JP2002537769A - ヒトエンドカインαおよび使用方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、サイトカインの腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリーの新規のメンバーに関する。特に、エンドカインαタンパク質をコードする単離された核酸分子を提供される。エンドカインαポリペプチドもまた提供され、ベクター、宿主細胞およびそれらを産生するための組換え方法も同様に提供される。ＴＮＦファミリー関連障害に関する診断方法および治療方法もまた、提供される。この方法は、エンドカインαポリペプチドの治療有効量を個体に投与する工程、またはエンドカインαアンタゴニストの治療有効量を個体に投与する工程を包含する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （発明の背景） （発明の分野） 本発明は、サイトカインの腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリーの新規なメンバ
ーに関する。より詳細には、エンドカインαタンパク質をコードする単離された
核酸分子が提供される。エンドカインαポリペプチドを産生するための、ベクタ
ー、宿主細胞および組換え方法もまた提供される。ＴＮＦファミリー関連障害に
関する診断方法および治療方法もまた提供される。

【０００２】 （関連分野） 腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦα；カケクチンとも称される）は、エンドトキシン
、または１７ｋＤタンパク質サブユニットの溶解性ホモ三量体のような他の刺激
の応答において単球およびマクロファージによって主に分泌されるタンパク質で
ある（Ｓｍｉｔｈ， Ｒ．Ａ．ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６２：６
９５１−６９５４（１９８７））。ＴＮＦの膜結合２６ｋＤ前駆体形態もまた記
載されている（Ｋｒｉｅｇｌｅｒ， Ｍ．ら、Ｃｅｌｌ ５３：４５−５３（１
９８８））。

【０００３】 蓄積した証拠は、ＴＮＦが多面的な生物学的活性を有する調節性サイトカイン
であることを示す。これらの活性には以下が含まれる：リポタンパク質リパーゼ
合成（「カケクチン」活性）の阻害（Ｂｅｕｔｌｅｒ， Ｂ．らＮａｔｕｒｅ
３１６：５５２（１９８５））、多形核白血球の活性化（Ｋｌｅｂａｎｏｆｆ，
Ｓ．Ｊ．ら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３６：４２２０（１９８６）；Ｐｅ
ｒｕｓｓｉａ， Ｂら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３８：７６５（１９８７）
）、細胞増殖の阻害または細胞増殖の刺激（Ｖｉｌｃｅｋ， Ｊ．ら、Ｊ． Ｅ
ｘｐ． Ｍｅｄ． １６３：６３２（１９８６）；Ｓｕｇａｒｍａｎ， Ｂ．
Ｊ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：９４３（１９８５）；Ｌａｃｈｍａｎ， Ｌ
．Ｂ．ら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３８：２９１３（１９８７））、特定の
形質転換細胞型における細胞傷害性活性（Ｌａｃｈｍａｎ， Ｌ．Ｂ．ら、前出
；Ｄａｒｚｙｎｋｉｅｗｉｃｚ， Ｚ．ら、Ｃａｎｃ． Ｒｅｓ． ４４：８３
（１９８４））、抗ウイルス活性（Ｋｏｈａｓｅ， Ｍ．ら、Ｃｅｌｌ ４５：
６５９（１９８６）；Ｗｏｎｇ， Ｇ．Ｈ．Ｗ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３２３：８
１９（１９８６））、骨再吸収刺激（Ｂｅｒｔｏｌｉｎｉ， Ｄ．Ｒ．ら、Ｎａ
ｔｕｒｅ ３１９：５１６（１９８６）；Ｓａｋｌａｔｖａｌａ， Ｊ．， Ｎ
ａｔｕｒｅ ３２２：５４７（１９８６））、コラゲナーゼおよびプロスタグラ
ンジンＥ２産生の刺激（Ｄａｙｅｒ， Ｊ．−Ｍ．ら、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ
． １６２：２１６３（１９８５））；および免疫調節作用（Ｔ細胞（Ｙｏｋｏ
ｔａ， Ｓ．ら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４０：５３１（１９８８））、Ｂ
細胞（Ｋｅｈｒｌ， Ｊ．Ｈ．ら、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １６６：７８６
（１９８７））、単球（Ｐｈｉｌｉｐ， Ｒ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３２３：８６
（１９８６））、胸腺細胞（Ｒａｎｇｅｓ， Ｇ．Ｅ．ら、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍ
ｅｄ． １６７：１４７２（１９８８））の活性化、ならびに主要組織適合性複
合体（ＭＨＣ）クラスＩおよびクラスＩＩ分子の細胞表面発現の刺激（Ｃｏｌｌ
ｉｎｓ， Ｔ．ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ
８３：４４６（１９８６）；Ｐｕｊｏｌ−Ｂｏｒｒｅｌ， Ｒ．ら、Ｎａｔｕｒ
ｅ ３２６：３０４（１９８７））を含む）。

【０００４】 ＴＮＦは、以下のような組織創傷を生じるそのプロ炎症性作用について示され
ている：血管内皮細胞における凝血促進活性の誘導（Ｐｏｂｅｒ， Ｊ．Ｓ．ら
、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３６：１６８０（１９８６））、好中球およびリ
ンパ球の増強した接着（Ｐｏｂｅｒ， Ｊ．Ｓ．ら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．
１３８：３３１９（１９８７））、ならびにマクロファージ、好中球、および血
管内皮細胞からの血小板活性化因子の放出の刺激（Ｃａｍｕｓｓｉ， Ｇ．ら、
Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １６６：１３９０（１９８７））。

【０００５】 最近の証拠は、ＴＮＦを、多くの感染（Ｃｅｒａｍｉ， Ａ．ら、Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ． Ｔｏｄａｙ ９：２８（１９８８））、免疫障害、腫瘍性症状（例えば
、いくつかの悪性を伴う悪液性における）（Ｏｌｉｆｆ． Ａ．ら、Ｃｅｌｌ
５０：５５５（１９８７））の病原体、ならびに自己免疫症状および移植片対宿
主症状（Ｐｉｇｕｅｔ， Ｐ．−Ｆ．ら、Ｊ． Ｅｃｐ． Ｍｅｄ． １６６：
１２８０（１９８７））に関連づける。ガンおよび感染症状とのＴＮＦの関連は
、しばしば宿主代謝状態に相関する。ガン患者の主な問題は体重の減少であり、
通常摂食障害と関連する。生じる大規模な衰弱は、「悪液質」として知られる（
Ｋｅｒｎ， Ｋ．Ａ．ら、Ｊ． Ｐａｒｅｎｔ． Ｅｎｔｅｒ． Ｎｕｔｒ．
１２：２８６−２９８（１９８８））。悪液質は、進行性の体重減少、摂食障害
、および悪性増殖の応答における体重の持続性衰退を含む。従って、悪液性状態
は顕著な死亡率と関連し、そして多数のガン死亡率の原因である。多数の研究が
、ＴＮＦが、ガン、感染症状、および他の代謝性状態における悪液質の重要なメ
ディエーターであることを示唆している。

【０００６】 ＴＮＦは、発熱、倦怠感、摂食障害、および悪液質を含む、グラム陰性敗血症
およびエンドトキシン性ショック（Ｍｉｃｈｉｅ， Ｈ．Ｒ．ら、Ｂｒ． Ｊ．
Ｓｕｒｇ． ７６：６７０−６７１（１９８９）；Ｄｅｂｅｔｓ， Ｊ． Ｍ
． Ｈ．ら、Ｓｅｃｏｎｄ， Ｖｉｅｎｎａ Ｓｈｏｃｋ Ｆｏｒｕｍ， ４６
３−４６６頁（１９８９）；Ｓｉｍｐｓｏｎ， Ｓ． Ｑ．ら、Ｃｒｉｔ． Ｃ
ａｒｅ Ｃｌｉｎ． ５：２７−４７（１９８９））の病理生理学的結果におけ
る中心的役割を果たすと考えられている。エンドトキシンは、強力な単球／マク
ロファージアクチベーターであり、これは、ＴＮＦの産生および分泌（Ｋｏｒｎ
ｂｌｕｔｈ， Ｓ．Ｋ．ら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３７：２５８５−２５
９１（１９８６））、ならびに他のサイトカインを刺激する。ＴＮＦは、エンド
トキシンの多くの生物学的効果を模倣し得るので、エンドトキシン関連病の臨床
的徴候に応答可能な中心的メディエーターであると結論付けられた。ＴＮＦおよ
び他の単球誘導性サイトカインは、エンドトキシンに対する代謝性応答および神
経ホルモン性応答を媒介する（Ｍｉｃｈｉｅ， Ｈ．Ｒ．ら、Ｎ． Ｅｎｇ．
Ｊ． Ｍｅｄ． ３１８：１４８１−１４８６（１９８８））。ヒトボランティ
アへのエンドトキシンの投与は、発熱、頻脈、代謝速度の上昇、およびストレス
ホルモン放出を含むインフルエンザ様症状を伴う急病を生じる（Ｒｅｖｈａｕｇ
， Ａ．ら、Ａｒｃｈ． Ｓｕｒｇ． １２３：１６２−１７０（１９８８））
。循環性ＴＮＦの上昇したレベルはまた、グラム陰性敗血症に罹患した患者にお
いて見い出されている（Ｗａａｇｅ， Ａ．ら、Ｌａｎｃｅｔ １：３５５−３
５７（１９８７）；Ｈａｍｍｅｒｌｅ， Ａ． Ｆ．ら、Ｓｅｃｏｎｄ Ｖｉｅ
ｎｎａ Ｓｈｏｃｋ Ｆｏｒｕｍ ７１５−７１８頁、（１９８９）；Ｄｅｂｅ
ｔｓ， Ｊ． Ｍ． Ｈ．ら、Ｃｒｉｔ． Ｃａｒｅ Ｍｅｄ． １７：４８９
−４９７（１９８９）；Ｃａｌａｎｄｒａ， Ｔ．ら、Ｊ． Ｉｎｆｅｃ． Ｄ
ｉｓ． １６１：９８２−９８７（１９９０））。

【０００７】 ＴＮＦの中和に指向される受動的免疫治療は、上記のようにこれらの病理状態
における増大したＴＮＦ産生および上昇したＴＮＦレベルに基づく、グラム陰性
敗血症およびエンドトキシンにおける毒性効果を有し得る。

【０００８】 カケクチン（後にＴＮＦと同一であることが見い出された）として特徴付けら
れた「モジュレーター」物質に対する抗体は、Ｃｅｒａｍｉらによって開示され
た（欧州特許公開０，２１２，４８９、１９８７年３月４日）。このような抗体
は、診断的免疫アッセイにおいて、および細菌性感染におけるショックの治療に
おいて有用であるといわれた。Ｒｕｂｉｎら（欧州特許公開０，２１８，８６８
、１９８７年４月２２日）は、ヒトＴＮＦに対するモニクローナル抗体、このよ
うな抗体を分泌するハイブリドーマ、このような抗体を産生する方法、ならびに
ＴＮＦの免疫アッセイにおけるこのような抗体の使用を開示した。Ｙｏｎｅら（
欧州特許公開０，２８８，０８８、１９８８年１０月２６日）は、抗ＴＮＦ抗体
（ｍＡｂを含む）および症状の免疫アッセイ診断における（特に川崎病の症状お
よび細菌感染）それらの有用性を開示した。川崎病の症状を有する患者の体液（
小児急性熱病粘膜皮膚リンパ節症候群；Ｋａｗａｓａｋｉ， Ｔ．， Ａｌｌｅ
ｒｇｙ １６：１７８（１９６７）；Ｋａｗａｓａｋｉ， Ｔ．， Ｓｈｏｎｉ
ｃａ（Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ）２６：９３５（１９８５））は、症状の進行に関
連して上昇したＴＮＦレベルを有するといわれた（Ｙｏｎｅら、前出）。

【０００９】 他の研究者はインビトロでの活性を中和した組換えヒトＴＮＦに特異的なｍＡ
ｂを記載した（Ｌｉａｎｇ， Ｃ−Ｍ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ
． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍ． １３７；８４７−８５４（１９８６）；Ｍｅａｇｅ
ｒ， Ａ．ら、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ６：３０５−３１１（１９８７）；Ｆｅｎ
ｄｌｙら、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ６：３５９−３６９（１９８７）；Ｂｒｉｎｇ
ｍａｎ， Ｔ．Ｓら、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ６：４８９−５０７（１９８７）；
Ｈｉｒａｉ， Ｍ．ら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈ． ９６：５７−６
２（１９８７）；Ｍｏｌｌｅｒ， Ａ．ら（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ２：１６２−１
６９（１９９０）））。これらのｍＡｂのいくつかは、ヒトＴＮＦのエピトープ
をマッピングし、酵素免疫アッセイを開発する（Ｆｅｎｄｌｙら、前出；Ｈｉｒ
ａｌら、前出；Ｍｏｌｌｅｒら、前出）ため、および組換えＴＮＦの精製におい
て補助する（Ｂｒｉｎｇｍａｎら、前出）ために使用された。しかし、これらの
研究は、免疫原性、特異性の欠除、および／または薬学的適合性に起因して、イ
ンビボ診断的使用またはヒトにおける治療的使用のために使用され得る抗体を中
和するＴＮＦを産生するための基礎を提供しない。

【００１０】 中和抗血清またはＴＮＦに対するｍＡｂは、ヒト以外の哺乳動物において、有
害な生理学的変化を排除し、そして実験的な内毒症および菌血症における致死的
チャレンジ後の死から予防することが示されている。この効果は、例えば、げっ
歯類致死率アッセイにおいて、および霊長類病理学モデル系において実証されて
いる（Ｍａｔｈｉｓｏｎ， Ｊ．Ｃ．ら、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．
８１：１９２５−１９３７（１９８８）；Ｂｅｕｔｌｅｒ， Ｂ．ら、Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ ２２９：８６９−８７１（１９８５）；Ｔｒａｃｅｙ， Ｋ．Ｊ．ら、
Ｎａｔｕｒｅ ３３０：６６２−６６４（１９８７）；Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ，
Ｙ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｌｅｔｔ． １７：３１１−３１８（１９８８）；
Ｓｉｌｖａ， Ａ． Ｔ．ら、Ｊ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ． １６２：４２
１−４２７（１９９０）；Ｏｐａｌ， Ｓ． Ｍ．ら、Ｊ． Ｉｎｆｅｃｔ．
Ｄｉｓ． １６１：１１４８−１１５２（１９９０）；Ｈｉｎｓｈａｗ， Ｌ．
Ｂ．ら、Ｃｉｒｃ． Ｓｈｏｃｋ ３０：２７９−２９２（１９９０））。

【００１１】 今日までに、ヒトにおける抗ＴＮＦ ｍＡｂ治療の経験は、限られているが、
有用な治療結果を示している（例えば、関節炎および敗血症において）。例えば
、Ｅｌｌｉｏｔｔ， Ｍ．Ｊ．ら、Ｂａｉｌｌｉｅｒｅｓ Ｃｌｉｎ． Ｒｈｅ
ｕｍａｔｏｌ． ９：６３３−５２（１９９５）；Ｆｅｌｄｍａｎｎ Ｍら、Ａ
ｎｎ． Ｎ． Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７６６：２７２−８（１
９９５）；ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｏｌｌ， Ｔ．ら、Ｓｈｏｃｋ ３：１−１２（
１９９５）；Ｗｈｅｒｒｙら、Ｃｒｉｔ． Ｃａｒｅ． Ｍｅｄ． ２１：Ｓ４
３６−４０（１９９３）；Ｔｒａｃｅｙ Ｋ． Ｊ．ら、Ｃｒｉｔ． Ｃａｒｅ
Ｍｅｄ． ２１ Ｓ４１５−２２（１９９３）を参照のこと。

【００１２】 サイトカインレセプターの配列分析は、以下の膜タンパク質のいくつかのサブ
ファミリーを定義する：（１）Ｉｇスーパーファミリー、（２）ヘマトポエチン
（サイトカインレセプタースーパーファミリー）、および（３）腫瘍壊死因子（
ＴＮＦ）／神経成長因子（ＮＧＦ）レセプタースーパーファミリー（ＴＮＦスー
パーファミリーの概説については、ＧｒｕｓｓおよびＤｏｗｅｒ， Ｂｌｏｏｄ
８５（１２）：３３７８−３４０４（１９９５）、ならびにＡｇｇａｒｗａｌ
およびＮａｔａｒａｊａｎ， Ｅｕｒ． Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｎｅｔｗ．， ７
（２）：９３−１２４（１９９６）を参照のこと）。ＴＮＦ／ＮＧＦレセプター
スーパーファミリーは、少なくとも１０の異なったタンパク質を含む。Ｇｒｕｓ
ｓおよびＤｏｗｅｒ、前出。これらのレセプターのリガンドは同定され、そして
少なくとも２つのサイトカインスーパーファミリーに属する。Ｇｒｕｓｓおよび
Ｄｏｗｅｒ、前出。

【００１３】 従って、病理学的状態に関与するＴＮＦに類似したサイトカインを提供する必
要がある。このような新規のサイトカインは、ＴＮＦ様障害の治療のため、これ
らのＴＮＦ様サイトカインを結合する新規の抗体または他のアンタゴニストを作
成するために使用され得る。

【００１４】 （発明の要旨） 本発明は、ＴＮＦに類似し、そして類似の生物学的効果および生物学的活性を
有すると考えられる、サイトカインをコードするポリヌクレオチドを含む、単離
された核酸分子を提供する。このサイトカインはエンドカインαと命名され、そ
して図１（配列番号２）のアミノ酸配列、またはバクテリア宿主中の、１９９６
年６月２７日にＡＴＣＣ寄託番号９７６４０として寄託されたｃＤＮＡクローン
によりコードされるアミノ酸配列の、少なくとも一部を有するエンドカインαポ
リペプチドを含む。寄託されたエンドカインαｃＤＮＡクローンを配列決定する
ことにより決定されたヌクレオチド配列は、Ｎ末端メチオニン、約１７アミノ酸
残基の細胞内ドメイン、約２６アミノ酸の膜貫通ドメイン、約１２６アミノ酸の
細胞外ドメイン、および約１９ｋＤａの完全タンパク質の推論分子量を含む、約
１６９アミノ酸残基のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム
を含む。

【００１５】 従って、本発明の１つの局面は、以下からなる群より選択されるヌクレオチド
配列を有するポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子を提供する：（ａ）
配列番号２における完全なアミノ酸配列を有するエンドカインαポリペプチドを
コードするヌクレオチド配列；（ｂ）配列番号２における完全なアミノ酸配列を
有するが、Ｎ末端メチオニン残基を引いた、エンドカインαポリペプチドをコー
ドするヌクレオチド配列；（ｃ）ＡＴＣＣ寄託番号９７６４０において含まれる
ｃＤＮＡクローンによってコードされる完全なアミノ酸配列を有するエンドカイ
ンαポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；および（ｄ）上記の（ａ）、
（ｂ）または（ｃ）のいずれかのヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列
。

【００１６】 本発明のさらなる実施形態は、上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、または（ｄ）
におけるヌクレオチド配列のいずれかに対して、少なくとも８０％、８５％、９
０％、９２％、または９５％同一の、およびより好ましくは、９６％、９７％、
９８％、または９９％同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、ある
いは上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、または（ｄ）におけるポリヌクレオチドに
対してストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする
ポリヌクレオチドを含むか、あるいはこれらからなる単離された核酸分子を含む
。ハイブリダイズするこのポリヌクレオチドは、Ａ残基またはＴ残基のみからな
るヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドに対してはストリンジェントなハ
イブリダイゼーション条件下ではハイブリダイズしない。本発明のさらなる核酸
の実施形態は、上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、または（ｄ）におけるアミノ酸
配列を有するエンドカインαポリペプチドのエピトープ保有部分のアミノ酸配列
をコードするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子に関する。

【００１７】 本発明はさらに、本明細書中で記載される核酸分子の核酸フラグメントに関す
る。好ましい核酸フラグメントには、以下をコードする核酸分子が挙げられる：
エンドカインα細胞内ドメインを含むポリペプチド（図１（配列番号２）におけ
る約１〜約１７のアミノ酸残基）；エンドカインα膜貫通ドメインを含むポリペ
プチド（図１（配列番号２）における約１８〜約４３のアミノ酸残基）；および
エンドカインα細胞外ドメインを含むポリペプチド（図１（配列番号２）におけ
る約４４〜約１６９のアミノ酸残基）。

【００１８】 本発明はまた、本発明の単離された核酸分子を含む組換えベクターおよびこの
組換えベクターを含む宿主細胞、ならびにそのようなベクターおよび宿主細胞を
作製する方法および組換え技術によるエンドカインαポリペプチドまたはペプチ
ドの産生のためにそれらを使用するための方法に関する。

【００１９】 本発明はさらに、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、単離
されたエンドカインαポリペプチドを提供する：（ａ）配列番号２の完全な１６
９個のアミノ酸配列；（ｂ）Ｎ末端メチオニン残基を引いた配列番号２における
完全な１６９個のアミノ酸配列；（ｃ）ＡＴＣＣ寄託番号９７６４０において含
まれるｃＤＮＡクローンによってコードされる、完全なアミノ酸配列；および（
ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のポリペプチドのいずれか１つのエピトープ保
有部分のアミノ酸配列。本発明のポリペプチドはまた、以下を有するポリペプチ
ドを含む：上記のアミノ酸配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％
または９５％同一、より好ましくは、少なくとも９６％、９７％、９８％または
９９％同一なアミノ酸配列。

【００２０】 本発明のエンドカインαポリペプチドのエピトープ保有部分のアミノ酸配列を
有するペプチドまたはポリペプチドは、少なくとも６アミノ酸または７アミノ酸
、好ましくは少なくとも９アミノ酸、およびより好ましくは少なくとも約３０ア
ミノ酸〜約５０アミノ酸を有するそのようなポリペプチドの部分を含むが、上記
の本発明のポリペプチドのアミノ酸配列全体までの任意の長さの、エピトープ保
有部分ポリペプチドもまた、本発明に含まれる。

【００２１】 別の実施形態において、本発明は、上記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）
において記載されるアミノ酸配列を有するエンドカインαポリペプチドに対して
特異的に結合する、単離された抗体を提供する。

【００２２】 本発明に従う好ましいポリペプチドフラグメントには、以下を含むポリペプチ
ドが挙げられる：エンドカインα細胞内ドメイン、エンドカインα膜貫通ドメイ
ン、およびエンドカインα細胞外ドメイン。

【００２３】 本発明はさらに、上記のようなアミノ酸配列を有するエンドカインαポリペプ
チドに特異的に結合する抗体を単離するための方法を提供する。このような抗体
は、エンドカインα−および／またはＴＮＦ関連障害の処置におけるアンタゴニ
ストとして、診断的または治療的に有用であり得る。本発明はまた、ＴＮＦ関連
障害の存在を決定するための診断方法を提供する。

【００２４】 （発明の詳細な説明） 本発明は、クローン化されたｃＤＮＡを配列決定することによって決定された
、図１（配列番号２）に示されるアミノ酸配列を有するエンドカインαタンパク
質をコードするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を提供する。エンド
カインαは、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）リガンドファミリーの新規なメンバーであ
り、そしてヒトＴＮＦαおよび関連のＴＮＦファミリーメンバーと配列相同性を
共有する（図２）。図１（配列番号１）に示されるヌクレオチド配列は、１９９
６年６月２７日に、アメリカンタイプカルチャーコレクション、Ｐａｔｅｎｔ
Ｄｅｐｏｓｉｔｏｒｙ，１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒ
ｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１１０−２２０９に寄託され、寄託番号９７
６４０が与えられたｃＤＮＡクローンを配列決定することによって得られた。寄
託されたクローンは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）プラスミド（Ｓｔｒ
ａｔａｇｅｎｅ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ）に含まれる。

【００２５】 （核酸分子） 他に示されない限り、本明細書中でＤＮＡ分子を配列決定することによって決
定されたすべてのヌクレオチド配列は、自動化ＤＮＡ配列決定機（例えば、Ａｐ
ｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ．からのＭｏｄｅｌ ３７３）を
用いて決定され、そして本明細書中で決定されるＤＮＡ分子によってコードされ
るポリペプチドのすべてのアミノ酸配列は、上記のように決定されるＤＮＡ配列
の翻訳によって予想された。従って、この自動化アプローチによって決定された
任意のＤＮＡ配列について当該分野において公知のように、本明細書中で決定さ
れる任意のヌクレオチド配列はいくつかの誤りを含み得る。自動化によって決定
されるヌクレオチド配列は、配列決定されるＤＮＡ分子の実際のヌクレオチド配
列に対して、代表的には少なくとも約９０％の同一、より代表的には少なくとも
約９５％から少なくとも約９９．９％の同一である。実際の配列は、当該分野に
おいて周知の手動ＤＮＡ配列決定方法を含む他のアプローチによってより正確に
決定され得る。当該分野においてまた公知のように、実際の配列と比較した、決
定されるヌクレオチド配列における単一の挿入または欠失は、ヌクレオチド配列
の翻訳におけるフレームシフトを引き起こし、その結果、決定されるヌクレオチ
ド配列によってコードされる予想されるアミノ酸配列は、挿入または欠失のよう
な点にて始まる配列決定されるＤＮＡ分子によって実際にコードされるアミノ酸
配列とは完全に異なる。

【００２６】 他に示されない限りは、本明細書中に記載される各「ヌクレオチド配列」は、
デオキシヌクレオチド（Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＴと省略される）の配列として示さ
れる。しかし、核酸分子またはポリヌクレオチドの「ヌクレオチド配列」によっ
て、ＤＮＡ分子またはポリヌクレオチドについてデオキシリボヌクレオチドの配
列が、およびＲＮＡ分子またはポリヌクレオチドについてリボヌクレオチド（Ａ
、Ｇ、Ｃ、およびＵ）の対応する配列が意図され、ここで、特定のデオキシヌク
レオチド配列における各チミジンデオキシヌクレオチド（Ｔ）は、リボヌクレオ
チドウリジン（Ｕ）で置換される。例えば、図１（配列番号１）の配列を有する
ＲＮＡ分子に対する参照は、デオキシリボヌクレオチドの略号を使用することが
、配列番号１の各デオキシヌクレオチドＡ、Ｇ、またはＣが、対応するデオキシ
リボヌクレオチドＡ、Ｇ、またはＣによって置換され、そして各デオキシヌクレ
オチドＴが、リボヌクレオチドＵによって置換されている配列を有するＲＮＡ分
子を示すことを意図する。

【００２７】 本明細書中に提供される情報（例えば、図１におけるヌクレオチド配列）を使
用して、エンドカインαポリペプチドをコードする本発明の核酸分子が、標準的
なクローニングおよびスクリーニング手順（例えば、出発物質としてｍＲＮＡを
使用するｃＤＮＡをクローニングするための方法）を使用して得られ得る。本発
明の例示として、図１（配列番号１）に記載した核酸分子は、ヒト脳線条由来の
ｃＤＮＡライブラリーにおいて見出された。エンドカインα ｃＤＮＡの一部に
対応する発現配列タグはまた、いくつかの内皮ライブラリーおよび胎児肝臓ライ
ブラリーにおいて見出された。

【００２８】 エンドカインα遺伝子は、約１６９アミノ酸残基のタンパク質をコードする読
み取り枠、約１７アミノ酸の細胞内ドメイン（図１（配列番号２）における約１
〜約１７のアミノ酸残基）、約２６アミノ酸の膜貫通ドメイン（図１（配列番号
２）における約１８〜約４３のアミノ酸残基）、約１２６アミノ酸の細胞外ドメ
イン（図１（配列番号２）における約４４〜約１６９のアミノ酸残基）；および
約１９ｋＤａの推定分子量を含む。図１（配列番号２）に示されるエンドカイン
αタンパク質は、ヒトＴＮＦα（これは、ＧｅｎＢａｎｋに登録番号Ｕ４２７６
４でアクセスされ得る）に対して約３０％類似、そして約２２％同一である。

【００２９】 当業者が理解するように、上記で議論された配列決定エラーの可能性のため、
寄託されたｃＤＮＡによりコードされる実際のエンドカインαポリペプチドは、
約１６９アミノ酸を含むが、しかし約１５４〜１８４アミノ酸の範囲内のいずれ
かであり得る。当業者によって理解されるように、使用される判断基準に依存し
て、上記のエンドカインαタンパク質ドメインの正確な「位置（ａｄｄｒｅｓｓ
）」は異なり得る。従って、例えば、図１（配列番号２）に示されるエンドカイ
ンαの細胞内ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞外ドメインの正確な位置は
、ドメインを規定するために使用される判断基準に依存してわずかに異なり得る
（例えば、正確なアドレスは、図１に示されるものと比較して約１〜約５残基異
なり得る）。

【００３０】 示されるように、本発明の核酸分子は、ＲＮＡの形態（例えば、ｍＲＮＡ）で
もまたはＤＮＡの形態（例えば、クローニングにより得られるか、または合成的
に生成された、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡを含む）であってもよい。このＤＮ
Ａは、二本鎖であってもまたは一本鎖であってもよい。一本鎖ＤＮＡは、コード
鎖（センス鎖としてもまた公知である）であってもよいし、または非コード鎖（
アンチセンス鎖とも呼ばれる）であってもよい。

【００３１】 「単離された」核酸分子とは、その天然の環境から取り除かれた核酸分子、Ｄ
ＮＡ、またはＲＮＡを意図する。例えば、ベクターに含まれる組換えＤＮＡ分子
は、本発明の目的のためには単離されたとみなされる。単離されたＤＮＡ分子の
さらなる例は、異種宿主細胞中で維持される組換えＤＮＡ分子、または溶液中の
（部分的に、または実質に）精製されたＤＮＡ分子を含む。単離されたＲＮＡ分
子は、インビボまたはインビトロにおける本発明のＤＮＡ分子のＲＮＡ転写産物
を含む。本発明に従う単離された核酸分子は、合成的に生成されたそのような分
子をさらに含む。

【００３２】 しかし、ライブラリーの他のメンバーから単離されていない（例えば、クロー
ンおよび他のライブラリーのメンバーを含む均一な溶液の形態で）、ライブラリ
ー（例えば、ゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリー）のメンバーであ
るクローン中に含まれる核酸、または細胞もしくは細胞溶解物から単離されたか
もしくは取り除かれた染色体（例えば、核型におけるような「染色体スプレッド
」）は、本発明の目的のためには「単離され」ていない。本明細書中でさらに議
論するように、本発明に従う単離された核酸分子は、天然に、組換え的に、また
は合成的に産生され得る。

【００３３】 本発明の単離された核酸分子は、図１（配列番号１）に示される読み取り枠（
ＯＲＦ）を含むＤＮＡ分子を含み、さらに図１（配列番号１）に示されるＯＲＦ
配列のすべてまたは一部とは実質的に異なる核酸分子を含むが、遺伝コードの縮
重に起因して、エンドカインαタンパク質またはそのフラグメントをなおコード
するＤＮＡ分子を含む。もちろん、遺伝コードは、当該分野において周知である
。従って、当業者にとって、上記の縮重改変体を産生することは日常的である。

【００３４】 別の局面において、本発明は、１９９６年６月２７日にＡＴＣＣ寄託番号９７
６４０として寄託されたクローンのｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列
を有するエンドカインαポリペプチドをコードする、単離された核酸分子を提供
する。本発明はさらに、図１（配列番号１）に示されるヌクレオチド配列を有す
る単離された核酸分子、または上記の寄託されたクローン中に含まれるエンドカ
インα ｃＤＮＡのヌクレオチド配列を有する単離された核酸分子、あるいは上
記の配列のうちの１つと相補的な配列を有する核酸分子を提供する。そのような
単離された分子（特にＤＮＡ分子）は、染色体を用いたインサイチュハイブリダ
イゼーションによる遺伝子地図作成のためのプローブとして、そしてヒト組織中
のエンドカインα遺伝子の発現を検出（例えば、ノーザンブロット分析による）
するためのプローブとして有用である。以下で詳細に記載されるように、特定の
組織または体液中で変化したエンドクリンα遺伝子発現を検出することは、特定
の障害の指標である。

【００３５】 本発明はさらに、本明細書中に記載される単離された核酸分子のフラグメント
に関する。寄託されたｃＤＮＡのヌクレオチド配列または図１（配列番号１）に
示されるヌクレオチド配列を有する単離された核酸分子のフラグメントによって
、本明細書中で議論されるような診断プローブおよび診断プライマーとして有用
である、少なくとも約１５ｎｔ、およびより好ましくは少なくとも約２０ｎｔ、
なおより好ましくは少なくとも約３０ｎｔ、およびさらに好ましくは、少なくと
も約４０ｎｔの長さであるフラグメントが意図される。もちろん、より大きなフ
ラグメント、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００
、４５０、および５００ｎｔの長さもまた、本発明に従って有用であり、寄託さ
れたｃＤＮＡのヌクレオチド配列または図１（配列番号１）において示されるヌ
クレオチド配列の、全てではないが、大部分に対応するフラグメントも、同様に
有用である。この文脈において、「約」とは、いくつか（５、４、３、２または
１）のヌクレオチドより大きいかまたはより小さな特定の列挙される値を含む。
例えば、少なくとも２０ｎｔ長のフラグメントとは、寄託されたｃＤＮＡのヌク
レオチド配列または図１（配列番号１）において示されるヌクレオチド配列由来
の、２０個以上連続した塩基を含むフラグメントが、意図される。その遺伝子は
寄託され、そして図１（配列番号１）に示されるそのヌクレオチド配列が提供さ
れるので、そのようなＤＮＡフラグメントを生成することは、当業者には慣用的
である。例えば、制限エンドヌクレアーゼ切断または超音波処理による剪断は、
種々のサイズのフラグメントを生成するために容易に使用され得る。あるいは、
そのようなフラグメントは、合成的に生成され得る。

【００３６】 さらに、本発明はまた、以下の関連するｃＤＮＡクローン：ＨＥＭＣＧ０４Ｒ
（配列番号１１）を同定し、これは、ＢＬＡＳＴ分析によって、配列番号１のヌ
クレオチド２６〜４８２に対して９４％の同一性を有する。

【００３７】 本発明の好ましい核酸フラグメントは、以下をコードする核酸分子を含む：エ
ンドカインα細胞内ドメイン（図１（配列番号２）の約１〜約１７のアミノ酸残
基、またはＡＴＣＣ寄託番号９７６４０において含まれるｃＤＮＡクローンによ
ってコードされるようなそのアミノ酸残基）を含むか、あるいはそれからなるポ
リペプチド；エンドカインα膜貫通ドメイン（図１（配列番号２）の約１８〜約
４３のアミノ酸残基、またはＡＴＣＣ寄託番号９７６４０において含まれるｃＤ
ＮＡクローンによってコードされるようなそのアミノ酸残基）を含むか、あるい
はそれからなるポリペプチド；および、エンドカインα細胞外ドメイン（図１（
配列番号２）の約４４〜約１６９のアミノ酸残基、またはＡＴＣＣ寄託番号９７
６４０において含まれるｃＤＮＡクローンによってコードされるようなそのアミ
ノ酸残基）を含むか、あるいはそれからなるポリペプチド。

【００３８】 さらに好ましい本発明の核酸フラグメントは、エンドカインαタンパク質のエ
ピトープ保有ペプチドをコードする核酸分子を含む。特に、本発明のこのような
核酸フラグメントは、以下のアミノ酸配列およびこれらのアミノ酸配列をコード
するポリヌクレオチドのいずれかの１、２、３以上を含むか、あるいはこれらか
らなるポリペプチドをコードする核酸分子を含む：図１（配列番号２）における
約４４〜約１５８のアミノ酸残基；図１（配列番号２）における約４４〜約５４
のアミノ酸残基；図１（配列番号２）における約５７〜約６８のアミノ酸残基；
図１（配列番号２）における約６９〜約７８のアミノ酸残基；図１（配列番号２
）における約９４〜約１０５のアミノ酸残基；図１（配列番号２）における約１
０８〜約１３２のアミノ酸残基；図１（配列番号２）における約１４８〜約１５
８のアミノ酸残基。本発明者らは、上記のポリペプチドフラグメントがエンドカ
インαタンパク質の抗原性領域であることを決定した。エンドカインαタンパク
質の他のこのようなエピトープ保有部分を決定するための方法は、以下で詳細に
記載される。

【００３９】 別の局面において、本発明は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条
件下で、上記の本発明の核酸分子中のポリヌクレオチド（例えば、本明細書中で
開示されたエンドクリンαポリヌクレオチドフラグメントの相補物、または１９
９６年６月２７日に寄託されたＡＴＣＣ受託番号９７６４０に含まれるｃＤＮＡ
クローン）の一部にハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む、単離された核
酸分子を提供する。「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、
５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸三
ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、
１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌ変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む
溶液中における４２℃で一晩のインキュベーションに続いて、約６５℃で０．１
×ＳＳＣ中におけるフィルターの洗浄を意図する。ポリヌクレオチドの「一部」
にハイブリダイズするポリヌクレオチドとは、参照ポリヌクレオチドのうちの少
なくとも約１５ヌクレオチド（ｎｔ）、そしてより好ましくは少なくとも約２０
ｎｔ、なおより好ましくは少なくとも約３０ｎｔ、そしてさらにより好ましくは
約３０〜７０ｎｔにハイブリダイズするポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ
のいずれか）を意図する。これらは、上記で議論されるように、そして以下でよ
り詳細に議論されるように、診断用プローブおよび診断用プライマーとして有用
である。

【００４０】 もちろん、参照ポリヌクレオチド（例えば、寄託されたｃＤＮＡクローン）の
より大きな部分（例えば、５０〜３００ｎｔ長の部分）にハイブリダイズするポ
リヌクレオチド、または参照ポリヌクレオチドの全体の長さでさえもまた、本発
明に従うプローブとして有用であり、寄託されたｃＤＮＡのヌクレオチド配列ま
たは図１（配列番号１）において示されるヌクレオチド配列の、全てではないが
、大部分に対応するポリヌクレオチドも、同様に有用である。例えば、「少なく
とも２０ｎｔ長」のポリヌクレオチドの部分とは、参照ポリヌクレオチドのヌク
レオチド配列（例えば、寄託されたｃＤＮＡまたはまたは図１（配列番号１）に
おいて示されるヌクレオチド配列）由来の、２０個以上連続したヌクレオチドが
意図される。示されるように、このような部分は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，
Ｊ．ら編、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８
９）（この全体の開示は本明細書中で参考として援用される）に記載されるよう
に、従来的なＤＮＡハイブリダイゼーション技術に従うプローブとしてまたはポ
リメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による標的配列の増幅のためのプライマーとして
のいずれかで、診断的に有用である。

【００４１】 エンドカインα ｃＤＮＡクローンは寄託され、そしてそのヌクレオチド配列
は、図１（配列番号１）において提供されるので、エンドカインα ｃＤＮＡ分
子の一部にハイブリダイズするポリヌクレオチドを生成することは、当業者に慣
用的である。例えば、エンドカインｃＤＮＡクローンの制限エンドヌクレアーゼ
切断または超音波処理による剪断は、種々のサイズのＤＮＡ部分（これは、エン
ドカインα ｃＤＮＡ分子の一部にハイブリダイズするポリヌクレオチドである
）を生成するために容易に使用され得る。あるいは、ハイブリダイズする本発明
のポリヌクレオチドは、公知の技術に従って合成的に生成され得る。

【００４２】 当然、ポリＡ配列（例えば、図１（配列番号１）に示されるエンドカインα
ｃＤＮＡの３’末端ポリ（Ａ）トラクト）、またはＴ（もしくはＵ）残基の相補
的ストレッチにのみハイブリダイズするポリヌクレオチドは、本発明の核酸の一
部にハイブリダイズするために使用される本発明のポリヌクレオチドには含まれ
ない。なぜなら、そのようなポリヌクレオチドは、ポリ（Ａ）ストレッチ、また
はその相補体（例えば、事実上任意の二本鎖ｃＤＮＡクローン）を含む任意の核
酸分子にハイブリダイズするからである。

【００４３】 示されるように、エンドカインαタンパク質をコードする本発明の核酸分子は
、以下を含み得るが、それらに制限されない；それだけでこのポリペプチドのア
ミノ酸配列をコードするもの；そのポリペプチドのコード配列および付加的配列
（例えば、プレタンパク質配列、またはプロタンパク質配列、あるいはプレプロ
タンパク質配列）；上記の付加的なコード配列を有するかまたは有さないポリペ
プチドのコード配列（これは、付加的な非コード配列（例えば、以下を含むがそ
れらに限定されない：イントロンならびに非コード５’配列および非コード３’
配列（例えば、転写、ｍＲＮＡプロセシング（スプライシングを含む））および
ポリアデニル化シグナルにおいて役割（例えば、ｍＲＮＡのリボソーム結合およ
び安定性）を果たす、転写される非翻訳配列）を伴う）；付加的アミノ酸（例え
ば、さらなる機能性を提供する付加的アミノ酸）をコードする付加的なコード配
列。従って、例えば、ポリペプチドをコードする配列は、マーカー配列（例えば
、融合されたポリペプチドの精製を容易にするペプチドをコードする配列）と融
合され得る。本発明のこの局面の特定の好ましい実施形態においては、このマー
カーアミノ酸配列は、とりわけ、ヘキサ−ヒスチジンペプチド（例えば、ｐＱＥ
ベクター（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）で提供されるタグ）であり、それらの多く
は公的に入手可能であるか、または市販されている。例えば、Ｇｅｎｔｚら、Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８２１−８２４（１９８
９）に記載されるように、ヘキサ−ヒスチジンは、融合タンパク質の簡便な精製
を提供する。「ＨＡ」タグは、インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）タンパク質
由来のエピトープに対応し、Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ ３７：７６７（１９８
４）に記載されている、精製のために有用な別のペプチドである。他のそのよう
な融合タンパク質は、Ｎ末端またはＣ末端で、Ｆｃと融合した、エンドカインα
タンパク質を含む。

【００４４】 本発明はさらに、エンドカインαタンパク質の一部、アナログ、または誘導体
をコードする本発明の核酸分子の改変体に関する。改変体（例えば、天然の対立
遺伝子改変体）は天然に生じ得る。「対立遺伝子改変体」によって、生物の染色
体上の所定の遺伝子座を占める遺伝子のいくつかの代替の形態の１つが意図され
る。天然に存在しない改変体は、例えば、当該分野で公知の変異誘発技術を使用
して産生され得る。

【００４５】 天然に存在しない改変体は、当該分野で公知の変異誘発技術を使用して産生さ
れ得、これらの方法には、オリゴヌクレオチド媒介変異誘発、アラニンスキャニ
ング、ＰＣＲ変異誘発、部位特異的変異誘発（例えば、Ｃａｒｔｅｒら、Ｎｕｃ
ｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１３：４３３１（１９８６）；およびＺｏｌｌｅｒら、
Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１０：６４８７（１９８２）を参照のこと）、
カセット変異誘発（例えば、Ｗｅｌｌｓら、Ｇｅｎｅ ３４：３１５（１９８５
）を参照のこと）、制限選択変異誘発（例えば、Ｗｅｌｌｓら、Ｐｈｉｌｏｓ．
Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄｏｎ ＳｅｒＡ ３１７：４１５（１９８６
）を参照のこと）が挙げられるが、これらに限定されない。

【００４６】 そのような改変体は、ヌクオチドの置換、欠失または付加により生成される改
変体を含む。この置換、欠失または付加は、１以上のヌクレオチドを含み得る。
改変体は、コード領域、非コード領域またはその両方の領域において変化し得る
。コード領域における改変は、保存的または非保存的なアミノ酸の置換、欠失ま
たは付加を生じ得る。これらの間で特に好ましいのは、エンドカインαタンパク
質またはそれらの一部の特性および活性を変化させない、サイレントな置換、付
加および欠失である。この点で、保存的置換もまた特に好ましい。最も非常に好
ましいのは、図１（配列番号２）において示されるアミノ酸配列を有するエンド
カインαタンパク質をコードする核酸分子、または寄託されたｃＤＮＡクローン
によりコードされるエンドカインαアミノ酸配列をコードする核酸分子である。
である。

【００４７】 本発明のさらなる実施形態は、以下に対して少なくとも８０％、８５％、９０
％、９２％、または９５％同一、およびより好ましくは少なくとも９６％、９７
％、９８％または９９％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド
を含むかあるいはそのポリヌクレオチドからなる、単離された核酸分子を含む：
（ａ）配列番号２におけるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、ヌ
クレオチド配列；（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を有するがＮ末端メチオニン
を欠くポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｃ）ＡＴＣＣ受託番号９
７６４０に含まれるｃＤＮＡクローンによってコードされるアミノ酸配列を有す
るポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；または（ｄ）（ａ）、（ｂ）、
もしくは（ｃ）におけるヌクレオチド配列のいずれかに相補的なヌクレオチド配
列。

【００４８】 エンドカインαポリペプチドをコードする参照ポリヌクレオチド配列に、例え
ば、少なくとも９５％「同一」であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチ
ドにより、このポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は、このポリヌクレオチド
配列が、エンドカインαポリペプチドをコードする参照ヌクレオチド配列の各１
００個のアミノ酸あたり５つまでの点変異を含み得ることを除いて、その参照配
列に同一であることが意図される。換言すれば、参照ヌクレオチド配列に少なく
とも９５％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために
、その参照配列におけるヌクレオチドの５％までが、欠失または別のアミノ酸で
置換され得るか、あるいは、参照配列における全ヌクレオチドの５％までの多数
のヌクレオチドが、参照配列に挿入され得る。参照配列のこれらの変異は、参照
アミノ酸配列の５’末端もしくは３’末端位置で生じ得るか、またはそれらの末
端位置の間のどこにでも生じ得、参照配列中のヌクレオチド間で個々に、または
参照配列内の１つ以上連続した群としてのいずれかで、散在される。

【００４９】 参照（問い合わせ）配列は、図１（配列番号１）に示される完全エンドカイン
α配列をコードするヌクレオチド配列または本明細書中に記載される任意のエン
ドカインαポリヌクレオチドフラグメントであり得る。

【００５０】 実際には、任意の特定の核酸分子が、例えば、図１に示されるヌクレオチド配
列または寄託されたｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列に、少なくとも８０％
、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同
一であるか否かは、例えば、ＢＥＳＴＦＩＴプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ， Ｖｅｒｓｉｏｎ ８
ｆｏｒ Ｕｎｉｘ（登録商標），Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒ
ｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ，５７５ Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ ５３７１１）のような公知のコ
ンピュータープログラムを用いて従来通りに決定され得る。ＢＥＳＴＦＩＴは、
ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２
−４８９（１９８１）の局所的相同性アルゴリズムを用いて、２つの配列間の相
同性の最適のセグメントを見出す。ＢＥＳＴＦＩＴまたは任意の他の配列整列プ
ログラムを使用して、特定の配列が、例えば本発明による参照配列に９５％同一
であるか否かを決定する場合、パラメーターは、もちろん、同一性の割合が、参
照ヌクレオチド配列の全長にわたって計算されるように、そして参照配列の総ヌ
クレオチド数の５％までの相同性におけるギャップが許容されるように、設定さ
れる。

【００５１】 特定の実施形態では、参照（照会）配列（本発明の配列）と対象配列との間の
同一性（全体的配列整列ともいう）は、Ｂｒｕｔｌａｇら（Ｃｏｍｐ． Ａｐｐ
．Ｂｉｏｓｃｉ．６：２３７−２４５（１９９０））のアルゴリズムに基づくＦ
ＡＳＴＤＢコンピュータープログラムを使用して決定される。同一性パーセント
である。同一性パーセントを算定するためにＤＮＡ配列のＦＡＳＴＤＢ整列にお
いて使用される好ましいパラメーターは：Ｍａｔｒｉｘ＝Ｕｎｉｔａｒｙ、ｋ−
ｔｕｐｌｅ＝４、Ｍｉｓｍａｔｃｈ Ｐｅｎａｌｔｙ＝１、Ｊｏｉｎｉｎｇ Ｐ
ｅｎａｌｔｙ＝３０、Ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ Ｇｒｏｕｐ Ｌｅｎｇｔｈ
＝０、Ｃｕｔｏｆｆ Ｓｃｏｒｅ＝１、Ｇａｐ Ｐｅｎａｌｔｙ＝５、Ｇａｐ
Ｓｉｚｅ Ｐｅｎａｌｔｙ ０．０５、Ｗｉｎｄｏｗ Ｓｉｚｅ＝５００または
対象ヌクレオチド配列の長さ（どちらかより短い方）である。この実施形態に従
って、対象配列が、５’または３’欠失が理由で（内部欠失が理由ではなく）、
照会配列より短い場合、手動の補正が結果に対してなされなけらばならない。こ
れは、全体同一性パーセントを算定する場合に、ＦＡＳＴＤＢプログラムが対象
配列の５’および３’短縮の短縮を考慮しないという事実を考慮するためである
。照会配列に対して、５’末端または３’末端で短縮化された対象配列について
は、同一性パーセントは、照会配列の総塩基のパーセントとして、整合／整列さ
れない対象配列の５’および３’である照会配列の塩基の数を算定することによ
って補正される。ヌクレオチドが整合／整列されるか否かは、ＦＡＳＴＤＢ配列
整列の結果によって決定される。次いで、このパーセントは、特定のパラメータ
ーを用いて上記のＦＡＳＴＤＢプログラムによって算定された同一性パーセント
から差し引かれ、最終的な同一性パーセントのスコアに到達する。この補正され
たスコアが、本発明の目的に使用されるものである。ＦＡＳＴＤＢ整列によって
示される場合、照会配列と整合／整列されいていない、対象配列の５’塩基およ
び３’塩基の外側の塩基のみが、同一性パーセントのスコアを手動で調整する目
的で算定される。例えば、９０アミノ酸残基の対象配列が、同一性パーセントを
決定するために１００残基の照会配列に整列される。欠失は対象配列の５’末端
で生じ、従って、そのＦＡＳＴＤＢ整列は、５’末端で最初の１０塩基の一致／
整列を示さない。その１０個の不対合残基は、その配列の１０％（一致していな
い５’末端および３’末端の塩基の数）／（照会配列の塩基の総数）を表し、そ
のため１０％が、ＦＡＳＴＤＢプログラムによって算定される同一性パーセント
のスコアから差し引かれる。残りの９０残基が完全に一致する場合は、最終的な
同一性パーセントは９０％である。別の例では、９０残基の対象配列が、１００
残基の照会配列と比較される。この場合、欠失は、内部欠失であり、その結果、
照会と一致／整列しない対象配列の５’末端または３’末端に塩基が存在しない
。この場合、ＦＡＳＴＤＢによって算定される同一性パーセントは、手動で補正
されない。再び、照会配列と一致／整列しない、対象配列の５’末端または３’
末端の塩基のみが手動で補正される。他の手動の補正は、この実施形態の目的で
はなされない。

【００５２】 本出願は、上記のアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％
、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一な核酸分子に関し
、これらがエンドカインαタンパク質活性を有するポリペプチドをコードするか
否かに拘らない。これはなぜなら、特定の核酸分子がエンドカインα活性を有す
るポリペプチドをコードしない場合でさえ、当業者は、核酸分子を、例えば、ハ
イブリダイゼーションプローブまたはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマ
ーとしてどのように使用するかを理解するからである。エンドカインα活性を有
するポリペプチドをコードしない本発明の核酸分子の使用としては、とりわけ、
以下が挙げられる：（１）ｃＤＮＡライブラリーからのエンドカインα遺伝子ま
たはその対立遺伝子改変体；（２）エンドカインα遺伝子の正確な染色体位置を
提供するための、分裂中期染色体スプレッドへのインサイチュハイブリダイゼー
ション（ＦＩＳＨ）（Ｖｅｒｍａら，Ｈｕｍａｎ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：Ａ
Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｐｅｒｇａｍｏｎ
Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）に記載される）；および（３）特
定の組織におけるエンドカインαｍＲＮＡ発現を検出するためのノーザンブロッ
ト分析。

【００５３】 しかし、上記の核酸配列に対して、このような少なくとも８０％、８５％、９
０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である配列を
有する核酸分子が好ましく、これらは事実、エンドカインαタンパク質活性を有
するポリペプチドをコードする。「エンドカインα活性を有するポリペプチド」
とは、特定の生物学的アッセイにおいて測定されるエンドカインαタンパク質と
比較して、類似の活性（必ずしも同じではない）を示すポリペプチドが意図され
る。エンドカインα活性は、公知の方法に従ってアッセイされ得る。例えば、細
胞傷害アッセイまたは細胞増殖アッセイを使用して、エンドカインαポリペプチ
ドを培養中の細胞に添加し、細胞でのエンドカインの効果を、細胞の数の増減を
測定することで決定する。

【００５４】 当然のことながら、遺伝コードの縮重に起因して、当業者は、上述の核酸配列
に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７
％、９８％または９９％同一な配列を有する多くの核酸分子が、「エンドカイン
αタンパク質活性を有する」ポリぺプチドをコードすることを即座に認識する。
事実、これらの縮重改変体は全て、同じポリぺプチドをコードするので、このこ
とは、たとえ上記した比較アッセイを行わなくても当業者にとって明らかである
。縮重改変体ではない核酸分子に関しては、その相当数がまた、エンドカインα
タンパク質活性を有するポリぺプチドをコードすることが、当該分野においてさ
らに認識される。これはなぜなら、当業者は、タンパク質機能にあまり有意に影
響を及ぼしそうにないか、または有意に影響を及ぼしそうにないかのいずれかの
アミノ酸置換（例えば、ある脂肪族アミノ酸を第二の脂肪族アミノ酸と置換する
）を十分に認識しているからである。

【００５５】 例えば、表現型的にサイレントなアミノ酸置換の作製方法に関するガイダンス
が、Ｂｏｗｉｅ，Ｊ．Ｕ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１３０６−１３１０（
１９９０）に提供され、ここで、著者らは変化に対するアミノ酸配列の寛容性を
研究するための２つの主要なストラテジーがあることを指摘する。第１の方法は
、変異が自然の選択によって容認されるか、または拒絶されるかのいずれかでの
進化の過程に依存する。第２のアプローチは、機能を維持する配列を同定するた
めに、クローン化された遺伝子の特定の位置でアミノ酸変化を導入するための遺
伝子工学を使用し、そして選択またはスクリーニングする。著者らが言及するよ
うに、これらの研究は、タンパク質がアミノ酸置換に驚くほど寛容であることを
明らかにした。著者らはさらに、どのアミノ酸変化が、タンパク質中の特定の位
置で許容されるようであるかを示す。例えば、ほとんど埋もれているアミノ酸残
基は、非極性側鎖を必要とするが、表面側鎖の特徴は、一般にほとんど保存され
ない。他のこのような表現型的にサイレントな置換は、Ｂｏｗｉｅ，Ｊ．Ｕ．ら
，前出に提供され、そしてこの参考文献が、本明細書中で引用されている。

【００５６】 「エンドカインα機能活性を有するポリペプチド」とは、例えば、特定の免疫
アッセイまたは生物学的アッセイにおいて測定される、本発明のエンドカインα
レセプター（完全長のポリペプチド、またはスプライス改変体のいずれか）の活
性に対して、類似の活性（必ずしも同じではない）を示すポリペプチドが意図さ
れる。例えば、エンドカインα活性は、エンドカインαリガンド（例えば、ＴＲ
１１（ＧＩＴＲ、ＡＩＴＲ））と結合するエンドカインαポリペプチドの能力を
決定することにより測定され得る。エンドカインα活性はまた、増殖、分化また
は活性化を刺激するか、またはＴＮＦ−αの産生を刺激するか、および／または
ポリペプチド（例えば、Ｂ細胞、Ｔ細胞および単球）を発現する細胞中でのＩＬ
−１２の産生を阻害するようなポリペプチド（例えば、細胞表面で遊離している
か、または発現される同属リガンド）の能力を決定することで測定され得る。

【００５７】 本発明は、本明細書中に記載の単離された核酸分子（すなわち、ポリヌクレオ
チド）のフラグメントにさらに指向される。例えば、寄託されたｃＤＮＡ（クロ
ーン９７６４０）のヌクレオチド配列、寄託されたｃＤＮＡによってコードされ
るポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、図１中の寄託されたポリペ
プチド配列をコードするヌクレオチド配列（配列番号：２）、図１に示されるヌ
クレオチド配列（配列番号１）、またはこれらの相補鎖を有する単離された核酸
分子のフラグメントによって、少なくとも１５ヌクレオチド、より好ましくは、
少なくとも約２０ヌクレオチド、さらにより好ましくは、少なくとも３０ヌクレ
オチド、およびなおさらにより好ましくは、少なくとも約４０、５０、１００、
１５０、２００、２５０、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４５０、
５００、５５０、または６００分子長のフラグメントが意図される。この文脈に
おいて「約（おおよそ）」は、特に記載された値、あるいはそれより数個（５、
４、３、２、または１）のヌクレオチドだけ大きいかまたは小さな値を含む。こ
れらのフラグメントは、本明細書中で議論されるように、診断プローブおよびプ
ライマーとしての多数の使用を含むが、それらに限定されない使用を有する。当
然のことながら、より大きなフラグメント（例えば、５０１〜１５００ヌクレオ
チド長のフラグメント）はまた、寄託されたｃＤＮＡ（クローン９７６４０）の
ヌクレオチド配列の全部ではなくてもほとんどに対応するフラグメントとして、
または図１（配列番号：１）に示されるように、本発明に従って有用である。例
えば、少なくとも２０ヌクレオチド長のフラグメントとは、例えば、寄託された
ｃＤＮＡのヌクレオチド配列、または図１（配列番号：１）に示されるようなヌ
クレオチド配列由来の２０以上の連続的な塩基を含むフラグメントが意図される
。

【００５８】 本発明のエンドカインαポリヌクレオチドフラグメントの代表例としては、例
えば、以下の配列番号１のヌクレオチド配列、またはそれらの相補鎖、または寄
託されたクローンに含有されるｃＤＮＡを含むか、あるいはそれらからなるフラ
グメントが挙げられる：約１〜５０、５１〜１００、１０１〜１５０、１５１〜
２００、２０１〜２５０、２５１〜３００、３０１〜３５０、３５１〜４００、
４０１〜４５０、４５１〜５００、５０１〜５５０、５５１〜６００、６００〜
６５０、６５１〜７００、７０１〜７５０、７５１〜８００、８０１〜８５０、
８５１〜９００、９０１〜９５０、９５１〜１０００、１００１〜１０５０、１
０５１〜１１００、１１０１〜１１５０、１１５１〜１２００、１２０１〜１２
５０、１２５１〜１３００、１３０１〜１３５０、１３５１〜１４００、１４０
１〜１４５０、１４５１〜１５００、１５０１〜１５５０、１５５１〜１６００
、１６０１〜１６５０、１６５１〜１７００、１７０１〜１７５０、１７５１〜
１８００、および／または１８０１から１８４０。この文脈において、「おおよ
そ（約）」は、特に記載された範囲、あるいはいずれかの末端もしくは両方の末
端において、これより数個（５、４、３、２、または１）のヌクレオチドだけ大
きいか、または小さな範囲を含む。

【００５９】 特定の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドフラグメントは、以下の
配列番号１のヌクレオチド配列、またはそれらの相補鎖を含むか、あるいはそれ
らからなる：９６１〜１０００、１７３０〜１７７０、１７７０〜１８００、お
よび／または１８００から１８４０。これらのポリヌクレオチドフラグメントに
ハイブリダイズするポリヌクレオチドがまた、本発明によって包含される。

【００６０】 好ましくは、本発明のポリヌクレオチドフラグメントは、エンドカインα機能
活性を示すポリペプチドをコードする。「機能的活性」を示すポリペプチドとは
、全長エンドカインαポリペプチドと関連した１つ以上の公知の機能的活性を示
し得るポリペプチドを意味する。このような機能的活性としては、生物学的活性
（例えば、Ｂ細胞の増殖、分化または活性化の刺激；Ｔ細胞の増殖、分化または
活性化の刺激；単球でのＴＮＦ−α産生の刺激；および／または単球でのＩＬ−
１２産生の阻害）、抗原性（抗エンドカインα抗体に結合する（または結合する
ことについて、エンドカインαポリペプチドと競合する）能力）、免疫原性（エ
ンドカインαポリペプチドに結合する抗体を産生する能力）、ネイティブなエン
ドカインαと多量体を形成する能力、およびエンドカインαポリペプチドについ
てのレセプターまたはリガンドに結合する能力が挙げられるが、これらに限定さ
れない（例えば、ＴＲ１１（米国特許出願第０９／１７６，２００を参照のこと
））。

【００６１】 エンドカインαポリペプチド、ならびにそれらのフラグメント、改変体、誘導
体、およびアナログの機能的特性は、種々の方法でアッセイされ得る。例えば、
全長エンドカインαポリケチドの抗エンドカインα抗体への結合について結合す
るか、またはそれと競合する能力についてアッセイする、１つの実施形態では、
当該分野で公知の種々の免疫アッセイが、用いられ得る。このようなアッセイと
しては、放射免疫アッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、「サン
ドイッチ」免疫アッセイ、免疫放射分析アッセイ、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散
アッセイ、インサイチュ免疫アッセイ（例えば、コロイド金、酵素または放射性
同位体標識を用いる）、ウェスタンブロット、沈降反応、凝集アッセイ（例えば
、ゲル凝集アッセイ、血球凝集アッセイ）、補体結合アッセイ、免疫蛍光アッセ
イ、プロテインＡアッセイ、および免疫電気泳動アッセイなどのような技術を用
いる競合および非競合アッセイ系が挙げられるが、これらに限定されない。１つ
の実施形態では、抗体結合が、一次抗体上の標識を検出することによって検出さ
れる。別の実施形態では、この一次抗体は、この一次抗体に対する二次抗体また
は試薬の結合を検出することによって検出される。さらなる実施形態では、この
二次抗体が標識される。多くの手段が、免疫アッセイにおける結合の検出につい
て当該分野で公知であり、そして本発明の範囲内である。

【００６２】 別の実施形態では、同定されたエンドカインαリガンド（例えば、ＲＴ１１）
、または本発明のポリペプチドフラグメント、改変体、または誘導体が多量体化
する能力が評価される場合、結合が、例えば、還元および非還元ゲルクロマトグ
ラフィー、タンパク質アフィニティークロマトグラフィー、ならびにアフィニテ
ィーブロッティングのような当該分野で周知の手段によって、アッセイされ得る
。一般には、Ｐｈｉｚｉｃｋｙ、Ｅ．ら、１９９５、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅ
ｖ．５９：９４−１２３（１９９５）を参照のこと。別の実施形態では、その基
質へのエンドカインα結合のポリペプチドの結合の生理学的相関（シグナル伝達
）がアッセイされ得る。

【００６３】 さらに、本明細書中に記載のアッセイ（実施例５〜８を参照のこと）および当
該分野で公知の他の方法は、エンドカインαポリペプチドならびにそれらのフラ
グメント、改変体、誘導体、およびアナログが、生物学的活性に関連したエンド
カインαを（例えば、Ｂ細胞の増殖、分化または活性化の刺激；Ｔ細胞の増殖、
分化または活性化の刺激；単球でのＴＮＦ−α産生の刺激；および／または単球
でのＩＬ−１２産生の阻害（インビトロまたはインビボのいずれかで））惹起す
る能力を測定するために、慣用的に適用され得る。他の方法は、当業者に公知で
あり、そして本発明の範囲内である。

【００６４】 （ベクターおよび宿主細胞） 本発明はまた、ベクター（本発明の単離されたＤＮＡ分子を含む）、組換えベ
クターを用いて遺伝子操作された宿主細胞、および組換え技術によるエンドカイ
ンαポリペプチドまたはそれらの部分の産生に関する。

【００６５】 組換え構築物が、感染、形質導入、トランスフェクション、トランスべクショ
ン（ｔｒａｎｓｖｅｃｔｉｏｎ）、エレクトロポレーション、および形質転換の
ような周知の技術を使用して宿主細胞に導入され得る。ベクターは、例えば、フ
ァージベクター、ウイルスベクター、またはレトロウイルスベクターであり得る
。レトロウイルスベクターは、複製能があるかまたは複製欠損であり得る。後者
の場合、ウイルス増殖は、一般に、相補的な宿主細胞においてのみ起こる。

【００６６】 ポリヌクレオチドは、宿主における増殖のために、選択マーカーを含むベクタ
ーに結合され得る。一般的に、プラスミドベクターは、リン酸カルシウム沈澱物
のような沈澱物か、または荷電された脂質との複合体で導入される。ベクターが
ウイルスである場合、ベクターは、適切なパッケージング細胞株を用いてインビ
トロでパッケージングされ得、次いで宿主細胞に形質導入され得る。

【００６７】 目的のポリヌクレオチドの対するｃｉｓ作用コントロール領域を含むベクター
が好ましい。適切なｔｒａｎｓ作用因子は、宿主細胞によって供給されるか、相
補ベクターにより供給されるか、または宿主への導入の際にベクター自身によっ
て供給され得る。

【００６８】 この点における特定の好ましい実施形態において、このベクターは、誘導性お
よび／または型特異性であり得る、特異的発現を提供する。このようなベクター
の中で特に好ましくは、温度および栄養分の添加のような処理しやすい環境因子
によって誘導されるベクターである。

【００６９】 本発明において有用な発現ベクターには、染色体ベクター、エピソームベクタ
ーおよびウイルス誘導ベクターが挙げられる（例えば、細菌性プラスミド、バク
テリオファージ、酵母エピソーム、酵母染色体エレメント、ウイルス（例えば、
バキュロウイルス、パポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏
痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルスおよびレトロウイルス）、ならびにこれらの組
み合わせから誘導されるベクター（例えば、コスミドおよびファージミド））。
例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ、前出；Ｓａｍｂｒｏｏｋ、前出を参照のこと。

【００７０】 そのＤＮＡ挿入物は、いくつかの名前を挙げると、ファージλＰＬプロモータ
ー、Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃプロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉ ｔｒｐプロモーター、
およびＥ．ｃｏｌｉ ｔａｃプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーターおよびＳ
Ｖ４０後期プロモーター、ならびにレトロウイルスＬＴＲのプロモーターなどの
ような、適切なプロモーターに作動可能に連結されるべきである。他の適切なプ
ロモーターは、当業者に公知である。発現構築物は、転写開始のための部位、転
写終結のための部位、および転写された領域において翻訳のためのリボソーム結
合部位をさらに含む。構築物によって発現される成熟転写物のコード部分は、始
めにＡＵＧを開始する翻訳および翻訳されるべきポリペプチドの末端に適切に位
置付けされる終止コドンを含む。

【００７１】 示されたように、発現ベクターは、好ましくは、少なくとも１つの選択マーカ
ーを含む。このようなマーカーとしては、真核生物細胞培養についてはジヒドロ
葉酸レダクターゼ、またはネオマイシン耐性、ならびにＥ．ｃｏｌｉおよび他の
細菌における培養についてはテトラサイクリン耐性遺伝子、またはアンピシリン
耐性遺伝子が挙げられる。適切な宿主の代表的な例としては、細菌細胞（例えば
、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ細胞、およびＳａｌｍｏｎｅｌ
ｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ細胞）；真菌細胞（例えば酵母細胞）；昆虫細胞
（例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２細胞およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ Ｓｆ
９細胞）；動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、およびＢｏｗｅｓメラ
ノーマ細胞）；ならびに植物細胞が挙げられる。上記の宿主細胞のための適切な
培養培地および条件は当該分野で公知である。

【００７２】 細菌における使用に好ましいベクターの中には、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、お
よびｐＱＥ−９（ＱＩＡＧＥＮから入手可能）；ｐＢＳベクター、Ｐｈａｇｅｓ
ｃｒｉｐｔベクター、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６
ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能）；なら
びにｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐ
ＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能）が含まれる。好ましい真核生物ベ
クターの中には、ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１および
ｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能）；ならびにｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ
、ｐＭＳＧ、およびｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能）がある。他の
適切なベクターは、当業者に容易に明らかである。

【００７３】 本発明における使用のために適切な公知の細菌性プロモーターの中には、Ｅ．
ｃｏｌｉ ｌａｃＩおよびｌａｃＺプロモーター、Ｔ３およびＴ７プロモーター
、ｇｐｔプロモーター、ラムダＰＲプロモーター、ラムダＰＬプロモーターおよ
びｔｒｐプロモーターが挙げられる。適切な真核細胞のプロモーターには、ＣＭ
Ｖ即時初期プロモーター、ＨＳＶチミジンプロモーター、初期ＳＶ４０プロモー
ター、および後期ＳＶ４０プロモーター、レトロウイルスＬＴＲのプロモーター
（例えば、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）のプロモーター）、ならびにメタロチ
オネインプロモーター（マウスメタロチオネイン−Ｉプロモーター）が挙げられ
る。

【００７４】 宿主細胞への構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥ
ＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、カチオン性脂質媒介トランスフ
ェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染または他の方法によって
もたらされ得る。このような方法は、多くの標準的研究室マニュアルに記載され
ている（例えば、Ｄａｖｉｓら、Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８６））。

【００７５】 高等真核生物による本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの転写は、ベク
ターへのエンハンサー配列の挿入により増大され得る。エンハンサーは、所定の
宿主細胞型において、プロモーターの転写活性を増大するように作用するＤＮＡ
のシス作用性エレメント（通常、約１０〜３００ｂｐ）である。エンハンサーの
例としては、複製起点の後側に位置するＳＶ４０エンハンサー（１００〜２７０
ｂｐ）、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後側
のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。

【００７６】 小胞体内腔中、ペリプラズム空間中、または細胞外環境中への、翻訳されたタ
ンパク質の分泌については、適切な分泌シグナルが、発現されたポリペプチド中
に組み込まれ得る。このシグナルは、ポリペプチドに対して内因性であってもい
いし、またはそれらは、異種シグナルであってもよい。

【００７７】 このポリペプチドは、改変された形態（例えば、融合タンパク質）において発
現され得、そして分泌シグナルのみではなくさらなる異種機能領域もまた含み得
る。さらなる実施例において、さらなるアミノ酸、特に荷電したアミノ酸の領域
が、ポリペプチドのＮ末端に付加され、精製の間またはその後の取り扱いおよび
貯蔵の間の、宿主細胞中での安定性および持続性を改善し得る。また、示される
ように、領域はまた、精製を容易にするためにポリペプチドに付加され得る。こ
のような領域は、ポリペプチドの最終的な調製前に除去され得る。とりわけ、安
定性を改善し、かつ精製を容易にするために、分泌または排出を引き起こすペプ
チド部分のポリペプチドへの付加は、よく知られており、そして当該分野におけ
る慣用技術である。好ましい融合タンパク質は、レセプターを可溶化するために
有用である免疫グロブリン由来の異種領域を含む。例えば、ＥＰＡＯ ０，４６
４，５３３（また、カナダ国対応特許第２，０４５，８６９号）は、別のヒトタ
ンパク質またはその部分とともに免疫グロブリン分子の定常領域の種々の部分を
含む融合タンパク質を開示する。多くの場合、融合タンパク質のＦｃ部分は、治
療および診断における使用にかなり有益であり、従って、例えば、改良された薬
物動態学的な特性を生じ得る（ＥＰＡ ０，２３２，２６２）。一方、いくつか
の使用については、記載される有利な様式において融合タンパク質が発現され、
検出され、そして精製された後に、Ｆｃ部分を欠失させることが望ましい。Ｆｃ
部分が、治療および診断における使用の妨害であることが判明する場合、例えば
、融合タンパク質が免疫化のための抗原として使用される場合がそうである。例
えば、薬物の発見において、ｈＩＬ−５のようなヒトタンパク質は、ｈＩＬ−５
のようなアンタゴニストを同定するためのハイズループットスクリーニングアッ
セイの目的のためにＦｃ部分と融合されてきた（Ｄ．Ｂｅｎｎｅｔｔら、Ｊｏｕ
ｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ８：５２−５
８（１９９５）；およびＫ．Ｊｏｈａｎｓｏｎら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏ
ｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２７０（１６）：９４５９−
９４７１（１９９５）を参照のこと）。

【００７８】 エンドカインαタンパク質は、周知の方法により組換え細胞培養物から回収お
よび精製され得る。この方法としては、硫酸アンモニウム沈澱またはエタノール
沈澱、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロ
ースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティー
クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、およびレク
チンクロマトグラフィーが挙げられる。最も好ましくは、高速液体クロマトグラ
フィー（「ＨＰＬＣ」）が、精製に用いられる。

【００７９】 本発明のポリペプチドとしては、天然に精製された産物、化学合成手順の産物
、および原核生物宿主もしくは真核生物宿主（例えば、細菌細胞、酵母細胞、高
等植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を含む）から組換え技術によって産
生される産物が挙げられる。組換え産生手順において使用される宿主に依存して
、本発明のポリペプチドは、グリコシル化されていてもよく、またはグリコシル
化されていなくてもよい。さらに、本発明のポリペプチドはまた、いくつかの場
合、宿主媒介プロセスの結果として、開始改変メチオニン残基を含み得る。

【００８０】 本明細書中に議論されるベクター構築物を含む宿主細胞を包含することに加え
て、本発明はまた、内因性遺伝物質（例えば、エンドカインαコード配列）を欠
失するかまたは置換し、そして／あるいは本発明のエンドカインαポリヌクレオ
チドに作動可能に連結し、そして内因性エンドカインαポリヌクレオチドを活性
化、変更、および／または増幅する遺伝物質（例えば、異種ポリヌクレオチド配
列）を含むように操作されている、脊椎動物起源、特に哺乳動物起源の初代宿主
細胞、二次性宿主細胞、および不死化宿主細胞を含む。例えば、当該分野におい
て公知の技術が、異種制御領域（例えば、プロモーターおよび／またはエンハン
サー）および内因性エンドカインαポリヌクレオチド配列を、相同組換えを介し
て作動可能に結合させるために使用され得る（例えば、米国特許第５，６４１，
６７０号（１９９６年６月２４日刊行）；国際公開番号ＷＯ９６／２９４１１（
１９９６年９月２６日公開）；国際公開番号ＷＯ９４／１２６５０（１９９４年
８月４日公開）；Ｋｏｌｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ ８６：８９３２〜８９３５（１９８９）；およびＺｉｊｌｓｔｒａら、Ｎ
ａｔｕｒｅ ３４２：４３５〜４３８（１９８９）（これらの各々の開示は、そ
れらの全体において参考として援用される）を参照のこと）。

【００８１】 （エンドカインαポリペプチドおよびペプチド） 本発明はさらに、寄託されたｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列、ま
たは図１に示されるアミノ酸配列（配列番号２）、あるいは上記ポリペプチドの
部分を含むペプチドまたはポリペプチドを有する、単離されたエンドカインαポ
リペプチドを提供する。用語「ペプチド」および「オリゴペプチド」は、（一般
に認識されるように）同義であるとみなされ、そして各用語は、状況が、ペプチ
ジル結合によって結合される少なくとも２つのアミノ酸の鎖を示すために必要と
する場合に、交換可能に使用され得る。用語「ポリペプチド」は、１０個よりも
多くのアミノ酸残基を含む鎖に対して本明細書で使用される。本明細書中の全て
のオリゴペプチドおよびポリペプチドの式または配列は、左から右に、そしてア
ミノ酸末端からカルボキシ末端の方向に記載される。

【００８２】 「単離された」ポリペプチドまたはタンパク質によって、ポリペプチドまたは
タンパク質が、その本来の環境から取り出されることを意味する。例えば、組換
え産生されたポリペプチドおよび組換え宿主細胞中に発現されたタンパク質は、
例えば、ＳｍｉｔｈおよびＪｏｈｎｓｏｎ、Ｇｅｎｅ ６７：３１〜４０（１９
８８）に記載される１工程の方法のような任意の適切な技術によって実質的に精
製されている、ネイティブまたは組換えポリペプチドおよびタンパク質と同様に
、本発明の目的について単離されたとみなされる。

【００８３】 エンドカインαポリペプチドのいくつかのアミノ酸配列は、このタンパク質の
構造および機能に有意な効果を及ぼすことなく変更され得ることが、当該分野に
おいて認識される。配列中のこのような差異が意図される場合、タンパク質上に
、活性を決定する重要な領域が存在することが理解されるはずである。一般に、
同様な機能を行う残基が使用される場合、三次構造を形成する残基を置換するこ
とが可能である。他の例では、残基の型は、タンパク質の非重要領域にて変更が
生じる場合、完全に重要ではなくてもよい。

【００８４】 従って、本発明はさらに、実質的なエンドカインαポリペプチド活性を示すか
、またはエンドカインαタンパク質の領域（例えば、以下に議論されるタンパク
質フラグメント）を含む、エンドカインαポリペプチドのバリエーションを含む
。このような変異としては、欠失、挿入、反転、反復、および型の置換（例えば
、ある疎水性残基を別の残基と置換すること、しかし、規則として、強力な親水
性残基を強力な疎水性残基と置換しない）が挙げられる。小さな電荷またはこの
ような「中性」アミノ酸の置換は、一般的に、活性にほとんど効果を有しない。

【００８５】 代表的には、脂肪族アミノ酸のＡｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅの間の
一対一の置換；ヒドロキシル残基のＳｅｒおよびＴｈｒの交換；酸性残基のＡｓ
ｐおよびＧｌｕの交換；アミド残基のＡｓｎとＧｌｎとの間の置換、塩基性残基
のＬｙｓおよびＡｒｇの交換；ならびに芳香族残基の間でのＰｈｅ、Ｔｙｒの間
の置換が、保存的置換として理解される。

【００８６】 上記に詳細に示されるように、表現型的にサイレントなようである（すなわち
、機能に対して有意に有害な効果を有さないようである）アミノ酸の交換に関す
るさらなる指針は、Ｂｏｗｉｅ，Ｊ．Ｕ．ら、「Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ ｔｈ
ｅ Ｍｅｓｓａｇｅ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：Ｔｏｌｅｒ
ａｎｃｅ ｔｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ」、Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ ２４７：１３０６−１３１０（１９９０）において見出され得る。

【００８７】 従って、配列番号２のポリペプチドのフラグメント、誘導体またはアナログ、
あるいは寄託されたｃＤＮＡによってコードされるポリペプチドのフラグメント
、誘導体またはアナログは、（ｉ）１つ以上のアミノ酸残基が、保存されたかま
たは保存されていないアミノ酸残基（好ましくは保存されたアミノ酸残基）で置
換され、そしてこのように置換されたアミノ酸残基が遺伝コードによりコードさ
れる残基であってもよいし、またはなくてもよい、ポリペプチドのフラグメント
、誘導体またはアナログ；あるいは（ｉｉ）１つ以上のアミノ酸残基が、置換基
を含む、ポリペプチドのフラグメント、誘導体またはアナログ；あるいは（ｉｉ
ｉ）成熟ポリペプチドが別の化合物、例えばポリペプチドの半減期を増加させる
化合物（例えば、ポリエチレングリコール）と融合される、ポリペプチドのフラ
グメント、誘導体またはアナログ；あるいは（ｉｖ）さらなるアミノ酸が、Ｉｇ
Ｇ Ｆｃ融合領域ペプチドまたはリーダー配列もしくは分泌配列または成熟ポリ
ペプチドの精製のために使用される配列またはプロタンパク質配列のような、成
熟ポリペプチドと融合される、ポリペプチドのフラグメント、誘導体、またはア
ナログ、であり得る。このようなフラグメント、誘導体およびアナログは、本明
細書における教示から当業者の範囲内であるとみなされる。

【００８８】 特定の目的は、荷電したアミノ酸の、別の荷電したアミノ酸および中性アミノ
酸または負に荷電したアミノ酸での置換である。後者は、エンドカインαタンパ
ク質の特徴を改善するために減少された正の荷電を有するタンパク質を生じる。
凝集の予防は、非常に望まれる。タンパク質の凝集は、活性の損失を生じるのみ
ならず、薬学的処方物を調製する場合に問題であり得る。なぜなら、これらは免
疫原性であり得るからである（Ｐｉｎｃｋａｒｄら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ．２：３３１〜３４０（１９６７）；Ｒｏｂｂｉｎｓら、Ｄｉａｂｅｔ
ｅｓ ３６：８３８〜８４５（１９８７）；Ｃｌｅｌａｎｄら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅ
ｖ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ １
０：３０７〜３７７（１９９３））。

