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KR20240040068A - 메조텔린을 특이적으로 표적화하는 조작된 면역 세포 및 이의 용도 - Google Patents

메조텔린을 특이적으로 표적화하는 조작된 면역 세포 및 이의 용도 Download PDF

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KR20240040068A
KR20240040068A KR1020247000845A KR20247000845A KR20240040068A KR 20240040068 A KR20240040068 A KR 20240040068A KR 1020247000845 A KR1020247000845 A KR 1020247000845A KR 20247000845 A KR20247000845 A KR 20247000845A KR 20240040068 A KR20240040068 A KR 20240040068A
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KR
South Korea
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car
cancer
seq
nucleic acid
cells
Prior art date
Application number
KR1020247000845A
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English (en)
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지히로 다케
아키코 야마구치
개리 사피로
Original Assignee
다케다 야쿠힌 고교 가부시키가이샤
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Abstract

인간 메조텔린을 특이적으로 인식하는 항체, CD8 힌지 영역, CD8 막횡단 영역, 4-1BB 세포내 영역 및 CD3ζ 세포내 영역를 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; IL-7을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 CCL19를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 분리된 핵산 분자가 본원에 개시된다. 또한 벡터, 변형된 면역 세포, 핵산 분자를 포함하는 약제학 조성물 및 사용 방법이 본원에 개시된다.

Description

메조텔린을 특이적으로 표적화하는 조작된 면역 세포 및 이의 용도
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2021년 7월 29일에 출원된 미국 가출원 번호 63/227,116에 대해 35 U.S.C § 119(e)에 따라 우선권을 주장하며, 그 전체 내용은 참조로 본원에 포함된다.
본 발명은 인간 메조텔린, 인터루킨 7(IL-7) 및 케모카인(C-C 모티프) 리간드 19(CCL19)를 특이적으로 인식하는 세포 표면 분자를 발현하는 면역세포, 상기 면역세포를 포함하는 약제학 조성물, 메조텔린을 특이적으로 인식하는 세포 표면 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, IL-7을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, CCL19를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터, 사용 방법 및 인간 메조텔린을 특이적으로 인식하는 세포 표면 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, IL-7을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 CCL19를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 면역 세포에 도입하는 단계를 포함하여 인간 메조텔린, IL-7 및 CCL19를 특이적으로 인식하는 세포 표면 분자를 발현하는 면역 세포의 생산 방법에 관한 것이다.
악성종양은 전 세계적으로 많은 사람에게 영향을 미치는 질병으로, 일반적으로 화학요법, 방사선요법, 수술요법 등으로 치료가 광범위하게 이루어지고 있다. 그러나 이상반응 발생, 일부 기능 상실, 치료가 불가능한 재발이나 전이 등 다양한 문제가 발생하고 있다. 이처럼 최근에는 환자의 보다 높은 삶의 질(QOL)을 유지하기 위해 면역 세포 치료법의 개발이 진행되고 있다. 면역 세포 치료법에는 환자로부터 면역 세포를 채취하고, 채취한 면역 세포의 면역 기능을 향상시키는 절차를 수행하고, 세포를 증폭시키고, 세포를 환자에게 다시 투여하는 과정이 포함된다. 예를 들어, 면역 세포 치료법에는 환자로부터 T 세포를 채취하고, 키메라 항원 수용체(구성적 안드로스탄 수용체: 이하, "CAR"이라고도 지칭)를 코딩하는 핵산을 T 세포에 도입하고, T 세포를 다시 환자에게 재투여하는 것이 포함될 수 있다. CAR-T 치료법을 통해 혈액암의 초기 성공이 관찰되었지만; 고형 종양 치료에서 생명을 위협하는 독성과 실질적인 효능 부족도 관찰되었다. 따라서 개선된 CAR-T 치료법이 필요하다.
선행 기술 문서
특허문서
특허문헌 1: WO2016/056228
특허문헌 2: WO2019/124468
특허문헌 3: WO2013/063419
비-특허문서
비-특허문헌 1: Adachi, 등, "IL-7 and CCL19 expression in CAR-T cells improves immune cell infiltration and CAR-T cell survival in the tumor," Nature Biotech, 36(4): 346-353, 2018.
T 세포를 이용한 면역치료법에는 고형 종양으로의 불충분한 트래피킹, 정상 조직에 대한 높은 독성, 면역억제성 종양 미세환경을 극복에 대한 무능력, 내인성 면역 반응의 불충분한 활성화 등 여러 가지 과제가 있다. 또한, 메조텔린을 특이적으로 인식하는 CAR을 발현하도록 변형된 면역 세포는 최소한의 치료 효능을 보이는 것으로 나타났다. 따라서, 해결해야 할 객관적인 기술적 과제는 메조텔린-발현 암을 표적화하는 최적화된 변형 면역세포를 제공하는 것이다.
본 발명자들은 메조텔린, IL-7 및 CCL19를 특이적으로 인식하는 CAR을 발현하도록 변형된 면역세포가 면역치료법의 치료 효능을 향상시키고 생존율을 향상시킬 수 있음을 발견하였다.
특정 구현양태에서, 본 발명은 인간 메조텔린을 특이적으로 인식하는 항체, CD8 힌지 영역, CD8 막관통 영역, 4-1BB 세포내 영역 및 CD3ζ 세포내 영역을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; IL-7을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 CCL19를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 분리된 핵산 분자를 포함하다. 일부 구현양태에서, IL-7은 인간 IL-7이다. 일부 구현양태에서, CCL19는 인간 CCL19이다. 일부 구현양태에서, 항체는 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하며, 여기서 VH는 서열번호: 1-3을 포함하는 3개의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하고, VL은 서열번호: 4-6을 포함하는 3개의 CDR을 포함한다. 일부 구현양태에서, VH는 서열번호: 7을 포함하고, VL은 서열번호: 8을 포함한다. 일부 구현양태에서, 항체는 단일-사슬 가변 단편(scFv) 형식을 포함한다. 일부 구현양태에서, 항체는 서열번호: 9를 포함한다. 일부 구현양태에서, 4-1BB 세포내 영역은 서열번호: 13을 포함한다. 일부 구현양태에서, CD3ζ 세포내 영역은 서열번호: 14를 포함한다. 일부 구현양태에서, 4-1BB 세포내 영역은 분리된 핵산 분자에서 CD3ζ 세포내 영역의 업스트림에 있다. 일부 구현양태에서, CD8 힌지 영역은 서열번호: 11을 포함한다. 일부 구현양태에서, CD8 막횡단 영역은 서열번호: 12를 포함한다. 일부 구현양태에서, 핵산은 항체와 CD8 힌지 영역을 연결하는 길이가 3 내지 10개 아미노산 잔기인 펩티드 링커를 추가로 포함한다. 일부 구현양태에서, 펩티드 링커는 AAA를 포함한다. 일부 구현양태에서, 분리된 핵산 분자는 신호전달 펩티드를 추가로 포함한다. 일부 구현양태에서, 신호전달 펩티드는 분리된 핵산 분자에서 인간 메조텔린을 특이적으로 인식하는 항체의 업스트림에 위치한다. 일부 구현양태에서, 신호전달 펩티드는 서열번호: 15를 포함한다. 일부 구현양태에서, IL-7을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 CCL19를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 자가-절단 2A 펩티드(2A 펩티드)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 프로모터 하에서 각각 독립적으로 전사된다. 일부 구현양태에서, 2A 펩티드는 임의로 ATNFSLLKQAGDVEENPGP를 포함하는 P2A이다. 일부 구현양태에서, 펩티드 링커는 2A 펩티드의 N-말단에 추가로 첨가되며, 여기서 펩티드 링커는 GSG를 포함한다. 일부 구현양태에서, IL-7은 서열번호: 18을 포함한다. 일부 구현양태에서, CCL19는 서열번호: 19를 포함한다. 일부 구현양태에서, CAR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, IL-7을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 CCL19를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 CAR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 - IL-7을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 - CCL19를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로서 5' 말단에서 3' 말단으로 핵산 분자에 배열된다. 일부 구현양태에서, 분리된 핵산 분자는 서열번호: 16을 포함하는 폴리펩티드를 코딩한다. 일부 구현양태에서, 분리된 핵산 분자는 서열번호: 17을 포함한다. 일부 구현양태에서, 분리된 핵산 분자는 서열번호: 25를 포함한다.
특정 구현양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 핵산 분자를 포함하는 벡터를 포함한다. 일부 구현양태에서, 벡터는 바이러스 벡터, 임의로 발현 벡터이다. 일부 구현양태에서, 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터로부터 선택된다. 일부 구현양태에서, 바이러스 벡터는 감마 레트로바이러스 벡터이다. 일부 구현양태에서, 바이러스 벡터는 pSFG 벡터, pMSGV 벡터, 또는 pMSCV 벡터이다. 일부 구현양태에서, 벡터는 플라스미드이다.
특정 구현양태에서, 본 발명은 포유동물로부터 유래되거나 포유동물로부터 분리되고 본원에 기재된 핵산 분자 또는 본원에 기재된 벡터를 포함하는 면역 세포를 포함한다. 일부 구현양태에서, 본 발명은 포유동물로부터 유래되거나 포유동물로부터 분리되고 a) 인간 메조텔린을 특이적으로 인식하는 항체, CD8 힌지 영역, CD8 막횡단 영역, 4-1BB 세포내 영역 및 CD3ζ 세포내 영역를 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR), b) IL-7, 및 c) CCL19를 발현하는 면역세포를 포함한다. 일부 구현양태에서, 면역 세포는 T 세포, 자연 살해(NK) 세포, B 세포, 항원 제시 세포 또는 과립구, 임의로 T 세포 또는 NK 세포이다.
특정 구현양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 면역 세포 및 약제학상 허용되는 첨가제를 포함하는 약제학 조성물을 포함한다.
특정 구현양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 면역 세포 또는 본원에 기재된 약제학 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하여 메조텔린-발현 암을 치료하는 방법을 포함한다. 일부 구현양태에서, 메조텔린-발현 암은 중피종, 결장직장암, 췌장암, 흉선암, 담관암, 폐암, 피부암, 유방암, 전립선암, 방광암, 처녀암, 목암, 자궁암, 간암, 신장암, 비장암, 기관암, 기관지암, 위장암(stomach cancer), 식도암, 담낭암, 고환암, 난소암, 골암으로부터 임의로 선택된 고형 종양이다. 일부 구현양태에서, 메조텔린-발현 암은 조혈암이다. 일부 구현양태에서, 메조텔린-발현 암은 연골육종, 유잉 육종, 악성 혈관내피종, 악성 신경초종, 골육종 및 연조직 육종으로부터 임의로 선택되는 육종이다. 일부 구현양태에서, 메조텔린-발현 암은 전이성 암이다. 일부 구현양태에서, 메조텔린-발현 암은 재발성 암 또는 불응성 암이다. 일부 구현양태에서, 방법은 대상체에게 추가 치료제 또는 추가 치료 요법을 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 구현양태에서, 추가 치료제는 화학요법제, 면역요법제, 표적 치료법, 방사선 치료법, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 구현양태에서, 추가 치료 요법은 1차 치료법을 포함한다. 일부 구현양태에서, 추가적인 치료 요법은 수술을 포함한다. 일부 구현양태에서, 상기 기재된 면역 세포 또는 상기 기재된 약제학 조성물 및 추가 치료제는 동시에 투여된다. 일부 구현양태에서, 상기 기재된 면역 세포 또는 상기 기재된 약제학 조성물 및 추가 치료제는 순차적으로 투여된다. 일부 구현양태에서, 상기 기재된 면역 세포 또는 상기 기재된 약제학 조성물은 추가 치료제를 투여하기 전에 대상체에게 투여된다. 일부 구현양태에서, 상기 기재된 면역 세포 또는 상기 기재된 약제학 조성물은 추가 치료제의 투여 후에 대상체에게 투여된다. 일부 구현양태에서, 대상체는 인간이다.
특정 구현양태에서, 본 발명은 종양 세포를 본원에 기재된 면역 세포와 접촉시켜 종양 세포 증식을 감소시키는 것을 포함하여, 종양 세포 증식을 감소시키는 방법을 포함한다. 일부 구현양태에서, 방법은 시험관내 방법이다. 일부 구현양태에서, 방법은 생체내 방법이다.
특정 구현양태에서, 본 발명은 인간 메조텔린, IL-7 및 CCL19를 특이적으로 인식하는 세포 표면 분자를 발현하는 면역 세포를 생산하는 방법을 포함하며, 이 방법은 본원에 기재된 핵산 분자 또는 본원에 기재된 벡터를 면역 세포에 도입하여 면역 세포에 의해 인간 메조텔린, IL-7 및 CCL19를 특이적으로 인식하는 세포 표면 분자의 발현을 유도하는 단계를 포함한다. 일부 구현양태에서, 면역 세포는 T 세포, 자연 살해(NK) 세포, B 세포, 항원 제시 세포 또는 과립구, 임의로 T 세포 또는 NK 세포이다.
특정 구현양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 핵산 분자; 본원에 기재된 벡터, 본원에 기재된 면역 세포, 또는 본원에 기재된 약제학 조성물, 및 사용 지침 을 포함하는 키트를 포함한다.
본 발명의 면역세포는 메조텔린(예를 들어, 인간 메조텔린)을 발현하는 암세포에 대해 세포독성 활성을 가지며, 메조텔린(예를 들어, 인간 메조텔린)을 발현하는 종양의 형성을 억제할 수 있다. 또한, 본 발명의 면역세포는 암세포의 재발을 억제하는 효과가 있다. 또한, 본 발명의 면역세포는 우수한 안전성 프로파일을 갖는다.
도 1a는 메조텔린을 특이적으로 인식하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, IL-7을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 CCL19를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 예시적인 벡터의 만화적 표현을 보여준다.
도 1b는 메조텔린, IL-7 및 CCL19를 특이적으로 인식하는 CAR을 발현하는 변형된 면역 세포의 만화적 표현을 보여준다.
도 2는 본원에 기재된 변형된 면역 세포에 의한 MSLN-양성 종양 세포의 시험관내 사멸을 예시한다.
도 3은 예시적인 2nd 세대 및 3rd 세대 CAR-T 시스템을 발현하는 변형된 면역 세포를 사용한 Capan-2 이종이식 마우스 모델에서의 생체내 효능을 보여준다.
도 4a는 비형질도입된(UTD) T 세포와 비교하여 예시적인 2nd 세대 CAR-T 시스템으로 처리된 마우스로부터의 Capan-2 이종이식 종양 조직의 조직병리학적 검사를 예시한다.
도 4b는 Capan-2 이종이식 마우스 모델을 사용한 예시적인 2nd 세대 CAR-T 시스템의 생체내 효능을 보여준다.
도 5a는 본원에 기재된 변형된 면역 세포의 존재 하에 SKOV3-luc 이종이식 마우스 모델에서 종양 세포 위치의 생물발광 영상화(BLI)를 보여준다.
도 5b는 SKOV3-luc BLI 모델을 사용하는 예시적인 2nd 세대 CAR-T 시스템의 생체내 효능을 보여준다.
도 6a는 비형질도입된(UTD) T 세포와 비교하여 예시적인 2nd 세대 CAR-T 시스템이 투여된 Capan-2 이종이식 마우스 모델의 체중 변화를 보여준다.
도 6b는 비형질도입된(UTD) T 세포와 비교하여 예시적인 2nd 세대 CAR-T 시스템이 투여된 비-종양 보유 마우스의 체중 변화를 보여준다.
도 7a는 비형질도입된(UTD) T 세포가 투여된 마우스 모델의 폐 조직의 조직병리학적 이미지를 보여준다. UTD 세포는 폐와 비장에서 최소한의 추정 CAR-T 침윤/염증을 보였다.
도 7b는 CAR#364(2nd 28-28z_7x19)가 투여된 마우스 모델의 폐 조직의 조직병리학적 이미지를 보여준다. 폐, 비장 및 간에서 추정 CAR-T 침윤/염증 발생률이 UTD 세포가 투여된 동물에 비해 동물에서 더 높게 관찰되었다.
도 7c는 CAR#365(2nd 8-BBz_7x19)가 투여된 마우스 모델의 폐 조직의 조직병리학적 이미지를 보여준다. 동물에서는 폐 단핵 침윤 또는 혼합 세포 염증의 발생률이 낮았고 비장 및 골수에 접목된 것으로 추정되는 CAR-T 세포의 발생률이 더 높았다.
도 8a는 예시적인 2nd 세대 CAR-T 시스템이 투여된 Capan-2 이종이식 마우스의 혈액에서 투여된 T 세포의 유세포 분석을 보여준다.
도 8b는 예시적인 2nd 세대 CAR-T 시스템이 투여된 Capan-2 이종이식 마우스의 종양에서 투여된 T 세포의 유세포 분석을 보여준다.
도 8c는 예시적인 2nd 세대 CAR-T 시스템이 투여된 Capan-2 이종이식 마우스의 비장에서 투여된 T 세포의 유세포 분석을 보여준다.
도 9는 가용성 hMSLN과 함께 사전-인큐베이션된 Capan-2 종양 세포 및 예시적인 2nd 세대 CAR-T 시스템의 공동-배양 상층액으로부터의 인간 IFN-감마 수준을 보여준다.
도 10a는 3rd 8-28BBz_7x19 CAR-T(CAR#348) 및 2nd 8-BBz_7x19 CAR-T(CAR#365)의 구성요소를 보여준다.
도 10b는 HepG2-RedFluc 이종이식 모델을 사용한 3rd 8-28BBz_7x19 CAR-T(CAR#348) 및 2nd 8-BBz_7x19 CAR-T(CAR#365)의 생체내 효능을 보여준다.
도 10c는 8-28BBz_7x19 CAR-T(CAR#348) 및 2nd 8-BBz_7x19 CAR-T(CAR#365)를 갖는 HepG2-RedFluc 이종이식 마우스 모델의 체중 변화를 보여준다.
도 11은 3rd 8-28BBz_7x19 CAR-T(CAR#348) 및 2nd 8-BBz_7x19 CAR-T(CAR#365)의 존재 하에 HepG2-RedFluc 이종이식 마우스 모델에서 종양 세포 위치의 생물발광 영상화(BLI)를 보여준다.
도 12a는 HepG2-RedFluc 이종이식 마우스 군 1(G1)에서 PBS 대조군의 생체내 효능을 보여준다.
도 12b는 HepG2-RedFluc 이종이식 마우스 군 2(G2)에서 3M 용량에서의 대조군 비형질도입(UTD)의 동등한 총 T 세포 수의 생체내 효능을 보여준다.
도 12c는 HepG2-RedFluc 이종이식 마우스 군 3(G3)에서 0.3M 용량에서의 2nd 8-BBz_7x19 CAR-T(CAR#365)의 생체내 효능을 보여준다.
도 12d는 HepG2-RedFluc 이종이식 마우스 군 3(G4)에서 1M 용량에서의 2nd 8-BBz_7x19 CAR-T(CAR#365)의 생체내 효능을 보여준다.
도 12e는 HepG2-RedFluc 이종이식 마우스 군 3(G5)에서 3M 용량에서의 2nd 8-BBz_7x19 CAR-T(CAR#365)의 생체내 효능을 보여준다.
도 12f는 HepG2-RedFluc 이종이식 마우스 군 3(G6)에서 0.3M 용량에서의 3rd 8-28BBz_7x19 CAR-T(CAR#348)의 생체내 효능을 보여준다.
도 12g는 HepG2-RedFluc 이종이식 마우스 군 3(G7)에서 1M 용량에서의 3rd 8-28BBz_7x19 CAR-T(CAR#348)의 생체내 효능을 보여준다.
도 12h는 HepG2-RedFluc 이종이식 마우스 군 3(G8)에서 3M 용량에서의 3rd 8-28BBz_7x19 CAR-T(CAR#348)의 생체내 효능을 보여준다.
조작된 면역 세포
특정 구현양태에서, 메조텔린, 인터류킨 7(IL-7) 및 케모카인(C-C 모티프) 리간드 19(CCL19)에 특이적으로 결합하는 조작된 세포 표면 분자를 발현하는 조작된 면역 세포가 본원에 개시된다. 일부 구현양태에서, 조작된 세포 표면 분자는 메조텔린을 특이적으로 인식하는 키메라 항원 수용체(CAR) 또는 메조텔린에 특이적으로 결합하는 T 세포 수용체(TCR)를 포함한다.
일부 구현양태에서, 조작된 면역 세포는 조작된 세포 표면 분자를 코딩하는 외인성 핵산, IL-7을 코딩하는 외인성 핵산, 및 CCL19를 코딩하는 외인성 핵산을 함유한다. 일부 구현양태에서, 조작된 면역 세포는 메조텔린, IL-7 및 CCL19를 특이적으로 인식하는 표면 분자를 발현한다.
메소텔린(MSLN)은 세포 표면-결합된 글리코실포스파티딜이노시톨(GPI) 고정 단백질로, 여기서 정상적인 발현은 흉막, 심낭, 복막, 질막, 난소 또는 나팔관과 같은 중피 세포로 제한된다. 그러나 MSLN은 악성 중피종, 난소암, 유방암(예를 들어 삼중음성유방암, TNBC), 췌장암, 폐암, 위암(gastric cancer), 자궁내막암, 자궁경부암, 담도암, 자궁 장액암종, 담관암종, 소아 급성 골수성 백혈병 등 다양한 암에서도 과발현되는 것으로 나타났다. 또한, 증가된 MSLN 발현은 TNBC, 난소암, 폐 선암종, 담관암종 및 췌장 선암종 환자에서 더욱 불량한 예후와 관련이 있다.
MSLN의 생리학적, 생물학적 기능은 완전히 밝혀지지 않았다. 그러나 MSLN은 암 발병의 여러 메커니즘에 관여하는 것으로 나타났다. 예를 들어, 상피성 난소암종의 경우 수술-절제된 난소암 조직에서 더 높은 수준의 MSLN mRNA 발현을 보인 환자는 더 낮은 MSLN 수준을 나타내는 화학요법-민감한 환자와 비교할 때 백금 및 사이클로포스파미드를 사용한 화학요법에 대한 저항성을 보였다(Tang, 등, "The role of mesothelin in tumor progression and targeted therapy," Anticancer Agents Med Chem. 13(2): 276-280 (2013)). MSLN은 또한 표면 점액 MUC16(또는 CA125)에 높은 친화력으로 결합하는 것으로 밝혀졌으며, 이러한 결합은 중피 세포에 대한 난소암 세포의 접착을 매개하고 전이를 촉진하는 것으로 제안되었다(Rump, 등, "Binding of ovarian cancer antigen CA125/MUC16 to mesothelin mediates cell adhesion," J Biol Chem 279(10): 9190-9198, 2004; Gubbels, 등, "Mesothelin-MUC16 binding is a high affinity, N-glycan dependent interaction that facilitates peritoneal metastasis of ovarian tumors," Mol Cancer 5(1): 50, 2006). 또한, MSLN은 시험관내 및 생체내 모두에서 췌장암의 종양 진행, 세포 생존 및 증식에 관여하는 것으로 나타났다(Li, 등, "Mesothelin is a malignant factor and therapeutic vaccine target for pancreatic cancer," Mol Cancer Ther. 7(2): 286-296, 2008).
키메라 항원 수용체(CAR)
A. 항-메조텔린 항체
일부 구현양태에서, 조작된 세포 표면 분자는 메조텔린을 특이적으로 인식하는 항체를 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함한다. 일부 구현양태에서, 항체는 포유동물 메조텔린, 예를 들어 설치류 메조텔린, 비-인간 영장류 메조텔린, 또는 인간 메조텔린을 특이적으로 인식한다.
40 kDa 단백질인 인간 메조텔린은 MSLN 유전자에 의해 코딩된다. 인간 메조텔린의 서열정보는 공지된 문헌이나 NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/) 등의 데이터베이스를 검색함으로써 적절하게 얻을 수 있다. 인간 메조텔린의 아미노산 서열 정보의 예로는 GenBank 수탁번호 NP_037536.2, AAV87530.1 및 이들의 이소폼을 포함할 수 있다.
일부 구현양태에서, 항-메조텔린 항체는 서열번호: 1에 제시된 CDRH1, 서열번호: 2에 제시된 CDRH2, 및 서열번호: 3에 제시된 CDRH3을 포함하거나 이로 구성된 중쇄 가변 영역(VH); 및 서열번호: 4에 제시된 CDRL1, 서열번호: 5에 제시된 CDRL2, 및 서열번호: 6에 제시된 CDRL3을 포함하거나 이로 구성된 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다. 표 1 참조.
표 1
*항-메조텔린 항체는 본원에서 P4로 지칭된다.
