).

[00148] As defensinas são proteínas catiônicas ricas em cisteína pequenas encontradas, por exemplo, em eucariotas (por exemplo vertebrados). Eles são ativos contra bactérias, fungos e muitos vírus envelopados e não envelopados. Eles consistem de 18 a 45 aminoácidos que incluem 6 (em vertebrados) a 8 resíduos de cisteína conservados. As células eucarióticas (por exemplo de vertebrado) do sistema imune contêm estes peptídeos para ajudar na morte das bactérias fagocitadas, por exemplo em granulócitos neutrofílicos e quase todas as células epiteliais.

[00149] Assim, o estabelecimento de vírus envelopados que compreendem proteínas virais contendo D-ramnose, D-perosamina, desóxi-D- talose, 6-desóxi-D-altrose, 4-ceto-3,6-didesóxi-D-manose, e/ou L-colitose, preferivelmente o açúcar de amino catiônico D-perosamina, nas suas glicoporções é altamente útil, por exemplo, na terapia de gene como vetores, visto que estes vírus seriam resistentes contra ataques de defensinas e outros peptídeos catiônicos da defesa imune congênita. A produção de vírus ou glicoproteínas virais contendo um ou mais dos resíduos de açúcar D-ramnose, D-perosamina, desóxi-D-talose, 6-desóxi-D-altrose, 4-ceto-3,6-didesóxi-D- manose, e/ou L-colitose nas suas glicoporções seria altamente útil para induzir uma resposta imune superior. Estes resíduos de açúcar naturalmente não estão presentes nas glicoproteínas de mamífero. Entretanto, eles são frequentes nas glicoproteínas e lipopolissacarídeos de bactérias. Pseudomonas aeruginosa a origem da sequência de RMD é um dos mais importantes patógenos bacterianos encontrados pelos hospedeiros imunocomprometidos e pacientes com fibrose cística (CF).

[00150] Particularmente, o estabelecimento de proteínas contendo o resíduo de açúcar D-perosamina ou vírus envelopados que compreendem proteínas virais contendo o resíduo de açúcar D-perosamina é, devido à cationicidade da D-perosamina, preferida. Um vírus que compreende glicoproteínas contendo o resíduo de açúcar D-perosamina no seu envelope tem uma carga de superfície catiônica que pode proteger o dito vírus contra a defesa imune congênita.

[00151] Em um sétimo aspecto, a presente invenção fornece uma unidade de expressão que compreende uma ou mais sequências de controle de expressão de vertebrado operativamente ligada a um (primeiro) polinucleotídeo que compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica uma enzima que usa GDP-6-desóxi-D-lixo-4-hexulose como um substrato, em que a enzima não catalisa a reação que converte GDP-6-desóxi- D-lixo-4-hexulose na GDP-L-fucose.

[00152] A unidade de expressão pode ser qualquer sistema de expressão conhecido pela pessoa habilitada na técnica em que a uma ou mais sequências de controle de expressão de vertebrado e um (primeiro) polinucleotídeo que compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica uma enzima que usa GDP-6-desóxi-D-lixo-4-hexulose como um substrato podem ser integradas, por exemplo um plasmídeo, um cosmídeo, um vírus etc.

[00153] Preferivelmente, a uma ou mais sequências de controle de expressão de vertebrado compreendidas na unidade de expressão são operativamente ligadas ao (primeiro) polinucleotídeo que compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica uma enzima que usa GDP-6-desóxi- D-lixo-4-hexulose como um substrato para permitir a expressão da sequência de ácido nucleico que codifica uma enzima que usa GDP-6-desóxi-D-lixo-4- hexulose como um substrato na célula de vertebrado, por exemplo célula CHO ou HeLa.

[00154] Preferivelmente, o vetor de expressão, por exemplo vetor plasmídico, permite a expressão transitória de uma sequência de ácido nucleico que codifica uma enzima que usa GDP-6-desóxi-D-lixo-4-hexulose como um substrato no citoplasma de uma célula de vertebrado ou permite a expressão estável de uma sequência de ácido nucleico que codifica uma enzima que usa GDP-6-desóxi-D-lixo-4-hexulose como um substrato na célula de vertebrado depois da integração da dita sequência no genoma da dita célula.

[00155] É particularmente preferido que a enzima que usa GDP-6- desóxi-D-lixo-4-hexulose como um substrato seja selecionada do grupo que consiste de GDP-6-desóxi-D-lixo-4-hexulose redutase (RMD), GDP- perosamina sintetase (Per), GDP-6-desóxi-D-talose sintetase (GTS), mutante de GDP-Fucose sintetase Cys109Ser- (GFS-Cys109Ser), GDP-4-ceto-6- desoximanose-3-desidratase (ColD), preferivelmente GDP-4-ceto-6- desoximanose-3-desidratase (ColD) em combinação com GDP-L-colitose sintase (ColC), e variantes destas.

[00156] Preferivelmente, a unidade de expressão compreende ainda um (segundo) polinucleotídeo que compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica uma glicosiltransferase para GDP-D-ramnose, GDP-D- perosamina, GDP-desóxi-D-talose, GDP-6-desóxi-D-altrose, GDP-4-ceto-3,6- didesóxi-D-manose, ou GDP-L-colitose, de modo preferível operativamente ligada a um ou mais elementos de controle de expressão de vertebrado, por exemplo um promotor, e preferivelmente compreendida em um vetor de expressão, por exemplo vetor plasmídico, para permitir a expressão da sequência de ácido nucleico que codifica a dita glicosiltransferase na célula de vertebrado, por exemplo célula CHO, a célula HeLa ou uma célula de tumor, preferivelmente uma célula de tumor autóloga, e opcionalmente um (terceiro) polinucleotídeo que compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica um transportador de nucleotídeo de açúcar de GDP-desoxihexose para GDP-D-ramnose, GDP-D-perosamina, GDP-desóxi-D-talose, GDP-6- desóxi-D-altrose, GDP-4-ceto-3,6-didesóxi-D-manose, ou GDP-L-colitose, de modo preferível operativamente ligada a um ou mais elementos de controle de expressão de vertebrado, por exemplo um promotor, e preferivelmente compreendida em um vetor de expressão, por exemplo vetor plasmídico, para permitir a expressão da sequência de ácido nucleico que codifica o dito transportador de nucleotídeo de açúcar de GDP-desoxihexose na célula de vertebrado, por exemplo célula CHO, célula HeLa ou uma célula de tumor, preferivelmente uma célula de tumor autóloga.

[00157] O dito primeiro, segundo, e opcionalmente terceiro polinucleotídeos podem ser integrados separadamente dentro dos vetores de expressão, por exemplo vetores de expressão transitórios ou vetores que integram dentro do genoma da célula. Alternativamente, o dito primeiro, segundo, e opcionalmente terceiro polinucleotídeos podem ser compreendido em uma vetor de expressão. A expressão pode ser direcionada a partir de um promotor, dois promotores, ou três promotores. No primeiro caso é preferido que as proteínas codificadas pelo primeiro, segundo, e opcionalmente terceiro polinucleotídeos sejam transcritas como um transcrito único e sejam separadas apenas por um IRES.

[00158] Em uma forma de realização preferida da invenção, a unidade de expressão compreende uma ou mais sequências de controle de expressão de vertebrado operativamente ligadas a um primeiro polinucleotídeo que compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica a enzima RMD, uma ou mais sequências de controle de expressão de vertebrado operativamente ligadas a um segundo polinucleotídeo que compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica uma glicosiltransferase para GDP- D-ramnose, e opcionalmente uma ou mais sequências de controle de expressão de vertebrado operativamente ligadas a um terceiro polinucleotídeo que compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica um transportador de nucleotídeo de açúcar de GDP-desoxihexose para GDP-D- ramnose, preferivelmente compreendido em um vetor de expressão, em dois vetores de expressão, ou em três vetores de expressão, respectivamente.

[00159] Em uma outra forma de realização preferida da invenção, a unidade de expressão compreende uma ou mais sequências de controle de expressão de vertebrado que controlam a expressão da sequência de ácido nucleico que codifica a enzima RMD compreendida dentro de um primeiro polinucleotídeo, a sequência de ácido nucleico que codifica uma glicosiltransferase para a GDP-D-ramnose compreendida dentro de um segundo polinucleotídeo, e opcionalmente a sequência de ácido nucleico que codifica um transportador de nucleotídeo de açúcar de GDP-desoxihexose para GDP-D-ramnose dentro de um terceiro polinucleotídeo, em que o primeiro, segundo, e opcionalmente terceiro polinucleotídeos são separados um do outro por um IRES, preferivelmente compreendidos em um vetor de expressão.

[00160] A unidade de expressão de acordo com o sétimo aspecto da invenção também pode ser usado na medicina, em particular na preparação de uma vacina para a terapia ou profilaxia de doenças que se beneficiam da estimulação imune, em particular tumores.

[00161] Adicionalmente, no contexto do sétimo aspecto todas as formas de realização mais preferidas e particularmente preferidas do primeiro aspecto da invenção, em particular relacionadas com os polinucleotídeos que compreendem vários ácidos nucleicos a serem expressados, elementos de controle de expressão, por exemplo que direcionam a expressão moderada ou baixa da enzima que usa GDP-6-desóxi-D-lixo-4-hexulose, são igualmente preferidos no contexto do sétimo aspecto.

