JPWO2005035583A1

JPWO2005035583A1 - Ｉｌ−５受容体に特異的に結合する抗体組成物

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Publication number: JPWO2005035583A1
Application number: JP2005514673A
Authority: JP
Inventors: 飯田　茂; 茂飯田; 佐藤　光男; 光男佐藤; 井上　美保; 美保井上; 雅子脇谷; 内田　和久; 和久内田; 丹羽　倫平; 倫平丹羽; 設楽　研也; 研也設楽; 正道小池
Original assignee: 協和醗酵工業株式会社
Priority date: 2003-10-08
Filing date: 2004-10-08
Publication date: 2007-11-22
Also published as: EP1688437A1; WO2005035583A1; AU2004279740A1; EP1688437A4; CA2542042A1

Abstract

ヒトインターロイキン−５受容体（ＩＬ−５Ｒ）α鎖に特異的に結合し、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖をＦｃ領域に有する抗体分子からなる組成物であって、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖が該糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖である抗体組成物、該抗体組成物を生産する形質転換体、該抗体組成物の製造方法および該抗体組成物を含有する医薬を提供する。

Description

本発明は、ヒトインターロイキン５受容体α鎖（以下、ＩＬ−５Ｒα鎖と表記する）に特異的に結合し、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖をＦｃ領域に有する遺伝子組換え抗体分子からなる組成物であって、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖が該糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖である抗体組成物、該抗体組成物を生産する形質転換体、該抗体組成物の製造方法および該抗体組成物を含有する医薬に関する。

インターロイキン−５（以下、ＩＬ−５と記す）は、サイトカインの一種であり、ヒトにおいては、好酸球の分化および増殖因子として作用する［ＡｄｖａｎｃｅｓｉｎＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，５７，１４５（１９９４）、Ｂｌｏｏｄ，７９，３１０１（１９９２）］。ヒトＩＬ−５受容体（以下、ＩＬ−５Ｒと記す）は、２種類のポリペプチド鎖［α鎖（以下、ＩＬ−５Ｒα鎖と記す）、β鎖（以下、ＩＬ−５Ｒβ鎖と称す）］で構成されている。ＩＬ−５との結合はＩＬ−５Ｒα鎖によって担われており、ＩＬ−５Ｒβ鎖単独ではＩＬ−５に対する結合能を示さない［ＥＭＢＯＪ．，９，４３６７（１９９０）、ＥＭＢＯＪ．，１０，２８３３（１９９１）、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７７，１５２３（１９９３）、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７５，３４１（１９９２）、Ｃｅｌｌ，６６，１１７５（１９９１）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８９，７０４１（１９９２）］。
好酸球は、慢性気管支喘息をはじめとするアレルギー性疾患患者の患者の体内で増加することが知られており、慢性気管支喘息患者の気道には好酸球の浸潤が認められる。また、好酸球は細胞傷害性を有する顆粒蛋白質を含んでおり、該蛋白質の沈着が慢性気管支喘息患者の気道組織あるいはアトピー性皮膚炎患者の病変部位に認められることなどから、好酸球は慢性気管支喘息またはアトピー性皮膚炎などのアレルギー性疾患の病態形成において重要な働きをしているものと考えられている［Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３９，１７７（１９８６）、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ，１３，５０１（１９９２）］。
ＩＬ−５遺伝子が導入されたマウスにおいて著しい好酸球増多が認められること［Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７２，１４２５（１９９０）、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７３，４２９（１９９１）、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２，９６５（１９９０）］、喘息モデル動物における好酸球の組織への浸潤が抗ＩＬ−５抗体の投与により抑制されること［Ａｍ．Ｒｅｖ．Ｒｅｓｉｒ．Ｄｉｓ．，１４７，５４８（１９９３）、Ａｍ．Ｒｅｖ．Ｒｅｓｉｒ．Ｄｉｓ．，１４８，１６２３（１９９３）］などから、生体内において好酸球の増多および組織への浸潤にはＩＬ−５が重要な働きをしている。また、ヒト慢性気管支喘息患者の気道粘膜組織またはアトピー性皮膚炎患者の病変部位において、ＩＬ−５の発現が認められる［Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，８７，１５４１（１９９１）、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７３，７７５（１９９１）］。さらに、ＩＬ−５は好酸球に選択的な活性化因子である［Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１６７，２１９（１９８８）］。
以上のことから、ＩＬ−５Ｒを発現する細胞を患者体内から除去できれば、慢性気管支喘息などのアレルギー性疾患の治療に有効であることが期待される。
これまでに、ＩＬ−５Ｒに対する抗体は、ＩＬ−５の中和活性を有する抗マウスＩＬ−５Ｒα鎖抗体［特開平３−１０８４９７、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２，１８１（１９９０）］、ＩＬ−５の中和活性は持たない抗ヒトＩＬ−５Ｒα鎖抗体であるα１６［ＥＭＢＯＪ．，１４，３３９５（１９９５）］などが報告されている。さらに、中和活性を有する抗ヒトＩＬ−５Ｒα鎖抗体の報告があり、ヒト型ＣＤＲ移植抗体も作製されている（ＷＯ９７／１０３５４）。
一般にヒト以外の動物の抗体をヒトに投与すると、異物として認識され、副作用を惹起すること［Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，２，８８１（１９８４）、Ｂｌｏｏｄ，６５，１３４９（１９８５）、Ｊ．Ｎａｔｌ．ＣａｎｃｅｒＩｎｓｔ．，８０，９３２（１９８８）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８２，１２４２（１９８５）］、抗体の体内からの消失を速めることにより［Ｂｌｏｏｄ，６５，１３４９（１９８５）、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．，２６，１０１１（１９８５）、Ｊ．Ｎａｔｌ．ＣａｎｃｅｒＩｎｓｔ．，８０，９３７（１９８８）］、抗体の治療効果を減じてしまうことが知られている［Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３５，１５３０（１９８５）、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，４６，６４８９（１９８６）］。
これらの問題点を解決するために遺伝子組換え技術を利用して、ヒト以外の動物の抗体をヒト型相補性決定領域（以下、ＣＤＲと表記する）移植抗体などのヒト化抗体にすることが試みられている［Ｎａｔｕｒｅ，３２１，５２２（１９８６）］。ヒト化抗体は、ヒト以外の動物の抗体に比べ、免疫原性が低下し［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８６，４２２０（１９８９）］、治療効果が延長することが報告されている［ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，５６，１１１８（１９９６）、Ｉｍｍｕｎｏｌ．，８５，６６８（１９９５）］。
ヒト化抗体は、遺伝子組換え技術を利用して作製するため、様々な形態の分子として作製することができる。例えば、エフェクター機能の高いヒト化抗体を作製することができる［ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，５６，１１１８（１９９６）］。
ヒトＩｇＧ１サブクラスの抗体は、そのＦｃ領域と抗体レセプター（以下、ＦｃγＲと表記する）あるいは各種補体成分との相互作用を介して、抗体依存性細胞傷害活性（以下、ＡＤＣＣ活性と表記する）および補体依存性細胞傷害活性（以下、ＣＤＣ活性と表記する）を発現する。抗体とＦｃγＲとの結合においては、抗体のヒンジ領域及びＣ領域の第２番目のドメイン（以下、Ｃγ２ドメインと表記する）に結合している糖鎖の重要性が示唆されている［ＣｈｅｍｉｃａｌＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６５，８８（１９９７）］。
抗体ＩｇＧ分子のＦｃ領域に結合しているＮ−グリコシド結合複合型糖鎖の非還元末端へのガラクトースの付加、および還元末端のＮ−アセチルグルコサミンへのフコースの付加に関しては多様性があることが知られており［Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３６，１３０（１９９７）］、特に糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンへのフコースの付加により、抗体のＡＤＣＣ活性が大きく低下することが報告されている［ＷＯ００／６１７３９、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７８，３４６６（２００３）］。
一般に、医薬品として利用される抗体組成物の多くは、遺伝子組換え技術を用いて作製され、動物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣組織由来のＣＨＯ細胞などを宿主細胞として製造されているが、発現させた抗体組成物の糖鎖構造は宿主細胞によって異なる。
抗体生産細胞内のα１，６−フコシルトランスフェラーゼ（以下、ＦＵＴ８と表記する）、ＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ（以下、ＧＭＤと表記する）、ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−Ｄ−マンノース−３，５−エピメラーゼ（以下、Ｆｘと表記する）の活性を低下または欠失することにより、Ｆｃ領域を有する抗体分子からなる組成物中で、該組成物中に含まれるＦｃ領域に結合するＮ−グリコシド結合複合型糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合を増加させることができる（ＷＯ０２／３１１４０）。

本発明の目的は、ヒトＩＬ−５Ｒα鎖に特異的に結合し、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖をＦｃ領域に有する遺伝子組換え抗体分子からなる組成物であって、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖が該糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖である抗体組成物、該抗体組成物を生産する形質転換体、該抗体組成物の製造方法および該抗体組成物を含有する医薬を提供することにある。本発明の抗ヒトＩＬ−５Ｒα鎖抗体組成物はフコース修飾された抗体分子を含まないため細胞傷害活性が増強される。そのため、ＩＬ−５Ｒα鎖を発現した好酸球を患者の体内から減少させる治療に有用である。細胞傷害活性が増強された抗体を治療に用いることにより、化学療法、放射性同位元素標識体などと併用が不要となることから患者への副作用を軽減させることが期待される。また、患者への治療薬の投与量を減少させることで患者への負担の軽減などが期待される。
本発明は、以下の（１）〜（４７）に関する。
（１）ヒトインターロイキン５受容体（ＩＬ−５Ｒ）α鎖に特異的に結合し、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖をＦｃ領域に有する遺伝子組換え抗体分子からなる抗体組成物であって、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖が該糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖である抗体組成物。
（２）Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖が、該糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合していない糖鎖である、（１）記載のに記載の抗体組成物。
（３）ヒトインターロイキン５受容体（ＩＬ−５Ｒ）α鎖の細胞外領域に特異的に結合する抗体である（１）または（２）記載の抗体組成物。
（４）細胞外領域が、配列番号４５で示されるアミノ酸配列の１〜３１３番目からなるアミノ酸配列で表される細胞外領域である（３）に記載の抗体組成物。
（５）ヒトＩＬ−５Ｒα鎖に特異的に結合し、インターロイキン５の生物活性を阻害する活性を有する（１）〜（４）のいずれか１項に記載の抗体組成物。
（６）ヒトＩＬ−５Ｒα鎖発現細胞に特異的に結合する（１）〜（５）のいずれか１項に記載の抗体組成物。
（７）ヒトＩＬ−５Ｒα鎖発現細胞に対し細胞傷害活性を示す（１）〜（６）のいずれか１項に記載の抗体組成物。
（８）ヒトＩＬ−５Ｒα鎖発現細胞に対し、非ヒト動物由来ハイブリドーマが生産するモノクローナル抗体よりも高い細胞傷害活性を示す（１）〜（７）のいずれか１項に記載の抗体組成物。
（９）細胞傷害活性が抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性である（７）または（８）に記載の抗体組成物。
（１０）それぞれ配列番号１４、１５および１６で示されるアミノ酸配列からなる抗体分子重鎖（Ｈ鎖）可変領域（Ｖ領域）の相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を含む、（１）〜（９）のいずれか１項に記載の抗体組成物。
（１１）それぞれ配列番号１７、１８および１９で示されるアミノ酸配列からなる抗体分子軽鎖（Ｌ鎖）可変領域（Ｖ領域）の相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を含む、（１）〜（９）のいずれか１項に記載の抗体組成物。
（１２）それぞれ配列番号１４、１５および１６で示されるアミノ酸配列からなる抗体分子重鎖（Ｈ鎖）可変領域（Ｖ領域）の相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、およびそれぞれ配列番号１７、１８および１９で示されるアミノ酸配列からなる抗体軽鎖（Ｌ鎖）Ｖ領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を含む、（１）〜（１１）のいずれか１項に記載の抗体組成物。
（１３）遺伝子組換え抗体がヒト型キメラ抗体またはヒト型ＣＤＲ移植抗体である（１）〜（１２）のいずれか１項に記載の抗体組成物。
（１４）ヒト型キメラ抗体がヒトＩＬ−５Ｒα鎖に特異的に結合するモノクローナル抗体の重鎖（Ｈ鎖）可変領域（Ｖ領域）および軽鎖（Ｌ鎖）Ｖ領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、（１３）に記載の抗体組成物。
（１５）抗体分子の重鎖（Ｈ鎖）可変領域（Ｖ領域）が、配列番号２１で示されるアミノ酸配列を含む（１４）に記載の抗体組成物。
（１６）抗体分子の軽鎖（Ｌ鎖）可変領域（Ｖ領域）が、配列番号２３で示されるアミノ酸配列を含む（１４）または（１５）に記載の抗体組成物。
（１７）抗体分子の重鎖（Ｈ鎖）可変領域（Ｖ領域）が、配列番号２１で示されるアミノ酸配列を含み、抗体分子の軽鎖（Ｌ鎖）Ｖ領域が、配列番号２３で示されるアミノ酸配列を含む（１４）〜（１６）のいずれか１項に記載のヒト型キメラ抗体組成物。
（１８）ヒト型ＣＤＲ移植抗体がヒトＩＬ−５Ｒα鎖に特異的に結合するモノクローナル抗体の重鎖（Ｈ鎖）可変領域（Ｖ領域）および軽鎖（Ｌ鎖）Ｖ領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、（１３）に記載の抗体組成物。
（１９）ヒトＩＬ−５Ｒα鎖に特異的に結合するモノクローナル抗体の重鎖（Ｈ鎖）可変領域（Ｖ領域）および軽鎖（Ｌ鎖）Ｖ領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）とヒト抗体のＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域のフレームワーク領域（ＦＲ）を含む、（１８）に記載の抗体組成物。
（２０）ヒトＩＬ−５Ｒα鎖に特異的に結合するモノクローナル抗体の重鎖（Ｈ鎖）可変領域（Ｖ領域）および軽鎖（Ｌ鎖）Ｖ領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）とヒト抗体のＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域のフレームワーク領域（ＦＲ）、ならびにヒト抗体のＨ鎖定常領域（Ｃ領域）およびＬ鎖Ｃ領域を含む、（１８）または（１９）に記載の抗体組成物。
（２１）抗体分子の重鎖（Ｈ鎖）可変領域（Ｖ領域）が、配列番号２４で示されるアミノ酸配列、または配列番号２４で示されるアミノ酸配列の４０番目のＡｌａ、４６番目のＧｌｕ、６７番目のＡｒｇ、７２番目のＡｌａ、７４番目のＴｈｒ、７９番目のＡｌａ、９５番目のＴｙｒおよび９７番目のＡｌａから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含む、（１８）〜（２０）のいずれか１項に記載の抗体組成物。
（２２）抗体分子の軽鎖（Ｌ鎖）可変領域（Ｖ領域）が、配列番号２５で示されるアミノ酸配列、または配列番号２５で示されるアミノ酸配列の７番目のＳｅｒ、８番目のＰｒｏ、２２番目のＴｈｒ、３７番目のＧｌｎ、３８番目のＧｌｎ、４４番目のＰｒｏ、４５番目のＬｙｓ、７１番目のＰｈｅ、７７番目のＳｅｒ、８７番目のＴｙｒおよび９８番目のＰｈｅから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含む、（１８）〜（２１）のいずれか１項に記載の抗体組成物。
（２３）抗体分子の重鎖（Ｈ鎖）可変領域（Ｖ領域）が、配列番号２４で示されるアミノ酸配列、または配列番号２４で示されるアミノ酸配列の４０番目のＡｌａ、４６番目のＧｌｕ、６７番目のＡｒｇ、７２番目のＡｌａ、７４番目のＴｈｒ、７９番目のＡｌａ、９５番目のＴｙｒおよび９７番目のＡｌａから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含み、かつ、抗体分子の軽鎖（Ｌ鎖）Ｖ領域が、配列番号２５で示されるアミノ酸配列、または配列番号２５で示されるアミノ酸配列の７番目のＳｅｒ、８番目のＰｒｏ、２２番目のＴｈｒ、３７番目のＧｌｎ、３８番目のＧｌｎ、４４番目のＰｒｏ、４５番目のＬｙｓ、７１番目のＰｈｅ、７７番目のＳｅｒ、８７番目のＴｙｒおよび９８番目のＰｈｅから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含む、（１８）〜（２２）のいずれか１項に記載の抗体組成物。
（２４）抗体分子の重鎖（Ｈ鎖）可変領域（Ｖ領域）が、それぞれ配列番号２４、２６、２７および２８で示されるアミノ酸配列から選ばれるアミノ酸配列を含む、（１８）〜（２１）または（２３）に記載の抗体組成物。
（２５）抗体分子の軽鎖（Ｌ鎖）可変領域（Ｖ領域）が、配列番号２５、２９、３０、３１および３２で示されるアミノ酸配列から選ばれるアミノ酸配列を含む（１８）〜（２０）、（２２）または（２３）に記載の抗体組成物。
（２６）抗体分子の重鎖（Ｈ鎖）可変領域（Ｖ領域）が、配列番号２４、２６、２７および２８から選ばれるアミノ酸配列を含み、かつ、抗体分子の軽鎖（Ｌ鎖）Ｖ領域が、配列番号２９、３０、３１および３２から選ばれるアミノ酸配列を含む（１８）〜（２５）のいずれか１項に記載の抗体組成物。
（２７）抗体分子の重鎖（Ｈ鎖）可変領域（Ｖ領域）が配列番号２８で示されるアミノ酸配列を含み、かつ、抗体分子の軽鎖（Ｌ鎖）Ｖ領域が配列番号２５で示されるアミノ酸配列を含む（１８）〜（２０）のいずれか１項に記載の抗体組成物。
（２８）ヒトＩＬ−５Ｒα鎖に特異的に結合する抗体分子をコードするＤＮＡを宿主細胞に導入して得られる、（１）〜（２７）のいずれか１項に記載の抗体組成物を生産する形質転換体。
（２９）宿主細胞が、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素、またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素が失活するようにゲノムが改変された細胞である、（２８）に記載の形質転換体。
（３０）宿主細胞が、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素、またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のゲノム上の対立遺伝子のすべてがノックアウトされた細胞である、（２８）に記載の形質転換体。
（３１）細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素が、ＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ（ＧＭＤ）またはＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−Ｄ−マンノース−３，５−エピメラーゼ（Ｆｘ）から選ばれる酵素である、（２９）または（３０）に記載の形質転換体。
（３２）ＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼが、以下の（ａ）および（ｂ）からなる群から選ばれるＤＮＡがコードする蛋白質である、（３１）に記載の形質転換体。
（ａ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
（３３）ＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼが、以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群から選ばれる蛋白質である、（３２）に記載の形質転換体。
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質；
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質。
（３４）ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−Ｄ−マンノース−３，５−エピメラーゼが、以下の（ａ）および（ｂ）からなる群から選ばれるＤＮＡがコードする蛋白質である、（３１）に記載の形質転換体。
（ａ）配列番号３で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号３で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−Ｄ−マンノース−３，５−エピメラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
（３５）ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−Ｄ−マンノース−３，５−エピメラーゼが、以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群から選ばれる蛋白質である、（３１）に記載の形質転換体。
（ａ）配列番号４で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｂ）配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−Ｄ−マンノース−３，５−エピメラーゼ活性を有する蛋白質；
（ｃ）配列番号４で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−Ｄ−マンノース−３，５−エピメラーゼ活性を有する蛋白質。
（３６）Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素がα１，６−フコシルトランスフェラーゼである（２９）または（３０）に記載の形質転換体。
（３７） α１，６−フコシルトランスフェラーゼが、以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群から選ばれるＤＮＡがコードする蛋白質である、（３６）に記載の形質転換体。
（ａ）配列番号５で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号６で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｃ）配列番号５で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
（ｄ）配列番号６で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
（３８） α１，６−フコシルトランスフェラーゼが、以下の（ａ）〜（ｆ）からなる群から選ばれる蛋白質である、（３６）に記載の形質転換体。
（ａ）配列番号７で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｂ）配列番号８で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｃ）配列番号７で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
（ｄ）配列番号８で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
（ｅ）配列番号７で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
（ｆ）配列番号８で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質。
（３９）形質転換体がＦＥＲＭＢＰ−８４７１である（３８）に記載の形質転換体。
（４０）宿主細胞が、下記の（ａ）〜（ｉ）からなる群から選ばれる細胞である（２８）〜（３９）のいずれか１項に記載の形質転換体。
（ａ）チャイニーズハムスター卵巣組織由来ＣＨＯ細胞；
（ｂ）ラットミエローマ細胞株ＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞；
（ｃ）マウスミエローマ細胞株ＮＳ０細胞；
（ｄ）マウスミエローマ細胞株ＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞；
（ｅ）シリアンハムスター腎臓組織由来ＢＨＫ細胞；
（ｆ）抗体を産生するハイブリドーマ細胞；
（ｇ）ヒト白血病細胞株ナマルバ細胞；
（ｈ）胚性幹細胞；
（ｉ）受精卵細胞。
（４１）（２８）〜（４０）のいずれか１項に記載の形質転換体を培地に培養し、培養物中に抗体組成物を生成蓄積させ、該抗体組成物を採取し、精製する、（１）〜（２７）のいずれか１項に記載の抗体組成物の製造方法。
（４２）（４１）に記載の製造方法により得られる、（１）〜（２７）のいずれか１項に記載の抗体組成物。
（４３）（１）〜（２７）および（４２）のいずれか１項に記載の抗体組成物を有効成分として含有する医薬。
（４４）（１）〜（２７）および（４２）のいずれか１項に記載の抗体組成物を有効成分として含有するヒトＩＬ−５Ｒα鎖発現細胞に関連した疾患の治療薬。
（４５）ヒトＩＬ−５Ｒα鎖発現細胞に関連した疾患が、アレルギー性疾患または好酸球増多を伴う疾患である（４４）に記載の治療薬。
（４６）（１）〜（２７）および（４２）のいずれか１項に記載の抗体組成物を患者に投与することを特徴とする、ヒトＩＬ−５Ｒα鎖発現細胞に関連した疾患の治療方法。
（４７）ヒトＩＬ−５Ｒα鎖発現細胞に関連した疾患の治療薬を製造するための（１）〜（２７）および（４２）のいずれか１項に記載の抗体組成物の使用。
以下、本発明を詳細に説明する。本願は、２００３年１０月８日および２００４年４月２３日に出願された日本国特許出願２００３−３５０１５９号および２００４−１２９０８２号の優先権を主張するものであり、当該特許出願の明細書及び／または図面に記載される内容を包含する。
本発明のヒトＩＬ−５Ｒα鎖に特異的に結合し、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖をＦｃ領域に有する遺伝子組換え抗体分子からなる抗体組成物であって、該Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖が該糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖である抗体組成物としては、該Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖が、該糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合していない糖鎖である抗体組成物があげられる。
抗体分子にはＦｃ領域があり、それらの領域にはＮ−グリコシド結合糖鎖が結合する。従って、抗体１分子あたり２本の糖鎖が結合している。
Ｎ−グリコシド結合糖鎖としては、コア構造の非還元末端側にガラクトース−Ｎ−アセチルグルコサミン（以下、Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃと表記する）の側鎖を並行して１ないしは複数本有し、更にＧａｌ−ＧｌｃＮＡｃの非還元末端側にシアル酸、バイセクティングのＮ−アセチルグルコサミンなどを有するコンプレックス型（複合型）糖鎖を挙げることができる。
本発明において、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖としては、下記化学式で示される。