【００８９】 アミノ酸の置換はまた、細胞表面レセプターへの結合の選択性を変化し得る。
Ｏｓｔａｄｅら、Ｎａｔｕｒｅ ３６１：２６６〜２６８（１９９３）は、ＴＮ
Ｆ−αの、ＴＮＦレセプターの２つの公知の型の１つのみへの選択的結合を生じ
る特定の変異を記載している。従って、本発明のエンドカインαポリペプチドは
、天然の変異か、またはヒトの操作のいずれかによる１つ以上のアミノ酸置換、
欠失または付加を含み得る。

【００９０】 示されるように、タンパク質のフォールディングまたは活性に有意に影響しな
い保存的なアミノ酸の置換のような、重要でない性質の変化が好ましい（表１を
参照のこと）。

【００９１】

【表１】 もちろん、当業者が作製するアミノ酸置換の数は、上記の因子を含む多くの因
子に依存する。一般的に言えば、任意の所定のエンドカインαポリペプチドの置
換の数は、対象に依存して、５０、４０、３０、２０、１０、５または３より多
くない。

【００９２】 機能のために必須である、本発明のエンドカインαタンパク質におけるアミノ
酸は、当該分野で公知の方法（例えば、部位特異的変異誘発またはアラニン走査
変異誘発）によって同定され得る（ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓ、Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ ２４４：１０８１〜１０８５（１９８９））。後者の手順は、単
一のアラニン変異を分子内のあらゆる残基に導入する。次いで、得られる変異型
分子は、生物学的活性（例えば、レセプター結合またはインビトロまたはインビ
トロ増殖活性）について試験される。リガンド−レセプター結合のために重要な
部位はまた、結晶化、核磁気共鳴または光親和性標識法のような構造分析によっ
て決定され得る（Ｓｍｉｔｈら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：８９９〜９０
４（１９９２）およびｄｅ Ｖｏｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５：３０６〜３１
２（１９９２））。

【００９３】 本発明のポリペプチドは、好ましくは、単離された形態で提供される。「単離
されたポリペプチド」によって、そのネイティブな環境から取り出されたポリペ
プチドが意図される。従って、組換え宿主細胞中で産生され、そして／またはそ
の中に含まれるポリペプチドは、本発明の目的のために単離されたとみなされる
。組換え宿主細胞から部分的または実質的に精製されたポリペプチドもまた、「
単離されたポリペプチド」として意図される。例えば、エンドカインαポリペプ
チドの組換え産生されたバージョンが、ＳｍｉｔｈおよびＪｏｈｎｓｏｎ Ｇｅ
ｎｅ ６７：３１〜４０（１９８８）に記載される１工程の方法によって実質的
に精製され得る。

【００９４】 本発明のポリペプチドは、（ａ）図１に示されるような完全アミノ酸配列（配
列番号２）；（ｂ）図１に示されるが（配列番号２）、Ｎ末端メチオニン残基を
欠く完全アミノ酸配列；（ｃ）ＡＴＣＣ寄託番号９７６４０に含まれるｃＤＮＡ
クローンによってコードされるアミノ酸配列を有するエンドカインαポリペプチ
ドのアミノ酸配列；ならびに（ｄ）（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）のポリペプチ
ド、および本明細書中に記載されるポリペプチドに、少なくとも８０％、８５％
、９０％、９２％または９５％同一、より好ましくは少なくとも９６％、９７％
、９８％または９９％同一なポリペプチドのうちのいずれか１つのエピトープ保
有部分のアミノ酸配列を含むか、あるいはそれらからなり、そしてまた、少なく
とも３０個のアミノ酸およびより好ましくは少なくとも５０個のアミノ酸を有す
るこのようなポリペプチドの部分を含む。

【００９５】 エンドカインαポリペプチドの参照アミノ酸配列に、例えば、少なくとも９
５％「同一」なアミノ酸配列を有するポリペプチドにより、ポリペプチド配列が
、エンドカインαポリペプチドの参照アミノ酸配列の各１００アミノ酸ごとに５
つまでのアミノ酸変化を含み得ることを除いて、そのポリペプチドのアミノ酸配
列が、参照配列に同一であることが意図される。換言すると、参照アミノ酸配列
に少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るために、参
照配列のアミノ酸残基の５％までが、欠失または、別のアミノ酸で置換され得る
か、または参照配列の合計アミノ酸残基の５％までの幾らかのアミノ酸が、その
参照配列に挿入され得る。参照配列のこれらの変化は、参照アミノ酸配列のアミ
ノ末端位置かまたはカルボキシ末端位置でか、あるいはこれらの末端位置間のど
こかで生じ得、参照配列の残基間で個々にか、または参照配列内で１個以上連続
する群としてかのいずれかで間に散在する。

【００９６】 実際的な問題として、任意の特定のポリペプチドが、例えば、図１（配列番号
２）に示されるアミノ酸配列、または寄託されたｃＤＮＡクローンによりコード
されるアミノ酸配列に、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、
９６％、９７％、９８％または９９％同一である配列を含むか、またはこれらか
なるかどうかは、ＢＥＳＴＦＩＴプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅ
ｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ ｆｏｒ Ｕ
ｎｉｘ（登録商標），Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎ
ｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅｒｃｈ Ｐａｒｋ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ
ｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ ５３７１１）のような公知のコンピュータープ
ログラムを使用して従来のように決定され得る。特定の配列が、本発明に従う参
照配列に、例えば９５％同一かどうか決定するために、ＢＥＳＴＦＩＴまたは任
意の他の配列アライメントプログラムを使用する場合、もちろん、参照アミノ酸
配列の全長に渡って同一性の百分率が算出されるように、そして参照配列中のア
ミノ酸残基の合計の数の５％までの相同性のギャップが許容されるように、パラ
メーターは設定される。

【００９７】 特定の実施形態において、参照（問い合わせ）配列（本発明の配列）と対象配
列との間の同一性（全体的配列整列もいわれる）は、Ｂｒｕｔｌａｇら（Ｃｏｍ
ｐ．Ａｐｐ．Ｂｉｏｓｃｉ．６：２３７−２４５（１９９０））のアルゴリズム
に基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータープログラムを使用して決定され得る。ＦＡ
ＳＴＤＢアミノ酸整列に用いられる好ましいパラメーターは：Ｍａｔｒｉｘ＝Ｐ
ＡＭ ０、ｋ−ｔｕｐｌｅ＝２、Ｍｉｓｍａｔｃｈ Ｐｅｎａｌｔｙ＝１、Ｊｏ
ｉｎｉｎｇ Ｐｅｎａｌｔｙ＝２０、Ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ Ｇｒｏｕｐ
Ｌｅｎｇｔｈ＝０、Ｃｕｔｏｆｆ Ｓｃｏｒｅ＝１、Ｗｉｎｄｏｗ Ｓｉｚｅ
＝配列の長さ、Ｇａｐ Ｐｅｎａｌｔｙ＝５、Ｇａｐ Ｓｉｚｅ Ｐｅｎａｌｔ
ｙ＝０．０５、Ｗｉｎｄｏｗ Ｓｉｚｅ＝５００または対象アミノ酸配列の長さ
（どちらかより短い方）である。この実施形態に従うと、対象配列が、Ｎ末端ま
たはＣ末端欠失により（内部の欠失のためではなく）問い合わせ配列よりも短い
場合、ＦＡＳＴＤＢプログラムが、全体的な同一性パーセントを算定する場合に
、対象配列のＮ末端短縮およびＣ末端短縮を考慮しないという事実を考慮して、
手動の補正が結果に対してなされる。問い合わせ配列に対する、Ｎ末端およびＣ
末端で短縮されている対象配列についての、同一性パーセントは、問い合わせ配
列の総塩基のパーセントとして、対応する対象残基と一致／整列しない、対象配
列のＮ末端およびＣ末端である問い合わせ配列の残基の数を計算することによっ
て補正される。残基が一致／整列されているか否かの決定は、ＦＡＳＴＤＢ配列
整列の結果によって決定される。次いで、このパーセントは、同一性パーセント
から差し引かれ、上記のＦＡＳＴＤＢプログラムによって特定のパラメーターを
使用して計算され、最終的な同一性パーセントのスコアに到達する。この最終的
な同一性パーセントのスコアは、この実施形態の目的で使用されるものである。
問い合わせ配列と一致／整列していない対象配列のＮ末端およびＣ末端側の残基
のみが、同一性パーセントのスコアを手動で調整する目的のために考慮される。
すなわち、問い合わせ残基位置のみが、対象配列の最も遠いＮ末端およびＣ末端
残基の外側に位置する。例えば、９０アミノ酸残基の対象配列は、同一性パーセ
ントを決定するために１００残基の問い合わせ配列と整列される。欠失が対象配
列のＮ末端で生じ、そしてそれゆえＦＡＳＴＤＢ整列は、Ｎ末端での最初の１０
残基の一致／整列を示さない。１０個の不対合残基は、配列の１０％（一致して
いないＮ末端およびＣ末端での残基の数／問い合わせ配列中の残基の総数）を表
し、その結果ＦＡＳＴＤＢプログラムによって計算される同一性パーセントのス
コアから１０％が差し引かれる。残りの９０残基が完全に一致した場合、最終的
な同一性パーセントは９０％である。別の例において、９０残基の対象配列が、
１００残基の問い合わせ配列と比較される。この場合、欠失は、内部欠失であり
、そのため問い合わせ配列と一致／整列しない対象配列のＮ末端またはＣ末端の
残基は存在しない。この場合、ＦＡＳＴＤＢによって算定される同一性パーセン
トは、手動で補正されない。再び、ＦＡＳＴＤＢ整列において示される、問い合
わせ配列と一致／整列しない対象配列のＮ末端およびＣ末端の外の残基位置のみ
が手動で補正される。他の手動の補正は、この実施形態の目的のためにはなされ
ない。

【００９８】 本願発明者らは、エンドカインαタンパク質が、３つの主要構造ドメインを示
す１６９残基タンパク質であることを発見した。細胞内ドメインが、図１（配列
番号２）の約１〜約１７の残基内に同定された。この膜貫通ドメインは、図１（
配列番号２）の約１８〜約４３の残基内に同定された。この細胞外ドメインは、
図１（配列番号２）の約４４〜約１６９の残基内に同定された。従って、本発明
は、さらに、以下から選択されたポリペプチドを含む好ましいエンドカインαタ
ンパク質フラグメントを提供する：エンドカインα細胞内ドメイン、膜貫通ドメ
インおよびエンドカインα細胞外ドメイン。

【００９９】 エンドカインαタンパク質の細胞外ドメインは、免疫グロブリン（ＩｇＧ）の
定常ドメインの部分と組み合わせられ、キメラポリペプチドを生じ得る。これら
の融合タンパク質は、増加したインビボでの半減期を示す。このことは、例えば
、ヒトＣＤ４ポリペプチドの最初の２つのドメインおよび哺乳動物の免疫グロブ
リンの重鎖または軽鎖の定常領域の種々のドメインからなるキメラタンパク質に
ついて示された（ＥＰ Ａ ３９４，８２７；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔ
ｕｒｅ ３３１：８４−８６（１９８８））。（ＩｇＧ部分に起因して）ジスル
フィド結合二量体構造を有する融合タンパク質はまた、単量体細胞外ドメイン単
独よりも、リガンドの結合および中和においてより効果的であり得る（Ｆｏｕｎ
ｔｏｕｌａｋｉｓら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２７０：３９５８−３９６４（１
９９５））。

【０１００】 本発明のポリペプチドフラグメントは、寄託されたクローンに含まれるｃＤＮ
Ａによってコードされるか、もしくは寄託されたクローンに含まれるヌクレオチ
ド配列に対してハイブリダイズする（例えば、ストリンジェントなハイブリダイ
ゼーション条件下で）核酸によってコードされる配列番号２に含まれるアミノ酸
配列、または図１（配列番号１）に示されるアミノ酸配列、もしくはそれに加え
てその相補鎖を含むか、あるいはそれからなるポリペプチドを含む。タンパク質
フラグメントは、そのフラグメントが、部分または領域、最も好ましくは、単一
の連続した領域として形成するより大きなポリペプチド内に、「自由にとどまっ
ている（ｆｒｅｅ−ｓｔａｎｄｉｎｇ）」か、または含まれ得る。本発明のポリ
ペプチドフラグメントの代表的な例としては、例えば、配列番号２のおおよそ以
下のアミノ酸残基を含むか、あるいはそれらからなるフラグメントが挙げられる
：１〜５０、５１〜１００、１０１〜１５０および／または１５１〜１６９。こ
の脈絡において、「おおよそ（約）」は、特定の列挙された範囲、およびいずれ
かの末端、または両方の末端において、いくつかの（５、４、３、２または１）
アミノ酸まで、より大きいかまたはより小さい範囲を含む。さらに、ポリペプチ
ドフラグメントは、長さが、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、
７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０または１
６８アミノ酸であり得る。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
はまた、本発明によって包含される。ポリヌクレオチドをコードするこれらの担
補体に対してハイブリダイズするポリヌクレオチドはまた、本発明によって包含
され、これらハイブリダイジングポリヌクレオチドによってコードされるポリペ
プチドも同様に包含される。

【０１０１】 エンドカインαの構造的寄与または機能的寄与によって特徴付けられるフラグ
メントは、本発明の特に好ましいフラグメントの１つである。このようなフラグ
メントには、全長エンドカインα（配列番号２）の以下を含むアミノ酸残基が挙
げられる：α−へリックスおよびα−へリックス形成領域（「α−領域」）、β
−シートおよびβ−シート形成領域（「β−領域」）、ターンおよびターン形成
領域（「ターン領域」）、コイルおよびコイル形成領域（「コイル領域」）、親
水性領域、疎水性領域、α両親媒性領域、β両親媒性領域、表面形成領域、なら
びに高抗原性指標領域（すなわち、Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆプログラムのデフ
ォルト（ｄｅｆａｕｌｔ）パラメータを使用して同定されるように、１．５より
大きいかまたは１．５に等しい抗原性指標を有する４つ以上の隣接したアミノ酸
を含む）。特定の好ましい領域は、図３に示される領域であり、そして図１（配
列番号２）に示されるアミノ酸配列の分析によって同定される、上述のタイプの
領域を含むが、これらに限定されない。このような好ましい配列は、以下を含む
：Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎ予測α−領域、β−領域、ターン領域、および
コイル領域；Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ予測α−領域、β−領域、ターン領域、お
よびコイル領域；Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ予測親水性領域および疎水性領
域；Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇαおよびβ両親媒性領域；Ｅｍｉｎｉ表面形成領域；な
らびにＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ高抗原性指標領域（これは、これらのコンピュ
ータプログラムのデフォルトパラメータを使用して予測された）。これらのポリ
ペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明によって包含される。

【０１０２】 上記のように、図３および／または表２に示されるエンドカインαの構造的寄
与または機能的寄与を表すデータは、デフォルトパラメータを使用するＤＮＡ^*
ＳＴＡＲの種々のモジュールおよびアルゴリズムを使用して生成された。好まし
い実施形態において、表２の欄ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸＩＩＩおよびＸＩＶに示され
るデータを使用して、抗原性について高い程度の潜在性を示すエンドカインαの
領域を決定し得る。高抗原性の領域が、免疫応答の初期の過程で抗原認識が起こ
り得る環境において、ポリペプチドの表面で曝露される傾向にあるポリペプチド
の領域を表す値を選択することによって、欄ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸＩＩＩおよび／
またはＩＶに示されるデータから決定される。

【０１０３】 これらの関連における特定の好ましい領域が図３に説明されるが、表２に示さ
れるように、図３に示されるデータの表による表現を使用することによって、表
されるか、または同定され得る。図３を得るために使用されるＤＮＡ^*ＳＴＡＲ
コンピュータアルゴリズム（元々のデフォルトパラメータが使用される）を使用
して、図３におけるデータを表の様式で与える（表２を参照のこと）。図３にお
けるデータの表様式を使用して、好ましい領域の特定の境界を容易に決定し得る
。

【０１０４】 図３および表２に説明される上述の好ましい領域は、図３に説明されるアミノ
酸配列の分析によって同定される上述のタイプの領域を含むが、これらに限定さ
れない。図３および表２に説明されるように、このような好ましい領域には、Ｇ
ａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎ α−領域、β−領域、ターン領域、およびコイル
領域、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ α−領域、β−領域、およびコイル領域、Ｋｙ
ｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ 親水性領域および疎水性領域、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ
α両親媒性領域およびβ両親媒性領域、Ｋａｒｐｌｕｓ−Ｓｃｈｕｌｚフレキ
シブル領域、Ｅｍｉｎｉ表面形成領域、ならびに高抗原性指標のＪａｍｅｓｏｎ
−Ｗｏｌｆ領域が挙げられる。

【０１０５】

【表２】 （アミノおよびカルボキシ末端欠失）上記のように、タンパク質のＮ末端から
の１つ以上のアミノ酸の欠失が、タンパク質の１つ以上の生物学的機能の改変ま
たは損失が生じるとしても、他の生物学的な活性はまだ保持され得る。従って、
短くなったエンドカインα Ｍａｄｏｎｎａｓの抗体を誘導する能力および／ま
たは抗体に結合する能力（この抗体は、ポリペプチドの完全または成熟した形態
を認識する）は、一般に、完全または成熟したポリペプチドの残基の大部分未満
が、Ｎ末端から除去されても保持される。完全なポリペプチドのＮ末端残基を欠
く特定のポリペプチドが、このような免疫学的活性を保持するか否かは、本明細
書に記載されるか、そうでなければ当該分野で公知の慣用的な方法によって容易
に決定され得る。多数の欠失したＮ末端アミノ酸残基を有するエンドカインαム
テインは、いくつかの生物学的活性または、免疫原性活性を保持し得る。実際に
、６個ほどに少ないエンドカインαアミノ酸残基からなるペプチドは、しばしば
、免疫応答を惹起し得る。

【０１０６】 従って、本発明は、さらに、図１（すなわち、配列番号２）に示されるエンド
カインαアミノ酸配列のアミノ末端から位置番号１６４のアスパラギン残基まで
の欠失される１つ以上の残基を有するポリペプチドおよびそのようなポリペプチ
ドをコードするポリヌクレオチドを提供する。特に、本発明は、図１（配列番号
２）の残基ｎ−１６９のアミノ酸残基を含むポリペプチドを提供し、ここで、ｎ
は、２〜１６４までの範囲の整数であり、そして１６５は、エンドカインαポリ
ペプチドの少なくとも免疫原性活性のために必要であると考えられている完全な
エンドカインαポリペプチドのＮ末端からの最初の残基の位置である。

【０１０７】 より特に、本発明は、図１に示されるエンドカインα配列の以下の残基からな
る群から選択されるメンバーのアミノ酸配列を含むか、あるいは、その配列から
なるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する：

【０１０８】

【化１】 本発明はまた、上記のエンドカインαポリペプチドをコードするポリヌクレオチ
ド配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７
％、９８％または９９％同一である、ポリヌクレオチド配列を含むか、あるいは
、そのポリヌクレオチド配列からなる核酸分子に関する。本発明はまた、異種ポ
リヌクレオチド配列に融合された上記のポリヌクレオチド配列を包含する。これ
らのポリヌクレオチド配列によってコードされたポリペプチドはまた、本発明に
よって包含される。

【０１０９】 また上記のように、タンパク質のＣ末端からの１つ以上のアミノ酸の欠失が、
タンパク質の１つ以上の生物学的機能の改変または損失を起こすとしても、他の
生物学的な活性はまだ保持され得る。従って、短くなったエンドカインαムテイ
ンの、抗体を誘導する能力および／または抗体に結合する能力（この抗体は、ポ
リペプチドの完全または成熟した形態を認識する）は、一般に、完全または成熟
したポリペプチドの残基の大部分未満がＣ末端から除去されても保持される。完
全なポリペプチドのＣ末端残基を欠く特定のポリペプチドがこのような免疫学的
活性を保持するか否かは、本明細書に記載されるか、そうでなければ当該分野で
公知の慣用的な方法によって容易に決定され得る。多数の欠失したＣ末端アミノ
酸残基を有するエンドカインαムテインは、いくつかの生物学的活性または免疫
原性活性を保持し得る。実際に、６個ほどに少ないエンドカインαアミノ酸残基
からなるペプチドは、しばしば、免疫応答を惹起し得る。

【０１１０】 従って、本発明は、さらに、図１（配列番号２）に示されるエンドカインαポ
リペプチドのアミノ酸配列のカルボキシ末端から、位置番号６のセリン残基まで
の欠失される１つ以上の残基を有するポリペプチドおよびそのようなポリペプチ
ドをコードするポリヌクレオチドを提供する。特に、本発明は、図１（すなわち
、配列番号２）の残基１−ｍのアミノ酸残基を含むポリペプチドを提供し、ここ
で、ｍは、６〜１６９までの範囲の整数であり、そして６は、エンドカインαポ
リペプチドの少なくとも免疫原性活性のために必要であると考えられている完全
なエンドカインαポリペプチドのＣ末端からの最初の残基の位置である。

【０１１１】 より詳細には、本発明は、図１に示されるエンドカインα配列の配列の、以下
：

【０１１２】

【化２】 からなる群から選択されるメンバーのアミノ酸配列を含むか、あるいはこれらか
ら構成されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明は
また、上記のエンドカインαポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に
対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％
、９８％または９９％同一であるポリヌクレオチド配列を含むか、あるいはこれ
らから構成される核酸分子に関する。本発明はまた、異種ポリヌクレオチド配列
と融合される上記のポリヌクレオチド配列を含む。これらのポリヌクレオチド配
列によってコードされるポリペプチドもまた、本発明によって含まれる。

【０１１３】 本発明はまた、エンドカインαポリペプチドのアミノ末端およびカルボキシル
末端の両方から欠失された一つ以上のアミノ酸を有するポリペプチドを提供し、
このポリペプチドは、図１（すなわち、配列番号２）の残基ｎ〜ｍを有するよう
に一般的に記載され得る（ここで、ｎおよびｍは、上記の整数である）。

【０１１４】 本発明のエンドカインαポリペプチドは、モノマーまたはマルチマー（すなわ
ち、ダイマー、トリマー、テトラマーおよびより高度のマルチマー）であり得る
。従って、本発明は、モノマーおよびマルチマーの本発明のエンドカインαポリ
ペプチド、それらの調製物およびそれらを含む組成物（好ましくは薬学的組成物
）に関する。特定の実施形態では、本発明のポリペプチドは、モノマー、ダイマ
ー、トリマーまたはテトラマーである。さらなる実施形態では、本発明のマルチ
マーは、少なくともダイマー、少なくともトリマー、または少なくともテトラマ
ーである。

【０１１５】 本発明によって含まれるマルチマーは、ホモマーまたはヘテロマーであり得る
。本明細書中で用いられる場合、用語ホモマーは、本発明のエンドカインαポリ
ペプチド（本明細書中に記載されるエンドカインαのフラグメント、改変体およ
び融合タンパク質を含む）のみを含むマルチマーをいう。これらのホモマーは、
同一または異なるアミノ酸配列を有するエンドカインαポリペプチドを含み得る
。特定の実施形態では、本発明のホモマーは、同一のアミノ酸配列を有するエン
ドカインαポリペプチドのみを含むマルチマーである。別の特定の実施形態では
、本発明のホモマーは、異なるアミノ酸配列を有するエンドカインαポリペプチ
ドを含むマルチマーである。特定の実施形態では、本発明のマルチマーは、ホモ
ダイマー（例えば、同一または異なるアミノ酸配列を有するエンドカインαポリ
ペプチドを含む）またはホモトリマー（例えば、同一または異なるアミノ酸配列
を有するエンドカインαポリペプチドを含む）である。さらなる実施形態では、
本発明のホモマー性マルチマーは、少なくともホモダイマー、少なくともホモト
リマーまたは少なくともホモテトラマーである。

【０１１６】 本明細書中で用いられる場合、用語ヘテロマーとは、本発明のエンドカインα
フラグメントおよびエンドカインαポリペプチドに加えて、異種ポリペプチド（
すなわち、異なるタンパク質のポリペプチド）を含むマルチマーをいう。特定の
実施形態では、本発明のマルチマーは、ヘテロダイマー、ヘテロトリマーまたは
ヘテロテトラマーである。さらなる実施形態では、本発明のヘテロマー性マルチ
マーは、少なくともヘテロダイマー、少なくともヘテロトリマーまたは少なくと
もヘテロテトラマーである。

【０１１７】 本発明のマルチマーは、疎水性、親水性、イオン性および／もしくは共有結合
的な結合の結果であり得、そして／または例えば、リポソーム形成によって間接
連結され得る。従って、１つの実施形態では、本発明のマルチマー（例えば、ホ
モダイマーまたはホモトリマーなど）は、本発明のポリペプチドが溶液中で互い
に接触する場合に形成される。別の実施形態では、本発明のへテロマルチマー（
例えば、ヘテロトリマーまたはヘテロテトラマーなど）は、本発明のポリペプチ
ドが、溶液中で本発明のポリペプチドに対する抗体（本発明の融合タンパク質に
おける異種ポリペプチド配列に対する抗体を含む）と接触した場合に形成される
。他の実施形態では、本発明のマルチマーは、本発明のエンドカインαポリペプ
チドとの、および／または本発明のエンドカインαポリペプチド間での共有結合
によって形成される。このような共有結合は、ポリペプチド配列（例えば、配列
番号２に列挙されるかまたはクローン９７６４０によってコードされるポリペプ
チドに含まれる、ポリペプチド配列）中に含まれる１以上のアミノ酸残基を含み
得る。１例では、この共有結合は、ネイティブ（すなわち、天然に存在する）ポ
リペプチドにおいて相互作用するポリペプチド配列内に存在するシステイン残基
間での架橋である。別の例では、この共有結合は、化学的操作または組換え操作
の結果である。あるいは、このような共有結合は、本発明の融合タンパク質中の
異種ポリペプチド配列において含まれる１以上のアミノ酸残基を含み得る。１例
では、共有結合は、エンドカインα融合タンパク質に含まれる異種配列間にある
（例えば、米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこと）。特定の例では、こ
の共有結合は、（本明細書中に記載されるような）本発明のエンドカインαＦｃ
融合タンパク質に含まれる異種配列間にある。別の特定の例では、本発明の融合
タンパク質の共有結合は、共有結合したマルチマーを形成し得る別のＴＮＦファ
ミリーリガンド／レセプターメンバー（例えば、オステオプロテゲリン（ｏｓｅ
ｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ）など）由来の異種ポリペプチド配列間にある（例
えば、国際公開番号ＷＯ ９８／４９３０５号（この内容はその全体が本明細書
中で参考として援用される）を参照のこと）。

【０１１８】 別の実施形態では、２以上の本発明のエンドカインαポリペプチドは、ペプチ
ドリンカーを通して連結される。例としては、米国特許第５，０７３，６２７号
（本明細書中に参考として援用される）に記載されるペプチドリンカーが挙げら
れる。ペプチドリンカーによって隔てられた複数のエンドカインαポリペプチド
を含むタンパク質は、従来の組換えＤＮＡ技術を用いて生成され得る。

【０１１９】 本発明のマルチマーエンドカインαポリペプチドを調製するための別の方法は
、ロイシンジッパーポリペプチド配列またはイソロイシンジッパーポリペプチド
配列に融合されたエンドカインαポリペプチドの使用を含む。ロイシンジッパー
ドメインおよびイソロイシンジッパードメインは、そのドメインが見出されるタ
ンパク質のマルチマー形成を促進するポリペプチドである。ロイシンジッパーは
元々、いくつかのＤＮＡ結合タンパク質において同定され（Ｌａｎｄｓｃｈｕｌ
ｚら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１７５９、（１９８８））、そしてそれ以来種
々の異なるタンパク質において見出されている。とりわけ公知のロイシンジッパ
ーは、ダイマー形成またはトリマー形成をする、天然に存在するペプチドおよび
その誘導体である。可溶性マルチマーエンドカインαタンパク質を生成するため
に適切なロイシンジッパードメインの例は、本明細書中に参考として援用される
ＰＣＴ出願ＷＯ ９４／１０３０８に記載されるロイシンジッパードメインであ
る。溶液中でダイマー形成またはトリマー形成をするペプチドに融合された可溶
性エンドカインαポリペプチドを含む組換え融合タンパク質は、適切な宿主細胞
中で発現され、そして得られる可溶性マルチマーエンドカインαは、当該分野で
公知の技術を用いて培養上清から回収される。

【０１２０】 タンパク質のＴＮＦファミリーの特定のメンバーは、トリマー形態で存在する
と考えられる（ＢｅｕｔｌｅｒおよびＨｕｆｆｅｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６４：
６６７、１９４４；Ｂａｎｎｅｒら、Ｃｅｌｌ ７３：４３１、１９９３）。従
って、トリマーエンドカインαは、増強された生物学的活性という利点を提供し
得る。好ましいロイシンジッパー部分は、トリマーを優先的に形成する部分であ
る。１例は、本明細書中に参考として援用されるＨｏｐｐｅら（ＦＥＢＳ Ｌｅ
ｔｔｅｒｓ ３４４：１９１，（１９９４））および米国特許出願第０８／４４
６，９２２号に記載される通りの肺サーファクタントプロテインＤ（ＳＰＤ）に
由来するロイシンジッパーである。天然に存在するトリマータンパク質由来の他
のペプチドは、トリマーエンドカインαの調製において用いられ得る。

【０１２１】 別の例では、本発明のタンパク質は、本発明のＦｌａｇ（登録商標）エンドカ
インα融合タンパク質に含まれるＦｌａｇ（登録商標）ポリペプチド配列間の相
互作用によって会合する。さらなる実施形態では、本発明のタンパク質の会合は
、本発明のＦｌａｇ（登録商標）エンドカインα融合タンパク質に含まれる異種
ポリペプチド配列と抗Ｆｌａｇ（登録商標）抗体との間の相互作用によって会合
する。

【０１２２】 本発明のマルチマーは、当該分野で公知の化学技術を用いて生成され得る。例
えば、本発明のマルチマーに含まれることが所望されるポリペプチドは、当該分
野で公知のリンカー分子およびリンカー分子長最適化技術を用いて化学的に架橋
され得る（例えば、本明細書中にその全体が参考として援用される、米国特許第
５，４７８，９２５号を参照のこと）。さらに、本発明のマルチマーは、当該分
野で公知の技術を用いて生成されて、マルチマーに含まれることが所望されるポ
リペプチドの配列内に存在するシステイン残基間の１以上の分子間架橋を形成し
得る（例えば、本明細書中にその全体が参考として援用される、米国特許第５，
４７８，９２５号を参照のこと）。さらに、本発明のポリペプチドは、ポリペプ
チドのＣ末端またはＮ末端へのシステインまたはビオチンの付加によって慣用的
に改変され得、そして当該分野で公知の技術が、１以上のこれらの改変されたポ
リペプチドを含むマルチマーを生成するために適用され得る（例えば、本明細書
中にその全体が参考として援用される、米国特許第５，４７８，９２５号を参照
のこと）。さらに、当該分野で公知の技術は、本発明のマルチマーに含まれるこ
とが所望されるポリペプチド成分を含むリポソームを生成するために適用され得
る（例えば、本明細書中にその全体が参考として援用される、米国特許第５，４
７８，９２５号を参照のこと）。

【０１２３】 あるいは、本発明のマルチマーは、当該分野で公知の遺伝子操作技術を用いて
生成され得る。１つの実施形態では、本発明のマルチマーに含まれるポリペプチ
ドは、本明細書中に記載されるかさもなくば当該分野で公知の融合タンパク質技
術を用いて組換え生成される（例えば、本明細書中にその全体が参考として援用
される、米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこと）。特定の実施形態では
、本発明のホモダイマーをコードするポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチ
ドをコードするポリヌクレオチド配列を、リンカーポリペプチドをコードする配
列に連結し、次いでさらに元々のＣ末端からＮ末端の方向とは逆方向でポリペプ
チドの翻訳産物をコードする合成ポリヌクレオチド（リーダー配列を欠く）に連
結することによって生成される（例えば、本明細書中にその全体が参考として援
用される、米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこと）。別の実施形態では
、本明細書中に記載されるかさもなくば当該分野で公知の組換え技術を適用して
、膜貫通ドメインを含み、そして膜再構成技術によってリポソームに取り込まれ
得る、本発明の組換えポリペプチドを生成する（例えば、本明細書中にその全体
が参考として援用される、米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこと）。

【０１２４】 さらに、本発明のポリペプチドは、当該分野で公知の技術を用いて化学合成さ
れ得る（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，１９８３，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕ
ｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｗ．Ｈ．
Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．，Ｎ．Ｙ．，およびＨｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ，Ｍ．
ら，Ｎａｔｕｒｅ，３１０：１０５−１１１（１９８４）を参照のこと）。例え
ば、本発明のエンドカインαポリペプチドのフラグメントに対応するペプチドは
、ペプチド合成機の使用により合成され得る。さらに、所望の場合、非古典的ア
ミノ酸または化学的アミノ酸アナログが、置換または付加としてこのエンドカイ
ンαポリペプチド配列に導入され得る。非古典的アミノ酸としては、以下が挙げ
られるがこれらに限定されない：通常のアミノ酸のＤ異性体、２，４−ジアミノ
酪酸、α−アミノイソ酪酸、４−アミノ酪酸、Ａｂｕ、２−アミノ酪酸、ｇ−Ａ
ｂｕ、ｅ−Ａｈｘ、６−アミノヘキサン酸、Ａｉｂ，２−アミノイソ酪酸、３−
アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロ
リン、サルコシン、シトルリン、ホモシトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグ
リシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β
−アラニン、フルオロアミノ酸、デザイナーアミノ酸（例えば、β−メチルアミ
ノ酸、Ｃａ−メチルアミノ酸、Ｎａ−メチルアミノ酸）、および一般のアミノ酸
アナログ。さらにアミノ酸はＤ（右旋性）であってもまたはＬ（左旋性）であっ
てよい。

【０１２５】 本発明は、翻訳の間または翻訳後に、例えば、グリコシル化、アセチル化、リ
ン酸化、アミド化、公知の保護基／ブロック基による誘導体化、タンパク質分解
切断、抗体分子または他の細胞性リガンドへの結合などによって示差的に改変さ
れるエンドカインαポリペプチドを含む。多数の化学的改変のうちのいずれをも
、以下を含むがこれらに限定されない公知の技術によって実施され得る：臭化シ
アン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、Ｖ８プロテアーゼ、ＮａＢＨ₄
による特異的化学的切断；アセチル化、ホルミル化、酸化、還元；ツニカマイシ
ンの存在下での代謝合成；など。

【０１２６】 本発明によって含まれるさらなる翻訳後修飾としては、例えば、以下などが挙
げられる：Ｎ結合型もしくはＯ結合型の糖鎖（Ｎ末端またはＣ末端のプロセシン
グ）、アミノ酸骨格への化学部分の結合、Ｎ結合型もしくはＯ結合型の糖鎖の化
学修飾、および原核生物宿主細胞発現の結果としてのＮ末端メチオニン残基の付
加もしくは欠失。このポリペプチドはまた、検出可能な標識（例えば、酵素標識
、蛍光標識、同位体標識または親和性標識）を用いて改変して、このタンパク質
の検出および単離を可能にし得る。

【０１２７】 本発明によってまた、さらなる利点（例えば、このポリペプチドの溶解度、安
定性および循環時間の増加、または免疫原性の減少）を提供し得る、エンドカイ
ンαの化学修飾誘導体が提供される（米国特許第４，１７９，３３７号を参照の
こと）。誘導体化のための化学部分は、水溶性ポリマー（例えば、ポリエチレン
グリコール、エチレングリコール／プロピレングリコールコポリマー、カルボキ
シメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコールなど）から選択され
得る。このポリペプチドは、この分子内のランダムな位置でか、またはこの分子
内の所定の位置で改変され得、そして１、２、３以上の結合した化学部分を含み
得る。

【０１２８】 このポリマーは、任意の分子量のポリマーであり得、そして分枝状であっても
非分枝状であってもよい。ポリエチレングリコールに関しては、好ましい分子量
は、取り扱いおよび製造の容易さのために、約１ｋＤａと約１００ｋＤａとの間
（用語「約（およそ）」は、ポリエチレングリコールの調製において、いくつか
の分子は示した分子量よりも重く、いくつかは示した分子量よりも軽いことを示
す）である。所望の治療プロフィール（例えば、所望される持続放出の持続時間
、存在する場合には生物学的活性に対する効果、取り扱いの容易さ、抗原性の程
度または抗原性がないこと、および治療タンパク質またはアナログに対するポリ
エチレングリコールの他の公知の効果）に依存して、他のサイズが用いられ得る
。

【０１２９】 ポリエチレングリコール分子（または他の化学的部分）は、このタンパク質の
機能的ドメインまたは抗原性ドメインに対する効果を考慮してこのタンパク質に
結合されるべきである。当業者に利用可能な多数の結合方法が存在する（例えば
、本明細書中に参考として援用される、ＥＰ ０ ４０１ ３８４（Ｇ−ＣＳＦ
にＰＥＧを結合する）、Ｍａｌｉｋら，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２０：１０２
８−１０３５（１９９２）（塩化トレシル（ｔｒｅｓｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）
を用いたＧＭ−ＣＳＦのペグ化を報告する）もまた参照のこと）。例えば、ポリ
エチレングリコールは、反応性基（例えば、遊離のアミノ基またはカルボキシル
基）を介してアミノ酸残基により共有結合され得る。反応性基は、活性化ポリエ
チレングリコール分子が結合し得る基である。遊離のアミノ基を有するアミノ酸
残基としては、リジン残基およびＮ末端アミノ酸残基が挙げられ得る；遊離のカ
ルボキシル基を有するアミノ酸残基としては、アスパラギン酸残基、グルタミン
酸残基およびＣ末端アミノ酸残基が挙げられ得る。スルフヒドリル残基もまた、
ポリエチレングリコール分子を結合するための反応性基として用いられ得る。治
療目的のために好ましいのは、アミノ基での結合、例えば、Ｎ末端またはリジン
基での結合である。

【０１３０】 Ｎ末端で化学修飾されたタンパク質が特に所望され得る。ポリエチレングリコ
ールを本組成物の例示として用いて、種々のポリエチレングリコール分子から（
分子量、分枝などによって）、反応混合物中でのポリエチレングリコール分子の
タンパク質（またはポリペプチド）分子に対する比、行われるべきペグ化反応の
型、および選択されたＮ末端ペグ化タンパク質の獲得方法を選択し得る。Ｎ末端
ペグ化調製物の獲得方法（すなわち、必要な場合、この部分を他のモノペグ化部
分から分離すること）は、ペグ化タンパク質分子の集団からの、Ｎ末端ペグ化物
質の精製により行われ得る。Ｎ末端修飾で化学修飾された選択的タンパク質は、
特定のタンパク質における誘導体化に利用可能な異なる型の第１級アミノ基（リ
ジン対Ｎ末端）の示差的反応性を利用する還元的アルキル化によって達成され得
る。適切な反応条件下では、カルボニル基含有ポリマーを用いた、Ｎ末端でのタ
ンパク質の実質的に選択的な誘導体化が達成される。

【０１３１】 本発明のポリペプチドは、本発明のポリペプチドを結合する抗体を生成するた
めの供給源としての用途、および当業者に周知の方法を用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥ
ゲルまたは分子ふるいゲル濾過カラムの分子量マーカーとしての用途を含むが、
これらに限定されない用途を有する。

【０１３２】 （タンパク質改変） さらに、本発明のタンパク質は、当該分野で公知の技術を用いて化学合成され
得る（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ
ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａ
ｎ ＆ Ｃｏ．，Ｎ．Ｙ．（１９８３）およびＨｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ，Ｍ．ら
，Ｎａｔｕｒｅ，３１０：１０５−１１１（１９８４）を参照のこと）。例えば
、本発明のエンドカインαポリペプチドのフラグメントに対応するペプチドは、
ペプチド合成機の使用により合成され得る。さらに、所望の場合、非古典的アミ
ノ酸または化学的アミノ酸アナログが、置換または付加としてこのエンドカイン
αポリペプチド配列に導入され得る。非古典的アミノ酸としては、以下が一般に
挙げられるがこれらに限定されない：通常のアミノ酸のＤ異性体、２，４−ジア
ミノ酪酸、α−アミノイソ酪酸、４−アミノ酪酸、Ａｂｕ、２−アミノ酪酸、α
−Ａｂｕ、α−Ａｈｘ、６−アミノヘキサン酸、Ａｉｂ，２−アミノイソ酪酸、
３−アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシ
プロリン、サルコシン、シトルリン、ホモシトルリン、システイン酸、ｔ−ブチ
ルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン
、α−アラニン、フルオロアミノ酸、デザイナーアミノ酸（例えば、α−メチル
アミノ酸、Ｃａ−メチルアミノ酸、Ｎａ−メチルアミノ酸）、および一般のアミ
ノ酸アナログ。さらにアミノ酸はＤ（右旋性）であってもまたはＬ（左旋性）で
あってよい。

【０１３３】 天然に存在しない改変体は、当該分野において公知の変異誘発技術（オリゴヌ
クレオチド媒介変異誘発、アラニン走査、ＰＣＲ変異誘発、部位特異的変異誘発
（例えば、Ｃａｒｔｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：４３３１（
１９８６）；およびＺｏｌｌｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１０：６
４８７（１９８２）を参照のこと）、カセット変異誘発（例えば、Ｗｅｌｌｓら
、Ｇｅｎｅ ３４：３１５（１９８５）を参照のこと）、制限選択変異誘発（例
えば、Ｗｅｌｌｓら、Ｐｈｉｌｏｓ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄｏｎ
ＳｅｒＡ ３１７：４１５（１９８６）参照のこと）を含むが、これらに限定さ
れない）を使用して産生され得る。

【０１３４】 本発明は、翻訳の間または翻訳後に、例えば、グリコシル化、アセチル化、リ
ン酸化、アミド化、公知の保護基／ブロック基による誘導体化、タンパク質分解
切断、抗体分子または他の細胞性リガンドへの結合などによって示差的に改変さ
れるエンドカインαポリペプチドを含む。多数の化学的改変のうちのいずれも、
以下を含むがこれらに限定されない公知の技術によって実施され得る：臭化シア
ン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、Ｖ８プロテアーゼ、ＮａＢＨ₄に
よる特異的化学的切断、アセチル化、ホルミル化、酸化、還元、ツニカマイシン
の存在下での代謝合成、など。

【０１３５】 本発明によって含まれるさらなる翻訳後修飾としては、例えば、以下などが挙
げられる：Ｎ結合型もしくはＯ結合型の糖鎖（Ｎ末端またはＣ末端のプロセシン
グ）、アミノ酸骨格への化学部分の結合、Ｎ結合型もしくはＯ結合型の糖鎖の化
学修飾、および原核生物宿主細胞発現の結果としてのＮ末端メチオニン残基の付
加もしくは欠失。このポリペプチドはまた、検出可能な標識（例えば、酵素標識
、蛍光標識、同位体標識または親和性標識）を用いて改変して、このタンパク質
の検出および単離を可能にし得る。

【０１３６】 本発明によってまた、さらなる利点（例えば、このポリペプチドの溶解度、安
定性および循環時間の増加、または免疫原性の減少）を提供し得る、エンドカイ
ンαの化学修飾誘導体が提供される（米国特許第４，１７９，３３７号を参照の
こと）。誘導体化のための化学部分は、水溶性ポリマー（例えば、ポリエチレン
グリコール、エチレングリコール／プロピレングリコールコポリマー、カルボキ
シメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコールなど）から選択され
得る。このポリペプチドは、この分子内のランダムな位置でか、またはこの分子
内の所定の位置で改変され得、そして１、２、３以上の結合した化学部分を含み
得る。

【０１３７】 このポリマーは、任意の分子量のポリマーであり得、そして分枝状であっても
非分枝状であってもよい。ポリエチレングリコールに関しては、好ましい分子量
は、取り扱いおよび製造の容易さのために、約１ｋＤａと約１００ｋＤａとの間
（用語「約（およそ）」は、ポリエチレングリコールの調製において、いくつか
の分子は示した分子量よりも重く、いくつかは示した分子量よりも軽いことを示
す）である。所望の治療プロフィール（例えば、所望される持続放出の持続時間
、存在する場合には生物学的活性に対する効果、取り扱いの容易さ、抗原性の程
度または抗原性がないこと、および治療タンパク質またはアナログに対するポリ
エチレングリコールの他の公知の効果）に依存して、他のサイズが用いられ得る
。例えば、ポリエチレングリコールは、約２００、５００、１０００、１５００
、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、
５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、８５００、９
０００、９５００、１０，０００、１０，５００、１１，０００、１１，５００
、１２，０００、１２，５００、１３，０００、１３，５００、１４，０００、
１４，５００、１５，０００、１５，５００、１６，０００、１６，５００、１
７，０００、１７，５００、１８，０００、１８，５００、１９，０００、１９
，５００、２０，０００、２５，０００、３０，０００、３５，０００、４０，
０００、５０，０００、５５，０００、６０，０００、６５，０００、７０，０
００、７５，０００、８０，０００、８５，０００、９０，０００、９５，００
０、または１００，０００ｋＤａの平均分子量を有し得る。

【０１３８】 上記のように、ポリエチレングリコールは、分枝状構造であり得る。分枝状ポ
リエチレングリコールは、例えば、米国特許第５，６４３，５４５号、Ｍｏｒｐ
ｕｒｇｏら、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５６：５９−
７２（１９９６）；Ｖｏｒｏｂｊｅｖら、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅ
ｏｔｉｄｅｓ １８：２７４５−２７５０（１９９９）；およびＣａｌｉｃｅｔ
ｉら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．１０：６３８−６４６（１９９９）に記
載され、そのそれぞれの開示が、本明細書中で参考として援用される。

【０１３９】 ポリエチレングリコール分子（または他の化学的部分）は、このタンパク質の
機能的ドメインまたは抗原性ドメインに対する効果を考慮してこのタンパク質に
結合されるべきである。当業者に利用可能な多数の結合方法が存在する（例えば
、本明細書中に参考として援用される、ＥＰ ０ ４０１ ３８４（Ｇ−ＣＳＦ
にＰＥＧを結合する）、Ｍａｌｉｋら，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２０：１０２
８−１０３５（１９９２）（塩化トレシル（ｔｒｅｓｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）
を用いたＧＭ−ＣＳＦのペグ化を報告する）もまた参照のこと）。例えば、ポリ
エチレングリコールは、反応性基（例えば、遊離のアミノ基またはカルボキシル
基）を介してアミノ酸残基により共有結合され得る。反応性基は、活性化ポリエ
チレングリコール分子が結合し得る基である。遊離のアミノ基を有するアミノ酸
残基としては、リジン残基およびＮ末端アミノ酸残基が挙げられ得る；遊離のカ
ルボキシル基を有するアミノ酸残基としては、アスパラギン酸残基、グルタミン
酸残基およびＣ末端アミノ酸残基が挙げられ得る。スルフヒドリル基もまた、ポ
リエチレングリコール分子を結合するための反応性基として用いられ得る。治療
目的のために好ましいのは、アミノ基での結合、例えば、Ｎ末端またはリジン基
での結合である。

【０１４０】 上で示したように、ポリエチレングリコールは、多数のアミノ酸残基のいずれ
かへの結合を介してタンパク質に結合され得る。例えば、ポリエチレングリコー
ルは、リジン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸またはシステインの
残基に共有結合を介してタンパク質に連結され得る。１つ以上の反応化学を使用
して、ポリエチレングリコールを、タンパク質の特定のアミノ酸残基（例えば、
リジン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、またはシステイン）に、
またはタンパク質のアミノ酸残基（例えば、リジン、ヒスチジン、アスパラギン
酸、グルタミン酸、システインおよびその組み合わせ）の１つより多いタイプに
結合し得る。

【０１４１】 Ｎ末端で化学修飾されたタンパク質が特に所望され得る。ポリエチレングリコ
ールを本発明の組成物の例示として用いて、種々のポリエチレングリコール分子
から（分子量、分枝などによって）、反応混合物中でのポリエチレングリコール
分子のタンパク質（ポリペプチド）分子に対する比、行われるべきペグ化反応の
型、および選択されたＮ末端ペグ化タンパク質の獲得方法を選択し得る。Ｎ末端
ペグ化調製物の獲得方法（すなわち、必要な場合、この部分を他のモノペグ化部
分から分離すること）は、ペグ化タンパク質分子の集団からの、Ｎ末端ペグ化物
質の精製により行われ得る。Ｎ末端修飾で化学修飾された選択的タンパク質は、
特定のタンパク質における誘導体化に利用可能な異なる型の第１級アミノ基（リ
ジン対Ｎ末端）の示差的反応性を利用する還元的アルキル化によって達成され得
る。適切な反応条件下では、カルボニル基含有ポリマーを用いた、Ｎ末端でのタ
ンパク質の実質的に選択的な誘導体化が達成される。

【０１４２】 上記のように、本発明のタンパク質のぺグ化は、任意の多くの手段によって達
成され得る。例えば、ポリエチレングリコールは、直接または介在するリンカー
のいずれかによって、タンパク質に結合され得る。ポリエチレングリコールをタ
ンパク質に結合するリンカーを使用しない系は、Ｄｅｌｇａｄｏら、Ｃｒｉｔ．
Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａ．Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓ．９：２４９−３０４
（１９９２）；Ｆｒａｎｃｉｓら，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｊ．ｏｆ Ｈｅｎｍａｔｏｌ
．６８：１−１８）；米国特許第４，００２，５３１号；米国特許第５，３４９
，０５２号；ＷＯ９５／０６０５８；およびＷＯ９８／３２４６６に記載され、
このそれぞれの開示は、本明細書中で参考として援用される。

【０１４３】 介在するリンカーなしで、タンパク質のアミノ酸残基に直接ポリエチレングリ
コールを結合するための１つの系は、トレシル化ＭＰＥＧ（塩化トレシル（Ｃｌ
ＳＯ₂ＣＨ₂ＣＦ₃）を使用するモノメトキシ（ｍｏｎｍｅｔｈｏｘｙ）ポリエチ
レングリコール（ＭＰＥＧ）の改変によって生成される）を使用する。トレシル
化ＭＰＥＧとタンパク質との反応のときに、ポリエチレングリコールをタンパク
質のアミン基に直接結合する。従って、本発明は、本発明のタンパク質と２，２
，２−トリフルオロエタンスルホニル基を有するポリエチレングリコール分子と
の反応によって生成されるタンパク質−ポリエチレングリコール結合体を含む。

【０１４４】 ポリエチレングリコールはまた、多数の示差的な介在するリンカーを使用して
タンパク質に結合され得る。例えば、米国特許第５，６１２，４６０号（その開
示全体が本明細書中で参考として援用される）は、ポリエチレングリコールをタ
ンパク質に連結するためのウレタンリンカーを開示する。ポリエチレングリコー
ルがリンカーによってタンパク質に結合するタンパク質−ポリエチレングリコー
ル結合体はまた、タンパク質とＭＰＥＧ−スクシンイミジルスクシネート、１，
１’−カルボニルジイミダゾールで活性化されたＭＰＥＧ、ＭＰＥＧ−２，４，
５−トリクロロペニルカーボネート（ｔｒｉｃｈｌｏｒｏｐｅｎｙｌｃａｒｂｏ
ｎａｔｅ）、ＭＰＥＧ−ｐ−ニトロフェノールカーボネート、および種々のＭＰ
ＥＧ−スクシネート誘導体のような化合物との反応によって作製され得る。多数
のさらなるポリエチレングリコール誘導体およびポリエチレングリコールをタン
パク質に結合する反応化学は、ＷＯ９８／３２４６６に記載され、その開示の全
体は、本明細書中で参考として援用される。本明細書中に記載される反応化学を
使用して生成されるぺグ化タンパク質生成物は、本発明の範囲内に含まれる。

【０１４５】 本発明のそれぞれのタンパク質に結合されるポリエチレングリコール部分の数
（すなわち、置換の程度）は、多様であり得る。例えば、本発明のぺグ化タンパ
ク質はまた、平均で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、
１７、２０以上のポリエチレングリコール分子に連結され得る。同様に、タンパ
ク質分子当たり１〜３、２〜４、３〜５、４〜６、５〜７、６〜８、７〜９、８
〜１０、９〜１１、１０〜１２、１１〜１３、１２〜１４、１３〜１５、１４〜
１６、１５〜１７、１６〜１８、１７〜１９、または１８〜２０のポリエチレン
グリコール部分の範囲内での平均の置換の程度である。置換の程度を決定するた
めの方法は、例えば、Ｄｅｌｇａｄｏら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａ．Ｄｒ
ｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓ．９：２４９−３０４（１９９２）に議論される
。

【０１４６】 （抗体およびエピトープ） 以下に詳細に記載されるように、本発明のポリペプチドは、ポリクローナル抗
体およびモノクローナル抗体を惹起するために使用され得、これは以下に記載さ
れるようなエンドカインαタンパク質発現を検出するための診断的アッセイにお
いて、またはエンドカインαタンパク質の機能を阻害し得るアゴニストおよびア
ンタゴニストとして有用である。さらに、このようなポリペプチドは、酵母ツー
ハイブリッド系において、本発明による候補アゴニストおよびアンタゴニストで
もあるエンドカインαタンパク質結合タンパク質を「捕捉」するために使用され
得る。酵母ツーハイブリッド系は、ＦｉｅｌｄｓおよびＳｏｎｇ（Ｎａｔｕｒｅ
３４０：２４５−２４６（１９８９））に記載される。

【０１４７】 別の局面において、本発明は、本発明のポリペプチドのエピトープ保有部分を
含むペプチドまたはポリペプチドを提供する。このポリペプチド部分のエピトー
プは、本発明のポリペプチドの免疫原性または抗原性エピトープである。「免疫
原性エピトープ」は、タンパク質全体が免疫原である場合、抗体応答を誘導する
、タンパク質の一部として定義される。これらの免疫原性エピトープは、分子の
いくつかの遺伝子座に制限されると考えられる。一方、抗体が結合し得るタンパ
ク質分子の領域は、「抗原性エピトープ」として定義され得る。タンパク質の免
疫原性エピトープの数は、一般に、抗原性エピトープの数よりも少ない。例えば
、Ｇｅｙｓｅｎ，Ｈ．Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８１：３９９８〜４００２（１９８４）を参照のこと。

【０１４８】 抗原性エピトープを保有するペプチドまたはポリペプチド（すなわち、抗体が
結合し得るタンパク質分子の領域を含む）の選択について、タンパク質配列の一
部に模倣する比較的短い合成ペプチドが、部分的に模倣されたタンパク質と反応
する抗血清を慣用的に誘発し得ることが、当該分野で周知である。例えば、Ｓｕ
ｔｃｌｉｆｆｅ，Ｊ．Ｇ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１９：６６０〜６６６（１９
８３）を参照のこと。タンパク質反応性の血清を誘発し得るペプチドは、タンパ
ク質の一次配列においてしばしば示され、一組の単純な化学法則によって特徴付
けられ得、そしてインタクトなタンパク質の免疫優性領域（すなわち、免疫原性
エピトープ）またはアミノ末端もしくはカルボキシ末端のいずれにも制限されな
い。非常に疎水性であるペプチドおよび６個以下の残基のペプチドは、一般的に
模倣タンパク質に結合する抗体の誘導には効果がなく；より長い可溶性のペプチ
ド、特にプロリン残基を含むものは、通常効果的である。Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら
、前出、６６１頁。例えば、これらのガイドラインに従って設計された、インフ
ルエンザウイルス赤血球凝集素ＨＡ１ポリペプチド鎖の配列の７５％をカバーす
る８〜３９の残基を含む３０個のペプチドのうちの１８個は、ＨＡ１タンパク質
と反応する抗体、またはインタクトなウイルスを誘導した：ＭｕＬｖポリメラー
ゼからの１２／１２のペプチドおよび狂犬病糖タンパク質からの１８／１８のペ
プチドは、それぞれのタンパク質を沈澱させる抗体を誘導した。

【０１４９】 本発明の抗原性エピトープ保有ペプチドおよび抗原性エピトープ保有ポリペプ
チドは、従って本発明のポリペプチドに対して特異的に結合する抗体（モノクロ
ーナル抗体を含む）を惹起するために有用である。従って、抗原エピトープ保有
ペプチドで免疫化されたドナーからの脾臓細胞の融合によって得られたハイブリ
ドーマの高い比率は、一般的に、ネイティブなタンパク質と反応性の抗体を分泌
する。Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら、前出、６６３頁。抗原性エピトープ保有ペプチド
または抗原性エピトープ保有ポリペプチドによって惹起される抗体は、模倣タン
パク質を検出するために有用であり、異なるペプチドに対する抗体は、翻訳後プ
ロセシングを受けるタンパク質前駆体の種々の領域の発生運命を追跡するために
使用され得る。ペプチドおよび抗ペプチド抗体は、模倣タンパク質についての種
々の定性的または定量的アッセイ（例えば、競合的アッセイ）に使用され得る。
なぜならそれは、短いペプチド（例えば、約９個のアミノ酸）でさえ免疫沈降ア
ッセイにおいて結合し、大きなペプチドを置換し得ることが示された。例えば、
Ｗｉｌｓｏｎ，Ｉ．Ａ．ら、Ｃｅｌｌ ３７：７６７〜７７８（１９８４）の７
７７を参照のこと。本発明の抗ペプチド抗体はまた、例えば、当該分野で周知の
方法を使用する吸着クロマトグラフィーによって、模倣タンパク質の精製に有用
である。

【０１５０】 上記ガイドラインに従って設計された本発明の抗原性エピトープ保有ペプチド
および抗原性エピトープ保有ポリペプチドは、本発明のポリペプチドのアミノ酸
配列中に含まれる好ましくは少なくとも７の、より好ましくは少なくとも９の、
および最も好ましくはおよそ少なくとも約１５と約３０との間のアミノ酸の配列
を含む。しかし、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列のより大きな部分を含む
ペプチドまたはポリペプチド（約３０〜約５０のアミノ酸を含むか、または本発
明のポリペプチドの全アミノ酸配列を含むまでの任意の長さを含む）はまた、考
慮される本発明のエピトープ保有ペプチドまたはエピトープ保有ポリペプチドで
あり、そしてまた模倣タンパク質と反応する抗体を誘導するために有用である。
好ましくは、エピトープ保有ペプチドのアミノ酸配列は、水性溶媒に実質的に可
溶性を提供するために使用され（すなわち、配列が比較的親水性の残基を含み、
そして高い疎水性の配列が好ましくは避けられる）；そしてプロリン残基を含む
配列は、特に好ましい。

【０１５１】 エンドカイン特異的ポリクローナル抗体およびエンドカイン特異的モノクロー
ナル抗体を産生するために使用され得る、抗原性ポリペプチドの限定されない例
は、これらのポリペプチドをコードする以下のアミノ酸配列およびポリヌクレオ
チドのいずれかのうちの１つ、２つ、３つまたはそれ以上を含むかあるいはそれ
らからなるポリペプチドを含む：図１（配列番号２）における約４４〜約１５８
のアミノ酸残基；図１（配列番号２）における約４４〜約５４のアミノ酸残基；
図１（配列番号２）における約５７〜約６８のアミノ酸残基；図１（配列番号２
）における約６９〜約７８のアミノ酸残基；図１（配列番号２）における約９４
〜約１０５のアミノ酸残基；図１（配列番号２）における約１０８〜約１３２の
アミノ酸残基；図１（配列番号２）における約１４８〜約１５８のアミノ酸残基
。上記のように、本発明者らは、上記のポリペプチドフラグメントがエンドカイ
ンαタンパク質の抗原性領域であることを決定した。

【０１５２】 本発明のエピトープ保有ペプチドおよびエピトープ保有ポリペプチドは、本発
明の核酸分子を使用して組換え手段を含む、ペプチドまたはポリペプチドを作製
するための任意の従来の手段によって産生され得る。例えば、短いエピトープ保
有アミノ酸配列は、組換え産生および精製の間、ならびに抗ペプチド抗体を産生
するための免疫化の間、キャリアとして作用するより大きなポリペプチドに融合
し得る。エピトープ保有ペプチドはまた、化学合成の公知の方法を使用して合成
され得る。例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎは、４週間未満で調製され特徴付けられた
（ＥＬＩＳＡ型結合研究による）ＨＡ１ポリペプチドのセグメントの単一のアミ
ノ酸改変体を示す２４８個の異なる１３残基ペプチド１０〜２０ｍｇのような多
数のペプチドの合成のための簡単な方法を記載している。Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，Ｒ
．Ａ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｖｉ．ＵＳＡ８２：５１３１−５
１３５（１９８５）を参照のこと。この「Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ Ｍｕｌｔ
ｉｐｌｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（ＳＭＰＳ）」プロセスは、Ｈ
ｏｕｇｈｔｅｎら（１９８６）に対する米国特許第４，６３１，２２１号におい
て、さらに記載される。この手順において、種々のペプチドの固相合成のための
個々の樹脂は、固相方法に含まれる多くの同一の反復工程の最適の使用を可能に
する、別々の溶媒浸透性パケットに含まれる。完全にマニュアルの手順によって
、５００〜１０００またはそれ以上の合成が同時に行われ得る。Ｈｏｕｇｈｔｅ
ｎら、前出、５１３４頁。

【０１５３】 本発明のエピトープ保有ペプチドおよびエピトープ保有ポリペプチドは、当該
分野で周知の方法に従って抗体を誘導するために使用される。例えば、Ｓｕｔｃ
ｌｉｆｆｅら、前出；Ｗｉｌｓｏｎら、前出；Ｃｈｏｗ，Ｍら、Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：９１０〜９１４；およびＢｉｔｔｌｅ
Ｆ．Ｊ．ら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２３４７−２３５４ （１９８５
）を参照のこと。一般的に、動物は、遊離ペプチドで免疫化され得る；しかし、
抗ペプチド抗体力価は、高分子キャリア（例えば、キーホールリンペットヘモシ
アニン（ＫＬＨ）または破傷風トキソイド）にペプチドを結合させることにより
ブーストされ得る。例えば、システインを含むペプチドは、ｍ−マレイミドベン
ゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）のようなリンカーを
用いてキャリアに結合体化され得る。その一方、他のペプチドは、より一般的な
結合剤（例えば、グルタルアルデヒド）を用いてキャリアに結合され得る。

【０１５４】 ウサギ、ラット、およびマウスのような動物は、遊離のペプチドまたはキャリ
ア結合ペプチドのいずれかを用いて、例えば、約１００μｇのペプチドまたはキ
ャリアタンパク質およびフロイントアジュバントを含むエマルジョンを腹腔内注
射および／または皮内注射することにより免疫される。いくつかのブースター注
射が、抗ペプチド抗体の有用な力価を提供するために、例えば、約２週間の間隔
で、必要とされ得る。この力価は、例えば、固体表面に吸着した遊離のペプチド
を用いるＥＬＩＳＡアッセイにより検出され得る。免疫した動物由来の血清中の
抗ペプチド抗体の力価は、抗ペプチド抗体の選択（例えば、当該分野で周知の方
法に従う固体支持体上のペプチドへの吸着および選択された抗体の溶出による）
により上昇し得る。

【０１５５】 本発明の免疫原性エピトープ保有ペプチド（すなわち、全タンパク質が免疫原
性である場合、抗体応答を誘発するタンパク質の部分）が、当該分野で公知の方
法に従って同定される。例えば、Ｇｅｙｓｅｎら（１９８４）、前出は、酵素連
結免疫吸着アッセイにおいて反応するために十分な純度の数百のペプチドの、固
相支持体上での迅速な同時合成のための手順を開示する。次いで、合成ペプチド
と抗体との相互作用は、それらを支持体から外すことなく容易に検出される。こ
の方法において、所望のタンパク質の免疫原性エピトープを保有するペプチドが
、当業者によって慣用的に同定され得る。

【０１５６】 例えば、口蹄疫ウイルスのコートタンパク質の免疫学的に重要なエピトープを
、Ｇｅｙｓｅｎらは、このタンパク質の全２１３個のアミノ酸配列をカバーする
２０８の可能なヘキサペプチド全ての重複セットの合成によって、７個のアミノ
酸の分解能で、位置決定した。次いで、全ての２０個のアミノ酸がエピトープ内
の全ての位置で次いで置換されたペプチドの完全な置換セットが合成され、そし
て抗体との反応に特異性を与える特定のアミノ酸が決定された。従って、本発明
のエピトープ保有ペプチドのペプチドアナログは、この方法によって慣用的に作
製され得る。Ｇｅｙｓｅｎ（１９８７）に対する米国特許第４，７０８，７８１
号は、さらに所望のタンパク質の免疫原性エピトープを保有するペプチドを同定
するためのこの方法を記載する。

【０１５７】 さらになお、Ｇｅｙｓｅｎ（１９９０）の米国特許第５，１９４，３９２号は
、目的の抗体の特定のパラトープ（抗原結合部位）に対して相補的なエピトープ
（すなわち「ミモトープ」）の位相幾何学的等価物であるモノマー（アミノ酸ま
たは他の化合物）の配列を検出または決定する一般的な方法を記載する。より一
般的には、Ｇｅｙｓｅｎ（１９８９）の米国特許第４，４３３，０９２号は、目
的の特定のレセプターのリガンド結合部位に相補的であるリガンドの位相幾何学
的等価物であるモノマーの配列を検出または決定する方法を記載する。同様に、
Ｐｅｒａｌｋｙｌａｔｅｄ Ｏｌｉｇｏｐｅｐｔｉｄｅ Ｍｉｘｔｕｒｅｓに関
するＨｏｕｇｈｔｅｎ，Ｒ．Ａ．ら（１９９６）の米国特許第５，４８０，９７
１号は、直鎖Ｃ₁−Ｃ₇−アルキル過アルキル化（ｐｅｒａｌｋｙｌａｔｅｄ）オ
リゴペプチドならびにこのようなペプチドのセットおよびライブラリー、ならび
に目的のアクセプター分子に、優先的に結合する過アルキル化オリゴペプチドの
配列を決定するためにこのようなオリゴペプチドのセットおよびライブラリーを
使用する方法を開示する。従って、本発明のエピトープ保有ペプチドの非ペプチ
ドアナログはまた、これらの方法により日常的に作成され得る。

【０１５８】 本発明はさらに、本発明のポリペプチドに特異的に結合する、抗体およびＴ細
胞抗原レセプター（ＴＣＲ）に関する。本発明の抗体は、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、Ｉ
ｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含む）、ＩｇＡ（ＩｇＡ１およびＩｇＡ２を
含む）、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはＩｇＭならびにＩｇＹを含む。本明細書中で使用
される場合、用語「抗体」（Ａｂ）は、単鎖抗体全体を含む抗体全体およびそれ
らの抗原結合フラグメントを含むことを意味する。最も好ましくは、この抗体は
、本発明のヒト抗原結合抗体フラグメントであり、これには、Ｆａｂ、Ｆａｂ’
およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、ジスルフィド
結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）ならびにＶ_LドメインまたはＶ_Hドメインのいずれかを含む
フラグメントが挙げられるがこれらに限定されない。この抗体は、鳥類および哺
乳動物を含む任意の動物起源由来であり得る。好ましくは、この抗体は、ヒト、
マウス、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、またはニワトリである。

【０１５９】 単鎖抗体を含む抗原結合抗体フラグメントは、可変領域を単独で、または以下
の全体もしくは部分と組み合わせて含み得る：ヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２およ
びＣＨ３ドメイン。可変領域ならびにヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３
ドメインの任意の組み合わせもまた本発明に含まれる。本発明はさらに、本発明
のポリペプチドと特異的に結合する、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体
、キメラ抗体、ヒト化抗体、ならびにヒトモノクローナル抗体およびヒトポリク
ローナル抗体を含む。本発明はさらに、本発明の抗体に対して抗イディオタイプ
である抗体を含む。

【０１６０】 本発明の抗体は、単一特異性、二重特異性、三重特異性またはより多重の多重
特異性であり得る。多重特異性抗体は、本発明のポリペプチドの異なるエピトー
プに対して特異的であり得るか、または本発明のポリペプチドおよび異種組成物
（例えば、異種ポリペプチド）の両方もしくは固体支持体物質に特異的であり得
る。例えば、ＷＯ ９３／１７７１５；ＷＯ９２／０８８０２；ＷＯ ９１／０
０３６０；ＷＯ ９２／０５７９３；Ｔｕｔｔ，Ａ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．
１４７：６０〜６９（１９９１）；米国特許第５，５７３，９２０号、同第４，
４７４，８９３号、同第５，６０１，８１９号、同第４，７１４，６８１号、同
第４，９２５，６４８号；Ｋｏｓｔｅｌｎｙ，Ｓ．Ａ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ
．１４８：１５４７〜１５５３（１９９２）を参照のこと。

【０１６１】 本発明の抗体は、この抗体により認識されるかまたは特異的に結合される本発
明のポリペプチドのエピトープまたは部分に関して記載されるかまたは特定され
得る。このエピトープまたはポリペプチドの部分は、例えば、Ｎ末端位置および
Ｃ末端位置により、連続するアミノ酸残基のサイズにより、または表および図に
列挙されて、本明細書中に記載される様に特定され得る。本発明の任意のエピト
ープまたはポリペプチドに特異的に結合する抗体もまた排除され得る。従って、
本発明は、本発明のポリペプチドを特異的に結合し、そしてこれの排除を可能に
する抗体を含む。

【０１６２】 本発明の抗体はまた、その交差反応性に関して記載または特定され得る。本発
明のポリペプチドの他のアナログ、オーソログまたはホモログのいずれをも結合
しない抗体が、含まれる。本発明のポリペプチドに対して９５％未満、９０％未
満、８５％未満、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６５％未満、６０％未
満、５５％未満および５０％未満の同一性（当該分野で公知の方法および本明細
書において記載された方法を用いて計算されるように）を有するポリペプチドを
結合しない抗体もまた、本発明に含まれる。さらに本発明には、ストリンジェン
トなハイブリダイゼーション条件下（本明細書において記載のような）で本発明
のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされる
ポリペプチドのみ結合する抗体が含まれる。本発明の抗体はまた、その結合親和
性に関して記載または特定され得る。好ましい結合親和性としては、５×１０^-6 Ｍ、１０^-6Ｍ、５×１０^-7Ｍ、１０^-7Ｍ、５×１０^-8Ｍ、１０^-8Ｍ、５×１０^-9 Ｍ、１０^-9Ｍ、５×１０^-10Ｍ、１０^-10Ｍ、５×１０^-11Ｍ、１０^-11Ｍ、５×１
０^-12Ｍ、１０^-12Ｍ、５×１０^-13Ｍ、１０^-13Ｍ、５×１０^-14Ｍ、１０^-14Ｍ、
５×１０^-15Ｍ、および１０^-15Ｍ未満の解離定数すなわちＫ_dの親和性が挙げら
れる。

【０１６３】 本発明の抗体は、インビトロおよびインビボの両方における診断方法および治
療方法を含む、本発明のポリペプチドを精製、検出および標的化するのための当
該分野で公知の方法を含むがこれに限定されない用途を有する。例えば、この抗
体は、生物学的サンプルにおいて本発明のポリペプチドのレベルを定性的および
定量的に測定するための免疫アッセイにおいて用途を有する。例えば、Ｈａｒｌ
ｏｗら，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，
第２版，１９８８）（全体が参考として援用されている）を参照のこと。

【０１６４】 本発明の抗体は、単独、または他の組成物との組み合わせのいずれかで用いら
れ得る。この抗体は、さらに、Ｎ末端もしくはＣ末端で異種のポリペプチドに組
換え的に融合され得るか、またはポリペプチドもしくは他の組成物に化学的に結
合（共有結合および非共有結合を含む）され得る。例えば、本発明の抗体は、検
出アッセイにおける標識として有用な分子およびエフェクター分子（例えば、異
種のポリペプチド、薬物または毒素）に組換え的に融合または結合され得る。例
えば、ＷＯ９２／０８４９５；ＷＯ９１／１４４３８；ＷＯ８９／１２６２４；
米国特許第５，３１４，９９５号；およびＥＰ ０ ３９６ ３８７を参照のこ
と。

【０１６５】 本発明の抗体は、当該分野で公知の任意の適切な方法によって調製され得る。
例えば、本発明のポリペプチドまたはその抗原性フラグメントは、ポリクローナ
ル抗体を含有する血清の産生を誘導するために動物に投与され得る。用語「モノ
クローナル抗体」は、ハイブリドーマ技術によって生成される抗体に限定されな
い。用語「モノクローナル抗体」は、任意の真核生物、原核生物、またはファー
ジのクローンを含む単一のクローンに由来する抗体をいい、そしてモノクローナ
ル抗体が生成される方法をいうわけではない。モノクローナル抗体は、ハイブリ
ドーマ技術、組換え技術、およびファージディスプレイ技術の使用を含む、当該
分野で公知の広範な種々の技術を用いて調製され得る。

【０１６６】 ハイブリドーマ技術は、当該分野で公知の技術を含み、そしてＨａｒｌｏｗら
、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，第２版、
１９８８）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄ
ｉｅｓ ａｎｄ Ｔ−ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ５６３−６８１頁（Ｅ
ｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８１）（上記の参考文献は、その全体が参考と
して援用される）に教示される。

【０１６７】 ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントは、パパイン（Ｆａｂフラグメント
を産生するため）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを産生するため
）のような酵素を使用して、タンパク質分解切断によって産生され得る。

【０１６８】 あるいは、本発明の抗体は、当該分野で公知の方法を使用して、組換えＤＮＡ
技術およびファージディスプレイ技術を適用して、または合成化学を通して生成
され得る。例えば、本発明の抗体は、当該分野で公知の種々のファージディスプ
レイ方法を用いて調製され得る。ファージディスプレイ方法において、機能的抗
体ドメインは、それらをコードするポリヌクレオチド配列を保有するファージ粒
子の表面に提示される。所望の結合特性を有するファージは、抗原、代表的には
固体表面またはビーズに結合または捕捉された抗原を用いて直接的に選択するこ
とにより、レパートリーまたはコンビナトリアル抗体ライブラリー（例えば、ヒ
トまたはマウス）から選択される。これらの方法において用いられるファージは
、代表的には、ファージ遺伝子ＩＩＩタンパク質またはファージ遺伝子ＶＩＩＩ
タンパク質のいずれかに組換え的に融合されたＦａｂ、Ｆｖまたはジスルフィド
安定化されたＦｖの抗体ドメインを有するｆｄおよびＭ１３を含む糸状ファージ
である。本発明の抗体を作製するために用いられ得るファージディスプレイ方法
の例としては、以下に開示される方法が挙げられる：Ｂｒｉｎｋｍａｎ，Ｕ．ら
、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８２：４１〜５０（１９９５）；Ａ
ｍｅｓ，Ｒ．Ｓ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８４：１７７〜
１８６（１９９５）；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ，Ｃ．Ａ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：９５２〜９５８（１９９４）；Ｐｅｒｓｉｃ，Ｌ．ら、
Ｇｅｎｅ １８７ ９〜１８（１９９７）；Ｂｕｒｔｏｎ，Ｄ．Ｒ．ら、Ａｄｖ
ａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５７：１９１〜２８０（１９９４）
；ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４；ＷＯ ９０／０２８０９；ＷＯ ９１／１０
７３７；ＷＯ ９２／０１０４７；ＷＯ ９２／１８６１９；ＷＯ ９３／１１
２３６；ＷＯ ９５／１５９８２；およびＷＯ ９５／２０４０１；ならびに米
国特許第５，６９８，４２６号、同第５，２２３，４０９号、同第５，４０３，
４８４号、同第５，５８０，７１７号、同第５，４２７，９０８号、同第５，７
５０，７５３号、同第５，８２１，０４７号、同第５，５７１，６９８号、同第
５，４２７，９０８号、同第５，５１６，６３７号、同第５，７８０，２２５号
、同第５，６５８，７２７号、および同第５，７３３，７４３号（上記の参考文
献は、その全体が参考として援用される）。

【０１６９】 上記参考文献に記載されているように、ファージ選択後、ファージ由来の抗体
コード領域は、ヒト抗体を含む抗体の全体または任意の他の所望の抗原結合フラ
グメントを作製するために単離および使用され得、そして哺乳動物細胞、昆虫細
胞、植物細胞、酵母および細菌を含む任意の所望の宿主において発現され得る。
例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２フラグメントを組換え的に生成
するための技術はまた、当該分野で公知の方法を用いて使用され得る。この方法
は、例えば、以下に開示される方法である：ＷＯ ９２／２２３２４；Ｍｕｌｌ
ｉｎａｘ，Ｒ．Ｌ．ら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １２（６）：８６４〜８
６９（１９９２）；およびＳａｗａｉ，Ｈ．ら、ＡＪＲＩ ３４：２６〜３４（
１９９５）；およびＢｅｔｔｅｒ，Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０４１
〜１０４３（１９８８）（これらの参考文献は、その全体が参考として援用され
る）。

【０１７０】 単鎖のＦｖおよび抗体を生成するために用いられ得る技術の例としては、米国
特許第４，９４６，７７８号および同第５，２５８，４９８号；Ｈｕｓｔｏｎら
、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２０３：４６〜８８（１９９
１）；Ｓｈｕ，Ｌ．ら、ＰＮＡＳ ９０：７９９５〜７９９９（１９９３）；お
よびＳｋｅｒｒａ，Ａ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０３８〜１０４０（１
９８８）に記載される技術が挙げられる。ヒトにおける抗体のインビボでの使用
およびインビトロ検出アッセイを含むいくつかの用途のために、キメラ抗体、ヒ
ト化抗体またはヒト抗体の使用が好ましくあり得る。キメラ抗体を生成するため
の方法は、当該分野において公知である。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ ２２９：１２０２（１９８５）；Ｏｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ
４：２１４（１９８６）；Ｇｉｌｌｉｅｓ，Ｓ．Ｄ．ら、（１９８９）Ｊ．Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １２５：１９１〜２０２；および米国特許第５
，８０７，７１５号を参照のこと。抗体は、以下を含む種々の技術を用いてヒト
化され得る：ＣＤＲ−グラフティング（ｇｒａｆｔｉｎｇ）（ＥＰ ０ ２３９
４００；ＷＯ ９１／０９９６７；米国特許第５，５３０，１０１号および同
第５，５８５，０８９号）、ベニヤリング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）またはリサー
フェイシング（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）（ＥＰ ０ ５９２ １０６；ＥＰ
０ ５１９ ５９６；Ｐａｄｌａｎ Ｅ．Ａ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕ
ｎｏｌｏｇｙ ２８（４／５）：４８９〜４９８（１９９１）； Ｓｔｕｄｎｉ
ｃｋａ Ｇ．Ｍ．ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ７（６）：８
０５〜８１４（１９９４）；Ｒｏｇｕｓｋａ Ｍ．Ａ．ら、ＰＮＡＳ ９１：９
６９〜９７３（１９９４））、およびチェーンシャッフリング（ｃｈａｉｎ ｓ
ｈｕｆｆｌｉｎｇ）（米国特許第５，５６５，３３２号）。ヒト抗体は、上記の
ファージディスプレイ方法を含む当該分野で公知の種々の方法により作製され得
る。米国特許第４，４４４，８８７号、同第４，７１６，１１１号、同第５，５
４５，８０６号および同第５，８１４，３１８号；ならびにＷＯ ９８／４６６
４５、ＷＯ９８／５０４３３、ＷＯ９８／２４８９３、ＷＯ９８／１６６５４、
ＷＯ９６／３４０９６、ＷＯ９６／３３７３５、およびＷＯ９１／１０７４１（
上記の参考文献はその全体が参考として援用される）もまた参照のこと。

