JP2024504696A - Ｃｔｌａ４結合性タンパク質およびがんを処置する方法 - Google Patents

Abstract

本開示は、細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原－４（ＣＴＬＡ４）に結合する操作された抗原結合性タンパク質を提供する。核酸、ベクター、宿主細胞、およびコンジュゲートも本開示で提供される。前記実体を含むキットおよび医薬組成物、ならびに操作された抗原結合性タンパク質を作出する方法およびそれを必要とする対象を処置する方法がさらに提供される。本発明は、少なくとも一部において、ある特定のＣＴＬＡ４結合性タンパク質が予想外のＴ細胞活性化特性を示すという発見に基づく。

Description

関連出願
本出願は、その内容が完全に参照により本明細書に組み込まれる２０２１年１月２０日出願の米国仮特許出願第６３／１３９，５１０号に基づく優先権の利益を主張するものである。

背景
チェックポイント遮断を用いたがん免疫療法の著しい臨床的成功は、このがん免疫療法によって多くの悪性腫瘍に対する治癒的治療の基盤が形成される可能性が高いことを示唆するものである（Reck et al. (2016) N. Engl. J. Med. 375: 1823-1833；Hodi et al. (2010) N. Engl. J. Med. 363: 711-723）。細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原－４（ＣＴＬＡ４）は、主にリンパ節におけるナイーブＴ細胞活性化の初期にＴ細胞増殖を調節する免疫チェックポイントであり、したがって、Ｔ細胞に負のシグナルをもたらすものである。ＣＴＬＡ４とその同類リガンドの結合が遮断されると、腫瘍特異的Ｔ細胞の活性化および増殖が促進されることによって抗腫瘍免疫応答が誘導される。

Reck et al. (2016) N. Engl. J. Med. 375: 1823-1833 Hodi et al. (2010) N. Engl. J. Med. 363: 711-723

イピリムマブ（ヤーボイ（Ｙｅｒｖｏｙ））は、ヒトＣＴＬＡ４に結合し、ヒトＣＴＬＡ４とリガンドの相互作用を遮断するヒトモノクローナル抗体であり、黒色腫、腎細胞癌、前立腺がん、尿路上皮癌、および卵巣がんの患者における臨床的有効性が実証されている。イピリムマブは、黒色腫の処置に関して米国食品医薬品局（Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）（ＦＤＡ）による承認を２０１１年に受けており、２０２０年の売上高は＄１７億であったと推定される。しかし、有効な治癒法ではあるが、イピリムマブの黒色腫根絶に関する長期間にわたる成功率はたった２２％である。さらに、イピリムマブは、毒性が強く、自己免疫疾患およびＴＲＥＧ（調節性Ｔ細胞）枯渇に特徴的な多くの副作用が伴い、それにより、その広範な使用が限定されている。したがって、より良好な有効性および安全性プロファイルを有する追加的な免疫療法戦略の大きな必要性が当技術分野において存在する。

要旨
本発明は、少なくとも一部において、ある特定のＣＴＬＡ４結合性タンパク質が予想外のＴ細胞活性化特性を示すという発見に基づく。これらのＣＴＬＡ４結合性タンパク質は、ＣＴＬＡ４上の複数のエピトープ、例えば、エピトープ１（^１３４ＭＹＰＰＰＹ^１３９（配列番号１））およびエピトープ２（^６５ＳＩＣＴ^６８（配列番号２））に結合するもの、ならびに抗体のＦｃ領域を欠く実体（例えば、Ｆ（ａｂ’）２またはダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ））を包含する。驚いたことに、本発明で提供されるバイパラトピック実体は、モノパラトピック対応物（例えば、イピリムマブ）の組合せよりも優れたＣＴＬＡ４リガンド結合およびＴ細胞活性化の遮断に対する相乗効果を示した。さらに、Ｆｃドメインを欠くＣＴＬＡ４結合性タンパク質の活性は、イピリムマブの活性もＦｃドメインを有する他のＣＴＬＡ４結合性抗体の活性も凌ぐものであった。ＣＴＬＡ４抗体のＦｃ領域とＦｃ受容体の相互作用がＣＴＬＡ４遮断活性に重要であることが広く認められているので、そのような所見は驚くべき予想外のものであった（Bulliard et al. (2013) J of Exp Medicine 9: 1685-1693；Waight et al. (2018) Cancer Cell 33: 1033-1047；Ingram et al. (2018) Proc Natl Acad Sci U S A 115: 3912-3917；Vargas et al. (2018) Cancer Cell 33: 1-15）。したがって、操作された抗原結合性タンパク質およびそれを含む医薬組成物には、イピリムマブを凌ぐ臨床的有効性があることが見込まれる。

ある特定の態様では、ＣＴＬＡ４の残基^１３４ＭＹＰＰＰＹ^１３９（配列番号１）によって定義されるエピトープ１および残基^６５ＳＩＣＴ^６８（配列番号２）によって定義されるエピトープ２に特異的に結合する操作された抗原結合性タンパク質が本発明で提供される。

ある特定の態様では、ＣＴＬＡ４に特異的に結合し、抗体の定常領域のＣＨ２ドメインおよび／またはＣＨ３領域を欠く操作された抗原結合性タンパク質が本発明で提供される。一部の実施形態では、操作された抗原結合性タンパク質は、ダイアボディである。

ある特定の態様では、本開示の操作された抗原結合性タンパク質をコードする単離された核酸分子が本発明で提供される。そのような核酸を含むベクターも本発明で提供される。単離された核酸を含む、ベクターを含む、または本開示の操作された抗原結合性タンパク質を発現する、宿主細胞が本発明でさらに提供される。

ある特定の態様では、本開示の操作された抗原結合性タンパク質、単離された核酸、ベクター、または宿主細胞の医薬組成物が本発明で提供される。少なくとも１つの本開示の操作された抗原結合性タンパク質を含むキットが本発明でさらに提供される。

ある特定の態様では、少なくとも１つの本開示の操作された抗原結合性タンパク質を作製する方法であって、（ｉ）少なくとも１つの本開示の操作された抗原結合性タンパク質をコードする配列を含む核酸を含む宿主細胞を、前記操作された抗原結合性タンパク質の発現を可能にするのに適した条件下で培養するステップと、（ｉｉ）発現された操作された抗原結合性タンパク質を回収するステップとを含む、方法が本発明で提供される。

ある特定の態様では、がんを患っている対象に対する予防または処置の方法であって、対象に、少なくとも１つの本開示の操作された抗原結合性タンパク質またはそれを含む医薬組成物を投与するステップを含む、方法が本発明で提供される。

ある特定の態様では、それを必要とする対象におけるがん細胞の増殖を低減させる方法であって、対象に、少なくとも１つの本開示の操作された抗原結合性タンパク質またはそれを含む医薬組成物を投与するステップを含む、方法が本発明で提供される。

本発明の任意の態様に適用すること、および／または本明細書に記載の任意の他の実施形態と組み合わせることができる多数の実施形態がさらに提供される。例えば、一部の実施形態では、少なくとも１つの操作された抗原結合性タンパク質または医薬組成物により、（ａ）がんにおいて増殖しているがん細胞の数が減少する；（ｂ）がんの腫瘍の体積もしくはサイズが低減する；（ｃ）がんに対する免疫応答が増大する；および／または（ｄ）Ｔ細胞が活性化される。

一部の実施形態では、操作された抗原結合性タンパク質は、抗原結合性ドメインに対して異種であるＦｃドメインを含む。一部の実施形態では、異種Ｆｃドメインにより、抗原結合性タンパク質の半減期が延長される。一部の実施形態では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１ Ｆｃである。さらに他の実施形態では、ＩｇＧ１ Ｆｃは、ＬＡＬＡＰＧアミノ酸配列を含む（Lo et al., (2017) J. Biological Chem., 292: 3900-08）。

一部の実施形態では、方法は、対象に、追加的ながん治療を施行するステップをさらに含む。一部の実施形態では、追加的ながん治療は、免疫療法、チェックポイント遮断、がんワクチン、キメラ抗原受容体、化学療法、放射線照射、標的治療、および外科手術からなる群から選択される。一実施形態では、追加的ながん治療は、ニボルマブである。

一部の実施形態では、がんは、膵がん、肺がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、悪性胸膜中皮腫、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）、腎細胞癌（ＲＣＣ）、乳がん、肝がん、肝細胞癌、腎がん（ｋｉｄｎｅｙ ｃａｎｃｅｒ）、皮膚がん、黒色腫、甲状腺がん（ｔｈｙｒｏｉｄ ｃａｎｃｅｒ）、胆嚢がん、頭頸部（扁平上皮）がん、胃がん（ｓｔｏｍａｃｈ（ｇａｓｔｒｉｃ）ｃａｎｃｅｒ）、頭頸部がん、膀胱がん（ｂｌａｄｄｅｒ ｃａｎｃｅｒ）、尿路上皮癌、メルケル細胞がん、結腸がん、結腸直腸がん、腸がん、卵巣がん、子宮頸がん、精巣がん、食道がん、頬粘膜がん（ｂｕｃｃａｌ ｃａｎｃｅｒ）、脳がん、血液がん、リンパ腫（Ｂ細胞リンパ腫およびＴ細胞リンパ腫）、中皮腫、皮膚扁平上皮細胞がん、ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、ならびにこれらの悪性または転移性形態から選択される。

一部の実施形態では、がんは、黒色腫（例えば、切除不能なまたは転移性黒色腫）、腎細胞癌（ＲＣＣ）、結腸直腸がん、肝細胞癌、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、悪性胸膜中皮腫、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）、乳がん、頭頸部がん、膀胱がん、尿路上皮癌、メルケル細胞がん、子宮頸がん、肝細胞癌、胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、皮膚扁平上皮細胞がん、ホジキンリンパ腫、およびＢ細胞リンパ腫から選択される。

ある特定の態様では、対象における免疫応答を増大させる方法であって、対象に、少なくとも１つの本開示の操作された抗原結合性タンパク質またはそれを含む医薬組成物を投与するステップを含む、方法が本発明で提供される。

ある特定の態様では、Ｔ細胞を活性化する方法であって、Ｔ細胞を、少なくとも１つの本開示の操作された抗原結合性タンパク質またはそれを含む医薬組成物と接触させるステップを含む、方法が本発明で提供される。

ある特定の態様では、それを必要とする対象におけるＣＴＬＡ４タンパク質の異所性発現または活性を特徴とする疾患または状態を予防または処置する方法であって、対象に、少なくとも１つの本開示の操作された抗原結合性タンパク質またはそれを含む医薬組成物を投与するステップを含む、方法が本発明で提供される。一部の実施形態では、疾患または状態は、がん、自己免疫疾患、感染、または炎症性疾患である。

図１は、ＣＴＬＡ４遮断アッセイを示す。このバイオアッセイは、２種の遺伝子操作された細胞株、ＣＴＬＡ４エフェクター細胞（Ｊｕｒｋａｔ）およびａＡＰＣ／Ｒａｊｉ細胞からなる。共培養すると、ＣＴＬＡ４／ＣＤ８０およびＣＤ８６相互作用により、ＣＤ２８経路により活性化される発光が阻害される（左側のパネル）。抗ＣＴＬＡ４抗体を添加することにより、ＣＴＬＡ４／ＣＤ８０およびＣＤ８６相互作用が遮断され、それにより、ＣＤ２８経路により活性化される発光が再度確立され、これを、発光剤（Ｇｌｏ）を添加し、ルミノメーターを用いて定量化することによって用量依存的に検出することができる（中央のパネル）。ＣＴＬＡ４を発現しないエフェクター細胞と共培養すると（右側のパネル）、活性化により、同様にＣＤ２８経路の活性化による発光が抗ＣＴＬＡ４抗体とは無関係に誘導される。

図２Ａは、イピリムマブ（「Ｉｐｉ」または「ＩＰＩ」）、Ｌ３Ｄ１０、またはＩＰＩとＬ３Ｄ１０の組合せに対するＣＴＬＡ４遮断用量反応を示す。

図２Ｂは、ＩＬ－２レベルをアッセイ出力として用いた、イピリムマブ（「Ｉｐｉ」または「ＩＰＩ」）またはＬ３Ｄ１０に対するＣＴＬＡ４遮断用量反応を示す。

図３は、抗ＣＴＬＡ４抗体が、Ｆｃ受容体であるＣＤ３２に依存するＣＴＬＡ４遮断活性を有することを示す。抗ＣＤ３２抗体を添加することにより、種々の抗ＣＴＬＡ４抗体によって媒介されるＣＴＬＡ４遮断が低減する。ここで試験した抗体には、Ｉｐｉ（イピリムマブ）、ＣＤ３２（抗ＣＤ３２抗体）、Ｌ３Ｄ１０（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ抗ＣＴＬＡ４抗体）、および２６ ＨｕＩｇＧ１が含まれる。

図４は、抗ＣＴＬＡ４抗体が、Ｆｃ受容体であるＣＤ３２に依存するＣＴＬＡ４遮断活性を有することを示す。抗ＣＤ３２抗体を添加することにより、種々の抗ＣＴＬＡ４抗体によって媒介されるＣＴＬＡ４遮断が低減するが、抗体のＦｃ領域とＣＤ３２の相互作用を抑止するＬＡＬＡ変異を含有する抗体ではそれが認められない。

図５は、２６ Ｆａｂ’または２６ Ｆ（ａｂ’）_２が２６ ＨｕＩｇＧ１全長抗体と比較してＣＴＬＡ４遮断活性の増大を有することを示す。

図６は、２６ Ｆ（ａｂ’）_２のＣＴＬＡ４遮断活性の増大がＣＤ３２とは無関係であることを示す。

図７は、イピリムマブ、Ｉｐｉ Ｆ（ａｂ’）_２、１２１ ＨｕＩｇＧ１、および１２１ Ｆ（ａｂ’）_２のＣＴＬＡ４遮断活性を示す。

図８は、イピリムマブ、Ｉｐｉ ｓｃＦｖ、１２１ ＨｕＩｇＧ１、および１２１ ｓｃＦｖのＣＴＬＡ４遮断活性を示す。

図９Ａおよび９Ｂは、本開示の種々の抗原結合性タンパク質の概略図を示す。図９Ａは、種々のダイアボディのドメイン構造を示す。図の出典は、Kipriyanov et al. (1999) J Mol Biol 293: 41-56、Volkel et al. (2001) Protein Engineering 14: 815-823、Gall et al. (2004) Protein Engineering, Design & Selection 17: 357-366、およびReusch et al. (2014) mAbs 6: 727-738である。図９Ｂは、異なる型の抗原結合性タンパク質の概略図を示す。

図１０Ａ～図１０Ｉは、種々のダイアボディのドメイン構造および配列を示す。図１０Ａは、例示的な抗ＣＴＬＡ４ダイアボディ（ＢｉｏＥ２０５１およびＢｉｏＥ２０５２）のドメイン構造を示す。ダイアボディは、イピリムマブおよび１２１抗体のＶＬおよびＶＨドメインを含み、ＣＴＬＡ４上の２つの独立したエピトープを標的とする。図１０Ｂは、ＢｉｏＥ２０５２の図および配列を示す。図１０Ｃは、ＢｉｏＥ２０５１の図および配列を示す。図１０Ｄは、ｉｐｉ Ｆ（ａｂ’）_２を形成するＢｉｏＥ２０２２およびＢｉｏＥ２０２３の図および配列を示す。図１０Ｅは、ｉｐｉ Ｆａｂ’を形成するＢｉｏＥ２２０１およびＢｉｏＥ２０２３の図および配列を示す。図１０Ｆは、１２１ Ｆ（ａｂ’）_２を形成するＢｉｏＥ２０３３およびＢｉｏＥ２０３４の図および配列を示す。図１０Ｇは、１２１ Ｆａｂ’を形成するＢｉｏＥ２２０２およびＢｉｏＥ２０３４の図および配列を示す。図１０Ｈは、ＢｉｏＥ２０２２とＢｉｏＥ２２０１のＣ末端配列の比較を示す。図１０Ｉは、ＢｉｏＥ２０３３とＢｉｏＥ２２０２のＣ末端配列の比較を示す。 図１０Ａ～図１０Ｉは、種々のダイアボディのドメイン構造および配列を示す。図１０Ａは、例示的な抗ＣＴＬＡ４ダイアボディ（ＢｉｏＥ２０５１およびＢｉｏＥ２０５２）のドメイン構造を示す。ダイアボディは、イピリムマブおよび１２１抗体のＶＬおよびＶＨドメインを含み、ＣＴＬＡ４上の２つの独立したエピトープを標的とする。図１０Ｂは、ＢｉｏＥ２０５２の図および配列を示す。図１０Ｃは、ＢｉｏＥ２０５１の図および配列を示す。図１０Ｄは、ｉｐｉ Ｆ（ａｂ’）_２を形成するＢｉｏＥ２０２２およびＢｉｏＥ２０２３の図および配列を示す。図１０Ｅは、ｉｐｉ Ｆａｂ’を形成するＢｉｏＥ２２０１およびＢｉｏＥ２０２３の図および配列を示す。図１０Ｆは、１２１ Ｆ（ａｂ’）_２を形成するＢｉｏＥ２０３３およびＢｉｏＥ２０３４の図および配列を示す。図１０Ｇは、１２１ Ｆａｂ’を形成するＢｉｏＥ２２０２およびＢｉｏＥ２０３４の図および配列を示す。図１０Ｈは、ＢｉｏＥ２０２２とＢｉｏＥ２２０１のＣ末端配列の比較を示す。図１０Ｉは、ＢｉｏＥ２０３３とＢｉｏＥ２２０２のＣ末端配列の比較を示す。 図１０Ａ～図１０Ｉは、種々のダイアボディのドメイン構造および配列を示す。図１０Ａは、例示的な抗ＣＴＬＡ４ダイアボディ（ＢｉｏＥ２０５１およびＢｉｏＥ２０５２）のドメイン構造を示す。ダイアボディは、イピリムマブおよび１２１抗体のＶＬおよびＶＨドメインを含み、ＣＴＬＡ４上の２つの独立したエピトープを標的とする。図１０Ｂは、ＢｉｏＥ２０５２の図および配列を示す。図１０Ｃは、ＢｉｏＥ２０５１の図および配列を示す。図１０Ｄは、ｉｐｉ Ｆ（ａｂ’）_２を形成するＢｉｏＥ２０２２およびＢｉｏＥ２０２３の図および配列を示す。図１０Ｅは、ｉｐｉ Ｆａｂ’を形成するＢｉｏＥ２２０１およびＢｉｏＥ２０２３の図および配列を示す。図１０Ｆは、１２１ Ｆ（ａｂ’）_２を形成するＢｉｏＥ２０３３およびＢｉｏＥ２０３４の図および配列を示す。図１０Ｇは、１２１ Ｆａｂ’を形成するＢｉｏＥ２２０２およびＢｉｏＥ２０３４の図および配列を示す。図１０Ｈは、ＢｉｏＥ２０２２とＢｉｏＥ２２０１のＣ末端配列の比較を示す。図１０Ｉは、ＢｉｏＥ２０３３とＢｉｏＥ２２０２のＣ末端配列の比較を示す。 図１０Ａ～図１０Ｉは、種々のダイアボディのドメイン構造および配列を示す。図１０Ａは、例示的な抗ＣＴＬＡ４ダイアボディ（ＢｉｏＥ２０５１およびＢｉｏＥ２０５２）のドメイン構造を示す。ダイアボディは、イピリムマブおよび１２１抗体のＶＬおよびＶＨドメインを含み、ＣＴＬＡ４上の２つの独立したエピトープを標的とする。図１０Ｂは、ＢｉｏＥ２０５２の図および配列を示す。図１０Ｃは、ＢｉｏＥ２０５１の図および配列を示す。図１０Ｄは、ｉｐｉ Ｆ（ａｂ’）_２を形成するＢｉｏＥ２０２２およびＢｉｏＥ２０２３の図および配列を示す。図１０Ｅは、ｉｐｉ Ｆａｂ’を形成するＢｉｏＥ２２０１およびＢｉｏＥ２０２３の図および配列を示す。図１０Ｆは、１２１ Ｆ（ａｂ’）_２を形成するＢｉｏＥ２０３３およびＢｉｏＥ２０３４の図および配列を示す。図１０Ｇは、１２１ Ｆａｂ’を形成するＢｉｏＥ２２０２およびＢｉｏＥ２０３４の図および配列を示す。図１０Ｈは、ＢｉｏＥ２０２２とＢｉｏＥ２２０１のＣ末端配列の比較を示す。図１０Ｉは、ＢｉｏＥ２０３３とＢｉｏＥ２２０２のＣ末端配列の比較を示す。 図１０Ａ～図１０Ｉは、種々のダイアボディのドメイン構造および配列を示す。図１０Ａは、例示的な抗ＣＴＬＡ４ダイアボディ（ＢｉｏＥ２０５１およびＢｉｏＥ２０５２）のドメイン構造を示す。ダイアボディは、イピリムマブおよび１２１抗体のＶＬおよびＶＨドメインを含み、ＣＴＬＡ４上の２つの独立したエピトープを標的とする。図１０Ｂは、ＢｉｏＥ２０５２の図および配列を示す。図１０Ｃは、ＢｉｏＥ２０５１の図および配列を示す。図１０Ｄは、ｉｐｉ Ｆ（ａｂ’）_２を形成するＢｉｏＥ２０２２およびＢｉｏＥ２０２３の図および配列を示す。図１０Ｅは、ｉｐｉ Ｆａｂ’を形成するＢｉｏＥ２２０１およびＢｉｏＥ２０２３の図および配列を示す。図１０Ｆは、１２１ Ｆ（ａｂ’）_２を形成するＢｉｏＥ２０３３およびＢｉｏＥ２０３４の図および配列を示す。図１０Ｇは、１２１ Ｆａｂ’を形成するＢｉｏＥ２２０２およびＢｉｏＥ２０３４の図および配列を示す。図１０Ｈは、ＢｉｏＥ２０２２とＢｉｏＥ２２０１のＣ末端配列の比較を示す。図１０Ｉは、ＢｉｏＥ２０３３とＢｉｏＥ２２０２のＣ末端配列の比較を示す。 図１０Ａ～図１０Ｉは、種々のダイアボディのドメイン構造および配列を示す。図１０Ａは、例示的な抗ＣＴＬＡ４ダイアボディ（ＢｉｏＥ２０５１およびＢｉｏＥ２０５２）のドメイン構造を示す。ダイアボディは、イピリムマブおよび１２１抗体のＶＬおよびＶＨドメインを含み、ＣＴＬＡ４上の２つの独立したエピトープを標的とする。図１０Ｂは、ＢｉｏＥ２０５２の図および配列を示す。図１０Ｃは、ＢｉｏＥ２０５１の図および配列を示す。図１０Ｄは、ｉｐｉ Ｆ（ａｂ’）_２を形成するＢｉｏＥ２０２２およびＢｉｏＥ２０２３の図および配列を示す。図１０Ｅは、ｉｐｉ Ｆａｂ’を形成するＢｉｏＥ２２０１およびＢｉｏＥ２０２３の図および配列を示す。図１０Ｆは、１２１ Ｆ（ａｂ’）_２を形成するＢｉｏＥ２０３３およびＢｉｏＥ２０３４の図および配列を示す。図１０Ｇは、１２１ Ｆａｂ’を形成するＢｉｏＥ２２０２およびＢｉｏＥ２０３４の図および配列を示す。図１０Ｈは、ＢｉｏＥ２０２２とＢｉｏＥ２２０１のＣ末端配列の比較を示す。図１０Ｉは、ＢｉｏＥ２０３３とＢｉｏＥ２２０２のＣ末端配列の比較を示す。 図１０Ａ～図１０Ｉは、種々のダイアボディのドメイン構造および配列を示す。図１０Ａは、例示的な抗ＣＴＬＡ４ダイアボディ（ＢｉｏＥ２０５１およびＢｉｏＥ２０５２）のドメイン構造を示す。ダイアボディは、イピリムマブおよび１２１抗体のＶＬおよびＶＨドメインを含み、ＣＴＬＡ４上の２つの独立したエピトープを標的とする。図１０Ｂは、ＢｉｏＥ２０５２の図および配列を示す。図１０Ｃは、ＢｉｏＥ２０５１の図および配列を示す。図１０Ｄは、ｉｐｉ Ｆ（ａｂ’）_２を形成するＢｉｏＥ２０２２およびＢｉｏＥ２０２３の図および配列を示す。図１０Ｅは、ｉｐｉ Ｆａｂ’を形成するＢｉｏＥ２２０１およびＢｉｏＥ２０２３の図および配列を示す。図１０Ｆは、１２１ Ｆ（ａｂ’）_２を形成するＢｉｏＥ２０３３およびＢｉｏＥ２０３４の図および配列を示す。図１０Ｇは、１２１ Ｆａｂ’を形成するＢｉｏＥ２２０２およびＢｉｏＥ２０３４の図および配列を示す。図１０Ｈは、ＢｉｏＥ２０２２とＢｉｏＥ２２０１のＣ末端配列の比較を示す。図１０Ｉは、ＢｉｏＥ２０３３とＢｉｏＥ２２０２のＣ末端配列の比較を示す。 図１０Ａ～図１０Ｉは、種々のダイアボディのドメイン構造および配列を示す。図１０Ａは、例示的な抗ＣＴＬＡ４ダイアボディ（ＢｉｏＥ２０５１およびＢｉｏＥ２０５２）のドメイン構造を示す。ダイアボディは、イピリムマブおよび１２１抗体のＶＬおよびＶＨドメインを含み、ＣＴＬＡ４上の２つの独立したエピトープを標的とする。図１０Ｂは、ＢｉｏＥ２０５２の図および配列を示す。図１０Ｃは、ＢｉｏＥ２０５１の図および配列を示す。図１０Ｄは、ｉｐｉ Ｆ（ａｂ’）_２を形成するＢｉｏＥ２０２２およびＢｉｏＥ２０２３の図および配列を示す。図１０Ｅは、ｉｐｉ Ｆａｂ’を形成するＢｉｏＥ２２０１およびＢｉｏＥ２０２３の図および配列を示す。図１０Ｆは、１２１ Ｆ（ａｂ’）_２を形成するＢｉｏＥ２０３３およびＢｉｏＥ２０３４の図および配列を示す。図１０Ｇは、１２１ Ｆａｂ’を形成するＢｉｏＥ２２０２およびＢｉｏＥ２０３４の図および配列を示す。図１０Ｈは、ＢｉｏＥ２０２２とＢｉｏＥ２２０１のＣ末端配列の比較を示す。図１０Ｉは、ＢｉｏＥ２０３３とＢｉｏＥ２２０２のＣ末端配列の比較を示す。 図１０Ａ～図１０Ｉは、種々のダイアボディのドメイン構造および配列を示す。図１０Ａは、例示的な抗ＣＴＬＡ４ダイアボディ（ＢｉｏＥ２０５１およびＢｉｏＥ２０５２）のドメイン構造を示す。ダイアボディは、イピリムマブおよび１２１抗体のＶＬおよびＶＨドメインを含み、ＣＴＬＡ４上の２つの独立したエピトープを標的とする。図１０Ｂは、ＢｉｏＥ２０５２の図および配列を示す。図１０Ｃは、ＢｉｏＥ２０５１の図および配列を示す。図１０Ｄは、ｉｐｉ Ｆ（ａｂ’）_２を形成するＢｉｏＥ２０２２およびＢｉｏＥ２０２３の図および配列を示す。図１０Ｅは、ｉｐｉ Ｆａｂ’を形成するＢｉｏＥ２２０１およびＢｉｏＥ２０２３の図および配列を示す。図１０Ｆは、１２１ Ｆ（ａｂ’）_２を形成するＢｉｏＥ２０３３およびＢｉｏＥ２０３４の図および配列を示す。図１０Ｇは、１２１ Ｆａｂ’を形成するＢｉｏＥ２２０２およびＢｉｏＥ２０３４の図および配列を示す。図１０Ｈは、ＢｉｏＥ２０２２とＢｉｏＥ２２０１のＣ末端配列の比較を示す。図１０Ｉは、ＢｉｏＥ２０３３とＢｉｏＥ２２０２のＣ末端配列の比較を示す。

図１１は、ＣＴＬＡ４上の２つのエピトープを標的とすることにより、ＣＴＬＡ４遮断活性が増大することを示す。抗ＣＴＬＡ４ダイアボディ（ＢｉｏＥ２０５１およびＢｉｏＥ２０５２）は、イピリムマブまたは１２１ ＨｕＩｇＧ１と比較してＣＴＬＡ遮断活性の増大を有する。

図１２は、ＣＴＬＡ４上の２つのエピトープを標的とすることにより、ＣＴＬＡ４遮断活性が増大することを示す。抗ＣＴＬＡ４ダイアボディ（ＢｉｏＥ２０５２）または１２１ ｓｃＦｖ＋Ｉｐｉ ｓｃＦｖの組合せは、イピリムマブまたは１２１ ＨｕＩｇＧ１と比較してＣＴＬＡ遮断活性の増大を有する。

図１３は、抗ＣＴＬＡ４ダイアボディ（ＢｉｏＥ２０５２）が、イピリムマブまたは１２１ ＨｕＩｇＧ１と比較してＣＴＬＡ４遮断活性の増大を有することを示す。

図１４は、イピリムマブと比較した抗ＣＴＬＡ４ダイアボディ（ＢｉｏＥ２０５２）のＣＴＬＡ４遮断活性の増大を示す。

図１５は、抗ＣＴＬＡ４ダイアボディ（ＢｉｏＥ２０５２）が、イピリムマブまたは１２１ ＨｕＩｇＧ１（ＢｉｏＥ２０３２）と比較してＣＴＬＡ４遮断活性の増大を有することを示す。

図１６は、イピリムマブ、Ｉｐｉ ｓｃＦｖ、およびＩｐｉ Ｆ（ａｂ’）_２のＣＴＬＡ４遮断活性を示す。

図１７は、ＢｉｏＥ２０２１（Ｉｐｉ ｓｃＦｖ）、ＢｉｏＥ２０３１（１２１ ｓｃＦｖ）、ＢｉｏＥ２０２２（Ｉｐｉ Ｆ（ａｂ’）_２）、ＢｉｏＥ２０３３（１２１ Ｆ（ａｂ’）_２）、およびイピリムマブのＣＴＬＡ４遮断活性を示す。