일부 구현양태에서, 항-메조텔린 항체는 서열번호: 7과 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH); 및 서열번호: 8과 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다. 일부 구현양태에서, 항-메조텔린 항체는 서열번호: 7과 약 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH); 및 서열번호: 8과 약 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다. 일부 구현양태에서, 항-메조텔린 항체는 서열번호: 7과 약 85% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH); 및 서열번호: 8과 약 85% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다. 일부 구현양태에서, 항-메조텔린 항체는 서열번호: 7과 약 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH); 및 서열번호: 8과 약 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다. 일부 구현양태에서, 항-메조텔린 항체는 서열번호: 7과 약 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH); 및 서열번호: 8과 약 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다. 일부 구현양태에서, 항-메조텔린 항체는 서열번호: 7과 약 96% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH); 및 서열번호: 8과 약 96% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다. 일부 구현양태에서, 항-메조텔린 항체는 서열번호: 7과 약 97% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH); 및 서열번호: 8과 약 97% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다. 일부 구현양태에서, 항-메조텔린 항체는 서열번호: 7과 약 98% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH); 및 서열번호: 8과 약 98% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다. 일부 구현양태에서, 항-메조텔린 항체는 서열번호: 7과 약 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH); 및 서열번호: 8과 약 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다. 항-메조텔린 항체는 서열번호: 7을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 서열번호: 8을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함할 수 있다. 항-메조텔린 항체는 서열번호: 7로 구성되는 중쇄 가변 영역(VH) 및 서열번호: 8로 구성되는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함할 수 있다.
일부 구현양태에서, 프레임워크 영역 내의 하나 이상의 잔기는 항-메조텔린 항체에서 변형되어 VH 또는 VL 영역에서 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 생성한다. '프레임워크 영역'이라는 용어는 상보성-결정 영역(CDR)을 제외한 항체 영역을 의미한다. 일부 구현양태에서, 항-메조텔린 항체는 프레임워크 영역 내에 하나 이상의 변형을 포함하고, 서열번호: 7과 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 포함하는 서열을 갖는다. 일부 구현양태에서, 항-메조텔린 항체는 프레임워크 영역 내에 하나 이상의 변형을 포함하고 서열번호: 7과 85% 서열 동일성을 포함하는 서열을 갖는다. 일부 구현양태에서, 항-메조텔린 항체는 프레임워크 영역 내에 하나 이상의 변형을 포함하고 서열번호: 7과 90% 서열 동일성을 포함하는 서열을 갖는다. 일부 구현양태에서, 항-메조텔린 항체는 프레임워크 영역 내에 하나 이상의 변형을 포함하고 서열번호: 7과 95% 서열 동일성을 포함하는 서열을 갖는다. 일부 구현양태에서, 항-메조텔린 항체는 프레임워크 영역 내에 하나 이상의 변형을 포함하고 서열번호: 7과 96% 서열 동일성을 포함하는 서열을 갖는다. 일부 구현양태에서, 항-메조텔린 항체는 프레임워크 영역 내에 하나 이상의 변형을 포함하고 서열번호: 7과 97% 서열 동일성을 포함하는 서열을 갖는다. 일부 구현양태에서, 항-메조텔린 항체는 프레임워크 영역 내에 하나 이상의 변형을 포함하고 서열번호: 7과 98% 서열 동일성을 포함하는 서열을 갖는다. 일부 구현양태에서, 항-메조텔린 항체는 프레임워크 영역 내에 하나 이상의 변형을 포함하고 서열번호: 7과 99% 서열 동일성을 포함하는 서열을 갖는다. 일부 구현양태에서, 항-메조텔린 항체는 프레임워크 영역 내에 하나 이상의 변형을 포함하고, 서열번호: 8과 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 포함하는 서열을 갖는다. 일부 구현양태에서, 항-메조텔린 항체는 프레임워크 영역 내에 하나 이상의 변형을 포함하고 서열번호: 8과 85% 서열 동일성을 포함하는 서열을 갖는다. 일부 구현양태에서, 항-메조텔린 항체는 프레임워크 영역 내에 하나 이상의 변형을 포함하고 서열번호: 8과 90% 서열 동일성을 포함하는 서열을 갖는다. 일부 구현양태에서, 항-메조텔린 항체는 프레임워크 영역 내에 하나 이상의 변형을 포함하고 서열번호: 8과 95% 서열 동일성을 포함하는 서열을 갖는다. 일부 구현양태에서, 항-메조텔린 항체는 프레임워크 영역 내에 하나 이상의 변형을 포함하고 서열번호: 8과 96% 서열 동일성을 포함하는 서열을 갖는다. 일부 구현양태에서, 항-메조텔린 항체는 프레임워크 영역 내에 하나 이상의 변형을 포함하고 서열번호: 8과 97% 서열 동일성을 포함하는 서열을 갖는다. 일부 구현양태에서, 항-메조텔린 항체는 프레임워크 영역 내에 하나 이상의 변형을 포함하고 서열번호: 8과 98% 서열 동일성을 포함하는 서열을 갖는다. 일부 구현양태에서, 항-메조텔린 항체는 프레임워크 영역 내에 하나 이상의 변형을 포함하고 서열번호: 8과 99% 서열 동일성을 포함하는 서열을 갖는다.
일부 구현양태에서, 항-메조텔린 항체는 단일-사슬 가변 단편(scFv) 형식을 포함한다. 일부 구현양태에서, 항-메조텔린 scFv 항체는 서열번호: 1에 제시된 CDRH1, 서열번호: 2에 제시된 CDRH2, 및 서열번호: 3에 제시된 CDRH3을 포함하거나 이로 구성된 VH; 및 서열번호: 4에 제시된 CDRL1, 서열번호: 5에 제시된 CDRL2, 및 서열번호: 6에 제시된 CDRL3을 포함하거나 이로 구성된 VL을 포함한다. 일부 구현양태에서, 항-메조텔린 scFv는 항체는 서열번호: 7과 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH; 및 서열번호: 8과 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
일부 구현양태에서, 항-메조텔린 scFv 항체의 VH 및 VL은 펩티드 링커를 통해 연결된다. 펩티드 링커는 3개 이상의 아미노산 잔기, 예를 들어 약 3 내지 약 30개, 약 3 내지 약 20개, 약 3 내지 약 10개, 약 5 내지 약 30개, 약 5 내지 약 20개, 또는 약 5 내지 약 10개를 포함할 수 있다. 펩티드 링커는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 또는 30개의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다.
펩티드 링커는 다수의 폴리-알라닌, 폴리-글리신, 또는 알라닌과 글리신 잔기의 혼합물을 포함할 수 있다. 펩티드 링커는 (Gly4Ser)n 링커를 포함할 수 있으며, 여기서 n은 1 내지 10의 정수, 바람직하게는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10, 보다 바람직하게는 2, 3, 4, 또는 5이다. 일부 구현양태에서, 펩티드 링커는 GGGGSGGGGSGGGGS(서열번호: 10)를 포함한다. 일부 경우에, 펩티드 링커는 SGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGSLQ(서열번호: 20)를 포함한다. 일부 경우에, 펩티드 링커는 SGGSGGGGSGGGSGGGGSLQ(서열번호: 21)를 포함한다. 일부 경우에, 펩티드 링커는 GSGGGGSGGGGSGGGGS(서열번호: 22)를 포함한다.
일부 구현양태에서, 항-메조텔린 scFv 항체는 QVQLQQSGPGLVTPSQTLSLTCAISGDSVSSNSATWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRMSINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARGMMTYYYGMDVWGQGTTVTVSSGILGSGGGGSGGGGSGGGGSQPVLTQSSSLSASPGASASLTCTLRSGINVGPYRIYWYQQKPGSPPQYLLNYKSDSDKQQGSGVPSRFSGSKDASANAGVLLISGLRSEDEADYYCMIWHSSAAVFGGGTQLTVLS (서열번호: 9)와 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 포함하는 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, 항-메조텔린 scFv 항체는 서열번호: 9와 약 85% 서열 동일성을 포함하는 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, 항-메조텔린 scFv 항체는 서열번호: 9와 약 90% 서열 동일성을 포함하는 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, 항-메조텔린 scFv 항체는 서열번호: 9와 약 95% 서열 동일성을 포함하는 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, 항-메조텔린 scFv 항체는 서열번호: 9와 약 96% 서열 동일성을 포함하는 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, 항-메조텔린 scFv 항체는 서열번호: 9와 약 97% 서열 동일성을 포함하는 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, 항-메조텔린 scFv 항체는 서열번호: 9와 약 98% 서열 동일성을 포함하는 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, 항-메조텔린 scFv 항체는 서열번호: 9와 약 99% 서열 동일성을 포함하는 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, 항-메조텔린 scFv 항체는 서열번호: 9를 포함한다. 일부 구현양태에서, 항-메조텔린 scFv 항체는 서열번호: 9로 구성된다.
B. 신호전달 펩티드
일부 구현양태에서, 본원에 개시된 키메라 항원 수용체(CAR)는 신호전달 펩티드(예를 들어, 리더 서열로서)를 포함한다. 신호전달 펩티드는 CAR을 세포 표면에 위치시킬 수 있다. 신호전달 펩티드에는 면역글로불린 중쇄, 면역글로불린 경쇄, CD8, T 세포 수용체 α 및 β 사슬, CD3ζ, CD28, CD3E, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, ICOS, CD154 또는 GITR-유래 신호 펩티드(리더 서열)의 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
일부 구현양태에서, 신호전달 펩티드는 MDWTWRILFLVAAATGAHS(서열번호 : 15)와 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 포함하는 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, 신호전달 펩티드는 서열번호: 15와 약 85% 서열 동일성을 포함하는 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, 신호전달 펩티드는 서열번호: 15와 약 90% 서열 동일성을 포함하는 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, 신호전달 펩티드는 서열번호: 15와 약 95% 서열 동일성을 포함하는 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, 신호전달 펩티드는 서열번호: 15와 약 96% 서열 동일성을 포함하는 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, 신호전달 펩티드는 서열번호: 15와 약 97% 서열 동일성을 포함하는 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, 신호전달 펩티드는 서열번호: 15와 약 98% 서열 동일성을 포함하는 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, 신호전달 펩티드는 서열번호: 15와 약 99% 서열 동일성을 포함하는 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, 신호전달 펩티드는 서열번호: 15를 포함한다. 일부 구현양태에서, 신호전달 펩티드는 서열번호: 15로 구성된다.
C. 막횡단 영역
일부 구현양태에서, 항-메조텔린 항체는 하나 이상의 막횡단 및 세포내 신호전달 도메인에 연결된다. 막횡단 영역은 천연 또는 합성 공급원에서 유래될 수 있다. 예시적인 막횡단 영역에는 CD8, T 세포 수용체 α 및 β 사슬, CD3ζ, CD28, CD3E(CD3 엡실론), CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, ICOS, CD154 및 GITR로부터 유래된 막횡단 영역의 폴리펩티드가 포함될 수 있다. 일부 구현양태에서, 막횡단 영역은 CD8 막횡단 영역(예를 들어, 인간 CD8 막횡단 영역)을 포함한다.
일부 구현양태에서, 막횡단 영역은 IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC(서열번호: 12)와 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 포함하는 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, 막횡단 영역은 서열번호: 12와 약 85%의 서열 동일성을 포함하는 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, 막횡단 영역은 서열번호: 12와 약 90%의 서열 동일성을 포함하는 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, 막횡단 영역은 서열번호: 12와 약 95%의 서열 동일성을 포함하는 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, 막횡단 영역은 서열번호: 12와 약 96%의 서열 동일성을 포함하는 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, 막횡단 영역은 서열번호: 12와 약 97%의 서열 동일성을 포함하는 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, 막횡단 영역은 서열번호: 12와 약 98%의 서열 동일성을 포함하는 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, 막횡단 영역은 서열번호: 12와 약 99%의 서열 동일성을 포함하는 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, 막횡단 영역은 서열번호: 12를 포함한다. 일부 구현양태에서, 막횡단 영역은 서열번호: 12로 구성된다.
일부 구현양태에서, 막횡단 영역은 IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCN(서열번호: 28)과 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 포함하는 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, 막횡단 영역은 서열번호: 28과 약 85%의 서열 동일성을 포함하는 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, 막횡단 영역은 서열번호: 28과 약 90%의 서열 동일성을 포함하는 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, 막횡단 영역은 서열번호: 28과 약 95%의 서열 동일성을 포함하는 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, 막횡단 영역은 서열번호: 28과 약 96%의 서열 동일성을 포함하는 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, 막횡단 영역은 서열번호: 28과 약 97%의 서열 동일성을 포함하는 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, 막횡단 영역은 서열번호: 28과 약 98%의 서열 동일성을 포함하는 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, 막횡단 영역은 서열번호: 28과 약 99%의 서열 동일성을 포함하는 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, 막횡단 영역은 서열번호: 28을 포함한다. 일부 구현양태에서, 막횡단 영역은 서열번호: 28로 구성된다.
D. 세포외 힌지 영역
임의의 올리고펩티드 또는 폴리펩티드를 포함하거나 이로 구성된 세포외 힌지 영역은 메조텔린을 인식하는 세포 표면 분자와 막횡단 영역 사이에 위치할 수 있다. 세포외 힌지 영역의 길이의 예는 1 내지 100개의 아미노산 잔기, 바람직하게는 10 내지 70, 10 내지 50, 또는 10 내지 30개의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 예시적인 세포외 힌지 영역은 CD8, CD28 및 CD4로부터 유래된 힌지 영역, 및 면역 글로불린 힌지 영역을 포함할 수 있다. 일부 구현양태에서, 힌지 영역은 인간 CD8의 힌지 영역을 포함한다.
일부 구현양태에서, 세포외 힌지 영역은 TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD (서열번호: 11)와 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CD8 힌지 영역이다. 일부 구현양태에서, CD8 힌지 영역은 서열번호: 11과 약 85% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, CD8 힌지 영역은 서열번호: 11과 약 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, CD8 힌지 영역은 서열번호: 11과 약 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, CD8 힌지 영역은 서열번호: 11과 약 96% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, CD8 힌지 영역은 서열번호: 11과 약 97% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, CD8 힌지 영역은 서열번호: 11과 약 98% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, CD8 힌지 영역은 서열번호: 11과 약 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, CD8 힌지 영역은 서열번호: 11을 포함한다. 일부 구현양태에서, CD8 힌지 영역은 서열번호: 11로 구성된다. 일부 구현양태에서, CD8 힌지 영역은 PTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD(서열번호: 29)를 갖는 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, CD8 힌지 영역은 서열번호: 29와 약 85% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, CD8 힌지 영역은 서열번호: 29와 약 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, CD8 힌지 영역은 서열번호: 29와 약 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, CD8 힌지 영역은 서열번호: 29와 약 96% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, CD8 힌지 영역은 서열번호: 29와 약 97% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, CD8 힌지 영역은 서열번호: 29와 약 98% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, CD8 힌지 영역은 서열번호: 29와 약 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, CD8 힌지 영역은 서열번호: 29를 포함한다. 일부 구현양태에서, CD8 힌지 영역은 서열번호: 29로 구성된다.
일부 구현양태에서, 항-메조텔린 scFv 항체는 펩티드 링커를 통해 힌지 영역에 연결된다. 펩티드 링커는 3개 이상의 아미노산 잔기, 예를 들어 약 3 내지 약 30개, 약 3 내지 약 20개, 약 3 내지 약 10개, 약 5 내지 약 30개, 약 5 내지 약 20개, 또는 약 5 내지 약 10개를 포함할 수 있다. 펩티드 링커는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 또는 30개의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다.
펩티드 링커는 다수의 폴리-알라닌, 폴리-글리신, 또는 알라닌과 글리신 잔기의 혼합물, 또는 알라닌 또는 글리신과 하나 이상의 추가 아미노산의 혼합물을 포함할 수 있다. 일부 구현양태에서, 펩티드 링커는 AlaAlaAla("AAA")를 포함한다. 일부 구현양태에서, 펩티드 링커는 삼중 알라닌 링커 또는 AlaAlaAla("AAA")이다. 일부 구현양태에서, 펩티드 링커는 ArgAlaAlaAla("RAAA")(서열번호: 30)를 포함한다. 일부 구현양태에서, 펩티드 링커는 ArgAlaAlaAla("RAAA")(서열번호: 30)이다.
일부 구현양태에서, 항-메조텔린 scFv 항체는 링커 없이 힌지 영역에 연결된다.
E. 면역세포 활성화 신호전달 영역
일부 구현양태에서, CAR은 하나 이상의 세포내 신호전달 영역을 포함한다. 세포내 신호전달 영역은 세포 표면 분자가 메조텔린을 인식할 때 신호를 세포 내로 변환할 수 있는 영역을 포함할 수 있다. 세포내 신호전달 영역은 CD28, 4-1BB(CD137), GITR, CD27, OX40, HVEM, CD3ζ 또는 Fc 수용체-연관 γ 사슬의 폴리펩티드의 세포내 영역으로부터 선택된 적어도 하나 이상의 구성원을 포함할 수 있다. 일부 구현양태에서, 세포내 신호전달 영역은 CD28 세포내 영역의 폴리펩티드, 4-1BB 세포내 영역의 폴리펩티드, CD3 세포내 영역의 폴리펩티드, 또는 이들의 조합을 포함한다.
일부 구현양태에서, CAR은 4-1BB 세포내 영역을 포함한다. 일부 구현양태에서, 4-1BB 세포내 영역은 KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(서열번호: 13)과 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 포함하는 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, 4-1BB 세포내 영역은 서열번호: 13과 약 85%의 서열 동일성을 포함하는 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, 4-1BB 세포내 영역은 서열번호: 13과 약 90%의 서열 동일성을 포함하는 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, 4-1BB 세포내 영역은 서열번호: 13과 약 95%의 서열 동일성을 포함하는 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, 4-1BB 세포내 영역은 서열번호: 13과 약 96%의 서열 동일성을 포함하는 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, 4-1BB 세포내 영역은 서열번호: 13과 약 97%의 서열 동일성을 포함하는 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, 4-1BB 세포내 영역은 서열번호: 13과 약 98%의 서열 동일성을 포함하는 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, 4-1BB 세포내 영역은 서열번호: 13과 약 99%의 서열 동일성을 포함하는 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, 4-1BB 세포내 영역은 서열번호: 13을 포함한다. 일부 구현양태에서, 4-1BB 세포내 영역은 서열번호: 13으로 구성된다.
일부 구현양태에서, CAR은 CD3ζ 세포내 영역을 추가로 포함한다. 일부 구현양태에서, CD3ζ 세포내 영역은 RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (서열번호: 14)과 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 포함하는 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, CD3ζ 세포내 영역은 서열번호: 14와 약 85%의 서열 동일성을 포함하는 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, CD3ζ 세포내 영역은 서열번호: 14와 약 90%의 서열 동일성을 포함하는 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, CD3ζ 세포내 영역은 서열번호: 14와 약 95%의 서열 동일성을 포함하는 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, CD3ζ 세포내 영역은 서열번호: 14와 약 96%의 서열 동일성을 포함하는 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, CD3ζ 세포내 영역은 서열번호: 14와 약 97%의 서열 동일성을 포함하는 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, CD3ζ 세포내 영역은 서열번호: 14와 약 98%의 서열 동일성을 포함하는 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, CD3ζ 세포내 영역은 서열번호: 14와 약 99%의 서열 동일성을 포함하는 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, CD3ζ 세포내 영역은 서열번호: 14를 포함한다. 일부 구현양태에서, CD3ζ 세포내 영역은 서열번호: 14로 구성된다.
IL-7 및 CCL19
인터루킨 7(IL-7)은 다능성(다분화능성) 조혈 줄기 세포의 림프 전구 세포로의 분화 및 림프 계통의 세포(예를 들어, B 세포, T 세포 및 NK 세포)의 증식에 관여한다. IL-7은 골수, 흉선 또는 림프 기관이나 조직의 간질 세포와 같은 비-조혈 세포에서 생산된다. 암 환경에서 IL-7의 투여는 CD8+ 및 CD4+ T 세포 모두의 항상성을 일시적으로 방해하고 CD4+CD25+Foxp3+ T 조절 세포의 비율을 감소시키는 것으로 나타났다.
일부 구현양태에서, 본원에 기재된 면역 세포는 IL-7을 발현한다. 일부 구현양태에서, IL-7은 MFHVSFRYIFGLPPLILVLLPVASSDCDIEGKDGKQYESVLMVSIDQLLDSMKEIGSNCLNNEFNFFKRHICDANKEGMFLFRAARKLRQFLKMNSTGDFDLHLLKVSEGTTILLNCTGQVKGRKPAALGEAQPTKSLEENKSLKEQKKLNDLCFLKRLLQEIKTCWNKILMGTKEH (서열번호: 18)와 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 포함하는 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, IL-7은 서열번호: 18과 약 85%의 서열 동일성을 포함하는 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, IL-7은 서열번호: 18과 약 90%의 서열 동일성을 포함하는 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, IL-7은 서열번호: 18과 약 95%의 서열 동일성을 포함하는 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, IL-7은 서열번호: 18과 약 96%의 서열 동일성을 포함하는 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, IL-7은 서열번호: 18과 약 97%의 서열 동일성을 포함하는 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, IL-7은 서열번호: 18과 약 98%의 서열 동일성을 포함하는 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, IL-7은 서열번호: 18과 약 99%의 서열 동일성을 포함하는 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, IL-7은 서열번호: 18을 포함한다. 일부 구현양태에서, IL-7은 서열번호: 18로 구성된다.
EBl1 리간드 케모카인(ELC) 및 대식세포 염증성 단백질-3-베타(MIP-3-베타)로도 알려진 케모카인(C-C 모티프) 리간드 19(CCL19)는 림프구 재순환 및 귀소에 역할을 한다. CCL19는 림프절의 수지상 세포 또는 대식세포에 의해 발현되며 수용체 CCR7을 통해 T 세포, B 세포 또는 성숙한 수지상 세포의 이동을 시작하는 기능을 가지고 있다.
일부 구현양태에서, 본원에 기재된 면역 세포는 CCL19를 추가로 발현한다. 일부 구현양태에서, CCL19는 MALLLALSLLVLWTSPAPTLSGTNDAEDCCLSVTQKPIPGYIVRNFHYLLIKDGCRVPAVVFTTLRGRQLCAPPDQPWVERIIQRLQRTSAKMKRRSS (서열번호: 19)와 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 포함하는 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, CCL19는 서열번호: 19와 약 85% 서열 동일성을 포함하는 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, CCL19는 서열번호: 19와 약 90% 서열 동일성을 포함하는 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, CCL19는 서열번호: 19와 약 95% 서열 동일성을 포함하는 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, CCL19는 서열번호: 19와 약 96% 서열 동일성을 포함하는 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, CCL19는 서열번호: 19와 약 97% 서열 동일성을 포함하는 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, CCL19는 서열번호: 19와 약 98% 서열 동일성을 포함하는 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, CCL19는 서열번호: 19와 약 99% 서열 동일성을 포함하는 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, CCL19는 서열번호: 19를 포함한다. 일부 구현양태에서, CCL19는 서열번호: 19로 구성된다.
추가 면역기능 제어 인자
본 발명의 면역세포는 IL-15, CCL21, IL-2, IL-4, IL-12, IL-13, IL-17, IL-18, IP-10, 인터페론-γ, MIP-1알파, GM-CSF, M-CSF, TGF-베타 또는 TNF-알파와 같은 추가적인 면역기능 제어 인자를 추가로 발현할 수 있다. 일부 구현양태에서, 추가적인 면역 기능 제어 인자는 IL-15를 포함한다. 일부 구현양태에서, 추가적인 면역 기능 제어 인자는 IL-2를 포함한다. 일부 구현양태에서, 추가적인 면역 기능 제어 인자는 인터페론-γ를 포함한다. 일부 구현양태에서, 추가적인 면역 기능 제어 인자는 GM-CSF를 포함한다. 일부 구현양태에서, 추가적인 면역 기능 제어 인자는 TGF-베타를 포함한다. 일부 구현양태에서, 추가적인 면역 기능 제어 인자는 TNF-알파를 포함한다. 일부 구현양태에서, 추가적인 면역 기능 제어 인자는 바람직하게는 IL-12 이외의 면역 기능 제어 인자이다.
각 지역의 배열
특정 구현양태에서, 메조텔린(예를 들어, 메조텔린에 특이적으로 결합하는 CAR), IL-7 및 CCL19에 특이적으로 결합하는 조작된 세포 표면 분자를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 분리된 핵산 분자가 본원에 개시된다. 일부 구현양태에서, 분리된 핵산 분자는 인간 메조텔린을 특이적으로 인식하는 항체, CD8 힌지 영역, CD8 막횡단 영역, 4-1BB 세포내 영역 및 CD3ζ 세포내 영역를 포함하는 CAR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; IL-7을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 CCL19를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현양태에서, CAR, IL-7 및 CCL19를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 핵산 분자 내의 2개 이상의 상이한 폴리뉴클레오티드에 위치한다. 다른 구현양태에서, 분리된 핵산 분자는 CAR 및 IL-7을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, CAR 및 CCL19를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 또는 CAR, IL-7 또는 CCL19를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 구현양태에서, CAR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 인간 메조텔린을 특이적으로 인식하는 항체의 업스트림에 신호전달 펩티드를 포함한다. 일부 구현양태에서, 항체는 펩티드 링커(예를 들어, AlaAlaAla)에 의해 CD8 힌지 영역에 연결된다. 일부 구현양태에서, 4-1BB 세포내 영역은 폴리뉴클레오티드에서 CD3ζ 세포내 영역의 업스트림에 위치한다.