本発明において、フコースが結合していない糖鎖としては、上記で示された化学式中、還元末端側のＮ−アセチルグルコサミンにはフコースが結合されておらず、また非還元末端の糖鎖の構造はいかなるものであってもよい。
したがって、本発明の抗体組成物としては、上記の糖鎖構造を有していれば、単一の糖鎖構造を有する抗体分子から構成されていてもよいし、複数の異なる糖鎖構造を有する抗体分子から構成されていてもよい。
本発明において、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していないとは、実質的にフコースが結合していないことをいう。実質的にフコースが結合していない抗体組成物とは、具体的には、後述の４に記載の糖鎖分析において、フコースが実質的に検出できない程度の抗体組成物である場合をいう。実質的に検出できない程度とは、測定の検出限界以下であることを意味する。糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない本発明の抗体組成物は、高いＡＤＣＣ活性を有する。
Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖をＦｃ領域に有する抗体分子からなる組成物中に含まれる、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖を有する抗体分子の割合は、抗体分子からヒドラジン分解や酵素消化などの公知の方法［生物化学実験法２３−糖蛋白質糖鎖研究法（学会出版センター）高橋禮子編（１９８９）］を用い、糖鎖を遊離させ、遊離させた糖鎖を蛍光標識又は同位元素標識し、標識した糖鎖をクロマトグラフィー法にて分離することによって決定することができる。また、遊離させた糖鎖をＨＰＡＥＤ−ＰＡＤ法［ジャーナル・オブ・リキッド・クロマトグラフィー（Ｊ．Ｌｉｑ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．），６，１５７７（１９８３）］によって分析することで決定することができる。
本発明の抗体組成物としては、ヒトＩＬ−５Ｒα鎖の細胞外領域に特異的に結合し、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖をＦｃ領域に有する遺伝子組換え抗体分子からなる抗体組成物であって、該Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖が該糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖である抗体組成物があげられる。
ヒトＩＬ−５Ｒα鎖の細胞外領域としては、配列番号４５で示されるアミノ酸配列の１〜３１３番目からなるアミノ酸配列で表すことができる。したがって、本発明の抗体組成物としては、好ましくは、配列番号４５に示されるヒトＩＬ−５Ｒα鎖アミノ酸配列の１〜３１３番目の領域に特異的に反応する抗体組成物があげられる。
また、本発明の抗体組成物としては、好ましくはＩＬ−５Ｒα鎖に特異的に結合し、ＩＬ−５の生物活性を阻害する活性を有する遺伝子組換え抗体組成物であって、該Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖が該糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖である抗体組成物があげられる。
ＩＬ−５の生物活性を阻害する活性を有する遺伝子組換え抗体組成物としては、抗体がＩＬ−５とＩＬ−５Ｒとの結合を阻害する活性を有することにより、ＩＬ−５によって誘導されるＩＬ−５Ｒ発現細胞の細胞応答を抑制できる抗体組成物があげられ、例えばＩＬ−５Ｒα鎖に結合し、かつＩＬ−５とＩＬ−５Ｒとの結合を阻害する活性を有する抗体組成物があげられる。
さらに、本発明の抗体組成物としては、ヒトＩＬ−５Ｒα鎖が発現した細胞（以下、ヒトＩＬ−５Ｒα鎖発現細胞と略記する）に特異的に結合し、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖をＦｃ領域に有する遺伝子組換え抗体分子からなる抗体組成物であって、該Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖が該糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖である抗体組成物などがあげられるが、好ましくはヒトＩＬ−５Ｒα鎖発現細胞に対し細胞傷害活性を有する抗体組成物であって、該Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖が該糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖である抗体組成物があげられる。
ヒトＩＬ−５Ｒα鎖発現細胞としては、ヒト好酸球などがあげられる。
細胞傷害活性としては、補体依存性細胞傷害活性（以下、ＣＤＣ活性と表記する）あるいは抗体依存性細胞傷害活性（以下、ＡＤＣＣ活性と表記する）などがあげられる。
ヒトＩＬ−５Ｒα鎖発現細胞に対し細胞傷害活性を有する抗体組成物であって、該Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖が該糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖である抗体組成物は、該抗体組成物の有する細胞傷害活性によりヒトＩＬ−５Ｒα鎖細胞である好酸球を傷害することにより、好酸球の組織への浸潤を抑制する等の効果を有する。
本発明の遺伝子組換え抗体は、ヒト型キメラ抗体組成物、ヒト型ＣＤＲ移植抗体組成物およびヒト抗体組成物、ならびにそれらの抗体断片組成物を包含する。
ヒト型キメラ抗体は、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬとヒト抗体のＣＨおよびＣＬとからなる抗体をいう。ヒト以外の動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ラビット等、ハイブリドーマを作製することが可能であれば、いかなるものも用いることができる。
本発明のヒト型キメラ抗体組成物は、ヒトＩＬ−５Ｒα鎖に特異的に反応するヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子を有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入することにより発現させ、製造することができる。
ヒト型キメラ抗体のＣＨとしては、ヒトイムノグロブリン（以下、ｈＩｇと表記する）に属すればいかなるものでもよいが、ｈＩｇＧクラスのものが好適であり、さらにｈＩｇＧクラスに属するｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３、ｈＩｇＧ４といったサブクラスのいずれも用いることができる。また、ヒト型キメラ抗体のＣＬとしては、ｈＩｇに属すればいずれのものでもよく、κクラスあるいはλクラスのものを用いることができる。
本発明のヒトＩＬ−５Ｒα鎖に特異的に結合するヒト型キメラ抗体組成物としては、配列番号１４、１５および１６で示されるアミノ酸配列からなるＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３および／または配列番号１７、１８および１９で示されるアミノ酸配列からなるＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、を含む抗ヒトＩＬ−５Ｒα鎖キメラ抗体、抗体のＶＨが配列番号２１で示されるアミノ酸配列および／またはＶＬが配列番号２３で示されるアミノ酸配列を含む抗ヒトＩＬ−５Ｒα鎖キメラ抗体、抗体のＶＨが配列番号２１で示されるアミノ酸配列およびヒト抗体のＣＨがｈＩｇＧ１サブクラスのアミノ酸配列からなり、抗体のＶＬが配列番号２３で示されるアミノ酸配列およびヒト抗体のＣＬがκクラスのアミノ酸配列からなる抗ヒトＩＬ−５Ｒα鎖キメラ抗体組成物などがあげられる。
ヒト型ＣＤＲ移植抗体は、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲをヒト抗体のＶＨおよびＶＬの適切な位置に移植した抗体を意味する。
本発明のヒト型ＣＤＲ移植抗体組成物は、ヒトＩＬ−５Ｒα鎖に特異的に反応するヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲを任意のヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲに移植したＶ領域をコードするｃＤＮＡを構築し、ヒト抗体のＨ鎖Ｃ領域（以下、ＣＨと表記する）およびＬ鎖Ｃ領域（以下、ＣＬと表記する）をコードするＤＮＡを有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターを構築し、該発現ベクターを動物細胞へ導入することにより発現させ、製造することができる。
ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列としては、ヒト抗体由来のアミノ酸配列であれば、いかなるものでも用いることができる。例えば、ＰｒｏｔｅｉｎＤａｔａＢａｎｋなどのデータベースに登録されているヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列、またはヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲの各サブグループの共通アミノ酸配列（ＳｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳＤｅｐｔ．ＨｅａｌｔｈａｎｄＨｕｍａｎＳｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１）などがあげられる。
本発明の抗体のＣＨとしては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよいが、ｈＩｇＧクラスのものが好適であり、さらにｈＩｇＧクラスに属するｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３、ｈＩｇＧ４といったサブクラスのいずれも用いることができる。また、ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＣＬとしては、ｈＩｇに属すればいずれのものでもよく、κクラスあるいはλクラスのものを用いることができる。
本発明のヒト型ＣＤＲ移植抗体組成物としては、ヒトＩＬ−５Ｒα鎖に特異的に反応するヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲを含むヒト型ＣＤＲ移植抗体があげられるが、好ましくは、それぞれ配列番号３９、４０、４１で示されるアミノ酸配列からなるＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３および／またはそれぞれ配列番号４２、４３、４４で示されるアミノ酸配列からなるＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を含む抗体、より好ましくは、それぞれ配列番号３３、３４、３５で示されるアミノ酸配列からなるＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３および／またはそれぞれ配列番号３６、３７、３８で示されるアミノ酸配列からなるＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を含む抗体、さらに好ましくは、それぞれ配列番号１４、１５、１６で示されるアミノ酸配列からなる抗体ＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３および／またはそれぞれ配列番号１７、１８、１９で示されるアミノ酸配列からなるＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体または該抗体断片などがあげられる。
これらのヒト型ＣＤＲ移植抗体組成物のなかでも、抗体のＶＨが配列番号２４で示されるアミノ酸配列、または配列番号２４で示されるアミノ酸配列のうち、４０番目のＡｌａ、４６番目のＧｌｕ、６７番目のＡｒｇ、７２番目のＡｌａ、７４番目のＴｈｒ、７９番目のＡｌａ、９５番目のＴｙｒおよび９７番目のＡｌａから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体組成物、抗体のＶＬが配列番号２５で示されるアミノ酸配列、または配列番号２４で示されるアミノ酸配列のうち、７番目のＳｅｒ、８番目のＰｒｏ、２２番目のＴｈｒ、３７番目のＧｌｎ、３８番目のＧｌｎ、４４番目のＰｒｏ、４５番目のＬｙｓ、７１番目のＰｈｅ、７７番目のＳｅｒ、８７番目のＴｙｒおよび９８番目のＰｈｅから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体組成物が好ましく、抗体のＶＨが配列番号２４で示されるアミノ酸配列のうち、４０番目のＡｌａ、４６番目のＧｌｕ、６７番目のＡｒｇ、７２番目のＡｌａ、７４番目のＴｈｒ、７９番目のＡｌａ、９５番目のＴｙｒおよび９７番目のＡｌａから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基が、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含み、かつ、抗体のＶＬが配列番号２５で示されるアミノ酸配列のうち、７番目のＳｅｒ、８番目のＰｒｏ、２２番目のＴｈｒ、３７番目のＧｌｎ、３８番目のＧｌｎ、４４番目のＰｒｏ、４５番目のＬｙｓ、７１番目のＰｈｅ、７７番目のＳｅｒ、８７番目のＴｙｒおよび９８番目のＰｈｅから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体組成物がより好ましい。
具体的には、抗体のＶＨがそれぞれ配列番号２４、２６、２７および２８で示されるアミノ酸配列から選ばれるアミノ酸配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体組成物、抗体のＶＬがそれぞれ配列番号２５、２９、３０、３１および３２で示されるアミノ酸配列から選ばれるアミノ酸配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体組成物、抗体のＶＨがそれぞれ配列番号２４、２６、２７および２８で示されるアミノ酸配列から選ばれるアミノ酸配列を含み、かつ抗体のＶＬがそれぞれ配列番号２５、２９、３０、３１および３２で示されるアミノ酸配列から選ばれるアミノ酸配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体組成物、より具体的にはＶＨが配列番号２８、ＶＬが配列番号２５で示されるアミノ酸配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体組成物があげられる。
これらのアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、付加、置換または挿入され、かつヒトＩＬ−５Ｒα鎖と特異的に結合する抗体または抗体断片も本発明の抗体組成物に包含される。
欠失、置換、挿入および／または付加されるアミノ酸の数は１個以上でありその数は特に限定されないが、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，１０，６４８７（１９８２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７９，６４０９（１９８２）、Ｇｅｎｅ，３４，３１５（１９８５）、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，１３，４４３１（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃｉＵＳＡ，８２，４８８（１９８５）等に記載の部位特異的変異導入法等の周知の技術により、欠失、置換もしくは付加できる程度の数であり、例えば、１〜数十個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個である。
本発明の抗体組成物のアミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入または付加されたとは、同一配列中の任意かつ１もしくは複数のアミノ酸配列中において、１または複数のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入または付加があることを意味し、欠失、置換、挿入または付加が同時に生じてもよく、置換、挿入または付加されるアミノ酸残基は天然型と非天然型とを問わない。天然型アミノ酸残基としては、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、Ｌ−システインなどがあげられる。
以下に、相互に置換可能なアミノ酸残基の好ましい例を示す。同一群に含まれるアミノ酸残基は相互に置換可能である。
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２−アミノブタン酸、メチオニン、Ｏ−メチルセリン、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２−アミノアジピン酸、２−アミノスベリン酸
Ｃ群：アスパラギン、グルタミン
Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、２，４−ジアミノブタン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸
Ｅ群：プロリン、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン
Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン
Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン
本発明の遺伝子組換え抗体断片組成物は、ヒトＩＬ−５Ｒα鎖に特異的に結合する遺伝子組換え抗体の抗体断片からなる組成物であって、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖が該糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖である抗体Ｆｃ領域の一部または全部を含んでいる抗体断片組成物である。
本発明の抗体断片組成物としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、ｓｃＦｖ、ｄｉａｂｏｄｙ、ｄｓＦｖおよびＣＤＲを含むペプチドなどの抗体断片組成物であって、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖が該糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖である抗体Ｆｃ領域の一部または全部を含む抗体断片組成物があげられるが、該抗体断片組成物に抗体のＦｃ領域の一部または全部を含まない場合は、該抗体断片と、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖を有する抗体Ｆｃ領域の一部または全部との融合蛋白質とすればよいと融合させるか、または該Ｆｃ領域の一部または全部を含む、蛋白質との融合蛋白質組成物とすればよい。
Ｆａｂは、ＩｇＧを蛋白質分解酵素パパインで処理して得られる断片のうち（Ｈ鎖の２２４番目のアミノ酸残基で切断される）、Ｈ鎖のＮ末端側約半分とＬ鎖全体がジスルフィド結合で結合した分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
本発明のＦａｂは、本発明のヒトＩＬ−５Ｒα鎖に特異的に結合する抗体組成物を蛋白質分解酵素パパインで処理して得ることができる。または、該抗体のＦａｂをコードするＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。
Ｆ（ａｂ’）_２は、ＩｇＧを蛋白質分解酵素ペプシンで処理して得られる断片のうち（Ｈ鎖の２３４番目のアミノ酸残基で切断される）、Ｆａｂがヒンジ領域のジスルフィド結合を介して結合されたものよりやや大きい、分子量約１０万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
本発明のＦ（ａｂ’）_２は、本発明のヒトＩＬ−５Ｒα鎖に特異的に結合する抗体組成物を蛋白質分解酵素ペプシンで処理して得ることができる。または、下記のＦａｂ’をチオエーテル結合あるいはジスルフィド結合させ、作製することができる。
Ｆａｂ’は、上記Ｆ（ａｂ’）_２のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断した分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
本発明のＦａｂ’は、本発明のヒトＩＬ−５Ｒα鎖に特異的に結合するＦ（ａｂ’）_２組成物を還元剤ジチオスレイトール処理して得ることができる。または、該抗体のＦａｂ’断片をコードするＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。
ｓｃＦｖは、１本のＶＨと１本のＶＬとを適当なペプチドリンカー（以下、Ｐと表記する）を用いて連結した、ＶＨ−Ｐ−ＶＬないしはＶＬ−Ｐ−ＶＨポリペプチドで、抗原結合活性を有する抗体断片である。
本発明のｓｃＦｖは、本発明のヒトＩＬ−５Ｒα鎖に特異的に結合する抗体組成物のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。
ｄｉａｂｏｄｙは、ｓｃＦｖが二量体化した抗体断片で、二価の抗原結合活性を有する抗体断片である。二価の抗原結合活性は、同一であることもできるし、一方を異なる抗原結合活性とすることもできる。
本発明のｄｉａｂｏｄｙは、本発明のヒトＩＬ−５Ｒα鎖に特異的に結合する抗体組成物のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡをＰのアミノ酸配列の長さが８残基以下となるように構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。
ｄｓＦｖは、ＶＨおよびＶＬ中のそれぞれ１アミノ酸残基をシステイン残基に置換したポリペプチドを該システイン残基間のジスルフィド結合を介して結合させたものをいう。システイン残基に置換するアミノ酸残基はＲｅｉｔｅｒらにより示された方法（ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７，６９７−７０４，１９９４）に従って、抗体の立体構造予測に基づいて選択することができる。
本発明のｄｓＦｖは、本発明のヒトＩＬ−５Ｒα鎖に特異的に結合する抗体組成物のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｄｓＦｖをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。
ＣＤＲを含むペプチドは、ＶＨまたはＶＬのＣＤＲの少なくとも１領域以上を含んで構成される。複数のＣＤＲを含むペプチドは、直接または適当なペプチドリンカーを介して結合させることができる。
本発明のＣＤＲを含むペプチドは、本発明のヒトＩＬ−５Ｒα鎖に特異的に結合する抗体組成物のＶＨおよびＶＬのＣＤＲをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。
また、ＣＤＲを含むペプチドは、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）などの化学合成法によって製造することもできる。
本発明の形質転換体としては、ヒトＩＬ−５Ｒα鎖に特異的に結合する抗体分子をコードするＤＮＡを宿主細胞に導入して得られる形質転換体であって、本発明の抗体組成物を生産する形質転換体であればいかなる形質転換体でも包含される。具体的な例としては、ヒトＩＬ−５Ｒα鎖に特異的に結合する抗体分子をコードするＤＮＡを以下の（ａ）または（ｂ）などの宿主細胞に導入して得られる形質転換体があげられる。
（ａ）細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素が失活するようにゲノムが改変された細胞；
（ｂ）Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素が失活するようにゲノムが改変された細胞。
上述において、酵素が失活するようにゲノムが改変されたとは、該酵素の発現を欠失させるように該酵素をコードする遺伝子の発現調節領域に変異を導入したり、または該酵素を失活させるように該酵素をコードする遺伝子のアミノ酸配列に変異を導入することをいう。変異を導入するとは、ゲノム上の塩基配列を欠失、置換、挿入および／または付加させるといった塩基配列の改変を行うことをいう。このように改変されたゲノム遺伝子の発現または活性が完全に抑制されることをゲノム遺伝子がノックアウトされるという。
細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素としては、ＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ（ＧＭＤ）、ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−Ｄ−マンノース−３，５−エピメラーゼ（Ｆｘ）などがあげられる。
ＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼとしては、
（ａ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
などがあげられる。
ＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼとしては、
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質；
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質；
などがあげられる。
ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−Ｄ−マンノース−３，５−エピメラーゼとしては、
（ａ）配列番号３で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号３で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−Ｄ−マンノース−３，５−エピメラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
などがあげられる。
ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−Ｄ−マンノース−３，５−エピメラーゼとしては、
（ａ）配列番号４で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｂ）配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−Ｄ−マンノース−３，５−エピメラーゼ活性を有する蛋白質；
（ｃ）配列番号４で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−Ｄ−マンノース−３，５−エピメラーゼ活性を有する蛋白質；
などがあげられる。
Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素としては、α１，６−フコシルトランスフェラーゼがあげられる。
本発明において、α１，６−フコシルトランスフェラーゼとしては、下記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）のＤＮＡがコードする蛋白質、
（ａ）配列番号５で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号６で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｃ）配列番号５で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
（ｄ）配列番号６で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
または、
（ｅ）配列番号７で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
（ｆ）配列番号８で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
（ｇ）配列番号７で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質
（ｈ）配列番号８で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質
（ｉ）配列番号７で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質
（ｊ）配列番号８で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かっα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質
等があげられる。
細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素のアミノ酸配列をコードするＤＮＡとしては、配列番号１または３で表される塩基配列を有するＤＮＡ、配列番号１または３で表される塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡなどがあげられる。
α１，６−フコシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列をコードするＤＮＡとしては、配列番号５または６で表される塩基配列を有するＤＮＡ、配列番号５または６で表される塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡなどがあげられる。
本発明において、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとは、例えば配列番号１、３、５または６で表される塩基配列からなるＤＮＡなどのＤＮＡまたはその一部の断片をプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０Ｍの塩化ナトリウム存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡをあげることができる。ハイブリダイゼーションは、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＳｅｃｏｎｄＥｄｉｔｉｏｎ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，１９８９（以下、モレキュラー・クローニング第２版と略す）、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９８７−１９９７（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）、ＤＮＡＣｌｏｎｉｎｇ１：ＣｏｒｅＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ，ＳｅｃｏｎｄＥｄｉｔｉｏｎ，ＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（１９９５）等に記載されている方法に準じて行うことができる。ストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとして具体的には、配列番号１、３、５または６で表される塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するＤＮＡ、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するＤＮＡをあげることができる。
本発明において、配列番号２または４で表されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素活性を有する蛋白質、または配列番号７または８で表されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質は、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，１０，６４８７（１９８２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７９，６４０９（１９８２）、Ｇｅｎｅ，３４，３１５（１９８５）、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，１３，４４３１（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃｉＵＳＡ，８２，４８８（１９８５）等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、例えば、配列番号１、３、５または６で表される塩基配列を有するＤＮＡに部位特異的変異を導入することにより取得することができる。欠失、置換、挿入および／または付加されるアミノ酸の数は１個以上でありその数は特に限定されないが、上記の部位特異的変異導入法等の周知の技術により、欠失、置換もしくは付加できる程度の数であり、例えば、１〜数十個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個である。
また、本発明において配列番号２、４、７または８で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ活性、ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−Ｄ−マンノース−３，５−エピメラーゼ活性、またはα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質としては、具体的には、それぞれ配列番号２、４、７または８で表されるアミノ酸配列とＢＬＡＳＴ〔Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３（１９９０）〕やＦＡＳＴＡ〔ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１８３，６３（１９９０）〕等の解析ソフトを用いて計算したときに、少なくとも８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上、最も好ましくは９９％以上の相同性を有する蛋白質などをあげることができる。
また、本発明に用いられる宿主細胞、すなわち細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素、またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素が失活した宿主細胞を取得する方法としては、目的とする酵素を失活させることができる手法であれば、いずれの手法でも用いることができる。上述の酵素を失活させる手法としては、
（ａ）酵素の遺伝子を標的した遺伝子破壊の手法；
（ｂ）酵素の遺伝子のドミナントネガティブ体を導入する手法；
（ｃ）酵素についての突然変異を導入する手法；
（ｄ）酵素の遺伝子の転写又は翻訳を抑制する手法；
（ｅ）Ｎ−グリコシド結合糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性である株を選択する手法などがあげられる。
Ｎ−グリコシド結合糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンとしては、該糖鎖構造を認識できるレクチンであれば、いずれのレクチンでも用いることができる。その具体的な例としては、レンズマメレクチンＬＣＡ（ＬｅｎｓＣｕｌｉｎａｒｉｓ由来のＬｅｎｔｉｌＡｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、エンドウマメレクチンＰＳＡ（Ｐｉｓｕｍｓａｔｉｖｕｍ由来のＰｅａＬｅｃｔｉｎ）、ソラマメレクチンＶＦＡ（Ｖｉｃｉａｆａｂａ由来のＡｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ヒイロチャワンタケレクチンＡＡＬ（Ａｌｅｕｒｉａａｕｒａｎｔｉａ由来のＬｅｃｔｉｎ）等を挙げることができる。
レクチンに耐性な細胞とは、レクチンを有効濃度与えたときにも、生育が阻害されない細胞を言う。有効濃度とは、ゲノム遺伝子が改変される以前の細胞（以下、親株とも称す）が正常に生育できない濃度以上であり、好ましくは、ゲノム遺伝子が改変される以前の細胞が成育できない濃度と同濃度、より好ましくは２〜５倍、さらに好ましくは１０倍、最も好ましくは２０倍以上である。
生育が阻害されないレクチンの有効濃度は、細胞株に応じて適宜定めればよく、通常のレクチンの有効濃度は１０μｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは０．５ｍｇ／ｍＬ〜２．０ｍｇ／ｍＬである。
本発明の抗体組成物を生産させる宿主細胞としては、本発明の抗体組成物を発現できる上記宿主細胞であればいかなる細胞も包含する。例えば、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞などがあげられる。これらの細胞としては、後述１に記載のものがあげられ、特に、動物細胞の中でも、チャイニーズハムスター卵巣組織由来のＣＨＯ細胞、ラットミエローマ細胞株ＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞、マウスミエローマ細胞株ＮＳ０細胞、マウスミエローマ細胞株ＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞、シリアンハムスター腎臓組織由来ＢＨＫ細胞、抗体を産生するハイブリドーマ細胞、ヒト白血病細胞株ナマルバ細胞、胚性幹細胞、受精卵細胞などが好ましい。
本発明の形質転換体としては、具体的には、本発明の抗ヒトＩＬ−５Ｒα鎖抗体の遺伝子を組み込んだチャイニーズハ厶スター卵巣組織由来のＣＨＯ細胞株ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞由来の形質転換株Ｍｓ７０５／ＩＬ−５Ｒがあげられる。なお、ＣＨＯ細胞株ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞由来の形質転換株Ｍｓ７０５／ＩＬ−５Ｒは、平成１５年９月９日付けで独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）にＦＥＲＭＢＰ−８４７１として寄託されている。
以下に、本発明の抗体組成物を生産する細胞の作製方法、本発明の抗体組成物の製造方法および本発明の抗体組成物の分析方法ならびに利用方法について説明する。
１．本発明の抗体組成物を生産する細胞の作製
本発明の抗体組成物を生産する細胞（以下、本発明の細胞と称す）は、以下に述べる手法により、本発明の抗体組成物を生産するために用いる宿主細胞を作製し、該宿主細胞に後述２に記載の方法により、抗ヒトＩＬ−５Ｒα鎖抗体をコードする遺伝子を導入することにより、作製することができる。
（１）酵素の遺伝子を標的とした遺伝子破壊の手法
本発明の細胞の作製のために用いる宿主細胞は、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の遺伝子を標的とし、遺伝子破壊の方法を用いることにより作製することができる。細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素としては、具体的には、ＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ（以下、ＧＭＤと表記する）、ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−Ｄ−マンノース−３，５−エピメラーゼ（以下、Ｆｘと表記する）などがあげられる。Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還示末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素としては、具体的には、α１，６−フコシルトランスフェラーゼ、α−Ｌ−フコシダーゼなどがあげられる。
ここでいう遺伝子とは、ＤＮＡまたはＲＮＡを含む。
遺伝子破壊の方法としては、標的とする酵素の遺伝子を破壊することができる方法であればいかなる方法も包含される。その例としては、アンチセンス法、リボザイム法、相同組換え法、ＲＮＡ−ＤＮＡオリゴヌクレオチド法（以下、ＲＤＯ法と表記する）、ＲＮＡインターフェアレンス法（以下、ＲＮＡｉ法と表記する）、レトロウイルスを用いた方法、トランスポゾンを用いた方法等があげられる。以下これらを具体的に説明する。
（ａ）アンチセンス法又はリボザイム法による本発明の細胞を作製するための宿主細胞の作製
本発明の細胞の作製のために用いる宿主細胞は、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素遺伝子を標的とし、細胞工学，１２，２３９（１９９３）、バイオ／テクノロジー（ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ），１７，１０９７（１９９９）、ヒューマン・モレキュラー・ジェネティクス（Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．），５，１０８３（１９９５）、細胞工学，１３，２５５（１９９４）、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），９６，１８８６（１９９９）等に記載されたアンチセンス法またはリボザイム法を用いて、例えば、以下のように作製することができる。
細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素をコードするｃＤＮＡあるいはゲノ厶ＤＮＡを調製する。
調製したｃＤＮＡあるいはゲノ厶ＤＮＡの塩基配列を決定する。
決定したＤＮＡの配列に基づき、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素をコードするＤＮＡ部分、非翻訳領域の部分あるいはイントロン部分を含む適当な長さのアンチセンス遺伝子またはリボザイムを設計する。
該アンチセンス遺伝子、またはリボザイ厶を細胞内で発現させるために、調製したＤＮＡの断片、または全長を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換えベクターを作製する。
該組換えベクターを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより形質転換体を得る。
細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の活性を指標として形質転換体を選択することにより、本発明の抗体組成物を作製するために用いる宿主細胞を得ることができる。また、細胞膜上の糖蛋白質の糖鎖構造または産生抗体分子の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択することにより、本発明の抗体組成物を作製のために用いる宿主細胞を得ることもできる。
本発明の抗体組成物を作製するために用いられる宿主細胞としては、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞など、標的とする細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の遺伝子を有しているものであればいずれも用いることができる。具体的には、後述２に記載の宿主細胞があげられる。
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製が可能であるか、ないしは染色体中への組み込みが可能で、設計したアンチセンス遺伝子、またはリボザイムを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。具体的には、後述２に記載の発現ベクターがあげられる。
各種宿主細胞への遺伝子の導入方法としては、後述２に記載の各種宿主細胞に適した組換えベクターの導入方法を用いることができる。
細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の活性を指標として形質転換体を選択する方法としては、例えば、以下の方法があげられる。
形質転換体を選択する方法
細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素が失活した細胞を選択する方法としては、文献［新生化学実験講座３−糖質Ｉ，糖蛋白質（東京化学同人）日本生化学会編（１９８８）］、文献［細胞工学，別冊，実験プロトコールシリーズ，グライコバイオロジー実験プロトコール，糖蛋白質・糖脂質・プロテオグリカン（秀潤社製）谷口直之・鈴木明美・古川清・菅原一幸監修（１９９６）］、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された生化学的な方法あるいは遺伝子工学的な方法などを用いて、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の活性を測定する方法があげられる。生化学的な方法としては、例えば、酵素特異的な基質を用いて酵素活性を評価する方法があげられる。遺伝子工学的な方法としては、例えば、酵素遺伝子のｍＲＮＡ量を測定するノーザン解析やＲＴ−ＰＣＲ法等があげられる。
細胞膜上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法としては、例えば、後述１の（５）に記載の方法があげられる。産生抗体分子の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法としては、例えば、後述４または後述５に記載の方法があげられる。
細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素をコードするｃＤＮＡを調製する方法としては、例えば、下記に記載の方法があげられる。
ｃＤＮＡの調製方法
各種宿主細胞の組織又は細胞から全ＲＮＡ又はｍＲＮＡを調製する。
調製した全ＲＮＡ又はｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作製する。
細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のアミノ酸配列に基づいて、デジェネレイティブプライマーを作製し、作製したｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてＰＣＲ法で細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素をコードする遺伝子断片を取得する。
取得した遺伝子断片をプローブとして用い、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素をコードするＤＮＡを取得することができる。
ヒト又は非ヒト動物の組織又は細胞のｍＲＮＡは市販のもの（例えばＣｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いてもよいし、以下のようにしてヒト又は非ヒト動物の組織又は細胞から調製してもよい。
ヒト又は非ヒト動物の組織又は細胞から全ＲＮＡを調製する方法としては、チオシアン酸グアニジン−トリフルオロ酢酸セシウム法［メソッズ・イン・エンザイモロジー（ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ），１５４，３（１９８７）］、酸性チオシアン酸グアニジン・フェノール・クロロホルム（ＡＧＰＣ）法［アナリティカル・バイオケミストリー（ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），１６２，１５６（１９８７）；実験医学、９，１９３７（１９９１）］などがあげられる。
また、全ＲＮＡからｐｏｌｙ（Ａ）^＋ＲＮＡとしてｍＲＮＡを調製する方法としては、オリゴ（ｄＴ）固定化セルロースカラム法（モレキュラー・クローニング第２版）等があげられる。
さらに、ＦａｓｔＴｒａｃｋｍＲＮＡＩｓｏｌａｔｉｏｎＫｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ＱｕｉｃｋＰｒｅｐｍＲＮＡＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）などの市販のキットを用いることによりｍＲＮＡを調製することができる。
調製したヒト又は非ヒト動物の組織又は細胞ｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作製する。ｃＤＮＡライブラリー作製法としては、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，２ｎｄＥｄ．（１９８９）等に記載された方法、あるいは市販のキット、例えばＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＰｌａｓｍｉｄＳｙｓｔｅｍｆｏｒｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓａｎｄＰｌａｓｍｉｄＣｌｏｎｉｎｇ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、ＺＡＰ−ｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓＫｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）を用いる方法などがあげられる。
ｃＤＮＡライブラリーを作製するためのクローニングベクターとしては、大腸菌Ｋ１２株中で自立複製できるものであれば、ファージベクター、プラスミドベクター等いずれでも使用できる。具体的には、ＺＡＰＥｘｐｒｅｓｓ［ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社、ストラテジーズ（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ），５，５８（１９９２）］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋）［ヌクレイック・アシッド・リサーチ（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ），１７，９４９４（１９８９）］、λＺＡＰＩＩ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）、λｇｔ１０、λｇｔ１１［ディーエヌエー・クローニング・ア・プラクティカル・アプローチ（ＤＮＡｃｌｏｎｉｎｇ，ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ），１，４９（１９８５）］、λＴｒｉｐｌＥｘ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）、λＥｘＣｅｌｌ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）、ｐＴ７Ｔ３１８Ｕ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）、ｐｃＤ２［モレキュラー・セルラー・バイオロジー（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．），３，２８０（１９８３）］およびｐＵＣ１８［ジーン（Ｇｅｎｅ），３３，１０３（１９８５）］等をあげることができる。
ｃＤＮＡライブラリーを作製するための宿主微生物としては、微生物であればいずれでも用いることができるが、好ましくは大腸菌が用いられる。具体的には、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＸＬ１−ＢｌｕｅＭＲＦ’［ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社、ストラテジーズ（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ），５，８１（１９９２）］、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＣ６００［ジェネティクス（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ），３９，４４０（１９５４）］、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＹ１０８８［サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２２２，７７８（１９８３）］、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＹ１０９０［サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２２２，７７８（１９８３）］、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＮＭ５２２［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．），１６６，１（１９８３）］、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＫ８０２［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．），１６，１１８（１９６６）］およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＪＭ１０５［ジーン（Ｇｅｎｅ），３８，２７５（１９８５）］等が用いられる。
ｃＤＮＡライブラリーは、そのまま以降の解析に用いてもよいが、不完全長ｃＤＮＡの割合を下げて、完全長ｃＤＮＡを効率よく取得するために、菅野らが開発したオリゴキャップ法［ジーン（Ｇｅｎｅ），１３８，１７１（１９９４）；ジーン（Ｇｅｎｅ），２００，１４９（１９９７）；蛋白質核酸酵素，４１，６０３（１９９６）；実験医学，１１，２４９１（１９９３）；ｃＤＮＡクローニング（羊土社）（１９９６）；遺伝子ライブラリーの作製法（羊土社）（１９９４）］を用いて調製して以下の解析に用いてもよい。
細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のアミノ酸配列に基づいて、該アミノ酸配列をコードすることが予測される塩基配列の５’末端および３’末端の塩基配列に特異的なデジェネレイティブプライマーを作製し、作製したｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてＰＣＲ法［ピーシーアール・プロトコールズ（ＰＣＲＰｒｏｔｏｃｏｌｓ），ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ（１９９０）］を用いてＤＮＡの増幅を行うことにより、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素をコードする遺伝子断片を取得することができる。
取得した遺伝子断片が細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素をコードするＤＮＡであることは、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）らのジデオキシ法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），７４，５４６３（１９７７）］あるいはＡＢＩＰＲＩＳＭ３７７ＤＮＡシークエンサー（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、確認することができる。
該遺伝子断片をプローブとして、ヒト又は非ヒト動物の組織又は細胞に含まれるｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡあるいはｃＤＮＡライブラリーからコロニーハイブリダイゼーションやプラークハイブリダイゼーション（モレキュラー・クローニング第２版）等を用いて、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−７コースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のＤＮＡを取得することができる。
また、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素をコードする遺伝子断片を取得するために用いたプライマーを使用し、ヒト又は非ヒト動物の組織又は細胞に含まれるｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡあるいはｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、ＰＣＲ法を用いて増幅することにより、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のｃＤＮＡを取得することもできる。
取得した細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素をコードするＤＮＡの塩基配列は、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）らのジデオキシ法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），７４，５４６３（１９７７）］あるいはＡＢＩＰＲＩＳＭ３７７ＤＮＡシークエンサー（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、該ＤＮＡの塩基配列を決定することができる。
決定したｃＤＮＡの塩基配列をもとに、ＢＬＡＳＴ等の相同性検索プログラムを用いて、Ｇｅｎｂａｎｋ、ＥＭＢＬおよびＤＤＢＪなどの塩基配列データベースを検索することにより、取得したＤＮＡがデータベース中の遺伝子の中で細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素をコードしている遺伝子であることを確認することもできる。
上記の方法で得られる細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素をコードする遺伝子の塩基配列としては、例えば、配列番号１または３に記載の塩基配列があげられる。
上記の方法で得られるＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素をコードする遺伝子の塩基配列としては、例えば、配列番号５または６に記載の塩基配列があげられる。
決定されたＤＮＡの塩基配列に基づいて、フォスフォアミダイト法を利用したＤＮＡ合成機ｍｏｄｅｌ３９２（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）等のＤＮＡ合成機で化学合成することにより、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のｃＤＮＡを取得することもできる。
細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のゲノムＤＮＡを調製する方法としては、例えば、以下に記載の方法があげられる。
ゲノムＤＮＡの調製方法
ゲノムＤＮＡを調製する方法としては、モレキュラー・クローニング第２版やカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された公知の方法があげられる。また、ゲノムＤＮＡライブラリースクリーニングシステム（ＧｅｎｏｍｅＳｙｓｔｅｍｓ社）やＵｎｉｖｅｒｓａｌＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒ^ＴＭＫｉｔｓ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）などを用いることにより、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のゲノムＤＮＡを取得することもできる。
取得した細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素をコードするＤＮＡの塩基配列は、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）らのジデオキシ法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），７４，５４６３（１９７７）］あるいはＡＢＩＰＲＩＳＭ３７７ＤＮＡシークエンサー（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、該ＤＮＡの塩基配列を決定することができる。
決定したゲノムＤＮＡの塩基配列をもとに、ＢＬＡＳＴ等の相同性検索プログラ厶を用いて、Ｇｅｎｂａｎｋ、ＥＭＢＬおよびＤＤＢＪなどの塩基配列データベースを検索することにより、取得したＤＮＡがデータベース中の遺伝子の中で細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素をコードしている遺伝子であることを確認することもできる。
決定されたＤＮＡの塩基配列に基づいて、フォスフォアミダイト法を利用したＤＮＡ合成機ｍｏｄｅｌ３９２（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）等のＤＮＡ合成機で化学合成することにより、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のゲノムＤＮＡを取得することもできる。
上記の方法で得られる細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素のゲノムＤＮＡの塩基配列としては、例えば配列番号９、１０、１１および１２に記載の塩基配列があげられる。
上記の方法で得られるＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のゲノ厶ＤＮＡの塩基配列としては、例えば配列番号１３に記載の塩基配列があげられる。
また、発現ベクターを用いず、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の塩基配列に基づいて設計したアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイムを、直接宿主細胞に導入することで、本発明の抗体組成物を作製するために用いる宿主細胞を得ることもできる。
アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイムは、公知の方法またはＤＮＡ合成機により調製することができる。具体的には、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素をコードするｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡの塩基配列のうち、連続した５〜１５０塩基、好ましくは５〜６０塩基、より好ましくは１０〜４０塩基に相当する配列を有するオリゴヌクレオチドの配列情報に基づき、該オリゴヌクレオチドと相補的な配列に相当するオリゴヌクレオチド（アンチセンスオリゴヌクレオチド）または該オリゴヌクレオチドの配列を含むリボザイ厶を合成して調製することができる。
オリゴヌクレオチドとしては、オリゴＲＮＡおよび該オリゴヌクレオチドの誘導体（以下、オリゴヌクレオチド誘導体という）等があげられる。
オリゴヌクレオチド誘導体としては、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスフォロチオエート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスフォアミデート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合がペプチド核酸結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄｃｙｔｏｓｉｎｅ）で置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースが２’−Ｏ−プロピルリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、あるいはオリゴヌクレオチド中のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体等があげられる［細胞工学，１６，１４６３（１９９７）］。
（ｂ）相同組換え法による本発明の抗体組成物を作製するための宿主細胞の作製
本発明の抗体組成物を作製するために用いる宿主細胞は、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の遺伝子を標的とし、染色体上の標的遺伝子を相同組換え法を用いて染色体を改変することによって作製することができる。
染色体上の標的遺伝子の改変は、ＭａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇｔｈｅＭｏｕｓｅＥｍｂｒｙｏＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＳｅｃｏｎｄＥｄｉｔｉｏｎ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ（１９９４）（以下、「マニピュレイティング・ザ・マウス・エンブリオ・ア・ラボラトリー・マニュアル」と略す）、ＧｅｎｅＴａｒｇｅｔｉｎｇ，ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬＰｒｅｓｓａｔＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ（１９９３）、バイオマニュアルシリーズ８ジーンターゲッティング，ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製，羊土社（１９９５）（以下、「ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製」と略す）等に記載の方法を用い、例えば以下のように行うことができる。
細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のゲノムＤＮＡを調製する。
ゲノムＤＮＡの塩基配列にも基づき、改変する標的遺伝子（例えば、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の構造遺伝子、あるいはプロモーター遺伝子）を相同組換えするためのターゲットベクターを作製する。
作製したターゲットベクターを宿主細胞に導入し、染色体上の標的遺伝子とターゲットベクターの間で相同組換えを起こした細胞を選択することにより、本発明の細胞の作製のために用いる宿主細胞を作製することができる。
宿主細胞としては、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、標的とする細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の遺伝子を有しているものであればいずれも用いることができる。具体的には、後述２に記載の宿主細胞があげられる。
細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のゲノムＤＮＡを調製する方法としては、上記１の（１）の（ａ）に記載のゲノムＤＮＡの調製方法などがあげられる。
上記の方法で得られる細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素のゲノムＤＮＡの塩基配列として、例えば配列番号９、１０、１１および１２に記載の塩基配列があげられる。
上記の方法で得られるＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のゲノムＤＮＡの塩基配列として、例えば配列番号１３に記載の塩基配列があげられる。
染色体上の標的遺伝子を相同組換えするためのターゲットベクターは、ＧｅｎｅＴａｒｇｅｔｉｎｇ，ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬＰｒｅｓｓａｔＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ（１９９３）、バイオマニュアルシリーズ８ジーンターゲッティング，ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製（羊土社）（１９９５）等に記載の方法にしたがって作製することができる。ターゲットベクターは、置換型、挿入型いずれでも用いることができる。
各種宿主細胞へのターゲットベクターの導入には、後述３に記載の各種宿主細胞に適した組換えベクターの導入方法を用いることができる。
相同組換え体を効率的に選別する方法として、例えば、ＧｅｎｅＴａｒｇｅｔｉｎｇ，ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬＰｒｅｓｓａｔＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ（１９９３）、バイオマニュアルシリーズ８ジーンターゲッティング，ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製（羊土社）（１９９５）等に記載のポジティブ選択、プロモーター選択、ネガティブ選択、ポリＡ選択などの方法を用いることができる。選別した細胞株の中から目的とする相同組換え体を選択する方法としては、ゲノムＤＮＡに対するサザンハイブリダイゼーション法（モレキュラー・クローニング第２版）やＰＣＲ法［ピーシーアール・プロトコールズ（ＰＣＲＰｒｏｔｏｃｏｌｓ），ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ（１９９０）］等があげられる。
（ｃ）ＲＤＯ方法による本発明の抗体組成物を作製するために用いる宿主細胞の作製
本発明の抗体組成物を作製するために用いる宿主細胞は、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の遺伝子を標的とし、ＲＤＯ法を用い、例えば、以下のように作製することができる。
細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のｃＤＮＡあるいはゲノムＤＮＡを上記１の（１）の（ａ）に記載の方法を用い、調製する。
調製したｃＤＮＡあるいはゲノムＤＮＡの塩基配列を決定する。
決定したＤＮＡの配列に基づき、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素をコードする部分、非翻訳領域の部分あるいはイントロン部分を含む適当な長さのＲＤＯのコンストラクトを設計し合成する。
合成したＲＤＯを宿主細胞に導入し、標的とした酵素、すなわち細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素に変異が生じた形質転換体を選択することにより、本発明の宿主細胞を作製することができる。
宿主細胞としては、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、標的とする細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の遺伝子を有しているものであればいずれも用いることができる。具体的には、後述２に記載の宿主細胞があげられる。
各種宿主細胞へのＲＤＯの導入には、後述２に記載の各種宿主細胞に適した組換えベクターの導入方法を用いることができる。
細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のｃＤＮＡを調製する方法としては、例えば、上記１の（１）の（ａ）に記載のｃＤＮＡの調製方法などがあげられる。
細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のゲノムＤＮＡを調製する方法としては、例えば、上記１の（１）の（ｂ）に記載のゲノムＤＮＡの調製方法などがあげられる。
ＤＮＡの塩基配列は、適当な制限酵素などで切断後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）等のプラスミドにサブクローニングし、通常用いられる塩基配列解析方法、例えば、サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）らのジデオキシ法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．），７４，５４６３（１９７７）］等の反応を行い、塩基配列自動分析装置、例えば、ＡＢＩＰＲＩＳＭ３７７ＤＮＡシークエンサー（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、確認することができる。
ＲＤＯは、常法またはＤＮＡ合成機を用いることにより調製することができる。
ＲＤＯを宿主細胞に導入し、標的とした酵素、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の遺伝子に変異が生じた細胞を選択する方法としては、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された染色体上の遺伝子の変異を直接検出する方法があげられる。
また、前記１の（１）の（ａ）に記載の、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の活性を指標として形質転換体を選択する方法、後述１の（５）に記載の細胞膜上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法、あるいは、後述４または後述５に記載の産生抗体分子の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法も用いることができる。
ＲＤＯは、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２７３，１３８６（１９９６）；ネイチャー・メディシン（ＮａｔｕｒｅＭｅｄｉｃｉｎｅ），４，２８５（１９９８）；ヘパトロジー（Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ），２５，１４６２（１９９７）；ジーン・セラピー（ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ），５，１９６０（１９９９）；ジーン・セラピー（ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ），５，１９６０（１９９９）；ジャーナル・オブ・モレキュラー・メディシン（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．），７５，８２９（１９９７）；プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），９６，８７７４（１９９９）；プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），９６，８７６８（１９９９）；ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．），２７，１３２３（１９９９）；インベスティゲーション・オブ・ダーマトロジー（Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｍａｔｏｌ．），１１１，１１７２（１９９８）；ネイチャー・バイオテクノロジー（ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈ．），１６，１３４３（１９９８）；ネイチャー・バイオテクノロジー（ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈ．），１８，４３（２０００）；ネイチャー・バイオテクノロジー（ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈ．），１８，５５５（２０００）等の記載に従って設計することができる。
（ｄ）ＲＮＡｉ法による本発明の抗体組成物を作製するために用いる宿主細胞の作製
本発明の抗体組成物を作製するために用いる宿主細胞は、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の遺伝子を標的とし、ＲＮＡｉ法を用い、例えば、以下のように作製することができる。
細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のｃＤＮＡを上記１の（１）の（ａ）に記載の方法を用い、ｃＤＮＡを調製する。
調製したｃＤＮＡの塩基配列を決定する。
決定したｃＤＮＡの配列に基づき、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素をコードする部分あるいは非翻訳領域の部分を含む適当な長さのＲＮＡｉ遺伝子を設計する。
該ＲＮＡｉ遺伝子を細胞内で発現させるために、調製したｃＤＮＡの断片、または全長を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換えベクターを作製する。
該組換えベクターを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより形質転換体を得る。
細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の活性、あるいは産生抗体分子または細胞表面上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標に形質転換体を選択することで、本発明の細胞を作製するために用いる宿主細胞を得ることができる。
宿主細胞としては、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、標的とする細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の遺伝子を有しているものであればいずれも用いることができる。具体的には、後述２に記載の宿主細胞があげられる。
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体への組み込みが可能で、設計したＲＮＡｉ遺伝子を転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。具体的には、後述２に記載の発現ベクターがあげられる。
各種宿主細胞への遺伝子の導入には、後述２に記載の各種宿主細胞に適した組換えベクターの導入方法を用いることができる。
細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素の活性またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の活性を指標として形質転換体を選択する方法としては、例えば、本項１の（１）の（ａ）に記載の方法があげられる。
細胞膜上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法としては、例えば、本項１の（５）に記載の方法があげられる。産生抗体分子の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法としては、例えば、後述４または後述５に記載の方法があげられる。
細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のｃＤＮＡを調製する方法としては、例えば、本項１の（１）の（ａ）に記載されたｃＤＮＡの調製方法などがあげられる。
また、発現ベクターを用いず、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の塩基配列に基づいて設計したＲＮＡｉ遺伝子を、直接宿主細胞に導入することで、本発明の細胞を作製するために用いる宿主細胞を得ることもできる。
ＲＮＡｉ遺伝子は、常法またはＤＮＡ合成機を用いることにより調製することができる。
ＲＮＡｉ遺伝子のコンストラクトは、［ネイチャ−（Ｎａｔｕｒｅ），３９１，８０６（１９９８）；プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），９５，１５５０２（１９９８）：ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），３９５，８５４（１９９８）；プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），９６，５０４９（１９９９）；セル（Ｃｅｌｌ），９５，１０１７（１９９８）；プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），９６，１４５１（１９９９）；プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），９５，１３９５９（１９９８）；ネイチャー・セル・バイオロジー（ＮａｔｕｒｅＣｅｌｌＢｉｏｌ．），２，７０（２０００）］等の記載に従って設計することができる。
（ｅ）トランスポゾンを用いた方法による、本発明の抗体組成物を作製するために用いる宿主細胞の作製
本発明の抗体組成物を作製するために用いる宿主細胞は、ネイチャー・ジェネティク（ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔ．），２５，３５（２０００）等に記載のトランスポゾンのシステムを用い、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の活性、あるいは産生抗体分子または細胞膜上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標に突然変異体を選択することで、本発明の細胞を作製するために用いる宿主細胞を作製することができる。
トランスポゾンのシステムとは、外来遺伝子をランダムに染色体上に挿入させることで突然変異を誘発させるシステムであり、通常、トランスポゾンに挿まれた外来遺伝子に突然変異を誘発させるベクターとして用い、この遺伝子を染色体上にランダムに挿入させるためのトランスポゼースの発現ベクターを同時に細胞の中に導入する。
トランスポゼースは、用いるトランスポゾンの配列に適したものであればいかなるものも用いることができる。
外来遺伝子としては、宿主細胞のＤＮＡに変異を誘起するものであればいかなる遺伝子も用いることができる。
宿主細胞としては、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、標的とする細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の遺伝子を有しているものであればいずれも用いることができる。具体的には、後述２に記載の宿主細胞があげられる。各種宿主細胞への遺伝子の導入には、後述２に記載の各種宿主細胞に適した組み換えベクターの導入方法を用いることができる。
細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の活性を指標として突然変異体を選択する方法としては、例えば、本項１の（１）の（ａ）に記載の方法があげられる。
細胞膜上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標として突然変異体を選択する方法としては、例えば、本項１の（５）に記載の方法があげられる。産生抗体分子の糖鎖構造を指標として突然変異体を選択する方法としては、例えば、後述４または後述５に記載の方法があげられる。
（２）酵素の遺伝子のドミナントネガティブ体を導入する手法
本発明の抗体組成物を作製するために用いる宿主細胞は、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の遺伝子を標的とし、該酵素のドミナントネガティブ体を導入する手法を用いることにより作製することができる。細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素としては、具体的には、ＧＭＤ、Ｆｘなどがあげられる。Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素としては、具体的には、α１，６−フコシルトランスフェラーゼ、α−Ｌ−フコシダーゼなどがあげられる。
これらの酵素は、基質特異性を有したある特定の反応を触媒する酵素であり、このような基質特異性を有した触媒作用を有する酵素の活性中心を破壊することで、これらの酵素のドミナントネガティブ体を作製することができる。標的とする酵素のうち、ＧＭＤを例として、そのドミナントネガティブ体に作製について具体的に以下に述べる。