図１８は、抗ＣＴＬＡ４ダイアボディ（ＢｉｏＥ２０５２）、ＢｉｏＥ２０２１（Ｉｐｉ ｓｃＦｖ）＋ＢｉｏＥ２０３１（１２１ ｓｃＦｖ）の組合せ、およびＢｉｏＥ２０２２（Ｉｐｉ Ｆ（ａｂ’）_２）＋ＢｉｏＥ２０３３（１２１ Ｆ（ａｂ’）_２）の組合せのＣＴＬＡ４遮断活性を示す。

図１９は、抗ＣＴＬＡ４ダイアボディ（ＢｉｏＥ２０５２）、ＢｉｏＥ２２０１（Ｉｐｉ Ｆａｂ’）、ＢｉｏＥ２２０２（１２１ Ｆａｂ’）、ＢｉｏＥ２２０１（Ｉｐｉ Ｆａｂ’）＋ＢｉｏＥ２２０２（１２１ Ｆａｂ’）の組合せ、およびイピリムマブのＣＴＬＡ４遮断活性を示す。

図２０は、抗ＣＴＬＡ４ダイアボディ（ＢｉｏＥ２０５２（０６９６６））、ＢｉｏＥ２０２２（Ｉｐｉ Ｆ（ａｂ’）_２）、ＢｉｏＥ２０３３（１２１ Ｆ（ａｂ’）_２）、およびイピリムマブのＣＴＬＡ４遮断活性を示す。これらは３連で実施され、データは比として表されている。

図２１は、ＣＴＬＡ４結合性タンパク質（ＢｉｏＥ２０５１、ＢｉｏＥ２０５２、ＢｉｏＥ２０８１、ＢｉｏＥ２０８２、ＢｉｏＥ２０９１、ＢｉｏＥ２０９２、ＢｉｏＥ２１２１、ＢｉｏＥ２０１２、およびイピリムマブ）のＣＴＬＡ４遮断活性を示す。

図２２は、ＣＴＬＡ４結合性タンパク質（ＢｉｏＥ２０２１ Ｉｐｉ ＳｃＦｖ、ＢｉｏＥ２０２２ Ｉｐｉ Ｆ（ａｂ’）_２、ＢｉｏＥ２０５２ Ｉｐｉ１２１－１２１Ｉｐｉ、ＢｉｏＥ２０１２、ＢｉｏＥ２１１１ ＤＡＲＴ、およびイピリムマブ）のＣＴＬＡ４遮断活性を示す。

図２３Ａおよび２３Ｂは、Ｈ２２モデルにおける、ＢｉｏＥ２０５２およびイピリムマブのマウス体重に対する影響を示す。図２３Ａは、ＢｉｏＥ２０５２の、グラム単位で測定された体重に対する影響を示す。図２３Ｂは、ＢｉｏＥ２０５２を用いた処置の間の体重の％変化を示す。

図２４は、Ｈ２２モデルにおける、ＢｉｏＥ２０５２およびイピリムマブの投与の腫瘍体積に対する影響を示す。

図２５Ａ～２５Ｃは、ビヒクル、ＢｉｏＥ２０５２、またはイピリムマブを投与したマウスにおける腫瘍体積の変化を示す。図２５Ａは、ビヒクルを投与したマウスにおける腫瘍体積の変化を示す。図２５Ｂは、ＢｉｏＥ２０５２を投与したマウスにおける腫瘍体積の変化を示す。図２５Ｃは、イピリムマブを投与したマウスにおける腫瘍体積の変化を示す。 図２５Ａ～２５Ｃは、ビヒクル、ＢｉｏＥ２０５２、またはイピリムマブを投与したマウスにおける腫瘍体積の変化を示す。図２５Ａは、ビヒクルを投与したマウスにおける腫瘍体積の変化を示す。図２５Ｂは、ＢｉｏＥ２０５２を投与したマウスにおける腫瘍体積の変化を示す。図２５Ｃは、イピリムマブを投与したマウスにおける腫瘍体積の変化を示す。 図２５Ａ～２５Ｃは、ビヒクル、ＢｉｏＥ２０５２、またはイピリムマブを投与したマウスにおける腫瘍体積の変化を示す。図２５Ａは、ビヒクルを投与したマウスにおける腫瘍体積の変化を示す。図２５Ｂは、ＢｉｏＥ２０５２を投与したマウスにおける腫瘍体積の変化を示す。図２５Ｃは、イピリムマブを投与したマウスにおける腫瘍体積の変化を示す。

図２６は、ＢｉｏＥ２０５２のＣＴＬＡ４への結合についての、重水素交換によって決定されるペプチドカバレッジを示す。

図２７は、ＢｉｏＥ２０５２の存在下で重水素交換を受けやすいＣＴＬＡ４の残基のヒートマップを示す。

図２８Ａは、モノクローナル抗ＣＴＬＡ４抗体ＢｉｏＥ２４２０の試料に対して実施したサイズ排除ＨＰＬＣのクロマトグラムである。

図２８Ｂは、モノクローナル抗ＣＴＬＡ４抗体ＢｉｏＥ２４３０の試料に対して実施したサイズ排除ＨＰＬＣのクロマトグラムである。

図２９Ａは、ＢｉｏＥ２４２０のＣＴＬＡ４機能的遮断アッセイの結果の要約である。

図２９Ｂは、ＢｉｏＥ２４３０のＣＴＬＡ４機能的遮断アッセイの結果の要約である。

詳細な説明
ＣＴＬＡ４に特異的に結合し、予想外のＴ細胞活性化特性を示す操作された抗原結合性タンパク質が本発明で提供される。これらのタンパク質は、ＣＴＬＡ４上の複数のエピトープ、例えば、エピトープ１（^１３４ＭＹＰＰＰＹ^１３９（配列番号１））およびエピトープ２（^６５ＳＩＣＴ^６８（配列番号２））に結合するもの、ならびに抗体のＦｃ領域を欠くＦ（ａｂ’）_２またはダイアボディを包含する。本発明で提供されるバイパラトピック実体は、モノパラトピック対応物（例えば、イピリムマブ）の組合せよりも優れた予想外のＣＴＬＡ４リガンド結合およびＴ細胞活性化の遮断に対する相乗効果を示した。さらに、Ｆｃドメインを欠くＣＴＬＡ結合性タンパク質の活性が、イピリムマブの活性もＦｃドメインを含む他のＣＴＬＡ４結合性抗体の活性も凌ぎ、これは、ＣＴＬＡ４抗体のＦｃ領域とＦｃ受容体の相互作用がＣＴＬＡ４抗体のＣＴＬＡ４遮断活性に重要であるという広く認められている考えに反する（Bulliard et al. (2013) J of Exp Medicine 9: 1685-1693；Waight et al. (2018) Cancer Cell 33: 1033-1047；Ingram et al. (2018) Proc Natl Acad Sci U S A 115: 3912-3917；Vargas et al. (2018) Cancer Cell 33: 1-15）。したがって、操作された抗原結合性タンパク質およびそれを含む医薬組成物には、イピリムマブを凌ぐ臨床的有効性および安全性があることが見込まれる。核酸、ベクター、宿主細胞、コンジュゲート、キット、医薬組成物、および操作された抗原結合性タンパク質を作出する方法が本発明でさらに提供される。さらに、患者（例えば、がんまたはＣＴＬＡ４の発現および／または活性の増大を特徴とする他の疾患を患っている患者）を処置する方法、免疫応答を増大させる方法、がん細胞の増殖を低減させる方法、およびＴ細胞を活性化する方法が本発明で提供される。

定義
「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」という冠詞は、本明細書では、１つ、または１つよりも多く（すなわち、少なくとも１つ）の、その冠詞の文法上の目的語を指すように使用される。例として、「１つの（ａｎ）要素」は、１つの要素または１つよりも多くの要素を意味する。

「抗原提示細胞」という用語は、プロフェッショナル抗原提示細胞（例えば、Ｂリンパ球、単球、樹状細胞、ランゲルハンス 細胞）ならびに他の抗原提示細胞（例えば、ケラチノサイト、内皮細胞、アストロサイト、線維芽細胞、オリゴデンドロサイト）を包含する。

本明細書で使用される場合、「複合抗体」という用語は、２つまたはそれよりも多くの無関係の可変領域由来の生殖細胞系列または非生殖細胞系列免疫グロブリン配列を含む可変領域を有する抗体を指す。さらに、「複合ヒト抗体」という用語は、ヒト生殖細胞系列または非生殖細胞系列免疫グロブリン配列に由来する定常領域と、２つまたはそれよりも多くの無関係のヒト可変領域由来のヒト生殖細胞系列または非生殖細胞系列配列を含む可変領域とを有する抗体を指す。

「共同療法（ｃｏｎｊｏｉｎｔ ｔｈｅｒａｐｙ）」および「併用療法（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｔｈｅｒａｐｙ）」という用語は、本明細書で使用される場合、２種またはそれよりも多くの治療用物質を投与することを指す。併用療法を構成する異なる薬剤は、１種または複数種の治療剤の投与と同時に投与される場合もあり、その前に投与される場合もあり、その後に投与される場合もある。

「検出可能な標識」とは、目的の分子に連結すると、目的の分子を分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、または化学的手段によって検出可能なものにする化合物、物質、または組成物を意味する。例えば、有用な標識としては、放射性同位元素、磁気ビーズ、金属ビーズ、コロイド粒子、蛍光色素、高電子密度試薬、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡにおいて一般に使用される）、ビオチン、ジゴキシゲニン、またはハプテンが挙げられる。

本明細書で使用される場合、「Ｆｃ領域」という用語は、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を記載するために使用され、ネイティブな配列のＦｃ領域およびバリアントＦｃ領域が包含される。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は変動し得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、通常、Ｃｙｓ２２６位のアミノ酸残基から、またはＰｒｏ２３０から、そのカルボキシル末端までにわたると定義される。本発明の抗体に使用するための適したネイティブな配列のＦｃ領域としては、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２（ＩｇＧ２Ａ、ＩｇＧ２Ｂ）、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４が挙げられる。

本明細書で使用される場合、「Ｆｃ受容体」または「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域と結合する受容体を記載するものである。好ましいＦｃＲは、ネイティブな配列のヒトＦｃＲである。さらに、好ましいＦｃＲは、ＩｇＧ抗体（ガンマ受容体）に結合するものであり、これらの受容体の対立遺伝子バリアントおよび選択的スプライシングを受けた形態を含めた、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体を包含する。ＦｃγＲＩＩ受容体には、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）およびＦｃγＲＩＩＢ（「阻害性受容体」）が含まれ、これらは同様のアミノ酸配列を有し、主にその細胞質ドメインが異なる。活性化受容体ＦｃγＲＩＩＡは細胞質ドメインに免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）を含有する。阻害性受容体ＦｃγＲＩＩＢは細胞質ドメインに免疫受容抑制性チロシンモチーフ（ＩＴＩＭ）を含有する（M. Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15: 203-234 (1997)を参照されたい）。ＦｃＲは、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92 (1991)；Capel et al., Immunomethods 4: 25-34 (1994)；およびde Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126: 330-41 (1995)に概説されている。今後同定されるものを含めた他のＦｃＲも本明細書の「ＦｃＲ」という用語に包含される。

抗体は「ヒト化」抗体であってもよく、ヒト化抗体には、ヒト細胞によって作られる抗体によく似たものになるように変更された可変領域および定常領域を有する、非ヒト細胞によって作られた抗体が含まれることが意図されている。例えば、非ヒト抗体アミノ酸配列を、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に見いだされるアミノ酸が組み入れられるように変更することによる。本発明のヒト化抗体は、例えばＣＤＲに、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるランダム変異誘発もしくは部位特異的変異誘発によって、またはｉｎ ｖｉｖｏにおける体細胞変異によって導入された変異）を含み得る。「ヒト化抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖細胞系列に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列に移植された抗体も包含する。

「インターロイキン２（ＩＬ－２）」は、免疫系において機能するサイトカインシグナル伝達分子である。ＩＬ－２タンパク質は、主に活性化Ｔ細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞）によって産生され、免疫に関与する他のＴ細胞およびＢ細胞の活性を調節する（これらの白血球の成長および活性を増大させる）。ＩＬ－２は、がん細胞に対する体の応答を改変する生物学的応答改変因子に分類される。ＩＬ－２の産生により、免疫系に対する広範な免疫調節効果がもたらされ、例えば、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ；Ｔ細胞）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞などの他の免疫細胞の増殖および／または機能活性、リンパ球有糸分裂誘発の増強、リンパ球細胞傷害性、ＮＫ細胞およびリンフォカイン活性化型ＮＫ細胞の誘導、ならびにインターフェロン－γ産生の誘導が増大する（S.L. Gaffen et al., 2004, Cytokine, 28 (3): 109-23）。Ｔ細胞では、ＩＬ－２合成がＴ細胞受容体（ＴＣＲ）からのシグナルおよびＣＤ２８によってｍＲＮＡレベルで密接に調節される。

本明細書で使用される場合、「ＫＤ」という用語は、特定の抗体－抗原相互作用の解離平衡定数を指すものとする。開示される発明の抗体の結合親和性は、標準の抗体－抗原アッセイ、例えば、競合アッセイ、飽和アッセイ、またはＥＬＩＳＡもしくはＲＩＡなどの標準のイムノアッセイによって測定または決定することができる。

核酸は、別の核酸配列と機能的に関連するように置かれている場合、「作動可能に連結」している。例えば、プロモーターまたはエンハンサーは、コード配列の転写に影響を及ぼす場合、そのコード配列と作動可能に連結している。転写調節配列に関して、作動可能に連結しているとは、連結しているＤＮＡ配列が、連続しており、２つのタンパク質コード領域を接合する必要がある場合、連続しており、かつ読み枠内に入っていることを意味する。スイッチ配列に関しては、作動可能に連結しているとは、それらの配列によりスイッチ組換えをもたらすことが可能であることを示す。

「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔ）」、「予防すること（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」、「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」、「予防的処置（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」などの用語は、疾患、障害、または状態を有していないが、それが発生するリスクがあるまたは発生しやすい対象において疾患、障害、または状態が発生する確率を低減させることを指す。

「寛解」という用語は当技術分野において認められており、がんの徴候および症状が低減している状態を指す。

「選択的」という用語は、優先的な作用または機能を指す。「選択的」という用語は、特定の目的の標的における他の標的と比べた優先的な効果という観点から数量化することができる。例えば、測定される変数（例えば、ＣＴＬＡ４結合性タンパク質の結合またはＣＴＬＡ４遮断活性）が、目的の標的において、意図されたものではないまたは望ましくない標的と比して１０％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１倍、１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、５．５倍、６倍、６．５倍、７倍、７．５倍、８倍、８．５倍、９倍、９．５倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍、２０倍、２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍、５５倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、またはそれよりも大きく、または包括的にこれらの間の任意の範囲で（例えば、５０％～１６倍）、異なる。同じ倍率解析を使用して、所与の組織、細胞集団、測定される変数、測定される効果などにおける効果の大きさを確認することができる。

対照的に、「特異的」という用語は、排他的な作用または機能を指す。例えば、抗体または抗原結合性タンパク質の所定の抗原への特異的結合は、抗体または抗原結合性タンパク質の、他の抗原には結合せずに目的の抗原に結合する能力を指す。一般には、抗体は、所定の抗原におよそ１×１０^－７Ｍ未満、例えば、およそ１０^－８Ｍ未満、およそ１０^－９Ｍ未満、およそ１０^－１０Ｍ未満、およそ１０^－１１Ｍ未満、またはさらに小さい親和性（Ｋ_Ｄ）で結合し、親和性は、所定の抗原または密接に関連する抗原以外の非特異的抗原（例えば、ＢＳＡ、カゼイン）への結合の親和性の少なくとも１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２．０倍、２．５倍、３．０倍、３．５倍、４．０倍、４．５倍、５．０倍、６．０倍、７．０倍、８．０倍、９．０倍、または１０．０倍であるまたはそれよりも大きい。

「感作する」という用語は、がん細胞または腫瘍細胞などの細胞を、治療（例えば、ＣＴＬＡ４結合性タンパク質）を用いたより有効な処置が可能になるように変更することを意味する。一部の実施形態では、正常な細胞は、治療（例えば、ＣＴＬＡ４結合性タンパク質）によって正常な細胞が過度に傷害を受けるまでの影響は受けない。治療的処置に対する感受性の増大または感受性の低減は、これだけに限定されないが、細胞増殖アッセイ（Tanigawa N, Kern D H, Kikasa Y, Morton D L, Cancer Res 1982; 42: 2159-2164）、細胞死アッセイ（Weisenthal L M, Shoemaker R H, Marsden J A, Dill P L, Baker J A, Moran E M, Cancer Res 1984; 94: 161-173；Weisenthal L M, Lippman M E, Cancer Treat Rep 1985; 69: 615-632；Weisenthal L M, In: Kaspers G J L, Pieters R, Twentyman P R, Weisenthal L M, Veerman A J P, eds. Drug Resistance in Leukemia and Lymphoma. Langhorne, P A：Harwood Academic Publishers, 1993: 415-432；Weisenthal L M, Contrib Gynecol Obstet 1994; 19: 82-90）を含めた、特定の処置について当技術分野において公知の方法および本明細書において下に記載されている方法によって測定される。感受性または抵抗性を、動物において、ある期間、例えば、ヒトについては６カ月およびマウスについては４～６週間にわたって腫瘍サイズの低減を測定することによって測定することもできる。組成物または方法による処置感受性の増大または抵抗性の低減が、そのような組成物または方法の非存在下での処置感受性または抵抗性と比較して、５％またはそれよりも大きい、例えば、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、またはそれよりも大きい、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍またはそれよりも大きい場合、その組成物または方法は、治療的処置に対する応答を感作するものである。治療的処置に対する感受性または抵抗性の決定は当技術分野では常套的なものであり、普通の熟練臨床医の技能の範囲内に入る。ＣＴＬＡ４結合性タンパク質の有効性を増強するための本明細書に記載の任意の方法を、過剰増殖性または他の点でがん性である細胞（例えば、抵抗性細胞）を治療に対して感作させるための方法に等しく適用することができることが理解されるべきである。

本明細書で使用される場合、「対象」は、任意の健康な動物、哺乳動物もしくはヒト、またはがんを患っている任意の動物、哺乳動物もしくはヒトを指す。「対象」という用語は「患者」と互換性がある。

「相乗効果」という用語は、２種またはそれよりも多くの治療剤、例えば、２種またはそれよりも多くのＣＴＬＡ４経路モジュレーターの、ＣＴＬＡ４経路モジュレーター単独で、または別のがん治療と組み合わせてのいずれかで、個々の薬剤単独での別々の効果の合計よりも大きくなり得る、組み合わさった効果を指す。本明細書で使用される場合、相乗効果は、２つまたはそれよりも多くの結合性部分を含む単一のＣＴＬＡ４結合性タンパク質の効果を指すためにも使用され得、その場合、効果（例えば、生物学的効果または治療効果）は、個々の結合性部分の別々の効果の合計よりも大きい。

ＴｃｏｎまたはＴｅｆｆとしても公知の従来のＴ細胞は、１つまたは複数のＴ細胞受容体を発現することによって、免疫応答を増大させるエフェクター機能（例えば、サイトカイン分泌、細胞傷害活性、抗自己認識など）を有する。ＴｃｏｎまたはＴｅｆｆは、一般に、Ｔｒｅｇではない任意のＴ細胞集団と定義され、例えば、ナイーブＴ細胞、活性化Ｔ細胞、メモリーＴ細胞、休止Ｔｃｏｎ、または、例えばＴｈ１もしくはＴｈ２系列に分化したＴｃｏｎが含まれる。一部の実施形態では、Ｔｅｆｆは、非Ｔｒｅｇ Ｔ細胞のサブセットである。一部の実施形態では、Ｔｅｆｆは、ＣＤ４＋ＴｅｆｆまたはＣＤ８＋Ｔｅｆｆ、例えば、ＣＤ４＋ヘルパーＴリンパ球（例えば、Ｔｈ０、Ｔｈ１、Ｔｆｈ、またはＴｈ１７）およびＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球である。本明細書にさらに記載されている通り、細胞傷害性Ｔ細胞は、ＣＤ８＋Ｔリンパ球である。「ナイーブＴｃｏｎ」は、骨髄において分化し、胸腺における中心的選択の正のプロセスおよび負のプロセスを首尾よく受けたものであるが、抗原への曝露による活性化をまだ受けていないＣＤ４^＋Ｔ細胞である。ナイーブＴｃｏｎは、一般に、Ｌ－セレクチン（ＣＤ６２Ｌ）の表面発現、ＣＤ２５、ＣＤ４４またはＣＤ６９などの活性化マーカーの非存在、およびＣＤ４５ＲＯなどのメモリーマーカーの非存在を特徴とする。したがって、ナイーブＴｃｏｎは、静止しており、非分裂性であり、恒常的生存のためにインターロイキン－７（ＩＬ－７）およびインターロイキン－１５（ＩＬ－１５）を必要とすると考えられている（少なくともＷＯ２０１０／１０１８７０を参照されたい）。そのような細胞の存在および活性は、免疫応答の抑制に関しては望ましくない。Ｔｒｅｇとは異なり、Ｔｃｏｎはアネルギー性ではなく、抗原に基づくＴ細胞受容体活性化に応答して増殖し得る（Lechler et al. (2001) Philos. Trans. R. Soc. Lond. Biol. Sci. 356: 625-637）。腫瘍では、消耗した細胞がアネルギーの特質を示し得る。

「治療効果」という用語は、薬理活性のある物質によって引き起こされる、動物、特に哺乳動物、より詳細にはヒトにおける局所または全身効果を指す。したがって、この用語は、疾患の診断、治癒、緩和、処置もしくは予防における使用、または、動物もしくはヒトにおける望ましい身体的もしくは精神的発達および状態の増強における使用が意図された任意の物質を意味する。

「治療有効量」および「有効量」という用語は、本明細書で使用される場合、本開示に包含される化合物、材料、または化合物を含む組成物の、動物の少なくとも細胞の亜集団において、任意の医学的処置に適用可能な合理的なベネフィット／リスク比でいくらかの所望の治療効果を生じさせるために有効な量を意味する。主題の化合物の毒性および治療有効性は、例えば、ＬＤ_５０およびＥＤ_５０を決定するための、細胞培養物または実験動物に対する標準の薬学的手順によって決定することができる。大きな治療指数を示す組成物が好ましい。一部の実施形態では、ＬＤ_５０（致死薬量）を測定することができ、ＬＤ_５０は、薬剤について、薬剤を投与しない場合と比べて、例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％またはそれよりも大きく減少し得る。同様に、ＥＤ_５０（すなわち、症状の最大半量の阻害が実現される濃度）を測定することができ、ＥＤ_５０は、薬剤について、薬剤を投与しない場合と比べて、例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％またはそれよりも大きく増大し得る。また、同様に、ＩＣ_５０（すなわち、がん細胞に対する最大半量の細胞傷害性または細胞増殖抑制性効果が実現される濃度）を測定することができ、ＩＣ_５０は、薬剤について、薬剤を投与しない場合と比べて、例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％またはそれよりも大きく増大し得る。一部の実施形態では、アッセイにおけるがん細胞の成長が、少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはさらには１００％阻害され得る。がん細胞死が少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはさらには１００％促進され得る。別の実施形態では、がん細胞数および／または固形悪性腫瘍の少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはさらには１００％の減少を実現することができる。

ＣＴＬＡ４、エピトープ、およびイピリムマブ
Ｔ細胞は、ＣＤ４（ヘルパー）およびＣＤ８（細胞傷害性）のどちらも、病原体および腫瘍に対する適応免疫応答、ならびに複雑なプロセスを構成する特定のＴ細胞活性化および動員に寄与する。Ｔ細胞が、十分に活性化された状態になる（続いて増殖し、エフェクター機能を媒介する）ためには、少なくとも２種の受容体－リガンド相互作用が必要である。これらのうち第１の相互作用は、Ｔ細胞の独特の受容体がその同類のリガンド、ＭＨＣ分子に関して提示される短いペプチドを認識すると生じる。この相互作用は絶妙に特異的であり、良好な適合が生じるとＴ細胞活性化が開始される。しかし、ＣＤ４またはＣＤ８Ｔ細胞の十分な活性化には、ペプチド／ＭＨＣを発現するものと同じ抗原提示細胞上に提示される共刺激分子によって伝達される第２のシグナルが必要である。この第２のシグナルは、共刺激分子（Ｂ７－１（ＣＤ８０）および／またはＢ７－２（ＣＤ８６））からＣＤ２８として公知のＴ細胞上の受容体まで伝達される。両方のシグナルが受けとられ、組み込まれた場合にのみ、特定のＴ細胞が増殖し、エフェクター機能を獲得し、抗原発現部位に移動する。

ＣＴＬＡ４は、ＣＤ２８のホモログであり、これにより、ＣＴＬＡ４が共刺激分子としてＣＤ２８と一緒に機能し得ることが示唆される。しかし、いくつかの他の試験では対立する結果がもたらされており、ＣＴＬＡ４により刺激または阻害シグナルがＴ細胞に伝達されるかどうかは、しばらくの間不明であった。ＣＴＬＡ４を欠くマウスの生成によってこの難問の解決法がもたらされた：ノックアウトマウスでは活性化Ｔ細胞の進行性の蓄積が発生し、生後約３～４週間でリンパ増殖性疾患によって死亡した。これらおよび他の結果から、モノクローナル抗体を用いてＣＴＬＡ４を遮断することにより、感染因子または発展している腫瘍に対する適応免疫応答が強化されることが示唆された。その後の試験では、ＣＴＬＡ４遮断により、いくつかの埋め込まれたマウス腫瘍の成長が弱まり得ることが示された。

ＣＴＬＡ４（ＣＤ１５２としても公知）は、免疫チェックポイントとして機能し、免疫応答をダウンレギュレートするタンパク質受容体である。ＣＴＬＡ４は、調節性Ｔ細胞では構成的に発現されるが、従来のＴ細胞では、当該Ｔ細胞が活性化されないとアップレギュレートされない－この現象はがんにおいて特に注目すべきものである。ＣＴＬＡ４は、抗原提示細胞の表面上のＣＤ８０またはＣＤ８６に結合した場合、「オフ」スイッチとして作用する。したがって、ＣＴＬＡ４は、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであり、阻害シグナルをＴ細胞に伝達するタンパク質をコードする。

このタンパク質は、細胞外Ｖドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質尾部を含有する。異なるアイソフォームをコードする代替の転写スプライスバリアントが特徴付けられている。膜結合型アイソフォームはジスルフィド結合によって相互接続したホモ二量体として機能し、一方、可溶性アイソフォームは単量体として機能する。細胞内ドメインは、内因性触媒活性を有さず、また、ＰＩ３Ｋ、ＰＰ２ＡおよびＳＨＰ－２に結合することができるＹＶＫＭモチーフを１つ、およびＳＨ３含有タンパク質に結合することができるプロリンリッチモチーフを１つ含有するという点で、ＣＤ２８の細胞内ドメインと類似している。Ｔ細胞応答の阻害におけるＣＴＬＡ４の第１の役割は、ＣＤ３およびＬＡＴなどのＴＣＲ近位シグナル伝達タンパク質のＳＨＰ－２およびＰＰ２Ａ脱リン酸化による、直接的なものであると思われる。ＣＴＬＡ４はまた、ＣＤ２８とＣＤ８０／８６結合について競合することにより、間接的にもシグナル伝達に影響を及ぼし得る。ＣＴＬＡ４はまた、ＰＩ３Ｋにも結合し得るが、この相互作用の重要性および結果は不確かである。ＣＴＬＡ４は、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＴＸＮ３、ＭＡＬＬ、ＰＩＫ３Ｒ１、およびＴＭＥＭ２１８などの種々のタンパク質と相互作用することが分かっている。

ＣＴＬＡ４の変異はインスリン依存性糖尿病、グレーブス病、橋本甲状腺炎、小児脂肪便症、全身性エリテマトーデス、甲状腺眼症、および他の自己免疫疾患に関連付けられている。

ヒトおよび他の生物体におけるＣＴＬＡ４の核酸配列およびポリペプチド配列は周知であり、それらには、例えば、ヒトＣＴＬＡ４（ＮＭ＿００１０３７６３１．３→ＮＰ＿００１０３２７２０．１細胞傷害性Ｔリンパ球タンパク質４アイソフォームＣＴＬＡ－４ｄｅｌＴＭ；ＮＭ＿００５２１４．５→ＮＰ＿００５２０５．２細胞傷害性Ｔリンパ球タンパク質４アイソフォームＣＴＬＡ４－ＴＭ前駆体）、マウスＣＴＬＡ４（ＮＭ＿００１２８１９７６．１→ＮＰ＿００１２６８９０５．１細胞傷害性Ｔリンパ球タンパク質４アイソフォーム２前駆体；ＮＭ＿００９８４３．４→ＮＰ＿０３３９７３．２細胞傷害性Ｔリンパ球タンパク質４アイソフォーム１前駆体）、およびラット（ＮＭ＿０３１６７４．１→ＮＰ＿１１３８６２．１細胞傷害性Ｔリンパ球タンパク質４前駆体）が含まれる。代表的な核酸配列およびポリペプチド配列を以下の表１に開示する。

ヤーボイ（Ｙｅｒｖｏｙ）という商品名で販売されているイピリムマブは、免疫系をダウンレギュレートするタンパク質受容体であるＣＴＬＡ４を標的とすることによって免疫系を活性化する機能を果たすモノクローナル抗体薬である。イピリムマブは、ＣＴＬＡ４とそのリガンドの相互作用を遮断する。上記の通り、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）は、がん細胞を認識し、破壊し得る。しかし、阻害機構によってこの破壊が妨げられる。イピリムマブは、この阻害機構をオフにし、がん細胞に対する体の免疫応答をブーストする。