폴리뉴클레오티드는 MDWTWRILFLVAAATGAHSQVQLQQSGPGLVTPSQTLSLTCAISGDSVSSNSATWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRMSINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARGMMTYYYGMDVWGQGTTVTVSSGILGSGGGGSGGGGSGGGGSQPVLTQSSSLSASPGASASLTCTLRSGINVGPYRIYWYQQKPGSPPQYLLNYKSDSDKQQGSGVPSRFSGSKDASANAGVLLISGLRSEDEADYYCMIWHSSAAVFGGGTQLTVLSAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (서열번호: 16)과 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CAR을 코딩할 수 있다. CAR은 서열번호: 16과 약 85% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. CAR은 서열번호: 16과 약 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. CAR은 서열번호: 16과 약 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. CAR은 서열번호: 16과 약 96% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. CAR은 서열번호: 16과 약 97% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. CAR은 서열번호: 16과 약 98% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. CAR은 서열번호: 16과 약 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. CAR은 서열번호: 16 포함할 수 있다. CAR은 서열번호: 16으로 구성될 수 있다.
폴리뉴클레오티드는 MDWTWRILFLVAAATGAHSQVQLQQSGPGLVTPSQTLSLTCAISGDSVSSNSATWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRMSINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARGMMTYYYGMDVWGQGTTVTVSSGILGSGGGGSGGGGSGGGGSQPVLTQSSSLSASPGASASLTCTLRSGINVGPYRIYWYQQKPGSPPQYLLNYKSDSDKQQGSGVPSRFSGSKDASANAGVLLISGLRSEDEADYYCMIWHSSAAVFGGGTQLTVLSRAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (서열번호: 31)과 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CAR을 코딩할 수 있다. CAR은 서열번호: 31과 약 85% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. CAR은 서열번호: 31과 약 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다.CAR은 서열번호: 31과 약 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. CAR은 서열번호: 31과 약 96% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. CAR은 서열번호: 31과 약 97% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. CAR은 서열번호: 31과 약 98% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. CAR은 서열번호: 31과 약 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. CAR은 서열번호: 31을 포함할 수 있다. CAR은 서열번호: 31로 구성될 수 있다.
폴리뉴클레오티드는 MDWTWRILFLVAAATGAHSQVQLQQSGPGLVTPSQTLSLTCAISGDSVSSNSATWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRMSINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARGMMTYYYGMDVWGQGTTVTVSSGILGSGGGGSGGGGSGGGGSQPVLTQSSSLSASPGASASLTCTLRSGINVGPYRIYWYQQKPGSPPQYLLNYKSDSDKQQGSGVPSRFSGSKDASANAGVLLISGLRSEDEADYYCMIWHSSAAVFGGGTQLTVLSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (서열번호: 32)과 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CAR을 코딩할 수 있다. CAR은 서열번호: 32와 약 85% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. CAR은 서열번호: 32와 약 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. CAR은 서열번호: 32와 약 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. CAR은 서열번호: 32와 약 96% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. CAR은 서열번호: 32와 약 97% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. CAR은 서열번호: 32와 약 98% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. CAR은 서열번호: 32와 약 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. CAR은 서열번호: 32을 포함할 수 있다. CAR은 서열번호: 32로 구성될 수 있다.
폴리뉴클레오티드는 MDWTWRILFLVAAATGAHSQVQLQQSGPGLVTPSQTLSLTCAISGDSVSSNSATWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRMSINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARGMMTYYYGMDVWGQGTTVTVSSGILGSGGGGSGGGGSGGGGSQPVLTQSSSLSASPGASASLTCTLRSGINVGPYRIYWYQQKPGSPPQYLLNYKSDSDKQQGSGVPSRFSGSKDASANAGVLLISGLRSEDEADYYCMIWHSSAAVFGGGTQLTVLSPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (서열번호: 33)과 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CAR을 코딩할 수 있다. CAR은 서열번호: 33과 약 85% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. CAR은 서열번호: 33과 약 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. CAR은 서열번호: 33과 약 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. CAR은 서열번호: 33과 약 96% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. CAR은 서열번호: 33과 약 97% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. CAR은 서열번호: 33과 약 98% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. CAR은 서열번호: 33와 약 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. CAR은 서열번호: 33을 포함할 수 있다. CAR은 서열번호: 33으로 구성될 수 있다.
폴리뉴클레오티드는 MDWTWRILFLVAAATGAHSQVQLQQSGPGLVTPSQTLSLTCAISGDSVSSNSATWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRMSINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARGMMTYYYGMDVWGQGTTVTVSSGILGSGGGGSGGGGSGGGGSQPVLTQSSSLSASPGASASLTCTLRSGINVGPYRIYWYQQKPGSPPQYLLNYKSDSDKQQGSGVPSRFSGSKDASANAGVLLISGLRSEDEADYYCMIWHSSAAVFGGGTQLTVLSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (서열번호: 34)과 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CAR을 코딩할 수 있다. CAR은 서열번호: 34와 약 85% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. CAR은 서열번호: 34와 약 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. CAR은 서열번호: 34와 약 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. CAR은 서열번호: 34와 약 96% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. CAR은 서열번호: 34와 약 97% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. CAR은 서열번호: 34와 약 98% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. CAR은 서열번호: 34와 약 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. CAR은 서열번호: 34를 포함할 수 있다. CAR은 서열번호: 34로 구성될 수 있다.
폴리뉴클레오티드는 MDWTWRILFLVAAATGAHSQVQLQQSGPGLVTPSQTLSLTCAISGDSVSSNSATWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRMSINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARGMMTYYYGMDVWGQGTTVTVSSGILGSGGGGSGGGGSGGGGSQPVLTQSSSLSASPGASASLTCTLRSGINVGPYRIYWYQQKPGSPPQYLLNYKSDSDKQQGSGVPSRFSGSKDASANAGVLLISGLRSEDEADYYCMIWHSSAAVFGGGTQLTVLSPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (서열번호: 35)과 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CAR을 코딩할 수 있다. CAR은 서열번호: 35와 약 85% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. CAR은 서열번호: 35와 약 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. CAR은 서열번호: 35와 약 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. CAR은 서열번호: 35와 약 96% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. CAR은 서열번호: 35와 약 97% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. CAR은 서열번호: 35와 약 98% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. CAR은 서열번호: 35와 약 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. CAR은 서열번호: 35를 포함할 수 있다. CAR은 서열번호: 35로 구성될 수 있다.
폴리뉴클레오티드는 MDWTWRILFLVAAATGAHSQVQLQQSGPGLVTPSQTLSLTCAISGDSVSSNSATWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRMSINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARGMMTYYYGMDVWGQGTTVTVSSGILGSGGGGSGGGGSGGGGSQPVLTQSSSLSASPGASASLTCTLRSGINVGPYRIYWYQQKPGSPPQYLLNYKSDSDKQQGSGVPSRFSGSKDASANAGVLLISGLRSEDEADYYCMIWHSSAAVFGGGTQLTVLSAAAPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (서열번호: 36)과 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CAR을 코딩할 수 있다. CAR은 서열번호: 36과 약 85% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. CAR은 서열번호: 36과 약 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. CAR은 서열번호: 36과 약 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. CAR은 서열번호: 36과 약 96% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. CAR은 서열번호: 36과 약 97% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. CAR은 서열번호: 36과 약 98% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. CAR은 서열번호: 36과 약 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. CAR은 서열번호: 36을 포함할 수 있다. CAR은 서열번호: 36으로 구성될 수 있다.
폴리뉴클레오티드는 MDWTWRILFLVAAATGAHSQVQLQQSGPGLVTPSQTLSLTCAISGDSVSSNSATWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRMSINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARGMMTYYYGMDVWGQGTTVTVSSGILGSGGGGSGGGGSGGGGSQPVLTQSSSLSASPGASASLTCTLRSGINVGPYRIYWYQQKPGSPPQYLLNYKSDSDKQQGSGVPSRFSGSKDASANAGVLLISGLRSEDEADYYCMIWHSSAAVFGGGTQLTVLSAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (서열번호: 37)과 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CAR을 코딩할 수 있다. CAR은 서열번호: 37과 약 85% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. CAR은 서열번호: 37과 약 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. CAR은 서열번호: 37과 약 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. CAR은 서열번호: 37과 약 96% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. CAR은 서열번호: 37과 약 97% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. CAR은 서열번호: 37과 약 98% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. CAR은 서열번호: 37과 약 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. CAR은 서열번호: 37을 포함할 수 있다. CAR은 서열번호: 37로 구성될 수 있다.
폴리뉴클레오티드는 MDWTWRILFLVAAATGAHSQVQLQQSGPGLVTPSQTLSLTCAISGDSVSSNSATWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRMSINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARGMMTYYYGMDVWGQGTTVTVSSGILGSGGGGSGGGGSGGGGSQPVLTQSSSLSASPGASASLTCTLRSGINVGPYRIYWYQQKPGSPPQYLLNYKSDSDKQQGSGVPSRFSGSKDASANAGVLLISGLRSEDEADYYCMIWHSSAAVFGGGTQLTVLSAAAPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (서열번호: 38)과 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CAR을 코딩할 수 있다. CAR은 서열번호: 38과 약 85% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. CAR은 서열번호: 38과 약 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. CAR은 서열번호: 38과 약 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. CAR은 서열번호: 38과 약 96% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. CAR은 서열번호: 38과 약 97% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. CAR은 서열번호: 38과 약 98% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. CAR은 서열번호: 38과 약 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. CAR은 서열번호: 38을 포함할 수 있다. CAR은 서열번호: 38로 구성될 수 있다.
폴리뉴클레오티드는 MDWTWRILFLVAAATGAHSQVQLQQSGPGLVTPSQTLSLTCAISGDSVSSNSATWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRMSINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARGMMTYYYGMDVWGQGTTVTVSSGILGSGGGGSGGGGSGGGGSQPVLTQSSSLSASPGASASLTCTLRSGINVGPYRIYWYQQKPGSPPQYLLNYKSDSDKQQGSGVPSRFSGSKDASANAGVLLISGLRSEDEADYYCMIWHSSAAVFGGGTQLTVLSRAAAPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (서열번호: 39)과 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CAR을 코딩할 수 있다. CAR은 서열번호: 39와 약 85% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. CAR은 서열번호: 39와 약 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. CAR은 서열번호: 39와 약 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. CAR은 서열번호: 39와 약 96% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. CAR은 서열번호: 39와 약 97% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. CAR은 서열번호: 39와 약 98% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. CAR은 서열번호: 39와 약 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. CAR은 서열번호: 39를 포함할 수 있다. CAR은 서열번호: 39로 구성될 수 있다.
폴리뉴클레오티드는 MDWTWRILFLVAAATGAHSQVQLQQSGPGLVTPSQTLSLTCAISGDSVSSNSATWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRMSINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARGMMTYYYGMDVWGQGTTVTVSSGILGSGGGGSGGGGSGGGGSQPVLTQSSSLSASPGASASLTCTLRSGINVGPYRIYWYQQKPGSPPQYLLNYKSDSDKQQGSGVPSRFSGSKDASANAGVLLISGLRSEDEADYYCMIWHSSAAVFGGGTQLTVLSRAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (서열번호: 40)과 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CAR을 코딩할 수 있다. CAR은 서열번호: 40과 약 85% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. CAR은 서열번호: 40과 약 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. CAR은 서열번호: 40과 약 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. CAR은 서열번호: 40과 약 96% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. CAR은 서열번호: 40과 약 97% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. CAR은 서열번호: 40과 약 98% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. CAR은 서열번호: 40과 약 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. CAR은 서열번호: 40을 포함할 수 있다. CAR은 서열번호: 40으로 구성될 수 있다.
폴리뉴클레오티드는 MDWTWRILFLVAAATGAHSQVQLQQSGPGLVTPSQTLSLTCAISGDSVSSNSATWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRMSINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARGMMTYYYGMDVWGQGTTVTVSSGILGSGGGGSGGGGSGGGGSQPVLTQSSSLSASPGASASLTCTLRSGINVGPYRIYWYQQKPGSPPQYLLNYKSDSDKQQGSGVPSRFSGSKDASANAGVLLISGLRSEDEADYYCMIWHSSAAVFGGGTQLTVLSRAAAPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (서열번호: 41)과 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CAR을 코딩할 수 있다. CAR은 서열번호: 41과 약 85% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. CAR은 서열번호: 41과 약 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. CAR은 서열번호: 41과 약 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. CAR은 서열번호: 41과 약 96% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. CAR은 서열번호: 41과 약 97% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. CAR은 서열번호: 41과 약 98% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. CAR은 서열번호: 41과 약 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. CAR은 서열번호: 41을 포함할 수 있다. CAR은 서열번호: 41로 구성될 수 있다.
본원에 기재된 CAR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 ATGGACTGGACCTGGAGGATCCTGTTTCTGGTGGCCGCCGCCACAGGAGCCCACAGCCAGGTGCAGCTGCAGCAGAGCGGACCTGGCCTGGTGACACCCAGCCAGACCCTGAGCCTGACCTGTGCCATCTCCGGCGATAGCGTGAGCAGCAACAGCGCCACCTGGAACTGGATCAGGCAGAGCCCCAGCAGAGGACTGGAGTGGCTGGGCAGGACCTACTACAGGAGCAAGTGGTACAACGACTACGCCGTGAGCGTGAAGAGCAGGATGAGCATCAACCCCGACACCAGCAAGAACCAGTTCTCCCTGCAGCTGAACTCCGTGACCCCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGGGCATGATGACCTACTACTACGGCATGGACGTGTGGGGCCAGGGAACCACCGTGACCGTGAGCAGCGGCATCCTGGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGAGGAGGCGGAAGCCAGCCTGTGCTGACCCAGAGCAGCAGCCTGAGCGCTAGCCCTGGAGCTAGCGCCAGCCTGACCTGCACCCTGAGAAGCGGCATCAACGTGGGCCCCTACAGGATCTACTGGTACCAGCAGAAGCCTGGCAGCCCCCCCCAGTACCTGCTGAACTACAAGAGCGACAGCGACAAGCAGCAGGGCAGCGGCGTGCCTAGCAGATTCAGCGGCAGCAAGGATGCCAGCGCCAACGCCGGAGTGCTGCTGATCAGCGGCCTGAGGAGCGAGGATGAGGCCGACTACTACTGCATGATCTGGCACAGCAGCGCCGCCGTGTTTGGAGGCGGAACCCAGCTGACCGTGCTGAGCGCGGCCGCAACCACCACCCCCGCCCCTAGACCTCCTACACCCGCTCCCACAATCGCCAGCCAGCCTCTGTCTTTAAGACCCGAGGCTTGTAGACCCGCTGCTGGCGGCGCCGTGCATACCAGAGGACTGGACTTCGCTTGTGACATCTACATCTGGGCTCCTTTAGCCGGCACATGTGGAGTGCTGCTGCTGTCTTTAGTGATCACTTTATACTGCAAGAGGGGTCGTAAGAAGCTGCTGTACATCTTCAAGCAGCCCTTCATGAGGCCCGTGCAGACCACCCAAGAAGAGGACGGCTGCAGCTGTCGTTTTCCCGAAGAGGAGGAGGGCGGCTGCGAGCTGAGGGTGAAGTTCAGCAGAAGCGCCGATGCCCCCGCTTACCAGCAAGGTCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAATTTAGGTCGTAGGGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGAGGAGGGGCAGAGACCCCGAAATGGGCGGCAAGCCTCGTAGGAAGAACCCCCAAGAAGGTTTATACAACGAGCTGCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGAGGAGGAGAGGCAAGGGCCACGACGGTTTATACCAAGGTCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTACGATGCTTTACACATGCAAGCTTTACCTCCTCGT (서열번호: 17)와 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 서열번호: 17과 약 85% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 서열번호: 17과 약 90% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 서열번호: 17과 약 95% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 서열번호: 17과 약 96% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 서열번호: 17과 약 97% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 서열번호: 17과 약 98% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 서열번호: 17과 약 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 서열번호: 17을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 서열번호: 17로 구성될 수 있다.
일부 구현양태에서, CAR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, IL-7을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 CCL19를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 자가-절단 2A 펩티드(2A 펩티드) 또는 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 프로모터 하에서 각각 독립적으로 전사된다. 일부 구현양태에서, IL-7을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 CCL19를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 2A 펩티드 또는 IRES를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 프로모터 하에서 각각 독립적으로 전사된다.
일부 구현양태에서, CAR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, IL-7을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 CCL19를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 각각 독립적으로 2A 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 프로모터 하에서 전사된다. 2A 펩티드 계열에는 P2A, E2A, F2A 및 T2A의 네 가지 구성원이 있다. P2A는 돼지 테스코바이러스-1 2A로부터 유래된다. E2A는 말 비염 A 바이러스에서 유래된다. F2A는 구제역 바이러스 18에서 유래된다. T2A는 토세아 아시그나(thosea asigna) 바이러스 2A에서 유래된다. 2A 펩티드 구성원에 대한 예시적인 서열은 다음을 포함한다:
P2A - ATNFSLLKQAGDVEENPGP;
E2A - QCTNYALLKLAGDVESNPGP;
F2A - VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP; 및
T2A - EGRGSLLTCGDVEENPGP.
일부 구현양태에서, 2A 펩티드의 말단, 예를 들어 N-말단에 펩티드 링커가 추가로 첨가된다. 일부 구현양태에서, 펩티드 링커는 GSG를 포함한다.
일부 구현양태에서, CAR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, IL-7을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 CCL19를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 P2A 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 프로모터 하에서 각각 독립적으로 전사된다. P2A 펩티드는 ATNFSLLKQAGDVEENPGP를 포함할 수 있다. 일부 구현양태에서, P2A 펩티드의 N-말단에 펩티드 링커(예를 들어, GSG)가 추가로 첨가된다. 일부 경우에, P2A는 GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP(서열번호: 23)를 포함한다.
일부 구현양태에서, CAR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, IL-7을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 CCL19를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 핵산 분자에서 5' 말단에서 3' 말단으로 다음과 같이 배열된다:
CAR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 - IL-7을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 - CCL19를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
CAR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 - CCL19를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 - IL-7을 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
IL-7을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 - CAR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 - CCL19를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
CCL19를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 - CAR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 - IL-7을 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
IL-7을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 - CCL19를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 - CAR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 또는
CCL19를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 - IL-7을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 - CAR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
일부 구현양태에서, 예상치 못한 재조합을 방지하기 위해 제1 2A 펩티드(1st 및 2nd 폴리뉴클레오티드 사이에 위치)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 제2 2A 펩티드(2nd 및 3rd 폴리뉴클레오티드 사이에 위치)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 동일하지 않은(코돈-최적화된) 폴리뉴클레오티드이다. 일부 구현양태에서, 제1 P2A 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 GGAAGCGGAGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCC(서열번호: 26)을 포함하고, 제2 P2A 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 GGCAGCGGCGCCACCAACTTCTCTCTGCTGAAGCAAGCCGGCGATGTGGAGGAGAATCCCGGCCCC(서열번호: 27)을 포함한다.
일부 구현양태에서, 본원에 기재된 CAR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, IL-7을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, CCL19를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 ATGGACTGGACCTGGAGGATCCTGTTTCTGGTGGCCGCCGCCACAGGAGCCCACAGCCAGGTGCAGCTGCAGCAGAGCGGACCTGGCCTGGTGACACCCAGCCAGACCCTGAGCCTGACCTGTGCCATCTCCGGCGATAGCGTGAGCAGCAACAGCGCCACCTGGAACTGGATCAGGCAGAGCCCCAGCAGAGGACTGGAGTGGCTGGGCAGGACCTACTACAGGAGCAAGTGGTACAACGACTACGCCGTGAGCGTGAAGAGCAGGATGAGCATCAACCCCGACACCAGCAAGAACCAGTTCTCCCTGCAGCTGAACTCCGTGACCCCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGGGCATGATGACCTACTACTACGGCATGGACGTGTGGGGCCAGGGAACCACCGTGACCGTGAGCAGCGGCATCCTGGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGAGGAGGCGGAAGCCAGCCTGTGCTGACCCAGAGCAGCAGCCTGAGCGCTAGCCCTGGAGCTAGCGCCAGCCTGACCTGCACCCTGAGAAGCGGCATCAACGTGGGCCCCTACAGGATCTACTGGTACCAGCAGAAGCCTGGCAGCCCCCCCCAGTACCTGCTGAACTACAAGAGCGACAGCGACAAGCAGCAGGGCAGCGGCGTGCCTAGCAGATTCAGCGGCAGCAAGGATGCCAGCGCCAACGCCGGAGTGCTGCTGATCAGCGGCCTGAGGAGCGAGGATGAGGCCGACTACTACTGCATGATCTGGCACAGCAGCGCCGCCGTGTTTGGAGGCGGAACCCAGCTGACCGTGCTGAGCGCGGCCGCAACCACCACCCCCGCCCCTAGACCTCCTACACCCGCTCCCACAATCGCCAGCCAGCCTCTGTCTTTAAGACCCGAGGCTTGTAGACCCGCTGCTGGCGGCGCCGTGCATACCAGAGGACTGGACTTCGCTTGTGACATCTACATCTGGGCTCCTTTAGCCGGCACATGTGGAGTGCTGCTGCTGTCTTTAGTGATCACTTTATACTGCAAGAGGGGTCGTAAGAAGCTGCTGTACATCTTCAAGCAGCCCTTCATGAGGCCCGTGCAGACCACCCAAGAAGAGGACGGCTGCAGCTGTCGTTTTCCCGAAGAGGAGGAGGGCGGCTGCGAGCTGAGGGTGAAGTTCAGCAGAAGCGCCGATGCCCCCGCTTACCAGCAAGGTCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAATTTAGGTCGTAGGGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGAGGAGGGGCAGAGACCCCGAAATGGGCGGCAAGCCTCGTAGGAAGAACCCCCAAGAAGGTTTATACAACGAGCTGCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGAGGAGGAGAGGCAAGGGCCACGACGGTTTATACCAAGGTCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTACGATGCTTTACACATGCAAGCTTTACCTCCTCGTGGAAGCGGAGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCCTGCATGTTCCATGTGAGCTTCAGGTACATCTTCGGACTGCCTCCTCTCATCCTGGTCCTCCTCCCCGTGGCCAGCTCCGACTGTGACATCGAAGGAAAGGATGGCAAGCAGTACGAAAGCGTGCTGATGGTGAGCATCGATCAGCTCCTGGATTCCATGAAGGAAATCGGCTCCAACTGCCTCAACAATGAGTTCAACTTTTTTAAGAGGCATATCTGCGACGCCAACAAGGAGGGCATGTTTCTGTTCAGGGCCGCCAGGAAGCTGAGACAGTTCCTCAAGATGAATAGCACCGGCGACTTCGACCTCCATCTGCTGAAGGTGTCCGAGGGAACCACCATCCTGCTGAACTGCACCGGCCAAGTGAAGGGAAGAAAACCTGCTGCCCTGGGCGAGGCTCAGCCTACCAAGAGCCTGGAGGAGAACAAAAGCCTGAAGGAGCAGAAGAAGCTGAACGACCTGTGCTTCCTCAAGAGGCTCCTGCAGGAGATTAAGACCTGTTGGAACAAGATCCTGATGGGCACAAAGGAGCACGGCAGCGGCGCCACCAACTTCTCTCTGCTGAAGCAAGCCGGCGATGTGGAGGAGAATCCCGGCCCCATGGCTCTGCTGCTCGCCCTGAGCCTGCTCGTCCTCTGGACCTCCCCTGCTCCTACCCTGAGCGGCACCAATGACGCTGAAGACTGCTGCCTGTCCGTGACCCAGAAGCCTATCCCCGGATATATCGTGAGGAATTTTCATTACCTCCTGATCAAGGACGGCTGTAGAGTGCCCGCCGTCGTGTTCACAACACTCAGAGGCAGGCAGCTGTGTGCTCCCCCCGACCAGCCTTGGGTGGAGAGAATCATTCAGAGACTGCAAAGGACCTCCGCTAAGATGAAGAGGAGGTCCAGC (서열번호: 25)와 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함할 수 있다.
벡터
일부 구현양태에서, 하나 이상의 벡터는 CAR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, IL-7을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 CCL19를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현양태에서, 벡터(예를 들어, 발현 벡터)는 인간 메조텔린을 특이적으로 인식하는 항체, CD8 힌지 영역, CD8 막횡단 영역, 4-1BB 세포내 영역, 및 CD3ζ 세포내 영역를 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; IL-7을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 CCL19를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자를 포함한다. 도 1a 참조. 일부 구현양태에서, IL-7을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 CCL19를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 벡터(예를 들어, 발현 벡터)에서 5' 말단에서 3' 말단으로 다음과 같이 배열된다:
CAR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 - IL-7을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 - CCL19를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
CAR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 - CCL19를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 - IL-7을 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
IL-7을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 - CAR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 - CCL19를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
CCL19를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 - CAR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 - IL-7을 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
IL-7을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 - CCL19를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 - CAR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 또는
CCL19를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 - IL-7을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 - CAR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
일부 구현양태에서, 제1 벡터(예를 들어, 제1 발현 벡터)는 CAR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 제2 벡터(예를 들어, 제2 발현 벡터)는 IL-7을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 CCL19를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, IL-7을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 CCL19를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 제2 벡터(예를 들어, 제2 발현 벡터)에서 5' 말단에서 3' 말단으로 임의로 IL-7을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 - CCL19를 코딩하는 폴리뉴클레오티드) 또는 CCL19를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 - IL-7을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로서 배열된다.