[00162] Em muitos casos, tempo considerável foi usado e esforços enormes foram feitos pelas companhias biofarmacêuticas para gerar e desenvolver linhagens de célula produtoras farmacêuticas eficazes que expressassem o transgene de interesse em níveis desejáveis. Em casos onde o transgene de interesse é um anticorpo terapêuticos que pode se beneficiar da função efetora ADCC realçada, é altamente desejável manipular ainda a linhagem de célula produtora em um tal modo que a célula produtora alta seja incapaz de ligar a fucose de núcleo às N-glicoporções ou seja capaz de ligar açúcares artificiais às N-glicoporções.

[00163] Preferivelmente, como já mencionado acima, a unidade de expressão compreende ainda um segundo polinucleotídeo que compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica uma glicosiltransferase para GDP-D-ramnose, GDP-D-perosamina, GDP-desóxi-D-talose, GDP-6-desóxi- D-altrose, GDP-4-ceto-3,6-didesóxi-D-manose, ou GDP-L-colitose, e opcionalmente um terceiro polinucleotídeo que compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica um transportador de nucleotídeo de açúcar de GDP-desoxihexose para GDP-D-ramnose, GDP-D-perosamina, GDP-desóxi- D-talose, GDP-6-desóxi-D-altrose, GDP-4-ceto-3,6-didesóxi-D-manose, ou GDP-L-colitose. É preferido que o segundo polinucleotídeo que compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica uma glicosiltransferase para GDP-D-ramnose, GDP-D-perosamina, GDP-desóxi-D-talose, GDP-6-desóxi- D-altrose, GDP-4-ceto-3,6-didesóxi-D-manose, ou GDP-L-colitose seja operavelmente ligada a uma ou mais sequências de controle de expressão de vertebrado para permitir a expressão da sequência de ácido nucleico que codifica a dita glicosiltransferase na célula de vertebrado, por exemplo células HeLa ou CHO. Também é preferido que o terceiro polinucleotídeo que compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica um transportador de nucleotídeo de açúcar de GDP-desoxihexose para GDP-D-ramnose, GDP- D-perosamina, GDP-desóxi-D-talose, GDP-6-desóxi-D-altrose, GDP-4-ceto- 3,6-didesóxi-D-manose, ou GDP-L-colitose seja operavelmente ligado a uma ou mais sequências de controle de expressão de vertebrado para permitir a expressão da sequência de ácido nucleico que codifica o dito transportador de nucleotídeo de açúcar de GDP-desoxihexose na célula de vertebrado, por exemplo células HeLa ou CHO.

[00164] A razão da expressão das sequências de ácido nucleico diferentes entre si depende tanto do número de cópia quanto do sítio de integração no genoma da célula de vertebrado. Por meio de processos de triagem padrão, é possível isolar clones de célula que expressam os produtos de gene individuais na razão desejada.

[00165] A dita unidade de expressão preferida pode ser facilmente aplicada às linhagens de célula já existentes (por exemplo CHO, HeLa) em um modo que as tornem capazes de ligar outros açúcares artificiais que não a fucose (por exemplo D-ramnose, D-perosamina, desóxi-D-talose, ou 6- desóxi-D-altrose) às glicoestruturas nascentes de glicoproteínas ou glicolipídeos. Esta unidade de expressão também pode ser facilmente aplicada às linhagens de célula já geneticamente engendradas (por exemplo CHO IgG1) em um modo que as tornem capazes de ligar outros açúcares artificiais que não fucose (por exemplo D-ramnose) às glicoestruturas nascentes de glicoproteínas, por exemplo de modo a produzir anticorpos tendo uma estrutura de glicosilação artificial, tais como IgG1/+D-ramnose.

[00166] Preferivelmente, a unidade de expressão compreende um outro polinucleotídeo (como um segundo, terceiro, ou quarto polinucleotídeo) que compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína de interesse, por exemplo IgG1. É preferido que o outro polinucleotídeo, que compreende um ácido nucleico que codifica uma proteína de interesse, por exemplo IgG1, seja operavelmente ligado às sequências de controle de expressão para permitir a expressão da sequência de ácido nucleico que codifica a dita proteína em uma célula de vertebrado, por exemplo células HeLa ou CHO.

[00167] No contexto da unidade de expressão do sétimo aspecto da presente invenção todos os elementos, preferivelmente ácidos nucleicos que codificam enzima, elementos de controle de expressão, sequência de ácido nucleico que codifica uma enzima, que usam GDP-6-desóxi-D-lixo-4- hexulose como um substrato e em que a enzima não catalisa a reação que converte GDP-6-desóxi-D-lixo-4-hexulose em GDP-L-fucose, divulgado no primeiro e segundo aspectos da invenção são similarmente preferidos.

[00168] Em um oitavo aspecto, a presente invenção diz respeito a uma célula (modificada) eucariótica para produzir uma proteína, que normalmente compreende fucose nas suas glicoporções, que carece de fucose ou tendo uma quantidade reduzida de fucose nas suas glicoporções que compreende: i) um primeiro polinucleotídeo que compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica uma enzima que usa GDP-6-desóxi- D-lixo-4-hexulose como um substrato, e ii) um segundo polinucleotídeo que compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína, em que a enzima não catalisa a reação que converte GDP-6- desóxi-D-lixo-4-hexulose em GDP-L-fucose.

[00169] No contexto da célula eucariótica todas as formas de realização preferidas e particularmente preferidas anteriormente descritas no contexto da célula de vertebrado do primeiro aspecto da invenção são similarmente preferidas.

[00170] Preferivelmente, a célula eucariótica é uma célula de vertebrado, por exemplo mamífero, um peixe, um anfíbio, um réptil ou uma célula aviária, preferivelmente como esboçado acima com respeito ao primeiro aspecto da invenção, ou uma célula de inseto. As células de inseto, por exemplo células Sf9 ou Hi5, usadas em conjunção com o sistema de expressão de baculovírus são preferidos para produzir glicoproteínas por causa de altos rendimentos e velocidade. Entretanto, as glicoproteínas das células de inseto podem conter alfa 1,3-fucose de núcleo. O resíduo de açúcar contribui em um grau maior com os anticorpos contra glicoproteínas derivadas de inseto, em particular anticorpos IgE. Eles são a base das reações alérgicas às glicoproteínas de inseto.

[00171] As células de inseto que compreendem pelo menos uma enzima que usa GDP-6-desóxi-D-lixo-4-hexulose como um substrato, em que a enzima não catalisa a reação que converte GDP-6-desóxi-D-lixo-4-hexulose em GDP-L-fucose carecerão de fucose ou terão fucose reduzidas nos seus glicanos. Isto reduzirá ou eliminará reações alérgicas a tais glicoproteínas.

[00172] A célula (modificada) eucariótica mencionada acima pode também compreender mais do que um polinucleotídeo que compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica uma enzima que usa GDP-6-desóxi- D-lixo-4-hexulose como um substrato, por exemplo polinucleotídeos que compreendem sequências de ácido nucleico que codifica diferentes enzimas que usam GDP-6-desóxi-D-lixo-4-hexulose como um substrato (ver primeiro aspecto da presente invenção).

[00173] Em um nono aspecto, a presente invenção diz respeito a um método para produzir uma proteína, que normalmente compreende fucose nas suas glicoporções, que carece de fucose ou com uma quantidade reduzida de fucose nas suas glicoporções que compreende as etapas de: i) fornecer uma célula eucariótica de acordo com o oitavo aspecto, ii) expressar a enzima codificada pelo primeiro polinucleotídeo e a proteína codificada pelo segundo polinucleotídeo na dita célula, e iii) isolar a proteína da dita célula.

[00174] No contexto do método que usa a célula eucariótica da presente invenção todas as formas de realização preferidas e particularmente preferidas anteriormente descritas no contexto da célula de vertebrado do primeiro aspecto da invenção e do método do segundo aspecto da presente invenção são similarmente preferidos no contexto do nono aspecto da invenção.

[00175] Em um décimo aspecto a presente invenção diz respeito a uma proteína que carece de fucose ou tendo uma quantidade reduzida de fucose nas suas glicoporções obteníveis pelo método do nono aspecto.

[00176] Várias modificações e variações da invenção estarão evidentes a aqueles habilitados na técnica sem divergir do escopo da invenção. Embora a invenção tenha sido descrita em conexão com as formas de realização específicas preferidas, deve ser entendido que a invenção como reivindicada não deve ser indevidamente limitada a tais formas de realização específicas. De fato, várias modificações dos modos descritos para realizar a invenção que são óbvias para aqueles habilitados na técnica nos campos relevante são intencionados a serem abrangidos pela presente invenção.

[00177] As figuras e exemplos que seguem são meramente ilustrativos da presente invenção e não devem ser interpretados como limitantes do escopo da invenção como indicado pelas reivindicações anexas em qualquer modo.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[00178] A Fig. 1 mostra uma vista geral da recuperação de fucose e caminhos de novo em células eucarióticas (por exemplo células de vertebrado). Na ausência de fucose, as células são incapazes de sintetizar GDP-fucose por intermédio do caminho de recuperação (ver painel à direita). O caminho de novo pode ser bloqueado pela conversão enzimática do intermediário GDP-4-ceto-6-desoximanose em um produto final morto que tipicamente não ocorre em células de vertebrado (painel à esquerda). Se a enzima derivada é RMD, por exemplo, então o produto final morto é GDP-D- ramnose. GDP-desoxihexoses tais como GDP-D-ramnose podem exercer uma inibição de retroalimentação sobre a enzima de GMD bloqueando deste modo ainda o caminho de novo da fucose assim como a síntese de GDP-ramnose alternativa.