【０１７１】 さらに、本発明には、本発明のポリペプチドに組換え的に融合または化学的に
結合体化（共有結合および非共有結合体化の両方を含む）した抗体が含まれる。
この抗体は、本発明のポリペプチド以外の抗原に特異的であり得る。例えば、抗
体は、本発明のポリペプチドを特定の細胞表面レセプターに特異的な抗体に融合
または結合体化することにより、インビトロまたはインビボのいずれかで本発明
のポリペプチドを特定の細胞型へ標的化するために用いられ得る。本発明のポリ
ペプチドに対して融合または結合体化された抗体はまた、当該分野で公知の方法
を用いてインビトロ免疫アッセイおよび精製方法において用いられ得る。例えば
、Ｈａｒｂｏｒら、前出、およびＷＯ ９３／２１２３２；ＥＰ 第０ ４３９
０９５；Ｎａｒａｍｕｒａ，Ｍ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．３９：９１
〜９９（１９９４）；米国特許第５，４７４，９８１号；Ｇｉｌｌｉｅｓ，Ｓ．
Ｏ．ら、ＰＮＡＳ ８９：１４２８〜１４３２（１９９２）；Ｆｅｌｌ，Ｈ．Ｐ
．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６：２４４６〜２４５２（１９９１）（上記の
参考文献は、その全体が参考として援用される）を参照のこと。

【０１７２】 本発明は、可変領域以外の抗体ドメインと融合または結合体化された本発明の
ポリペプチドを含む組成物をさらに含む。例えば、本発明のポリペプチドは、抗
体のＦｃ領域またはその一部分と融合され得るか、またはそれに結合体化され得
る。本発明のポリペプチドに融合した抗体部分は、ヒンジ領域、ＣＨ１ドメイン
、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインまたはドメイン全体もしくはその一部
の任意の組み合わせを含み得る。本発明のポリペプチドは、ポリペプチドのイン
ビボでの半減期を増大させるか、または免疫アッセイにおいて使用するために、
当該分野で公知の方法を用いて、上記の抗体部分に融合され得るか、またはそれ
に結合体化され得る。このポリペプチドはまた、上記の抗体部分に融合されるか
、またはそこに結合体化されて、マルチマーを形成し得る。例えば、本発明のポ
リペプチドに融合されたＦｃ部分は、Ｆｃ部分の間のジスルフィド結合によって
ダイマーを形成し得る。より高次のマルチマー形態は、ＩｇＡおよびＩｇＭの一
部分にそのポリペプチドを融合することにより作製され得る。本発明のポリペプ
チドを抗体部分に融合または結合体化するための方法は、当該分野で公知である
。例えば、米国特許第５，３３６，６０３号、同第５，６２２，９２９号、同第
５，３５９，０４６号、同第５，３４９，０５３号、同第５，４４７，８５１号
、同第５，１１２，９４６号；ＥＰ ０ ３０７ ４３４、ＥＰ ０ ３６７
１６６；ＷＯ９６／０４３８８、ＷＯ９１／０６５７０；Ａｓｈｋｅｎａｚｉ，
Ａ．ら、ＰＮＡＳ ８８：１０５３５−１０５３９（１９９１）；Ｚｈｅｎｇ，
Ｘ．Ｘ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：５５９０−５６００（１９９４）；
ならびにＶｉｌ，Ｈ．ら、ＰＮＡＳ ８９：１１３３７−１１３４１（１９９２
）（上記の参考文献は、その全体が参考として援用される）を参照のこと。

【０１７３】 本発明はさらに、本発明のポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストと
して作用する抗体に関する。例えば、本発明は、部分的または完全にかのいずれ
かで本発明のポリペプチドとのレセプター／リガンド相互作用を破壊する抗体を
含む。レセプター特異的抗体およびリガンド特異的抗体の両方が含まれる。リガ
ンド結合を妨害しないが、レセプター活性化を妨害するレセプター特異的抗体が
含まれる。レセプター活性化（すなわち、シグナル伝達）は、本明細書中に記載
の技術、そうでなければ、当該分野で公知の技術により決定され得る。リガンド
結合およびレセプター活性化を両方とも妨害するレセプター特異的抗体もまた含
まれる。同様に、リガンドに結合し、そしてリガンドのレセプターへの結合を妨
害する中和抗体、ならびにリガンドに結合し、それによってレセプター活性化を
妨害するが、リガンドがレセプターに結合することを妨害しない抗体が含まれる
。レセプターを活性化する抗体がさらに含まれる。これらの抗体は、リガンド媒
介レセプター活性化により影響を及ぼされる生物学的活性の全てまたは全て未満
のいずれかについてのアゴニストとして作用し得る。この抗体は、本明細書中に
開示された特異的活性を含む生物学的活性についてのアゴニストまたはアンタゴ
ニストとして特定され得る。上記の抗体アゴニストは、当該分野で公知の方法を
使用して作製され得る。例えば、ＷＯ９６／４０２８１；米国特許第５，８１１
，０９７号；Ｄｅｎｇ，Ｂ．ら、Ｂｌｏｏｄ ９２（６）：１９８１−１９８８
（１９９８）；Ｃｈｅｎ，Ｚ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５８（１６）：３６
６８−３６７８（１９９８）；Ｈａｒｒｏｐ，Ｊ．Ａ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ
．１６１（４）：１７８６−１７９４（１９９８）；Ｚｈｕ，Ｚ．ら、Ｃａｎｃ
ｅｒ Ｒｅｓ：５８（１５）：３２０９−３２１４（１９９８）；Ｙｏｏｎ，Ｄ
．Ｙ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０（７）：３１７０−３１７９（１９９８
）；Ｐｒａｔ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．１１１（Ｐｔ２）：２３７−２
４７（１９９８）；Ｐｉｔａｒｄ，Ｖ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ ２０５（２）：１７７−１９０（１９９７）；Ｌｉａｕｔａｒｄ，Ｊ．ら、
Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ９（４）：２３３−２４１（１９９７）；Ｃａｒｌｓｏｎ，
Ｎ．Ｇ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（１７）：１１２９５−１１３０
１（１９９７）；Ｔａｒｙｍａｎ，Ｒ．Ｅ．ら、Ｎｅｕｒｏｎ １４（４）：７
５５−７６２（１９９５）；Ｍｕｌｌｅｒ，Ｙ．Ａ．ら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ
６（９）：１１５３−１１６７（１９９８）；Ｂａｒｔｕｎｅｋ，Ｐ．ら、Ｃｙ
ｔｏｋｉｎｅ ８（１）：１４−２０（１９９６）（上記の文献は、その全体が
参考として援用される）を参照のこと。

【０１７４】 この節「ポリペプチドおよびペプチド」中に引用される各文書の全ての開示は
、本明細書中によって参考として本明細書中に援用される。

【０１７５】 （エピトープ） 本発明は、以下を含むポリペプチドか、あるいは以下からなるポリペプチドを
含む：配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドのエピトープ、あるいは
、寄託されたクローン（寄託情報）中に含まれるポリヌクレオチド配列によって
コードされるか、または上記に定義されるようなストリンジェントなハイブリダ
イゼーション条件下もしくは低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション
条件下で、配列番号１の配列の相補体もしくはＡＴＣＣ寄託番号９７６４０（１
９９６年６月２７日）として寄託されたクローンに含まれる配列の相補体にハイ
ブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド配列のエピ
トープ。ｃＤＮＡプラスミドＺ中のｃＤＮＡによりコードされるポリペプチド配
列のエピトープ、あるいは前述で定義されるように、ストリンジェントなハイブ
リダイゼーション条件下またはより低いストリンジェンシーハイブリダイゼーシ
ョン条件下で、配列番号Ｘのエピトープコード配列またはｃＤＮＡプラスミドＺ
に含まれるエピトープコード配列の相補鎖にハイブリダイズする、ポリヌクレオ
チドによってコードされるポリペプチド配列のエピトープ。本発明はさらに、本
発明のポリペプチド配列のエピトープをコードするポリヌクレオチド配列（例え
ば、配列番号１に開示される配列など）、本発明のエピトープをコードするポリ
ヌクレオチド配列の相補鎖のポリヌクレオチド配列、および前記で定義されるよ
うに、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下またはより低いストリ
ンジェンシー条ハイブリダイゼーション件下で、この相補鎖にハイブリダイズす
るポリヌクレオチド配列を含む。

【０１７６】 用語「エピトープ」とは、本明細書中で使用される場合、動物において、好ま
しくは哺乳動物において、そして最も好ましくはヒトにおいて抗原性活性または
免疫原性活性を有するポリペプチドの部分をいう。好ましい実施形態において、
本発明は、エピトープを含むポリペプチド、およびこのポリペプチドをコードす
るポリヌクレオチドを含む。「免疫原性エピトープ」とは、本明細書中で使用さ
れる場合、当該分野で公知の任意の方法によって決定されるような（例えば、下
記に記載される抗体を産生するための方法による）、動物における抗体応答を誘
発するタンパク質の一部として定義される（例えば、Ｇｅｙｓｅｎら、Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：３９９８−４００２（１９８３
）を参照のこと）。用語「抗原性エピトープ」とは、本明細書中で使用される場
合、当該分野で周知の任意の方法（例えば、本明細書中に記載される免疫アッセ
イによる）によって決定されるような、抗体がその抗原に免疫特異的に結合し得
るタンパク質の一部として定義される。免疫特異的結合は、非特異的結合は除外
するが、他の抗原との交差反応を除外する必要はない。抗原性エピトープは、免
疫原性である必要はない。

【０１７７】 エピトープとして機能するフラグメントは、任意の従来の方法によって産生さ
れ得る。（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．ＵＳＡ ８２：５１３１−５１３５（１９８５）を参照のこと。これはさらに
、米国特許第４，６３１，２１１号に記載される）。

【０１７８】 本発明においては、抗原性エピトープは、好ましくは、少なくとも４、少なく
とも５、少なくとも６、少なくとも７アミノ酸配列を含み、より好ましくは、少
なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０
、少なくとも２５アミノ酸配列を含み、そして最も好ましくは約１５アミノ酸と
約３０アミノ酸との間の配列を含む。免疫原性エピトープまたは抗原性エピトー
プを含有する好ましいポリペプチドは、少なくとも１０、１５、２０、２５、３
０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９
０、９５または１００アミノ酸残基の長さである。抗原性エピトープは、有用で
ある（例えば、エピトープに特異的に結合する抗体（モノクローナル抗体を含む
）を惹起するため）。抗原性エピトープは、イムノアッセイにおいて、標的分子
として使用され得る。（例えば、Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ ３７：７６７−７
７８（１９８４）；Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１９：６６０−
６６６（１９８３）を参照のこと）。

【０１７９】 同様に、例えば、当該分野において周知の方法に従って抗体を誘導するために
免疫原性エピトープが用いられ得る（例えば、Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら、前出；Ｗ
ｉｌｓｏｎら、前出；Ｃｈｏｗら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ ８２：９１０−９１４；およびＢｉｔｔｌｅら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ
．６６：２３４７−２３５４（１９８５）を参照のこと）。好ましい免疫原性エ
ピトープとしては、分泌タンパク質が挙げられる。１つ以上の免疫原性エピトー
プを含むポリペプチドは、アルブミンのようなキャリアタンパク質とともに抗体
応答を誘発するために動物系（例えば、ウサギまたはマウス）に対して提示され
得るか、またはそのポリペプチドが十分に長い場合（少なくとも約２５アミノ酸
）、そのポリペプチドはキャリアなしに、提示され得る。しかし、わずか８〜１
０アミノ酸を含む免疫原性エピトープが、少なくとも変性ポリペプチドにおける
直鎖状エピトープと結合可能である抗体を惹起させるのに十分であることが示さ
れた（例えば、ウエスタンブロッティングにおいて）。

【０１８０】 本発明のエピトープ保有ポリペプチドは、当該分野で周知の方法に従って抗体
を誘導するために使用され得る。これらの周知の方法としては、インビボ免疫、
インビトロ免疫、およびファージディスプレイ法が挙げられるが、それらに限定
されない。例えば、Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら、前出；Ｗｉｌｓｏｎら、前出、およ
びＢｉｔｔｌｅら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、６６：２３４７−２３５４（１
９８５）を参照のこと。インビボ免疫を使用する場合、動物を遊離ペプチドを用
いて免疫し得る；しかし、抗ペプチド抗体力価は、高分子キャリア（例えば、キ
ーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）または破傷風トキソイド）にペプチ
ドを結合させることによりブーストされ得る。例えば、システイン残基を含むペ
プチドは、マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（Ｍ
ＢＳ）のようなリンカーを用いてキャリアに結合され得る。その一方、他のペプ
チドは、より一般的な結合剤（例えば、グルタルアルデヒド）を用いてキャリア
に結合され得る。例えば、ウサギ、ラット、およびマウスのような動物は、遊離
のペプチドまたはキャリア結合ペプチドのいずれかを用いて、例えば、約１００
μｇのペプチドまたはキャリアタンパク質およびフロイントアジュバントまたは
免疫応答を刺激することが公知である他のアジュバントを含むエマルジョンを腹
腔内注射および／または皮内注射することにより免疫される。いくつかのブース
ター注射が、抗ペプチド抗体の有用な力価を提供するために、例えば、約２週間
の間隔で、必要とされ得る。この力価は、例えば、固体表面に吸着した遊離のペ
プチドを用いるＥＬＩＳＡアッセイにより検出され得る。免疫した動物由来の血
清中の抗ペプチド抗体の力価は、抗ペプチド抗体の選択（例えば、当該分野で周
知の方法に従う固体支持体上のペプチドへの吸着および選択された抗体の溶出に
よる）により上昇し得る。

【０１８１】 当業者に理解されるように、そして上記で考察されるように、免疫原性エピト
ープまたは抗原性エピトープを含む本発明のポリペプチドは、他のポリペプチド
配列に融合され得る。例えば、本発明のポリペプチドは、免疫グロブリン（Ｉｇ
Ａ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ）の定常ドメインまたはそれらの部分（ＣＨ１、Ｃ
Ｈ２、ＣＨ３、またはそれらの任意の組み合わせ、およびこれらの部分）と融合
し得、これがキメラポリペプチドを生じる。このような融合タンパク質は、精製
を容易にし得、そしてインビボにおける半減期を増加し得る。このことは、ヒト
ＣＤ４ポリペプチドの最初の２つのドメインおよび哺乳動物の免疫グロブリンの
重鎖または軽鎖の定常領域の種々のドメインからなるキメラタンパク質について
示された。例えば、ＥＰ ３９４，８２７；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕ
ｒｅ，３３１：８４−８６（１９８８）を参照のこと。ジスルフィド架橋二量体
構造を有するＩｇＧ融合タンパク質はまた、そのＩｇＧ部分ジスルフィド結合に
起因して、単量体ポリペプチドまたはそれらのフラグメント単独よりも、他の分
子の結合および中和において効果的であることが見出された。例えば、Ｆｏｕｎ
ｔｏｕｌａｋｉｓら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２７０：３９５８−３９６４（１
９９５）を参照のこと。上記のエピトープをコードする核酸はまた、エピトープ
タグ（例えば、血球凝集素（「ＨＡ」）タグまたはフラッグタグ（ｆｌａｇ ｔ
ａｇ））として目的の遺伝子と組換えられ、発現されたポリペプチドの検出およ
び精製を補助し得る。例えば、Ｊａｎｋｎｅｃｈｔらによって記載された系は、
ヒト細胞株において発現される非変性融合タンパク質の迅速な精製を可能にする
（Ｊａｎｋｎｅｃｈｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８
８：８９７２−８９７（１９９１））。この系において、目的の遺伝子は、遺伝
子の読み取り枠（オープンリーディングフレーム）が、６つのヒスチジン残基か
らなるアミノ末端タグと翻訳で融合されるように、ワクシニア組換えプラスミド
中にサブクローンされる。このタグは、融合タンパク質についての基質結合ドメ
インとして働く。組換えワクシニアウイルスに感染した細胞由来の抽出物は、Ｎ
ｉ²⁺ニトリロ三酢酸アガロースカラムに充填され、そしてヒスチジンタグ化した
タンパク質が、イミダゾール含有緩衝液を用いて選択的に溶出され得る。

【０１８２】 本発明のさらなる融合タンパク質は、遺伝子シャッフリング、モチーフシャッ
フリング、エキソンシャッフリング、および／またはコドンシャッフリング（総
称して「ＤＮＡシャッフリング」といわれる）の技術を通じて生成され得る。Ｄ
ＮＡシャッフリングを使用して、本発明のポリペプチドの活性を調節し得、この
ような方法を用いて、変化した活性を有するポリペプチド、ならびにそのポリペ
プチドのアゴニストおよびアンタゴニストを生成し得る。一般には、米国特許第
５，６０５，７９３号；同第５，８１１，２３８号；同第５，８３０，７２１号
；同第５，８３４，２５２号；および同第５，８３７，４５８号、ならびにＰａ
ｔｔｅｎら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：７２４−
３３（１９９７）；Ｈａｒａｙａｍａ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．
１６（２）：７６−８２（１９９８）；Ｈａｎｓｓｏｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．２８７：２６５−７６（１９９９）；ならびにＬｏｒｅｎｚｏおよびＢｌａ
ｓｃｏ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２４（２）：３０８−１３（１９９８）
（これらの特許および刊行物の各々は、本明細書によってその全体が参考として
援用される）を参照のこと。１つの実施形態において、配列番号１に対応するポ
リヌクレオチドおよびこれらのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプ
チドの改変は、ＤＮＡシャッフリングにより達成され得る。ＤＮＡシャッフリン
グは、相同組換えまたは部位特異的組換えにより、２つ以上のＤＮＡセグメント
をアセンブリして、ポリヌクレオチド配列における変化を産生することを含む。
別の実施形態において、本発明のポリヌクオチドまたはコードされるポリペプチ
ドは、組換え前に、エラープローンＰＣＲ、ランダムヌクレオチド挿入または他
の方法による、ランダムな変異誘発に供されることによって改変され得る。別の
実施形態において、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの１つ
以上の成分、モチーフ、セクション（ｓｅｃｔｉｏｎ）、部分、ドメイン、フラ
グメントなどは、１つ以上の異種分子の１つ以上の成分、モチーフ、セクション
、部分、ドメイン、フラグメントなどと組み換えられ得る。

【０１８３】 （抗体） 本発明はさらに、本発明のポリペプチド、好ましくはエピトープに（特異的抗
体−抗原結合をアッセイするための当該分野で周知のイムノアッセイにより決定
される場合）免疫特異的に結合する抗体およびＴ−細胞抗原レセプター（ＴＣＲ
）に関する。本発明の抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体
、多重特異的抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体、単鎖抗体、Ｆａ
ｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーによって
産生されたフラグメント、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本発明の
抗体に対する抗Ｉｄ抗体が挙げられる）、および任意の上記の抗体のエピトープ
結合フラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書中で使用さ
れる場合、用語「抗体」とは、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の
免疫学的に活性な部分（すなわち、抗原に免疫特異的に結合する抗原結合部位を
含む分子）をいう。本発明の免疫グロブリン分子は、免疫グロブリン分子の任意
の型（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ）、ク
ラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇ
Ａ２）またはサブクラスの分子であり得る。

【０１８４】 最も好ましくは、抗体は、本発明のヒト抗原結合抗体フラグメントであり、そ
してＦａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単
鎖抗体、ジスルフィド連結Ｆｖ（ｓｄＦｖ）およびＶＬドメインまたはＶＨドメ
インのいずれかを含むフラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。単
鎖抗体を含む抗原結合抗体フラグメントは、可変領域を、単独であるいは以下：
ヒンジ領域、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインの全体また
は部分との組み合わせで含み得る。ヒンジ領域、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイ
ンおよびＣＨ３ドメインと可変領域の任意の組み合わせをもまた含む抗原結合フ
ラグメントもまた、本発明に含まれる。本発明の抗体は、鳥類および哺乳動物を
含む任意の動物起源由来であり得る。好ましくは、この抗体は、ヒト、マウス、
ロバ、ウサギ（ｓｈｉｐ ｒａｂｂｉｔ）、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、
またはニワトリである。本明細書中で使用される場合、「ヒト」抗体は、ヒト免
疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を含み、そしてヒト免疫グロブリンラ
イブラリーから、または１つ以上のヒト免疫グロブリンについてトランスジェニ
ックでかつ内因性免疫グロブリンを発現しない動物（以下および、例えば、Ｋｕ
ｃｈｅｒｌａｐａｔｉらによる米国特許第５，９３９，５９８号に記載されるよ
うな）から単離された抗体を含む。

【０１８５】 本発明の抗体は、一重特異的、二重特異的、三重特異的またはより多価の多重
特異的であり得る。多重特異的な抗体は、本発明のポリペプチドの異なるエピト
ープに対して特異的であり得るか、または本発明のポリペプチドおよび異種エピ
トープ（例えば、異種ポリペプチドまたは固体支持体物質）の両方に特異的であ
り得る。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ ９３／１７７１５；ＷＯ９２／０８８０２；
ＷＯ ９１／００３６０；ＷＯ ９２／０５７９３；Ｔｕｔｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ．１４７：６０−６９（１９９１）；米国特許第４，４７４，８９３号；
同第４，７１４，６８１号；同第４，９２５，６４８号；同第５，５７３，９２
０号；同第５，６０１，８１９号；Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．
１４８：１５４７−１５５３（１９９２）を参照のこと。

【０１８６】 本発明の抗体は、抗体により認識されるかまたは特異的に結合される本発明の
ポリペプチドのエピトープまたは部分によって記載され得るかまたは特定化され
得る。このエピトープまたはポリペプチド部分は、本明細書中に記載されるよう
に、例えば、Ｎ末端およびＣ末端位置により、または連続するアミノ酸残基のサ
イズにより、特定化され得るか、または表および図に列挙され得る。本発明の任
意のエピトープまたはポリペプチドを特異的に結合する抗体はまた排除され得る
。従って、本発明は、本発明のポリペプチドを特異的に結合し、そしてこのポリ
ペプチドの排除を可能にする抗体を含む。

【０１８７】 本発明の抗体はまた、その交差反応性によって記載され得るか、または特定化
され得る。本発明のポリペプチドの任意の他のアナログ、オルソログ（ｏｒｔｈ
ｏｌｏｇ）またはホモログを結合しない抗体が、含まれる。本発明のポリペプチ
ドに対して少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくと
も８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６５％、少なくと
も６０％、少なくとも５５％および少なくとも５０％の同一性（当該分野で公知
の方法および本明細書において記載された方法を用いて計算される場合）を有す
るポリペプチドを結合する抗体もまた、本発明に含まれる。本発明のポリペプチ
ドに対して９５％未満、９０％未満、８５％未満、８０％未満、７５％未満、７
０％未満、６５％未満、６０％未満、５５％未満および５０％未満の同一性（当
該分野で公知の方法および本明細書において記載された方法を用いて計算される
場合）を有するポリペプチドに結合しない抗体もまた、本発明に含まれる。さら
に本発明には、（本明細書中に記載されるような）ストリンジェントなハイブリ
ダイゼーション条件下で本発明のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌ
クレオチドによりコードされるポリペプチドを結合する抗体が含まれる。本発明
の抗体はまた、本発明のポリペプチドに対するその結合親和性によって記載また
は特定され得る。好ましい結合親和性としては、５×１０^-2Ｍ、１０^-2Ｍ、５×
１０^-3Ｍ、１０^-3Ｍ、５×１０^-4Ｍ、１０^-4Ｍ、５×１０^-5Ｍ、１０^-5Ｍ、５×
１０^-6Ｍ、１０^-6Ｍ、５×１０^-7Ｍ、１０^-7Ｍ、５×１０^-8Ｍ、１０^-8Ｍ、５×
１０^-9Ｍ、１０^-9Ｍ、５×１０^-10Ｍ、１０^-10Ｍ、５×１０^-11Ｍ、１０^-11Ｍ、
５×１０^-12Ｍ、１０^-12Ｍ、５×１０^-13Ｍ、１０^-13Ｍ、５×１０^-14Ｍ、１０^{- 14} Ｍ、５×１０^-15Ｍ、または１０^-15Ｍ未満の解離定数すなわちＫ_dを有する結
合親和性が挙げられる。

【０１８８】 本発明はまた、競合的な結合を決定するための当該分野で公知の任意の方法（
例えば、本明細書中に記載されるイムノアッセイ）によって決定されるような、
本発明のエピトープに対する抗体の結合を競合的に阻害する抗体を提供する。好
ましい実施形態において、抗体は、少なくとも９０％、少なくとも８０％、少な
くとも７０％、少なくとも６０％、または少なくとも５０％、エピトープに対す
る結合を競合的に阻害する。

【０１８９】 本発明の抗体は、本発明のポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストと
して作用し得る。例えば、本発明は、レセプター／リガンドと本発明のポリペプ
チドとの相互作用を部分的または完全にのいずれかで破壊する抗体を含む。本発
明は、レセプター特異的抗体およびリガンド特異的抗体の両方を特徴とする。本
発明はまた、リガンド結合を妨げないがレセプターの活性化を妨げるレセプター
特異的抗体を特徴とする。レセプターの活性化（すなわち、シグナル伝達）は、
本明細書中に記載される技術、またはさもなくば当該分野で公知の技術によって
決定され得る。例えば、レセプターの活性化は、（例えば、上記されたような）
免疫沈降、続いてウエスタンブロット分析によって、レセプターのリン酸化（例
えば、チロシンまたはセリン／スレオニン）あるいはその基質を検出することに
よって決定され得る。特定の実施形態において、抗体の非存在下の活性の少なく
とも９０％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、または
少なくとも５０％、リガンド活性またはレセプター活性を阻害する抗体を提供す
る。

【０１９０】 本発明はまた、リガンド結合およびレセプター活性化の両方を妨げるレセプタ
ー特異的抗体、ならびにレセプター−リガンド複合体を認識し、そして、好まし
くは、結合していないレセプターまたは結合していないリガンドを特異的に認識
しない抗体を特徴とする。同様に、本発明には、リガンドに結合し、そしてリガ
ンドのレセプターへの結合を妨げる中和抗体、ならびにリガンドに結合し、それ
によってレセプター活性化を妨げるが、リガンドがレセプターに結合することは
妨げない抗体が含まれる。さらに本発明に含まれるのは、レセプターを活性化す
る抗体である。これらの抗体は、レセプターアゴニストとして作用し得、すなわ
ち、リガンド媒介のレセプター活性化の生物学的活性のすべてまたはサブセット
（ｓｕｂｓｅｔ）のいずれかを増強または活性化し得る。この抗体は、本明細書
中に開示される本発明のペプチドの特定の生物学的活性を含む生物学的活性に対
するアゴニスト、アンタゴニストまたはインバース（ｉｎｖｅｒｓｅ）アゴニス
トとして特定化され得る。上記の抗体アゴニストは、当該分野で公知の方法を用
いて作製され得る。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９６／４０２８１；米国特許第５，
８１１，０９７号；Ｄｅｎｇら、Ｂｌｏｏｄ ９２（６）：１９８１−１９８８
（１９９８）；Ｃｈｅｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５８（１６）：３６６８−
３６７８（１９９８）；Ｈａｒｒｏｐら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１（４）：
１７８６−１７９４（１９９８）；Ｚｈｕら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ：５８（１
５）：３２０９−３２１４（１９９８）；Ｙｏｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１
６０（７）：３１７０−３１７９（１９９８）；Ｐｒａｔら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓ
ｃｉ．１１１（Ｐｔ２）：２３７−２４７（１９９８）；Ｐｉｔａｒｄら、Ｊ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０５（２）：１７７−１９０（１９９７）
；Ｌｉａｕｔａｒｄら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ９（４）：２３３−２４１（１９９
７）；Ｃａｒｌｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（１７）：１１２９
５−１１３０１（１９９７）；Ｔａｒｙｍａｎら、Ｎｅｕｒｏｎ １４（４）：
７５５−７６２（１９９５）；Ｍｕｌｌｅｒら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ６（９）
：１１５３−１１６７（１９９８）；Ｂａｒｔｕｎｅｋら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ
８（１）：１４−２０（１９９６）（上記の文献はすべて、その全体が本明細書
において参考として援用される）を参照のこと。

【０１９１】 本発明の抗体は、例えば、インビトロおよびインビボの両方における診断方法
および治療方法を含めて、本発明のポリペプチドを精製、検出および標的化する
のために使用され得るが、これに限定されない。例えば、この抗体は、生物学的
サンプルにおいて本発明のポリペプチドのレベルを定性的および定量的に測定す
るためのイムノアッセイにおいて用途を有する。例えば、Ｈａｒｌｏｗら，Ａｎ
ｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，第２版，１９
８８）（その全体が参考として本明細書中に援用される）を参照のこと。

【０１９２】 以下により詳細が議論されるように、本発明の抗体は、単独で、または他の組
成物との組み合わせのいずれかで用いられ得る。この抗体は、さらに、Ｎ末端も
しくはＣ末端で異種ポリペプチドに組換え的に融合され得るか、またはポリペプ
チドもしくは他の組成物に化学的に結合（共有結合および非共有結合を含む）さ
れ得る。例えば、本発明の抗体は、検出アッセイにおける標識として有用な分子
およびエフェクター分子（例えば、異種ポリペプチド、薬物、放射性核種または
毒素）に組換え的に融合または結合体化され得る。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９２
／０８４９５；ＷＯ９１／１４４３８；ＷＯ８９／１２６２４；米国特許第５，
３１４，９９５号；および欧州特許第３９６，３８７号を参照のこと。

【０１９３】 本発明の抗体は、例えば、共有結合性付着（ｃｏｖａｌｅｎｔ ａｔｔａｃｈ
ｍｅｎｔ）が、抗体が抗イディオタイプ応答を産生するのを妨げないような、抗
体に対する任意の型の分子の共有結合性付着により、改変された、誘導体を含む
。例えば、制限されないが、抗体誘導体には、例えば、グリコシル化、アセチル
化、ぺグ化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）、リン酸化（ｐｈｏｓｐｈｙｌａｔｉｏｎ
）、アミド化、既知の保護基／ブロック基（ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｇｒｏｕｐ）に
よる誘導体化、タンパク質分解性切断、細胞性リガンドまたは他のタンパク質へ
の連結などによって改変された抗体が挙げられる。多数の任意の化学的改変が、
特異的化学切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝的合成などを
含むが、これらに制限されない公知の技術によって実行され得る。さらに、誘導
体は、１つ以上の非古典的アミノ酸を含み得る。

【０１９４】 本発明の抗体は、当該分野で公知の任意の適切な方法によって産生され得る。
目的の抗原に対するポリクローナル抗体は、当該分野で周知の種々の手順によっ
て産生され得る。例えば、本発明のポリペプチドが種々の宿主動物（ウサギ、マ
ウス、ラットなどを含むがこれらに限定されない）に投与されて、抗原に対して
特異的なポリクローナル抗体を含む血清の産生を誘導し得る。種々のアジュバン
トが、宿主種に依存して、免疫学的応答を増加させるために使用され得、そして
フロイント（完全および不完全）、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル（
ｍｉｎｅｒａｌ ｇｅｌ）、リゾレシチンのような界面活性物質、プルロニック
（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油エマルジョン、
キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、ならびにＢＣＧ（カ
ルメット−ゲラン杆菌）およびｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ
のような潜在的に有用なヒトアジュバントを含むが、これらに限定されない。こ
のようなアジュバントはまた、当該分野で周知である。

【０１９５】 モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組換え、およびファージディスプレ
イ技術、またはそれらの組み合わせの使用を含む、当該分野で公知の広範な種々
の技術を用いて調製され得る。例えば、モノクローナル抗体は、当該分野で公知
の以下に挙げられるハイブリドーマ技術を使用して産生され得、例えば、Ｈａｒ
ｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，
（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ
，第２版、１９８８）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎ
ｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ５６３−６
８１（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．１９８１）（上記の参考文献は、その全体が
参考として援用される）に教示される。本明細書中で使用される場合、用語「モ
ノクローナル抗体」とは、ハイブリドーマ技術を通して生成された抗体に限定さ
れない。用語「モノクローナル抗体」とは、任意の真核生物、原核生物、または
ファージクローンを含む単一のクローンに由来する抗体をいい、そしてその生成
される方法ではない。

【０１９６】 ハイブリドーマ技術を用いて特異的抗体を産生およびスクリーニングする方法
は、当該分野で慣用的かつ周知であり、そして実施例３に詳細に議論される。簡
略には、マウスは、本発明のポリペプチドまたはそのようなペプチドを発現する
細胞を用いて免疫され得る。一旦免疫応答が検出される（例えば、抗原に特異的
な抗体がマウスの血清中に検出される）と、マウスの脾臓を収集しそして脾細胞
を単離する。次に、その脾細胞を周知の技術によって任意の適切な骨髄腫細胞（
例えば、ＡＴＣＣから入手可能な細胞株ＳＰ２０由来の細胞）に融合させる。ハ
イブリドーマを限界希釈によって選択およびクローン化する。次に、ハイブリド
ーマクローンを、本発明のポリペプチドに結合し得る抗体を分泌する細胞につい
て、当該分野で公知の方法によってアッセイする。一般的に高いレベルの抗体を
含む腹水（ａｓｃｉｔｅｓ ｆｌｕｉｄ）が、陽性ハイブリドーマクローンを用
いてマウスを免疫させることによって、産生され得る。

【０１９７】 従って、本発明は、モノクローナル抗体および本発明の抗体を分泌するハイブ
リドーマ細胞を培養する工程を包含する方法によって産生される抗体を、生成す
る方法を提供し、ここで、好ましくは、このハイブリドーマは、骨髄腫細胞と本
発明の抗原で免疫したマウスから単離された脾細胞とを融合させ、次いで本発明
のポリペプチドと結合し得る抗体を分泌するハイブリドーマクローンについて、
融合物から生じるハイブリドーマをスクリーニングすることによって生成される
。

【０１９８】 特定のエピトープを認識する抗体フラグメントは、公知の技術によって産生さ
れ得る。例えば、本発明のＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントは、（Ｆａ
ｂフラグメントを産生するための）パパインまたは（Ｆ（ａｂ’）２フラグメン
トを産生するための）ペプシンのような酵素を使用して、免疫グロブリン分子の
タンパク質分解切断によって産生され得る。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、可
変領域、軽鎖定常領域および重鎖のＣＨ１ドメインを含む。

【０１９９】 例えば、本発明の抗体はまた、当該分野で公知の種々のファージディスプレイ
方法を用いて産生され得る。ファージディスプレイ法において、機能的抗体ドメ
インは、それらをコードするポリヌクレオチド配列を保有するファージ粒子の表
面に提示される。特定の実施形態において、そのようなファージは、レパートリ
ーまたはコンビナトリアル抗体ライブラリー（例えば、ヒトまたはマウス）から
発現される抗原結合ドメインを提示するために利用され得る。目的の抗原に結合
する抗原結合ドメインを発現するファージは、抗原を用いて選択または同定され
得る（例えば、標識した抗体あるいは固体表面またはビーズに結合または捕捉さ
れた抗原を使用する）。これらの方法において用いられるファージは、代表的に
は、ファージ遺伝子ＩＩＩタンパク質またはファージ遺伝子ＶＩＩＩタンパク質
のいずれかに組換え的に融合されたＦａｂ、Ｆｖまたはジスルフィド安定化され
たＦｖの抗体ドメインを有するファージから発現されたｆｄおよびＭ１３結合ド
メインを含む糸状ファージ（ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｐｈａｇｅ）である。本
発明の抗体を作製するために用いられ得るファージディスプレイ方法の例として
は、以下に開示される方法が挙げられる：Ｂｒｉｎｋｍａｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８２：４１−５０（１９９５）；Ａｍｅｓら、Ｊ．Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８４：１７７−１８６（１９９５）；Ｋｅｔ
ｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：９５２−９５８
（１９９４）；Ｐｅｒｓｉｃら、Ｇｅｎｅ １８７ ９−１８（１９９７）；Ｂ
ｕｒｔｏｎら、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５７：１９１
−２８０（１９９４）；ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４；ＰＣＴ
公開ＷＯ ９０／０２８０９；ＷＯ ９１／１０７３７；ＷＯ ９２／０１０４
７；ＷＯ ９２／１８６１９；ＷＯ ９３／１１２３６；ＷＯ ９５／１５９８
２；ＷＯ ９５／２０４０１；ならびに米国特許第５，６９８，４２６号；同第
５，２２３，４０９号；同第５，４０３，４８４号；同第５，５８０，７１７号
；同第５，４２７，９０８号；同第５，７５０，７５３号；同第５，８２１，０
４７号；同第５，５７１，６９８号；同第５，４２７，９０８号；同第５，５１
６，６３７号；同第５，７８０，２２５号；同第５，６５８，７２７号；同第５
，７３３，７４３号および同第５，９６９，１０８号（これらの各々は、本明細
書中でその全体が参考として援用される）。

【０２００】 上記参考文献に記載されるように、ファージ選択後、ファージ由来の抗体をコ
ードする領域は、ヒト抗体を含む抗体の全体または任意の他の所望の抗原結合フ
ラグメントを生成するために単離されかつ用いられ得、そして例えば、以下に詳
細が記載されるように、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母および細菌を
含む任意の所望の宿主において発現され得る。例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’および
Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを組換え的に産生するための技術はまた、当該分野
で公知の方法を用いて使用され得、このような方法は、以下に開示される：ＰＣ
Ｔ公開ＷＯ ９２／２２３２４；Ｍｕｌｌｉｎａｘら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕ
ｅｓ １２（６）：８６４−８６９（１９９２）；およびＳａｗａｉら、ＡＪＲ
Ｉ ３４：２６−３４（１９９５）；およびＢｅｔｔｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ
２４０：１０４１−１０４３（１９９８）（これらの参考文献は、その全体が参
考として援用される）。

【０２０１】 単鎖のＦｖｓおよび抗体を産生するために用いられ得る技術の例としては、米
国特許第４，９４６，７７８号および同第５，２５８，４９８号；Ｈｕｓｔｏｎ
ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２０３：４６−８８（１９
９１）；Ｓｈｕら、ＰＮＡＳ ９０：７９９５−７９９９（１９９３）；および
Ｓｋｅｒｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０３８−１０４０（１９８８）に
記載される技術が挙げられる。ヒトにおける抗体のインビボにおける使用および
インビトロ検出アッセイを含むいくつかの用途のために、キメラ抗体、ヒト化抗
体またはヒト抗体の使用が好ましくあり得る。キメラ抗体とは、抗体の異なる部
分が、異なる動物種に由来する分子（例えば、マウスモノクローナル抗体由来の
可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有する抗体）である。キメラ抗体
を産生するための方法は、当該分野において公知である。例えば、Ｍｏｒｒｉｓ
ｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２（１９８５）；Ｏｉら、ＢｉｏＴｅｃ
ｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４（１９８６）；Ｇｉｌｌｉｅｓら、（１９８９）Ｊ
．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １２５：１９１−２０２；米国特許第５，
８０７，７１５号；同第４，８１６，５６７号；および同第４，８１６，３９７
号を参照のこと（これらはそれらの全体が、参考として本明細書中に援用される
）。ヒト化抗体は、非ヒト種由来の１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）および
ヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域を有する所望された抗原に結
合する非ヒト種抗体由来の抗体分子である。しばしば、ヒトフレームワーク領域
内のフレームワーク残基（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｓｉｄｕｅ）は、抗原結合
を変化させるため（好ましくは改善させるために）ＣＤＲドナー抗体由来の対応
残基と置換される。これらフレームワークの置換は、当該分野で周知の方法によ
って同定され、例えば、抗原結合に重要なフレームワーク残基を同定するための
ＣＤＲおよびフレームワーク残基の相互作用のモデリング、ならびに特定の位置
における異常なフレームワーク残基を同定するための配列比較による。（例えば
、Ｑｕｅｅｎら、米国特許第５，５８５，０８９号；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎ
ａｔｕｒｅ ３３２：３２３（１９８８）を参照のこと（これらはそれらの全体
が参考として本明細書中に援用される）。）抗体は、以下を含む当該分野で公知
の種々の技術を用いてヒト化され得る：例えば、ＣＤＲ−移植（欧州特許第２３
９，４００号；ＰＣＴ公開ＷＯ ９１／０９９６７；米国特許第５，２２５，５
３９号；同第５，５３０，１０１号および同第５，５８５，０８９号）、ベニヤ
リング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）またはリサーフェイシング（ｒｅｓｕｒｆａｃｉ
ｎｇ）（欧州特許第５９２，１０６号；同第５１９，５９６号；Ｐａｄｌａｎ、
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２８（４／５）：４８９−４９８
（１９９１）； Ｓｔｕｄｎｉｃｋａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉ
ｎｇ ７（６）：８０５−８１４（１９９４）；Ｒｏｇｕｓｋａら、ＰＮＡＳ
９１：９６９−９７３（１９９４））、およびチェーンシャッフリング（ｃｈａ
ｉｎ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）（米国特許第５，５６５，３３２号）。

【０２０２】 完全なヒト抗体は、ヒト患者の治療的処置に対して特に所望される。ヒト抗体
は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体ライブラリーを用いた上記のファー
ジディスプレイ法を含む当該分野で公知の種々の方法により作製され得る。米国
特許第４，４４４，８８７号、同第４，７１６，１１１号；およびＰＣＴ公開Ｗ
Ｏ ９８／４６６４５、ＷＯ ９８／５０４３３、ＷＯ ９８／２４８９３、Ｗ
Ｏ ９８／１６６５４、ＷＯ ９６／３４０９６、ＷＯ ９６／３３７３５、お
よびＷＯ ９１／１０７４１；（これらの各々はその全体が参考として本明細書
中に援用される）もまた参照のこと。

【０２０３】 ヒト抗体はまた、機能的内因性免疫グロブリンの発現は出来ないが、ヒト免疫
グロブリン遺伝子を発現し得るトランスジェニックマウスを用いて産生され得る
。例えば、ヒト重鎖免疫グロブリン遺伝子およびヒト軽鎖免疫グロブリン遺伝子
の複合体は、無作為にまたは相同組換えによってマウス胚性幹細胞に導入され得
る。あるいは、ヒト可変領域、定常領域および多様性領域（ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ
ｒｅｇｉｏｎ）は、ヒト重鎖遺伝子およびヒト軽鎖遺伝子に加えて、マウスの
胚性幹細胞に導入され得る。マウス重鎖免疫グロブリン遺伝子およびマウス軽鎖
免疫グロブリン遺伝子は、相同組換えによるヒト免疫グロブリン座の導入と別々
にまたは同時に非機能的にされ得る。特に、ＪＨ領域のホモ接合性の欠失は、内
因性抗体の産生を妨げる。改変された胚性幹細胞を発展させ、そしてキメラマウ
スを産生するために胚盤胞中に微量注入する。次に、キメラマウスを、ヒト抗体
を発現するホモ接合性の子孫を産生するために繁殖させる。トランスジェニック
マウスを、選択された抗原（例えば、本発明のポリペプチドの全体または部分）
を用いて通常の様式で免疫する。抗原に対するモノクローナル抗体は、従来のハ
イブリドーマ技術を用いた免疫したトランスジェニックマウスから得られ得る。
トランスジェニックマウスに保持されたヒト免疫グロブリン導入遺伝子は、Ｂ細
胞分化の間に再編成し、そしてその後、クラススイッチングおよび体細胞変異を
受ける。従って、そのような技術の使用によって、治療的に有用なＩｇＧ抗体、
ＩｇＡ抗体、ＩｇＭ抗体およびＩｇＥ抗体の産生が可能である。ヒト抗体を産生
するためのこの技術の概要については、ＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ、Ｉ
ｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３（１９９５）を参照のこと。
ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのこの技術のならびにそ
のような抗体を産生するためのプロトコールの詳細な議論については、例えば、
ＰＣＴ公開ＷＯ９８／２４８９３；ＷＯ９２／０１０４７；ＷＯ９６／３４０９
６；ＷＯ９６／３３７３５；欧州特許第０ ５９８ ８７７；米国特許第５，４
１３，９２３号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第
５，５６９，８２５号；同第５，６６１，０１６号；同第５，５４５，８０６号
；同第５，８１４，３１８号；同第５，８８５，７９３号；同第５，９１６，７
７１号；および同第５，９３９，５９８号を参照のこと（これらはその全体が本
明細書中に参考として援用される）。さらに、Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．（Ｆｒ
ｅｅｍｏｎｔ，ＣＡ）およびＧｅｎｐｈａｒｍ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）のよ
うな企業は、上記の技術に類似した技術を用いて選択された抗原に対するヒト抗
体を提供することに従事し得る。

【０２０４】 選択されたエピトープを完全に認識するヒト抗体を、「ガイドされた（ｇｕｉ
ｄｅｄ）選択」といわれる技術を用いて産生し得る。このアプローチにおいて、
選択された非ヒトモノクローナル抗体（例えば、マウス抗体）は、同じエピトー
プを完全に認識するヒト抗体の選択を導くために使用される。（Ｊｅｓｐｅｒｓ
ら、Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２：８９９−９０３（１９８８））。

【０２０５】 さらに、本発明のポリペプチドに対する抗体は、当業者に周知の技術を用いて
本発明のポリペプチドを「模倣する」抗イディオタイプ抗体を産生するために順
々に利用され得る。（例えば、ＧｒｅｅｎｓｐａｎおよびＢｏｎａ、ＦＡＳＥＢ
Ｊ．７（５）：４３７−４４４；（１９８９）およびＮｉｓｓｉｎｏｆｆ，Ｊ
．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７（８）：２４２９−２４３８（１９９１）を参照のこ
と。）例えば、結合し、そしてポリペプチドのマルチマー化（ｍｕｌｔｉｍｅｒ
ｉｚａｔｉｏｎ）および／またはリガンドに対する本発明のポリペプチドの結合
を競合的に阻害する抗体が、ポリペプチドのマルチマー化ドメインおよび／また
は結合ドメインを「模倣する」抗イディオタイプを産生するために使用され得、
そして結果としてポリペプチドおよび／またはそのリガンドに結合し、そして中
和する。そのような抗イディオタイプまたはそのような抗イディオタイプのＦａ
ｂフラグメントの中和は、ポリペプチドリガンドを中和するための治療的レジメ
ンに使用され得る。例えば、そのような抗イディオタイプ抗体は、本発明のポリ
ペプチドに結合するためおよび／またはそのリガンド／レセプターに結合するた
めに使用され得、そしてそれによってその生物学的活性がブロックされる。

【０２０６】 （抗体をコードするポリヌクレオチド） 本発明はさらに、本発明の抗体およびそのフラグメントをコードするヌクレオ
チド配列を含むポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、ストリンジェント
な、またはより低いストリジェンシーのハイブリダイゼーション条件下で（例え
ば、上記に定義されるような）抗体（好ましくは、本発明のポリペプチドと特異
的に結合する、好ましくは、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドに
結合する抗体）をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレ
オチドを含む。

【０２０７】 ポリヌクレオチドが、当該分野で公知の任意の方法によって得られ得、そして
そのポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が決定される。例えば、抗体のヌクレ
オチド配列が知られている場合、この抗体をコードするポリヌクレオチドは、化
学的に合成されたオリゴヌクレオチドから構築され得（例えば、Ｋｕｔｍｅｉｅ
ｒら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １７：２４２（１９９４）に記載されるよ
うな）、これは、簡単にいうと、以下の工程を包含する：この抗体をコードする
配列の部分を含むオーバーラップするオリゴヌクレオチドの合成、これらのオリ
ゴヌクレオチドのアニーリングおよび連結、次いでＰＣＲによる連結されたオリ
ゴヌクレオチドの増幅。

【０２０８】 あるいは、抗体をコードするポリヌクレオチドは、適切な供給源からの核酸か
ら生成され得る。特定の抗体をコードする核酸を含むクローンは入手不可能だが
、その抗体分子の配列が既知である場合、その免疫グロブリンをコードする核酸
は、化学的に合成され得るか、あるいは適切な供給源（例えば、抗体ｃＤＮＡラ
イブラリー、または抗体を発現する任意の組織もしくは細胞（例えば、本発明の
抗体の発現のために選択されたハイブリドーマ細胞）から生成されたｃＤＮＡラ
イブラリー、またはそれから単離された核酸（好ましくはポリＡ＋ＲＮＡ））か
ら、例えば、その抗体をコードするｃＤＮＡライブラリーからのｃＤＮＡクロー
ンを同定するために、配列の３’末端および５’末端にハイブリダイズ可能な合
成プライマーを使用するＰＣＲ増幅によって、または特定の遺伝子配列に特異的
なオリゴヌクレオチドプローブを使用するクローニングによって得られ得る。Ｐ
ＣＲによって生成された増幅された核酸は、次いで、当該分野で周知の任意の方
法を用いて、複製可能なクローニングベクターにクローニングされ得る。

【０２０９】 一旦、抗体のヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列が決定されると、
抗体のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列の操作について当該分野で周知の
方法（例えば、組換えＤＮＡ技術、部位特異的変異誘発、ＰＣＲなど（例えば、
Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９９０，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ
およびＡｕｓｕｂｅｌら編、１９９８，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ
ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ
，ＮＹに記載の技術を参照のこと。これらは両方がその全体において本明細書に
参考として援用される。））を用いて操作され、例えば、アミノ酸の置換、欠失
、および／または挿入を作製するように異なるアミノ酸配列を有する抗体を生成
し得る。

【０２１０】 特定の実施形態において、重鎖および／または軽鎖の可変ドメインのアミノ酸
配列は、相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列の同定のために、当該分野において周
知の方法によって（例えば、配列超可変性の領域を決定するために、他の重鎖、
および軽鎖の可変領域を既知のアミノ酸配列と比較することによって）調べられ
得る。慣用的な組換えＤＮＡ技術を用いて、１つ以上のＣＤＲが、前述のように
フレームワーク領域内に（例えば、非ヒト抗体をヒト化するために、ヒトフレー
ムワーク領域中に）挿入され得る。このフレームワーク領域は天然に存在し得る
か、またはコンセンサスフレームワーク領域であり得、そして好ましくはヒトフ
レームワーク領域であり得る（例えば、列挙したヒトフレームワーク領域につい
ては、Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７８：４５７−４７９（１
９９８）を参照のこと）。好ましくは、フレームワーク領域およびＣＤＲの組み
合わせによって生成されたポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドに特異的
に結合する抗体をコードする。好ましくは、上記に議論されるように、１つ以上
のアミノ酸置換は、フレームワーク領域内で作製され得、そして好ましくは、そ
のアミノ酸置換は、抗体のその抗原への結合を改善する。さらに、このような方
法は、１つ以上の鎖内ジスルフィド結合が欠如した抗体分子を生成するように、
鎖内ジスルフィド結合に関与する１つ以上の可変領域のシステイン残基のアミノ
酸置換または欠失を作製するために使用され得る。ポリヌクレオチドへの他の変
更は、本発明によって、および当該分野の技術において包含される。

【０２１１】 さらに、適切な抗原特異性のマウス抗体分子由来の遺伝子を、適切な生物学的
活性のヒト抗体分子由来の遺伝子と共にスプライシングさせることによって、「
キメラ抗体」を産生するために開発された技術（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：８５１−８５５（１９８４）；Ｎｅｕｂ
ｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６０４−６０８（１９８４）；Ｔａｋｅ
ｄａら、Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４５２−４５４（１９８５））が使用され得る
。上記のように、キメラ抗体は、異なる部分が異なる動物種に由来する分子であ
り、このような分子は、マウスｍＡｂおよびヒト免疫グロブリンの定常領域由来
の可変領域を有する（例えば、ヒト化抗体）。

【０２１２】 あるいは、単鎖抗体の産生に関する記載された技術（米国特許第４，９４６，
７７８号；Ｂｉｒｄ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２（１９８８）；Ｈ
ｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７
９−５８８３（１９８８）；およびＷａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ ３３４：５４４
−５４（１９８９））が、単鎖抗体の産生に適応され得る。単鎖抗体は、Ｆｖ領
域の重鎖フラグメントおよび軽鎖フラグメントがアミノ酸架橋を介して連結され
れることによって形成され、単鎖ポリペプチドを生じる。Ｅ．ｃｏｌｉにおける
機能性Ｆｖフラグメントのアセンブリのための技術もまた、使用され得る（Ｓｋ
ｅｒｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：１０３８−１０４１（１９８８））。

【０２１３】 （抗体を産生する方法） 本発明の抗体は、抗体を合成するための当該分野で公知の任意の方法によって
、特に、化学合成によって、または、好ましくは、組換え発現技術によって産生
され得る。

【０２１４】 本発明の抗体、またはそのフラグメント、誘導体もしくはアナログ（例えば、
本発明の抗体の重鎖もしくは軽鎖または本発明の単鎖抗体）の組換え発現は、そ
の抗体をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターの構築を必要とす
る。一旦、本発明の抗体分子または抗体の重鎖もしくは軽鎖、あるいはそれらの
部分（好ましくは、重鎖または軽鎖の可変ドメインを含有する）をコードするポ
リヌクレオチドが得られると、抗体分子の産生のためのベクターは、当該分野で
周知の技術を用いる組換えＤＮＡ技術によって生成され得る。従って、抗体をコ
ードするヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチドの発現によってタンパク
質を調製するための方法は、本明細書に記載される。当業者に周知の方法は、抗
体をコードする配列ならびに適切な転写制御シグナルおよび翻訳制御シグナルを
含有する発現ベクターの構築のために使用され得る。これらの方法には、例えば
、インビトロの組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびインビボの遺伝子組換えが
挙げられる。従って、本発明は、プロモーターに作動可能に連結された、本発明
の抗体分子、あるいはその重鎖もしくは軽鎖、または重鎖もしくは軽鎖の可変ド
メインをコードするヌクレオチド配列を含む、複製可能なベクターを提供する。
このようなベクターは、抗体分子の定常領域（例えば、ＰＣＴ公開 ＷＯ８６／
０５８０７；ＰＣＴ公開 ＷＯ８９／０１０３６；および米国特許第５，１２２
，４６４号を参照のこと）をコードするヌクレオチド配列を含み得、そしてこの
抗体の可変ドメインは、重鎖または軽鎖の全体の発現のためにこのようなベクタ
ーにクローニングされ得る。

【０２１５】 この発現ベクターは、従来技術によって宿主細胞へと移入され、そしてこのト
ランスフェクトされた細胞は、次いで、本発明の抗体を産生するために、従来技
術によって培養される。従って、本発明は、異種プロモーターに作動可能に連結
された、本発明の抗体、あるいはその重鎖もしくは軽鎖、または本発明の単鎖抗
体をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を含む。二重鎖抗体の発現につ
いての好ましい実施形態において、重鎖および軽鎖の両方をコードするベクター
は、以下に詳述されるように、免疫グロブリン分子全体の発現のために宿主細胞
中に同時発現され得る。

【０２１６】 種々の宿主発現ベクター系は、本発明の抗体分子を発現させるために利用され
得る。このような宿主発現系は、目的のコード配列が産生され、かつ続いて精製
され得るビヒクルを表わすが、また、適切なヌクレオチドをコードする配列で形
質転換またはトランスフェクトされる場合に、インサイチュで本発明の抗体分子
を発現し得る細胞を表わす。これらには、抗体をコードする配列を含む組換えバ
クテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクター
を用いて形質転換された細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）
のような微生物；抗体をコードする配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転
換された酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ）；抗体を
コードする配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス
）に感染した昆虫細胞系；組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワー
モザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）に感染した植
物細胞系または抗体をコードする配列を含む組換えプラスミド発現ベクター（例
えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換された植物細胞系；あるいは哺乳動物細胞の
ゲノムに由来するプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）また
は哺乳動物のウイルスに由来するプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プ
ロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を含む組換え発現構築
物を保有する哺乳動物細胞系（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、３Ｔ
３細胞）が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、Ｅｓｃｈｅｒｉ
ｃｈｉａ ｃｏｌｉのような細菌細胞、そしてより好ましくは、特に、組換え抗
体分子全体の発現のために真核生物細胞が、組換え抗体分子の発現のために使用
される。例えば、ヒトサイトメガロウイルス由来の主要最初期遺伝子プロモータ
ーエレメントのようなベクターと組み合わされた、チャイニーズハムスターの卵
巣細胞（ＣＨＯ）のような哺乳動物細胞が、抗体のための効果的な発現系である
（Ｆｏｅｃｋｉｎｇら、Ｇｅｎｅ ４５：１０１（１９８６）；Ｃｏｃｋｅｔｔ
ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：２（１９９０））。

【０２１７】 細菌系において、多くの発現ベクターが、抗体分子の発現を意図する使用に依
存して有利に選択され得る。例えば、多量のこのようなタンパク質が産生される
べき場合、抗体分子の薬学的組成物の生成のために、容易に精製される融合タン
パク質産物の高レベルの発現を指向するベクターが所望され得る。このようなベ
クターには、抗体をコードする配列がｌａｃＺをコードする領域と共にベクター
にインフレームで個別に連結され得、その結果、融合タンパク質が産生されるＥ
．ｃｏｌｉ発現ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒら、ＥＭＢＯ Ｊ．２：１
７９１（１９８３））；ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅ＆Ｉｎｏｕｙｅ、Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：３１０１−３１０９（１９８５）；Ｖａ
ｎ Ｈｅｅｋｅ＆Ｓｃｈｕｓｔｅｒ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４：５５０３
−５５０９（１９８９））などが挙げられるが、これらに限定されない。ｐＧＥ
Ｘベクターもまた、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タ
ンパク質として、外来性ポリペプチドを発現させるために使用され得る。一般に
、このような融合タンパク質は可溶性であり、そして溶解した細胞から、マトリ
ックスグルタチオン−アガロースビーズへの吸着および結合、それに続く遊離グ
ルタチオン存在化での溶出によって容易に精製され得る。このｐＧＥＸベクター
は、トロンビンまたはＸａ因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計され、そ
の結果、このクローニングされた標的遺伝子産物は、ＧＳＴ部分から放出され得
る。

【０２１８】 昆虫系において、オートグラファカリフォルニカ核多核体病ウイルス（Ａｕｔ
ｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅｄｒ
ｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）（ＡｃＮＰＶ）は、外来性遺伝子を発現させるためのベ
クターとして使用される。このウイルスは、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉ
ｐｅｒｄａ細胞中で増殖する。この抗体をコードする配列は、ウイルスの非必須
領域（例えば、ポリヘドリン遺伝子）に個々にクローニングされ得、そしてＡｃ
ＮＰＶプロモーター（例えば、ポリヘドリンプロモーター）の制御下に配置され
得る。

【０２１９】 哺乳動物の宿主細胞において、多くのウイルスに基づいた発現系が利用され得
る。アデノウイルスが発現ベクターとして使用される場合、抗体をコードする目
的の配列は、アデノウイルス転写／翻訳制御複合体（例えば、後期プロモーター
および３部からなるリーダー配列）に連結され得る。次いで、このキメラ遺伝子
は、インビトロまたはインビボの組換えによって、アデノウイルスゲノム中に挿
入され得る。ウイルスのゲノムの非必須領域（例えば、領域Ｅ１またはＥ３）へ
の挿入は、感染した宿主において生存し、かつ抗体分子を発現し得る組換えウイ
ルスを生じる。（例えば、Ｌｏｇａｎ＆Ｓｈｅｎｋ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：３５５−３５９（１９８４）を参照のこと）。特
定の開始シグナルもまた、挿入された抗体をコードする配列の効率的な翻訳のた
めに必要とされ得る。これらのシグナルは、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接する配
列を含む。さらに、この開始コドンは、挿入物全体の翻訳を保証するように、所
望のコード配列のリーディングフレームと同調（ｉｎ ｐｈａｓｅ）でなければ
ならない。これらの外因性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、天然および合
成の両方の種々の起源であり得る。発現の効率は、適切な転写エンハンサーエレ
メント、転写ターミネーターなどを含めることによって増大され得る（Ｂｉｔｔ
ｎｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１−５４４（１
９８７）を参照のこと）。

【０２２０】 さらに、挿入された配列の発現を調節するか、または遺伝子産物を所望の特定
の様式に改変およびプロセスする宿主細胞株が、選択され得る。タンパク質産物
のこのような改変（例えば、グリコシル化）およびプロセシング（例えば、切断
）は、タンパク質の機能にとって重要であり得る。異なる宿主細胞は、タンパク
質産物および遺伝子産物の翻訳後プロセシングおよび改変について特徴的かつ特
有の機構を有する。適切な細胞株または宿主系は、発現した外来性タンパク質の
正確な改変およびプロセシングを保証するように選択され得る。この目的のため
に、一次転写物の適切なプロセシング、遺伝子産物のグリコシル化、およびリン
酸化のための細胞の機構を有する真核生物の宿主細胞が使用され得る。このよう
な哺乳動物の宿主細胞には、ＣＨＯ、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ、Ｈｅｌａ、ＣＯＳ、Ｍ
ＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、ＷＩ３８、および、特に、乳癌細胞株（例えば、ＢＴ
４８３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＴＢ２、ＢＴ２０およびＴ４７Ｄなど）、ならびに正
常な乳腺細胞株（例えば、ＣＲＬ７０３０およびＨｓ５７８Ｂｓｔなど）が挙げ
られるが、これらに限定されない。

【０２２１】 組換えタンパク質の長期の高収率の産生のために、安定した発現が好ましい。
例えば、抗体分子を安定して発現する細胞株が操作され得る。ウイルスの複製起
点を含む発現ベクターの使用よりも、むしろ宿主細胞は、適切な発現制御エレメ
ント（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリ
アデニル化部位など）によって制御されるＤＮＡ、および選択可能なマーカーで
形質転換され得る。外来性ＤＮＡの導入に続いて、操作された細胞は、濃縮され
た培地中で１〜２日間増殖され得、次いで選択培地に切り換えられる。組換えプ
ラスミド中の選択マーカーは、選択への耐性を与え、そして細胞がプラスミドを
それらの染色体に安定に組み込み、そして増殖し、次いで細胞株にクローニング
および増殖され得る、増殖巣（ｆｏｃｉ）を形成することを可能にする。この方
法は、抗体分子を発現する細胞株を操作するために有利に使用され得る。このよ
うな操作された細胞株は、抗体分子と直接的または間接的に相互作用する化合物
のスクリーニングおよび評価において特に有用であり得る。

【０２２２】 多くの選択系が使用され得、それらには、それぞれｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−、ま
たはａｐｒｔ−細胞において使用され得る、単純ヘルペスウイルスチミジンキナ
ーゼ（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｃｅｌｌ １１：２２３（１９７７））、ヒポキサンチ
ン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＳｚｙｂａｌｓｋａおよびＳ
ｚｙｂａｌｓｋｉ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ４８：２
０２（１９９２））、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏ
ｗｙら、Ｃｅｌｌ ２２：８１７（１９８０））遺伝子が挙げられるが、これら
に限定されない。また、代謝拮抗物質耐性は、以下の遺伝子に関する選択の基礎
として使用され得る：メトトレキサートへの耐性を与えるｄｈｆｒ（Ｗｉｇｌｅ
ｒら、Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：３５７（１９８０））；Ｏ
’Ｈａｒｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：１５２
７（１９８１）；ミコフェノール酸への耐性を与えるｇｐｔ（Ｍｕｌｌｉｇａｎ
およびＢｅｒｇ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：２０
７２（１９８１））；アミノグリコシドＧ−４１８への耐性を与えるｎｅｏ（Ｃ
ｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｙ １２：４８８−５０５；ＷｕおよびＷｕ、
Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ３：８７−９５（１９９１）；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ、
Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：５７３−５９６
（１９９３）；Ｍｕｌｌｉｇａｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：９２６−９３２（
１９９３）；ならびにＭｏｒｇａｎおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．
Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１−２１７（１９９３）；１９９３年５月，ＴＩＢ
ＴＥＣＨ １１（５）：１５５−２１５）；ならびにハイグロマイシンへの耐
性を与えるｈｙｇｒｏ（Ｓａｎｔｅｒｒｅら、Ｇｅｎｅ ３０：１４７（１９８
４））。使用され得る当該分野で一般に公知である組換えＤＮＡ技術の方法は、
例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎ
Ｙ（１９９３）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ、Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅ
ｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔ
ｏｎ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９０）；ならびにＤｒａｃｏｐｏｌｉら（編）、
Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，
Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９４）の１２および１３章；Ｃｏ
ｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：１（１９８
１）に記載され、これらはその全体が本明細書において参考として援用される。

【０２２３】 抗体分子の発現レベルは、ベクター増幅によって増加され得る（総説について
は、ＢｅｂｂｉｎｇｔｏｎおよびＨｅｎｔｓｃｈｅｌ、「Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ
ｖｅｃｔｏｒｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｇｅｎｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｌｏｎｅｄ ｇｅｎｅｓ
ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ」、ＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ、第３巻（
Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７）を参照のこと）
。抗体を発現するベクター系においてマーカーが増幅できる場合、宿主細胞の培
養液に存在するインヒビターのレベルの増加は、マーカー遺伝子のコピーの数を
増加する。この増幅された領域が抗体遺伝子と結合しているために、この抗体の
産生もまた、増加する（Ｃｒｏｕｓｅら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２
５７（１９８３））。

【０２２４】 その宿主細胞は、本発明の２つの発現ベクター（重鎖に由来するポリペプチド
をコードする第１のベクターおよび軽鎖に由来するポリペプチドをコードする第
２のベクター）で同時トランスフェクトされ得る。この２つのベクターは、重鎖
および軽鎖のポリペプチドの等しい発現を可能とする同一の選択マーカーを含み
得る。あるいは、重鎖および軽鎖のポリペプチドの両方をコードする単一のベク
ターが使用され得る。このような状況において、この軽鎖は、過剰の有毒な遊離
重鎖を避けるために、重鎖の前に配置されるべきである（Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ、
Ｎａｔｕｒｅ ３２２：５２（１９８６）；Ｋｏｈｌｅｒ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：２１９７（１９８０））。重鎖および軽鎖
のコード配列は、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを含み得る。

【０２２５】 一旦、本発明の抗体分子が、組換え発現されると、この抗体分子は、免疫グロ
ブリン分子の精製に関する当該分野で公知の任意の方法によって（例えば、クロ
マトグラフィー（例えば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティー（特
に、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａの後の特異的抗原へのアフィニティーによる）クロマト
グラフィー、およびサイジング（ｓｉｚｉｎｇ）カラムクロマトグラフィー）、
遠心分離、差示的溶解度によって、またはタンパク質の精製に関する他の任意の
標準的な技術によって）精製され得る。さらに、本発明の抗体またはそのフラグ
メントは、精製を容易にするために、本明細書に記載されるか、またはそうでな
ければ当該分野で公知の異種ポリペプチド配列と融合され得る。

【０２２６】 （抗体結合体） 本発明は、融合タンパク質を生成するために、本発明のポリペプチド（または
それらの一部、好ましくは、そのポリペプチドの少なくとも１０、２０、または
５０個のアミノ酸）に組換え的に融合されたか、あるいは化学的に結合（共有結
合および非共有結合の両方を含む）された抗体を含む。この融合は、必ずしも直
接的である必要はないが、リンカー配列を通して起こり得る。この抗体は、本発
明のポリペプチド（またはそれらの一部、好ましくは、そのポリペプチドの少な
くとも１０、２０、または５０個のアミノ酸）以外の抗原に特異的であり得る。
例えば、本発明のポリペプチドを、特定の細胞表面レセプターに特異的な抗体に
融合させるかまたは結合させることによって、抗体は、インビトロまたはインビ
ボのいずれかで本発明のポリペプチドを特定の細胞型に標的化するために使用さ
れ得る。本発明のポリペプチドに融合されたかまたは結合された抗体はまた、当
該分野で公知の方法を使用してインビトロイムノアッセイおよび精製方法にて使
用され得る。例えば、Ｈａｒｂｏｒら、前出およびＰＣＴ公開ＷＯ ９３／２１
２３２；ＥＰ ４３９，０９５；Ｎａｒａｍｕｒａら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔ
ｔ．３９：９１−９９（１９９４）；米国特許第５，４７４，９８１号；Ｇｉｌ
ｌｉｅｓら、ＰＮＡＳ ８９：１４２８−１４３２（１９９２）；Ｆｅｌｌら、
Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６：２４４６−２４５２（１９９１）（これらは、そ
れらの全体において参考として援用される）を参照のこと。

【０２２７】 本発明はさらに、可変領域以外の抗体のドメインに融合されたかまたは結合さ
れた本発明のポリペプチドを含む組成物を包含する。例えば、本発明のポリペプ
チドは、抗体のＦｃ領域、あるいはその一部に融合または結合され得る。本発明
のポリペプチドに融合された抗体部分は、定常領域、ヒンジ領域、ＣＨ１ドメイ
ン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメイン、あるいはそれらのドメイン全体ま
たは部分の任意の組合せを含み得る。このポリペプチドはまた、上記の抗体部分
に融合または結合され、多量体を形成し得る。例えば、本発明のポリペプチドに
融合されたＦｃ部分は、Ｆｃ部分間のジスルフィド結合を介して二量体を形成し
得る。より高次な多量体形態は、このポリペプチドをＩｇＡおよびＩｇＭの部分
に融合することにより作製され得る。本発明のポリペプチドを抗体部分に融合ま
たは結合するための方法は、当該分野において公知である。例えば、米国特許第
５，３３６，６０３号；同第５，６２２，９２９号；同第５，３５９，０４６号
；同第５，３４９，０５３号；同第５，４４７，８５１号；同第５，１１２，９
４６号；ＥＰ ３０７，４３４；ＥＰ ３６７，１６６；ＰＣＴ公開ＷＯ ９６
／０４３８８；ＷＯ ９１／０６５７０；Ａｓｈｋｅｎａｚｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１０５３５−１０５３９（１９９１
）；Ｚｈｅｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：５５９０−５６００（１９９
５）；およびＶｉｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９
：１１３３７−１１３４１（１９９２）（上記の参考文献は、それらの全体が参
考として援用される）を参照のこと。

【０２２８】 上記で議論されたように、本発明のポリペプチドは、上記の抗体部分に融合ま
たは結合されて、このポリペプチドのインビボの半減期を増加するか、または当
該分野で公知の方法を使用するイムノアッセイにおいて使用され得る。さらに、
本発明のポリペプチドは、精製を容易にするために、上記の抗体部分に融合また
は結合され得る。１つの報告された実施例は、ヒトＣＤ４ポリペプチドの第１の
２つのドメインおよび哺乳動物免疫グロブリンの重鎖もしくは軽鎖の定常領域の
種々のドメインからなるキメラタンパク質を記載する。（ＥＰ ３９４，８２７
；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３３１：８４−８６（１９８８））
。ジスルフィド連結した二量体構造（ＩｇＧに起因する）を有する抗体に融合ま
たは結合された本発明のポリペプチドはまた、単量体分泌タンパク質またはタン
パク質フラグメント単独よりも、他の分子との結合および中和においてより効率
的であり得る。（Ｆｏｕｎｔｏｕｌａｋｉｓら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０：
３９５８−３９６４（１９９５））。多くの場合において、融合タンパク質のＦ
ｃ部分は、治療および診断において有利であり、従って、例えば、改良された薬
物動態学的な特性を生じ得る。（ＥＰ Ａ ２３２，２６２）。あるいは、融合
タンパク質が発現、検出、および精製された後のＦｃ部分の欠損は、好ましい。
例えば、この融合タンパク質が免疫化のための抗原として使用される場合、この
Ｆｃ部分は、治療および診断を妨げ得る。薬物の発見において、例えば、ヒトタ
ンパク質（例えばｈＩＬ−５）は、ｈＩＬ−５のアンタゴニストを同定するため
の高スループットスクリーニングアッセイの目的のために、Ｆｃ部分と融合され
た。（Ｄ．Ｂｅｎｎｅｔｔら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏ
ｎ ８：５２−５８（１９９５）；Ｊｏｈａｎｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．２７０：９４５９−９４７１（１９９５）を参照のこと。） さらに、本発明の抗体またはそれらのフラグメントは、精製を容易にするペプ
チドのような、マーカー配列と融合され得る。好ましい実施形態において、この
マーカーアミノ酸配列は、とりわけ、ｐＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ、Ｉｎｃ．
，９２５９ Ｅｔｏｎ Ａｖｅｎｕｅ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ，９１３１
１）において提供されるタグのようなヘキサ−ヒスチジンペプチドであり、それ
らの多くは市販されている。例えば、Ｇｅｎｔｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８２１−８２４（１９８９）に記載されるように
、ヘキサ−ヒスチジンは、融合タンパク質の簡便な精製を提供する。精製に有用
な他のペプチドタグには、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質由来のエピト
ープに対応する「ＨＡ」タグ（Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ ３７：７６７（１９
８４））および「ｆｌａｇ」タグが挙げられるが、これらに限定されない。

【０２２９】 本発明はさらに、診断剤または治療剤に結合される抗体またはそのフラグメン
トを含む。この抗体は、例えば、臨床試験の手順の一部（例えば、所定の治療レ
ジメンの有効性を決定するための）として、腫瘍の発生または進行をモニターす
るために診断的に使用され得る。検出は、抗体を検出可能な物質にカップリング
することによって容易にされ得る。検出可能な物質の例には、種々の酵素、補欠
分子群、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射性物質、種々の陽子射出断層
撮影法を使用する陽電子放射金属、および非放射性常磁性金属イオンが挙げられ
る。本発明に従う診断剤として使用するための抗体に結合され得る金属イオンに
ついては、例えば、米国特許第４，７４１，９００号を参照のこと。適切な酵素
の例には、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラク
トシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられ；適切な補欠分子群
複合体の例には、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙
げられ；適切な蛍光物質の例には、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオ
レセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオ
レセイン、ダンシルクロライドまたはフィコエリトリンが挙げられ；発光物質の
例には、ルミノールが挙げられ；生物発光物質の例には、ルシフェラーゼ、ルシ
フェリン、およびエクオリンが挙げられ；そして適切な放射性物質の例には、^{12 5} Ｉ、¹³¹Ｉ、¹¹¹Ｉｎまたは⁹⁹Ｔｃが挙げられる。

【０２３０】 さらに、抗体またはそのフラグメントは、治療用部分（例えば細胞毒（例えば
細胞増殖抑制性もしくは細胞殺傷性の薬剤））、治療剤または放射性金属イオン
に結合され得る。細胞毒または細胞毒性薬剤は、細胞に対して有害な任意の薬剤
を含む。例としては、パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｏｌ）、サイトカラシ
ンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシ
ド、テニポシド（ｔｅｎｏｐｏｓｉｄｅ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、
コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオ
ン（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ ａｎｔｈｒａｃｉｎ ｄｉｏｎｅ）、ミトキサントロ
ン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ，１−デヒドロテストステロン、グル
ココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、
およびピューロマイシン、ならびにそのアナログまたはホモログ、が挙げられる
。治療剤は、代謝拮抗物質（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン
、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン）、アル
キル化剤（例えば、メクロレタミン、チオテパ（ｔｈｉｏｅｐａ）クロラムブシ
ル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、
シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｔｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、ブスルファン、ジ
ブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、ならびにｃｉｓ
−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリ
ン（例えば、ダウノルビシン（以前はダウノマイシン）およびドキソルビシン）
、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ブレオマ
イシン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン（ａｎｔｈｒａｍｙｃｉｎ）
（ＡＭＣ））、ならびに有糸分裂阻害剤（例えばビンクリスチンおよびビンブラ
スチン）、を含むが、それらに限定されない。

【０２３１】 本発明の結合体は、所与の生物学的応答を改変するために使用され得、治療剤
または薬物部分は、慣用の化学的治療剤に限定されると解釈されない。例えば、
薬物部分は、所望の生物学的活性を有するタンパク質またはポリぺプチドであり
得る。このようなタンパク質としては、例えば、毒素（例えばアブリン、リシン
Ａ、シュードモナス外毒素、またはジフテリアトキシン）；タンパク質（例えば
、腫瘍壊死因子、α−インターフェロン、β−インターフェロン、神経発育因子
、血小板由来増殖因子、組織プラスミノゲン活性化因子、血栓症薬もしくは抗脈
管形成薬（例えば、アンジオスタチンもしくはエンドスタチン）；または生物学
的応答改変剤（例えばリンホカイン、インターロイキン−１（「ＩＬ−１」）、
インターロイキン−２（「ＩＬ−２」）、インターロイキン−６（「ＩＬ−６」
）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）、顆粒球コロ
ニー刺激因子（「Ｇ−ＣＳＦ」）、または他の増殖因子）、が挙げられ得る。

【０２３２】 抗体はまた、固体支持体に付着させられ得、この固体支持体は、標的抗原の免
疫アッセイまたは精製に特に有用である。このような固体支持体としては、ガラ
ス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニ
ルまたはポリプロピレン、が挙げられるがそれらに限定されない。

【０２３３】 このような治療部分を抗体に結合する技術は、周知である、例えば、Ａｒｎｏ
ｎら、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏ
ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｏｆ Ｄｒｕｇｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ
」、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔ
ｈｅｒａｐｙ、Ｒｅｉｓｆｅｌｄら（編）、ｐｐ．２４３−５６（Ａｌａｎ Ｒ
．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９８５）；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら、「Ａｎｔｉｂｏｄｉ
ｅｓ Ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕ
ｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（第二版）、Ｒｏｂｉｎｓｏｎら（編）、ｐｐ．６２３−
５３（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．１９８７）；Ｔｈｏｒｐｅ、「Ａ
ｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｒｒｉｅｒｓ Ｏｆ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ａｇｅｎｔｓ
Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ Ｒｅｖｉｅｗ」、Ｍｏｎｏｃｌｏ
ｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ’８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎｄ Ｃｌ
ｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｐｉｎｃｈｅｒａら（編）、ｐｐ．
４７５−５０６（１９８５）；「Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，Ａｎｄ
Ｆｕｔｕｒｅ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉ
ｃ Ｕｓｅ Ｏｆ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｎ Ｃａ
ｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ」、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ
Ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｂａｌ
ｄｗｉｎら（編）、ｐｐ．３０３−１６（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９
８５）、およびＴｈｏｒｐｅら、「Ｔｈｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ａｎｄ
Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ Ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｔｏｘ
ｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ」、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．６２：１１９−５８
（１９８２）を参照のこと。

【０２３４】 あるいは、抗体は、Ｓｅｇａｌにより米国特許第４，６７６，９８０号（その
全体が参考として本明細書中で援用される）に記載されるように、第二の抗体に
結合され、抗体ヘテロ結合体を形成し得る。

【０２３５】 単独または細胞毒因子および／もしくはサイトカインと組合せて投与される抗
体（その抗体に結合する治療部分を有するまたは有さない）は、治療剤として使
用され得る。

【０２３６】 （抗体結合アッセイ） 本発明の抗体は、免疫特異的結合について、当該分野で公知の任意の方法によ
ってアッセイされ得る。使用され得る免疫アッセイは、競合的および非競合的ア
ッセイ系を含むがこれに限定されない。このアッセイ系は以下のような技術を使
用する、少し例を挙げると、ウェスタンブロット、放射性免疫アッセイ、ＥＬＩ
ＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、「サンドイッチ」免疫アッセイ、免疫沈降
アッセイ、沈降素反応、ゲル拡散沈降素反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ
、補体結合アッセイ、免疫放射分析アッセイ、蛍光免疫アッセイ、プロテインＡ
免疫アッセイ。このようなアッセイは、当該分野で、慣習的および周知である（
例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第１巻、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏ
ｎｓ Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９４）を参照のこと。これはその全体
が本明細書中で参考として援用される）。典型的な免疫アッセイは、以下に簡単
に記載される（しかし限定として意図されない）。