イピリムマブは、ＣＴＬＡ４のエピトープ１（^１３４ＭＹＰＰＰＹ^１３９（配列番号１））に結合する。Ｔｙｒ１３９を含むＭＹＰＰＰＹモチーフは、ＣＴＬＡ４とその免疫賦活性パラログＣＤ２８の両方にわたって高度に保存されており、ＣＤ８０およびＣＴＬＡ４阻害剤イピリムマブの両方との直接接触面となる。本明細書および米国特許第７，０３４，１２１号Ｂ２に記載されている他の抗体、例えば、マウス２６抗体またはヒト化１２１抗体は、ＣＴＬＡ４のエピトープ２（^６５ＳＩＣＴ^６８（配列番号２））に結合する。これらのエピトープの重要性は本開示以前には知られていなかった。

イピリムマブは、黒色腫（例えば、成人および小児患者における切除不能なまたは転移性黒色腫）、腎細胞癌（ＲＣＣ）、結腸直腸がん、肝細胞癌、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、および悪性胸膜中皮腫の処置に関して米国食品医薬品局（ＦＤＡ）による承認を受けている。イピリムマブはまた、ＰＤ－１を標的とするニボルマブと組み合わせても有効である。

イピリムマブ治療は有効である一方で、主要な欠点として、Ｔ細胞活性化および増殖に起因する重症の潜在的に致死的な免疫学的有害作用が伴い、これは患者の１０～２０パーセントで生じる。重篤な有害作用としては、胃痛、鼓腸、便秘、下痢、発熱、呼吸困難、および排尿の問題が挙げられる。イピリムマブを用いた処置を受けた個体の５．７％から９．１％の間で、チェックポイント阻害剤により誘導された大腸炎が発生する。急性炎症性脱髄性多発ニューロパチーおよび上行性の運動麻痺、ならびに重症筋無力症を含めた、イピリムマブ後の重症神経性障害の個々の症例が観察されている。

抗原結合性タンパク質
ＣＴＬＡ４に結合する抗原結合性タンパク質が本発明で提供される。本開示の抗原結合性タンパク質は当技術分野で公知の抗原結合性タンパク質の多くの形態のうちの任意の１つを取り得る。種々の実施形態では、本開示の抗原結合性タンパク質は、抗体、または抗原結合性抗体断片、または抗体タンパク質作製物の形態を取る。

本開示の種々の実施形態では、抗原結合性タンパク質は、抗体またはその断片を含む、それから本質的になる、またはそれからなる。本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、重鎖と軽鎖とを含み、可変領域と定常領域とを含む従来の免疫グロブリンフォーマットを有するタンパク質を指す。例えば、抗体は、ＩｇＧであり、これは、各対が１本の「軽鎖」（一般には約２５ｋＤａの分子量を有する）と１本の「重鎖」（一般には約５０～７０ｋＤａの分子量を有する）とを有する２つの同一のポリペプチド鎖対を持つ「Ｙ形」構造である。抗体は、可変領域と定常領域とを有する。ＩｇＧフォーマットでは、可変領域は、一般に、約１００～１１０アミノ酸またはそれよりも多くのアミノ酸であり、抗原認識に主に関与し、異なる抗原に結合する他の抗体の間で実質的に変動する３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。抗体に基づく抗原結合性タンパク質は、抗体のＣＤＲを含むが、他の領域（例えば、定常領域）は必ずしも含まない。定常領域は、抗体が免疫系の細胞および分子を動員することを可能にするものである。可変領域は軽鎖および重鎖それぞれのＮ末端領域で構成され、一方、定常領域は、重鎖および軽鎖それぞれのＣ末端部分で構成される。（Janeway et al., "Structure of the Antibody Molecule and the Immunoglobulin Genes", Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 4^th ed. Elsevier Science Ltd./Garland Publishing, (1999)）。

抗体のＣＤＲの一般構造および特性は当技術分野において記載されている。簡単に述べると、抗体足場において、重鎖および軽鎖可変領域においてＣＤＲがフレームワークの中に埋め込まれており、抗原結合および認識に大きく関与する領域を構成する。可変領域は、一般には、フレームワーク領域（Kabat et al., 1991によりフレームワーク領域１～４、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４と名付けられている；Chothia and Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196: 901-917；Chothia et al., 1989, Nature 342: 877-883も参照されたい）内に少なくとも３つの重鎖または軽鎖ＣＤＲを含む（Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Public Health Service N.I.H., Bethesda, Md.；Chothia and Lesk, 1987、上記も参照されたい）。

ＣＤＲは、相補性決定領域（ＣＤＲ）を指し、そのうちの３つが軽鎖可変領域の結合特徴を構成し（ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２およびＣＤＲ－Ｌ３）、３つが重鎖可変領域の結合特徴を構成する（ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２およびＣＤＲ－Ｈ３）。ＣＤＲは、抗体分子の機能活性に寄与し、足場またはフレームワーク領域を含むアミノ酸配列によって分離されている。正確な定義上のＣＤＲの境界および長さは、異なる分類および番号付け方式によって左右される。したがって、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、接触または任意の他の境界定義によって称され得る。境界が異なるにもかかわらず、これらの方式のそれぞれで、可変配列内のいわゆる「超可変領域」を何が構成するかがある程度重複する。したがって、これらの方式に従ったＣＤＲ定義は、長さおよび隣接するフレームワーク領域に対する境界領域が異なり得る。例えば、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、および／またはＭａｃＣａｌｌｕｍらを参照されたい（Kabat et al., in "Sequences of Proteins of Immunological Interest", 5th Edition, U.S. Department of Health and Human Services, 1992; Chothia et al. (1987) J. Mol. Biol. 196, 901；およびMacCallum et al., J. Mol. Biol. (1996) 262, 732、そのそれぞれの全体が参照によって組み込まれる）。

抗体は当技術分野で公知の任意の定常領域を含み得る。ヒト軽鎖は、カッパ軽鎖およびラムダ軽鎖に分類される。重鎖は、ミュー、デルタ、ガンマ、アルファ、またはイプシロンに分類され、これにより抗体のアイソタイプがそれぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥに規定される。ＩｇＧには、これだけに限定されないが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含めたいくつかのサブクラスがある。ＩｇＭには、これだけに限定されないが、ＩｇＭ１およびＩｇＭ２を含めたサブクラスがある。本開示の実施形態は、抗体のそのようなクラスまたはアイソタイプを全て包含する。軽鎖定常領域は、例えば、カッパ型またはラムダ型軽鎖定常領域、例えば、ヒトカッパ型またはラムダ型軽鎖定常領域であり得る。重鎖定常領域は、例えば、アルファ型、デルタ型、イプシロン型、ガンマ型、またはミュー型重鎖定常領域、例えば、ヒトアルファ型、デルタ型、イプシロン型、ガンマ型、またはミュー型重鎖定常領域であり得る。したがって、種々の実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４のうちの任意の１つを含め、アイソタイプＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、またはＩｇＭの抗体である。種々の態様では、抗体は、半減期／安定性を改善するため、または抗体を発現／製造可能性により適するものにするために、天然に存在する対応物と比べて１つまたは複数のアミノ酸改変を含む定常領域を含む。種々の場合では、抗体は、天然に存在する対応物に存在するＣ末端Ｌｙｓ残基が除去または短縮された定常領域を含む。

抗体は、モノクローナル抗体であり得る。一部の実施形態では、抗体は、哺乳動物、例えば、マウス、ウサギ、ヤギ、ウマ、ニワトリ、ハムスター、ヒトなどによって産生される天然に存在する抗体と実質的に同様の配列を含む。この点について、抗体は、哺乳動物抗体、例えば、マウス抗体、ウサギ抗体、ヤギ抗体、ウマ抗体、ニワトリ抗体、ハムスター抗体、ヒト抗体などとみなすことができる。ある特定の態様では、抗原結合性タンパク質は、ヒト抗体などの抗体である。ある特定の態様では、抗原結合性タンパク質は、キメラ抗体またはヒト化抗体である。「キメラ抗体」という用語は、２種またはそれよりも多くの異なる抗体由来のドメインを含有する抗体を指す。キメラ抗体は、例えば、１つの種由来の定常ドメインと第２の種由来の可変ドメインとを含有し得る、または、より一般的には、少なくとも２つの種由来のアミノ酸配列のひと続きを含有し得る。キメラ抗体はまた、同じ種内の２種またはそれよりも多くの異なる抗体のドメインも含有し得る。「ヒト化」という用語は、抗体に関して使用される場合、元々の供給源抗体よりも真のヒト抗体と同様の構造および免疫学的機能を有するように操作された非ヒト供給源由来のＣＤＲ領域を少なくとも有する抗体を指す。例えば、ヒト化には、マウス抗体などの非ヒト抗体由来のＣＤＲをヒト抗体に移植することが伴い得る。ヒト化には、非ヒト配列がヒト配列とより同様になるようにアミノ酸置換を選択することも伴い得る。ヒト抗体重鎖および軽鎖定常領域の配列情報を含めた情報はＵｎｉｐｒｏｔデータベースならびに抗体工学および産生の当業者に周知の他のデータベースを通じて公的に入手可能である。例えば、ＩｇＧ２定常領域は、ＵｎｉｐｒｏｔデータベースからＵｎｉｐｒｏｔ番号Ｐ０１８５９として入手可能であり、参照により本明細書に組み込まれる。

抗体を、酵素、例えば、パパインおよびペプシンなどによって切断して断片にすることができる。パパインは、抗体を切断して２つのＦａｂ’断片と単一のＦｃ断片を生じさせる。ペプシンは、抗体を切断してＦ（ａｂ’）_２断片とｐＦｃ’断片を生じさせる。本開示の種々の態様では、本開示の抗原結合性タンパク質は、抗体の抗原結合性断片（別名、抗原結合性抗体断片、抗原結合性断片、抗原結合性部分）である。種々の場合では、抗原結合性抗体断片は、Ｆａｂ’断片またはＦ（ａｂ’）_２断片である。

抗体のアーキテクチャを活用して、分子量範囲が少なくとも約１２～１５０ｋＤａに及び、結合価（ｎ）が単量体（ｎ＝１）から、二量体（ｎ＝２）まで、三量体（ｎ＝３）まで、四量体（ｎ＝４）まで、および潜在的により高次までにわたる、拡大する範囲の代替抗体フォーマットが創出されている。そのような代替抗体フォーマットは、本明細書では「抗体タンパク質作製物」と称される。抗体タンパク質作製物は、完全な抗体構造に基づくもの、および十分な抗原結合能を保持する抗体断片、例えば、ｓｃＦｖ、ＦａｂおよびＶＨＨ／ＶＨ（以下に考察する）を模倣するものを包含する。完全な抗原結合性部位を保持する最小の抗原結合性断片はＦｖ断片であり、これは、可変（Ｖ）領域全体からなる。分子の安定化のためにＶ領域とｓｃＦｖ（可変単鎖断片）断片を接続するため、または定常（Ｃ）ドメインをＶ領域に付加してＦａｂ’断片を生成するために、可溶性の柔軟なアミノ酸ペプチドリンカーが使用される。ｓｃＦｖおよびＦａｂ’断片はどちらも宿主細胞、例えば、原核生物宿主細胞において容易に産生させることができる。他の抗体タンパク質作製物としては、ジスルフィド結合によって安定化されたｓｃＦｖ（ｄｓ－ｓｃＦｖ）、単鎖Ｆａｂ’（ｓｃＦａｂ’）、ならびに、ダイアボディ、トリアボディ、およびテトラボディなどの二量体および多量体抗体フォーマット、またはオリゴマー形成ドメインと連結したｓｃＦｖからなる異なるフォーマットを含むミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）（ｍｉｎｉＡｂ）が挙げられる。最小の断片は、ラクダ科動物重鎖Ａｂならびに単一ドメインＡｂ（ｓｄＡｂ）のＶＨＨ／ＶＨである。新規の抗体フォーマットを創出するために最も頻繁に使用される構成単位は、単鎖可変（Ｖ）ドメイン抗体断片（ｓｃＦｖ）であり、これは、約１５アミノ酸残基のペプチドリンカーによって連結した重鎖由来のＶドメインと軽鎖由来のＶドメイン（ＶＨドメインとＶＬドメイン）を含む。さらに別の抗体タンパク質作製物は、ペプチボディ（ｐｅｐｔｉｂｏｄｙ）またはペプチド－Ｆｃ融合物である。ペプチボディの構造は、Ｆｃドメインに移植された生物学的に活性なペプチドからなる。ペプチボディは当技術分野において十分に記載されている。例えば、Shimamoto et al., mAbs 4 (5): 586-591 (2012)を参照されたい。

他の抗体タンパク質作製物としては、単鎖抗体（ＳＣＡ）；ダイアボディ；トリアボディ；テトラボディなどが挙げられる。

種々の態様では、本開示の抗原結合性タンパク質は、これらの抗体タンパク質作製物のうちのいずれか１つを含む、それから本質的になる、またはそれからなる。種々の態様では、本開示の抗原結合性タンパク質は、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、ＶＨＨ／ＶＨ、Ｆｖ断片、ｄｓ－ｓｃＦｖ、ｓｃＦａｂ’、ハーフ抗体（ｈａｌｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ）－ｓｃＦｖ、ヘテロ二量体Ｆａｂ／ｓｃＦｖ－Ｆｃ、ヘテロ二量体ｓｃＦｖ－Ｆｃ、ヘテロ二量体ＩｇＧ（ＣｒｏｓｓＭａｂ）、タンデムｓｃＦｖ、タンデムバイパラトピックｓｃＦｖ、Ｆａｂ／ｓｃＦｖ－Ｆｃ、タンデムＦａｂ’、単鎖ダイアボディ、二量体抗体、多量体抗体（例えば、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ）、ミニＡｂ、ラクダ科動物重鎖抗体のペプチボディＶＨＨ／ＶＨ、ｓｄＡｂ、ダイアボディ（単鎖ダイアボディ、ホモ二量体ダイアボディ、ヘテロ二量体ダイアボディ、タンデムダイアボディ（ＴａｎｄＡｂ）、自己二量体化するダイアボディ）、トリアボディ、テトラボディのうちのいずれか１つを含む、それから本質的になる、またはそれからなる。任意の二重特異性抗原結合性タンパク質フォーマットを使用して、バイパラトピック抗原結合性タンパク質フォーマットを生成することができることが当業者には理解されよう。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質は、二重親和性再標的化抗体（ｄｕａｌ－ａｆｆｉｎｉｔｙ ｒｅ－ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ）（ＤＡＲＴ）である。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質は、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ－ｃｅｌｌ ｅｎｇａｇｅｒ）（ＢｉＴＥ）である。

種々の態様では、本開示の抗原結合性タンパク質を薬剤と連結する。下記の通り、薬剤は、これだけに限定されないが、化学療法剤、サイトカインおよび増殖因子、細胞傷害剤、検出可能な薬剤（例えば、フルオレセイン）などを含めた、当技術分野において公知の任意のものであり得る。

本発明で提供される抗原結合性タンパク質は、ＣＴＬＡ４に非共有結合性かつ可逆的な様式で結合する。種々の実施形態では、抗原結合性タンパク質のＣＴＬＡ４に対する結合強度を、抗原結合性タンパク質の結合性部位とエピトープの相互作用の強度の評価基準である親和性という観点から記載することができる。種々の態様では、本発明で提供される抗原結合性タンパク質は、ＣＴＬＡ４に対して高い親和性を有し、したがって、親和性が低い抗原結合性タンパク質よりも多くの量のＣＴＬＡ４がより短い期間で結合する。種々の態様では、抗原結合性タンパク質の平衡会合定数Ｋ_Ａは、少なくとも１０^５ｍｏｌ^－１、少なくとも１０^６ｍｏｌ^－１、少なくとも１０^７ｍｏｌ^－１、少なくとも１０^８ｍｏｌ^－１、少なくとも１０^９ｍｏｌ^－１、または少なくとも１０^１０ｍｏｌ^－１である。当業者には理解される通り、Ｋ_Ａは、ｐＨ、温度および緩衝剤の組成を含めた因子の影響を受ける可能性がある。

種々の実施形態では、抗原結合性タンパク質のＣＴＬＡ４に対する結合強度を、感受性という観点から記載することができる。Ｋ_Ｄは平衡解離定数であり、抗原結合性タンパク質とＣＴＬＡ４の間のｋ_ｏｆｆ／ｋ_ｏｎ比である。Ｋ_ＤおよびＫ_Ａは反比例する。Ｋ_Ｄ値は、抗原結合性タンパク質の濃度（特定の実験に必要な抗原結合性タンパク質の量）に関し、したがって、Ｋ_Ｄ値が低い（濃度が低い）ほど、抗原結合性タンパク質の親和性が高い。種々の態様では、抗原結合性タンパク質のＣＴＬＡ４に対する結合強度を、Ｋ_Ｄという観点から記載することができる。種々の態様では、本発明で提供される抗原結合性タンパク質のＫ_Ｄは、約１０^－１、約１０^－２、約１０^－３、約１０^－４、約１０^－５、約１０^－６、またはそれ未満である。種々の態様では、本発明で提供される抗原結合性タンパク質のＫ_Ｄは、マイクロモル、ナノモル、ピコモルまたはフェムトモルである。種々の態様では、本発明で提供される抗原結合性タンパク質のＫ_Ｄは、約１０^－４～１０^－６または１０^－７～１０^－９または１０^－１０～１０^－１２または１０^－１３～１０^－１５の範囲内に入る。種々の態様では、本発明で提供される抗原結合性タンパク質のＫ_Ｄは、約１．０×１０^－１２Ｍ～約１．０×１０^－８Ｍの範囲内に入る。種々の態様では、抗原結合性タンパク質のＫ_Ｄは、約１．０×１０^－１１Ｍ～約１．０×１０^－９Ｍの範囲内に入る。

種々の態様では、抗原結合性タンパク質の親和性を、フローサイトメトリー－または蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）に基づくアッセイを使用して測定または順位付けする。フローサイトメトリーに基づく結合アッセイは当技術分野で公知である。例えば、Cedeno-Arias et al., Sci Pharm 79 (3): 569-581 (2011)；Rathanaswami et al., Analytical Biochem 373: 52-60 (2008)；およびGeuijen et al., J Immunol Methods 302 (1-2): 68-77 (2005)を参照されたい。種々の態様では、抗原結合性タンパク質の親和性を、Trikha et al., Int J Cancer 110: 326-335 (2004)およびTam et al., Circulation 98 (11): 1085-1091 (1998)ならびに以下に記載されている通り、競合アッセイを使用して測定または順位付けする。

結合力は、抗原結合性タンパク質－抗原複合体の全体的な強度の評価基準をもたらすものである。結合力は、３つの主要なパラメータに依存する：抗原結合性タンパク質のエピトープに対する親和性、抗原結合性タンパク質およびＣＴＬＡ４の両方の結合価、ならびに相互作用する部分の構造的配置。抗原結合性タンパク質の結合価が大きいほど（抗原結合性部位の数が多いほど）、抗原結合性タンパク質が結合し得る抗原（ＣＴＬＡ４）の量が増す。種々の態様では、抗原結合性タンパク質はＣＴＬＡ４に対して強力な結合力を有する。種々の態様では、抗原結合性タンパク質は多価である。種々の態様では、抗原結合性タンパク質は二価である。種々の場合では、抗原結合性タンパク質は一価である。

ある特定の態様では、ＣＴＬＡ４上の複数のエピトープに特異的に結合する操作された抗原結合性タンパク質が本発明で提供される。

一部の実施形態では、操作された抗原結合性タンパク質は、ＣＴＬＡ４の残基^１３４ＭＹＰＰＰＹ^１３９（配列番号１）によって定義されるエピトープ１および残基^６５ＳＩＣＴ^６８（配列番号２）によって定義されるエピトープ２に特異的に結合する。

一部の実施形態では、操作された抗原結合性タンパク質は、表３に列挙されているＶＨ配列からなる群から選択されるＶＨ配列に対してａ）少なくとももしくは約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、もしくは１００％の同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列；および／またはｂ）表３に列挙されているＶＬ配列からなる群から選択されるＶＬ配列に対して少なくとももしくは約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または１００％の同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列を含む。

一部の実施形態では、操作された抗原結合性タンパク質は、配列番号９、１０、１２、１４、１５、１７、１９、２０～２４、２７、２８、および２９～５４から選択される配列に対して少なくともまたは約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または１００％の同一性を有する配列を含む。

一部の実施形態では、操作された抗原結合性タンパク質は、ａ）配列番号：９および１０；ｂ）配列番号：９および１４；ｃ）配列番号：９および１７；ｄ）配列番号：１２および１０；ｅ）配列番号：１２および１４；ｆ）配列番号：１２および１７；ｇ）配列番号：１５および１０；ｈ）配列番号：１５および１４；ｉ）配列番号：１５および１７；ｊ）配列番号：９、１０、１５、および１７；ｋ）配列番号：１２、１４、１５、および１７；ｌ）配列番号：２１および２２；ｍ）配列番号：２７および２８；ｎ）配列番号：３１、３２、および３３；ｏ）配列番号：３４、３５、および３６；ｐ）配列番号：３７、３８、および３９；ｑ）配列番号：４０、４１、および４２；ｒ）配列番号：４３および４４；ｓ）配列番号：４５および４６；ｔ）配列番号：４７、４８、および４９；ｕ）配列番号５０、５１、および５２；ならびにｖ）配列番号５３および５４から選択される配列に対して少なくともまたは約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または１００％の同一性を有する配列を含む。

一部の実施形態では、操作された抗原結合性タンパク質は、ａ）表３に列挙されているＶＨ配列からなる群から選択されるＶＨ配列；および／またはｂ）表３に列挙されているＶＬ配列からなる群から選択されるＶＬ配列を含む。

一部の実施形態では、操作された抗原結合性タンパク質は、配列番号９、１０、１２、１４、１５、１７、１９、２０～２４、２７、２８、および２９～５４から選択される配列を含む。

一部の実施形態では、操作された抗原結合性タンパク質は、ａ）配列番号：９および１０；ｂ）配列番号：９および１４；ｃ）配列番号：９および１７；ｄ）配列番号：１２および１０；ｅ）配列番号：１２および１４；ｆ）配列番号：１２および１７；ｇ）配列番号：１５および１０；ｈ）配列番号：１５および１４；ｉ）配列番号：１５および１７；ｊ）配列番号：９、１０、１５、および１７；ｋ）配列番号：１２、１４、１５、および１７；ｌ）配列番号：２１および２２；ｍ）配列番号：２７および２８；ｎ）配列番号：３１、３２、および３３；ｏ）配列番号：３４、３５、および３６；ｐ）配列番号：３７、３８、および３９；ｑ）配列番号：４０、４１、および４２；ｒ）配列番号：４３および４４；ｓ）配列番号：４５および４６；ｔ）配列番号：４７、４８、および４９；ｕ）配列番号５０、５１、および５２；ならびにｖ）配列番号５３および５４から選択される配列を含む。

一部の実施形態では、操作された抗原結合性タンパク質は、抗体、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ’、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ｓｃ（Ｆｖ）_２、ハーフ抗体－ｓｃＦｖ、タンデムｓｃＦｖ、タンデムバイパラトピックｓｃＦｖ、Ｆａｂ／ｓｃＦｖ－Ｆｃ、タンデムＦａｂ’、単鎖ダイアボディ、タンデムダイアボディ（ＴａｎｄＡｂ）、Ｆａｂ／ｓｃＦｖ－Ｆｃ、ヘテロ二量体Ｆａｂ／ｓｃＦｖ－Ｆｃ、ヘテロ二量体ｓｃＦｖ－Ｆｃ、ヘテロ二量体ＩｇＧ（ＣｒｏｓｓＭａｂ）、ＤＡＲＴ、およびダイアボディから選択される。

ある特定の実施形態では、操作された抗原結合性タンパク質は、ＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２Ａ、ＩｇＧ２Ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、およびＩｇＥ定常ドメインからなる群から選択される免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含む。

一部の実施形態では、操作された抗原結合性タンパク質は、Ｆｃドメインを含む。一部の実施形態では、Ｆｃドメインは、１つまたは複数のＦｃ受容体に結合し得る機能的なまたは野生型Ｆｃドメインである。一部の実施形態では、Ｆｃドメインは、非機能的であり得る、例えば、１つまたは複数の極めて重要なアミノ酸の変異、欠失、置換、付加を含み、したがって、Ｆｃドメイン（構造的には存在する）は、もはや１つまたは複数のＦｃ受容体に結合することができない。他の実施形態では、操作された抗原結合性タンパク質は、抗体の定常領域の（ａ）Ｆｃドメインまたは（ｂ）ＣＨ２ドメインおよび／もしくはＣＨ３ドメインを含まない。したがって、一部の実施形態では、操作された抗原結合性タンパク質は、操作された抗原結合性タンパク質がＦｃドメインを含むかどうかとは関係なく、１つまたは複数のＦｃ受容体に結合しない。

ある特定の態様では、ＣＴＬＡ４に特異的に結合し、抗体の定常領域のＣＨ２ドメインおよび／またはＣＨ３ドメインを欠く操作された抗原結合性タンパク質が本発明で提供される。

一部の実施形態では、操作された抗原結合性タンパク質は、ａ）表３に列挙されているＶＨ配列からなる群から選択されるＶＨ配列に対して少なくとももしくは約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、もしくは１００％の同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列；および／またはｂ）表３に列挙されているＶＬ配列からなる群から選択されるＶＬ配列に対して少なくとももしくは約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、もしくは１００％の同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列を含む。

一部の実施形態では、操作された抗原結合性タンパク質は、配列番号９、１０、１２、１４、１５、１７、１９、２０～２４、２７、２８、および２９～５４から選択される配列に対して少なくともまたは約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または１００％の同一性を有する配列を含む。

一部の実施形態では、操作された抗原結合性タンパク質は、ａ）配列番号：９および１０；ｂ）配列番号：９および１４；ｃ）配列番号：９および１７；ｄ）配列番号：１２および１０；ｅ）配列番号：１２および１４；ｆ）配列番号：１２および１７；ｇ）配列番号：１５および１０；ｈ）配列番号：１５および１４；ｉ）配列番号：１５および１７；ｊ）配列番号：９、１０、１５、および１７；ｋ）配列番号：１２、１４、１５、および１７；ｌ）配列番号：２１および２２；ｍ）配列番号：２７および２８；ｎ）配列番号：３１、３２、および３３；ｏ）配列番号：３４、３５、および３６；ｐ）配列番号：３７、３８、および３９；ｑ）配列番号：４０、４１、および４２；ｒ）配列番号：４３および４４；ｓ）配列番号：４５および４６；ｔ）配列番号：４７、４８、および４９；ｕ）配列番号５０、５１、および５２；ならびにｖ）配列番号５３および５４から選択される配列に対して少なくともまたは約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または１００％の同一性を有する配列を含む。

一部の実施形態では、操作された抗原結合性タンパク質は、ａ）表３に列挙されているＶＨ配列からなる群から選択されるＶＨ配列；および／またはｂ）表３に列挙されているＶＬ配列からなる群から選択されるＶＬ配列を含む。

一部の実施形態では、操作された抗原結合性タンパク質は、配列番号９、１０、１２、１４、１５、１７、１９、２０～２４、２７、２８、および２９～４０から選択される配列を含む。

一部の実施形態では、操作された抗原結合性タンパク質は、ａ）配列番号：９および１０；ｂ）配列番号：９および１４；ｃ）配列番号：９および１７；ｄ）配列番号：１２および１０；ｅ）配列番号：１２および１４；ｆ）配列番号：１２および１７；ｇ）配列番号：１５および１０；ｈ）配列番号：１５および１４；ｉ）配列番号：１５および１７；ｊ）配列番号：９、１０、１５、および１７；ｋ）配列番号：１２、１４、１５、および１７；ｌ）配列番号：２１および２２；ｍ）配列番号：２７および２８；ｎ）配列番号：３１、３２、および３３；ｏ）配列番号：３４、３５、および３６；ｐ）配列番号：３７、３８、および３９；ｑ）配列番号：４０、４１、および４２；ｒ）配列番号：４３および４４；ｓ）配列番号：４５および４６；ｔ）配列番号：４７、４８、および４９；ｕ）配列番号５０、５１、および５２；ならびにｖ）配列番号５３および５４から選択される配列を含む。

一部の実施形態では、操作された抗原結合性タンパク質は、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ’、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ｓｃ（Ｆｖ）_２、ハーフ抗体－ｓｃＦｖ、タンデムｓｃＦｖ、タンデムバイパラトピックｓｃＦｖ、Ｆａｂ／ｓｃＦｖ－Ｆｃ、タンデムＦａｂ’、単鎖ダイアボディ、タンデムダイアボディ（ＴａｎｄＡｂ）、Ｆａｂ／ｓｃＦｖ－Ｆｃ、ヘテロ二量体Ｆａｂ／ｓｃＦｖ－Ｆｃ、ヘテロ二量体ｓｃＦｖ－Ｆｃ、ヘテロ二量体ＩｇＧ（ＣｒｏｓｓＭａｂ）、ＤＡＲＴ、およびダイアボディから選択される。

ある特定の実施形態では、操作された抗原結合性タンパク質は、Ｆ（ａｂ’）_２である。一部の実施形態では、操作された抗原結合性タンパク質は、配列番号２７および２８の配列を含む。一部の実施形態では、操作された抗原結合性タンパク質は、配列番号２１および２２の配列を含む。

ある特定の実施形態では、操作された抗原結合性タンパク質は、ＣＴＬＡ４の２つのエピトープ：残基^１３４ＭＹＰＰＰＹ^１３９（配列番号１）によって定義されるエピトープ１および残基^６５ＳＩＣＴ^６８（配列番号２）によって定義されるエピトープ２に結合する。

一部の実施形態では、操作された抗原結合性タンパク質は、少なくとも２つの異なるＶＨドメインおよび少なくとも２つの異なるＶＬドメインを含む。

一部の実施形態では、操作された抗原結合性タンパク質は、ＤＡＲＴまたはダイアボディである。一部の実施形態では、ダイアボディは、ホモ二量体ダイアボディまたはヘテロ二量体ダイアボディである。一部の実施形態では、ダイアボディは、単鎖ダイアボディまたはタンデムダイアボディ（ＴａｎｄＡｂ）である。一部の実施形態では、ダイアボディは、タンデムダイアボディである。