[00179] A Fig. 2 mostra a fluorescência de GFP de células RMD- CHO-IgG que estavelmente superexpressam o transgene RMD.

[00180] A Fig. 3 mostra uma análise de RT-PCR de clones que expressam o Transgene RMD. Linha M = bp-DNA-Marcador, Linha 1: RMD-CHO-IgG clone 1; Linha 2: RMD-CHO-IgG clone 2; Linha 3: RMD- CHO-IgG clone 3; Linha 4: RMD-CHO-IgG clone 4; Linha 5: RMD-CHO- IgG clone 5; Linha 6: RMD-CHO-IgG clone 6; Linha 7: CHO-IgG clone precursor; Linha 8: controle de PCR negativa. A faixa RMD é visível em todos os clones tranfectados com RMD.

[00181] A Fig. 4 mostra uma comparação sinóptica de perfis de MALDI MS de N-glicanos permetilados liberados de IgG1 de células CHO- IgG (B) e RMD-CHO-IgG (A). Oligossacarídeos de anticorpo Fc liberados pela digestão com PNGase F foram analisados usando um espectrômetro de massa TOF/TOF UltraFlex III equipado com um laser smartbeam-II®. Os picos de valor m/z correspondem ao íon de oligossacarídeo associado a sódio. Todos os sinais de íon molecular [M + Na]+ rotulados podem ser designados como anotados. Uma mudança de 164 Da dos picos m/z principais no espectro de MALDI mostrados no painel A é indicativo da perda de fucose. A estrutura de oligossacarídeo esquemática de cada pico é ilustrada acima de cada pico anotado. As N-glicoestruturas obtidas de um anticorpo IgG1 terapêutico expressado nas células RMD-CHO-IgG que estavelmente superexpressa o transgene RMD são completamente destituídos de Resíduos de Fucose ligados e contêm uma quantidade comparativamente maior de estruturas com manose alta com base nas intensidades relativas de pico MALDI (Painel A; estruturas de Manose Alta proeminentes circundadas) enquanto que as N-Glicoestruturas obtidas a partir de um anticorpo IgG1 terapêutico expressado nas células precursoras de CHO-IgG não modificadas são fucosiladas no núcleo e contêm quantidades significantemente mais baixas de estruturas com manose alta. (Resíduos de fucose = triângulos pretos circundados; Painel B).

[00182] A Fig. 5 mostra um espectro de MALDI-TOF de N-glicanos de IgG desialilados produzidos usando (A) células CHO WT; (B) RMD-CHO clone H1; (C) RMD-CHO clone H2; (D) RMD-CHO clone H3. Todos os íons moleculares estão presentes na forma sodada [M+Na+] ou potassada [M+K+] (cruz preta). O círculo cinza escuro, Man; círculo claro, Gal; quadrado preto, GlcNAc; triângulo preto, Fuc; cruz branca, não contém nenhum material de carboidrato.

[00183] A Fig. 6 mostra em (A) curvas de ligação de FcgRIIIa-His (Phe158) à IgG WT e IgG afucosilada na ausência de plasma. A ligação de FcYRIIIa foi detectada por um ELISA que usa FcYRIIIa-His como um reagente de captura, anticorpo de IgG anti-humano conjugado com peroxidase como um reagente de detecção e Tetrametilbenzidina (TMB) como um substrato cromogênico. Os pontos indicam a absorção média de peroxidase reagida com TMB a 450 nm, n = 2. As barras indicam SD. Círculos abertos = IgG tipo selvagem (WT) fucosilada, círculos fechados = IgG não fucosilada derivada de clone H1 (H1); quadrados fechados = IgG não fucosilada derivada de clone H2 (H2); triângulos fechados apontando para cima = IgG não fucosilada derivada de clone H3 (H3). A mesma mostra em (B) aumento de vezes relativo na ligação em FCYRIII de IgG não fucosilada em relação à IgG WT. O aumento em vezes relativo na ligação em FCYRIII foi calculado a partir dos valores EC50. WT, IgG fucosilada do tipo selvagem; H1, IgG não fucosilada derivada de clone H1; H2, IgG não fucosilada derivada de clone H2; H3, IgG não fucosilada derivada de clone H3.

[00184] A Fig. 7 mostra a preparação e análise de Células NK para ensaios de atividade de ADCC. (A) Plotagem de pontos mostrando o nível de pureza das células NK primárias isoladas usadas nos ensaios de ADCC. As células NK primárias foram isoladas de sangue integral de um doador humano saudável pela separação em pérola magnética. As células NK isoladas foram depois analisadas quanto a pureza pela citometria de fluxo que usa anticorpos contra os marcadores de célula NK CD16 e CD56. (B) Desempenho das células NK isoladas. De modo a determinar a atividade citossólica das células NK isoladas, as células alvejadas a K562 tingidas com calceína AM foram incubadas sozinhas, com células NK ou com o agente de lisagem de célula saponina por 4 horas. A intensidade de fluorescência média (MFI) liberada a partir das células alvo incubadas indiretamente indica o grau de lise de célula. A MFI observada para a lise de célula mediada por NK subtraída da MFI obtida para a lise de célula expontânea indica a MFI específica máxima possível a ser observada no ensaio de ADCC. Observe que a lise mediada por NK não atinge completamente o nível de MFI obtido a partir da lise total.

[00185] A Fig. 8 mostra a atividade de ADCC in vitro de IgG não fucosilada e fucosilada derivada de CHO e RMD-CHO. Os pontos indicam a lise de célula específica média (%) em uma dada concentração de IgG (%), n = 4; as barras indicam +/-SD, IgG do tipo selvagem (quadrados abertos), IgG não fucosilada derivada de clone H1 (círculos fechados), IgG não fucosilada derivada de clone H2 (triângulo fechado apontando para baixo) e IgG não fucosilada derivada de clone H3 (triângulo fechado apontando para cima). Dados comparáveis foram obtidos quando as células SK-BR-3 foram usadas como células alvo (dados não mostrados).

[00186] A Fig. 9 mostra um perfil de HPAEC-PAD de monossacarídeos hidrolisados a partir da fração citossólica de (A) células CHO não modificadas e (C) RMD-CHO clone H2. (B), (A) reforçadas com 10 pmol/μl de L-ramnose e (D), (C) reforçadas com 10 pmol/μl de L- ramnose. Como os monossacarídeos não foram re-N-acetilados depois da hidrólise com TFA, GlcNAc foi medido como GlcNH2. Sob as condições selecionadas, o pico de L-ramnose elui em um tempo de retenção de aproximadamente 15,5 minutos. Observar a ausência do pico de fucose a partir dos cromatogramas de HPAEC-PAD do lisado de célula do clone H2 modificado.

[00187] A Fig. 10 mostra um perfil de HPAEC-PAD de monossacarídeos liberados a partir de N-glicanos de IgG de (A), WT CHO e (C), o clone H2 de RMD-CHO modificado, (B), (A) reforçado com 10 pmol/μl de L-ramnose e (D), (C) reforçado com 10 pmol/μl de L-ramnose. Visto que os monossacarídeos não foram re-N-acetilados depois da hidrólise de TFA, GlcNAc foi medido como GlcNH2. Sob as condições selecionadas, o pico de L-ramnose elui em um tempo de retenção de aproximadamente 15,5 minutos. Observe a ausência do pico de fucose dos cromatogramas de HPAEC-PAD da amostra de N-glicano de IgG derivada de RMD-CHO clone H2.

EXEMPLOS 1. Parte Experimental 1.1 Materiais e Métodos 1.1.1 Linhagens de célula

[00188] A linhagem de célula CHO/DG44 recombinante CHO-IgG foi estabelecida mais no princípio em nosso laboratório pela transfecção estável da linhagem de célula CHO deficiente na diidrofoliato redutase, CHO/DG44 (Urlaub et al., 1986, Proc Natl Acad Sci USA. 83 (2): 337-341) com um vetor de expressão contendo um cassete de expressão de anticorpo que compreende sequências de nucleotídeo que codificam cadeia leve e pesada de um anticorpo monoclonal terapêutico (Trastuzumab (Herceptin®)). A geração da linhagem de célula RMD-CHO-IgG começou a partir da linhagem de célula CHO-IgG existente. Ambas as linhagens de célula foram mantidas em meio isento de soro. 1.1.2 Otimização e Síntese de Gene A sequência de aminoácido para a oxidorredutase Rmd (Pseudomonas aeruginosa PAO1; 304 aminoácidos) (Acesso no GenBank No: AAG08839.1) foi traduzida de modo reverso e a sequência de nucleotídeo resultante otimizada pelo silenciamento de sítios de junção críptica e elementos de sequência que desestabilizam RNA, otimização para a estabilidade e adaptação de RNA aumentada de uso de códon para emparelhar as exigências de células CHO (Cricetulus griseus). 1.1.3 Construção do plasmídeo de expressão de RMD