【０２３７】 免疫沈降プロトコルは一般に、タンパク質ホスファターゼおよび／またはプロ
テアーゼインヒビター（例えば、ＥＤＴＡ、ＰＭＳＦ、アプロチニン、バナジン
酸ナトリウム）を補充したＲＩＰＡ緩衝液（１％ ＮＰ−４０またはＴｒｉｔｏ
ｎ Ｘ−１００、１％ デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ ＳＤＳ、０．
１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２での０．０１Ｍ リン酸ナトリウム、１％ Ｔｒ
ａｓｙｌｏｌ）のような溶解緩衝液中で細胞の集団を溶解する工程、目的の抗体
を細胞溶解物に添加する工程、一定時間（例えば、１〜４時間）４℃でインキュ
ベートする工程、プロテインＡおよび／またはプロテインＧセファロースビーズ
を細胞溶解物に添加する工程、約１時間以上４℃でインキュベートする工程、溶
解緩衝液中でビーズを洗浄する工程、ならびにＳＤＳ／サンプル緩衝液中でビー
ズを再懸濁する工程を含む。目的の抗体の、特定の抗原を免疫沈降する能力は、
例えば、ウエスタンブロット分析により、評価され得る。当業者は、抗体の抗原
への結合を増加させるように、そしてバックグラウンドを減少させるように改変
され得るパラメータ（例えば、セファロースビーズを用いて細胞溶解物を事前に
清澄化する工程）に関して、精通し得る。免疫沈降プロトコルに関するさらなる
考察については、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃ
ｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１巻、Ｊｏｈｎ Ｗｉ
ｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９４），１０．１６
．１を参照のこと。

【０２３８】 ウエスタンブロット分析は、一般に、タンパク質サンプルを調製する工程、ポ
リアクリルアミドゲル（例えば、抗原の分子量に応じた８％〜２０％ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ）中でタンパク質サンプルを電気泳動する工程、タンパク質サンプルをそ
のポリアクリルアミドゲルからニトロセルロース、ＰＶＤＦまたはナイロンのよ
うな膜に移す工程、ブロッキング溶液（例えば、３％ ＢＳＡまたは脱脂粉乳を
有するＰＢＳ）中でその膜をブロックする工程、その膜を洗浄緩衝液（例えば、
ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ ２０）中で洗浄する工程、ブロッキング緩衝液中で希釈さ
れた一次抗体（目的の抗体）を用いてその膜をブロックする工程、その膜を洗浄
緩衝液中で洗浄する工程、ブロッキング緩衝液中で希釈された酵素基質（例えば
、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）あるいは放射性
分子（例えば、３２Ｐまたは１２５Ｉ）に結合した二次抗体（一次抗体を認識す
る、例えば、抗ヒト抗体）を用いてその膜をブロックする工程、洗浄緩衝液中で
その膜を洗浄する工程、ならびにその抗原の存在を検出する工程を含む。当業者
は、検出されるシグナルを増加させるように、そしてバックグラウンドノイズを
減少させるように改変され得るパラメータに関して、精通し得る。ウエスタンブ
ロットプロトコルに関するさらなる考察については、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら
編，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏ
ｌｏｇｙ，第１巻、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ（１９９４），１０．８．１を参照のこと。

【０２３９】 ＥＬＩＳＡは、抗原を調製する工程、９６ウェルマイクロタイタープレートの
ウェルをその抗原でコーティングする工程、酵素基質（例えば、西洋ワサビペル
オキシダーゼまたはアルカリホスフォターゼ）のような検出可能な化合物に結合
した目的の抗体をそのウェルに添加し、そして一定時間インキュベートする工程
、および抗原の存在を検出する工程を含む。ＥＬＩＳＡにおいて、目的の抗体は
、検出可能な化合物に結合している必要はない；その代わり、検出可能な化合物
に結合した二次抗体（目的の抗体を認識する）がウェルに添加され得る。さらに
、ウェルを抗原でコーティングする代わりに、抗体がウェルにコーティングされ
得る。この場合、検出可能な化合物に結合した二次抗体が、コーティングされた
ウェルへの目的の抗原の添加に続いて、添加され得る。当業者は、検出されるシ
グナルを増加させるように改変され得るパラメータ、および当該分野において公
知のＥＬＩＳＡの他のバリエーションに関して、精通し得る。ＥＬＩＳＡに関す
るさらなる考察については、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐ
ｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１巻、Ｊｏ
ｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９４），
１１．２．１を参照のこと。

【０２４０】 抗体の抗原に対する結合親和性および抗体−抗原相互作用のオフレート（ｏｆ
ｆ−ｒａｔｅ）が、競合結合アッセイにより決定され得る。競合結合アッセイの
一つの例は、放射免疫アッセイであり、放射免疫アッセイは、標識した抗原（例
えば、３Ｈまたは１２５Ｉ）と、漸増量の非標識抗原の存在下での目的の抗体と
のインキュベーション、および標識した抗原に結合した抗体の検出を含む。目的
の抗体の、特定の抗原に対する親和性、および結合オフレートは、スキャッチャ
ードプロット分析によるデータから決定され得る。二次抗体との競合はまた、放
射免疫アッセイを用いて決定され得る。この場合、抗原は、漸増量の非標識二次
抗体の存在下で、標識した化合物（例えば、３Ｈまたは１２５Ｉ）に結合した目
的の抗体とともにインキュベートされる。

【０２４１】 （エンドカインα関連障害の診断） エンドカインαは、ＴＮＦファミリーのサイトカインの新規なメンバーである
。エンドカインα関連障害については、「標準」のエンドカインα遺伝子発現レ
ベル（すなわち、この障害を有さない個体からの組織または体液中のエンドカイ
ンα発現レベル）と比較して実質的に変化した（上昇したかまたは低下した）レ
ベルのエンドカインα遺伝子発現が、このような障害を有する個体から採取した
、組織または他の細胞または体液（例えば、血清、血漿、尿、滑液または髄液）
において検出され得ると考えられる。従って、本発明は、エンドカインα関連障
害の診断の間に有用な診断方法を提供し、この方法は、個体由来の組織または他
の細胞または体液中のエンドカインαタンパク質をコードする遺伝子の発現レベ
ルを測定する工程、ならびに測定された遺伝子発現レベルを標準のエンドカイン
α遺伝子の発現レベルと比較し、これにより、標準と比較して上昇または低下し
た遺伝子発現レベルは、エンドカインα関連障害を表す、工程を包含する。

【０２４２】 個体によって、哺乳動物個体、好ましくはヒトが意図される。「エンドカイン
αタンパク質をコードする遺伝子の発現レベルを測定する工程」によって、第１
の生物学的サンプル中のエンドカインαタンパク質のレベルまたはエンドカイン
αタンパク質をコードするｍＲＮＡのレベルを、直接的（例えば、絶対的なタン
パク質レベルまたはｍＲＮＡレベルを決定または見積もることによる）または相
対的（例えば、第２の生物学的サンプル中のエンドカインαタンパク質レベルま
たはｍＲＮＡレベルに対して比較することによる）のいずれかで、定性的または
定量的に測定することまたは見積もることが意図される。好ましくは、第１の生
物学的サンプル中のエンドカインαのタンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルが
測定または見積もられ、そして標準のエンドカインαのタンパク質レベルまたは
ｍＲＮＡレベルに対して比較され、この標準は、この障害を有さない個体から入
手した第２の生物学的サンプルから採取されるか、またはエンドカインαを含む
障害を有さない個体集団からのレベルを平均化することによって決定される。当
該分野で認識されるように、一旦標準的なエンドカインαのタンパク質レベルま
たはｍＲＮＡレベルが公知になれば、これは、比較のための標準として繰り返し
使用され得る。

【０２４３】 「生物学的サンプル」により、エンドカインαのタンパク質またはｍＲＮＡを
含有する個体、体液、細胞株、組織培養物または他の供給源から得られた任意の
生物学的サンプルを意図する。示したように、生物学的サンプルとしては、分泌
型の成熟エンドカインαタンパク質を含む体液（例えば、血清、血漿、尿、滑液
および髄液）、またはエンドカインαを発現することが見出された組織供給源が
挙げられる。哺乳動物から組織生検および体液を得るための方法は、当該分野で
周知である。生物学的サンプルがｍＲＮＡを含む場合、組織生検は好ましい供給
源である。

【０２４４】 本発明は、当該分野で公知であるかまたは本明細書中で提示されるようなＴＮ
Ｆ様障害と同様に、哺乳動物、好ましくはヒトにおける種々のエンドカインα関
連障害の診断に有用である。これらとしては、免疫調節に関連する障害、ならび
に炎症、細胞増殖、新脈管形成、腫瘍転移、アポトーシス、敗血症および内毒素
症が挙げられる。

【０２４５】 総細胞ＲＮＡは、生物学的サンプルから、任意の適切な技術（例えば、Ｃｈｏ
ｍｃｚｙｎｓｋｉおよびＳａｃｃｈｉ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６２：１
５６−１５９（１９８７）に記載される一工程グアニジニウム−チオシアネート
−フェノール−クロロホルム法）を用いて単離され得る。次いで、エンドカイン
αポリペプチドをコードするｍＲＮＡのレベルは、任意の適切な方法を用いてア
ッセイされる。これらとしては、ノーザンブロット分析、Ｓ１ヌクレアーゼマッ
ピング、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ポリメラーゼ連鎖反応と組み合わせ
た逆転写（ＲＴ−ＰＣＲ）およびリガーゼ連鎖反応と組み合わせた逆転写（ＲＴ
−ＬＣＲ）が挙げられる。

【０２４６】 ノーザンブロット分析は、Ｈａｒａｄａら，Ｃｅｌｌ ６３：３０３−３１２
（１９９０）に記載されるように行われ得る。手短には、総ＲＮＡは、上記のよ
うに生物学的サンプルから調製される。ノーザンブロットについては、ＲＮＡは
、適切な緩衝液（例えば、グリオキサール／ジメチルスルホキシド／リン酸ナト
リウム緩衝液）中で変性され、アガロースゲル電気泳動に供され、そしてニトロ
セルロースフィルターに転写される。ＵＶリンカーによってＲＮＡがフィルター
に連結された後、このフィルターを、ホルムアミド、ＳＳＣ、デンハルト溶液、
変性サケ精子、ＳＤＳ、およびリン酸ナトリウム緩衝液を含む溶液中でプレハイ
ブリダイズする。任意の適切な方法（例えば、³²ＰマルチプライムＤＮＡ標識シ
ステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））に従って標識したエンドカインαタンパク質ｃＤ
ＮＡをプローブとして用いる。一晩のハイブリダイゼーション後、このフィルタ
ーを洗浄し、そしてＸ線フィルムに曝露する。本発明に従ってプローブとして使
用するためのｃＤＮＡは、上記の節に記載され、そして好ましくは少なくとも１
５ｂｐ長である。

【０２４７】 Ｓ１マッピングは、Ｆｕｊｉｔａら，Ｃｅｌｌ ４９：３５７−３６７（１９
８７）に記載されるように行われ得る。Ｓ１マッピングにおいて使用するための
プローブＤＮＡを調製するために、上記のｃＤＮＡのセンス鎖をテンプレートと
して用いて、標識されたアンチセンスＤＮＡを合成する。次いで、アンチセンス
ＤＮＡを、適切な制限エンドヌクレアーゼを用いて消化して、所望の長さのさら
なるＤＮＡプローブを作製し得る。このようなアンチセンスプローブは、標的ｍ
ＲＮＡ（すなわち、エンドカインαタンパク質をコードするｍＲＮＡ）に相当す
る保護されたバンドを可視化するために有用である。ノーザンブロット分析は、
上記のように行われ得る。

【０２４８】 好ましくは、エンドカインαタンパク質をコードするｍＲＮＡのレベルは、Ｍ
ａｋｉｎｏら，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ２：２９５−３０１（１９９０）に記載さ
れるＲＴ−ＰＣＲ法を用いてアッセイされる。この方法によって、ポリアクリル
アミドゲルバンド中の「アンプリコン」の放射能は、標的ｍＲＮＡの初期濃度に
線形に関連付けされる。手短には、この方法は、生物学的サンプルから単離され
た総ＲＮＡを、ＲＴプライマーおよび適切な緩衝液を含む反応混合物に添加する
工程を包含する。プライマーアニーリングのためのインキュベーションの後、こ
の混合物に、ＲＴ緩衝液、ｄＮＴＰ、ＤＴＴ、ＲＮａｓｅインヒビターおよび逆
転写酵素が補充され得る。インキュベーションしてＲＮＡの逆転写を達成した後
、次いで、このＲＴ産物は、標識されたプライマーを用いるＰＣＲに供される。
あるいは、プライマーを標識するよりも、標識されたｄＮＴＰを、ＰＣＲ反応混
合物中に含め得る。ＰＣＲ増幅は、従来の技術に従ってＤＮＡサーマルサイクラ
ーにおいて行われ得る。増幅を達成するに適切な回数の後、ＰＣＲ反応混合物を
、ポリアクリルアミドゲルで電気泳動する。このゲルを乾燥した後、適切なバン
ド（エンドカインαタンパク質をコードするｍＲＮＡに相当する）の放射能を、
画像化分析器を用いて定量する。ＲＴおよびＰＣＲ反応の成分および条件、試薬
ならびにゲル濃度、ならびに標識方法は、当該分野で周知である。ＲＴ−ＰＣＲ
法についてのバリエーションは、当業者に明らかである。

【０２４９】 逆転写された標的ｍＲＮＡを増幅する任意のセットのオリゴヌクレオチドプラ
イマーは、上記の節において記載されるように用いられ得、そして設計され得る
。

【０２５０】 生物学的サンプル中でエンドカインαタンパク質のレベルをアッセイすること
は、当該分野で公知の任意の方法を用いて行われ得る。生物学的サンプル中のエ
ンドカインαタンパク質のレベルをアッセイするために好ましいのは、抗体ベー
スの技術である。例えば、組織中のエンドカインαタンパク質の発現は、古典的
な免疫組織学的方法を用いて研究され得る。これらにおいては、特異的認識が、
一次抗体（ポリクローナルまたはモノクローナル）によって提供されるが、二次
検出システムは、蛍光、酵素または他の結合体化二次抗体を利用し得る。結果と
して、病理学的検査のための組織切片の免疫学的染色が得られる。組織はまた、
ウェスタンブロットまたはドット／スロットアッセイのためのエドカインαタン
パク質の遊離のために、尿素または中性の界面活性剤を用いて抽出され得る（Ｊ
ａｌｋａｎｅｎ，Ｍ．ら，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０１：９７６−９８５（
１９８５）；Ｊａｌｋａｎｅｎ，Ｍ．ら，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０５：３
０８７−３０９６（１９８７））。カチオン性固相の使用に基づくこの技術では
、エンドカインαタンパク質の定量は、単離されたエンドカインαタンパク質を
標準として用いて達成され得る。この技術はまた、体液にも適用され得る。これ
らのサンプルを用いて、モル濃度のエンドカインαタンパク質は、血清、血漿、
尿、滑液、髄液などのような異なる体液についてエンドカインαタンパク質含量
の標準の値を設定するのを補助する。次いで、エンドカインαタンパク質の正常
な出現量は、健常な個体からの値を用いて設定され得、これは、試験被験体から
得られた値と比較され得る。

【０２５１】 エンドカインαタンパク質レベルを検出するために有用な他の抗体ベースの方
法としては、免疫アッセイ（例えば、酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）
および放射免疫アッセイ（ＲＩＡ））が挙げられる。例えば、エンドカインαタ
ンパク質特異的モノクローナル抗体は、免疫吸着剤および酵素標識プローブの両
方として用いられて、エンドカインαタンパク質を検出および定量し得る。サン
プル中に存在するエンドカインαタンパク質の量は、線形回帰コンピューターア
ルゴリズムを用いて標準調製物中に存在する量を参照して算出され得る。腫瘍抗
原を検出するためのこのようなＥＬＩＳＡは、Ｌａｃｏｂｅｌｌｉら，Ｂｒｅａ
ｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ １１：
１９−３０（１９８８）に記載される。別のＥＬＩＳＡアッセイでは、２つの別
個の特異的モノクローナル抗体を用いて、体液中のエンドカインαタンパク質を
検出し得る。このアッセイでは、抗体のうちの一方が免疫吸着剤として用いられ
、そして他方が酵素標識プローブとして用いられる。

【０２５２】 上記の技術は、「一工程」アッセイまたは「二工程」アッセイとして本質的に
行われ得る。「一工程」アッセイは、エンドカインαタンパク質を、固定化抗体
と接触させる工程、および洗浄を伴わずに、この混合物を標識抗体と接触させる
工程を含む。「二工程」アッセイは、混合物を標識抗体と接触させる前に洗浄す
る工程を含む。他の従来の方法もまた適切に用いられ得る。アッセイ系の１つの
成分を支持体上に固定化し、それにより、この系の他の成分が、この成分と接触
して、このサンプルから容易に除去されるのを可能にすることが通常所望される
。

【０２５３】 適切な酵素標識としては、例えば、基質との反応による過酸化水素の産生を触
媒するオキシダーゼ群由来の標識が挙げられる。グルコースオキシダーゼは、良
好な安定性を有することおよびその基質（グルコース）が容易に利用可能である
ことから、特に好ましい。オキシダーゼ標識の活性は、酵素標識抗体／基質反応
により形成される過酸化水素の濃度を測定することによりアッセイされ得る。酵
素の他に、他の適切な標識としては、放射性同位体（例えば、ヨウ素（¹²⁵Ｉ、^{1 21} Ｉ）、炭素（¹⁴Ｃ）、硫黄（³⁵Ｓ）、トリチウム（³Ｈ）、インジウム（¹¹²Ｉ
ｎ）およびテクネチウム（^99mＴｃ））；ならびに蛍光標識（例えば、フルオレ
セインおよびローダミン）、ならびにビオチンが挙げられる。

【０２５４】 個体から得られた生物学的サンプル中のエンドカインαタンパク質のレベルを
アッセイすることに加えて、エンドカインαタンパク質はまた、インビボで画像
化によって検出され得る。エンドカインαタンパク質のインビボ画像化のための
抗体標識またはマーカーとしては、Ｘ線撮影法、ＮＭＲまたはＥＳＲによって検
出可能なものが挙げられる。Ｘ線撮影法に関しては、適切な標識としては、検出
可能な放射線を放射するが、被験体に対して明らかには有害ではない、放射性同
位体（例えば、バリウムまたはセシウム）が挙げられる。ＮＭＲおよびＥＳＲに
ついて適切なマーカーとしては、検出可能な特有のスピンを有するマーカー（例
えば、重水素）が挙げられる。このマーカーは、適切なハイブリドーマについて
の栄養素を標識することによって抗体中に取り込まれ得る。

【０２５５】 適切な検出可能な画像化部分（例えば、放射性同位体（例えば、¹³¹Ｉ、¹¹¹Ｉ
ｎ、^99mＴｃ）、放射線不透物質または核磁気共鳴によって検出可能な物質）を
用いて標識された、エンドカインαタンパク質特異的抗体または抗体部分は、障
害について検査される哺乳動物に（例えば、非経口的に、皮下的にまたは腹腔内
に）導入される。当該分野において、被験体の大きさおよび用いられる画像化系
が、診断画像を生ずるために必要な画像化部分の量を決定することが理解される
。放射性同位体部分の場合、ヒト被験体について、注射される放射能の量は通常
、約５ミリキュリー〜２０ミリキュリーの範囲の^99mＴｃである。次いで、標識
された抗体または抗体部分は、エンドカインαタンパク質を含む細胞の位置に優
先的に蓄積する。インビボ腫瘍画像化は、Ｓ．Ｗ．Ｂｕｒｃｈｉｅｌら，「Ｉｍ
ｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ
Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｐｏｒｔｉｏｎｓ」（Ｔｕｍｏ
ｒ Ｉｍａｇｉｎｇ：Ｔｈｅ Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｄｅｔｅｃｔｉｏ
ｎ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ，Ｂｕｒｃｈｉｅｌ，Ｓ．Ｗ．およびＲｈｏｄｅｓ，Ｂ
．Ａ．編，Ｍａｓｓｏｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｉｎｃ．（１９８２）の第１
３章）に記載される。

【０２５６】 本発明において使用するためのエンドカインαタンパク質特異的抗体は、イン
タクトなエンドカインαタンパク質またはその抗原性ポリペプチド部分（これら
は、アルブミンのようなキャリアタンパク質を、動物の系（例えば、ウサギまた
はマウス）に対して一緒に提示し得るか、または充分に長い（少なくとも約２５
アミノ酸）場合、キャリアなしで提示し得る）に対して惹起され得る。

【０２５７】 本明細書中で使用する場合、用語「抗体」（Ａｂ）または「モノクローナル抗
体」（Ｍａｂ）は、インタクトな分子ならびにエンドカインαタンパク質に特異
的に結合し得る抗体部分（例えば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）₂部分）を含むこ
とを意味する。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）₂部分は、インタクトな抗体のＦｃ部
分を欠き、循環からより迅速にクリアランスされ、そしてインタクトな抗体のあ
まり非特異的でない組織結合を有し得る（Ｗａｈｌら，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．
２４：３１６−３２５（１９８３））。従って、これらの部分が好ましい。

【０２５８】 本発明の抗体は、任意の種々の方法によって調製され得る。例えば、エンドカ
インαタンパク質またはその抗原性部分を発現する細胞は、ポリクローナル抗体
を含有する血清の産生を誘導するために動物に投与され得る。好ましい方法では
、エンドカインαタンパク質の調製物が、上記のように調製され、そして精製さ
れて、この調製物が天然の夾雑物を実質的に含まないようにされる。次いで、こ
のような調製物は、より大きな比活性のポリクローナル抗血清を産生するために
動物に導入される。

【０２５９】 最も好ましい方法では、本発明の抗体は、モノクローナル抗体（またはそのエ
ンドカインαタンパク質結合部分）である。このようなモノクローナル抗体は、
ハイブリドーマ技術を用いて調製され得る（例えば、Ｃｏｌｌｉｇａｎ，Ｃｕｒ
ｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ Ｉ
ｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９０−１９９６）；Ｈａｒｌ
ｏｗおよびＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａ
ｎｕａｌ，第６章〜第９章，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓ
ｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８８）；Ａｕｓｕ
ｂｅｌ，下記、第１１章を参照のこと、これらの参考文献は、本明細書中で参考
として完全に援用される）。

【０２６０】 一般に、このような手順は、動物（好ましくは、マウス）を、エンドカインα
ポリペプチド抗原またはエンドカインαポリペプチド発現細胞で免疫する工程を
含む。適切な細胞は、抗エンドカインαタンパク質抗体に結合する能力によって
認識され得る。このような細胞は、任意の適切な組織培養培地（例えば、１０％
ウシ胎仔血清（約５６℃で非働化）を補充し、約１０μｇ／ｌの非必須アミノ酸
、約１，０００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび約１００μｇ／ｍｌのストレプトマ
イシンを補充したＥａｒｌｅ改変Ｅａｇｌｅ培地）中で培養され得る。このよう
なマウスの脾細胞は抽出され、そして適切な骨髄腫細胞株と融合される。任意の
適切な骨髄腫細胞株（例えば、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴ
ＣＣ）（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＵＳＡ）から入手可能な親骨髄腫細胞株（Ｓ
Ｐ₂Ｏ））は、本発明に従って用いられ得る。融合後、得られるハイブリドーマ
細胞は、ＨＡＴ培地中で選択的に維持され、次いでＷａｎｄｓら，Ｇａｓｔｒｏ
ｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ８０：２２５−２３２（１９８１）；Ｈａｒｌｏｗおよ
びＬａｎｅ，下記の第７章に記載されるような限界希釈によってクローニングさ
れる。次いで、このような選択を通じて得られたハイブリドーマ細胞をアッセイ
して、エンドカインα抗原に結合し得る抗体を分泌するクローンが同定される。

【０２６１】 あるいは、このエンドカインα抗原に結合し得るさらなる抗体を、抗イディオ
タイプ抗体を使用して２段階工程の手順において生成し得る。このような方法は
、抗体それ自体が抗原であり、それゆえ第二の抗体に結合する抗体を得ることが
可能であるという事実を利用する。この方法に従って、エンドカインαタンパク
質特異的抗体を使用して、動物（好ましくは、マウス）を免疫する。次いで、こ
のような動物の脾細胞を使用して、ハイブリドーマ細胞を産生する。そして、こ
のハイブリドーマ細胞は、このエンドカインαタンパク質特異的抗体に結合する
能力がこのエンドカインαタンパク質抗原によってブロックされ得る抗体を産生
するクローンを同定するためにスクリーニングされる。このような抗体は、この
エンドカインαタンパク質特異的抗体に対する抗イディオタイプ抗体を含み、そ
してこのような抗体は、動物を免疫してさらなるエンドカインαタンパク質特異
的抗体の形成を誘導するために使用され得る。

【０２６２】 本発明の抗体のＦａｂおよびＦ（ａｂ’）₂ならびに他の部分が、本明細書中
に開示される方法によって使用され得ることが、理解される。このような部分は
、代表的には、パパイン（Ｆａｂ部分を生成するため）またはペプシン（Ｆ（ａ
ｂ）₂部分を生成するため）のような酵素を使用して、タンパク質分解性切断に
よって生成される。あるいは、エンドカインαタンパク質結合部分が、組換えＤ
ＮＡ技術の適用を介してかまたは合成化学を介して、生成され得る。

【０２６３】 ヒトにおける診断のためにエンドカインαタンパク質のレベルの増大を検出す
るためにインビボ画像化が使用される場合、「ヒト化」キメラ抗体を使用するこ
とが好ましくあり得る。このような抗体は、上記のモノクローナル抗体を産生す
るハイブリドーマ細胞に由来する遺伝子構築物を使用することによって産生され
得る。キメラ抗体を産生するための方法は当該分野で公知である。総説について
は、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２（１９８５）；Ｏｉ
ら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４（１９８６）；Ｃａｂｉｌｌｙら
、米国特許第４，８１６，５６７号；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら、ＥＰ １７１４９
６；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、ＥＰ １７３４９４；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、ＷＯ
８６０１５３３；Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、ＷＯ ８７０２６７１；Ｂｏｕｌｉａｎ
ｎｅら、Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６４３（１９８４）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、
Ｎａｔｕｒｅ ３１４：２６８（１９８５）を参照のこと。

【０２６４】 本発明のエンドカインαタンパク質特異的抗体のためのさらに適切な標識が、
以下に提供される。適切な酵素標識の例としては、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、
スタフィロコッカスヌクレアーゼ、Δ−５−ステロイドイソメラーゼ、酵母アル
コールデヒドロゲナーゼ、α−グリセロールリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオー
スリン酸イソメラーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラ
ギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ
、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコ
アミラーゼ、およびアセチルコリンエステラーゼが、挙げられる。

【０２６５】 適切な放射性同位体標識の例としては、³Ｈ、¹¹¹Ｉｎ、¹²⁵Ｉ、¹³¹Ｉ、³²Ｐ、 ³⁵ Ｓ、¹⁴Ｃ、⁵¹Ｃｒ、⁵⁷Ｔｏ、⁵⁸Ｃｏ、⁵⁹Ｆｅ、⁷⁵Ｓｅ、¹⁵²Ｅｕ、⁹⁰Ｙ、⁶⁷Ｃ
ｕ、²¹⁷Ｃｉ、²¹¹Ａｔ、²¹²Ｐｂ、⁴⁷Ｓｃ、¹⁰⁹Ｐｄなどが、挙げられる。¹¹¹Ｉ
ｎおよび^99mＴｃが、インビボ画像化が使用される場合に好ましい同位体である
。なぜなら、これらは、肝臓による¹²⁵Ｉまたは¹³¹Ｉで標識されたモノクローナ
ル抗体の脱ハロゲン化という問題を回避するからである。さらに、これらの放射
性核種は、画像化のためにより好ましいγ放射エネルギーを有する（Ｐｅｒｋｉ
ｎｓら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．１０：２９６〜３０１（１９８５）；
Ｃａｒａｓｑｕｉｌｌｏら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２８：２８１〜２８７（１
９８７））。例えば、１−（ｐ−イソチオシアナートベンジル）−ＤＰＴＡを有
するモノクローナル抗体に結合した¹¹¹Ｉｎは、非腫瘍組織（特に、肝臓）にて
ほとんど取り込みを示さず、従って、腫瘍位置決定の特異性を増大する（Ｅｓｔ
ｅｂａｎら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２８：８６１〜８７０（１９８７））。

【０２６６】 適切な非放射性同位体標識の例としては、¹⁵⁷Ｇｄ、⁵⁵Ｍｎ、¹⁶²Ｄｙ、⁵²Ｔｒ
、および⁵⁶Ｆｅが、挙げられる。

【０２６７】 適切な蛍光標識の例としては、¹⁵²Ｅｕ標識、フルオレセイン標識、イソチオ
シアナート標識、ローダミン標識、フィコエリトリン標識、フィコシアニン標識
、アロフィコシアニン標識、ｏ−フタルアルデヒド（ｐｈｔｈａｌｄｅｙｄｅ）
標識およびフルオレサミン標識が、挙げられる。

【０２６８】 適切な毒素標識としては、ジフテリア毒素、リシン、およびコレラ毒素が、挙
げられる。

【０２６９】 化学発光標識の例としては、ルミナール（ｌｕｍｉｎａｌ）標識、イソルミナ
ール標識、芳香族アクリジニウムエステル標識、イミダゾール標識、アクリジニ
ウム塩標識、シュウ酸エステル標識、ルシフェリン標識、ルシフェラーゼ標識、
およびエクオリン標識が、挙げられる。

【０２７０】 核磁気共鳴造影剤の例としては、重金属核種（例えば、Ｇｄ、Ｍｎ、およびＦ
ｅ）が、挙げられる。

【０２７１】 抗体に上記の標識を結合するための代表的技術は、Ｋｅｎｎｅｄｙら（Ｃｌｉ
ｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ ７０：１〜３１（１９７６））およびＳｃｈｕｒｓら
（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ ８１：１〜４０（１９７７））に提供される
。後者にて言及される結合技術は、グルタルアルデヒド法、過ヨウ素酸塩法、ジ
マレイミド法、ｍ−マレイミドベンジル−Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミドエス
テル法であり、これらの方法全ては、本明細書中に参考として援用される。

【０２７２】 本発明はさらに、本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体およびＴ細胞
抗原レセプター（ＴＣＲ）に関する。本発明の抗体としては、ＩｇＧ（ＩｇＧ１
、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含む）、ＩｇＡ（ＩｇＡ１およびＩｇ
Ａ２を含む）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、およびＩＧＹが、挙げられる。本明細
書中で使用される場合、用語「抗体」（Ａｂ）とは、単鎖抗体全体を含む抗体全
体、およびその抗原結合フラグメントを含むことが、意味される。最も好ましく
は、この抗体は、本発明のヒト抗原結合抗体フラグメントであり、Ｆａｂ、Ｆａ
ｂ’およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、ジスルフ
ィド結合したＦｖ（ｓｄＦｖ）、およびＶＬドメインまたはＶＨドメインのいず
れかを含むフラグメントを含むが、これらに限定されない。この抗体は、鳥類お
よび哺乳動物を含む、任意の動物起源に由来し得る。好ましくは、この抗体は、
ヒト、マウス、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、またはニワトリ由来
である。

【０２７３】 単鎖抗体を含む抗原結合抗体フラグメントは、可変領域を、単独でかあるいは
以下：ヒンジ領域、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインの全
体または部分と組み合わせて、含み得る。ヒンジ領域、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２
ドメインおよびＣＨ３ドメインと可変領域の任意の組み合わせもまた、本発明に
含まれる。本発明はさらに、本発明のポリペプチドに特異的に結合する、キメラ
、ヒト化、およびヒトの、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を含む
。本発明はさらに、本発明の抗体に対する抗イディオタイプ抗体を含む。

【０２７４】 本発明の抗体は、単一特異的、二重特異的、三重特異的またはより多価の多重
特異的であり得る。多重特異的な抗体は、本発明のポリペプチドの異なるエピト
ープに対して特異的であり得るか、または本発明のポリペプチドおよび異種組成
物（例えば、異種ポリペプチドまたは固体支持体物質）の両方に特異的であり得
る。例えば、ＷＯ ９３／１７７１５；ＷＯ９２／０８８０２；ＷＯ ９１／０
０３６０；ＷＯ ９２／０５７９３；Ｔｕｔｔ，Ａ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．
１４７：６０−６９（１９９１）；米国特許第５，５７３，９２０号；同第４，
４７４，８９３号；同第５，６０１，８１９号；同第４，７１４，６８１号；同
第４，９２５，６４８号；Ｋｏｓｔｅｌｎｙ，Ｓ．Ａ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ
．１４８：１５４７−１５５３（１９９２）を参照のこと。本発明の抗体は、そ
の抗体により認識されるかまたは特異的に結合される本発明のポリペプチドのエ
ピトープまたは部分に関して、記載され得るかまたは特定され得る。このエピト
ープ部分またはポリペプチド部分は、本明細書中に記載されるように、例えば、
Ｎ末端およびＣ末端の位置により、連続するアミノ酸残基のサイズにより、特定
され得るか、あるいは表および図面に列挙され得る。本発明の任意のエピトープ
またはポリペプチドに特異的に結合する抗体はまた、排除され得る。従って、本
発明は、本発明のポリペプチドに特異的に結合し、そしてこのポリペプチドの排
除を可能にする、抗体を含む。

【０２７５】 本発明の抗体はまた、その交差反応性に関して、記載され得るか、または特定
され得る。本発明のポリペプチドの任意の他のアナログ、オルソログ（ｏｒｔｈ
ｏｌｏｇ）またはホモログに結合しない抗体が、含まれる。本発明のポリペプチ
ドと９５％未満、９０％未満、８５％未満、８０％未満、７５％未満、７０％未
満、６５％未満、６０％未満、５５％未満および５０％未満の同一性（当該分野
で公知の方法および本明細書において記載された方法を用いて計算される場合）
を有するポリペプチドに結合する抗体もまた、本発明に含まれる。本発明にさら
に含まれるのは、ストリンジェントな条件（本明細書中に記載されるような）下
で本発明のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコー
ドされるポリペプチドにのみ結合する抗体である。本発明の抗体はまた、その結
合親和性に関しても、記載され得るかまたは特定され得る。好ましい結合親和性
としては、５×１０^-6Ｍ、５×１０^-7Ｍ、１０^-7Ｍ、５×１０^-8Ｍ、１０^-8Ｍ、
５×１０^-9Ｍ、１０^-9Ｍ、５×１０^-10Ｍ、１０^-10Ｍ、５×１０^-11Ｍ、１０^-11 Ｍ、５×１０^-12Ｍ、１０^-12Ｍ、５×１０^-13Ｍ、１０^-13Ｍ、５×１０^-14Ｍ、
１０^-14Ｍ、５×１０^-15Ｍ、および１０^-15Ｍ未満の解離定数すなわちＫ_dを有す
る結合親和性が挙げられる。

【０２７６】 本発明の抗体は、インビトロおよびインビボでの診断方法および治療方法の両
方を含む、本発明のポリペプチドを精製、検出および標的化するのための当該分
野で公知の方法を含むがこれに限定されない、用途を有する。例えば、この抗体
は、生物学的サンプルにおいて本発明のポリペプチドのレベルを定性的および定
量的に測定するためのイムノアッセイにおいて用途を有する。例えば、Ｈａｒｌ
ｏｗら，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，
第２版，１９８８）（その全体が参考として本明細書中に援用される）を参照の
こと。

【０２７７】 本発明の抗体は、単独でかまたは他の組成物と組み合わせてのいずれかで、用
いられ得る。この抗体は、さらに、Ｎ末端もしくはＣ末端で異種ポリペプチドに
組換え的に融合され得るか、またはポリペプチドもしくは他の組成物に化学的に
結合（共有結合および非共有結合を含む）され得る。例えば、本発明の抗体は、
検出アッセイにおける標識として有用な分子およびエフェクター分子（例えば、
異種ポリペプチド、薬物、または毒素）に、組換え的により融合または結合され
得る。例えば、ＷＯ９２／０８４９５；ＷＯ９１／１４４３８；ＷＯ８９／１２
６２４；米国特許第５，３１４，９９５号；およびＥＰ ０ ３９６ ３８７を
参照のこと。

【０２７８】 本発明の抗体は、当該分野で公知の任意の適切な方法によって産生され得る。
例えば、本発明のポリペプチドまたはその抗原性フラグメントが、ポリクローナ
ル抗体を含む血清の産生を誘導するために、動物に投与され得る。モノクローナ
ル抗体は、ハイブリドーマ技術および組換え技術の使用を含む、当該分野で公知
の種々の技術を使用して調製され得る。例えば、Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏ
ｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，第２版、１９８８）；
Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎ
ｄ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ、５６３−６８１頁（Ｅｌｓｅｖｉｅ
ｒ，Ｎ．Ｙ．１９８１）（上記の参考文献は、その全体が参考として援用される
）を参照のこと。

【０２７９】 ＦａｂフラグメントおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントは、（Ｆａｂフラグメ
ントを生成するために）パパインまたは（Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを産生す
るために）ペプシンのような酵素を使用して、タンパク質分解切断によって産生
され得る。

【０２８０】 あるいは、本発明の抗体は、当該分野で公知の方法を使用する組換えＤＮＡ技
術の適用を介してかまたは合成化学を介して、産生され得る。例えば、本発明の
抗体は、当該分野で公知の種々のファージディスプレイ方法を用いて産生され得
る。ファージディスプレイ法において、機能的抗体ドメインは、それらをコード
するポリヌクレオチド配列を保有するファージ粒子の表面に提示される。所望の
結合特性を有するファージは、抗原（代表的には、固体表面またはビーズに結合
または捕捉された、抗原）を用いて直接的に選択することによって、レパートリ
ー抗体ライブラリーまたはコンビナトリアル抗体ライブラリー（例えば、ヒトま
たはマウス）から選択される。これらの方法において用いられるファージは、代
表的には、ファージ遺伝子ＩＩＩタンパク質またはファージ遺伝子ＶＩＩＩタン
パク質のいずれかに組換えにより融合されたＦａｂ、Ｆｖまたはジスルフィド安
定化されたＦｖの抗体ドメインを有する、ｆｄおよびＭ１３を含む糸状ファージ
（ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｐｈａｇｅ）である。本発明の抗体を作製するため
に用いられ得るファージディスプレイ方法の例としては、以下に開示される方法
が挙げられる：Ｂｒｉｎｋｍａｎ，Ｕ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ １８２：４１−５０（１９９５）；Ａｍｅｓ，Ｒ．Ｓ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８４：１７７−１８６（１９９５）；Ｋｅｔｔｌｅｂ
ｏｒｏｕｇｈ，Ｃ．Ａ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：９５２−９５
８（１９９４）；Ｐｅｒｓｉｃ，Ｌ．ら、Ｇｅｎｅ １８７ ９−１８（１９９
７）；Ｂｕｒｔｏｎ，Ｄ．Ｒ．ら、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏ
ｇｙ ５７：１９１−２８０（１９９４）；ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４；Ｗ
Ｏ ９０／０２８０９；ＷＯ ９１／１０７３７；ＷＯ ９２／０１０４７；Ｗ
Ｏ ９２／１８６１９；ＷＯ ９３／１１２３６；ＷＯ ９５／１５９８２；Ｗ
Ｏ ９５／２０４０１；ならびに米国特許第５，６９８，４２６号；同第５，２
２３，４０９号；同第５，４０３，４８４号；同第５，５８０，７１７号；同第
５，４２７，９０８号；同第５，７５０，７５３号；同第５，８２１，０４７号
；同第５，５７１，６９８号；同第５，４２７，９０８号；同第５，５１６，６
３７号；同第５，７８０，２２５号；同第５，６５８，７２７号；および同第５
，７３３，７４３号（これらの各々は、本明細書中でその全体が参考として援用
される）。

【０２８１】 上記参考文献に記載されるように、ファージ選択後、ファージ由来の抗体をコ
ードする領域は、ヒト抗体を含む抗体の全体または任意の他の所望の抗原結合フ
ラグメントを生成するために単離されかつ用いられ得、そして哺乳動物細胞、昆
虫細胞、植物細胞、酵母および細菌を含む任意の所望の宿主において発現され得
る。例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２フラグメントを組換えによ
り産生するための技術はまた、当該分野で公知の方法を用いて使用され得、この
ような方法は、以下に開示される：ＷＯ ９２／２２３２４；Ｍｕｌｌｉｎａｘ
，Ｒ．Ｌ．ら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １２（６）：８６４−８６９（１
９９２）；およびＳａｗａｉ，Ｈ．ら、ＡＪＲＩ ３４：２６−３４（１９９５
）；およびＢｅｔｔｅｒ，Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０４１−１０４
３（１９９８）（これらの参考文献は、その全体が参考として援用される）。

【０２８２】 単鎖のＦｖｓおよび抗体を産生するために用いられ得る技術の例としては、米
国特許第４，９４６，７７８号および同第５，２５８，４９８号；Ｈｕｓｔｏｎ
ら（１９９１）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２０３：４６
−８８；Ｓｈｕ，Ｌ．ら、ＰＮＡＳ ９０：７９９５−７９９９（１９９３）；
およびＳｋｅｒｒａ，Ａ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０３８−１０４０（
１９８８）に記載される技術が挙げられる。ヒトにおける抗体のインビボにおけ
る使用およびインビトロ検出アッセイを含むいくつかの用途のために、キメラ抗
体、ヒト化抗体またはヒト抗体の使用が好ましくあり得る。キメラ抗体を産生す
るための方法は、当該分野において公知である。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２（１９８５）；Ｏｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑ
ｕｅｓ ４：２１４（１９８６）；Ｇｉｌｌｉｅｓ，Ｓ．Ｄ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １２５：１９１−２０２（１９８９）；米国特許第５
，８０７，７１５号を参照のこと。抗体は、以下を含む種々の技術を用いてヒト
化され得る：ＣＤＲ−移植（ＥＰ ０ ２３９ ４００；ＷＯ ９１／０９９６
７；米国特許第５，５３０，１０１号および同第５，５８５，０８９号）、ベニ
ヤリング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）または再表面化（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）（
ＥＰ ０ ５９２，１０６；ＥＰ ０ ５１９，５９６；Ｐａｄｌａｎ，Ｅ．Ａ
．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２８（４／５）：４８９−４
９８（１９９１）；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ，Ｇ．Ｍ．ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ
ｉｎｅｅｒｉｎｇ ７（６）：８０５−８１４（１９９４）；Ｒｏｇｕｓｋａ，
Ｍ．Ａ．ら、ＰＮＡＳ ９１：９６９−９７３（１９９４））、および鎖シャッ
フリング（米国特許第５，５６５，３３２号）。ヒト抗体は、上記のファージデ
ィスプレイ法を含む、当該分野で公知の種々の方法により作製され得る。また、
米国特許第４，４４４，８８７号、同第４，７１６，１１１号、同第５，５４５
，８０６号；および同第５，８１４，３１８号；ならびにＷＯ ９８／４６６４
５（これらの各々はその全体が参考として本明細書中に援用される）もまた参照
のこと。

【０２８３】 さらに本発明に含まれるのは、本発明のポリペプチドに、組換えにより融合さ
れるかまたは化学的に結合（共有結合または非共有結合の両方を含む）される。
この抗体は、本発明のポリペプチド以外の抗原に特異的であり得る。例えば、抗
体は、インビトロまたはインビボのいずれかで、特定の細胞型に本発明のポリペ
プチドを標的化するために、本発明のポリペプチドを特定の細胞表面レセプター
に融合または結合することによって、使用され得る。本発明のポリペプチドに融
合または結合された抗体はまた、当該分野で公知の方法を使用して、インビトロ
イムノアッセイおよび精製方法において使用され得る。例えば、Ｈａｒｂｏｒら
（前出）およびＷＯ ９３／２１２３２；ＥＰ ０ ４３９ ０９５；Ｎａｒａ
ｍｕｒａ，Ｍ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．３９：９１〜９９（１９９４）
；米国特許第５，４７４，９８１号；Ｇｉｌｌｉｅｓ，Ｓ．Ｏ．ら、ＰＮＡＳ
８９：１４２８〜１４３２（１９９２）；Ｆｅｌｌ．Ｈ．Ｐ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ．１４６：２４４６〜２４５２（１９９１）（上記の参考文献は、その全
体が参考として援用される）を参照のこと。

【０２８４】 本発明はさらに、可変領域以外の抗体ドメインに融合したかまたは結合した、
本発明のポリペプチドを含む組成物を含む。例えば、本発明のポリペプチドは、
抗体のＦｃ領域またはその一部に、融合または結合され得る。本発明のポリペプ
チドに融合した抗体部分は、ヒンジ領域、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、お
よびＣＨ３ドメイン、またはそのドメイン全体もしくは一部の任意の組み合わせ
を含み得る。本発明のポリペプチドは、当該分野で公知の方法を使用して、その
ポリペプチドのインビボでの半減期を増加するため、またはイムノアッセイにお
ける使用のために、上記の抗体部分に融合または結合され得る。このポリペプチ
ドはまた、マルチマーを形成するように、上記の抗体部分に融合または結合され
得る。例えば、本発明のポリペプチドに融合したＦｃ部分は、そのＦｃ部分間の
ジスルフィド結合を介して、ダイマーを形成し得る。より大きなマルチマーが、
ＩｇＡおよびＩｇＭの一部にこのポリペプチドを融合することによって生成され
得る。本発明のポリペプチドを抗体部分に融合または結合するための方法は、当
該分野で公知である。例えば、米国特許第５，３３６，６０３号、同第５，６２
２，９２９号、同第５，３５９，０４６号、同第５，３４９，０５３号、同第５
，４４７，８５１号、同第５，１１２，９４６号；ＥＰ ０ ３０７ ４３４、
ＥＰ ０ ３６７ １６６；ＷＯ ９６／０４３８８、ＷＯ ９１／０６５７０
；Ａｓｈｋｅｎａｚｉ，Ａ．ら、ＰＮＡＳ ８８：１０５３５〜１０５３９（１
９９１）；Ｚｈｅｎｇ，Ｘ．Ｘ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｍｏｌ．１５４：５５９０〜
５６００（１９９５）；ならびにＶｉｌ．Ｈ．ら、ＰＮＡＳ ８９：１１３３７
〜１１３４１（１９９２）（上記参考文献は、その全体が参考として援用される
）を参照のこと。

【０２８５】 本発明はさらに、本発明のポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストと
して作用する抗体に関する。例えば、本発明は、部分的にかまたは完全にかのい
ずれかで、本発明のポリペプチドとのレセプター／リガンドの相互作用を中断す
る抗体を含む。レセプター特異的抗体およびリガンド特異的抗体の両方が、含ま
れる。リガンドの結合を妨げないが、レセプターの活性化を妨げる、レセプター
特異的抗体が、含まれる。レセプターの活性化（すなわち、シグナル伝達）は、
本明細書中に記載されるかさもなければ当該分野で公知の技術によって、測定さ
れ得る。また、リガンド結合およびレセプターの活性化の両方を妨げる、レセプ
ター特異的抗体も含まれる。同様に、リガンドに結合しかつレセプターへのリガ
ンドの結合を妨げる中和抗体、ならびにリガンドに結合しそれによりレセプター
活性化を妨げるがリガンドがレセプターに結合するのは妨げない抗体が、含まれ
る。レセプターを活性化する抗体が、さらに含まれる。これらの抗体は、リガン
ド媒介レセプター活性化により影響を受ける、生物学的活性のすべてまたはすべ
てよりも少なくのいずれかについての、アゴニストとして作用し得る。この抗体
は、本明細書中に開示される特定の活性を含む生物学的活性についての、アゴニ
ストまたはアンタゴニストとして特定され得る。上記の抗体アゴニストは、当該
分野で公知の方法を使用して作製され得る。例えば、以下を参照のこと：ＷＯ
９６／４２０２８１；米国特許第５，８１１，０９７号；Ｄｅｎｇ，Ｂ．ら、Ｂ
ｌｏｏｄ ９２（６）：１９８１〜１９８８（１９９８）；Ｃｈｅｎ，Ｚ．ら、
Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５８（１６）：３６８８〜３６７８（１９９８）；Ｈａ
ｒｒｏｐ，Ｊ．Ａ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１（４）：１７８６〜１７９
４（１９９８）；Ｚｈｕ，Ｚ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５８（１５）：３２
０９〜３２１４（１９９８）；Ｙｏｏｎ，Ｄ．Ｙ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１
６０（７）：３１７０〜３１７９（１９９８）；Ｐｒａｔ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｃｅｌ
ｌ．Ｓｃｉ．１１１（第２部）：２３７〜２４７（１９９８）；Ｐｉｔａｒｄ，
Ｖ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０５（２）：１７７〜１９０
（１９９７）；Ｌｉａｕｔａｒｄ，Ｊ．ら、Ｃｙｔｏｋｉｎｄｅ ９（４）：２
３３〜２４１（１９９７）；Ｃａｒｌｓｏｎ，Ｎ．Ｇ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．２７２（１７）：１１２９５〜１１３０１（１９９７）；Ｔａｒｙｍａｎ
，Ｒ．Ｅ．ら、Ｎｅｕｒｏｎ １４（４）：７５５〜７６２（１９９５）；Ｍｕ
ｌｌｅｒ，Ｙ．Ａ．ら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ６（９）：１１５３〜１１６７（
１９９８）；Ｂａｒｔｕｎｅｋ，Ｐ．ら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ８（１）：１４〜
２０（１９９６）上記の参考文献は、その全体が参考として援用される）。

【０２８６】 （トランスジェニック動物） 本発明のポリペプチドはまた、トランスジェニック動物において発現され得る
。マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、モルモット、ブタ、ミニブタ（ｍｉｃ
ｒｏ−ｐｉｇ）、ヤギ、ヒツジ、ウシおよびヒト以外の霊長類（例えば、ヒヒ、
サルおよびチンパンジー）を含むがこれらに限定されない任意の種の動物は、ト
ランスジェニック動物を作製するために用いられ得る。特定の実施形態において
、本明細書に記載されるかまたはさもなければ当該分野で公知の技術が、遺伝子
治療プロトコルの一部として、ヒトにおける本発明のポリペプチドの発現のため
に用いられる。

【０２８７】 当該分野で公知の任意の技術を、導入遺伝子（すなわち、本発明のポリヌクレ
オチド）の動物への導入に用いて、トランスジェニック動物の創始系統（ｆｏｕ
ｎｄｅｒ ｌｉｎｅ）を生成し得る。このような技術は、前核マイクロインジェ
クション（Ｐａｔｅｒｓｏｎら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌ．４０：６９１−６９８（１９９４）；Ｃａｒｖｅｒら、Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）１１：１２６３−１２７０（１９９３）；Ｗｒｉｇｈｔ
ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）９：８３０−８３４（１９９１）；お
よびＨｏｐｐｅら、米国特許第４，８７３，１９１号（１９８９））；生殖細胞
系へのレトロウイルス媒介遺伝子移入（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｕｔｔｅｎら、Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：６１４８−６１５２（１９
８５））、胚盤胞または胚；胚性幹細胞における遺伝子標的化（Ｔｈｏｍｐｓｏ
ｎら、Ｃｅｌｌ ５６：３１３−３２１（１９８９））；細胞または胚のエレク
トロポレーション（Ｌｏ、１９８３、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：１８０
３−１８１４（１９８３））；遺伝子銃を用いた本発明のポリヌクレオチドの導
入（例えば、Ｕｌｍｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：１７４５（１９９３）を
参照のこと）；胚性多能性（ｐｌｅｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞への核酸構築物
の導入および胚盤胞へのこの幹細胞の移入；ならびに精子媒介遺伝子移入（Ｌａ
ｖｉｔｒａｎｏら、Ｃｅｌｌ ５７：７１７−７２３（１９８９））；などを含
むがこれらに限定されない。このような技術の総説については、本明細書中にそ
の全体が参考として援用される、Ｇｏｒｄｏｎ、「Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ａｎ
ｉｍａｌｓ」、Ｉｎｔｌ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ．１１５：１７１−２２９（１９
８９）を参照のこと。

【０２８８】 当該分野で公知の任意の技術を用いて、本発明のポリヌクレオチドを含むトラ
ンスジェニッククローンを生成し得る（例えば、培養された、静止状態に誘導さ
れた胚細胞、胎児細胞または成体の細胞に由来する核の、除核した卵母細胞への
核移入（Ｃａｍｐｅｌｌら、Ｎａｔｕｒｅ ３８０：６４−６６（１９９６）；
Ｗｉｌｍｕｔら、Ｎａｔｕｒｅ ３８５：８１０−８１３（１９９７））これら
の各々は、その全体が本明細書中に参考として援用される）。

【０２８９】 本発明は、その全ての細胞に導入遺伝子を有するトランスジェニック動物、な
らびにいくつかの細胞（しかしその全ての細胞ではない）に導入遺伝子を有する
動物（すなわち、モザイク動物またはキメラ動物）を提供する。導入遺伝子は、
１つの導入遺伝子としてまたはコンカテマー（例えば、頭−頭タンデム型または
頭−尾タンデム型）のような複数のコピーとして組み込まれ得る。この導入遺伝
子はまた、例えば、Ｌａｓｋｏらの教示（Ｌａｓｋｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：６２３２−６２３６（１９９２））に従って
特定の細胞型に選択的に導入され得、そして活性化され得る。このような細胞型
特異的活性化に必要とされる調節配列は、目的の特定の細胞型に依存し、そして
それらは当業者に明らかである。ポリヌクレオチド導入遺伝子が、内在性遺伝子
の染色体部位に組み込まれることが所望される場合、遺伝子の標的化が好ましい
。手短に言えば、このような技術が利用される場合、内在性遺伝子に対して相同
ないくつかのヌクレオチド配列を含むベクターが、染色体配列との相同な組換え
を介して内在性遺伝子のヌクレオチド配列に組み込まれ、そのヌクレオチド配列
の機能を破壊することを目的として設計される。導入遺伝子はまた、特定の細胞
型に選択的に導入され得、従って、例えば、Ｇｕら（Ｇｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ
２６５：１０３−１０６（１９９４））の教示に従って、導入された細胞型にお
いてのみ内在性遺伝子が不活化される。そのような細胞型特異的不活化に必要と
される調節配列は、目的の特定の細胞型に依存し、そしてそれらは当業者に明ら
かである。この節で記載された文書の各々の内容は、その全体が本明細書中に参
考として援用される。

【０２９０】 一旦トランスジェニック動物が作製されると、その組換え遺伝子の発現は、標
準的な技術を利用してアッセイされ得る。最初のスクリーニングは、サザンブロ
ット分析またはＰＣＲ技術によって達成されて、導入遺伝子の組み込みが起きた
ことを動物組織の分析により確認し得る。トランスジェニック動物の組織におけ
る導入遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルはまた、動物から得た組織サンプルのノーザ
ンブロット分析、インサイチュハイブリダイゼーション分析および逆転写酵素Ｐ
ＣＲ（ｒｔ−ＰＣＲ）を含むがこれらに限定されない技術を用いて評価され得る
。トランスジェニック遺伝子発現組織のサンプルはまた、導入遺伝子産物に特異
的な抗体を用いて免疫細胞化学的または免疫組織化学的に評価され得る。一旦、
創始動物が生成されると、それらは、交配され、同系交配され、異系交配される
かまたは交雑されて、特定の動物のコロニーを生成し得る。そのような交配戦略
の例は、以下を含むがそれらに限定されない：別の系統を樹立するための１つよ
り多くの組み込み部位を有する創始動物の異系交配；各導入遺伝子の相加的発現
効果によって、より高いレベルで導入遺伝子を発現する複合トランスジェニック
を生成するための別々の系統の同系交配；発現の増強およびＤＮＡ分析による動
物のスクリーニングの必要性の排除の両方のための、所定の組み込み部位に対し
てホモ接合性の動物を生成するヘテロ接合性トランスジェニック動物の交雑；複
合ヘテロ接合性またはホモ接合性系統を生成するための別々のホモ接合系統の交
雑；ならびに目的の実験モデルに適切な異なるバックグラウンド上に導入遺伝子
を配置するための交配。

【０２９１】 本発明のトランスジェニックおよび「ノックアウト」動物は、エンドカインα
ポリペプチドの生物学的機能の詳述、異常なエンドカインα発現に関連する状態
および／または障害の研究、ならびにこのような状態および／または障害の改善
に有効な化合物についてのスクリーニングに有用な動物モデル系を含むがこれら
に限定されない用途を有する。

【０２９２】 本発明のさらなる実施形態において、本発明のポリペプチドを発現するために
遺伝子操作される細胞、あるいは本発明のポリペプチドを発現しないように遺伝
子操作された細胞（例えば、ノックアウト）を、インビボで患者に投与する。こ
のような細胞は、患者（すなわち、ヒトを含む動物）またはＭＨＣ適合性ドナー
から入手され得、そして線維芽細胞、骨髄細胞、血球（例えば、リンパ球）、脂
肪細胞、筋細胞、内皮細胞などを含み得るが、それらに限定されない。この細胞
を、例えば、形質導入（ウイルスベクターおよび好ましくは細胞ゲノム中に導入
遺伝子を組み込むベクターを使用する）、またはトランスフェクション手順（プ
ラスミド、コスミド、ＹＡＣ、裸のＤＮＡ、エレクトロポレーション、リポソー
ムなどの使用を含むが、これらに限定されない）によって、細胞中に本発明のポ
リペプチドのコード配列を導入するために、あるいはこのコード配列および／ま
たは本発明のポリペプチドに結合している内因性の調節配列を破壊するために、
組換えＤＮＡ技術を使用してインビトロで遺伝子操作する。本発明のポリペプチ
ドのコード配列を強力な構成的プロモーターもしくは誘導性プロモーターまたは
プロモーター／エンハンサーの制御下に配置し、本発明のポリペプチドの発現お
よび好ましくは分泌を達成し得る。本発明のポリペプチドを発現および好ましく
は分泌する操作した細胞を、例えば、循環中において、または腹腔内で患者中へ
全身的に導入し得る。あるいは、この細胞をマトリックスに組み込み得、そして
身体に移植し得る（例えば、遺伝子操作した線維芽細胞を皮膚移植片の一部とし
て移植し得る）；遺伝子操作した内皮細胞をリンパ移植片または脈管移植片の一
部として移植し得る（例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎら、米国特許第５，３９９，３
４９号ならびにＭｕｌｌｉｇａｎおよびＷｉｌｓｏｎ、米国特許第５，４６０，
９５９号を参照のこと。これらの各々は、本明細書中でその全体が参考として援
用される）。米国特許第５，４６４，７６４号（Ｃａｐｅｃｃｈｉら、Ｐｏｓｉ
ｔｉｖｅ−Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ
Ｖｅｃｔｏｒｓ）；米国特許第５，６３１，１５３号（Ｃａｐｅｃｃｈｉら，Ｃ
ｅｌｌｓ ａｎｄ Ｎｏｎ−Ｈｕｍａｎ Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ Ｃｏｎｔａｉｎ
ｉｎｇ Ｐｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉ
ｏｎｓ ａｎｄ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ−Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ
Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｋｉｎｇ Ｓａｍｅ）
；米国特許第４，７３６，８６６号（Ｌｅｄｅｒら，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｎ
ｏｎ−Ｈｕｍａｎ Ａｎｉｍａｌｓ）；および米国特許第４，８７３，１９１号
（Ｗａｇｎｅｒら，Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｚ
ｙｇｏｔｅｓ）；もまた参照のこと（これらの各々は、その全体が本明細書中に
参考として援用される）。

【０２９３】 投与される細胞が非自己または非ＭＨＣ適合性細胞である場合、それらを、こ
の導入細胞に対する宿主免疫応答の発生を妨害する周知の技術を使用して投与し
得る。例えば、この細胞をカプセル性の形態で導入し得、この形態は、構成成分
と即時の細胞外環境との交換を可能にしつつ、導入細胞が宿主免疫系によって認
識されることを可能にしない。

【０２９４】 （アンタゴニスト） 特定の実施形態において、本発明に従うアンタゴニストは、配列番号１に含ま
れる配列またはその相補鎖に対応する核酸および／開示されるクローン９７６４
０に含まれるヌクレオチド配列に対応する核酸である。１つの実施形態において
、アンチセンス配列は、生物体により内部で生成され、別の実施形態において、
アンチセンス配列は別々に投与される（例えば、Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ，Ｎｅｕｒｏ
ｃｈｅｍ．５６：５６０（１９９１）を参照のこと）。Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎ
ｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏ
ｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔ
ｏｎ，ＦＬ（１９８８）。アンチセンス技術を使用して、アンチセンスＤＮＡも
しくはＲＮＡを通してか、または３重らせんの形成を通して遺伝子発現を制御し
得る。アンチセンス技術は、例えば、Ｏｋａｎｏ，Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５６：
５６０（１９９１）；Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ Ａ
ｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉ
ｏｎ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（１９８８）に考察さ
れる。３重らせん形成は、例えば、Ｌｅｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒ
ｅｓｅａｒｃｈ ６：３０７３（１９７９）；Ｃｏｏｎｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ
、２４１：４５６（１９８８）；およびＤｅｒｖａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５
１：１３００（１９９１）において考察される。これらの方法は、相補的なＤＮ
ＡまたはＲＮＡへのポリヌクレオチドの結合に基づく。

【０２９５】 例えば、本発明の成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの５’コー
ド部分を使用して、約１０〜４０塩基対長のアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオ
チドを設計し得る。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、転写に関与する遺伝子の領域
に相補的であるように設計され、それにより転写およびレセプターの産生を阻害
する。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドは、インビボでｍＲＮＡにハイブ
リダイズし、そしてｍＲＮＡ分子のレセプターポリペプチドへの翻訳をブロック
する。

【０２９６】 １つの実施形態において、本発明のエンドカインαアンチセンス核酸は、外来
の配列からの転写により細胞内で産生される。例えば、ベクターまたはその一部
が転写され、本発明のアンチセンス核酸（ＲＮＡ）を産生する。このようなベク
ターは、エンドカインαアンチセンス核酸をコードする配列を含む。このような
ベクターは、それが転写されて所望のアンチセンスＲＮＡを産生し得る限り、エ
ピソームを保持し得るか、または染色体に組込まれ得る。このようなベクターは
、当該分野において標準的な組換えＤＮＡ技術方法により構築され得る。ベクタ
ーは、脊椎動物細胞において複製および発現のために使用される、当該分野で公
知のプラスミド、ウイルスなどであり得る。エンドカインαをコードする配列ま
たはそのフラグメントの発現は、脊椎動物、好ましくはヒト細胞において作用す
る、当該分野で公知の任意のプロモーターにより得る。そのようなプロモーター
は、誘導性または構成性であり得る。このようなプロモーターは、ＳＶ４０初期
プロモーター領域（ＢｅｒｎｏｉｓｔおよびＣｈａｍｂｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ、２
９：３０４−３１０（１９８１））、ラウス肉腫ウイルスの３’長末端反復に含
まれるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｃｅｌｌ、２２：７８７−７９７（
１９８０））、ヘルペスチミジンプロモーター（Ｗａｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：１４４１−１４４５（１９８１
））、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ
、２９６：３９−４２（１９８２））などが挙げられるが、これらに限定されな
い。

【０２９７】 本発明のアンチセンス核酸は、少なくともエンドカインα遺伝子のＲＮＡ転写
物の一部に相補的な配列を含む。しかし、完全に相補的であることは好ましいが
、必要ではない。本明細書中で言及される「少なくともＲＮＡの一部に相補的な
」配列は、ＲＮＡとハイブリダイズし得るに十分な相補性を有し、安定な二重鎖
を形成する配列を意味し；従って、本発明の二本鎖エンドカインαアンチセンス
核酸の場合において、二重鎖ＤＮＡの一本鎖が試験され得るか、または三重鎖形
成がアッセイされ得る。ハイブリダイズする能力は、相補性の程度およびアンチ
センス核酸の長さの両方に依存する。一般的に、ハイブリダイズする核酸が長い
ほど、エンドカインα ＲＮＡ配列とのより多くの塩基ミスマッチを含み得、こ
れは、安定な二重鎖（または三重鎖の場合もあり得る）を含み得、そしてなお形
成し得る。当業者は、ハイブリダイズ複合体の融点を決定するために標準的な手
順を使用することによりミスマッチの許容の程度を確認し得る。

【０２９８】 メッセージの５’末端に相補的であるオリゴヌクレオチド（例えば、ＡＵＧ開
始コドンまででかつＡＵＧ開始コドンを含む５’非翻訳配列）は、翻訳の阻害の
際に最も効率的に働くべきである。しかし、ｍＲＮＡの３’非翻訳配列に相補的
な配列は、同様にｍＲＮＡの翻訳を阻害する際に有効であることが示された。一
般的に、Ｗａｇｎｅｒ，Ｒ．（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ ３７２：３３３−３３
５を参照のこと。従って、図１に示されるヌクレオチド配列の５’−または３’
−の非翻訳非コード領域のいずれかに相補的なオリゴヌクレオチドは、内因性エ
ンドカインα ｍＲＮＡの翻訳を阻害するアンチセンスアプローチに使用され得
る。ｍＲＮＡの５’非翻訳領域に相補的なオリゴヌクレオチドは、ＡＵＧ開始コ
ドンの相補物を含むべきである。ｍＲＮＡコード領域に相補的なアンチセンスオ
リゴヌクレオチドは、翻訳のあまり効率的でないインヒビターであるが、本発明
に従って使用され得る。エンドカインα ｍＲＮＡの５’領域、３’領域または
コード領域にハイブリダイズするように設計されるか否かにかかわらず、アンチ
センス核酸は、少なくとも６ヌクレオチド長であるべきであり、そして好ましく
は６〜約５０ヌクレオチド長にわたるオリゴヌクレオチドである。特定の局面に
おいて、このオリゴヌクレオチドは、少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも
１７ヌクレオチド、少なくとも２５ヌクレオチドまたは少なくとも５０ヌクレオ
チドである。

【０２９９】 本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、もしくはＲＮＡ、またはキメラ混合物
、あるいはそれらの誘導体もしくは改変バージョン、一本鎖、または二本鎖であ
り得る。このオリゴヌクレオチドは、塩基部分、糖部分、またはリン酸骨格で改
変されて、例えば、分子の安定性、ハイブリダーゼーションなどを改善し得る。
このオリゴヌクレオチドは、ペプチドのような他の付加基（例えば、インビボに
おいて宿主細胞レセプターを標的化するために）、または細胞膜を通した輸送を
促進する因子（例えば、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：６５５３−６５５６（１９８９）；Ｌｅｍａｉｔ
ｒｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４：６４８−６５２（１９
８７）；ＰＣＴ公開番号ＷＯ８８／０９８１０（１９８８年１２月１５日公開）
を参照のこと）、または血液脳関門（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ８９／１０１
３４（１９８８年４月２５日公開）を参照のこと）、ハイブリダイゼーション誘
引切断剤（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ−ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ ｃｌｅａｖａｇ
ｅ ａｇｅｎｔ）（例えば、Ｋｒｏｌら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、６：９
５８−９７６（１９８８）を参照のこと）、またはインターカレート剤（例えば
、Ｚｏｎ，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．５：５３９−５４９（１９８８）を参照のこと
）を含み得る。この目的のために、オリゴヌクレオチドは、別の分子（例えば、
ペプチド、ハイブリダーゼーション誘引架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーショ
ン誘引切断剤など）に結合体化され得る。

【０３００】 アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの改変された塩基部分を
含み得、この塩基部分は、以下を含むがそれらに限定されない群から選択される
：５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨー
ドウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カル
ボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２
−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシ
ル、α−Ｄ−ガラクトシルキューオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデ
ニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、
２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシ
トシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシ
ル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキュー
オシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２
−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ
）、ワイブトキソシン（ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、プソイドウラシル、キュ
ーオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシ
ル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチル
エステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、
３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）
ｗ、および２，６−ジアミノプリン。

【０３０１】 アンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、以下を含むがそれらに限定されない
群から選択される少なくとも１つの改変された糖部分を含み得る：アラビノース
、２−フルオロアラビノース、キシルロース、およびヘキソース。

【０３０２】 さらなる別の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、以下を
含むがそれらに限定されない群から選択される少なくとも１つの改変されたリン
酸骨格を含む：ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミドチ
オエート、ホスホロアミデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅ）、ホスホロ
ジアミデート、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステル、およびホル
ムアセタール（ｆｏｒｍａｃｅｔａｌ）またはそれらのアナログ。

【０３０３】 さらに別の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ａ−アノ
マーオリゴヌクレオチドである。α−アノマーオリゴヌクレオチドは、相補的な
ＲＮＡと特異的な二本鎖ハイブリッドを形成し、通常のβ−ユニットとは反対に
、その鎖は互いに平行にする（Ｇａｕｔｉｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．、１５：６６２５−６６４１（１９８７））。このオリゴヌクレオチドは、
２−０’−メチルリボヌクレオチドであるか（Ｉｎｏｕｅら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉ
ｄｓ Ｒｅｓ．、１５：６１３１−６１４８（１９８７））、またはキメラＲＮ
Ａ−ＤＮＡアナログである（Ｉｎｏｕｅら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２１５：３２
７−３３０（１９８７））。

【０３０４】 本発明のポリヌクレオチドは当該分野で公知の標準的な方法（例えば、自動Ｄ
ＮＡ合成機により（このような装置はＢｉｏｓｅａｒｃｈ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂ
ｉｏｓｙｓｔｅｍｓなどから市販されている）の使用により）合成され得る。例
えば、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、Ｓｔｅｉｎらの方法（Ｎｕｃ
ｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１６：３２０９（１９８８））により合成され得、
メチルホスホネートオリゴヌクレオチドは、コントロールドポアガラス（ｃｏｎ
ｔｒｏｌｌｅｄ ｐｏｒｅ ｇｌａｓｓ）ポリマー支持体（Ｓａｒｉｎら、Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８５：７４４８−７４５１
（１９８８））などの使用により調製され得る。

【０３０５】 一方、エンドカインαコード領域配列に相補的なアンチセンスヌクレオチドが
、使用され得、転写された非翻訳領域に相補的なアンチセンスヌクレオチドが最
も好ましい。

【０３０６】 本発明による潜在的なアンタゴニストはまた、触媒ＲＮＡ、すなわちリボザイ
ムを含む（例えば、ＰＣＴ国際公開ＷＯ９０／１１３６４、１９９０年１０月４
日公開；Ｓａｒｖｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４７：１２２２−１２２５（１９
９０）を参照のこと）。一方、部位特異的認識配列でｍＲＮＡを切断するリボザ
イムを使用して、エンドカインα ｍＲＮＡを破壊し得るが、ハンマーヘッド型
リボザイムの使用が好ましい。ハンマーヘッド型リボザイムは、標的ｍＲＮＡと
相補的な塩基対を形成する隣接領域により決定される位置で、ｍＲＮＡを切断す
る。たった１つの必要条件は、標的ｍＲＮＡが以下の２つの塩基配列を有するこ
とである：５’−ＵＧ−３’。ハンマーヘッド型リボザイムの構築および生成は
当該分野で周知であり、そしてＨａｓｅｌｏｆｆおよびＧｅｒｌａｃｈ、Ｎａｔ
ｕｒｅ、３３４：５８５−５９１（１９８８）により十分に記載される。エンド
カインαのヌクレオチド配列（図１）内に多くの潜在的なハンマーヘッド型リボ
ザイム切断部位が存在する。好ましくは、このリボザイムは、切断認識部位がエ
ンドカインα ｍＲＮＡの５’末端付近に位置するように；すなわち、効率を増
大し、そして非機能的ｍＲＮＡ転写物の細胞内蓄積を最小化するように、操作さ
れる。

【０３０７】 アンチセンスアプローチの場合、本発明のリボザイムは、改変されたオリゴヌ
クレオチド（例えば、安定性、標的化などについて改良された）から構成され得
、そしてインビボにおいてエンドカインαを発現する細胞に送達されるべきであ
る。リボザイムをコードするＤＮＡ構築物は、ＤＮＡをコードするアンチセンス
の導入のための上記と同じ様式において細胞中に導入され得る。送達の好ましい
方法は、強力な構成性プロモーター（例えば、ｐｏｌ ＩＩＩまたはｐｌ ＩＩ
プロモーターのような）の制御下で、リボザイムを「コードする」ＤＮＡ構築物
を使用することを含み、その結果トランスフェクトした細胞が内因性エンドカイ
ンαメッセージを破壊し、そして翻訳を阻害するに十分な量のリボザイムを生成
する。リボザイムはアンチセンス分子と異なり触媒性であるので、より低い細胞
内濃度が効率のために必要とされる。

【０３０８】 内因性遺伝子発現もまた、標的化された相同組換えを使用してエンドカインα
遺伝子および／またはそのプロモーターを不活性化あるいは「ノックアウトする
」ことによって減少し得る（例えば、Ｓｍｉｔｈｉｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ ３１
７：２３０−２３４（１９８５）；ＴｈｏｍａｓおよびＣａｐｅｃｃｈｉ、Ｃｅ
ｌｌ ５１：５０３−５１２（１９８７）；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｃｅｌｌ ５
：３１３−３２１（１９８９）を参照のこと；これらの各々は、本明細書中でそ
の全体が参考として援用される）。例えば、内因性ポリヌクレオチド配列（この
遺伝子のコード領域または調節領域のいずれか）と相同性のＤＮＡに隣接される
、本発明の変異体、非機能的なポリヌクレオチド（または完全に関連のないＤＮ
Ａ配列）を、選択マーカーおよび／またはネガティブ選択マーカーを用いてまた
は用いずに使用し、インビボで本発明のポリペプチドを発現する細胞をトランス
フェクトし得る。別の実施形態において、当該分野で公知の技術を、目的の遺伝
子を含むが、発現しない細胞中でノックアウトを作製するために使用する。標的
化された相同組換えを介した、このＤＮＡ構築物の挿入は、標的化された遺伝子
の不活性化を生じる。このようなアプローチは、胚性幹細胞に対する改変が不活
性な標的化された遺伝子を有する動物の子孫を作製するために使用され得る研究
および農業分野に特に適する（例えば、ＴｈｏｍａｓおよびＣａｐｅｃｃｈｉ
１９８７およびＴｈｏｍｐｓｏｎ １９８９、前出を参照のこと）。しかし、こ
のアプローチは、当業者に明白な適切なウイルスベクターを使用して、組換えＤ
ＮＡ構築物がインビボで要求された部位に直接投与されるか、または標的化され
る場合、ヒトにおける使用に慣用的に適合され得る。この節で記載された文書の
各々の内容は、その全体が本明細書中に参考として援用される。

【０３０９】 他の実施形態において、本発明によるアンタゴニストは、エンドカインαの可
溶形態（例えば、全長レセプターの細胞外領域由来のリガンド結合ドメインを含
む、図１に示すエンドカインαポリペプチドのフラグメント）を含む。このよう
なエンドカインαの可溶形態（これは、天然に存在するかまたは合成され得る）
は、ＴＮＦファミリーリガンドを結合するためのレセプターの細胞表面結合形態
と競合することによって、エンドカインαにより媒介されるシグナル伝達を拮抗
する。本発明のアンタゴニストはまた、ＴＮＦファミリーリガンドおよびエンド
カインα−Ｆｃ融合タンパク質に対して特異的である抗体を含む。

【０３１０】 「ＴＮＦファミリーリガンド」によって、ＴＮＦレセプターファミリーのメン
バーを結合し得、そしてリガンド／レセプターシグナル伝達経路を誘導および／
またはブロックし得る、天然に存在するリガンド、組換えリガンド、および合成
リガンドが意図される。ＴＮＦリガンドファミリーのメンバーとしては、ＴＮＦ
−α、リンホトキシン−ａ（ＬＴ−ａ、ＴＮＦ−ｂとしても公知）、ＬＴ−ｂ（
複合体異種三量体ＬＴ−ａ２−ｂにおいて見出される）、ＦａｓＬ、ＣＤ４０Ｌ
、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌおよび神経成長因子（Ｎ
ＧＦ）が挙げられるが、これらに限定されない。

【０３１１】 ＴＮＦ−αは、単純疱疹ウイルス１型（ＨＳＶ−１）による感染からマウスを
保護することが示されている。Ｒｏｓｓｏｌ−Ｖｏｔｈら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒ
ｏｌ．７２：１４３〜１４７（１９９１）。ＴＮＦ−αの保護効果の機構は未知
であるが、インターフェロンもＮＫ細胞殺傷も関与しないようである。ＴＮＦＲ
ファミリーの１つのメンバーは、ＨＳＶ−１が細胞に入ることを媒介することが
示されている。Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙら、Ｅｕｒ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｎｅｗｔ
．７：１５９（１９９６）。さらに、このＴＮＦＲの細胞外ドメインに対して特
異的である抗体は、ＨＳＶ−１が細胞に入ることをブロックする。従って、本発
明のエンドカインαアンタゴニストは、エンドカインαアミノ酸配列、およびＴ
ＮＦＲにより媒介されてウイルスが細胞に入ることを防止し得る抗体の両方を含
む。このような配列および抗体は、細胞表面に局在化するＴＮＦＲがウイルスに
結合することと競合すること、またはウイルスが細胞表面レセプターに結合する
ことを直接ブロックすることのいずれかによって、機能し得る。

【０３１２】 本発明による抗体は、本発明のエンドカインαレセプター免疫原を使用する、
種々の標準的な方法のいずれかによって、調製され得る。このようなエンドカイ
ンαレセプター免疫原は、図１（配列番号２）に示すエンドカインαレセプター
タンパク質（これは、リーダー配列を含んでもよいし、含まなくてもよい）、お
よびこのエンドカインαレセプターのリガンド結合ドメイン、細胞外ドメイン、
膜貫通ドメイン、細胞内ドメイン、またはこれらの任意の組合せを含む、レセプ
ターのポリペプチドフラグメントを含む。

【０３１３】 本発明によるポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体のアゴニストまた
はアンタゴニストは、本明細書中に開示される方法に従って、ならびに／または
、例えば、ＴａｒｔａｇｌｉａおよびＧｏｅｄｄｅｌ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ
．２６７（７）：４３０４−４３０７（１９９２）；Ｔａｒｔａｇｌｉａら、Ｃ
ｅｌｌ ７３：２１３−２１６（１９９３）、ならびにＰＣＴ出願第ＷＯ９４／
０９１３７（これら３つの文献の各々の内容は、その全体が本明細書中に参考と
して援用される）に記載される方法のように当該分野で公知の方法に従って、惹
起され得、そして好ましくは、配列番号２のアミノ酸配列を有する本発明のポリ
ぺプチドに対して特異的である。

【０３１４】 当業者が理解するように、本発明のエンドカインαポリペプチドおよび上記そ
のエピトープを保有するフラグメントは、異種ポリペプチド配列に結合され得る
。例えば、本発明のポリペプチドは、免疫グロブリン（ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＧ
、およびＩｇＭ）の定常ドメインまたはそれらの部分（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３
、ならびにそれらの任意の組み合わせ（それらのドメイン全体および部分の両方
を含む））と融合し得、これがキメラポリペプチドを生じる。これらの融合タン
パク質は、精製を容易にし、そして増加した半減期を示す。

