NO316076B1 - Fremgangsmåte for fremstilling av et terapeutisk aktivt CDR- podet antistoffmolekyl, DNA-molekyl, klonings- eller ekspresjonsvektor samtvertscelle - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av humaniserte antistoffmolekyler ved anvendelse av rekombinant DNA-teknologi

Oppfinnelsen vedrører også et DNA-molekyl, klonings- eller ekspresjonsvektor samt vertscelle

Uttrykket "humanisert antistoffmolekyl" anvendes for å beskrive et molekyl med et antigenbindende sete avledet fra et immunoglobulin fra en ikke-human spesies, og hvor de gjenværende immunoglobulin-avledede deler av molekylet er avledet fra et humant immunoglobulin Det antigenbindende sete omfatter typisk hypervariable regioner {"complementary determining regions")(CDR<*>er) som bestemmer bindingsspesiflsiteten for antistoffmolekylet og som er båret på passende struktur-regioner i de variable domener Der er tre CDR'er (CDRl, CDR2 og CDR3) i hver av de tung og lett kjede variable domener

I beskrivelsen vises det til en rekke publikasjoner ved hjelp av tallangivelser Publikasjonene er angitt i numerisk rekke-følge på slutten av beskrivelsen

Naturlige immunoglobuliner har vært kjent i en rekke år, og likeledes de forskjellige fragmenter derav som Pab, {Fab')2

og Fc-fragmentene, som kan utvinnes ved hjelp av enzymatisk spalting Naturlige immunoglobuliner omfatter et molekyl som generelt er Y-formet og med et antigenbindende sete i nærheten av enden av hver øvre arm Resten av strukturen, og særlig stammen i det Y-formede molekyl formidler virkmngs-funksjonene forbundet med immunoglobuliner

Naturlige immunoglobuliner har vært anvendt i forbindelse med analyser, diagnose og, i mere begrenset utstrekning, terapi Slike anvendelser, særlig i terapi, har imidlertid inntil nylig vært forhindret pga de naturlige immunoglobuliners polyklonale natur Et betydelig skritt frem mot bruk av immunoglobiner som terapeutiske midler var oppdagelsen av prosedyrene for fremstilling av monoklonale antistoff

(MAb'er) med definert spesifisitet (1)

De fleste MAb'er er imidlertid dannet ved hjelp av hybridomer som er fusjoneringer av miltceller og myelomaceller fra gnagere De er derfor i alt vesentlig gnager-proteiner Der er svært få rapporter vedrørende fremstilling av humane MAb'er

Da de fleste tilgjengelige MAb'er er av gnageropprinnelse, er de av naturen antigeniske i mennesker og kan således føre til en uønsket immunrespons betegnet HAMA ("Human Anti-Mouse Antibody") respons Anvendelse av MAb'er fra gnagere som terapeutiske midler i mennesker er derfor følgelig begrenset ved det faktum at det menneskelige individ vil sette i verk en immunologisk respons mot MAb og vil enten fjerne det fullstendig eller i det minste redusere dets virkningsfullhet I praksis kan MAb1 er av gnageropprinnelse ikke anvendes i pasi-enter ved mer enn en eller noen få behandlinger, da det snart utvikles en HAMA-respons som gjør MAb ineffektivt så vel som at det oppstår uønskede reaksjoner 0KT3, et IgG2a/k MAb fra mus som gjenkjenner et antigen i T-cellereseptor-CD3-komplek-set har f eks vært godkjent for anvendelse i en rekke land i verden som en immuno-undertrykker ved behandling av akutt allograft-forkastelse (Chatenoud et al (2) og Jeffers et al (3)) Sett på bakgrunn av gnager-naturen for dette og andre slike MAb'er, vil imidlertid en signifikant HAMA-respons som kan inkludere en viktig anti-idiotype-komponent, kunne bygges opp ved anvendelse Det er derfor klart at det er meget ønskelig å nedsette eller avskaffe denne uønskede HAMA-respons og således utvide anvendelsesområdene for disse svært nyttige antistoffer

Det er derfor foreslått at ikke-humane MAb'er gjøres mindre antigeniske i mennesker Slike teknikker kan generelt beteg-nes som "humaniserings"-teknikker Disse teknikker omfatter typisk anvendelse av rekombinant DNA-teknikk for å manipulere DNA-sekvensen som koder for polypeptidkjedene i antistoffmolekylet

Tidligere metoder for humanisering av MAb'er involverte dannelse av chimeriske antistoffer hvor et antigenbindende sete som omfattet de totale variable domener av ett antistoff er bundet til konstante domener avledet fra et annet antistoff Metoder for å gjennomføre slike chimerisermgsprose-dyrer er beskrevet i EP 0120694 (Celltech Limited), EP 0125023 (Genentech Inc og City of Hope), EP-A-0 171496 (Res Dev Corp , Japan), EP-A-0 1734 94 (Stanford University), og WO 86/01533 (Celltech Limited) Denne sistnevnte Celltech-søknaden (WO 86/01533) omhandler en fremgangsmåte for fremstilling av et antistoffmolekyl som har de variable domener fra et mus-MAb og de konstante domener fra et humant immunoglobulin Slike humaniserte chimeriske antistoffer inneholder imidlertid fremdeles en betydelige andel av ikke-human ammosyresekvens, dvs de fullstendige ikke-humane variable domener, og kan således fremdeles utløse noe HAMA-respons, særlig ved tilførsel over en forlenget tidsperiode (Begent et al (referanse 4))

I en alternativ fremgangsmåte beskrevet i EP-A-0239400 (Winter), har de hypervariable regioner (CDR'er) i et muse-MAb blitt podet på rammeverkregionene ("framework regions") av de variable domener i et humant immunoglobulin ved hjelp av sete-rettet mutagnese ved anvendelse av lange oligonukleotider Den foreliggende oppfinnelse vedrører humaniserte antistoffmolekyler som er fremstilt i henhold til denne alternative fremgangsmåte, dvs CDR-podede humaniserte antistoffmolekyler Slike CDR-podede humaniserte antistoffer vil i mye mindre utstrekning føre til en HAMA-respons enn de humaniserte chimeriske antistoffer på bakgrunn av at de inneholder en mye mindre andel av ikke-human ammosyresekvens

Det tidligste arbeid i forbindelse med humanisering av MAb'er ved hjelp av CDR-poding ble gjennomført på MAb'er som gjenkjenner syntetiske antigener, slik som NP- eller NIP-antigener Eksempler hvor et muse-MAb som gjenkjenner et lysozym og et rotte-MAb som gjenkjenner et antigen på humane T-celler ble humanisert ved hjelp av CDR-podmg, er imidlertid henholdsvis beskrevet av Verhoeyen et al (5) og Riechmann et al (6) Fremstillingen av CDR-podet antistoff mot antigenet på humane T-celler er også beskrevet i WO 89/07452 (Medical Research Council)

I Riechmann et al/Medical Research Council er det funnet at overføring av CDR-regionene alene (som definert av Kabat, referanse (7) og (8)) ikke var tilstrekkelig til å gi tilfredsstillende antigen-bindmgsaktivitet i det CDR-podede produkt Riechmann et al fant at det var nødvendig å bytte en sermrest i stilling 27 i den humane sekvens med den tilsvarende rotte-fenylalaninrest for å oppnå et CDR-podet produkt med forbedret antigen-bindmgsaktivitet Denne rest i stilling 27 i den tunge kjede er innenfor den strukturelle sløyfe ved siden av CDRl En ytterligere sammenstilling som i tillegg inneholdt en endring fra humant serin til rottetyrosin i stilling 30 i den tunge kjede hadde ikke en signifikant endret bindingsaktivitet i forhold til det humaniserte antistoff hvor serin var endret til fenylalanin i stilling 2 7 alene Disse resultater indikerer at forandringer av rester i den humane sekvens utenfor CDR-regionene, særlig i den strukturelle sløyfe i nærheten av CDRl, kan være nødvendig for å oppnå effektiv antigen-bindmgsaktivitet for CDR-podede antistoffer som gjenkjenner mer komplekse antigener Likevel var bindmgsaffiniteten for de beste CDR-podede antistoffer som ble oppnådd fremdeles betydelig mindre enn det opprinnelige MAb

Nylig har Queen et al (9) beskrevet fremstillingen av et humanisert antistoff som binder til mterleukm-2-reseptoren, ved at CDR'er av et murmt MAb (anti-Tac) kombineres med humane immunoglobulinrammeverk- og konstante regioner De humane rammeverkregioner ble valgt for å gjøre homologien med anti-Tac MAb-sekvensen så stor som mulig I tillegg ble det anvendt data for å identifisere rammeverk-aminosyrerester som det var sannsynlig ville virke sammen med CDR1 ene eller antigenet, og det ble anvendt muse-aminosyrer i disse posisjoner i det humaniserte antistoff

I WO 90/07861 foreslo Queen et al fire kriterier for utforming av humaniserte immunoglobuliner Det første kriterium er å anvende, som den humane akseptor, rammeverket ("framework") fra et spesielt humant immunoglobulin som er særlig homologt til det ikke-humane donor-immunoglobulin som skal humanise-res, eller å anvende en konsensus-struktur fra flere humane antistoffer Det andre kriterium er å heller anvende donor-ammosyren enn akseptoren dersom den humane akseptorrest er uvanlig og donorresten er typisk for humane sekvenser i en spesifikk rest av strukturen Det tredje kriterium er å heller anvende donorstuktur-ammosyreresten enn akseptoren i stillinger i umiddelbar nærhet av CDR'ene Det fjerde kriterium er å anvende donor-ammosyreresten i rammeverk-posisjoner hvor aminosyren er forutsagt til å ha et sidekjedeatom innen omtrent 3 Å av CDR'ene i en tredimensjonal lmmunoglo-bulmmodell og til å være i stand til å interagere med antigenet eller med CDR1 ene i det humaniserte immunoglobulin Det er foreslått at kriterium 2, 3 eller 4 kan anvendes i tillegg til eller alternativt til kriterium en, og kan anvendes alene eller i enhver kombinasjon

WO 90/078 61 beskriver detaljert fremstillingen av et enkelt CDR-podet humanisert antistoff, et humanisert antistoff med spesifisitet for p55 Tac-proteinet i IL-2-reseptoren Kombinasjonen av alle fire kriterier, som nevnt over, ble anvendt for å utforme dette humaniserte antistoff, idet variabel region rammeverkene av det humane antistoff Eu (7) anvendes som akseptor I det oppnådde humaniserte antistoff var donor-CDR'ene som definert av Kabat et al (7 og 8) og i tillegg ble muse-donorrestene anvendt i stedet for de humane akseptorrester l stillingene 27, 30, 48, 66, 67, 89, 91, 94, 103,

104, 105 og 107 i den tunge kjede og i stillingene 48, 60 og 63 i den lette kjede i variabel region rammeverkene Det oppnådde humaniserte anti-Tac-antxstoff er rapportert til å ha en affinitet for p55 på 3 x IO<9> M-<1>, noe som er omtrent en tredjedel av det som ble oppnådd for mur mt MAb

Videre er fremstillingen av CDR-podede humaniserte antistoffmolekyler blitt undersøkt og det er identifisert et stillings-hierarki innenfor rammeverket av de variable regioner (dvs utenfor både Kabat CDR'ene og de strukturelle sløyfer i de variable regioner), hvor aminosyre-identitetene av restene er viktige for å oppnå CDR-podede produkter med tilfredsstillende bmdmgsaffmitet Dette har gjort det mulig å etablere et oppsett for å oppnå tilfredsstillende CDR-podede produkter som kan anvendes i utstrakt grad uavhengig av graden av homologi mellom donor-immunoglobulinet og akseptor-rammeverket Gruppen av rester som er identifisert til å være av kritisk viktighet faller ikke sammen med restene som er identifisert av Queen et al (9)

De foran beskrevne fordeler oppnås med fremgangsmåten, DNA-molekylet, klonings- eller ekspresjonsvektoren samt verts-cellen slik de er definert med de i kravene anførte trekk

Følgelig, i et første aspekt av oppfinnelsen tilveiebringes en fremgangsmåte for fremstilling av et terapeutisk aktivt CDR-podet antistoffmolekyl omfattende en tung kjede med et variabelt region domene omfattende akseptorstruktur og donor-antlgenbindende regioner hvori strukturen omfatter donorrester i minst en av posisjonene 6, 23 og/eller 24, 48 og/eller 49, 71 og/eller 73, 75 og/eller 76 og/eller 78 og 88 og/eller 91, med den betingelse at det CDR-podede antistoff ikke binder p55 Tac proteinet av IL-2 reseptoren

I foretrukne utførelsesformer omfatter rammeverket av den tunge kjede donorrester i posisjonene 23, 24, 49, 71, 73 og 78 eller i posisjonene 23, 24 og 49 Restene i posisjonene 71, 73 og 78 i rammeverket av den tunge kjede er foretrukket alle enten akseptorrester eller alle donorrester

I særlig foretrukne utførelsesformer omfatter rammeverket av den tunge kjede i tillegg donorrester i en, noen eller i alle posisjonene 6, 37, 48 og 94 Det er også særlig foretrukket at restene i posisjoner i rammeverket av den tunge kjede som vanligvis beholdes på tvers av spesies, dvs posisjonene 2, 4, 25, 36, 39, 47, 93, 103, 104, 106 og 107 ytterligere omfatter donorrester dersom de ikke er beholdt mellom donor og akseptor Mest foretrukket omfatter rammeverket av den tunge kjede i tillegg donorrester i posisjoner 2, 4, 6, 25, 36, 37, 39, 47, 48, 93 og 94, 103, 104, 106 og 107

I tillegg omfatter rammeverket av den tunge kjede eventuelt donorrester i en, noen eller i alle posisjonene 1 og 3, 72 og 76,