[00189] A construção de RMD sintetizada foi cortada com EcoRI e Bgl II e desfosforilada com fosfatase intestinal de bezerro. O inserto digerido e desfosforilado foi ligado em um vetor de expressão bicistrônico pré-digerido que permite a coexpressão coordenada de RMD e proteína fluorescente verde de uma mensagem bicistrônica (gfp). O plasmídeo de expressão é equipado com um gene de resistência à neomicina para permitir quanto a seleção direta de células que tenham estavelmente integrado o cassete de expressão bicistrônico. Os procedimentos gerais para construir plasmídeos de expressão são descritos em Sambrook, J., E. F. Fritsch e T. Maniatis: Cloning I/II/III, A Laboratory Manual Nova Iorque/Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Segunda Edição. 1.1.4 Conversão de células CHO-IgG que produzem anticorpo em células que secretam anticorpos não-fucosilados

[00190] As células CHO-IgG que expressam estavelmente o anticorpo terapêutico tipo IgG1 Trastuzumab foram estavelmente transfectadas com o transgene RMD-gfp pela eletroporação de acordo com as instruções do fabricante (MicroPorator, PEQLAB Biotech, Alemanha). 24 h depois transfectantes da eletroporação foram selecionados em alfa-MEM contendo o antibiótico G418. Os clones resistentes a G418 foram depois isolados pela clonagem em diluição limitante, isto é eles foram recolocados em suspensão neste meio seletivo e semeados em placas de 96 reservatórios em diluições onde a sua probabilidade de obter uma colônia de uma única célula é maior 95 % com base nas estatísticas de Poisson. Para garantir a monoclonalidade, as células cultivadas dentro dos 96 reservatórios foram isoladas e mais uma vez semeadas em placas de 96 reservatórios na diluição limitante. Depois destas duas rodadas de clonagem de célula única, um par dos clones de célula única isolado foi expandido em volumes maiores. Depois disso, eles foram adaptados para o cultivo em suspensão. Usando o protocolo de eletroporação descrito uma eficiência de transformação de aproximadamente 2000 por 2 x 106 células eletroporadas foi obtida como avaliado a partir da distribuição de fluorescência de gfp nas placas de cultura (Fig. 2). 1.1.5 Triagem de Clone pela Microscopia de Fluorescência

[00191] Os clones de célula única foram semeados em placas de 96 reservatórios e triados quanto a integração de RMD bem sucedida pelo monitoramento de fluorescência de GFP com um Olympus IX-50 (Olympus Optical Co., Europe) adaptado com um adaptador cmount. Para a varredura de GFP um filtro de fluorescência na extensão de 200 vezes foi usado versus contraste de fase. As imagens foram editadas pela aplicação Viewfinder lite. Adicionalmente, a expressão de mRNA do transgene RMD foi confirmado pela análise de RT-PCR. A expressão bem sucedida do transgene de RMD foi confirmado pela RT-PCR que usa um conjunto específico de RMD de iniciadores (Fig. 3). 1.1.6 Produção de IgG1 não modificada e glicoengendrada pela cultura de batelada isenta de soro em tubos de agitador

[00192] De modo a comparar as glicoestruturas de anticorpos produzidas pelos clones produtores de CHO modificados com RMD (RMD- CHO-IgG) com a glicoestrutura de anticorpos tipo IgG1 secretados de células produtoras de anticorpo CHO não modificadas (CHO-IgG), ambas as linhagens de célula foram usadas para produzir anticorpos de IgG1 no sobrenadante de cultura. Os clones produtores de anticorpo RMD-CHO-IgG e CHO-IgG foram inoculados em 2 x 105 células/ml em um meio de cultivo deficiente em fucose. Os tubos de agitador foram incubados a 180 rpm, 37° C, 7,5 % pCO2. A cultura foi interrompida depois de 7 dias quando as células mostraram ainda uma vitalidade > 80 %. A densidade de células viáveis foi medida com um contador de célula automático, Vi-CELL® XR (Beckman Coulter, Fullerton, CA), que usa a exclusão de azul de tripano. O padrão de declínio da viabilidade e relação à duração do ensaio de lote alimentado assim como a produtividade específica média (qp) entre os dias 3 e 10 do ensaio de agitador de lote alimentado permaneceu comparável entre os dois clones diferentes. As células foram depois pelotizadas pela centrifugação por 10' a 5000 rpm e o sobrenadante foi transferido em um frasco separado. As células RMD-CHO IgG e CHOIgG não modificadas foram cultivadas da mesma forma. A concentração de anticorpo nos sobrenadantes de cultura foi medida no Gyrolab Workstation (Gyros AB, Suécia) por um Imuno Ensaio Intercalado específico para IgG1 humana. Ambos os clones cresceram logaritmicamente, produziram títulos de IgG comparativos nas respectivas datas de amostragem e tiveram um tempo de duplicação inicial comparativo. Ambos os clones retiveram a morfologia típica de células do ovário de hamster chinês. 1.1.7 Purificação de IgG1 pela Cromatografia de Afinidade com a Proteína A

[00193] A seguir da filtração estéril em filtro de 0,2 μm, o sobrenadante foi carregado em uma mini coluna de proteína-A-Sepharose. 0,5 ml de material de suporte de coluna com uma capacidade total de 10 mg foi usado. A coluna foi equilibrada com 5 volumes de coluna de fosfato de sódio a 20 mM, pH 7,0 no fluxo de gravidade. Depois a ligação da proteína em uma taxa de fluxo lenta, a coluna foi lavada duas vezes com o tampão de equilíbrio. Depois o anticorpo foi eluído com 4 volumes de coluna de tampão de glicina a 0,1 M, pH 3,0 no fluxo de gravidade. As frações de 1 ml foram coletadas e imediatamente neutralizadas com Tris-HCl 1 M, pH 9. Integridade e pureza de cada IgG1 purificado foi confirmado pela análise de SDS-PAGE redutora. A pureza foi > 90 % e a integridade dos anticorpos eluídos foi confirmada pela análise de SDS-PAGE redutora. 1.1.8 Preparação de derivado de anticorpo ligado em N Oligossacarídeos

[00194] 100 μg de cada anticorpo foram usados para a caracterização espectrométrica de massa de oligossacarídeos ligados em N. As proteínas foram digeridas com tripsina (0,2 mg/ml, 16 h, 37° C) antes que os N- Glicanos fossem liberados pela incubação com 1 unidade de peptídeo-N- glicosidase F (PNGaseF, Roche Diagnostics) por 18 h a 37° C. Os N-glicanos liberados foram recuperados pela cromatografia de duas etapas em colunas RP- (Sep-Pak C18-) seguidas pelas colunas limpas de extrato carbográfico (Wuhrer et al., 2006, Glycobiology 16 (2006), pp. 991-1006). 50 % de cada reunião de N-glicano foram digeridos com 10 mU de Neuraminidase 18 h a 37° C e 50 % foram permetilados com iodeto de metila como descrito por Ciucanu e Kerek (Ciucanu e Kerek, 1984, Carbohidr Res. 1984: 131:209). 1.1.9 Análise de Oligossacarídeos ligados em N pela MALDI- TOF-MS

[00195] Os N-glicanos liberados de cada IgG1 purificada foram analisados por um UltraFlex espectrômetro de massa III TOF/TOF (Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Alemanha) equipado com um laser smartbeam-II®. As medições foram realizadas no modo de íon positivo. Os íons positivos foram submetidos a uma voltagem de aceleração de 25 kV e uma demora de extração de 10 ns e analisados em um modo reflectron. Para a análise, os glicanos desialilados foram dissolvidos em H2O e os glicanos permetilados foram dissolvidos em 70 % (v/v) acetonitrila. 0,5 μl de amostras foi misturado 1:1 (v/v) com Arabinosazona (2 mg/ml) dissolvido em 80 % de EtOH em um alvo e deixado secar na temperatura ambiente. Uma calibração externa com uma escada de dextrano foi usada. Os espectros foram analisados usando Glyco-peakfinder (Maas et al., 2007, Proteomics 7, 4435-4444). As estruturas de glicano identificadas foram construídas com o software GlycoWorkbench (Ceroni et al., 2008, J. Proteome Res. 7(4) 1650-1659). A análise de perfil de oligossacarídeo de produtos purificados a partir do meio de cultura final confirmou que os Fc oligossacarídeos ligados em N dos produtos foram do tipo manose alta assim como do complexo tipo de duas antenas, e que o produto de IgG1 secretado do clone RMD-CHO-IgG totalmente careceu da fucosilação de núcleo. A análise da glicoestrutura mostrou que a razão de oligossacarídeos não fucosilados dos anticorpos produzidos pelos clones que coexpressam RMD aumentaram significantemente em cada caso (isto é, até 99 %, 95 %, 97 %, e 98 %), comparados com aqueles dos clones CHO-IgG precursores (Fig. 4). As N-Glicoestruturas obtidas a partir de produto de anticorpo IgG1 expressadas em células RMD-CHO-IgG são quase completamente isentos de resíduos de fucose ligados e contêm uma quantidade comparativamente maior de estruturas do tipo de manose alta com base nas intensidades relativas de pico de MALDI (Fig. 4, Painel A; estruturas do tipo manose alta proeminente circundadas), enquanto que as N- Glicoestruturas obtidas de um anticorpo IgG1 terapêutico expressado em células CHO-IgG não modificadas são fucosiladas no núcleo e contêm quantidades significantemente mais baixo de estruturas do tipo manose alta (Resíduos de fucose = triângulos circundados; Fig. 4, Painel B). 2. Parte experimental 2.2 Materiais e Métodos 2.2.1 Linhagens de célula, Otimização e síntese de gene, Construção do plasmídeo de expressão de RMD, Conversão de células CHO- IgG que produzem anticorpo em células que secretam anticorpos não fucosilados, Triagem de clone pela microscopia de fluorescência e RT-PCR