ある特定の実施形態では、ＤＡＲＴまたはダイアボディはＮ末端からＣ末端の方向に、ａ）第１のＶＨ；ｂ）第１のＶＬ；ｃ）第２のＶＨ；およびｄ）第２のＶＬを含み、ここで、第１のＶＨと第１のＶＬがリンカーＡによって連結しており、第１のＶＬと第２のＶＨがリンカーＢによって連結しており、第２のＶＨと第２のＶＬがリンカーＣによって連結している。

一部の実施形態では、リンカーＡおよび／またはリンカーＢは、（ＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）ｎのペプチド配列を含み、ｎ＝１～２０である。一部の実施形態では、ｎ＝０、１、２、または３である。一部の実施形態では、ｎ＝３である。

一部の実施形態では、リンカーＣは、（ＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）ｎのペプチド配列を含み、ｎ＝１～２０である。一部の実施形態では、ｎは、４よりも大きい。一部の実施形態では、ｎ＝０、１、２、３、または４である。一部の実施形態では、ｎ＝３である。

一部の実施形態では、リンカーＡ、リンカーＢ、およびリンカーＣのそれぞれが（ＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）ｎを含み、ｎ＝３である。

ある特定の実施形態では、第１のＶＨおよび第２のＶＬは、エピトープ１（配列番号１）に結合し、第１のＶＬおよび第２のＶＨは、エピトープ２（配列番号２）に結合する。一部の実施形態では、第１のＶＨ、第１のＶＬ、第２のＶＨ、第２のＶＬは、それぞれ配列番号１５、配列番号１４、配列番号１２、および配列番号１７に対して少なくともまたは約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または１００％の同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、第１のＶＨ、第１のＶＬ、第２のＶＨ、第２のＶＬは、それぞれ配列番号１５、配列番号１４、配列番号１２、および配列番号１７の配列を含む。

一部の実施形態では、操作された抗原結合性タンパク質は、配列番号２４（ＢｉｏＥ２０５２）に対して少なくともまたは約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または１００％の同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、操作された抗原結合性タンパク質は、配列番号２４（ＢｉｏＥ２０５２）の配列を含む。

ある特定の実施形態では、第１のＶＨおよび第２のＶＬはエピトープ２（配列番号２）に結合し、第１のＶＬおよび第２のＶＨはエピトープ１（配列番号１）に結合する。一部の実施形態では、第１のＶＨ、第１のＶＬ、第２のＶＨ、第２のＶＬは、それぞれ配列番号１２、配列番号１７、配列番号１５、および配列番号１４に対して少なくともまたは約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または１００％の同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、第１のＶＨ、第１のＶＬ、第２のＶＨ、第２のＶＬは、それぞれ配列番号１２、配列番号１７、配列番号１５、および配列番号１４に記載の配列を含む。

一部の実施形態では、操作された抗原結合性タンパク質は、配列番号２３（ＢｉｏＥ２０５１）に対して少なくともまたは約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または１００％の同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、操作された抗原結合性タンパク質は、配列番号２３（ＢｉｏＥ２０５１）の配列を含む。

本発明の任意の態様に適用すること、および／または本明細書に記載の任意の他の実施形態と組み合わせることができる多数の実施形態がさらに提供される。例えば、一部の実施形態では、ＣＴＬＡ４は、ヒトＣＴＬＡ４である。一部の実施形態では、操作された抗原結合性タンパク質は、キメラ、ヒト化、複合、マウス、またはヒトである。一部の実施形態では、操作された抗原結合性タンパク質は、ペプチドタグ（例えば、ヒスチジンタグ）をさらに含む。一部の実施形態では、操作された抗原結合性タンパク質は、リーダー配列をさらに含む。一部の実施形態では、リーダー配列は、配列番号５５に記載の配列を含む。一部の実施形態では、操作された抗原結合性タンパク質は、コンジュゲートしたまたは検出可能に標識されたものであり、必要に応じて、操作された抗原結合性タンパク質は、例えば、循環中の半減期を延長するためまたはより良好な溶解性のためにＰＥＧ化されたものである。一部の実施形態では、操作された抗原結合性タンパク質は、自己二量体化する。一部の実施形態では、操作された抗原結合性タンパク質は、ａ）ＣＴＬＡ４とそのリガンド（例えば、ＣＤ８０（Ｂ７－１）およびＣＤ８６（Ｂ７－２））の相互作用を遮断する；かつ／またはｂ）Ｔ細胞によるインターロイキン－２（ＩＬ－２）発現を増大させる。

ある特定の態様では、本開示の操作された抗原結合性タンパク質をコードする単離された核酸分子が本発明で提供される。そのような単離された核酸を含むベクターも本発明で提供される。前記単離された核酸を含む、前記ベクターを含む、または本開示の操作された抗原結合性タンパク質を発現する宿主細胞が本発明でさらに提供される。

ある特定の態様では、本開示の操作された抗原結合性タンパク質、前記操作された抗原結合性タンパク質をコードする単離された核酸、前記単離された核酸を含むベクター、または前記単離された核酸を含む、前記ベクターを含む、もしくは本開示の操作された抗原結合性タンパク質を発現する宿主細胞を含む医薬組成物が本発明で提供される。

ある特定の態様では、少なくとも１つの本開示の操作された抗原結合性タンパク質を含むキットが本発明で提供される。

配列同一性／相同性
機能保存的バリアントは、これだけに限定されないが、アミノ酸の同様の特性（例えば、極性、水素結合の潜在性、酸性、塩基性、疎水性、芳香族など）を有するアミノ酸での置換えを含め、タンパク質または酵素の所与のアミノ酸残基が、ポリペプチドの全体的なコンフォメーションおよび機能の変更を伴わずに変化したものである。タンパク質において、保存されたものとして示されているもの以外のアミノ酸は異なる可能性があり、したがって、機能が同様である任意の２つのタンパク質間のパーセントタンパク質またはアミノ酸配列類似性は変動し得、例えば、類似性は、ＭＥＧＡＬＩＧＮアルゴリズムに基づくＣｌｕｓｔｅｒ Ｍｅｔｈｏｄによるものなどのアラインメントスキームに従って決定して、７０％から９９％までにわたり得る。機能保存的バリアントはまた、ＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡアルゴリズムによって決定して少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９０％、なおより好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有し、それが比較されるネイティブなまたは親タンパク質と同じまたは実質的に同様の特性または機能を有するポリペプチドも包含する。

２つの配列間のパーセント同一性は、２つの配列を最適にアラインメントするために導入する必要があるギャップの数および各ギャップの長さを考慮に入れた、それらの配列が共有する同一の位置の数の関数である（すなわち、％同一性＝同一の位置の数／位置の総数×１００）。配列の比較および２つの配列間のパーセント同一性の決定は、以下の非限定的な例に記載の通り、数学的アルゴリズムを使用して実現することができる。

２つのヌクレオチド配列間のパーセント同一性を、ＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラム（Ｗｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ ＷｅｂでＧＣＧ社ウェブサイトにおいて入手可能）を使用し、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰ行列およびギャップ重みづけ（ｇａｐ ｗｅｉｇｈｔ）４０、５０、６０、７０、または８０および長さ重みづけ（ｌｅｎｇｔｈ ｗｅｉｇｈｔ）１、２、３、４、５、または６を使用して決定することができる。２つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の間のパーセント同一性を、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み入れられたE. Meyers and W. Miller（CABIOS, 4: 11 17 (1989)）のアルゴリズムを使用し、ＰＡＭ１２０重み付け残基表（ｗｅｉｇｈｔ ｒｅｓｉｄｕｅ ｔａｂｌｅ）、ギャップ長ペナルティ（ｇａｐ ｌｅｎｇｔｈ ｐｅｎａｌｔｙ）１２およびギャップペナルティ（ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ）４を使用して決定することもできる。さらに、２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性をＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラム（ワールドワイドウェブでＧＣＧ社ウェブサイトにおいて入手可能）に組み入れられたNeedleman and Wunsch (J. Mol. Biol. (48): 444 453 (1970)）アルゴリズムを使用し、Ｂｌｏｓｕｍ ６２行列またはＰＡＭ２５０行列のいずれか、ならびにギャップ重みづけ１６、１４、１２、１０、８、６、または４および長さ重みづけ１、２、３、４、５、または６を使用して決定することができる。

例えば、関連する配列を同定するために、本発明の核酸およびタンパク質配列をさらに「クエリ配列」として使用して公共データベースに対する検索を実施することができる。そのような検索は、Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403 10のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を使用して実施することができる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索をＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長（ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ）＝１２を用いて実施して、本発明の核酸分子と相同なヌクレオチド配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索をＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いて実施して、本発明のタンパク質分子と相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較する目的でギャップが挿入されたアラインメントを得るために、Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25 (17): 3389 3402に記載されている通りＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを利用することができる。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータを使用することができる（Ｗｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ ＷｅｂでＮＣＢＩウェブサイトにおいて入手可能）。

抗体産生の方法および関連する方法
抗原結合性タンパク質（例えば、抗体、抗原結合性抗体断片、および抗体タンパク質作製物）を作出する適切な方法は当技術分野で公知である。例えば、抗体を産生させるための標準のハイブリドーマ法は、例えば、Harlow and Lane (eds.), Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press (1988)、およびCA. Janeway et al. (eds.), Immunobiology, 5^th Ed., Garland Publishing, New York, NY (2001)に記載されている。

宿主種に応じて、種々のアジュバントを使用して免疫学的応答を増大させ、それにより、宿主によるより多くの抗体産生を導くことができる。そのようなアジュバントとしては、これだけに限定されないが、フロイント、水酸化アルミニウムなどの無機ゲル、ならびにリゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油エマルション、キーホールリンペットヘモシアニン、およびジニトロフェノールなどの表面活性物質が挙げられる。ＢＣＧ（ｂａｃｉｌｌｉ Ｃａｌｍｅｔｔｅ－Ｇｕｅｒｉｎ）およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍは潜在的に有用なヒトアジュバントである。

抗体産生の他の方法を表２に要約する。

抗原結合性タンパク質を、その薬物動態（ＰＫ）特性（例えば、半減期）が増大するまたは改善されるように操作することができる。これだけに限定されないが、分子サイズ、フォールディング安定性、溶解性、標的相互作用、胎児性Ｆｃ結合能、および電荷を含めた、抗原結合性タンパク質の多数の特性が薬物動態に影響を及ぼし得る。抗原結合性タンパク質に対する改変として、これだけに限定されないが、抗原結合性ドメインと１つまたは複数の担体タンパク質のコンジュゲーション、ＰＥＧ化、アシル化（例えば、脂肪酸分子とのコンジュゲーションによるもの）、ポリシアリル化、またはグリコシル化が挙げられる。アミノ酸配列改変を使用してタンパク質のＰＫ特性を改善または最適化することができ、また、大きな、緩徐に代謝される巨大分子とのコンジュゲーションによってもタンパク質のＰＫ特性を改変することができる。抗原タンパク質とコンジュゲートすることができる巨大分子としては、これだけに限定されないが、タンパク質（例えば、アルブミン）、多糖（例えば、セファロース、アガロース、セルロース、またはセルロースビーズ）、ポリマーアミノ酸（ポリグルタミン酸またはポリリシン）、アミノ酸共重合体、不活化ウイルス粒子、不活化細菌毒素（例えば、ロイコトキシンまたはジフテリア、破傷風、またはコレラ毒素または分子）、不活化細菌、樹状細胞、サイログロブリン、ポリアミノ酸（例えば、ポリ（Ｄ－リシン：Ｄ－グルタミン酸））、ロタウイルスＶＰ６ポリペプチド、インフルエンザウイルス赤血球凝集素、インフルエンザウイルス核タンパク質、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ならびにＢ型肝炎ウイルスコアタンパク質および表面抗原が挙げられる（ＷＯ２０２１１４６４３６）。当技術分野で公知の追加的なＰＫモジュレーターには、脂肪親和性物質、胆汁酸、ステロイド、リン脂質類似体、およびビタミンが含まれ、これらの例として、これだけに限定されないが、コレステロール、脂肪酸、コール酸、リトコール酸、ジアルキルグリセリド、ジアシルグリセリド、リン脂質、スフィンゴ脂質、ナプロキセン、イブプロフェン、ビタミンＥ、およびビオチンが挙げられる（Ｕ．Ｓ．９，３２２，０１８）。本明細書に記載の改変された抗原結合性タンパク質を作製する方法は当技術分野で公知である。

一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質受容体を従来の断片結晶化可能領域（Ｆｃ領域）と融合するまたは他のやり方で連結する。例えば、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４ Ｆｃ領域であり得る。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質のＦｃ領域の変異を、胎児性Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）を介して生じるＩｇＧの受容体媒介性内部移行および再利用に関与する抗原結合性タンパク質のＦｃ領域とＦｃＲｎの相互作用がモジュレートされ（Sockolosky and Szoka, Adv Drug Deliv Rev. (2015) 109-24）それにより、抗原結合性タンパク質の薬物動態特性が改善されるように操作することができる（ＵＳ２０２１０２７７０９２）。例えば、Ｆｃ領域は抗原結合性タンパク質の胎児性Ｆｃγ受容体への結合を阻害するＬＡＬＡＰＧアミノ酸配列を含み得る。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質をアルブミン結合性タンパク質と融合するまたは他のやり方で連結する。

一部の実施形態では、巨大分子を抗原結合性タンパク質と直接コンジュゲートする。一部の実施形態では、巨大分子を抗原結合性ペプチドとリンカーを介して融合する。

本明細書に記載の改変された抗原結合性タンパク質は、改善または最適化された薬物動態（ＰＫ）特性、例えば、４時間を超える、５時間を超える、６時間を超える、７時間を超える、８時間を超える、９時間を超える、１０時間を超える、１２時間を超える、１８時間を超える、２４時間を超える、２日間を超える、３日間を超える、４日間を超える、５日間を超える、６日間を超える、７日間を超える、１０日間を超える、１４日間を超える、または３０日間を超える、ヒト対象における血漿中半減期を有し得る。

抗原結合性タンパク質がどのように作製されたものであるかにかかわらず、抗原結合性タンパク質をＣＴＬＡ４のエピトープに結合する能力について試験する方法は当技術分野で公知であり、それらとして、任意の結合アッセイ、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、免疫沈降、ＳＰＲ、および競合阻害アッセイが挙げられる（例えば、米国特許出願公開第２００２／０１９７２６６号を参照されたい）。

配列
本明細書で使用される場合、コード領域とは、アミノ酸残基に翻訳されるコドンを含むヌクレオチド配列の領域を指し、一方、非コード領域とは、アミノ酸に翻訳されないヌクレオチド配列の領域（例えば、５’および３’非翻訳領域）を指す。

［～と］相補的（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ［ｔｏ］ｏｒ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）とは、２本の核酸鎖の領域間または同じ核酸鎖の２つの領域間の配列相補性の広範な概念を指す。第１の核酸領域のアデニン残基が、第１の領域と逆平行である第２の核酸領域の残基と、その残基がチミンまたはウラシルである場合に特異的な水素結合（塩基対合）形成することが可能であることが公知である。同様に、第１の核酸鎖のシトシン残基が、第１の鎖と逆平行である第２の核酸鎖の残基と、その残基がグアニンである場合に塩基対合することが可能であることが公知である。核酸の第１の領域と、同じまたは異なる核酸の第２の領域とは、その２つの領域が逆平行に配置されており、第１の領域の少なくとも１つのヌクレオチド残基が第２の領域の残基と塩基対合することが可能である場合、相補的である。一部の実施形態では、第１の領域は第１の部分を含み、第２の領域は第２の部分を含み、それによって、第１の部分および第２の部分が逆平行に配置されている場合、第１の部分のヌクレオチド残基の少なくともまたは約５０％、および好ましくは少なくともまたは約７５％、少なくともまたは約９０％、または少なくともまたは約９５％が、第２の部分のヌクレオチド残基と塩基対合することが可能である。他の実施形態では、第１の部分の全てのヌクレオチド残基が、第２の部分のヌクレオチド残基と塩基対合することが可能である。

核酸は、別の核酸配列と機能的に関連するように置かれている場合、作動可能に連結している。例えば、プロモーターまたはエンハンサーは、コード配列の転写に影響を及ぼす場合、そのコード配列に作動可能に連結している。転写調節配列に関して、作動可能に連結しているとは、連結しているＤＮＡ配列が連続しており、２つのタンパク質コード領域を接合する必要がある場合、連続しており、かつ読み枠内に入っていることを意味する。スイッチ配列に関しては、作動可能に連結しているとは、それらの配列によりスイッチ組換えをもたらすことが可能であることを示す。

特定のタンパク質のアミノ酸配列とそのタンパク質をコードし得るヌクレオチド配列の間には、遺伝暗号（以下に示す）によって定義される公知の明確な対応が存在する。同様に、特定の核酸のヌクレオチド配列とその核酸によってコードされるアミノ酸配列の間には、遺伝暗号によって定義される公知の明確な対応が存在する。

遺伝暗号の重要な周知の特色は、タンパク質を構成するために使用されるアミノ酸の大多数に１つよりも多くのコードヌクレオチドトリプレットが使用され得る（上に例示されている）という重複性である。したがって、いくつかの異なるヌクレオチド配列が所与のアミノ酸配列をコードし得る。そのようなヌクレオチド配列は、全ての生物体において同じアミノ酸配列の産生をもたらすので（ある特定の生物体では一部の配列が他の配列よりも効率的に翻訳される場合があるが）、機能的に等価であるとみなされる。さらに、時々、プリンまたはピリミジンのメチル化バリアントが所与のヌクレオチド配列に見いだされ得る。そのようなメチル化はトリヌクレオチドコドンと対応するアミノ酸との間のコード関連性には影響を及ぼさない。

ポリペプチドのアミノ配列を変化させることに関して、アミノ酸の疎水性親水性指標を考慮することができる。タンパク質に相互作用的な生物学的機能を付与することにおけるアミノ酸の疎水性親水性指標の重要性は当技術分野において一般に理解されている。アミノ酸の相対的なハイドロパシー的特性が得られるタンパク質の二次構造に寄与し、今度はそれによりタンパク質と他の分子、例えば、酵素、基質、受容体、ＤＮＡ、抗体、抗原などの相互作用が規定されることが許容される。各アミノ酸に、それらの疎水性および電荷特徴に基づいて疎水性親水性指標が割り当てられており、以下の通りである：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（－０．４）；トレオニン（－０．７）；セリン（－０．８）；トリプトファン（－０．９）；チロシン（－１．３）；プロリン（－１．６）；ヒスチジン（－３．２）；グルタミン酸（－３．５）；グルタミン（－３．５）；アスパラギン酸（＜ＲＴＩ３．５）；アスパラギン（－３．５）；リシン（－３．９）；およびアルギニン（－４．５）。

ある特定のアミノ酸を同様の疎水性親水性指標またはスコアを有する他のアミノ酸で置換することができ、それでもなお同様の生物活性を有するタンパク質がもたらされる、すなわち、それでもなお生物学的機能的に等価のタンパク質が得られることが当技術分野で公知である。

上に概説されている通り、したがって、一般に、アミノ酸置換は、アミノ酸側鎖置換基の相対的な類似性、例えば、それらの疎水性、親水性、電荷、サイズなどに基づく。種々の前述の特徴を考慮した例示的な置換は当業者に周知であり、それらとして、アルギニンとリシン；グルタミン酸とアスパラギン酸；セリンとトレオニン；グルタミンとアスパラギン；およびバリン、ロイシンとイソロイシンが挙げられる。

前述のことを考慮して、ＤＮＡまたはＲＮＡをアミノ酸配列に翻訳するために遺伝暗号を使用してポリペプチドアミノ酸配列を導き出すために、ＤＮＡまたはＲＮＡのヌクレオチド配列を使用することができる。同様に、ポリペプチドアミノ酸配列について、ポリペプチドをコードし得る対応するヌクレオチド配列を遺伝暗号から推定することができる（遺伝暗号の重複性に起因して、任意の所与のアミノ酸配列について複数の核酸配列が生じる）。したがって、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に関する本明細書における説明および／または開示には、ヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列の説明および／または開示も包含されるとみなされるべきである。同様に、本明細書におけるポリペプチドアミノ酸配列に関する説明および／または開示には、アミノ酸配列をコードし得る全ての可能性のあるヌクレオチド配列に関する説明および／または開示も包含されるとみなされるべきである。

核酸およびベクター
本発明の別の目的は、本発明のモノクローナル抗体およびその断片、免疫グロブリン、ならびにポリペプチドをコードする核酸配列に関する。

例えば、ある特定の実施形態では、本発明は、一部、ｍＡｂ ９Ａ３、１４Ｃ３、８Ｈ３、もしくは４Ａ３のＶＨドメイン；またはｍＡｂ ９Ａ３、１４Ｃ３、８Ｈ３、もしくは４Ａ３のＶＬドメインをコードする核酸配列に関する。

一般には、前記核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子であり、プラスミド、コスミド、エピソーム、人工染色体、ファージまたはウイルスベクターなどの任意の適切なベクター中に含まれていてよい。

「ベクター」、「クローニングベクター」および「発現ベクター」という用語は、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列（例えば、外来遺伝子）を宿主細胞に導入して、したがって、宿主を形質転換させ、導入された配列の発現（例えば、転写および翻訳）を促進することができる、ビヒクルを意味する。したがって、本発明の別の目的は、本発明の核酸を含むベクターに関する。

そのようなベクターは、対象に投与されると前記ポリペプチドの発現を引き起こすまたは方向付けるための調節エレメント、例えば、プロモーター、エンハンサー、ターミネーターなどを含み得る。動物細胞のための発現ベクターに使用されるプロモーターおよびエンハンサーの例としては、ＳＶ４０の初期プロモーターおよびエンハンサー（Mizukami T. et al. 1987）、モロニーマウス白血病ウイルスＬＴＲプロモーターおよびエンハンサー（Kuwana Y et al. 1987）、免疫グロブリンＨ鎖のプロモーター（Mason J O et al. 1985）およびエンハンサー（Gillies S D et al. 1983）などが挙げられる。

動物細胞に対する任意の発現ベクターを使用することができる。適切なベクターの例としては、ｐＡＧＥ１０７（Miyaji H et al. 1990）、ｐＡＧＥ１０３（Mizukami T et al. 1987）、ｐＨＳＧ２７４（Brady G et al. 1984）、ｐＫＣＲ（O'Hare K et al. 1981）、ｐＳＧ１ベータｄ２－４－（Miyaji H et al. 1990）などが挙げられる。プラスミドの他の代表的な例として、複製開始点を含む複製性プラスミド、または組込み型プラスミド、例えば、ｐＵＣ、ｐｃＤＮＡ、ｐＢＲなどが挙げられる。ウイルスベクターの代表的な例としては、アデノウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルスおよびＡＡＶベクターが挙げられる。そのような組換えウイルスは当技術分野で公知の技法によって、例えば、パッケージング細胞へのトランスフェクションによって、またはヘルパープラスミドもしくはウイルスの一過性トランスフェクションによって、作製することができる。ウイルスパッケージング細胞の典型的な例としては、ＰＡ３１７細胞、ＰｓｉＣＲＩＰ細胞、ＧＰｅｎｖ陽性細胞、２９３細胞などが挙げられる。そのような複製欠損組換えウイルスを作製するための詳細なプロトコールは、例えば、ＷＯ９５／１４７８５、ＷＯ９６／２２３７８、米国特許第５，８８２，８７７号、米国特許第６，０１３，５１６号、米国特許第４，８６１，７１９号、米国特許第５，２７８，０５６号およびＷＯ９４／１９４７８に見いだすことができる。

したがって、本開示の核酸は、一部の態様では、ベクターに組み入れられている。この点について、本開示は、本開示の核酸のいずれかを含むベクターを提供する。種々の態様では、ベクターは、組換え発現ベクターである。本発明の目的に関して、「組換え発現ベクター」という用語は、宿主細胞によるｍＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドの発現を可能にする遺伝子改変されたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド構築物を意味し、構築物はｍＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、ベクターを細胞と、細胞内でｍＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドを発現させるために十分な条件下で接触させる。本開示のベクターは、全体としては天然に存在しない。しかし、ベクターの一部は天然に存在し得る。本開示のベクターは、これだけに限定されないが、一本鎖であっても二本鎖であってもよく、合成されたものであっても一部が天然の供給源から得られたものであってもよく、また、天然ヌクレオチド、非天然ヌクレオチドまたは変更されたヌクレオチドを含んでよい、ＤＮＡおよびＲＮＡを含めた、任意の型のヌクレオチドを含み得る。ベクターは、天然に存在するヌクレオチド間連結または天然に存在しないヌクレオチド間連結、または両方の型の連結を含み得る。一部の態様では、変更されたヌクレオチドも、天然に存在しないヌクレオチド間連結も、ベクターの転写または複製を妨げるものではない。

本開示のベクターは、任意の適切なベクターであってよく、任意の適切な宿主への形質導入、形質転換またはトランスフェクションのために使用することができる。適切なベクターとしては、増殖（ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ）および拡大のため、または発現のため、またはその両方のために設計されたもの、例えば、プラスミドおよびウイルスなどが挙げられる。ベクターは、プラスミドに基づく発現ベクターであってよい。種々の態様では、ベクターは、ｐＵＣシリーズ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔシリーズ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＬａＪｏＩＩａ、ＣＡ）、ｐＥＴシリーズ（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、ｐＧＥＸシリーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）、およびｐＥＸシリーズ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）からなる群から選択される。バクテリオファージベクター、例えば、λＧＴＩＯ、λＧＴｌ１、λＺａｐＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、λＥＭＢＬ４、およびλＮＭ１１４９なども使用することができる。植物発現ベクターの例としては、ｐＢＩＯｌ、ｐＢＩ１０１．２、ｐＢＩ１０１．３、ｐＢＩ１２１およびｐＢＩＮ１９（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）が挙げられる。動物発現ベクターの例としては、ｐＥＵＫ－Ｃ１、ｐＭＡＭおよびｐＭＡＭｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）が挙げられる。一部の態様では、ベクターは、ウイルスベクター、例えば、レトロウイルスベクターである。種々の態様では、ベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクター、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）ベクター、ワクシニアウイルスベクター、またはレンチウイルスベクターである。例えば、Howarth et al., Cell Biol. Toxicol. 26 (1): 1-20 (2010)を参照されたい。種々の態様では、ベクターは、節足動物、例えば、昆虫に感染するバキュロウイルスベクターである。種々の態様では、バキュロウイルスベクターは、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｎｕｃｌｅａｒ ｖｉｒｕｓ）（ＡｃＭＮＰＶ）またはＢｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ核多角体病ウイルス（Ｂｏｍｂｙｘｍｏｒｉｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ）（ＢｍＮＰＶ）である。例えば、Khan, Adv Pharm Bull 3 (2): 257-263 (2013)；Miller, Bioessays 11 (4): 91-96 (1989)；Atkinson et al., Pestic Sci 28: 215-224 (1990)を参照されたい。

本開示のベクターは、例えば、Sambrook et al., 上記、およびAusubel et al., 上記に記載されている標準の組換えＤＮＡ技法を使用して調製することができる。環状または直鎖状の発現ベクターの構築物を、原核生物または真核生物宿主細胞において機能的な複製系を含有するように調製することができる。複製系は、例えば、ＣｏＩＥ１、２μプラスミド、λ、ＳＶ４０、ウシパピローマウイルスなどに由来するものであってよい。

一部の態様では、ベクターは、必要に応じて、また、ベクターがＤＮＡに基づくものであるかＲＮＡに基づくものであるかを考慮して、ベクターが導入される宿主の型（例えば、細菌、真菌、植物、または動物）に特異的な調節配列、例えば、転写および翻訳開始および終結コドンを含む。

ベクターは、形質転換またはトランスフェクトされた宿主の選択を可能にする１つまたは複数のマーカー遺伝子を含み得る。マーカー遺伝子としては、殺生物剤耐性、例えば、抗生物質、重金属などに対する耐性、栄養要求性宿主において原栄養性をもたらすための補完などが挙げられる。本開示の発現ベクターのための適切なマーカー遺伝子としては、例えば、ネオマイシン／Ｇ４１８耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ヒスチジノール耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、およびアンピシリン耐性遺伝子が挙げられる。

ベクターは、ポリペプチド（機能的部分およびその機能的バリアントを含む）をコードするヌクレオチド配列、またはポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と相補的であるもしくはそれとハイブリダイズするヌクレオチド配列と作動可能に連結したネイティブなまたは規範的なプロモーターを含み得る。プロモーターの選択、例えば、強力なプロモーター、弱いプロモーター、誘導性プロモーター、組織特異的プロモーターおよび発生特異的プロモーターは、当業者の通常の技術の範囲内に入る。同様に、ヌクレオチド配列とプロモーターを組み合わせることも当業者の技術の範囲内に入る。プロモーターは、非ウイルスプロモーターであってもよく、ウイルスプロモーター、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＲＳＶプロモーター、およびマウス幹細胞ウイルスの長い末端反復に見いだされるプロモーターであってもよい。

別の態様では、本発明は、本明細書に開示されるポリヌクレオチドと選択的なハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする単離された核酸を提供する。したがって、この実施形態のポリヌクレオチドを、そのようなポリヌクレオチドを含む核酸の単離、検出、および／または数量化に使用することができる。例えば、本発明のポリヌクレオチドを使用して、寄託されたライブラリー内の部分的なまたは全長のクローンを同定、単離、または増幅することができる。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ヒトもしくは哺乳動物核酸ライブラリーから単離された、または他のやり方でヒトもしくは哺乳動物核酸ライブラリー由来のｃＤＮＡと相補的な、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ配列である。ｃＤＮＡライブラリーは、少なくとも８０％全長配列、好ましくは少なくとも８５％または９０％全長配列、好ましくは少なくとも９５％全長配列を含むことが好ましい。ｃＤＮＡライブラリーを、希少な配列の表示が増加するように標準化することができる。相補配列に対する配列同一性が低い配列には、必ずではないが一般に、低または中ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件が使用される。同一性がより大きい配列に対して、必要に応じて中および高ストリンジェンシー条件を使用することができる。低ストリンジェンシー条件は、約７０％の配列同一性を有する配列の選択的なハイブリダイゼーションを可能にするものであり、オルソロガスまたはパラロガスな配列を同定するために使用することができる。必要に応じて、本発明のポリヌクレオチドは、本明細書に記載のポリヌクレオチドによってコードされる抗体の少なくとも一部分をコードする。本発明のポリヌクレオチドは、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドとの選択的なハイブリダイゼーションに使用することができる核酸配列を包含する。例えば、それぞれが完全に参照により本明細書に組み込まれるAusubel、上記；Colligan、上記を参照されたい。