69 (dersom 48 er forskjellig mellom donor og akseptor),

3 8 og 4 6 (dersom 48 er donorresten) ,

80 og 20 (dersom 69 er donorresten),

67,

82 og 18 (dersom 67 er donorresten) ,

91,

88, og

hvilken som helst eller flere av 9, 11, 41, 87, 108, 110 og 112

I det første og andre aspekter av den foreliggende oppfinnelse skal det vises til en fremgangsmåte for fremstilling av terapeutisk aktive CDR-podede antistoffprodukter som omfatter akseptor-rammeverk og donorantigenbindende regioner Det skal forståes at oppfinnelsen i stor utstrekning kan anvendes for CDR-podmg av antistoffer generelt Donor- og akseptorantistoffene kan således avledes fra dyr av den samme spesies og til og med fra samme antistoffgruppe eller undergruppe Det er imidlertid mer vanlig at donor- og akseptorantistoffene er avledet fra dyr av forskjellig spesies Donorantistoffet er typisk et ikke-humant antistoff, slik som et gnager-MAb, og akseptorantistoffet er et humant antistoff

I det første og andre aspekter av den foreliggende oppfinnelse, omfatter den donorantigenbindende regionen typisk minst ett CDR fra donorantistoffet Vanligvis omfatter den donorantigenbende regionen minst to og foretrukket alle tre CDR'er av hver av de tung kjede og/eller lett kjed variable regioner CDR1 ene kan omfatte Kabat CDR'er, strukturell sløyfe CDR'er eller en kompositt av Kabat CDR'er og strukturell sløyfe CDR'er og enhver kombinasjon av disse Foretrukket omfatter de antigenbindende regionene i det variable domene av den CDR-podede tunge kjede CDR'er som tilsvarer Kabat CDR'er ved CDR2 (restene 50 - 65) og CDR3 (restene 95 - 100) og en kompositt av Kabat CDR'er og strukturell sløyfe CDR1 er ved CDRl (restene 2 6 - 35)

Angivelsene av restene som er gitt over og andre steder i den foreliggende søknad er nummerert i henhold til Kabat-nummereringen (referansene (7) og (8)) Således vil rest-angivelser ikke alltid tilsvare direkte til den lineære nummerering av aminosyrerestene Den virkelige lineære ammosyresekvens kan inneholde færre eller ytterligere aminosyrer enn i den strenge Kabat-nummerering tilsvarende til en forkortning av, eller mnføyning inn i, en strukturkomponent, enten rammeverk eller CDR, av den grunnleggende variable domene struktur Den variable region i den tunge kjede i anti-Tac-antistoffet som beskrevet av Queen et al (9) inneholder f eks en enkel aminosyre-innføyning (rest 52a) etter rest 52 i CDR2 og en mnføyning omfattende tre aminosyrer (rester 82a, 82b og 82c) etter rammeverk-rest 82 i Kabat-nummereringen Den korrekte Kabat-nummerering av rester kan bestemmes for et gitt antistoff ved at regioner med homologi i antistoffets sekvens ordnes med en "standard" Kabat-nummerert sekvens

I et andre aspekt tilveiebringer også den foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for fremstilling av et terapeutisk aktivt CDR-podet antistoffmolekyl omfattende en lett kjede med et variabel region domene omfattende akseptor-rammeverk og donorantigenbindende regioner hvor rammeverket omfatter donorrester i det minste i en av posisjonene 1 og/eller 3 og 46 og/eller 47, med den betingekse at det CDR-podede antistoff ikke binder p55 Tac proteinet av IL-2 reseptoren

Den CDR-podede lette kjede ifølge det andre aspekt av oppfinnelsen omfatter foretrukket donorrester i posisjonene 4 6 og/eller 47

I et tredje aspekt av den foreliggende oppfinnelse tilveiebringes også en fremgangsmåte for fremstilling av et terapeutisk aktivt CDR-podet antistoffmolekyl omfattende en lett kjede med et variabelt region domene omfattende akseptor-rammeverk og donorantigenbindende regioner hvor rammeverket omfatter donorrester i minst en av posisjonene 46, 48, 58 og 71, med den betingekse at det CDR-podede antistoff ikke binder p55 Tac proteinet av IL-2 reseptoren

I en foretrukket utførelsesform av det tredje aspekt, omfatter rammeverket donorrester i alle posisjoner 46, 48, 58 og 71

I særlig foretrukne utførelsesformer av det andre og tredje aspekt, omfatter rammeverket ytterligere donorrester i posisjoner 36, 44, 47, 85 og 87 Likeledes, vil posisjoner i lett kjede rammeverket som vanligvis beholdes på tvers av spesies, dvs posisjoner 2, 4, 6, 35, 49, 62, 64 - 69, 98, 99, 101 og 102 i tillegg omfatte donorrester dersom de ikke er beholdt mellom donor og akseptor Mest foretrukket omfatter lett kjede rammeverket i tillegg donorrester i posisjoner 2, 4, 6, 35, 36, 38, 44, 47, 49, 62, 64 - 69, 85, 87, 98, 99, 101 og 102

Dessuten, inneholder rammeverket i det andre eller tredje aspekt eventuelt donorrester i en, noen eller alle av posisjonene

1 og 3,

63 , 60 (dersom 60 og 54 er i stand til å danne en potensiell saltbro), 70 (dersom 70 og 24 er i stand til å danne potensiell saltbro), 73 og 21 (dersom 47 er forskjellig mellom donor og akseptor), 37 og 45 (dersom 47 er forskjellig mellom donor og akseptor), og

hvilken som helst eller flere av 10, 12, 40, 80, 103 og 105

Foretrukket omfatter de antigenbindende regionene i det CDR-podede lett kjede variable domene CDR'er tilsvarende til Kabat CDR'er i CDRl (rest 24 - 34), CDR2 (rest 50 - 56) og CDR3 (rest 89 - 97)

I et fjerde aspekt tilveiebringer oppfinnelsen ytterligere en fremgangsmåte for fremstilling av et terapeutisk aktivt CDR-podet antistoffmolekyl som omfatter minst en CDR-podet tung kjede og mmst en CDR-podet lett kjede i henhold til det første og andre eller første og tredje aspekt av den foreliggende oppfinnelse, med den betingelse at det CDR-podede antistoff ikke binder p55 Tac proteinet av IL-2 reseptoren

De humaniserte antistoffmolekyler og kjeder fremstilt i henhold til oppfinnelsen kan omfatte et fullstendig antistoffmolekyl, med tunge og lette kjeder i full lengde, et fragment derav som et Fab, (Fab')2 eller FV-fragment, en lett kjede eller tung kjede monomer eller dimer, eller et enkeltkjedet antistoff, f eks enkelkjedet FV hvor tung og lett kjede variable regioner er bundet sammen ved hjelp av en peptid-binding, eller et hvilket som helst annet CDR-podet molekyl med den samme spesifisitet som det opprinnelige donoranti-stof f Likeledes kan den CDR-podede tung og lett kjede variable region passende kombineres med andre antistoff-domener De tunge eller de lette kjeder eller de humaniserte antistoffmolekyler fremstilt i henhold til oppfinnelsen kan også ha et effektor- eller reportermolekyl festet dertil Det kan f eks ha en makrosyklus for chelatenng av et tungt metall-atom, eller et toksin, som nem, festet dertil ved hjelp av en kovalent brobindmgsstruktur Alternativt kan prosedyrene for rekombinant DNA-teknologi anvendes for å fremstille et immunoglobulinmolekyl hvor Fc-fragmentet eller CH3-domenet i et fullstendig immunoglobulinmolekyl er blitt erstattet med, eller har festet dertil ved hjelp av peptidbmding, et funksjonelt ikke-immunoglobulinprotein som et enzym eller et toksinmolekyl

Hvilke som helst passende akseptor variabel region ramme-verksekvenser kan anvendes under hensyntagen til klasse/type av donorantistoffet hvorfra de antigenbende regionene er avledet Typen akseptorrammeverk som anvendes er foretrukket av samme/lignende klasse/type som donorantistoffer Følgelig kan rammeverket velges for å maksimere/optimalisere homologi med donorantistoffsekvensen, særlig i posisjoner nær eller i nabostillmg til CDR1 ene En høy grad av homologi mellom donor-og akseptorsekvenser er imidlertid ikke viktig for anvendelsen av den foreliggende oppfinnelse Ved den foreliggende oppfinnelse identifiseres et system av rammeverk-restposisjoner hvor donorrester kan være viktige eller ønskelige for å oppnå et CDR-podet antistoffprodukt med tilfredsstillende bindingsegenskaper De CDR-podede produkter har vanligvis bindingsaffmiteter på minst IO<5> M"<1>, foretrukket minst omtrent IO<8>M"<1>, eller særlig i området IO<8> - IO<12> M"<1 >Prmsippielt kan den foreliggende oppfinnelse anvendes for enhver kombinasjon av donor- og akseptorantistoffer uten hensyn til graden av homologi mellom deres sekvenser Et oppsett for anvendelse av den foreliggende oppfinnelse på et hvilket som helst spesielt donor-akseptor antistoffpar er gitt i det etterfølgende Eksempler på humane rammeverk som kan anvendes er KOL, NEWM, REI, EU, LAY og POM (referanse 4 og 5) og lignende, f eks KOL og NEWM for den tunge kjede og REI for den lette kjede og EU, LAY og POM for både den tunge kjede og den lette kjede

Også konstant region domenene i produktene fremstilt i henhold til oppfinnelsen kan velges under hensyntagen til antistoffets foreslåtte funksjon og særlig de effektorfunksjoner som kreves Konstant region domenene kan f eks være human IgA-, IgE-, IgG- eller IgM-domener Spesielt kan humane IgG konstant region domener anvendes, særlig av isotypene IgGl og IgG3, når det humaniserte antistoffmolekyl er bestemt til terapeutiske anvendelser, og antistoff-effektorfunksjoner kreves Alternativt kan IgG2- og IgG4-isotyper anvendes når det humaniserte antistoffmolekyl er beregnet for terapeutiske formål og når antistoff-effektorfunksjonen ikke er nødvendig, f eks for enkel blokkering av lymfokmaktivitet

Resten av antistoffmolekylene behøver imidlertid ikke omfatte bare protemsekvenser fra immunoglobuliner Et gen kan f eks konstrueres hvori en DNA-sekvens som koder for en del av en human immunoglobulinkjede fusjoneres til en DNA-sekvens som koder for ammosyresekvensen av et funksjonelt polypeptid slik som et effektor- eller reportermolekyl

Ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen for fremstilling av et terapeutisk aktivt CDR-podet antistoffmolekyl benyttes en rekombinant genteknologisk fremgangsmåte

Ytterligere aspekter av den foreliggende oppfinnelse inkluderer således også DNA-sekvenser som koder for de CDR-podede tunge og lette kjeder, klonings- og ekpresjonsvektorer som inneholder DNA-sekvensene samt vertsceller som er transformert med DNA-sekvensene og som er i stand til ekspresjon av DNA-sekvensene

De generelle metoder for konstruksjon av vektorene, transfek-sjonsmetoder og dyrkmgsmetoder er i seg selv velkjente Slike metoder er f eks vist i referansene 10 og 11

DNA-sekvensene som koder for donoraminosyresekvensen kan oppnås ved hjelp av metoder som er velkjente innen teknikkens stand De donor-kodende sekvenser kan f eks oppnås ved genomisk kloning, eller cDNA-klomng fra passende hybridom-cellelinjer Positive kloner kan screenes ved anvendelse av passende prober for de aktuelle gener for den tunge og lette kjede Også PCR-kloning kan anvendes

DNA som koder for akseptor, f eks human akseptor, sekvenser kan oppnås på en hvilken som helst passende måte DNA-sekvenser som koder for foretrukne humane akseptor-rammeverk som KOL, REI, EU og NEWM, er f eks lett tilgjengelige for de som arbeider innen dette området

Standardteknikker innen molekylær biologi kan anvendes for fremstilling av DNA-sekvenser som koder for de CDR-podede produkter Ønskede DNA-sekvenser kan syntetiseres helt eller delvis ved anvendelse av oligonukleotidsynteseteknikker Sete-rettet mutagenese og polymerasekjedereaksjon (PCR)-teknikker kan passende anvendes Oligonukleotid-rettet syntese som beskrevet av Jones et al (referanse 20) kan f eks anvendes Også oligonukleotid-rettet mutagenese av en variabel region som på forhånd er fjernet, som f eks beskrevet av Verhoeyen et al (referanse 5) eller Riechmann et al (referanse 6) kan anvendes Også enzymatisk tilføying i avbrutte oligonukleotider ved anvendelse av T4 DNA-polymerase som f eks beskrevet av Queen et al (referanse 9) kan anvendes

Ethvert passende vertscelle/vektorsystem kan anvendes for ekspresjon av DNA-sekvensene som koder for de CDR-podede tunge og lette kjeder Bakterielle f eks E coli og andre mikrobielle systemer kan anvendes, særlig for ekspresjon av antistoff-fragmenter som FAb og (Fab<1>)2-fragmenter, og særlig FV-fragmenter og antistoff-fragmenter med en enkelt kjede, f eks FVer med enkelt kjede Eukaryotiske f eks ekspresjonssystemer fra pattedyr-vertsceller kan anvendes for fremstilling av større CDR-podede antistoffprodukter, inkluderende fullstendige antistoffmolekyler Passende pattedyr-vertsceller inkluderer CHO-celler og myelom- eller hybridomcelle-linjer

I et ytterligere aspekt tilveiebringer således den foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for fremstilling av et CDR-podet antistoffprodukt omfattende