[00196] Como para a linhagem de célula CHO-IgG usada de modo a produzir a linhagem de célula RMD-CHO-IgG, a otimização e síntese de gene de RMD, a construção do plasmídeo de expressão de RMD, a conversão de células CHO-IgG que produz anticorpo nas células que secretam anticorpos não fucosilados, a triagem de clone pela microscopia de fluorescência para a integração de RMD bem sucedida e a RT-PCR para a expressão de mRNA bem sucedida do transgene de RMD, são aludidos os itens 1.1.1 a 1.1.5 como mencionado acima (1. Parte experimental). 2.2.2 Cultura de lote alimentado

[00197] A IgG foi produzida usando tanto célula CHO quanto RMD- CHO (clones H1, H2 e H3) de modo a comparar as suas estruturas de N- glicano. As células foram semeadas a 4x105 células/ml em frascos agitados de 500 ml em 100 ml de meio isento de soro (formulação adaptada pela ProBioGen; SAFC Bioscience, Lenexa, KA) suplementada com 4 mM de glutamina mas sem antibióticos ou MTX. As culturas foram agitadas a 180 rpm em 37° C e 7,5 % de CO2. As células foram alimentadas com 1,75 ml de Mistura PBG-Feed por 100 ml de volume de cultura no dia de cultura 4. A densidade e viabilidade de célula foram determinadas pela exclusão em azul de tripano que usa um sistema de quantificação de célula ViCell automatizado (Beckman Coulter, Brea, CA). As alíquotas de sobrenadante de cultura de célula foram coletadas nos dias 3, 5 e 7 de modo a determinar as concentrações de IgG, que foram medidas pelo imunoensaio intercalado Gyrolab. A cultura foi interrompida depois de 7 dias quando as células ainda mostraram vitalidade mais alta do que 80 %. O sobrenadante de cultura de célula foi coletado e filtrado estéril. 2.2.3 Imuno ensaio intercalado Gyrolab específico de IgG1

[00198] A concentração de IgG1 foi determinada por um imuno ensaio intercalado realizado em um Workstation Gyrolab (Gyros AB, Uppsala, Suécia). O ensaio incluiu a adição sequencial de anticorpo de captura biotinilado, que reconhece epítopos na parte Fc de IgG, amostras de sobrenadante de cultura de célula ou padrão de referência de IgG policlonal humano e um anticorpo de detecção rotulada com Alexa Fluor 647, que liga epítopos no domínio Fab de IgG. As amostras e padrões foram medidos em triplicata. A OD média, desvio padrão (SD), e % de coeficiente de variação (% CV) foram calculados automaticamente pelo software avaliador Gyrolab depois de cada rodada. O imuno ensaio intercalado Gyrolab de IgG1 descrito foi pré-validado com base na premissa de que os resíduos para cada padrão de calibração atingem um limite de aceitação de 20 % de erro relativo (RE). 2.2.4 Purificação de IgG usando a cromatografia de afinidade de proteína A

[00199] O sobrenadante de cultura de célula foi carregado em uma coluna de 0,5 ml de Proteína A-Sepharose, pré-equilibrada com 20 mM de fosfato de sódio, pH 7,0. Depois de lavar a coluna com dois volumes de leito de tampão de equilíbrio, o anticorpo foi eluído com 4 volumes de coluna de glicina 0,1 M pH 3,0. Frações foram coletadas e imediatamente neutralizada com Tris-HCl 1 M, pH 9. A integridade e pureza de cada IgG purificada foram confirmadas pela análise de SDS-PAGE redutora. A concentração de proteína da IgG purificada foi determinada pelo imuno ensaio intercalado Gyrolab. 2.2.5 Processamento de N-glicanos de IgG

[00200] As IgGs (100 μg) foram digeridas com tripsina por 16 h a 37° C. A reação foi terminada aquecendo-se a amostra por 5 min a 95° C. Os anticorpos foram digeridos ainda com 1 U de PNGase F por 18 h a 37° C. Os N-glicanos liberados foram isolados e dessalinizados em cartuchos Sep-Pak C18 de fase reversa seguido pelas colunas limpas de extrato carbográfico. Cada reunião de N-glicano foi digerida com 10 mU de Neuraminidase por 18 h a 37° C. 2.2.6 Espectrometria de massa

[00201] Os N-glicanos foram analisados em um espectrômetro de massa UltraFlex III TOF/TOF (Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Alemanha) equipado com um laser smartbeam-II® e uma instalação LIFT-MS/MS. Os espectros foram registrados em um modo de refletor em uma voltagem de aceleração de 25 kV e uma demora de extração de 10 ns. As medições foram realizadas no modo de íon positivo. A calibração externa foi realizada usando uma escada de dextrano. Os N-glicanos desialilados foram dissolvidos em H2O. Amostras de 0,5 μl foram misturadas 1:1 (v/v) com D-arabinosazona (5 mg/ml) dissolvida em etanol aquoso a 70 % em um alvo de aço (Chen et al. 1997). Os espectros foram analisados usando Glyco-Peakfinder [Maas et al., 2007]. As estruturas de glicano identificadas foram construídas com o software GlycoWorkbench [Ceroni et al., 2008]. 2.2.7 Ensaio de ligação específica de receptor Fc-gama IIIA (FCYRIIIA)

[00202] A atividade de ligação de FCYRIIIA das amostras de IgG foi analisada por um ensaio de ligação específica de FcyRIIIA como descrito pr Niwa et al., 2004 com modificações leves. Um FcyRIIIA rotulado com histidina (HIS) (F158) (22 kDa; 158F; R&D Systems, Mineápolis, MN) foi usado em combinação com um anticorpo monoclonal anti-tetraHIS (Qiagen, Hilden, Alemanha) para a ligação de receptor. Imunoplacas (Maxisorp, Thermo, Waltham, MA) foram revestidos com anticorpo anti-tetraHIS e bloqueado com reagente bloqueador (Roche Diagnostics, Penzberg, Alemanha). Subsequentemente, FcyRIIIA recombinante rotulado com HIS foi adicionado às imunoplacas. As placas revestidas foram depois incubadas com diluições de amostra em série e controles de modo que possam ligar o receptor de FcyRIIIA imobilizado. Depois de uma etapa de lavagem, as IgGs ligadas foram detectadas por um mAb conjugado com peroxidase de IgG antihumana (Dianova, Hamburg, Alemanha) e a quantidade de IgG ligado foi quantificada por intermédio da atividade de peroxidase. Depois de cada etapa de incubação a imunoplaca foi lavada 3 vezes com PBS contendo 0,2 % de Tween-20. Tetrametilbenzidina (TMB; Seramun, Heidesee, Alemanha) foi usado como um substrato cromogênico, a reação foi terminada usando ácido sulfúrico 1 M e finalmente, a absorção foi detectada a 450 nm (Leitora Infinite F200, Tecan, Crailsheim, Alemanha). Com base nos dados de absorção dependente da concentração, ajustes de curva completos foram conduzidos usando um modelo de curva logística de 4 parâmetros (Magellan Software 6.1, Tecan). A precisão intra-serial para este ensaio de ligação de FcyRIIIA foi determinada estar dentro de 15 % CV. 2.2.8 Ensaio de citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC)

[00203] As células NK humanas primárias foram isoladas a partir de células mononucleares de sangue periférico (PBMCs). As PBMCs foram separadas do sangue integral de doadores humanos saudáveis pela centrifugação de gradiente de densidade e as células NK foram subsequentemente isoladas pela separação de pérola magnética negativa (Miltenyi, Bergisch Gladbach, Alemanha). A pureza das células NK isoladas foi confirmada pela citometria de fluxo (anticorpos CD16 conjugado com PE e CD56 conjugado com Alexa488, BD, San Jose, CA). As linhagens de célula BT-474 (Lasfargues et al., 1978, invasive ductal carcinoma of the breast, human, CLS, Eppelheim, Alemanha) e SK-BR-3 (Zabrecky et al., 1991, adenocarcinoma of the breast, human, ATCC, Manassas, VA) foram usados como células alvo. Ambas as linhagens de célula foram confirmadas positivas para o marcador Her2/neu pela citometria de fluxo (dados não mostrados). As linhagens de célula alvo foram revitalizadas a partir de um banco de célula de pesquisa 3 dias antes da inoculação. A lise da célula alvo induzida pela célula NK dependente de anticorpo foi quantificada pela liberação de uma cepa vital (Calcein AM, Life Technologies, Carlsbad, CA). As células alvo foram tingidas de acordo com o protocolo dos fabricantes e semeados a 2 x 104 células viáveis/reservatórios em 50 μl de RPMI1640 (Life Technologies) + 10 % de FCS (Biochrom, Berlim, Alemanha) em placas micro tituladoras de 96 reservatórios. Diluições 1:3 em série de anticorpos em RPMI1640 + 10 % de FCS foram preparadas. 50 μL/reservat0rio de cada diluição foram pipetados com n = 3 e pré-incubados com as células alvo por 30 min a 37° C antes da inoculação de célula NK. No final da pré-incubação de anticorpo, as células efetoras foram semeadas a uma razão de efetor para célula alvo (E:T) de 5:1. As placas foram subsequentemente centrifugadas a 200 g por 3 min e incubadas por 4 h a 37° C e 5 % de CO2. Para cada linhagem de célula, um controle de lise de célula alvo espontâneo (células NK w/o), um controle de lise de célula alvo independente de anticorpo (células NK w/) e um controle de lise de célula alvo total (induzido pela saponina) foram induzidos. A lise total nos reservatórios de controle foi induzida adicionando-se 15 μl/reservat0rio 0,1 mg/ml de saponina em RPMI1640 + 10 % FCS 15 min antes do final do período de incubação. Em todos os outros reservatórios, 15 μl de RPMI1640 + 10 % FCS foram adicionados. A liberação de calceína AM foi quantificada pela detecção de fluorescência no sobrenadante de cultura. As placas foram centrifugadas (150 g; 3 min) e 100 μl de sobrenadante de cada reservatório foram transferidos em uma placa de fluorescência preta de 96 reservatórios (Thermo). A intensidade de fluorescência média (MFI) foi detectada usando uma leitora Infinite F200 (Tecan, filtro de excitação/emissão de 485/535 nm). O ajuste de curva foi feito usando um modelo de resposta de dose logística de 4 parâmetros (software Magellan versão 6.1). A lise de célula específica foi calculada como segue: Lise de célula específica [%] = [MFI (amostra) - MFI (espontâneo)] / [MFI (total) - MFI (espontâneo)] x 100. Ao passo que MFI (amostra) é a intensidade de fluorescência média liberada pela lise de célula alvo específica, MFI (espontâneo) é a liberação gradual do corante fluorescente pelas células alvo, e MFI (total) é intensidade de fluorescência média obtida depois da lise de célula alvo total induzida por detergente. 2.2.9 Análise de monossacarídeo e determinação de ramnose