大腸菌由来のＧＭＤの立体構造を解析した結果、４つのアミノ酸（１３３番目のトレオニン、１３５番目のグルタミン酸、１５７番目のチロシン、１６１番目のリシン）が酵素活性に重要な機能を担っていることが明らかにされている（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，８，２，２０００）。すなわち、立体構造の情報にもとづきこれら４つのアミノ酸を異なる他のアミノ酸に置換した変異体を作製した結果、いずれの変異体においても有意に酵素活性が低下していたことが示されている。一方、ＧＭＤの補酵素ＮＡＤＰや基質であるＧＤＰ−マンノースとの結合能に関しては、いずれの変異体においてもほとんど変化が観察されていない。従って、ＧＭＤの酵素活性を担うこれら４つのアミノ酸を置換することによりドミナントネガティブ体を作製することができる。大腸菌由来のＧＭＤのドミナントネガティブ体の作製の結果に基づき、アミノ酸配列情報をもとにした相同性比較や立体構造予測を行うことにより、例えば、ＣＨＯ細胞由来のＧＭＤ（配列番号２）では、１５５番目のトレオニン、１５７番目のグルタミン酸、１７９番目のチロシン、１８３番目のリシンを他のアミノ酸に置換することによりドミナントネガティブ体を作製することができる。このようなアミノ酸置換を導入した遺伝子の作製は、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された部位特異的変異導入法を用いて行うことができる。
本発明の抗体組成物を作製するために用いる宿主細胞は、上述のように作製した標的酵素のドミナントネガティブ体をコードする遺伝子（以下、ドミナントネガティブ体遺伝子と略記する）を用い、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、マニピュレーティング・マウス・エンブリオ第２版等に記載された遺伝子導入の方法に従って、例えば、以下のように作製することができる。
細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のドミナントネガティブ体遺伝子を調製する。
調製したドミナントネガティブ体遺伝子の全長ＤＮＡをもとにして、必要に応じて、該蛋白質をコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製する。
該ＤＮＡ断片、または全長ＤＮＡを適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換えベクターを作製する。
該組換えベクターを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、形質転換体を得る。
細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素の活性またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の活性、あるいは産生抗体分子または細胞膜上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標に形質転換体を選択することで、本発明の細胞を作製するために用いる宿主細胞を作製することができる。
宿主細胞としては、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、標的とする細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の遺伝子を有しているものであればいずれも用いることができる。具体的には、後述２に記載の宿主細胞があげられる。
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組み込みが可能で、目的とするドミナントネガティブ体をコードするＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。具体的には、後述２に記載の発現ベクターがあげられる。
各種宿主細胞への遺伝子の導入には、後述２に記載の各種宿主細胞に適した組換えベクターの導入方法を用いることができる。
細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素の活性またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の活性を指標として形質転換体を選択する方法としては、例えば、後述１（１）の（ａ）に記載の方法があげられる。
細胞膜上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法としては、例えば、後述１の（５）に記載の方法があげられる。産生抗体分子の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法としては、例えば、後述４または後述５に記載の方法があげられる。
（３）酵素に突然変異を導入する手法
本発明の抗体組成物を作製するために用いる宿主細胞は、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の遺伝子に突然変異を導入し、該酵素に突然変異を生じた所望の細胞株を選択する手法を用いることにより作製できる。
細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素としては、具体的には、ＧＭＤ、Ｆｘなどがあげられる。Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素としては、具体的には、α１，６−フコシルトランスフェラーゼ、α−Ｌ−フコシダーゼなどがあげられる。
酵素に突然変異を導入する方法としては、１）突然変異誘発処理で親株を処理した突然変異体あるいは自然発生的に生じた突然変異体から、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素の活性またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の活性を指標として所望の細胞株を選択する方法、２）突然変異誘発処理で親株を処理した突然変異体あるいは自然発生的に生じた突然変異体から、生産抗体分子の糖鎖構造を指標として所望の細胞株を選択する方法、３）突然変異誘発処理で親株を処理した突然変異体あるいは自然発生的に生じた突然変異体から、該細胞の細胞膜上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標として所望の細胞株を選択する方法などがあげられる。
突然変異誘発処理としては、親株の細胞のＤＮＡに点突然変異、欠失あるいはフレー厶シフト突然変異を誘起するものであればいかなる処理も用いることができる。
具体的には、エチルニトロソウレア、ニトロソグアニジン、ベンゾピレン、アクリジン色素による処理、放射線の照射などがあげられる。また、種々のアルキル化剤や発癌物質も突然変異誘発物質として用いることができる。突然変異誘発物質を細胞に作用させる方法としては、例えば、組織培養の技術第三版（朝倉書店）日本組織培養学会編（１９９６）、ネイチャー・ジェネティクス（ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔ．），２４，３１４，（２０００）等に記載の方法を挙げることができる。
自然発生的に生じた突然変異体としては、特別な突然変異誘発処理を施さないで、通常の細胞培養の条件で継代培養を続けることによって自然発生的に生じる突然変異体を挙げることができる。
細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素の活性またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の活性を測定する方法としては、例えば、本項１の（１）の（ａ）に記載の方法があげられる。産生抗体分子の糖鎖構造を識別する方法としては、例えば、後述４または後述５に記載の方法があげられる。細胞膜上の糖蛋白質の糖鎖構造を識別する方法としては、例えば、本項の１の（５）に記載の方法があげられる。
（４）酵素の遺伝子の転写又は翻訳を抑制する手法
本発明の抗体組成物を作製するために用いる宿主細胞は、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の遺伝子を標的とし、アンチセンスＲＮＡ／ＤＮＡ技術［バイオサイエンスとインダストリー，５０，３２２（１９９２）、化学，４６，６８１（１９９１）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，３５８（１９９２）、ＴｒｅｎｄｓｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０，８７（１９９２）、ＴｒｅｎｄｓｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０，１５２（１９９２）、細胞工学，１６，１４６３（１９９７）］、トリプル・ヘリックス技術［ＴｒｅｎｄｓｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０，１３２（１９９２）］等を用い、標的とする遺伝子の転写または翻訳を抑制することで作製することができる。
細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素としては、具体的には、ＧＭＤ、Ｆｘなどがあげられる。Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素としては、具体的には、α１，６−フコシルトランスフェラーゼ、α−Ｌ−フコシダーゼなどがあげられる。
細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素の活性またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の活性を測定する方法としては、例えば、本項１の（１）の（ａ）に記載の方法があげられる。
細胞膜上の糖蛋白質の糖鎖構造を識別する方法としては、例えば、本項１の（５）に記載の方法があげられる。産生抗体分子の糖鎖構造を識別する方法としては、例えば、後述４または後述５に記載の方法があげられる。
（５）Ｎ−グリコシド結合糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性である株を選択する手法
本発明の抗体組成物を作製するために用いる宿主細胞は、Ｎ−グリコシド結合糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性である株を選択する手法を用いることにより作製することができる。
Ｎ−グリコシド結合糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性である株を選択する手法としては、例えば、ソマティク・セル・アンド・モレキュラー・ジェネティクス（ＳｏｍａｔｉｃＣｅｌｌＭｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．），１２，５１（１９８６）等に記載のレクチンを用いた方法があげられる。
レクチンとしては、Ｎ−グリコシド結合糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンであればいずれのレクチンでも用いることができるが、その具体的な例としては、レンズマメレクチンＬＣＡ（ＬｅｎｓＣｕｌｉｎａｒｉｓ由来のＬｅｎｔｉｌＡｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）エンドウマメレクチンＰＳＡ（Ｐｉｓｕｍｓａｔｉｖｕｍ由来のＰｅａＬｅｃｔｉｎ）、ソラマメレクチンＶＦＡ（Ｖｉｃｉａｆａｂａ由来のＡｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ヒイロチャワンタケレクチンＡＡＬ（Ａｌｅｕｒｉａａｕｒａｎｔｉａ由来のＬｅｃｔｉｎ）等を挙げることができる。
具体的には、１μｇ／ｍＬ〜１ｍｇ／ｍＬの濃度の上述のレクチンを含む培地で１日〜２週間、好ましくは１日〜１週間培養し、生存している細胞を継代培養あるいはコロニーをピックアップし別の培養容器に移し、さらに引き続きレクチンを含む培地で培養を続けることによって、本発明のＮ−グリコシド結合糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性である株を選択することができる。
２．抗体組成物の製造方法
本発明の抗体組成物は、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８（以下、アンチボディズと略す）、ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄｐｒａｃｔｉｃｅ，ＴｈｉｒｄＥｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ，１９９３（以下、モノクローナルアンチボディズと略す）、ＡｎｔｉｂｏｄｙＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬＰｒｅｓｓａｔＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ，１９９６（以下、アンチボディエンジニアリングと略す）等に記載された方法を用い、例えば、以下のように宿主細胞中で発現させて取得することができる。
抗ヒトＩＬ−５Ｒα鎖抗体分子の全長ｃＤＮＡを調製し、該抗体分子をコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製する。
該ＤＮＡ断片、または全長を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換えベクターを作製する。
該組換えベクターを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、抗体分子を生産する形質転換体を得ることができる。
宿主細胞としては、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができる。
抗体分子のＦｃ領域に結合するＮ−グリコシド結合糖鎖の修飾に係わる酵素、すなわち細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素が失活した細胞を選択するか、または前述１に示された種々の人為的手法により得られた細胞を宿主細胞として用いることもできる。
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組込が可能で、目的とする抗体分子をコードするＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
ｃＤＮＡは、前記１．の（１）の（ａ）に記載のｃＤＮＡの調製方法に従い、ヒト又は非ヒト動物の組織又は細胞より、目的とする抗体分子に特異的なプローブまたはプライマー等を用いて調製することができる。
酵母を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ＹＥＰ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）、ＹＣｐ５０（ＡＴＣＣ３７４１９）等をあげることができる。
プロモーターとしては、酵母菌株中で発現できるものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、ヘキソースキナーゼ等の解糖系の遺伝子のプロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ｇａｌ１プロモーター、ｇａｌ１０プロモーター、ヒートショック蛋白質プロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＣＵＰ１プロモーター等をあげることができる。
宿主細胞としては、サッカロミセス属、シゾサッカロミセス属、クリュイベロミセス属、トリコスポロン属、シュワニオミセス属等に属する微生物、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓｌａｃｔｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎｐｕｌｌｕｌａｎｓ、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓａｌｌｕｖｉｕｓ等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法［メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．），１９４，１８２（１９９０）］、スフェロプラスト法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ），８４，１９２９（１９７８）］、酢酸リチウム法［ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ），１５３，１６３（１９８３）、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ），７５，１９２９（１９７８）］に記載の方法等をあげることができる。
動物細胞を宿主として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ｐｃＤＮＡＩ、ｐｃＤＭ８（フナコシ社より市販）、ｐＡＧＥ１０７［特開平３−２２９７９；サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３，（１９９０）］、ｐＡＳ３−３［特開平２−２２７０７５］、ｐＣＤＭ８［ネイチャ−（Ｎａｔｕｒｅ），３２９，８４０，（１９８７）］、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ｐＲＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ｐＡＧＥ１０３［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），１０１，１３０７（１９８７）］、ｐＡＧＥ２１０等をあげることができる。
プロモーターとしては、動物細胞中で発現できるものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のＩＥ（ｉｍｍｅｄｉａｔｅｅａｒｌｙ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター等をあげることができる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
宿主細胞としては、ヒトの細胞であるナマルバ（Ｎａｍａｌｗａ）細胞、サルの細胞であるＣＯＳ細胞、チャイニーズ・ハムスターの細胞であるＣＨＯ細胞、ＨＢＴ５６３７（特開昭６３−２９９）、ラットミエローマ細胞、マウスミエローマ細胞、シリアンハムスター腎臓由来細胞、胚性幹細胞、受精卵細胞等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、動物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］、リン酸カルシウム法［特開平２−２２７０７５］、リポフェクション法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），８４，７４１３（１９８７）］、インジェクション法［マニピュレイティング・ザ・マウス・エンブリオ・ア・ラボラトリー・マニュアル］、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法［特許第２６０６８５６号、特許第２５１７８１３号］、ＤＥＡＥ−デキストラン法［バイオマニュアルシリーズ４−遺伝子導入と発現・解析法（羊土社）横田崇・新井賢一編（１９９４）］、ウイルスベクター法［マニピュレーティング・マウス・エンブリオ第２版］等をあげることができる。
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、例えばカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーＢａｃｕｌｏｖｉｒｕｓＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＶｅｃｔｏｒｓ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ．ＦｒｅｅｍａｎａｎｄＣｏｍｐａｎｙ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９９２）、バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），６，４７（１９８８）等に記載された方法によって、蛋白質を発現することができる。
即ち、発現ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、蛋白質を発現させることができる。
該方法において用いられる遺伝子導入ベクターとしては、例えば、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ（ともにＩｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社）等をあげることができる。
バキュロウイルスとしては、例えば、夜盗蛾科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａｎｕｃｌｅａｒｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓｖｉｒｕｓ）等を用いることができる。
昆虫細胞としては、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞であるＳｆ９、Ｓｆ２１［カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーＢａｃｕｌｏｖｉｒｕｓＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＶｅｃｔｏｒｓ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ．ＦｒｅｅｍａｎａｎｄＣｏｍｐａｎｙ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９９２）］、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａｎｉの卵巣細胞であるＨｉｇｈ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）等を用いることができる。
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への上記発現導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），８４，７４１３（１９８７）］等をあげることができる。
植物細胞を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、Ｔｉプラスミド、タバコモザイクウイルスベクター等をあげることができる。
プロモーターとしては、植物細胞中で発現できるものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター、イネアクチン１プロモーター等をあげることができる。
宿主細胞としては、タバコ、ジャガイモ、トマト、ニンジン、ダイズ、アブラナ、アルファルファ、イネ、コムギ、オオムギ等の植物細胞等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、植物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）［特開昭５９−１４０８８５、特開昭６０−７００８０、ＷＯ９４／００９７７］、エレクトロポレーション法［特開昭６０−２５１８８７］、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法［日本特許第２６０６８５６、日本特許第２５１７８１３］等をあげることができる。
抗体遺伝子の発現方法としては、直接発現以外に、モレキュラー・クローニング第２版に記載されている方法等に準じて、分泌生産、Ｆｃ領域と他の蛋白質との融合蛋白質発現等を行うことができる。
糖鎖の合成に関与する遺伝子を導入した酵母、動物細胞、昆虫細胞または植物細胞により発現させた場合には、導入した遺伝子によって糖あるいは糖鎖が付加された抗体分子を得ることができる。
以上のようにして得られる形質転換体を培地に培養し、培養物中に抗体分子を生成蓄積させ、該培養物から採取することにより、抗体組成物を製造することができる。形質転換体を培地に培養する方法は、宿主細胞の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
酵母等の真核生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、該生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
炭素源としては、該生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノールなどのアルコール類等を用いることができる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、ならびに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消化物等を用いることができる。
無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マン癌、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。
培養は、通常振盪培養または深部通気攪拌培養などの好気的条件下で行う。培養温度は１５〜４０℃がよく、培養時間は、通常１６時間〜７日間である。培養中のｐＨは３．０〜９．０に保持する。ｐＨの調製は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用いて行う。
また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地［ザ・ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディカル・アソシエイション（ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆｔｈｅＡｍｅｒｉｃａｎＭｅｄｉｃａｌＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ），１９９，５１９（１９６７）］、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地［サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），１２２，５０１（１９５２）］、ダルベッコ改変ＭＥＭ培地［ヴュウロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ），８，３９６（１９５９）］、１９９培地［プロシーディング・オブ・ザ・ソサイエティ・フォア・ザ・バイオロジカル・メディスン（ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｏｆｔｈｅＳｏｃｉｅｔｙｆｏｒｔｈｅＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＭｅｄｉｃｉｎｅ），７３，１（１９５０）］、Ｗｈｉｔｔｅｎ培地［発生工学実験マニュアル−トランスジェニック・マウスの作り方（講談社）勝木元也編（１９８７）］またはこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等を用いることができる。
培養は、通常ｐＨ６．０〜８．０、３０〜４０℃、５％ＣＯ_２存在下等の条件下で１〜７日間行う。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
昆虫細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＴＮＭ−ＦＨ培地（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）、Ｓｆ−９００ＩＩＳＦＭ培地（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、ＥｘＣｅｌｌ４００、ＥｘＣｅｌｌ４０５（いずれもＪＲＨＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、Ｇｒａｃｅ’ｓＩｎｓｅｃｔＭｅｄｉｕｍ［ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），１９５，７８８（１９６２）］等を用いることができる。
培養は、通常ｐＨ６．０〜７．０、２５〜３０℃等の条件下で、１〜５日間行う。
また、培養中必要に応じて、ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
植物細胞を宿主として得られた形質転換体は、細胞として、または植物の細胞や器官に分化させて培養することができる。該形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているムラシゲ・アンド・スクーグ（ＭＳ）培地、ホワイト（Ｗｈｉｔｅ）培地、またはこれら培地にオーキシン、サイトカイニン等、植物ホルモンを添加した培地等を用いることができる。
培養は、通常ｐＨ５．０〜９．０、２０〜４０℃の条件下で３〜６０日間行う。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ハイグロマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
上記のとおり、抗体分子をコードするＤＮＡを組み込んだ発現ベクターを保有する動物細胞、あるいは植物細胞由来の形質転換体を、通常の培養方法に従って培養し、抗体組成物を生成蓄積させ、該培養物より抗体組成物を採取することにより、抗体組成物を製造することができる。
抗体遺伝子の発現方法としては、直接発現以外に、モレキュラー・クローニング第２版に記載されている方法に準じて、分泌生産、融合蛋白質発現等を行うことができる。
抗体組成物の生産方法としては、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞外に分泌させる方法、あるいは宿主細胞外膜上に生産させる方法があり、使用する宿主細胞や、生産させる抗体分子の構造を変えることにより、該方法を選択することができる。
抗体組成物が宿主細胞内あるいは宿主細胞外膜上に生産される場合、ポールソンらの方法［ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．），２６４，１７６１９（１９８９）］、ロウらの方法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），８６，８２２７（１９８９）；ジーン・デベロップメント（ＧｅｎｅｓＤｅｖｅｌｏｐ．），４，１２８８（１９９０）］、または特開平０５−３３６９６３、ＷＯ９４／２３０２１等に記載の方法を準用することにより、該抗体組成物を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
すなわち、遺伝子組換えの手法を用いて、発現ベクターに、抗体分子をコードするＤＮＡ、および抗体分子の発現に適切なシグナルペプチドをコードするＤＮＡを挿入し、該発現ベクターを宿主細胞へ導入の後に抗体分子を発現させることにより、目的とする抗体分子を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
また、特開平２−２２７０７５に記載されている方法に準じて、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子等を用いた遺伝子増幅系を利用して生産量を上昇させることもできる。
さらに、遺伝子導入した動物または植物の細胞を再分化させることにより、遺伝子が導入された動物個体（トランスジェニック非ヒト動物）または植物個体（トランスジェニック植物）を造成し、これらの個体を用いて抗体組成物を製造することもできる。
形質転換体が動物個体または植物個体の場合は、通常の方法に従って、飼育または栽培し、抗体組成物を生成蓄積させ、該動物個体または植物個体より該抗体組成物を採取することにより、該抗体組成物を製造することができる。
動物個体を用いて抗体組成物を製造する方法としては、例えば公知の方法［アメリカン・ジャーナル・オブ・クリニカル・ニュートリション（ＡｍｅｒｉｃａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｌｉｎｉｃａｌＮｕｔｒｉｔｉｏｎ），６３，６３９Ｓ（１９９６）；アメリカン・ジャーナル・オブ・クリニカル・ニュートリション（ＡｍｅｒｉｃａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｌｉｎｉｃａｌＮｕｔｒｉｔｉｏｎ），６３，６２７Ｓ（１９９６）；バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），９，８３０（１９９１）］に準じて遺伝子を導入して造成した動物中に目的とする抗体組成物を生産させる方法があげられる。
動物個体の場合は、例えば、抗体分子をコードするＤＮＡを導入したトランスジェニック非ヒト動物を飼育し、抗体組成物を該動物中に生成・蓄積させ、該動物中より抗体組成物を採取することにより、抗体組成物を製造することができる。該動物中の生成・蓄積場所としては、例えば、該動物のミルク（特開昭６３−３０９１９２）または卵等をあげることができる。この際に用いられるプロモーターとしては、動物で発現できるものであればいずれも用いることができるが、例えば、乳腺細胞特異的なプロモーターであるαカゼインプロモーター、βカゼインプロモーター、βラクトグロブリンプロモーター、ホエー酸性プロテインプロモーター等が好適に用いられる。
植物個体を用いて抗体組成物を製造する方法としては、例えば抗体分子をコードするＤＮＡを導入したトランスジェニック植物を公知の方法［組織培養，２０（１９９４）；組織培養，２１（１９９５）；トレンド・イン・バイオテクノロジー（ＴｒｅｎｄｓｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），１５，４５（１９９７）］に準じて栽培し、抗体組成物を該植物中に生成・蓄積させ、該植物中より該抗体組成物を採取することにより、抗体組成物を生産する方法があげられる。
抗体分子をコードする遺伝子を導入した形質転換体により製造された抗体組成物は、例えば抗体組成物が、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液に懸濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、通常の酵素の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、ＤＩＡＩＯＮＨＰＡ−７５（三菱化学（株）製）等レジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、抗体組成物の精製標品を得ることができる。
また、抗体組成物が細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより、沈殿画分として抗体組成物の不溶体を回収する。回収した抗体組成物の不溶体を蛋白質変性剤で可溶化する。該可溶化液を希釈または透析することにより、該抗体組成物を正常な立体構造に戻した後、上記と同様の単離精製法により該抗体組成物の精製標品を得ることができる。
抗体組成物が細胞外に分泌された場合には、培養上清に該抗体組成物あるいはその誘導体を回収することができる。即ち、該培養物を上記と同様の遠心分離等の手法により処理することにより培養上清を取得し、該培養上清から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、抗体組成物の精製標品を得ることができる。
以下に、本発明の抗体組成物の取得のより具体的な例として、ヒト化抗体の組成物の製造方法について記すが、他の抗体組成物を当該方法と同様にして取得することもできる。
（１）ヒト化抗体発現用ベクターの構築
ヒト化抗体発現用ベクターとは、ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子が組み込まれた動物細胞用発現ベクターであり、動物細胞用発現ベクターにヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子をそれぞれクローニングすることにより構築することができる。
ヒト抗体のＣ領域としては、任意のヒト抗体のＣＨおよびＣＬであることができ、例えば、ヒト抗体のＨ鎖のＩｇＧ１サブクラスのＣ領域（以下、ｈＣγ１と表記する）およびヒト抗体のＬ鎖のκクラスのＣ領域（以下、ｈＣκと表記する）等があげられる。
ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子としてはエキソンとイントロンから成る染色体ＤＮＡを用いることができ、また、ｍＲＮＡから逆転写して作製されたｃＤＮＡを用いることもできる。
動物細胞用発現ベクターとしては、ヒト抗体のＣ領域をコードする遺伝子を組込み発現できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ｐＡＧＥ１０７［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］、ｐＡＧＥ１０３［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），１０１，１３０７（１９８７）］、ｐＨＳＧ２７４［ジーン（Ｇｅｎｅ），２７，２２３（１９８４）］、ｐＫＣＲ［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），７８，１５２７（１９８１）］、ｐＳＧ１βｄ２−４［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），４，１７３（１９９０）］等があげられる。動物細胞用発現ベクターに用いるプロモーターとエンハンサーとしては、ＳＶ４０の初期プロモーターとエンハンサー［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），１０１，１３０７（１９８７）］、モロニーマウス白血病ウイルスのＬＴＲ［バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．），１４９，９６０（１９８７）］、免疫グロブリンＨ鎖のプロモーター［セル（Ｃｅｌｌ），４１，４７９（１９８５）］とエンハンサー［セル（Ｃｅｌｌ），３３，７１７（１９８３）］等があげられる。
ヒト化抗体発現用ベクターは、抗体Ｈ鎖及びＬ鎖が別々のベクター上に存在するタイプあるいは同一のベクター上に存在するタイプ（以下、タンデム型と表記する）のどちらでも用いることができるが、ヒト化抗体発現ベクターの構築の容易さ、動物細胞への導入の容易さ、動物細胞内での抗体Ｈ鎖及びＬ鎖の発現量のバランスが均衡する等の点からタンデム型のヒト化抗体発現用ベクターの方が好ましい［ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッズ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ），１６７，２７１（１９９４）］。タンデム型のヒト化抗体発現ベクターとしては、ｐＫＡＮＴＥＸ９３［モレキュラー・イムノロジー（Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．），３７，１０３５（２０００）］、ｐＥＥ１８［ハイブリドーマ（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ），１７，５５９（１９９８）］などがあげられる。
構築したヒト化抗体発現用ベクターは、ヒト型キメラ抗体及びヒト型ＣＤＲ移植抗体の動物細胞での発現に使用できる。
（２）ヒト以外の動物の抗体のＶ領域をコードするｃＤＮＡの取得
ヒト以外の動物の抗体、例えば、マウス抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡは以下のようにして取得することができる。
ヒトＩＬ−５Ｒα鎖に特異的に結合する抗体を産生するハイブリドーマ細胞から抽出したｍＲＮＡを鋳型として用い、ｃＤＮＡを合成する。合成したｃＤＮＡをファージ或いはプラスミド等のベクターに挿入してｃＤＮＡライブラリーを作製する。該ライブラリーより、既存のマウス抗体のＣ領域或いはＶ領域をコードするＤＮＡをプローブとして用い、Ｈ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡを有する組換えファージ或いは組換えプラスミド及びＬ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡを有する組換えファージ或いは組換えプラスミドをそれぞれ単離する。組換えファージ或いは組換えプラスミド上の目的のマウス抗体のＶＨおよびＶＬの全塩基配列を決定し、塩基配列よりＶＨおよびＶＬの全アミノ酸配列を推定する。
ヒトＩＬ−５Ｒα鎖に特異的に結合できるヒト以外の動物の抗体を生産するハイブリドーマ細胞は、配列番号４３で示されるヒトＩＬ−５Ｒα鎖をヒト以外の動物に免疫し、周知の方法（アンティボディズ：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ）．ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ１４，１９９８）に従って、免疫された動物の抗体産生細胞とミエローマ細胞とでハイブリドーマを作製し、次いで単一細胞化したハイブリドーマを選択し、これを培養し、培養上清から精製し、取得することができる。
ヒト以外の動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ等、ハイブリドーマ細胞を作製することが可能であれば、いかなるものも用いることができる。
ハイブリドーマ細胞から全ＲＮＡを調製する方法としては、チオシアン酸グアニジン−トリフルオロ酢酸セシウム法［メソッズ・イン・エンザイモロジー（ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌ．），１５４，３（１９８７）］、また全ＲＮＡからｍＲＮＡを調製する方法としては、オリゴ（ｄＴ）固定化セルロースカラム法［モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ），ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂ．ＰｒｅｓｓＮｅｗＹｏｒｋ，１９８９］等があげられる。また、ハイブリドーマ細胞からｍＲＮＡを調製するキットとしては、ＦａｓｔＴｒａｃｋｍＲＮＡＩｓｏｌａｔｉｏｎＫｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ＱｕｉｃｋＰｒｅｐｍＲＮＡＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等があげられる。
ｃＤＮＡの合成及びｃＤＮＡライブラリー作製法としては、常法［モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ），ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂ．ＰｒｅｓｓＮｅｗＹｏｒｋ，１９８９；カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ），Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ１−３４］、或いは市販のキット、例えば、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ^ＴＭＰｌａｓｍｉｄＳｙｓｔｅｍｆｏｒｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓａｎｄＰｌａｓｍｉｄＣｌｏｎｉｎｇ（ＧＩＢＣＯＢＲＬ社製）やＺＡＰ−ｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓＫｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いる
方法などがあげられる。
ｃＤＮＡライブラリーの作製の際、ハイブリドーマ細胞から抽出したｍＲＮＡを鋳型として合成したｃＤＮＡを組み込むベクターは、該ｃＤＮＡを組み込めるベクターであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ＺＡＰＥｘｐｒｅｓｓ［ストラテジーズ（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ），５，５８（１９９２）］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋）［ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ），１７，９４９４（１９８９）］、λＺＡＰＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、λｇｔ１０、λｇｔ１１［ディーエヌエー・クローニング：ア・プラクティカル・アプローチ（ＤＮＡＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ），Ｉ，４９（１９８５）］、ＬａｍｂｄａＢｌｕｅＭｉｄ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）、λＥｘＣｅｌｌ、ｐＴ７Ｔ３１８Ｕ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐｃＤ２［モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．），３，２８０（１９８３）］及びｐＵＣ１８［ジーン（Ｇｅｎｅ），３３，１０３（１９８５）］等が用いられる。
ファージ或いはプラスミドベクターにより構築されるｃＤＮＡライブラリーを導入する大腸菌としては該ｃＤＮＡライブラリーを導入、発現及び維持できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ＸＬ１−ＢｌｕｅＭＲＦ’［ストラテジーズ（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ），５，８１（１９９２）］、Ｃ６００［ジェネティックス（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ），３９，４４０（１９５４）］、Ｙ１０８８、Ｙ１０９０［サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２２２，７７８（１９８３）］、ＮＭ５２２［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．），１６６，１（１９８３）］、Ｋ８０２［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．），１６，１１８（１９６６）］及びＪＭ１０５［ジーン（Ｇｅｎｅ），３８，２７５（１９８５）］等が用いられる。
ｃＤＮＡライブラリーからのヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡクローンを選択する方法としては、アイソトープ或いは蛍光などで標識したプローブを用いたコロニー・ハイブリダイゼーション法或いはプラーク・ハイブリダイゼーション法［モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ），ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂ．ＰｒｅｓｓＮｅｗＹｏｒｋ，１９８９］により選択することができる。また、プライマーを調製し、ｃＤＮＡ或いはｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、ＰＣＲ［モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ），ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂ．ＰｒｅｓｓＮｅｗＹｏｒｋ，１９８９；カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ），Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ１−３４］によりＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを調製することもできる。
上記方法により選択されたｃＤＮＡを、適当な制限酵素などで切断後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）等のプラスミドにクローニングし、通常用いられる塩基配列解析方法、例えば、サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）らのジデオキシ法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．），７４，５４６３（１９７７）］等の反応を行い、塩基配列自動分析装置、例えば、ＡＢＩＰＲＩＳＭ３７７ＤＮＡシークエンサー（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより該ｃＤＮＡの塩基配列を決定することができる。
決定した塩基配列からＶＨおよびＶＬの全アミノ酸配列を推定し、既知の抗体のＶＨおよびＶＬの全アミノ酸配列［シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト（ＳｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ），ＵＳＤｅｐｔ．ＨｅａｌｔｈａｎｄＨｕｍａｎＳｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１］と比較することにより、取得したｃＤＮＡが分泌シグナル配列を含む抗体のＶＨおよびＶＬを完全に含んでいるアミノ酸配列をコードしているかを確認することができる。
さらに、抗体可変領域のアミノ酸配列または該可変領域をコードするＤＮＡの塩基配列がすでに公知である場合には、以下の方法を用いて製造することができる。
アミノ酸配列が公知である場合には、コドンの使用頻度［シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト（ＳｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ），ＵＳＤｅｐｔ．ＨｅａｌｔｈａｎｄＨｕｍａｎＳｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１］を考慮して該可変領域をコードするＤＮＡ配列を設計し、設計したＤＮＡ配列に基づき、１００塩基前後の長さからなる数本の合成ＤＮＡを合成し、それらを用いてＰＣＲ法を行うことによりＤＮＡを得ることができる。塩基配列が公知である場合には、その情報を基に１００塩基前後の長さからなる数本の合成ＤＮＡを合成し、それらを用いてＰＣＲ法を行うことによりＤＮＡを得ることができる。
（３）ヒト以外の動物の抗体のＶ領域のアミノ酸配列の解析
分泌シグナル配列を含む抗体のＶＨおよびＶＬの完全なアミノ酸配列に関しては、既知の抗体のＶＨおよびＶＬのアミン酸配列［シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト（ＳｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ），ＵＳＤｅｐｔ．ＨｅａｌｔｈａｎｄＨｕｍａｎＳｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１］と比較することにより、分泌シグナル配列の長さ及びＮ末端アミノ酸配列を推定でき、更には抗体が属するサブグループを知ることができる。また、ＶＨおよびＶＬの各ＣＤＲのアミノ酸配列についても、同様の方法で見出すことができる。
（４）ヒト型キメラ抗体発現ベクターの構築
本項２の（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子の上流に、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを挿入し、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。例えば、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを、ヒト以外の動物の抗体ＶＨおよびＶＬの３’末端側の塩基配列とヒト抗体のＣＨおよびＣＬの５’末端側の塩基配列とからなり、かつ適当な制限酵素の認識配列を両端に有する合成ＤＮＡとそれぞれ連結し、それぞれを本項２の（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現するように挿入し、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。
（５）ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶ領域をコードするｃＤＮＡの構築
ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡは、以下のようにして構築することができる。まず、目的のヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲを移植するヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列を選択する。ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列としては、ヒト抗体由来のものであれば、いかなるものでも用いることができる。例えば、ＰｒｏｔｅｉｎＤａｔａＢａｎｋ等のデータベースに登録されているヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲの各サブグループの共通アミノ酸配列［シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト（ＳｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ），ＵＳＤｅｐｔ．ＨｅａｌｔｈａｎｄＨｕｍａｎＳｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１］等があげられるが、その中でも、十分な活性を有するヒト型ＣＤＲ移植抗体を作製するためには、目的のヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列とできるだけ高い相同性（少なくとも６０％以上）を有するアミノ酸配列を選択することが望ましい。
次に、選択したヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列に目的のヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列を移植し、ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列を設計する。設計したアミノ酸配列を抗体の遺伝子の塩基配列に見られるコドンの使用頻度［シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト（ＳｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ），ＵＳＤｅｐｔ．ＨｅａｌｔｈａｎｄＨｕｍａｎＳｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１］を考慮してＤＮＡ配列に変換し、ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を設計する。設計したＤＮＡ配列に基づき、１００塩基前後の長さからなる数本の合成ＤＮＡを合成し、それらを用いてＰＣＲ法を行う。この場合、ＰＣＲでの反応効率及び合成可能なＤＮＡの長さから、Ｈ鎖、Ｌ鎖とも４〜６本の合成ＤＮＡを設計することが好ましい。
また、両端に位置する合成ＤＮＡの５’末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、本項２の（１）で構築したヒト化抗体発現用ベクターに容易にクローニングすることができる。ＰＣＲ後、増幅産物をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）等のプラスミドにクローニングし、本項２の（２）に記載の方法により、塩基配列を決定し、所望のヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有するプラスミドを取得する。
（６）ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶ領域のアミノ酸配列の改変
ヒト型ＣＤＲ移植抗体は、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのみをヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲに移植しただけでは、その抗原結合活性は元のヒト以外の動物の抗体に比べて低下してしまうことが知られている［バイオ／テクノロジー（ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ），９，２６６（１９９１）］。この原因としては、元のヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬでは、ＣＤＲのみならず、ＦＲのいくつかのアミノ酸残基が直接的或いは間接的に抗原結合活性に関与しており、それらアミノ酸残基がＣＤＲの移植に伴い、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲの異なるアミノ酸残基へと変化してしまうことが考えられている。この問題を解決するため、ヒト型ＣＤＲ移植抗体では、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列の中で、直接抗原との結合に関与しているアミノ酸残基やＣＤＲのアミノ酸残基と相互作用したり、抗体の立体構造を維持し、間接的に抗原との結合に関与しているアミノ酸残基を同定し、それらを元のヒト以外の動物の抗体に由来するアミノ酸残基に改変し、低下した抗原結合活性を上昇させることが行われている［バイオ／テクノロジー（ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ），９，２６６（１９９１）］。
ヒト型ＣＤＲ移植抗体の作製においては、それら抗原結合活性に関わるＦＲのアミノ酸残基を如何に効率よく同定するかが、最も重要な点であり、そのためにＸ線結晶解析［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．），１１２，５３５（１９７７）］或いはコンピューターモデリング［プロテイン・エンジニア・リング（ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ），７，１５０１（１９９４）］等による抗体の立体構造の構築及び解析が行われている。これら抗体の立体構造の情報は、ヒト型ＣＤＲ移植抗体の作製に多くの有益な情報をもたらして来た。しかしながら、あらゆる抗体に適応可能なヒト型ＣＤＲ移植抗体の作製法は未だ確立されていない。現状ではそれぞれの抗体について数種の改変体を作製し、それぞれの抗原結合活性との相関を検討する等の種々の試行錯誤が必要である。
ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸残基の改変は、改変用合成ＤＮＡを用いて本項２の（５）に記載のＰＣＲ法を行うことにより、達成できる。ＰＣＲ後の増幅産物について本項２の（２）に記載の方法により、塩基配列を決定し、目的の改変が施されたことを確認する。
（７）ヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターの構築
本項２の（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子の上流に、本項２の（５）および（６）で構築したヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを挿入し、ヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターを構築することができる。例えば、本項２の（５）および（６）でヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬを構築する際に用いる合成ＤＮＡのうち、両端に位置する合成ＤＮＡの５’末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、本項２の（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現するように挿入し、ヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターを構築することができる。
（８）ヒト化抗体の安定的生産
本項２の（４）及び（７）に記載のヒト化抗体発現ベクターを適当な動物細胞に導入することによりヒト型キメラ抗体及びヒト型ＣＤＲ移植抗体（以下、併せてヒト化抗体と称す）を安定に生産する形質転換株を得ることができる。
動物細胞へのヒト化抗体発現ベクターの導入法としては、エレクトロポレーション法［特開平２−２５７８９１；サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］等があげられる。
ヒト化抗体発現ベクターを導入する動物細胞としては、ヒト化抗体を生産させることができる動物細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができる。
具体的には、マウスミエローマ細胞であるＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞、ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞、ラットミエローマ細胞ＹＢ２／０細胞、ＩＲ９８３Ｆ細胞、シリアンハムスター腎臓由来であるＢＨＫ細胞、ヒトミエローマ細胞であるナマルバ細胞などがあげられるが、好ましくは、チャイニーズハムスター卵巣細胞であるＣＨＯ／ＤＧ４４細胞、ラットミエローマＹＢ２／０細胞等があげられる。
ヒト化抗体発現ベクターの導入後、ヒト化抗体を安定に生産する形質転換株は、特開平２−２５７８９１に開示されている方法に従い、Ｇ４１８硫酸塩（以下、Ｇ４１８と表記する；ＳＩＧＭＡ社製）等の薬剤を含む動物細胞培養用培地により選択できる。動物細胞培養用培地としては、ＲＰＭＩ１６４０培地（日水製薬社製）、ＧＩＴ培地（日本製薬社製）、ＥＸ−ＣＥＬＬ３０２培地（ＪＲＨ社製）、ＩＭＤＭ培地（ＧＩＢＣＯＢＲＬ社製）、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地（ＧＩＢＣＯＢＲＬ社製）、またはこれら培地に牛胎児血清（以下、ＦＣＳと表記する）等の各種添加物を添加した培地等を用いることができる。得られた形質転換株を培地中で培養することで培養上清中にヒト化抗体を生産蓄積させることができる。培養上清中のヒト化抗体の生産量及び抗原結合活性は酵素免疫抗体法［以下、ＥＬＩＳＡ法と表記する；アンティボディズ：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ；ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ），ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ１４，１９９８、モノクローナル・アンティボディズ：プリンシプルズ・アンド・プラクティス（ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅ），ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓＬｉｍｉｔｅｄ，１９９６］等により測定できる。また、形質転換株は、特開平２−２５７８９１に開示されている方法に従い、ＤＨＦＲ遺伝子増幅系等を利用してヒト化抗体の生産量を上昇させることができる。
ヒト化抗体は、形質転換株の培養上清よりプロテインＡカラムを用いて精製することができる［アンティボディズ：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ），ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ８，１９８８、モノクローナル・アンティボディズ：プリンシプルズ・アンド・プラクティス（ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅ），ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓＬｉｍｉｔｅｄ，１９９６］。また、その他に通常、蛋白質の精製で用いられる精製方法を使用することができる。例えば、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー及び限外濾過等を組み合わせて行い、精製することができる。精製したヒト化抗体のＨ鎖、Ｌ鎖或いは抗体分子全体の分子量は、ＳＤＳ変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動［以下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと表記する；ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），２２７，６８０（１９７０）］やウエスタンブロッティング法［アンティボディズ：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ），ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ１２，１９８８、モノクローナル・アンティボディズ：プリンシプルズ・アンド・プラクテイス（ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅ），ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓＬｉｍｉｔｅｄ，１９９６］等で測定することができる。
以上、動物細胞を宿主とした抗体組成物の製造方法を示したが、上述したように、酵母、昆虫細胞、植物細胞または動物個体あるいは植物個体においても動物細胞と同様の方法により抗体組成物を製造することができる。
すでに宿主細胞が抗体分子を発現する能力を有する場合には、上記１に記載した方法を用いて抗体分子を発現させる細胞を調製した後に、該細胞を培養し、該培養物から目的とする抗体組成物を精製することにより、本発明の抗体組成物を製造することができる。
３．抗体組成物の活性評価
精製した抗体組成物の蛋白量、抗原との結合活性あるいは細胞傷害活性を測定する方法としては、モノクローナルアンチボディズ、あるいはアンチボディエンジニアリング等に記載の公知の方法を用いることができる。
具体的な例としては、抗体組成物がヒト化抗体の場合、抗原との結合活性、抗原陽性培養細胞株に対する結合活性はＥＬＩＳＡ法及び蛍光抗体法［キャンサー・イムノロジー・イムノセラピー（ＣａｎｃｅｒＩｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．），３６，３７３（１９９３）］等により測定できる。抗原陽性培養細胞株に対する細胞傷害活性は、ＣＤＣ活性、ＡＤＣＣ活性等を測定することにより、評価することができる［キャンサー・イムノロジー・イムノセラピー（ＣａｎｃｅｒＩｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．），３６，３７３（１９９３）］。
また、抗体組成物のヒトでの安全性、治療効果は、カニクイザル等のヒトに比較的近い動物種の適当なモデルを用いて評価することができる。
４．抗体組成物の糖鎖の分析
各種細胞で発現させた抗体分子の糖鎖構造は、通常の糖蛋白質の糖鎖構造の解析に準じて行うことができる。例えば、ＩｇＧ分子に結合している糖鎖はガラクトース、マンノース、フコースなどの中性糖、Ｎ−アセチルグルコサミンなどのアミノ糖、シアル酸などの酸性糖から構成されており、糖組成分析および二次元糖鎖マップ法などを用いた糖鎖構造解析等の手法を用いて行うことができる。
（１）中性糖・アミノ糖組成分析
抗体組成物の糖鎖の組成分析は、トリフルオロ酢酸等で、糖鎖の酸加水分解を行うことにより、中性糖またはアミノ糖を遊離し、その組成比を分析することができる。
具体的な方法として、Ｄｉｏｎｅｘ社製糖組成分析装置を用いる方法があげられる。ＢｉｏＬｃはＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ（ｈｉｇｈｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅａｎｉｏｎ−ｅｘｃｈａｎｇｅｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−ｐｕｌｓｅｄａｍｐｅｒｏｍｅｔｒｉｃｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）法［ジャーナル・オブ・リキッド・クロマトグラフィー（Ｊ．Ｌｉｑ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．），６，１５７７（１９８３）］によって糖組成を分析する装置である。
また、２−アミノピリジンによる蛍光標識化法でも組成比を分析することができる。具体的には、公知の方法［アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．），５５（１），２８３−２８４（１９９１）］に従って酸加水分解した試料を２−アミノピリジル化で蛍光ラベル化し、ＨＰＬＣ分析して組成比を算出することができる。
（２）糖鎖構造解析
抗体組成物の糖鎖の構造解析は、２次元糖鎖マップ法［アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），１７１，７３（１９８８）、生物化学実験法２３−糖蛋白質糖鎖研究法（学会出版センター）高橋禮子編（１９８９年）］により行うことができる。２次元糖鎖マップ法は、例えば、Ｘ軸には逆相クロマトグラフィーによる糖鎖の保持時間または溶出位置を、Ｙ軸には順相クロマトグラフィーによる糖鎖の保持時間または溶出位置を、それぞれプロットし、既知糖鎖のそれらの結果と比較することにより、糖鎖構造を推定する方法である。
具体的には、抗体をヒドラジン分解して、抗体から糖鎖を遊離し、２−アミノピリジン（以下、ＰＡと略記する）による糖鎖の蛍光標識［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），９５，１９７（１９８４）］を行った後、ゲルろ過により糖鎖を過剰のＰＡ化試薬などと分離し、逆相クロマトグラフィーを行う。次いで、分取した糖鎖の各ピークについて順相クロマトグラフィーを行う。これらの結果をもとに、２次元糖鎖マップ上にプロットし、糖鎖スタンダード（ＴａＫａＲａ社製）、文献［アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），１７１，７３（１９８８）］とのスポットの比較より糖鎖構造を推定することができる。
さらに各糖鎖のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳなどの質量分析を行い、２次元糖鎖マップ法により推定される構造を確認することができる。
５．抗体分子の糖鎖構造を識別する免疫学的定量方法
抗体組成物は、抗体のＦｃ領域に結合する糖鎖構造が異なった抗体分子から構成されている。本発明の抗体組成物は、Ｆｃ領域に結合する全Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が１００％であり、高いＡＤＣＣ活性を示す。このような抗体組成物は、上記４．に記載の抗体分子の糖鎖構造の分析法を用いることにより識別できる。また、レクチンを用いた免疫学的定量方法を用いることによっても識別できる。
レクチンを用いた免疫学的定量方法を用いた抗体分子の糖鎖構造の識別は、文献［モノクローナル・アンティボディズ：プリンシプルズ・アンド・アプリケーションズ（ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ），Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，（１９９５）；酵素免疫測定法，第３版，医学書院（１９８７）；改訂版，酵素抗体法，学際企画（１９８５）］等に記載のウエスタン染色、ＲＩＡ（Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、ＶＩＡ（Ｖｉｒｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、ＥＩＡ（Ｅｎｚｙｍｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、ＦＩＡ（Ｆｌｕｏｒｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、ＭＩＡ（Ｍｅｔａｌｌｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）などの免疫学的定量方法に準じて、例えば、以下のように行うことができる。
抗体組成物を構成する抗体分子の糖鎖構造を認識するレクチンを標識し、標識したレクチンと試料である抗体組成物を反応させる。次に、標識したレクチンと抗体分子の複合体の量を測定する。
抗体分子の糖鎖構造を識別に用いられるレクチンとしては、例えば、ＷＧＡ（Ｔ．ｖｕｌｇａｒｉｓ由来のｗｈｅａｔ−ｇｅｒｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ＣｏｎＡ（Ｃ．ｅｎｓｉｆｏｒｍｉｓ由来のｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎＡ）、ＲＩＣ（Ｒ．ｃｏｍｍｕｎｉｓ由来の毒素）、Ｌ−ＰＨＡ（Ｐ．ｖｕｌｇａｒｉｓ由来のｌｅｕｋｏａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ＬＣＡ（Ｌ．ｃｕｌｉｎａｒｉｓ由来のｌｅｎｔｉｌａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ＰＳＡ（Ｐ．ｓａｔｉｖｕｍ由来のＰｅａｌｅｃｔｉｎ）、ＡＡＬ（ＡｌｅｕｒｉａａｕｒａｎｔｉａＬｅｃｔｉｎ）、ＡＣＬ（ＡｍａｒａｎｔｈｕｓｃａｕｄａｔｕｓＬｅｃｔｉｎ）、ＢＰＬ（ＢａｕｈｉｎｉａｐｕｒｐｕｒｅａＬｅｃｔｉｎ）、ＤＳＬ（ＤａｔｕｒａｓｔｒａｍｏｎｉｕｍＬｅｃｔｉｎ）、ＤＢＡ（ＤｏｌｉｃｈｏｓｂｉｆｌｏｒｕｓＡｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ＥＢＬ（ＥｌｄｅｒｂｅｒｒｙＢａｌｋＬｅｃｔｉｎ）、ＥＣＬ（ＥｒｙｔｈｒｉｎａｃｒｉｓｔａｇａｌｌｉＬｅｃｔｉｎ）、ＥＥＬ（ＥｕｏｎｙｍｕｓｅｕｒｏｐａｅｕｓＬｅｃｔｉｎ）、ＧＮＬ（ＧａｌａｎｔｈｕｓｎｉｖａｌｉｓＬｅｃｔｉｎ）、ＧＳＬ（ＧｒｉｆｆｏｎｉａｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａＬｅｃｔｉｎ）、ＨＰＡ（ＨｅｌｉｘｐｏｍａｔｉａＡｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ＨＨＬ（ＨｉｐｐｅａｓｔｒｕｍＨｙｂｒｉｄＬｅｃｔｉｎ）、Ｊａｃａｌｉｎ、ＬＴＬ（ＬｏｔｕｓｔｅｔｒａｇｏｎｏｌｏｂｕｓＬｅｃｔｉｎ）、ＬＥＬ（ＬｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍＬｅｃｔｉｎ）、ＭＡＬ（ＭａａｃｋｉａａｍｕｒｅｎｓｉｓＬｅｃｔｉｎ）、ＭＰＬ（ＭａｃｌｕｒａｐｏｍｉｆｅｒａＬｅｃｔｉｎ）、ＮＰＬ（ＮａｒｃｉｓｓｕｓｐｓｅｕｄｏｎａｒｃｉｓｓｕｓＬｅｃｔｉｎ）、ＰＮＡ（ＰｅａｎｕｔＡｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、Ｅ−ＰＨＡ（ＰｈａｓｅｏｌｕｓｖｕｌｇａｒｉｓＥｒｙｔｈｒｏａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ＰＴＬ（ＰｓｏｐｈｏｃａｒｐｕｓｔｅｔｒａｇｏｎｏｌｏｂｕｓＬｅｃｔｉｎ）、ＲＣＡ（ＲｉｃｉｎｕｓｃｏｍｍｕｎｉｓＡｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ＳＴＬ（ＳｏｌａｎｕｍｔｕｂｅｒｏｓｕｍＬｅｃｔｉｎ）、ＳＪＡ（ＳｏｐｈｏｒａｊａｐｏｎｉｃａＡｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ＳＢＡ（ＳｏｙｂｅａｎＡｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ＵＥＡ（ＵｌｅｘｅｕｒｏｐａｅｕｓＡｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ＶＶＬ（ＶｉｃｉａｖｉｌｌｏｓａＬｅｃｔｉｎ）、ＷＦＡ（ＷｉｓｔｅｒｉａｆｌｏｒｉｂｕｎｄａＡｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）があげられる。
Ｎ−グルコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合している糖鎖構造を特異的に認識するレクチンを用いることが好ましく、その具体的な例としては、レンズマメレクチンＬＣＡ（ＬｅｎｓＣｕｌｉｎａｒｉｓ由来のＬｅｎｔｉｌＡｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）エンドウマメレクチンＰＳＡ（Ｐｉｓｕｍｓａｔｉｖｕｍ由来のＰｅａＬｅｃｔｉｎ）、ソラマメレクチンＶＦＡ（Ｖｉｃｉａｆａｂａ由来のＡｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ヒイロチャワンタケレクチンＡＡＬ（Ａｌｅｕｒｉａａｕｒａｎｔｉａ由来のＬｅｃｔｉｎ）を挙げることができる。
６．本発明の抗体分子の利用
本発明の抗体組成物は、ヒトＩＬ−５Ｒα鎖に特異的に結合し、高い抗体依存性細胞傷害活性を有するため、炎症性疾患や好酸球増多を伴う疾患をはじめとする各種ＩＬ−５Ｒα鎖発現細胞関連疾患の予防および治療において有用である。
本発明の抗体組成物による治療が有効な炎症性疾患としては、気管支喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、慢性副鼻腔炎、Ｃｈｕｒｇ−Ｓｔｒａｕｓｓ症候群、蕁麻疹、天疱瘡、好酸球性心筋炎、アレルギー性胃腸炎、アレルギー性肉芽腫性血管炎などがあげられる。
本発明の抗体組成物による治療が有効な好酸球増多を伴う疾患としては、好酸球性肉芽腫、サルコイドーシス、好酸球性胃腸炎、潰瘍性大腸炎、好酸球性白血病、ホジキン病、好酸球性肺炎、木村病、レフラー心内膜炎、結節性多発性動脈炎、全身性エリテマトーデス、鼻ポリープ症、はん種性好酸球性膠原病、ウェゲナー肉芽腫症、好酸球性肺浸潤症候群などがあげられる。
気管支喘息やアトピー性皮膚炎、慢性副鼻腔炎などの炎症性疾患では、好酸球をはじめとする炎症性細胞がサイトカインやケモカインなどによって増殖、分化、集積し、これらの炎症性細胞が産生する生体機能分子を介して組織傷害やアレルギー反応が誘発される。また、好酸球性肉芽腫や好酸球性胃腸炎、好酸球性肺炎などの好酸球性疾患では、多数の好酸球が局所に浸潤し、組織に傷害を与える。好酸球の機能を抑制する治療薬としては、好酸球の分化、増殖、集積に関与するサイトカインまたはケモカイン等に対する阻害物質があげられる。しかしながら、これらの薬剤は、炎症局所に浸潤して活性化したサイトカイン非依存性の好酸球に対しては作用しない可能性が高い。本発明の抗体組成物は、ＩＬ−５Ｒα鎖に特異的に結合し、ＩＬ−５Ｒα鎖を発現する好酸球に対して高い細胞傷害活性を示しているため、好酸球を特異的に阻害し、かつ活性化好酸球に対して細胞死を誘導することができるので、治療薬として有用である。
また、本発明の抗体組成物は高い細胞傷害活性を有しているため、従来の抗体組成物では治癒することができない、上述の炎症性疾患や好酸球増多を伴う疾患の患者の治療を可能にすることができる。
特に、上述の疾患の中でも、気管支喘息、慢性副鼻腔炎、鼻ポリープ症、好酸球性肉芽腫などの疾患は、好酸球の浸潤部位に薬物が届きにくいため、少量の薬物でも治療効果を有することが好ましい。本発明の抗体組成物は、少量でも高い細胞傷害活性を有するため、気管支喘息、慢性副鼻腔炎、鼻ポリープ症、好酸球性肉芽腫などの疾患を治療することができる。
本発明の抗体組成物を含有する医薬は、治療薬として単独で投与することも可能ではあるが、通常は薬理学的に許容される一つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として提供するのが望ましい。
投与経路は、治療に際して最も効果的なものを使用するのが望ましく、経口投与、または口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内および静脈内等の非経口投与をあげることができ、抗体製剤の場合、望ましくは静脈内投与をあげることができる。
投与形態としては、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏、テープ剤等があげられる。
経口投与に適当な製剤としては、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等があげられる。
乳剤およびシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトール、果糖等の糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール等のグリコール類、ごま油、オリーブ油、大豆油等の油類、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類等の防腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミント等のフレーバー類等を添加剤として用いて製造できる。
カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等は、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニトール等の賦形剤、デンプン、アルギン酸ナトリウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルク等の滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン等の結合剤、脂肪酸エステル等の界面活性剤、グリセリン等の可塑剤等を添加剤として用いて製造できる。
非経口投与に適当な製剤としては、注射剤、座剤、噴霧剤等があげられる。
注射剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液、あるいは両者の混合物からなる担体等を用いて調製される。または、抗体組成物を常法に従って凍結乾燥し、これに塩化ナトリウムを加えることによって粉末注射剤を調製することもできる。
座剤はカカオ脂、水素化脂肪またはカルボン酸等の担体を用いて調製される。
また、噴霧剤は該抗体組成物そのもの、ないしは受容者の口腔および気道粘膜を刺激せず、かつ該抗体組成物を微細な粒子として分散させ吸収を容易にさせる担体等を用いて調製される。
担体として具体的には乳糖、グリセリン等が例示される。該抗体組成物および用いる担体の性質により、エアロゾル、ドライパウダー等の製剤が可能である。また、これらの非経口剤においても経口剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。
投与量または投与回数は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、体重等により異なるが、有効成分の量として、通常成人１日当たり１０μｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇである。
また、抗体組成物の各種腫瘍細胞に対する抗腫瘍効果を検討する方法は、インビトロ実験としては、ＣＤＣ活性測定法、ＡＤＣＣ活性測定法等があげられ、インビボ実験としては、マウス等の実験動物での腫瘍系を用いた抗腫瘍実験等があげられる。
ＣＤＣ活性、ＡＤＣＣ活性、抗腫瘍実験は、文献［キャンサー・イムノロジー・イムノセラピー（ＣａｎＣｅｒＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙＩｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ），３６，３７３（１９９３）；キャンサー・リサーチ（ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ），５４，１５１１（１９９４）］等記載の方法に従って行うことができる。
以下に、実施例により本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