추가 구현양태에서, 제1 벡터(예를 들어, 제1 발현 벡터)는 CAR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 IL-7을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 CCL19를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 제2 벡터(예를 들어, 제2 발현 벡터)는 IL-7을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 제1 벡터에 포함되지 않은 CCL19를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현양태에서, 제1 벡터(예를 들어, 제1 발현 벡터)는 CAR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 IL-7을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 제2 벡터(예를 들어, 제2 발현 벡터)는 CCL19를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 다른 구현양태에서, 제1 벡터(예를 들어, 제1 발현 벡터)는 CAR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 CCL19를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 제2 벡터(예를 들어, 제2 발현 벡터)는 IL-7을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
추가 구현양태에서, 제1 벡터(예를 들어, 제1 발현 벡터)는 CAR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 제2 벡터(예를 들어, 제2 발현 벡터)는 IL-7을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 제3 벡터(예를 들어, 제3 발현 벡터)는 CCL19를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
본 발명의 벡터(예를 들어, 발현 벡터)는 하나 이상의 천연 유래 핵산 또는 인공 합성 핵산을 포함할 수 있으며, 본 발명의 벡터(예를 들어, 발현 벡터)가 도입되는 세포의 종류에 따라 적절하게 선택될 수 있다. 이들의 서열 정보는 공지된 문헌이나 NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/) 등의 데이터베이스를 검색함으로써 적절하게 얻을 수 있다.
본 발명의 벡터는 벡터를 세포와 접촉시켜 그안에 코딩된 소정의 단백질(폴리펩티드)이 면역세포 내에서 발현되어 본 발명의 변형된 면역세포를 생산할 수 있도록 면역세포 또는 그 전구체 세포에 도입되는 발현 벡터일 수 있다. 본 발명의 발현벡터는 어떠한 구현양태에 특별히 제한되지 않는다. 당업자는 면역 세포에서 원하는 단백질(폴리펩티드)의 발현을 허용하는 발현 벡터를 설계하고 생산할 수 있다. 인간 메조텔린을 특이적으로 인식하는 세포 표면 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, IL-7을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, CCL19를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 본 발명의 발현 벡터의 예로는 본 발명의 면역 세포 생산을 위한 발현 벡터 중 어느 하나를 포함할 수 있다.
본 발명의 발현 벡터의 종류는 선형 또는 원형일 수 있으며, 플라스미드와 같은 비-바이러스성 벡터일 수도 있고, 바이러스성 벡터일 수도 있고, 트랜스포존 기반의 벡터일 수도 있다. 이러한 벡터는 프로모터 또는 터미네이터와 같은 제어 서열, 또는 약물 저항성 유전자 또는 리포터 유전자와 같은 선택적 마커 서열을 함유할 수 있다. CAR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, IL-7을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 CCL19를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 각각의 폴리뉴클레오티드가 효율적으로 전사될 수 있도록 프로모터 서열의 다운스트림에 작동가능하게 배열될 수 있다.
프로모터의 예로는 레트로바이러스 LTR 프로모터, SV40 초기 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터, 헤르페스 심플렉스 바이러스 티미딘 키나제 프로모터 등의 바이러스-유래 프로모터; 및 포스포글리세레이트 키나제(PGK) 프로모터, Xist 프로모터, β-액틴 프로모터 및 RNA 폴리머라제 II 프로모터와 같은 포유동물-유래 프로모터를 포함할 수 있다. 일부 구현양태에서, 프로모터는 바람직하게는 레트로바이러스 LTR 프로모터를 포함할 수 있다. 레트로바이러스 LTR 프로모터는 CTGAATATGGGCCAAACAGGATATCTGTGGTAAGCAGTTCCTGCCCCGGCTCAGGGCCAAGAACAGATGGAACAGCTGAATATGGGCCAAACAGGATATCTGTGGTAAGCAGTTCCTGCCCCGGCTCAGGGCCAAGAACAGATGGTCCCCAGATGCGGTCCAGCCCTCAGCAGTTTCTAGAGAACCATCAGATGTTTCCAGGGTGCCCCAAGGACCTGAAATGACCCTGTGCCTTATTTGAACTAACCAATCAGTTCGCTTCTCGCTTCTGTTCGCGCGCTTCTGCTCCCCGAGCTCAATAAAAGAGCCCACAACCCCTCACTCGGCGCGCCAGTCCTCCGATTGACTGAGTCGCCCGGGTACCCGTGTATCCAATAAACCCTCTTGCAGTTGCATCCGACTTGTGGTCTCGCTGTTCCTTGGGAGGGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACCCGTCAGCGGGGGTCTTTCA (서열번호: 24)를 포함할 수 있다. 또는, 테트라사이클린에 의해 유도되는 테트라사이클린-반응성 프로모터, 인터페론에 의해 유도되는 Mx1 프로모터 등을 사용할 수도 있다. 본 발명의 발현 벡터에 특정 물질에 의해 유도되는 프로모터를 사용하면 암의 치료 과정, 예를 들어 본 발명의 벡터를 함유하는 면역세포가 암 치료에 사용하기 위한 약제학 조성물로 사용되는 경우에 IL-7 및 CCL19의 발현 유도를 제어할 수 있다.
바이러스 벡터의 예는 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터 등을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 감마 레트로바이러스 벡터 등의 레트로바이러스 벡터, 보다 바람직하게는 pMSGV 벡터(Tamada k 등, Clin Cancer Res 18: 6436-6445 (2002)), pMSCV 벡터(Takara Bio Inc. 제조) 또는 pSFG 벡터를 포함할 수 있다. 레트로바이러스 벡터를 사용하면 전이유전자가 숙주 세포의 게놈에 통합되기 때문에 전이유전자의 장기적이고 안정적인 발현이 가능해진다.
본 발명의 발현 벡터가 면역 세포에 함유되어 있는지 확인하기 위해 하나 이상의 검정법을 사용할 수 있다. 예시적인 검정법에는 조작된 면역 세포에 의한 CAR의 발현을 스크리닝하기 위한 유세포측정법, 노던 블롯팅, 서던 블롯팅, RT-PCR과 같은 PCR, ELISA 또는 웨스턴 블롯팅이 포함될 수 있다. 일부 구현양태에서, 발현 벡터는 면역 세포에 의한 CAR, IL-7 및/또는 CCL19의 발현을 검출하기 위한 마커 유전자(예를 들어 녹색 형광 단백질(GFP), 적색 형광 단백질(RFP) 또는 황색 형광 단백질(YFP)과 같은 형광 단백질을 코딩)을 추가로 포함한다.
면역 세포 및 생산 방법
특정 구현양태에서, 본원에 기재된 면역 세포는 메조텔린(예를 들어, 인간 메조텔린), IL-7 및 CCL19를 특이적으로 인식하는 세포 표면 분자를 발현하도록 변형된다(도 1b). 예시적인 면역 세포는 T 세포, 자연 살해 세포(NK 세포) 및 B 세포와 같은 림프 세포, 단핵구, 대식세포, 수지상 세포와 같은 항원 제시 세포, 또는 호중구, 호산구, 호염기구 또는 비만세포와 같은 과립구를 포함할 수 있다. 면역세포는 인간, 개, 고양이, 돼지, 마우스 등의 포유동물로부터 유래된 T 세포, 바람직하게는 인간으로부터 유래되거나 분리된 T 세포를 포함할 수 있다. 면역 세포(예를 들어, T 세포)는 배양, 예를 들어 생체외 배양을 통해 얻거나 포유동물로부터 직접 수확될 수 있다. 면역 세포는 면역 반응에 관여하고 메조텔린(예를 들어, 인간 메조텔린)을 특이적으로 인식하고 IL-7을 발현하며 CCL19를 발현하는 세포 표면 분자를 발현할 수 있는 한 제한되지 않다. 면역 세포는 후속 치료를 위해 이를 필요로 하는 대상체로부터 수확된 자가 세포일 수 있다. 면역 세포는 또한 이를 필요로 하는 대상체에 대해 동종 세포 또는 동계 세포일 수 있다. 면역세포는 또한 줄기세포(예를 들어, 유도만능줄기세포(iPS 세포), 배아줄기세포(ES 세포)) 또는 전구세포를 면역세포로 유도하고 분화시키기 위한 적절한 조건에서 배양함으로써 얻을 수 있다.
특정 구현양태에서, 메조텔린, IL-7 및 CCL19를 특이적으로 인식하는 CAR을 발현하도록 변형된 면역 세포 집단이 본원에 개시된다. 일부 구현양태에서, 면역 세포 집단은 메조텔린, IL-7 및 CCL19를 특이적으로 인식하는 CAR을 발현하는 변형된 T 세포(예를 들어, 생체외에서 확장되거나 포유동물로부터 수확된)를 포함한다. 면역 세포 집단은 변형된 T 세포의 약 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 그 이상의 백분율을 포함할 수 있다. 면역 세포 집단은 약 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95%의 변형된 T 세포를 포함할 수 있다. 면역 세포 집단은 변형된 T 세포의 실질적으로 순수한 집단을 포함할 수 있다. 예시적인 T 세포는 알파-베타 T 세포, 감마-델타 T 세포, CD8+ T 세포, CD4+ T 세포, 종양 침윤 T 세포, 기억 T 세포, 미경험 T 세포 및 자연 살해 T (NKT)세포를 포함할 수 있다.
일부 구현양태에서, 메조텔린, IL-7 및 CCL19를 특이적으로 인식하는 CAR을 발현하도록 변형된 면역 세포 집단은 오염된 세포를 약 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5% 미만을 포함한다. 본원에 사용된 용어 "오염 세포"는 메조텔린, IL-7 및 CCL19를 특이적으로 인식하는 CAR을 발현하지 않는 세포를 의미한다. 오염 세포에는 메조텔린, IL-7 및 CCL19를 특이적으로 인식하는 CAR을 발현하지 않는 T 세포, 및 메조텔린, IL-7 및 CCL19를 특이적으로 인식하는 CAR을 발현하지 않는 다른 유형의 면역 세포가 포함될 수 있다. 오염 세포는 또한 혈액 또는 골수액과 같은 체액, 비장 조직, 흉선 또는 림프절과 같은 조직에서 유래되거나 원발성 종양 조직, 전이성 종양 조직, 또는 암성 복수와 같은 암 조직에서 유래한 비-면역 세포를 의미할 수도 있다.
본 발명의 면역세포를 생산하는 방법의 예는 세포 표면 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, IL-7을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, CCL19를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 면역세포에 도입하는 생산 방법을 포함할 수 있다. 제조 방법으로는, 예를 들어 WO2016/056228, WO2017/159736, WO2013/176915, WO2015/120096, WO2016/019300 또는 Vormittag P 등, Curr Opin Biotechnol 2018; 53: 164-81에 기재된 생산방법을 포함할 수 있다. 대안적인 예에는 메조텔린(예를 들어, 인간 메조텔린), IL-7 및/또는 CCL19를 특이적으로 인식하는 세포 표면 분자의 발현을 위한 벡터를 수정된 알에 이식하여 생산된 트랜스제닉 포유동물로부터 면역 세포를 정제하고 수득하는 방법 및 필요에 따라 메조텔린(예를 들어, 인간 메조텔린), IL-7 및/또는 CCL19를 특이적으로 인식하는 세포 표면 분자의 발현을 위한 벡터를 트랜스제닉 포유동물로부터 정제하여 수득한 면역세포에 추가로 도입하는 제조 방법이 포함될 수 있다.
세포 표면 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, IL-7을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 CCL19를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 상기 기재된 벡터를 도입하는 경우, 방법은 폴리뉴클레오티드 또는 벡터를 면역세포에 도입하는 임의의 방법일 수 있다. 예로는 전기천공법(Cytotechnology, 3, 133(1990)), 인산칼슘법(일본 미심사 특허출원 공개 제2-227075호), 리포펙션법(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 84, 7413 (1987)) 및 바이러스 감염 방법을 포함한다. 바이러스 감염 방법의 예로는 GP2-293 세포(Takara Bio Inc. 제품), Plat-GP 세포(Cosmo Bio Co., Ltd. 제품), PG13 세포(ATCC CRL-10686) 또는 PA317 세포(ATCC CRL-9078)와 같은 패키징 세포를 도입할 벡터와 패키징 플라스미드를 사용하여 형질감염시켜 재조합 바이러스를 생산하고 면역 세포를 재조합 바이러스로 감염시키는 방법을 포함할 수 있다(예를 들어 WO2017/159736 참조).
일부 구현양태에서, 방법은 CAR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, IL-7을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 CCL19를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 하나 이상의 벡터를 면역 세포에 도입하는 것을 포함한다. 일부 구현양태에서, 방법은 인간 메조텔린을 특이적으로 인식하는 항체, CD8 힌지 영역, CD8 막횡단 영역, 4-1BB 세포내 영역 및 CD3ζ 세포내 영역를 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; IL-7을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 CCL19를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자를 포함하는 벡터(예를 들어 발현 벡터)를 면역세포에 도입하는 것을 포함한다. 일부 구현양태에서, 방법은 CAR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 벡터(예를 들어, 제1 발현 벡터) 및 IL-7을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 CCL19를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제2 벡터(예를 들어, 제2 발현 벡터)를 함께 또는 단계적으로 면역 세포에 도입하는 것을 포함한다. 일부 구현양태에서, 방법은 CAR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 IL-7을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 CCL19를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 벡터(예를 들어, 제1 발현 벡터) 및 IL-7을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 제1 벡터에 포함되지 않은 CCL19를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제2 벡터(예를 들어, 제2 발현 벡터)를 함께 또는 단계적으로 면역 세포에 도입하는 것을 포함한다. 일부 구현양태에서, 방법은 CAR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 IL-7을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 벡터(예를 들어, 제1 발현 벡터) 및 CCL19를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제2 벡터(예를 들어, 제2 발현 벡터)를 함께 또는 단계적으로 면역 세포에 도입하는 것을 포함한다. 일부 구현양태에서, 방법은 CAR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 CCL19를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 벡터(예를 들어, 제1 발현 벡터) 및 IL-7을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제2 벡터(예를 들어, 제2 발현 벡터)를 함께 또는 단계적으로 면역 세포에 도입하는 것을 포함한다. 일부 구현양태에서, 방법은 CAR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 벡터(예를 들어, 제1 발현 벡터), IL-7을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제2 벡터(예를 들어, 제2 발현 벡터), 및 CCL19를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제3 벡터(예를 들어, 제3 발현 벡터)를 함께 또는 단계적으로 면역 세포에 도입하는 것을 포함한다.
CAR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, IL-7을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, CCL19를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 중 하나 이상이 면역 세포의 게놈 내로 통합될 수 있다. 일부 구현양태에서, CAR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, IL-7을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 CCL19를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 게놈 내로 (예를 들어 에피솜적으로) 통합되지 않는다.
사용 방법
특정 구현양태에서, 메조텔린-발현 암을 치료하는 방법이 본원에 개시된다. 일부 구현양태에서, 방법은 메조텔린, 인터루킨 7(IL-7) 및 케모카인(C-C 모티프) 리간드 19(CCL19)에 특이적으로 결합하는 조작된 세포 표면 분자를 발현하도록 변형된 본원에 기재된 면역 세포를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현양태에서, 면역 세포는 메조텔린을 특이적으로 인식하는 키메라 항원 수용체(CAR) 또는 메조텔린에 특이적으로 결합하는 T 세포 수용체(TCR)를 포함하는 조작된 세포 표면 분자를 발현하도록 변형된다. 일부 구현양태에서, 면역 세포는 인간 메조텔린을 특이적으로 인식하는 항체, CD8 힌지 영역, CD8 막횡단 영역, 4-1BB 세포내 영역 및 CD3ζ 세포내 영역를 포함하는 CAR; IL-7; 및 CCL19을 발현하도록 변형된다.
일부 구현양태에서, 메조텔린-발현 암은 고형 종양이다. 일부 구현양태에서, 고형 종양은 중피종, 결장직장암, 췌장암, 흉선암, 담관암, 폐암, 피부암, 유방암, 전립선암, 방광암, 처녀암, 목암, 자궁암, 간암, 신장암, 위암, 비장암, 기관암, 기관지암, 위장암, 식도암, 담낭암, 고환암, 난소암 또는 골암을 포함한다. 일부 구현양태에서, 메조텔린-발현 암은 난소암이다. 일부 구현양태에서, 메조텔린-발현 암은 중피종이다. 일부 구현양태에서, 메조텔린-발현 암은 위암이다. 일부 구현양태에서, 메조텔린-발현 암은 폐암(예를 들어, 비소세포폐암(NSCLC), 소세포폐암(SCLC), 폐 카르시노이드 종양, 폐의 선편평암종, 대세포 신경내분비 암종, 또는 타액선형 폐암종)이다. 일부 구현양태에서, 메조텔린-발현 암은 NSCLC(예를 들어, 폐 선암종, 편평 세포, 대세포 미분화 암종, 육종양 암종 또는 선편평 암종)이다.
메조텔린-발현 암은 조혈암일 수 있다. 조혈암은 B-세포 조혈암, T-세포 조혈암, 호지킨 림프종, 또는 비-호지킨 림프종일 수 있다. 조혈암은 급성 림프구성 백혈병(ALL), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 소림프구성 림프종(SLL), 미만성 거대 B-세포 림프종(DLBCL), 여포성 림프종(FL), 외투세포 림프종(MCL), 변연부 림프종, 버킷 림프종, 또는 발덴스트롬 마크로글로불린혈증암일 수 있다.
조혈암은 육종일 수 있다. 육종에는 연골육종, 유잉 육종, 악성 혈관내피종, 악성 신경초종, 골육종 또는 연조직 육종이 포함될 수 있다.
메조텔린-발현 암은 전이성 암, 예를 들어 전이성 고형 종양 또는 전이성 조혈암일 수 있다. 전이성 메조텔린-발현 암은 전이성 난소암, 전이성 중피종, 전이성 위암, 또는 전이성 폐암(예를 들어, 전이성 NSCLC)일 수 있다.
메조텔린-발현 암은 재발성 또는 불응성 암, 예를 들어 재발성 또는 불응성 고형 종양, 또는 재발성 또는 불응성 조혈암일 수 있다. 재발성 또는 불응성 메조텔린-발현 암은 재발성 또는 불응성 난소암, 재발성 또는 불응성 중피종, 재발성 또는 불응성 위암, 또는 재발성 또는 불응성 폐암(예를 들어, 재발성 또는 불응성 NSCLC)일 수 있다.
일부 구현양태에서, 방법은 대상체에게 추가 치료제 또는 추가 치료 요법을 투여하는 것을 추가로 포함한다. 추가 치료제는 화학요법제, 면역요법제, 표적 치료법, 방사선 치료법, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 예시적인 추가 치료제에는 알트레타민, 부술판, 카르보플라틴, 카르무스틴, 클로람부실, 시스플라틴, 사이클로포스파미드, 다카르바진, 로무스틴, 멜팔란, 옥살라플라틴, 테모졸로미드 또는 티오테파와 같은 알킬화제; 5-플루오로우라실(5-FU), 6-머캅토퓨린(6-MP), 카페시타빈, 시타라빈, 플록스우리딘, 플루다라빈, 젬시타빈, 하이드록시우레아, 메토트렉세이트 또는 페메트렉시드와 같은 항대사물질; 다우노루비신, 독소루비신, 에피루비신 또는 이다루비신과 같은 안트라사이클린; 토포테칸 또는 이리노테칸(CPT-11)과 같은 토포이소머라제 I 억제제; 에토포사이드(VP-16), 테니포사이드 또는 미톡산트론과 같은 토포이소머라제 II 억제제; 도세탁셀, 에스트라무스틴, 익사베필론, 파클리탁셀, 빈블라스틴, 빈크리스틴 또는 비노렐빈과 같은 유사분열 억제제; 또는 프레드니손, 메틸프레드니솔론, 덱사메타손과 같은 코르티코스테로이드를 포함하나 이로 제한되지 않는다.
일부 구현양태에서, 추가 치료제는 1차 치료법을 포함한다. 본원에 사용된 "1차 치료법"은 암에 걸린 대상체에 대한 주요 치료를 포함한다. 일부 구현양태에서, 암은 원발성 암이다. 다른 구현양태에서, 암은 전이성 또는 재발성 암이다. 일부 구현양태에서, 1차 치료법은 화학요법을 포함한다. 다른 구현양태에서, 1차 치료는 방사선 요법을 포함한다. 숙련된 기술자는 상이한 1차 치료법이 상이한 유형의 암에 적용될 수 있다는 것을 쉽게 이해할 것이다.
일부 구현양태에서, 추가 치료제는 효소 폴리 ADP 리보스 폴리머라제(PARP)의 억제제를 포함한다. 예시적인 PARP 억제제에는 올라파립(AZD-2281, Lynparza®, Astra Zeneca 제품), 루카파립(PF-01367338, Rubraca®, Clovis Oncology 제품), 니라파립(MK-4827, Zejula®, Tesaro 제품), 탈라조파립(BMN-673, BioMarin Pharmaceutical Inc. 제품), 벨리파립(ABT-888, Abb Vie 제품), CK-102(이전 CEP 9722, Teva Pharmaceutical Industries Ltd. 제품), E7016(Eisai 제품), 이니파립( BSI 201, Sanofi 제품) 및 파미파립(BGB-290, BeiGene 제품)이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다.
일부 구현양태에서, 추가 치료제는 면역 체크포인트 억제제를 포함한다. 일부 구현양태에서, 체크포인트 억제제는 펨브롤리주맙, 니볼루맙, 트레멜리무맙 또는 이필리무맙을 포함한다. 일부 구현양태에서, 체크포인트 억제제는 PD-L1, PD-L2, PD-1, CTLA-4, LAG3, B7-H3, KIR, CD137, PS, TFM3, CD52, CD30, CD20, CD33, CD27, OX40, GITR, ICOS, BTLA (CD272), CD160, 2B4, LAIR1, TIGHT, LIGHT, DR3, CD226, CD2, 또는 SLAM의 억제제를 포함한다. 억제제는 항체 또는 이의 단편(예를 들어, 모노클로날 항체, 인간, 인간화 또는 키메라 항체), RNAi 분자 또는 소분자일 수 있다.
일부 구현양태에서, 추가 치료제는 알렘투주맙, 트라스투주맙, 이브리투모맙 티욱세탄, 브렌툭시맙 베도틴, 아도-트라스투주맙 엠탄신 또는 블리나투모맙과 같은 항체를 포함한다.
일부 구현양태에서, 추가 치료제는 사이토카인을 포함한다. 예시적인 사이토카인에는 IL-Iβ, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-15, IL-21 또는 TNFα가 포함되나 이에 제한되지는 않는다.
일부 구현양태에서, 추가 치료제는 수용체 효능제를 포함한다. 일부 구현양태에서, 수용체 효능제는 톨-유사 수용체(TLR) 리간드를 포함한다. 일부 구현양태에서, TLR 리간드는 TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8 또는 TLR9를 포함한다. 일부 구현양태에서, TLR 리간드는 합성 리간드, 예를 들어 Pam3Cys, CFA, MALP2, Pam2Cys, FSL-1, Hib-OMPC, Poly I:C, poly A:U, AGP, MPL A, RC-529, MDF2p, CFA, 또는 플라겔린(Flagellin)을 포함한다.
일부 구현양태에서, 추가 치료제는 플루다라빈 및 사이클로포스파미드를 포함한다.
일부 구현양태에서, 추가 치료제는 티사겐류셀(KYMRIAH®), 악시카브타겐 실로류셀(YESCARTA®) 또는 브렉수카바타겐 오토류셀(TECARTUS®)을 포함한다.
일부 구현양태에서, 추가적인 치료 요법은 수술을 포함한다.
일부 구현양태에서, 본원에 기재된 면역 세포 또는 본원에 기재된 약제학 조성물 및 추가 치료제는 동시에 투여된다.
일부 구현양태에서, 본원에 기재된 면역 세포 또는 본원에 기재된 약제학 조성물 및 추가 치료제는 순차적으로 투여된다. 일부 구현양태에서, 본원에 기재된 면역 세포 또는 본원에 기재된 약제학 조성물은 추가 치료제를 투여하기 전에 대상체에게 투여된다. 다른 구현양태에서, 본원에 기재된 면역 세포 또는 본원에 기재된 약제학 조성물은 추가 치료제의 투여 후에 대상체에게 투여된다.
일부 구현양태에서, 대상체는 인간이다.
일부 구현양태에서, 메조텔린(예를 들어, 인간 메조텔린), IL-7 및 CCL19를 특이적으로 인식하는 세포 표면 분자를 발현하는 면역 세포를 생산하는 방법이 또한 본원에 기재되어 있다. 방법은 본원에 기재된 핵산 분자 또는 핵산 분자를 포함하는 벡터를 면역 세포에 도입하여 면역 세포에 의해 인간 메조텔린, IL-7 및 CCL19를 특이적으로 인식하는 세포 표면 분자의 발현을 유도하는 것을 포함한다. 일부 구현양태에서, 면역 세포는 T 세포, 자연 살해(NK) 세포, B 세포, 항원 제시 세포 또는 과립구, 임의로 T 세포 또는 NK 세포이다.