[00204] As células (3 x 107) foram separadas do sobrenadante pela centrifugação a 100 g por 5 min. Estas foram subsequentemente lisadas por 3 ciclos de descongelamento-congelamento. As membranas celulares foram depois separadas das frações citossólicas a 21 000 g por 30 min a 4° C. O sobrenadante de cultura de células, membranas celulares, frações citossólicas assim como N-glicanos de IgG foram hidrolisados em TFA de 2 N por 4 h a 100° C. Depois da evaporação sob atmosfera reduzida, as amostras foram analisadas pela HPAEC-PAD em uma coluna PA-1 que usa um Dionex ICS- 3000 e 2-desoxirribose foi usada como o padrão interno. Os monossacarídeos neutros foram separados pela elução isocrática com 2,25 mM de NaOH. A adição pós coluna de 200 mM de NaOH permitiu a detecção amperométrica. Visto que HPAEC-PAD não permite a designação de identidade enantiomérica (Horton, D. 2004), L-ramnose foi usado como um padrão para determinar o tempo de retenção esperado para a D-ramnose. A LOD para ramnose foi determinada como descrito no Capítulo 6.3 das diretrizes tripartidas harmonizadas da ICH para a validação de procedimentos analíticos (ICHQ2 (R1)). 2.3 Resultados 2.3.1 Expressão heteróloga do transgene de RMD

[00205] Para avaliar os efeitos da expressão de transgene RMD sobre os níveis de fucosilação de IgG secretada, um vetor equipado com um cassete de expressão bicistrônica que compreende os genes para a GDP-6-desóxi-D- lixo-4-hexulose redutase (RMD) e proteína fluorescente verde (gfp) foi gerada e introduzida em um clone CHO/ DG44 que foi previamente engendrado para a superexpressão e secreção de uma versão biossimilar do anticorpo terapêutico tipo IgG1 Trastuzumab (Herceptin®, Roche). Os clones resistentes a G418 que expressa o transgene foram identificados pela sua fluorescência verde mediada por gfp e apareceu dentro de 2 semanas de transfecção. Uma eficiência de transformação de aproximadamente 80 % foi obtida pela eletroporação como avaliado a partir da distribuição da fluorescência gfp (dados não mostrados mas comparáveis com dados mostrados na Fig. 2). A expressão bem sucedida do transgene de RMD foi confirmado pela RT-PCR que usa um conjunto específico de RMD de iniciadores (dados não mostrados mas comparáveis com os dados mostrados na Fig. 3). As células CHO modificadas que expressam o transgene RMD são chamadas de RMD-CHO. 2.3.2 Cultura de lote alimentado isenta de soro de células CHO e RMD-CHO que produzem anticorpo

[00206] A cultura de lote alimentado isenta de soro das células CHO precursora não modificada e a célula RMD-CHO transfectada que produz IgG foi realizada em tubos de biorreator de 50 ml contendo um meio de crescimento deficiente em fucose suplementado com L-glutamina. Os tubos de biorreator foram inoculados em uma densidade de célula de partida de 4 X105 células/ml e depois incubadas a 180 rpm, 37° C, 7,5 % de pCO2. O desempenho das culturas de lote alimentado foi monitorado por 14 dias e foi comparado lado a lado. A análise comparativa de culturas de lote alimentado paralelas de células CHO e RMD-CHO não mostrou nenhum desvio significante em um curso de 14 dias. as taxas de duplicação inicial, as taxas de proliferação e os títulos de IgG nas respectivas datas de amostragem foram congruentes para ambas as linhagens de célula. Ambos os clones retiveram a morfologia típica de células CHO. O padrão de declínio da viabilidade em relação à duração do ensaio de lote alimentado assim como a produtividade específica média (qp) entre os dias 3 e 10 do ensaio de agitador de lote alimentado permaneceram comparáveis para os dois clones diferentes (dados não mostrados). 2.3.3 Análise de N-glicano de IgG produzida a partir de células CHO e RMD-CHO

[00207] As células CHO e RMD-CHO foram cultivadas em uma cultura de batelada. Três clones de RMD-CHO diferentes que produzem IgG foram usados, a saber H1, H2 e H3. As células foram inoculadas em uma densidade de célula de partida de 4 x 105 células/ml e cultivadas por 7 dias em tubos de biorreator a 180 rpm, 37° C, 7,5 % de pCO2. Os sobrenadantes foram colhidos no dia 7 e as amostras de IgG foram purificadas pela cromatografia de afinidade de proteína A. A pureza e integridade dos anticorpos eluídos foram confirmados pela SDS-PAGE redutora. Os N- glicanos, liberados que usam PNGase F, foram desialilados e subsequentemente analisados pela MALDI-TOF-MS. A quantificação relativa de intensidades de sinal de N-glicanos foi realizada como foi demonstrado mais no princípio para dar resultados confiáveis quando comparado com métodos cromatográficos (Wada et al., 2007). Estruturas de N-glicano do tipo de manose alta assim como do tipo complexo de antena dupla foram detectadas em todas as amostras (Fig. 5). N-glicanos de antena dupla monofucosilados agalactosilados/ monogalactosilados/digalactosilados foram as três estruturas de N-glicano mais abundantes encontradas na IgG do tipo selvagem (WT) (Fig. 5 A). A presença de fucose de núcleo naqueles picos, a saber em m/z 1485,4, 1647,4 e 1809,4, foi confirmada pela MALDI-TOF/TOF. Um fragmento de íon de diagnóstico dHex1HexNAc2 foi observado em cada espectro em m/z 592,8. Nas amostras de IgG que foram produzidas de células RMD-CHO, apenas quantidades traços de fucose foram observados (Fig. 5 B, C, D) representando um máximo de 2 % da reunião de N-glicano total (amostra H2). Simultaneamente, a amostra H2 conteve uma quantidade maior de estruturas do tipo manose alta do que IgG do tipo selvagem. 2.3.4 Atividade de ligação de IgG1-Fc de IgG produzida a partir de células CHO e RMD-CHO

[00208] Visto que a interação comparativamente fraca (K ~1 μM) entre IgG1 e seu receptor de Fc cognato FcYRIIIa é um dos fatores principais que contribuem para a função efetora de ADCC (Sondermann et al., 2000), um ensaio de ligação de FcYRIIIa é uma medida indireta para prognosticar a atividade ADCC de amostras de anticorpo monoclonal de IgG1. A ligação de FcYRIIIa de IgG não fucosilada secretada a partir das células RMD-CHO foi enormemente aumentada com ligação equivalente em ~16 vezes menos proteína para FcYRIIIa-158F quando comparada com IgG fucosilada secretada das células CHO do tipo selvagem (Fig. 6 A, B). Os dados são reportados na Fig. 6 B como vezes de aumento relativo na ligação de IgG não fucosilada que usa a IgG fucosilada como uma referência. 2.3.5 Atividade ADCC de IgG não fucosilada produzida que usa células RMD-CHO

[00209] Para analisar a atividade ADCC, as células NK isoladas e as células alvo que expressam HER2 foram co-incubadas com diluições em série de IgG afucosilada e fucosilada. Como um pré-requisito para o ensaio, as células NK foram isoladas a partir de amostras de sangue integral em um nível de pureza de 73 % (Fig. 7). O controle da citotoxicidade celular NK técnica mostrou uma atividade de lise específica de 77 % para o material doador usado para o ensaio ADCC (Fig. 7). A linhagem de célula alvo que expressa HER2 BT-474 (isolada de um carcinoma humano, invasivo dutal da mama) foi usado no ensaio de ADCC. A linhagem de célula alvo BT-474 também é atacada pelas células NK pelos mecanismos outros que não ADCC. As células BT-474 mostram um valor médio de 16 % de lise de célula independente de anticorpo (dados não mostrados). Os dados para a lise de célula específica induzida pelas amostras de IgG são demonstradas na Fig. 8. Todas as três amostras de IgG não fucosilada (H1-H3) induziram uma resposta ADCC aumentada comparada com o anticorpo WT (Fig. 8). A amostra de IgG não fucosilada H2 induziu a resposta ADCC mais alta (Fig. 8). Resultados similares foram obtidos quando as células SK-BR-3 (adenocarcinoma positivo em HER2 da mama) foram usadas como células alvo no ensaio. Os valores de EC50 calculados para amostras de IgG afucosiladas e fucosiladas incubadas com células BT-474 e SK-BR-3 são resumidas na Tabela 2 (ver abaixo). A mudança observada na EC50 entre IgG tipo selvagem e as variantes H1 a H3 permaneceram comparáveis independente da linhagem de célula alvo usada no ensaio ADCC (Fig. 8). Na presença das linhagens de célula alvo de BT474 e SK-BR-3 positivas em HER2 e células NK purificadas, a IgG não fucosilada mostrou uma atividade de esgotamento de célula alvo mediada por anticorpo de 16 vezes em média com valores de EC50 médios de 0,443 μg/ml e 0,00817 μg/ml que indicaram uma eficácia muito mais alta comparada com a IgG fucosilada. Deve ser mencionado que as amostras de IgG não fucosilada que mostraram uma atividade de ligação de FcYRIIIa aumentada também induziu uma resposta de ADCC mais alta comparada com a IgG WT.