(a) fremstilling, i en ekspresjonsvektor, av et operon med DNA-sekvens som koder for en tung kjede av et antistoff i henhold til det første aspekt av oppfinnelsen, og/eller (b) fremstilling, i en ekspresjonsvektor, av et operon med en DNA-sekvens som koder for en komplementær lett kjede av et antistoff i henhold til det andre eller tredje aspekt av oppfinnelsen, (c) transfeksjon av en vertscelle med den eller hver vektor,

og

(d) dyrking av den transfekterte cellelinje for fremstilling av det CDR-podede antistoffprodukt

Det CDR-podede produkt kan omfatte polypeptid avledet fra kun den tunge eller den lette kjede, hvor kun en tung eller lett kjede polypeptid-kodende sekvens anvendes for å transfektere vertscellene

For fremstilling av produkter som omfatter både tunge og lette kjeder, kan cellelinjen transfekteres med to vektorer, idet den første vektor kan inneholde et operon som koder for et peptid avledet fra en lett kjede og den andre vektor kan inneholde et operon som koder for et polypeptid avledet fra en tung kjede Vektorene er foretrukket identiske, unntatt når det gjelder kodesekvenser og selekterbare markører, for å sikre, så langt som mulig, at hver polypeptidkjede uttrykkes likt Alternativt kan en enkel vektor anvendes, idet vektoren inkluderer sekvensene som koder for polypeptider som er avledet fra både den lette og den tunge kjede

DNA i de sekvenser som koder for de lette og tunge kjeder kan omfatte cDNA eller genomisk DNA eller begge Det er imidlertid foretrukket at DNA-sekvensen som koder for den tunge eller lette kjede omfatter i det minste delvis genomisk DNA, foretrukket fusjonert cDNA og genomisk DNA

Den foreliggende oppfinnelse kan anvendes for antistoffer med en hviken som helst passende spesifisitet Oppfinnelsen kan imidlertid fordelaktig anvendes for å humanisere ikke-humane antistoffer som anvendes for in vivo terapi Antistoffene kan således være steds-spesifikke antistoffer slik som tumor-spesifikke eller celleoverflate-spesifikke antistoffer som passende kan anvendes i in vivo terapi Eksempler på celle-overf late-spesif ikke antistoffer er anti-T-celle antistoffer, som anti-CD3, og CD4 og adhesjonsmolekyler som CR3, ICAM og ELAM Antistoffene kan ha spesifisitet for mterleukmer {inkluderende lymfokmer, vekstfaktorer og stimulerende faktorer) , hormoner og andre biologisk aktive forbindelser, og reseptorer for hvilken som helst av disse Antistoffene kan

f eks ha spesifisitet for hvilken som helst av de følgende interferoner a, &, y eller 6, ILI, 112, IL3 eller IL4 osv, TNF, GCSF, GMCSF, EPO, hGH eller insulin osv

Terapeutiske preparater som omfatter de CDR-podede produkter fremstilt i henhold til oppfinnelsen for anvendelse innen terapi kan også oppnås

Det kan således tilveiebringes et terapeutisk preparat som omfatter et antistoff eller molekyl med CDR-podet tung eller lett kjede i henhold til tidligere aspekter av den foreliggende oppfinnelse sammen med en farmasøytisk tålbar bærer, fortynnmgsmiddel eller hjelpestoff

For terapi tilføres av en effektiv mengde av et antistoff eller molekyl med CDR-podet tung eller lett kjede i henhold til de tidligere aspekter av oppfinnelsen, til et menneske eller et dyr

En foretrukket protokoll for oppnåelse av antistoff med CDR-podede tunge og lette kjeder fremstilt i overensstemmelse med den foreliggende oppfinnelse er angitt i det etterfølgende sammen med den logiske begrunnelse som denne protokoll er utledet fra

Protokoll

Det er først og fremst nødvendig å sekvensere det DNA som koder for de variable regioner i den tunge og lette kjede i donorantistoffet, for å bestemme deres ammosyresekvenser Det er også nødvendig å velge passende akseptor variable regioner i den tunge og lette kjede, med kjent aminosyre-sekvens Den CDR-podede kjede utformes deretter med utgangs-punkt i basisen av akseptorsekvensen Det skal forstås at donor- og akseptor-aminosyrerestene i noen tilfeller kan være identiske i en spesiell posisjon og det kreves således ingen forandringer av akseptor-rammeverkresten

1 I et første trinn ble akseptorrester erstattet med donorrester i CDR'ene For dette formål er CDR'ene foretrukket definert som følger

De posisjoner hvori akseptor skal erstattes med donorrester i rammeverket velges deretter som følger, først og fremst med hensyn til den tunge kjede og deretter med hensyn til den lette kjede

2 Tung kjede

2 l Velg donorrester i alle posisjoner 23, 24, 49, 71, 73 og 7 8 i den tunge kjede og i alle posisjoner 23, 24 og 49 (71, 73 og 78 er alltid enten alle donor eller alle akseptor) 2 2 Undersøk at de følgende har den samme aminosyre i donor-og akseptorsekvenser, og dersom ikke velg foretrukket donoren 2, 4, 6, 25, 36, 37, 39, 47, 48, 93, 94, 103,

104, 106 og 107

2 3 For å optimalisere affiniteten ytterligere, overvei valg av donorrester i en, noen eller hvilke som helst av i 1,3

il 72, 76

in Dersom 48 er forskjellig mellom donor- og akseptorsekvenser, overvei 69

iv Dersom donorresten velges i 48, overvei 3 8 og 46

v Dersom donorresten velges i 69, overvei 8 0 og

deretter 2 0

vi 67

vu Dersom donorresten velges i 67, overvei 82 og

deretter 18

vin 91

IX 88

x 9, 11, 41, 87, 108, 110, 112

3 Lett kjede

3 l Velg donor i 46, 48, 58 og 71

3 2 Undersøk at de følgende har den samme aminosyre i donor-og akseptorsekvenser, og dersom dette ikke er tilfelle velg foretrukket donor

2, 4, 6, 35, 38, 44, 47, 49, 62, 64 - 69, 85, 87, 98,

99, 101 og 102

3 3 For å optimalisere affiniteten ytterligere, overvei valg av donorrester i en, noen eller hvilken som helst av i 1,3

il 63

ni 60, dersom 60 og 54 er i stand til å danne en potensiell saltbro

iv 70, dersom 70 og 24 er i stand til å danne en

potensiell saltbro

v 73, og 21 dersom 47 er forskjellig mellom donor og

akseptor

vi 3 7, og 4 5 dersom 47 er forskjellig mellom donor og

akseptor

Vil 10, 12, 40, 80, 103, 105

Praksis

For å overføre bmdingsstedet i et antistoff mn i en forskjellig akseptorrammeverk, må en rekke faktorer tas i betraktning

1 Omfanget av CDR'ene

CDR'ene ("Complementary Determmmg Regions") ble definert av Wu og Kabat (referansene 4 og 5) på grunnlag av en analyse som vedrører varierbarheten av forskjellige regioner i antistof f -variable regioner Tre regioner pr domene ble aner-kjent I den lette kjede er sekvensen 24 til og med 34, 50 til og med 56, og 89 til og med 97 (nummerering i henhold til Kabat (referanse 4), Eu Index) og i den tunge kjede er sekvensene 31 til og med 35, 50 til og med 65 og 95 til og med 102

Når antistoffstrukturene ble tilgjengelige var det tydelig at disse CDR-regioner hovedsakelig tilsvarer sløyferegioner som strekker seg fra £-"barrel"(lukket p-plate)-rammeverket i de lette og tunge variable domener For Hl var der er en uover-ensstemmelse ved at sløyfen var fra 26 til og med 32 og for H2 var sløyfen fra 52 til 56 og for L2 fra 50 til 53 Med unntak av Hl, omfattet imidlertid CDR-regionene sløyfe-regionene og strakk seg mn i fi-"barrel"- rammeverket I Hl, har rest 2 6 en tendens til å være serin og 27 fenylalanin eller tyrosm, rest 29 er fenylalanin i de fleste tilfeller Restene 2 8 og 3 0 som er overflaterester som utsettes for løsningsmiddel kan være involvert i antigenbinding En forsiktig definisjon av Hl-CDR vil derfor kunne inkludere rester 26 til 35, som derfor inkluderer både sløyferegioner og de hypervariable rester 33 til 35

Det er interessant å merke seg eksempelet etter Riechmann et al (referanse 3), som valgte resten 31 - 3 5 for CDR-Hl For å danne effektiv antigenbinding, må også rest 27 være rekrut-tert fra donor (rotte) antistoffet

2 Ikke-CDR-rester som bidrar til antigenbinding Ved undersøkelse av tilgjengelige røntgenstråle-strukturer er det blitt identifisert en rekke rester som kan ha en virkning på netto antigenbinding og som kan vises ved forsøk Disse rester kan oppdeles i en rekke grupper 2 1 Overflaterester nær CDR (all nummerering som i Kabat et al (referanse 7)) 2 11 Tung kjede - Nøkkelrester er 23, 71 og 73 Andre rester som kan bidra i mindre utstrekning er 1, 3 og 76 Endelig er 25 vanligvis bevart, men murinresten

bør anvendes dersom der er en forskjell

2 12 Lett kjede - Mange rester nær CDR'ene, f eks er 63, 65, 67 og 69 bevart Dersom de er bevart, har sann-synligvis ingen av disse overflaterester i den lette kjede en viktig effekt Dersom murinresten i disse posisjoner imidlertid er uvanlig, vil det være fordelaktig å analysere det sannsynlige bidrag nærmere Andre rester som også kan bidra til binding er l og 3, og også 60 og 70 dersom restene i disse posisjoner og i henholdsvis 54 og 24 eventuelt er i stand til å

danne en saltbro dvs 60+54, 70 + 24

2 2 Sammenfoldingsrester nær CDR'ene

2 2 1 Tung kjede - Nøkkelrester er 24, 4 9 og 7 8 Andre nøkkelrester ville være 3 6 dersom ikke et tryptofan, 94 dersom ikke et argmin, 104 og 106 dersom ikke gly-cmer og 107 dersom ikke threomn Rester som kan gi ytterligere bidrag til stabil sammenfolding av den tunge kjede og således forbedret affinitet er 2, 4, 6, 38, 46, 67 og 69 67 sammenfolder mot CDR-resten 63 og dette par vil begge enten være fra mus eller begge fra menneske Rester som bidrar til sammenfolding i denne region men fra en større avstand er til slutt 18, 20, 80, 82 og 86 82 sammenfolder mot 67 og 18 sammenfolder igjen mot 82 80 sammenfolder mot 69 og 2 0 sammenfolder igjen mot 80 86 danner et H-bindmgs-nettverk med 3 8 og 46 Mange av forskjellene mellom mus og menneske er av mindre betydning, f eks Leu-Ile, men vil kunne ha en mindre virkning på korrekt sammenfolding som vil kunne overføres til endret

plassering av CDR'ene

2 2 2 Lett kjede - Nøkkelrester er 48, 58 og 71 Andre nøkkelrester vil kunne være 6 dersom ikke glutamin, 3 5 dersom ikke tryptofan, 62 dersom ikke fenylalanin eller tyrosm, 64, 66, 68, 99 og 101 dersom ikke gly-cmer og 102 dersom ikke threonm Rester som ytterligere bidrar er 2, 4, 37, 45 og 47 Endelig kan rester 73 og 21 og 19 i mindre utstrekning bidra til

sammenfoldmg over større avstand

2 3 Rester i det variable domenes grenseflate mellom tunge og lette kjeder - I både den tunge og den lette kjede er de fleste ikke-CDR-grenseflaterester bevart Dersom en bevart rest erstattes av en rest med forskjellig karak-ter, f eks størrelse eller ladning, bør det anses for

retensjon som murinresten

2 3 1 Tung kjede - Rester som man behøver å vurdere er 37 dersom resten ikke er valin, men har et større side-kjedevolum eller har en ladning eller polaritet Andre rester er 39 dersom ikke et glutamin, 45 dersom ikke et leucin, 47 dersom ikke et tryptofan, 91 dersom ikke et fenylalanin eller tyrosm, 93 dersom ikke et alanin og 103 dersom ikke et tryptofan Rest 89 er også i

grenseflaten, men er ikke i en posisjon hvor side-kjeden vil kunne ha stor innvirkning 2 3 2 Lett kjede - Rester som man behøver å vurdere er 36, dersom ikke et tyrosm, 3 8 dersom ikke et glutamin, 44 dersom ikke et prolin, 46, 49 dersom ikke et tyrosm, rest 85, rest 87 dersom ikke et tyrosin og 98 dersom ikke et fenylalanin 2 4 Varxabel-konstant region grenseflate - Vinkelen mellom variable og konstante regioner kan påvirkes ved forandringer i sammenfolding av nøkkelrester i den variable region mot den konstante region som kan påvirke posisjonen av VL og VH med hensyn til hverandre Man skal derfor legge merke til restene som passende kan være i kontakt med den konstante region I den tunge kjede er overflaterestene som eventuelt er i kontakt med den variable region beholdt mellom antistoffer fra mus og menneske og derfor kan kontaktrestene i den variable region innvirke på V-C-interaksjonen I den lette kjede varierer aminosyrene som er funnet i en rekke av kon-taktpunktene i den konstante region, og V- og C-regionene er ikke i en slik nær tilknytning som i den tunge kjede Derfor vil innvirkningene av V-C-grenseflåtene i

den lette kjede være av mindre betydning

2 4 1 Tung kjede - Kontaktrester er 7, 11, 41, 87, 108, 110, 112 2 4 2 Lett kjede - I den lette kjede er eventuelle kontaktrester 10, 12, 40, 80, 83, 103 og 105

De overnevnte analyser sammen med søkernes betydelige prak-tiske eksperimentelle erfaring i CDR-poding av en rekke forskjellige antistoffer har ført til det overnevnte oppsett

Den foreliggende oppfinnelse skal nå eksempelvis beskrives med henvisning til de vedlagte figurer 1-13