약제학 조성물
특정 구현양태에서, 상기 기재된 면역 세포는 약제학 조성물로 제형화된다. 일부 구현양태에서, 약제학 조성물은 비경구, 경구, 설하 또는 경피 투여 경로를 포함하지만 이에 제한되지 않는 다중 투여 경로에 의해 대상체에게 투여된다. 일부 구현양태에서, 비경구 투여는 정맥내, 피하, 근육내, 비강내, 동맥내, 관절내, 진피내, 골내 주입, 복강내, 거미막하, 두개내, 윤활막내, 종양내, 피내, 골수내, 심장내 또는 척추강내 투여를 포함한다. 일부 구현양태에서, 약제학 조성물은 국소 투여용으로 제형화된다. 다른 구현양태에서, 약제학 조성물은 전신 투여용으로 제형화된다.
일부 구현양태에서, 약제학 조성물은 약제학적으로 허용되는 첨가제를 포함한다. 첨가제로는 식염수, 완충식염수, 세포배양 배지, 덱스트로스, 주사용수, 글리세롤, 에탄올, 안정화제, 가용화제, 계면활성제, 완충제, 방부제, 등장화제, 충진제, 윤활제, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
일부 구현양태에서, 약제학 조성물은 아세트산, 붕산, 시트르산, 락트산, 인산 및 염산과 같은 산, 수산화나트륨, 인산나트륨, 붕산나트륨, 나트륨 시트레이트, 나트륨 아세테이트, 나트륨 락테이트 및 트리스-하이드록시메틸아미노메탄과 같은 염기를 포함하는 pH 조절제 또는 완충제, 및 시트레이트/덱스트로스, 중탄산나트륨 및 염화암모늄과 같은 완충액을 추가로 포함한다. 이러한 산, 염기 및 완충액은 조성물의 pH를 허용가능한 범위로 유지하는 데 필요한 양으로 포함된다.
일부 구현양태에서, 약제학 조성물은 조성물의 삼투질농도를 허용되는 범위로 만드는 데 필요한 양으로 하나 이상의 염을 포함한다. 이러한 염에는 나트륨, 칼륨 또는 암모늄 양이온 및 염화물, 시트레이트, 아스코르베이트, 붕산염, 인산염, 중탄산염, 황산염, 티오황산염 또는 중아황산염 음이온을 갖는 염이 포함되며, 적합한 염에는 염화나트륨, 염화칼륨, 티오황산나트륨, 중아황산나트륨 및 황산암모늄이 포함된다.
예시적인 방법에서, 본 발명의 약제학 조성물은 한번에 또는 1일 4회, 3회, 2회 또는 1회, 1일, 2일, 3일, 4일 또는 5일 간격으로, 1주 1회, 또는 7일, 8일, 또는 9일 간격으로, 주 2회, 월 1회, 월 2회, 월 3회 이상에 걸쳐 수회 분할하여 독립적으로 투여할 수 있다.
환자의 상태가 호전되는 경우에는 의사의 판단에 따라 조성물의 투여를 지속적으로, 교대로 하거나, 투여되는 조성물의 용량을 일시적으로 감소시키거나 일정 기간 동안 일시적으로 중단할 수도 있다(즉, "휴약 기간"). 일부 구현양태에서, 휴약 기간은 단지 예로서 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 10일, 12일, 15일, 20일, 28일, 35일, 50일, 70일, 100일, 120일, 150일, 180일, 200일, 250일, 280일, 300일, 320일, 350일 또는 365일을 포함하여 2일 내지 1년 사이로 다양하다. 휴약 기간 동안의 용량 감소는 10%-100%이며, 예를 들어 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 이다.
일부 구현양태에서, 이러한 양에 상응하는 주어진 변형된 T-세포의 양은 질병의 중증도, 치료가 필요한 대상체 또는 숙주의 신원(예를 들어, 체중)과 같은 요인에 따라 달라지며, 그러나 그럼에도 불구하고, 예를 들어 투여되는 특정 제제, 투여 경로 및 치료되는 대상체 또는 숙주를 포함하여 사례를 둘러싼 특정 상황에 따라 당업계에 공지된 방식으로 일상적으로 결정된다. 일부 구현양태에서, 원하는 용량은 단일 용량으로 또는 동시에(또는 짧은 기간에 걸쳐) 또는 적절한 간격으로 투여되는 분할 용량, 예를 들어 1일 2회, 3회, 4회 이상의 하위 용량으로 편리하게 제시된다.
개별 치료 방식에 관한 변수의 수가 많고 이러한 권장 값에서 상당한 차이가 나는 경우가 드물지 않기 때문에 전술한 범위는 단지 제안적일 뿐이다. 이러한 투여량은 사용되는 화합물의 활성, 치료할 질병 또는 상태, 투여 방식, 개별 대상체의 요구 사항, 치료할 질병 또는 상태의 중증도, 및 개업의의 판단에 제한되지 않고 다양한 변수에 따라 변경된다.
일부 구현양태에서, 이러한 치료 요법의 독성 및 치료 효능은 LD50(집단의 50%에 치사량인 용량) 및 ED50(인구의 50%에서 치료적으로 효과적인 용량)의 결정을 포함하지만 이에 제한되지 않는 세포 배양 또는 실험 동물에서의 표준 약제학 절차에 의해 결정된다. 독성 효과와 치료 효과 사이의 투여량 비율은 치료 지수이며 LD50과 ED50 사이의 비율로 표시된다. 높은 치료 지수를 나타내는 화합물이 바람직하다. 세포 배양 검정 및 동물 연구에서 얻은 데이터는 인간에게 사용할 수 있는 다양한 용량을 공식화하는 데 사용된다. 이러한 화합물의 투여량은 독성이 최소화된 ED50을 포함하는 순환 농도 범위 내에 있는 것이 바람직하다. 투여량은 사용된 투여 형태와 사용된 투여 경로에 따라 이 범위 내에서 다양하다.
키트/제조 물품
특정 구현양태에서, 위에서 기재된 핵산 분자, 위에서 기재된 핵산 분자를 포함하는 벡터, 메조텔린(예를 들어, 인간 메조텔린), IL-7 및 CCL19을 특이적으로 인식하는 CAR을 발현하는 면역 세포, 또는 약제학 조성물를 포함하는 키트가 본원에 개시된다. 일부 구현양태에서, 키트는 암 치료에 사용하기 위한 사용 방법 등을 기술하는 패키지 삽입물, 라벨, 패키지 등과 같은 하나 이상의 포장 재료를 함유할 수 있다. 본 발명의 약제학 조성물에서 면역 세포는 종양의 재발을 억제하는 효과를 가지므로, 본 발명의 약제학 조성물은 종양의 재발을 억제하는데 사용되는 약제학 조성물의 역할을 할 수 있다. 이러한 종양의 재발을 억제하는데 사용되는 약제학 조성물에는 종양 재발 억제에 사용하기 위한 사용 방법 등을 기재한 패키지 삽입물, 라벨, 패키지 등과 같은 하나 이상의 포장 재료를 함유할 수 있다.
"포장 재료"라는 용어는 키트의 구성요소를 수용하는 물리적 구조를 의미한다. 재료는 구성요소를 무균 상태로 유지할 수 있으며 이러한 목적으로 일반적으로 사용되는 재료(예를 들어 종이, 골판지 섬유, 유리, 플라스틱, 호일, 앰플, 바이알, 튜브 등)로 만들어질 수 있다.
본 발명의 키트는 라벨 또는 삽입물을 포함할 수 있다. 라벨이나 삽입물에는 종이나 판지와 같은 "인쇄물"이 포함되거나, 별도로 또는 구성요소, 키트 또는 포장 재료(예를 들어 상자)에 부착되거나, 키트 구성요소를 함유하는 앰플, 튜브 또는 바이알에 부착된 것이 포함된다. 라벨이나 삽입물에는 디스크(예를 들어, 플로피 디스켓, ZIP 디스크), CD- 또는 DVD-ROM/RAM, DVD, MP3와 같은 광학 디스크, 자기 테이프 또는 예를 들어, RAM 및 ROM과 같은 전기 저장 매체 또는 자기/광학 저장 매체, FLASH 매체 또는 메모리 유형 카드와 같은 이들의 하이브리드와 같은 컴퓨터 판독가능 매체가 추가로 포함될 수 있다.
라벨 또는 삽입물에는 그 안의 하나 이상의 구성요소(예를 들어, 결합제 또는 약제학 조성물)의 식별 정보, 투여량, 작용 기전을 포함하는 활성제(들)의 임상 약리학, 약동학 및 약력학이 포함될 수 있다. 라벨이나 삽입물에는 제조업체 정보, 로트 번호, 제조 위치 및 날짜를 식별하는 정보가 포함될 수 있다.
라벨 또는 삽입물에는 키트 구성요소를 사용할 수 있는 질병에 대한 정보가 포함될 수 있다. 라벨 또는 삽입물에는 방법, 치료 프로토콜 또는 치료 요법에서 하나 이상의 키트 구성 요소를 사용하기 위한 임상의 또는 대상체를 위한 지침이 포함될 수 있다. 지시사항에는 투여량, 빈도 또는 기간, 그리고 본원에 기재된 임의의 방법, 치료 프로토콜 또는 치료 요법을 실행하기 위한 지시사항이 포함될 수 있다.
라벨 또는 삽입물에는 치료적 이점과 같이 구성요소가 제공할 수 있는 임의의 이점에 대한 정보가 포함될 수 있다. 라벨 또는 삽입물에는 특정 조성물(예를 들어, 본원에 기재된 변형된 면역 세포)을 사용하는 것이 적절하지 않은 상황에 관해 대상체 또는 임상의에게 경고하는 것과 같은 잠재적인 부작용에 대한 정보가 포함될 수 있다. 예를 들어, 부작용은 일반적으로 활성제의 더 높은 용량, 빈도 또는 기간에서 발생할 가능성이 더 높으므로, 더 높은 용량, 빈도 또는 기간에 대한 권장 사항이 포함될 수 있다. 대상체가 조성물과 양립할 수 없는 하나 이상의 다른 약물을 복용했거나 복용할 예정이거나 현재 복용 중인 경우, 또는 대상체가 조성물과 양립할 수 없는 다른 치료 프로토콜 또는 치료법을 복용 중이거나 복용할 예정이거나 현재 복용 중인 경우에도 부작용이 발생할 수 있으므로, 지침에는 이러한 비양립성에 관한 정보가 포함될 수 있다.
정의
명세서 및 청구범위에 사용된 바와 같이, 단수형 "하나" 및 "그"는 문맥에서 달리 명시하지 않는 한 복수형을 포함한다. 예를 들어, "하나의 세포"라는 용어는 복수의 세포 및 이들의 혼합물을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "포함하는"은 조성물 및 방법이 언급된 요소를 포함하지만 다른 요소를 배제하지 않는다는 것을 의미하도록 의도된다. 조성물과 방법을 정의하는 데 사용된 "본질적으로 구성되는"은 의도된 용도의 조합에 필수적인 의미를 갖는 다른 요소를 제외하는 것을 의미한다. 예를 들어, 본원에 정의된 요소로 본질적으로 구성된 조성물은 분리 및 정제 방법에서 미량 오염물질과 인산염 완충 식염수, 보존제 등과 같은 약제학적으로 허용되는 담체를 배제하지 않는다. "구성된"은 본원에 개시된 조성물을 투여하기 위한 미량 원소 이상의 다른 성분 및 실질적인 방법 단계를 배제하는 것을 의미한다. 이들 전환 용어 각각에 의해 정의된 측면은 본 개시의 범위 내에 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "약"은 값이 값을 결정하기 위해 사용되는 장치 또는 방법에 대한 오차의 표준 편차를 포함한다는 것을 나타내는 데 사용된다. 범위를 포함하여 온도, 시간, 양, 농도 앞에 사용된 "약"이라는 용어는 (+) 또는 (-) 15%, 10%, 5%, 3%, 2% 또는 1%만큼 달라질 수 있는 근사치를 나타낸다.
또한 본원에 사용된 바와 같이, "및/또는"은 연관된 나열된 항목 중 하나 이상의 가능한 모든 조합뿐만 아니라 대안("또는")으로 해석될 때 조합의 결여를 지칭하고 포괄한다.
본원에 사용된 바와 같이, "임의의" 또는 "임의로"는 이후에 기재되는 사건 또는 상황이 발생할 수 있거나 발생할 수 없다는 것을 의미하며, 기재에는 사건 또는 상황이 발생하는 구현양태와 발생하지 않는 구현양태가 포함된다.
본원에 사용된 용어 "항체"는 각각 중쇄 및 경쇄 가변 도메인인 VH 및 VL을 통해 다른 분자(항원, 예를 들어 메조텔린)에 결합하는 단백질을 의미한다. "가변 영역" 또는 "가변 도메인"이라는 용어는 항원에 대한 항체의 결합에 관여하는 항체의 도메인을 의미한다. 천연 항체의 중쇄 및 경쇄(각각 VH 및 VL)의 가변 도메인은 일반적으로 유사한 구조를 가지며, 각 도메인은 4개의 보존된 프레임워크 영역(FR) 및 3개의 CDR을 포함한다(Kindt 등 Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007) 참조). 단일 VH 또는 VL 도메인은 항원-결합 특이성을 부여하기에 충분할 수 있다. 또한, 특정 항원에 결합하는 항체는 각각 상보적인 VL 또는 VH 도메인의 라이브러리를 스크리닝하기 위해 항원을 결합하는 항체로부터 VH 또는 VL 도메인을 사용하여 분리될 수 있다(Portolano 등, J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson 등, Nature 352:624-628 (1991) 참조).
본 개시내용의 항체는 모노클로날 항체를 포함한다. 항체와 관련하여 사용되는 용어 "모노클로날"은 임의의 진핵생물, 원핵생물 또는 파지 클론을 포함하는 단일 클론에 기초하거나, 그로부터 수득되거나, 유래된 항체를 지칭한다. 따라서 "모노클로날" 항체는 본원에서 구조적으로 정의되며, 이를 생산하는 방법은 아니다.
모노클로날 항체는 당업계에 공지된 방법에 의해 제조된다(Kohler 등, Nature, 256:495(1975); and Harlow and Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1999). 간단히 말해서, 모노클로날 항체는 마우스에 항원을 주입하여 얻을 수 있다. 동물을 면역화하는데 사용되는 폴리펩티드 또는 펩티드는 번역된 DNA로부터 유래되거나 화학적으로 합성되어 담체 단백질에 접합될 수 있다. 면역화 펩티드에 화학적으로 커플링되는 일반적으로 사용되는 담체로는, 예를 들어 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH), 티로글로불린, 소 혈청 알부민(BSA) 및 파상풍 독소가 포함된다. 항체 생산은 혈청 샘플 분석, 비장 제거를 통해 B 림프구 획득, B 림프구를 골수종 세포와 융합하여 하이브리도마 생성, 하이브리도마 클로닝, 항원에 대한 항체를 생성하는 양성 클론 선택, 및 하이브리도마 배양물에서 항체 분리를 통해 검증된다. 모노클로날 항체는, 예를 들어 단백질-A 세파로스를 사용한 친화성 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피 및 이온-교환 크로마토그래피를 포함하는 다양한 확립된 기술에 의해 하이브리도마 배양물로부터 분리 및 정제될 수 있다(Coligan 등, Current Protocols in Immunology sections 2.7.1-2.7.12 and sections 2.9.1-2.9.3; and Barnes 등, "Methods in Molecular Biology," 10:79-104, Humana Press (1992)).
본 개시내용의 항체는 임의의 항체 부류, IgM, IgG, IgE, IgA, IgD 또는 아부류에 속할 수 있다. IgG의 예시적인 아부류는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4이다.
본 개시내용의 항체는 인간화 항체일 수 있다. 용어 "인간화"는 수용체 인간 면역글로불린 분자 내 항원에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR)의 비-인간 아미노산 잔기, 및 CDR 측면에 있는 프레임워크 영역(FR) 내 하나 이상의 인간 아미노산 잔기를 갖는 항체 서열을 의미한다. 임의의 마우스, 래트, 기니피그, 염소, 비-인간 영장류(예를 들어, 유인원, 침팬지, 짧은꼬리원숭이, 오랑우탄 등) 또는 기타 동물 항체가 인간화 항체를 생산하기 위한 CDR 공여자로서 사용될 수 있다. 인간 프레임워크 영역 잔기는 상응하는 비-인간 잔기(예를 들어, 공여자 가변 영역으로부터의)로 대체될 수 있다. 따라서 인간 프레임워크 영역의 잔기는 비-인간 CDR 공여자 항체의 상응하는 잔기로 대체될 수 있다. 인간화 항체는 인간 항체나 공여자 CDR 또는 프레임워크 서열에서는 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 인간화 모노클로날 항체에서 유래된 항체 성분을 사용하면 비-인간 영역의 면역원성과 관련된 문제가 줄어든다. 인간화 항체를 생성하는 방법은 당업계에 공지되어 있다(U.S. Patent Nos. 5,225,539; 5,530,101, 5,565,332 and 5,585,089; Riechmann 등, (1988) Nature 332:323; EP 239,400; W091/09967; EP 592,106; EP 519,596; Padlan Molecular Immunol. (1991) 28:489; Studnicka 등, Protein Engineering (1994) 7:805; Singer 등, J. Immunol. (1993) 150:2844; 및 Roguska 등, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA (1994) 91:969).
본 개시내용의 항체는 키메라 항체일 수 있다. 용어 "키메라 항체"는 뮤린 모노클로날 항체로부터 유래된 가변 영역 및 인간 면역글로불린 불변 영역, 예를 들어 인간화 항체를 갖는 것과 같이, 상이한 부분이 상이한 동물 종으로부터 유래된 항체를 지칭한다. 일부 구현양태에서, 적절한 생물학적 활성을 갖는 인간 항체 분자의 유전자와 함께 적절한 항원 특이성을 갖는 마우스 항체 분자의 유전자를 스플라이싱하여 "키메라 항체"의 생산을 위해 개발된 기술(Morrison 등, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci.　81:851-855; Neuberger 등, 1984, Nature　312:604-608; Takeda 등, 1985, Nature　314:452-454)을 사용한다.
본 개시내용의 항체는 이의 결합 단편을 포함한다. 예시적인 항체 단편에는 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fd, 단일-사슬 Fv(scFv), 이황화-결합된 Fv(sdFv), 경쇄 가변 영역 VL, 중쇄 가변 영역 VH, 삼중특이적(Fab3), 이중특이적(Fab2), 디아바디((VL-VH)2 또는 (VH-VL)2), 트리아바디(3가), 테트라바디(4가), 미니바디((scFV-CH)2), 이중특이적 단일-사슬 Fv (Bis-scFv), IgGdeltaCH2, scFv-Fc, (scFv)2-Fc 및 IgG4PE를 포함한다. 이러한 단편은 전장 항체로서의 결합 친화성, 전장 항체로서의 결합 특이성, 또는 전장 항체로서의 하나 이상의 활성 또는 기능, 예를 들어 메조텔린 결합 항체의 기능 또는 활성을 가질 수 있다.
항체 단편이 조합될 수 있다. 예를 들어, VL 또는 VH 하위서열은 링커 서열에 의해 연결되어 VL-VH 키메라를 형성할 수 있다. 단일-사슬 Fv(scFv) 서열의 조합은 링커 서열에 의해 연결되어 scFv-scFv 키메라를 형성할 수 있다. 항체 단편에는 단일-사슬 항체 또는 가변 영역(들)이 단독으로 또는 다른 서열 전체 또는 일부와 조합되어 포함된다.
항체 단편은 온전한 항체의 단백질분해 소화 및 재조합 숙주 세포에 의한 생산을 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 기술에 의해 제조될 수 있다. 일부 구현양태에서, 항체는 합성 링커, 예를 들어 펩티드 링커에 의해 연결된 2개 이상의 항체 영역 또는 사슬을 갖는 것과 같이 자연적으로 발생하지 않는 배열을 포함하는 단편과 같은 재조합적으로 생성된 단편이고/이거나 자연적으로 발생하는 온전한 항체의 효소 소화에 의해 생산되지 않는 것일 수 있다. 일부 측면에서, 항체 단편은 scFv이다.
항체 단편은 또한 항체의 단백질 가수분해, 예를 들어 전체 항체의 펩신 또는 파파인 소화에 의해 제조될 수 있다. 펩신을 사용한 효소 절단에 의해 생성된 항체 단편은 F(ab')2로 표시된 5S 단편을 제공한다. 이 단편은 티올 환원제를 사용하여 추가로 절단되어 3.5S Fab' 1가 단편을 생성할 수 있다. 대안적으로, 펩신을 사용한 효소적 절단은 2개의 1가 Fab' 단편 및 Fc 단편을 직접 생성한다(U.S. Patent Nos. 4,036,945 및 4,331,647; 및 Edelman 등, Methods Enymol. 1:422 (1967) 참조). 1가 경-중쇄 단편을 형성하기 위한 중쇄의 분리, 단편의 추가 절단, 또는 기타 효소 또는 화학물질과 같은 항체 절단의 다른 방법도 사용될 수 있다.
일부 구현양태에서, 단일 사슬 항체의 생산을 위해 기재된 기술(U.S. Pat. No. 4,694,778; Bird, 1988, Science　242:423-42; Huston 등, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA　85:5879-5883; 및 Ward 등, 1989, Nature　334:544-54)은 단일 사슬 항체를 생성하도록 적응된다. 단일 사슬 항체는 Fv 영역의 중쇄와 경쇄 단편을 아미노산 가교를 통해 연결하여 형성되어 단일 사슬 폴리펩티드를 생성한다. 대장균에서 기능성 Fv 단편을 조립하는 기술도 임의로 사용된다(Skerra 등, 1988, Science　242:1038-1041).
본원에서 사용되는 "동일한", "서열 동일성" 또는 퍼센트 "동일성"은 2개 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열과 관련하여 사용되는 경우, 동일하거나 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기의 특정 백분율, 예를 들어 적어도 60% 동일성, 바람직하게는 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 지정된 지역에서 더 높은 동일성을 나타내는 2개 이상의 서열을 의미한다. 정렬 및 서열 동일성은 당업계에 공지된 소프트웨어 프로그램(Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel 등, eds. 1987) Supplement 30, section 7.7.18, Table 7.7.1)에 기재된 프로그램을 사용하여 결정될 수 있다. 바람직하게는, 정렬에는 기본 매개변수가 사용된다. 바람직한 정렬 프로그램은 기본 매개변수를 사용하는 BLAST이다. 특히, 바람직한 프로그램은 다음 기본 매개변수를 사용하는 BLASTN 및 BLASTP이다: 유전자 코드 = 표준; 필터 = 없음; 가닥 = 둘 다; 컷오프 = 60; 기대 = 10; 매트릭스 = BLOSUM62; 설명 = 50개 서열; 정렬 기준 = 높은 점수; 데이터베이스 = 중복되지 않음, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS 번역 + SwissProtein + SPupdate + PIR. 이러한 프로그램에 대한 자세한 내용은 다음 인터넷 주소에서 확인할 수 있다: ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST. "동일한", "서열 동일성" 또는 퍼센트 "동일성"이라는 용어는 또한 테스트 서열의 보체을 지칭하거나 이에 적용될 수 있다. 이 용어에는 결실 및/또는 추가가 있는 서열뿐만 아니라 치환이 있는 서열도 포함된다. 본원에 기재된 바와 같이, 바람직한 알고리즘은 갭 등을 고려할 수 있다. 바람직하게는, 동일성은 길이가 약 25개 이상의 아미노산 또는 뉴클레오티드인 영역에 걸쳐 존재하며, 보다 바람직하게는 길이가 적어도 50-100개 아미노산 또는 뉴클레오티드인 영역에 걸쳐 존재한다. "관련되지 않은" 또는 "비-상동적인" 서열은 본원에 기재된 서열 중 하나와 40% 미만의 동일성, 또는 대안적으로 25% 미만의 동일성을 공유한다.
용어 "단백질", "펩티드" 및 "폴리펩티드"는 상호교환적으로 사용되며 2개 이상의 서브유닛 아미노산, 아미노산 유사체 또는 펩티드모방체의 화합물을 지칭하기 위해 가장 넓은 의미로 사용된다. 서브유닛은 펩티드 결합으로 연결될 수 있다. 또 다른 측면에서, 서브유닛은 다른 결합, 예를 들어 에스테르, 에테르 등에 의해 연결될 수 있다. 단백질 또는 펩티드는 적어도 2개의 아미노산을 함유해야 하며 단백질 또는 펩티드 서열을 구성할 수 있는 아미노산의 최대 수에는 제한이 없다. 폴리펩티드에는 전장의 천연 폴리펩티드, 및 하위서열, 변이체 서열, 융합/키메라 서열 및 우성-음성 서열과 같은 "변형된" 형태가 포함된다. 본원에 사용된 용어 "아미노산"은 글리신과 D 및 L 광학 이성질체, 아미노산 유사체 및 펩티드모방체를 포함하는 천연 및/또는 비천연 또는 합성 아미노산을 의미한다.