宿主細胞
本開示の核酸またはベクターを含む宿主細胞が本発明で提供される。本発明の別の目的は、本発明による核酸および／またはベクターによってトランスフェクト、感染または形質転換された細胞に関する。「形質転換」という用語は、「外来」（すなわち、外因性または細胞外）遺伝子、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列が宿主細胞に導入され、その結果、宿主細胞が、導入された遺伝子または配列を発現して、導入された遺伝子または配列によってコードされる所望の物質、一般にはタンパク質または酵素を産生することを意味する。導入されたＤＮＡまたはＲＮＡを受け取り、それを発現している宿主細胞は、「形質転換」されたものである。

本発明の核酸を使用して、適切な発現系において本発明の組換えポリペプチドを産生させることができる。「発現系」という用語は、宿主細胞および適合するベクターが、例えば、ベクターによって運ばれ、宿主細胞に導入される外来ＤＮＡによってコードされるタンパク質を発現させるために適した条件下にあることを意味する。

一般的な発現系としては、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞とプラスミドベクター、昆虫宿主細胞とバキュロウイルスベクター、および哺乳動物宿主細胞とベクターが挙げられる。宿主細胞の他の例としては、限定することなく、原核細胞（例えば、細菌など）および真核細胞（例えば、酵母細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞など）が挙げられる。特定の例として、Ｅ．ｃｏｌｉ、ＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓまたはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ酵母、哺乳動物細胞株（例えば、Ｖｅｒｏ細胞、ＣＨＯ細胞、３Ｔ３細胞、ＣＯＳ細胞など）ならびに初代または樹立哺乳動物細胞培養物（例えば、リンパ芽球、線維芽細胞、胚細胞、上皮細胞、神経細胞、脂肪細胞などから作製されたもの）が挙げられる。例として、マウスＳＰ２／０－Ａｇ１４細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５８１）、マウスＰ３Ｘ６３－Ａｇ８．６５３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５８０）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子（以下「ＤＨＦＲ遺伝子」と称される）が欠損したＣＨＯ細胞（Urlaub G et al; 1980）、ラットＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６６２、以下「ＹＢ２／０細胞」と称される）なども挙げられる。ＹＢ２／０細胞において発現させるとキメラまたはヒト化抗体のＡＤＣＣ活性が増強されるので、この細胞が好ましい。

本発明は、本発明による抗体またはポリペプチドを発現する組換え宿主細胞を作製する方法であって、（ｉ）ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏにおいて本明細書に記載の組換え核酸またはベクターをコンピテント宿主細胞に導入することからなるステップ、（ｉｉ）ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏにおいて、得られた組換え宿主細胞を培養することからなるステップ、ならびに（ｉｉｉ）必要に応じて、前記抗体またはポリペプチドを発現および／または分泌する細胞を選択することからなるステップを含む、方法にも関する。そのような組換え宿主細胞を本発明の抗体およびポリペプチドの産生に使用することができる。

本明細書で使用される場合、「宿主細胞」という用語は、本開示のベクターを含有し得、核酸によってコードされる発現産物（例えば、ｍＲＮＡ、タンパク質）を産生することが可能な任意の細胞型を指す。宿主細胞は、一部の態様では、接着細胞または浮遊細胞、すなわち、懸濁液中で成長している細胞である。種々の態様における宿主細胞は、培養された細胞、または初代細胞、すなわち、生物体、例えば、ヒトから直接単離された細胞である。宿主細胞は、任意の細胞型のものであってよく、任意の型の組織を起源とするものであってよく、また、任意の発生段階にあってよい。

ある特定の態様では、抗原結合性タンパク質はグリコシル化されたタンパク質であり、宿主細胞はグリコシル化コンピテント細胞である。種々の態様では、グリコシル化コンピテント細胞は、これだけに限定されないが、酵母細胞、糸状菌細胞、原生動物細胞、藻類細胞、昆虫細胞、または哺乳動物細胞を含めた真核細胞である。そのような宿主細胞は当技術分野において記載されている。例えば、Frenzel, et al., Front Immunol 4: 217 (2013)を参照されたい。種々の態様では、真核細胞は哺乳動物細胞である。種々の態様では、哺乳動物細胞は非ヒト哺乳動物細胞である。一部の態様では、細胞はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞およびその派生物（例えば、ＣＨＯ－Ｋ１、ＣＨＯ ｐｒｏ－３）、マウス骨髄腫細胞（例えば、ＮＳ０、ＧＳ－ＮＳ０、Ｓｐ２／０）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）活性が欠損するように操作された細胞（例えば、ＤＵＫＸ－Ｘ１１、ＤＧ４４）、ヒト胎児由来腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞またはその派生物（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＥＫ２９３－ＥＢＮＡ）アフリカミドリサル腎臓細胞（例えば、ＣＯＳ細胞、ＶＥＲＯ細胞）、ヒト子宮頸がん細胞（例えば、ＨｅＬａ）、ヒト骨肉腫上皮細胞Ｕ２－ＯＳ、ヒト肺胞基底上皮腺癌細胞Ａ５４９、ヒト線維肉腫細胞ＨＴ１０８０、マウス脳腫瘍細胞ＣＡＤ、胚性癌腫細胞Ｐ１９、マウス胚線維芽細胞ＮＩＨ ３Ｔ３、マウス線維芽細胞Ｌ９２９、マウス神経芽細胞腫細胞Ｎ２ａ、ヒト乳がん細胞ＭＣＦ－７、網膜芽細胞腫細胞Ｙ７９、ヒト網膜芽細胞腫細胞ＳＯ－Ｒｂ５０、ヒト肝がん細胞Ｈｅｐ Ｇ２、マウスＢ骨髄腫細胞Ｊ５５８Ｌ、またはベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞である（Gaillet et al. 2007; Khan, Adv Pharm Bull 3 (2): 257-263 (2013)）。

ベクターを増幅または複製する目的に関しては、宿主細胞は、一部の態様では、原核細胞、例えば、細菌細胞である。

本明細書に記載の宿主細胞を少なくとも１つ含む細胞の集団も本開示で提供される。細胞の集団は、一部の態様では、記載のベクターを含む宿主細胞、加えて、ベクターのいずれも含まない他の細胞を少なくとも１つ含む不均一な集団である。あるいは、一部の態様では、細胞の集団は実質的に均一な集団であり、当該集団は、ベクターを含む宿主細胞を主に含む（例えば、それから本質的になる）。集団は、一部の態様では、細胞のクローン集団であり、集団の全ての細胞が、ベクターを含む単一の宿主細胞のクローンであり、したがって、集団の全ての細胞がベクターを含む。本開示の種々の実施形態では、細胞の集団は、本明細書に記載のベクターを含む宿主細胞を含むクローン集団である。

ある特定の態様では、宿主細胞は、対象に対して自己または同種のヒト細胞である。一部の実施形態では、本発明の核酸を、ウイルスベクターを介して形質導入する、または他の適切な方法（例えば、電気穿孔など）で形質転換に用いる。疾患または状態、例えば、がんの持続的処置のために、そのような宿主細胞を対象に移入する（例えば、移植する、埋め込むなど）。

製造方法
ＣＴＬＡ４に結合する抗原結合性タンパク質を作製する方法も本発明で提供される。種々の実施形態では、方法は、本明細書に記載の抗原結合性タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む宿主細胞を細胞培養培地中で培養するステップ、および細胞培養培地から抗原結合性タンパク質を収集するステップを含む。宿主細胞は、本明細書に記載の宿主細胞のいずれであってもよい。種々の態様では、宿主細胞は、ＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞、ＣＯＳ細胞、ＶＥＲＯ細胞、およびＢＨＫ細胞からなる群から選択される。種々の態様では、宿主細胞を培養するステップは、宿主細胞を成長培地中で培養して、宿主細胞の成長および拡大を支持することを含む。種々の態様では、成長培地は、細胞密度、培養生存率および生産性を適時に増大させるものである。種々の態様では、成長培地は、アミノ酸、ビタミン、無機塩、グルコース、および増殖因子の供給源として血清、ホルモン、ならびに付着因子を含む。種々の態様では、成長培地は、アミノ酸、ビタミン、微量元素、無機塩、脂質およびインスリンまたはインスリン様増殖因子からなる、十分に化学的に限定された培地中である。成長培地は、栄養分をもたらすことに加えて、ｐＨおよび重量オスモル濃度の維持も補助する。いくつかの成長培地が市販されており、当技術分野において記載されている。例えば、Arora, "Cell Culture Media: A Review" Mater Methods 3: 175 (2013)を参照されたい。

種々の態様では、方法は、宿主細胞をフィード培地中で培養することを含む。種々の態様では、方法は、フィード培地中、流加方式で培養することを含む。組換えタンパク質産生の方法は当技術分野で公知である。例えば、Li et al., "Cell culture processes for monoclonal antibody production" MAbs 2 (5): 466-477 (2010)を参照されたい。

抗原結合性タンパク質を作出する方法は、細胞培養物またはその上清からタンパク質を精製し、好ましくは精製されたタンパク質を回収する１つまたは複数のステップを含み得る。種々の態様では、方法は、１つまたは複数のクロマトグラフィーステップ、例えば、アフィニティークロマトグラフィー（例えば、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー、ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ用のニッケル樹脂）、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィーを含む。種々の態様では、方法は、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー樹脂を使用してタンパク質を精製するステップを含む。

種々の実施形態では、方法は、精製されたタンパク質などを製剤化し、それにより、精製されたタンパク質を含む製剤を得るステップをさらに含む。そのようなステップは、Formulation and Process Development Strategies for Manufacturing, eds. Jameel and Hershenson, John Wiley & Sons, Inc. (Hoboken, NJ), 2010に記載されている。

種々の態様では、抗原結合性タンパク質はポリペプチドと連結しており、その抗原結合性タンパク質は融合タンパク質の一部である。したがって、本開示は、さらに、ＣＴＬＡ４に結合する抗原結合性タンパク質を含む融合タンパク質を作製する方法を提供する。種々の実施形態では、方法は、本明細書に記載の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む宿主細胞を細胞培養培地中で培養するステップ、および細胞培養培地から融合タンパク質を収集するステップを含む。

したがって、本発明の操作された抗原結合性タンパク質を、これだけに限定することなく、任意の化学的、生物学的、遺伝学的または酵素的技法などの当技術分野で公知の任意の技法によって、それら単独でまたは組み合わせて、作製することができる。

当業者は、所望の配列のアミノ酸配列が分かれば、ポリペプチドを作製するための標準の技法によって前記抗体またはポリペプチドを容易に作製することができる。例えば、前記抗体またはポリペプチドを、周知の固相法を使用して、好ましくは、市販のペプチド合成装置（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆ．によって製造されたものなど）を使用し、製造者の指示に従って、合成することができる。あるいは、本発明の抗体および他のポリペプチドを、当技術分野で周知の組換えＤＮＡ技法によって合成することができる。例えば、これらの断片を、所望の（ポリ）ペプチドをコードするＤＮＡ配列を発現ベクターに組み入れ、そのようなベクターを、所望のポリペプチドを発現する適切な真核生物または原核生物宿主に導入し、後でその宿主から周知の技法を使用して単離することができる、ＤＮＡ発現産物として得ることができる。

特に、本発明は、さらに、本発明の抗体またはポリペプチドを作製する方法であって、（ｉ）本発明による形質転換された宿主細胞を、前記抗体またはポリペプチドの発現を可能にするのに適した条件下で培養すること；および（ｉｉ）発現された抗体またはポリペプチドを回収することからなるステップを含む方法に関する。

本発明の抗体および他のポリペプチドを、例えば、プロテインＡ－セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、アフィニティークロマトグラフィー、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーなどの従来の免疫グロブリン精製手順によって培養培地から適切に分離する。高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）を精製のために使用することもできる。例えば、それぞれが完全に参照により本明細書に組み込まれるColligan, Current Protocols in ImmunologyまたはCurrent Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, N.Y.,(1997-2001)、例えば、Chapters 1, 4, 6, 8, 9, 10を参照されたい。

本発明のキメラ抗体（例えば、マウス－ヒトキメラまたは非齧歯類－ヒトキメラ）を、ＶＬおよびＶＨドメインをコードする核酸配列を以前に記載されている通り得、それらを、ヒト抗体ＣＨおよびヒト抗体ＣＬをコードする遺伝子を有する動物細胞のための発現ベクターに挿入することによってヒトキメラ抗体発現ベクターを構築し、発現ベクターを動物細胞に導入することによってコード配列を発現させることにより、作製することができる。ヒトキメラ抗体のＣＨドメインは、ＩｇＧクラスまたはそのサブクラス、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４などの、ヒト免疫グロブリンに属する任意の領域であってよい。同様に、ヒトキメラ抗体のＣＬは、カッパクラスまたはラムダクラスなどの、Ｉｇに属する任意の領域であってよい。ヒト部分と非ヒト部分の両方を含むキメラおよびヒト化モノクローナル抗体は、標準の組換えＤＮＡ技法を使用して作出することができ、本発明の範囲内に入る。そのようなキメラおよびヒト化モノクローナル抗体を、当技術分野で公知の組換えＤＮＡ技法によって、例えば、Robinson et al., 国際特許公開第ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９号；Akira et al., 欧州特許出願第１８４，１８７号；Taniguchi, M. 欧州特許出願第１７１，４９６号；Morrison et al., 欧州特許出願第１７３，４９４号；Neuberger et al., ＰＣＴ出願第ＷＯ８６／０１５３３号；Cabilly et al., 米国特許第４，８１６，５６７号；Cabilly et al., 欧州特許出願第１２５，０２３号；Better et al. (1988) Science 240: 1041-1043；Liu et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3439-3443；Liu et al. (1987) J. Immunol. 139: 3521-3526；Sun et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. 84: 214-218；Nishimura et al. (1987) Cancer Res. 47: 999-1005；Wood et al. (1985) Nature 314: 446-449；Shaw et al. (1988) J. Natl. Cancer Inst. 80: 1553-1559）；Morrison, S. L. (1985) Science 229: 1202-1207；Oi et al. (1986) Biotechniques 4: 214；Winter、米国特許第５，２２５，５３９号；Jones et al. (1986) Nature 321: 552-525；Verhoeyan et al. (1988) Science 239: 1534;およびBeidler et al. (1988) J. Immunol. 141: 4053-4060に記載の方法を使用して作製することができる。

さらに、米国特許第５，５６５，３３２号に開示されているものなどの標準のプロトコールに従ってヒト化抗体を作出することができる。別の実施形態では、抗体鎖または特定の結合対メンバーを、当技術分野において公知の技術、例えば、米国特許第５，５６５，３３２号、５，８７１，９０７号、または５，７３３，７４３号で説明されたものなどを用いて、特定の結合対メンバーのポリペプチド鎖と複製可能な一般的なディスプレイパッケージの構成成分との融合物をコードする核酸分子を含むベクターと、単一の結合対メンバーの第２のポリペプチド鎖をコードする核酸分子を含有するベクターとの間の組換えによって作製することができる。ＣＤＲドメインをコードする核酸配列を以前に記載されている通り得、それらを、（ｉ）ヒト抗体のものと同一の重鎖定常領域および（ｉｉ）ヒト抗体のものと同一の軽鎖定常領域をコードする遺伝子を有する動物細胞のための発現ベクターに挿入することによってヒト化抗体発現ベクターを構築し、発現ベクターを動物細胞に導入することによって遺伝子を発現させることにより、本発明のヒト化抗体を作製することができる。

ヒト化抗体発現ベクターは、抗体重鎖をコードする遺伝子と抗体軽鎖をコードする遺伝子が別々のベクター上に存在する型、または両方の遺伝子が同じベクター上に存在する型（タンデム型）のいずれであってもよい。

従来の組換えＤＮＡおよび遺伝子トランスフェクション技法に基づいてヒト化抗体を作製するための方法は当技術分野で周知である（例えば、Riechmann L. et al. 1988; Neuberger M S. et al. 1985を参照されたい）。抗体のヒト化は、例えば、ＣＤＲ移植（ＥＰ２３９，４００；ＰＣＴ公開第ＷＯ９１／０９９６７号；米国特許第５，２２５，５３９号；同第５，５３０，１０１号；および同第５，５８５，０８９号）、ベニアリングまたはリサーフェイシング（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）（ＥＰ５９２，１０６；ＥＰ５１９，５９６；Padlan EA (1991)；Studnicka G M et al. (1994)；Roguska M A. et al. (1994)）、および鎖シャッフリング（米国特許第５，５６５，３３２号）を含めた当技術分野で公知の様々な技法を使用して行うことができる。そのような抗体を調製するための一般的な組換えＤＮＡ技術も公知である（欧州特許出願第ＥＰ１２５０２３号および国際特許出願第ＷＯ９６／０２５７６号を参照されたい）。

さらに、抗体断片を作製するための方法が周知である。例えば、本発明のＦａｂ断片を、ガングリオシドと特異的に反応する抗体をパパインなどのプロテアーゼで処理することによって得ることができる。また、抗体のＦａｂをコードするＤＮＡを原核生物発現系または真核生物発現系のためのベクターに挿入し、そのベクターを原核生物または真核生物（適宜）に導入して、Ｆａｂを発現させることにより、Ｆａｂを作製することができる。

同様に、本発明のＦ（ａｂ’）_２断片を、ガングリオシドと特異的に反応する抗体をプロテアーゼであるペプシンで処理することによって得ることができる。また、Ｆ（ａｂ’）_２断片を、下記のＦａｂ’をチオエーテル結合またはジスルフィド結合によって結合させることによって作製することもできる。

本発明のＦａｂ’断片を、ガングリオシドと特異的に反応するＦ（ａｂ’）_２を還元剤であるジチオスレイトールで処理することによって得ることができる。また、抗体のＦａｂ’断片をコードするＤＮＡを、原核生物のための発現ベクターまたは真核生物のための発現ベクターに挿入し、そのベクターを原核生物または真核生物（適宜）に導入して、その発現を実施することにより、Ｆａｂ’断片を作製することができる。

さらに、ＶＨおよびＶＬドメインをコードするｃＤＮＡを以前に記載されている通り得、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築し、そのＤＮＡを原核生物のための発現ベクターまたは真核生物のための発現ベクターに挿入し、次いで、その発現ベクターを原核生物または真核生物（適宜）に導入して、ｓｃＦｖを発現させることにより、本発明のｓｃＦｖを作製することができる。ヒト化ｓｃＦｖ断片を生成するために、ＣＤＲ移植と称される周知の技術を使用することができる。ＣＤＲ移植は、ドナーｓｃＦｖ断片から相補性決定領域（ＣＤＲ）を選択し、それらのＣＤＲを、３次構造が分かっているヒトｓｃＦｖ断片フレームワークに移植することを伴う（例えば、ＷＯ９８／４５３２２；ＷＯ８７／０２６７１；米国特許第５，８５９，２０５号；米国特許第５，５８５，０８９号；米国特許第４，８１６，５６７号；ＥＰ０１７３４９４を参照されたい）。

本発明のダイアボディ分子を、新規のタンパク質合成および結合性タンパク質をコードする核酸の組換え発現を含めた当技術分野で周知の種々の方法を使用して作製することができる。組換え方法によって、または固相ＤＮＡ合成によって所望の核酸配列を作製することができる。ダイアボディの例示的な作製方法は当技術分野で公知である（例えば、ＵＳ５６３７４８１Ａ、ＵＳ９０１７６８７Ｂ１、ＵＳ２０１８０１９４８４０Ａ１を参照されたい）。

抗原結合性タンパク質の改変
本明細書に記載の抗原結合性タンパク質（例えば、抗体またはその断片、例えば、ダイアボディ、Ｆ（ａｂ’）_２）のアミノ酸配列改変が意図されている。例えば、抗原結合性タンパク質（例えば、抗体またはその断片、例えば、ダイアボディ、Ｆ（ａｂ’）_２）の結合親和性および／または他の生物学的特性を改善することが望ましい場合がある。非ヒト動物に由来する抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのみをヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲに単に移植することによってヒト化抗体を作製する場合、抗原結合活性は非ヒト動物に由来する元の抗体と比較して低減することが公知である。非ヒト抗体のＶＨおよびＶＬの、ＣＤＲ内のアミノ酸残基だけでなくＦＲ内のアミノ酸残基のいくつかが抗原結合活性に直接的または間接的に関連すると考えられている。したがって、これらのアミノ酸残基をヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲに由来する異なるアミノ酸残基で置換することで結合活性が低減し、この低減を、これらのアミノ酸を非ヒト動物に由来する元の抗体のアミノ酸残基で置き換えることにより補正することができる。

本発明の抗体の構造、および本発明の抗体をコードするＤＮＡ配列に改変および変更を行い、それでもなお、望ましい特徴を有する抗体およびポリペプチドをコードする機能的分子を得ることができる。例えば、タンパク質構造内のある特定のアミノ酸を、活性の明らかな低下を伴わずに、他のアミノ酸で置換することができる。タンパク質の相互作用的能力および性質によりタンパク質の生物学的機能活性が定義されるので、タンパク質配列、および当然そのＤＮＡコード配列においてある特定のアミノ酸置換を行い、それにもかかわらず、同様の特性を有するタンパク質を得ることができる。したがって、本発明の抗体配列、または前記ポリペプチドをコードする対応するＤＮＡ配列において、それらの生物活性の明らかな低下を伴わずに、種々の変化をなすことができることが意図されている。

一実施形態では、ＤＮＡ配列内のコドンを、遺伝暗号の保存に基づいた保存的置換をコードするように変更することにより、アミノ酸の変化を実現することができる。具体的には、特定のタンパク質のアミノ酸配列とそのタンパク質をコードし得るヌクレオチド配列との間に、遺伝暗号（以下に示す）によって定義される公知の明確な対応が存在する。同様に、特定の核酸のヌクレオチド配列とその核酸によってコードされるアミノ酸配列との間に、遺伝暗号（上記の遺伝暗号チャートを参照されたい）によって定義される公知の明確な対応が存在する。

上記の通り、遺伝暗号の重要な周知の特色は、タンパク質を構成するために使用されるアミノ酸の大多数に１つよりも多くのコードヌクレオチドトリプレットが使用され得る（上に例示されている）という重複性である。したがって、いくつかの異なるヌクレオチド配列が所与のアミノ酸配列をコードし得る。そのようなヌクレオチド配列は、全ての生物体において同じアミノ酸配列の産生をもたらすので（ある特定の生物体では一部の配列が他の配列よりも効率的に翻訳される場合があるが）、機能的に等価であるとみなされる。さらに、時々、プリンまたはピリミジンのメチル化バリアントが所与のヌクレオチド配列に見いだされ得る。そのようなメチル化はトリヌクレオチドコドンと対応するアミノ酸との間のコード関連性には影響を及ぼさない。

ポリペプチドのアミノ配列を変化させることに関して、アミノ酸の疎水性親水性指標を考慮することができる。タンパク質に相互作用的な生物学的機能を付与することにおけるアミノ酸の疎水性親水性指標の重要性は当技術分野において一般に理解されている。アミノ酸の相対的なハイドロパシー的特性が得られるタンパク質の二次構造に寄与し、今度はそれによりタンパク質と他の分子、例えば、酵素、基質、受容体、ＤＮＡ、抗体、抗原などの相互作用が規定されることが許容される。各アミノ酸に、それらの疎水性および電荷特徴に基づいて疎水性親水性指標が割り当てられており、以下の通りである：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（－０．４）；トレオニン（－０．７）；セリン（－０．８）；トリプトファン（－０．９）；チロシン（－１．３）；プロリン（－１．６）；ヒスチジン（－３．２）；グルタミン酸（－３．５）；グルタミン（－３．５）；アスパラギン酸（＜ＲＴＩ３．５）；アスパラギン（－３．５）；リシン（－３．９）；およびアルギニン（－４．５）。

ある特定のアミノ酸を同様の疎水性親水性指標またはスコアを有する他のアミノ酸で置換することができ、それでもなお同様の生物活性を有するタンパク質がもたらされる、すなわち、それでもなお生物学的機能的に等価のタンパク質が得られることが当技術分野で公知である。

上に概説されている通り、したがって、一般に、アミノ酸置換は、アミノ酸側鎖置換基の相対的な類似性、例えば、それらの疎水性、親水性、電荷、サイズなどに基づく。種々の前述の特徴を考慮した例示的な置換は当業者に周知であり、それらとして、アルギニンとリシン；グルタミン酸とアスパラギン酸；セリンとトレオニン；グルタミンとアスパラギン；およびバリン、ロイシンとイソロイシンが挙げられる。

例えば、安定性を増大させるために、抗体の元のグリコシル化パターンを変更するために、本発明の抗体の別の型のアミノ酸改変が有用であり得る。「変更すること（ａｌｔｅｒｉｎｇ）」とは、抗体に見いだされる１つもしくは複数の炭水化物部分を欠失させること、および／または抗体に存在しない１つもしくは複数のグリコシル化部位を付加することを意味する。抗体のグリコシル化は、一般にはＮ結合型である。「Ｎ結合型」とは、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の付着を指す。アスパラギン－Ｘ－セリンおよびアスパラギン－Ｘ－トレオニンというトリペプチド配列（配列中、Ｘはプロリン以外の任意のアミノ酸である）が、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素的付着の認識配列である。したがって、これらのトリペプチド配列のいずれかがポリペプチド内に存在することにより、潜在的なグリコシル化部位が創出される。抗体へのグリコシル化部位の付加は、アミノ酸配列を、上記のトリペプチド配列の１つまたは複数を含有するように（Ｎ結合型グリコシル化部位として）変更することによって都合よく実現される。別の型の共有結合性改変は、抗体のグリコシドを化学的または酵素的にカップリングすることを伴う。これらの手順は、Ｎ結合型またはＯ結合型グリコシル化のためのグリコシル化能力を有する宿主細胞において抗体を産生させる必要がないという点で有利である。使用されるカップリング方式に応じて、糖を（ａ）アルギニンおよびヒスチジン、（ｂ）遊離のカルボキシル基、（ｃ）システインのものなどの遊離のスルフヒドリル基、（ｄ）セリン、トレオニン、もしくはヒドロキシプロリンのものなどの遊離のヒドロキシル基、（ｅ）フェニルアラニン、チロシン、もしくはトリプトファンのものなどの芳香族残基、または（ｆ）グルタミンのアミド基に付着させることができる。例えば、そのような方法は、ＷＯ８７／０５３３０に記載されている。

同様に、抗体に存在する任意の炭水化物部分の除去を化学的または酵素的に実現することができる。化学的な脱グリコシルには、抗体を化合物トリフルオロメタンスルホン酸、または相当する化合物に曝露させることが必要である。この処理により、連結している糖（Ｎ－アセチルグルコサミンまたはＮ－アセチルガラクトサミン）以外の大多数または全ての糖の切断がもたらされる一方で、抗体はインタクトなまま残る。化学的な脱グリコシルは、Sojahr H. et al. (1987)およびEdge, A S. et al. (1981)により記載されている。抗体の炭水化物部分の酵素による切断は、Thotakura, N R. et al. (1987)に記載されている通り、種々のエンドグリコシダーゼおよびエキソグリコシダーゼを使用することによって実現することができる。

他の改変は、イムノコンジュゲートの形成を伴い得る。例えば、共有結合性の改変の１つの型では、抗体またはタンパク質を種々の非タンパク質ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレンのうちの１つと、米国特許第４，６４０，８３５号；同第４，４９６，６８９号；同第４，３０１，１４４号；同第４，６７０，４１７号；同第４，７９１，１９２号または同第４，１７９，３３７号に記載されている様式で共有結合により連結する。

本発明の抗体または他のタンパク質と異種薬剤のコンジュゲーションは、これだけに限定されないが、Ｎ－スクシンイミジル（２－ピリジルジチオ）プロピオン酸（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えば、アジプイミド酸ジメチルＨＣＬなど）、活性エステル（例えば、スベリン酸ジサクシンイミジルなど）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒドなど）、ビス－アジド化合物（例えば、ビス（ｐ－アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンなど）、ビス－ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス－（ｐ－ジアゾニウムベンゾイル）－エチレンジアミンなど）、ジイソシアン酸（例えば、トルエン２，６ジイソシアン酸など）、およびビス－活性フッ素化合物（例えば、１，５－ジフルオロ－２，４－ジニトロベンゼンなど）を含めた種々の二官能性タンパク質カップリング剤を使用して行うことができる。例えば、炭素標識された１－イソチオシアネートベンジルメチルジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＭＸ－ＤＴＰＡ）は、抗体への放射性ヌクレオチド（ｒａｄｉｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）のコンジュゲーションのための例示的なキレート剤である（ＷＯ９４／１１０２６）。

別の態様では、本発明は、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏにおける検出を可能にする部分とコンジュゲートしたＣＴＬＡ４に特異的に結合する抗原結合性タンパク質（例えば、抗体またはその断片、例えば、ダイアボディ、Ｆ（ａｂ’）_２）を特色とする。コンジュゲートした抗原結合性タンパク質を使用して、臨床試験の手順の一部として血液または組織中のその存在をモニタリングすることができる。検出可能な部分の例としては、種々の酵素、補欠分子族、蛍光材料、発光材料、生物発光材料、および放射性材料が挙げられる。適切な酵素の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられる。適切な補欠分子族複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられる。適切な蛍光材料の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリトリン（ＰＥ）が挙げられる。発光材料の例としては、ルミノールが挙げられる；生物発光材料の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンが挙げられる。適切な放射性材料の例としては、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^３５Ｓ、または^３Ｈが挙げられる。本明細書で使用される場合、「標識された」という用語は、抗体に関しては、検出可能な物質、例えば、放射性薬剤またはフルオロフォア（例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）またはフィコエリトリン（ＰＥ）またはインドシアニン（Ｃｙ５））を抗体にカップリングすること（すなわち、物理的に連結すること）によって抗体を直接標識すること、ならびに、検出可能な物質との反応性によって抗体を間接的に標識することを包含するものとする。例えば、増幅させ、検出することができる核酸配列、または、特定の遺伝子の発現を低減させ、その結果、その後に発現を検出し、測定することができる、アンチセンスオリゴヌクレオチドで抗体を標識することができる。