Kort beskrivelse av figurene

Fig 1 viser DNA og aminosyresekvenser av den 0KT3 lette

kjede,

Fig 2 viser DNA og aminosyresekvenser av den OKT3 tunge

kj ede,

Fig 3 viser oppstillingen av 0KT3 ammosyresekvensen av den lette variable region sammen med den for den lette variable region av det humane antistoff REI, Fig 4 viser oppstillingen av 0KT3 aminosyresekvensen av den tunge variable region sammen med den for den tunge variable region av det humane antistoff KOL, Fig 5 viser ammosyresekvensene av den tunge variable region av 0KT3, KOL og forskjellige tilsvarende CDR-podmger, Fig 6 viser aminosyresekvensen av den lette variable region av 0KT3, REI og forskjellige tilsvarende CDR-podinger, Fig 7 iser en grafisk fremstilling av bindingsforsøks- resultater for forskjellige podede 0KT3-antistoffer, Fig 8 viser en grafisk fremstilling av blokkeringsforsøks- resultater for forskjellige podede 0KT3-antistoffer, Fig 9 viser en lignende grafisk fremstilling av

blokkeringsforsøksresultater,

Fig 10 viser lignende grafiske fremtillinger for både

bindingsforsøks- og blokkeringsforsøksresultater,

Fig 11 viser ytterligere lignende grafiske fremstillinger for både bindingsforsøks- og blokkeringsforsøks-resultater, Fig 12 viser engrafiske fremstilling av konkurranse-for-søksresultater for et minimalt podet 0KT3-antistoff sammenlignet med OKT3 murin referansestandard, og Fig 13 viser en lignende grafisk fremstilling av konkur-ranse- f orsøksresultater som sammenligner et fullstendig podet OKT3-antistoff med den munne referansestandard

Detaljert beskrivelse av utførelsesformer av oppfinnelsen

EKSEMPEL 1

CDR-podmg av OKT3

Material og metoder

1 Utgangsceller

Hybridomceller som danner antistoff 0KT3 ble tilveiebragt fra Ortho (seedlot 4882 1) og blir dyrket i et Dulbecco's Modi-fied Eagles Medium uten antibiotika (DMEM) som var til-satt glutamin og 5 % føtalt kalveserum, og som ble skilt til å gi en overliggende supernatant for evaluering og celler for ekstraksjon av RNA Den overliggende supernatant inneholdt 250 /xg/ml murmt IgG2a/kappa antistoff Supernatanten inneholdt ikke munn lambda lett kjede og IgGl, IgG2b, IgG3, IgA og IgM tung kjede 2 0 ml supernatant ble undersøkt for å bekrefte at det tilstedeværende antistoff var 0KT3

2 Molekylær biologiprosedyrer

De grunnleggende prosedyrer for molekylær biologi var som beskrevet i Maniatis et al (referanse 9) med noen mindre modifikasjoner i enkelte tilfeller DNA-sekvensering ble gjennomført som beskrevet i Sanger et al (referanse 11) og i Amersham International Plc sekvenseringshåndboken Seterettet mutagenese var som beskrevet i Kramer et al (referanse 12) og i Anglian Biotechnology Ltd håndboken COS-celleekpresjon og metabolsk merking var som beskrevet i Whittle et al (referanse 13)

3 Undersøkelsesforsøk

3 1 Samleforsøk

Samleforsøk ble gjennomført på supernatanter fra transfiserte COS-celler for å bestemme mengden tilstedeværende intakt IgG

3 11 COS-celler transfektert med OKT3-gener fra mus Forsøket som ble gjennomført for intakt muse-IgG i COS-celle supernatanter var ELISA med følgende format mikrotiterplater med 96 brønner ble belagt med F (ab *) 2-o;eit anti-mus IgG Fc Platene ble vasket i vann og prøver ble tilsatt i løpet av en time ved romtemperatur Platene ble vasket og F(ab')2-geit anti-mus IgG F(ab')2 (HRPO-konjugert) ble deretter tilsatt Substrat ble tilsatt for å vise reaksjonen UPC10, et IgG2a-myeloma fra mus ble anvendt som en

standard

3 12 COS- og CHO-celler transfektert med chimeriske eller CDR-podede OKT3-gener

Bestemmelsen som ble anvendt i forbindelse med chimerisk eller CDR-podet antistoff i COS-celle supernatanter var ELISA med følgende format

mikrotiterplater med 96 brønner ble belagt med F(ab')2_gelt anti-humant IgG Fc Platene ble deretter

vasket og prøver ble tilsatt og inkubert i en time ved romtemperatur Platene ble vasket og monoklonal anti-human kappa-kjede fra mus ble tilsatt i løpet av en time ved romtemperatur Platene ble vasket og F(ab')2-geit anti-mus IgG Fc (HRPO-konjugert) ble tilsatt Enzymsubstratet ble tilsatt for å vise reaksjonen Chimerisk B72 3 (IgG4) (referanse 13) ble anvendt som standard Anvendelse av en monoklonal anti-kappa-kjede i dette forsøk tillater at podede antistoffer kan

avleses ut fra den chimeriske standard

3 2 Bestemmelse av antigen-bindingsaktivitet

Material fra COS-cellesupernatanter ble analysert for 0KT3-antigenbindende aktivitet på CD3 positive celler i en direkte analyse Prosedyren var som følger HUT 78-celler (human T-cellelinje, CD3-positiv) ble holdt i cellekultur Monolag av HUT 78-celler ble fremstilt på ELISA-plater med 96 brønner ved anvendelse av poly-L-lysin og glutaraldehyd Prøver ble tilsatt til monolagene i løpet av en time ved romtemperatur

Platene ble vasket forsiktig ved anvendelse av PBS F(ab')2-geit anti-humant IgG Fc (HRPO-konjugert) eller F(ab')2-geit anti-mus IgG Fc (HRPO-konjugert) ble til-satt som passende for humaniserte eller museprøver Substrat ble tilsatt for å vise reaksjon Den negative kontroll for den cellebaserte bestemmelse var chimerisk B72 3 Den positive kontroll var Orthomune OKT3 av mus eller chimerisk 0KT3 når det var tilgjengelig Dette cellebaserte forsøk var vanskelig å gjennomføre, og en alternativ analyse ble utviklet for CDR-podet 0KT3 som var mer sensitiv og lettere å gjennomføre

I dette system ble CDR-podet 0KT3 dannet ved hjelp av COS-celler testet for dets evne til å binde til den CD3-positive HPB-ALL ("human peripheral blood acute lympho-cytic leukemia") cellelinje Det ble også testet for dets evne til å blokkere binding av murmt 0KT3 til disse celler Bindingen ble målt ved hjelp av følgende prosedyre HPB-ALL-celler ble høstet fra vevskultur Cellene ble inkubert ved 4°C i en time med forskjellige fortynninger av test-antistoff, positiv kontroll-antistoff eller negativ kontroll-antistoff Cellene ble vasket en gang og inkubert ved 4°C i en time med FITC-merket geit anti-humant IgG (Fc-spesifikk, museabsor-bert) Cellene ble vasket to ganger og analysert ved hjelp av cytofluorografi Chimerisk 0KT3 ble anvendt som en positiv kontroll for direkte binding Celler inkubert med mock-transfektert COS-celle supernatant, etterfulgt av FITC-merket geit anti-humant IgG, var den negative kontroll For å teste den evnen som CDR-podet 0KT3 har til å blokkere munn 0KT3-binding, ble HPB-ALL-cellene inkubert ved 4°C i en time med forskjellige fortynninger av et antistoff eller kontrollantistoff En fast mettende mengde FITC 0KT3 ble tilsatt Prøvene ble inkubert i en time ved 4°C, vasket to ganger og analysert ved hjelp cytofluorografi FITC-merket 0KT3 ble anvendt som en positiv kontroll for å bestemme maksimal binding Umer-ket munn 0KT3 tjente som en referansestandard for blokkering Negative kontroller var ikke-merkede celler med eller uten mock-transfektert celle supernatant Den evnen som CDR-podet 0KT3 lett kjede har til å binde CD3-positive celler og blokkere bindingen av murin 0KT3 ble først testet sammen med den chimeriske 0KT3 tunge kjede Den chimeriske 0KT3 tunge kjede består av den murine 0KT3 variable region og den humane IgG4 konstante region Gener for den chimeriske tunge kjede uttrykkes i den samme ekspresjonsvektor som anvendes for de CDR-podede gener Ekspresjonsvektoren for CDR-podet lett kjede og ekspresjonsvektoren for den chimeriske tunge kjede ble ko-transfektert inn i COS-celler Hele det chimeriske 0KT3-antistoff (chimerisk lett kjede og chimerisk tung kjede) ble funnet å være i stand til å binde til CD3 positive celler og blokkere bindingen av

murint 0KT3 til disse celler

3 3 Bestemmelse av relativ bindingsaffinitet

De relative bindingsaffmiteter av CDR-podede anti-CD3 monoklonale antistoffer ble bestemt ved konkurrerende binding (referanse 6) ved anvendelse av den HPB-ALL humane T-cellelmje som en kilde for CD3-antigen, og fluorescein-konjugert murmt 0KT3 (F1-0KT3) med en kjent bmdingsaffinitet som et markør-antistoff Bmdmgsaf f 1-niteten av Fl-0KT3-markør antistoffet ble bestemt ved hjelp av en direkte bindmgsbestemmelse hvori økende mengde F1-0KT3 ble inkubert med HPB-ALL (5xl0<5>) i PBS med 5 % føtalt kalveserum i 60 minutter ved 4°C Cellene ble vasket og den fluorescerende intensitet ble bestemt på et FACScan flowcytometer som var kalibrert med kvantitative mikrokule-standarder (Flow Cytometry Standards, Research Triangle Park, NC) Fluorescerende intensitet per antistoffmolekyl (F/P-forhold) ble bestemt ved anvendelse av mikrokuler som har et forhåndsbestemt antall mus igG-antistoff-bindingsseter (Simply Cellular beads, Flow Cytometry Standards) F/P er lik den fluorescerende intensitet av kuler mettet med F1-OKT3 dividert med antall bindingsseter pr kule Mengden av bundet og fritt F1-0KT3 ble beregnet fra den gjennomsnittlige fluorescerende intensitet pr celle, og forholdet bundet/fritt ble plottet mot antall mol bundet antistoff En lineær tilpasning ble anvendt for å bestemme bmdmgsaf f miteten (absolutt verdi av helningen ("slope")) For konkurrerende binding, ble økende mengder konkurrerende antistoff tilsatt til en sub-mettende dose av F1-OKT3 og inkubert med FxlO<5> HPB-ALL i 200 ml PBS med 5 % føtalt kalveserum i 60 minutter ved 4°C De fluorescerende mtensiteter av cellene ble målt på et FACScan flowcytometer som er kalibrert med kvantitative mikrokule-standarder Konsentrasjonene av bundet og fritt F1-0KT3 ble beregnet Affinitetene av konkurrerende antistoffer ble beregnet fra ligningen

[X] - [0KT3] a (l/Kx) - (l/Ka), hvori Ka er affiniteten av murmt OKT3, Kx er affiniteten av det konkurrerende X, [ ] er konsentrasjonen av konkurrerende antistoff hvor bundet/fri binding er R/2, og R er maksimal

bundet/fri binding

4 Oppbygning av cDNA-bibliotek

4 1 Fremstilling av mRNA og syntese av cDNA

0KT3-produserende celler ble dyrket som beskrevet over og 1,2 x l0<9->celler ble høstet og mRNA ble ekstrahert ved anvendelse av guanidm/LiCl ekstraksjonsprosedyren cDNA ble fremstilt ved priming fra Oligo-dT til å danne cDNA med full lengde cDNA ble metylert og EcoRI-lmkere

ble tilsatt for kloning

4 2 Oppbygning av bibliotek cDNA-biblioteket ble ligert til pSP65-vektor DNA som var kuttet med EcoRI og 5'-fosfatgruppene ble fjernet ved kalvetarm-fosfatase (EcoRl/CIP) Ligermgen ble anvendt for å transformere Eschericia coli (E coli) HB101 med høy transformasjonseffektlvitet Et cDNA-bibliotek ble fremstilt 3 600 kolonier ble screenet for den lette kjede og 10 00 0 kolonier ble screenet for den tunge

kj ede

5 Screening

E coli-kolonier som var positive med hensyn til prober for enten tung eller lett kjede ble identifisert ved oligonukleotid-screening med anvendelse av oligonukleotidene

5'-TCCAGATGTTAACTGCTCAC for den lette kjede som er komplementær til en sekvens i den konstante kappa-region i mus, og 5<1->CAGGGGCCAGTGGATGGATAGAC for den tunge kjede som er komplementær til en sekvens i den IgG2a konstante CHl-domene-region i mus Tolv lett kjede kloner og ni tung kjede kloner ble identifisert og tatt ut for en ytterligere screening Positive kloner fra den ytterligere screening ble dyrket og DNA ble fremstilt Størrelsene av geninnskuddene ble estimert ved gelelektroforese og de med en størrelse som er i stand til å inneholde en uforkortet cDNA ble sub-klonet inn i M13 for DNA-sekvensering

6 DNA- sekvensering

Kloner som representerer fire størrelsesgrupper for både tunge og lette kjeder ble oppnådd i M13 DNA-sekvensen for de 51 ikke-translaterte regioner, signalsekvenser, variable regioner og 3' ikke-translaterte regioner av uforkortede cDNA'er (figurene 1(a) og 2 (a)) ble oppnådd og de tilsvarende aminosyresekvenser ble beregnet ((figurene 1(b) og 2 (b)) I fig l(a) er de ikke-oversatte DNA-regioner vist øverst, og i begge figurene 1 og 2 er signalsekvensene understreket