펩티드에는 L- 및 D-이성질체, 및 이들의 조합이 포함된다. 펩티드는 일반적으로 단백질의 번역 후 처리와 관련된 변형, 예를 들어 고리화(예를 들어 이황화 또는 아미드 결합), 인산화, 글리코실화, 카복실화, 유비퀴틴화, 미리스틸화 또는 지질화를 포함할 수 있다. 변형된 펩티드는 다른 잔기로 치환되거나, 서열에 첨가되거나, 서열에서 삭제된 하나 이상의 아미노산 잔기를 가질 수 있다. 구체적인 예에는 하나 이상의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실(예를 들어, 1-3, 3-5, 5-10, 10-20 또는 그 이상)이 포함된다.
본원에 사용된 용어 "변형" 및 "변형된"은 변형이 없는 항체, 단백질 또는 폴리펩티드와 등가인 기준 항체, 단백질, 또는 폴리펩티드와 비교하여 항체, 단백질 또는 폴리펩티드의 하나 이상의 아미노산 잔기의 돌연변이, 치환, 첨가 또는 결실을 의미한다. 일부 구현양태에서, 변형은 보존적 치환을 포함한다.
"보존적 치환"은 하나의 아미노산을 생물학적, 화학적 또는 구조적으로 유사한 잔기로 대체하는 것이다. 생물학적으로 유사하다는 것은 치환이 비치환 서열의 활성 또는 기능과 호환성임을 의미한다. 구조적으로 유사하다는 것은 아미노산이 알라닌, 글리신, 세린과 같이 길이가 비슷하거나 크기가 비슷한 측쇄를 가지고 있음을 의미한다. 화학적 유사성은 잔기가 동일한 전하를 갖거나 모두 친수성이거나 소수성임을 의미한다. 특정한 예에는 이소류신, 발린, 류신 또는 메티오닌과 같은 하나의 소수성 잔기의 다른 것으로의 치환, 또는 리신을 아르기닌으로, 아스파르트산을 글루탐산으로, 또는 아스파라긴을 글루타민, 트레오닌을 세린으로 치환하는 것을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "핵산"은 천연, 합성 또는 인공 뉴클레오티드 유사체 또는 염기를 포함하는 DNA 또는 RNA를 의미한다. 일부 구현양태에서, 뉴클레오티드 유사체 또는 인공 뉴클레오티드 염기는 리보스 모이어티의 2' 하이드록실 기에서 변형이 있는 핵산을 포함한다. 일부 구현양태에서, 변형에는 H, OR, R, 할로, SH, SR, NH2, NHR, NR2 또는 CN이 포함되며, 여기서 R은 알킬 모이어티이다. 예시적인 알킬 모이어티에는 할로겐, 황, 티올, 티오에테르, 티오에스테르, 아민(1차, 2차 또는 3차), 아미드, 에테르, 에스테르, 알코올 및 산소가 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. 일부 구현양태에서, 알킬 모이어티는 변형을 추가로 포함한다. 일부 구현양태에서, 변형은 아조 기, 케토 기, 알데히드 기, 카복실 기, 니트로 기, 니트로소 기, 니트릴 기, 헤테로사이클(예를 들어, 이미다졸, 하이드라지노 또는 하이드록실아미노) 기, 이소시아네이트 또는 시아네이트 기, 또는 황 함유 기(예를 들어 설폭사이드, 설폰, 설파이드 또는 디설파이드)를 포함한다. 일부 구현양태에서, 알킬 모이어티는 헤테로 치환을 추가로 포함한다. 일부 구현양태에서, 헤테로사이클릭기의 탄소는 질소, 산소 또는 황으로 치환된다. 일부 구현양태에서, 헤테로사이클릭 치환에는 모르폴리노, 이미다졸 및 피롤리디노가 포함되지만 이에 제한되지는 않는다.
일부 구현양태에서, 뉴클레오티드 유사체는 5-프로피닐우리딘, 5-프로피닐시티딘, 6-메틸아데닌, 6-메틸구아닌, N,N,-디메틸아데닌, 2-프로필아데닌, 2프로필구아닌, 2-아미노아데닌, 1-메틸이노신, 3-메틸우리딘, 5-메틸시티딘, 5-메틸우리딘 및 5 위치에 변형이 있는 기타 뉴클레오티드, 5-(2-아미노)프로필우리딘, 5-할로시티딘, 5-할로우리딘, 4-아세틸시티딘, 1-메틸아데노신, 2-메틸아데노신, 3-메틸시티딘, 6-메틸우리딘, 2-메틸구아노신, 7-메틸구아노신, 2,2-디메틸구아노신, 5-메틸아미노에틸우리딘, 5-메틸옥시우리딘, 데아자뉴클레오티드(예를 들어, 7-데아자-아데노신, 6-아조우리딘, 6-아조시티딘 또는 6-아조시티미딘), 5-메틸-2-티오우리딘, 기타 티오 염기(예를 들어, 2-티오우리딘, 4-티오우리딘 및 2-티오시티딘), 디하이드로우리딘, 슈도우리딘, 큐오신, 아르카에오신, 나프틸 및 치환된 나프틸 기, 임의의 O- 및 N-알킬화 퓨린 및 피리미딘(예를 들어, N6-메틸아데노신, 5-메틸카보닐메틸우리딘, 우리딘 5-옥시아세트산, 피리딘-4-온 또는 피리딘-2-온), 페닐 및 아미노페놀 또는 2,4,6-트리메톡시 벤젠과 같은 변형된 페닐기, G-클램프 뉴클레오티드로 작용하는 변형된 시토신, 8-치환된 아데닌 및 구아닌, 5-치환된 우라실 및 티민, 아자피리미딘, 카복시하이드록시알킬 뉴클레오티드, 카복시알킬아미노알킬 뉴클레오티드, 및 알킬카보닐 알킬화된 뉴클레오티드를 포함하나 이에 제한되지 않는 변형된 염기를 포함한다. 변형된 뉴클레오티드에는 또한 당 모이어티와 관련하여 변형된 뉴클레오티드뿐만 아니라 리보실이 아닌 당 또는 이의 유사체를 갖는 뉴클레오티드도 포함된다. 예를 들어, 일부 구현양태에서 당 모이어티는 만노스, 아라비노스, 글루코피라노스, 갈락토피라노스, 4'-티오리보스 및 기타 당, 헤테로사이클 또는 카보사이클이거나 이를 기반으로 한다. 뉴클레오티드라는 용어는 또한 당업계에 보편적인 염기로 알려진 것을 포함한다. 예를 들어, 유니버설 염기에는 3-니트로피롤, 5-니트로인돌 또는 네뷸라린이 포함되지만 이에 제한되지는 않다.
본 발명의 핵산 분자는 각 핵산의 뉴클레오티드 서열에 관한 정보를 기초로 하여 화학적 합성법, PCR 증폭법 등 공지된 기술에 의해 제조될 수 있다. 아미노산을 코딩하기 위해 선택된 코돈은 관심 숙주 세포에서 핵산 발현을 최적화하기 위해 조작될 수 있다.
T 세포 집단을 기술할 때 본원에서 사용된 용어 "실질적으로"는 약 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5% 이하의 오염 세포를 포함하는 집단을 의미한다. 일부 구현양태에서, 오염 세포는 T 세포 집단에서 약 20% 미만이다. 일부 구현양태에서, 오염 세포는 T 세포 집단에서 약 15% 미만이다. 일부 구현양태에서, 오염 세포는 T 세포 집단에서 약 10% 미만이다.
본원에 사용된 용어 "치료하는", "치료" 등은 원하는 약리학적 및/또는 생리학적 효과를 얻는 것을 의미한다. 효과는 질병 증상의 개선, 질병의 부분적 또는 완전한 치료 및/또는 질병으로 인한 부작용 측면에서 치료적일 수 있다. 한 측면에서, "치료"라는 용어는 예방을 제외한다.
본원에 사용된 "치료"는 병리학과 관련된 증상의 전신적 개선 및/또는 증상 발병의 지연을 추가로 포함한다. "치료"에 대한 임상적 및 준임상적 증거는 병리학, 개체 및 치료에 따라 달라질 수 있다. 한 측면에서, 치료는 예방을 제외한다.
"개선하다"라는 용어는 대상체의 상태에서 감지가능한 개선을 의미한다. 감지가능한 개선에는 하나 이상의 유해 증상과 같은 질병으로 인해 발생하거나 이와 관련된 증상, 질병으로 인해 발생하거나 이과 관련된 장애, 질환, 병리, 질병 또는 합병증의 발생, 빈도, 심각도, 진행 또는 기간의 주관적 또는 객관적인 축소, 감소, 억제, 진정, 제한 또는 제어, 또는 질병의 근본 원인이나 결과의 개선, 또는 질병의 역전이 포함된다.
따라서 치료는 질병, 관련 증상이나 결과, 또는 근본적인 원인을 축소, 감소, 억제, 진정, 제한, 제어 또는 방지; 질병, 상태, 증상 또는 결과 또는 근본적인 원인의 진행 또는 악화를 축소, 감소, 억제, 진정, 제한, 제어 또는 방지; 또는 질병 상태의 하나 이상의 추가 증상 또는 증상이 추가로 악화 또는 발생하는 결과를 가져올 수 있다. 따라서 성공적인 치료 결과는 대상체의 하나 이상 증상 또는 상태, 질병 또는 증상의 근본적인 원인 또는 결과, 예컨대 질병 또는 상태로 인해 발생하거나 이와 관련된 하나 이상의 불리한 증상, 장애, 질환, 병리, 질병 또는 합병증의 발생, 빈도, 중증도, 진행 또는 지속 기간을 축소, 감소, 억제, 진정, 제한, 제어 또는 방지하는 "치료 효과" 또는 "혜택"으로 이어진다. 따라서 상태, 질병 또는 증상의 하나 이상의 근본 원인에 영향을 미치는 치료 방법은 유익한 것으로 간주된다. 장애나 상태를 안정화시키는 것도 성공적인 치료 결과이다.
따라서 치료적 이점 또는 개선은 상태 또는 질병과 관련된 임의의 하나, 대부분 또는 모든 증상, 합병증, 결과 또는 근본 원인의 완전한 제거일 필요는 없다. 따라서, 만족스러운 종료점은 대상체의 상태가 점진적으로 개선되거나 발생, 빈도, 중증도, 진행 또는 지속 기간이 부분적으로 축소, 감소, 억제, 진정, 제한, 제어 또는 방지되거나 단기간 또는 장기간(시간, 일, 주, 달 등)에 걸쳐 질병이나 상태로 인해 발생하거나 이와 관련된 하나 이상의 불리한 증상, 장애, 질환, 병리, 질병 또는 합병증과 같은 장애나 질병의 생리학적, 생화학적 또는 세포적 징후 또는 특징 중 하나 이상의 하나 이상의 관련된 유해 증상 또는 합병증 또는 결과 또는 근본 원인, 악화 또는 진행의 억제 또는 역전(예를 들어, 상태, 장애 또는 질병의 하나 이상의 증상 또는 합병증의 안정화)될 때 성취된다.
본원에 개시된 임의의 성분, 범위, 투여 형태 등의 선택을 설명하기 위해 사용되는 용어 "허용되는", "유효한" 또는 "충분한"은 상기 성분, 범위, 투여 형태 등이 개시된 목적에 대해 적합하다는 것을 의미한다.
용어 "대상체", "숙주", "개체" 및 "환자"는 동물, 전형적으로 포유동물을 지칭하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 임의의 적합한 포유동물은 본원에 기재된 방법, 세포 또는 조성물에 의해 치료될 수 있다. 포유동물의 비-제한적 예는 인간, 비-인간 영장류(예를 들어, 유인원, 긴팔원숭이, 침팬지, 오랑우탄, 원숭이, 짧은꼬리원숭이 등), 애완동물(예를 들어, 개 및 고양이), 농장 동물(예를 들어, 말, 소, 염소, 양, 돼지) 및 실험 동물(예를 들어, 마우스, 쥐, 토끼, 기니피그)을 포함한다. 일부 구현양태에서 포유동물은 인간이다. 포유동물은 임의의 연령 또는 임의의 발달 단계(예를 들어 성인, 10대, 어린이, 유아 또는 자궁 내 포유동물)일 수 있다. 포유류는 수컷일 수도 있고 암컷일 수도 있다. 포유동물은 임신한 암컷일 수 있다. 일부 구현양태에서 대상체는 인간이다.
실시예
이들 실시예는 단지 설명의 목적으로만 제공되며, 본원에 제공된 청구범위의 범위를 제한하지 않다.
실시예 1
CAR-T 세포의 제조
MSGVγ-레트로바이러스 벡터의 형질도입을 위해, pAmpho 벡터와 함께 리포펙타민 3000(Thermo Fisher Scientific, MA, USA)을 사용하여 플라스미드를 GP2-293 패키징 세포주에 형질감염시켜 바이러스 상층액을 생성했다. 형질감염 48시간 후 상층액을 수집하고 레트로넥틴(Retronectin)(Takarabio, Shiga, Japan)-코팅된 플레이트에서 원심분리하여 바이러스 결합 플레이트를 제조했다. 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)는 고형화된 항-인간 CD3 Ab(OKT3, 5 μg/mL)에 의해 활성화되었고, 재조합 인간 IL-2(400 IU/mL)를 함유한 배지에서 3일 동안 배양되었다. PBMC를 바이러스 결합 플레이트에 첨가하고 1차 감염을 위해 24시간 동안 배양했다. 이어서, 배양된 PBMC를 2차 감염을 위해 다른 바이러스 결합 플레이트로 옮겼고, 4시간 인큐베이션후, 감염된 세포를 400 IU/mL 재조합 인간 IL-2를 함유하는 새로운 배지로 3일 동안 확장시켰다. SFGγ-레트로바이러스 벡터의 형질도입을 위해, 플라스미드를 Gag/pol 유전자(Cell Biolabs Inc., CA, US) 및 VSV-G 벡터(Takarabio, Shiga, Japan)와 함께 FuGENE® HD 형질감염 시약(Promega Corp., WI, USA)를 사용하여 피닉스암포(PhoenixAmpho) 패키징 세포주에 형질감염시켰다. EasySep™ 인간 T 세포 분리 키트(Stem Cell Technologies, BC, Canada)를 사용하여 PBMC에서 T 세포를 분리한 후 T 세포 트랜스액트(TransAct)(Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany) 및 10 ng/mL 재조합 인간 IL-2(Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany)와 함께 2일 동안 배양했다. T 세포를 10 ng/mL 재조합 인간 IL-2 함유 배지에서 배양을 유지하고, 분리로부터 3일 후, T 세포를 20 ug/mL 레트로넥틴으로 코팅된 플레이트에 5시간 동안 바이러스 상층액으로 형질도입했다. 형질도입된 T 세포를 G-Rex(WilsonWolf, MN, USA)를 사용하여 4일 동안 확장시켰다. 형질도입 효율은 유 세포측정법에 의해 결정되었다. X-VIVO™ 15 배지(Lonza, Basel, Switzerland) 또는 CTS™ OpTmizer™ T 세포 확장 SFM(Thermo Fisher Scientific, MA, USA)을 배양 배지로 사용했다.
CAR-T 세포의 시험관내 종양 세포독성 활성 평가
CAR-T 세포의 시험관내 표적 종양 세포 사멸 활성을 인간 MSLN 발현 세포에 대해 평가하였다. 비형질도입(UTD) T 세포를 대조 물품으로서 병행하여 평가했다. 본 연구에 사용된 표적 세포는 인간 MSLN을 내인성으로 발현하는 Capan-2 세포와 MSTO-211H-Luc 세포였다. 표적 세포를 시딩한 후 희석된 CAR-T 세포 또는 UTD T 세포를 첨가하여 6점 계열의 이펙터(CAR 양성):표적 세포(E:T) 비율: 3:1, 1:1, 0.3:1, 0.1:1, 0.03:1, 및 0.01:1을 획득했다. 48시간의 공동-배양 후, T 세포를 세척한 후 CellTiter-Glo® 발광 세포 생존력 검정(Promega Corp., WI, USA)를 사용하여 표적 세포주의 생존력을 측정했다. 상대 사멸 활성은 T 세포 공동-배양 조건에서의 표적 세포의 세포 생존력과 비-T 세포 공동-배양 조건에서의 세포 생존력을 비교하여 계산되었다.
Capan-2 및 MSTO-211H-Luc 세포에 대한 CAR-T 세포 및 UTD T 세포의 시험관 내 표적 세포 사멸 활성을 도 2에 나타내었다. 테스트된 모든 CAR-T 세포는 Capan-2 및 MSTO-211H-Luc 세포에 대한 표적 세포 사멸 활성이 용량-의존적으로 증가하는 것으로 나타났다. 대조적으로, UTD T 세포는 가장 높은 E:T 비율에서도 Capan-2 및 MSTO-211H-Luc 세포를 사멸시키는 제한된 능력을 보여주었다. 2nd 8-28z_7x19 CAR-T(CAR#305), 2nd 8-BBz_7x19 CAR-T(CAR#309) 및 2nd 28-28z_7x19 CAR-T(CAR#311) 세포는 3rd 8-28BBz_7x19 CAR-T 세포(CAR#301)에 비해 더 높은 표적 세포 사멸 활성과 유사한 것으로 나타났다.
실험에 사용된 항-MSLN CAR - IL-7 - CCL19 작제물에 대한 설명은 아래에 기재되어 있다.
CAR#301(F2A, pMSGV를 갖는 3 rd 8-28BBz_7x19)
항-MSLN scFv, 인간 CD8의 힌지 및 막횡단 영역, 인간 CD8, CD28, 4-1BB 및 CD3z의 세포내 신호 도메인을 코딩하는 항-MSLN CAR DNA 단편
CAR#305(F2A, pMSGV를 갖는 2 nd 8-28z_7x19)
항-MSLN scFv, 인간 CD8의 힌지 및 막횡단 영역, 인간 CD28 및 CD3z의 세포내 신호 도메인을 코딩하는 항-MSLN CAR DNA 단편
CAR#309(F2A, pMSGV를 갖는 2 nd 8-BBz_7x19)
항-MSLN scFv, 인간 CD8의 힌지 및 막횡단 영역, 인간 4-1BB 및 CD3z의 세포내 신호 도메인을 코딩하는 항-MSLN CAR DNA 단편
CAR#311(F2A, pMSGV를 갖는 2 nd 28-28z_7x19)
항-MSLN scFv, 인간 CD28의 힌지 및 막횡단 영역, 인간 CD28 및 CD3z의 세포내 신호 도메인을 코딩하는 항-MSLN CAR DNA 단편
CAR#334(F2A, pSFG를 갖는 3 rd 8-28BBz_7x19)
항-MSLN scFv, 인간 CD8의 힌지 및 막횡단 영역, 인간 CD8, CD28, 4-1BB 및 CD3z의 세포내 신호 도메인을 코딩하는 항-MSLN CAR DNA 단편
CAR#314(F2A, pSFG를 갖는 2 nd 8-28z_7x19)
항-MSLN scFv, 인간 CD8의 힌지 및 막횡단 영역, 인간 CD28 및 CD3z의 세포내 신호 도메인을 코딩하는 항-MSLN CAR DNA 단편
CAR#318(F2A, pSFG를 갖는 2 nd 8-BBz_7x19)
항-MSLN scFv, 인간 CD8의 힌지 및 막횡단 영역, 인간 4-1BB 및 CD3z의 세포내 신호 도메인을 코딩하는 항-MSLN CAR DNA 단편
CAR#323(F2A, pSFG를 갖는 2 nd 28-28z_7x19)
항-MSLN scFv, 인간 CD28의 힌지 및 막횡단 영역, 인간 CD28 및 CD3z의 세포내 신호 도메인을 코딩하는 항-MSLN CAR DNA 단편
CAR#345(P2A, pSFG를 갖는 2 nd 28-28z_7x19)
항-MSLN scFv, 인간 CD28의 힌지 및 막횡단 영역, 인간 CD28 및 CD3z의 세포내 신호 도메인을 코딩하는 항-MSLN CAR DNA 단편
CAR#347(P2A, pSFG를 갖는 2 nd 8-28z_7x19)
항-MSLN scFv, 인간 CD8의 힌지 및 막횡단 영역, 인간 CD28 및 CD3z의 세포내 신호 도메인을 코딩하는 항-MSLN CAR DNA 단편
CAR#348(P2A, pSFG를 갖는 3 rd 8-28BBz_7x19)
항-MSLN scFv, 인간 CD8의 힌지 및 막횡단 영역, 인간 CD8, CD28, 4-1BB 및 CD3z의 세포내 신호 도메인을 코딩하는 항-MSLN CAR DNA 단편
CAR#349(P2A, pSFG를 갖는 2 nd 8-BBz_7x19)
항-MSLN scFv, 인간 CD8의 힌지 및 막횡단 영역, 인간 4-1BB 및 CD3z의 세포내 신호 도메인을 코딩하는 항-MSLN CAR DNA 단편
CAR#357(F2A, pSFG를 갖는 2 nd 8-BBz_7x19)
항-MSLN scFv, 인간 CD8의 힌지 및 막횡단 영역, 인간 4-1BB 및 CD3z의 세포내 신호 도메인을 코딩하는 항-MSLN CAR DNA 단편
CAR#358(T2A, pSFG를 갖는 2 nd 8-BBz_7x19)
항-MSLN scFv, 인간 CD8의 힌지 및 막횡단 영역, 인간 4-1BB 및 CD3z의 세포내 신호 도메인을 코딩하는 항-MSLN CAR DNA 단편
CAR#364(동일하지 않은 뉴클레오티드 P2A 서열, pSFG을 갖는 2 nd 28-28z_7x19)
항-MSLN scFv, 인간 CD28의 힌지 및 막횡단 영역, 인간 CD28 및 CD3z의 세포내 신호 도메인을 코딩하는 항-MSLN CAR DNA 단편
CAR#365(동일하지 않은 뉴클레오티드 P2A 서열, pSFG을 갖는 2 nd 8-BBz_7x19)
항-MSLN scFv, 인간 CD8의 힌지 및 막횡단 영역, 인간 4-1BB 및 CD3z의 세포내 신호 도메인을 코딩하는 항-MSLN CAR DNA 단편
상기 기재된 실험에 사용된 작제물에서는 각 P2A, F2A, T2A 서열의 N-말단에 GSG(펩티드 링커)를 첨가하였다.
CAR-T 세포의 생체내 항-종양 활성 평가
암컷 NSG 마우스에 MSLN-양성 Capan-2 종양 세포 200만개(M)를 피하 접종하였다. 접종 후 7일에 CAR-T 세포를 여러 용량(3rd 8-28BBz_7x19 CAR-T(CAR#334)의 경우 0.8M, 2M 및 5M, 2nd 8-28z_7x19(CAR#314) 및 2nd 8-BBz_7x19 CAR-T(CAR#318)의 경우 3.2M, CAR 양성 세포 수로서 2nd 28-28z_7x19 CAR-T 세포(CAR#323)의 경우 5M)으로 정맥 내로 단일 투여했다. 대조군으로는 비히클 대조군 인산염 완충 식염수(PBS) 또는 대조군 UTD T 세포를 투여하였다. 각 마우스의 종양 부피(TV)를 매주 2회 측정했다.
각 치료 군의 마우스(군당 5마리 마우스)의 종양 부피(TV)를 도 3에 나타내었다. 5M 3rd 8-28BBz_7x19 CAR-T(CAR#334) 군과 3.2M 2nd 8-28z_7x19 CAR-T 군(CAR#314)에서, TV는 투여 후 첫 3주 동안 천천히 증가하는 경향을 보였고, TV의 약간의 감소 경향이 관찰되었다. 반면, 5M 2nd 28-28z_7x19 CAR-T 군(CAR#323)과 3.2M 2nd 8-BBz_7x19 CAR-T(CAR#318) 군에서는 CAR-T 치료 후 2주 이내에 종양 수축이 관찰되었고 각 군의 5마리 마우스 중 3마리는 종양 조직의 소멸을 보여 완전 반응(CR)을 시사했다. 이러한 결과는 IL-7 및 CCL19로 강화된 2nd 세대 CAR-T가 3rd 8-28BBz_7x19 CAR-T 작제물에 비해 더 높은 항-종양 효능을 가짐을 나타낸다.
이종이식 종양 조직의 조직병리학적 평가를 이용한 CAR-T 세포의 항-종양 활성 평가
암컷 NSG 마우스에 메조텔린-양성 Capan-2 종양 세포 200만개(M)를 피하 접종하였다. 접종 후 7일에 CAR-T 세포의 5M CAR 양성 세포를 정맥내로 단일 투여하였다. 테스트된 작제물은 2nd 8-BBz_7x19 CAR-T(CAR#349) 및 2nd 28-28z_7x19 CAR-T 세포(CAR#345)였다. 대조군으로는 비히클 대조군 인산염 완충 식염수(PBS) 또는 대조군 UTD T 세포의 동등한 총 T 세포 수를 투여하였다. 각 마우스의 종양 부피(TV)를 매주 2회 측정했다. 각 군의 종료점(2nd 28-28z_7x19 CAR-T(CAR#345) 군의 경우 18일, UTD 또는 2nd 8-BBz_7x19 CAR-T(CAR#349) 군의 경우 32일)에서, 종양 이종이식편을 수집하고 조직 슬라이드의 현미경 검사가 수행되었다. 도 4a 참조.