そのような治療用部分を抗原結合性タンパク質（例えば、抗体またはその断片）にコンジュゲートするための技法は周知であり、例えば、Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243 56 (Alan R. Liss, Inc. 1985)；Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623 53 (Marcel Dekker, Inc. 1987)；Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475 506 (1985)；"Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303 16 (Academic Press 1985)、およびThorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62: 119 58 (1982)を参照されたい。

コンジュゲート
本開示は、第２の部分（例えば、異種部分、コンジュゲート部分）と付着、連結またはコンジュゲートした抗原結合性タンパク質も提供する。したがって、本開示は、抗原結合性タンパク質と異種部分とを含むコンジュゲートを提供する。本明細書で使用される場合、「異種部分」という用語は、「コンジュゲート部分」と同義であり、本開示の抗原結合性タンパク質とは異なる任意の分子（化学的または生化学的、天然に存在するまたはコードされていないもの）を指す。種々の異種部分には、これだけに限定されないが、ポリマー、炭水化物、脂質、核酸、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡまたはＲＮＡ、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、治療剤、（例えば、細胞傷害剤、サイトカイン）、または診断剤が含まれる。

一部の実施形態では、異種部分は、ポリマーである。ポリマーは、分枝であっても非分枝であってもよい。ポリマーは、任意の分子量のものであってよい。一部の実施形態では、ポリマーの平均分子量は約２ｋＤａから約１００ｋＤａの間である（「約」という用語は、水溶性ポリマーの調製物中、明記された分子量よりも分子量が大きい分子もあり、小さい分子もあることを意味する）。一部の態様では、ポリマーの平均分子量は、約５ｋＤａから約５０ｋＤａの間、約１２ｋＤａから約４０ｋＤａの間、または約２０ｋＤａから約３５ｋＤａの間である。

一部の実施形態では、ポリマーを、アシル化のための活性エステルまたはアルキル化のためのアルデヒドなどの単一の反応性基を有し、したがって、重合度を制御することができるように改変する。一部の実施形態では、ポリマーは、水溶性であり、したがって、ポリマーを付着させたタンパク質は、生理的環境などの水性環境では沈殿しない。一部の実施形態では、例えば、組成物を治療的使用のために使用する場合、ポリマーは、薬学的に許容されるものである。さらに、一部の態様では、ポリマーは、ポリマーの混合物、例えば、共重合体、ブロック共重合体である。

一部の実施形態では、ポリマーは、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリアルキレンおよびポリアルキレングリコール、ポリアルキレンオキシド、ポリアルキレンテレフタレートを含めたその誘導体、ポリメチルメタクリレート、ポリエチルメタクリレート、ポリブチルメタクリレート、ポリイソブチルメタクリレート、ポリヘキシルメタクリレート、ポリイソデシルメタクリレート、ポリラウリルメタクリレート、ポリフェニルメタクリレート、ポリメチルアクリレート、ポリイソプロピルアクリレート、ポリイソブチルアクリレート、およびポリオクタデシルアクリレートを含めたアクリルおよびメタクリルエステルのポリマー、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、ポリビニルエステル、ポリハロゲン化ビニル、ポリ（酢酸ビニル）、およびポリビニルピロリドンを含めたポリビニルポリマー、ポリグリコリド、ポリシロキサン、ポリウレタンおよびその共重合体、アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、セルロースエーテル、セルロースエステル、ニトロセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシ－プロピルメチルセルロース、ヒドロキシブチルメチルセルロース、酢酸セルロース、プロピオン酸セルロース、酪酸酢酸セルロース、酢酸フタル酸セルロース、カルボキシルエチルセルロース（carboxylethyl cellulose）、三酢酸セルロース、およびセルロース硫酸ナトリウム塩を含めたセルロース、ポリプロピレン、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（エチレンオキシド）、およびポリ（エチレンテレフタレート）を含めたポリエチレン、ならびにポリスチレンからなる群から選択される。

本発明における使用のために特に好ましい水溶性ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。本明細書で使用される場合、ポリエチレングリコールは、モノ（Ｃ１～Ｃ１０）アルコキシまたはアリールオキシポリエチレングリコールなどの、他のタンパク質の誘導体化に使用することができる任意の形態のＰＥＧを包含するものとする。ＰＥＧは、広範囲の分子量で入手可能であり、水および大多数の有機溶媒に可溶性である、直鎖または分枝状の中性ポリエーテルである。

一部の実施形態では、異種部分は炭水化物である。一部の実施形態では、炭水化物は、単糖（例えば、グルコース、ガラクトース、フルクトース）、二糖（例えば、スクロース、ラクトース、マルトース）、オリゴ糖（例えば、ラフィノース、スタキオース）、多糖（デンプン、アミラーゼ、アミロペクチン、セルロース、キチン、カロース、ラミナリン、キシラン、マンナン、フコイダン、ガラクトマンナンである。

一部の実施形態では、異種部分は脂質である。一部の実施形態では、脂質は、脂肪酸、エイコサノイド、プロスタグランジン、ロイコトリエン、トロンボキサン、Ｎ－アシルエタノールアミン）、グリセロ脂質（例えば、一置換、二置換、三置換グリセロール）、グリセロリン脂質（例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン）、スフィンゴ脂質（例えば、スフィンゴシン、セラミド）、ステロール脂質（例えば、ステロイド、コレステロール）、プレノール脂質、糖脂質（ｓａｃｃｈａｒｏｌｉｐｉｄ）、またはポリケチド、油、蝋、コレステロール、ステロール、脂溶性ビタミン、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、リン脂質である。

一部の実施形態では、異種部分は治療剤である。治療剤は、当技術分野で公知の治療剤のいずれであってもよい。本発明で意図されている治療剤の例としては、これだけに限定されないが、天然の酵素、天然の供給源に由来するタンパク質、組換えタンパク質、天然のペプチド、合成ペプチド、環状ペプチド、抗体、受容体アゴニスト、細胞傷害剤、免疫グロブリン、ベータ－アドレナリン作動性遮断剤、カルシウムチャネル遮断薬、冠状動脈血管拡張薬、強心配糖体、抗不整脈薬、心臓交感神経作動薬、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤、利尿薬、変力物質、コレステロールおよびトリグリセリド減少薬、胆汁酸捕捉剤、フィブラート系薬剤、３－ヒドロキシ－３－メチルグルテリル（ＨＭＧ）－ＣｏＡレダクターゼ阻害剤、ナイアシン誘導体、抗アドレナリン剤、アルファ－アドレナリン作動性遮断剤、中枢作用性抗アドレナリン剤、血管拡張薬、カリウム保持性薬剤、チアジドおよび関連する薬剤、アンジオテンシンＩＩ受容体アンタゴニスト、末梢性血管拡張薬、抗アンドロゲン薬、エストロゲン、抗生物質、レチノイド、インスリンおよび類似体、アルファ－グルコシダーゼ阻害剤、ビグアナイド系化合物、メグリチニド、スルホニル尿素系、チアゾリジンジオン、アンドロゲン、プロゲストーゲン、骨代謝調節薬、下垂体前葉ホルモン、視床下部ホルモン、下垂体後葉ホルモン、ゴナドトロピン、ゴナドトロピン放出ホルモンアンタゴニスト、排卵刺激薬、選択的エストロゲン受容体モジュレーター、抗甲状腺剤、甲状腺ホルモン、膨張性薬剤（ｂｕｌｋ ｆｏｒｍｉｎｇ ａｇｅｎｔ）、緩下剤、嬬動抑制薬、細菌叢調整薬（ｆｌｏｒａ ｍｏｄｉｆｉｅｒ）、腸内吸着薬（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ａｄｓｏｒｂｅｎｔ）、腸内抗感染薬、食欲増進薬（ａｎｔｉａｎｏｒｅｘｉｃ）、抗悪液質薬（ａｎｔｉｃａｃｈｅｘｉｃ）、抗過食薬（ａｎｔｉｂｕｌｉｍｉｃ）、食欲抑制薬、抗肥満剤、制酸薬、上部消化管に対する薬剤（ｕｐｐｅｒ ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｔｒａｃｔ ａｇｅｎｔ）、抗コリン剤、アミノサリチル酸誘導体、生物学的応答改変因子、コルチコステロイド、鎮痙薬、５－ＨＴ_４部分的アゴニスト、抗ヒスタミン薬、カンナビノイド、ドーパミンアンタゴニスト、セロトニンアンタゴニスト、細胞保護薬、ヒスタミンＨ２受容体アンタゴニスト、粘膜保護剤、プロトンポンプ阻害剤、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ根絶療法、赤血球生成促進薬、造血剤、貧血に対する薬剤（ａｎｅｍｉａ ａｇｅｎｔ）、ヘパリン、抗線溶薬、止血薬、血液凝固因子、アデノシン二リン酸阻害剤、糖タンパク質受容体阻害剤、フィブリノーゲン－血小板結合性阻害剤、トロンボキサン－Ａ_２阻害剤、プラスミノーゲン活性化因子、抗血栓剤、グルココルチコイド、ミネラルコルチコイド、コルチコステロイド、選択的免疫抑制剤、抗真菌薬、予防的治療に伴う薬物、ＡＩＤＳ関連感染症、サイトメガロウイルス、非ヌクレオシド系逆転写酵素阻害剤、ヌクレオシド類似体逆転写物阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、貧血、カポジ肉腫、アミノグリコシド、カルバペネム、セファロスポリン、糖ペプチド、リンコサミド、マクロライド系薬、オキサゾリジノン、ペニシリン、ストレプトグラミン、スルホンアミド、トリメトプリムおよび誘導体、テトラサイクリン、駆虫薬、抗アメーバ薬、ビグアナイド系化合物、キナアルカロイド、葉酸アンタゴニスト、キノリン誘導体、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ療法、ヒドラジド、イミダゾール、トリアゾール、ニトロイミダゾール、環状アミン、ノイラミニダーゼ阻害剤、ヌクレオシド、リン酸結合物質、コリンエステラーゼ阻害剤、補助的療法、バルビツール酸系薬および誘導体、ベンゾジアゼピン系薬、ガンマアミノ酪酸誘導体、ヒダントイン誘導体、イミノスチルベン誘導体、スクシンイミド誘導体、抗痙攣薬、麦角アルカロイド、抗片頭痛調製物、生物学的応答改変因子、カルバミン酸エステル、三環式誘導体、脱分極剤、非脱分極性剤、神経筋麻痺剤、ＣＮＳ刺激薬、ドーパミン作動性試薬、モノアミン酸化酵素阻害薬、ＣＯＭＴ阻害剤、スルホン酸アルキル、エチレンイミン、イミダゾテトラジン、ナイトロジェンマスタード類似体、ニトロソ尿素、白金含有化合物、代謝拮抗薬、プリン類似体、ピリミジン類似体、尿素誘導体、アントラサイクリン系薬、アクチノマイシンｄ、カンプトテシン誘導体、エピポドフィロトキシン、タキサン、ビンカアルカロイドおよび類似体、抗アンドロゲン薬、抗エストロゲン薬、非ステロイド性アロマターゼ阻害剤、プロテインキナーゼ阻害剤系抗悪性腫瘍薬、アザスピロデカンジオン誘導体、抗不安薬、刺激薬、モノアミン再取り込み阻害薬、選択的セロトニン再取り込み阻害剤、抗うつ薬、ベンズイソオキサゾール誘導体、ブチロフェノン誘導体、ジベンゾジアゼピン誘導体、ジベンゾチアゼピン誘導体、ジフェニルブチルピペリジン誘導体、フェノチアジン、チエノベンゾジアゼピン誘導体、チオキサンテン誘導体、アレルゲンエキス、非ステロイド剤、ロイコトリエン受容体アンタゴニスト、キサンチン、エンドセリン受容体アンタゴニスト、プロスタグランジン、肺サーファクタント、粘液溶解薬、抗有糸分裂薬、尿酸排泄薬、キサンチンオキシダーゼ阻害剤、ホスホジエステラーゼ阻害剤、メテナミン塩、ニトロフラン誘導体、キノロン、平滑筋弛緩薬、副交感神経刺激剤、ハロゲン化炭化水素、アミノ安息香酸のエステル、アミド（例えば、リドカイン、アルチカイン塩酸塩、ブピバカイン塩酸塩）、解熱薬、睡眠薬および鎮静薬、シクロピロロン、ピラゾロピリミジン、非ステロイド性抗炎症薬、オピオイド、パラ－アミノフェノール誘導体、アルコールデヒドロゲナーゼ阻害剤、ヘパリンアンタゴニスト、吸着剤、催吐薬、オピオイドアンタゴニスト、コリンエステラーゼ再賦活薬、ニコチン補充療法、ビタミンＡ類似体およびアンタゴニスト、ビタミンＢ類似体およびアンタゴニスト、ビタミンＣ類似体およびアンタゴニスト、ビタミンＤ類似体およびアンタゴニスト、ビタミンＥ類似体およびアンタゴニスト、ビタミンＫ類似体およびアンタゴニストが挙げられる。

本開示の抗原結合性タンパク質を、腫瘍転移の阻害に有効な１つまたは複数のサイトカインおよび増殖因子とコンジュゲートすることができ、ここで、サイトカインまたは増殖因子は、少なくとも１つの細胞集団に対して抗増殖効果を有することが示されているものである。そのようなサイトカイン、リンフォカイン、増殖因子、または他の造血因子としては、これだけに限定されないが、Ｍ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＴＮＦ、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１４、ＩＬ－１５、ＩＬ－１６、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＦＮ、ＴＮＦα、ＴＮＦ１、ＴＮＦ２、Ｇ－ＣＳＦ、Ｍｅｇ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、トロンボポエチン、幹細胞因子、およびエリスロポエチンが挙げられる。本発明において使用するための追加的な増殖因子として、アンジオゲニン、骨形態形成タンパク質－１、骨形態形成タンパク質－２、骨形態形成タンパク質－３、骨形態形成タンパク質－４、骨形態形成タンパク質－５、骨形態形成タンパク質－６、骨形態形成タンパク質－７、骨形態形成タンパク質－８、骨形態形成タンパク質－９、骨形態形成タンパク質－１０、骨形態形成タンパク質－１１、骨形態形成タンパク質－１２、骨形態形成タンパク質－１３、骨形態形成タンパク質－１４、骨形態形成タンパク質－１５、骨形態形成タンパク質受容体ＩＡ、骨形態形成タンパク質受容体ＩＢ、脳由来神経栄養因子、毛様体神経栄養因子、毛様体神経栄養因子受容体α、サイトカイン誘導型好中球走化性因子１、サイトカイン誘導型好中球走化性因子２α、サイトカイン誘導型好中球走化性因子２β、β内皮細胞増殖因子、エンドセリン１、上皮由来好中球誘引物質、グリア細胞株由来神経栄養因子受容体α１、グリア細胞株由来神経栄養因子受容体α２、成長関連タンパク質、成長関連タンパク質α、成長関連タンパク質β、成長関連タンパク質γ、ヘパリン結合性上皮増殖因子、肝細胞増殖因子、肝細胞増殖因子受容体、インスリン様増殖因子Ｉ、インスリン様増殖因子受容体、インスリン様増殖因子ＩＩ、インスリン様増殖因子結合タンパク質、ケラチノサイト増殖因子、白血病抑制因子、白血病抑制因子受容体α、神経増殖因子 神経増殖因子受容体、ニューロトロフィン－３、ニューロトロフィン－４、プレＢ細胞成長刺激因子、幹細胞因子、幹細胞因子受容体、トランスフォーミング増殖因子α、トランスフォーミング増殖因子β、トランスフォーミング増殖因子β１、トランスフォーミング増殖因子β１．２、トランスフォーミング増殖因子β２、トランスフォーミング増殖因子β３、トランスフォーミング増殖因子β５、潜在型トランスフォーミング増殖因子β１、トランスフォーミング増殖因子β結合性タンパク質Ｉ、トランスフォーミング増殖因子β結合性タンパク質ＩＩ、トランスフォーミング増殖因子β結合性タンパク質ＩＩＩ、腫瘍壊死因子受容体Ｉ型、腫瘍壊死因子受容体ＩＩ型、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子受容体、およびキメラタンパク質ならびにこれらの生物学的または免疫学的に活性な断片が挙げられる。

本開示は、ポリペプチドと連結した本開示の抗原結合性タンパク質を含む、融合タンパク質であるコンジュゲートも提供する。したがって、本開示は、ポリペプチドと連結した本開示の抗原結合性タンパク質を含む融合タンパク質を提供する。種々の実施形態では、ポリペプチドは、診断用標識、例えば、蛍光タンパク質、例えば緑色蛍光タンパク質、または他のタグ、例えばＭｙｃタグである。種々の態様では、ポリペプチドは、上に列挙されているサイトカイン、リンフォカイン、増殖因子、または他の造血因子のうちの１つである。

組成物、医薬組成物、および製剤
本開示の抗原結合性タンパク質、核酸、ベクター、宿主細胞、またはコンジュゲートを含む組成物が本発明で提供される。組成物は、一部の態様では、抗原結合性タンパク質を単離および／または精製された形態で含む。一部の態様では、組成物は、単一の型（例えば、構造）の本開示の抗原結合性タンパク質を含む、または２つもしくはそれよりも多くの本開示の抗原結合性タンパク質の組合せを含み、組合せは、異なる型（例えば、構造）の２つもしくはそれよりも多くの抗原結合性タンパク質を含む。

一部の態様では、組成物は、抗原結合性タンパク質の物理化学的特色を、例えば、ある特定の温度、例えば室温における抗原結合性タンパク質を安定化すること、貯蔵寿命を延長させること、分解、例えば、酸化プロテアーゼ媒介性分解を低減させること、抗原結合性タンパク質の半減期を延長させることなどによって増強する薬剤を含む。一部の態様では、組成物は、異種部分またはコンジュゲート部分として本明細書に開示される薬剤のいずれかを、必要に応じて、本開示の抗原結合性タンパク質との混和物として、または抗原結合性タンパク質とのコンジュゲートとして含む。

本開示の種々の態様では、組成物は、薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤をさらに含む。一部の実施形態では、本開示の抗原結合性タンパク質、核酸、ベクター、宿主細胞、またはコンジュゲート（以下「活性薬剤」と称される）を、活性薬剤を薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と共に含む医薬組成物に製剤化する。この点について、本開示は、さらに、対象、例えば哺乳動物への投与が意図された、活性薬剤を含む医薬組成物を提供する。

一部の実施形態では、活性薬剤は、医薬組成物中に、患者への投与のための適切な純度レベルで存在する。一部の実施形態では、活性薬剤は、少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％または約９９％の純度レベル、および薬学的に許容される希釈剤、担体または賦形剤を有する。一部の実施形態では、組成物は、活性薬剤を約０．００１～約３０．０ｍｇ／ｍｌの濃度で含有する。

種々の態様では、医薬組成物は、薬学的に許容される担体を含む。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」という用語は、任意の標準の医薬担体、例えば、リン酸緩衝食塩水溶液、水、油／水または水／油エマルションなどのエマルション、および種々の型の湿潤剤を包含する。この用語は、ヒトを含めた動物への使用に関して米国連邦政府の規制当局による承認を受けたまたは米国薬局方に収載されている任意の薬剤も包含する。

医薬組成物は、例えば、酸性化剤、添加剤、吸着剤、エアロゾル噴射剤、空気置換剤、アルカリ化剤、固化防止剤、抗凝固薬、抗菌保存剤、抗酸化剤、防腐剤、基剤、結合剤、緩衝剤、キレート剤、コーティング剤、着色料、乾燥剤、界面活性剤、希釈剤、消毒薬、崩壊剤、分散剤、溶解増強剤、染料、皮膚軟化剤、乳化剤、エマルション安定剤、充填剤、フィルム形成剤、調味料、香味剤、流動促進剤、ゲル化剤、増粒剤、保水剤、滑沢剤、粘膜接着剤、軟膏基剤、軟膏剤、油性ビヒクル、有機塩基、パステル基剤、色素、可塑剤、研磨剤、保存剤、封鎖剤、皮膚浸透剤、可溶化剤、溶媒、安定化剤、坐薬基剤、表面活性剤、界面活性物質、懸濁化剤、甘味剤、治療剤、増粘剤、等張化剤、毒性薬剤、粘度増加剤、吸水剤、水混和性共溶媒、硬水軟化剤、または湿潤剤を含めた任意の薬学的に許容される成分を含み得る。例えば、その全体が参照によって組み込まれるthe Handbook of Pharmaceutical Excipients, Third Edition, A. H. Kibbe (Pharmaceutical Press, London, UK, 2000)、その全体が参照によって組み込まれるRemington's Pharmaceutical Sciences, Sixteenth Edition, E. W. Martin (Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1980)を参照されたい。

種々の態様では、医薬組成物は、使用される投薬量および濃度でレシピエントに対して非毒性の製剤材料を含む。特定の実施形態では、医薬組成物は、活性薬剤および１つまたは複数の薬学的に許容される塩；ポリオール；界面活性物質；浸透圧調整剤；等張化剤；抗酸化剤；抗生物質；抗真菌薬；増量剤；凍結保護剤；消泡剤；キレート剤；保存剤；着色剤；鎮痛薬；または追加的な薬学的作用剤を含む。種々の態様では、医薬組成物は、１つまたは複数のポリオールおよび／または１つまたは複数の界面活性物質、必要に応じて、さらに、これだけに限定されないが、薬学的に許容される塩；浸透圧調整剤（等張化剤）；抗酸化剤；抗生物質；抗真菌薬；増量剤；凍結保護剤；消泡剤；キレート剤；保存剤；着色剤；および鎮痛薬を含めた１つまたは複数の賦形剤を含む。

ある特定の実施形態では、医薬組成物は、例えば、組成物のｐＨ、容量オスモル濃度、粘度、透明性、色、等張性、匂い、無菌性、安定性、溶解もしくは放出速度、吸着または浸透を改変する、維持するまたは保存するための製剤材料を含有し得る。そのような実施形態では、適切な製剤材料として、これだけに限定されないが、アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリシンなど）；抗菌薬；抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウムまたは亜硫酸水素ナトリウムなど）；緩衝剤（例えば、ホウ酸、炭酸水素、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、クエン酸、リン酸または他の有機酸など）；増量剤（例えば、マンニトールまたはグリシンなど）；キレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）など）；錯化剤（例えば、カフェイン、ポリビニルピロリドン、ベータ－シクロデキストリンまたはヒドロキシプロピル－ベータ－シクロデキストリンなど）；充填剤；単糖；二糖；および他の炭水化物（例えば、グルコース、マンノースまたはデキストリンなど）；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなど）；着色料、香味剤および希釈剤；乳化剤；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドンなど）；低分子量ポリペプチド；塩形成性対イオン（例えば、ナトリウムなど）；保存剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチル アルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸または過酸化水素など）；溶媒（例えば、グリセリン、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールなど）；糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトールなど）；懸濁化剤；界面活性物質または湿潤剤（例えば、プルロニック（登録商標）、ＰＥＧ、ソルビタンエステル、ポリソルベート２０、ポリソルベートなどのポリソルベート類、トリトン、トロメタミン、レシチン、コレステロール、チロキサポール（tyloxapal）など）；安定性増強剤（例えば、スクロースまたはソルビトールなど）；張度増強剤（例えば、ハロゲン化アルカリ金属、好ましくはナトリウムまたは塩化カリウム、マンニトール、ソルビトールなど）；送達ビヒクル；希釈剤；賦形剤および／または医薬補助剤が挙げられる。Remington's Pharmaceutical Sciences, 18" Edition, (A. R. Genrmo, ed.), 1990, Mack Publishing Companyを参照されたい。

生理的に適合性のｐＨが実現されるように医薬組成物を製剤化することができる。一部の実施形態では、医薬組成物のｐＨは、例えば、約４もしくは約５から約８．０の間、または約４．５から約７．５の間、または約５．０から約７．５の間であってよい。種々の実施形態では、医薬組成物のｐＨは、５．５から７．５の間である。

本開示は、医薬組成物を作製する方法を提供する。種々の態様では、方法は、抗原結合性タンパク質、コンジュゲート、融合タンパク質、核酸、ベクター、宿主細胞、またはこれらの組合せを、薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と組み合わせるステップを含む。

投与
本開示に関しては、活性薬剤、またはそれを含む医薬組成物を、対象に任意の適切な投与経路で投与することができる。例えば、活性薬剤を対象に非経口投与、経鼻投与、経口投与、経肺投与、局部投与、経膣投与、または直腸投与によって投与することができる。投与経路に関する以下の考察は、ただ単に種々の実施形態を例示するために提示するものであり、多少なりとも範囲を限定するものと解釈されるべきではない。

非経口投与のための適切な製剤としては、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、および製剤を意図されたレシピエントの血液と等張性にする溶質を含有し得る水性および非水性、等張性の滅菌注射液、ならびに、懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤、および保存剤を含み得る水性および非水性滅菌懸濁剤が挙げられる。「非経口的」という用語は、消化管を通じたものではなく、いくつかの他の経路、例えば、皮下、筋肉内、脊髄内、または静脈内などによるものであることを意味する。本開示の活性薬剤を、生理的に許容される希釈剤と共に、医薬担体、例えば、水、生理食塩水、水性ブドウ糖および関連する糖溶液、エタノールまたはヘキサデシルアルコールなどのアルコール、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールなどのグリコール、ジメチルスルホキシド、グリセロール、２，２－ジメチル－１，３－ジオキソラン－４－メタノールなどのケタール、エーテル、ポリ（エチレングリコール）４００、油、脂肪酸、脂肪酸エステルもしくはグリセリド、またはアセチル化脂肪酸グリセリドを含めた滅菌された液体または液体の混合物中、薬学的に許容される界面活性物質、例えば、セッケンまたは界面活性剤など、懸濁化剤、例えば、ペクチン、カルボマー、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、もしくはカルボキシメチルセルロースなど、または乳化剤および他の医薬補助剤の添加を伴ってまたは伴わずに、投与することができる。

非経口製剤に使用することができる油として、石油、動物油、植物油、または合成油が挙げられる。油の特定の例としては、ピーナッツ油、ダイズ油、ゴマ油、綿実油、トウモロコシ油、オリーブ油、ワセリン、および鉱油が挙げられる。非経口製剤に使用するための適切な脂肪酸としては、オレイン酸、ステアリン酸、およびイソステアリン酸が挙げられる。適切な脂肪酸エステルの例は、オレイン酸エチルおよびミリスチン酸イソプロピルである。

非経口製剤に使用するための適切なセッケンとしては、脂肪酸アルカリ金属、アンモニウム、およびトリエタノールアミン塩が挙げられ、適切な界面活性剤としては、（ａ）カチオン性界面活性剤、例えば、ジメチルジアルキルアンモニウムハロゲン化物、およびアルキルピリジニウムハロゲン化物など、（ｂ）陰イオン性界面活性剤、例えば、アルキル、アリール、およびオレフィンスルホン酸塩、アルキル、オレフィン、エーテル、およびモノグリセリド硫酸塩、およびスルホコハク酸塩など、（ｃ）非イオン界面活性剤、例えば、脂肪アミン酸化物、脂肪酸アルカノールアミド、およびポリオキシエチレンポリプロピレン共重合体など、（ｄ）両性界面活性剤、例えば、アルキル－β－アミノプロピオネート、および２－アルキル－イミダゾリン第四級アンモニウム塩など、ならびに（ｅ）これらの混合物が挙げられる。

非経口製剤は、一部の実施形態では、溶液中、約０．５重量％から約２５重量％までの本開示の活性薬剤を含有する。保存剤および緩衝剤を使用することができる。注射部位の刺激を最小限にするまたは排除するために、そのような組成物に、親水性－脂肪親和性平衡（ＨＬＢ）が約１２から約１７までの非イオン界面活性物質を１つまたは複数含有させることができる。そのような製剤中の界面活性物質の数量は、一般には、約５重量％から約１５重量％までにわたる。適切な界面活性物質としては、ソルビタンモノオレエートなどのポリエチレングリコールソルビタン脂肪酸エステル、および、プロピレンオキシドとプロピレングリコールの縮合によって形成される疎水性基部を有するエチレンオキシドの高分子量付加物が挙げられる。一部の態様では、非経口製剤を、単位用量または複数回用量の密封容器、例えばアンプルおよびバイアル中に入れて提供し、フリーズドライ（凍結乾燥）条件で保管することができ、使用する直前に注射用の滅菌された液体賦形剤、例えば水を添加するだけでよい。一部の態様では、即時注射液および懸濁液を、以前に記載されている滅菌された散剤、顆粒剤、および錠剤から調製する。

注射製剤は、本開示に従う。注射用組成物のための有効な医薬担体の要件は当業者には周知である（例えば、Pharmaceutics and Pharmacy Practice, J. B. Lippincott Company, Philadelphia, PA, Banker and Chalmers, eds., pages 238-250 (1982)、およびASHP Handbook on Injectable Drugs, Toissel, 4th ed., pages 622-630 (1986)を参照されたい）。

投薬量
本開示の活性薬剤は、腫瘍成長を阻害する方法、ならびに、がんを処置または予防する方法を含めた本明細書にさらに記載の他の方法において有用であると考えられる。本開示の目的に関して、投与される活性薬剤の量または用量は、例えば、対象または動物において妥当な時間枠にわたって治療的または予防的応答をもたらすために十分なものであるべきである。例えば、本開示の活性薬剤の用量は、投与時間から約１～４分間、１～４時間または１～４週間またはそれよりも長い、例えば、５～２０週間またはそれよりも長い期間中、本明細書に記載のがんを処置するために十分なものであるべきである。ある特定の実施形態では、期間はさらに長い場合がある。用量は、特定の活性薬剤の有効性および動物（例えば、ヒト）の状態、ならびに処置される動物（例えば、ヒト）の体重によって決定される。