第１図は、プラスミドｐＫＯＦＵＴ８Ｎｅｏの構築を示した図である。
第２図は、ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞のＦＵＴ８対立遺伝子を１コピー破壊したヘミノックアウトクローンのゲノムサザンの解析結果を示した図である。レーンは左からそれぞれ分子量マーカー、ヘミノックアウトクローン５０−１０−１０４および親株であるＣＨＯ／ＤＧ４４細胞のゲノムサザンである。
第３図は、ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞のＦＵＴ８両対立遺伝子を破壊したダブルノックアウトクローンＷＫ７０４のゲノ厶サザン解析結果を示した図である。矢印は、相同組換えが起こった際に検出される陽性断片の検出位置を示す。
第４図は、ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞のＦＵＴ８両対立遺伝子を破壊したダブルノックアウトクローンより薬剤耐性遺伝子を除去したクローンのゲノムサザン解析結果を示した図である。レーンは左からそれぞれ分子量マーカー、ダブルノックアウトクローンの薬剤耐性遺伝子除去クローン４−５−Ｃ３、ダブルノックアウトクローンＷＫ７０４、ヘミノックアウトクローン５０−１０−１０４および親株であるＣＨＯ／ＤＧ４４細胞のゲノムサザンである。
第５図は、精製したＭｓ７０５／ＩＬ−５Ｒ抗体およびＤＧ４４／ＩＬ−５Ｒ抗体のＩＬ−５Ｒ−Ｆｃ融合蛋白質に対するＥＬＩＳＡ法における反応性を、抗体濃度を変化させて測定した図である。横軸に抗体濃度を、縦軸に各抗体濃度における吸光度を示す。□がＤＧ４４／ＩＬ−５Ｒ抗体、■がＭｓ７０５／ＩＬ−５Ｒ抗体をそれぞれ示す。
第６図は、精製したＭｓ７０５／ＩＬ−５Ｒ抗体およびＤＧ４４／ＩＬ−５Ｒ抗体のＣＴＬＬ−２（ｈ５Ｒ）細胞に対するＡＤＣＣ活性を、抗体濃度を変化させて測定した図である。横軸に抗体濃度を、縦軸に各抗体濃度における細胞傷害活性を示す。●がＤＧ４４／ＩＬ−５Ｒ抗体、○がＭｓ７０５／ＩＬ−５Ｒ抗体をそれぞれ示す。
第７図は、ヒトＩＬ−５受容体α鎖発現ベクターを導入した形質転換株ＢａＦ／ｈ５Ｒ細胞のヒトＩＬ−５Ｒ受容体の発現を、フローサイトメーターで測定した図である。グラフ縦軸に細胞数、横軸に検出抗体として用いたＦＩＴＣ標識ウサギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ｆ（ａｂ’）_２抗体のＦＩＴＣ蛍光強度をそれぞれ示す。各ヒストグラムは左から、ＢａＦ／ｈ５Ｒ細胞の自家蛍光、正常ヒトＩｇＧ１抗体で染色したＢａＦ／ｈ５Ｒ細胞の蛍光強度、Ｍｓ７０５／ＩＬ−５Ｒ抗体で染色したＢａＦ／ｈ５Ｒ細胞の蛍光強度をそれぞれ示す。
第８図は、精製した２種類の抗ＩＬ−５受容体α鎖ヒト型ＣＤＲ移植抗体の、ＢａＦ／ｈ５Ｒ細胞に対するｉｎＶｉｔｒｏＡＤＣＣ活性を示した図である。グラフ縦軸に細胞傷害活性、横軸に抗体濃度をそれぞれ示す。○はＭｓ７０５／ＩＬ−５Ｒ抗体、●はＤＧ４４／ＩＬ−５Ｒ抗体の活性をそれぞれ示す。
第９図は、３．７ｎｇ／ｍＬのＭｓ７０５／ＩＬ−５Ｒ抗体に、０〜３００ｎｇ／ｍＬのＤＧ４４／ＩＬ−５Ｒ抗体もしくはＭｓ７０５／ＩＬ−５Ｒ抗体を添加して調製した抗ＩＬ−５受容体α鎖ヒト型ＣＤＲ移植抗体組成物の、ＢａＦ／ｈ５Ｒ細胞に対するｉｎｖｉｔｒｏＡＤＣＣ活性を示した図である。グラフ縦軸に細胞傷害活性、横軸に添加した抗体濃度をそれぞれ示す。●は３．７ｎｇ／ｍＬのＭｓ７０５／ＩＬ−５Ｒ抗体にＤＧ４４／ＩＬ−５Ｒ抗体を添加して調製した抗体組成物、○は３．７ｎｇ／ｍＬのＭｓ７０５／ＩＬ−５ＲにＭｓ７０５／ＩＬ−５Ｒ抗体を添加して調製した抗体組成物の活性をそれぞれ示す。図中の※は、３．７ｎｇ／ｍＬのＭｓ７０５／ＩＬ−５Ｒ抗体にＤＧ４４／ＩＬ−５Ｒ抗体を添加して調製した抗体組成物のうち、フコース非結合型糖鎖を有する抗体の割合が２０％以上の抗体組成物を示す。
第１０図は、Ｍｓ７０５／ＩＬ−５Ｒ抗体のみからなる抗体組成物と、Ｍｓ７０５／ＩＬ−５Ｒ抗体に９倍量のＤＧ４４／ＩＬ−５Ｒ抗体を混合した抗体組成物の、ＢａＦ／ｈ５Ｒ細胞に対するｉｎｖｉｔｒｏＡＤＣＣ活性を示した図である。グラフ縦軸に細胞傷害活性を示す。グラフ横軸に示した数値は、上段から▲１▼Ｍｓ７０５／ＩＬ−５Ｒ抗体の濃度（ｎｇ／ｍＬ）、▲２▼添加したＤＧ４４／ＩＬ−５Ｒ抗体の濃度（ｎｇ／ｍＬ）、▲３▼総抗体濃度（ｎｇ／ｍＬ）をそれぞれ示す。□はＭｓ７０５／ＩＬ−５Ｒ抗体のみからなる抗体組成物、■はＭｓ７０５／ＩＬ−５Ｒ抗体に９倍量のＤＧ４４／ＩＬ−５Ｒ抗体を混合した抗体組成物の活性を示す。