7 Konstruksjon av cDNA- ekspresionsvektorer

Celltech-ekspresjonsvektorer er basert på plasmidet pEE6hCMV (referanse 14) En polylmker for innskuddet av gener som skal uttrykkes er innført etter den største tidlige direkte promotor/enhancer av det humane Cytomegalovirus (hCMV) Markørgener for seleksjon av plasmidet i transfekterte eukaryotiske celler kan innskytes som BamHI-kassetter i det unike BamHI-sete i pEE6hCMV, f eks neomarkøren for å gi pEEShCMVneo Det er vanlig praksis å innskyte neo- og gpt-markører før genet av interesse innskytes, mens GS-markøren innskytes til sist pga tilstedeværelse av interne EcoRl-seter i kasset-ten

De selekterbare markører uttrykkes fra den SV40 sene promoter som også tilveiebringer et replikasjonsorigo slik at vektorene kan anvendes for ekspresjon i det COS-celle transiente ekspresj onssystem

Musesekvensene ble fjernet fra de M13-baserte vektorer som er beskrevet over som EcoRI-fragmenter og klonet inn i enten pEE6-hCMV-neo for den tunge kjede eller mn i EE6-hCMV-gpt for den lette kjede til å gi henholdsvis vektorene pJA13 6 og pJAI35

8 Ekspresjon av cDNA' er i COS- celler

Plasmidene pJA135 og pJA136 ble ko-transfektert mn i COS-celler og supernatant fra transient-ekspresjonsforsøket ble vist til å inneholde sammensatt antistoff som bandt til T-celle-anrikede lymfocytter Metabolske merkingsforsøk med anvendelse av <35>S-methionm viste ekspresjon og sammensetning av tunge og lette kjeder

9 Konstruksjon av chimeriske gener

Konstruksjon av chimeriske gener fulgte en tidligere beskrevet strategi (Whittle et al (referanse 13)) Et restriksjonssete nær 3'-enden av den variable domenesekvens identfiseres og anvendes til å feste en oligonukleotidadapter som koder for resten av den variable region fra mus og et passende restriksjonssete for festing til den valgte konstante region

9 1 Konstruksjon av lett kjede gen

Lett kjede cDNA-sekvenser fra mus inneholder et Aval-sete nær 3'-enden av den variable region (fig l(a)) Størsteparten av sekvensen av den variable region ble isolert som et EcoRI-Aval-fragment med 3 96 basepar En oligonukleotid-adapter ble utformet til å erstatte resten av 3'-regionen i den variable region fra Aval-setet og til å inkludere 5'-restene av den humane konstante region opp til og inkluderende et eneste Narl-sete som tidligere var innarbeidet i den konstante region

Et Hmdlll-sete ble innført til å virke som en markør for innskyt ing av lmkeren Linkeren ble ligert til VL-fragmentet og det EcoRI-Narl-tilpassede fragment med 413 basepar ble renset fra ligermgsblandingen

Den konstante region ble isolert som et Narl-BamHI-fragment fra et M13-klon-NW3 61 og ble ligert med det variable region-DNA inn i en EcoRI/BamHI/CIP pSP65-behandlet vektor i en treveis-reaksjon til å gi plasmid JA143 Kloner ble isolert etter transformasjon mn i E coli og lmkeren og koblmgssekvenser ble bekreftet ved tilstedeværelse av Hindlll-setet og ved DNA-sekvense-rmg

9 2 Konstruksjon av lett kjede gen - versjon 2 Konstruksjonen av det første chimeriske lett kjede gen gir en fusjon av mus- og humane aminosyresekvenser i koblingen variabel-konstant region I tilfellet med 0KT3-lett kjede er aminosyrene i den chimere kobling Leu-Glu-Ile- Asn- Ara/-/ Thr-Val-Ala-Ala

VARIABEL KONSTANT

Dette sekvensarrangement introduserer et potensielt sete for asparagin (Asn) bundet (N-bundet) glykosylering av V-C-koblmgen Derfor ble en annen versjon av den chimeriske lett kjede oligonukleotid-adapteren utformet hvor threonm (Thr) , den første aminosyre i den humane konstante region, ble erstattet med den ekvivalente aminosyre fra den konstante region i mus, alanin (Ala)

Et internt Hmdlll-sete var ikke inkludert i denne adapter, for å differensiere de to chimeriske lett kjede gener

Variabel region fragmentet ble isolert som et EcoRI-Aval-fragment med 376 baserpar Oligonukleotidlmkeren ble ligert til Narl-kuttet pNW361 og deretter ble den tilpassede konstante region med 3 96 basepar isolert etter at det modifiserte pNW361 var kuttet på nytt med EcoRI Variabel region fragmentet og det modifiserte konstant region fragmentet ble ligert direkte inn i EcoI/CIP-behandlet pEE6hCMV~neo til å gi pJA137 Opprinnelig hadde alle de undersøkte kloner innskuddet i den ukorrekt orientering Innskuddet ble derfor isolert på nytt og klonet på nytt for å vende innskuddet om og gi plasmid pJA141 Det ble oppnådd flere kloner med innskudd i korrekt orientering og adapter-sekvensen av

ett ble bekreftet ved DNA-sekvensering

9 3 Konstruksjon av tung kjede gen

9 3 1 Valg av gen-xsotype for tung kjede

Konstant region isotypen som ble valgt for den tunge

kjede var human IgG4

9 3 2 Genkonstruksjon

Tung kjede cDNA-sekvensen viste et Banl-sete nær 3'-enden av den variable region (fig 2(a)) Det meste av sekvensen for den variable region ble isolert som et EcoRl/CIP/Banl-fragment med 42 6 basepar En oligonukleotid-adapter ble utformet til å erstatte resten av 3'-regionen av den variable region fra BanI setet opp til og inkluderende et eneste Hmdlll-sete som tidligere var blitt innført inn i de første to aminosyrer av den konstante region Linkeren ble ligert til VH-fragmentet og det EcoRI-Hmdlll-tilpassede fragment ble renset fra ligermgsblandingen

Den variable region ble ligert til den konstante region ved at pJA9l ble kuttet med EcoRI og Hindlll med fjerning av mtron-fragmentet og erstatning av dette med VH til å gi pJA142 Kloner ble isolert etter transformasjon inn i E coli JM101 og linker- og kob-lingssekvenser ble bekreftet ved DNA-sekvensering

(Merk Hindlll-setet er tapt ved kloning)

10 Konstruksjon av chimeriske ekspresjonsvektorer

10 1 Neo-og-gpt-vektorer

Den chimeriske lette kjede (versjon 1) ble fjernet fra pJA143 som et EcoRI-fragment og klonet mn i EcoRI/CIP-behandlet pEEShCMVneo-ekspresjonsvektor til å gi pJA145 Kloner med innskuddet i korrekt orientering ble identifisert ved restriksjonskartlegging

Den chimeriske lette kjede (versjon 2) ble konstruert som beskrevet over Det chimeriske tung kjede gen ble isolert fra pJAl42 som et 2,5 kbp EcoRI/BamHI-fragment og klonet mn i det EcoRI/BclI/CIP-behandlede vektor-fragment av et derivat av pEE6hCMVgpt til å gi plasmid

pJA144

10 2 GS separate vektorer

GS-versjoner av pJAl41 og pJAl44 ble konstruert ved at neo- og gpt-kassettene ble erstattet ved en BamHI/Sall/- CIP-behandling av plasmidene, isolering av vektorfrag-mentet og ligering til et GS-holdig fragment av plasmidet pR04 9 til å gi lett kjede vektoren pJA179 og tung

kjede vektoren pJA180

10 3 GS enkeltvektor-konstruksjon

Enkeltvektor-konstruksjoner som inneholder cL (chimerisk lett), cH (chimerisk tung) og GS-gener på ett plasmid i rekkefølgen cL-cH-GS, eller cH-cL-GS og med transkrip-sjon av genene som er hode til hale("head to tail") f eks cL>cH>GS ble konstruert Disse plasmider ble fremstilt ved at pJA17 9 eller pJA18 0 ble behandlet med BamHI/CIP og ligert i en Bglll/Hmdlll hCMV-promoter-kassett sammen med enten HindIII/BamHT-fragmentet fra pJA14l inn i pJA180 til å gi cH-cL-GS-plasmidet pJA182

eller HindIII/BamHI-fragmentet fra pJA144 mn i pJA179 til å gi cL-cH-GS-plasmidet pJA181

11 Ekspresjon av chimeriske gener

11 1 Ekspresjon i COS-celler

Det chimeriske antistoff-plasmid pJA145 (cL) og pJA144 (cH) ble ko-transfektert inn i COS-celler og supernatant fra transient-ekspresjonsforsøket ble vist til å inneholde sammenstilt ("assembled") antistoff som bandt til den humane T-cellelmje HUT 78 Metabolske merkmgsfor-søk ved anvendelse av <3>SS-methionin viste ekspresjon og sammenstilling av tunge og lette kjeder Mobiliteten av den lette kjede som ses på reduserte geler foreslår imidlertid at det potensielle glykosyleringssete var blitt glykosylert Ekspresjon i COS-celler i nærvær av tunicamycin viste en reduksjon av den lette kjedes størrelse i forhold til den som er vist for kontroll-chimeriske antistoffer og den 0KT3 lette kjede fra mus Derfor ble JA141 konstruert og uttrykt I dette tilfelle viste ikke den lette kjede en varierende mobilitet eller endring av størrelsen i nærvær eller fravær av tunicamycin Denne andre versjon av den chimeriske lette kjede, når den uttrykkes sammen med chimerisk tung (cH) kjede, dannet antistoff som viste god binding til HUT 78-celler I begge tilfeller var antigenbinding

ekvivalent med den for museantistoffet

11 2 Ekspresjon i ovarie (CHO) celler fra kinesisk hamster Stabile cellelinjer er fremstilt fra plasmidet pJA14l/pJA144 og fra pJA179/pJA18 0, pJAI81 og pJA182 ved transfeksjon mn i CHO-celler

12 CDR- podmg

Den metode som anvendes var et forsøk på å innføre tilstrek-kelige muserester mn i et humant variabel region rammeverk for å danne antigen-bindmgsaktivitet som var sammenlignbar med museantistoffene og de chimeriske antistoffene 12 1 Analyser av den variable region

Fra en undersøkelse av en liten database av strukturer av antistoffer og antigen-antistoff-komplekser er det klart at kun et lite antall antistoffrester er i direkte kontakt med antigenet Andre rester kan bidra til antigen binding ved plassering av kontaktrestene i ønskelige konfigurasjoner og også ved å indusere en stabil sammenfolding av de mviduelle variable domener og stabil interaksjon av de variable domener i den lette og tunge kjede De rester som velges for overføring kan identi-fisering på en rekke måter (a) Ved eksaminasjon av antistoff røntgenkrystall-strukturer kan antigen-bindmgsoverflaten i alt vesentlig lokaliseres på en rekke sløyfer, tre pr domene, som strekker seg fra B-"barrel" rammeverket (b) Ved analyse av variabelt domene sekvenser av antistoffet kan hypervariable regioner {betegnet "the Complementary Determining Region's" (CDR<1>er) av Wu og Kabat (referanse 5)) identifiseres I de fleste, men ikke alle tilfeller tilsvarer disse CDR'er, men strekker seg litt utenfor, de overnevnte sløyferegioner (c) Rester som ikke identifiseres ved (a) og (b) kan bidra til antigenbinding direkte eller indirekte ved at de påvirker topologien i antigenbmdmgssetet, eller ved at de induserer en stabil sammenfolding av de individuelle variable domener og en stabilisering av den

inter-variable domeneinteraksjon Disse rester kan enten identifiseres ved at sekvensene for et visst antistoff legges oppå en kjent struktur og man ser på nøkkelrester for deres bidrag, eller ved sekvens-oppstillmgsanalyser i det man merker seg "idiosyn-kratiske" rester med etterfølgende undersøkelse av

deres strukturelle lokalisering og lignende effekter 12 1 1 Lett kjede

Fig 3 viser en oppstilling av sekvenser for den humane rammeverkregion REI og den 0KT3-variable region i den lette kjede De strukturelle sløyfer (LOOP) og CDR'er (Kabat) som man antar svarer til antigen-bmdingsregionen er markert En rekke andre rester som også eventuelt bidrar til antigenbinding som beskrevet i 13 l(c) er også markert Over sekvensene i fig 3 indikerer resttypen den romlige lokalisering av hver rest-sidekjede, utledet ved eksaminasjon av oppløste strukturer fra røntgenkrystallografi-analyser Nøkkelen til denne rest-type-angivelse er som følger N - nær CDR (Fra røntgenstrukturer)

P - Sammenfolding B - Begravet ikke-sammenfolding

S - Overflate E - Synlig

I - Grenseflate <*> - Grenseflate

- Sammenfolding/Synlig del

- Ikke-CDR-rester som kan være nødvendig å etterlate som musesekvens

De rester som er understreket i fig 3 er aminosyrer REI ble valgt som det humane rammeverk fordi den lette kjede er en kappa-kjede og de kappa-variable regioner viser større homologi med musesekvensene enn en lambda lett kjede variabel region f eks KOL (se under) REI ble valgt fremfor en annen kappa lett kjede fordi røntgenstrukturen av den lette kjede har vært bestemt slik at en struktur-undersøkelse av de individuelle rester vil kunne gjennom-føres

12 1 2 Tung kjede

Likeledes viser fig 4 en sammenstilling av sekvenser for den humane rammeverkregion KOL og den 0KT3 variable region i den tunge kjede De strukturelle sløyfer og CDR'er som antas å korrespondere med antigen-bmdmgsregionen er markert En rekke andre rester som også kan bidra til antigenbinding er markert, som beskrevet i 12 l(c) Nøkkel-resttypen og andre indikatorer som anvendes i fig 4 er de samme som dem som ble anvendt i fig 3 KOL ble valgt som tung kjede rammeverket fordi røntgenstrukturen er blitt bestemt til en bedre oppløsning enn f eks NEWM og sekvensoppstillmgen av den 0KT3 variable region i den tunge kjede viste en noe bedre homologi med KOL enn med