投与される用量を決定するための多くのアッセイが当技術分野で公知である。本発明の目的に関して、所与の用量の本開示の活性薬剤を一組の哺乳動物の中の哺乳動物に投与し、哺乳動物の各組に異なる用量の活性薬剤を与薬した場合の、がんが処置される程度を比較することを含むアッセイを使用して、哺乳動物に投与される開始用量を決定することができる。ある特定の用量を投与した際にがんが処置される程度は、例えば、マウス異種移植モデルにおいて活性薬剤を用いて実現される腫瘍退縮の程度として表すことができる。腫瘍退縮をアッセイする方法は当技術分野で公知であり、本明細書の実施例に記載されている。

本開示の活性薬剤の用量はまた、本開示の特定の活性薬剤の投与に付随し得る任意の有害な副作用の存在、性質および程度によっても決定される。一般には、個々の患者それぞれを処置するための本開示の活性薬剤の投薬量は、年齢、体重、全体的な健康、食事、性別、投与される本開示の活性薬剤、投与経路、および処置される状態の重症度などの種々の因子を考慮して、担当医によって決定される。例として、本開示を限定することを意図せずに、本開示の活性薬剤の用量は、１日当たり処置される対象の体重１ｋｇ当たり約０．０００１～約１ｇ、１日当たり体重１ｋｇ当たり約０．０００１～約０．００１ｇ、または１日当たり体重１ｋｇ当たり約０．０１ｍｇ～約１ｇであり得る。

制御放出製剤
一部の実施形態では、本明細書に記載の活性薬剤を、デポ剤形態、したがって、本開示の活性薬剤の投与される体内に放出される様式が、時間および体内の場所に関して制御されるように改変することができる（例えば、米国特許第４，４５０，１５０号を参照されたい）。本開示の活性薬剤のデポ剤形態は、例えば、活性薬剤およびポリマーなどの多孔質または非多孔質材料を含み、活性薬剤が材料および／または非多孔質材料の分解産物に封入されているまたはその全体を通して拡散している、埋め込み型組成物であってよい。それから、デポ剤を対象の体内の所望の場所に埋め込み、埋め込み物から活性薬剤を所定の速度で放出させる。

ある特定の態様では、活性薬剤を含む医薬組成物を、任意の型のｉｎ ｖｉｖｏ放出プロファイルを有するように改変する。一部の態様では、医薬組成物は、即時放出、制御放出、持続放出、延長放出、遅延放出、または二相放出製剤である。制御放出のためにペプチドを製剤化する方法は当技術分野で公知である。例えば、Qian et al., J Pharm 374: 46-52 (2009)および国際特許出願公開第ＷＯ２００８／１３０１５８号；同第ＷＯ２００４／０３３０３６号；同第ＷＯ２０００／０３２２１８号；および同第ＷＯ１９９９／０４０９４２号を参照されたい。

本組成物は、例えば、ミセルもしくはリポソーム、もしくはいくつかの他の封入された形態をさらに含み得る、または、持続的な貯蔵および／または送達効果をもたらすために延長放出形態で投与することができる。

疾患を予防または処置する方法
本開示の抗原結合性タンパク質は、腫瘍成長の阻害のために有用である。特定の理論に縛られずに、本発明で提供される抗原結合性タンパク質の阻害作用により、そのような実体が、がんを処置する方法に有用なものになる。

ある特定の態様では、がんを患っている対象に対する予防または処置の方法であって、対象に、少なくとも１つの本開示の操作された抗原結合性タンパク質またはそれを含む医薬組成物を投与するステップを含む、方法が本発明で提供される。

ある特定の態様では、それを必要とする対象におけるがん細胞の増殖を低減させる方法であって、対象に、少なくとも１つの本開示の操作された抗原結合性タンパク質またはそれを含む医薬組成物を投与するステップを含む、方法も本発明で提供される。

対象における腫瘍成長を阻害する方法および対象における腫瘍サイズを低減させる方法が本発明でさらに提供される。種々の実施形態では、方法は、対象に本開示の医薬組成物を対象における腫瘍成長を阻害するまたは腫瘍サイズを低減させるために有効な量で投与するステップを含む。

ある特定の実施形態では、操作された抗原結合性タンパク質または医薬組成物を治療有効量で、それを必要とする対象に投与する。他の実施形態では、対象に対して自己または同種である細胞を得、本開示の操作された抗原結合性タンパク質の任意の１つをコードする核酸（またはそれを含むベクター）を用いて形質導入する（例えば、ＡＡＶなどのウイルスベクターによって）または他のやり方で形質転換する。好ましい実施形態では、そのような核酸は、宿主細胞のゲノムに安定に組み込まれる。核酸での形質転換が確認されたら、細胞を対象に導入して（例えば、移植するまたは埋め込む）、継続的な抗原結合性タンパク質の供給源を供給する（すなわち、移植された細胞によって発現され、血液中に分泌される）。

種々の態様では、黒色腫（例えば、切除不能なまたは転移性黒色腫）、腎細胞癌（ＲＣＣ）、結腸直腸がん、肝細胞癌、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、悪性胸膜中皮腫、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）、乳がん、頭頸部がん、膀胱がん、尿路上皮癌、メルケル細胞がん、子宮頸がん、肝細胞癌、胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、皮膚扁平上皮細胞がん、ホジキンリンパ腫、またはＢ細胞リンパ腫の成長を阻害する。種々の態様では、黒色腫（例えば、切除不能なまたは転移性黒色腫）、腎細胞癌（ＲＣＣ）、結腸直腸がん、肝細胞癌、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、悪性胸膜中皮腫、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）、乳がん、頭頸部がん、膀胱がん、尿路上皮癌、メルケル細胞がん、子宮頸がん、肝細胞癌、胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、皮膚扁平上皮細胞がん、ホジキンリンパ腫、またはＢ細胞リンパ腫のサイズを低減させる。

本明細書で使用される場合、「阻害する」または「低減させる」という用語およびそれらに由来する単語は、１００％または完全な阻害または低減ではない場合がある。そうではなく、潜在的な利益または治療効果があると当業者に理解される阻害または低減の程度は変動する。この点において、本開示の抗原結合性タンパク質は、任意の量またはレベルまで腫瘍成長を阻害し得るまたは腫瘍サイズを低減させ得る。種々の実施形態では、本開示の方法によってもたらされる阻害は、少なくともまたは約１０％の阻害（例えば、少なくともまたは約２０％の阻害、少なくともまたは約３０％の阻害、少なくともまたは約４０％の阻害、少なくともまたは約５０％の阻害、少なくともまたは約６０％の阻害、少なくともまたは約７０％の阻害、少なくともまたは約８０％の阻害、少なくともまたは約９０％の阻害、少なくともまたは約９５％の阻害、少なくともまたは約９８％の阻害）である。種々の実施形態では、本開示の方法によってもたらされる低減は、少なくともまたは約１０％の低減（例えば、少なくともまたは約２０％の低減、少なくともまたは約３０％の低減、少なくともまたは約４０％の低減、少なくともまたは約５０％の低減、少なくともまたは約６０％の低減、少なくともまたは約７０％の低減、少なくともまたは約８０％の低減、少なくともまたは約９０％の低減、少なくともまたは約９５％の低減、少なくともまたは約９８％の低減）である。

本明細書で使用される場合、「処置する」という用語ならびにそれに関連する単語は、必ずしも１００％または完全な処置を意味するものではない。そうではなく、潜在的な利益または治療効果があると当業者に認識される処置の程度は変動する。この点において、本開示のがんを処置する方法により、任意の量または任意のレベルの処置がもたらされ得る。さらに、本開示の方法によってもたらされる処置は、処置されるがんの１つまたは複数の状態または症状または徴候の処置を含み得る。また、本開示の方法によってもたらされる処置は、がんの増悪を緩徐化することを包含し得る。例えば、方法は、がんに対するＴ細胞活性または免疫応答を増強すること、腫瘍またはがんの成長を低減させること、腫瘍細胞の転移を低減させること、腫瘍またはがん細胞の細胞死を増加させることなどによってがんを処置することができるものである。種々の態様では、方法は、がんの発症または再発を少なくとも１日、２日、４日、６日、８日、１０日、１５日、３０日、２カ月、３カ月、４カ月、６カ月、１年、２年、３年、４年、またはそれよりも長く遅延させることによって処置するものである。種々の態様では、方法は、対象の生存を増大させることによって処置するものである。

本発明の任意の態様に適用すること、および／または本明細書に記載の任意の他の実施形態と組み合わせることができる多数の実施形態がさらに提供される。例えば、一部の実施形態では、少なくとも１つの操作された抗原結合性タンパク質または医薬組成物により、（ａ）がんにおいて増殖しているがん細胞の数が減少する；（ｂ）がんの腫瘍の体積もしくはサイズが低減する；（ｃ）がんに対する免疫応答が増大する；および／または（ｄ）Ｔ細胞が活性化される。

一部の実施形態では、方法は、対象に、追加的ながん治療を施行するステップをさらに含む。一部の実施形態では、追加的ながん治療は、免疫療法、チェックポイント遮断、がんワクチン、キメラ抗原受容体、化学療法、放射線照射、標的治療、および外科手術からなる群から選択され、必要に応じて、追加的ながん治療はニボルマブである。

ある特定の態様では、対象における免疫応答を増大させる方法であって、対象に、少なくとも１つの本開示の操作された抗原結合性タンパク質またはそれを含む医薬組成物を投与するステップを含む、方法が本発明で提供される。

ある特定の態様では、Ｔ細胞を活性化する方法であって、Ｔ細胞を、少なくとも１つの本開示の操作された抗原結合性タンパク質またはそれを含む医薬組成物と接触させるステップを含む、方法が本発明で提供される。そのような方法をｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、またはｅｘ ｖｉｖｏで使用することができる。

ある特定の態様では、それを必要とする対象におけるＣＴＬＡ４タンパク質の異所性発現または活性を特徴とする疾患または状態を予防または処置する方法であって、対象に、少なくとも１つの本開示の操作された抗原結合性タンパク質またはそれを含む医薬組成物を投与するステップを含む、方法が本発明で提供される。一部の実施形態では、疾患または状態は、がん、自己免疫疾患、感染、または炎症性疾患である。

がん
がん、腫瘍、または過剰増殖性障害とは、がんを引き起こす細胞に典型的な特徴、例えば、制御されない増殖、不死性、転移能、迅速な成長および増殖速度、およびある特定の特徴的な形態学的特色を有する細胞が存在することを指す。がん細胞は、多くの場合、腫瘍の形態であるが、そのような細胞は、動物内に単独で存在し得る、または、例えば白血病細胞など、非腫瘍形成性がん細胞であり得る。がんとしては、これだけに限定されないが、Ｂ細胞がん、例えば、多発性骨髄腫、ワルデンストレームマクログロブリン血症、例えばアルファ鎖病、ガンマ鎖病、およびミュー鎖病などの重鎖病、良性単クローン性免疫グロブリン血症、および免疫細胞アミロイドーシス、黒色腫、乳がん、肺がん、気管支がん、結腸直腸がん、前立腺がん、膵がん、胃がん（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）、卵巣がん、膀胱がん（ｕｒｉｎａｒｙ ｂｌａｄｄｅｒ ｃａｎｃｅｒ）、脳または中枢神経系がん、末梢神経系がん、食道がん、子宮頸がん、子宮または子宮体がん、口腔または咽頭のがん、肝がん、腎がん、精巣がん、胆道がん、小腸または虫垂がん、唾液腺がん、甲状腺がん（ｔｈｙｒｏｉｄ ｇｌａｎｄ ｃａｎｃｅｒ）、副腎がん、骨肉腫、軟骨肉腫、血液組織のがんなどが挙げられる。本発明に包含される方法に適用可能ながんの型の他の非限定的な例としては、ヒト肉腫および癌腫、例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、結腸直腸がん、膵がん、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性肺癌、腎細胞癌、ヘパトーマ、胆管癌、肝がん、絨毛癌、セミノーマ、胎児性癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸がん、骨がん、脳腫瘍、精巣がん、肺癌、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏枝神経膠腫、髄膜腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫；白血病、例えば、急性リンパ性白血病および急性骨髄球性白血病（骨髄芽球性白血病、前骨芽球性白血病、骨髄単球性白血病、単球性白血病および赤白血病）；慢性白血病（慢性骨髄球性（顆粒球性）白血病および慢性リンパ性白血病）；ならびに真性赤血球増加症、リンパ腫（ホジキン病および非ホジキン病）、多発性骨髄腫、ワルデンストレームマクログロブリン血症、および重鎖病が挙げられる。一部の実施形態では、がんは上皮性のものであり、それらとして、これだけに限定されないが、膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、結腸がん、婦人科のがん、腎がん（ｒｅｎａｌ ｃａｎｃｅｒ）、喉頭がん、肺がん、口腔がん、頭頸部がん、卵巣がん、膵がん、前立腺がん、または皮膚がんが挙げられる。他の実施形態では、がんは、乳がん、前立腺がん、肺がん、または結腸がんである。さらに他の実施形態では、上皮がんは、非小細胞肺がん、非乳頭状腎細胞癌、子宮頸癌、卵巣癌（例えば、漿液性卵巣癌）、または乳癌である。上皮がんは、これだけに限定されないが、漿液性、類内膜、粘液性、明細胞、ブレンナー、または未分化を含め、種々の他のやり方で特徴付けることができる。

一部の実施形態では、がんは、膵がん、肺がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、悪性胸膜中皮腫、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）、腎細胞癌（ＲＣＣ）、乳がん、肝がん、肝細胞癌、腎がん、皮膚がん、黒色腫、甲状腺がん（ｔｈｙｒｏｉｄ ｃａｎｃｅｒ）、胆嚢がん、頭頸部（扁平上皮）がん、胃がん（ｓｔｏｍａｃｈ（ｇａｓｔｒｉｃ）ｃａｎｃｅｒ）、頭頸部がん、膀胱がん、尿路上皮癌、メルケル細胞がん、結腸がん、結腸直腸がん、腸がん、卵巣がん、子宮頸がん、精巣がん、食道がん、頬粘膜がん、脳がん、血液がん、リンパ腫（Ｂ細胞リンパ腫およびＴ細胞リンパ腫）、中皮腫、皮膚扁平上皮細胞がん、ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、ならびにこれらの悪性または転移性形態から選択される。

がん治療
本発明の治療剤を単独で使用することもでき、例えば、化学療法剤、ホルモン、血管新生抑制薬、放射標識された化合物と共に、または外科手術、寒冷療法、免疫療法、がんワクチン、免疫細胞の工学的操作（例えば、ＣＡＲ－Ｔ）、および／もしくは照射療法と共に併用療法として投与することもできる。前述の処置方法を他の形態の従来の治療（例えば、当業者に周知のがんに対する標準治療処置）と併せて、従来の治療と連続して、従来の治療の前に、または従来の治療の後に施行することができる。例えば、本発明の薬剤を治療有効用量の化学療法剤と共に投与することができる。他の実施形態では、化学療法剤の活性および有効性を増強するために、本発明の薬剤を化学療法と併せて投与する。Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ’Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（ＰＤＲ）には、種々のがんの処置に使用されてきた化学療法剤の投薬量が開示されている。治療的に有効なこれらの上述の化学療法薬の投薬レジメンおよび投薬量は、処置される特定のがん、疾患の程度および当業者である医師によく知られている他の因子に依存し、医師が決定することができる。

免疫療法は、例えば、がんワクチンおよび／または感作された抗原提示細胞の使用を含み得る標的化治療である。例えば、腫瘍溶解性ウイルスは、がん細胞に感染し、それを溶解させることができ、一方で、正常な細胞は無傷のまま残すウイルスであり、それにより、腫瘍溶解性ウイルスががん治療において潜在的に有用なものになる。腫瘍溶解性ウイルスの複製により、腫瘍細胞の破壊が容易になるとともに、腫瘍部位における用量増幅も生じる。腫瘍溶解性ウイルスは、抗がん性遺伝子のベクターとして作用し得、それにより、腫瘍溶解性ウイルスを腫瘍部位に特異的に送達することが可能になる。免疫療法は、宿主を短期間保護するための受動免疫を伴い得、これは、がん抗原または疾患抗原に対して予め形成された抗体を投与すること（例えば、腫瘍抗原に対する、必要に応じて化学療法剤または毒素と連結したモノクローナル抗体の投与）によって実現される。例えば、抗ＶＥＧＦは、腎細胞癌の処置において有効であることが公知である。免疫療法はまた、がん細胞株の、細胞傷害性リンパ球により認識されるエピトープを使用することに焦点を当てたものでもあり得る。あるいは、アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、ＲＮＡ干渉分子、三重らせんポリヌクレオチドなどを使用して、腫瘍またはがんの開始、増悪、および／または病理に関連付けられる生体分子を選択的にモジュレートすることができる。

免疫療法は、免疫チェックポイントモジュレーターも包含する。免疫チェックポイントは、抗腫瘍免疫応答をダウンモジュレートまたは阻害することによって免疫応答を微調整する、ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞表面上の分子の群である。免疫チェックポイントタンパク質は当技術分野で周知であり、それらとして、限定することなく、ＣＴＬＡ４、ＰＤ－１、ＶＩＳＴＡ、Ｂ７－Ｈ２、Ｂ７－Ｈ３、ＰＤ－Ｌ１、Ｂ７－Ｈ４、Ｂ７－Ｈ６、２Ｂ４、ＩＣＯＳ、ＨＶＥＭ、ＰＤ－Ｌ２、ＣＤ１６０、ｇｐ４９Ｂ、ＰＩＲ－Ｂ、ＫＩＲ ｆａｍｉｌｙ受容体、ＴＩＭ－１、ＴＩＭ－３、ＴＩＭ－４、ＬＡＧ－３、ＢＴＬＡ、ＳＩＲＰａｌｐｈａ（ＣＤ４７）、ＣＤ４８、２Ｂ４（ＣＤ２４４）、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＩＬＴ－２、ＩＬＴ－４、ＴＩＧＩＴ、ＨＨＬＡ２、ＴＭＩＤＧ２、ＫＩＲ３ＤＬ３、およびＡ２ａＲが挙げられる（例えば、ＷＯ２０１２／１７７６２４を参照されたい）。がんをより効果的に処置するために、１つまたは複数の免疫チェックポイント阻害剤による阻害により、阻害性シグナル伝達を遮断または他のやり方で中和して、それにより、免疫応答をアップレギュレートすることができる。一部の実施形態では、がん治療は、免疫チェックポイントの１つまたは複数の阻害剤（免疫チェックポイント阻害療法）、例えば、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、および／またはＣＤ４７阻害剤である。一部の実施形態では、がん治療はニボルマブである。

養子細胞に基づく免疫療法を本発明の治療と組み合わせることができる。これだけに限定することなく、照射処理した自己または同種の腫瘍細胞、腫瘍溶解物またはアポトーシス性腫瘍細胞、抗原提示細胞に基づく免疫療法、樹状細胞に基づく免疫療法、養子Ｔ細胞移入、養子ＣＡＲ Ｔ細胞療法、自家免疫強化療法（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ｉｍｍｕｎｅ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｔｈｅｒａｐｙ）（ＡＩＥＴ）、がんワクチン、および／または抗原提示細胞を含めた周知の養子細胞に基づく免疫療法モダリティ。そのような細胞に基づく免疫療法を、例えばＧＭ－ＣＳＦのようなサイトカインの発現などの免疫応答をさらにモジュレートするために１つまたは複数の遺伝子産物を発現するように、および／または、Ｍａｇｅ－１、ｇｐ－１００などの腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）抗原を発現するように、さらに改変することができる。

「キメラ抗原受容体」または「ＣＡＲ」という用語は、所望の抗原特異性を有する操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を指す。Ｔリンパ球は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）と、主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩまたはＩＩ分子によって提示される短いペプチドとの相互作用を通じて、特定の抗原を認識する。最初の活性化およびクローン性拡大に関しては、ナイーブＴ細胞は、追加的な共刺激シグナルをもたらすプロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）に依存する。共刺激の非存在下でＴＣＲが活性化されると、不応答性およびクローン性アネルギーが生じる可能性がある。免疫を回避するために、移植された認識特異性を用いて細胞傷害性エフェクター細胞を導き出す異なる手法が開発されている。ＴＣＲ関連ＣＤ３複合体の細胞表面構成成分に特異的な天然のリガンドまたは抗体に由来する結合性ドメインからなるＣＡＲが構築されている。抗原が結合すると、そのようなキメラ抗原受容体がエフェクター細胞における内在性シグナル伝達経路に連結し、ＴＣＲ複合体によって開始されるものと同様の活性化シグナルが生じる。キメラ抗原受容体に関する最初の報告以来、この概念は着実に練り上げられてきており、キメラ受容体の分子設計が最適化されており、任意の数のｓｃＦＶおよび本明細書に記載の別のタンパク質結合性断片などの周知の結合性ドメインが常套的に使用されている。

他の実施形態では、免疫療法は、細胞に基づくものではない免疫療法を含む。一部の実施形態では、抗原を含み、ワクチン増強アジュバントを伴うまたは伴わない組成物を使用する。そのような組成物は、例えば、ペプチド組成物、腫瘍溶解性ウイルス、組換え抗原を含む融合タンパク質などの多くの周知の形態で存在する。一部の実施形態では、インターフェロン、Ｇ－ＣＳＦ、イミキモド、ＴＮＦアルファなどの免疫モジュレートサイトカイン、ならびにこれらのモジュレーター（例えば、遮断抗体またはより強力なもしくはより長く存続する形態）を使用する。一部の実施形態では、免疫モジュレートインターロイキン、例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１７、ＩＬ－２３など、ならびにこれらのモジュレーター（例えば、遮断抗体またはより強力なもしくはより長く存続する形態）を使用する。一部の実施形態では、免疫モジュレートケモカイン、例えば、ＣＣＬ３、ＣＣＬ２６、およびＣＸＣＬ７など、ならびにこれらのモジュレーター（例えば、遮断抗体またはより強力なもしくはより長く存続する形態）を使用する。一部の実施形態では、免疫モジュレート分子を標的とする免疫抑制、例えば、ＳＴＡＴ３シグナル伝達モジュレーター、ＮＦｋａｐｐａＢシグナル伝達モジュレーター、および免疫チェックポイントモジュレーターを使用する。

さらに他の実施形態では、免疫モジュレート薬物、例えば、免疫細胞増殖抑制薬（ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｓｔａｔｉｃ ｄｒｕｇ）、グルココルチコイド、細胞増殖抑制薬、イムノフィリンおよびこれらのモジュレーター（例えば、ラパマイシン、カルシニューリン阻害剤、タクロリムス、シクロスポリン（シクロスポリン）、ピメクロリムス、アベチムス、グスペリムス、リダフォロリムス、エベロリムス、テムシロリムス、ゾタロリムスなど）、ヒドロコルチゾン（コルチゾール）、コルチゾン酢酸エステル、プレドニゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾン、ベタメタゾン、トリアムシノロン、ベクロメタゾン、フルドロコルチゾン酢酸エステル、酢酸デオキシコルチコステロン（ｄｏｃａ）アルドステロン、非グルココルチコイドステロイド、ピリミジン合成阻害剤、レフルノミド、テリフルノミド、葉酸類似体、メトトレキセート、抗胸腺細胞グロブリン、抗リンパ球グロブリン、サリドマイド、レナリドマイド、ペントキシフィリン、ブプロピオン、クルクミン、カテキン、オピオイド、ＩＭＰＤＨ阻害剤、ミコフェノール酸、ミリオシン、フィンゴリモド、ＮＦ－ｘＢ阻害剤、ラロキシフェン、ドロトレコギンアルファ、デノスマブ、ＮＦ－ｘＢシグナル伝達カスケード阻害剤、ジスルフィラム、オルメサルタン、ジチオカルバメート、プロテアソーム阻害剤、ボルテゾミブ、ＭＧ１３２、Ｐｒｏｌ、ＮＰＩ－００５２、クルクミン、ゲニステイン、レスベラトロール、パルテノライド、サリドマイド、レナリドマイド、フラボピリドール、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、三酸化ヒ素、デヒドロキシメチルエポキシキノマイシン（ＤＨＭＥＱ）、Ｉ３Ｃ（インドール－３－カルビノール）／ＤＩＭ（ジ－インドールメタン）（１３Ｃ／ＤＩＭ）、Ｂａｙ １１－７０８２、ルテオリン、細胞透過性ペプチドＳＮ－５０、ＩＫＢａ．－スーパーリプレッサー過剰発現、ＮＦＫＢデコイオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、またはこれらのいずれかの誘導体もしくは類似体を使用する。さらに他の実施形態では、免疫モジュレート抗体またはタンパク質を使用する。例えば、ＣＤ４０、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ２７、または４－１ＢＢに結合する抗体、Ｔ細胞二重特異性抗体、抗ＩＬ－２受容体抗体、抗ＣＤ３抗体、ＯＫＴ３（ムロモナブ）、オテリキシズマブ、テプリズマブ、ビシリズマブ、抗ＣＤ４抗体、クレノリキシマブ、ケリキシマブ、ザノリムマブ、抗ＣＤ１１α抗体、エファリズマブ、抗ＣＤ１８抗体、エルリズマブ、ロベリズマブ、抗ＣＤ２０抗体、アフツズマブ、オクレリズマブ、オファツムマブ、パスコリズマブ、リツキシマブ、抗ＣＤ２３抗体、ルミリキシマブ、抗ＣＤ４０抗体、テネリキシマブ、トラリズマブ、抗ＣＤ４０Ｌ抗体、ルプリズマブ、抗ＣＤ６２Ｌ抗体、アセリズマブ、抗ＣＤ８０抗体、ガリキシマブ、抗ＣＤ１４７抗体、ガビリモマブ、Ｂリンパ球刺激物質（ＢＬｙＳ）阻害抗体、ベリムマブ、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ融合タンパク質、アバタセプト、ベラタセプト、抗ＣＴＬＡ４抗体、イピリムマブ、トレメリムマブ、抗エオタキシン１抗体、ベルチリムマブ、抗ａ４－インテグリン抗体、ナタリズマブ、抗ＩＬ－６Ｒ抗体、トシリズマブ、抗ＬＦＡ－１抗体、オヅリモマブ、抗ＣＤ２５抗体、バシリキシマブ、ダクリズマブ、イノリモマブ、抗ＣＤ５抗体、ゾリモマブ、抗ＣＤ２抗体、シプリズマブ、ネレリモマブ、ファラリモマブ、アトリズマブ、アトロリムマブ、セデリズマブ、ドルリモマブアリトクス、ドルリキシズマブ、フォントリズマブ、ガンテネルマブ、ゴミリキシマブ、レブリリズマブ、マスリモマブ、モロリムマブ、パキセリズマブ、レスリズマブ、ロベリズマブ、タリズマブ、テリモマブアリトクス、バパリキシマブ、ベパリモマブ、アフリベルセプト、アレファセプト、リロナセプト、ＩＬ－１受容体アンタゴニスト、アナキンラ、抗ＩＬ－５抗体、メポリズマブ、ＩｇＥ阻害剤、オマリズマブ、タリズマブ、ＩＬ１２阻害剤、ＩＬ２３阻害剤、ウステキヌマブなど。

免疫応答を増強する栄養補給剤、例えば、ビタミンＡ、ビタミンＥ、ビタミンＣなどが当技術分野で周知であり（例えば、米国特許第４，９８１，８４４号および５，２３０，９０２およびＰＣＴ公開第ＷＯ２００４／００４４８３号を参照されたい）、本明細書に記載の方法に使用することができる。

同様に、種々の薬剤またはこれらの組合せを、がんを処置するために使用することができる。例えば、化学療法、放射線照射、エピジェネティック改変因子（例えば、ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）改変因子、メチル化改変因子、リン酸化改変因子など）、標的化治療などが当技術分野で周知である。

一部の実施形態では、化学療法を使用する。化学療法は、化学療法剤の投与を含む。そのような化学療法剤は、これだけに限定されないが、以下の化合物の群から選択されるものであってよい：白金化合物、細胞傷害性抗生物質、代謝拮抗薬、抗有糸分裂薬、アルキル化剤、ヒ素化合物、ＤＮＡトポイソメラーゼ阻害剤、タキサン、ヌクレオシド類似体、植物アルカロイド、および毒素；ならびにこれらの合成誘導体。例示的な化合物としては、これだけに限定されないが、アルキル化剤：シスプラチン、トレオスルファン、およびトロホスファミド；植物アルカロイド：ビンブラスチン、パクリタキセル、ドセタキセル（docetaxol）；ＤＮＡトポイソメラーゼ阻害剤：テニポシド、クリスナトール、およびマイトマイシン；葉酸代謝拮抗薬：メトトレキセート、ミコフェノール酸、およびヒドロキシウレア；ピリミジン類似体：５－フルオロウラシル、ドキシフルリジン、およびシトシンアラビノシド；プリン類似体：メルカプトプリンおよびチオグアニン；ＤＮＡ代謝拮抗薬：２’－デオキシ－５－フルオロウリジン、グリシン酸アフィディコリン、およびピラゾロイミダゾール；ならびに抗有糸分裂薬：ハリコンドリン、コルヒチン、およびリゾキシンが挙げられる。１つまたは複数の化学療法剤を含む組成物（例えば、ＦＬＡＧ、ＣＨＯＰ）も使用することができる。ＦＬＡＧは、フルダラビン、シトシンアラビノシド（Ａｒａ－Ｃ）およびＧ－ＣＳＦを含む。ＣＨＯＰは、シクロホスファミド、ビンクリスチン、ドキソルビシン、およびプレドニゾンを含む。別の実施形態では、ＰＡＲＰ（例えば、ＰＡＲＰ－１および／またはＰＡＲＰ－２）阻害剤を使用し、そのような阻害剤は当技術分野で周知である（例えば、オラパリブ、ＡＢＴ－８８８、ＢＳＩ－２０１、ＢＧＰ－１５（Ｎ－Ｇｅｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）；ＩＮＯ－１００１（Ｉｎｏｔｅｋ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．）；ＰＪ３４（Soriano et al., 2001; Pacher et al., 2002b）；３－アミノベンズアミド（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ）；４－アミノ－１，８－ナフタルイミド；（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ）；６（５Ｈ）－フェナントリジノン（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ）；ベンズアミド（米国特許再発行３６，３９７）；およびＮＵ１０２５（Bowman et al.）。作用機序は、一般に、ＰＡＲＰ阻害剤のＰＡＲＰに結合し、その活性を低下させる能力に関する。ＰＡＲＰは、ベータ－ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）のニコチンアミドとポリ－ＡＤＰ－リボース（ＰＡＲ）への変換を触媒する。ポリ（ＡＤＰ－リボース）およびＰＡＲＰはどちらも、転写、細胞増殖、ゲノム安定性、およびがん発生の調節に関連付けられている（Bouchard V. J. et.al. Experimental Hematology, Volume 31, Number 6, June 2003, pp. 446-454 (9)；Herceg Z.；Wang Z.-Q. Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, Volume 477, Number 1, 2 Jun. 2001, pp. 97-110 (14)）。ポリ（ＡＤＰ－リボース）ポリメラーゼ１（ＰＡＲＰ１）は、ＤＮＡ一本鎖切断（ＳＳＢ）の修復における重要な分子である（de Murcia J. et al. 1997． Proc Natl Acad Sci USA 94: 7303-7307；Schreiber V, Dantzer F, Ame J C、de Murcia G (2006) Nat Rev Mol Cell Biol 7: 517-528；Wang Z Q, et al. (1997) Genes Dev 11: 2347-2358）。ＰＡＲＰ１機能を阻害することによってＳＳＢ修復をノックアウトすると、ＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）が誘導され、それにより、がん細胞において、相同組換えＤＳＢ修復の欠陥を伴う合成致死性が誘発され得る（Bryant H E, et al. (2005) Nature 434: 913-917；Farmer H, et al. (2005) Nature 434: 917-921）。前述の化学療法剤の例は、例示的なものであり、限定するものではない。