実施例１ゲノム上のα１，６−フコシルトランスフェラーゼ（以下、ＦＵＴ８と表記する）両対立遺伝子を破壊したＣＨＯ／ＤＧ４４細胞の造成
ＦＵＴ８両対立遺伝子の翻訳開始コドンを含むゲノム領域を欠失させたＣＨＯ／ＤＧ４４細胞株を以下の手順で造成した。
１．チャイニーズハムスターＦＵＴ８遺伝子のエクソン２を含むターゲティングベクターｐＫＯＦＵＴ８Ｎｅｏの構築
ＷＯ０２／３１１４０の実施例１３の１項に記載の方法で構築されたチャイニーズハムスターＦＵＴ８遺伝子のエクソン２を含むターゲティングベクターｐＫＯＦＵＴ８ＰｕｒｏおよびｐＫＯＳｅｌｅｃｔＮｅｏ（Ｌｅｘｉｃｏｎ社製）を用いて、以下のようにしてｐＫＯＦＵＴ８Ｎｅｏを構築した。
ｐＫＯＳｅｌｅｃｔＮｅｏ（ＬｅＸｉｃｏｎ社製）を制限酵素ＡｓｃＩ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ社製）で消化後、アガロースゲル電気泳動に供し、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＳｐｉｎＫｉｔ（ＢＩＯ１０１社製）を用いてネオマイシン耐性遺伝子発現ユニットを含む約１．６ＫｂのＡｓｃＩ断片を回収した。
次に、ｐＫＯＦＵＴ８Ｐｕｒｏを制限酵素ＡｓｃＩ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ社製）で消化後、大腸菌Ｃ１５株由来ＡｌｋａｌｉｎｅＰｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（宝酒造社製）により、ＤＮＡ断片の末端を脱リン酸化させた。反応後、フェノール／クロロホルム抽出処理およびエタノール沈殿法を用いて、ＤＮＡ断片を精製した。
上記で得たｐＫＯＳｅｌｅｃｔＮｅｏ由来のＡｓｃＩ断片（約１．６Ｋｂ）０．１μｇとｐＫＯＦＵＴ８Ｐｕｒｏ由来のＡｓｃＩ断片（約１０．１Ｋｂ）０，１μｇに滅菌水を加えて５μＬとし、ＬｉｇａｔｉｏｎＨｉｇｈ（東洋紡社製）５μＬを加えて１６℃で３０分間反応させることにより、連結反応を行った。該反応液を用いて大腸菌ＤＨ５α株を形質転換し、得られたアンピシリン耐性クローンより各々プラスミドＤＮＡを調製し、ＢｉｇＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＲｅａｄｙＲｅａｃｔｉｏｎＫｉｔｖ２．０（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて添付の説明書に従って反応後、同社のＤＮＡシーケンサＡＢＩＰＲＩＳＭ３７７により塩基配列を解析した。このようにして第１図に示したｐＫＯＦＵＴ８Ｎｅｏを得た。ｐＫＯＦＵＴ８ＮｅｏはＣＨＯ細胞のＦＵＴ８遺伝子ヘミノックアウト細胞株を作製するためのターゲティングベクターとして用いた。
２．ゲノム上のＦＵＴ８遺伝子の１コピーを破壊したヘミノックアウト細胞株の作製
（１）ターゲティングベクターｐＫＯＦＵＴ８Ｎｅｏ導入株の取得
ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（ｄｈｆｒ）を欠損したチャイニーズハムスター卵巣由来ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞［ＳｏｍａｔｉｃＣｅｌｌａｎｄＭｏｌｅｃｕｌｅｒＧｅｎｅｔｉｃｓ，１２，５５５，１９８６］に、実施例１の１項で構築したチャイニーズハムスターＦＵＴ８ゲノム領域ターゲティングベクターｐＫＯＦＵＴ８Ｎｅｏを以下のようにして導入した。
ｐＫＯＦＵＴ８Ｎｅｏを制限酵素ＳａｌＩ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ社製）で消化して線状化し、線状化した４μｇのｐＫＯＦＵＴ８Ｎｅｏを１．６×１０^６個のＣＨＯ／ＤＧ４４細胞ヘエレクトロポレーション法［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］により導入した後、ＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）−ＨＴ（１）［透析ＦＢＳ（インビトロジェン社製）を１０％、ＨＴｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（インビトロジェン社製）を１倍濃度で含むＩＭＤＭ培地（インビトロジェン社製）］に懸濁し、接着細胞培養用１０ｃｍデッシュ（Ｆａｌｃｏｎ社製）へ播種した。５％ＣＯ_２インキュベーター内で３７℃、２４時間培養後、Ｇ４１８（ナカライテスク社製）を６００μｇ／ｍＬの濃度で含むＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）［透析ＦＢＳを１０％で含むＩＭＤＭ培地］１１０ｍＬに培地交換した。この培地交換作業を３〜４日毎に繰り返しながら５％ＣＯ_２インキュベーター内で３７℃、１５日間の培養を行い、Ｇ４１８耐性クローンを取得した。
（２）ゲノムＰＣＲによる相同組換えの診断
本項（１）で取得したＧ４１８耐性クローンの相同組換えの診断を、ゲノムＤＮＡを用いたＰＣＲにより、以下のように行った。
９６穴プレート上のＧ４１８耐性クローンに対してトリプシン処理を行った後、２倍容量の凍結培地［２０％ＤＭＳＯ、４０％ウシ胎児血清、４０％ＩＭＤＭ］を各ウェルに添加、懸濁した。各ウェル中の細胞懸濁液の半量を接着細胞用平底９６穴プレート（旭テクノグラス社製）へ播種してレプリカプレートとする一方、残りの半量をマスタープレートとして凍結保存した。
レプリカプレート上のネオマイシン耐性クローンは、Ｇ４１８を６００μｇ／ｍＬの濃度で含むＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）で５％ＣＯ_２インキュベーター内で３７℃、１週間培養した後、細胞を回収し、回収した細胞から公知の方法［アナリティカル・バイオケミストリー（ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），２０１，３３１（１９９２）］に従って各クローンのゲノ厶ＤＮＡを調製し、各々３０μＬのＴＥ−ＲＮａｓｅ緩衝液（ｐＨ８．０）［１０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ、２００μｇ／ｍＬＲＮａｓｅＡ］に一晩溶解した。
ゲノムＰＣＲに用いるプライマーは以下のように設計した。まず、ＷＯ０３／３１１４０の実施例１２に記載の方法により取得したＦＵＴ８ゲノム領域の配列（配列番号１３）の中から、配列番号４６または配列番号４７でそれぞれ示されるプライマーをフォワードプライマーとした。また、ターゲティングベクターのｌｏｘＰ配列に特異的に結合するプライマー（配列番号４８または配列番号４９）をリバースプライマーとし、以下のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に用いた。
上記で調製したゲノムＤＮＡ溶液を各々１０μＬ含む２５μＬの反応液［ＤＮＡポリメラーゼＥＸＴａｑ（宝酒造社製）、ＥＸＴａｑｂｕｆｆｅｒ（宝酒造社製）、０．２ｍｍｏｌ／ＬｄＮＴＰｓ、０．５μｍｏｌ／Ｌ上記プライマー（フォワードプライマーとリバースプライマーを組み合わせて使用する）］を調製し、９４℃で３分間の加熱の後、９４℃で１分間、６０℃で１分間、７２℃で２分間からなる反応を１サイクルとした条件でＰＣＲを行った。
ＰＣＲ後、該反応液を０．８％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動に供し、相同組換えによって生じる約１．７Ｋｂの特異的増幅産物が認められた株を陽性クローンと判定した。
（３）ゲノムサザンブロットによる相同組換えの診断
本項（２）で取得された陽性クローンの相同組換えの診断を、ゲノムＤＮＡを用いたサザンブロットにより、以下のように行った。
本項（２）で凍結保存したマスタープレートのうち、本項（２）で見出された陽性クローンを含む９６穴プレートを選択し、５％ＣＯ_２インキュベーター内で３７℃、１１０分間静置した後、陽性クローンに該当するウェル中の細胞を接着細胞用平底２４穴プレート（グライナー社製）へ播種した。Ｇ４１８を６００μｇ／ｍＬの濃度で含むＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）を用いて５％ＣＯ_２インキュベーター内で３７℃，１週間培養した後、接着細胞用平底６穴プレート（グライナー社製）へ播種した。該プレートを５％ＣＯ_２インキュベーター内で３７℃にて培養し、細胞を回収した。回収した細胞より公知の方法［ヌクレイック・アシッド・リサーチ（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ），３，２３０３，（１９７６）］に従って各クローンのゲノムＤＮＡを調製し、各々１５０μＬのＴＥ−ＲＮａｓｅ緩衝液（ｐＨ８．０）に一晩溶解した。
上記で調製したゲノムＤＮＡ１２μｇを制限酵素ＢａｍＨＩ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ社製）で消化し、エタノール沈殿法を用いてＤＮＡ断片を回収した後、２０μＬのＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）［１０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ］に溶解し、０．６％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動に供した。泳動後、公知の方法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），７６，３６８３，（１９７９）］に従って、ナイロン膜へゲノムＤＮＡを転写した。転写終了後、ナイロン膜に対し８０℃で２時間の熱処理を行い、固定化した。
一方、サザンブロットに用いるプローブを以下のように調製した。ＷＯ０３／３１１４０の実施例１２に記載の方法により取得したＦＵＴ８ゲノム領域の配列（配列番号１３）の中から、配列番号５０および配列番号５１でそれぞれ示されるプライマーを作製し、以下のＰＣＲに用いた。ＷＯ０２／３１１４０の実施例１２に記載のｐＦＵＴ８ｆｇＥ２−２４．０ｎｇをテンプレートとして含む２０μＬの反応液［ＤＮＡポリメラーゼＥｘＴａｑ（宝酒造社製）、ＥｘＴａｑｂｕｆｆｅｒ（宝酒造社製）、０．２ｍｍｏｌ／ＬｄＮＴＰｓ、０．５μｍｏｌ／Ｌ上記プライマー］を調製し、９４℃で１分間の加熱の後、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７４℃で１分間からなる反応を１サイクルとした２５サイクルの条件でＰＣＲを行った。
ＰＣＲ後、該反応液を１．７５％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動に供し、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＳｐｉｎＫｉｔ（ＢＩＯ１０１社製）を用いて約２３０ｂｐのプローブＤＮＡ断片を回収した。得られたプローブＤＮＡ溶液のうち５μＬを、［α−^３２Ｐ］ｄＣＴＰ１．７５ＭＢｑおよびＭｅｇａｐｒｉｍｅＤＮＡＬａｂｅｌｌｉｎｇｓｙｓｔｅｍ，ｄＣＴＰ（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ社製）を用いて放射線標識した。
ハイブリダイゼーションは以下のように行った。まず、上記のゲノムＤＮＡ消化物が転写されたナイロン膜をローラーポトルへ封入し、１５ｍＬのハイブリダイゼーション液［５×ＳＳＰＥ、５０×Ｄｅｎｈａｌｄｔ’ｓ液、０．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、１００μｇ／ｍＬサケ精子ＤＮＡ］を加えて６５℃で３時間のプレハイブリダイゼーションを行った後、^３２Ｐ標識したプローブＤＮＡを熱変性してボトルへ投入し、６５℃で一晩ハイブリダイゼーションを行った。
ハイブリダイゼーション後、ナイロン膜を５０ｍＬの一次洗浄液［２×ＳＳＣ−０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ］に浸漬し、６５℃で１５分間加温して洗浄した。上記の洗浄操作を２回繰り返した後、ナイロン膜を５０ｍＬの二次洗浄液［０．２×ＳＳＣ−０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ］に浸漬し、６５℃で１５分間加温して洗浄した。洗浄後、ナイロン膜をＸ線フィルムへ−８０℃で暴露し現像した。
第２図には、親株であるＣＨＯ／ＤＧ４４細胞、および本項（２）で取得した陽性クローンである５０−１０−１０４株のゲノムＤＮＡを本法により解析した結果を示した。ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞では、野生型ＦＵＴ８対立遺伝子由来の約２５．５Ｋｂの断片のみが検出された。一方、陽性クローン５０−１０−１０４株では、野生型ＦＵＴ８対立遺伝子由来の約２５．５Ｋｂの断片に加え、相同組換えされた対立遺伝子に特異的な約２０．０Ｋｂの断片が検出された。両断片の量比は１：１であったことから、５０−１０−１０４株は、ＦＵＴ８対立遺伝子のうち１コピーが破壊されたヘミノックアウトクローンであることが確認された。
３．ゲノム上のＦＵＴ８遺伝子をダブルノックアウトしたＣＨＯ／ＤＧ４４細胞の作製
（１）ターゲティングベクターｐＫＯＦＵＴ８Ｐｕｒｏ導入株の作製
本実施例の２項で得たＦＵＴ８遺伝子ヘミノックアウトクローンのもう一方のＦＵＴ８対立遺伝子を破壊するために、ＷＯ０２／３１１４０の実施例１３の１項に記載のチャイニーズハムスターＦＵＴ８遺伝子エクソン２ターゲティングベクターであるｐＫＯＦＵＴ８Ｐｕｒｏを以下のようにして導入した。
ｐＫＯＦＵＴ８Ｐｕｒｏを制限酵素ＳａｌＩ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ社製）で消化して線状化し、線状化した４μｇのｐＫＯＦＵＴ８Ｐｕｒｏを１．６×１０^６個のＦＵＴ８遺伝子ヘミノックアウトクローンヘエレクトロポレーション法［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］により導入後、ＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）−ＨＴ（１）に懸濁し、接着細胞培養用１０ｃｍデッシュ（Ｆａｌｃｏｎ社製）へ播種した。５％ＣＯ_２インキュベーター内で３７℃、２４時間培養後、ピューロマイシン（ＳＩＧＭＡ社製）を１５μｇ／ｍＬの濃度で含むＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）−ＨＴ（１）１０ｍＬに培地交換した。この培地交換作業を７日間毎に繰り返しながら５％ＣＯ_２インキュベーター内で３７℃、１５日間の培養を行い、ピューロマイシン耐性クローンを取得した。
（２）ゲノムサザンブロットによる相同組換えの診断
本項（１）で取得された薬剤耐性クローンの相同組換えの診断を、ゲノムＤＮＡを用いたサザンブロットにより以下のように行った。
ピューロマイシン耐性クローンを、公知の方法［ＧｅｎｅＴａｒｇｅｔｉｎｇ，ＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ，（１９９３）］に従って接着細胞用平底プレート（旭テクノグラス社製）へ採取し、ピューロマイシン（ＳＩＧＭＡ社製）を１５μｇ／ｍＬの濃度で含むＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）−ＨＴ（１）を用いて５％ＣＯ_２インキュベーター内で３７℃、１週間培養した。
培養後、上記プレートの各クローンに対しトリプシン処理を行い、接着細胞用平底２４穴プレート（グライナー社製）へ播種した。ピューロマイシン（ＳＩＧＭＡ社製）を１５μｇ／ｍＬの濃度で含むＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）−ＨＴ（１）を用いて５％ＣＯ_２インキュベーター内で３７℃、１週間培養した後、同様にトリプシン処理を行い、接着細胞用平底６穴プレート（グライナー社製）へ播種した。該プレートを５％ＣＯ_２インキュベーター内で３７℃にて培養し、回収した細胞より公知の方法［ヌクレイック・アシッド・リサーチ（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ），３，２３０３，（１９７６）］に従って各クローンのゲノムＤＮＡを調製し、各々１５０μＬのＴＥ−ＲＮａｓｅ緩衝液（ｐＨ８．０）に一晩溶解した。
上記で調製したゲノムＤＮＡ１２μｇを制限酵素ＢａｍＨＩ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ社製）で消化し、エタノール沈殿法を用いてＤＮＡ断片を回収した後、２０μＬのＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解し、０．６％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動に供した。泳動後、公知の方法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），７６，３６８３，（１９７９）］に従って、ナイロン膜へゲノムＤＮＡを転写した。転写後、ナイロン膜に対し８０℃で２時間の熱処理を行い、固定化した。
一方、サザンブロットに用いるプローブを以下のように調製した。まず、ターゲティングベクターに含まれるＦＵＴ８ゲノ厶領域よりもさらに５’側の配列に特異的に結合するプライマー（配列番号５２および配列番号５３）を作製し、以下のＰＣＲに用いた。ＷＯ０２／３１１４０の実施例１２に記載のプラスミドｐＦＵＴ８ｆｇＥ２−２４．０ｎｇをテンプレートとして含む２０μＬの反応液［ＤＮＡポリメラーゼＥＸＴａｑ（宝酒造社製）、ＥＸＴａｑｂｕｆｆｅｒ（宝酒造社製）、０．２ｍｍｏｌ／ＬｄＮＴＰｓ、０．５μｍｏｌ／Ｌ上記プライマー］を調製し、９４℃で１分間の加熱の後、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７４℃で１分間からなる反応を１サイクルとした２５サイクルの条件でＰＣＲを行った。
ＰＣＫ後、該反応液を１．７５％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動に供し、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＳｐｉｎＫｉｔ（ＢＩＯ１０１社製）を用いて約２３０ｂｐのプローブＤＮＡ断片を精製した。得られたプローブＤＮＡ溶液のうち５μＬを、［α−^３２Ｐ］ｄＣＴＰ１．７５ＭＢｑおよびＭｅｇａｐｒｉｍｅＤＮＡＬａｂｅｌｌｉｎｇｓｙｓｔｅｍ，ｄＣＴＰ（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ社製）を用いて放射線標識した。
ハイブリダイゼーションは以下のように行った。まず、上記のゲノムＤＮＡ消化物が転写されたナイロン膜をローラーボトルへ封入し、１５ｍＬのハイブリダイゼーション液［５×ＳＳＰＥ、５０×Ｄｅｎｈａｌｄｔ’ｓ液、０．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、１００μｇ／ｍＬサケ精子ＤＮＡ］を加えて６５℃で３時間のプレハイブリダイゼーションを行った後、^３２Ｐ標識したプローブＤＮＡを熱変性してボトルヘ投入し、６５℃で一晩ハイブリダイゼーションを行った。
ハイブリダイゼーション後、ナイロン膜を５０ｍＬの一次洗浄液［２×ＳＳＣ−０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ］に浸漬し、６５℃で１５分間加温して洗浄した。上記の洗浄操作を２回繰り返した後、ナイロン膜を５０ｍＬの二次洗浄液［０．２×ＳＳＣ−０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ］に浸漬し、６５℃で１５分間加温して洗浄した。洗浄後、ナイロン膜をＸ線フィルムヘ−８０℃で暴露し現像した。
第３図には、５０−１０−１０４株から本項（１）に記載の方法により取得したピューロマイシン耐性クローンの１つであるＷＫ７０４株のゲノムＤＮＡを本法により解析した結果を示した。ＷＫ７０４株では、野生型ＦＵＴ８対立遺伝子由来の約２５．５Ｋｂの断片が消失し、相同組換えされた対立遺伝子に特異的な約２０．０Ｋｂの断片（図中に矢印で示す）のみが検出された。この結果からＷＫ７０４株は、ＦＵＴ８両対立遺伝子が破壊されたクローンであることが確認された。
４．ＦＵＴ８遺伝子をダブルノックアウトした細胞からの薬剤耐性遺伝子の除去
（１）Ｃｒｅリコンビナーゼ発現ベクターの導入
本実施例の３項で取得したＦＵＴ８遺伝子ダブルノックアウトクローンの薬剤耐性遺伝子を除去することを目的として、Ｃｒｅリコンビナーゼ発現ベクターｐＢＳ１８５（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を以下のようにして導入した。
４μｇのｐＢＳ１８５を１．６×１０^６個のＦＵＴ８遺伝子ダブルノックアウトクローンヘエレクトロポレーション法［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］により導入後、ＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）−ＨＴ（１）１０ｍＬに懸濁し、さらに同培地を用いて２万倍に希釈した。該希釈液を接着細胞培養用１０ｃｍディッシュ（Ｆａｌｃｏｎ社製）７枚へ播種後、５％ＣＯ_２インキュベーター内で３７℃、１０日間の培養を行い、コロニーを形成させた。
（２）Ｃｒｅリコンビナーゼ発現ベクター導入株の取得
本項（１）で取得したコロニーのうち、任意のクローンを公知の方法［ＧｅｎｅＴａｒｇｅｔｉｎｇ，ＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ，（１９９３）］に従って接着細胞用平底プレート（旭テクノグラス社製）へ採取し、ＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）−ＨＴ（１）を用いて５％ＣＯ_２インキュベーター内で３７℃、１週間培養した。
培養後、上記プレートの各クローンに対してトリプシン処理を行い、２倍容量の凍結培地［２０％ＤＭＳＯ、４０％ウシ胎児血清、４０％ＩＭＤＭ］を各ウェルに添加、懸濁した。各ウェル中の細胞顕濁液の半量を接着細胞用平底９６穴プレート（旭テクノガラス社製）へ播種してレプリカプレートとする一方、残りの半量をマスタープレートとして凍結保存した。
次にレプリカプレート上の細胞を、Ｇ４１８を６００μｇ／ｍＬ、ピューロマイシンを１５μｇ／ｍＬの濃度で含むＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）−ＨＴ（１）を用いて５％ＣＯ_２インキュベーター内で３７℃、一週間培養した。Ｃｒｅリコンビナーゼの発現によりｌｏｘＰ配列に挟まれた薬剤耐性遺伝子が除去された陽性クローンは、Ｇ４１８およびピューロマイシン存在下で死滅する。本法により陽性クローンを選択した。
（３）ゲノムサザンブロットによる薬剤耐性遺伝子除去の診断
本項（２）で選択した陽性クローンに対し、以下の手順でゲノムサザンブロットによる薬剤耐性遺伝子除去の診断を行った。
本項（２）で凍結保存したマスタープレートのうち、上記陽性クローンを含む９６穴プレートを選択し、５％ＣＯ_２インキュベーター内で３７℃、１０分間静置した。静置後、上記クローンに該当するウェルから細胞を接着細胞用平底２４穴プレート（グライナー社製）へ播種した。ＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）−ＨＴ（１）を用いて１週間培養した後、トリプシン処理を行い、接着細胞用平底６穴プレート（グライナー社製）へ播種して５％ＣＯ_２インキュベーター内で３７℃で培養し、増殖した細胞を回収した。回収した細胞より公知の方法［ヌクレイック・アシッド・リサーチ（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ），３，２３０３，（１９７６）］に従って各クローンのゲノムＤＮＡを調製し、各々１５０μＬのＴＥ−ＲＮａｓｅ緩衝液（ｐＨ８．０）に一晩溶解した。
上記で調製したゲノムＤＮＡ１２μｇを制限酵素ＮｈｅＩ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ社製）で消化し、エタノール沈殿法を用いてＤＮＡ断片を回収した後、２０μＬのＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解し、０．６％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動に供した。泳動後、公知の方法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），７６，３６８３，（１９７９）］に従って、ナイロン膜へゲノムＤＮＡを転写した。転写終了後、ナイロン膜に対し８０℃で２時間の熱処理を行い、固定化した。
一方、サザンブロットに用いるプローブを以下のように調製した。ターゲティングベクターに含まれるＦＵＴ８ゲノ厶領域よりもさらに５’側の配列に特異的に結合するプライマー（配列番号５２および配列番号５３）を用いて、以下のＰＣＲを行った。ＷＯ０２／３１１４０の実施例１２に記載のｐＦＵＴ８ｆｇＥ２−２４．０ｎｇをテンプレートとして含む２０μＬの反応液［ＤＮＡポリメラーゼＥｘＴａｑ（宝酒造社製）、ＥＸＴａｑｂｕｆｆｅｒ（宝酒造社製）、０．２ｍｍｏｌ／ＬｄＮＴＰｓ、０．５μｍｏｌ／Ｌ上記プライマー］を調製し、９４℃で１分間の加熱の後、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７４℃で１分間からなる反応を１サイクルとした２５サイクルの条件でＰＣＲを行った。
ＰＣＲ後、該反応液を１．７５％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動に供し、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＳｐｉｎＫｉｔ（ＢＩＯ１０１社製）を用いて、約２３０ｂｐのプローブＤＮＡ断片を精製した。得られたプローブＤＮＡ溶液のうち５μＬを、［α−^３２Ｐ］ｄＣＴＰ１．７５ＭＢｑおよびＭｅｇａｐｒｉｍｅＤＮＡＬａｂｅｌｌｉｎｇｓｙｓｔｅｍ，ｄＣＴＰ（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ社製）を用いて放射線標識した。
ハイブリダイゼーションは以下のように行った。まず、上記のゲノムＤＮＡ消化物が転写されたナイロン膜をローラーボトルへ封入し、ハイブリダイゼーション液［５×ＳＳＰＥ、５０×Ｄｅｎｈａｌｄｔ’ｓ液、０．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、１００μｇ／ｍＬサケ精子ＤＮＡ］１５ｍＬを加えて６５℃で３時間のプレハイブリダイゼーション後、^３２Ｐ標識したプローブＤＮＡを熱変性してボトルへ投入し、６５℃で一晩ハイブリダイゼーションを行った。
ハイブリダイゼーション後、ナイロン膜を５０ｍＬの一次洗浄液［２×ＳＳＣ−０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ］に浸漬し、６５℃で１５分間加温して洗浄した。上記の洗浄操作を２回繰り返した後、ナイロン膜を５０ｍＬの二次洗浄液［０．２×ＳＳＣ−０．１％（Ｗ／Ｖ）ＳＤＳ］に浸漬し、６５℃で１５分間加温して洗浄した。洗浄後、ナイロン膜をＸ線フィルムへ−８０℃で暴露し現像した。
第４図には、親株であるＣＨＯ／ＤＧ４４細胞、本実施例の２項に記載の５０−１０−１０４株、本実施例の３項に記載のＷＫ７０４株、およびＷＫ７０４株から本項（２）に記載の方法により取得した薬剤感受性クローンの１つである４−５−Ｃ３株のゲノムＤＮＡを、本法により解析した結果を示した。ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞では、野生型ＦＵＴ８対立遺伝子に由来する約８．０ＫｂのＤＮＡ断片のみが検出された。また、５０−１０−１０４株やＷＫ７０４株では、相同組換えが起こった対立遺伝子に由来する約９．５ＫｂのＤＮＡ断片が認められた。一方、４−５−Ｃ３株では、相同組換えが起こった対立遺伝子からさらにネオマイシン耐性遺伝子（約１．６Ｋｂ）およびピューロマイシン耐性遺伝子（約１．５Ｋｂ）が除去されて生じる約８．０ＫｂのＤＮＡ断片のみが検出された。この結果から４−５−Ｃ３株は、Ｃｒｅリコンビナーゼにより薬剤耐性遺伝子が除去されたことが確認された。
薬剤耐性遺伝子の除去されたＦＵＴ８遺伝子ダブルノックアウトクローン（以下、ＦＵＴ８遺伝子ダブルノックアウト細胞と表記する）は、４−５−Ｃ３株以外にも複数株取得された。
実施例２ＦＵＴ８遺伝子ダブルノックアウト細胞による抗ＩＬ−５Ｒα鎖ヒトＣＤＲ移植抗体組成物の発現
１．ＦＵＴ８遺伝子ダブルノックアウト細胞での安定発現
実施例１の４項に記載のＦＵＴ８遺伝子ダブルノックアウト細胞および親株であるＣＨＯ／ＤＧ４４細胞に、ＷＯ９７／１０３５４記載の抗ＩＬ−５Ｒα鎖ヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ１２５９ＨＶ３ＬＶ０を導入し、抗ＩＬ−５Ｒα鎖ヒト型ＣＤＲ移植抗体組成物の安定生産細胞を以下のようにして作製した。
ｐＫＡＮＴＥＸ１２５９ＨＶ３ＬＶ０を制限酵素ＡａｔＩＩ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ社製）で消化して直線状化した後、直線状化された１０μｇのｐＫＡＮＴＥＸ１２５９ＨＶ３ＬＶ０を１．６×１０^６個のＦＵＴ８遺伝子ダブルノックアウト細胞および親株であるＣＨＯ／ＤＧ４４細胞へエレクトロポレーション法［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］により導入後、１０ｍＬのＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）−ＨＴ（１）［透析ＦＢＳ（インビトロジェン社製）を１０％、ＨＴｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（インビトロジェン社製）を１倍濃度で含むＩＭＤＭ培地（インビトロジェン社製）］に懸濁し、７５ｃｍ^２フラスコ（グライナー社製）に播種した。５％ＣＯ_２インキュベーター内で３７℃、２４時間培養後、Ｇ４１８（ナカライテスク社製）を５００μｇ／ｍＬの濃度で含むＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）［透析ＦＢＳを１０％で含むＩＭＤＭ培地］に培地交換し、１〜２週間培養した。最終的にＧ４１８を５００μｇ／ｍＬの濃度で含むＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）培地で増殖可能かつ、抗ＩＬ−５Ｒα鎖ヒト型ＣＤＲ移植抗体を生産する形質転換株を得た。親株のＣＨＯ／ＤＧ４４細胞より得られた形質転換株をＤＧ４４／ＩＬ−５Ｒ株、ＦＵＴ８遺伝子ダブルノックアウト細胞より得られた形質転換株をＭｓ７０５／ＩＬ−５Ｒ株と名付けた。なお、取得したＭｓ７０５／ＩＬ−５Ｒ株は、平成１５年９月９日付けで独立法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地中央第６）にＦＥＲＭＢＰ−８４７１として寄託した。
２．培養上清中のヒトＩｇＧ抗体濃度の測定（ＥＬＩＳＡ法）
ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）抗体（ＡｍｅｒｉｃａｎＱｕａｌｅｘ社製）をＰｈｏｓｐｈａｔｅＢｕｆｆｅｒｅｄＳａｌｉｎｅ（以下、ＰＢＳと表記する）（インビトロジェン社製）で希釈して１μｇ／ｍＬとし、９６穴のＥＬＩＳＡ用プレート（グライナー社製）に、５０μＬ／ウェルで分注し、４℃で一晩放置して吸着させた。ＰＢＳで洗浄後、ＢＳＡを１％の濃度で含むＰＢＳ（以下、１％ＢＳＡ−ＰＢＳと表記する）（和光純薬社製）を１００μＬ／ウェルで加え、室温で１時間反応させて残存する活性基をブロックした。１％ＢＳＡ−ＰＢＳを捨て、形質転換株の培養上清、または培養上清から精製した抗体の各種希釈溶液を５０μＬ／ウェルで加え、室温で１時間反応させた。反応後、Ｔｗｅｅｎ２０を０．０５％の濃度で含むＰＢＳ（以下、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳと表記する）（和光純薬社製）で各ウェルを洗浄後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳで２０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）抗体溶液（ＡｍｅｒｉｃａｎＱｕａｌｅｘ社製）を二次抗体溶液として、それぞれ５０μＬ／ウェルで加え、室温で１時間反応させた。反応後、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、ＡＢＴＳ基質液［２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）アンモニウム（和光純薬社製）の０．５５ｇを１Ｌの０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．２）に溶解し、使用直前に過酸化水素（和光純薬社製）を１μＬ／ｍＬで添加した溶液］を５０μＬ／ウェルで加えて発色させ、４１５ｎｍの吸光度（以下、ＯＤ４１５と表記する）を測定した。
３．抗ＩＬ−５Ｒα鎖ヒト型ＣＤＲ移植抗体組成物の精製
実施例２の１項で得られた形質転換細胞株ＤＧ４４／ＩＬ−５Ｒ株およびＭｓ７０５／ＩＬ−５Ｒ株を用いて、それぞれが生産する抗ＩＬ−５Ｒα鎖ヒト型ＣＤＲ移植抗体を以下のようにして精製した。
各々の形質転換株を、Ｇ４１８を５００μｇ／ｍＬの濃度で含むＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）に懸濁し、３０ｍＬを１８２ｃｍ^２フラスコ（グライナー社製）に播種して５％ＣＯ_２インキュベーター内で３７℃、数日間培養した。細胞密度がコンフルエントになった時点で培養上清を除去し、２５ｍＬのＰＢＳで細胞を洗浄後、ＥＸＣＥＬＬ３０１培地（ＪＲＨＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）３０ｍＬを注入した。５％ＣＯ_２インキュベーター内で３７℃、７日間培養後、細胞懸濁液を回収し、３０００ｒｐｍ、４℃の条件で５分間の遠心分離を行って上清を回収した後、０．２２μｍ孔径ＭｉｌｌｅｘＧＶフィルター（ミリポア社製）を用いて濾過滅菌した。上述の方法により取得した培養上清より、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）カラムを用いて、添付の説明書に従い、抗ＩＬ−５Ｒα鎖ヒト型ＣＤＲ移植抗体組成物を精製した。精製した抗ＩＬ−５Ｒα鎖ヒト型ＣＤＲ移植抗体組成物は、ＤＧ４４／ＩＬ−５Ｒ株より得られた抗体組成物をＤＧ４４／ＩＬ−５Ｒ抗体、Ｍｓ７０５／ＩＬ−５Ｒ株より得られた抗体組成物をＭｓ７０５／ＩＬ−５Ｒ抗体と名付けた。
実施例３ＦＵＴ８遺伝子ダブルノックアウト細胞が生産する抗ＩＬ−５Ｒα鎖ヒト型ＣＤＲ移植抗体組成物の生物活性
１．抗ＩＬ−５Ｒα鎖ヒト型ＣＤＲ移植抗体のヒトＩＬ−５Ｒに対する結合活性（ＥＬＩＳＡ法）
ＷＯ９７／１０３５４の実施例１の１項に記載の方法により作製したｈＩＬ−５Ｒα−Ｆｃ融合蛋白質を用いて、実施例２の３項で精製したＤＧ４４／ＩＬ−５Ｒ抗体およびＭｓ７０５／ＩＬ−５Ｒ抗体のヒトＩＬ−５Ｒに対する結合活性を、以下のようにして測定した。
ｈＩＬ−５Ｒα−Ｆｃ融合蛋白をＰＢＳで希釈して５μｇ／ｍＬとし、９６穴のＥＬＩＳＡ用プレート（グライナー社製）に５０μＬ／ウェルで分注し、４℃で一晩放置して吸着させた。ＰＢＳで洗浄後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳを１００μＬ／ウェルで加え、室温で１時間反応させて残存する活性基をブロックした。１％ＢＳＡ−ＰＢＳを捨て、各ウェルをＴｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、実施例２の３項で調製したＤＧ４４／ＩＬ−５Ｒ抗体またはＭｓ７０５／ＩＬ−５Ｒ抗体の各種希釈溶液を５０μＬ／ウェルで加え、室温で２時間反応させた。反応後、各ウェルをＴｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳで２０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識マウス抗ヒトＩｇＧ１（Ｆｃ）抗体（サザンバイオテクノロジー社製）を二次抗体溶液として、それぞれ５０μＬ／ウェルで加え、室温で１時間反応させた。反応後、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、ＡＢＴＳ基質液を５０μＬ／ウェルで加えて発色させ、ＯＤ４１５を測定した。
第５図には、ＤＧ４４／ＩＬ−５Ｒ抗体およびＭｓ７０５／ＩＬ−５Ｒ抗体のｈＩＬ−５Ｒα−Ｆｃ融合蛋白質に対する結合活性を示した。両抗体はｈＩＬ−５Ｒα−Ｆｃ融合蛋白質に対して同等の結合活性を有していた。
２．抗ＩＬ−５Ｒα鎖ヒト型ＣＤＲ移植抗体組成物のｉｎｖｉｔｒｏ細胞傷害活性（ＡＤＣＣ活性）
実施例２の３項で得られたＤＧ４４／ＩＬ−５Ｒ抗体およびＭｓ７０５／ＩＬ−５Ｒ抗体のｉｎｖｉｔｒｏ細胞傷害活性を以下のようにして測定した。
（１）標的細胞溶液の調製
ＣＴＬＬ−２細胞（ＡＴＣＣＴＩＢ２１４）にｈＩＬ−５Ｒα遺伝子を導入したＣＴＬＬ−２（ｈ５Ｒ）細胞［ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．），１７７，１５２３（１９９３）］を遠心分離操作及び懸濁によりＲＰＭＩ１６４０−ＦＣＳ（５）培地（５％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地（ＧＩＢＣＯＢＲＬ社製））で洗浄した後、ＲＰＭＩ１６４０−ＦＣＳ（５）培地によって、２×１０^５細胞／ｍＬに調製し、標的細胞溶液とした。
（２）エフェクター細胞溶液の調製
健常人静脈血５０ｍＬを採取し、ヘパリンナトリウム（清水製薬社製）０．５ｍＬを加え穏やかに混ぜた。これをＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（ＡＸＩＳＳＨＩＥＬＤ社製）を用いて、添付の使用説明書に従い単核球層を分離した。ＲＰＭＩ１６４０−ＦＣＳ（５）培地で３回遠心分離して洗浄後、同培地を用いて５×１０^６細胞／ｍＬの濃度で懸濁し、エフェクター細胞溶液とした。
（３）ＡＤＣＣ活性の測定
９６ウェルＵ字底プレート（Ｆａｌｃｏｎ社製）の各ウェルに上記（１）で調製した標的細胞溶液の５０μＬ（１×１０^４細胞／ウェル）を分注した。次いで（２）で調製したエフェクター細胞溶液を５０μＬ（２．５×１０^５細胞／ウェル、エフェクター細胞と標的細胞の比は２５：１となる）添加した。更に、各種抗ｈＩＬ−５Ｒヒト型ＣＤＲ移植抗体を各最終濃度０．１〜１０００ｎｇ／ｍＬとなるように加えて全量を１５０μＬとし、３７℃で４時間反応させた。反応後、プレートを遠心分離し、上清中の乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）活性を、ＣｙｔｏＴｏｘ９６Ｎｏｎ−ＲａｄｉｏａｃｔｉｖｅＣｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙＡｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて、添付の説明書にしたがって吸光度データを取得することで測定した。標的細胞自然遊離の吸光度データは、エフェクター細胞溶液および抗体溶液の代わりに培地のみを用いて、また、エフェクター細胞自然遊離の吸光度データは、標的細胞溶液および抗体溶液の代わりに培地のみを用いて、上記と同様の操作を行うことで取得した。標的細胞全遊離の吸光度データは、抗体溶赦、エフェクター細胞溶液の代わりに培地を用い、反応終了４５分前に１５μＬの９％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００溶液を添加し、上記と同様の操作を行い、上清のＬＤＨ活性を測定することにより求めた。ＡＤＣＣ活性は次式により求めた。