【０３１５】 遺伝子シャッフリング、モチーフシャッフリング、エキソンシャッフリング、
および／またはコドンシャッフリング（総称して「ＤＮＡシャッフリング」とい
われる）の技術を使用して、エンドカインαの活性を調節し得、これによって、
エンドカインαのアゴニストおよびアンタゴニストを効果的に生成する。一般に
は、米国特許第５，６０５，７９３号、同第５，８１１，２３８号、同第５，８
３０，７２１号、同第５，８３４，２５２号および同第５，８３７，４５８号、
ならびにＰａｔｔｅｎ，Ｐ．Ａ．ら，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌ．８：７２４−３３（１９９７）；Ｈａｒａｙａｍａ，Ｓ．、Ｔｒｅｎ
ｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６（２）：７６−８２（１９９８）；Ｈａｎｓ
ｓｏｎ，Ｌ．Ｏ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８７：２６５−７６（１９９９
）；ならびにＬｏｒｅｎｚｏ，Ｍ．Ｍ．およびＢｌａｓｃｏ，Ｒ．、Ｂｉｏｔｅ
ｃｈｎｉｑｕｅｓ ２４（２）：３０８−１３（１９９８）（これらの特許およ
び刊行物の各々の全体が本明細書により参考として援用される）を参照のこと。
１つの実施形態において、エンドカインαポリヌクレオチド、および対応するポ
リペプチドの改変は、ＤＮＡシャッフリングにより達成され得る。ＤＮＡシャッ
フリングは、相同組換えまたは部位特異的組換えにより、２つ以上のＤＮＡセグ
メントを所望のエンドカインα分子に構築することを含む。別の実施形態におい
て、エンドカインαポリヌクレオチドおよび対応するポリペプチドは、組換え前
に誤りがちの（ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ）ＰＣＲ、ランダムヌクレオチド挿入ま
たは他の方法により、ランダムな変異誘発に供されることによって改変され得る
。別の実施形態において、エンドカインαの１つ以上の成分、モチーフ、区切り
（ｓｅｃｔｉｏｎ）、部分、ドメイン、フラグメントなどは、１つ以上の異種分
子の１つ以上の成分、モチーフ、区切り、部分、ドメイン、フラグメントなどと
組み換えられ得る。好ましい実施形態において、異種の分子は、例えば、ＴＮＦ
−α、リンホトキシン−α（ＬＴ−α、ＴＮＦ−βとしても公知）、ＬＴ−β（
ＬＴ−α２−β異種三量体の複合体中に見出される）、ＯＰＧＬ、ＦａｓＬ、Ｃ
Ｄ２７Ｌ、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＤｃＲ３、ＯＸ４０Ｌ、Ｔ
ＮＦ−γ（国際公開番号ＷＯ９６／１４３２８）、ＡＩＭ−Ｉ（国際公開番号Ｗ
Ｏ９７／３３８９９）、ＡＩＭ−ＩＩ（国際公開番号ＷＯ９７／３４９１１）、
ＡＰＲＩＬ（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８（６）：１１８５−１１９０）、ｅｎ
ｄｏｋｉｎｅ−α（国際公開番号ＷＯ９８／０７８８０および同ＷＯ９８／１８
９２１）、ＯＰＧ，ＯＸ４０、神経増殖因子（ＮＧＦ）、および可溶型のＦａｓ
、ＣＤ３０、ＣＤ２７、ＣＤ４０および４−ＩＢＢ、ＤＲ３（国際公開番号ＷＯ
９７／３３９０４）、ＤＲ４（国際公開番号ＷＯ９８／３２８５６）、ＴＲ５（
国際公開番号ＷＯ９８／３０６９３）、ＴＲ６（国際公開番号ＷＯ９８／３０６
９４）、ＴＲ７（国際公開番号ＷＯ９８／４１６２９）、ＴＲＡＮＫ、ＴＲ９（
国際公開番号ＷＯ９８／５６８９２）、ＴＲ１０（国際公開番号ＷＯ９８／５４
２０２）、３１２Ｃ２（国際公開番号ＷＯ９８／０６８４２）、ＴＲ１２、およ
びＴＮＦ−Ｒ１、ＴＲＡＭＰ／ＤＲ３／ＡＰＯ−３／ＷＳＬ／ＬＡＲＤ、ＴＲＡ
ＩＬ−Ｒ１／ＤＲ４／ＡＰＯ−２、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２／ＤＲ５、ＤｃＲｌ／ＴＲ
ＡＩＬ−Ｒ３／ＴＲＩＤ／ＬＩＴ、ＤｃＲ２／ＴＲＡＩＬ−Ｒ４、ＣＡＤ、ＴＲ
ＡＩＬ、ＴＲＡＭＰ、およびｖ−ＦＬＩＰである。

【０３１６】 さらに好ましい実施形態において、異種分子は、ＴＮＦファミリーの任意のメ
ンバーである。

【０３１７】 （染色体アッセイ） 本発明の核酸分子はまた、染色体同定に有用である。その配列は、個々のヒト
染色体上の特定の位置に特異的に標的化され、そしてそれとハイブリダイズし得
る。さらに、染色体上の特定の部位を同定する必要性が、現在存在する。実際の
配列データ（反復多型性）に基づく染色体マーキング試薬は現在、染色体位置を
印付けするためには、ほとんど利用可能ではない。本発明に従うＤＮＡの染色体
へのマッピングは、これらの配列を疾患に関連する遺伝子と相関付ける際の、重
要な第一段階である。

【０３１８】 この点における特定の好ましい実施形態において、本明細書中で開示されるｃ
ＤＮＡを使用して、エンドカインαのタンパク質の遺伝子のゲノムＤＮＡをクロ
ーニングする。このことは、一般に市販されている種々の周知の技術およびライ
ブラリーを使用して達成され得る。次いで、ゲノムＤＮＡを、インサイチュ染色
体マッピングのために、この目的のための周知の技術を使用して使用する。代表
的に、染色体マッピングのための慣用的な手順に従って、良好なインサイチュの
ハイブリダイゼーションシグナルを与えるゲノムプローブを同定するために、い
くらかの試行錯誤が必要であり得る。

【０３１９】 さらに、いくつかの場合において、配列は、ｃＤＮＡ由来のＰＣＲプライマー
（好ましくは、１５〜２５ｂｐ）を調製することにより、染色体にマッピングさ
れ得る。遺伝子の３’非翻訳領域のコンピュータ分析を使用して、ゲノムＤＮＡ
における１より多くのエキソンにまたがる（従って、増幅プロセスを複雑にする
）ことのないプライマーを迅速に選択する。次いで、これらのプライマーを、個
々のヒト染色体を含む体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングのために使用
する。このプライマーに対応するヒト遺伝子を含むハイブリッドのみが、増幅さ
れた部分を与える。

【０３２０】 体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピングは、特定のＤＮＡを特定の染色体に割
り当てるための、迅速な手順である。本発明を同じオリゴヌクレオチドプライマ
ーと共に使用して、サブ位置決定（ｓｕｂｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）が、特定
の染色体からの部分のパネルまたは大きなゲノムクローンのプールによって、類
似の様式で達成され得る。その染色体に対してマッピングするために同様に使用
され得る、他のマッピングストラテジーとしては、インサイチュハイブリダイゼ
ーション、フロー選別した標識染色体での予備スクリーニングおよび染色体特異
的なｃＤＮＡライブラリーを構築するためのハイブリダイゼーションによる予備
選択が挙げられる。

【０３２１】 中期染色体スプレッド（ｓｐｒｅａｄ）へのｃＤＮＡクローンの蛍光インサイ
チュハイブリダイゼーション（「ＦＩＳＨ」）を使用して、１つの工程で、正確
な染色体位置を提供し得る。この技術は、５０または６０ｂｐほどの短いｃＤＮ
Ａ由来のプローブとともに使用され得る。この技術の概説について、Ｖｅｒｍａ
ら、Ｈｕｍａｎ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉ
ｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ
（１９８８）を参照のこと。

【０３２２】 一旦、配列が正確な染色体位置にマッピングされると、染色体上のその配列の
物理的位置を、遺伝マップデータに相関付けし得る。そのようなデータは、例え
ば、Ｖ．ＭｃＫｕｓｉｃｋ，Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｉ
ｎ Ｍａｎ（Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｅｌｃｈ
Ｍｅｄｉｃａｌ Ｌｉｂｒａｒｙからオンラインで利用可能）において見出さ
れる。次いで、同じ染色体領域にマッピングされた遺伝子と疾患との間の関係を
、連鎖解析（物理的に隣接する遺伝子の同時遺伝）を通して同定する。

【０３２３】 次いで、罹患している個体と罹患していない個体との間の、ｃＤＮＡまたはゲ
ノム配列における差異を決定することが必要である。変異が、罹患している個体
のいくらか、またはすべてにおいて観察されるが、正常な個体においては全く観
察されない場合、その変異は、その疾患の原因因子である可能性がある。

【０３２４】 物理的マッピングおよび遺伝子マッピング技術の現在の解像度を用いると、疾
患と関連する染色体領域に正確に位置決定されるｃＤＮＡは、５０〜５００の潜
在的な原因遺伝子のうちの１つであり得る（これは、１メガベースマッピング解
像度および２０ｋｂあたり１遺伝子と仮定する）。

【０３２５】 （エンドカインαの使用） 腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリーリガンドは、最も多面発現性のサイトカイ
ンであることが公知であり、多数の細胞応答（細胞傷害性、抗ウイルス活性、免
疫調節活性、およびいくつかの遺伝子の転写調節を含む）を誘導する（Ｇｏｅｄ
ｄｅｌ，Ｄ．Ｖ．ら、「Ｔｕｍｏｒ Ｎｅｃｒｏｓｉｓ Ｆａｃｔｏｒｓ：Ｇｅ
ｎｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｃｔｉｖｉｔｉ
ｅｓ」、Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５１：５９７−６０９（１９８６）
、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ；Ｂｅｕｔｌｅｒ，Ｂ．およびＣｅｒ
ａｍｉ，Ａ．、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５７：５０５−５１８（１
９８８）；Ｏｌｄ，Ｌ．Ｊ．、Ｓｃｉ．Ａｍ．２５８：５９−７５（１９８８）
；Ｆｉｅｒｓ，Ｗ．、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２８５：１９９−２２４（１９９１
））。ＴＮＦ−ファミリーリガンドは、ＴＮＦ−ファミリーレセプターに結合す
ることによって、このような種々の細胞応答を誘導する。

【０３２６】 本発明のエンドカインαポリヌクレオチド、ポリペプチド、アゴニストまたは
アンタゴニストは、エンドカインαの欠損または不十分な量のエンドカインαに
より（直接的または間接的に）媒介される、任意の障害のための処置の開発にお
いて、使用され得る。エンドカインαポリペプチド、アゴニストまたはアンタゴ
ニストは、このような障害に苦しむ患者（例えば、哺乳動物、特にヒト）に投与
され得る。あるいは、遺伝子治療アプローチが、このような障害を処置するため
に適用され得る。エンドカインαヌクレオチド配列の本明細書中の開示は、欠損
エンドカインα遺伝子の検出、および正常なエンドカインαコード遺伝子での欠
損エンドカインα遺伝子の置換を可能にする。欠損遺伝子は、インビトロ診断ア
ッセイにおいて、本明細書中に開示されるエンドカインαヌクレオチド配列を、
この遺伝子の欠損を有すると疑われる患者由来のエンドカインα遺伝子のヌクレ
オチド配列と比較することによって、検出され得る。

【０３２７】 別の実施形態において、本発明のポリペプチドは、ＴＲ１１／エンドカインα
相互作用の阻害から生じる、異なる細胞型に対する生物学的効果を試験するため
の、研究ツールとして使用される。エンドカインαポリペプチドはまた、ＴＲ１
１またはエンドカインαまたはその相互作用を検出するために、インビトロアッ
セイにおいて使用され得る。

【０３２８】 上記のように、ＴＮＦは、組織損傷を生じるそのプロ炎症性作用（例えば、血
管内皮細胞における凝血原活性の誘導（Ｐｏｂｅｒ，Ｊ．Ｓ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ．１３６：１６８０（１９８６））、好中球およびリンパ球の接着の増加
（Ｐｏｂｅｒ，Ｊ．Ｓ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３８：３３１９（１９８７
））、ならびにマクロファージ、好中球および血管内皮細胞からの血小板活性化
因子の放出の刺激（Ｃａｍｕｓｓｉ，Ｇ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６：１
３９０（１９８７））について注目される。最近の証拠は、多くの感染（Ｃｅｒ
ａｍｉ，Ａ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ ９：２８（１９８８））、免疫
障害、腫瘍性病理学（例えば、いくつかの悪性腫瘍を伴う悪液質において（Ｏｌ
ｉｆｆ，Ａ．ら、Ｃｅｌｌ ５０：５５５（１９８７））の病原において、なら
びに自己免疫病理学および対宿主性移植片病理学（Ｐｉｇｕｅｔ，Ｐ．−Ｆ．ら
、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６：１２８０（１９８７））において、ＴＮＦを関
係付けている。多くの研究は、ＴＮＦが、癌、感染病理および他の異化状態にお
ける悪液質の重要な媒介物であることを示唆してきた。

【０３２９】 従って、本発明のエンドカインαタンパク質は、腫瘍の標的化のために、好ま
しくは、放射性同位体または細胞増殖抑制性の薬物との結合体化の後に、使用さ
れ得る（ＧｒｕｓｓおよびＤｏｗｅｒ、Ｂｌｏｏｄ ８５（１２）：３３７８−
３４０４（１９９５））。エンドカインαは、黒色腫および肉腫を有する患者に
おいて、局所的な注射によって、腫瘍の後退および患者の寿命の長さの延長のた
めに使用され得るか、または隔離された四肢の潅流において使用され得る（Ａｇ
ｇａｒｗａｌおよびＮａｔａｒａｊａｎ、Ｅｕｒ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｎｅｔｗ
．７（２）：９２−１２４（１９９６））。

【０３３０】 本発明のエンドカインαはまた、特定の状況において、治療的役割（例えば、
ウイルス、細菌、酵母、真菌、および他の感染（トキソプラスマ症、マンソン住
血吸虫、リステリア菌およびＢＣＧを含む）に対する活性、）を有し得る。エン
ドカインαのこれらの効果は間接的であり得、従って好ましくは、マクロファー
ジ、好酸球、線維芽細胞、または好中球の活性化により、媒介される。

【０３３１】 ＴＮＦはまた、グラム陰性敗血症および内毒素ショックの病態生理学的（熱、
倦怠感、食欲不振および悪液質を含む）な結果において中心的な役割を果たすと
考えられる（Ｍｉｃｈｉｅ，Ｈ．Ｒ．ら、Ｂｒ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．７６：６７０−
６７１（１９８９）；Ｄｅｂｅｔｓ，Ｊ．Ｍ．Ｈ．ら、Ｓｅｃｏｎｄ Ｖｉｅｎ
ｎａ Ｓｈｏｃｋ Ｆｏｒｕｍ，４６３−４６６頁（１９８９）；Ｓｉｍｐｓｏ
ｎ，Ｓ．Ｑ．ら、Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ Ｃｌｉｎ．５：２７−４７（１９８９）
）。内毒素は、ＴＮＦ（Ｋｏｒｎｂｌｕｔｈ，Ｓ．Ｋ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ
．１３７：２５８５−２５９１（１９８６））および他のサイトカインの産生お
よび分泌を刺激する強力な単球／マクロファージ活性化因子である。増大したレ
ベルの循環するＴＮＦはまた、グラム陰性敗血症を罹患する患者において見出さ
れてきた（Ｗａａｇｅ，Ａ．ら、Ｌａｎｃｅｔ ｌ：３５５−３５７（１９８７
））；Ｈａｍｍｅｒｌｅ，Ａ．Ｆ．ら、Ｓｅｃｏｎｄ Ｖｉｅｎｎａ Ｓｈｏｃ
ｋ Ｆｏｒｕｍ ７１５−７１８頁（１９８９）；Ｄｅｂｅｔｓ，Ｊ．Ｍ．Ｈ．
ら、Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．１７：４８９−４９７（１９８９）；Ｃａｌ
ａｎｄｒａ，Ｔ．ら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃ．Ｄｉｓ．１６１：９８２−９８７（１９
９０））。

【０３３２】 ＴＮＦに対する中和抗血清またはｍＡｂは、ヒト以外の哺乳動物において、有
害な生理学的変化を廃止し、そして実験的な内毒素血症および菌血症における致
死のチャレンジの後に、死を予防することが示された。この効果は、例えば、げ
っ歯類の死亡率アッセイおよび霊長類の病理モデル系において、実証された（Ｍ
ａｔｈｉｓｏｎ，Ｊ．Ｃ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８１：１９２５−
１９３７（１９８８）；Ｂｅｕｔｌｅｒ，Ｂ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：８
６９−８７１（１９８５）；Ｔｒａｃｅｙ，Ｋ．Ｊ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３３０
：６６２−６６４（１９８７）；Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ，Ｙ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ
．Ｌｅｔｔ．１７：３１１−３１８（１９８８）；Ｓｉｌｖａ，Ａ．Ｔ．ら、Ｊ
．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１６２：４２１−４２７（１９９０）；Ｏｐａｌ，Ｓ
．Ｍ．ら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１６１：１１４８−１１５２（１９９０
）；Ｈｉｎｓｈａｗ，Ｌ．Ｂ．ら、Ｃｉｒｃ．Ｓｈｏｃｋ ３０：２７９−２９
２（１９９０））。現在まで、ヒトにおける抗ＴＮＦ ｍＡｂ治療の体験は制限
されていたが、有益な治療結果（例えば、関節炎および敗血症において）を示し
た（例えば、Ｅｌｌｉｏｔｔ，Ｍ．Ｊ．ら、Ｂａｉｌｌｉｅｒｅｓ Ｃｌｉｎ．
Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．９：６３３−５２（１９９５）；Ｆｅｌｄｍａｎｎ Ｍ．
ら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７６６：２７２−８（１９９
５）；ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｏｌｌ，Ｔ．ら、Ｓｈｏｃｋ ３：１−１２（１９９
５）：Ｗｈｅｒｒｙら、Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ．Ｍｅｄ．２１：Ｓ４３６−４０（
１９９３；Ｔｒａｃｅｙ Ｋ．Ｊ．ら、Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．２１：Ｓ
４１５−２２（１９９３）を参照のこと）。

【０３３３】 エンドカインαは、ＴＮＦの生物学的効果の多くを示すと考えられるので、本
発明は、抗体に基づく治療にさらに関し、この治療は、１つ以上の上記の障害を
処置するために、抗エンドカインα抗体を、哺乳動物（特にヒト）患者に処置す
る工程を包含する。抗エンドカインαポリクローナルおよびモノクローナル抗体
を産生するための方法は、上に詳細に記載される。このような抗体は、当該分野
において公知であるか、または本明細書中に記載されるような、薬学的に受容可
能な組成物において提供され得る。

【０３３４】 本発明のポリヌクレオチドおよび／もしくはポリペプチドならびに／またはそ
のアゴニストおよび／もしくはアンタゴニストは、広範囲の疾患および／または
状態の診断および処置または予防において、有用である。このような疾患および
状態は、癌（例えば、免疫細胞に関連した癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、濾胞性
リンパ腫、、膠芽腫、ｐ５３の変異または改変に付随する癌、脳腫瘍、膀胱癌、
子宮頚部癌、結腸癌、結腸直腸癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、胃癌、など）リ
ンパ球増殖性の疾患（例えば、リンパ節症およびリンパ腫（例えば、ＥＢＶによ
り誘導されるリンパ増殖およびホジキン病））、微生物（例えば、ウィルス、細
菌、など）の感染（例えば、ＨＩＶ−１感染、ＨＩＶ−２感染、ヘルペスウィル
ス感染（ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、ＣＭＶ、ＶＺＶ、ＨＨＶ−６、ＨＨＶ−７、
ＥＢＶを含むがこれらに限定されない）、アデノウィルス感染、ポックスウィル
ス感染、ヒトパピローマウィルス感染、肝炎感染（例えば、ＨＡＶ、ＨＢＶ、Ｈ
ＣＶ、など）、ヘリコバクターピロリ感染、侵襲性ブドウ球菌感染、など）、寄
生虫感染、腎炎、骨の疾患（例えば、骨粗しょう症）、アテローム性動脈硬化症
、疼痛、心臓血管障害（例えば、新生血管形成、新生血管形成低下または循環低
下（例えば、虚血性の疾患（例えば、心筋梗塞、発作、など）））、ＡＩＤＳ、
アレルギー、炎症、神経変性疾患、（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン
病、筋萎縮性側索硬化症、色素性網膜症、小脳変質、など）、移植片拒絶（急性
および慢性）、対宿主移植片病、骨髄形成異常による疾患（例えば、再生不良性
貧血、など）、リウマチにおける関節組織破壊、肝臓病（例えば、急性肝炎およ
び慢性肝炎、肝損傷、ならびに肝硬変）、自己免疫疾患（例えば、多発性硬化症
、重症筋無力症、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、免疫複合体糸球
体腎炎、自己免疫性糖尿病、自己免疫性血小板減少性紫斑病、グレイブ（Ｇｒａ
ｖｅ）病、橋本甲状腺炎、など）、心筋症（例えば、拡張型心筋症）、糖尿病、
糖尿病性合併症（例えば、糖尿病性腎症、糖尿病性ニューロパシー、糖尿病性網
膜症）、インフルエンザ、ぜん息、乾癬、糸球体腎炎、敗血症性ショック、およ
び潰瘍性大腸炎を含むが、限定されない。

【０３３５】 本発明のポリヌクレオチドおよび／もしくはポリペプチド、ならびに／または
そのアゴニストおよび／もしくはアンタゴニストは、新脈管形成、創傷（例えば
、創傷、やけど、および骨折）治癒を促進すること、ならびに骨形成の調節およ
び骨粗しょう症の処置において、有用である。

【０３３６】 本発明のポリヌクレオチドおよび／もしくはポリペプチド、ならびに／または
そのアゴニストおよび／もしくはアンタゴニストはまた、特定の抗原、および／
または抗ウイルス免疫応答に対して免疫応答性を増強するためのアジュバンドと
して、有用である。

【０３３７】 さらに一般的に、本発明のポリヌクレオチドおよび／もしくはポリペプチドな
らびに／またはそのアゴニストおよび／もしくはアンタゴニストは、免疫応答を
調節する（すなわち、上昇および減少する）ことにおいて有用である。例えば、
本発明のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドは、手術、外傷、放射線
療法、化学療法、および移植の準備または回復において有用であり得、あるいは
高齢者および免疫無防備状態の個体において免疫応答および／または回復を高め
るために使用され得る。あるいは、本発明のポリヌクレオチドおよび／もしくは
ポリペプチド、ならびに／またはそのアゴニストおよび／もしくはアンタゴニス
トは、例えば、自己免疫障害の処置または予防において、あるいは移植拒絶（ｔ
ｒａｎｓｏｌａｎｔ ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ）の予防として有用である。特定の実
施形態において、本発明のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドは、本
明細書中に記載されるような、または当該分野において公知である、慢性炎症、
アレルギーまたは自己免疫状態を、処置または予防するために使用される。

【０３３８】 本発明の抗体が治療的に使用され得る方法をまとめると、身体内で局所的にま
たは全身的に、あるいは（例えば、補体（ＣＤＣ）により、またはエフェクター
細胞（ＡＤＣＣ）により媒介されるような）抗体の直接的細胞傷害性により、エ
ンドカインαを結合させることを含む。これらのアプローチのいくつかは、より
詳細に以下に記載される。本明細書中で提供される教示を与えられれば、当業者
は、過度の実験なしに、診断上の目的、モニタリングの目的あるいは治療上の目
的のために、本発明の抗体を使用する方法を知る。

【０３３９】 本発明の薬学的組成物は、その意図される目的を達成する任意の手段によって
、投与され得る。抗体、それらのフラグメントまたは誘導体の投与の量およびレ
ジメンは、ＴＮＦ関連疾患を処置する臨床分野の当業者によって、容易に決定さ
れ得る。

【０３４０】 例えば、投与は、非経口経路、皮下経路、静脈内経路、筋内経路、腹腔内経路
、経皮経路、または口腔内経路により得る。あるいは、または同時に、投与は経
口経路により得る。投与される投薬量は、レシピエントの年齢、健康状態、およ
び体重、併用する処置の種類（あるならば）、処置の頻度、および所望される効
果の性質に依存する。

【０３４１】 本発明の範囲内にある組成物は、抗体、フラグメントまたは誘導体が、その意
図される目的を達成するために有効な量で含まれている、すべての組成物を包含
する。個々の必要性は変動するが、各成分の有効量の最適範囲の決定は、当該分
野の技術の範囲内である。有効用量は、個々のキメラ抗体またはモノクローナル
抗体、結合体化された治療剤（以下を参照のこと）の存在および性質、患者およ
び患者の臨床状態の関数であり、そして約１０μｇ／ｋｇ体重から約５０００ｍ
ｇ／ｋｇ体重まで変動し得る。好ましい投薬量は、０．１〜５００ｍｇ／ｋｇ体
重を含む。

【０３４２】 薬理学的に活性な成分に加えて、新規の薬学的組成物は、薬学的に使用され得
る調製物への活性化合物の加工を容易にする賦形剤および補助剤（ａｕｘｉｌｉ
ａｒｙ）を含む、適切な薬学的に受容可能なキャリアを含有し得る。好ましくは
、調製物は、約０．０１〜９９％、好ましくは約２０〜７５％の活性化合物（単
数または複数）を賦形剤と共に含有する。

【０３４３】 同様に、非経口投与のための本発明のエンドカインα抗体またはフラグメント
の調製物（例えば、画像化のための検出可能に識別された形態または治療のため
の遊離もしくは結合体化された形態）は、滅菌水溶液または滅菌非水性溶液、懸
濁液、およびエマルジョンを含む。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、
ポリエチレングリコール、植物油（例えば、オリーブ油）、および注射可能な有
機エステル（例えば、オレイン酸エチル）である。水性キャリアとしては、水、
アルコール性／水性溶液、エマルジョンまたは懸濁液（生理食塩水および緩衝化
媒体を含む）、非経口ビヒクル（塩化ナトリウム溶液、リンガーデキストロース
、デキストロースおよび塩化ナトリウムを含む）、乳酸リンガー、または固定油
が挙げられる。静脈内ビヒクルとしては、液体および栄養補充剤（例えば、リン
ガーデキストロースに基づくものなど）が挙げられる。防腐剤および他の添加剤
（例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガスなどのような）も
また存在し得る。一般的に、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉ
ｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、第１６版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．
、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、１９８０を参照のこと。

【０３４４】 特に、本発明の抗体、フラグメント、および誘導体は、本明細書中に記載され
るようなエンドカインα関連障害を有するかまたは発症する被験体を処置するた
めに有用である。このような処置は、単回用量または複数回用量の抗体、フラグ
メントもしくは誘導体、またはそれらの結合体を非経口的に投与する工程を包含
する。

【０３４５】 本発明の抗体は、抗体と相互作用するエフェクター細胞の数または活性を増加
させるために役立つ他のモノクローナル抗体もしくはキメラ抗体、またはリンホ
カインもしくは造血増殖因子などと組み合わせて有利に利用され得る。

【０３４６】 エンドカインα（ＴＮＦと同様）の循環濃度は、極めて低い傾向にある（敗血
症でない個体において約１０ｐｇ／ｍｌの範囲、そして敗血症患者において約５
０ｐｇ／ｍｌに達し、そしてＴＮＦについての敗血症症候群では約１００ｐｇ／
ｍｌを超え（Ｈａｍｍｅｒｌｅ，Ａ．Ｆ．ら、１９８９、前出））か、またはエ
ンドカインα関連障害の部位でわずかに検出可能であるのみであり得るので、エ
ンドカインαイムノアッセイおよびエンドカイン関連障害の治療の両方のために
は、高親和性および／または強力なインビボエンドカインα阻害抗体および／ま
たは中和抗体、フラグメントまたはそれらの領域を使用することが好ましい。こ
のような抗体、フラグメント、または領域は、好ましくは、Ｋａとして表される
、少なくとも１０⁸Ｍ^-1、より好ましくは、少なくとも１０⁹Ｍ^-1（例えば、５×
１０⁸Ｍ^-1、８×１０⁸Ｍ^-1、、２×１０⁹Ｍ^-1、４×１０⁹Ｍ^-1、６×１０⁹Ｍ^-1
、８×１０⁹Ｍ^-1）のヒトエンドカインαに対する親和性を有する。

【０３４７】 ヒトの治療的用途に好ましいのは、本発明に従って、インビボで強力なエンド
カイン阻害活性および／または中和活性を有する（例えば、細胞接着分子（例え
ば、ＥＬＡＭ−１およびＩＣＡＭ−１）のエンドカインに誘導されるＩＬ−１、
ＩＬ−６またはＴＮＦの分泌、凝血促進活性、発現およびマイトジェン活性をイ
ンビボ、インサイチュ、およびインビトロにおいてブロックする）、高親和性の
マウスおよびマウス／ヒト、またはヒト／ヒトキメラ抗体、ならびにフラグメン
ト、領域、および誘導体である。

【０３４８】 本発明のさらなる好ましい実施形態としては、以下の適用におけるエンドカイ
ン−αポリペプチドおよび機能的アゴニストの使用が挙げられるが、これらに限
定されない： 特異的抗原に対する免疫応答性を増強するワクチンアジュバント。

【０３４９】 腫瘍特異的免疫応答を増強するためのアジュバント。

【０３５０】 抗ウイルス免疫応答を増強するためのアジュバント。

【０３５１】 病原体に対するＢ細胞応答の刺激物質として。

【０３５２】 Ｔ細胞のアクチベーターとして。

【０３５３】 免疫抑制治療を受ける前に、個体の免疫状態を上昇させる薬剤として。

【０３５４】 免疫無防備状態の個体の回復を促進するための薬剤として；高齢の集団の間で
免疫応答性を追加免疫するための薬剤として；骨髄移植後の免疫系エンハンサー
として。

【０３５５】 個体の免疫系を、体液性応答（すなわち、ＴＨ２）および／またはＴＨ１細胞
性応答の発生に指向させるための薬剤として。

【０３５６】 腫瘍増殖を誘導するため、従ってそれを抗腫瘍性薬剤に対してより感受性にさ
せるための手段として。例えば、多発性骨髄腫は、緩徐に分裂する疾患であり、
従って、実質的にすべての抗腫瘍レジメンに対して難治性である。これらの細胞
をより迅速に増殖させる場合、これらの感受性プロフィールはおそらく変化する
。

【０３５７】 細胞増殖の特定のアクチベーターまたはインヒビターが結合し得る細胞（例え
ば、内皮細胞）特異的結合タンパク質を発現するＢ細胞および他のリガンドとし
て。結果は、正常なＢ細胞集団、罹患したＢ細胞集団、または腫瘍性Ｂ細胞集団
に対するこのようなアクチベーターまたはインヒビターの活性に焦点をあわせる
べきである。

【０３５８】 Ｂ系列細胞および／またはリガンド発現細胞（例えば、内皮細胞）を、その特
異性によって検出する手段として。この適用は、検出の手段を提供するためにビ
オチンまたは他の薬剤を用いてタンパク質を標識することを必要とし得る。

【０３５９】 病理（例えば、ＡＩＤＳ、慢性リンパ球障害（ｃｈｒｏｎｉｃ ｌｙｍｐｈｏ
ｃｙｔｅ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）、および／または分類不能型免疫不全）における
Ｂ細胞産生の刺激物質として。

【０３６０】 Ｂ細胞選択デバイスの一部としてであって、その機能は、細胞型の異種混合物
からＢ細胞ならびに他のリガンド発現細胞（例えば、内皮細胞）を単離すること
である。エンドカインαは、固体支持体に結合され得、次いで、この固体支持体
にＢ細胞は特異的に結合する。結合しない細胞は洗い流され、そして結合した細
胞は引き続いて溶出される。この技術は、移植前に、例えば、骨髄または末梢血
から腫瘍細胞を除去することを可能にする。

【０３６１】 外科手術、外傷、または遺伝的欠陥に続く、リンパ組織の産生および／または
再生のための治療として。

【０３６２】 免疫不全（例えば、ＳＣＩＤ患者の間で観察されるような）を生じる遺伝学的
に遺伝する障害のための遺伝子に基づく治療として。

【０３６３】 エンドカインα媒介応答を阻害または増強するための抗体の産生についての抗
原として。

【０３６４】 単球に影響する寄生生物性疾患（例えば、リーシュマニア（Ｌｅｓｈｍａｎｉ
ａ））に対して防御するために、単球／マクロファージを活性化する手段として
。

【０３６５】 移植前の骨髄サンプルの前処理として。このような処置は、Ｂ細胞提示を増加
させ、従って回復を促進する。

【０３６６】 エンドカインαによって誘発される分泌サイトカインを調節する手段として。

【０３６７】 所望されないＴＨ１応答の阻害。ＩＬ−１２が、ＴＨ１分化を指向する際に重
要なサイトカインであることを実証するため強力な証拠が存在する。ＩＬ−１２
産生のエンドカインα誘導阻害は、ＴＨ１関連状態（例えば、自己免疫疾患、炎
症、急性同種移植拒絶、胎児吸収（ｆｅｔａｌ ｒｅｓｏｒｐｔｉｏｎ））を制
御するにおいて有益であり得る。

【０３６８】 炎症応答の低下。ＩＬ−１０およびＭＣＰ−１の誘導は、糞便性腹膜炎（ｆｅ
ｃａｌ ｐｅｒｉｔｏｎｉｔｉｓ）を改善することが示されている。

【０３６９】 病原体に対する抵抗性の増強。酸化バースト（ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｂｕｒｓ
ｔ）の産物（例えば、Ｈ₂Ｏ₂）は、食作用した病原体を殺傷するため、または細
胞の細胞外破壊（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ
ｃｅｌｌ）のために、単球によって使用される。

【０３７０】 上記のすべての適用を、同様に、獣医学的医薬に適用し得る。

【０３７１】 エンドカインαレセプターの結合抗体および／または阻害抗体、アンチセンス
核酸、リボザイム、あるいは可溶性形態を含むエンドカインαのアンタゴニスト
。これらは、上記のリガンドの多くの活性を逆転し、そして以下のような臨床的
または実用的適用を見出すと予期される： 外来因子または自己に対する免疫応答の種々の局面をブロックする手段。例と
しては、例えば、狼瘡のような自己免疫障害、および関節炎、ならびに皮膚アレ
ルギー、炎症、腸疾患、外傷、および病原体に対する免疫応答性が挙げられる。
本発明者らの現在のデータは、Ｂ細胞、Ｔ細胞および単球に関連した病原体にお
けるエンドカインαの潜在的役割を直接的に示すが、他の細胞型が、発現または
エンドカインαに対する応答性を獲得し得ることは依然として可能である。従っ
て、エンドカインαは、ＣＤ４０およびそのリガンドと同様に、免疫系の状態お
よびその細胞が位置付けられる微小環境によって調節され得る。

【０３７２】 自己免疫疾患（例えば、特発性血小板減少性紫斑症、全身性エリテマトーデス
およびＭＳ）に関連するＢ細胞増殖および／またはＴ細胞増殖、ならびにＩｇ分
泌を予防するための治療。

【０３７３】 内皮細胞におけるＢ細胞移動および／またはＴ細胞移動のインヒビター。この
活性は、組織構築（ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ）および同種の応答を破壊し、そ
して例えば、免疫応答を破壊する際および敗血症をブロックする際に有用である
。

【０３７４】 対宿主性移植片病または移植拒絶のインヒビター。

【０３７５】 Ｂ細胞および／またはＴ細胞悪性疾患（例えば、ＡＬＬ、ホジキン病、非ホジ
キンリンパ腫、慢性リンパ球白血病、形質細胞腫、多発性骨髄腫、バーキットリ
ンパ腫、およびＥＢＶ−形質転換疾患（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｄｉｓｅａｓ
ｅ））の治療。

【０３７６】 意義不明の単一クローン性高ガンマグロブリン血症（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌｇ
ａｍｍｏｐａｔｈｙ ｏｆ ｕｎｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎ
ｃｅ）（ＭＧＵＳ）、ヴァルデンストレーム疾患、および関連の特発性単一クロ
ーン性高ガンマグロブリン血症のような疾患における慢性高ガンマグロブリン血
症事象の治療。

【０３７７】 慢性骨髄性白血病に関連したＢ細胞およびＩｇの関与を低下させる手段。

【０３７８】 免疫抑制剤。

【０３７９】 エンドカインα誘導Ｂ細胞活性化に関連しているＥＲＫ１、ＣＯＸ２およびＣ
ｙｃｌｉｎＤ２の関与するシグナル伝達経路のインヒビター。

【０３８０】 アゴニストおよびアンタゴニストは、例えば、上記のように、薬学的に受容可
能なキャリアを有する組成物において使用され得る。

【０３８１】 アンタゴニストは、例えば、特定の自己免疫疾患および慢性炎症性疾患および
感染性疾患において、エンドカインαの走化性そしてマクロファージおよびそれ
らの前駆体の活性化、ならびに好中球、好塩基球、Ｂリンパ球およびいくつかの
Ｔ細胞サブセット（例えば、活性化されたＴ細胞およびＣＤ８細胞傷害性Ｔ細胞
）ならびにナチュラルキラー細胞の活性化を阻害するために使用され得る。自己
免疫疾患の例としては、多発性硬化症およびインシュリン依存性真性糖尿病が挙
げられる。

【０３８２】 アンタゴニストはまた、単核食細胞の補充および活性化を予防することによっ
て、感染性疾患（珪肺症、類肉腫症、特発性肺線維症（ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ
ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）を含む）を処置するために使用され得
る。これらはまた、好酸球の産生および移動を予防することによって、特発性好
酸球増加症候群を処置するために使用され得る。エンドトキシンショックはまた
、マクロファージの移動および本発明のエンドカインαポリペプチドのその産生
を予防することによって、アンタゴニストにより処置され得る。アンタゴニスト
はまた、動脈壁における単球の浸潤を予防することによって、アテローム性動脈
硬化症を処置するために使用され得る。

【０３８３】 アンタゴニストはまた、ケモカイン誘導肥満細胞および好塩基球脱顆粒ならび
にヒスタミンの放出を阻害することによって、ヒスタミン媒介アレルギー反応お
よび免疫学的障害（晩期アレルギー反応、慢性じんま疹、およびアトピー性皮膚
炎を含む）を処置するために使用され得る。ＩｇＥ媒介アレルギー反応（例えば
、アレルギー性喘息、鼻炎、および湿疹）もまた処置され得る。

【０３８４】 アンタゴニストはまた、創傷領域への単球の誘引を予防することによって、慢
性および急性の炎症を処置するために使用され得る。慢性および急性の炎症性肺
疾患は、肺における単核食細胞の壊死巣分離（ｓｅｑｕｅｓｔｒａｔｉｏｎ）に
関連しているので、これらはまた、正常な肺のマクロファージ集団を調節するた
めに使用され得る。アンタゴニストはまた、患者の関節における滑液中に単球を
誘引すること予防することによって、慢性関節リウマチを処置するために使用さ
れ得る。単球の流入および活性化は、変性関節炎および炎症性関節炎の両方の病
因において重要な役割を果たす。アンタゴニストは、主にＩＬ−１およびＴＮＦ
に帰する有害なカスケードを干渉するために使用され得、これは他の炎症性サイ
トカインの生合成を予防する。この様式において、アンタゴニストは、炎症を予
防するために使用され得る。アンタゴニストはまた、エンドカインαによって誘
導されるプロスタグランジン非依存性発熱（ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ−ｉｎ
ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｆｅｖｅｒ）を阻害するために使用され得る。アンタゴニ
ストはまた、骨髄欠陥の症例（例えば、再生不良性貧血および骨髄異形成症候群
）を処置するために使用され得る。アンタゴニストはまた、肺における好酸球の
蓄積を予防することによって喘息およびアレルギーを処置するために使用され得
る。アンタゴニストはまた、喘息の肺の顕著な特徴である上皮下基底膜線維症を
処置するために使用され得る。

【０３８５】 エンドカインαに対する抗体は、外傷後に肺への好中球の浸潤を予防すること
によって、ＡＲＤＳを処置するためにエンドカインα活性に結合するために使用
され得る。本発明のアンタゴニストおよびアンタゴニストは、例えば、本明細書
中の以降で記載するように薬学的に受容可能なキャリアを有する組成物において
使用され得る。

【０３８６】 本発明のアゴニストおよびアンタゴニストはまた、創傷および組織の修復を刺
激する際、新脈管形成を刺激する際、脈管またはリンパの疾患または障害の修復
を刺激する際における用途を有する。さらに、本発明のアゴニストおよびアンタ
ゴニストは、粘膜表面の再生を刺激するために使用され得る。

【０３８７】 本発明の組成物は、単独または他の治療剤と組み合わせて投与され得る。本発
明の組成物と組み合わせて投与され得る治療剤としては、ＴＮＦファミリーの他
のメンバー、化学療法剤、抗生物質、ステロイド性および非ステロイド性の抗炎
症剤、従来の免疫療法剤、サイトカインおよび／または増殖因子が挙げられるが
、これらに限定されない。併用物は、同時に（例えば、混合物として、別々であ
るが、同時に（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ）もしくは同時に（ｃｏｎｃｕｒ
ｒｅｎｔｌｙ））または連続的にのいずれかで投与され得る。これは、併用され
るた薬剤が、治療用合剤として共に投与される提示、およびまた、併用される薬
剤が、別々であるが同時に（例えば、同一個体への別々の静脈内ラインを通して
）投与される手順を包含する。「組み合わせにおける」投与はさらに、第１に与
えられる１つの化合物または薬剤（これは、第２物によって続けられる）の別々
の投与を包含する。

【０３８８】 １つの実施形態において、本発明の組成物は、ＴＮＦファミリーの他のメンバ
ーと組み合わせて投与される。本発明の組成物とともに投与され得るＴＮＦ分子
、ＴＮＦ関連分子、またはＴＮＦ様分子としては、以下が挙げられるが、これら
に限定されない：可溶性形態の、ＴＮＦ−α、リンホトキシン−α、（ＬＴ−α
、ＴＮＦ−βとしても公知）、ＬＴ−β（複合ヘテロ三量体ＬＴ−α２−βの状
態で見出される）、ＯＰＧＬ、ＦａｓＬ、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ
、４−１ＢＢＬ、ＤｃＲ３、ＯＸ４０Ｌ、ＴＮＦ−γ（国際公開番号ＷＯ９６／
１４３２８）、ＡＩＭ−Ｉ（国際公開番号ＷＯ９７／３３８９９）、エンドカイ
ン（ｅｎｄｏｋｉｎｅ）−α（国際公開番号ＷＯ９８／０７８８０）、ＴＲ６（
国際公開番号ＷＯ９８／３０６９４）、ＯＰＧ、およびニュートロカイン（ｎｅ
ｕｔｒｏｋｉｎｅ）−α（国際公開番号ＷＯ９８／１８９２１）、ＯＸ４０、お
よび神経成長因子（ＮＧＦ）、ならびに可溶性形態の、Ｆａｓ、ＣＤ３０、ＣＤ
２７、ＣＤ４０および４−ＩＢＢ、ＴＲ２（国際公開番号ＷＯ９６／３４０９５
）、ＤＲ３（国際公開番号ＷＯ９７／３３９０４）、ＤＲ４（国際公開番号ＷＯ
９８／３２８５６）、ＴＲ５（国際公開番号ＷＯ９８／３０６９３）、ＴＲ６（
国際公開番号ＷＯ９８／３０６９４）、ＴＲ７（国際公開番号ＷＯ９８／４１６
２９）、ＴＲＡＮＫ、ＴＲ９（国際公開番号ＷＯ９８／５６８９２）、ＴＲ１０
（国際公開番号ＷＯ９８／５４２０２）、３１２Ｃ２（国際公開番号ＷＯ９８／
０６８４２）、およびＴＲ１２、ならびに可溶性形態の、ＣＤ１５４、ＣＤ７０
、およびＣＤ１５３。

【０３８９】 本発明の組成物とともに投与され得る従来の非特異的免疫抑制剤としては、ス
テロイド類、シクロスポリン、シクロスポリンアナログ、シクロホスファミドメ
チルプレドニゾン、プレドニゾン、アザチオプリン、ＦＫ−５０６、１５−デオ
キシスペルグアリン（１５−ｄｅｏｘｙｓｐｅｒｇｕａｌｉｎ）、および応答Ｔ
細胞の機能を抑制することによって作用する他の免疫抑制剤が挙げられるが、こ
れらに限定されない。

【０３９０】 さらなる実施形態では、本発明の組成物は、抗生物質剤と組み合わせて投与さ
れる。本発明の組成物と共に投与され得る抗生物質剤としては、テトラサイクリ
ン、メトロニダゾル、アモキシリン、β−ラクタマーゼ、アミノ配糖体、マクロ
ライド、キノロン類、フルオロキノロン類、セファロスポリン、エリスロマイシ
ン、シプロフロキサシン、およびストレプトマイシンが挙げられるが、これらに
限定されない。

【０３９１】 さらなる実施形態において、本発明の組成物を、単独または抗炎症剤と組み合
わせて投与する。本発明の組成物と共に投与され得る抗炎症剤は、糖質コルチコ
イドおよび非ステロイド性抗炎症薬、アミノアリールカルボン酸誘導体、アリー
ル酢酸誘導体、アリール酪酸誘導体、アリールカルボン酸、アリールプロピオン
酸誘導体、ピラゾール、ピラゾロン、サリチル酸誘導体、チアジンカルボキシア
ミド、ｅ−アセトアミドカプロン酸、Ｓ−アデノシルメチオニン、３−アミノ−
４−ヒドロキシ酪酸、アミキセトリン、ベンダザック、ベンジダミン、ブコロー
ム、ジフェンピラミド、ジタゾール、エモルファゾン、グアイアズレン、ナブメ
トン、ニメスリド、オルゴテイン、オキサセプロル、パラリニン、ペリソキサー
ル、ピフォキシム、プロカゾン、プロキサゾール、およびテニダプを含むが、限
定されない。

【０３９２】 別の実施形態において、本発明の組成物を、化学療法剤と組み合わせて投与す
る。本発明の組成物と共に投与され得る化学療法剤は、抗生物質誘導体（例えば
、ドキソルビシン、ブレオマイシン、ダウノルビシン、およびダクチノマイシン
）；抗エストロゲン（例えば、タモキシフェン）；代謝拮抗剤（例えば、フルオ
ロウラシル、５−ＦＵ、メトトレキサート、フロクシウリジン、インターフェロ
ンαー２ｂ、グルタミン酸、プリカマイシン、メルカプトプリン、および６−チ
オグアニン）；細胞傷害剤（例えば、カルムスチン、ＢＣＮＵ、ロムスチン、Ｃ
ＣＮＵ、シトシンアラビノシド、シクロホスファミド、エストラムスチン、ヒド
ロキシウレア、プロカルバジン、マイトマイシン、ブスルファン、シス−プラチ
ン（ｃｉｓ−ｐｌａｔｉｎ）、および硫酸ビンクリスチン）；ホルモン（例えば
、メドロキシプロゲステロン、エストラムスチンリン酸ナトリウム、エチニルエ
ストラジオール、エストラジオール、酢酸メゲストロール、メチルテストステロ
ン、二リン酸ジエチルスチルベストロール、クロロトリアニセン、およびテスト
ラクトン）；ナイトロジェンマスタード誘導体（例えば、メファレン（ｍｅｐｈ
ａｌｅｎ）、チョランブシル、メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード）お
よびチオテパ）；ステロイドおよび組合せ（例えば、リン酸ベタメタソンナトリ
ウム；およびその他（例えば、ジカルバジン、アスパラギナーゼ、ミトタン、硫
酸ビンクリスチン、硫酸ビンブラスチン、およびエトポシド）を含むが、これら
に限定されない。

【０３９３】 さらなる実施形態において、本発明の組成物は、サイトカインと組み合わせて
投与される。本発明の組成物とともに投与され得るサイトカインとしては、ＩＬ
２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ１０、ＩＬ１２、ＩＬ１３
、ＩＬ１５、抗ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αが挙げられ
るが、これらに限定されない。

【０３９４】 さらなる実施形態において、本発明の組成物は、脈管形成タンパク質と組み合
わせて投与される。本発明の組成物とともに投与され得る脈管形成タンパク質と
しては、欧州特許ＥＰ−３９９８１６に開示されるようなグリオーム誘導増殖因
子（Ｇｉｌｉｏｍａ Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ）（ＧＤＧ
Ｆ）；欧州特許ＥＰ−６８２１１０に開示されるような血小板誘導増殖因子−Ａ
（ＰＤＧＦ−Ａ）；欧州特許ＥＰ−２８２３１７に開示されるような血小板誘導
増殖因子−Ｂ（ＰＤＧＦ−Ｂ）；国際公開番号ＷＯ９２／０６１９４号に開示さ
れるような胎盤増殖因子（ＰｌＧＦ）；Ｈａｕｓｅｒら、Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃ
ｔｏｒｓ、４：２５９−２６８（１９９３）に開示されるような胎盤増殖因子−
２（ＰｌＧＦ−２）；国際公開番号ＷＯ９０／１３６４９号に開示されるような
血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）；欧州特許ＥＰ−５０６４７７に開示されるよう
な血管内皮増殖因子−Ａ（ＶＥＧＦ−Ａ）；国際公開番号ＷＯ９６／３９５１５
号に開示されるような血管内皮増殖因子−２（ＶＥＧＦ−２）；国際公開番号Ｗ
Ｏ９６／２６７３６号に開示されるような血管内皮増殖因子Ｂ−１８６（ＶＥＧ
Ｆ−Ｂ１８６）；国際公開番号ＷＯ９８／０２５４３号に開示されるような血管
内皮増殖因子−Ｄ（ＶＥＧＦ−Ｄ）；国際公開番号ＷＯ９８／０７８３２号に開
示されるような血管内皮増殖因子−Ｄ（ＶＥＧＦ−Ｄ）；およびドイツ国特許Ｄ
Ｅ１９６３９６０１に開示されるような血管内皮増殖因子−Ｅ（ＶＥＧＦ−Ｅ）
が挙げられるが、これらに限定されない。上記の参考文献は、本明細書で参考と
して援用される。

【０３９５】 さらなる実施形態において、本発明の組成物は、線維芽細胞増殖因子と組み合
わせて投与される。本発明の組成物とともに投与され得る線維芽細胞増殖因子と
しては、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−３、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５、ＦＧ
Ｆ−６、ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−８、ＦＧＦ−９、ＦＧＦ−１０、ＦＧＦ−１１、
ＦＧＦ−１２、ＦＧＦ−１３、ＦＧＦ−１４、およびＦＧＦ−１５が挙げられる
が、これらに限定されない。

【０３９６】 さらなる実施形態において、本発明の組成物は、他の治療レジメンまたは予防
レジメン（例えば、放射線治療）と組み合わせて投与される。

【０３９７】 本発明のエンドカインα組成物はまた、徐放性システムにより適切に投与され
る。徐放性組成物の適切な例は、ポリマー材料（例えば、フィルムまたはマイク
ロカプセルの成形品の形態の半透過性ポリマーマトリックスのような適切な）、
適切な疎水性材料（例えば、受容可能な油中の乳濁液として）またはイオン交換
樹脂、および貧可溶性誘導体（例えば、貧可溶性塩のような）を包含する。

【０３９８】 徐放性マトリックスとしては、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９
号、ＥＰ５８，４８１）、Ｌ−グルタミン酸およびγ−エチル−Ｌ−グルタメー
トのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎ，Ｕ．ら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ２２：５４
７−５５６（１９８３））、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（Ｒ
．Ｌａｎｇｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７−２
７７（１９８１）、およびＲ．Ｌａｎｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８
−１０５（１９８２））、エチレンビニルアセテート（Ｒ．Ｌａｎｇｅｒら、同
書）またはポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（ＥＰ１３３，９８８）が挙
げられる。

【０３９９】 徐放性組成物はまた、リポソームに封入された本発明の組成物を包含する（一
般には、Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３（１９９
０）；Ｔｒｅａｔら，Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏ
ｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ，Ｌｏｐｅ
ｚ−ＢｅｒｅｓｔｅｉｎおよびＦｉｄｌｅｒ（編），Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒ
ｋ，３１７−３２７頁および３５３−３６５頁（１９８９）を参照のこと）。エ
ンドカインαポリぺプチドを含有するリポソームは、それ自体が公知である方法
により調製される：ＤＥ３，２１８，１２１；Ｅｐｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８２：３６８８−３６９２（１９８５）
；Ｈｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）７７：４
０３０−４０３４（１９８０）；ＥＰ５２，３２２；ＥＰ３６，６７６；ＥＰ８
８，０４６；ＥＰ１４３，９４９；ＥＰ１４２，６４１；日本国特許出願第８３
−１１８００８号；米国特許第４，４８５，０４５号および同第４，５４４，５
４５号；ならびにＥＰ１０２，３２４。通常、リポソームは、小さな（約２００
〜８００Å）ユニラメラ型であり、そこでは、脂質含有量は、約３０モル％コレ
ステロールよりも多く、選択された割合が、最適なエンドカインαポリぺプチド
治療のために調整される。

【０４００】 別の実施形態では、本発明の徐放性（ｓｙｓｔａｉｎｅｄ ｒｅｌｅａｓｅ）
組成物は、当該分野で公知の結晶処方物を含む。

【０４０１】 なおさらなる実施形態において、本発明の組成物は、ポンプによって送達され
る（Ｌａｎｇｅｒ，前出；Ｓｅｆｔｏｎ，ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍ
ｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１（１９８７）；Ｂｕｃｈｗａｌｄら，Ｓｕｒｇｅｒ
ｙ ８８：５０７（１９８０）；Ｓａｕｄｅｋら，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．
３２１：５７４（１９８９）を参照のこと）。他の制御放出系は、Ｌａｎｇｅｒ
（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３（１９９０））による総説にお
いて議論される。

【０４０２】 本発明の組成物は、単独で、または他のアジュバントと組み合わせて投与され
得る。本発明の組成物とともに投与され得るアジュバントとしては、以下が挙げ
られるが、それらに限定されない：ミョウバン、ミョウバンおよびデオキシコー
ル酸（ＩｍｍｕｎｏＡｇ）、ＭＴＰ−ＰＥ（Ｂｉｏｃｉｎｅ Ｃｏｒｐ．）、Ｑ
Ｓ２１（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）、ＢＣＧ、およびＭＰＬ。特定の実施
形態において、本発明の組成物は、ミョウバンと組み合わせて投与される。別の
特定の実施形態において、本発明の組成物は、ＱＳ−２１と組み合わせて投与さ
れる。本発明の組成物とともに投与され得るさらなるアジュバントとしては、以
下が挙げられるが、これらに限定されない：モノホスホリル脂質免疫調節剤、Ａ
ｄｊｕＶａｘ １００ａ、ＱＳ−２１、ＱＳ−１８、ＣＲＬ１００５、アルミニ
ウム塩、ＭＦ−５９、およびＶｉｒｏｓｏｍａｌアジュバント技術。本発明の組
成物とともに投与され得るワクチンとしては、以下が挙げられるが、これらに限
定されない：ＭＭＲ（麻疹、流行性耳下腺炎，風疹）、ポリオ（ｐｏｌｉｏ）、
水痘、破傷風／ジフテリア、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｂ型インフルエンザ、百日咳
（ｗｈｏｏｐｉｎｇ ｃｏｕｇｈ）、肺炎、インフルエンザ、ライム病、ロタウ
イルス、コレラ、黄熱病、日本脳炎、ポリオ（ｐｏｌｉｏｍｙｅｌｉｔｉｓ）、
狂犬病、腸チフス、および百日咳（ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）に対する防御に指向す
るワクチンならびに／またはＰＮＥＵＭＯＶＡＸ−２３^TM。組み合わせは、例え
ば、混合物として同時に、別々であるが同時にもしくは並行して；または逐次的
にかのいずれかで投与され得る。これは、組み合わされた薬剤が治療混合物とし
てともに投与される説明を含み、そして組み合わせた薬剤が、別々であるが同時
に（例えば、同じ個体へ別々の静脈ラインを通じての場合）投与される手順もま
た含む。「組み合わせ」投与は、第１に、続いて第２に与えられる化合物または
薬剤のうちの１つを別々に投与することをさらに含む。

【０４０３】 別の特定の実施形態では、本発明の組成物は、ＰＮＥＵＭＯＶＡＸ−２３^TMと
組合せて使用され、感染ならびに／または感染に関連する任意の疾患、障害、お
よび／もしくは状態を処置、予防、および／または診断する。１つの実施形態で
は、本発明の組成物は、ＰＮＥＵＭＯＶＡＸ−２３^TMと組合せて使用されて、任
意のグラム陽性菌感染ならびに／またはグラム陽性菌感染に関連する任意の疾患
、障害、および／もしくは状態を処置、予防、および／または診断する。別の実
施形態では、本発明の組成物は、ＰＮＥＵＭＯＶＡＸ−２３^TMと組合せて使用さ
れて、感染ならびに／またはＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属および／またはＳｔｒ
ｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属の１つ以上のメンバーに関連する任意の疾患、障害、お
よび／もしくは状態を処置、予防、および／または診断する。別の実施形態では
、本発明の組成物は、ＰＮＥＵＭＯＶＡＸ−２３^TMとの任意の組合せで使用され
て、感染ならびに／またはＢ群連鎖球菌の１つ以上のメンバーに関連する任意の
疾患、障害、および／もしくは状態を、処置、予防、および／または診断する。
別の実施形態では、本発明の組成物は、ＰＮＥＵＭＯＶＡＸ−２３^TMと組合せて
使用され、感染ならびに／またはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎ
ｉａｅに関連する任意の疾患、障害、および／もしくは状態を、処置、予防、お
よび／または診断する。

【０４０４】 本発明の組成物は、単独で、または他の治療的薬剤と組み合わせて投与され得
る。本発明の組成物とともに投与され得る治療的薬剤としては、以下が挙げられ
るが、それらに限定されない：化学療法剤、抗生物質、抗ウイルス剤、ステロイ
ド性および非ステロイド性の抗炎症剤、従来の免疫療法剤、ならびにサイトカイ
ン。組み合わせは、例えば、混合物として同時に、別々であるが同時にもしくは
並行して；または逐次的にかのいずれかで投与され得る。これは、組み合わされ
た薬剤が、治療混合物としてともに投与される説明を含み、そして組み合わせた
薬剤が、別々であるが同時に（例えば、同じ個体へ別々の静脈ラインを通じての
場合）投与される手順もまた含む。「組み合わせ」投与は、第１に、続いて第２
に与えられる化合物または薬剤のうちの１つを別々に投与することをさらに含む
。

【０４０５】 １つの実施形態において、本発明の組成物は、ＴＮＦファミリーのメンバーと
組み合わせて投与される。本発明の組成物とともに投与され得るＴＮＦ、ＴＮＦ
関連、またはＴＮＦ様の分子としては、以下が挙げられるが、これらに限定され
ない：可溶性形態のＴＮＦ−α、リンホトキシン−α、（ＬＴ−α、ＴＮＦ−β
としても公知）、ＬＴ−β（複合ヘテロトリマーＬＴ−α２−βにおいて見出さ
れた）、ＯＰＧＬ、ＦａｓＬ、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、４−１Ｂ
ＢＬ、ＤｃＲ３、ＯＸ４０Ｌ、ＴＮＦ−γ（国際公開番号ＷＯ９６／１４３２８
）、ＡＩＭ−Ｉ（国際公開番号ＷＯ９７／３３８９９）、ＡＩＭ−ＩＩ（国際公
開番号ＷＯ９７／３４９１１およびＷＯ９８／１８９２１）、ＡＰＲＩＬ（Ｊ．
Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８（６）１１８５−１１９０）、エンドカイン−α（国際
公開番号ＷＯ９８／０７８８０）、ＴＲ６（国際公開番号ＷＯ９８／３０６９４
）、ＯＰＧ、ＯＸ４０、神経増殖因子（ＮＧＦ）、ならびに可溶性形態のＦａｓ
、ＣＤ３０、ＣＤ２７、ＣＤ４０および４−ＩＢＢ、ＴＲ２（国際公開番号ＷＯ
９６／３４０９５）、ＤＲ３（国際公開番号ＷＯ９７／３３９０４）、ＤＲ４（
国際公開番号ＷＯ９８／３２８５６）、ＴＲ５（国際公開番号ＷＯ９８／３０６
９３）、ＴＲ６（国際公開番号ＷＯ９８／３０６９４）、ＴＲ７（国際公開番号
ＷＯ９８／４１６２９）、ＴＲＡＮＫ、ＴＲ９（国際公開番号ＷＯ９８／５６８
９２）、ＴＲ１０（国際公開番号ＷＯ９８／５４２０２）、３１２Ｃ２（国際公
開番号ＷＯ９８／０６８４２）、ならびにＴＲ１２。

【０４０６】 好ましい実施形態では、本発明の組成物は、単独あるいはＣＤ４０リガンド（
ＣＤ４０Ｌ）、ＣＤ４０の可溶性形態（例えば、ＡＶＲＥＮＤ）、ＣＤ４０Ｌの
生物学的に活性なフラグメント、改変体、もしくは誘導体、抗−ＣＤ４０Ｌ抗体
（例えば、アゴニスト抗体またはアンタゴニスト抗体）、および／または抗−Ｃ
Ｄ４０抗体（例えば、アゴニスト抗体またはアンタゴニスト抗体）と組合せて投
与される。

【０４０７】 特定の実施形態において、本発明の組成物を、抗レトロウイルス剤、ヌクレオ
シド逆トランスクリプターゼインヒビター、非ヌクレオシド逆トランスクリプタ
ーゼインヒビター、および／またはプロテアーゼインヒビターと共に投与する。
本発明の組成物と組み合わせて投与され得るヌクレオシド逆トランスクリプター
ゼインヒビターは、ＲＥＴＲＯＶＩＲ^TM（ジドブジン／ＡＺＴ）、ＶＩＤＥＸ^TM （ジダノシン／ｄｄＩ）、ＨＩＶＩＤ^TM（ザルシタビン（ｚａｌｃｉｔａｂｉｎ
ｅ／ｄｄＣ）／ｄｄＣ）、ＺＥＲＩＴ^TM（スタブジン（ｓｔａｖｕｄｉｎｅ）／
ｄ４Ｔ）、ＥＰＩＶＩＲ^TM（ラミブジン（ｌａｍｉｖｕｄｉｎｅ）／３ＴＣ）、
およびＣＯＭＢＩＶＩＲ^TM（ジドブジン／ラミブジン）を含むが、限定されない
。本発明の組成物と組み合わされて投与され得る非ヌクレオシド逆トランスクリ
プターゼインヒビターは、ＶＩＲＡＭＵＮＥ^TM（ネビラピン（ｎｅｖｉｒａｐｉ
ｎ））、ＲＥＳＣＲＩＰＴＯＲ^TM（デラビルジン（ｄｅｌａｖｉｒｄｉｎｅ））
、およびＳＵＳＴＩＶＡ^TM（エファビレンツ（ｅｆａｖｉｒｅｎｚ））を含むが
、これらに限定されない。本発明の組成物と組み合わせて投与され得るプロテア
ーゼインヒビターは、ＣＲＩＸＩＶＡＮ^TM（インジナビル（ｉｎｄｉｎａｖｉｒ
））、ＮＯＲＶＩＲ^TM（リトナビル（ｒｉｔｏｎａｖｉｒ））、ＩＮＶＩＲＡＳ
Ｅ^TM（サキナビル（ｓａｑｕｉｎａｖｉｒ）、およびＶＩＲＡＣＥＰＴ^TM（ネル
フィナビル（ｎｅｌｆｉｎａｖｉｒ））を含むが、これらに限定されない。特定
の実施形態において、抗レトロウイルス剤、ヌクレオシド逆トランスクリプター
ゼインヒビター、非ヌクレオシド逆トランスクリプターゼインヒビター、および
／またはプロテアーゼインヒビターは、本発明の組成物と任意に組み合わせて、
使用され、ＡＩＤＳを処置、予防、および／もしくは診断し得、ならびに／また
はＨＩＶ感染を処置、予防、および／もしくは診断し得る。

【０４０８】 他の実施形態において、本発明の組成物を抗日和見性感染剤と組み合わせて投
与され得る。本発明の組成物と組み合わせて投与され得る抗日和見性剤は、ＴＲ
ＩＭＥＴＨＯＰＲＩＭ−ＳＵＬＦＡＭＥＴＨＯＸＡＺＯＬＥ^TM、ＤＡＰＳＯＮＥ ^TM 、ＰＥＮＴＡＭＩＤＩＮＥ^TM、ＡＴＯＶＡＱＵＯＮＥ^TM、ＩＳＯＮＩＡＺＩＤ ^TM 、ＲＩＦＡＭＰＩＮ^TM、ＰＹＲＡＺＩＮＡＭＩＤＥ^TM、ＥＴＨＡＭＢＵＴＯＬ ^TM 、ＲＩＦＡＢＵＴＩＮ^TM、ＣＬＡＲＩＴＨＲＯＭＹＣＩＮ^TM、ＡＺＩＴＨＲＯ
ＭＹＣＩＮ^TM、ＧＡＮＣＩＣＬＯＶＩＲ^TM、ＦＯＳＣＡＲＮＥＴ^TM、ＣＩＤＯＦ
ＯＶＩＲ^TM、ＦＬＵＣＯＮＡＺＯＬＥ^TM、ＩＴＲＡＣＯＮＡＺＯＬＥ^TM、ＫＥＴ
ＯＣＯＮＡＺＯＬＥ^TM、ＡＣＹＣＬＯＶＩＲ^TM、ＦＡＭＣＩＣＯＬＶＩＲ^TM、Ｐ
ＹＲＩＭＥＴＨＡＭＩＮＥ^TM、ＬＥＵＣＯＶＯＲＩＮ^TM、ＮＥＵＰＯＧＥＮ^TM（
フィルグラスティム／Ｇ−ＣＳＦ）、およびＬＥＵＫＩＮＥ^TM（サーグラモステ
ィム（ｓａｒｇｒａｍｏｓｔｉｍ／ＧＭ−ＣＳＦ）を含むが、これらに限定され
ない。特定の実施形態において、本発明の組成物は、ＴＲＩＭＥＴＨＯＰＲＩＭ
−ＳＵＬＦＡＭＥＴＨＯＸＡＺＯＬＥ^TM、ＤＡＰＳＯＮＥ^TM、ＰＥＮＴＡＭＩＤ
ＩＮＥ^TM、および／またはＡＴＯＶＡＱＵＯＮＥ^TMと任意に組み合わせて使用さ
れ、日和見Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ肺炎感染を予防的に処置
し、予防し、および／または診断する。別の特定の実施形態において、本発明の
組成物は、ＩＳＯＮＩＡＺＩＤ^TM、ＲＩＦＡＭＰＩＮ^TM、ＰＹＲＡＺＩＮＡＭＩ
ＤＥ^TM、および／またはＥＴＨＡＭＢＵＴＯＬ^TMと任意に組み合わせて使用され
、日和見性Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ菌複合感染を予防的に処置
し、予防し、および／または診断する。別の特定の実施形態において、本発明の
組成物は、ＲＩＦＡＢＵＴＩＮ^TM、ＣＬＡＲＩＴＨＲＯＭＹＣＩＮ^TM、および／
またはＡＺＩＴＨＲＯＭＹＣＩＮ^TM、と任意に組み合わせて使用され、日和見性
Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ感染を予防的に処置、
予防、および／または診断する。別の特定の実施形態において、本発明の組成物
は、ＧＡＮＣＩＣＬＯＶＩＲ^TM、ＦＯＳＣＡＲＮＥＴ^TM、および／またはＣＩＤ
ＯＦＯＶＩＲ^TMと任意に組み合わせて使用され、日和見性サイトメガロウイルス
感染を予防的に処置、予防、および／または診断する。別の実施形態において、
本発明の組成物は、ＦＬＵＣＯＮＡＺＯＬＥ^TM、ＩＴＲＡＣＯＮＡＺＯＬＥ^TM、
および／またはＫＥＴＯＣＯＮＡＺＯＬＥ^TMと任意に組み合わせて使用され、日
和見性真菌感染を予防的に処置、予防、および／または診断する。別の特定の実
施形態において、本発明の組成物は、ＡＣＹＣＬＯＶＩＲ^TM、および／またはＦ
ＡＭＣＩＣＯＬＶＩＲ^TMと任意に組み合わせて使用され、日和見性Ｉ型単純疱疹
ウイルス感染および／またはＩＩ型単純疱疹ウイルス感染を予防的に処置、予防
、および／または診断する。別の実施形態において、本発明の組成物は、ＰＹＲ
ＩＭＥＴＨＡＭＩＮＥ^TMおよび／またはＬＥＵＣＯＶＯＲＩＮ^TMと任意に組み合
わせて使用され、日和見性Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ感染を予防的に
処置し、予防し、および／または診断する。別の実施形態において、本発明の組
成物は、ＬＥＵＣＯＶＯＲＩＮ^TMおよび／またはＮＥＵＰＯＧＥＮ^TMと任意に組
み合わせて使用され、日和見性細菌感染を予防的に処置し、予防し、および／ま
たは診断する。

【０４０９】 さらなる実施形態において、本発明の組成物を、抗ウイルス剤と組み合わせて
投与する。本発明の組成物と共に投与され得る抗ウイルス剤は、アシクロビル、
リバビリン、アマンタジン、およびレマンチジン（ｒｅｍａｎｔｉｄｉｎｅ）を
含むが、これらに限定されない。

【０４１０】 さらなる実施形態において、本発明の組成物を抗生物質剤と組み合わせて投与
する。本発明の組成物と共に投与され得る抗生物質剤は、アモキシリン、アミノ
酸糖体、β−ラクタム（糖ペプチド）、β−ラクタマーゼ、クリンダマイシン、
クロラムフェニコール、セファロスポリン、シプロフロキサシン、エリスロマイ
シン、フルオロキノロン類、マクロライド系抗生物質、メトロニダゾル、ペニシ
リン類、キノロン類、リファンピン、ストレプトマイシン、スルホンアミド、テ
トラサイクリン、トリペトプリム、トリメトプリム−スルファメトキサゾール、
およびバンコマイシンを含むが、これらに限定されない。

【０４１１】 本発明の組成物と組み合わせて投与され得る、従来の非特定の免疫抑制剤は、
ステロイド、シクロスポリン、シクロスポリンアナログ、シクロホスファミドＩ
Ｖ、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、アザチオプリン、ＦＫ−５０６、
１５−デオキシスペルグアリン（ｄｅｏｘｙｓｐｅｒｇｕａｌｉｎ）、およびＴ
細胞に応答する機能を抑制することにより作用する他の免疫抑制剤を含むが、こ
れらに限定されない。

【０４１２】 特定の実施形態において、本発明の組成物を、免疫抑制薬と組み合わせて投与
する。本発明の組成物と共に投与され得る免疫抑制薬製剤調製物は、ＯＲＴＨＯ
ＣＬＯＮＥ^TM（ＯＫＴ３）、ＳＡＮＤＩＭＭＵＮＥ^TM／ＮＥＯＲＡＬ^TM／ＳＡＮ
ＧＤＹＡ^TM（シクロスポリン）、ＰＲＯＧＲＡＦ^TM（タクロリムス）、ＣＥＬＬ
ＣＥＰＴ^TM（マイコフェノレート（ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌａｔｅ））、アザチオ
プリン、グルコルチコステロイド（ｇｌｕｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｉｄｓ）、
およびＲＡＰＡＭＵＮＥ^TM（シロリマス（ｓｉｒｏｌｉｍｕｓ））を含むが、こ
れらに限定されない。特定の実施形態において、免疫抑制剤は、器官または骨髄
移植の拒絶を妨ぐために使用され得る。

【０４１３】 好ましい実施形態において、本発明の組成物は、ステロイド治療と組合せて投
与される。本発明の組成物と組合せて投与され得るステロイドとしては、経口コ
ルチコステロイド、プレドニゾン、およびメチルプレドニゾロン（例えば、ＩＶ
メチルプレドニゾロン）が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形
態では、本発明の組成物は、プレドニゾンと組合せて投与される。さらなる特定
の実施形態では、本発明の組成物は、プレドニゾンおよび免疫抑制剤と組合せて
投与される。本発明の組成物およびプレドニゾンと共に投与され得る免疫抑制剤
は、本明細書中に記載される免疫抑制剤であり、そしてアザチオプリン、シクロ
ホスファミド（ｃｙｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、およびシクロホスファミド
ＩＶが挙げられるが、これらに限定されない。別の特定の実施形態では、本発明
の組成物は、メチルプレドニゾロンと組み合わせて投与される。さらなる特定の
実施形態では、本発明の組成物は、メチルプレドニゾロンおよび免疫抑制剤と組
合せて投与される。本発明の組成物およびメチルプレドニゾロンと共に投与され
得る免疫抑制剤は、本明細書中に記載される免疫抑制剤であり、そしてアザチオ
プリン、シクロホスファミド、およびシクロホスファミドＩＶが挙げられるが、
これらに限定されない。

【０４１４】 好ましい実施形態では、本発明の組成物は、抗マラリア薬と組合せて投与され
る。本発明の組成物と共に投与され得る抗マラリア薬としては、ヒドロキシクロ
ロキン、クロロキン、および／またはキナクリンが挙げられるが、これらに限定
されない。

【０４１５】 好ましい実施形態においては、本発明の組成物は、ＮＳＡＩＤと組み合わせて
投与される。

【０４１６】 非排他的な実施形態においては、本発明の組成物は、１、２、３、４、５、１
０、またはそれより多い以下の薬物と組み合わせて投与される：ＮＲＤ−１０１
（Ｈｏｅｃｈｓｔ Ｍａｒｉｏｎ Ｒｏｕｓｓｅｌ）、ジクロフェナク（Ｄｉｍ
ｅｔｈａｉｄ）、オキサプロジンカリウム（Ｍｏｎｓａｎｔｏ）、ｍｅｃａｓｅ
ｒｍｉｎ（Ｃｈｉｒｏｎ）、Ｔ−６１４（Ｔｏｙａｍａ）、ｐｅｍｅｔｒｅｘｅ
ｄ ｄｉｓｏｄｉｕｍ（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ）、ａｔｒｅｌｅｕｔｏｎ（Ａｂｂ
ｏｔｔ）、ｖａｌｄｅｃｏｘｉｂ（Ｍｏｎｓａｎｔｏ）、ｅｌｔｅｎａｃ（Ｂｙ
ｋ Ｇｕｌｄｅｎ）、ｃａｍｐａｔｈ、ＡＧＭ−１４７０（Ｔａｋｅｄａ）、Ｃ
ＤＰ−５７１（Ｃｅｌｌｔｅｃｈ Ｃｈｉｒｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＭ−１０１
（ＣａｒｂｏＭｅｄ）、ＭＬ−３０００（Ｍｅｒｃｋｌｅ）、ＣＢ−２４３１（
ＫＳ Ｂｉｏｍｅｄｉｘ）、ＣＢＦ−ＢＳ２（ＫＳ Ｂｉｏｍｅｄｉｘ）、ＩＬ
−１Ｒａ遺伝子治療（Ｖａｌｅｎｔｉｓ）、ＪＴＥ−５２２（Ｊａｐａｎ Ｔｏ
ｂａｃｃｏ）、ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ（Ａｎｇｉｏｔｅｃｈ）、ＤＷ−１６６Ｈ
Ｃ（Ｄｏｎｇ Ｗｈａ）、ｄａｒｂｕｆｅｌｏｎｅ ｍｅｓｙｌａｔｅ（Ｗａｒ
ｎｅｒ−Ｌａｍｂｅｒｔ）、可溶性ＴＮＦレセプター １（ｓｙｎｅｒｇｅｎ；
Ａｍｇｅｎ）、ＩＰＲ−６００１（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｐｈａｒｍａ
ｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、ｔｒｏｃａｄｅ（Ｈｏｆｆｍａｎ−Ｌ
ａ Ｒｏｃｈｅ）、ＥＦ−５（Ｓｃｏｔｉａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ
）、ＢＩＩＬ−２８４（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）、ＢＩＩ
Ｆ−１１４９（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）、ＬｅｕｋｏＶａ
ｘ（Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｃｓ）、ＭＫ−６６３（Ｍｅｒｃｋ）、ＳＴ−１４８
２（Ｓｉｇｍａ−Ｔａｕ）、およびｂｕｔｉｘｏｃｏｒｔ ｐｒｏｐｉｏｎａｔ
ｅ（ＷａｒｎｅｒＬａｍｂｅｒｔ）。

【０４１７】 好ましい実施形態において、本発明の組成物は、１、２、３、４、５またはそ
れ以上の以下の薬物と組み合わせて投与される：メトトレキサート、スルファサ
ラジン、金チオリンゴ酸ナトリウム、オーラノフィン、シクロスポリン、ペニシ
ラミン、アザチオプリン、抗マラリア薬（例えば、本明細書中で記載されるよう
な）、シクロホスファミド、クロランブシル、金、ＥＮＢＲＥＬ^TM（Ｅｔａｎｅ
ｒｃｅｐｔ）、抗ＴＮＦ抗体、およびプレドニゾロン。

【０４１８】 より好ましい実施形態においては、本発明の組成物は、抗マラリア薬、メトト
レキサート、抗ＴＮＦ抗体、ＥＮＢＲＥＬ^TMおよび／またはスルファサラジンと
組み合わせて投与される。１つの実施形態においては、本発明の組成物は、メト
トレキサートと組み合わせて投与される。別の実施形態においては、本発明の組
成物は、抗ＴＮＦ抗体と組み合わせて投与される。別の実施形態においては、本
発明の組成物は、メトトレキサートおよび抗ＴＮＦ抗体と組み合わせて投与され
る。別の実施形態においては、本発明の組成物は、スルファサラジンと組み合わ
せて投与される。別の実施形態においては、本発明の組成物は、メトトレキサー
ト、抗ＴＮＦ抗体、およびスルファサラジンと組み合わせて投与される。別の実
施形態においては、本発明の組成物は、ＥＮＢＲＥＬ^TMと組み合わせて投与され
る。別の実施形態においては、本発明の組成物は、ＥＮＢＲＥＬ^TMおよびメトト
レキサートと組み合わせて投与される。別の実施形態においては、本発明の組成
物は、ＥＮＢＲＥＬ^TM、メトトレキサートおよびスルファサラジンと組み合わせ
て投与される。別の実施形態においては、本発明の組成物は、ＥＮＢＲＥＬ^TM、
メトトレキサートおよびスルファサラジンと組み合わせて投与される。他の実施
形態においては、１以上の抗マラリア薬が、上記列挙される組み合わせの１つと
組み合わされる。特定の実施形態においては、本発明の組成物は、抗マラリア薬
（例えば、ヒドロキシクロロキン）、ＥＮＢＲＥＬ^TM、メトトレキサートおよび
スルファサラジンと組み合わせて投与される。別の特定の実施形態においては、
本発明の組成物は、抗マラリア薬（例えば、ヒドロキシクロロキン）、スルファ
サラジン、抗ＴＮＦ抗体、およびメトトレキサートと組み合わせて投与される。

【０４１９】 さらなる実施形態においては、本発明の組成物は、単独で、または１以上の静
脈内免疫グロブリン調製物と組み合わせて投与される。本発明の組成物と共に投
与され得る静脈内免疫グロブリン調製物としては、ＧＡＭＭＡＲ^TM、ＩＶＥＥＧ
ＡＭ^TM、ＳＡＮＤＯＧＬＯＢＵＬＩＮ^TM、ＧＡＭＭＡＧＡＲＤ Ｓ／Ｄ^TM、およ
びＧＡＭＩＭＵＮＥ^TMが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態
においては、本発明の組成物は、移植治療（例えば、骨髄移植）において、静脈
内免疫グロブリン調製物と組み合わせて投与される。