각 군의 평균 종양 부피(TV)를 도 4b에 플롯팅하였다. 2nd 28-28z_7x19 CAR-T(CAR#345) 치료 군은 CAR-T 투여 후 8일부터 평균 TV의 급성 증가를 나타냈고 모든 마우스는 인도적 종료점으로 평가된 GvHD-유사 증상으로 인해 18일에 희생되었다. 반면, 2nd 8-BBz_7x19 CAR-T(CAR#349) 처리 군에서는 15일부터 22일까지 평균 TV의 증가가 관찰되었으며 이러한 부풀어 오른 종양 이종이식편은 32일까지 급격히 감소했다. 32일에, 5마리의 마우스 중 3마리에서 종양의 소멸이 입증되었는데, 이는 2nd 8-BBz_7x19 CAR-T 세포(CAR#349)의 완전한 반응을 시사한다. UTD T 세포로 처리된 종양 이종이식편은 종양 세포의 선상 패턴을 유지했으며 인간 CD3 양성 T 세포의 약한 침윤이 관찰되었다. 인간 CD3 양성 T 세포의 현저한 침윤이 2nd 28-28z_7x19 CAR-T(CAR#345) 처리 군의 종양 이종이식편에서 관찰되었다. 2nd 8-BBz_7x19 CAR-T(CAR#349) 처리된 마우스로부터 수집된 종양 이종이식편은 종양이 종료점에서 축소되었음을 보여주었지만, 나머지 이종이식편에서는 인간 CD3 양성 T 세포의 중간 정도의 침윤이 확인되었다. CAR-T 처리된 마우스의 이종이식 조직에서는 종양 세포의 선상 성장 패턴이 사라지고 조직이 침윤된 인간 T 세포로 채워졌는데, 이는 UTD T 세포 처리된 마우스의 조직과 완전히 달랐다. 이러한 결과는 CAR-T 처리된 마우스에서 관찰된 종양 질량의 증가가 이종이식된 종양 미세환경에서 투여된 인간 T 세포의 축적의 결과임을 나타냈으며, 이는 종양의 가성진행으로 간주될 수 있으며, 이는 MOA에 의한 효능 징후가 IL-7-의존성 T 세포 증식 및 T 세포의 CCL19-의존성 축적에서 비롯됨을 시사한다.
종양 세포의 생물발광 영상화(BLI)를 이용한 CAR-T 세포의 항-종양 활성 평가
평균 종양 부피는 종양 부담을 평가하는 일반적인 수단이지만, CAR-T 또는 기타 유사한 테스트 항목의 사용에서 예상되는 것처럼 테스트 항목이 종양 조직에서 면역 세포 축적을 자극하는 경우 종양 부피(TV)로 측정된 효과가 복잡할 수 있다. 염증으로 인한 종양 부피의 변화 또는 증가가 관찰되지 않음에도 불구하고 종양 세포의 감소를 구체적으로 측정할 수 있기 때문에, 루시퍼라제-발현 종양 세포주를 사용한 종양 부피의 생체내 평가는 이러한 모델에서 항종양 효능을 보다 구체적으로 측정할 수 있다. 암컷 NSG 마우스에 MSLN-양성 SKOV3-luc 종양 세포 500만개(M)를 복강내 접종했다. 접종 후 4일에 CAR-T 세포를 여러 용량(2nd 8-BBz_7x19 CAR-T(CAR#365) 및 CAR 양성 세포 수로서 2nd 28-28z_7x19 CAR-T 세포(CAR #364)의 경우 0.1M, 0.3M 및 1M)으로 정맥 내 단일 투여했다. 대조군으로는 비히클 대조군 인산염 완충 식염수(PBS) 또는 대조군 UTD T 세포와 동등한 총 T 세포 수를 0.3M 및 1M UTD 군에 대해 투여하였다. 마우스를 28일 동안 모니터링했다. SKOV3-luc 세포의 발광성을 측정하는 총 플럭스(TF)는 동물에 존재하는 SKOV3-luc 종양 세포의 수에 비례하며 항-종양 효능을 평가하는 데 사용할 수 있으며 주 1회 측정되었다. 도 5a 참조.
본 연구 기간은 28일이었지만, 0.1M, 0.3M 및 1M 용량의 2nd 28-28z_7x19 CAR-T(CAR#364) 치료 군은 모두 CAR-T 주입 후 인도적인 종료점으로 인해 14일에 희생되었다. 1M CAR-T 세포 용량을 사용한 CAR-T 처리 군(CAR#364 및 CAR#365) 모두 14일에 평균 총 플럭스의 감소를 나타냈으며, 이는 CAR-T 주입 후 7일에 첫 번째 측정에서 처음 관찰되었다. 평균 TF의 감소는 0.3M 및 1M 용량의 2nd 8-BBz_7x19 CAR-T(CAR#365) 처리군에서 연구 기간 동안 지속되었다. 2nd 8-BBz_7x19(CAR#365) CAR-T의 0.1M 용량 군에서는 연구 기간 내내 종양 세포가 남아 있었다. 비히클 대조군과 UTD T 세포의 두 용량군 모두의 TF는 7일부터 종료점까지 지속적으로 증가했다. 이러한 결과는 발광의 척도인 평균 TF의 상당한 감소로 측정된 SKOV3-luc 이종이식편을 보유한 NSG 마우스에서 2nd 8-BBz_7x19 CAR-T(CAR#365) 및 2nd 28-28z_7x19 CAR-T(CAR#364) 세포 모두의 용량 의존적 항-종양 활성의 증거를 나타낸다. 도 5b 참조.
CAR-T 세포의 항원-독립적인 생체내 세포 확장 능력을 평가하기 위해, CAR-T 투여 후 항원-발현 종양이 있거나 없는 마우스의 체중(BW) 변화를 조사했다. BW 감소는 일반적으로 마우스에 인간 T 세포를 주입한 후 이식편대숙주병(GvHD) 증상으로 관찰되었다.
암컷 NSG 마우스에 MSLN-양성 Capan-2 종양 세포 200만개(M)를 피하 접종하였다. 접종 후 7일에 CAR-T 세포의 3M CAR 양성 세포를 정맥내로 단일 투여하였다. 테스트된 CAR-T 작제물은 2nd 8-28z_7x19(CAR#347), 2nd 8-BBz_7x19 CAR-T(CAR#349) 및 2nd 28-28z_7x19 CAR-T 세포(CAR#345)였다. 대조군으로는 동등한 총 세포 수의 UTD T 세포(4.4M 세포)를 투여하였다. 이들 T 세포를 같은 날 종양이 없는 마우스에 투여하였다. 각 마우스의 체중(BW)을 매주 2회 측정했다.
5마리의 동물을 포함하는 각 마우스 군의 평균 BW 변화(%)를 도 6a 및 도 6b 에 나타내었다.
Capan-2 종양 이종이식 모델에서, 2nd 8-28z_7x19 CAR-T 세포(CAR#347) 투여 후 11일에 급성 BW 감소가 관찰되었다. BW 감소는 2nd 28-28z_7x19 CAR-T 세포(CAR#345) 투여 후 14일에도 관찰된 반면, UTD T 세포나 2nd 8-BBz_7x19 CAR-T(CAR#349) 처리군에서는 유의미한 BW 감소가 관찰되지 않았다. 비-종양 보유 상태에서 평균 BW의 유의한 감소는 11일에 2nd 8-28z_7x19 CAR-T(CAR#347) 치료 군에서만 관찰되었으며 다른 CAR-T 치료 군 및 UTD 군에서는 관찰되지 않았으며, 이는 표적외 독성 위험으로 간주될 수 있는 항원-자극 없이 2nd 8-28z_7x19 CAR-T(CAR#347)의 높은 생체내 확장 능력을 시사한다.
CAR-T 세포의 생체내 안전성 평가
작제물 CAR#365(2nd 8-BBz_7x19), CAR#364(2nd 28-28z_7x19) 및 비형질도입(UTD) 세포의 안전성은 비종양-보유 암컷 NSG 마우스에서 7.5 x 106개 총 세포(3M CAR+와 동일)의 단일 용량 투여 후 평가되었다. 이 연구에서 동물은 CAR-T 투여 후 17일에 인도적으로 안락사되었으며 혈청 화학, 장기 무게, 거시적 및 현미경적 병리학의 변화를 평가했다.
세 군 사이에 혈청 화학이나 장기 중량에는 유의미한 변화가 없었으며, 모든 동물은 말기 부검까지 생존했다. CAR#364를 투여한 동물에서 거시적 소견이 나타났으며 폐 변색 및 비장 비대로 구성되었으며, 두 가지 모두 장기 중량의 최소 증가와 현미경적으로 이러한 조직 내 CAR-T 세포의 존재, 즉 혼합 세포 염증(폐) 및 백색 펄프(비장)의 세포질 증가와 상관관계가 있었다.
UTD 세포는 폐 및 비장에서 최소한의 추정 CAR-T 침윤/염증을 보였다. 폐의 패턴이 전형적이었기 때문에, 이 발견은 이식편대숙주병(GvHD)과 관련이 있을 가능성이 있는 것으로 간주된다. CAR#365를 투여한 동물은 더 낮은 폐 단핵 침윤 또는 혼합 세포 염증의 발생률, 및 비장과 추가로 골수에 생착되는 추정 CAR-T 세포의 더 높은 발생률로 UTD 세포를 투여한 동물과 유사했다. 간에서 각각 한 마리의 동물에서 추가 소견이 나타났다(최소 추정 CAR-T 침윤은 아마도 GvHD와 일치할 수 있다).
CAR#364를 투여한 동물은 UTD 세포를 투여한 동물에 비해 더 높은 중증도의 소견을 가졌으며 간에서도 추가 소견이 있었다. 이러한 소견은 GvHD의 효과 및/또는 사이토카인 방어와 관련된 CAR-T 활성화의 다른 메커니즘을 악화시키는 강장제 신호전달을 시사한다.
전반적으로, 작제물 CAR#365는 UTD 세포와 유사한 최소한의 소견으로 비종양-보유 암컷 NSG 마우스에서 잘 용인되었으며, 이는 소견이 GvHD와 관련될 수 있음을 나타낸다. 작제물 CAR#365는 또한 정상 조직에서 조절되지 않는 세포 증식의 징후가 있는 작제물 CAR#364에 비해 우수한 안전성 프로필을 나타냈다. 도 7a-7c 참조.
Capan-2 이종이식된 NSG 마우스에 투여된 T 세포의 유세포 분석
암컷 NOG MHC 클래스 I/II KO 마우스에 메조텔린-양성 Capan-2 종양 세포 200만개(M)를 피하 접종하였다. 종양 접종 후 7일에, CAR-T 세포의 5M CAR 양성 세포를 정맥내로 단일 투여하였다. 테스트된 CAR-T 작제물은 2nd 8-BBz_7x19 CAR-T(CAR#364) 및 2nd 28-28z_7x19 CAR-T 세포(CAR#365)였다. 대조군으로는 동등한 총 세포 수의 UTD T 세포(12.5M 세포)를 투여하였다. 혈액, 비장 및 이종이식 종양 조직은 2nd 8-BBz_7x19 CAR-T(CAR#365) 용량 군에 대한 CAR-T 주입 후 13일, 27일 및 41일에 수집되었다. 2nd 28-28z_7x19 CAR-T(CAR#364) 세포 용량 군에서도 CAR-T 주입 후 13일에 혈액 및 조직을 수집했는데, 그 이유는 이 군의 모든 동물이 인도적 종료점으로 인해 CAR-T 주사 후 13일에 희생되었기 때문이다. 종양 샘플의 경우, 종양 및 조직 해리 시약 키트(TTDR, BD Biosciences)를 사용하여 세포를 수집했다. 비장 샘플을 해리하고 여과하여 세포 현탁액을 얻었다. 세포를 암실에서 실온에서 30분 동안 FACS 완충액(500 mL DPBS-/5 ml NaN3/10mL FBS) 중 his-태그된 메조텔린과 함께 인큐베이션했다. 세포를 세척하고 원심분리한 후 PBS 중 좀비 NIR과 함께 실온에서 15분 동안 암실에서 인큐베이션했다. 세포를 항체 혼합물(CD3/FITC, CD8/BV510, CTLA4/PE-Cy7, LAG-3/Alexa Fluor 647, PD-1/BV421, TIM-3/PerCP-Cy5.5, 항-his Ab/PE)과 인큐베이션했다. 세척된 세포를 DW에서 BD FACS 용해 완충액(BD Biosciences)과 함께 인큐베이션했다. 세척 단계 후, 세포를 FACS 완충액(500 mL DPBS-/5 ml NaN3/10 mL FBS)에 재현탁시키고 BD FACSLyricTM 유세포 분석기로 분석했다. 데이터 분석에는 FlowJo 소프트웨어(BD Biosciences)가 사용되었다.
혈액, 종양 및 비장에서 CD3+ 세포에 대한 탈진 마커(CTLA4, PD-1, LAG-3 및 TIM3) 발현이 도 8a-8c에 제시되어 있다. 말초(혈액 및 비장)에서 CAR#365는 CAR#364보다 탈진 마커 발현이 덜한 것으로 나타났다. 종양에서는 LAG-3 및 TIM-3 발현이 #364 및 #365 모두에서 낮았다. CTLA-4 및 PD-1의 경우 CAR#365는 CAR#364보다 느린 발현을 보였다.
CAR-T 활성화에 대한 가용성 인간 메조텔린의 평가
CAR-T 기능에 대한 가용성 형태의 MSLN 차단 활성을 평가하기 위해, 2nd 8-BBz_7x19 CAR-T(CAR#349) 및 2nd 28-28z_7x19 CAR-T 세포(CAR#345)를 가용성 MSLN(sMSLN)와 각각 24시간 동안 여러 용량(0.01, 0.03, 0.1, 0.3 및 1 ug/mL)으로 사전-인큐베이션하고 세척된 CAR-T 세포를 MSLN 양성 Capan-2 종양 세포와 함께 인큐베이션했다. 종양과 CAR-T 세포의 공동-배양 48시간 후, 공동-배양 상층액을 수집하고 인간 IFNγ 분비 수준을 ELISA로 측정했다.
도 9에 도시된 바와 같이, 약 10,000 pg/mL의 인간 IFNγ가 비히클 PBS와 사전-인큐베이션된 Capan-2 세포 및 2nd 28-28z_7x19 CAR-T(CAR#345) 세포의 공동-배양 상층액으로부터 분비되었다. 2nd 8-BBz_7x19 CAR-T 세포(CAR#349)로부터 IFNγ 분비는 동일한 조건에서 약 7,000 pg/mL였다. 항원-자극된 2nd 28-28z_7x19 CAR-T 세포(CAR#345)로부터의 IFNγ 분비는 sMSLN과의 사전-인큐베이션에 의해 용량-의존적으로 감소한 반면, 항원-자극된 2nd 8-BBz_7x19 CAR-T 세포(CAR#349)로부터의 IFNγ 분비에 대한 용량-의존적 억제는 sMSLN에 의해 유도되지 않았다.
CAR-T 세포로부터 IL-7 및 CCL19 분비 수준 비교
IL-7 및 CCL19의 분비 수준은 배양된 2nd 8-BBz_7x19 CAR-T(P2A 포함, CAR#349) 세포, 2nd 8-BBz_7x19 CAR-T(F2A 포함, CAR#357) 세포 및 2nd 8-BBz_7x19 CAR-T(T2A 포함, CAR#358) 세포로부터 수집된 배양 상층액을 사용하여 ELISA에 의해 평가되었다. 각 CAR-T 세포에서 분비되는 IL-7-CCL19 융합 단백질의 정량은 MSD 시스템을 이용하여 수행하였다.
MSD GOLD 96-웰 스트렙타비딘 SECTOR 플레이트(MSD 카탈로그 번호: L15SA-5)를 3% BSA를 함유하는 250 uL/웰 1x PBST와 함께 >30분 동안 인큐베이션했다. 플레이트를 1x PBST로 3회 세척하고 블로팅하여 과잉 완충액을 제거했다(이하 세척 단계라 지칭). U-PLEX 인간 MIP-3β 항체 세트(MSD, 카탈로그 번호: B21VA-3)로부터 비오틴 항-인간 MIP-3β 항체를 포획 시약으로 사용했다. 25 uL/웰 1x 포획 항체를 첨가하고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션했다. 세척 단계 후, 샘플을 동일한 부피의 검정 완충액(3% BSA를 함유하는 1x PBST)으로 희석했다. 50 uL/웰의 2x 희석 샘플을 플레이트에 첨가하고 진탕기에서 가볍게 흔들면서 실온에서 1.5시간 동안 인큐베이션했다. 세척 단계 후, U-PLEX 인간 IL-7 항체 세트(MSD 카탈로그 번호: B21UP-3)의 검출 항체를 검정 완충액(3% BSA를 함유하는 1x PBST)으로 100배 희석하여 1x 검출 항체 용액을 제조했다. 50 uL/웰의 1x 검출 항체 용액을 첨가하고 진탕기에서 가볍게 흔들면서 실온에서 1.5시간 동안 인큐베이션했다. 세척 단계 후 2x MSD 판독 완충액 150/uL를 첨가하고 MSD 플레이트 판독기에서 즉시 플레이트를 판독했다.
각 CAR-T 세포의 배양 상층액에서 IL-7, CCL19 및 IL-7/CCL19 융합 단백질의 분비 수준은 표 2에 나타내었다. 2nd 8-BBz_7x19 CAR-T(P2A 포함, CAR#349) 세포는 동일한 양의 배양 상층액에서 IL-7 및 CCL19의 가장 높은 발현 수준을 입증했다. 2nd 8-BBz_7x19 CAR-T(P2A 포함, #349)는 가장 높은 절단된 IL-7 및 CCL19 농도를 나타냈다. IL-7/CCL19 융합 단백질의 경우, P2A 작제물의 절단/비절단 융합 단백질의 비율은 2nd 8-BBz_7x19 CAR-T(T2A 포함, #358)의 비율과 비슷하고 2nd 8-BBz_7x19 CAR-T(F2A 포함, #357)의 비율보다 낮다.
표 2. CAR-T 세포 배양 상층액에서 IL-7, CCL19 및 IL-7/CCL19 융합 단백질의 농도 및 이들 비율.
종양세포의 생물발광 영상화를 이용한 2 nd 세대 및 3 rd 세대 CAR-T 세포의 생체내 항-종양 활성 평가
3rd 세대 7x19 CAR-T와 2nd 세대 7x19 CAR-T의 효능을 공정하게 비교하기 위해, 3rd 세대 8-28BBz_7x19 CAR-T(CAR#348)와 2nd 세대 8-BBz_7x19 CAR-T(CAR#365) 세포를 도 10a에 도시된 바와 같이, P2A 펩티드 서열을 포함하는 동일한 레트로바이러스 벡터 성분을 사용하여 생성시켰다. 암컷 NSG 마우스에 메조텔린-양성 HepG2-RedFluc 세포 500만개(M)를 피하 접종했다. 접종 후 7일에, 3rd 8-28BBz_7x19 CAR-T(CAR#348) 및 2nd 8-BBz_7x19 CAR-T(CAR#365) 세포를 여러 용량(CAR 양성 세포 수로서 0.3M, 1M 및 3M)으로 단일 정맥내 투여했다. 대조군으로는 비히클 대조군 인산염 완충 식염수(PBS) 또는 3M CAR 양성 세포에 대한 대조군 비형질도입(UTD) T 세포의 등가 총 T 세포 수를 UTD 3M 군에 투여하였다. CAR-T 세포의 항-종양 효능 평가를 위해 동물에 존재하는 종양 세포의 수에 비례하는 HepG2-RedFluc 세포의 발광성을 측정하는 총 플럭스(TF)를 주 1회 측정했다.
2nd 8-BBz_7x19 CAR-T(CAR#365) 및 3rd 8-28-BBz_7x19 CAR-T(CAR#348) 둘 모두는 용량 의존 방식으로 평균 총 플럭스의 감소를 입증했다. 3M CAR-T 군에서는 두 군 모두 비슷한 효능을 보였지만, 3rd 8-28-BBz_7x19 CAR-T(CAR#348) 군에서는 인간적 종료점으로 인해 연구가 끝날 때까지 5마리의 마우스 중 3마리가 희생되었다. TF의 유의한 감소는 또한 종료점까지 1M CAR-T 군 모두에서 관찰된 반면, 3rd 8-28-BBz_7x19 CAR-T(CAR#348)의 마우스 5마리 중 1마리는 14일 후에 종양이 재성장했다. 0.3M CAR-T 군에서, 비슷한 수준의 TF 감소가 두 CAR-T 군 모두에서 종료점에서 관찰되었으나, 2nd 8-BBz_7x19 CAR-T(CAR#365)는 테스트된 모든 마우스에서 더 나은 종양 제어를 보인 반면, 3rd 8-28-BBz_7x19 CAR-T(CAR#348) 군의 테스트된 마우스 5마리 중 1마리는 연구 기간 동안 종양 퇴행을 나타내지 않았다. 이러한 결과는 2nd 8-BBz_7x19 CART(CAR#365)가 3rd 8-28BBz_7x19 CART(CAR#348)에 비해 항종양 활성이 더 높고 장기간 지속된다는 것을 나타낸다. 도 10a-b, 도 11 및 도 12a-h 참조.
실시예 2
메조텔린-발현 진행성 또는 전이성 고형 종양이 있는 성인 환자에서 본원에 기재된 CAR, IL-7 및 CCL19를 발현하는 변형된 면역 세포에 대한 공개 라벨, 용량 증량, 1상, 최초의 인간 연구
연구 설계:
이는 확립된 임상적 이점이 있는 표준 치료 대안이 없는 메조텔린-발현 진행성 또는 전이성 고형 종양 환자에게 정맥내(IV) 투여된 본원에 기재된 CAR, IL-7 및 CCL19를 발현하는 변형된 면역 세포의 안전성 및 내약성을 평가하기 위한 공개-라벨, 비무작위화, 1상, 최초 인간 연구이다. 난소암, 중피종, 위암 및 비소폐세포암(NSCLC)은 본원에 기재된 CAR, IL-7 및 CCL19를 발현하는 변형된 면역 세포에 대한 최우선 표적 집단이다. 다른 유형의 암 환자는 조사자와 후원자 간의 논의를 바탕으로 등록될 것이다. 최대 21명의 DLT 평가가능한 환자가 제안된 5개의 투약 코호트 중 1개에서 본원에 기재된 CAR, IL-7 및 CCL19를 발현하는 변형된 면역 세포로 치료될 것이다. 용량 증량은 각 용량 수준에 대해 관찰된 DLT 비율을 기반으로 하는 베이지안 최적 간격(BOIN) 설계에 따라 안내될 것이다. 용량 증량/감소 결정은 DLT 이외의 안전성, 효능 및 세포 동역학(CK)을 고려하여 BOIN의 권장 용량 내에서 결정되며 코호트 종료 회의를 포함한 회의에서 후원자와 조사자가 공동으로 작성될 것이다. 추가로 나타나는 번역 데이터(예를 들어, 가용성 메조텔린, 암 항원 125[CA125])도 가능한 경우 사용되어 주어진 용량 수준에서 추가 환자에게 투여하는 결정을 내리는 데 도움이 될 수 있다. 권장되는 2상 용량(RP2D)은 각 용량 수준에서 안전성, 유효성, CK 및 바이오마커 평가에 대한 종합적인 관찰을 기반으로 결정될 것이다. 임의의 용량 코호트에서, 첫 번째 및 두 번째 환자의 본원에 기재된 CAR, IL-7 및 CCL19를 발현하는 변형된 면역 세포의 주입은 14일(또는 그 이상)만큼 분리될 것이다. 두 번째 및 후속 환자에게는 동시에 투여할 수 있다. 용량 코호트는 최소 28일(선행 코호트의 마지막 주입부터 후속 코호트의 첫 번째 주입까지)만큼 분리될 것이다. 독성은 국립암연구소(National Cancer Institute)의 유해사례에 대한 공통 용어 기준(NCI CTCAE) 버전 5.0에 따라 평가될 것이다. 사이토카인 방출 증후군(CRS)과 면역 이펙터 세포-연관 신경독성 증후군(ICANS)은 미국 이식 및 세포 치료 협회(ASTCT) 합의에 따라 평가될 것이다. 면역 이펙터 세포 치료법과 연관된 독성의 모니터링, 등급 지정 및 관리를 위해, CARTOX(CAR-T-세포-치료법-연관 독성) 권장 사항이 사용될 것이다.