第６図には、ＤＧ４４／ＩＬ−５Ｒ抗体およびＭｓ７０５／ＩＬ−５Ｒ抗体のＣＴＬＬ−２（ｈ５Ｒ）細胞に対する細胞傷害活性を示した。Ｍｓ７０５／ＩＬ−５Ｒ抗体はいずれの抗体濃度においてもＤＧ４４／ＩＬ−５Ｒ抗体よりも高いＡＤＣＣ活性を示し、最高細胞傷害活性値も高い値を示した。
実施例４ＦＵＴ８遺伝子ダブルノックアウト細胞が生産する抗ＩＬ−５Ｒα鎖ヒト型ＣＤＲ移植抗体組成物の単糖組成分析
実施例１の３項で精製したＤＧ４４／ＩＬ−５Ｒα鎖抗体およびＭｓ７０５／ＩＬ−５Ｒα鎖抗体の中性糖・アミノ糖組成分析を、以下のようにして行った。
抗体を遠心濃縮機で減圧下乾固した後、２．０−４．０Ｍのトリフルオロ酢酸溶液を加えて１００℃、２−４時間酸加水分解を行い、タンパク質から中性糖・アミノ糖を遊離した。トリフルオロ酢酸溶液を遠心濃縮機で除去し、脱イオン水に再溶解してＤｉｏｎｅｘ社製糖分析装置（ＤＸ−５００）を用いて分析を行った。ＣａｒｂｏＰａｃＰＡ−１カラム、ＣａｒｂｏＰａｃＰＡ−１ガードカラム（Ｄｉｏｎｅｘ社製）を用い、溶離液として１０−２０ｍＭ水酸化ナトリウム−脱イオン水溶解液、洗浄液として５００ｍＭ水酸化ナトリウム−脱イオン水溶解液を使用して、第１表に示した溶出プログラムで分析した。