【０４２０】 さらなる実施形態においては、本発明の組成物は、単独で、または抗炎症薬と
組み合わせて投与される。本発明の組成物と共に投与され得る抗炎症薬としては
、以下が挙げられるが、これらに限定されない：グルココルチコイドおよび非ス
テロイド系抗炎症薬、アミノアリールカルボン酸誘導体、アリール酢酸誘導体、
アリール酪酸誘導体、アリールカルボン酸、アリールプロピオン酸誘導体、ピラ
ゾール、ピラゾロン、サリチル酸誘導体、チアジンカルボキサミド、ｅ−アセト
アミドカプロン酸、Ｓ−アデノシルメチオニン、３−アミノ−４−ヒドロキシ酪
酸、アミキセトリン（ａｍｉｘｅｔｒｉｎｅ）、ベンダザック、ベンジダミン、
ブコローム、ジフェンピラミド（ｄｉｆｅｎｐｉｒａｍｉｄｅ）、ジタゾール（
ｄｉｔａｚｏｌ）、エモルファゾン、グアイアズレン（ｇｕａｉａｚｕｌｅｎｅ
）、ナブメトン、ニメスリド（ｎｉｍｅｓｕｌｉｄｅ）、オルゴテイン（ｏｒｇ
ｏｔｅｉｎ）、オキサセプロール（ｏｘａｃｅｐｒｏｌ）、パラニリン（ｐａｒ
ａｎｙｌｉｎｅ）、ペリゾキサール、ピフォキシム（ｐｉｆｏｘｉｍｅ）、プロ
クアゾン（ｐｒｏｑｕａｚｏｎｅ）、プロキサゾール（ｐｒｏｘａｚｏｌｅ）、
およびテニダップ（ｔｅｎｉｄａｐ）。

【０４２１】 別の実施形態においては、本発明の組成物は、化学療法薬と組み合わせて投与
される。本発明の組成物と共に投与され得る化学療法薬としては、以下が挙げら
れるがこれらに限定されない：抗生物質誘導体（例えば、ドキソルビシン、ブレ
オマイシン、ダウノルビシン、およびダクチノマイシン）；抗エストロゲン剤（
例えば、タモキシフェン）；代謝拮抗剤（例えば、フルオロウラシル、５−ＦＵ
、メトトレキサート、フロクスウリジン（ｆｌｏｘｕｒｉｄｉｎｅ）、インター
フェロンα−２ｂ、グルタミン酸、プリカマイシン（ｐｌｉｃａｍｙｃｉｎ）、
メルカプトプリン、および６−チオグアニン）；細胞傷害性薬剤（例えば、カル
ムスチン、ＢＣＮＵ、ロムスチン（ｌｏｍｕｓｔｉｎｅ）、ＣＣＮＵ、シトシン
アラビノシド、シクロホスファミド、エストラムスチン、ヒドロキシ尿素、プロ
カルバジン、マイトマイシン、ブスルファン、ｃｉｓ−プラチン、およびビンク
リスチンスルフェート）；ホルモン（例えば、メドロキシプロゲステロン、エス
トラムスチンホスフェートナトリウム、エチニルエストラジオール、エストラジ
オール、メゲストロールアセテート、メチルテストステロン、ジエチルスチルベ
ストロールジホスフェート、クロロトリアニセン、およびテストラクトン）；ナ
イトロジェンマスタード誘導体（例えば、メファレン（ｍｅｐｈａｌｅｎ）、コ
ラムブシル（ｃｈｏｒａｍｂｕｃｉｌ）、メクロルエタミン（ｍｅｃｈｌｏｒｅ
ｔｈａｍｉｎｅ）（ナイトロジェンマスタード）およびチオテパ）；ステロイド
および組み合わせ（例えば、ベタメタゾン（ｂｅｔｈａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）ナ
トリウムホスフェート）；ならびにその他（例えば、ジカルバジン（ｄｉｃａｒ
ｂａｚｉｎ）、アスパラギナーゼ、ミトタン（ｍｉｔｏｔａｎｅ）、硫酸ビンク
リスチン、ビンブラスチンスルフェート、およびエトポシド）。

【０４２２】 特定の実施形態においては、本発明の組成物は、ＣＨＯＰ（シクロホスファミ
ド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、およびプレドニゾン）またはＣＨＯＰの
構成成分の任意の組み合わせと組み合わせて投与される。別の実施形態において
は、本発明の組成物は、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂと組み合わせて投与される。さらな
る実施形態においては、本発明の組成物は、ＲｉｔｕｘｍａｂおよびＣＨＯＰ、
またはＲｉｔｕｘｍａｂおよびＣＨＯＰの構成成分の任意の組み合わせと共に投
与される。

【０４２３】 さらなる実施形態においては、本発明の組成物は、サイトカインと組み合わせ
て投与される。本発明の組成物と共に投与され得るサイトカインとしては、以下
が挙げられるが、これらに限定されない：ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ２、
ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ１０、ＩＬ１２、ＩＬ１３、Ｉ
Ｌ１５、抗−ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、Ｔ
ＮＦ−α、およびＴＮＦ−β。別の実施形態においては、本発明の組成物は、任
意のインターロイキンと共に投与され得、そのインターロイキンとしては、以下
が挙げられるが、これらに限定されない：ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、
ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、Ｉ
Ｌ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、Ｉ
Ｌ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２１、お
よびＩＬ−２２。好ましい実施形態においては、本発明の組成物は、ＩＬ４およ
びＩＬ１０と組み合わせて投与される。

【０４２４】 さらなる実施形態においては、本発明の組成物は、ケモカインと共に投与され
る。別の実施形態においては、本発明の組成物は、ケモカインβ−８、ケモカイ
ンβ−１、および／またはマクロファージ炎症性タンパク質−４と共に投与され
る。好ましい実施形態においては、本発明の組成物は、ケモカインβ−８と共に
投与される。

【０４２５】 さらなる実施形態においては、本発明の組成物は、ＩＬ−４アンタゴニストと
共に投与される。本発明の組成物と共に投与され得るＩＬ−４アンタゴニストと
しては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：可溶性ＩＬ−４レセプタ
ーポリペプチド、可溶性ＩＬ−４レセプターポリペプチドの多量体形態；ＩＬ−
４によって誘発される生物学的シグナルを変換することなく、ＩＬ−４レセプタ
ーと結合する、抗ＩＬ−４レセプター抗体、１以上のＩＬ−４レセプターへのＩ
Ｌ−４の結合をブロックする、抗ＩＬ−４抗体、およびＩＬ−４レセプターに結
合するが、ＩＬ−４によって誘発される生物学的シグナルを変換しない、ＩＬ−
４のムテイン。好ましくは、この方法に従って使用される抗体は、モノクロナー
ル抗体（抗体フラグメント（例えば、本明細書中に記載されるような抗体フラグ
メント）を含む）である。

【０４２６】 さらなる実施形態においては、本発明の組成物は、造血成長因子と組み合わせ
て投与される。本発明の組成物と共に投与され得る造血成長因子としては、ＬＥ
ＵＫＩＮＥ^TM（ＳＡＲＧＲＡＭＯＳＴＩＭ^TM）およびＮＥＵＰＯＧＥＮ^TM（ＦＩ
ＬＧＲＡＳＴＩＭ^TM）が挙げられるが、これらに限定されない。

【０４２７】 さらなる実施形態においては、本発明の組成物は、線維芽細胞成長因子と組み
合わせて投与される。本発明の組成物と共に投与され得る線維芽細胞成長因子と
しては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２
、ＦＧＦ−３、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−６、ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−８
、ＦＧＦ−９、ＦＧＦ−１０、ＦＧＦ−１１、ＦＧＦ−１２、ＦＧＦ−１３、Ｆ
ＧＦ−１４、およびＦＧＦ−１５。

【０４２８】 さらに、本発明の組成物は、単独で、または放射線療法が挙げられるがこれに
限定されない、他の治療レジメンと組み合わせて投与され得る。このような組み
合わせの治療は、連続的におよび／または同時に投与され得る。

【０４２９】 （治療的使用） 本発明はさらに、抗体を基礎とした治療に関し、これは、本発明の抗体を、１
つ以上の記載された障害を処置するために、動物、好ましくは哺乳動物、そして
最も好ましくはヒトの患者に投与する工程を包含する。本発明の治療的化合物と
しては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：本発明の抗体（本明細書
中に記載されるような、それらのフラグメント、アナログおよび誘導体を含む）
ならびに本発明の抗体をコードする核酸（本明細書中に記載されるようなそれら
のフラグメント、アナログおよび誘導体を含む）。本発明の抗体は、本発明のポ
リペプチドの異常な発現および／または活性に関連する疾患、障害または状態を
処置、阻害または予防するために使用され得、それらの疾患、障害または状態と
しては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：本明細書中に記載される
１以上の任意の疾患、障害または状態（例えば、このような疾患または障害（自
己免疫溶血性貧血、自己免疫新生児血小板減少症、突発性血小板減少性紫斑病、
自己免疫血球減少症、溶血性貧血、抗リン脂質症候群、皮膚炎、アレルギー性脳
脊髄炎、心筋炎、再発性多発性軟骨炎、リウマチ性心疾患、糸球体腎炎（例えば
、ＩｇＡ腎症）、多発性硬化症、神経炎、ブドウ膜眼炎、多発性内分泌腺症、紫
斑病（例えば、Ｈｅｎｌｏｃｈ−Ｓｃｏｅｎｌｅｉｎ紫斑病）、ライター病、ス
ティッフマン症候群、自己免疫性肺炎、ギャン−バレー症候群、インシュリン依
存性真性糖尿病、および自己免疫炎症眼、自己免疫甲状腺炎、甲状腺機能不全症
（すなわち、橋本甲状腺炎）、全身性エリテマトーゼス、グッドパスチャー症候
群、天疱瘡、レセプター自己免疫（例えば、グレーヴズ病、重症筋無力症、およ
びインシュリン抵抗性）、自己免疫溶血性貧血、自己免疫血小板減少性紫斑病、
慢性関節リウマチ、抗コラーゲン抗体を伴う強皮症（ｓｃｈｌｅｒｏｄｅｒｍａ
）、混合結合組織病、多発性筋炎／皮膚筋炎、悪性貧血、特発性アディソン病、
不妊症、糸球体腎炎（例えば、一次糸球体腎炎およびＩｇＡ腎症）、水疱性類天
疱瘡、シェーグレン症候群、真性糖尿病、およびアドレナリン作動性薬剤耐性（
喘息または嚢胞性線維症を伴うアドレナリン作動性薬剤耐性を含む）、活動性慢
性肝炎（ｃｈｒｏｎｉｃ ａｃｔｉｖｅ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ）、原発性胆汁性
肝硬変、他の内分泌腺不全、白斑、脈管炎、ＭＩ後、心臓切開症候群、じんま疹
、アトピー性皮膚炎、喘息、炎症性筋障害、ならびに他の炎症性、肉芽種性、変
性および萎縮性障害、ならびに免疫不全が挙げられるが、これらに限定されない
）に関連する、自己免疫疾患、障害または状態、あるいは対宿主性移植片病およ
び移植片拒絶を含むがこれらに限定されない疾患または障害に関連する状態。

【０４３０】 特定の実施形態においては、本発明の抗体は、慢性関節リウマチを処置、阻害
、予後の判定、診断または予防するために使用される。

【０４３１】 別の特定の実施形態においては、本発明の抗体は、全身性エリテマトーデスを
処置、阻害、予後の判定、診断または予防するために使用される。

【０４３２】 本発明のポリペプチドの異常な発現および／または活性に関連する疾患および
障害の処置および／または予防としては、これらの疾患および障害に関連する症
状の軽減が挙げられるが、これに限定されない。本発明の抗体は、当該分野で公
知であるか、または本明細書中に記載される、薬学的に受容可能な組成物で提供
され得る。

【０４３３】 本発明の抗体が治療的に使用され得る様式の概要としては、身体における局所
的もしくは全身的な本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドの結合、ま
たは抗体の直接的な細胞傷害性による様式（例えば、補体（ＣＤＣ）もしくはエ
フェクター細胞（ＡＤＣＣ）によって媒介されるような）を含む。これらのアプ
ローチのいくつかは、以下により詳細に記載される。本明細書に提供される教示
によって、当業者は、過度の実験なして、診断目的、モニタリング目的または治
療目的のための本発明の抗体の使用法を理解する。

【０４３４】 本発明の抗体は、例えば、この抗体と相互作用するエフェクター細胞の数また
は活性を増加させるために役立つ、他のモノクロナール抗体もしくはキメラ抗体
、またはリンホカインもしくは造血成長因子（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−３およ
びＩＬ−７など）と組み合わせて、有利に使用され得る。

【０４３５】 本発明の抗体は、単独で、または他の型の処置（例えば、放射線治療、化学療
法、ホルモン治療、免疫療法および抗腫瘍剤）と組み合わせて投与され得る。一
般に、（抗体の場合は）患者と同じ種である、種起源または種反応性の生成物の
投与が好ましい。従って、好ましい実施形態においては、ヒト抗体、フラグメン
ト誘導体、アナログ、または核酸が、治療または予防のためにヒト患者に投与さ
れる。

【０４３６】 本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド（そのフラグメントを含む）に
関するイムノアッセイ、およびそれらに関連した障害の治療の両方のために、本
発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対する、高親和性および／または
強力な、インビボでの阻害抗体および／または中和抗体、そのフラグメント、ま
たはその領域を使用することが好ましい。このような抗体、フラグメント、また
は領域は、好ましくは、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド（そのフラグメン
トを含む）に対して親和性を有する。好ましい結合親和性としては、５×１０^-6 Ｍ、１０^-6Ｍ、５×１０^-7Ｍ、１０^-7Ｍ、５×１０^-8Ｍ、１０^-8Ｍ、５×１０^-9 Ｍ、１０^-9Ｍ、５×１０^-10Ｍ、１０^-10Ｍ、５×１０^-11Ｍ、１０^-11Ｍ、５×１
０^-12Ｍ、１０^-12Ｍ、５×１０^-13Ｍ、１０^-13Ｍ、５×１０^-14Ｍ、１０^-14Ｍ、
５×１０^-15Ｍ、および１０^-15Ｍより小さい解離定数すなわちＫｄを有する結合
親和性が挙げられる。

【０４３７】 １つの実施形態においては、本発明は、本発明のポリペプチドを含む組成物（
例えば、異種ポリペプチド、異種核酸、トキシン、またはプロドラッグに会合す
るエンドカインαポリペプチドまたは抗エンドカインα抗体を含む組成物）を、
標的細胞に送達し、それらの表面上にエンドカインαの膜結合形態を発現するか
、あるいはそれらの表面上にエンドカインαレセプター（例えば、ＴＲ１１）を
発現する方法を提供する。本発明のエンドカインαポリペプチドまたは抗エンド
カインα抗体は、疎水性、親水性、イオン性および／または共有結合性の相互作
用を介して、異種ポリペプチド、異種核酸、トキシンまたはプロドラッグに会合
し得る。

【０４３８】 １つの実施形態においては、本発明は、異種ポリペプチドまたは異種核酸に会
合する本発明のポリペプチド（例えば、エンドカインαまたは抗エンドカインα
抗体）を投与することによる、本発明の組成物の特異的送達のための方法を提供
する。１つの例においては、本発明は、治療的タンパク質を標的細胞に送達する
ための方法を提供する。別の例においては、本発明は、一本鎖核酸（例えば、ア
ンチセンスもしくはリボザイム）または二本鎖核酸（例えば、細胞のゲノムに組
み込まれ得るか、またはエピソームにて複製し得、そして転写され得るＤＮＡ）
を標的細胞に送達するための方法を提供する。

【０４３９】 別の実施形態においては、本発明は、本発明のポリペプチド（例えば、エンド
カインαポリペプチドまたは抗エンドカインα抗体）をトキシンまたは細胞傷害
性プロドラッグと共に投与することによる、細胞の特異的破壊（例えば、腫瘍細
胞の破壊）のための方法を提供する。

【０４４０】 特定の実施形態においては、本発明は、エンドカインαポリペプチドをトキシ
ンまたは細胞傷害性プロドラッグと共に投与することにより、それらの表面上に
ＴＲ１１を発現する細胞（例えば、活性化Ｔ細胞および／またはＴ細胞および／
またはＢ細胞関連白血病もしくはリンパ腫）の特異的破壊のための方法を提供す
る。

【０４４１】 別の特異的な実施形態においては、本発明は、抗エンドカインα抗体をトキシ
ンまたは細胞傷害性プロドラッグと共に投与することによる、それらの表面上に
エンドカインαの膜結合形態を発現する細胞（例えば、内皮細胞）の特異的破壊
のための方法を提供する。

【０４４２】 「トキシン」とは、内因性の細胞傷害性エフェクター系、ラジオアイソトープ
、ホロトキシン（ｈｏｌｏｔｏｘｉｎ）、改変型トキシン、トキシンの触媒サブ
ユニット、細胞毒素（細胞傷害性薬剤）または細胞中もしくは細胞表面には通常
存在しない規定の条件下で細胞死を引き起こす任意の分子もしくは酵素を結合お
よび活性化する化合物を意味する。本発明の方法に従って使用され得るトキシン
としては、当該分野で公知のラジオアイソトープ、固有のまたは誘導された内因
性の細胞傷害性エフェクター系に結合する化合物（例えば、抗体（またはその一
部を含む補体結合））、チミジンキナーゼ、エンドヌクレアーゼ、ＲＮＡｓｅ、
αトキシン、リシン、アブリン、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａ、ジフテリア
毒素、サポリン、モモルジン（ｍｏｍｏｒｄｉｎ）、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ
）、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、αサルシン（ｓａｒｃｉｎ）およびコレ
ラ毒素が含まれるが、これらに限定されない。「トキシン」はまた、細胞成長抑
止剤もしくは細胞破壊剤、治療薬剤または放射性金属イオン（例えば、α−放射
体（例えば、²¹³Ｂｉまたは他の放射性同位体（例えば、¹⁰³Ｐｄ、¹³³Ｘｅ、¹³¹ Ｉ、⁶⁸Ｇｅ、⁵⁷Ｃｏ、⁶⁵Ｚｎ、⁸⁵Ｓｒ、³²Ｐ、³⁵Ｓ、⁹⁰Ｙ、¹⁵³Ｓｍ、¹⁵³Ｇｄ、 ¹⁶⁹ Ｙｂ、⁵¹Ｃｒ、⁵⁴Ｍｎ、⁷⁵Ｓｅ、¹¹³Ｓｎ、⁹⁰イットリウム、¹¹⁷スズ、¹⁸⁶レ
ニウム、¹⁶⁶ホルミウムおよび¹⁸⁸レニウム）；発光標識（例えば、ルミノール）
；ならびに蛍光標識（例えば、フルオレセインおよびローダミン）ならびにビオ
チンを含む。

【０４４３】 当該分野において公知の技術は、本発明の標識タンパク質（抗体を含む）に適
用され得る。このような技術としては、二官能性結合剤の使用（例えば、米国特
許第５，７５６，０６５号；同第５，７１４，６３１号；同第５，６９６，２３
９号；同第５，６５２，３６１号；同第５，５０５，９３１号；同第５，４８９
，４２５号；同第５，４３５，９９０号；同第５，４２８，１３９号；同第５，
３４２，６０４号；同第５，２７４，１１９号；同第４，９９４，５６０号；お
よび同第５，８０８，００３号を参照のこと；これら各々の内容は、本明細書中
にその全体が参考として援用される）が挙げられるが、これらに限定されない。
細胞毒素または細胞傷害性薬剤は、細胞に対して有害な任意の薬剤を含む。例と
しては、以下が挙げられる：パクリタキソール（ｐａｃｌｉｔａｘｏｌ）、サイ
トカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、
エトポシド、テノポシド（ｔｅｎｏｐｏｓｉｄｅ）、ビンクリスチン、ビンブラ
スチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラ
シンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デ
ヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リド
カイン、プロプラノロールおよびピューロマイシンならびにこれらのアナログま
たはホモログ。治療薬剤としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない
：代謝拮抗剤（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグ
アニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例
えば、メクロレタミン（ｍｅｃｈｌｏｒｅｔｈａｍｉｎｅ）、チオエパ（ｔｈｉ
ｏｅｐａ）クロランブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロ
ムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロトスファミド（ｃｙｃｌｏｔｈｏｓｐｈａｍｉｄ
ｅ）、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイ
シンＣ、およびｃｉｓ−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン
）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（以前は、ダウノマイシン）
およびドキソルビジン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前はアクチ
ノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシンおよびアントラマイシン（ＡＭ
Ｃ））、ならびに有糸分裂阻害剤（例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチ
ン）。

【０４４４】 「細胞障害性プロドラッグ」とは、通常、細胞に存在する酵素によって細胞障
害性化合物に転化された非毒性の化合物が意味する。本発明の方法に従って使用
され得る細胞障害性プロドラッグとしては、安息香酸カラシアルキル化試薬のグ
ルタミル誘導体、エトポシドまたはマイトマイシンＣのリン酸誘導体、シトシン
アラビノシド、ダウノルビシン、およびドキソルビシンのフェノキシアセトアミ
ド誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。

【０４４５】 本発明の組成物は、機能的な内因性抗体分子を産生できない動物、または他の
損なわれた免疫を有する動物（上記の動物が挙げられるが、これらに限定されず
、そして、トランスジェニック動物もまた挙げられる）に投与され得る。しかし
、この動物は、他の動物由来の再構成または部分的に再構築された免疫系を使用
してヒト免疫グロブリン分子を産生可能である（例えば、刊行されたＰＣＴ公開
番号ＷＯ ９８／２４８９３、ＷＯ ９６／３４０９６、ＷＯ ９６／３３７３
５、ＷＯ ９１／１０７４１を参照のこと）。本発明の組成物としては、エンド
カイン（ｅｎｄｏｋｉｎｅ）−αポリペプチドおよびポリヌクレオチドならびに
そのアゴニストおよびアンタゴニスト、抗体、アンチ抗体などが挙げられるが、
これらに限定されない。

【０４４６】 本明細書中に記載される組成物は、特定の抗体に対する免疫応答性を増強する
ワクチンアジュバントとして使用され得る。特定の実施形態において、ワクチン
アジュバントは、本明細書中に記載されるエンドカインαポリペプチドである。
別の特定の実施形態において、ワクチンアジュバントは、本明細書中に記載され
るエンドカインαポリヌクレオチドである（すなわち、エンドカインαポリヌク
レオチドは、遺伝的ワクチンアジュバントである）。本明細書中に議論されるよ
うに、エンドカインαポリヌクレオチドは、当該分野で公知の技術（リポソーム
の送達、組み換えベクター送達、裸のＤＮＡの注入、および遺伝子銃送達を含む
が、これらに限定されない）を用いて投与され得る。

【０４４７】 本明細書中に記載される組成物はまた、腫瘍特異的な免疫応答を増強するため
に使用されるアジュバントであり得る。

【０４４８】 本発明の組成物をアジュバントとして使用する増強され得る抗ウイルス免疫応
答としては、ウイルスおよびウイルス関連疾患または本明細書中に記載されるか
、あるいは当該分野で公知の別の症状が挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態において、本発明の組成物は、以下：ＡＩＤＳ、髄膜炎、デング
熱、ＥＢＶ、および肝炎（例えば、Ｂ型肝炎）からなる群より選択されるウイル
ス、疾患、または症状に対する免疫応答を増強するアジュバントとして使用され
る。別の特定の実施形態において、本発明の組成物は、以下：ＨＩＶ／ＡＩＤＳ
、ＲＳウイルス、デング熱、ロタウイルス、日本脳炎、インフルエンザＡおよび
Ｂ、パラインフルエンザ、麻疹、サイトメガロウイルス、狂犬病、フニン、チク
ングニヤ、リフトバレー熱、単純ヘルペス、および黄熱病からなる群より選択さ
れるウイルス、疾患、または症状に対する免疫応答を増強するためのアジュバン
トとして使用される。別の特定の実施形態において、本発明の組成物は、ＨＩＶ
ｇｐ１２０抗原に対する免疫応答を増強するためのアジュバントとして使用さ
れる。

【０４４９】 本発明の組成物をアジュバントとして使用して増強され得る抗細菌または抗真
菌免疫応答としては、細菌または真菌および本明細書中で記載されるか、または
当該分野で公知の他の疾患または症状に関連する細菌または真菌が挙げられる。
特定の実施形態において、本発明の組成物は、以下：破傷風、ジフテリア、ボツ
リスム、および髄膜炎Ｂ型からなる群より選択される細菌または真菌、疾患、ま
たは症状免疫応答を増強するためのアジュバントとして使用される。別の特定の
実施形態において、本発明の組成物は、以下：コレラ菌、らい菌、チフス菌、パ
ラチフス菌、Ｍｅｉｓｓｅｒｉａｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓ、肺炎連鎖球菌、Ｂ群連
鎖球菌属、赤痢菌属、腸毒性大腸菌、腸出血性大腸菌、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕ
ｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、およびプラスモディウム属（マラリア）からなる群より選
択される細菌または真菌、疾患または症状に対する免疫応答を増強するためのア
ジュバントとして使用される。

【０４５０】 アジュバントとして本発明の組成物を使用する増強され得る抗寄生生物免疫応
答は、寄生生物および本明細書中に記載されるか、または当該分野において公知
の他の寄生生物に関連した疾患または症状を含む。特定の実施形態において、本
発明の組成物は、寄生生物に対する免疫応答を増強するアジュバントとして使用
される。別の特定の実施形態において、本発明の組成物は、プラスモディウム属
（マラリア）に対する免疫応答を増強するアジュバントとして使用される。

【０４５１】 本発明の組成物は、病原体に対するＢまたはＴ細胞の反応性の刺激物質として
使用され得る。

【０４５２】 本発明の組成物は、免疫抑制療法を受ける前に個々の免疫状態を上昇させる薬
剤として使用され得る；高度な親和性抗体を誘導するための薬剤として；血清免
疫グロブリン濃度を増加するための薬剤として；免疫無防備状態の個体の回復を
促進するための薬剤として；老いた集団の中で免疫応答性をブーストするための
薬剤として；および骨髄移植および／または他の移植（例えば、同種異系または
異種の器官移植）前、または最中、または後の免疫系のエンハンサーとして。

【０４５３】 移植に関して、本発明の組成物は、移植の前、同時および／または後に投与さ
れ得る。特定の実施形態において、本発明の組成物は、Ｔ細胞集団の回復の開始
の前に、移植後に投与される。別の特定の実施形態において、本発明の組成物は
、Ｔ細胞集団の回復の開始後の移植の後、初めに投与されが、Ｂ細胞の集団の完
全な回復の前である。

【０４５４】 本発明の組成物は、Ｂ細胞および／またはＴ細胞免疫不全個体（例えば、部分
的または完全な脾摘出を受けた個体）間の免疫応答性をブーストするための薬剤
として使用され得る。エンドカインαポリペプチドまたは本発明のポリヌクレオ
チド、あるいはそのアゴニストの投与によって回復され得るか、または処置され
得るＢ細胞免疫不全としては、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）−Ｘ結合、ＳＣＩ
Ｄ−常染色体、アデノシンデアミナーゼ欠損（ＡＤＡ欠損）、Ｘ−結合無ガンマ
グロブリン血症（ＸＬＡ）、Ｂｒｕｔｏｎ病、先天性無ガンマグロブリン血症、
Ｘ結合乳児無ガンマグロブリン血症、後天性無ガンマグロブリン血症、成人発症
無ガンマグロブリン血症、後期発症無ガンマグロブリン血症、低ガンマグロブリ
ン血症、高ガンマグロブリン血症、乳児の過渡性高ガンマグロブリン血症、不特
定の高ガンマグロブリン血症、無ガンマグロブリン血症、分類不能型免疫不全（
ＣＶＩＤ）（後天性）、ヴィスコット‐オールドリッチ症候群（ＷＡＳ）、過剰
ＩｇＭを伴うＸ結合免疫不全、過剰ＩｇＭを伴う非Ｘ結合免疫不全、選択的Ｉｇ
Ａ欠損、ＩｇＧサブクラス欠損（ＩｇＡ欠損を伴うか、または伴わない）、正常
または上昇したＩｇｓを伴う抗体不全、胸腺腫を伴う免疫欠損、Ｉｇ重鎖欠損、
カッパ鎖欠損、Ｂ細胞リンパ増殖性障害（ＢＬＰＤ）、選択性ＩｇＭ免疫欠損、
劣性無ガンマグロブリン血症（スイス型）、網様発育不全、新生児好中球減少症
、重症の先天性白血球減少症、免疫欠損を有するリンパ形成不全−発育不全症ま
たは形成異常症、運動失調−毛細血管拡張症、短肢小人症、Ｘ−結合リンパ増殖
性症候群（ＸＬＰ）、Ｉｇｓを伴うネゼロフ症候群−混合免疫欠損、プリンヌク
レオシドホスホリラーゼ欠損（ＰＮＰ）、ＭＨＣクラスＩＩ欠損（不全リンパ球
症候群）および重症複合型免疫不全が挙げられるが、これらに限定はされない。

【０４５５】 エンドカインαポリペプチドまたは本発明のポリヌクレオチド、またはそのア
ゴニスト投与によって回復され得るか、または処置され得るＴ細胞免疫欠損とし
ては、ＤｉＧｅｏｒｇｅ異常、胸腺発育不全、慢性粘膜皮膚カンジダ症、ナチュ
ラルキラー細胞欠損、特発性ＣＤ４＋ Ｔ−リンパ球減少症、および優勢なＴ細
胞欠損を有する免疫欠損、対宿主性移植片病、移植片拒絶および免疫欠損に関連
した炎症が挙げられるが、これらに限定されない。

【０４５６】 エンドカインαポリペプチドまたは本発明のポリヌクレオチド、またはそのア
ゴニスト投与によって回復され得るか、または処置され得る後天性のＢまたはＴ
細胞機能の損失を生じるさらなる状態としては、ＨＩＶ感染、ＡＩＤＳ、骨髄、
およびＢ細胞慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）が挙げられるが、これらに限定され
ない。

【０４５７】 本発明の組成物はまた、一時的な免疫欠損を有する個々の間の免疫反応性をブ
ーストするための薬剤として使用され得る。エンドカインαポリペプチドまたは
本発明のポリヌクレオチド、あるいはそのアゴニストの投与によって回復さえ得
るか、または処置され得る一時的な免疫欠損を生じる状態としては、ウイルス感
染（例えば、インフルエンザ）からの回復、栄養不良に関連した状態、感染性単
核細胞症からの回復、またはストレスに関連した状態、麻疹からの回復、血液輸
血からの回復、およびが手術からの回復が挙げられるが、これらに限定されない
。

【０４５８】 好ましい実施形態において、エンドカインαポリヌクレオチド、ポリペプチド
、および／またはそのアゴニストおよび／またはアンタゴニストは、体の種々の
粘液性膜の任意の１以上に発症する疾患または障害、または関連した状態の処置
、予防、および／または診断に使用される。このような疾患または障害としては
、例えば、ｍｕｃｏｓｉｔｉｓ、粘膜破壊、粘液性結腸炎、皮膚粘膜リーシュマ
ニア症（例えば、アメリカリーシュマニア症、皮膚フランベシア、鼻咽頭リーシ
ュマニア症、および新世界リーシュマニア症のような）、皮膚粘膜リンパ節症候
群（例えば、川崎病）、小腸粘膜炎、粘液性類表皮癌、粘液類上皮腫、粘膜上皮
形成異常、類粘液腺癌、ムコイド変性、ミクソイド（ｍｙｘｏｉｄ）変性、ミク
ソイド（ｍｙｘｏｍａｔｏｕｓ）変性、ムコイド中膜変性（例えば、嚢胞性中膜
壊死）、ムコリピドーシス（例えば、ムコリピドーシスＩ、ムコリピドーシスＩ
Ｉ、ムコリピドーシスＩＩＩ、およびムコリピドーシスＩＶを含む）、粘液溶解
障害、粘液性膜性腸炎、小腸粘膜炎、ムコ多糖体症（例えば、Ｉ型ムコ多糖体症
（すなわち、フルラー症候群）、ＩＳ型ムコ多糖体症（すなわち、シャイエ症候
群またはＶ型ムコ多糖体症）、ＩＩ型ムコ多糖体症（すなわち、ハンター症候群
）、ＩＩＩ型ムコ多糖体症（すなわち、サンフィリポ症候群）、ＩＶ型ムコ多糖
体症（すなわち、モルキオ症候群）、ＶＩ型ムコ多糖体症（すなわち、マロトー
−ラミー症候群）、ＶＩＩ型ムコ多糖体症（すなわち、βグリクロニダーゼ欠損
に起因するムコ多糖体症）、およびムコスルファチドーシスのような）、ムコ多
糖体尿、粘液膿性結膜炎、膿様粘液、ムコール菌症（すなわち、粘液腫症）、粘
膜病（すなわち、ウシのウイルス性下痢）、粘液性大腸結腸炎（例えば、粘液性
結腸炎および粘液性大腸結腸炎のような）、およびムコビシドーシス（例えば、
嚢胞性線維症（ｃｙｓｔｉｃ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、嚢胞性線維症（ｃｙｓｔｉ
ｃ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐａｎｃｒｅａｓ）、クラーク−ハッド
フィールド症候群、膵線維嚢胞症、ムコビシドーシスおよび粘液過剰症のような
）が挙げられるが、これらに限定されない。高度に好ましい実施形態において、
エンドカインαポリヌクレオチド、ポリペプチド、および／またはそのアゴニス
トおよび／またはアンタゴニストは、ｍｕｃｏｓｉｔｉｓ、特に化学療法に関連
した処置、予防、および／または診断のために使用される。

【０４５９】 本発明のエンドカインαポリヌクレオチドまたはポリペプチド、またはそのア
ゴニストあるいはアンタゴニストは、１以上の以下：原発性免疫欠損、免疫媒介
性血小板減少症、川崎症、骨髄移植（例えば、成人または子供の最近の骨髄移植
）、慢性Ｂ細胞リンパ球白血病、ＨＩＶ感染（例えば、成人または小児ＨＩＶ感
染）、慢性炎症脱髄性多発ニューロパシー、および移植後の紫斑の疾患、または
障害、あるいはそれらに関連した状態の診断、予知、処置、または予防に使用さ
れ得る。

【０４６０】 さらに、本発明のエンドカインαポリヌクレオチドまたはポリペプチド、また
はそのアゴニストまたはアンタゴニストは、１以上の以下：ギヤン−バレー症候
群、貧血（例えば、パルボウイルスＢ１９に関連した貧血）、感染の危険の高い
安定な多発性骨髄腫を有する患者の疾患（例えば、再発性感染）、自己免疫性溶
血性貧血（温暖型自己免疫性溶血性貧血）、血小板減少症（例えば、新生児血小
板減少症）、および免疫媒介性好中球減少症、移植術（例えば、ＣＭＶ−陽性器
官のサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）−陰性受容者）、ｈｙｐｏｇａｍｍｍａｇ
ｌｏｂｕｌｉｎｅｍｉａ（例えば、低ガンマグロブリン（例えば、感染または病
的状態の危険因子を有するｈｙｐｏｇａｍｍｍａｇｌｏｂｕｌｉｎｅｍｉｃ）新
生児）、てんかん、（例えば、難治性てんかん）、全身管脈症（ｓｙｓｔｅｍｉ
ｃ ｖａｓｃｕｌｉｔｉｃ ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ）、重症筋無力症（例えば、重
症筋無力症における代償不全）、皮膚筋炎および多発性筋炎の障害、またはそれ
らに関連する状態の診断、予知、処置、または予防に使用され得る。

【０４６１】 本発明のエンドカインαポリヌクレオチドまたはポリペプチドおよび／または
そのアゴニストおよび／またはアンタゴニストは、哺乳動物（特にヒト）におけ
る種々の免疫系関連疾患および／またはこれらの疾患に関連する状態の処置、予
防、および／または診断に使用され得る。多くの自己免疫疾患は、免疫細胞によ
る外来物質としての自身の不適切な認識に起因する。この不適切な認識は、宿主
組織の破壊を導く免疫応答を生じる。従って、免疫応答（特に、Ｂ細胞の増殖、
および／または免疫グロブリンの産生）を示し得る本発明のエンドカインαポリ
ヌクレオチドまたはポリペプチド、および／またはそのアゴニストおよび／また
はアンタゴニストの投与は、自己免疫障害の処置および／または予防における有
効な療法であり得る。従って、好ましい実施形態において、本発明のエンドカイ
ンαアンタゴニスト（例えば、エンドカインαのポリペプチドフラグメントおよ
び抗エンドカインα抗体）は、自己免疫障害の処置、予防、および／または診断
に使用される。

【０４６２】 本発明のエンドカインαポリヌクレオチド、ポリペプチド、および／またはア
ンタゴニスト（例えば、抗エンドカインα抗体）で処置、予防、および／または
診断され得る自己免疫疾患、およびこれらの疾患に関連した状態としては、自己
免疫溶血性貧血、自己免疫新生血小板減少症、特発性血小板減少性紫斑病、自己
免疫性血球減少症、溶血性貧血、抗リン脂質症、皮膚炎、アレルギー性脳脊髄炎
、心筋炎、再発性多発性軟骨炎、リウマチ性心疾患、糸球体腎炎（例えば、Ｉｇ
Ａ腎症）、多発性硬化症、神経炎、ブドウ膜炎眼結膜炎、多発性内分泌腺症、紫
斑（例えば、Ｈｅｎｌｏｃｈ−Ｓｃｏｅｎｌｅｉｎ紫斑）、Ｒｅｉｔｅｒ’ｓ病
、スティッフマン症候群、自己免疫肺炎症、ギヤン−バレー症候群、スティッフ
マン症候群、インスリン依存性糖尿病、および自己免疫炎症眼疾患が挙げられる
が、これらに限定されない。

【０４６３】 本発明の組成物で処置、予防、および／または診断され得る、さらなる自己免
疫障害（非常にありそうな）としては、自己免疫甲状腺炎、甲状腺機能低下症（
すなわち、橋本甲状腺炎）（しばしば例えば、細胞媒介性およびホルモン甲状細
胞毒性によって特徴付けられる）、全身性エリテマトーデス（例えば、循環およ
び局所的に生成された免疫複合体によってしばしば特徴づけられる）、グッドパ
スチャー症候群（例えば、抗基底膜抗体によってしばしば特徴付けられる）、天
疱瘡（しばしば例えば、表皮棘融解抗体によって特徴付けられる）、自己免疫レ
セプター（しばしば例えば、グレーヴズ病（例えば、ＴＳＨレセプター抗体によ
って特徴付けられる）、重症筋無力症（しばしば例えば、アセチルコリンレセプ
ター抗体によって特徴付けられる）、およびインスリン耐性（しばしば例えば、
インスリンレセプター抗体によって特徴付けられる）、自己免疫溶血性貧血（し
ばしば例えば、抗体感作ＲＢＣの食菌作用によって特徴付けられる）、および自
己免疫特発性血小板減少性紫斑病（しばしば例えば、抗体感作小板の食菌作用に
よって特徴付けられる）のような）が挙げられるが、これらに限定されない。

【０４６４】 本発明の組成物で処置、予防、および／または診断され得るさらなる自己免疫
障害としては、リウマチ様動脈炎（しばしば間接における免疫複合体によって特
徴付けられる）、抗コラーゲン抗体を有するｓｃｈｌｅｒｏｄｅｒｍａ（しばし
ば例えば、核小体および他の核抗体によって特徴付けられる）、混合結合組織病
（抽出可能な核抗原（しばしば例えば、リボ核蛋白）に対する抗体によって特徴
付けられる）、多発性筋炎／皮膚筋炎（しばしば例えば、リボ核蛋白ＡＮＡによ
って特徴付けられる）、悪性貧血（しばしば例えば、抗壁細胞、ミクロソーム、
および内性因子抗体によって特徴付けられる）、特発性アディソン病（しばしば
体液および細胞媒介性腎傍細胞毒性、不妊症（しばしば例えば、抗精子抗体によ
って特徴付けられる）によって特徴付けられる）、原発性糸球体腎炎およびＩｇ
Ａ腎症のような糸球体腎炎（しばしば例えば、糸球基底膜抗体または免疫複合体
によって特徴付けられる）、水胞性天疱瘡（しばしば例えば、基底膜におけるＩ
ｇＧおよび補体によって特徴付けられる）、シェーグレン症候群（しばしば例え
ば、多発性組織抗体、および／または特異的非ヒストンＡＮＡ（ＳＳ−Ｂ）によ
って特徴付けられる）、糖尿病蜜剤（しばしば例えば、細胞媒介性および体液性
島細胞抗体によって特徴付けられる）およびアドレナリン作用性薬物耐性（ぜん
息または嚢胞性線維症を有するアドレナリン作用性薬物耐性を含む）（しばしば
例えば、βアドレナリン作用性レセプター抗体によって特徴付けられる）が挙げ
られるが、これらに限定されない。

【０４６５】 本発明の組成物で処理、予防、および／または診断され得る、さらに（可能な
）自己免疫障害としては慢性活動性肝炎（しばしば例えば、平滑筋抗体によって
特徴付けられる）、原発性胆汁性肝硬変（しばしば例えば、ミトコンドリア（ｍ
ｉｔｃｈｏｎｄｒｉａｌ）によって抗体特徴付けられる）、他の内分泌腺不全（
しばしば例えば、ある場合においては、特定組織の抗体によって特徴付けられる
）、白斑（しばしば例えば、メラノサイト抗体によって特徴付けられる）、脈管
炎（しばしば例えば、血管壁および／または低血清組成物におけるＩｇおよび補
体によって、特徴付けられる）、ＭＩ後（ｐｏｓｔ−ＭＩ）（しばしば心筋抗体
によって、特徴付けられる）、心臓切開術症（しばしば心筋抗体によって、特徴
付けられる）、じんま疹（しばしば例えば、ＩｇＥに対するＩｇＧおよびＩｇＭ
抗体によって、特徴付けられる）、ぜん息（しばしば例えば、ＩｇＥに対するＩ
ｇＧおよびＩｇＭ抗体として、特徴付けられる）、炎症性ミオパシー、および多
くの他の炎症、顆粒性、変性、および萎縮性障害が挙げられるが、これらに限定
されない。

【０４６６】 好ましい実施形態において、上記の自己免疫疾患および障害および／またはこ
の疾患および障害に関連する状態は、抗エンドカインα抗体を使用して処置、予
防、および／または診断される。

【０４６７】 特定の好ましい実施形態において、リウマチ様動脈炎は、本発明の抗エンドカ
インα抗体および／または他のアンタゴニストを使用して処置、予防および／ま
たは診断される。

【０４６８】 特定の好ましい実施形態において、狼瘡は、本発明の抗エンドカインα抗体、
および／または他のアンタゴニストを使用して処置、予防、および／または診断
される。

【０４６９】 特定の好ましい実施形態において、狼瘡に関連する腎炎は、本発明の抗エンド
カインα抗体および／または他のアンタゴニストを使用して処置、予防、および
／または診断される。

【０４７０】 特定の実施形態において、エンドカインαポリヌクレオチドまたはポリペプチ
ド、またはそのアンタゴニスト（例えば、抗エンドカインα抗体）は、全身性エ
リテマトーデスのおよび／または疾患、障害および／またはそれに関連した状態
の処置、または予防のために使用される。エンドカインαポリヌクレオチドまた
はポリペプチド、または本発明のアンタゴニストで処置、または予防され得る狼
瘡に関連した疾患、障害、または状態としては、血液学的障害（例えば、溶血性
貧血、白血球減少症、リンパ球減少症、および血小板減少症）、免疫学的障害（
例えば、抗ＤＮＡ抗体、および抗Ｓｍ抗体）、発疹、羞明、口潰瘍、関節炎、熱
、疲労、重量喪失、漿膜炎（例えば、胸膜炎）、腎障害（例えば、腎炎）、神経
学的障害（例えば、発作、末梢性ニューロパシー、ＣＮＳ関連障害）、胃腸障害
、レーノー現象、および心膜炎が挙げられるが、これらに限定されない。好まし
い実施形態において、エンドカインαポリヌクレオチドまたはポリペプチド、ま
たはそのアンタゴニスト（例えば、抗エンドカインα抗体）は、全身性エリテマ
トーデスに関連した障害の処置または予防に使用される。最も好ましい実施形態
において、エンドカインαポリヌクレオチドまたはポリペプチド、またはそのア
ンタゴニスト（例えば、抗エンドカインα抗体）は、全身性エリテマトーデスに
関連した腎炎の処置または予防に使用される。

【０４７１】 特定の実施形態において、本発明の溶解性エンドカインαポリペプチドまたは
そのアゴニストは、免疫欠損（例えば、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）−Ｘ連鎖
、ＳＣＩＤ−常染色体、アデノシンデアミナーゼ欠損（ＡＤＡ欠損）、Ｘ連鎖無
ガンマグロブリン血症（ＸＬＡ）、Ｂｒｕｔｏｎ病、先天性無ガンマグロブリン
血症、Ｘ連鎖乳児無ガンマグロブリン血症、後天性無ガンマグロブリン血症、成
体発生無ガンマグロブリン血症、後期発症ガンマグロブリン血症、低ガンマグロ
ブリン血症（ｄｙｓｇａｍｍａｇｌｏｂｕｌｉｎｅｍｉａ、ｈｙｐｏｇａｍｍａ
ｇｌｏｂｕｌｉｎｅｍｉａ）、乳児の一過性低ガンマグロブリン血症、不特定の
低ガンマグロブリン血症、無ガンマグロブリン血症、分類不能型免疫不全（ＣＶ
ＩＤ）（後天性）、ヴィスコット‐オールドリッチ症候群（ＷＡＳ）、過剰Ｉｇ
Ｍを伴うＸ連鎖免疫欠損、過剰ＩｇＭを伴う非Ｘ連鎖免疫欠損、選択的ＩｇＡ欠
損、ＩｇＧサブクラス欠損（ＩｇＡ欠損を伴うかまたは伴わない）、正常または
増大したＩｇｓを伴う抗体欠損、胸腺腫を伴う免疫欠損、Ｉｇ重鎖欠損、κ鎖欠
損、Ｂ細胞リンパ球増殖障害（ＢＬＰＤ）、選択的ＩｇＭ免疫欠損、退縮無ガン
マグロブリン血症（スイス型）、細網発育不全、重症の先天性白血球減少、免疫
欠損を伴う胸腺リンパ形成不全−発育不全または形成異常、運動失調、短肢小人
症、Ｘ連鎖リンパ球増殖症候群（ＸＬＰ）、Ｉｇｓを伴うネゼロフ症候群複合免
疫欠損、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ欠損（ＰＮＰ）、ＭＨＣクラスＩＩ
欠損（不全リンパ球症候群）および重症の複合免疫欠損、ディ・ジョージ異常、
胸腺発育不全、慢性粘膜皮膚カンジダ症、ナチュラルキラー細胞欠損、特発性Ｃ
Ｄ４＋Ｔ−リンパ球減少、ならびに優性Ｔ細胞欠損を伴う免疫欠損または免疫欠
損に付随する状態）の処置、予防、予後判定、および／または診断のために投与
される。

【０４７２】 特定の実施形態において、本発明のエンドカインαポリペプチドまたはポリヌ
クレオチド、あるいはそれらのアゴニストは、分類不能型免疫不全の処置、予防
、予後判定、および／または診断のために投与される。

【０４７３】 特定の実施形態において、本発明のエンドカインαポリペプチドまたはポリヌ
クレオチド、あるいはそれらのアゴニストは、Ｘ連鎖無ガンマグロブリン血症の
処置、予防、予後判定、および／または診断のために投与される。

【０４７４】 別の特定の実施形態において、本発明のエンドカインαポリペプチドまたはポ
リヌクレオチド、あるいはそれらのアゴニストは、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ
）の処置、予防、予後判定、および／または診断のために投与される。

【０４７５】 別の特定の実施形態において、本発明のエンドカインαポリペプチドまたはポ
リヌクレオチド、あるいはそれらのアゴニストは、ヴィスコット‐オールドリッ
チ症候群の処置、予防、予後判定、および／または診断のために投与される。

【０４７６】 別の特定の実施形態において、本発明のエンドカインαポリペプチドまたはポ
リヌクレオチド、あるいはそれらのアゴニストは、過剰ＩｇＭを伴うＸ連鎖Ｉｇ
欠損の処置、予防、予後判定、および／または診断のために投与される。

【０４７７】 別の特定の実施形態において、本発明のエンドカインαポリペプチドまたはポ
リヌクレオチド、あるいはそれらのアゴニストは、ディ・ジョージ異常の処置、
予防、予後判定、および／または診断のために投与される。

【０４７８】 別の特定の実施形態において、ＩＬ−１０およびエンドカインαポリペプチド
またはポリヌクレオチドの組み合わせは、Ｔ細胞応答に関連する病理学、特に、
自己免疫疾患、対宿主性移植片病（ＧＶＨＤ）および組織移植拒絶の抑制におい
て有利に使用され得る。本発明は、同種移植拒絶およびＧＶＨＤのような細胞媒
介反応を抑制するために使用され得る。さらに、ＩＬ−１０の多様な生物学的活
性を考慮すると、ＩＬ−１０およびエンドカインαポリペプチドまたはポリヌク
レオチドの併用は、同種異系骨髄移植におけるＧＶＬ（対白血病性移植）を支持
し得る。

【０４７９】 別の特定の実施形態において、本発明の組成物は、拒絶反応の防止または皮膚
、骨、ニューロン組織、滑膜、心臓、腎臓、膵臓、骨髄、小腸、肺、心肺の組合
わせ、角膜組織、肝臓などの同種異系移植組織の生存を延長するために使用され
得る。移植された組織自体は代表的にはヒトが起源であるが、アカゲザル、ヒヒ
またはブタのような別の種からでもあり得る。本明細書中で使用される場合、用
語「組織」は、血液細胞のような個々の細胞を含み、これには、それらの前駆体
（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ ａｎｄ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ）、および膵細胞、
ならびに固形器官などを含む。用語固形器官は、心臓、皮膚、肝臓、肺、角膜、
腎臓、膵臓、腸、内分泌腺、膀胱、骨格筋などを意味する。

【０４８０】 別の特定の実施形態において、本発明の組成物は、大きな範疇の疾患を、その
発生の前および／または後に処置するために使用され得、このような疾患として
は、自己免疫疾患（病因学を有する炎症性疾患（関節炎のような自己免疫成分（
例えば、慢性関節リウマチ、関節炎慢性プログレジエンテ（ｐｒｏｇｒｅｄｉｅ
ｎｔｅ）および慢性関節リウマチ）ならびにリウマチ性疾患）が挙げられるがこ
れらに限定されない）が挙げられるがこれらに限定されない。

【０４８１】 自己免疫疾患は、２つの一般的な型、すなわち全身性自己免疫疾患（関節炎、
狼瘡および強皮症によって例示される）、および器官特定（多発性硬化症、糖尿
病およびアテローム性動脈硬化症によって例示され、このうち後者の場合、脈管
構造が特定器官としてみなされる）に分類され得る。本発明の組成物が使用され
得る特定の自己免疫疾患としては、自己免疫血液学的障害（例えば、溶血性貧血
、再生不良性貧血、悪性貧血、赤芽球ろうおよび特発性血小板減少が挙げられる
）、全身性エリテマトーデス、多発性軟骨炎、強皮症、ヴェーゲナー肉芽腫症、
皮膚筋炎、活動性慢性肝炎、重症筋無力症、乾癬、スティーヴンズ‐ジョンソン
症候群、特発性スプルー、自己免疫炎症性腸疾患（例えば、潰瘍性大腸炎および
クローン病が挙げられる）、自己免疫甲状腺炎、特発性アディソン病、白斑（ｖ
ｉｔｉｌｏｇｏ）、グルテン過敏性腸症（ｇｌｕｔｅｎ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ
ｅｎｔｅｒｏｐａｔｈｙ）、自己免疫好中球減少症（ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｎ
ｅｕｔｒｏｐｅｎｉａｓ）、尋常天疱瘡、グッドパスチャー疾患、水疱性類天疱
瘡、円板状狼瘡（ｄｉｓｃｏｉｄ ｌｕｐｕｓ）、デンスデポジット病、内分泌
性眼障害、ＩＢＤ、ぜん息、グレーヴズ病、類肉腫症、多発性硬化症、原発性胆
汁性肝硬変を含む肝硬変、若年性糖尿病（真性糖尿病１型）、インスリン依存性
糖尿病、（すなわち、ＩＤＤＭ、または自己免疫糖尿病）、ブドウ膜炎（前側お
よび後側）、自己免疫胃炎、リンパ球減少、結節性多発動脈炎、シェーグレン症
候群、ベーチェット（Ｂｅｃｈｅｔ’ｓ）病、橋本病、原発性粘液水腫、多発性
筋炎、混合結合組織病、乾性角結膜炎および春季カタル、間隙性肺線維症、乾癬
性関節炎、糸球体腎炎（ネフローゼ症候群を伴うものおよび伴わないもの（例え
ば、特発性ネフローゼ症候群または最少変化腎症が挙げられる））、若年性皮膚
筋炎、活動性慢性肝炎を含む肝炎、器官拒絶、ならびに他の病気が挙げれられる
がこれらに限定されない。他の疾患および状態としては、自己免疫甲状腺炎、自
己免疫溶血性貧血、および接触過敏疾患（ｃｏｎｔａｃｔ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉ
ｔｙ ｄｉｓｅａｓｅ）が挙げられるがこれらに限定されない。これらの疾患お
よび状態は、例えば、ツタウルシのような植物物質によって引き起こされ得る。
他の疾患および状態には、慢性および急性の一相性ＥＡＥ（ｍｏｎｏｐｈａｓｉ
ｃ ＥＡＥ）の抑制、ＨＩＶ関連状態、ＡＩＤＳ、ＳＣＩＤＳ、アジュバント関
節炎、リンパ悪性疾患または免疫障害、および筋萎縮側索硬化のような神経変性
疾患、アルツハイマー病、パーキンソン病、および原発性側索硬化症が挙げられ
るがこれらに限定されない。さらに、本発明の組成物は、創傷の治癒の促進およ
び感染疾患の処置のために使用され得る。

【０４８２】 上記に記載の疾患は、本明細書中で言及される場合、これらの疾患についての
動物モデルによって示されるものを含む（例えば、ＩＤＤＭについての非肥満糖
尿病（ＮＯＤ）マウス、および多発性硬化症についての実験的自己免疫脳脊髄炎
（ＥＡＥ）マウスなど）。他の状態としては、免疫系関連流産および炎症性障害
が挙げられる。本発明の開示はまた、子宮内膜症を含む不妊症のような顕著な自
己免疫疾患を処置するために適用され得る。

【０４８３】 さらに、多くの脈管障害（このような障害のアテローム性動脈硬化形態を含む
）が、自己免疫成分を有し、そして脈管疾患を有する多くの患者が循環する自己
抗体を有することが徐々に明らかとなってきている。

【０４８４】 一般に、本発明の組成物は、免疫調節、特に免疫抑制において、およびＴリン
パ急の過増殖によって特徴付けられる白血病（ウイルス誘導白血病（例えば、Ｈ
ＴＬＶ−１誘導白血病）を含む）の処置において有用である。免疫機能における
改善または回復は、免疫応答を高める能力の部分的または全体の回復の観察によ
って評価され得る。自己免疫疾患の場合、改善または回復は、自己免疫疾患によ
って引き起こされる炎症に付随する臨床的症状（例えば、慢性間接リウマチにお
ける間接痛または腫脹あるいは凝り、慢性再発性多発性硬化症における大発作の
数；慢性進行性多発性硬化症における運動機能の安定化または改善；クローン病
の場合の腸炎；および血清学的測定（例えば、二本鎖ＤＮＡに対する抗体、補体
成分および循環免疫複合体）、ならびに全身性エリテマトーデスについての皮膚
の発赤拡大または筋痛、間接痛、白血球減少、あるいは血小板減少の数および重
症度）の有意な減少または消失によって最も評価され得る。自己免疫疾患におけ
るレジメンの有効性をモニターするために使用され得るこれらの症状は、一般的
に当該分野で周知である。

【０４８５】 本発明の組成物は、種々の抗原に対するＴ細胞耐性を誘導するために適用され
得る。例えば、Ｔ細胞耐性は、溶解性抗原（例えば、溶解性タンパク質）に対し
て誘導され得る。Ｔ細胞は、異常免疫応答に関連する自己免疫疾患または障害に
関与する抗原に対して寛容化され得る。例えば、１つの実施形態において、抗原
は自己抗原である。別の実施形態において、抗原はアレルゲン（ａｌｌｅｒｇａ
ｎ）である。あるいは、Ｔ細胞は、外来性細胞上で発現される抗原に対して寛容
化され得る。従って、さらに他の実施形態において、抗原は同種抗原または異物
抗原である。同種抗原または異物抗原に対するＴ細胞耐性の誘導は、例えば、ド
ナー移植片（例えば、組織または器官の移植片または骨髄移植）の移植受容者に
よる拒絶を阻害するために、特に移植において使用される。さらに、骨髄植皮片
中のドナーのＴ細胞の寛容化は、対宿主性移植片病の阻害に有用である。

【０４８６】 （遺伝子治療） 特定の実施形態において、抗体またはその機能的誘導体をコードする配列を含
む核酸は、本発明のポリペプチドの異常な発現および／または活性に関連した疾
患または障害を処置、阻害または予防するために、遺伝子治療の目的で投与され
る。遺伝子治療とは、発現したか、または発現可能な核酸の、被験体への投与に
より行われる治療をいう。本発明のこの実施形態において、核酸は、それらのコ
ードされたタンパク質を産生し、そのタンパク質は治療効果を媒介する。

【０４８７】 当該分野で利用可能な遺伝子治療のための任意の方法は、本発明に従って使用
され得る。例示的な方法が以下に記載される。

【０４８８】 遺伝子治療の方法の一般的な概説については、Ｇｏｌｄｓｐｉｅｌら，Ｃｌｉ
ｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｙ １２：４８８−５０５（１９９３）；Ｗｕおよ
びＷｕ，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ３：８７−９５（１９９１）；Ｔｏｌｓｔｏｓ
ｈｅｖ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：５７３
−５９６（１９９３）；Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：９２６−
９３２（１９９３）；ならびにＭｏｒｇａｎおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ，Ａｎｎ．
Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１−２１７（１９９３）；ＴＩＢＴＥＣＨ
１１（５）：１５５−２１５（１９９３年５月）を参照のこと。使用され得る
、組換えＤＮＡ技術分野において一般的に公知である方法は、Ａｕｓｕｂｅｌら
（編），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂ
ｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９３）；およびＫ
ｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，
ＮＹ（１９９０）に記載される。

【０４８９】 好ましい局面において、化合物は抗体をコードする核酸配列を含有し、上記核
酸配列は、適切な宿主において、抗体、またはそのフラグメントもしくはキメラ
タンパク質、あるいはその重鎖もしくは軽鎖を発現する発現ベクターの一部であ
る。特に、このような核酸配列は、抗体コード領域に作動可能に連結したプロモ
ーターを有し、上記プロモーターは誘導性であるかまたは構成性であり、そして
必要に応じて組織特異的である。別の特定の実施形態においては、抗体をコード
する配列および任意の他の所望の配列がゲノム中の所望の部位での相同組換えを
促進する領域に隣接した核酸分子が使用され、従って抗体核酸の染色体内の発現
を提供する（ＫｏｌｌｅｒおよびＳｍｉｔｈｉｅｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８９３２−８９３５（１９８９）；Ｚｉｊｌｓｔ
ｒａら，Ｎａｔｕｒｅ ３４２：４３５−４３８（１９８９））。特定の実施形
態において、発現した抗体分子は単鎖抗体であるか；あるいはこの核酸配列は、
この抗体の重鎖および軽鎖の両方をコードする配列またはそのフラグメントを含
む。

【０４９０】 核酸の患者への送達は、直接的（この場合、患者は核酸または核酸保有ベクタ
ーに直接的に曝される）か、または間接的（この場合、細胞は最初にインビトロ
で核酸で形質転換され、次いで患者に移植される）のいずれかであり得る。これ
らの２つのアプローチは、インビボ遺伝子治療として、またはエキソビボ遺伝子
治療としてそれぞれ公知である。

【０４９１】 特定の実施形態において、核酸配列はインビボで直接的に投与され、そこで核
酸配列は発現されて、コードされた生成物を産生する。これは、当該分野で公知
の多数の方法（例えば、それらを適切な核酸発現ベクターの一部分として構築し
、そしてそれを（例えば、欠損性または弱毒化したレトロウイルスまたは他のウ
イルスベクター（米国特許第４，９８０，２８６号を参照のこと）を用いる感染
により）細胞内になるように投与することにより、あるいは、裸のＤＮＡの直接
注射により、あるいは、微粒子ボンバードメント（例えば、遺伝子銃；Ｂｉｏｌ
ｉｓｔｉｃ、Ｄｕｐｏｎｔ）の使用により、あるいは脂質または細胞表面のレセ
プターでコーティングするか、もしくは薬剤をトランスフェクトすることにより
、あるいは、リポソーム、微粒子、またはマイクロカプセル中へのカプセル化に
より、あるいは、それらを核に入ることが公知であるペプチドと結合させて投与
することにより、レセプター媒介のエンドサイトーシスを受けるリガンドと結合
させて投与することにより（例えば、ＷｕおよびＷｕ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ
．２６２：４４２９−４４３２（１９８７）を参照のこと）（レセプターを特異
的に発現する細胞の型を標的にするために用いられ得る）などのいずれかにより
達成され得る。別の実施形態において、核酸−リガンド複合体が形成され得、こ
こで、このリガンドはエンドソームを破壊するフソジェニック（ｆｕｓｏｇｅｎ
ｉｃ）ウイルス性ペプチドを含み、この核酸がリソゾーム分解を回避することを
可能にする。さらに別の実施形態において、核酸は、特定のレセプターを標的化
することにより、細胞特異的な取り込みおよび発現についてインビボで標的化さ
れ得る（例えば、１９９２年４月１６日付のＰＣＴ公開第ＷＯ９２／０６１８０
号（Ｗｕら）；１９９２年１２月２３日付の同第ＷＯ９２／２２６３５号（Ｗｉ
ｌｓｏｎら）；１９９２年１１月２６日付の同第ＷＯ９２／２０３１６号（Ｆｉ
ｎｄｅｉｓら）；１９９３年７月２２日付の同第ＷＯ９３／１４１８８号（Ｃｌ
ａｒｋｅら）；および１９９３年１０月１４日付けの同第ＷＯ９３／２０２２１
号（Ｙｏｕｎｇ）を参照のこと）。あるいは、核酸は、細胞内部に導入され得、
そして相同組換えにより、発現のために宿主細胞ＤＮＡ中に組み込まれ得る（Ｋ
ｏｌｌｅｒおよびＳｍｉｔｈｉｅｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ ８６：８９３２−８９３５（１９８９）；Ｚｉｊｌｓｔｒａら，Ｎａｔ
ｕｒｅ ３４２：４３５−４３８（１９８９））。

【０４９２】 特定の実施形態において、本発明の抗体をコードする核酸配列を含むウイルス
ベクターが使用される。例えば、レトロウイルスベクターが用いられ得る（Ｍｉ
ｌｌｅｒら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：５８１−５９９（１９９３）
を参照のこと）。これらのレトロウイルスベクターは、ウイルス性ゲノムのパッ
ケージングおよび宿主細胞ＤＮＡへの組込みのために必要とされないレトロウイ
ルス性配列を除去する。遺伝子治療において使用される抗体をコードする核酸配
列は、一つ以上のベクター中にクローニングされ、これは、患者内への遺伝子の
送達を容易にする。レトロウイルスベクターに関するさらなる詳細は、Ｂｏｅｓ
ｅｎら，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ６：２９１−３０２（１９９４）（これは、幹
細胞を化学療法に対してより耐性にするために、ｍｄｒ１遺伝子を造血性幹細胞
に送達するための、レトロウイルスベクターの使用を記載する）に見出され得る
。遺伝子治療におけるレトロウイルスベクターの使用を説明する他の参考文献は
、以下である：Ｃｌｏｗｅｓら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９３：６４４−
６５１（１９９４）；Ｋｉｅｍら，Ｂｌｏｏｄ ８３：１４６７−１４７３（１
９９４）；ＳａｌｍｏｎｓおよびＧｕｎｚｂｅｒｇ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔ
ｈｅｒａｐｙ ４：１２９−１４１（１９９３）；ならびにＧｒｏｓｓｍａｎお
よびＷｉｌｓｏｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄ
ｅｖｅｌ．３：１１０−１１４（１９９３）。

【０４９３】 アデノウイルスは、遺伝子治療において使用され得る他のウイルスベクターで
ある。アデノウイルスは、特に、気道上皮へ遺伝子を送達するための魅力的なビ
ヒクルである。アデノウイルスは、自然に気道上皮に感染し、そこで軽い疾患を
起こす。アデノウイルスベースの送達システムの他の標的は、肝臓、中枢神経系
、内皮細胞、および筋肉である。アデノウイルスは、非分裂細胞を感染すること
ができるという利点を有する。ＫｏｚａｒｓｋｙおよびＷｉｌｓｏｎ，Ｃｕｒｒ
ｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍ
ｅｎｔ ３：４９９−５０３（１９９３）は、アデノウイルスベースの遺伝子治
療の概説を示す。Ｂｏｕｔら，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：３
−１０（１９９４）は、アカゲザルの気道上皮に遺伝子を移すためのアデノウイ
ルスベクターの使用を示した。遺伝子治療におけるアデノウイルスの使用の他の
例は、Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：４３１−４３４（１９
９１）；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら，Ｃｅｌｌ ６８：１４３−１５５（１９９２）
；Ｍａｓｔｒａｎｇｅｌｉら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９１：２２５−２
３４（１９９３）；ＰＣＴ公開第ＷＯ９４／１２６４９号；およびＷａｎｇら，
Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：７７５−７８３（１９９５）に見出され得る。
好ましい実施形態において、アデノウイルスベクターが使用される。

【０４９４】 アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）はまた、遺伝子治療における使用が提案されて
きた（Ｗａｌｓｈら，Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．２０４：
２８９−３００（１９９３）；米国特許第５，４３６，１４６号）。

【０４９５】 遺伝子治療への別のアプローチは、エレクトロポレーション、リポフェクショ
ン、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション、またはウイルス感染のような
方法により、組織培養中の細胞へ遺伝子を移入する工程を包含する。通常、移入
の方法は、選択可能なマーカーの細胞への移入を含む。次いで、細胞は、移入さ
れた遺伝子を取り込みそして発現する細胞を単離するために選沢下に置かれる。
次いで、それらの細胞は患者に送達される。

【０４９６】 この実施形態においては、得られた組換え細胞のインビボ投与の前に、核酸が
細胞に導入される。このような導入は、当該分野において公知の任意の方法によ
り実施され得、それらの方法としては以下が挙げられるが、これらに限定されな
い：トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクショ
ン、核酸配列を含むウイルスベクターまたはバクテリオファージベクターでの感
染、細胞融合、染色体媒介の遺伝子移入、マイクロセル媒介の遺伝子移入、スフ
ェロプラスト融合など。外来遺伝子の細胞への導入については、当該分野におい
て多数の技術が公知であり（例えば、ＬｏｅｆｆｌｅｒおよびＢｅｈｒ，Ｍｅｔ
ｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：５９９−６１８（１９９３）；Ｃｏｈｅｎら，Ｍ
ｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：６１８−６４４（１９９３）；Ｃｌｉｎｅ，
Ｐｈａｒｍａｃ．Ｔｈｅｒ．２９：６９−９２（１９８５）を参照のこと）、そ
してレシピエント細胞の必要な発生的および生理学的機能が破壊されないならば
、本発明に従って使用され得る。この技術は、細胞への核酸の安定した移入を提
供するべきであり、その結果、この核酸は、細胞により発現可能であり、好まし
くは、その細胞の子孫により遺伝性でかつ発現可能である。

【０４９７】 得られた組換え細胞は、当該分野において公知の様々な方法により、患者へ送
達され得る。組換え血球（例えば、造血幹細胞または造血前駆細胞）は、好まし
くは、静脈内に投与される。使用が考えられる細胞の量は、所望の効果、患者の
状態などに依存し、当業者により決定され得る。

【０４９８】 遺伝子治療の目的のために核酸が導入され得る細胞は、任意の所望の入手可能
な細胞型を包含し、以下を含むがそれらに限定されない：上皮細胞、内皮細胞、
ケラチノサイト、線維芽細胞、筋肉細胞、肝細胞；Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、単
球、マクロファージ、好中球、好酸球、巨核球、顆粒球のような血球；様々な幹
細胞または前駆細胞、特に、造血幹細胞または造血前駆細胞（例えば、骨髄、臍
帯血、末梢血、胎児の肝臓などから得られるような細胞）。

【０４９９】 好ましい実施形態において、遺伝子治療に使用される細胞は、患者に対して自
己である。

【０５００】 遺伝子治療において組換え細胞が使用される実施形態において、抗体をコード
する核酸配列は、細胞またはそれらの子孫により核酸配列が発現可能であるよう
に細胞に導入され、そして次いで組み換え細胞は、治療的効果のためにインビボ
で投与される。具体的な実施形態において、幹細胞または前駆細胞が用いられる
。インビトロで単離され得、そしてインビトロで維持され得る任意の幹細胞およ
び／または前駆細胞は、本発明のこの実施形態に従って潜在的に使用され得る（
例えば、１９９４年４月２８日の日付となっているＰＣＴ公開第ＷＯ９４／０８
５９８号：ＳｔｅｍｐｌｅおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ，Ｃｅｌｌ ７１：９７３−
９８５（１９９２）；Ｒｈｅｉｎｗａｌｄ，Ｍｅｔｈ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ．２１
Ａ：２２９（１９８０）；ならびにＰｉｔｔｅｌｋｏｗおよびＳｃｏｔｔ，Ｍａ
ｙｏ Ｃｌｉｎｉｃ Ｐｒｏｃ．６１：７７１（１９８６）を参照のこと）。

【０５０１】 具体的な実施形態において、遺伝子治療の目的で導入されるべき核酸は、コー
ド領域に作動可能に連結された誘導性プロモーターを含有し、その結果、核酸の
発現は、適切な転写誘導因子の存在または不在を制御することにより制御可能で
ある。

【０５０２】 （治療活性または予防活性の証明） 本発明の化合物または薬学的組成物は、好ましくは、ヒトでの使用の前にイン
ビトロで、そして次いでインビボで、所望の治療活性または予防活性について試
験される。例えば、化合物または薬学的組成物の、治療有用性または予防有用性
を証明するためのインビトロアッセイとしては、細胞株または患者組織サンプル
に対する化合物の効果が挙げられる。細胞株および／または組織サンプルに対す
る化合物または組成物の効果は、当業者に公知である技術（ロゼット形成アッセ
イおよび細胞溶解アッセイが挙げられるがこれらに限定されない）を利用して決
定され得る。本発明に従って、特定の化合物の投与が示されるか否かを決定する
ために用いられ得るインビトロアッセイとしては、インビトロ細胞培養アッセイ
が挙げられ、このアッセイでは、患者組織サンプルが培養物において増殖し、そ
して化合物に曝されるか、そうでなければ化合物が投与され、そして、組織サン
プルに対するそのような化合物の効果が観察される。

【０５０３】 （治療的／予防的な投与および組成物） 本発明は、被験体への有効量の本発明の化合物または薬学的組成物、好ましく
は本発明の抗体の投与による処置、阻害および予防の方法を提供する。好ましい
局面において、化合物は実質的に精製される（例えば、その効果を制限するかま
たは望ましくない副作用を生じる物質は実質的にない）。被験体は好ましくは、
ウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌなどの動物が挙げられるがそれらに限
定されない動物であり、そして好ましくは哺乳動物であり、そして最も好ましく
はヒトである。

【０５０４】 化合物が核酸または免疫グロブリンを含む場合に使用され得る処方および投与
方法は、上記に記載され；さらなる適切な処方および投与経路は、本明細書中で
以下に記載されたものの中から選択され得る。

【０５０５】 様々な送達システムが公知であり、そして本発明の化合物を投与するために用
いられ得る（例えば、リポソーム、微粒子、マイクロカプセル、この化合物の発
現が可能な組換え細胞中でのカプセル化、レセプター媒介エンドサイトーシス（
例えば、ＷｕおよびＷｕ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３
２（１９８７）を参照のこと）、レトロウイルスまたは他のベクターの一部とし
ての核酸の構築など）。導入方法としては、皮内、筋内、腹腔内、静脈内、皮下
、鼻腔内、硬膜外、および経口経路が挙げられるがそれらに限定されない。化合
物または組成物は、任意の好都合な経路により（例えば、注入またはボーラス注
射により、上皮または粘膜内層（例えば、口腔粘膜、直腸粘膜および腸粘膜など
）を通しての吸収により）投与され得、そして他の生物学的に活性な薬剤と一緒
に投与され得る。投与は、全身的または局所的であり得る。さらに、本発明の薬
学的化合物または組成物を、任意の適切な経路（脳室内注射および髄腔内注射を
包含し；脳室内注射は、例えば、Ｏｍｍａｙａリザーバのようなリザーバに取り
付けられた脳室内カテーテルにより容易にされ得る）により中枢神経系に導入す
ることが望まれ得る。例えば、吸入器または噴霧器の使用、およびエアゾール化
剤を用いた処方により、肺投与もまた使用され得る。

【０５０６】 具体的な実施形態において、本発明の薬学的化合物または組成物を、処置の必
要な領域に局所的に投与することが望まれ得る；これは、制限する目的ではない
が、例えば、手術中の局部注入、局所適用（例えば、手術後の創傷包帯との組み
合わせて）により、注射により、カテーテルの手段により、坐剤の手段により、
またはインプラント（このインプラントは、シアラスティック（ｓｉａｌａｓｔ
ｉｃ）膜のような膜または繊維を含む、多孔性、非多孔性、または膠様材料であ
る）の手段により達成され得る。好ましくは、抗体を含む本発明のタンパク質を
投与する際、タンパク質が吸収されない材料を使用するために注意が払われなけ
ればならない。

【０５０７】 別の実施形態において、化合物または組成物は、小胞、特に、リポソーム中へ
送達され得る（Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３（
１９９０）；Ｔｒｅａｔら，Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐ
ｙ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ，Ｌ
ｏｐｅｚ−ＢｅｒｅｓｔｅｉｎおよびＦｉｄｌｅｒ（編），Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ，３５３〜３６５頁（１９８９）；Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ，
同書３１７〜３２７頁を参照のこと）。

【０５０８】 さらに別の実施形態において、化合物または組成物は制御された放出システム
中で送達され得る。１つの実施形態において、ポンプが用いられ得る（Ｌａｎｇ
ｅｒ，（前出）；Ｓｅｆｔｏｎ，ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅ
ｎｇ．１４：２０１（１９８７）；Ｂｕｃｈｗａｌｄら，Ｓｕｒｇｅｒｙ ８８
：５０７（１９８０）；Ｓａｕｄｅｋら，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：
５７４（１９８９）を参照のこと）。別の実施形態において、高分子材料が用い
られ得る（Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌ
ｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，ＬａｎｇｅｒおよびＷｉｓｅ（編），ＣＲＣ Ｐｒｅ
ｓ．，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ（１９７４）；Ｃｏｎｔｒｏｌｌ
ｅｄ Ｄｒｕｇ Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｄｕｃｔ
Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，ＳｍｏｌｅｎおよびＢａｌ
ｌ（編），Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８４）；ＲａｎｇｅｒおよびＰ
ｅｐｐａｓ，Ｊ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．２３：６１（１９８３）を参照のこと；Ｌｅｖｙら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２
２８：１９０（１９８５）；Ｄｕｒｉｎｇら，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：３
５１（１９８９）；Ｈｏｗａｒｄら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：１０５（
１９８９）もまた参照のこと）。さらに別の実施形態において、制御された放出
システムは、治療標的、即ち、脳の近くに置かれ得、従って、全身用量の一部の
みを必要とする（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔ
ｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，（前出），第２巻，
１１５〜１３８頁（１９８４）を参照のこと）。

【０５０９】 他の制御された放出システムは、Ｌａｎｇｅｒにより総説において議論される
（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３（１９９０））。

【０５１０】 本発明の化合物がタンパク質をコードする核酸である、具体的な実施形態にお
いて、その核酸は、それを適切な核酸発現ベクターの一部として構成し、そして
それが細胞内になるように投与することにより（例えば、レトロウイルスベクタ
ーの使用により（米国特許第４，９８０，２８６号を参照のこと）、または直接
注射により、または微粒子ボンバードメント（例えば、遺伝子銃；Ｂｉｏｌｉｓ
ｔｉｃ，Ｄｕｐｏｎｔ）の使用により、または脂質もしくは細胞表面レセプター
もしくはトランスフェクト剤でコーティングすることにより、または核に入るこ
とが公知であるホメオボックス様ペプチドと結合させて投与すること（例えば、
Ｊｏｌｉｏｔら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１８
６４−１８６８（１９９１）を参照のこと）などにより、そのコードされたタン
パク質の発現を促進するようにインビボで投与され得る。あるいは、核酸は、細
胞内に導入され得、そして、発現のために相同組換えにより宿主細胞ＤＮＡ内に
組み込まれ得る。

【０５１１】 本発明はまた、薬学的組成物を提供する。このような組成物は、治療有効量の
化合物、および薬学的に受容可能なキャリアを含む。具体的な実施形態において
、用語「薬学的に受容可能な」とは、動物における、そしてさらに特にヒトにお
ける使用のために、連邦規制当局もしくは米国政府により認められたか、または
米国薬局方もしくは他の一般に認められた薬局方に列挙されたことを意味する。
用語「キャリア」とは、治療剤とともに投与される、希釈剤、アジュバンド、賦
形剤、またはビヒクルをいう。このような薬学的なキャリアは、水および油（石
油起源、動物起源、植物起源、または合成起源の油（例えば、ピーナッツ油、大
豆油、鉱油、ゴマ油など）を含む）のような滅菌した液体であり得る。水は、薬
学的組成物が静脈内に投与される場合に、好ましいキャリアである。生理食塩水
溶液、ならびにデキストロースおよびグリセロールの水溶液はまた、特に注射可
能な溶液のために、液体キャリアとして使用され得る。適切な薬学的賦形剤とし
ては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、イネ
、フラワー、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン
酸グリセロール、滑石、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン
、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。組成物はまた、所望されるな
らば、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含み得る。これらの組
成物は、液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、持続放出処方物
などの形態を取り得る。この組成物は、従来の結合剤およびトリグリセリドのよ
うなキャリアとともに、坐剤として処方され得る。経口処方物は、薬学的等級の
マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリン
ナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどのような標準キャリアを含み得
る。適切な薬学的キャリアの例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇ
ｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載される
。このような組成物は、治療有効量の化合物を、好ましくは精製された形態で、
適切な量のキャリアとともに含んで、患者への適切な投与のための形態を提供す
る。処方物は、投与形態に適するべきである。

【０５１２】 好ましい実施形態において、組成物は、慣用手順に従って、ヒトへの静脈内投
与のために採用された薬学的組成物として、処方される。代表的には、静脈内投
与のための組成物は、滅菌等張水性緩衝液の溶液である。必要な場合、組成物は
また、可溶化剤および注射の部位での痛みを緩和するリグノカインのような局部
麻酔を含み得る。一般的には、成分は、別々にかまたは単一投薬形態で一緒に混
合してのどちらかで、例えば、一定量の活性薬剤を示すアンプルまたは小袋（ｓ
ａｃｈｅｔｔｅ）のような密封された容器中の凍結乾燥粉末または水を含まない
濃縮物として供給される。組成物が注入により投与されるべき場合には、組成物
は、滅菌した薬学的等級の水または生理食塩水を含む注入ボトルに分配され得る
。組成物が注射により投与される場合、成分が投与の前に混合され得るように、
注射用滅菌水または生理食塩水のアンプルが提供され得る。