[00210] Tabela 2: Resultados resumidos da função efetora de ADCC de IgG afucosilada (H1-3) e fucosilada (WT) incubada com células alvo que apresentam antígeno diferentes (BT-474, SK-BR-3). A razão calculada de EC50 (fucosilada) / EC50 (afucosilada) indica a função efetora de ADCC realçada.

2.3.6 Análise de Monossacarídeo - Ausência de quantidades detectáveis de D-ramnose em lisados de célula assim como em N-glicanos de IgG

[00211] As membranas celulares, sobrenadantes de cultura e frações citossólicas foram isoladas de células RMD-CHO. Os monossacarídeos foram subsequentemente liberados e analisados pela HPAEC-PAD. Como esperado, a fucose foi presente nas células CHO e não nas células RMD-CHO. Um nível de ramnose que excede o limite de detecção (LOD) não foi observado nas frações citossólicas (Fig. 9). Com base no desvio padrão do intercepto y e inclinação das curvas de calibração, as LOD foram 1,2 pmol e 1,1 pmol por 10 μl de volume de injeção de amostra para ramnose e fucose, respectivamente. Similarmente, N-glicanos, liberados de anticorpos purificados produzidos usando células RMD-CHO, foram hidrolisados com TFA e os monossacarídeos resultantes foram analisados pela HPAEC-PAD. Os N-glicanos hidrolisados por TFA não produziram nenhum pico de ramnose que excedeu a LOD (Fig. 10). Para concluir, nem as células RMD- CHO nem os anticorpos secretados contêm quantidades detectáveis de ramnose.

2.4 Comentários Finais

[00212] Nós avaliamos um método de glicoengendramento para obter a secreção de mAbs deficientes em fucose a partir de linhagens de célula que foram modificadas quanto a remoção contínua de um intermediário metabólico chave do caminho da síntese de novo da fucose citossólica (Fig. 1). Nossos dados claramente mostram que uma expressão transgênica de uma enzima bacteriana heteróloga leva ao bloqueio desejado na síntese de fucose nos N-glicanos de glicoproteína nascentes. O grau de esgotamento de fucose por este método também indica que a omissão de fucose do meio de cultura foi suficiente para bloquear completamente o caminho de recuperação, que pode de outro modo ter servido como uma fonte alternativa de GDP-fucose citossólica.

[00213] O alvo metabólico chave em nosso método foi GDP-4-ceto-6- desóxi-D-manose, que é um intermediário comum para a síntese de várias GDP-monodesoxihexoses diferentes que incluem GDP-L-fucose, GDP-4- desóxi-D-talose, GDP-colitose, e GDP-D-perosamina, por exemplo, em bactérias. Além disso, um sítio ativo Cys109Ser mutante de GDP-fucose sintase produz GDP-6-desóxi-D-altrose ao invés de GDP-fucose (Lau e Tanner, 2008).

[00214] A enzima procariótica específica que nós exemplarmente selecionamos para o nosso método foi GDP-6-desóxi-D-lixo-4-hexulose redutase (sinônimo com GDP-4-ceto-6-desóxi-D-manose redutase, abreviado RMD) (Kneidinger et al., 2001; Maki et al., 2002). Nós demonstramos aqui que a expressão heteróloga da enzima procariótica GDP-6-desóxi-D-lixo-4- hexulose redutase (RMD) dentro do citosol pode eficientemente desviar o caminho de novo da fucose. A dita enzima utiliza NADH e NADPH como doadores de hidrogênio e catalisa a redução alvejada do grupo 4-ceto do intermediário GDP-4-ceto-6-desóxi-D-manose do caminho de fucose para produzir GDP-D-ramnose. A conversão de GDP-4-ceto-6-desóxi-D-manose para GDP-D-ramnose pela RMD parece progredir quantitativamente, porque nenhuma reação reversa foi detectada (Kneidinger et al., 2001).

[00215] Nossos dados também mostram que GDP-ramnose, uma 6- desoxihexose encontrada apenas em glicoconjugados de certas bactérias mas não em animais (Webb et al., 2004), é um produto que nunca produzirá resultados positivos dentro do contexto do citosol de vertebrado. As células de vertebrado não modificadas carecem de rhamnosiltransferases (Webb et al., 2004) e transportadores de membrana de modo que a incorporação de GDP- D-ramnose em glicanos nascentes é muito improvável dentro das células de vertebrado. Nossos dados puderam confirmar isto. Eles claramente mostram que a D-ramnose artificial não foi incorporada na IgG secretada ou em outro lugar na célula (Fig. 9 e Fig. 10).

[00216] Além da falta de fucose nas estruturas de glicano, as IgGs secretadas dos clones geneticamente engendrados mostraram um nível mais alto de estruturas do tipo de manose alta. Isto pode surgir de uma inibição de retroalimentação de GMD pela GDP-D-ramnose. A falta de atividade GMD como um escoamento metabólico alternativo para GDP-manose pode ter contribuído para uma reunião elevada de GDP-D-manose citossólica que por sua vez pode ter causado a elevação de estruturas do tipo de manose alta observada em produtos secretados das células hospedeiras modificadas com RMD (Fig. 4 e Fig. 5).

[00217] Nossos resultados para o ensaio de ligação FCYRIII assim como para o ensaio de ADCC in vitro também mostram que IgG não fucosilada têm uma atividade de ligação significantemente mais alta para FcYRIIIa e uma resposta ADCC realçada. A mudança EC50 observada e o aumento em vezes na atividade de esgotamento de célula alvo (Tabela 2, Fig. 8) teriam sido ainda mais altos se o ensaio tivesse sido conduzido na presença de sangue integral, soro ou plasma. De maneira interessante, nós observamos que a amostra de IgG não fucosilada H2 com o nível mais alto de estruturas de manose alta, também mostraram a atividade de ADCC mais alta, independente da célula alvo usada no ensaio (BT474 ou SK-BR-3) (Tabela 2).

[00218] Quando juntos, este estudo demonstra que a superexpressão de RMD em células hospedeiras de vertebrado causa um esgotamento de um intermediário chave importante para a síntese de GDP-fucose citossólica, GDP-4-ceto-6-desóxi-D-manose. Este método permite a geração de linhagens de célula metabolicamente engendrada mas também oferece uma nova estratégia altamente promissora para converter clones de célula que expressam anticorpo existentes em células produtoras para produtos terapêuticos esgotados em fucose. A capacidade para engendrar com segurança a deficiência em fucose em linhagens de célula já existentes pode ajudar a acelerar o desenvolvimento de medicamento para a geração seguinte de anticorpos monoclonais.