得られた溶出プロファイルの中性糖・アミノ糖成分のピーク面積から、Ｎ−アセチルグルコサミン比を４とした場合の各成分（フコース、ガラクトース、マンノース）の組成比を算出した。
第２表に各抗体の単糖組成比により計算された、全Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖に占める、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合を示した。ＤＧ４４／ＩＬ−５Ｒ抗体ではフコースが結合していない糖鎖の割合が８％であった。一方、Ｍｓ７０５／ＩＬ−５Ｒ抗体ではフコースのピークは検出限界以下であったことから、フコースが結合していない糖鎖の割合はほぼ１００％と見積もられた。
以上の結果より、Ｍｓ７０５／ＩＬ−５Ｒ抗体のＮ−グリコシド結合複合型糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンには、フコースが結合していないことが示された。

実施例５フコースが結合していない糖鎖を有する抗ＩＬ−５受容体α鎖ヒト型ＣＤＲ移植抗体組成物の生物活性の解析
本発明の抗ＩＬ−５受容体α鎖ヒト型ＣＤＲ移植抗体組成物の優位性をさらに明らかとするため、フコースが結合した糖鎖を有する抗体組成物と、フコースが結合していない糖鎖を有する抗体分子とフコースが結合する糖鎖を有する抗体分子とが混合された抗体組成物との生物活性の比較を行った。具体的には、フコースが結合していない糖鎖の割合が１００％であるＭｓ７０５／ＩＬ−５Ｒ抗体組成物に、フコースが結合した糖鎖を有する抗ＩＬ−５受容体α鎖ヒト型ＣＤＲ移植抗体を混合させた場合の細胞傷害活性の変化を調べた。抗ＩＬ−５受容体α鎖ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＡＤＣＣ活性は、以下の様にして測定した。
１．ヒトＩＬ−５受容体α鎖発現細胞の樹立
ＡＤＣＣ活性測定用の標的細胞として、ヒトＩＬ−５受容体α鎖を発現する細胞を以下の様にして作製した。
（１）ヒトＩＬ−５受容体α鎖発現ベクターの導入
高津らの報告［ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．），１７５，３４１（１９９２）、特開平０６−０５４６９０］をもとに、完全長の膜貫通型ヒトＩＬ−５受容体α鎖を発現するためのベクターを構築した。マウスＩＬ−３依存性ｐｒｏＢ細胞株Ｂａ／Ｆ３細胞１×１０^６個に上記のベクター１μｇをエレクトロポレーション法［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］により導入した後、ＦＢＳ（インビトロジェン社製）を１０％、Ｇ４１８（ナカライテスク社製）を５００μｇ／ｍＬ、ヒトＩＬ−５（Ｒ＆Ｄ社製）を２ｎｇ／ｍＬの濃度で含むＭＥＭ−α培地（インビトロジェン社製）に細胞を懸濁して５％ＣＯ_２インキュベーター内で３７℃にて培養した。最終的にＧ４１８に耐性を示す形質転換株を得たのち、９６ウェルプレート（ファルコン社製）に０．５細胞／ウェルの細胞密度で播種し、シングルセルクローニングを行った。
（２）ヒトＩＬ−５受容体の発現解析
Ｂａ／Ｆ３細胞から樹立した形質転換株をＦＡＣＳ（ＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅＡｃｔｉｖａｔｅｄＣｅｌｌＳｏｒｔｅｒ）用緩衝液（ＰＢＳ、０．０５％ＮａＮ_３）で洗浄後、正常ヒトＩｇＧ１（シグマ社製）抗体、またはＭｓ７０５／ＩＬ−５Ｒ抗体を各１μｇ添加して氷中で３０分間反応させた。ＦＡＣＳ用緩衝液で洗浄後、ＦＩＴＣ標識ウサギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ｆ（ａｂ’）_２抗体（和光純薬社製）を加えて氷中で３０分間反応させた後、ＦＡＣＳ用緩衝液で洗浄し、最終的にＦＡＣＳ用緩衝液５００μＬに懸濁してフローサイトメーター（Ｃｏｕｌｔｅｒ社ＥＰＩＣＳＸＬ−ＭＣＬ）で測定した。
第７図にＦＩＴＣヒストグラムを示す。Ｂａ／Ｆ３細胞から樹立した形質転換株にヒトＩＬ−５受容体の発現を確認し、これをＢａＦ／ｈ５Ｒ細胞と名付けた。
２．抗ＩＬ−５受容体α鎖ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＢａＦ／ｈ５Ｒ細胞に対するｉｎｖｉｔｒｏ細胞傷害活性（ＡＤＣＣ活性）
実施例２の３項で取得したＭｓ７０５／ＩＬ−５Ｒ抗体及びＤＧ４４／ＩＬ−５Ｒ抗体の、本実施例１項で樹立したＢａＦ／ｈ５Ｒ細胞に対するｉｎｖｉｔｒｏ細胞傷害活性を、以下の様にして測定した。
（１）標的細胞溶液の調製
本実施例１項で樹立したＢａＦ／ｈ５Ｒ細胞を、遠心分離と懸濁によりＲＰＭＩ１６４０−ＦＣＳ（５）培地で洗浄後、ＲＰＭＩ１６４０−ＦＣＳ（５）培地で２×１０^５細胞／ｍＬに調製し、標的細胞溶液とした。
（２）エフェクター細胞溶液の調製
健常人静脈血５０ｍＬを採取し、ヘパリンナトリウム（清水製薬社製）０．５ｍＬを加えて穏やかに混ぜた。これを、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（ＡＸＩＳＳＨＩＥＬＤ社製）を用いて使用説明書に従い単核球層を分離した。ＲＰＭＩ１６４０−ＦＣＳ（５）培地で３回遠心分離して洗浄後、同培地を用いて４×１０^６細胞／ｍＬの濃度で懸濁し、エフェクター細胞溶液とした。
（３）Ｍｓ７０５／ＩＬ−５Ｒ抗体およびＤＧ４４／ＩＬ−５Ｒ抗体のＢａＦ／ｈ５Ｒ細胞に対するＡＤＣＣ活性の測定
９６ウェルＵ字底プレート（Ｆａｌｃｏｎ社製）の各ウェルに、上記（１）で調製した標的細胞溶液を５０μＬ（１×１０^４細胞／ウェル）分注した。次いで（２）で調製したエフェクター細胞溶液を５０μＬ（２×１０^５細胞／ウェル、エフェクター細胞と標的細胞の比は２０：１となる）添加した。更に、Ｍｓ７０５／ＩＬ−５Ｒ抗体およびＤＧ４４／ＩＬ−５Ｒ抗体をそれぞれ単独で、または両者を混合して加えて全量を１５０μＬとし、３７℃で４時間反応させた。反応後、プレートを遠心分離し、上清中の乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）活性をＬＤＨ−ＣｙｔｏｔｏｘｉｃＴｅｓｔＷａｋｏ（和光純薬社製）を用いて添付の説明書に従い測定した。ＡＤＣＣ活性は実施例３の２項に記載の方法に従って算出した。
第８図に、ＤＧ４４／ＩＬ−５Ｒ抗体およびＭｓ７０５／ＩＬ−５Ｒ抗体のＢａＦ／ｈ５Ｒ細胞に対する細胞傷害活性を示した。Ｍｓ７０５／ＩＬ−５Ｒ抗体は、いずれの抗体濃度においてもＤＧ４４／ＩＬ−５Ｒ抗体よりも有意に高いＡＤＣＣ活性を示した。以上より、フコースが結合しない糖鎖を有する抗ＩＬ−５受容体α鎖ヒト型ＣＤＲ移植抗体は、フコースが結合する糖鎖を有する抗ＩＬ−５受容体α鎖ヒト型ＣＤＲ移植抗体よりも有意に高いＡＤＣＣ活性を有していた。
次に、一定量のＭｓ７０５／ＩＬ−５Ｒ抗体にＤＧ４４／ＩＬ−５Ｒ抗体を添加することで、一定量のフコースが結合しない糖鎖を有する抗体を変化させた抗ＩＬ−５受容体α鎖ヒト型ＣＤＲ移植抗体組成物を調製し、そのＡＤＣＣ活性を測定した。具体的には、３．７ｎｇ／ｍＬのＭｓ７０５／ＩＬ−５Ｒ抗体に０〜３００ｎｇ／ｍＬのＤＧ４４／ＩＬ−５Ｒ抗体を添加した抗ＩＬ−５受容体α鎖ヒト型ＣＤＲ移植抗体組成物を調製した。調製した抗体組成物のＡＤＣＣ活性を第９図に示した。
３．７ｎｇ／ｍＬのＭｓ７０５／ＩＬ−５Ｒ抗体にさらにＭｓ７０５／ＩＬ−５Ｒ抗体を添加すると、総抗体濃度の増加にともなってＡＤＣＣ活性の上昇が観察されたが、３．７ｎｇ／ｍＬのＭｓ７０５／ＩＬ−５Ｒ抗体にさらにＤＧ４４／ＩＬ−５Ｒ抗体を添加しても、総抗体濃度が増加するにも関わらず調製した抗体組成物のＡＤＣＣ活性は逆に低下した。このことは、フコースが結合する糖鎖を有する抗体分子が、フコースが結合しない糖鎖を有する抗体分子の活性を阻害することを示した。また、フコースが結合する糖鎖を有する抗体分子とフコースが結合しない糖鎖を有する抗体分子とが混合された抗体組成物においても、フコースが結合しない糖鎖を有する抗体の割合が２０％以上の抗体組成物では、該割合が２０％未満の抗体組成物に比べ顕著に高いＡＤＣＣ活性を示した。第１０図に、３ｎｇ／ｍＬのＭｓ７０５／ＩＬ−５Ｒ抗体サンプルと、３ｎｇ／ｍＬのＭｓ７０５／ＩＬ−５Ｒ抗体に９倍量の２７ｎｇ／ｍＬのＤＧ４４／ＩＬ−５Ｒ抗体を加えた抗体サンプルのＡＤＣＣ活性をグラフとして示した。Ｍｓ７０５／ＩＬ−５Ｒ抗体のＡＤＣＣ活性はＤＧ４４／ＩＬ−５Ｒ抗体を加えることで大幅に低下した。Ｍｓ７０５／ＩＬ−５Ｒ抗体とＤＧ４４／ＩＬ−５Ｒ抗体の存在比が１対９のまま抗体組成物の抗体濃度を１０００倍以上に上昇させても、３ｎｇ／ｍＬのＭｓ７０５／ＩＬ−５Ｒ抗体サンプルのＡＤＣＣ活性には及ばなかった。以上のことから、フコースが結合した糖鎖を有する抗体分子が、フコースが結合しない糖鎖を有する抗体分子のＡＤＣＣ活性を阻害していること、従来の抗体組成物では、フコースが結合していない糖鎖を有する抗体組成物と同等のＡＤＣＣ活性を発揮することはできないことが明らかとなった。
したがって、本発明の抗体組成物によって、従来の抗体組成物では治癒できなかった患者を治療することができる。