【０５１３】 本発明の化合物は、中性のまたは塩の形態として処方され得る。薬学的に受容
可能な塩としては、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来するもの
のようなアニオンとともに形成される塩、およびナトリウム、カリウム、アンモ
ニウム、カルシウム、水酸化第２鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、
２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来するもののよ
うなカチオンとともに形成される塩が挙げられる。

【０５１４】 この処置（本発明のポリペプチドの異常な発現および／または活性と関連する
疾患または障害の抑制および予防）において効果的である本発明の化合物の量は
、標準的な臨床技術により決定され得る。さらに、インビトロアッセイは、必要
に応じて、使用して最適な投薬量の範囲を同定するのを助け得る。処方において
使用されるべき正確な用量はまた、投与の経路、および疾患または障害の重篤さ
に依存し、そして開業医の判断および各患者の状況に従って決定されるべきであ
る。有効用量は、インビトロまたは動物モデル試験系から得られた用量反応曲線
から外插され得る。

【０５１５】 抗体に関して、患者に投与される投薬量は、代表的に、患者の体重１ｋｇあた
り０．１ｍｇ〜１００ｍｇである。好ましくは、患者に投与される投薬量は、患
者の体重１ｋｇあたり０．１ｍｇと２０ｍｇとの間であり、より好ましくは、患
者の体重１ｋｇあたり１ｍｇ〜１０ｍｇである。一般に、ヒト抗体は、外来ポリ
ペプチドへの免疫応答に起因して、他種由来の抗体よりもヒト体内で長い半減期
を有する。従って、ヒト抗体の低い投薬量および頻度の低い投与は、しばしば可
能である。さらに、本発明の抗体の投与の投薬量および頻度は、改変（例えば、
脂溶化（ｌｉｐｉｄａｔｉｏｎ）のような）による抗体の取り込みおよび組織浸
透（例えば、脳への）を増強することにより減少され得る。

【０５１６】 本発明はまた、本発明の薬学的組成物の一つ以上の成分で満たされている一つ
以上の容器を備える薬学的パックまたはキットを提供する。薬学的製品または生
物学的製品の製造、使用または販売を規制している政府機関により規定される形
式における通告は、このような容器に、必要に応じて伴ない得る。この通告は、
ヒトの投与のための製造、使用または販売のこの機関による認可を反映する。

【０５１７】 （診断および画像化） 目的のポリペプチドに特異的に結合する標識化抗体、ならびにその誘導体およ
びそのアナログは、診断目的のために使用されて、本発明のポリペプチドの異常
な発現および／または活性に関連する疾患および／または障害を検出、診断また
はモニターし得る。本発明は、目的のポリペプチドの異常な発現の検出について
提供し、これは、（ａ）目的のポリペプチドに特異的な１つ以上の抗体を使用し
て、個体の細胞または体液中の目的のポリペプチドの発現をアッセイする工程、
および（ｂ）この遺伝子発現レベルと標準的な遺伝子発現のレベルを比較する工
程、を包含し、これによって、その標準的な発現レベルと比較されるアッセイさ
れたポリペプチド遺伝子発現レベルの増加または減少が、異常な発現を示す。

【０５１８】 本発明は、障害を診断するための診断アッセイを提供し、このアッセイは、（
ａ）目的のポリペプチドに特異的な１つ以上の抗体を使用して、個体の細胞また
は体液中の目的のポリペプチドの発現をアッセイする工程、および（ｂ）この遺
伝子発現レベルと標準的な遺伝子発現のレベルを比較する工程、を包含し、これ
によって、その標準的な発現レベルと比較されるアッセイされたポリペプチド遺
伝子発現レベルの増加または減少が、特定の障害を示す。癌に関して、個体由来
の生検組織における比較的高い量の転写物の存在は、疾患の発生のための素因を
示し得るか、または実際の臨床症状の出現前に疾患を検出するための手段を提供
し得る。この型のより決定的な診断は、保健専門家に予防手段を使用させること
、または早期の積極的な処置を可能にし得、これにより、癌の発生またはさらな
る進行を予防する。

【０５１９】 本発明の抗体を使用して、当業者に公知の古典的な免疫組織学的方法を使用し
て生物学的サンプル中のタンパク質レベルをアッセイし得る（例えば、Ｊａｌｋ
ａｎｅｎ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０１：９７６−９８５（１９８
５）；Ｊａｌｋａｎｅｎ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０５：３０８７
−３０９６（１９８７）を参照のこと）。タンパク質遺伝子発現を検出するため
に有用な、抗体に基づく他の方法としては、イムノアッセイ（例えば、酵素結合
イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）および放射免疫測定法（ＲＩＡ））が挙
げられる。適切な抗体アッセイ標識は、当該分野において公知であり、そして酵
素標識（例えば、グルコースオキシダーゼ）；放射性同位体（例えば、ヨウ素（ ¹²⁵ Ｉ、¹²¹Ｉ）、炭素（¹⁴Ｃ）、硫黄（³⁵Ｓ）、トリチウム（³Ｈ）、インジウ
ム（¹¹²Ｉｎ）、およびテクネチウム（⁹⁹Ｔｃ））；発光標識（例えば、ルミノ
ール）；ならびに蛍光標識（例えば、フルオレセインおよびローダミン）、なら
びにビオチンが挙げられる。

【０５２０】 本発明の１つの局面は、動物、好ましくは哺乳動物、そして最も好ましくはヒ
トにおける、目的のポリペプチドの異常な発現と関連する疾患または障害の検出
および診断である。１つの実施形態において、診断は、ａ）目的のポリペプチド
に特異的に結合する有効量の標識化分子を被験体に（例えば、非経口的に、皮下
に、または腹腔内に）投与する工程；ｂ）このポリペプチドが発現する被験体内
の部位でこの標識化分子が優先的に濃縮することを可能にするために（および結
合していない標識化分子がバックグラウンドレベルまで除去されるために）投与
後、時間間隔を待つ工程；ｃ）バックグラウンドレベルを決定する工程；および
ｄ）この被験体中の標識化分子を検出する工程、を包含し、その結果、このバッ
クグラウンドレベルを越える標識化分子の検出は、この被験体が目的のポリペプ
チドの異常な発現と関連する特定の疾患または障害を有することを示す。バック
グラウンドレベルは、特定の系について以前に決定された標準的な値と、検出さ
れた標識化分子の量を比較する工程を包含する種々の方法により決定され得る。

【０５２１】 被験体の大きさおよび使用される画像化システムが、診断の画像を産生するた
めに必要である画像化部分の量を決定するということは、当該分野において理解
される。放射性同位体部分の場合、ヒト被験体について、注入される放射能の量
は、通常、約５〜２０ミリキュリーの範囲の９９ｍＴｃである。次いで、標識化
抗体または標識化抗体フラグメントは、特定のタンパク質を含む細胞の位置で優
先的に蓄積する。インビボでの腫瘍の画像化は、Ｓ．Ｗ．Ｂｕｒｃｈｉｅｌら、
「Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｒａｄｉｏｌａｂｅ
ｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ」（
Ｔｕｍｏｒ Ｉｍａｇｉｎｇ、第１３章：Ｔｈｅ Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ
Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ，Ｓ．Ｗ．Ｂｕｒｃｈｉｅｌおよび
Ｂ．Ａ．Ｒｈｏｄｅｓ編、Ｍａｓｓｏｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｉｎｃ．（１
９８２）において、記載される。

【０５２２】 使用する標識の型および投与の様式を含む、いくつかの変動に依存して、標識
化分子が被験体中の部位に優先的に濃縮することを可能にするため、および結合
していない標識化分子がバックグラウンドレベルまで除去されるための投与後の
時間間隔は、６〜４８時間もしくは６〜２４時間または６〜１２時間である。別
の実施形態において、投与後の時間間隔は、５〜２０日間または５〜１０日間で
ある。

【０５２３】 １つの実施形態においては、疾患または障害のモニタリングは、疾患または障
害を診断するための方法を繰り返すこと（例えば、最初の診断後１ヶ月、最初の
診断後６ヶ月、最初の診断後１年など）により行われる。

【０５２４】 標識分子の存在は、当該分野において公知のインビボ走査の方法を用いて、患
者から検出され得る。これらの方法は、用いられる標識の型に依存する。当業者
は、特定の標識を検出するための適切な方法を決定し得る。本発明の診断方法に
おいて用いられ得る方法およびデバイスとしては、限定はされないが、コンピュ
ーター断層撮影（ＣＴ）、陽子（ｐｏｓｉｔｉｏｎ）射出断層撮影法（ＰＥＴ）
のような全身走査、磁気共鳴像（ＭＲＩ）、および超音波診断法が挙げられる。

【０５２５】 特定の実施形態においては、この分子は放射性同位体で標識され、そして放射
線反応性の外科用機器を用いて患者から検出される（Ｔｈｕｒｓｔｏｎら、米国
特許第５，４４１，０５０号）。別の実施形態においては、この分子は蛍光化合
物で標識され、そして蛍光反応性の走査機器を用いて患者から検出される。別の
実施形態においては、この分子は陽電子放出金属で標識され、そして陽子射出断
層撮影法を用いて患者（ｐａｔｅｎｔ）において検出される。さらに別の実施形
態においては、この分子は常磁性標識で標識され、そして磁気共鳴像（ＭＲＩ）
を用いて患者において検出される。

【０５２６】 （キット） 本発明は、上記の方法において用いられ得るキットを提供する。１つの実施形
態においては、キットは、１以上の容器に入った本発明の抗体（好ましくは精製
された抗体）を含む。特定の実施形態においては、本発明のキットは、このキッ
トに含まれる抗体に対して特異的に免疫反応性のエピトープを含む、実質的に単
離されたポリペプチドを含む。好ましくは、本発明のキットは、目的のポリペプ
チドと反応しないコントロール抗体を、さらに含む。別の特定の実施形態におい
ては、本発明のキットは、抗体と目的のポリペプチドとの結合を検出するための
手段（例えば、検出可能な基質（例えば、蛍光化合物、酵素基質、放射性化合物
または発光化合物）と結合し得る抗体、または検出可能な基質と結合し得る一次
抗体を認識する二次抗体）を含む。

【０５２７】 本発明の別の特定の実施形態においては、このキットは、増殖性および／また
は癌性のポリヌクレオチドおよびポリペプチドに対して特異的な抗体を含む血清
をスクリーニングする際に用いる診断用キットである。このようなキットは、目
的のポリペプチドと反応しないコントロール抗体を含み得る。このようなキット
は、少なくとも１つの抗ポリペプチド抗原抗体に対して特異的に免疫反応性のエ
ピトープを含む、実質的に単離されたポリペプチド抗原を含み得る。さらに、こ
のようなキットは、この抗体の抗原への結合を検出するための手段（例えば、フ
ローサイトメトリーにより検出され得る、フルオレセインまたはローダミンのよ
うな蛍光化合物と結合し得る抗体）を含む。特定の実施形態においては、このキ
ットは、組み換え的に産生されたポリペプチド抗原または化学的に合成されたポ
リペプチド抗原を含み得る。このキットのポリペプチド抗原はまた、固体支持体
に付着され得る。

【０５２８】 より特定の実施形態においては、上記のキットの検出手段は、このポリペプチ
ド抗原が付着される固体支持体を含む。このようなキットはまた、非付着レポー
ター標識抗ヒト抗体を含む。この実施形態においては、抗体とポリペプチド抗原
との結合はこのレポーター標識抗体の結合により検出され得る。

【０５２９】 さらなる実施形態においては、本発明は、本発明のポリペプチドの抗原を含む
血清をスクリーニングする際に用いる診断用キットを含む。この診断用キットは
、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド抗原と特異的に免疫反応性の実質的に単
離された抗体、およびポリヌクレオチドまたはポリペプチド抗原と抗体との結合
を検出する手段を含む。１つの実施形態においては、抗体は、固体支持体に付着
される。特定の実施形態においては、その抗体は、モノクロナール抗体であり得
る。このキットの検出手段は、第二の標識モノクロナール抗体を含み得る。ある
いは、またはさらに、この検出手段は、標識された競合抗原を含み得る。

【０５３０】 １つの診断の構成においては、試験血清は、本発明の方法により得られる表面
結合抗原を有する固相試薬と反応する。特異的な抗原抗体をこの試薬と結合させ
、そして結合されない血清成分を洗浄により除去した後、固体支持体上に結合す
る抗抗原抗体の量に応じて、レポーターをこの試薬と結合させるために、この試
薬をレポーター標識抗ヒト抗体と反応させる。この試薬は、結合されない標識抗
体を除去するため、再度洗浄され、そしてこの試薬と会合したレポーターの量が
決定される。代表的には、レポーターは、適切な蛍光定量的基質、発光基質また
は比色基質（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）の存在下で、この固相をイ
ンキュベートすることにより検出される酵素である。

【０５３１】 上記のアッセイにおける固体表面試薬は、タンパク質材料を固体支持体材料（
例えば、高分子ビーズ、ディップスティック、９６ウェルプレートまたは濾過材
料）に付着させるための公知の技術により調製される。これらの付着方法として
は、一般的に、支持体へのタンパク質の非特異的な吸着または固体支持体上の化
学的に反応性の基（例えば、活性なカルボキシル基、ヒドロキシル基、またはア
ルデヒド基）とのタンパク質の共有結合（ｃｏｖａｌｅｎｔ ａｔｔａｃｈｍｅ
ｎｔ）（代表的には、遊離アミン基を介する）が挙げられる。あるいは、ストレ
プトアビジンでコートされたプレートが、ビオチン化された抗原と共に使用され
得る。

【０５３２】 従って、本発明は、この診断方法を行うためのアッセイ系またはキットを提供
する。このキットは、一般的に、表面結合された組み換え抗原を有する支持体、
および表面結合された抗抗原抗体を検出するための、レポーター標識された抗ヒ
ト抗体を含む。

【０５３３】 本発明を一般的に記載してきたが、本発明は、以下の実施例を参照することに
よってより容易に理解される。これらは、説明のために提供されるものであり、
限定することを意図しない。

【０５３４】 （実施例） （実施例１：Ｅ．ｃｏｌｉにおけるエンドカインαの発現および精製） 寄託されたｃＤＮＡクローン中のエンドカインαタンパク質をコードするＤＮ
Ａ配列をこのエンドカインαタンパク質のアミノ末端配列に特異的なＰＣＲオリ
ゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅した。クローニングを容易にするため
の制限部位を含むさらなるヌクレオチドを５’配列および３’配列のそれぞれに
付加した。

【０５３５】 ５’オリゴヌクレオチドプライマーは、下線を引いたＮｃｏＩ制限部位を含む
配列

【０５３６】

【化３】 を有する。

【０５３７】 ３’プライマーは、下線を引いたＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を含む配列

【０５３８】

【化４】 を有する。

【０５３９】 この制限部位は、細菌発現ベクターｐＱＥ６０における制限酵素部位に対して
便利であり、このベクターは、本実施例においてＭ１５／ｒｅｐ４宿主細胞にお
ける細菌発現のために使用する（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔ
ｈ，ＣＡ，９１３１１）。ｐＱＥ６０は、アンピシリン抗生物質耐性（「Ａｍｐ ^r 」）をコードし、そして細菌の複製起点（「ｏｒｉ」）、ＩＰＴＧ誘導性プロ
モーター、リボソーム結合部位（「ＲＢＳ」）、６−Ｈｉｓタグおよび制限酵素
部位を含む。

【０５４０】 増幅したエンドカインαタンパク質ＤＮＡおよびベクターｐＱＥ６０の両方を
ＮｃｏＩおよびＨｉｄＩＩＩで消化し、次いで、消化されたＤＮＡを互いに連結
する。エンドカインαタンパク質ＤＮＡの制限化されたｐＱＥ６０ベクターへの
挿入は、エンドカインαタンパク質コード領域をベクターのＩＰＴＧ誘導性プロ
モーターの下流に置き、かつベクターのＩＰＴＧ誘導性プロモーターとエンドカ
インαタンパク質の翻訳のためにおおよそ位置決めされた開始ＡＴＧとインフレ
ームで作動可能に連結した。

【０５４１】 連結混合物を、標準的な手順を使用してコンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞に形質
転換する。このような手順は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第二版；Ｃｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）に記載される。ｌａｃリプレ
ッサーを発現し、そしてカナマイシン耐性（「Ｋａｎ^r」）を与える、プラスミ
ドｐＲＥＰ４の多コピーを含むＥ．ｃｏｌｉ株Ｍ１５／ｒｅｐ４を、本明細書中
に記載された例示的な実施例を実施するのに使用する。エンドカインαタンパク
質を発現するために適切である多くのうちの１つであるこの株は、Ｑｉａｇｅｎ
から市販される。

【０５４２】 形質転換体は、それらがアンピシリンおよびカナマイシンの存在下でＬＢプレ
ート上で増殖する能力によって同定する。プラスミドＤＮＡを耐性コロニーから
単離し、そしてクローン化ＤＮＡの同一性を、制限分析によって確認した。

【０５４３】 所望の構築物を含むクローンは、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）およびカ
ナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）の両方を補充したＬＢ培地の液体培養において一
晩（「Ｏ／Ｎ」）で増殖する。

【０５４４】 Ｏ／Ｎ培養物を大量培養に約１：１００〜１：２５０の希釈で接種するために
使用する。この細胞を、６００ＮＭでの光学密度（「ＯＤ６００」）が０．４と
０．６との間まで増殖する。次いで、イソプロピル−Ｂ−Ｄ−チオガラクトピラ
ノシド（「ＩＰＴＧ」）を添加し、最終濃度１ｍＭとして、ｌａｃリプレッサー
を不活性化することによってｌａｃリプレッサー感受性プロモーターからの転写
を誘導する。細胞を連続的に３〜４時間さらにインキュベートする。次いで、細
胞を遠心分離によって収集し、そして標準的な方法によって破砕する。封入体を
破砕された細胞から慣用的な収集技術を使用して精製し、そしてタンパク質を封
入体から８Ｍ尿素へ可溶化する。可溶化タンパク質を含む８Ｍ尿素溶液を２×リ
ン酸緩衝化生理食塩水（「ＰＢＳ」）中でＰＤ−１０カラムに通し、これによっ
て、尿素を除去し、緩衝液を交換し、そしてタンパク質を再び折り畳む。このタ
ンパク質を、エンドトキシンを除去するためにクロマトグラフィーのさらなる工
程によって精製する。次いで、精製タンパク質を、滅菌濾過する。滅菌濾過した
タンパク質調製物を、２×ＰＢＳ中に保存した。

【０５４５】 （実施例２：バキュロウイルス発現系におけるエンドカインαのクローニング
および発現） 寄託されたクローンにおけるエンドカインαタンパク質をコードするｃＤＮＡ
配列を、この遺伝子の５’領域および３’領域に対応するＰＣＲオリゴヌクレオ
チドプライマーを使用して増幅する。

【０５４６】 ５’プライマーは、下線を引いたＢａｍＨＩ制限酵素部位および図１における
エンドカインαタンパク質の一部をコードするヌクレオチドを含む配列

【０５４７】

【化５】 を有する。

【０５４８】 ３’プライマーは、下線を引いたＢａｍＨＩ制限部位および図１におけるエン
ドカインαタンパク質の一部をコードする配列に相補的な配列を含む配列

【０５４９】

【化６】 を有する。

【０５５０】 増幅したフラグメントを、市販のキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」ＢＩＯ １
０１ Ｉｎｃ．，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａ）を使用して１％アガロースゲルから
単離する。次いで、このフラグメントをＢａｍＨＩで消化し、そして再度１％ア
ガロースゲルで精製する。このフラグメントは、本明細書中でＦ２と称される。

【０５５１】 ベクターｐＡ２−ＧＰを使用して、Ｓｕｍｍｅｒｓら、Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏ
ｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎ
ｄ Ｉｎｓｅｃｔ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ、Ｔｅｘ
ａｓ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｓｔａｔｉｏｎ
Ｂｕｌｌｅｔｉｎ Ｎｏ．１５５５（１９８７）に記載のような標準的な方法
を使用して、バキュロウイルス発現系においてエンドカインαタンパク質を発現
する。この発現ベクターは、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核
多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）の強力なポリヘドリンプロモーター、続いて
簡便な制限部位を含む。Ｎ末端メチオニンを含むＡｃＭＮＰＶ ｇｐ６７のシグ
ナルペプチドは、ＢａｍＨＩの直ぐ上流に位置される。シミアンウイルス４０（
「ＳＶ４０」）のポリアデニル化部位を、効率的なポリアデニル化のために使用
する。組換えウイルスの容易な選択のために、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のβ−ガラクト
シダーゼ遺伝子を、ポリへドリンプロモーターと同方向で、続いて、ポリへドリ
ン遺伝子のポリアデニル化シグナルを挿入する。ポリへドリン配列を、野生型ウ
イルスＤＮＡとの細胞媒介性の相同組換えのためのウイルス配列によって両方の
側で隣接させ、クローン化ポリヌクレオチドを発現する生存可能なウイルスを作
製する。

【０５５２】 多くの他のバキュロウイルスベクター（例えば、ｐＡｃ３７３、ｐＶＬ９４１
、およびｐＡｃＩＭ１）は、当業者が容易に理解するように、構築物が転写、翻
訳、分泌などのために適切に配置されたシグナル（必要とされる場合、インフレ
ームなＡＵＧおよびシグナルペプチドを含む）を提供する限りにおいて、ｐＡ２
−ＧＰの代わりに使用され得る。このようなベクターは、数ある中でＬｕｃｋｏ
ｗら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７０：３１−３９に記載される。

【０５５３】 このプラスミドを、当該分野で公知の慣用的な手順を使用して、制限酵素Ｂａ
ｍＨＩで消化し、次いで仔ウシ腸ホスファターゼを使用して脱リン酸化する。次
いで、このＤＮＡを、市販のキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」、ＢＩＯ １０１
Ｉｎｃ．，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａ．）を使用して１％アガロースゲルから単
離する。このベクターを、本明細書中で「Ｖ２」と称する。

【０５５４】 フラグメントＦ２および脱リン酸化プラスミドＶ２を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで
互いに連結する。Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１細胞を連結混合物で形質転換し、そ
して培養プレート上に塗り広げた。ＢａｍＨＩを使用して個々のコロニー由来の
ＤＮＡを消化し、次いで、ゲル電気泳動によって消化産物を分析することによっ
てヒトエンドカインα遺伝子を有するプラスミドを含む細菌を同定する。このク
ローン化フラグメントの配列をＤＮＡ配列決定によって確認する。

【０５５５】 ５μｇのプラスミドを、１．０μｇの市販の直線化バキュロウイルスＤＮＡ（
「ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ^TMバキュロウイルスＤＮＡ」Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓ
ａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ」）とともに、Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：７４１３−７４１７（１９８７）によって
記載されたリポフェクション法を使用して同時トランスフェクトする。１μｇの
ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ^TMウイルスＤＮＡおよび５μｇのプラスミドを、５０μｌ
の無血清グレース培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｇａ
ｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を含むマイクロタイタープレートの滅菌ウェルに
おいて混合する。その後、１０μｌのリポフェクチンおよび９０μｌグレース培
地を加え、混合し、そして室温で１５分間インキュベートする。次いで、トラン
スフェクション混合液を、無血清のグレース培地１ｍｌを加えた３５ｍｍ組織培
養プレートに播種したＳｆ９昆虫細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １７１１）に滴下す
る。このプレートを前後に揺らし、そして新しく添加した溶液と混合する。次い
で、このプレートを２７℃で５時間インキュベートする。５時間後、トランスフ
ェクション溶液をこのプレートから除去し、そして１０％ウシ胎仔血清を補充し
た１ｍｌのグレース昆虫培地を添加する。このプレートをインキュベーターに戻
し、そして培養を２７℃で４日間継続する。

【０５５６】 ４日後上清を収集し、そしてＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ（前出）によっ
て記載されるようにプラークアッセイを行う。「Ｂｌｕｅ Ｇａｌ」（Ｌｉｆｅ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）を含むア
ガロースゲルを使用して、ｇａｌが発現しているクローン（青色に染色したプラ
ークを生ずる）の容易な同定および単離を可能にする。（この型の「プラークア
ッセイ」の詳細な説明はまた、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．
，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇによって頒布される、昆虫細胞培養およびバキュロ
ウイルス学のための使用者ガイド９−１０頁の中に見出され得る）。

【０５５７】 連続希釈から４日後、ウイルスを細胞に添加する。適切なインキュベーション
後、青く染色したプラークを、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆピペットのチップで拾う。次
いで、この組換えウイルスを含む寒天を２００μｌのグレース培地を含むＥｐｐ
ｅｎｄｏｒｆチューブにおいて再懸濁する。この寒天を短時間遠心分離により除
去し、そして組換えバキュロウイルスを含む上清を使用して、３５ｍｍ皿におい
て播種されたＳＦ９細胞を感染する。４日後、これらの培養皿の上清を採集し、
次いで４℃で保存する。適切に挿入されたエンドカインαを含むクローンを、こ
のプラスミドの制限マッピングおよび配列決定を含むＤＮＡ分析によって同定す
る。

【０５５８】 Ｓｆ９細胞を、１０％熱不動化ＦＢＳを補充したグレース培地において増殖す
る。この細胞を、約２（約１〜約３）の感染多重度（「ＭＯＩ」）で、組換えバ
キュロウイルスで感染させる。６時間後に培地を除去し、そしてメチオニンおよ
びシステインを含まないＳＦ９００ ＩＩ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇから入手可能）に置き換える。４
２時間後、５μＣｉの³⁵Ｓ−メチオニンおよび５μＣｉの³⁵Ｓ−システイン（Ａ
ｍｅｒｓｈａｍから入手可能）を添加する。細胞をさらに１６時間インキュベー
トし、次いで遠心分離によって採集し、溶解し、そして標識タンパク質をＳＤＳ
−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーによって可視化する。

【０５５９】 （実施例３：ＣＨＯ細胞におけるクローニングおよび発現） ベクターｐＣ４を、エンドカインαタンパク質の発現のために使用する。プラ
スミドｐＣ４は、プラスミドｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ受託番号３７１４６
）の誘導体である。このプラスミドは、ＳＶ４０初期プロモーターの制御下で、
マウスＤＨＦＲ遺伝子を含む。これらのプラスミドでトランスフェクトされるジ
ヒドロ葉酸活性を欠如するチャイニーズハムスター卵巣細胞または他の細胞は、
化学治療剤メトトレキサートを補充した選択培地（αマイナスＭＥＭ、Ｌｉｆｅ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で細胞を増殖させることによって選択され得る
。メトトレキサート（ＭＴＸ）に耐性である細胞におけるＤＨＦＲ遺伝子の増幅
は、よく考証されている（例えば、Ａｌｔ，Ｆ．Ｗ．、Ｋｅｌｌｅｍｓ，Ｒ．Ｍ
．Ｂｅｒｔｉｎｏ，Ｊ．Ｒ．，およびＳｃｈｉｍｋｅ，Ｒ．Ｔ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ
．Ｃｈｅｍ．２５３：１３５７−１３７０（１９７８）；Ｈａｍｌｉｎ，Ｊ．Ｌ
．およびＭａ，Ｃ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１０９
７：１０７−１４３（１９９０）；Ｐａｇｅ，Ｍ．Ｊ．およびＳｙｄｅｎｈａｍ
，Ｍ．Ａ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：６４−６８（１９９１）を参照の
こと）。漸増濃度のＭＴＸにおいて増殖した細胞は、ＤＨＦＲ遺伝子の増幅の結
果として、標的酵素ＤＨＦＲを過剰産生することによって薬物への耐性を発達す
る。第二の遺伝子がＤＨＦＲ遺伝子に連結される場合、通常、同時増幅され、そ
して過剰発現される。このアプローチを使用して、増幅遺伝子の１，０００を超
えるコピーを有する細胞株を開発し得ることは当該分野で公知である。続いて、
メトトレキサートが取り除かれる場合、宿主細胞の１以上の染色体に取り込まれ
た増幅遺伝子を含む細胞株が得られる。

【０５６０】 プラスミドｐＣ４は、目的の遺伝子の発現のために、ラウス肉腫ウイルス（Ｃ
ｕｌｌｅｎら、Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：４３８−４４７（１９８
５））の長末端反復（ＬＴＲ）の強力なプロモーターに加えてヒトサイトメガロ
ウイルス（ＣＭＶ）（Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ ４１：５２１−５３０（１
９８５））の最初期遺伝子のエンハンサーから単離されたフラグメントを含む。
プロモーターの下流は、遺伝子の取り込みを可能にする、ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ
およびＡｓｐ７１８制限酵素切断部位である。これらのクローニング部位の後ろ
に、このプラスミドは、ラットプレプロインスリン遺伝子の３’イントロンおよ
びポリアデニル化部位を含む。他の高効率プロモーターもまた、発現のために使
用され得る（例えば、ヒトβアクチンプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター
もしくは後期プロモーター、または他のレトロウイルス（例えば、ＨＩＶおよび
ＨＴＬＶＩ）由来の長末端反復）。ＣｌｏｎｔｅｃｈのＴｅｔ−ＯｆｆおよびＴ
ｅｔ−Ｏｎの遺伝子発現システムならびに類似のシステムを使用して、哺乳動物
細胞中に調節された方法でエンドカインαを発現し得る（Ｇｏｓｓｅｎ，Ｍ．お
よびＢｕｊａｒｄ，Ｈ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９
：５５４７−５５５１（１９９２））。ｍＲＮＡのポリアデニル化のために、他
のシグナル（例えば、ヒト成長ホルモンまたはグロビン遺伝子由来）も同様に使
用され得る。染色体に組み込まれた目的の遺伝子を保有する安定な細胞株もまた
、選択マーカー（例えば、ｇｐｔ、Ｇ４１８、またはハイグロマイシン）での同
時トランスフェクトの際に選択され得る。初めに１より多い選択マーカー（例え
ば、Ｇ４１８およびメトトレキサート）を使用することが有用である。

【０５６１】 プラスミドｐＣ４を制限酵素ＢａｍＨＩおよびＡｓｐ７１８Ｉで消化し、次い
で当該分野に公知の手順により仔ウシ腸ホスフェートを用いて、脱リン酸化する
。このベクターを、次いで１％アガロースゲルから単離する。

【０５６２】 完全エンドカインαタンパク質のリーダー配列を含むこのタンパク質をコード
するＤＮＡ配列を、遺伝子の５’配列および３’配列に対応するＰＣＲオリゴヌ
クレオチドプライマーを用いて増幅する。この５’プライマー配列は、下線のＢ
ａｍ ＨＩ制限酵素部位を含む配列５’ＧＣＧＧＧＡＴＣＣＧＣＣＡＴＣＡＴＧ
ＣＣＴＴＴＡＡＧＣＣＡＴＴＣ３’（配列番号９）を含有し、続いて、真核生物
細胞における翻訳の開始のために効率的なシグナル（Ｋｏｚａｋ，Ｍ．，Ｊ．Ｍ
ｏｌ．Ｂｉｏｌ． １９６：９４７−９５０（１９８７）に記載されるような）
および図１（配列番号１）に示されるエンドカインαのコード配列の１７塩基を
含有する。この３’プライマーは、下線のＡｓｐ７１８Ｉ制限部位を含む配列５
’ＧＣＧＧＡＴＣＣＣＴＡＧＧＡＧＡＴＧＡＡＴＴＧＧＧＡＴＴＴＧ３’を含有
し、続いて図１（配列番号１）中に示されるエンドカインα遺伝子の翻訳されて
いない領域に相補的な多くのヌクレオチドを含有する。

【０５６３】 この増幅されたフラグメントを、エンドヌクレアーゼＢａｍ ＨＩおよびＡｓ
ｐ７１８Ｉで消化し、次いで１％アガロースゲル上で精製する。次いで、単離し
たフラグメントおよび脱リン酸化したベクターをＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いて
連結する。次いで、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１またはＸＬ−１ Ｂｌｕｅ細胞を
形質転換し、そして例えば、制限酵素分析を用いてプラスミドｐＣ４へ挿入され
たフラグメントを含む細菌を同定する。

【０５６４】 活性なＤＨＦＲ遺伝子を欠損するチャイニーズハムスター卵巣細胞を、トラン
スフェクションのために使用する。５μｇの発現プラスミドｐＣ４を、リポフェ
クチン法（Ｆｅｌｇｎｅｒら、前出）を用いて、０．５μｇのプラスミドｐＳＶ
２ｎｅｏとともに同時トランスフェクトする。プラスミドｐＳＶ２−ｎｅｏは、
優性選択マーカー（Ｇ４１８を含む一群の抗生物質に対する耐性を与える酵素を
コードするＴｎ５由来のｎｅｏ遺伝子）を含む。細胞を、１ｍｇ／ｍｌのＧ４１
８を補充したαマイナスＭＥＭに播種する。２日後、細胞をトリプシン処理し、
そして１０、２５、または５０ｎｇ／ｍｌのメトトレキサートおよび１ｍｇ／ｍ
ｌ Ｇ４１８を補充したαマイナスＭＥＭ中のハイブリドーマクローニングプレ
ート（Ｇｒｅｉｎｅｒ， Ｇｅｒｍａｎｙ）に播種する。約１０〜１４日後、単
一のクローンをトリプシン処理し、次いで異なる濃度のメトトレキサート（５０
ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、４００ｎＭ、８００ｎＭ）を用いて、６ウェル
ペトリ皿または１０ｍｌフラスコに播種する。次いで、最高濃度のメトトレキサ
ートで増殖するクローンを、さらに高濃度のメトトレキサート（１μＭ、２μＭ
、５μＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ）を含む新たな６ウェルプレートに移す。同じ手
順を、１００〜２００μＭの濃度で増殖するクローンが得られるまで繰り返す。
ＰＧＲＰ−Ｋ、ＰＧＲＰ−Ｗ、またはＰＧＲＰ−Ｃのいずれかの発現を、例えば
、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析によるか、または逆相ＨＰＬ
Ｃ分析によって分析する。

【０５６５】 （実施例４：エンドカインα発現の組織分布） 数ある中で、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）によって記載された方法を用いるノ
ーザンブロット分析を実行し、ヒト組織内のエンドカインαタンパク質をコード
する遺伝子の発現のレベルを試験した。本発明のエンドカインαタンパク質のヌ
クレオチド配列全体（配列番号１）を含むｃＤＮＡプローブを、ｒｅｄｉｐｒｉ
ｍｅ^TM ＤＮＡ標識システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）
を用いて、製造業者の使用説明書に従って、³²Ｐで標識した。標識後、このプロ
ーブを、ＣＨＲＯＭＡ ＳＰＩＮ−１００^TMカラム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．）を使用して、製造業者のプロトコル番号ＰＴ１
２００−１に従って精製した。次いで、精製した標識プローブを使用して、種々
のヒト組織をエンドカインαタンパク質をコードする遺伝子の発現について試験
した。

【０５６６】 種々のヒト組織（Ｈ）またはヒト免疫系組織（ＩＭ）を含む多重組織ノーザン
（ＭＴＮ）ブロットをＣｌｏｎｔｅｃｈから入手し、そしてＥｘｐｒｅｓｓＨｙ
ｂ^TMハイブリダイゼーション溶液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて、製造業者のプ
ロトコル番号ＰＴ１１９０−１に従って、標識プローブを用いて試験した。ハイ
ブリダイゼーションおよび洗浄後、このブロットをマウントして、そして−７０
℃で一晩フィルムに曝露し、そしてこのフィルムを標準的な手順に従って現像し
た。

【０５６７】 本発明のエンドカインαタンパク質をコードする遺伝子の発現は、ヒトの脳線
条および膵臓組織において検出された。

【０５６８】 （実施例５：ＴＮＦレセプタースーパーファミリーの新規な活性化誘導タンパ
ク質およびそのリガンドの同定） （背景） ＴＮＦＲスーパーファミリーのメンバーは、細胞外ドメインの同様な複数のシ
ステインが豊富な擬似繰り返しを共有し、各々が、６つのシステインを伴なう３
０〜４５のアミノ酸を含む（Ｓｍｉｔｈ，Ｃ．Ａ．ら、Ｃｅｌｌ ７６：９５９
〜９６２（１９９４））。ＴＮＦＲ１（Ｓｃｈａｌｌ，Ｔ．Ｊら、Ｃｅｌｌ ６
１：３６１〜３７０（１９９０））、Ｆａｓ（Ｔｒａｕｔｈ，Ｂ．Ｃ．ら、Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ ２４５：３０１〜３０５（１９８９）、Ｙｏｎｅｈａｒａ，Ｓ．ら
、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６９：１７４７〜１７５６（１９８９）、およびＯｅ
ｈｍ，Ａ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１０７０９〜１０７１５（１
９９２））、ＤＲ３（Ｃｈｉｎｎａｉｙａｎ，Ａ．Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２
７４：９９０〜９９２（１９９６）、Ｋｉｔｓｏｎ，Ｊ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３
８４：３７２〜３７５（１９９６）、Ｂｏｄｍｅｒ，Ｊ．−Ｌ．ら、Ｉｍｍｕｎ
ｉｔｙ ６：７９〜８８（１９９７）およびＳｃｒｅａｔｏｎ，Ｇ．Ｒ．ら、Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：４６１５〜４６１９（１
９９７））、ＤＲ４（Ｗｉｌｅｙ，Ｓ．Ｒ．ら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ３：６７３
〜６８２（１９９５）、Ｐｉｔｔｉ，Ｒ．Ｍ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２
７１：１２６８７〜２６９０（１９９６）およびＰａｎ，Ｇ．ら、Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ ２７６：１１１〜１１３（１９９７））、ＤＲ５（Ｗａｌｃｚａｋ，Ｈ．ら
、ＥＭＢＯ Ｊ．１６：５３８６〜５３９７（１９９７）、Ｍａｃ Ｆａｒｌａ
ｎｅ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２５４１７〜２５４２０（１
９９７）、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｐ．ら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ７：８３１〜８３
６（１９９７）、Ｃｈａｕｄｈａｒｙ，Ｐ．Ｍ．ら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ７：８
２１〜８３０（１９９７）およびＳｈｅｒｉｄａｎ，Ｊ．Ｐ．ら、Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ ２７７：８１８〜８２１（１９９７）、ならびにデコイＴＲＡＩＬレセプタ
ー（Ｍａｒｓｔｅｒｓ，Ｓ．Ａ．ら、Ｃｕｒ．Ｂｉｏｌ．７：１００３〜１００
６（１９９７）、Ｐａｎ，Ｇ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７７：８１５〜８１５（
１９９７）、Ｄｅｇｌｉ−Ｅｓｐｏｓｔｉ，Ｍ．Ａ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．
１８６：１１６５〜１１７０（１９９７）およびＤｅｇｌｉ−Ｅｓｐｏｓｔｉ，
Ｍ．Ａ．ら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ７：８１３〜８２０（１９９７））を含む細胞
死ドメイン含有ファミリーを除いて、注目すべき類似性は、これらの分子の細胞
内ドメイン内には、見出されない。しかし、マウスおよびヒトの４−１ＢＢ、Ｃ
Ｄ２７ならびにＴＮＦＲスーパファミリーメンバー内のマウスＧＩＴＲ（Ｋｗｏ
ｎ，Ｂ．Ｓ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１９
６３〜１９６７（１９８９）、Ｃａｍｅｒｉｍｉ，Ｄ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ
．１４７：３１６５〜３１６９（１９９１）、およびＮｏｃｅｎｔｉｎｉ，Ｇ．
ら、Ｐｒｏｃ，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：６２１６〜６２２
１（１９９７））の細胞質ドメインにおいて際立った相同性がある。酸性アミノ
酸は、このサブファミリーの細胞質ドメインにおいて特に高度に保存されている
。他のＴＮＦＲスーパーファミリーのメンバー（Ｓｍｉｔｈ，Ｃ．Ａ．ら、Ｃｅ
ｌｌ ７６：９５９〜９６２（１９９４））のように、このサブファミリーは、
多様な生物学的機能に関する。まず第１に、４−１ＢＢおよびＣＤ２７分子は、
それらのそれぞれのリガンドまたは拮抗抗体で結合される場合、Ｔ細胞増殖につ
いての強力な補助的刺激のシグナルを提供する（Ｓｍｉｔｈ，Ｃ．Ａ．ら、Ｃｅ
ｌｌ ７６：９５９〜９６２（１９９４）およびＰｏｌｌｏｋ，Ｋ．Ｅ．ら、Ｊ
．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：７７１〜７８１（１９９３））。補助的分子として
の機能に加えて、ＣＤ２７は、アポトーシス（Ｓｉｖａと言われる細胞死ドメイ
ン含有分子（Ｐｒａｓａｄ，Ｋ．Ｖ．Ｓ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：６３４６〜６３５１（１９９７））によって媒介される
）を誘導する。近年同定されたマウスＧＩＴＲは、ＴＣＲ誘導アポトーシスを阻
害することが示されている（Ｎｏｃｅｎｔｉｎｉ，Ｇ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：６２１６〜６２２１（１９９７））。

【０５６９】 サブファミリーメンバーの免疫学的機能は、比較的に良好に規定されてきたが
、それらのシグナル伝達経路についての見識は、ほんの近年明確にされた（Ａｒ
ｃｈ，Ｒ．Ｈ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８：５５８〜５６５（１９
９８）、Ｊａｎｇ，Ｉ．Ｋ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃ
ｏｍ．２４２：６１３〜６２０（１９９８）、Ｓａｏｕｌｌｉ，Ｋ．ら、Ｊ．Ｅ
ｘｐ．Ｍｅｄ．１８７：１８４９〜１８６２（１９９８）およびＡｋｉｂａ，Ｈ
．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：１３３５３〜１３３５８（１９９８）
）。２つのグループ（Ａｒｃｈ，Ｒ．Ｈ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１
８：５５８〜５６５（１９８８）、およびＪａｎｇ，Ｉ．Ｋ．ら、Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍ．２４２：６１３〜６２０（１９９８））
は、ＴＲＡＦ２分子との４−１ＢＢの会合が、ＮＦ−κＢの活性に導くシグナル
カスケードを開始するということを示すデータを提供した。ＣＤ２７シグナル伝
達通路において、ＴＲＡＦ２およびＴＲＡＦ５の両方は、ＮＦ−κＢおよびＳＡ
ＰＫ／ＪＮＫ（ストレス活性化タンパク質キナーゼ／ｃ−Ｊｕｎ Ｎ末端キナー
ゼ）活性化およびＮＩＫ（ＮＦ−κＢ誘導キナーゼ）（これは、ＴＲＡＦ２およ
びＴＲＡＦ５の共通の下流のキナーゼである）を媒介する（Ａｋｉｂａ，Ｈ．ら
、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：１３３５３〜１３３５８（１９９８））。

【０５７０】 ＴＮＦＲメンバーの数が、急速に拡大しているので、さらにより多くの数のス
ーパーファミリーが、存在すると予測された。マウスＧＩＴＲ配列を用いるＰＣ
Ｒに基づくストラテジーおよびＥＳＴ（発現された配列タグ）データベースを検
索することによって、ＴＮＦＲの新しいメンバーが、発見され、ＴＲ１１と名づ
けられた。以下は、レセプターＴＲ１１およびそのリガンドであるエンドカイン
αの特徴付けを提供する。

【０５７１】 （実験手順） （ｃＤＮＡクローン化） ７５０より多くの異なるｃＤＮＡライブラリーから
得た２百万より多くのＥＳＴを含むデータベースが、ランダムに選択したヒトｃ
ＤＮＡクローンのハイスループット自動化ＤＮＡ配列分析を用いて、Ｈｕｍａｎ
Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．によって作製された。このデータ
ベースに対するＴＮＦＲメンバーの公知のアミノ酸配列およびモチーフを用いる
特異的相同性およびモチーフの検索は、ＴＮＦＲファミリーの翻訳された配列に
３５〜５５％相同な翻訳された配列を有する幾つかのＥＳＴを明確にした。幾つ
かのクローンは、ＰＨＡ活性化Ｔ細胞、Ｔヘルパー細胞、白血球、癒合腹部創傷
、一次樹状細胞および脂肪組織のｃＤＮＡライブラリーから同定された。インタ
クトなＮ末端シグナルペプチドをコードする全長ＴＲ−１１ ｃＤＮＡクローン
を、ヒト活性化Ｔ細胞ライブラリーから得、そしてさらなる調査のために選択し
た（米国特許出願番号第０９／１７６，２００号（１９９８年１０月２１日出願
）を参照のこと）。このクローンの鎖の両方の完全ｃＤＮＡ配列を決定し、そし
てＴＮＦＲメンバーに対するその相同性を確認した。同一の遺伝子がまた、マウ
スＧＩＴＲ配列を用いるＰＣＲに基づくストラテジーによって同定された。同様
に、エンドカイン−α（ＴＮＦリガンド６）が、ＴＮＦリガンドファミリーメン
バーとの配列の相同性の系統的な比較を通して同定された。ＴＮＦリガンドファ
ミリーメンバーの配列に対して２５％相同である部分的なエンドカイン−αの配
列が、内皮ｃＤＮＡライブラリー、ＨＵＶＥＣ（ヒト臍静脈内皮細胞）ｃＤＮＡ
ライブラリー、脳ｃＤＮＡライブラリーおよび胎児肝臓ｃＤＮＡライブラリーか
ら同定された。全長のｃＤＮＡクローンがヒト脳ｃＤＮＡライブラリーから得ら
れた。

【０５７２】 （発現ベクター） 推定ＴＲ−１１タンパク質全体（アミノ酸２６〜２３４）
をコードする、全長ＴＲ−１１およびＨＡ（血球凝集素Ａエピトープ）タグ化Ｔ
Ｒ−１１を、センス（それぞれ、５’−ＣＴＡＧＣＴＡＧＣＴＡＧＶＶＶＡＧＣ
ＧＣＣＣＣＡＣＣＧＧＧＧＧＴＣＣＣ−３’および５’−ＣＴＡＧＣＴＡＧＣＴ
ＡＧＣＴＡＴＣＣＡＴＡＴＧＡＴＧＴＴＣＣＡＧＡＴＴＡＴＧＣＴＣＡＧＣＧＣ
ＣＣＣＡＣＣＧＧＧＧＧＴＣＣＣ−３’）プライマーならびにアンチセンス（５
’−ＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＧＣＧＧＧＣＣＧＣＴＣＡＣＡＣＣＣＡＣＡＧＧＴＣ
ＴＣＣＣＡＧ−３’）プライマーを用いるＰＣＲによって増幅し、Ｎｈｅ Ｉ／
Ｎｏｔ Ｉで切断し、そしてＣＤ５リーダー配列（Ｊａｎｇ，Ｉ．Ｋ．ら、Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍ．２４２：６１３〜６２０（１９
９８））の下流域にインフレームで、ｐｃＤＮＡ３．１（ｐｃＤＮＡ３．１／Ｃ
Ｄ５Ｌ−ＴＲ−１１）およびｐｃＤＮＡ３（ｐｃＤＮＡ３／ＣＤ５Ｌ−ＴＲ−１
１）にそれぞれ融合した。全長エンドカイン−αを、ＰＣＲ（センス、５’−Ａ
ＧＡＣＣＣＡＡＧＣＴＴＴＴＧＡＡＡＡＴＧＡＴ ＡＴＧＡＧＡＣＧＣ−３’；
アンチセンス、５’−ＡＧＡＣＧＧＧＡＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＡＴＡＧＴＡＡ
ＧＡＡＧＧＣ−３’）によって増幅し、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ／ＢａｍＨ Ｉを用い
て切断し、そしてｐｃＤＮＡ３．１（ｐｃＤＮＡ３．１／エンドカイン−α）お
よびｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ；ｐＣＥＰ４
／エンドカイン−α）に挿入した。Ｆｌａｇタグ化全長ＴＲＡＦ１、ＴＲＡＦ２
、ＴＲＡＦ３、ＴＲＡＦ５、ＴＲＡＦ６、ＮＩＫ、ドミナントネガティブＴＲＡ
Ｆ２（ｄｎＴＲＡＦ２）またはｄｎＮＩＫをコードするｐＲＫ５ベースの発現ベ
クターが、記載されてきた（Ｊａｎｇ，Ｉ．Ｋ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍ．２４２：６１３〜６２０（１９９８）、Ｒｏｔｈｅ，
Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９：１４２１〜１４２７（１９９５）、Ｈｕ，Ｈ
．Ｍ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：３００６９〜３００７２（１９９
４）、Ｎａｋａｎｏ，Ｈ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１４６６１〜
１４６６４（１９９６）、Ｔａｋｅｕｃｈｉ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ
．２７１：１９９３５〜１９９４２（１９９６）、Ｃａｏ，Ｚ．ら、Ｎａｔｕｒ
ｅ ３８３：４４３〜４４６（１９９６）およびＳｏｎｇ，Ｈ．Ｙ．ら、Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：９７９２〜９７９６（１９７
７））。ＮＦ−κＢ依存性Ｅ−セレクチン−ルシフェラーゼレポーター遺伝子（
ｐＥＬＡＭ−Ｌｕｃ）およびｐＲＳＶ−β−ガラクトシダーゼ（ｐＲＳＶ−β−
ｇａｌ）プラスミドもまた、他に記載されてきた（Ｒｏｔｈｅ，Ｍ．ら、Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ ２６９：１４２１〜１４２７（１９９５）およびＳｃｈｉｎｄｌｅｒ
，Ｕ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４：５８２０〜９７９６（１９９４
））。

【０５７３】 （ノーザンブロットおよびＲＴ（逆転写）−ＰＣＲ分析） ノーザンブロット
分析について、ｃＤＮＡプローブを、製造業者の使用説明書に従って、Ｒｅｄｉ
ｐｒｉｍｅ ＤＮＡ標識システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔ，ＩＬ）を用いて³²Ｐで標識した。組み
込まれていないヌクレオチドを、ＣＨＲＯＭＡ ＳＰＩＮ−１００（Ｃｌｏｎｅ
ｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を用いて標識プローブから除去した。種
々のヒト組織由来の１レーンあたり約２μｇのポリ（Ａ）ＲＮＡを含有する２つ
のヒト多重組織ポリ（Ａ）ＲＮＡブロットを、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから購入した。
さらに、異なる細胞株由来の２０ｍｇの全ＲＮＡを含有する２つの細胞株ブロッ
トを使用した。ノーザンブロットを、製造業者のマニュアルに従って、発現され
たハイブリダイゼーション溶液（Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉ
ｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）を用いて実行した。ＲＴ−Ｐ
ＣＲ分析について、全ＲＮＡを、デキサメタゾン、ＰＭＡ／イオノマイシンまた
は抗ＣＤ−３／ＣＤ２８ ｍＡｂを用いる刺激の後、ヒトＰＢＭＣから単離し、
そして刺激されてないかまたはＬＰＳ刺激されたＨＵＶＥＣ細胞から単離した。
ＲＴ−ＰＣＲを、標準条件下で実行した。

【０５７４】 （ＴＲ−１１とＴＲＡＦとの相互作用） ｐｃＤＮＡ３／ＣＤ５Ｌ−ＴＲ−１
１−ＨＡプラスミド（５μｇ／１０ｃｍプレート）を、標準的なリン酸カルシウ
ム沈殿方法によって、ｐＲＫ／ＴＲＡＦ１、２、３、５または６−Ｆｌａｇベク
ター（５μｇ／プレート）を用いて、ＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞（２×１０⁶
細胞／プレート）に同時トランスフェクトした。トランスフェクションの２４時
間後、細胞を、１ｍｌの溶解緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ［ｐＨ７．４］、２
５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％のＮｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０、５ｍＭ ＥＤＴＡ
、１０％のグリセロールおよびプロテアーゼインヒビター）を用いて、溶解させ
た。免疫沈降について、溶解物を、抗Ｆｌａｇ Ｍ２（Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄ
ａｋ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）またはコントロールマウスＩｇＧ１ ｍＡｂ
を用いて４℃で１時間インキュベートし、続いて、２０μｌのプロテインＧ−セ
ファロース（１：１スラリー）（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，
ＣＡ）を用いてさらに１時間インキュベートした。沈殿物を、溶解緩衝液を用い
て徹底的に洗浄し、次いで、ＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｅ
，ＭＡ）に移す前に、１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで分画した。ウェ
スターンブロット分析を、西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ
Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮと結合体化した抗ＨＡ
ｍＡｂを用いて実行し、そして増強された化学発光ウェスターンブロット検出シ
ステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて可視化した。

【０５７５】 （レポーターアッセイによるＮＦ−κＢの分析） 約０．５×１０⁶ＨＥＫ２
９３ＥＢＮＡ細胞／ウェルを、６ウェルプレートに播種した。２４時間後、細胞
を、ｐｃＤＮＡ３．１／ＣＤ５Ｌ−ＴＲ−１１およびＴＲＡＦ、ｄｎＴＲＡＦ２
、ＮＩＫまたはｄｎＮＩＫをコードするｐＲＫ５プラスミドの種々の組合せを用
いて、標準的なリン酸カルシウム沈殿方法により、トランスフェクトした。プラ
スミドの全量を、空のベクターを添加することにより、２．０μｇに調整した。
トランスフェクションの２４時間後、細胞を、２００μｌのレポーター溶解緩衝
液（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）中に溶解させた。ルシフェラーゼ
活性を、２０μｌの細胞抽出物を用いて測定した。５μｌの細胞抽出物を使用し
て、β−ガラクトシダーゼ活性を内部コントロールとしてアッセイし、そして発
光値を、個々のβ−ガラクトシダーゼ活性によって正規化した。

【０５７６】 （組換えタンパク質の産生および精製） ＴＲ−１１−Ｆｃ融合タンパク質を
、リガンドスクリーニングおよび細胞結合実験のために使用した。ＴＲ−１１の
測定した細胞外ドメイン（アミノ酸２６〜１３９）をコードするフラグメントを
、Ｎｈｅ Ｉ部位に隣接したセンスプライマー（５’−ＡＧＡＣＣＣＡＡＧＣＴ
ＴＧＴＧＧＧＣＴＣＴＴＧＡＡＡＣＣＣＧＧＣＡＴＧ−３’）およびＢｇｌ Ｉ
Ｉ部位に隣接したアンチセンスプライマー（５’−ＧＡＡＡＧＡＴＣＴＧＧＧＣ
ＴＣＴＧＣＣＧＧＣＧＧＧＧＡＣＣＣＴＧＧＧＡＣ−３’）を用いて、増幅した
。増幅したフラグメントを、Ｎｈｅ Ｉ／Ｂｇｌ ＩＩを用いて切断し、そして
５’末端ではＣＤ５Ｌと、そして３’末端ではヒトＩｇＧ１のＦｃ部分（ｐＣＥ
Ｐ４／ＣＤ５Ｌ−ＴＲ−１１−Ｆｃ）とインフレームで、哺乳動物ベクターｐＣ
ＥＰ４にクローン化した。ｐＣＥＰ４／ＣＤ５Ｌ−ＴＲ−１１−Ｆｃを、ＨＥＫ
２９３ ＥＢＮＡ細胞にトランスフェクトした。ＴＲ−１１−Ｆｃ−融合タンパ
ク質を、プロテインＧカラムを用いて、ｐＣＥＰ４／ＣＤ５Ｌ−ＴＲ−１１−Ｆ
ｃでトランスフェクトされたＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞上清から精製した。エ
ンドカイン−αタンパク質のＦｌａｇタグ化可溶性形態（アミノ酸３９〜１６９
）を産生するために、ｆｌａｇタグ化エンドカイン−α発現ベクター（ｐＣＥＰ
４／ＣＤ５Ｌ−エンドカイン−α−Ｆｌａｇ）を、センス（５’−ＣＴＡＧＣＴ
ＡＧＣＣＣＡＧＣＧＣＣＣＣＧＡＣＴＡＣＡＡＧＧＡＣＧＡＣＧＡＴＧＡＣＡＡ
ＧＧＡＧＡＣＴＧＣＴＡＡＧＧＡＧＣＣＣ−３’）プライマーおよびアンチセン
ス（５’−ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＣＴＡＴＡＧＴＡＡＧＡＡＧＧＣＴＣＣ−３’）
プライマーを用いて、エンドカイン−αコード配列のＰＣＲ増幅しＮｈｅ Ｉ／
Ｘｈｏ Ｉを用いて産物を消化し、ｐＣＥＰ４にＣＤ５Ｌ配列とインフレームで
クローン化することによって構築した。この構築物を、ＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ
細胞において発現させた。分泌エンドカイン−α−Ｆｌａｇを含有するトランス
フェクトされた細胞上清を収集し、そして結合アッセイのために使用した。いく
つかの実験のために、エンドカイン−α−Ｆｌａｇタンパク質を、製造業者の使
用説明書に従って、抗Ｆｌａｇゲル（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ．ＭＯ）を
用いて、収集した上清から精製した。

【０５７７】 （結合アッセイ） タンパク質結合アッセイを、Ｐａｎ，Ｇ．ら、Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ ２７６：１１１〜１１３（１９９７）に記載されるように、本質的に行っ
た。細胞結合アッセイについて、ＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞を、上記のように
ｐｃＤＮＡ３．１／ＣＤ５Ｌ−ＴＲ−１１またはｐｃＤＮＡ３．１を用いてトラ
ンスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後に、細胞を収集し、そし
てエンドカイン−α−Ｆｌａｇ含有上清、抗Ｆｌａｇ抗体およびＦＩＴＣ結合体
化抗マウスＩｇＧ抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｉ
ｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）を用いて連続的にインキュベートした。フローサイト
メトリー分析を、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳｃａｎ（Ｓａｎ
Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を用いて実行した。ジャーカットＴ細胞を、直鎖化ｐｃＤＮ
Ａ３．１／ＣＤ５Ｌ−ＴＲ−１１を用いてエレクトロポレーションによって安定
にトランスフェクトし、そしてＺｅｏｃｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の存在下
で選択した。この細胞株についての結合アッセイを、上記のように実行した。Ｔ
Ｒ−１１−Ｆｃ融合タンパク質の、膜結合エンドカイン−αに結合する能力を試
験するために、ｐＣＥＰ４／エンドカイン−αを、ＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞
に安定にトランスフェクトした。ハイグロマイシンの存在下での選択の後、エン
ドカイン−α発現細胞を収集し、ＴＲ−１１−Ｆｃタンパク質とともにインキュ
ベートし、続いて、ＦＩＴＣ結合体化抗ヒトＩｇＧ１抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）とともにインキュベートした。Ｂｅｃｔｏｎ Ｄ
ｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳｃａｎをフローサイトメトリー分析のために使用し
た。

【０５７８】 （結果および考察） ＴＲ１１を、ＥＳＴデータベースの検索およびマウスＧＩＴＲ配列を用いたＰ
ＣＲに基づくストラテジーによって同定した。仮にＴＲ−１１と名付けられる（
活性化誘導性ＴＮＦＲファミリーのメンバーとして）ヒト活性化Ｔ細胞ｃＤＮＡ
ライブラリー由来のクローンの全長ｃＤＮＡは、算出された２５ｋＤａの分子量
を有する、２３４アミノ酸のＩ型膜貫通タンパク質をコードする。このレセプタ
ーは、シグナルペプチド（最初の２５アミノ酸）および一つの膜貫通領域（アミ
ノ酸１４０〜１５８）を有する。他のＴＮＦＲファミリーのメンバーの細胞外ド
メインと比較する場合、ＴＲ−１１は、それぞれ第二のＴＮＦＲモチーフ、第三
のＴＮＦＲモチーフおよび第四のＴＮＦＲモチーフに対応する３つのシステイン
リッチな偽反復（ｐｓｅｕｄｏｒｅｐｅａｔ）を提示する。第一のシステイン偽
反復は、８つのシステイン残基を含み、そしてＣ４を欠失する。従って、Ｃ１〜
Ｃ２、Ｃ３〜Ｃ５およびＣ４〜Ｃ６のジスルフィド結合の規範的な型は、このモ
チーフ中に存在するようである。第二の偽反復は、第三のＴＮＦＲモチーフのい
くつかの特性を示すが、たとえこの第二の偽反復が７つのシステイン残基を含む
としても、Ｃ５が存在しない点において典型的ではない。第三の偽反復は、４−
１ＢＢの第四の偽反復との広範な相同性を示す。この細胞質ドメインは、４−１
ＢＢ、ＣＤ２７およびＧＩＴＲの細胞質ドメインにおいて高度に保存される酸性
アミノ酸を含む。全般的に、ＴＲ−１１は、マウスのＧＩＴＲに対して高い相同
性（５５％の同一性）を示すが、ＧＩＴＲとＴＲ−１１との間の第一のシステイ
ンリッチな偽反復において、ミスマッチが存在する。なぜなら、ＧＩＴＲの第一
の偽反復が、第一のＴＮＦＲのシステインリッチなモチーフに対応するからであ
る（Ｎｏｃｅｎｔｉｎｉ，Ｇ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ ９４：６２１６−６２２１（１９９７））。

【０５７９】 ＴＲ−１１ ｍＲＮＡの発現は、ノザンブロットハイブリダイゼーションによ
って、複数のヒト組織において研究した。１．２５ｋｂのｍＲＮＡが、リンパ節
、ＰＢＬで検出され、そして脾臓で弱く検出された。本発明者らはまた、ＴＲ−
１１ ｍＲＮＡの発現について、種々の腫瘍細胞株を試験した。１．２５ｋｂの
メッセージが、試験した細胞株の中で、結腸直腸腺癌細胞株であるＳＷ４８０の
みにおいて検出された。実質的にすべてのメンバーのＴＮＦＲスーパーファミリ
ーの発現が、抗原刺激／リンパ球活性化によって増強される（Ｓｍｉｔｈ，Ｃ．
Ａ．ら、Ｃｅｌｌ ７６：９５９−９６２（１９９４））。この認識と矛盾せず
に、ＴＲ−１１発現は、刺激後にＰＢＭＣにおいてアップレギュレートされた。
ＴＲ−１１のメッセージは、本発明者らが高感度ＲＴ−ＰＣＲ法を使用した場合
に、刺激を受けていないＰＢＭＣにおいて検出不可能であった。ＴＲ−１１発現
は、２４時間以内に、代表的なＰＢＭＣ刺激（例えば、ＰＭＡならびにイオノマ
イシンでの処理、または可溶性抗ＣＤ３ｍＡｂおよび抗ＣＤ２８ｍＡｂでの処理
）によって、明らかに誘導された。しかし、ＴＲ−１１発現についてのＦＡＣＳ
分析は、活性化ＰＢＭＣの小集団が、刺激後４８時間で細胞表面上にＴＲ−１１
を発現したことを示し、これは、長期の刺激が、ＴＲ−１１の最大の発現に必要
であることを示唆した（ＢＫ、未公表データ）。ＴＲ−１１の発現は、デキサメ
タゾンでの処理によって誘導されなかった。この性質は、ＧＩＴＲの性質とは異
なった（Ｎｏｃｅｎｔｉｎｉ，Ｇ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．ＵＳＡ ９４：６２１６−６２２１（１９９７））。

【０５８０】 最近、４−１ＢＢ分子が、ＴＲＡＦ１、ＴＲＡＦ２およびＴＲＡＦ３と関連す
ることが示された（Ａｒｃｈ，Ｒ．Ｈ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８
：５５８−５６５（１９９８）、Ｊａｎｇ，Ｉ．Ｋ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉ
ｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍ．２４２：６１３−６２０（１９９８）およびＳａ
ｏｕｌｌｉ，Ｋ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８７：１８４９−１８６２（１９
９８））。ＴＲ−１１の細胞質ドメインが、４−１ＢＢの細胞質ドメインに類似
するので、ＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞において過剰発現された６つの公知のＴ
ＲＡＦのうちの５つを共沈殿する能力を試験した。ＴＲＡＦ１、ＴＲＡＦ２およ
びＴＲＡＦ３とのＴＲ−１１の相互作用が観察されたが、ＴＲＡＦ５およびＴＲ
ＡＦ６との相互作用については観察されなかった。ＴＲＡＦ２とのＴＲ−１１の
会合は、ＴＮＦＲスーパーファミリーの他のメンバーと同様に（Ａｒｃｈ，Ｒ．
Ｈ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８：５５８−５６５（１９９８）、Ｊ
ａｎｇ，Ｉ．Ｋ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍ．２４
２：６１３−６２０（１９９８）、Ａｋｉｂａ，Ｈ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．２７３：１３３５３−１３３５８（１９９８）、Ｒｏｔｈｅ，Ｍ．ら、Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ ２６９：１４２１−１４２７（１９９５）、Ｃｈｅｎｇ，Ｇ．ら、
Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６７：１４９４−１４９８（１９９５）、Ｄｕｃｋｅｔｔ，
Ｃ．Ｓ．ら、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１７：１５３５−１５４２（１９９
７）およびＶａｎＡｒｓｄａｌｅ，Ｔ．Ｌ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：２４６０−２４６５（１９９６））、ＴＲ−１１が、
ＴＲＡＦ２を通じてＮＦ−κＢ活性化を媒介し得ることを示唆した。この可能性
を試験するために、ＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞におけるＮＦ−κＢレポーター
系を使用した（Ｒｏｔｈｅ，Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９：１４２１−１４
２７（１９９５））。ＴＲ−１１発現ベクターを用いる同時トランスフェクショ
ンは、ベクタートランスフェクションコントロールと比較した場合に、代表的に
は、３倍より高いルシフェラーゼ活性を誘導した。ＴＲＡＦ２とともに共発現さ
せた場合、ＴＲ−１１は、ＴＲＡＦ２単独で発現させたよりも高いルシフェラー
ゼ活性を誘導した。より重要なことには、ＲＩＮＧモチーフおよびジンクフィン
ガーモチーフを欠失するドミナントネガティブなＴＲＡＦ２（Ｒｏｔｈｅ，Ｍ．
ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９：１４２１−１４２７（１９９５））の過剰発現は
、ＴＲ−１１によって誘導されたルシフェラーゼ活性を排除した。これは、ＴＲ
ＡＦ２が、ＴＲ−１１についてのＮＦ−κＢ活性化の重要なメディエータである
ことを示す。同様の観察が、ＮＦ−κＢシグナル伝達経路においてＴＲＡＦ２の
下流に位置すると考えられるＮＩＫの活性が、ドミナントネガティブなＮＩＫ（
これは、触媒ドメインの２つのリジン残基を欠失する）の過剰発現によってブロ
ックされた場合になされた（Ｓｏｎｇ，Ｈ．Ｙ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：９７９２−９７９６（１９９７））。まとめると
、これらのデータは、ＴＲ−１１が、ＴＲＡＦ２／ＮＩＫ経路を通じてＮＦ−κ
Ｂ活性化を媒介することを示す。ＴＲＡＦ１およびＴＲＡＦ３が、ＨＥＫ２９３
ＥＢＮＡ細胞においてＴＲ−１１と会合することが見出されたので、ＴＲＡＦ
１およびＴＲＡＦ３の、ＴＲ−１１によって誘導されるＮＦ−κＢ活性化に対す
る効果を調べた。ＴＲＡＦ３の導入は、ＴＲ−１１の過剰発現によって誘導され
たルシフェラーゼ活性をほとんど廃止した。より少ない程度に、ＴＲＡＦ１の過
剰発現は、ＴＲ−１１によって誘導されたＮＦ−κＢ活性化を減少した。これら
のデータは、ＴＲＡＦ１および特にＴＲＡＦ３が、ＴＲ−１１に誘導されたＮＦ
−κＢ活性化をダウンレギュレートすることを示唆する。

【０５８１】 ＴＲ−１１のリガンドを同定するために、ＴＲ−１１−Ｆｃ融合タンパク質へ
の結合のためのＦｌａｇタグ化された候補ＴＮＦリガンドタンパク質のパネルを
、免疫沈降によってスクリーニングした。試験したＦｌａｇタグ化されたＴＮＦ
リガンドタンパク質の中で、ＴＲ−１１−Ｆｃが、選択的にエンドカイン−α−
Ｆｌａｇを結合した。本発明者らの条件において、４−１ＢＢおよびＴＲ２（Ｈ
ＶＥＭ）は、これらの同族リガンドである４−１ＢＢＬおよびＬＩＧＨＴ（Ｍａ
ｕｒｉ，Ｄ．Ｎ．ら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ８：２１−３０（１９９８））をそれ
ぞれ結合した。さらに、このデータは、エンドカイン−α−Ｆｌａｇタンパク質
が、ＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞の細胞表面上で一過性に発現されたＴＲ−１１
およびＪｕｒｋａｔ細胞の細胞表面上で構成的に発現されたＴＲ−１１を結合し
たことを明らかに示した。エンドカイン−αが、膜貫通タンパク質であるので（
下記を参照のこと）、フローサイトメトリーを使用し、ＴＲ−１１−Ｆｃ融合タ
ンパク質が、全長のエンドカイン−αで安定にトランスフェクトされたＨＥＫ２
９３ ＥＢＮＡ細胞を結合し得るか否かを決定した。結果は、ＴＲ−１１−Ｆｃ
タンパク質が、ＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞上で発現されたエンドカイン−αを
結合し得たことを示す。

【０５８２】 次に、ＴＲ−１１とエンドカイン−αとの間の相互作用が、ＮＦ−κＢ活性化
を生じるか否かを決定した。ＮＦ−κＢレポーターアッセイにおいて、リガンド
依存性ＮＦ−κＢ活性化は、ＴＲ−１１との膜貫通エンドカイン−αの同時トラ
ンスフェクション、またはエンドカイン−αを発現するＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ
細胞のトランスフェクションによって示された。さらに、ＴＲ−１１を、可溶性
エンドカイン−αタンパク質を構成的に分泌したＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞に
一過性にトランスフェクトした場合、ＮＦ−κＢ活性化は、空のベクターでトラ
ンスフェクトされたＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞と比較すると、顕著に増大した
。同様に、より高いＮＦ−κＢ活性化が、ＴＲ−１１で一過性にトランスフェク
トされた可溶性のエンドカイン−αタンパク質ＨＥＫ２９３細胞で処理すること
によって誘導された。これは、エンドカイン−αが、ＮＦ−κＢのＴＲ−１１特
異的活性化を誘発し得ることを示す。エンドカイン−αによるＮＦ−κＢのより
高い誘導が、ＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞におけるＴＲＡＦ２とのＴＲ−１１の
より強い会合と関連するようである。なぜなら、ＴＲＡＦ２とのＴＲ−１１のよ
り強い会合が、ＴＲ−１１単独でトランスフェクトされた細胞よりも、エンドカ
イン−αで同時トランスフェクトされた細胞において観察されたからである。

【０５８３】 エンドカイン−αは、ＥＳＴデータベースサーチによって最初に同定されたＴ
ＮＦリガンドタンパク質の一つであった。脳ｃＤＮＡライブラリー由来の全長エ
ンドカイン−αのクローンの親水性分析により、一つの疎水性膜貫通ドメイン、
およびシグナル配列の不在を推定される。エンドカイン−αは、Ｃ末端領域に２
つの可能性のあるグリコシル化部位を含む。これらの特徴は、エンドカイン−α
が、細胞外Ｃ末端領域を有するＩＩ型膜タンパク質であることを示唆する。ヒト
組織ＲＮＡのノザンブロット分析が、膵臓における一つの２．４ｋｂのエンドカ
イン−αのｍＲＮＡの発現を明らかにした。種々のヒト細胞株およびＰＢＭＣも
また、エンドカイン−α発現について調べた。なんのメッセージも、刺激されて
いないかまたは刺激されたかのいずれかであるＴ細胞株（ＣＥＭ−６およびＪｕ
ｒｋａｔ）、刺激されていないかまたは刺激されたかのいずれかであるＢ細胞株
（ＰｒｉｅｓｓおよびＦｒｅｖ）、刺激されていないかまたは刺激されたかのい
ずれかである前骨髄球性細胞株（ＨＬ−６０）、刺激されていないかまたは刺激
されたかのいずれかである単球細胞株（ＴＩＩＰ−１）および刺激されていない
かまたは刺激されたかのいずれかであるＰＢＭＣにて、ＲＴ−ＰＣＲによって検
出不可能であった。対照的に、ＨＵＶＥＣ細胞は、構成的にエンドカイン−αを
発現し、そしてその発現は、ＬＰＳでの刺激後にアップレギュレートされた。従
って、ＴＲ−１１およびそのリガンドが、活性化Ｔリンパ球と血管との間の相互
作用のために重要であると考えられる。

【０５８４】 ＴＲ−１１は、アミノ酸レベルでマウスのＧＩＴＲと５５％の同一性を有する
。ヒトとマウスとの間の高い配列保存は、ＴＲ−１１がマウスのＧＩＴＲのヒト
ホモログであるという証拠を提供する。しかし、この時点で、これらの２つのレ
セプターが、以下の事実に基づいて、互いに異なる機能を供給し得るという可能
性が残る：（１）ＧＩＴＲとＴＲ−１１との間の第一のシステインリッチな偽反
復においてミスマッチが存在する；（２）ＧＩＴＲと対照的に、ＴＲ−１１が、
デキサメタゾンによって誘導不可能である。

【０５８５】 要約すれば、ＴＲＡＦ２媒介性メカニズムを通じてＮＦ−κＢを活性化するＴ
ＮＦＲスーパーファミリーの新規のタンパク質であるＴＲ−１１が同定された。
ＴＲ−１１の発現は、活性化誘導性である。ＴＲ−１１についてのリガンドであ
るエンドカイン−αは、ＴＮＦリガンドファミリーのメンバーであり、そして内
皮細胞株において、構成的に発現される。これは、ＴＲ−１１およびそのリガン
ドが、活性化Ｔ細胞の輸送（ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ）に関与し得ることを示す
。

【０５８６】 （実施例６：単球に対するエンドカインαの効果） これらの研究は、エンドカイン−αでの処理が、単球からのＴＮＦ−α、ＭＣ
Ｐ−１、ＩＬ−８およびＩＬ−１０の放出を誘導し、そして単球におけるＩＬ−
１２の産生を阻害したことを開示する（データは示さず）。

【０５８７】 （方法） （単球精製）末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ勾配（Ｓ
ｉｇｍａ）を通じて遠心分離することによって、単一のドナーロイコパック（ｌ
ｅｕｋｏｐａｃｋ）（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｒｅｄ Ｃｒｏｓｓ，Ｂａｌｔｉｍｏ
ｒｅ，ＭＤ）から精製した。単球を、向流遠心性エルトリエーションによってＰ
ＢＭＣから単離した。

【０５８８】 （ＥＬＩＳＡ）ヒト単球を、漸増濃度のエンドカイン−αとともに、５×１０ ⁵ 細胞／ｍｌの密度でインキュベートした。ＩＬ−１２産生のために、この細胞
を、エンドカイン−αの存在下で、ＩＦＮ−γ（１００Ｕ／ｍｌ）を用いて一晩
プライムした。次いで、ＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）を添加した。馴化培地を、２
４時間後に収集し、そして使用するまで凍結させた。ＴＮＦ−α、ＩＬ−１０、
ＭＣＰ−１およびＩＬ−８の測定のためのＥＬＩＳＡキットを、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓ
ｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）から購入した。各々の値は、三連の
サンプル±標準偏差の平均であった。

【０５８９】 （酸化バースト）精製された単球を、２〜１×１０⁵細胞／ウェルで、９６ウ
ェルプレートにプレーティングした。漸増濃度のエンドカイン−αを、総量０．
２ｍｌの培養培地（ＲＰＭＩ １６４０＋１０％ ＦＣＳ、グルタミンおよび抗
生物質）中でウェルに添加する。３日間のインキュベーション後、プレートを遠
心分離し、そして培地を、ウェルから取り除く。マクロファージの単層に対して
、１ウェルあたり０．２ｍｌのフェノールレッド溶液（１４０ｍＭ ＮａＣｌ、
１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、５．５ｍＭ デキストロース
、０．５６ｍＭ フェノールレッドおよび１９Ｕ／ｍｌ ＨＲＰＯ）を、刺激物
（２００ｎＭ ＰＭＡ）とともに添加した。このプレートを、３７℃で２時間イ
ンキュベートし、そして反応を、１ウェルあたり２０μｌの１Ｎ ＮａＯＨを添
加することにより停止した。吸光度を、６１０ｎｍで読みとった。マクロファー
ジによって産生されたＨ₂Ｏ₂の量を算出するために、既知のモル濃度のＨ₂Ｏ₂溶
液の標準曲線を各々の実験について行った。

【０５９０】

【表３】 （実施例７：Ｂ細胞増殖および分化の刺激または阻害を検出するためのアッセ
イ） （背景） 機能的体液性免疫応答の生成は、Ｂ系統細胞とそれらの微小環境との間の可溶
性シグナル伝達および同族のシグナル伝達の両方を必要とする。シグナルは、Ｂ
系統細胞にそのプログラムされた発達を継続させる正の刺激、またはその細胞に
その現在の発達経路を停止することを指示する負の刺激を与え得る。現在までに
、多数の刺激性シグナルおよび阻害性シグナルが、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ５
、ＩＬ６、ＩＬ−７、ＩＬ１０、ＩＬ−１３、ＩＬ１４およびＩＬ１５を含むＢ
細胞の応答性に影響を及ぼすことが見出された。興味深いことに、これらのシグ
ナルは、単独では弱いエフェクターであるが、種々の同時刺激タンパク質と組み
合わせて、Ｂ細胞集団の間の活性化、増殖、分化、ホーミング、耐性および死を
誘導し得る。Ｂ細胞同時刺激タンパク質の最も研究されたクラスの一つは、ＴＮ
Ｆスーパーファミリーである。このファミリー内で、ＣＤ４０、ＣＤ２７および
ＣＤ３０は、これらのそれぞれのリガンドであるＣＤ１５４、ＣＤ７０およびＣ
Ｄ１５３とともに、種々の免疫応答を調節することが見出された。これらのＢ細
胞集団およびこれらの前駆体の、増殖および分化の、検出および／または観察を
可能にするアッセイは、増殖および分化に関して、これらのＢ細胞集団に対して
種々のタンパク質が有し得る効果を決定するのに価値ある手段である。以下に列
挙されたものは、Ｂ細胞集団およびそれらの前駆体の分化、増殖または阻害の検
出を可能にするように設計された２つのアッセイである。

【０５９１】 （実験手順） （インビトロアッセイ）精製されたエンドカイン−αタンパク質またはその短
縮型形態が、Ｂ細胞集団およびそれらの前駆体における活性化、増殖、分化また
は阻害および／または死を誘導する能力について評価される。０．１〜１０，０
００ｎｇ／ｍＬの範囲の用量にわたって定性的に測定された、精製ヒト扁桃Ｂ細
胞に対するエンドカイン−αタンパク質の活性が、標準的なＢリンパ球同時刺激
アッセイにおいて評価される。このアッセイにおいて、精製扁桃Ｂ細胞を、プラ
イミング剤として、ホルマリン固定Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕ
ｓ Ｃｏｗａｎ Ｉ（ＳＡＣ）または固定化抗ヒトＩｇＭ抗体のいずれかの存在
下で培養する。第二のシグナル（例えば、ＩＬ−２およびＩＬ−１５）は、ＳＡ
ＣおよびＩｇＭ架橋とともに協同し、トリチル化チミジン取り込みによって測定
されるようなＢ細胞増殖を誘発する。新規の協同因子は、このアッセイを用いて
容易に同定され得る。このアッセイとしては、ＣＤ−３陽性細胞の磁気ビーズ（
ＭＡＣＳ）枯渇によって、ヒト扁桃Ｂ細胞を単離する工程を含む。得られた細胞
集団は、ＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）の発現によって評価されるように、９５％より
も多くがＢ細胞である。各々のサンプルの種々の希釈物は、９６ウェルプレート
の個々のウェルに配置され、このプレートに、総量１５０μｌの培養培地（１０
％ ＦＢＳ、５×１０^-5Ｍ ２ＭＥ、１００Ｕ／ｍｌ ペニシリン、１０μｇ／
ｍｌ ストレプトマイシンおよびＳＡＣの１０^-5希釈物を含む、ＲＰＭＩ １６
４０）に懸濁された１０⁵個のＢ細胞を添加する。増殖または阻害を、因子の添
加７２時間後より³Ｈ−チミジン（６．７Ｃｉ／ｍＭ）を用いて、２０時間のパ
ルス（１μＣｉ／ウェル）によって定量化する。陽性コントロールおよび陰性コ
ントロールは、それぞれＩＬ２および培地である。