NEWM

12 2 Utforming av variable gener

Variabel region domenene ble utformet med anvendelse av variabel region optimal kodon fra mus (Grantham og Perrm (referanse 15)) og ved anvendelse av B72 3 signalsekvenser (Whittle et al (referanse 13)) Sekvensene ble utformet til å festes til den konstante region på samme måte som for de overnevnte chimeriske gener Enkelte sammenstillinger inneholdt "Kozak Konsensus-sekvensen" (Kozak (referanse 16)) direkte bundet til 5' av signalsekvensen i genet

Dette sekvensmotiv antas å spille en viktig rolle i trans-lasjonsinitiermg i eukaryoter

12 3 Genkonstruksjon

For å bygge de variable regioner er forskjellige strategier tilgjengelig Sekvensen kan sammenstilles ved anvendelse av oligonukleotider på en lignende måte som hos Jones et al (referanse 17) eller ved samtidig erstatning av alle CDR'er eller sløyferegioner ved oligonukleotid-rettet setespesi-fikk mutagenese på samme måte som i henhold til Verhoeyen et al (referanse 2) Begge strategier ble anvendt og en liste over konstruksjoner er angitt i tabellene 1 og 2 og i fig 4 og 5 I en rekke tilfeller ble det notert at mutagenese-metoden førte til delesjoner og rearrangementet i genet som remodelleres, mens en vellykket sammenstilling var meget følsom med hensyn til kvaliteten av oligonukleotidene

13 Konstruksjon av ekspresjonsvektorer

Gener ble isolert fra M13- eller SP65-baserte intermediære vektorer og klonet inn i pEE6hCMVneo for de lette kjeder og pEE6hCMVgpt for de tunge kjeder på samme måte som for de overnevnte chimeriske gener

Bemerk

i u - ikke utført

SDM - Seterettet mutagenese

Gensammenstillmg - Variabel region sammenstilt helt fra

oligonukleotider

Delvis gen- - Variabel region sammenstilt ved kombma-s ammens tilling sjon av restriksjonsf ragmenter enten fra andre gener som opprinnelig er dannet ved hjelp av SDM og gensammenstillmg eller ved oligomikleotid-sammenstilling av en del av den variable region og rekonstrux.-sjon med restriksjonsfragmenter fra andre gener som opprinnelig er dannet ved hjelp av SDM og gensammenstillmg

14 Ekspresjon av CDR- podede gener

14 1 Fremstilling av antistoff bestående av podede lette (gli) kjeder med tunge (mH) kjeder fra mus eller chimeriske tunge (cH) kjeder

Alle gL-kjeder i forening med mH eller cH ga rimelige mengder antistoff Innskudd av Kozak-konsensus-sekvensen i en posisjon 5' til ATG (kgL-konstrukter) førte imidlertid til en 2 - 5 dobbel forbedring i netto ekspresjon Over en omfattende serie med forsøk ble ekspresjonsnivåene økt fra omtrent 200 ng/ml til omtrent 50 0 ng/ml for kgL/cH- eller kgL/mH-kombinasjoner

Når den direkte binding til antigen på HUT 78-celler ble målt, førte et konstrukt som var utformet til å inkludere musesekvens basert på sløyfelengde (gLl2l) ikke til aktivt antistoff i forening med mH eller cH Et konstrukt utformet til å inkludere musesekvens basert på Kabat CDR'er (gL221) viste noe svak binding i fore-ning med mH eller cH Når rammeverkrester 1, 3, 46, 47 imidlertid ble forandret fra de humane til de murine 0KT3-ekvivalenter basert på de argumenter som er angitt i avsnitt 12 1, ble det vist antigen binding når begge de nye konstrukter, som ble betegnet 12IA og 22IA var ko-uttrykt med cH Når virkningen av disse rester ble undersøkt mer detaljert, fremkom det at rester 1 og 3 ikke er viktige medvirkende rester da produktet av gL221B-genet viser liten påvisbar bindingsaktivitet sammen med cH Lett kjede produktet av gL221C, hvor musesekvenser er tilstede i 46 og 47, viser god bindingsaktivitet i forening med cH

14 2 Fremstilling av antistoff bestående av podede tunge (gH) kjeder med lette (mL) kjeder fra mus eller chimeriske lette (cL) kjeder

Ekspresjon av gH-genene viste seg å være vanskeligere å oppnå enn for gL For det første viste det seg at inklu-dering av Kozak-sekvensen ikke hadde noen markert virkning på ekspresjon av gH-gener Ekspresjonen synes å være noe forbedret, men ikke i samme grad som man ser for den podede lette kjede

Det viste seg også å være vanskelig å demonstrere fremstilling av forventede mengder material når sløyfevalget {aminosyre 26-32) for CDRl anvendes , f eks gH121, 131, 141 og man kan ikke trekke noen konklusjoner i forbindelse med disse konstrukter

Ko-ekspresjonen av gH341-genet med cL eller mL har dessuten variert og har hatt en tendens til å danne mindre mengder antistoff enn cH/cL- eller mH/mL-kombinasjoner Endringene til gH341 for å danne gH341A og gH341B førte til forbedrede ekspresjonsnivåer

Dette kan enten skyldes en generell økning i musesekvens- fraksjonen i den variable region, eller endrin-gen i posisjonen 63 hvor resten er bragt tilbake til den humane aminosyre valin (Val) fra fenylalanin {Phe) for å unngå mulige interne sammenfoldingsproblemer med resten av det humane rammeverk Dette arrangement forekommer også i gH33l og gH321

Når gH3 2l eller gH331 ble uttrykt i forening med cL, ble det dannet antistoff, men antistoff-bindingsaktivitet ble ikke påvist Når det mer konservative gH341-gen ble anvendt kunne antigen binding påvises sammen med cL eller mL, men aktiviteten var akkurat like over bakgrunnsnivået Når ytterligere muserester ble substituert basert på argumentene i 12 1, kunne antigen binding klart demonstreres for antistoffet som var dannet når

kgH341A og kgH34lB ble uttrykt i forening med cL

14 3 Fremstilling av fullstendig CDR-podet antistoff kgL221A-genet ble uttrykt sammen med kgH341, kgH341A eller kgH341B For kombinasjonen kgH221A/kgH341 ble det dannet svært lite material i en normal COS-celleekspre-sjon For kombinasjonene kgL221A/kgH341A eller kgH22lA/- kgH341B ble det dannet antistoffmengder som var tilsvarende dem for gL/cH

I flere forsøk kunne ingen antigen-bmdingsaktivitet påvises med kgH221A/gH341 eller kgH221A/kgH341-kombinasjoner, skjønt ekspresjonsnivåene var svært lave Antigen binding ble påvist når kgL221A/kgH341A eller kgH22lA/kgH34IB-kombinasjoner ble uttrykt Når antistoffet var dannet fra kombinasjonen kgL22lA/kgH3 41A var antigen bindingen svært lik den for det chimeriske antistoff

En analyse av de overnevnte resultater er gitt i det etterfølgende 15 Diskusjon i forbindelse med resultatene fra CDR- poding I utformingen av det fullstendige humaniserte antistoff var målet å overføre det minimale antall muse-aminosyrer som vil gi antigen binding på et humant antistofframmeverk 15 1 Lett kjede

15 1 1 Omfanget av CDR'ene

For den lette kjede er de regioner som definerer sløyfene og som er kjent fra strukturstudier for andre antistoffer til å inneholde antigen-kontaktrester, og de hypervariable sekvenser som er definert av Kabat et al (referanser 4 og 5) som "Comple-mentarity Determining Regions" (CDR<1>er), ekvivalente for CDR2 For CDRl strekker den hypervariable region seg fra rester 24 til og med 34 mens den strukturelle sløyfe strekker seg fra 2 6 til og med 32 Når det gjelder 0KT3 er der kun en aminosyre som er forskjellig mellom de to valg, ved aminosyre 24, hvor musesekvensen er et serin og den humane struktur REI har glutamin For CDR3 strekker sløyfen seg fra rest 91 til og med 96 mens Kabat hypervariabiliteten strekker seg fra rester 89 til og med 97 For 0KT3, er aminosyrer 89, 90 og 97 de samme mellom OKT3 og REI (fig 3) Når konstrukter basert på sløyfevalget for CDRl (gLi2i) og Kabat-valget (gL22l) ble gjen-nomført og uttrykt sammen med mH eller cH, fant man intet bevis for antigen bindingsaktivitet for gL12l, men spor av aktivitet kunne påvises for gL22l, noe som foreslår at en enkelt ekstra muserest i den podede variable region kunne ha noen påvisbar

effekt Begge genkonstrukter var rimelig godt uttrykt i det transiente ekspresjonssystem

15 1 2 Rammeverkrester

De gjenværende rammeverkrester ble deretter ytterligere undersøkt, særlig aminosyrer som var kjent fra røntgenanalyser av andre antistoffer til å være nær CDR• ene og også de aminosyrer som i 0KT3 viste forskjeller fra konsensus-rammeverket for musesub-gruppen (subgruppe VI) hvortil 0KT3 viser mest homologi Fire posisjoner l, 3, 46 og 47 ble identifisert og deres eventuelle bidrag ble undersøkt ved at den humane aminosyre ble erstattet med aminosyren fra mus i hver posisjon Derfor ble gL221A (gL221 + D1Q, Q3V, L46R, L47W, se fig 3 og tabell 1) dannet, klonet i EE6hCMVneo og ko-uttrykt med cH (pJA144) Det resulterende antistoff var godt ko-uttrykt og viste god bindingsaktivitet Når de relaterte gener gL221B (gL221 + D1Q, Q3V) og gL221C (gL221 + L46R, L47W) ble dannet og likeledes testet, mens begge gener dannet antistoff når ko-uttrykt med cH, viste kun gL221C/cH-kombinasjonen god antigen binding Når gL121A (gL121 + D1Q, Q3V, L46R, L47W) genet ble dannet og ko-uttrykt med cH, ble det dannet antistoff som også bandt til antigenet

15 2 Tung kjede

15 2 1 Omfanget av CDR'ene

For den tunge kjede var analyser av sløyfen og hypervariabilitet kun overenstemmende i CDR3 For CDRl strakk sløyferegionen seg fra rester 26 til og med 32 mens Kabat-CDR strakk seg fra rester 31 til og med 3 5 For CDR2 er sløyferegionen fra 5 0 til og med 58 mens den hypervariable region dekker aminosyrer 50 til og med 65 De humaniserte tunge kjeder ble derfor konstruert ved anvendelse av rammeverket fra antistoff KOL og med forskjellige kombinasjoner av disse CDR-valg, inkluderende et kortere valg for CDR2 av 50 til og med 56 idet der var noe usikkerhet når det gjaldt definisjonen av endepunktet for CDR2-sløyfen rundt rester 56 til 58 Genene ble ko-uttrykt initialt med mL eller cL Når det gjaldt gH-genene med sløyfevalg for CDRl f eks gH121/ gH131, gH141, ble det dannet svært lite antistoff i kultur-supernatantene Da det ikke ble påvist noen fri lett kjede ble det antatt at antistoffet var dannet og sammenstilt inne i cellen, men at den tunge kjede på en eller annen måte var avvikende, eventuelt ukorrekt foldet, og derfor ble antistoffet nedbrutt internt I enkelte forsøk kunne spormengder av antistoff påvises i studier hvor det ble anvendt merking med <35>S

Da intet netto antistoff ble dannet, ble analyser av disse konstrukter ikke videreført ytterligere

Når en kombinasjon av sløyfevalget og Kabat-valget for CDRl imidlertid ble testet (muse-aminosyrer 26 til og med 35) og hvor rester 31 (Ser til Arg),

33 (Ala til Thr) og 3 5 (Tyr til His) ble endret fra

humane rester til muserester og sammenlignet med den første serien, ble antistoff dannet for gH321, kgH331 og kgH341 når ko-uttrykt med cL Ekspresjonen var generelt liten og kunne ikke forbedres særlig ved innskudd av Kozak-konsensus-sekvensen 5' til ATG i signalsekvensen av genet, til forskjell fra tilfellet med gL-genene hvor et slikt innskudd førte til en 2 - 5 dobbel økning i netto antistoffproduk-sjon Kun i tilfellet med gH341/mL eller kgH34l/cL kunne imidlertid marginal antigen bindingsaktivitet demonstreres Når kgH341-genet var uttrykt sammen med kgL221A, var nettoutbyttet av antistoff alt for lavt til å gi et signal over bakgrunnsnivået i antigen-bindingsforsøket

15 2 2 Rammeverkrester

Som i tilfellet med den lette kjede ble rammeverkene av den tunge kjede undersøkt på nytt Muligens pga den mindre opprinnelige homologi mellom de variable domener i den humane tunge kjede og den tunge kjede fra mus sammenlignet med de lette kjeder, viste det seg at flere ammosyrepo si sjoner var av interesse To gener kgH341A og kgH341B ble konstruert, hvor henholdsvis 11 eller 8 humane rester var erstattet av muserester sammenlignet med gH341, og med CDR2-resten 63 tilbake til den humane aminosyre eventuelt for å forbedre domene-sammenfolding Begge viste antigen binding når de ble kombinert med cL eller kgL221A, idet kgH341A-genet med alle 11 forandringer viste seg å være et overlegent valg