본 연구는 사전스크리닝, 스크리닝, 전치료, 치료 및 1차 추적 조사, 2차 추적 조사 단계로 구성된다. 사전스크리닝 단계는 환자가 종양 세포에서 메조텔린 발현 평가를 위해 기관 검토 위원회/독립 윤리 위원회(IRB/IEC)-승인한 사전 동의서(ICF)에 서명한 날짜에 시작될 수 있다. 스크리닝 단계는 스크리닝 단계의 절차 중 하나가 수행되는 날짜부터 시작된다. 환자에게는 사전스크리닝 ICF 날짜 또는 주요 ICF 날짜 중 먼저 도래하는 날짜에 연구별 환자 번호가 제공된다. 스크리닝 단계에는 적격성 확인 및 연구 등록이 포함되며 백혈구성분채집술 절차 시작으로 종료된다. 전치료 단계는 백혈구성분채집술 시술 시작부터 조건화 화학요법 완료, 주입 시작까지의 기간으로 정의된다. 전치료 단계에서는 백혈구성분채집술, 가교 치료법, 조건화 화학요법이 시행될 것이다. 치료 및 1차 추적 조사 단계는 본원에 기재된 CAR, IL-7 및 CCL19를 발현하는 변형된 면역 세포의 투여로 시작하여 13개월까지 계속된다. 2차 추적 조사 단계는 치료 및 1차 추적 조사 종료로 시작되며 37개월까지 계속된다. 전치료, 치료 및 1차 추적 조사, 2차 추적 조사 단계에서 환자는 사망, 동의 철회 또는 기타 미리 정의된 상황으로 인해 연구 참여를 완료할 수 있다.
연구 1차 및 2차 목적의 적절한 평가를 위해 적절한 데이터가 수집되도록 보장하기 위해 방문 일정에 따라 환자를 추적 관찰할 것이다. 환자는 치료 및 1차 추적 조사 단계를 자발적으로 철회하거나 조사자의 재량에 따라 언제든지 중단할 수 있다. 다음과 같은 이유로 환자가 1차 추적 조사를 떠나 2차 추적 조사로 이동할 수 있을 것으로 예상된다:
- 질병 진행
- 1차 추적 조사에서 환자의 자발적 철회
13개월 이전에 치료 및 1차 추적 조사 단계를 중단한 환자는 보건 당국에서 요청한 데이터(예를 들어 프로토콜 정의된 AE)를 수집하기 위해 2차 추적 단계에서 본원에 기재된 CAR, IL-7 및 CCL19를 발현하는 변형된 면역 세포의 주입 후 최대 3년까지 계속 추적될 것이다.
2차 추적 조사 단계의 첫 번째 방문은 환자가 치료 및 1차 추적 조사 단계에서 중단한 시점에 따라 결정된다. 예를 들어, 환자가 7개월차에 치료 및 1차 추적 조사 단계를 중단하는 경우 2차 추적 조사 단계의 첫 번째 방문은 10개월차가 될 것이다.
1차 목적:
- 본원에 기재된 CAR, IL-7 및 CCL19를 발현하는 변형된 면역 세포의 안전성 및 내약성을 평가하기 위해.
- 본원에 기재된 CAR, IL-7 및 CCL19를 발현하는 변형된 면역 세포의 RP2D를 결정하기 위해.
2차 목적:
- 본원에 기재된 CAR, IL-7 및 CCL19를 발현하는 변형된 면역 세포의 항종양 활성을 평가하기 위해.
- 본원에 기재된 CAR, IL-7 및 CCL19를 발현하는 변형된 면역 세포의 CK를 특성화하기 위해.
- 복제가능한 레트로바이러스(RCR)-양성 테스트 결과가 있는 구현양태의 수와 퍼센트를 결정하기 위해.
대상체 집단:
메조텔린-발현 진행성 또는 전이성 고형 종양이 있는 환자. 이 연구에는 최대 21명의 DLT 평가가능한 환자가 포함될 것이다.
투여량 수준:
용량 수준이 증가하는 다음 코호트가 테스트된다:
코호트(-1): 0.3 x 107 키메라 항원 수용체(CAR)(+) 세포/신체. (코호트 1이 용인되지 않는 경우)
코호트 1: 1 x 107 CAR(+) 세포/신체 [시작 용량].
코호트 2: 1×108 CAR(+) 세포/신체.
코호트 3: 5×108 CAR(+) 세포/신체.
코호트 4: 1 x 109 CAR(+) 세포/신체.
투여 경로: 정맥내
치료 기간:
단일 IV 주입. 조건화 화학 요법이 치료보다 우선한다. (조건화 화학요법을 실시하지 않는 코호트는 테스트될 수 있다.)
포함을 위한 주요 기준:
1. 사전 동의서 서명 당시 ≥20세인 남성 또는 여성 환자.
2. 입증된 임상적 이점이 있는 표준 요법에 대한 선택권이 없거나 불내성으로 조직학적으로 또는 세포학적으로 확인된 진행성 또는 전이성 고형 종양.
3. 메조텔린-발현(강도 2+ 및/또는 3+의 생존 종양 세포에서 ≥50% 양성)은 후원자가 확인하는 검증된 검정, 채점 및 염색을 사용하여 면역조직화학에 의해 종양에서 국소적으로 결정되어야 한다. 백혈구성분채집술 절차 전 6개월 이내에 채취한 보관된 생검 샘플을 사용할 수 없는 경우, 신선한 생검 샘플을 적격성 평가에 사용해야 한다.
4. 기대 수명 ≥12주.
5. 동부 협력 종양학 그룹 성능 상태 0 또는 1.
6. 아래 명시된 바와 같이 임상 실험실 값에 의해 확인된 적절한 기관 기능:
a) 총 빌리루빈≤1.5 × 정상 범위 상한치(ULN). 길버트 증후군 환자를 제외. 길버트 증후군 환자는 직접 빌리루빈의 ≤3 × ULN인 직접 빌리루빈으로 등록할 수 있다. 수혈 후 용혈로 인한 간접 빌리루빈 상승은 허용된다.
b) 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT) 또는 아스파테이트 아미노트랜스퍼라제(AST)는 <3 × ULN이어야 한다. 간 전이성 질병의 존재로 인해 상승이 합리적이라고 판단될 경우 AST와 ALT는 ULN의 5배까지 상승할 수 있다.
c) 계산된 크레아티닌 청소율 > 50 mL/분(Cockcroft-Gault 공식).
d) 헤모글로빈은 ≥9 g/dL이어야 한다.
e) 호중구 수치는 >1000 /mm3이어야 한다.
f) 절대 림프구 수는 >500 /mm3이어야 한다.
g) 혈소판 수는 >75,000 /mm3이어야 한다.
7. 환자는 고형 종양의 반응 평가 기준, 버전 1.1(RECIST 1.1)에 정의된 방사선학적으로 측정가능한 질병을 가지고 있어야 한다.
8. 다음과 같은 여성 환자:
a) 스크리닝 방문 전 적어도 1년 동안 폐경기(자연적 무월경) 상태이거나, 또는
b) 외과적으로 불임인 경우, 또는
c) 가임기인 경우, 사전 동의서에 서명한 시점부터 본원에 기재된 CAR, IL-7 및 CCL19를 발현하는 변형된 면역 세포주입 후 적어도 12개월까지 매우 효과적인 비호르몬 피임법 1가지와 추가로 효과적인(장벽) 피임법 1가지를 동시에 실행하는 데 동의하거나, 또는
d) 대상체가 선호하고 일반적인 생활방식과 일치할 때 진정한 금욕을 실천하는 데 동의한다. 참고: 주기적인 금욕(예를 들어 달력, 배란, 증상체온, 배란 후 방법), 금단, 살정제만 사용, 수유기 무월경은 허용되는 피임 방법이 아니다.
9. 외과적으로 불임(예를 들어, 정관수술)을 받은 경우에도 다음과 같은 남성 환자:
a) 사전 동의서에 서명한 시점부터 본원에 기재된 CAR, IL-7 및 CCL19를 발현하는 변형된 면역 세포 주입 후 적어도 12개월 동안 효과적인 장벽 피임법을 실행하는 데 동의하거나, 또는
b) 대상체가 선호하고 일반적인 생활방식과 일치할 때 진정한 금욕을 실천하는 데 동의한다. 참고: 주기적인 금욕(예를 들어 달력, 배란, 증상체온, 배란 후 방법), 금단, 살정제만 사용, 수유기 무월경은 허용되는 피임 방법이 아니다.
10. 표준 의료의 일부가 아닌 연구 관련 절차를 수행하기 전에 자발적인 서면 동의가 제공되어야 하며, 환자는 향후 의료를 침해하지 않고 언제든지 동의를 철회할 수 있다는 점을 이해해야 한다.
11. 예정된 방문 및 연구 절차를 준수하려는 의지와 능력.
주요 제외 기준:
1. 활동성 전신 감염.
2. 알려진 B형 간염 표면 항원(HBsAg) 양성, 또는 알려진 또는 의심되는 활성 C형 간염 바이러스(HCV) 감염. 양성 B형 간염 코어 항체(HBcAb) 또는 B형 간염 표면 항체(HBsAb)가 있는 환자는 등록할 수 있지만 검출할 수 없는 B형 간염 바이러스(HBV) 바이러스 부하가 있어야 한다. C형 간염 바이러스 항체(HCVAb) 양성인 환자는 HCV 바이러스 부하가 검출되지 않아야 한다.
3. 응고 장애 또는 호흡기계나 면역계, 폐쇄성/제한성 폐질환을 포함한 기타 주요 의학적 질병.
4. 불안정 협심증, 임상적으로 유의미한 부정맥, 심근경색, 울혈성 심부전, 좌심실 박출률(LVEF) <45%, 실내 공기 기준 기준 산소 포화도 <93%로 정의되는 알려진 심혈관 및 심폐 질환이 있는 환자. 잘 조절된 심방세동은 배제가 되지 않지만, 조절되지 않은 심방세동은 배제가 될 수 있다.
5. 조사자의 의견에 따르면 이 프로토콜에 따른 치료 완료를 잠재적으로 방해할 수 있는 심각한 의학적 또는 정신적 질병.
6. ≥3년 질병이 없는 경우를 제외하고 비흑색종 피부암 또는 상피내 암종(예를 들어 자궁경부, 방광, 유방) 이외의 악성 종양 병력.
7. 전신 스테로이드 치료가 필요한 임의의 질병.
8. 세포 및 유전자 치료법의 이전 사용.
9. 백혈구성분채집술 절차 전 14일 이내에 또는 조건화 화학요법 또는 본원에 기재된 CAR, IL-7 및 CCL19를 발현하는 변형된 면역 세포로 치료하기 전 28일 이내에 임의의 연구용 제품(세포 또는 유전자 치료법 제외)으로 치료.
10. 백혈구성분채집술 절차 전 14일 이내에 전신 항암 요법(면역종양학 요법 포함) 및 방사선요법을 통한 치료 또는 조건화 화학요법 또는 본원에 기재된 CAR, IL-7 및 CCL19를 발현하는 변형된 면역 세포를 사용한 치료.
11. 백혈 성분채집술 절차 전 28일 이내에 대수술을 통한 치료 또는 조건화 화학요법 또는 본원에 기재된 CAR, IL-7 및 CCL19를 발현하는 변형된 면역 세포를 이용한 치료(카테터 배치와 같은 경미한 수술 절차는 배제 기준이 아니다).
12. 임의의 메조텔린-표적 치요법을 이용한 이전 치료.
13. 이전 항암 치료법으로 인해 해결되지 않은 3등급 이상의 독성.
14. 연구자가 판단한 출혈의 위험이 있는 환자.
15. 중추신경계 전이 또는 기타 중요한 신경학적 상태의 존재(필요한 경우 효과적으로 치료되었으며 안정적인 중추신경계 전이가 있는 환자가 등록될 수 있다).
16. 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 혈청 양성 및/또는 인간 T-세포 림프친화성 바이러스(HTLV) 혈청 양성 환자.
17. 장기 이식 병력이 있거나 장기 이식을 기다리는 환자.
18. 사이클로포스파미드, 플루다라빈 또는 스트렙토마이신을 포함하는 제제에 중증의 즉각적 과민증이 있는 환자.
19. 불법 약물 사용, 약물 남용 또는 알코올 남용의 인정 또는 증거의 제시.
20. 조건화 요법 시작 전 ≤6주 생백신 .
21. 수유 중이거나 모유수유 중이거나 또는 양성 혈청 임신 검사(소변 임신 검사는 조건화 화학요법 및 본원에 기재된 CAR, IL-7 및 CCL19를 발현하는 변형된 면역 세포로 치료하기 전에 허용)인 여성 환자.
참고: 수유 중인 여성 환자는 본원에 기재된 CAR, IL-7 및 CCL19를 발현하는 변형된 면역 세포로 치료하기 전에 모유수유를 중단하는 경우 적격할 것이다.
평가 및 분석을 위한 주요 기준:
1차 종료점:
용량 제한 독성(DLT)의 발생.
치료로 인한 유해사례(TEAE)의 발생.
중증 ICANS, CRS, 혈구탐식성 림프조직구증가증, 대식세포 활성화 증후군 및 종양 용해 증후군을 포함하는 임상적으로 관심이 있는 유해사례(AE)의 발생.
2차 종료점:
RECIST 1.1 및 iRECIST에 따라 조사자가 평가한 전체 반응률(ORR), 질병 제어율(DCR), 반응 기간(DOR), 진행까지의 시간(TTP) 및 무진행 생존(PFS).
전체 생존(OS).
CAR 벡터 카피수에 의해 평가된 CK-관련 매개변수([단회 용량 투여 후 말초혈액 약물 농도에서 관찰된 최대(피크)Cmax], tmax[관찰된 최대 말초혈액 농도의 최초 발생 시간], Clast[말초 혈액의 정량가능한 마지막 관찰된 농도], tlast[지속성: 말초 혈액의 마지막으로 관찰된 정량가능한 농도 시간(일)], AUC[혈액 농도-시간 곡선 아래 면적]).
RCR-양성 테스트 결과가 있는 구현양태의 수 및 백분율.
통계적 고려사항:
DLT 및 TEAE의 발생률 및 백분율은 국제 조화 협의회(ICH) 규제 활동에 대한 의학 사전(MedDRA)의 시스템 기관 부류 및 선호 용어 및 등급별로 요약될 것이다. 또한, 아래의 사건도 같은 방법으로 정리될 것이다.
- 치료-관련 TEAE.
- 3등급 이상의 TEAE.
- 3등급 이상의 치료-관련 TEAE.
- 심각한 유해사례(관련되고 관계에 무관하게).
임상적으로 관심이 있는 AE 및 RCR은 계수와 백분율로 요약될 것이다.
2차 효능 종료점의 경우, 점 추정치 및 양면 95% 정확한 이항 신뢰 구간이 이진 종료점에 대해 계산될 것이며 시간 대 사건 종료점은 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 방법을 사용하여 기술적으로 분석될 것이다.
CK 매개변수는 기술 통계를 사용하여 요약될 것이다. 개별 농도-시간 데이터 및 개별 CK 매개변수가 목록에 표시되고 용량 코호트별 요약 통계를 사용하여 표로 작성될 것이다. 개별 및 평균 농도-시간 프로파일은 용량 코호트별로 표시될 것이다.
다르게 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 기술이 속하는 기술분야의 통상의 기술자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다.
본원에 예시적으로 기재된 본 기술은 본원에 구체적으로 개시되지 않은 임의의 요소(들), 제한 또는 제한들 없이도 적합하게 실행될 수 있다. 따라서, 예를 들어, "포함하는", "포함하는", "함유하는" 등의 용어는 제한 없이 광범위하게 해석되어야 한다. 또한, 본원에 사용된 용어와 표현은 설명의 용어로 사용된 것으로 한정적이지 않으며, 이러한 용어와 표현을 사용함에 있어 도시되고 기재된 특징과 동등한 것 또는 그 일부를 배제하려는 의도는 없으며 청구된 본 기술의 범위 내에서 다양한 변형이 가능하다는 것이 인식된다.
따라서, 본원에 제공된 재료, 방법 및 실시예는 바람직한 측면을 대표하고, 예시적이며, 본 기술의 범위를 제한하려는 의도가 아니라는 것을 이해해야 한다.
본 기술은 본원에서 광범위하고 일반적으로 설명되었다. 일반적인 개시 내용에 속하는 각각의 더 좁은 종과 하위 속 군도 본 기술의 일부를 형성한다. 여기에는 삭제된 자료가 본원에 구체적으로 언급되었는지 여부에 관계없이 속에서 모든 주제를 제거하는 단서 또는 부정적 제한과 함께 본 기술의 일반적인 설명이 포함된다.
또한, 본 기술의 특징 또는 측면이 마쿠쉬(Markush) 군의 관점에서 기술되는 경우, 당업자는 본 기술이 이로써 마쿠쉬(Markush) 군의 임의의 개별 구성원 또는 구성원의 하위 군의 관점에서도 기술된다는 것을 인식할 것이다.
본원에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 기타 참고문헌은 각각이 개별적으로 참고로 포함되는 것과 동일한 정도로 전체적으로 참고로 명시적으로 포함된다. 상충되는 경우 정의를 포함하여 본 명세서가 적용된다.
다른 측면은 다음 청구범위에 제시되어 있다.

Claims (55)

  1. 인간 메조텔린을 특이적으로 인식하는 항체, CD8 힌지 영역, CD8 막횡단 영역, 4-1BB 세포내 영역, 및 CD3ζ 세포내 영역을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
    IL-7을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및
    CCL19를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 분리된 핵산 분자.
  2. 제1항에 있어서, 상기 IL-7이 인간 IL-7인, 분리된 핵산 분자.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 CCL19가 인간 CCL19인, 분리된 핵산 분자.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하고, 여기서 VH는 서열번호: 1-3을 포함하는 3개의 상보성-결정 영역(CDR)을 포함하고, VL은 서열번호: 4-6을 포함하는 3개의 CDR을 포함하는, 분리된 핵산 분자.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 VH가 서열번호: 7을 포함하고, VL이 서열번호: 8을 포함하는, 분리된 핵산 분자.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 단일-사슬 가변 단편(scFv) 형식을 포함하는, 분리된 핵산 분자.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 서열번호: 9를 포함하는, 분리된 핵산 분자.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 4-1BB 세포내 영역이 서열번호: 13을 포함하는, 분리된 핵산 분자.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CD3ζ 세포내 영역이 서열번호: 14를 포함하는, 분리된 핵산 분자.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 4-1BB 세포내 영역이 분리된 핵산 분자에서 CD3ζ 세포내 영역의 업스트림에 있는, 분리된 핵산 분자.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CD8 힌지 영역이 서열번호: 11을 포함하는, 분리된 핵산 분자.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CD8 막횡단 영역이 서열 번호: 12를 포함하는, 분리된 핵산 분자.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산이 항체와 CD8 힌지 영역을 연결하는 3 내지 10개 아미노산 잔기 길이의 펩티드 링커를 추가로 포함하는, 분리된 핵산 분자.
  14. 제13항에 있어서, 상기 펩티드 링커가 AAA를 포함하는, 분리된 핵산 분자.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분리된 핵산 분자가 신호전달 펩티드를 추가로 포함하는, 분리된 핵산 분자.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 신호전달 펩티드가 분리된 핵산 분자에서 인간 메조텔린을 특이적으로 인식하는 항체의 업스트림에 위치하는,분리된 핵산 분자.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 상기 신호전달 펩티드가 서열번호: 15를 포함하는, 분리된 핵산 분자.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, IL-7을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 CCL19를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 자가-절단 2A 펩티드(2A 펩티드)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 프로모터 하에서 각각 독립적으로 전사되는, 분리된 핵산 분자.
  19. 제18항에 있어서, 상기 2A 펩티드가 임의로 ATNFSLLKQAGDVEENPGP를 포함하는 P2A인, 분리된 핵산 분자.
  20. 제18항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드 링커가 2A 펩티드의 N-말단에 추가로 첨가되고, 상기 펩티드 링커가 GSG를 포함하는, 분리된 핵산 분자.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IL-7이 서열번호: 18을 포함하는, 분리된 핵산 분자.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CCL19가 서열번호: 19를 포함하는, 분리된 핵산 분자.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, CAR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, IL-7을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 CCL19를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 핵산 분자에서 5' 말단에서 3' 말단으로 CAR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 - IL-7을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 - CCL19를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 배열되는, 분리된 핵산 분자.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분리된 핵산 분자가 서열번호: 16을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는, 분리된 핵산 분자.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분리된 핵산 분자가 서열번호: 17을 포함하는, 분리된 핵산 분자.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항의 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  27. 제26항에 있어서, 상기 벡터가 바이러스 벡터, 임의로 발현 벡터인, 벡터.
  28. 제27항에 있어서, 상기 바이러스 벡터가 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터로부터 선택되는, 벡터.
  29. 제27항 또는 제28항에 있어서, 상기 바이러스 벡터가 pSFG 벡터, pMSGV 벡터, 또는 pMSCV 벡터인, 벡터.
  30. 제26항에 있어서, 상기 벡터가 플라스미드인, 벡터.
  31. 포유동물로부터 유래되거나 포유동물로부터 분리되고, 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항의 핵산 분자 또는 제26항 내지 제30항 중 어느 한 항의 벡터를 포함하는 면역 세포.
  32. 포유동물로부터 유래되거나 포유동물로부터 분리되고 a) 인간 메조텔린을 특이적으로 인식하는 항체, CD8 힌지 영역, CD8 막횡단 영역, 4-1BB 세포내 영역 및 CD3ζ 세포내 영역를 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR), b) IL-7, 및 c) CCL19를 발현하는 면역 세포.
  33. 제31항 또는 제32항에 있어서, 상기 면역 세포가 T 세포, 자연 살해(NK) 세포, B 세포, 항원 제시 세포, 또는 과립구, 임의로 T 세포 또는 NK 세포인, 면역 세포.
  34. 제31항 내지 제33항 중 어느 한 항의 면역 세포 및 약제학적으로 허용되는 첨가제를 포함하는 약제학 조성물.
  35. 제31항 내지 제33항 중 어느 한 항의 면역 세포 또는 제34항의 약제학 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 메조텔린-발현 암을 치료하는 방법.
  36. 제35항에 있어서, 상기 메조텔린-발현 암이 중피종, 결장직장암, 췌장암, 흉선암, 담관암, 폐암, 피부암, 유방암, 전립선암, 방광암, 처녀암, 목암, 자궁암, 간암, 신장암, 비장암, 기관암, 기관지암, 위장암, 식도암, 담낭암, 고환암, 난소암, 골암으로부터 임의로 선택되는 고형 종양인, 방법.
  37. 제35항에 있어서, 상기 메조텔린-발현 암이 조혈암인, 방법.
  38. 제35항에 있어서, 상기 메조텔린-발현 암이 연골육종, 유잉 육종, 악성 혈관내피종, 악성 신경초종, 골육종 및 연조직 육종으로부터 임의로 선택되는 육종인, 방법.
  39. 제35항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 메조텔린-발현 암이 전이성 암인, 방법.
  40. 제35항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 메조텔린-발현 암이 재발성 암 또는 불응성 암인, 방법.
  41. 제35항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 대상체에게 추가 치료제 또는 추가 치료 요법을 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  42. 제41항에 있어서, 상기 추가 치료제가 화학요법제, 면역요법제, 표적 치료법, 방사선 치료법, 또는 이들의 조합을 포함하는, 방법.
  43. 제41항에 있어서, 상기 추가적인 치료 요법이 1차 치료법을 포함하는, 방법.
  44. 제41항에 있어서, 상기 추가적인 치료 요법이 수술을 포함하는, 방법.
  45. 제41항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 제31항 내지 제33항 중 어느 한 항의 면역 세포 또는 제34항의 약제학 조성물 및 추가 치료제가 동시에 투여되는, 방법.
  46. 제41항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 제31항 내지 제33항 중 어느 한 항의 면역 세포 또는 제34항의 약제학 조성물 및 추가 치료제가 순차적으로 투여되는, 방법.
  47. 제46항에 있어서, 제31항 내지 제33항 중 어느 한 항의 면역 세포 또는 제34항의 약제학 조성물이 추가 치료제를 투여하기 전에 대상체에게 투여되는, 방법.
  48. 제46항에 있어서, 제31항 내지 제33항 중 어느 한 항의 면역 세포 또는 제34항의 약제학 조성물이 추가 치료제를 투여 후에 대상체에게 투여되는, 방법.
  49. 제35항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 인간인, 방법.
  50. 종양 세포를 제31항 내지 제33항 중 어느 한 항의 면역 세포와 접촉시켜 종양 세포 증식을 감소시키는 단계를 포함하는, 종양 세포 증식을 감소시키는 방법.
  51. 제50항에 있어서, 상기 방법이 시험관내 방법인, 방법.
  52. 제50항에 있어서, 상기 방법이 생체내 방법인, 방법.
  53. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항의 핵산 분자 또는 제26항 내지 제30항 중 어느 한 항의 벡터를 면역 세포에 도입하여 면역 세포에 의해 인간 메조텔린, IL-7 및 CCL19를 특이적으로 인식하는 세포 표면 분자의 발현을 유도하는 단계를 포함하는, 인간 메조텔린, IL-7 및 CCL19를 특이적으로 인식하는 세포 표면 분자를 발현하는 면역 세포를 생산하는 방법.
  54. 제53항에 있어서, 상기 면역 세포가 T 세포, 자연 살해(NK) 세포, B 세포, 항원 제시 세포, 또는 과립구, 임의로 T 세포 또는 NK 세포인, 방법.
  55. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항의 핵산 분자; 제26항 내지 제30항 중 어느 한 항의 벡터; 제31항 내지 제33항 중 어느 한 항의 면역 세포, 또는 제34항의 약제학 조성물, 및 사용 지침을 포함하는, 키트.
KR1020247000845A 2021-07-29 2022-07-28 메조텔린을 특이적으로 표적화하는 조작된 면역 세포 및 이의 용도 KR20240040068A (ko)

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