【０５９２】 （インビボアッセイ）ＢＡＬＢ／ｃマウスに、緩衝液のみか、または１ｋｇあ
たり２ｍｇのエンドカイン−αタンパク質、あるいはその短縮型形態を、１日あ
たり２回注射（ｉ．ｐ．）する。マウスにこの処置を継続して４日間与え、この
時点で、マウスを屠殺し、そして種々の組織および血清を分析のために収集する
。正常な脾臓およびエンドカイン−αタンパク質で処置された脾臓由来のＨ＆Ｅ
切片の比較により、脾臓細胞に対するエンドカイン−αタンパク質の活性の結果
（例えば、動脈周囲のリンパ鞘の拡散および／または赤色脾髄領域の有核の細胞
性（ｎｕｃｌｅａｔｅｄ ｃｅｌｌｕｌａｒｉｔｙ）の有意な増加）を同定し、
これは、Ｂ細胞集団の分化および増殖の活性化を示し得る。Ｂ細胞マーカーであ
る抗ＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）を使用する免疫組織化学的研究を、脾細胞に対する
なんらかの生理学的変化（例えば、脾臓組織崩壊）が、確立したＴ細胞領域を浸
潤する大まかに規定されたＢ細胞ゾーン内の増加したＢ細胞提示に起因するか否
かを決定するために使用する。

【０５９３】 エンドカイン−αタンパク質処置マウス由来の脾臓のフローサイトメトリー分
析を、エンドカイン−αタンパク質が、コントロールマウスにおいて観察される
比率を超えて、ＴｈＢ＋、ＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）ダル（ｄｕｌｌ）Ｂ細胞の比
率を特異的に増加させるか否かを示すために使用する。

【０５９４】 同様に、インビボでの増加した成熟Ｂ細胞提示の推定結果が、血清Ｉｇ力価に
おける相対的増加である。従って、血清ＩｇＭレベルおよび血清ＩｇＡレベルを
、緩衝液処置マウスとエンドカイン−αタンパク質処置マウスとの間で比較する
。

【０５９５】 （実施例８：Ｔ細胞の増殖および分化の刺激または阻害を検出するためのアッ
セイ） 抗ＣＤ３および／またはＰＨＡ同時刺激アッセイを、Ｔ細胞増殖および分化の
刺激または阻害を検出するために使用する。

【０５９６】 （アッセイパラメータ） 細胞： １ウェルあたりのＰＢＭＣ：１０⁵ １ドナーあたりの回収されたＰＢＭＣ：２００×１０⁶ １日あたりの総プレート：２０ １プレートあたりの上清：４８（各々２連でアッセイした） １ドナーあたり１日あたりの総上清：９６０（１日あたり２ドナー） 新規のアッセイを適応させるために、１週あたりさらに４ユニットの血液が必要
である。

【０５９７】 （試薬） 抗ヒトＣＤ３ ｍＡｂ（各ウェルで最終濃度２５ｐｇ／ｍＬ） ＰＨＡ ｒｈＩＬ−２（ポジティブコントロール）³ Ｈ−チミジン（０．５μＣｉ／ウェル、６．７Ｃｉ／ミリモル） ９６−ウェルプレート （プロトコール） ＰＢＭＣを精製する。 適切なコントロールを有するプレートを調製する。 ３７℃にて３〜４時間インキュベーションする。³ Ｈ−ＴｄＲを添加し、そしてインキュベーターに戻してさらに２０〜２４時間
インキュベーションする。 収集して計数する。

【０５９８】 （結果） このアッセイは、Ｅｎｄｏｋｉｎｅ−αがＰＭＢＣの抗ＣＤ３依存性増殖を促
進するかまたは阻害するのか、およびＥｎｄｏｋｉｎｅ−αが同時刺激シグナル
の非存在下でＰＢＭＣ増殖を刺激するか否かの決定を可能にする。

【０５９９】 （実施例９：ｓｃＦｖｓのライブラリーからの本発明のポリペプチドに対する
抗体フラグメントの単離） ヒトＰＢＬから単離した天然に存在するＶ遺伝子を、本発明のポリペプチドに
対する反応性を含む抗体フラグメントの大きいライブラリーに構築する。ドナー
は、この本発明のポリペプチドに曝露されていてもよいし、曝露されていなくて
もよい（例えば、米国特許第５，８８５，７９３号（その全体が参考として本明
細書に援用される）を参照のこと）。

【０６００】 （ライブラリーのレスキュー）ＰＣＴ公開ＷＯ ９２／０１０４７に記載のよ
うに、ヒトＰＢＬのＲＮＡからｓｃＦｖのライブラリーを構築する。抗体フラグ
メントを提示するファージをレスキューするため、ファージミドを保有する約１
０⁹個のＥ．ｃｏｌｉを用いて、５０ｍｌの２×ＴＹ（１％グルコースおよび１
００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する）（２×ＴＹ−ＡＭＰ−ＧＬＵ）を接
種し、そして振盪しながら０．８のＯ．Ｄ．まで増殖させる。この培養物の５ｍ
ｌを用いて５０ｍｌの２×ＴＹ−ＡＭＰ−ＧＬＵを接種（ｉｎｎｏｃｕｌａｔｅ
）する。２×１０⁸ＴＵのΔ遺伝子３ヘルパーファージ（Ｍ１３Δ遺伝子ＩＩＩ
、ＰＣＴ公開ＷＯ９２／０１０４７を参照のこと）を添加し、そして培養物を振
盪なしで３７℃で４５分間インキュベートし、次いで振盪しながら３７℃で４５
分間インキュベートする。この培養物を１０分間４０００ｒ．ｐ．ｍ．で遠心分
離し、そしてペレットを２リットルの２×ＴＹ（１００μｇ／ｍｌアンピシリン
および５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含有する）中に再懸濁し、そして一晩増殖
させる。ファージをＰＣＴ公開ＷＯ９２／０１０４７に記載のように調製する。

【０６０１】 Ｍ１３Δ遺伝子ＩＩＩを以下のように調製する：Ｍ１３Δ遺伝子ＩＩＩヘルパ
ーファージは、遺伝子ＩＩＩタンパク質をコードしない。それゆえ、抗体フラグ
メントを提示するファージ（ファージミド）は、抗原に対するより大きい結合ア
ビディティーを有する。ファージ形態形成の間、野生型遺伝子ＩＩＩタンパク質
を供給するｐＵＣ１９誘導体を保有する細胞においてヘルパーファージを増殖さ
せることにより、感染性Ｍ１３Δ遺伝子ＩＩＩ粒子を作製する。培養物を振盪な
しで３７℃で１時間インキュベートし、次いで振盪しながら３７℃でさらに１時
間インキュベートする。細胞をスピンダウン（ＩＥＣ−Ｃｅｎｔｒａ ８，４０
０ ｒ．ｐ．ｍで１０分間）し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび２５μ
ｇ／ｍｌのカナマイシンを含有する２×ＴＹブロス（２×ＴＹ−ＡＭＰ−ＫＡＮ
）３００ｍｌ中で再懸濁し、そして３７℃で振盪しながら一晩増殖させた。ファ
ージ粒子を、２回のＰＥＧ沈殿（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９９０）により培養培
地から精製および濃縮し、２ｍｌ ＰＢＳに再懸濁し、そして０．４５μｍのフ
ィルター（Ｍｉｎｉｓａｒｔ ＮＭＬ；Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を通過させ、約１
０¹³形質導入単位／ｍｌ（アンピシリン耐性クローン）の最終濃度を得た。

【０６０２】 （ライブラリーのパニング）Ｉｍｍｕｎｏｔｕｂｅｓ（Ｎｕｎｃ）を、１００
ｍｇ／ｍｌまたは１０ｍｇ／ｍｌのいずれかの本発明のポリヌクレオチドの４ｍ
ｌを用いてＰＢＳ中で一晩被膜する。チューブを２％Ｍａｒｖｅｌ−ＰＢＳを用
いて３７℃で２時間ブロックし、次いでＰＢＳ中で３回洗浄する。約１０¹³ＴＵ
のファージをこのチューブに適用し、そして、回転盤で上下に傾けながら室温で
３０分間インキュベートし、次いでさらに１．５時間静置しておく。チューブを
ＰＢＳ ０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０で１０回、そしてＰＢＳで１０回洗浄する。
１ｍｌの１００ｍＭトリエチルアミンを添加し、そして回転盤で１５分間上下に
回転させることによりファージを溶出し、その後、この溶液を０．５ｍｌの１．
０Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４で直ちに中和する。次いで、溶出したファ
ージを細菌とともに３７℃で３０分間インキュベートすることにより、ファージ
を用いて、１０ｍｌの対数増殖中期のＥ．ｃｏｌｉ ＴＧ１に感染させる。次い
で、Ｅ．ｃｏｌｉを１％グルコースおよび１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有
するＴＹＥプレート上にプレーティングする。次いで、生じた細菌ライブラリー
を、上記のようにΔ遺伝子３ヘルパーファージでレスキューし、次の回の選択の
ためのファージを調製する。次いで、このプロセスを、アフィニティー精製の全
４回について反復し、３回目および４回目にはチューブ洗浄をＰＢＳ、０．１％
Ｔｗｅｅｎ−２０で２０回、そしてＰＢＳで２０回に増加する。

【０６０３】 （結合剤の特徴付け）３回目および４回目の選択から溶出したファージを用い
て、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ ２１５１を感染させ、そして可溶性ｓｃＦｖをアッセ
イのために単一コロニーから生成する（Ｍａｒｋｓら、１９９１）。５０ｍＭ炭
酸水素塩、ｐＨ９．６中の本発明のポリペプチドの１０ｐｇ／ｍｌのいずれかで
被膜したマイクロタイタープレートを用いてＥＬＩＳＡを実施する。ＥＬＩＳＡ
中の陽性クローンをＰＣＲフィンガープリンティング（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ
９２／０１０４７を参照のこと）、次いで配列決定することによりさらに特徴付
ける。

【０６０４】 （実施例１０：Ｅｎｄｏｋｉｎｅ α遺伝子における変化の決定方法） ＲＮＡを、目的の表現型（例えば、疾患）を提示する家族全員または個々の患
者から単離する。次いで、ｃＤＮＡをこれらのＲＮＡサンプルから当該分野で公
知のプロトコルを使用して生成する（Ｓａｍｂｒｏｏｋを参照のこと）。次いで
、このｃＤＮＡを、配列番号１における目的の領域を取り囲むプライマーを用い
るＰＣＲのテンプレートとして使用する。示唆されるＰＣＲ条件は、Ｓｉｄｒａ
ｎｓｋｙ，Ｄ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：７０６（１９９１）に記載の緩衝
溶液を使用し、９５℃で３０秒間；５２〜５８℃で６０〜１２０秒間；および７
０℃で６０〜１２０秒間の３５サイクルからなる。

【０６０５】 次いで、ＰＣＲ産物を、ＳｅｑｕｉＴｈｅｒｍ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｅｐ
ｉｃｅｎｔｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用い、それらの５’末端にＴ４
ポリヌクレオチドキナーゼで標識したプライマーを使用して配列決定する。エン
ドカインαの選択したエキソンのイントロン−エキソン境界もまた決定し、ゲノ
ムＰＣＲ産物を分析してその結果を確認する。次いで、エンドカインαにおける
疑わしい変異を有するＰＣＲ産物のクローン化および配列決定を行い、直接配列
決定の結果を確認する。

【０６０６】 エンドカインαのＰＣＲ産物を、Ｈｏｌｔｏｎ，Ｔ．Ａ．およびＧｒａｈａｍ
，Ｍ．Ｗ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９：１１５６
（１９９１）に記載のようにＴテールベクターにクローン化し、そしてＴ７ポリ
メラーゼ（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）で配列決定
する。罹患個体を、非罹患個体には存在しない変異により同定する。

【０６０７】 ゲノム再配置もまた、エンドカインα遺伝子における改変を決定する方法とし
て観察する。当該分野で公知の技術により単離したゲノムクローンを、ジゴキシ
ゲニンデオキシ−ウリジン５’−三リン酸（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｈｅ
ｉｍ）を用いてニックトランスレーションし、そしてＪｏｈｎｓｏｎ、Ｃ．Ｇ．
ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．３５：７３−９９（１９９１）に記
載のようにＦＩＳＨを行う。対応するゲノムの遺伝子座への特異的ハイブリダイ
ゼーションのために、大過剰のヒトｃｏｔ−１ ＤＮＡを用いて標識プローブと
のハイブリダイゼーションを行う。

【０６０８】 染色体を、４，６−ジアミノ−２−フェニリドールおよびヨウ化プロピジウム
で対比染色し、ＣバンドおよびＲバンドの組み合わせを生成する。正確なマッピ
ングのための整列イメージを、三重バンドフィルターセット（Ｃｈｒｏｍａ Ｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｒａｔｔｌｅｂｏｒｏ，ＶＴ）と冷却電荷結合素子カメ
ラ（Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）および可変励起波長フィ
ルター（Ｊｏｈｎｓｏｎ、Ｃ．Ｖ．ら、Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．Ｔｅｃｈ．Ａｐ
ｐｌ．，８：７５（１９９１））とを組み合わせて用いて得る。ＩＳｅｅ Ｇｒ
ａｐｈｉｃａｌ Ｐｒｏｇｒａｍ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｏｖｉｓｉｏｎ Ｃｏｒ
ｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｄｕｒｈａｍ，ＮＣ）を使用して、イメージ収集、分析およ
び染色体部分長測定を行う。エンドカインαのゲノム領域（プローブがハイブリ
ダイズする）の染色体変化を、挿入、欠失および転座として同定する。これらの
エンドカインαの変化を関連疾患の診断マーカーとして使用する。

【０６０９】 （実施例１１：生物学的サンプル中のエンドカインαの異常レベルを検出する
方法） エンドカインαポリペプチドは生物学的サンプル中で検出され得、そしてエン
ドカインαレベルの上昇または低下が検出される場合、このポリペプチドは、特
定表現型のマーカーである。検出方法は数多くあり、そしてそれ故、当業者が以
下のアッセイをそれらの特定の必要性に適合するように改変し得ることが、理解
される。

【０６１０】 例えば、抗体サンドイッチＥＬＩＳＡを使用し、サンプル中、好ましくは、生
物学的サンプル中のエンドカインαを検出する。マイクロタイタープレートのウ
ェルを、特異的抗体を最終濃度０．２〜１０μｇ／ｍｌで用いてコーティングす
る。この抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルのいずれかであって、そ
して実施例１０に記載の方法により産生される。ウェルに対するエンドカインα
の非特異的結合が減少するように、このウェルをブロックする。

【０６１１】 次いで、コーティングしたウェルを、エンドカインα含有サンプルを用いてＲ
Ｔで２時間を超えてインキュベートする。好ましくは、サンプルの系列希釈を使
用して結果を確認すべきである。次いで、このプレートを脱イオン水または蒸留
水で三回洗浄し、非結合エンドカインαを除去する。

【０６１２】 次いで、５０μｌの特異的抗体−アルカリホスファターゼ結合体を２５〜４０
０ｎｇの濃度で加え、室温で２時間インキュベートする。このプレートを再び脱
イオン水または蒸留水で三回洗浄し、未結合の結合体を除去する。

【０６１３】 ７５μｌの４−メチルウンベリフェリルリン酸（ＭＵＰ）またはｐ−ニトロフ
ェニルリン酸（ＮＰＰ）基質溶液を各ウェルに添加し、そして室温で１時間イン
キュベートし、基質および蛍光の切断を可能にする。蛍光をマイクロタイタープ
レートリーダーにより測定する。Ｘ軸（対数スケール）にサンプル濃度をプロッ
トし、そしてＹ軸（直線スケール）に蛍光または吸光度をプロットし、コントロ
ールサンプルの系列希釈からの実験結果を使用して標準曲線を作成した。次いで
、そのサンプルの測定した蛍光に基づく標準曲線を使用して、サンプル中のエン
ドカインαポリペプチドの濃度を補間する。

【０６１４】 （実施例１２：エンドカインαの減少したレベルを処置する方法） 本発明はまた、身体において増加したレベルのエンドカインαの生物学的活性
を必要としている個体を処置するための方法に関し、この方法は、治療的有効量
のエンドカインαまたはそのアゴニストを含む組成物をそのような個体に投与す
る工程を包含する。

【０６１５】 さらに、個体中のエンドカインαの標準または正常な発現レベルの減少により
引き起こされる状態が、好ましくは可溶性形態および／または分泌形態のエンド
カインαを投与することにより処置され得ることは理解される。従って、本発明
はまた、増加したレベルのエンドカインαポリペプチドを必要としている個体を
処置する方法を提供し、この方法は、そのような個体においてエンドカインαの
生物学的活性を増加する量のエンドカインαを含む薬学的組成物をそのような個
体に投与する工程を包含する。

【０６１６】 例えば、減少したレベルのエンドカインαポリペプチドを有する患者は、６日
間連続して日用量が０．１〜１００μｇ／ｋｇのポリペプチドを受ける。好まし
くは、このポリペプチドは可溶性形態および／または分泌形態である。

【０６１７】 （実施例１３：エンドカインαの増加したレベルを処置する方法） 本発明は、身体における減少したレベルのエンドカインαの生物学的活性を必
要とする個体を処置するための方法に関し、この方法は、そのような個体に治療
的有効量のエンドカインαのアンタゴニストを含む組成物を投与する工程を包含
する。本発明における使用のための好ましいアンタゴニストは、エンドカインα
特異的抗体またはエンドカインαアンチセンスポリヌクレオチドである。

【０６１８】 アンチセンス技術を使用してエンドカインαの産生を阻害する。この技術は、
癌のような様々な病因に起因するエンドカインα、好ましくは分泌形態のエンド
カインαのレべルを低下させる方法の１つの例である。

【０６１９】 例えば、エンドカインαのレベルが異常に上昇したと診断された患者に、アン
チセンスポリヌクレオチドを、０．５、１．０、１．５、２．０および３．０ｍ
ｇ／ｋｇ／日で静脈内に２１日間投与する。この処置に対して十分な耐性があれ
ば、７日間の休薬期間後に、この処置を繰り返す。

【０６２０】 （実施例１４：遺伝子治療を使用する処置方法−エキソビボ） 遺伝子治療の１つの方法は、可溶性および／またはマウスのエンドカインαポ
リペプチドを発現し得る線維芽細胞を患者に移植する方法である。一般に、線維
芽細胞は、皮膚生検により被験者から得られる。得られた組織を組織培養培地中
に置き、小片に分割する。小塊の組織を組織培養フラスコの湿潤表面に置き、ほ
ぼ１０片を各フラスコに置く。このフラスコを倒置し、しっかりと閉めた後、室
温で一晩放置する。室温で２４時間後、このフラスコを反転させ、組織塊をフラ
スコの底に固定させたままにし、そして新鮮培地（例えば、１０％ＦＢＳ、ペニ
シリンおよびストレプトマイシンを含有するＨａｍのＦ１２培地）を添加する。
次いで、フラスコを３７℃で約１週間インキュベートする。

【０６２１】 この時点で、新鮮培地を添加し、次いで数日ごとに取り換える。さらに二週間
培養した後に単層の線維芽細胞が出現する。単層をトリプシン処理し、さらに大
きなフラスコにスケールアップする。

【０６２２】 Ｍｏｌｏｎｅｙマウス肉腫ウイルスの長末端反復が隣接するｐＭＶ−７（Ｋｉ
ｒｓｃｈｍｅｉｅｒ，Ｐ．Ｔ．ら、ＤＮＡ，７：２１９−２５（１９８８））を
ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、続いて仔ウシ腸ホスファターゼで処
理する。線状ベクターをアガロースゲルで分画し、そしてガラスビーズを使用し
て精製する。

【０６２３】 エンドカインαをコードするｃＤＮＡを、それぞれ５’および３’末端配列に
対応するＰＣＲプライマーを使用して増幅し得る。好ましくは、５’プライマー
はＥｃｏＲＩ部位を含み、そして３’プライマーはＨｉｎｄＩＩＩ部位を含む。
等量の、Ｍｏｌｏｎｅｙマウス肉腫ウイルス線状骨格および増幅したＥｃｏＲＩ
およびＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼの存在下で一緒に
加える。得られた混合物を二つのフラグメントの連結に適した条件下で維持する
。次いで、連結混合物を使用し、細菌ＨＢ１０１を形質転換する。次いで、その
連結混合物を使用して、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１を形質転換し、それを、次い
でベクターが正確に挿入された目的の遺伝子を有することを確認するために、カ
ナマイシンを含む寒天上にプレーティングする。

【０６２４】 アンフォトロピックｐＡ３１７またはＧＰ＋ａｍ１２パッケージング細胞を、
１０％仔ウシ血清（ＣＳ）、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含むＤｕｌ
ｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅｓ培地（ＤＭＥＭ）中、組織培養でコンフルエントな
密度まで増殖させる。次いで、エンドカインα遺伝子を含むＭＳＶベクターを培
地に加え、そしてパッケージング細胞にベクターを形質導入する。このとき、パ
ッケージング細胞はエンドカインα遺伝子を含む感染性ウイルス粒子を産生する
（ここで、パッケージング細胞をプロデューサー細胞という）。

【０６２５】 形質導入されたプロデューサー細胞に新鮮培地を添加し、続いて１０ｃｍプレ
ートのコンフルエントなプロデューサー細胞から採取する。感染性ウイルス粒子
を含む使用済み培地を、ミリポアーフィルターを通して濾過し、はがれたプロデ
ューサー細胞を除去し、次いでこの培地を使用して、線維芽細胞を感染させる。
線維芽細胞のサブコンフルエントなプレートから培地を除去し、そしてプロデュ
ーサー細胞からの培地で速やかに置き換える。この培地を除去し、そして新鮮培
地と置き換える。ウイルスの力価が高い場合、実質的にすべての線維芽細胞が感
染され、選択は必要ではない。力価が非常に低い場合、ｎｅｏまたはｈｉｓのよ
うな選択マーカーを有するレトロウイルスベクターを使用することが必要である
。一旦、線維芽細胞が効率的に感染すると、線維芽細胞を分析し、タンパク質が
産生されているか否かを決定する。

【０６２６】 次いで、操作された線維芽細胞を、単独で、またはサイトデックス３マイクロ
キャリアビーズ上でコンフルエントに増殖させた後のいずれかで宿主に移植する
。

【０６２７】 （実施例１５：遺伝子治療を使用する処置方法−インビボ） 本発明の別の局面は、障害、疾患、および状態を処置するためにインビボ遺伝
子治療方法を使用することである。この遺伝子治療法は、エンドカインαポリペ
プチドの発現を増大または減少させるための、動物への裸の核酸（ＤＮＡ、ＲＮ
Ａ、およびアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡ）エンドカインα配列の導入に関す
る。エンドカインαポリヌクレオチドは、プロモーター、または標的組織による
そのエンドカインαポリペプチドの発現に必要な任意の他の遺伝子エレメントに
、作動可能に連結され得る。このような遺伝子治療および送達の技術および方法
は、当該分野で公知であり、例えば、ＷＯ９０／１１０９２、ＷＯ９８／１１７
７９；米国特許第５６９３６２２号、同第５７０５１５１号、同第５５８０８５
９号；Ｔａｂａｔａら、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．３５（３）：４７０−
４７９（１９９７）；Ｃｈａｏ Ｊ．ら、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｓ．３５：
５１７−５２２（１９９７）；Ｗｏｌｆｆ Ｊ．Ａ．、Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌ
．Ｄｉｓｏｒｄ．７：３１４−３１８（１９９７）、Ｓｃｈｗａｒｔｚ Ｂ．ら
、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．３：４０５−４１１（１９９６）；Ｔｓｕｒｕｍｉ Ｙ
．ら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ９４：３２８１−３２９０（１９９６）（本明
細書中に参考として援用される）を参照のこと。

【０６２８】 エンドカインαポリヌクレオチド構築物は、注入可能な物質を動物の細胞に送
達する任意の方法（例えば、組織（心臓、筋肉、皮膚、肺、肝臓、腸など）の間
隙空間への注入）によって送達され得る。このエンドカインαポリヌクレオチド
構築物は、薬学的に受容可能な液体または水性キャリア中で送達され得る。

【０６２９】 用語「裸の」ポリヌクレオチド、ＤＮＡまたはＲＮＡは、細胞への侵入を補助
、促進、または容易にするように作用するいかなる送達ビヒクル（ウイルス配列
、ウイルス粒子、リポソーム処方物、リポフェクチン、または沈澱剤などを含む
）も含まない配列をいう。しかし、エンドカインαポリヌクレオチドはまた、当
業者に周知の方法によって調製され得るリポソーム処方物（例えば、Ｆｅｌｇｎ
ｅｒ Ｐ．Ｌ．らＡｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７７２：１２６−１３９（
１９９５）およびＡｂｄａｌｌａｈ Ｂ．らＢｉｏｌ．Ｃｅｌｌ ８５：１−７
（１９９５）で教示されたもの）中で送達され得る。

【０６３０】 この遺伝子治療方法において使用されるエンドカインαポリヌクレオチドベク
ター構築物は、好ましくは、宿主ゲノムに組み込まれず、複製を可能にする配列
も含まない構築物である。当業者に公知の任意の強力なプロモーターが、ＤＮＡ
の発現を駆動するために用いられ得る。他の遺伝子治療技術とは異なり、裸の核
酸配列を標的細胞に導入する１つの主要な利点は、その細胞におけるポリヌクレ
オチド合成の一過性の性質である。研究によって、非複製ＤＮＡ配列が細胞に導
入されて、６ヶ月までの間の期間、所望のポリペプチドの産生を提供し得ること
が示された。

【０６３１】 このエンドカインαポリヌクレオチド構築物は、動物内の組織（筋肉、皮膚、
脳、肺、肝臓、脾臓、骨髄、胸腺、心臓、リンパ、血液、骨、軟骨、膵臓、腎臓
、胆嚢、胃、腸、精巣、卵巣、子宮、直腸、神経系、眼、腺、および結合組織を
包含する）の間隙空間に送達され得る。この組織の間隙空間は、細胞間液、ムコ
多糖基質（器官組織の細網線維、血管または腔（ｃｈａｍｂｅｒ）の壁における
弾性線維、線維性組織のコラーゲン線維に間にある）、あるいは結合組織鞘性筋
肉細胞内または骨の裂孔中の同じ基質を包含する。これは、同様に、循環の血漿
およびリンパチャネルのリンパ液により占められた空間である。筋肉組織の間隙
空間への送達は、以下に考察する理由のために好ましい。それらは、これらの細
胞を含む組織への注入によって、好都合に送達され得る。それらは、好ましくは
、分化した持続性の非分裂細胞に送達され、そしてその細胞において発現される
が、送達および発現は、非分化細胞または完全には分化していない細胞（例えば
、血液の幹細胞または皮膚線維芽細胞など）において達成され得る。インビボで
、筋肉細胞は、ポリヌクレオチドを取り込み、そして発現するそれらの能力にお
いて、特に適格である。

【０６３２】 裸のエンドカインαポリヌクレオチド注入のために、ＤＮＡまたはＲＮＡの有
効投薬量は、約０．０５μｇ／ｋｇ体重から約５０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲にある
。好ましくは、この投薬量は、約０．００５ｍｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋｇで
あり、そしてより好ましくは、約０．０５ｍｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇである
。もちろん、当業者が認識するように、この投薬量は、注入の組織部位に従って
変化する。核酸配列の適切かつ有効な投薬量は、当業者によって容易に決定され
得、そして処置される状態および投与経路に依存し得る。好ましい投与経路は、
組織の間隙空間への非経口注入経路によってである。しかし、他の非経口経路も
また用いられ得、これには、例えば、特に肺または気管支組織、咽喉、または鼻
の粘膜への送達のためのエアロゾル処方物の吸入が挙げられる。さらに、裸のエ
ンドカインαポリヌクレオチド構築物が、血管形成術の間に、この手順において
用いられるカテーテルによって動脈に送達され得る。

【０６３３】 インビボでの筋肉における注入されたエンドカインαポリヌクレオチドの用量
応答効果を、以下のようにして決定する。エンドカインαポリペプチドをコード
するｍＲＮＡの生成のための適切なエンドカインα鋳型ＤＮＡを、標準的な組換
えＤＮＡ方法論に従って調製する。鋳型ＤＮＡ（これは環状または線状のいずれ
かであり得る）を裸のＤＮＡとして使用するか、またはリポソームと複合体化す
るかのいずれかである。次いで、マウスの四頭筋に、種々の量の鋳型ＤＮＡを注
入する。

【０６３４】 ５〜６週齢の雌性および雄性のＢａｌｂ／Ｃマウスに、０．３ｍｌの２．５％
Ａｖｅｒｔｉｎを腹腔内注射することにより麻酔する。１．５ｃｍの切開を大腿
前部で行い、そして四頭筋を直接可視化する。エンドカインα鋳型ＤＮＡを、０
．１ｍｌのキャリアに入れて、１ｃｃ注射器で２７ゲージ針を通して１分間にわ
たって、筋肉の遠位挿入部位から約０．５ｃｍのところで膝に、約０．２ｃｍの
深さで注入する。縫合を、将来の位置決定のために注入部位の上で行い、そして
その皮膚をステンレス鋼クリップで閉じる。

【０６３５】 適切なインキュベーション時間（例えば、７日）後、筋肉抽出物を、四頭全体
を切り出すことによって調製する。個々の四頭筋の５枚毎の１５μｍ切片を、エ
ンドカインαタンパク質について組織化学的に染色する。エンドカインαタンパ
ク質発現についてのタイムコースを、異なるマウスからの四頭を異なる時間で採
取すること以外は、同様な様式で行い得る。注入後の筋肉中のエンドカインαＤ
ＮＡの持続性を、注入したマウスおよびコントロールマウスからの全細胞性ＤＮ
ＡおよびＨＩＲＴ上清を調製した後、サザンブロット分析によって決定し得る。
マウスにおける上記実験の結果を、裸のエンドカインαＤＮＡを用いて、ヒトお
よび他の動物において適切な投薬量および他の処置パラメーターを外挿するため
に使用し得る。

【０６３６】 （実施例１６：内因性エンドカインα遺伝子を使用する遺伝子治療） 本発明に従う遺伝子治療の別の方法は、内因性エンドカインα配列を、例えば
、米国特許第５，６４１，６７０号（１９９７年６月２４日公布）；国際公開第
ＷＯ ９６／２９４１１号（１９９６年９月２６日公開）；国際公開第ＷＯ ９
４／１２６５０号（１９９４年８月４日公開）；Ｋｏｌｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：８９３２〜８９３５（１９８９）；
およびＺｉｊｌｓｔｒａら、Ｎａｔｕｒｅ，３４２：４３５〜４３８（１９８９
）に記載されるように、相同組換えを介してプロモーターと作動可能に結合する
工程を包含する。この方法は、その標的細胞中に存在するが、その細胞中で発現
されないかまたは所望されるよりも低いレベルで発現される、遺伝子の活性化を
包含する。プロモーターおよび標的化配列を含むポリヌクレオチド構築物を作製
する。この標的配列は、プロモーターに隣接する、内因性エンドカインαの５’
非コード配列に相同である。この標的化配列は、エンドカインαの５’末端に十
分に近く、その結果、このプロモーターは、相同組換えの際にこの内因性配列に
作動可能に連結される。このプロモーターおよび標的化配列を、ＰＣＲを使用し
て増幅し得る。好ましくは、この増幅したプロモーターは、５’末端および３’
末端上に異なる制限酵素部位を含む。好ましくは、第１の標的化配列の３’末端
は、増幅したプロモーターの５’末端と同じ制限酵素部位を含み、そして第２の
標的化配列の５’末端は、増幅したプロモーターの３’末端と同じ制限部位を含
む。

【０６３７】 この増幅したプロモーターおよび増幅した標的化配列を、適切な制限酵素で消
化し、続いてウシ腸ホスファターゼで処理する。消化したプロモーターおよび消
化した標的化配列を、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼの存在下でともに加える。生じた混
合物を、これら２つのフラグメントの連結に適切な条件下で維持する。この構築
物をアガロースゲル上でサイズ分画し、次いでフェノール抽出およびエタノール
沈殿により精製する。

【０６３８】 この実施例において、このポリヌクレオチド構築物を、エレクトロポレーショ
ンを介して裸のポリヌクレオチドとして投与する。しかし、このポリヌクレオチ
ド構築物はまた、トランスフェクション促進剤（例えば、リポソーム、ウイルス
配列、ウイルス粒子、沈殿剤など）とともに投与され得る。送達のこのような方
法は、当該分野で公知である。

【０６３９】 一旦、細胞をトランスフェクトすると、相同組換えが、このプロモーターで生
じて、この内因性エンドカインα配列に作動可能に連結される。これは、この細
胞中におけるエンドカインαの発現を生じる。発現は、免疫学的染色または当該
分野で公知の他の任意の方法により、検出され得る。

【０６４０】 線維芽細胞を、皮膚生検により被験体から得る。得られた組織を、ＤＭＥＭ＋
１０％胎仔ウシ血清中に配置する。対数増殖期または定常期初期の線維芽細胞を
、トリプシン処理し、そしてプラスチックの表面から栄養培地でリンスする。細
胞懸濁液のアリコートを、計数のために取り出し、そして残りの細胞を遠心分離
に供する。上清を吸引し、そしてペレットを５ｍｌのエレクトロポレーション緩
衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．３、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ Ｋ
Ｃｌ、０．７ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、６ｍＭデキストロース）に再懸濁する。こ
の細胞を再遠心分離し、上清を吸引し、そして細胞をアセチル化ウシ血清アルブ
ミン１ｍｇ／ｍｌを含むエレクトロポレーション緩衝液に再懸濁する。この最終
細胞懸濁物は、約３×１０⁶細胞／ｍｌを含む。エレクトロポレーションを、再
懸濁直後に実施すべきである。

【０６４１】 プラスミドＤＮＡを、標準的技術に従って調製する。例えば、エンドカインα
遺伝子座に標的化するためのプラスミドを構築するために、プラスミドｐＵＣ１
８（ＭＢＩ Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、Ａｍｈｅｒｓｔ、ＮＹ）をＨｉｎｄＩＩＩで
消化する。ＣＭＶプロモーターを、５’末端にＸｂａＩ部位および３’末端にＢ
ａｍＨＩ部位を備えてＰＣＲにより増幅する。２つのエンドカインα非コード配
列をＰＣＲを介して増幅する：一方のエンドカインα非コード配列（エンドカイ
ンαフラグメント１）を、５’末端にＨｉｎｄＩＩＩ部位および３’末端にＸｂ
ａ部位を備えて増幅する；他方のエンドカインα非コード配列（エンドカインα
フラグメント２）を、５’末端にＢａｍＨＩ部位および３’末端にＨｉｎｄＩＩ
Ｉ部位を備えて増幅する。このＣＭＶプロモーターおよびエンドカインαフラグ
メントを、適切な酵素（ＣＭＶプロモーター−ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩ；エン
ドカインαフラグメント１−ＸｂａＩ；エンドカインαフラグメント２−Ｂａｍ
ＨＩ）で消化し、そしてともに連結する。生じた連結生成物をＨｉｎｄＩＩＩで
消化し、そしてＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＵＣ１８プラスミドと連結する。

【０６４２】 プラスミドＤＮＡを、０．４ｃｍの電極ギャップを備える滅菌キュベット（Ｂ
ｉｏ−Ｒａｄ）に添加する。最終ＤＮＡ濃度は、一般的に、少なくとも１２０μ
ｇ／ｍｌである。次いで、この細胞懸濁液の０．５ｍｌ（約１〜５×１０⁶細胞
を含む）をこのキュベットに添加し、そしてこの細胞懸濁液およびＤＮＡ溶液を
、穏やかに混合する。エレクトロポレーションを、Ｇｅｎｅ−Ｐｕｌｓｅｒ装置
（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて実施する。容量および電圧を、それぞれ、９６０μ
Ｆおよび２５０〜３００Ｖに設定する。電圧が増加すると、細胞の生存が減少す
るが、導入されたＤＮＡをそのゲノム中に安定に組込む生存細胞の割合が劇的に
増加する。これらのパラメーターを与えると、パルス時間約１４〜２０ｍｓｅｃ
が観察されるはずである。

【０６４３】 エレクトロポレーションした細胞を、室温で約５分間維持し、次いで、このキ
ュベットの中身を、滅菌した移動ピペットを用いて穏やかに取り出す。この細胞
を、１０ｃｍのディッシュ中の、予め温めた栄養培地（１５％ウシ血清を含むＤ
ＭＥＭ）１０ｍｌに直接加え、そして３７℃でインキュベートする。翌日、この
培地を吸引し、そして１０ｍｌの新鮮な培地で置換し、そしてさらにこの細胞を
１６〜２４時間インキュベートする。

【０６４４】 次いで、操作された線維芽細胞を、宿主中に、単独か、またはサイトデックス
３マイクロキャリアビーズ上でコンフルエントになるまで増殖させた後かのいず
れかで、注入する。ここで、この線維芽細胞は、タンパク質産物を生成する。次
いで、この線維芽細胞を、上記のような患者に導入し得る。

【０６４５】 （実施例１７：ＭＨＣクラスＩＩ、同時刺激分子および接着分子の発現、なら
びに単球および単球由来ヒト樹状細胞の細胞分化への、エンドカインαの効果） 樹状細胞を末梢血において見出される増殖前駆体の増殖により生成する：接着
性ＰＢＭＣまたは清浄化単球画分を、ＧＭ−ＣＳＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）およびＩ
Ｌ−４（２０ｎｇ／ｍｌ）とともに７〜１０日間培養する。これらの樹状細胞は
、非成熟細胞の特徴的表現型（ＣＤ１、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０およびＭ
ＨＣクラスＩＩ抗原の発現）を有する。ＴＮＦ−αのような活性化因子での処理
は、表面表現形に迅速な変化（ＭＨＣクラスＩおよびＩＩ、同時刺激分子および
接着分子の発現の増加、ＦＣγＲＩＩの下方制御、ＣＤ８３の上方制御）を生じ
る。これらの変化は抗原提示能力の増加、および樹状細胞の機能的成熟と関連す
る。

【０６４６】 表面抗原のＦＡＣＳ分析を以下の様に実施する。細胞を、本発明のエンドカイ
ンαまたはＬＰＳ（陽性コントロール）の漸増する濃度で１〜３日処理し、１％
ＢＳＡおよび０．０２ｍＭアジ化ナトリウムを含有するＰＢＳで洗浄し、次いで
１：２０希釈の適切なＦＩＴＣ標識モノクローナル抗体またはＰＥ標識モノクロ
ーナル抗体とともに、４℃で３０分間インキュベートする。さらなる洗浄後、標
識した細胞をＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）でのフロー
サイトメトリーにより分析する。

【０６４７】 （サイトカインの生成への効果）樹状細胞により生成されるサイトカイン、特
にＩＬ−１２は、Ｔ細胞依存性免疫応答の開始において重要である。ＩＬ−１２
は、Ｔｈ１ヘルパーＴ細胞免疫応答の発生に強力に影響し、そして細胞傷害性Ｔ
細胞機能およびＮＫ細胞機能を誘導する。ＥＬＩＳＡを用いて以下のようにＩＬ
−１２放出を測定する。樹状細胞（１０⁶／ｍｌ）を、本発明のエンドカインα
の漸増する濃度で２４時間処理する。ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）を、陽性コン
トロールとして細胞培養に添加する。次いで、細胞培養からの上清を収集し、そ
して市販のＥＬＩＳＡキット（例えば、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａ
ｐｏｌｉｓ，ＭＮ））を用いてＩＬ−１２含量について分析する。キットに提供
される標準的プロトコールを用いる。

【０６４８】 （ＭＨＣクラスＩＩ、同時刺激分子および接着分子の発現への効果）細胞表面
抗原の３つの主なファミリー：接着分子、抗原提示に関与する分子、およびＦｃ
レセプター、が、単球上で同定され得る。ＭＨＣクラスＩＩ抗原および他の同時
刺激分子（例えば、Ｂ７およびＩＣＡＭ−Ｉ）の発現の調節は、単球の抗原提示
能力、およびＴ細胞活性化を誘導する能力に変化を生じ得る。Ｆｃレセプターの
発現増加は、単球細胞傷害性活性、サイトカイン放出および食菌作用の改善と相
関し得る。

【０６４９】 ＦＡＣＳ分析は、以下のような表面抗原を試験するために用いられる。単球を
、エンドカインαまたはＬＰＳ（陽性コントロール）の漸増する濃度で１〜５日
処理し、１％ＢＳＡおよび０．０２ｍＭアジ化ナトリウムを含有するＰＢＳで洗
浄し、次いで１：２０希釈の適切なＦＩＴＣ標識モノクローナル抗体またはＰＥ
標識モノクローナル抗体とともに、４℃で３０分間インキュベートする。さらな
る洗浄後、標識した細胞をＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ
）でのフローサイトメトリーにより分析する。

【０６５０】 （単球活性化および／または生存の増加）単球を活性化する（もしくは、不活
化する）および／または単球の生存を増加する（もしくは、単球生存を低下させ
る）分子についてのアッセイは、当該分野で公知であり、そして本発明の分子が
単球のインヒビターまたはアクチベーターとして機能するか否かを決定するため
に慣用的に適用され得る。エンドカインα、エンドカインαのアゴニストまたは
アンタゴニストは、以下に記載の３つのアッセイを用いてスクリーニングされ得
る。これらのアッセイのそれぞれについて、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｈ
ｉｓｔｏｐａｑｕｅ勾配（Ｓｉｇｍａ）を通じた遠心分離により、単一のドナー
ｌｅｕｋｏｐａｃｋ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｒｅｄ Ｃｒｏｓｓ，Ｂａｌｔｉｍｏ
ｒｅ，ＭＤ）から精製する。単球を向流遠心性エルトリエーション（ｃｏｕｎｔ
ｅｒｆｌｏｗ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ ｅｌｕｔｒｉａｔｉｏｎ）によりＰＢ
ＭＣから単離する。

【０６５１】 （１．単球生存アッセイ）ヒト末梢血単球は、血清または他の刺激の非存在下
で培養した場合、次第に生存度を失う。それらの死は、内部調節されたプロセス
（アポトーシス）から生じる。活性化因子、例えばＴＮＦαの培養への添加は、
劇的に、細胞生存を改善し、そしてＤＮＡの断片化を妨げる。プロピジウムヨー
ド（ＰＩ）染色を用いて、以下のようにアポトーシスを測定する。単球を、１０
０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−α（陰性コントロール）の存在下、および試験される種
々の濃度の化合物の存在下で、ポリプロピレンチューブ中の無血清培地（陽性コ
ントロール）中で、４８時間培養する。細胞を、最終濃度５μｇ／ｍｌでＰＩを
含有するＰＢＳ中で２×１０⁶／ｍｌの濃度に懸濁し、次いでＦＡＣＳｃａｎ分
析の前に５分間室温でインキュベートする。ＰＩ取り込みは、この試験パラダイ
ムにおけるＤＮＡの断片化と相関することを示している。

【０６５２】 （２．サイトカイン放出への影響）単球／マクロファージの重要な機能は、刺
激後のサイトカインの放出を通じた免疫系の他の細胞集団への調節活性である。
サイトカイン放出を測定するためのＥＬＩＳＡは、以下のように実施する。ヒト
単球を、５×１０⁵細胞／ｍｌの密度で、エンドカインαの漸増する濃度ととも
にか、またはエンドカインαの非存在下で、インキュベートする。ＩＬ−１２の
生成については、この細胞を、エンドカインαの存在下でＩＦＮ−γ（１００Ｕ
／ｍｌ）で１晩プライムする。次いで、ＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）を添加する。
馴化培地を２４時間後に収集し、そして使用するまで凍結保存する。次いで、Ｔ
ＮＦ−α、ＩＬ−１０、ＭＣＰ−１およびＩＬ−８の測定を市販のＥＬＩＳＡキ
ット（例えば、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を用
い、キットに提供される標準的プロトコールを適用して実施する。

【０６５３】 （３．酸化的バースト（Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｂｕｒｓｔ））精製した単球を
９６ウェルプレートに２〜１×１０⁵細胞／ウェルでプレートする。エンドカイ
ンαの漸増濃度を、ウェルの総量０．２ｍｌの培養培地（ＲＰＭＩ １６４０＋
１０％ＦＣＳ、グルタミンおよび抗生物質）に添加する。３日間のインキュベー
ション後、このプレートを遠心分離し、そして培地をウェルから除く。マクロフ
ァージの単層に、１ウェルあたり０．２ｍｌのフェノールレッド溶液（１４０ｍ
Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．０、５．５ｍＭデキス
トロース、０．５６ｍＭフェノールレッドおよび１９Ｕ／ｍｌのＨＲＰＯ）を、
刺激物質（２００ｎＭ ＰＭＡ）とともに添加する。このプレートを３７℃で２
時間インキュベートし、そして１ウェルあたり２０μｌの１Ｎ ＮａＯＨを添加
して反応を停止する。吸光度を６１０ｎｍで読む。マクロファージにより生成さ
れるＨ₂Ｏ₂の量を算出するため、既知のモル濃度のＨ₂Ｏ₂溶液の標準曲線をそれ
ぞれの実験について実施する。

【０６５４】 本実施例において記載される研究は、エンドカインαの活性を試験した。しか
し、当業者は、エンドカインαポリヌクレオチドの活性（例えば、遺伝子治療）
、エンドカインαアゴニストの活性および／またはアンタゴニストの活性を試験
するために、例示する研究を容易に改変し得る。

【０６５５】 （実施例１８：Ｔ細胞増殖の刺激または阻害を検出するためのアッセイ） ＣＤ３誘導性の増殖アッセイをＰＢＭＣで実行し、そして³Ｈ−チミジンの取
り込みにより測定する。このアッセイを以下のように実行する。９６ウェルプレ
ートを、ＣＤ３に対するｍＡｂ（ＨＩＴ３ａ，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）の１００
μｌ／ウェル、またはアイソタイプ適合のコントロールｍＡｂ（Ｂ３３．１）（
０．０５Ｍ 炭酸水素緩衝液、ｐＨ９．５中、１μｇ／ｍｌ）で４℃で１晩、コ
ートし、次いでＰＢＳで３回洗浄する。ＰＢＭＣをヒト末梢血から、Ｆ／Ｈ勾配
遠心分離により単離し、そしてエンドカインαタンパク質の種々の濃度での存在
下で、１０％ＦＣＳおよびＰ／Ｓを含有するＲＰＭＩ中、ｍＡｂでコートしたプ
レートの４通りのウェル（５×１０⁴／ウェル）に添加する（総量２００μｌ）
。関連するタンパク質緩衝液および培地単独がコントロールである。３７℃での
培養の４８時間後、プレートを１０００ｒｐｍで２分間回転させ、そして１００
μｌの上清を除去し、そして、増殖への効果が観察される場合、ＩＬ−２（また
は他のサイトカイン）の測定のために−２０℃で貯蔵した。ウェルに０．５μＣ
ｉの³Ｈチミジンを含有する１００μｌの培地を補充し、そして３７℃で１８〜
２４時間培養する。ウェルを収集し、そして³Ｈチミジンの取り込みを増殖の指
標として用いた。抗ＣＤ３単独が増殖の陽性コントロールである。ＩＬ−２（１
００Ｕ／ｍｌ）をまた、増殖を増強するコントロールとして用いる。Ｔ細胞の増
殖を誘導しないコントロール抗体をエンドカインαタンパク質の効果についての
陰性コントロールとして用いる。

【０６５６】 本実施例において記載される研究は、エンドカインαタンパク質の活性を試験
した。しかし、当業者は、エンドカインαポリヌクレオチドの活性（例えば、遺
伝子治療）、エンドカインαのアゴニストの活性、および／またはアンタゴニス
トの活性を試験するために、例示する研究を容易に改変し得る。

【０６５７】 （実施例１９−抗体の産生） （ａ．ハイブリドーマ技術） 本発明の抗体は、種々の方法によって調製され得る。（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒ
ｏｔｏｃｏｌｓ，第２章を参照のこと）。このような方法の１つの例として、エ
ンドカインαを発現する細胞は、ポリクローナル抗体を含む血清の産生を誘導す
るために動物に投与される。好ましい方法において、エンドカインαタンパク質
の調製物が調製され、そして精製されて、天然の夾雑物を実質的に含まないよう
にされる。次いで、より大きな比活性のポリクローナル抗血清を生成するために
、このような調製物は、動物に導入される。

【０６５８】 タンパク質エンドカインαに対して特異的なモノクローナル抗体は、ハイブリ
ドーマ技術を使用して調製される（Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４
９５（１９７５）；Ｋｏｈｌｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１
（１９７６）；Ｋｏｈｌｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：２９２（１
９７６）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉ
ｅｓ ａｎｄ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．
Ｙ．、５６３−６８１頁（１９８１））。一般に、動物（好ましくはマウス）は
、エンドカインαポリペプチドで、またはより好ましくは分泌エンドカインαポ
リペプチド発現細胞で免疫される。このようなポリペプチド発現細胞は、任意の
適切な組織培養培地において、好ましくは１０％ウシ胎仔血清（約５６℃で非働
化した）を補充し、そして約１０ｇ／ｌの非必須アミノ酸、約１，０００Ｕ／ｍ
ｌのペニシリン、および約１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補充したＥ
ａｒｌｅ改変イーグル培地において培養される。

【０６５９】 このようなマウスの脾細胞は抽出され、そして適切な骨髄腫細胞株と融合され
る。任意の適切な骨髄腫細胞株は、本発明に従って用いられ得る；しかし、ＡＴ
ＣＣから入手可能な親骨髄腫細胞株（ＳＰ２Ｏ）を用いることが好ましい。融合
後、得られるハイブリドーマ細胞を、ＨＡＴ培地において選択的に維持し、次い
でＷａｎｄｓら（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ８０：２２５−２３２（
１９８１））により記載されるように限界希釈によってクローニングする。次い
で、このような選択によって得られるハイブリドーマ細胞は、エンドカインαポ
リぺプチドを結合し得る抗体を分泌するクローンを同定するためにアッセイされ
る。

【０６６０】 あるいは、エンドカインαポリぺプチドに結合し得るさらなる抗体を、抗イデ
ィオタイプ抗体を使用して２段階工程の手順において生成し得る。このような方
法は、抗体それ自体が抗原であり、それゆえ第二の抗体に結合する抗体を得るこ
とが可能であるという事実を利用する。この方法に従って、タンパク質特異的抗
体を使用して、動物（好ましくは、マウス）を免疫する。次いで、このような動
物の脾細胞を使用して、ハイブリドーマ細胞を産生する。そして、このハイブリ
ドーマ細胞は、抗体のエンドカインαタンパク質特異的抗体に結合する能力がエ
ンドカインαによってブロックされ得る抗体を産生するクローンを同定するため
にスクリーニングされる。このような抗体は、エンドカインαタンパク質特異的
抗体に対する抗イディオタイプ抗体を含み、そして動物を免疫してさらなるエン
ドカインαタンパク質特異的抗体の形成を誘導するために使用される。

【０６６１】 ヒトにおける抗体のインビボ使用のために、抗体は、「ヒト化」される。この
ような抗体は、上記のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞に由来
する遺伝的構築物を使用することによって産生され得る。キメラ抗体およびヒト
化抗体を産生するための方法は当該分野で公知であり、そして本明細書中に議論
される（総説については、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０
２（１９８５）；Ｏｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４（１９８６
）；Ｃａｂｉｌｌｙら、米国特許第４，８１６，５６７号；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ
ら、ＥＰ １７１４９６；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、ＥＰ １７３４９４；Ｎｅｕｂ
ｅｒｇｅｒら、ＷＯ ８６０１５３３；Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、ＷＯ ８７０２６
７１；Ｂｏｕｌｉａｎｎｅら、Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６４３（１９８４）；Ｎ
ｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３１４：２６８（１９８５）を参照のこと
）。

【０６６２】 （ｂ）ｓｃＦｖｓのライブラリーからのエンドカインαに対して指向される抗
体フラグメントの単離） ヒトＰＢＬから単離した天然に存在するＶ遺伝子を、ドナーが曝され得たかま
たは曝され得なかったエンドカインαに対する反応性を含む抗体フラグメントの
ライブラリーに構築する（例えば、米国特許第５，８８５，７９３号（その全体
が参考として本明細書に援用される）を参照のこと）。

【０６６３】 ライブラリーのレスキュー。 ＰＣＴ公開ＷＯ ９２／０１０４７に記載のよ
うに、ヒトＰＢＬのＲＮＡからｓｃＦｖｓのライブラリーを構築する。抗体フラ
グメントを提示するファージをレスキューするため、ファージミドを保有する約
１０９個のＥ．ｃｏｌｉを用いて、５０ｍｌの２×ＴＹ（１％グルコースおよび
１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する）（２×ＴＹ−ＡＭＰ−ＧＬＵ）を
接種し、そして振盪しながら０．８のＯ．Ｄ．まで増殖させる。この培養物の５
ｍｌを用いて５０ｍｌの２×ＴＹ−ＡＭＰ−ＧＬＵに接種し、２×１０８ＴＵの
Δ遺伝子３ヘルパー（Ｍ１３Δ遺伝子ＩＩＩ、ＰＣＴ公開ＷＯ９２／０１０４７
を参照のこと）を添加し、そして培養物を振盪なしで３７℃で４５分間インキュ
ベートし、次いで振盪しながら３７℃で４５分間インキュベートする。この培養
物を１０分間４０００ｒ．ｐ．ｍ．で遠心分離し、そしてペレットを２リットル
の２×ＴＹ（１００μｇ／ｍｌアンピシリンおよび５０μｇ／ｍｌカナマイシン
を含有する）中に再懸濁し、そして一晩増殖させる。ファージをＰＣＴ公開ＷＯ
９２／０１０４７に記載のように調製する。

【０６６４】 Ｍ１３Δ遺伝子ＩＩＩを以下のように調製する：Ｍ１３Δ遺伝子ＩＩＩヘルパ
ーファージは、遺伝子ＩＩＩタンパク質をコードしない。それゆえ、抗体フラグ
メントを提示するファージ（ファージミド）は、抗原に対するより大きい結合ア
ビディティーを有する。ファージ形態形成の間、野生型遺伝子ＩＩＩタンパク質
を供給するｐＵＣ１９誘導体を保有する細胞においてヘルパーファージを増殖さ
せることにより、感染性Ｍ１３Δ遺伝子ＩＩＩ粒子を作製する。培養物を振盪な
しで３７℃で１時間インキュベートし、次いで振盪しながら３７℃でさらなる時
間インキュベートする。細胞を遠心沈殿（ＩＥＣ−Ｃｅｎｔｒａ ８，４００ｒ
．ｐ．ｍ．で１０分間）し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび２５μｇ／
ｍｌのカナマイシンを含有する２×ＴＹブロス（２×ＴＹ−ＡＭＰ−ＫＡＮ）３
００ｍｌ中で再懸濁し、そして３７℃で振盪しながら一晩増殖させた。ファージ
粒子を、２回のＰＥＧ沈殿（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９９０）により培養培地か
ら精製および濃縮し、２ｍｌ ＰＢＳに再懸濁し、そして０．４５μｍのフィル
ター（Ｍｉｎｉｓａｒｔ ＮＭＬ；Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を通過させ、約１０１
３形質導入単位／ｍｌ（アンピシリン耐性クローン）の最終濃度を得る。

【０６６５】 ライブラリーのパニング。Ｉｍｍｕｎｏｔｕｂｅｓ（Ｎｕｎｃ）を、本発明の
ポリペプチドの１００μｇ／ｍｌまたは１０μｇ／ｍｌのいずれかの４ｍｌを用
いてＰＢＳ中で一晩被膜する。チューブを２％Ｍａｒｖｅｌ−ＰＢＳを用いて３
７℃で２時間ブロックし、次いでＰＢＳ中で３回洗浄する。約１０１３ＴＵのフ
ァージをチューブに適用し、そして、回転盤上で上下にタンブリングしながら室
温で３０分間インキュベートし、次いでさらに１．５時間静置しておく。チュー
ブをＰＢＳ０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０で１０回、そしてＰＢＳで１０回洗浄する
。１ｍｌの１００ｍＭトリエチルアミンを添加し、そして回転盤上で１５分間上
下に回転させることによりファージを溶出し、その後この溶液を０．５ｍｌの１
．０Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４で直ちに中和する。次いで、溶出したフ
ァージを細菌とともに３７℃で３０分間インキュベートすることにより、ファー
ジを用いて、１０ｍｌの対数増殖中期のＥ．ｃｏｌｉ ＴＧ１に感染させる。次
いで、Ｅ．ｃｏｌｉを１％グルコースおよび１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含
有するＴＹＥプレート上にプレートする。次いで、得られる細菌ライブラリーを
、上記のようにΔ遺伝子３ヘルパーファージでレスキューし、次の回の選択のた
めのファージを調製する。次いで、このプロセスを、アフィニティー精製の全４
回について反復し、３回目および４回目にはチューブ洗浄をＰＢＳ、０．１％Ｔ
ｗｅｅｎ−２０で２０倍、そしてＰＢＳで２０倍に増加する。

【０６６６】 結合剤の特徴付け。第３回目および４回目の選択から溶出したファージを用い
て、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ ２１５１を感染させ、そして可溶性ｓｃＦｖをアッセ
イのために単一コロニーから生成する（Ｍａｒｋｓら、１９９１）。５０ｍＭ炭
酸水素塩、ｐＨ９．６中の本発明のポリペプチドの１０ｐｇ／ｍｌのいずれかで
被膜したマイクロタイタープレートを用いてＥＬＩＳＡを実行する。ＥＬＩＳＡ
中の陽性クローンをＰＣＲフィンガープリンティング（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ
９２／０１０４７を参照のこと）、次に配列決定することによりさらに特徴付け
る。

【０６６７】 本発明を、前述の説明および実施例に詳細に記載された以外の方法で実施し得
ることは、明らかである。

【０６６８】 本発明の多数の改変およびバリエーションが、上記の教示を考慮して可能であ
り、従って、それは、添付の特許請求の範囲の範囲内にある。

【０６６９】 本発明の中に参照される全ての特許、特許出願、および刊行物の開示は、本明
細書によって参考として援用される。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、エンドカインαタンパク質のヌクレオチド配列（配列番号１）および
推定アミノ酸配列（配列番号２）を示す。アミノ酸１〜１７は、細胞内ドメイン
を、アミノ酸１８〜４３は膜貫通ドメイン（下線を引いた配列）を、そしてアミ
ノ酸４４〜１６９は細胞外ドメイン（残りの配列）を表す。

【図２】 図２は、エンドカインαタンパク質（配列番号２）、組織壊死因子α（ＴＮＦ
−α）（配列番号３）およびＴＮＦ−β（配列番号４）のアミノ酸配列間の類似
性の領域を示す。Ｊ．Ｈｅｉｎ法が、ＰＡＭ ２５０残基重量表と共に使用され
た。黒塗りの部分は、正確に一致していることを示す。

【図３】 図３は、エンドカインαアミノ酸配列の分析を示す。α、β、ターンおよびコ
イル領域；親水性および疎水性；両親媒性領域；可撓性領域；抗原指数および表
面確率が示される。「抗原指標−Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ」グラフにおいて、
図１のアミノ酸残基４４〜５４、５７〜６８、６９〜７８、９４〜１０５、１０
８〜１３２および１４８〜１５８は、エンドカインαタンパク質の高度に抗原性
の領域と一致する。

【手続補正書】

【提出日】平成１３年９月４日（２００１．９．４）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００３６

【補正方法】変更

【補正の内容】

【００３６】 さらに、本発明はまた、以下の関連するｃＤＮＡクローン：ＨＥＭＣＧ０４Ｒ を 同定し、これは、ＢＬＡＳＴ分析によって、配列番号１のヌクレオチド２６〜
４８２に対して９４％の同一性を有する。

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０５７２

【補正方法】変更

【補正の内容】

【０５７２】 （発現ベクター） 推定ＴＲ−１１タンパク質全体（アミノ酸２６〜２３４）
をコードする、全長ＴＲ−１１およびＨＡ（血球凝集素Ａエピトープ）タグ化Ｔ
Ｒ−１１を、センス（それぞれ、５’−ＣＴＡＧＣＴＡＧＣＴＡＧＶＶＶＡＧＣ
ＧＣＣＣＣＡＣＣＧＧＧＧＧＴＣＣＣ−３’（配列番号１１）および５’−ＣＴ
ＡＧＣＴＡＧＣＴＡＧＣＴＡＴＣＣＡＴＡＴＧＡＴＧＴＴＣＣＡＧＡＴＴＡＴＧ
ＣＴＣＡＧＣＧＣＣＣＣＡＣＣＧＧＧＧＧＴＣＣＣ−３’（配列番号１２））プ
ライマーならびにアンチセンス（５’−ＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＧＣＧＧＧＣＣＧ
ＣＴＣＡＣＡＣＣＣＡＣＡＧＧＴＣＴＣＣＣＡＧ−３’（配列番号１３））プラ
イマーを用いるＰＣＲによって増幅し、Ｎｈｅ Ｉ／Ｎｏｔ Ｉで切断し、そし
てＣＤ５リーダー配列（Ｊａｎｇ，Ｉ．Ｋ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍ．２４２：６１３〜６２０（１９９８））の下流域にインフ
レームで、ｐｃＤＮＡ３．１（ｐｃＤＮＡ３．１／ＣＤ５Ｌ−ＴＲ−１１）およ
びｐｃＤＮＡ３（ｐｃＤＮＡ３／ＣＤ５Ｌ−ＴＲ−１１）にそれぞれ融合した。
全長エンドカイン−αを、ＰＣＲ（センス、５’−ＡＧＡＣＣＣＡＡＧＣＴＴＴ
ＴＧＡＡＡＡＴＧＡＴ ＡＴＧＡＧＡＣＧＣ−３’（配列番号１４）；アンチセ
ンス、５’−ＡＧＡＣＧＧＧＡＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＡＴＡＧＴＡＡ ＧＡＡＧ
ＧＣ−３’（配列番号１５））によって増幅し、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ／ＢａｍＨ
Ｉを用いて切断し、そしてｐｃＤＮＡ３．１（ｐｃＤＮＡ３．１／エンドカイン
−α）およびｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ；ｐ
ＣＥＰ４／エンドカイン−α）に挿入した。Ｆｌａｇタグ化全長ＴＲＡＦ１、Ｔ
ＲＡＦ２、ＴＲＡＦ３、ＴＲＡＦ５、ＴＲＡＦ６、ＮＩＫ、ドミナントネガティ
ブＴＲＡＦ２（ｄｎＴＲＡＦ２）またはｄｎＮＩＫをコードするｐＲＫ５ベース
の発現ベクターが、記載されてきた（Ｊａｎｇ，Ｉ．Ｋ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．
Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍ．２４２：６１３〜６２０（１９９８）、Ｒｏ
ｔｈｅ，Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９：１４２１〜１４２７（１９９５）、
Ｈｕ，Ｈ．Ｍ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：３００６９〜３００７２
（１９９４）、Ｎａｋａｎｏ，Ｈ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１４
６６１〜１４６６４（１９９６）、Ｔａｋｅｕｃｈｉ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．２７１：１９９３５〜１９９４２（１９９６）、Ｃａｏ，Ｚ．ら、Ｎ
ａｔｕｒｅ ３８３：４４３〜４４６（１９９６）およびＳｏｎｇ，Ｈ．Ｙ．ら
、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：９７９２〜９７９６
（１９７７））。ＮＦ−κＢ依存性Ｅ−セレクチン−ルシフェラーゼレポーター
遺伝子（ｐＥＬＡＭ−Ｌｕｃ）およびｐＲＳＶ−β−ガラクトシダーゼ（ｐＲＳ
Ｖ−β−ｇａｌ）プラスミドもまた、他に記載されてきた（Ｒｏｔｈｅ，Ｍ．ら
、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９：１４２１〜１４２７（１９９５）およびＳｃｈｉｎ
ｄｌｅｒ，Ｕ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４：５８２０〜９７９６（
１９９４））。

【手続補正３】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０５７６

【補正方法】変更

【補正の内容】

【０５７６】 （組換えタンパク質の産生および精製） ＴＲ−１１−Ｆｃ融合タンパク質を
、リガンドスクリーニングおよび細胞結合実験のために使用した。ＴＲ−１１の
測定した細胞外ドメイン（アミノ酸２６〜１３９）をコードするフラグメントを
、Ｎｈｅ Ｉ部位に隣接したセンスプライマー（５’−ＡＧＡＣＣＣＡＡＧＣＴ
ＴＧＴＧＧＧＣＴＣＴＴＧＡＡＡＣＣＣＧＧＣＡＴＧ−３’（配列番号１６））
およびＢｇｌ ＩＩ部位に隣接したアンチセンスプライマー（５’−ＧＡＡＡＧ
ＡＴＣＴＧＧＧＣＴＣＴＧＣＣＧＧＣＧＧＧＧＡＣＣＣＴＧＧＧＡＣ−３’（配 列番号１７） ）を用いて、増幅した。増幅したフラグメントを、Ｎｈｅ Ｉ／Ｂ
ｇｌ ＩＩを用いて切断し、そして５’末端ではＣＤ５Ｌと、そして３’末端で
はヒトＩｇＧ１のＦｃ部分（ｐＣＥＰ４／ＣＤ５Ｌ−ＴＲ−１１−Ｆｃ）とイン
フレームで、哺乳動物ベクターｐＣＥＰ４にクローン化した。ｐＣＥＰ４／ＣＤ
５Ｌ−ＴＲ−１１−Ｆｃを、ＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞にトランスフェクトし
た。ＴＲ−１１−Ｆｃ−融合タンパク質を、プロテインＧカラムを用いて、ｐＣ
ＥＰ４／ＣＤ５Ｌ−ＴＲ−１１−ＦｃでトランスフェクトされたＨＥＫ２９３
ＥＢＮＡ細胞上清から精製した。エンドカイン−αタンパク質のＦｌａｇタグ化
可溶性形態（アミノ酸３９〜１６９）を産生するために、ｆｌａｇタグ化エンド
カイン−α発現ベクター（ｐＣＥＰ４／ＣＤ５Ｌ−エンドカイン−α−Ｆｌａｇ
）を、センス（５’−ＣＴＡＧＣＴＡＧＣＣＣＡＧＣＧＣＣＣＣＧＡＣＴＡＣＡ
ＡＧＧＡＣＧＡＣＧＡＴＧＡＣＡＡＧＧＡＧＡＣＴＧＣＴＡＡＧＧＡＧＣＣＣ−
３’（配列番号１８））プライマーおよびアンチセンス（５’−ＣＣＧＣＴＣＧ
ＡＧＣＴＡＴＡＧＴＡＡＧＡＡＧＧＣＴＣＣ−３’（配列番号１９））プライマ
ーを用いて、エンドカイン−αコード配列のＰＣＲ増幅しＮｈｅ Ｉ／Ｘｈｏ
Ｉを用いて産物を消化し、ｐＣＥＰ４にＣＤ５Ｌ配列とインフレームでクローン
化することによって構築した。この構築物を、ＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞にお
いて発現させた。分泌エンドカイン−α−Ｆｌａｇを含有するトランスフェクト
された細胞上清を収集し、そして結合アッセイのために使用した。いくつかの実
験のために、エンドカイン−α−Ｆｌａｇタンパク質を、製造業者の使用説明書
に従って、抗Ｆｌａｇゲル（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ．ＭＯ）を用いて、
収集した上清から精製した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 1/00 Ａ６１Ｐ 3/00 ４Ｈ０４５ 1/16 3/08 3/00 5/14 3/08 7/06 5/14 9/10 7/06 11/06 9/10 13/12 11/06 17/02 13/12 17/06 17/02 19/00 17/06 19/02 19/00 21/04 19/02 25/00 21/04 １０１ 25/00 25/16 １０１ 25/28 25/16 27/02 25/28 29/00 １０１ 27/02 31/04 29/00 １０１ 33/00 31/04 35/00 33/00 35/02 35/00 37/02 35/02 37/04 37/02 37/06 37/04 37/08 37/06 43/00 １１１ 37/08 Ｃ０７Ｋ 14/52 43/00 １１１ 16/24 Ｃ０７Ｋ 14/52 Ｃ１２Ｎ 1/15 16/24 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 5/10 5/00 Ａ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/24 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ユ， グオ−リアン アメリカ合衆国 カリフォルニア 94705， バークレイ， グラバット ドライブ 242 (72)発明者 ニ， ジアン アメリカ合衆国 メリーランド 20853， ロックビル， マナーフィールド ロー ド 5502 (72)発明者 ローゼン， クレイグ エイ． アメリカ合衆国 メリーランド 20882， レイトンズビル， ローリング ヒル ロード 22400 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA21 BA28 BA41 CA04 CA11 DA01 DA02 DA05 DA11 EA01 EA02 EA03 EA04 FA02 GA11 HA01 HA11 4B064 AG02 CA01 CA19 CC24 DA01 DA13 4B065 AA01X AA57X AA87X AA93Y AB01 BA01 CA24 CA25 CA44 CA46 4C084 AA02 AA06 AA07 BA01 BA02 BA08 BA19 BA20 BA21 BA22 BA23 CA53 CA56 DA25 NA14 ZA012 ZA022 ZA162 ZA332 ZA452 ZA552 ZA752 ZA892 ZA902 ZA942 ZA962 ZB052 ZB072 ZB082 ZB092 ZB112 ZB132 ZB152 ZB262 ZB272 ZB352 ZB372 ZC062 ZC212 ZC352 4C085 AA13 AA14 BB07 BB17 DD62 DD63 EE01 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 CA40 DA01 DA76 EA20 EA50 FA72 FA74

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 単離された核酸分子であって、以下： （ａ）配列番号２の約１〜約１６９のアミノ酸を含むポリペプチドをコードす
   るヌクレオチド配列； （ｂ）配列番号２の約２〜約１６９のアミノ酸を含むポリペプチドをコードす
   るヌクレオチド配列； （ｃ）ＡＴＣＣ受託番号９７６４０に含まれるｃＤＮＡクローンによってコー
   ドされるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；お
   よび （ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のヌクレオチド配列のいずれかに相補的な
   ヌクレオチド配列、 からなる群から選択される配列に少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を有
   するポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子。
2. 【請求項２】 単離された核酸分子であって、該核酸分子は、請求項１に記
   載の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）のヌクレオチド配列に同一なヌクレオ
   チド配列を有するポリヌクレオチドに、ストリンジェントなハイブリダイゼーシ
   ョン条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含み、ここで、該ポリヌク
   レオチドは、Ａ残基のみまたはＴ残基のみからなるヌクレオチド配列を有するポ
   リヌクレオチドには、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイ
   ブリダイズしない、単離された核酸分子。
3. 【請求項３】 請求項１に記載の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）のア
   ミノ酸配列を有するエンドカインαポリペプチドのエピトープ保有部分のアミノ
   酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子。
4. 【請求項４】 請求項３に記載の単離された核酸分子であって、該核酸分子
   が、以下： 配列番号２の約４４〜約１５８のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号２
   の約４４〜約５４のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号２の約５７〜約
   ６８のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号２の約６９〜約７８のアミノ
   酸残基を含むポリペプチド；配列番号２の約９４〜約１０５のアミノ酸残基を含
   むポリペプチド；配列番号２の約１０８〜約１３２のアミノ酸残基を含むポリペ
   プチド；および、配列番号２の約１４８〜約１５８のアミノ酸残基を含むポリペ
   プチド、 からなる群から選択されるエンドカインαポリペプチドのエピトープ保有部分を
   コードする、 単離された核酸分子。
5. 【請求項５】 単離された核酸分子であって、以下： （ａ）配列番号１に示される配列のフラグメントのヌクレオチド配列であって
   、ここで、該フラグメントが、配列番号１由来の少なくとも５０個連続したヌク
   レオチドを含み、ただし、該単離された核酸分子は、配列番号１のヌクレオチド
   ２６で開始しかつヌクレオチド４７６で終止するフラグメントまたは配列番号１
   のヌクレオチド２６で開始しかつヌクレオチド４７６で終止するフラグメントの
   サブフラグメントではない、ヌクレオチド配列；および （ｂ）（ａ）のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列： からなる群より選択される配列を有するポリヌクレオチドを含む、 単離された核酸分子。
6. 【請求項６】 組換えベクターを作製する方法であって、請求項１に記載の
   単離された核酸分子をベクターに挿入する工程を包含する、方法。
7. 【請求項７】 請求項６に記載の方法によって生成された、組換えベクター
   。
8. 【請求項８】 組換え宿主細胞を作製する方法であって、請求項７に記載
   の組換えベクターを宿主細胞に導入する工程を包含する、方法。
9. 【請求項９】 請求項８に記載の方法によって生成された、組換え宿主細胞
   。
10. 【請求項１０】 エンドカインαポリペプチドを生成するための組換え方法
    であって、該ポリペプチドが発現されるような条件下で、請求項９に記載の組換
    え宿主細胞を培養する工程、および該ポリペプチドを回収する工程を包含する、
    方法。
11. 【請求項１１】 単離されたエンドカインαポリペプチドであって、以下： （ａ）配列番号２の約１〜約１６９のアミノ酸； （ｂ）配列番号２の約２〜約１６９のアミノ酸； （ｃ）ＡＴＣＣ受託番号９７６４０に含まれるｃＤＮＡクローンによってコー
    ドされるアミノ酸配列を有するエンドカインαポリペプチドのアミノ酸配列；お
    よび （ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）に記載のいずれか１つのポリペプチドのエ
    ピトープ保有部分のアミノ酸配列、 からなる群より選択される配列に少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を有する
    、単離されたエンドカインαポリペプチド。
12. 【請求項１２】 エンドカインαのエピトープ保有部分を含む、請求項１１
    に記載の単離されたポリペプチドであって、ここで、該部分が、以下： 配列番号２の約４４〜約１５８のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号２
    の約４４〜約５４のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号２の約５７〜約
    ６８のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号２の約６９〜約７８のアミノ
    酸残基を含むポリペプチド；配列番号２の約９４〜約１０５のアミノ酸残基を含
    むポリペプチド；配列番号２の約１０８〜約１３２のアミノ酸残基を含むポリペ
    プチド；および、配列番号２の約１４８〜約１５８のアミノ酸残基を含むポリペ
    プチド、 からなる群から選択される、 単離されたポリペプチド。
13. 【請求項１３】 組換え宿主細胞中で産生されるか、または組換え宿主細胞
    中に含まれる、請求項１１に記載の単離されたポリペプチド。
14. 【請求項１４】 前記組換え宿主細胞が哺乳動物細胞である、請求項１３に
    記載の単離されたポリペプチド。
15. 【請求項１５】 エンドカインαポリペプチドをコードするポリヌクレオチ
    ドを含む、単離された核酸分子であって、ここで、１〜５０個の保存的アミノ酸
    置換以外は、該ポリペプチドが、以下： （ａ）配列番号２の約１〜約１６９のアミノ酸を含むポリペプチドをコードす
    るヌクレオチド配列； （ｂ）配列番号２の約２〜約１６９のアミノ酸を含むポリペプチドをコードす
    るヌクレオチド配列； （ｃ）ＡＴＣＣ受託番号９７６４０に含まれるｃＤＮＡクローンによってコー
    ドされるアミノ酸を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；および
    、 （ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）に記載のヌクレオチド配列のいずれかに相
    補的なヌクレオチド配列、 からなる群より選択される配列を有する、 単離された核酸分子。
16. 【請求項１６】 単離されたエンドカインαポリペプチドであって、ここで
    、１〜５０個の保存的アミノ酸置換以外は、該ポリペプチドが、以下： （ａ）配列番号２の約１〜約１６９のアミノ酸； （ｂ）配列番号２の約２〜約１６９のアミノ酸； （ｃ）ＡＴＣＣ受託番号９７６４０に含まれるｃＤＮＡクローンによってコー
    ドされるアミノ酸配列を有するエンドカインαポリペプチドのアミノ酸配列；お
    よび （ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）に記載のいずれか１つのポリペプチドのエ
    ピトープ保有部分のアミノ酸配列、 からなる群より選択される配列を有する、 単離されたエンドカインαポリペプチド。
17. 【請求項１７】 請求項１１に記載のエンドカインαポリペプチドに特異的
    に結合する、単離された抗体または抗体フラグメント。
18. 【請求項１８】 減少したレベルのエンドカインα活性を必要とする個体を
    処置するための方法であって、該方法が、請求項１７に記載の単離された抗体ま
    たは抗体フラグメントを含む組成物を該個体に投与する工程を包含する、方法。
19. 【請求項１９】 以下からなる群より選択される障害を有する個体を処置す
    る方法であって： ＡＩＤＳ、慢性リンパ球障害、分類不能型免疫不全、腫瘍、寄生虫病、自己免疫
    疾患、狼瘡、関節炎、特発性血小板減少性紫斑病、多発性硬化症、慢性炎症、急
    性炎症、急性同種移植拒絶、対宿主性移植片病、移植拒絶、胎児吸収、糞便性腹
    膜炎、皮膚アレルギー、腸疾患、創傷、敗血症、ＡＬＬ、ホジキン病、非ホジキ
    ンリンパ腫、慢性リンパ性白血病、形質細胞腫、多発性骨髄腫、バーキットリン
    パ腫、ＥＢＶ−形質転換疾患、慢性骨髄性白血病、慢性高ガンマグロブリン血症
    、自己免疫血液障害、多発性軟骨炎、強皮症、ヴェーゲナー肉芽腫症、皮膚筋炎
    、活動性慢性肝炎、重症筋無力症、乾癬、スティーヴンズ−ジョンソン症候群、
    特発性スプルー、自己免疫甲状腺炎、特発性アディソン病、白斑、グルテン過敏
    性腸症、自己免疫好中球減少症、尋常性天疱瘡、グッドパスチャー病、水疱性類
    天疱瘡、円板状狼瘡、デンスデポジット病、内分泌性眼障害、ＩＢＤ、喘息、グ
    レーヴズ病、類肉腫症、肝硬変症、若年性糖尿病、インシュリン依存性糖尿病、
    ブドウ膜炎、自己免疫胃炎、リンパ球減少症、結節性多発性動脈炎、シェーグレ
    ン症候群、ベーチェット病、橋本病、原発性粘液水腫、多発性筋炎、混合結合組
    織病、乾性角結膜炎、春季カタル、間質性肺線維症、糸球体腎炎、肝炎、自己免
    疫溶血性貧血、接触過敏疾患、一相性ＥＡＥ、ＳＣＩＤＳ、アルツハイマー病、
    パーキンソン病および原発性側索硬化症； ここで、該方法が、以下； （ａ）請求項１１に記載のポリペプチド；および （ｂ）請求項１６に記載のポリペプチド、 からなる群より選択されるエンドカインαポリペプチドの治療有効量を該個体に
    投与する工程を包含する、 方法。
20. 【請求項２０】 以下からなる群より選択される障害を有する個体を処置す
    る方法であって： 自己免疫疾患、珪肺症、類肉腫症、特発性肺線維症、特発性好酸球増加症候群、
    エンドトキシンショック、アテローム性動脈硬化症、ヒスタミン媒介アレルギー
    反応、ＩｇＥ媒介アレルギー反応、慢性炎症、急性炎症、慢性関節リウマチ、再
    生不良性貧血、骨髄異形成症候群、および創傷； ここで、該方法が、エンドカインαアンタゴニストの治療有効量を該個体に投
    与する工程を包含する、 方法。