15 3 Foreløpelige konklusjoner

Det har derfor blitt demonstrert for 0KT3 at for å over-føre antigen bindingsevne til det humaniserte antistoff, vil muserester utenfor CDR-regionene som definert ved Kabat-hypervariabilitet eller strukturelle sløyfevalg kreves for både de lette og tunge kjeder Færre ekstra rester behøves for den lette kjede, noe som eventuelt skyldes den større initiale homologi mellom de variable humane kappa-regioner og dem fra mus

Av forandringene, er syv (1 og 3 fra den lette kjede og 6, 23, 71, 73 og 76 fra den tunge kjede) forutsagt ut fra kjennskap til andre antistoff-strukturer til å være enten delvis eksponert eller på antistoff-overflaten Det er her blitt vist at rester 1 og 3 i den lette kjede ikke absolutt nødvendigvis må være musesekvensen, og for den tunge kjede dannet den gH34lB-tunge kjede i kombinasjon med den 22IA-lett kjede kun svak bindingsaktivitet Tilstedeværelse av 6, 23 og 24 forandringene er derfor viktige for å opprettholde en bmdingsaffmitet som er lik den for det munne antistoff Det var derfor viktig å ytterligere studere det individuelle bidrag fra åtte andre muserester av kgH341A-genet sammenlignet med kgH341

16 Ytterligere CDR- podingsforsøk

Ytterligere CDR-podede tung kjede gener ble i alt vesentlig fremstilt som beskrevet over Med henvisning til tabell 2 var de ytterligere gener for den tunge kjede basert på gH341 (plasmid pJA178) og gH341A (plasmid pJA185) med enten mus-0KT3 eller humane KOL-rester 16, 23, 24, 48, 49, 63, 71, 73, 76, 78, 88 og 91 som indikert De CDR-podede lett kjede gener som ble anvendt 1 disse ytterligere forsøk var gL221, gL22lA, gL22lB og gL221C som beskrevet over

Munne rester er understreket

De CDR-podede tung og lett kjede gener var ko-uttrykt i COS-celler, enten med hverandre i forskjellige kombinasjoner, men også med de tilsvarende munne og chimeriske tung og lett kjede gener, i alt vesentlig som beskrevet over De oppnådde antistoffprodukter ble deretter analysert i bindings- og blokkermgsanalyser med HPB-ALL-celler som beskrevet over

Resultatene fra forsøkene i forbindelse med de forskjellige podede tunge kjeder ko-uttrykt med den gL221C-lette kjede er gitt i figurene 7 og 8 (for JA184, JA185, JA197 og JA198 sammenstillingene - se tabell 2), i fig 9 (for JA183, JA184, JA185 og JA197 sammenstillingene) i fig 10 (for de chimeriske JA185, JA199, JA204, JA205, JA207, JA208 og JA209 sammenstillinger) og i fig 11 (for JAIB3, JA184, JA185, JA198, JA203, JA205 og JA206 sammenstillingene)

Det basis-podede produkt uten forandringer fra human til munn i de variable rammeverk, dvs gL221 uttrykt sammen med gH341 (JA178), og også det "fullstendig podede" produkt som mest har humane til munne forandringer i rammeverket av den podede tunge kjede, dvs gL221C ko-uttrykt med gH34lA (JA185), ble målt for relativ bmdmgsaf f mitet i et konkurrerende forsøk mot munn 0KT3-referansestandard ved anvendelse av HPB-ALL-celler Forsøket som anvendes var som beskrevet over i avsnitt 3 3 De oppnådde resultater er gitt i fig 12 for det basis-podede produkt og fig 13 for det fullstendig podede produkt Disse resultater indikerer at det basis-podede produkt hadde ubetydelig bindmgsevne sammenlignet med 0KT3 munn referansestandard, mens det "fullstendig podede" produkt hadde en bmdingsevne som er svært lik den for den 0KT3 munne referansestandard

Bindings- og blokkeringsforsøksresultatene indikerer følgende

JA198- og JA207-sammenstillingene synes å ha de beste bindmgsegenskaper og tilsvarende bindingsevner, som begge i alt vesentlig er de samme som for de chimeriske og fullstendig podede gH34IA-produkter Dette indikerer at posisjoner 88 og 91 og posisjon 76 ikke er særdeles kritiske for oppretthol-deise av 0KT3-bindmgsevnen, mens minst noen av posisjonene 6, 23, 24, 48, 49, 71, 73 og 78 er svært viktige

Dette er et resultat av det funn at JA209 og JA199, skjønt de har lignende bmdmgsevne til hverandre, har mindre bindingsevne enn JA198- og JA207-sammenstillingene Dette indikerer viktigheten med å ha muserester i posisjonene 71, 73 og 78, som er enten helt eller delvis human i henholdsvis JAI99- og JA209-sammenstillingene

Ved sammenligning av resultatene oppnådd for JA205- og JA183-sammenstillmgene ses det dessuten at det er en reduksjon i binding fra JA205- til JA183-sammenstillingene Dette indikerer viktigheten av å beholde en muserest i posisjon 23, den eneste posisjon som er forandret mellom JA2 05 og JA183

Disse og andre resultater fører til den konklusjon at av de elleve muse-rammeverkrester som anvendes i gH34lA (JA185) sammenstillingen, er det viktig å beholde muserester i alle posisjoner 6, 23, 24, 48, 49, og eventuelt for maksimal bm-dm<g>saf f mitet i 71, 73 og 78

Tilsvarende forsøk ble gjennomført for å CDR-pode en rekke av gnager-antistoffene inkluderende antistoffer med spesifisitet for CD4 (0KT4), ICAM-1 (R6-5), TAG72 (B72 3), og TNFa (61E71, 101 4, hTNFl, hTNF2 og hTNF3)

EKSEMPEL 2

CDR-poding av et murmt anti-CD4 T-celle receptorantistoff, 0KT4A

Ant1-OKT4A CDR-podede tung og lett kjede gener ble fremstilt, uttrykt og i alt vesentlig testet som beskrevet over i eksempel l for CDR-podet 0KT3 CDR-podmg av 0KT4A er beskrevet detaljert i Ortho patentsøknad PCT/GB90 med samme dato som den foreliggende søknad og med tittelen "Humanised Antibodies" En rekke CDR-podede OKT4-antistoffer er blitt fremstilt Det valgte CDR-podede 0KT4A er kombinasjonen av den podede lette kjede LCDR2 og den podede tunge kjede HCDR10

Den lette kiede

Det humane akseptorrammeverk anvendt for de podede lette kjeder var REI Den foretrukne LCDR2-lette kjede har forandringer fra human til mus i posisjoner 33, 34, 38, 49 og 89 i tillegg til strukturell sløyfe CDR'ene Av disse endrede posisjoner, faller posisjonene 33, 34 og 89 innenfor de foretrukne utstrakte/utvidete CDR'er fremstilt i henhold til oppfinnelsen (posisjoner 33 og 34 i CDRl og posisjon 89 i CDR3) De humane til munne forandringer i posisjoner 38 og 4 9 tilsvarer posisjoner hvor aminosyrerestene foretrukket er donor-murme ammosyrerester

En sammenligning av aminosyresekvensene for det donor-murine variable domene av lett kjede og det REI humane akseptor variable domene av lett kjede viser ytterligere at munne og humane rester er identiske i alle posisjoner 46, 48 og 71 og 1 alle posisjoner 2, 4, 6, 35, 36, 44, 47, 62, 64 - 69, 85, 87, 98, 99, 101 og 102 Aminosyrerestene i posisjon 58 i LCDR2 er imidlertid den humane REI-rammeverkrest og ikke 0KT4-museresten som ville vært foretrukket

Den tunge kjede

Det humane akseptorrammeverk anvendt for de podede tunge kjeder var KOL

Den foretrukne CDR-podede HCDR10-tunge kjede har forandringer fra human til mus i posisjonene 24, 35, 57, 58, 60, 88 og 91 i tillegg til strukturell sløyfe CDR'ene Av disse posisjoner, faller posisjon 35 (CDRl) og posisjoner 57, 58 og 60 (CDR2) innenfor de foretrukne utstrakte CDR'er fremstilt i overensstemmelse med oppfinnelsen Også forandringen fra human til mus i posisjon 24 tilsvarer en posisjon hvor ammosyreresten er en donor-murin rest Forandringer fra human til mus i posisjonene 88 og 91 tilsvarer dessuten til posisjoner hvor aminosyrerestene eventuelt er donor-munne rester

En sammenligning av de munne 0KT4A og humane KOL variable aminosyresekvenser av tung kjede viser at de munne og humane rester er identiske i alle posisjoner 23, 49, 71, 73 og 78 og i alle posisjoner 2, 4, 6, 25, 36, 37, 39, 47, 48, 93, 94, 103, 104, 106 og 107

Således tilsvarer den 0KT4A CDR-podede tunge kjede HCDR10 en særlig foretrukket utførelsesform i forbindelse med den foreliggende oppfinnelse

EKSEMPEL 3

CDR-poding av et anti-mucm spesifikt murint antistoff, B72 3 Kloning av genet som koder for det anti-mucin spesifikke munne monoklonale antistoff B72 3 og fremstillingen av B72 3 mus-humane chimeriske antistoffer er tidligere beskrevet (referanse 13 og WO 89/01783) CDR-podede versjoner av B72 3 ble fremstilt som følger

(a) B72 3 Lett kiede

CDR-podmg av denne lette kjede ble gjennomført ved direkte overføring av de munne CDR'er inn i rammeverket av den humane lette kjede REI De regioner som ble over-ført var

Aktiviteten av den resulterende podede lette kjede ble målt ved ko-ekspresjon i COS-celler, av gener for kombinasjonene

B72 3 CH/B72 3 cL

og B72 3 CH/B72 3 gL

Supernatanter ble målt for antistoffkonsentrasjon og for evnen til å binde til mikrotiterplater som var belagt med mucm De oppnådde resultater indikerte at, i kombinasjonen med B72 3 cH-kjeden, hadde B72 3 cL og B72 3 gL tilsvarende bmdingsegenskaper

Sammenligning av de murine B72 3 og REI aminosyresekvenser av lett kjede viser at restene er identiske i posisjoner 46, 58 og 71 men er forskjellige i posisjonen 48 Således kan forandring av den humane rest til donor-museresten i posisjon 48 ytterligere forbedre bindingsegenskapene av den CDR-podede lette kjede, (B72 3 gL) fremstilt i overensstemmelse med den foreliggende oppfinnelse

(b) B72 3 Tung kjede

i Valg av rammeverk

Det var først nødvendig å gjøre et valg med hensyn til humant rammeverk Spørsmålet var som følger var det nødvendig å anvende rammeverkregionene fra et antistoff hvis krystallstruktur var kjent eller kunne valget gjøres på bakgrunn av andre kriterier''

For B72 3 tung kjede ble det resonert at, mens kunn-skap vedrørende struktur var viktige, kunne overføring av CDR'ene fra mus til humane rammeverk forenkles dersom den totale homologi mellom donor- og resep-tor r amme verkene maksimeres Sammenligning av B72 3 tung kjede sekvensen med dem i Kabat (referanse 4) for humane tunge kjeder viste klart at B72 3 hadde dårlig homologi for KOL og NEWM (for hvilke krystallstruktur-er er tilgjengelig), men var svært homolog med den tunge kjede for EU På dette grunnlag, ble EU valgt for CDR-poding og de følgende rester ble overført som CDR'er

Det ble også notert at FR4-regionen i EU var forskjellig fra den i et hvilket som helst annet humant (eller mus) antistoff Følgelig, i genene for podet tung kjede var dette også forandret til å gi en "konsensus" human sekvens (Innledende forsøk viste at podet tung kjede gener som inneholdt EU FR4 sekvensen hadde svært dårlig ekspresjon i transiente ekspresjonssystemer)

li Resultater med podet tung kjede gener

Ekspresjon av podet tung kjede gener som inneholdt alle humane rammeverkregioner med enten gL- eller cL-gener ga et podet antistoff med liten evne til å binde til mucm Det podede antistoff hadde omtrent 1 % av aktiviteten til det chimeriske antistoff I disse forsøk ble det imidlertid bemerket at aktiviteten av det podede antistoff økte til omtrent 10 % av B72 3 ved eksponering for pH verdier fra 2 - 3,5 Denne observasjon tilveiebragte en pekepinn for hvordan aktiviteten av det podede antistoff kunne forbedres uten syrebehandlmg Det ble postulert at syre-eksponering bevirket protonermg av en sur rest (pKa for asparagmsyre = 3,86 og glutammsyre = 4,25 ) som således ga forandring i strukturen av CDR-sløyfene, eller tillot bedre tilgang for antigen For sammenligning av sekvensene av B72 3 (referanse 13) og EU (referansene 4 og 5), var det klart at ved å gå fra muse-rammeverkene til humane rammeverk, hadde kun to posisjoner blitt forandret på en slik måte at sure rester var blitt innført Disse posisjonene er i rester 73 og 81, hvor henholdsvis K til E og Q til E forandringer var blitt gjennomført

Hvilke av disse posisjoner som kunne være viktige ble bestemt ved at krystallstrukturen av KOL-antistoffet ble undersøkt I KOL tung kjede, er posisjon 81 langt fra begge CDR-sløyfene Posisjon 73 er imidlertid nær begge CDR'ene 1 og 3 av den tunge kjede og i denne posisjon var det mulig å tenke seg at en K til E forandring i denne region ville kunne ha en ødeleggende virkning på antigenbinding

lii Rammeverkforandringer i B72 3 gH-genet

På grunnlag av de ovennevnte analyser ble E73 mutert til et lysm (K) Det ble funnet at denne forandring hadde en dramatisk effekt på den evnen som det podede Ab har til å binde seg til mucm Videre, var den evnen som det podede B72 3 har, som dannet ved hjelp av den muterte gH/gL-kombinasjon, til å binde til mucm tilsvarende den for det