3. Abreviações

[00219] ACN, Acetonitrila; CHO, Ovário de hamster chinês; CV, coeficiente de variação; dHex, desoxihexose; EC50, concentração eficaz meia máxima (isto é a concentração de agonista que provoca um meio caminho de resposta entre a resposta de linha de base e a máxima), Fuc, fucose; Gal, galactose; GalNAc, N-acetilgalactosamina; GlcNAc, N-acetilglicosamina; GMER, GDP-4-ceto-6-desóxi-D-manose-3,5-epimerase/4-redutase; HPLC, cromatografia líquida de alto desempenho; HPAEC-PAD, cromatografia de troca de ânion em pH alto com detecção amperométrica pulsada; LOD Limite de Detecção; mAb, anticorpo monoclonal; MALDI-TOF-MS espectrometria de massa de tempo de voo de ionização de dessorção a laser auxiliada por matriz; MEM, Meio de Eagle Modificado; PBMCs, células mononucleares de sangue periférico; PBS, solução salina tamponada com fosfato; PNGase F, peptideo-N4-(N-acetil-β-glucosaminil) asparagina amidase F; Rha, ramnose; RMD, GDP-6-desóxi-D-lixo-4-hexulose redutase; SDS, dodecil sulfato de sódio; TFA, Ácido trifluoroacético. REFERÊNCIAS Ceroni, A., Maass, K., Geyer, H., Geyer, R., Dell, A., Haslam, S.M. 2008. GlycoWorkbench: A Tool for the Computer-Assisted Annotation of Mass Spectra of Glycans, Journal of Proteome Research, 7 (4), 1650-1659. Chen, P, Baker AG, Novotny MV. 1997. The use of osazones as matrices for the matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry of carbohydrates. Anal Biochem. 244(1): 144-51. Horton, D 2004 Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry. D. Horton, Editor, Elsevier Academic Press, Amsterdam and San Diego, Vol. 59, p.11. ICH Q2(R1): ICH Harmonized Tripartite Guideline: Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology Q2(R1) Current Step 4 version, Parent Guideline dated 27 October 1994. Kneidinger B, Graninger M, Adam G, Puchberger M, Kosma P, Zayni S, Messner P. 2001. Identification of two GDP-6-deoxy-D-lyxo-4- hexulose reductases synthesizing GDP-D-rhamnose in Aneurinibacillus thermoaerophilus L420-91T. J Biol Chem. Feb 23;276(8): 5577-83. Lasfargues EY, Coutinho WG and Redfield ES. 1978. Isolation of two human tumor epithelial cell lines from solid breast carcinomas. J Natl Cancer Inst.; 61(4): 967-78. Lau S.T.B., Tanner, M.E. 2008. Mechanism and Active Site Residues of GDP-Fucose Synthase, Journal of the American Chemical Society, vol. 130, no51, pp. 17593-17602 Maki M, Jarvinen N, Rabina J, Roos C, Maaheimo H, Renkonen R; Pirkko; Mattila. 2002. Functional expression of Pseudomonas aeruginosa GDP-4-keto-6-deoxy-D-mannose reductase which synthesizes GDP-rhamnose. Eur J Biochem. Jan;269(2): 593-601. Niwa R, Shoji-Hosaka E, Sakurada M, Shinkawa T, Uchida K, Nakamura K, Matsushima K, Ueda R, Hanai N, Shitara K.2004. Defucosylated anti-CC chemokine receptor 4 IgG1 with enhanced antibodydependent cellular cytotoxicity shows potent therapeutic activity to T cell leukemia and lymphoma. Cancer Res, 64: 2127-2133. Niwa R, Hatanaka S, Shoji-Hosaka E, Sakurada M, Kobayashi Y, Uehara A, Yokoi H, Nakamura K, Shitara K. 2004. Enhancement of the antibody-dependent cellular cytotoxicity of low-fucose IgG1 is independent of FcgammaRIIIa functional polymorphism. Clin Cancer Res, 10: 6248-6255. Shields RL, Lai J, Keck R, O'Connell LY, Hong K, Meng YG, Weikert SH, Presta LG. 2002. Lack of fucose on human IgG1 N-linked oligosaccharide improves binding to human FcgammaRIII and antibodydependent cellular toxicity. J Biol Chem, 277: 26733-26740. Sondermann, P., Huber, R., Oosthuizen, V., and Jacob, U. 2000. The 3.2-A crystal structure of the human IgG1 Fc fragment-Fc gammaRIII complex. Nature 406, 267-273. Urlaub G, Kas E, Carothers AM, Chasin LA. Deletion of the diploid dihydrofolate reductase locus from cultured mammalian cells. Cell. 1983 Jun;33(2): 405-12. Urlaub G, Mitchell PJ, Kas E, Chasin LA, Funanage VL, Myoda TT, Hamlin J. 1986. Effect of gamma rays at the dihydrofolate reductase locus: Deletions and inversions. Somatic Cell Mol Genet, 12: 555556. Wada, Y.; Azadi, P.; Costello, C. E.; Dell, A.; Dwek, R. A.; Geyer, H.; Geyer, R.; Kakehi, K.; Karlsson, N. G.; Kato, K.; Kawasaki, N.; Khoo, K. H.; Kim, S.; Kondo, A.; Lattova, E.; Mechref, Y.; Miyoshi, E.; Nakamura, K.; Narimatsu, H.; Novotny, M. V.; Packer, N. H.; Perreault, H.; Peter-Katalinic, J.; Pohlentz, G.; Reinhold, V. N.; Rudd, P. M.; Suzuki, A.; Taniguchi, N. 2007. Comparison of the methods for profiling glycoprotein glycans--HUPO Human Disease Glycomics/Proteome Initiative multi- institutional study. Glycobiology; 17(4): 411-22. Webb NA, Mulichak AM, Lam JS, Rocchetta HL, Garavito RM. 2004. Crystal structure of a tetrameric GDP-D-mannose 4,6-dehydratase from a bacterial GDP-D-rhamnose biosynthetic pathway. Protein Sci. Feb;13(2): 529-39. Zabrecky JR, Lam T, McKenzie SJ and Carney W. 1991. The extracellular domain of p185/neu is released from the surface of human breast carcinoma cells, SK-BR-3. J Biol Chem.; 266(3): 1716-20.

Claims

1. Método para produzir uma molécula que naturalmente compreende fucose nas suas glicoporções, carecendo de fucose ou com uma quantidade reduzida de fucose nas suas glicoporções, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: i) fornecer uma célula de vertebrado compreendendo pelo menos uma enzima que usa GDP-6-desóxi-D-lixo-4-hexulose como um substrato, em que a pelo menos uma enzima é selecionada a partir do grupo que consiste de GDP-6-desóxi-D-lixo-4-hexulose redutase (RMD), GDP- perosamina sintetase (Per), GDP-6-desóxi-D-talose sintetase (GTS), mutante de GDP-Fucose sintetase Cys109Ser- (GFS-Cys109Ser), e GDP-4-ceto-6- desoximanose-3-desidratase (ColD), preferivelmente GDP-4-ceto-6- desoximanose-3-desidratase (ColD) em combinação com GDP-L-colitose sintase (ColC), e ii) isolar a molécula que é capaz de ser um substrato para uma fucosiltransferase, preferivelmente uma proteína ou lipídeo, da célula em i).

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a GDP-6-desóxi-D-lixo-4-hexulose redutase (RMD) é de Pseudomonas aeruginosa (SEQ ID NO: 1).

3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a célula compreende GDP-D-ramnose, GDP-D-perosamina, GDP-desóxi-D-talose, GDP-6-desóxi-D-altrose, GDP-4-ceto-3,6-didesóxi-D- manose, e/ou GDP-L-colitose.

4. Método de vertebrado de acordo com as reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a célula compreende ainda pelo menos uma molécula que é capaz de ser um substrato para uma fucosiltransferase.

5. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a molécula é uma proteína ou um lipídeo.

6. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a proteína é uma proteína endógena ou uma exógena.

7. Método de acordo com as reivindicações 5 ou 6, caracterizado pelo fato de que a proteína é um anticorpo, preferivelmente um anticorpo IgG1, um fragmento de anticorpo, preferivelmente um fragmento de anticorpo que compreende a região Fc de um anticorpo, uma proteína de fusão, preferivelmente uma proteína de fusão que compreende a região Fc de um anticorpo, uma proteína viral, fragmento de proteína viral, um antígeno, ou um hormônio.

8. Método de acordo com as reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a célula de vertebrado é uma célula de mamífero, uma de peixe, uma de anfíbio, uma de réptil ou uma célula aviária.

9. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que i) a célula de mamífero é uma célula de ser humano, hamster, canina ou de macaco, preferivelmente uma célula do ovário do hamster chinês (CHO), uma célula renal de macaco verde africano (VERO-76) (ATCC CRL- 1587), uma célula de carcinoma cervical humana (HELA) (ATCC CCL 2), uma célula renal canina de Madin Darbin (MDCK) (ATCC CCL 34), uma célula PER.C6 humana, ou uma célula AGE1.HN humana; ii) a célula de peixe é uma célula ovariana (CCO) de Ictalurus punctatus (peixe gato de canal) (ATCC CRL-2772), iii) a célula de anfíbio é uma célula renal de Xenopus laevis (ATCC CCL-102); iv) a célula de réptil é uma célula cardíaca de Iguana iguana (IgH-2) (ATCC CCL-108); ou v) a célula aviária é uma célula de retina aviária, preferivelmente uma célula AGE1.CR.PIX, ou uma célula de somito aviário.

10. Método para produzir uma proteína que normalmente compreende fucose nas suas glicoporções, carecendo de fucose ou com uma quantidade reduzida de fucose nas suas glicoporções, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: i) fornecer uma célula de inseto compreendendo: a) um primeiro polinucleotídeo compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica uma enzima que usa GDP-6-desóxi-D-lixo-4- hexulose como um substrato, em que a enzima é selecionada a partir do grupo que consiste de GDP-6-desóxi-D-lixo-4-hexulose redutase (RMD), GDP-perosamina sintetase (Per), GDP-6-desóxi-D-talose sintetase (GTS), mutante de GDP- Fucose sintetase Cys109Ser- (GFS-Cys109Ser), e GDP-4-ceto-6- desoximanose-3-desidratase (ColD), preferivelmente GDP-4-ceto-6- desoximanose-3-desidratase (ColD) em combinação com GDP-L-colitose sintase (ColC), e b) um segundo polinucleotídeo compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína, ii) expressar a enzima codificada pelo primeiro polinucleotídeo e a proteína codificada pelo segundo polinucleotídeo na dita célula, e iii) isolar a proteína da dita célula.

11. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a proteína é um anticorpo, preferivelmente um anticorpo IgG1, um fragmento de anticorpo, preferivelmente um fragmento de anticorpo que compreende a região Fc de um anticorpo, uma proteína de fusão, preferivelmente uma proteína de fusão que compreende a região Fc de um anticorpo, uma proteína viral, fragmento de proteína viral, um antígeno, ou um hormônio.