本発明によりヒトＩＬ−５Ｒα鎖に特異的に結合し、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖をＦｃ領域に有する抗体分子からなる組成物であって、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖が該糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖である抗体組成物、該抗体組成物を生産する形質転換体、該抗体組成物の製造方法および該抗体組成物を含有する医薬が提供される。

配列番号２４−人工配列の説明：抗体重鎖可変領域アミノ酸配列
配列番号２５−人工配列の説明：抗体軽鎖可変領域アミノ酸配列
配列番号２６−人工配列の説明：抗体重鎖可変領域アミノ酸配列
配列番号２７−人工配列の説明：抗体重鎖可変領域アミノ酸配列
配列番号２８−人工配列の説明：抗体重鎖可変領域アミノ酸配列
配列番号２９−人工配列の説明：抗体軽鎖可変領域アミノ酸配列
配列番号３０−人工配列の説明：抗体軽鎖可変領域アミノ酸配列
配列番号３１−人工配列の説明：抗体軽鎖可変領域アミノ酸配列
配列番号３２−人工配列の説明：抗体軽鎖可変領域アミノ酸配列
配列番号４６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号５０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号５１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号５２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号５３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ

Claims

ヒトインターロイキン５受容体（ＩＬ−５Ｒ）α鎖に特異的に結合し、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖をＦｃ領域に有する遺伝子組換え抗体分子からなる抗体組成物であって、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖が該糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖である抗体組成物。
Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖が、該糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合していない糖鎖である、請求項１記載のに記載の抗体組成物。
ヒトインターロイキン５受容体（ＩＬ−５Ｒ）α鎖の細胞外領域に特異的に結合する抗体である請求項１または２記載の抗体組成物。
細胞外領域が、配列番号４５で示されるアミノ酸配列の１〜３１３番目からなるアミノ酸配列で表される細胞外領域である請求項３に記載の抗体組成物。
ヒトＩＬ−５Ｒα鎖に特異的に結合し、インターロイキン５の生物活性を阻害する活性を有する請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体組成物。
ヒトＩＬ−５ｋα鎖発現細胞に特異的に結合する請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体組成物。
ヒトＩＬ−５Ｒα鎖発現細胞に対し細胞傷害活性を示す請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体組成物。
ヒトＩＬ−５Ｒα鎖発現細胞に対し、非ヒト動物由来ハイブリドーマが生産するモノクローナル抗体よりも高い細胞傷害活性を示す請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗体組成物。
細胞傷害活性が抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性である請求項７または８に記載の抗体組成物。
それぞれ配列番号１４、１５および１６で示されるアミノ酸配列からなる抗体分子重鎖（Ｈ鎖）可変領域（Ｖ領域）の相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗体組成物。
それぞれ配列番号１７、１８および１９で示されるアミノ酸配列からなる抗体分子軽鎖（Ｌ鎖）可変領域（Ｖ領域）の相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗体組成物。
それぞれ配列番号１４、１５および１６で示されるアミノ酸配列からなる抗体分子重鎖（Ｈ鎖）可変領域（Ｖ領域）の相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、およびそれぞれ配列番号１７、１８および１９で示されるアミノ酸配列からなる抗体軽鎖（Ｌ鎖）Ｖ領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の抗体組成物。
遺伝子組換え抗体がヒト型キメラ抗体またはヒト型ＣＤＲ移植抗体である請求項１〜１２のいずれか１項に記載の抗体組成物。
ヒト型キメラ抗体がヒトＩＬ−５Ｒα鎖に特異的に結合するモノクローナル抗体の重鎖（Ｈ鎖）可変領域（Ｖ領域）および軽鎖（Ｌ鎖）Ｖ領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、請求項１３に記載の抗体組成物。
抗体分子の重鎖（Ｈ鎖）可変領域（Ｖ領域）が、配列番号２１で示されるアミノ酸配列を含む請求項１４に記載の抗体組成物。
抗体分子の軽鎖（Ｌ鎖）可変領域（Ｖ領域）が、配列番号２３で示されるアミノ酸配列を含む請求項１４または１５に記載の抗体組成物。
抗体分子の重鎖（Ｈ鎖）可変領域（Ｖ領域）が、配列番号２１で示されるアミノ酸配列を含み、抗体分子の軽鎖（Ｌ鎖）Ｖ領域が、配列番号２３で示されるアミノ酸配列を含む請求項１４〜１６のいずれか１項に記載のヒト型キメラ抗体組成物。
ヒト型ＣＤＲ移植抗体がヒトＩＬ−５Ｒα鎖に特異的に結合するモノクローナル抗体の重鎖（Ｈ鎖）可変領域（Ｖ領域）および軽鎖（Ｌ鎖）Ｖ領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、請求項１３に記載の抗体組成物。
ヒトＩＬ−５Ｒα鎖に特異的に結合するモノクローナル抗体の重鎖（Ｈ鎖）可変領域（Ｖ領域）および軽鎖（Ｌ鎖）Ｖ領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）とヒト抗体のＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域のフレームワーク領域（ＦＲ）を含む、請求項１８に記載の抗体組成物。
ヒトＩＬ−５Ｒα鎖に特異的に結合するモノクローナル抗体の重鎖（Ｈ鎖）可変領域（Ｖ領域）および軽鎖（Ｌ鎖）Ｖ領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）とヒト抗体のＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域のフレームワーク領域（ＦＲ）、ならびにヒト抗体のＨ鎖定常領域（Ｃ領域）およびＬ鎖Ｃ領域を含む、請求項１８または１９に記載の抗体組成物。
抗体分子の重鎖（Ｈ鎖）可変領域（Ｖ領域）が、配列番号２４で示されるアミノ酸配列、または配列番号２４で示されるアミノ酸配列の４０番目のＡｌａ、４６番目のＧｌｕ、６７番目のＡｒｇ、７２番目のＡｌａ、７４番目のＴｈｒ、７９番目のＡｌａ、９５番目のＴｙｒおよび９７番目のＡｌａから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含む、請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の抗体組成物。
抗体分子の軽鎖（Ｌ鎖）可変領域（Ｖ領域）が、配列番号２５で示されるアミノ酸配列、または配列番号２５で示されるアミノ酸配列の７番目のＳｅｒ、８番目のＰｒｏ、２２番目のＴｈｒ、３７番目（７）Ｇｌｎ、３８番目のＧｌｎ、４４番目のＰｒｏ、４５番目のＬｙｓ、７１番目のＰｈｅ、７７番目のＳｅｒ、８７番目のＴｙｒおよび９８番目のＰｈｅから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含む、請求項１８〜２１のいずれか１項に記載の抗体組成物。
抗体分子の重鎖（Ｈ鎖）可変領域（Ｖ領域）が、配列番号２４で示されるアミノ酸配列、または配列番号２４で示されるアミノ酸配列の４０番目のＡｌａ、４６番目のＧｌｕ、６７番目のＡｒｇ、７２番目のＡｌａ、７４番目のＴｈｒ、７９番目のＡｌａ、９５番目のＴｙｒおよび９７番目のＡｌａから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含み、かつ、抗体分子の軽鎖（Ｌ鎖）Ｖ領域が、配列番号２５で示されるアミノ酸配列、または配列番号２５で示されるアミノ酸配列の７番目のＳｅｒ、８番目のＰｒｏ、２２番目のＴｈｒ、３７番目のＧｌｎ、３８番目のＧｌｎ、４４番目のＰｒｏ、４５番目のＬｙｓ、７１番目のＰｈｅ、７７番目のＳｅｒ、８７番目のＴｙｒおよび９８番目のＰｈｅから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を、含む、請求項１８〜２２のいずれか１項に記載の抗体組成物。
抗体分子の重鎖（Ｈ鎖）可変領域（Ｖ領域）が、それぞれ配列番号２４、２６、２７および２８で示されるアミノ酸配列から選ばれるアミノ酸配列を含む、請求項１８〜２１または２３に記載の抗体組成物。
抗体分子の軽鎖（Ｌ鎖）可変領域（Ｖ領域）が、配列番号２５、２９、３０、３１および３２で示されるアミノ酸配列から選ばれるアミノ酸配列を含む請求項１８〜２０、２２または２３に記載の抗体組成物。
抗体分子の重鎖（Ｈ鎖）可変領域（Ｖ領域）が、配列番号２４、２６、２７および２８から選ばれるアミノ酸配列を含み、かつ、抗体分子の軽鎖（Ｌ鎖）Ｖ領域が、配列番号２９、３０、３１および３２から選ばれるアミノ酸配列を含む請求項１８〜２５のいずれか１項に記載の抗体組成物。
抗体分子の重鎖（Ｈ鎖）可変領域（Ｖ領域）が配列番号２８で示されるアミノ酸配列を含み、かつ、抗体分子の軽鎖（Ｌ鎖）Ｖ領域が配列番号２５で示されるアミノ酸配列を含む請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の抗体組成物。
ヒトＩＬ−５Ｒα鎖に特異的に結合する抗体分子をコードするＤＮＡを宿主細胞に導入して得られる、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の抗体組成物を生産する形質転換体。
宿主細胞が、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素、またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素が失活するようにゲノムが改変された細胞である、請求項２８に記載の形質転換体。
宿主細胞が、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素、またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のゲノ厶上の対立遺伝子のすべてがノックアウトされた細胞である、請求項２８に記載の形質転換体。
細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素が、ＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ（ＧＭＤ）またはＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−Ｄ−マンノース−３，５−エピメラーゼ（Ｆｘ）から選ばれる酵素である、請求項２９または３０に記載の形質転換体。
ＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼが、以下の（ａ）および（ｂ）からなる群から選ばれるＤＮＡがコードする蛋白質である、請求項３１に記載の形質転換体。
（ａ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
ＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼが、以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群から選ばれる蛋白質である、請求項３２に記載の形質転換体。
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質；
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質。
ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−Ｄ−マンノース−３，５−エピメラーゼが、以下の（ａ）および（ｂ）からなる群から選ばれるＤＮＡがコードする蛋白質である、請求項３１に記載の形質転換体。
（ａ）配列番号３で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号３で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−Ｄ−マンノース−３，５−エピメラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−Ｄ−マンノース−３，５−エピメラーゼが、以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群から選ばれる蛋白質である、請求項３１に記載の形質転換体。
（ａ）配列番号４で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｂ）配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−Ｄ−マンノース−３，５−エピメラーゼ活性を有する蛋白質；
（ｃ）配列番号４で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−Ｄ−マンノース−３，５−エピメラーゼ活性を有する蛋白質。
Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素がα１，６−フコシルトランスフェラーゼである請求項２９または３０に記載の形質転換体。
α１，６−フコシルトランスフェラーゼが、以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群から選ばれるＤＮＡがコードする蛋白質である、請求項３６に記載の形質転換体。
（ａ）配列番号５で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号６で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｃ）配列番号５で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
（ｄ）配列番号６で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＨＡ。
α１，６−フコシルトランスフェラーゼが、以下の（ａ）〜（ｆ）からなる群から選ばれる蛋白質である、請求項３６に記載の形質転換体。
（ａ）配列番号７で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｂ）配列番号８で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｃ）配列番号７で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
（ｄ）配列番号８で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
（ｅ）配列番号７で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
（ｆ）配列番号８で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質。
形質転換体がＦＥＲＭＢＰ−８４７１である請求項３８に記載の形質転換体。
宿主細胞が、下記の（ａ）〜（ｉ）からなる群から選ばれる細胞である請求項２８〜３９のいずれか１項に記載の形質転換体。
（ａ）チャイニーズハムスター卵巣組織由来ＣＨＯ細胞；
（ｂ）ラットミエローマ細胞株ＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞；
（ｃ）マウスミエローマ細胞株ＮＳ０細胞；
（ｄ）マウスミエローマ細胞株ＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞；
（ｅ）シリアンハ厶スター腎臓組織由来ＢＨＫ細胞；
（ｆ）抗体を産生するハイブリドーマ細胞；
（ｇ）ヒト白血病細胞株ナマルバ細胞；
（ｈ）胚性幹細胞；
（ｉ）受精卵細胞。
請求項２８〜４０のいずれか１項に記載の形質転換体を培地に培養し、培養物中に抗体組成物を生成蓄積させ、該抗体組成物を採取し、精製する、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の抗体組成物の製造方法。
請求項４１に記載の製造方法により得られる、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の抗体組成物。
請求項１〜２７および４２いずれか１項に記載の抗体組成物を有効成分として含有する医薬。
請求項１〜２７および４２のいずれか１項に記載の抗体組成物を有効成分として含有するヒトＩＬ−５Ｒα鎖発現細胞に関連した疾患の治療薬。
ヒトＩＬ−５Ｒα鎖発現細胞に関連した疾患が、アレルギー性疾患または好酸球増多を伴う疾患である請求項４４に記載の治療薬。
請求項１〜２７および４２のいずれか１項に記載の抗体組成物を患者に投与することを特徴とする、ヒトＩＬ−５Ｒα鎖発現細胞に関連した疾患の治療方法。
ヒトＩＬ−５Ｒα鎖発現細胞に関連した疾患の治療薬を製造するための請求項１〜２７および４２のいずれか１項に記載の抗体組成物の使用。