B72 3 chimeriske antistoff

LV Andre rammeverkforandringer

Under de ovennevnte forsøk ble det gjennomført andre forandringer i rammeverkregionen i den tunge kjede Innen nøyaktigheten av de anvendte forsøk, synes ingen av forandringene, enten alene eller sammen, å være fordelaktige

v Andre

Alle de anvendte forsøk målte den evnen som det podede Ab har til å binde til mucm og indikerte som et hele at den enkle rammeforandring i posisjon 33 er tilstrekkelig til å danne et antistoff med tilsvarende bindingsegenskaper som B72 3

Sammenligning av B72 3 munne og EU tung kjede sekvenser viste at muserestene og de humane rester er identiske i posisjonene 23, 24, 71 og 78

Således utgjør den muterte CDR-podede B72 3 tunge kjede en foretrukket utførelsesform av den foreliggende oppfinnelse

EKSEMPEL 4

CDR- <p>odmg av et murint anti- ICAM- 1 monoklonalt antistoff Et murint antistoff, R6-5-D6 (EP 0314863) med spesifisitet for mtercellulært adhesjonsmolekyl 1 (ICAM-1) ble CDR-podet som hovedsakelig beskrevet over i de foregående eksempler Dette arbeid er beskrevet mer detaljert i den samtidige patentsøknad, GB patentsøknad nr 9009549 8

Det humane EU-rammeverk ble anvendt som akseptor-rammeverket for både tunge og lette kjeder Det aktuelle CDR-podede antistoff tilveiebringes ved ko-eksepresjon av podet lett kjede gL221A og podet tung kjede gH341D som har en bmdmgsaf fim - tet for ICAM-1 på omtrent 75 % av den for det tilsvarende mus-humane chimeriske antistoff

Lett kjede

gL221A har munne CDR'er i posisjonene 24 - 34 (CDRl), 50 - 56 (CDR2) og 8 9 - 97 (CDR3) I tillegg er også flere rammeverkrester den munne aminosyre Disse rester velges etter overveielse av disse resters mulig bidrag til domene-sammenfolding og stabilitet av komformasjonen av antigen-bindings-regionen Restene som er beholdt som muserester er i posisjoner 2, 3, 48 f), 60, 84, 85 og 87 Sammenligning av de munne anti-ICAM-1 og humane EU lett kjede aminosyresekvenser

viser at de munne og humane rester er identiske i posisjonene 46, 58 og 71

Tuna k-iede

gH341D har munne CDR'er i posisjoner 26 - 35 (CDRl), 50 - 56 (CDR2) og 94 - 10OB (CDR3) I tillegg ble det anvendt munne rester i gH341D i posisjoner 24, 48, 69, 71, 73, 80, 88 og 91 Sammenligning av de munne anti-ICAM-1 og humane EU aminosyresekvenser av den tunge kjede er identiske i posisjoner 23, 49 og 78

EKSEMPEL 5

CDR- poding av munne anti- TNFa- antistof f er

En rekke munne anti-TNFa-monoklonale antistoffer ble CDR-podet som i alt vesentlig beskrevet i de foregående eksempler Disse antistoffer inkluderer de munne monoklonale antistoffer betegnet 61E71, hTNFl, hTNF3 og 101 4 En kort oppsummering av CDR-podmgen av hvert av disse antistoffer er gitt i det etterfølgende

61E71

En tilsvarende analyse som beskrevet over (eksempel 1, avsnitt 12 1) ble gjennomført for 61E71 og for den tunge kjede ble ti rester identifisert i 23, 24, 48, 49, 68, 69, 71, 73, 75 og 88 som rester som eventuelt beholdes som munne De humane strukturer som velges for CDR-poding av dette antistoff, og hTNF3- og 101 4-antistoffene var REI for den lette kjede og KOL for den tunge kjede Det ble dannet tre gener, hvorav det første inneholdt 23, 24, 48, 49, 71 og 73 (gH341(6)) som munne rester Det andre genet hadde også 78 og 88 som munne rester (gh34l(8)) mens det tredje genet ytterligere hadde 68, 69, 75 og 88 som munne rester (gH34l (10)) Hver ble ko-uttrykt med gL221, den minimalt podede lette kjede (bare CDR'er) gL22l/gH341(6) og gl22l/gH341(8) antistoffene bandt begge like godt til TNF som murint 61E71 gL22l/gH341(10) antistoffet uttrykkes ikke og denne kombinasjon ble ikke bragt videre

Deretter ble gL22l/gH341(6) antistoffet vurdert i en L929-celle konkurrerende bestemmelse hvor antistoffet konkurrerer mot TNF-reseptoren på L929-celler for binding til TNF i opp-løsning I dette forsøk var gL221/gH341(6) antistoffet omtrent 10 % så aktivt som murint 61E71

hTNFl

hTNFl er et monoklonalt antistoff som gjenkjenner en epitop på human TNF- Den EU humane struktur ble anvendt for CDR-poding av både tung og lett kjede variable domener

Tung knede

I den CDR-podede tunge kjede (ghTNFl) ble muse-CDR'er anvendt l posisjonene 26 - 35 (CDRl),50-65 (CDR2) og 95 - 102 (CDR3) Muserester ble også anvendt i rammeverket i posisjoner 48, 67, 69, 71, 73, 76, 89, 91, 94 og 108 Sammenligning av TNFl-muse- og EU humane tung kjede rester viser at disse er identiske i posisjoner 23, 24, 29 og 78

Lett knede

I den CDR-podede lette kjede (gLhTNFl) ble muse-CDR'er anvendt i posisjonene 24 - 34 (CDRl), 50-56 (CDR2) og 89 - 97 (CDR3) I tillegg ble muserester anvendt i rammeverkene i posisjoner 3, 42, 48, 49, 83, 106 og 108 Sammenligning av hTNFl-muse- og EU humane lett kjede rester viste at disse er identiske posisjonene 46, 58 og 71

Den podede hTNFl tunge kjede ble uttrykt sammen med den chimeriske lette kjede og produktets bindingsevne ble sammenlignet med den for produktet med chimerisk lett kjede/chimerisk tung kjede i et TNF-bindingsforsøk Produktet med den podede tunge kjede viste seg å ha en bindingsevne for TNF som var noe bedre enn det fullstendige chimeriske produkt

Likeledes ble et produkt av podet tung kjede/podet lett kjede ko-uttrykt og sammenlignet med det fullstendige chimeriske produkt og funnet til å ha nærmest like bindmgsegenskaper som det sistnevnte produkt

hTNF3

hTNF3 gjenkjenner en epitop på human TNF-a Sekvensen av hTNF3 viser kun 21 forskjeller sammenlignet med 61E71 i de variable regioner av den lette og tunge kjede, 10 i den lette kjede (2 i CDR'ene i posisjoner 50, 96 og 8 i rammeverket i 1, 19, 40, 45, 46, 76, 103 og 106) og 11 i den tunge kjede (3 i CDR-regionene i posisjoner 52, 60, 95 og 8 i rammeverket i 1, 10, 38, 40, 67, 73, 87 og 105) De lette og tunge kjeder av de 61E71 og hTNF3 chimeriske antistoffer kan byttes uten tap av aktivitet i det direkte bindingsforsøk 61E71 har

imidlertid mindre evne til å konkurrere med TNF-reseptoren på L929-celler for TNF-a sammenlignet med hTNF3 Basert på 61E71 CDR-podingsdata har gL221 og gH341 (+23, 24, 48, 49, 71 og 73 som mus) gener blitt bygget for hTNF3 og testet og det oppnådde podede antistoff binder godt til TNF-a, men konkurrerer svært dårlig i L929-forsøket Det er mulig at også rammeverk-restene som er identifisert for 0KT3-programmet i dette tilfelle kan forbedre den konkurrerende bmdingsevnen for dette antistoff

101 4

101 4 er et ytterligere murint monoklonalt antistoff som er i stand til å gjenkjenne humant TNF-a Den tunge kjede i dette antistoff viser god homologi til KOL og CDR-podmgen har således blitt basert på REI for den lette kjede og KOL for den tunge kjede En rekke podede gener av den tunge kjede er konstruert med konservative valg for CDR'ene (gH341) og som kun har en eller et lite antall ikke-CDR-rester i stillingene 73, 78 eller 77 til og med 79, som muse-aminosyrene Disse er uttrykt sammen med cL eller gL221 I alle tilfeller ses binding til TNF som er ekvivalent med det chimeriske antistoff og ved ko-ekspresjon med cL er de resulterende antistoff i stand til å konkurrere godt i L929-forsøket Med gL221 er imidlertid de resulterende antistoffer minst en størrelses-orden mindre i stand til å konkurrere for TNF mot TNF-reseptoren på L929-celler

Muserester i andre posisjoner i den tunge kjede, f eks både 2 3 og 2 4 eller i 76 har ikke vist fornedring av den konkurrerende evne for det podede antistoff i L929-forsøket

En rekke andre antistoffer som inkluderer antistoffer med spesifisitet for interleukmer, f eks ILI og cancer-markører som carcmoembryonisk antigen (CEA) f eks det monoklonale antistoff A5B7 (referanse 21), er blitt CDR-podet på en vellykket måte

Referanser

1 Kohler & Milstein, Nature, 2_65, 295-497, 1975.

2 Chatenoud et al, (1986), J. Immunol. 137, 830-838. 3. Jeffers et al, ( 1986), Transplantation, 4JL, 572-578.

4. Begent et al, Br. J. Cancer 6_2: 487 ( 1990).

5. Verhoeyen et al, Science, 239, 1534-1536, 1988

6 Riechmann et al, Nature, 332, 323-324, 1988.

7 Kabat, E.A., Wu, T.T. , Reid-Miller, M., Perry, H.M., Gottesman, K.S., 1987, in Sequences of Proteins of Innnunological Intereat, US Department of Health and Human Services, NIH, USA. 8 Wu, T T., and Kabat, E A , 1970, J. Exp. Med 132 211-250 9 Queen et al, (1989), Proe Nati. Acad. Sei USA, 86, 10029-10033 and WO 90/07861 10 Maniatis et al, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, New Yorx, 19B9 11 Prunrose and Old, Principles of Gene Manipulation, Blackwell, Oxford, 1980 12. Sanger, F , Nicklen, S , Coulson, A R , 1977, Proe Nati Acad. Sei USA, 74_ 5463 13 Kramer, W , Drutsa, V , Jansen, H.-W , Kramer, 3 , Plugfelder, M , Fritz, H.-J , 1984, Nucl Acids Res 12, 9441 14 Whittle, N., Adair, J., Lloyd, J.C., Jenkins, E , Devine, J., Schlom, J., Raubitshek, A. r Colcher, D., Bodmer, M., 1987, Protein Engineering 1, 499 15. Sikder, S.S., Akolkar, P N., Kaledas, P.M., Morrison, S.L., Kabat, E.A., 1985, J. Immunol. 135, 4215.

16 Wallick, S C, Kabat, E.A., Morrison, S.L., 19B8,

J. Exp. Med. _168, 109 9

17 Bebbmgton, C R , Published International Patent Application WO 89/01036.

18. Granthan and Pemn 1986, Immunology Today 7, 160

19 Kozak, M., 19B7, J Mol. Biol. 196, 947

20 Jones, T.P , Dear, P H , Foote, J., Neuberger, M S , Wmter, G , 1986, Nature, 321, 522

21 Harvood et al, Br J Cancer, 54, 75-82 (1986)

Claims (9)

1 Fremgangsmåte for fremstilling av et terapeutisk aktivt CDR-podet antistoffmolekyl omfattende en tung kjede og/eller 5 en lett kjede med et variabel region domene omfattende akseptor-rammeverk og donor-antigenbindende regioner hvor rammeverket av den tunge kjede omfatter donorrester i minst en av posisjonene 6, 23 og/eller 24, 48 og/eller 49, 71 og/eller 73, 75 og/eller 76 og/eller 78 og 88 og/eller 91, og 10 hvor rammeverket av den lette kjede omfatter donorrester i minst en av posisjonene 1 og/eller 3 og 46 og/eller 47, med den betingelse at det CDR-podede antistoff ikke binder p55 Tac proteinet av IL-2 reseptoren karakterisert ved at det benyttes en 15 rekombinant genteknologisk fremgangsmåte

2 Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at den tunge kjede omfatter donorrester i posisjonene 23, 24, 49, 71, 73 og 78 20 eller i posisjonene 23, 24 og 49

3 Fremgangsmåte som angitt i krav 1 og 2, karakterisert ved at den lette kjede omfatter donorrester i posisjonene 46 og 47 25

4 Fremgangsmåte som angitt i ett eller flere av de foregående krav, karakterisert ved at rammeverket av den lette kjede omfatter donorrester i minst en av posisjonene 30 46, 48, 58 og 71

5 Fremgangsmåte som angitt i krav 4, karakterisert ved at den lette kjede omfatter donorrester i posisjonene 46, 48, 58 og 71 35

6 Fremgangsmåte som angitt i ett eller flere av de foregående krav, karakterisert ved at antistoffmolekylet omfatter minst en CDR-podet tung kjede og minst en CDR-podet lett kjede5

7 Fremgangsmåte som angitt i ett eller flere av de foregående krav, karakterisert ved at antistoffmolekylet omfatter humane akseptorrester og ikke-humane donorrester10

8 DNA-molekyl, karakterisert ved at en DNA-sekvens som koder for antistoffmolekylet fremstilt ifølge ett eller flere av kravene 1 - 7 er i kombinasjon med translasjons-, transkripsjons- og reguleringssekvenser 15

9 Klonings- eller ekspresjonsvektor, karakterisert ved at den inneholder DNA-sekvensen som angitt i krav 820 10 Vertscelle, karakterisert ved at den er transformert med et DNA-molekyl som angitt i krav 8, og som er i stand til å uttrykke DNA-sekvensen