他の実施形態では、放射線療法を使用する。放射線療法において使用される放射線照射は電離放射線であってよい。放射線療法はまた、ガンマ線、Ｘ線、または陽子線であってもよい。放射線療法の例としては、これだけに限定されないが、外照射放射線療法、放射性同位元素（Ｉ－１２５、パラジウム、イリジウム）の組織内埋め込み（ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）、ストロンチウム８９などの放射性同位元素、胸部放射線療法、腹腔内Ｐ－３２放射線療法、および／または腹部全体および骨盤内放射線療法が挙げられる。放射線療法の一般的な概要については、Hellman, Chapter 16: Principles of Cancer Management: Radiation Therapy, 6th edition, 2001、DeVita et al., eds., J. B. Lippencott Company, Philadelphiaを参照されたい。放射線療法は、放射線照射が遠隔供給源から方向付けられる外照射または遠隔放射線療法として施行することができる。放射線照射処置はまた、放射性供給源が体内のがん細胞または腫瘍の質量の近くに置かれる内部照射療法（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｔｈｅｒａｐｙ）または密封小線源治療として施行することもできる。光増感剤、例えば、ヘマトポルフィリンおよびその誘導体、ベルテポルフィン（ＢＰＤ－ＭＡ）、フタロシアニン、光増感剤Ｐｃ４、デメトキシ－ヒポクレリンＡ；および２ＢＡ－２－ＤＭＨＡなどの投与を含む光線力学的療法の使用も包含される。

他の実施形態では、ホルモン療法を使用する。ホルモンによる治療的処置は、例えば、ホルモンアゴニスト、ホルモンアンタゴニスト（例えば、フルタミド、ビカルタミド、タモキシフェン、ラロキシフェン、酢酸リュープロリド（ＬＵＰＲＯＮ）、ＬＨ－ＲＨアンタゴニスト）、ホルモン生合成およびプロセシングの阻害剤、ならびにステロイド（例えば、デキサメタゾン、レチノイド、デルトイド、ベタメタゾン、コルチゾール、コルチゾン、プレドニゾン、デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、ミネラルコルチコイド、エストロゲン、テストステロン、プロゲスチン）、ビタミンＡ誘導体（例えば、オールトランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ））；ビタミンＤ３類似体；抗ゲスターゲン薬（例えば、ミフェプリストン、オナプリストン）、または抗アンドロゲン薬（例えば、酢酸シプロテロン）を含み得る。

他の実施形態では、一部の型のがんの治療に光線力学的療法（ＰＤＴ、光放射線照射療法、光線療法、または光化学療法とも称される）を使用する。光線力学的療法は、光感作剤として公知のある特定の化学物質が、単細胞生物体が特定の型の光に曝露した場合にその生物体を死滅させ得るという発見に基づく。

さらに他の実施形態では、高強度の光を利用してがん細胞を破壊するためにレーザー療法を使用する。この技法は、多くの場合、特に、がんを他の処置によって治癒させることができない場合に、出血または閉塞などのがんの症状を軽減するために使用される。この技法を、腫瘍を縮小させるまたは破壊することによってがんを処置するために使用することもできる。
炎症性障害

本明細書に記載の操作された抗原結合性タンパク質および／または医薬組成物を、例えば、慢性炎症性腸疾患、全身性エリテマトーデス、乾癬、マックル・ウェルズ症候群、関節リウマチ、多発性硬化症、または橋本病、アレルギー性疾患、喘息；感染性疾患；ＴＮＦ媒介性炎症性疾患などの炎症性疾患（例えば、回腸嚢炎などの胃腸管の炎症性疾患、アテローム性動脈硬化症などの心血管の炎症性状態、または炎症性肺疾患）などの炎症性疾患を予防または処置する（その有害な影響を部分的にまたは完全に低減する）ために使用することができる。操作された抗原結合性タンパク質および／または医薬組成物を、臓器移植または組織拒絶反応が起こる恐れがある他の状況において、拒絶反応を抑制するため；免疫機能を改善するため；または免疫細胞の増殖もしくは機能を抑制するために使用することができる。

ある特定の実施形態では、炎症性障害として、筋骨格の炎症、血管の炎症、神経の炎症、消化器系の炎症、眼の炎症、生殖系の炎症、および他の炎症を含めた体の任意の組織および器官の炎症を含む。

一部の実施形態では、筋骨格の炎症は、手関節、手首関節、肘関節、肩関節、顎関節、脊椎関節、頸部関節、股関節、膝関節、足首関節、および足関節を含めた骨格関節に影響を及ぼす状態、ならびに筋肉と骨を接続する組織、例えば腱などに影響を及ぼす状態を含む。本明細書に記載の方法および組成物を用いて処置することができるそのような免疫障害の例としては、これだけに限定されないが、関節炎（例えば、変形性関節症、関節リウマチ、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、急性および慢性感染性関節炎、痛風および偽痛風に付随する関節炎、および若年性特発性関節炎）、腱炎、滑膜炎、腱鞘炎、滑液包炎、結合織炎（線維筋痛症）、上顆炎、筋炎、ならびに骨炎（例えば、パジェット病、恥骨骨炎、および嚢胞性線維性骨炎を含む）が挙げられる。

一部の実施形態では、眼の免疫障害は、眼瞼を含めた眼の任意の構造に影響を及ぼす免疫障害を指す。本明細書に記載の方法および組成物を用いて処置することができる眼の免疫障害の例としては、これだけに限定されないが、眼瞼炎、眼瞼皮膚弛緩症、結膜炎、涙腺炎、角膜炎、乾性角結膜炎（ドライアイ）、強膜炎、睫毛乱生症、およびぶどう膜炎が挙げられる。

一部の実施形態では、本明細書に記載の方法および組成物を用いて処置することができる神経系の免疫障害として、これだけに限定されないが、脳炎、ギラン・バレー症候群、髄膜炎、神経性筋強直症、ナルコレプシー、多発性硬化症、脊髄炎および統合失調症が挙げられる。本明細書に記載の方法および組成物を用いて処置することができる脈管構造またはリンパ系の炎症の例としては、これだけに限定されないが、関節硬化症、関節炎、静脈炎、血管炎、およびリンパ管炎が挙げられる。

一部の実施形態では、本明細書に記載の方法および医薬組成物を用いて処置することができる消化器系の免疫障害として、胆管炎、胆嚢炎、腸炎、全腸炎、胃炎、胃腸炎、炎症性腸疾患、回腸炎、および直腸炎が挙げられる。炎症性腸疾患としては、例えば、関連する状態の群の、ある特定の当技術分野で認められている形態が挙げられる。炎症性腸疾患のいくつかの主要な形態が公知であり、これらの障害のうち最も一般的なものは、クローン病（限局性腸疾患、例えば、非活動性の形態および活動性の形態）ならびに潰瘍性大腸炎（例えば、非活動性の形態および活動性の形態）である。さらに、炎症性腸疾患は、過敏性腸症候群、顕微鏡的大腸炎、リンパ球形質細胞性腸炎、セリアック病、膠原性大腸炎、リンパ球性大腸炎および好酸性腸炎を包含する。他のあまり一般的でない形態のＩＢＤとして、分類不能大腸炎、偽膜性大腸炎（壊死性大腸炎）、虚血性炎症性腸疾患、ベーチェット病、サルコイドーシス、強皮症、ＩＢＤ関連異形成、異形成に付随する腫瘤または病変、および原発性硬化性胆管炎が挙げられる。

一部の実施形態では、本明細書に記載の方法および医薬組成物を用いて処置することができる生殖系の免疫障害として、これだけに限定されないが、子宮頸管炎、絨毛膜羊膜炎、子宮内膜炎、精巣上体炎、臍炎、卵巣炎、精巣炎、卵管炎、卵管卵巣膿瘍、尿道炎、腟炎、外陰炎、および外陰部痛が挙げられる。

一部の実施形態では、炎症性障害として、急性播種性汎発性脱毛症、ベーチェット病、シャーガス病、慢性疲労症候群、自律神経障害、脳脊髄炎、強直性脊椎炎、再生不良性貧血、化膿性汗腺炎、自己免疫性肝炎、自己免疫性卵巣炎、小児脂肪便症、クローン病、１型糖尿病、２型糖尿病、巨細胞性動脈炎、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本病、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、川崎病、エリテマトーデス、顕微鏡的大腸炎、顕微鏡的多発動脈炎、混合性結合組織病、マックル・ウェルズ症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、眼球クローヌス・ミオクローヌス症候群、視神経炎、オード甲状腺炎、天疱瘡、結節性多発性動脈炎、多発性筋痛、関節リウマチ、ライター症候群、シェーグレン症候群、側頭動脈炎、ウェゲナー肉芽腫症、温式自己免疫性溶血性貧血、間質性膀胱炎、ライム病、斑状強皮症、乾癬、サルコイドーシス、強皮症、潰瘍性大腸炎、および白斑が挙げられる。

本明細書に記載の方法および組成物を使用して、炎症性構成成分を有するＴ細胞媒介性過敏性疾患を処置することができる。そのような状態としては、接触過敏症、接触皮膚炎（ツタウルシに起因するものを含む）、蕁麻疹、皮膚アレルギー、呼吸器アレルギー（枯草熱、アレルギー性鼻炎、ハウスダストマイトアレルギー）およびグルテン過敏性腸症（小児脂肪便症）が挙げられる。

方法および医薬組成物を用いて処置することができる他の免疫障害としては、例えば、虫垂炎、皮膚炎、皮膚筋炎、心内膜炎、結合織炎、歯肉炎、舌炎、肝炎、化膿性汗腺炎、虹彩炎、喉頭炎、乳腺炎、心筋炎、腎炎、耳炎、膵炎、耳下腺炎、心膜炎、腹膜炎、咽頭炎、胸膜炎、肺臓炎、前立腺炎、腎盂腎炎、および口内炎、移植片拒絶反応（腎臓、肝臓、心臓、肺、膵臓（例えば、膵島細胞）、骨髄、角膜、小腸などの器官、皮膚同種移植片（ａｌｌｏｇｒａｆｔ）、皮膚同種移植片（ｈｏｍｏｇｒａｆｔ）、および心臓弁異種移植片が関与するもの、血清病、ならびに移植片対宿主病）、急性膵炎、慢性膵炎、急性呼吸窮迫症候群、セクザリー症候群、先天性副腎過形成、非化膿性甲状腺炎、がんに付随する高カルシウム血症、天疱瘡、水疱性疱疹状皮膚炎、重症多形性紅斑、剥脱性皮膚炎、脂漏性皮膚炎、季節性または通年性アレルギー性鼻炎、気管支喘息、接触皮膚炎、アトピー性皮膚炎、薬物過敏性反応、アレルギー性結膜炎、角膜炎、眼部帯状疱疹、虹彩炎および虹彩毛様体炎、脈絡網膜炎、視神経炎、症候性サルコイドーシス、電撃性または播種性肺結核化学療法、成人特発性血小板減少性紫斑病、成人続発性血小板減少症、後天性（自己免疫性）溶血性貧血、限局性腸炎、自己免疫性血管炎、多発性硬化症、慢性閉塞性肺疾患、実質臓器移植片拒絶反応、敗血症が挙げられる。好ましい処置としては、移植片拒絶反応、関節リウマチ、乾癬性関節炎、多発性硬化症、１型糖尿病、喘息、炎症性腸疾患、全身性エリテマトーデス、乾癬、慢性閉塞性肺疾患、および炎症に付随する感染性状態（例えば、敗血症）の処置が挙げられる。

臨床的有効性／治療に対する応答
臨床的有効性を当技術分野で公知の任意の方法によって測定することができる。例えば、治療に対する応答は、がん、例えば腫瘍の治療に対する任意の応答、好ましくは、ネオアジュバントまたはアジュバント化学療法の開始後の腫瘍の質量および／または体積の変化に関する。ネオアジュバントまたはアジュバントの状況での腫瘍応答を評価することができ、その場合、ＣＴ、ＰＥＴ、マンモグラム、超音波または触診によって測定して、全身性介入後の腫瘍のサイズと最初のサイズおよび寸法を比較することができ、組織学的に腫瘍の細胞充実性を推定し、処置開始前に取得した腫瘍生検材料の細胞充実性と比較することができる。生検または外科的切除後の腫瘍のカリパス測定または病理学的検査によって応答を評価することもできる。応答を腫瘍体積または細胞充実性の変化のパーセンテージのように定量的に記録することもでき、残存がん負荷量（Symmans et al., J. Clin. Oncol. (2007) 25: 4414-4422）またはＭｉｌｌｅｒ－Ｐａｙｎｅスコア（Ogston et al., (2003) Breast（Edinburgh, Scotland）12: 320-327）などの半定量的スコアリングシステムを使用し、「病理学的完全奏効」（ｐＣＲ）、「臨床的完全寛解」（ｃＣＲ）、「臨床的部分寛解」（ｃＰＲ）、「臨床的安定疾患」（ｃＳＤ）、「臨床的進行」（ｃＰＤ）または他の定性的基準のように定性的に記録することもできる。腫瘍応答の評価は、ネオアジュバントまたはアジュバント療法の開始後の早期に、例えば、数時間後、数日後、数週間後または好ましくは数カ月後に実施することができる。応答評価の典型的な終点は、ネオアジュバント化学療法の終了時または残留する腫瘍細胞および／もしくは腫瘍床の外科的除去時である。

一部の実施形態では、本明細書に記載の治療的処置の臨床的有効性を、臨床的有用率（ＣＢＲ）を測定することによって決定することができる。臨床的有用率は、治療終了時から少なくとも６カ月の時点での完全寛解（ＣＲ）にある患者のパーセンテージ、部分寛解（ＰＲ）にある患者の数、および安定疾患（ＳＤ）を有する患者の数の合計を決定することによって測定される。この式を簡略化すると、ＣＢＲ＝６カ月にわたるＣＲ＋ＰＲ＋ＳＤである。一部の実施形態では、特定の抗免疫チェックポイント治療レジメンのＣＢＲは、少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％である、またはそれよりも高い。

がん治療に対する応答を評価するための追加的な基準は「生存」に関するものであり、以下の全てを含む：死亡までの生存期間、全生存期間としても公知（前記死亡は、原因を問わないものであるか、または腫瘍に関連するものである）；「無再発生存期間」（再発という用語は、限局的な再発および遠隔再発の両方を含むものとする）；無転移生存期間；無疾患生存期間（疾患という用語は、がんおよびそれに関連する疾患を含むものとする）。前記生存期間の長さは、定義された開始点（例えば、診断または処置開始の時点）および終了点（例えば、死亡、再発または転移）を参照することによって算出することができる。さらに、処置の有効性についての基準を拡大して、生存の確率、所与の期間内の転移の確率、および腫瘍再発の確率を含めることができる。

例えば、適当な閾値を決定するために、特定の抗がん治療レジメンを対象の集団に施行することができ、転帰を、あらゆるがん治療の施行前に決定されたバイオマーカー測定値と相関付けることができる。転帰測定値は、ネオアジュバントの状況でもたらされた治療に対する病理的応答とすることができる。あるいは、バイオマーカー測定値が分かっている、がん治療後の対象について、全生存および無病生存などの転帰評価基準をある期間にわたってモニタリングすることができる。ある特定の実施形態では、同じ用量の抗がん剤を各対象に投与する。関連する実施形態では、投与する用量は、抗がん剤に関して当技術分野で公知の標準の用量である。対象をモニタリングする期間は変動し得る。例えば、対象を、少なくとも２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、または６０カ月間モニタリングすることができる。がん治療の転帰と相関するバイオマーカー測定の閾値は、実施例の節に記載されているものなどの方法を使用して決定することができる。

キット
一部の実施形態では、本開示の抗原結合性タンパク質はキットとして提供される。種々の態様では、キットは、抗原結合性タンパク質を単位用量として含む。本発明の目的に関して、「単位用量」とは、適切な担体中に分散させた別個の量を指す。種々の態様では、単位用量は、対象に所望の効果、例えば、腫瘍成長の阻害、腫瘍サイズの低減、がんの処置をもたらすために十分な量である。したがって、必要に応じて単位用量で提供される本開示の抗原結合性タンパク質を含むキットが本発明で提供される。種々の態様では、キットは、いくつかの単位用量、例えば、１週間または１カ月分の供給量の単位用量を含み、必要に応じて、そのそれぞれが個別に包装されている、または他のやり方で他の単位用量と分離されている。一部の実施形態では、キットの構成成分／単位用量を患者に投与するための説明書と共に包装する。一部の実施形態では、キットは、患者に投与するための１つまたは複数のデバイス、例えば、針およびシリンジなどを含む。一部の態様では、本開示の抗原結合性タンパク質、薬学的に許容されるその塩、抗原結合性タンパク質を含むコンジュゲート、または抗原結合性タンパク質を含む多量体もしくは二量体を、すぐに使用できる形態、例えば、シリンジ、静脈内バッグなどに予め包装する。一部の態様では、キットは、本明細書に記載のもののいずれかを含めた他の治療剤または診断剤または薬学的に許容される担体（例えば、溶媒、緩衝剤、希釈剤など）をさらに含む。特定の態様では、キットは、本開示の抗原結合性タンパク質を、薬剤、例えば、化学療法または放射線療法に使用される治療剤と共に含む。

以下の実施例は、ただ単に本開示を例示するために提示するものであり、本開示の範囲を多少なりとも限定するものではない。

（実施例１）
ＣＴＬＡ４遮断アッセイ
本明細書に記載のＣＴＬＡ４遮断アッセイでは、市販のキット、ＣＴＬＡ４遮断バイオアッセイ（ｃａｔ．＃ＪＡ３００１およびＪＡ３００５；Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用した。ＣＴＬＡ４は、ＣＤ１５２としても公知であり、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）上に構成的に発現され、活性化Ｔ細胞においてアップレギュレートされる免疫阻害性受容体である。ＣＴＬＡ４は、腫瘍抗原および自己抗原に対する免疫応答の調節において極めて重要な役割を果たす。ＣＴＬＡ４は、共刺激Ｂ７－ＣＤ２８経路の対応物である。Ｔ細胞の表面上でＣＴＬＡ４発現がアップレギュレートされると、Ｔ細胞がＢ７とより高い結合力で結合し、したがって、ＣＤ２８からの正の共刺激シグナルに打ち勝つ。さらに、ＣＴＬＡ４が、隣接する抗原提示細胞（ＡＰＣ）上のそのリガンドであるＣＤ８０（Ｂ７－１）またはＣＤ８６（Ｂ７－２）のいずれかと会合することにより、Ｔ細胞活性化、細胞増殖およびサイトカイン産生のＣＤ２８共刺激が阻害される。

ＣＴＬＡ４遮断アッセイには、２種の細胞株：Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞（不死化リンパ性白血病Ｔ細胞、ＣＴＬＡ４エフェクター細胞とも称される）およびＲａｊｉ細胞（抗原提示細胞（ＡＰＣ）とも称される）が必要である。Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞は、ＴＣＲ／ＣＤ２８活性化に応答するネイティブなプロモーターによって駆動されるヒトＣＴＬＡ４およびルシフェラーゼレポーターを発現する。Ｒａｊｉ細胞は、同類のＴＣＲを抗原非依存的に活性化するように、および、ＣＴＬＡ４リガンドである、集合的にＢ７リガンドと称されるＣＤ８０（Ｂ７－１）およびＣＤ８６（Ｂ７－２）を内在性に発現するように設計された操作された細胞表面タンパク質を発現する。これらの２つの細胞型を共培養すると、ＣＴＬＡ４とＣＤ２８がそれらの共有リガンドであるＣＤ８０およびＣＤ８６について競合し、したがって、ＣＤ２８経路活性化およびプロモーター媒介性発光が阻害される。抗ＣＴＬＡ４抗体を添加することにより、ＣＴＬＡ４とそのリガンドであるＣＤ８０およびＣＤ８６の相互作用が遮断され、その結果、プロモーター媒介性発光がもたらされる（図１）。

Ｊｕｒｋａｔ細胞はまた、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８、または抗ＣＤ３と細胞表面Ｂ７リガンドによって活性化されて、ＩＬ－２を発現し得る。したがって、発光に加えて、ＩＬ－２タンパク質の発現レベルが活性化の測定基準になる。したがって、Ｊｕｒｋａｔ細胞を、Ｂ７リガンドを内在性に発現し、抗ＣＤ３を発現するように操作されているＲａｊｉ細胞と共培養すると、Ｊｕｒｋａｔ細胞が活性化され、ＩＬ－２とルシフェラーゼの両方を発現する。ＩＬ－２およびルシフェラーゼの発現レベルは、互いに、および活性化と線形相関する。しかし、Ｂ７リガンドに結合し、Ｊｕｒｋａｔ細胞活性化を遮断するＣＴＬＡ４細胞外ドメインが存在すると、ＩＬ－２発現とルシフェラーゼ発現がどちらも抑止される。ＣＴＬＡ４機能を遮断する、例えば、ＣＴＬＡ４のＢ７リガンドへの結合を遮断する薬剤により、Ｊｕｒｋａｔ細胞によるＩＬ－２およびルシフェラーゼの発現が可能になる。ＩＬ－２発現、ルシフェラーゼ発現／活性、および抗ＣＴＬＡ４薬剤の遮断有効性の間には線形相関が存在する。このアッセイによって測定されるＣＴＬＡ４遮断と一次Ｔ細胞活性化との相関は文書で十分に裏付けられており、このアッセイの適応性がさらに確証される（Waight et al. (2018) Cancer Cell 33: 1033-1047）。

どちらのアッセイの活性曲線も同様のプロファイルを有すると予測されるが、Ｔ細胞活性化はＦｃ受容体の影響を受ける（Waight et al. (2018) Cancer Cell 33: 1033-1047）。具体的には、抗原提示細胞を用いたある特定のｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｔ細胞活性化の状況における抗ＣＴＬＡ４抗体は、Ｆｃ受容体相互作用に依存的な生物学的効果を示す。Ｒａｊｉ細胞はＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）を発現し、抗ＣＤ３２抗体またはＦｃドメインの欠失のいずれかによる抗ＣＴＬＡ４抗体ＦｃとＦｃγＲＩＩの相互作用の遮断により、抗ＣＴＬＡ４抗体の活性の減弱、ならびに絶対的な応答レベルの低下が導かれる。この抗ＣＴＬＡ４抗体の活性の減弱は、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６）受容体が必須であり、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ／ＢもＦｃγＲＩＩＢも必須ではない一次Ｔ細胞活性化の抗原刺激まで及ぶことが報告されている（Waight et al. (2018) Cancer Cell 33: 1033-1047）。Ｐｒｏｍｅｇａアッセイに使用したＲａｊｉ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６）を発現せず、抗ＣＤ１６抗体による負の活性減退効果は見られないが、抗ＣＤ３２抗体は抗ＣＴＬＡ生物学的作用の強力なアテニュエーターである。したがって、ＣＴＬＡ４抗体のＦｃ領域とＦｃ受容体の相互作用がＣＴＬＡ４抗体のＣＴＬＡ４遮断活性のために重要であることが広く認められている（Bulliard et al. (2013) J of Exp Medicine 9: 1685-1693；Waight et al. (2018) Cancer Cell 33: 1033-1047；Ingram et al. (2018) Proc Natl Acad Sci U S A 115: 3912-3917；Vargas et al. (2018) Cancer Cell 33: 1-15）。

本明細書に記載のＣＴＬＡ４遮断アッセイでは、９６ウェルプレートのプレート２つに１２０の試料を要した。アッセイは、特に断りのない限り、タンパク質濃度または結合価の濃度（抗原結合性部位の数）の力価測定曲線に関して試料を２連で用いて実施した。標準の対照抗ＣＴＬＡ４抗体も、力価測定に関して２連で、試験試料アッセイプレート内でアッセイした。例外的な状況として、別のプレートからのものであるが、同じアッセイキット内のものである、対照抗ＣＴＬＡ４抗体の力価測定曲線を使用した。Ｐｒｏｍｅｇａ ＣＴＬＡ４遮断バイオアッセイは、相対ルシフェラーゼ活性（ＲＬＵ）読み取りのために設計され、適合させたものである。試料の活性は、本明細書では、試験薬剤の相対ルシフェラーゼ単位／試験薬剤なしでの相対ルシフェラーゼ単位（Ｔ細胞活性化の基礎レベルを表すバックグラウンドルシフェラーゼ単位）の比として報告した。アッセイを１２～１６時間インキュベートした。実験の間で相対ルシフェラーゼ単位の変動が生じたが、ＣＴＬＡ４遮断活性の比は一定のままであった。一部の実験では、ルシフェラーゼ活性を測定するのではなく、ヒトＩＬ－２レベルについてアッセイウェル培地をアッセイした。従来のヒトＩＬ－２ ＥＬＩＳＡアッセイを使用した。一般に、アッセイウェルの内容物全てをＩＬ－２について直接分析した。

使用した対照抗ヒトＣＴＬＡ４抗体は、ＰｒｏｍｅｇａのＣａｔ番号ＪＡ１０２０、ＳｅｌｌｅｃｋＣｈｅｍのイピリムマブ、およびＢｉｏＬｅｇｅｎｄｓのＬ３Ｄ１０であった。

（実施例２）
抗ＣＴＬＡ４抗体のＣＴＬＡ４遮断活性におけるＦｃ受容体の重要性
効力および安全性プロファイルが増大した新規のＣＴＬＡ４結合性タンパク質を開発するために、ＣＴＬＡ４リガンド結合をアロステリックに遮断することができ、ＣＴＬＡ４受容体の生物学的シグナル伝達をもたらす結合性タンパク質の対象となる、ＣＴＬＡ４の細胞外ドメインにわたる部位が存在すると仮定した。そのようなシグナル伝達が、新規の強力ながん免疫治療薬の基礎になり得るという仮説も立てた。

実験用抗体およびそれらの誘導体の遺伝子配列、配列確認、発現、精製および分析的タンパク質解析を、Ｐｒｏｔｅｏｓ（Ｋａｌａｍａｚｏｏ、ＭＩ）またはＡｂｓｏｌｕｔｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（商標）（Ｏｘｆｏｒｄ、ＵＫ）のいずれかで行った。抗体および誘導体の遺伝子配列を合成し、独自の発現ベクターに挿入し、２９３細胞において標準の一過性トランスフェクションプロトコールによって発現させ、プロテインＡカラム、またはＨｉｓ_６タグを使用した場合にはＮｉカラムのいずれかによって精製した。全ての実験用抗体が１ｍｇ当たり０．１ＥＵ未満であった。

図２Ａおよび図２Ｂは、イピリムマブ（ＩＰＩ）（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ、Ｃａｔ．番号Ａ２００１）およびＬ３Ｄ１０（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄｓ）の力価測定曲線用量反応のＰｒｏｍｅｇａ ＣＴＬＡ４遮断バイオアッセイを示す。これは、２つの別々のアッセイで実行し、一方のアッセイセットは標準のルシフェラーゼ活性アッセイで読み取りを行い（図２Ａ）、他方は、発現されたＩＬ－２タンパク質のレベルとして読み取りを行った（図２Ｂ）。ＲＬＵ比（１０～１５）は、Ｐｒｏｍｅｇａ技術マニュアルにおいて報告されているものと一致し、また、Ｐｒｏｍｅｇａの抗ＣＴＬＡ４抗体、ＪＡ１０２０についての同様の活性力価測定曲線とも一致した（データは示していない）。Ｊｕｒｋａｔエフェクター細胞を単独で抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８および抗Ｆｃ架橋結合抗体と一緒にインキュベートした場合、バックグラウンドを３０よりも大きく超えるＲＬＵ比が観察された。イピリムマブおよびＬ３Ｄ１０の力価測定プロファイルのそれぞれで、ルシフェラーゼまたはＩＬ－２読み取りのいずれについてもおよそ５０ｎＭという同様の最大半量活性濃度が示された。

イピリムマブとＬ３Ｄ１０（May et al. (2005)、Du et al. (2018)）は、どちらも、Ｂ７に対するＣＴＬＡ４のリガンド結合性部位、^１３４ＭＹＰＰＰＹ^１３９に密接に結合するが、イピリムマブとＬ３Ｄ１０はどちらも異なる生化学的および生物学的特性を有し（Du et al. (2018a)、Du et al.(2018b)）、これは、それらのそれぞれの独特の配列構造から生じる可能性が高い。図２Ｂに示されている通り、イピリムマブとＬ３Ｄ１０の遮断活性は、抗体力価測定系列を合計してもそれらの活性が相加的にならないので、どちらも機構的に同様である可能性が高い。５０００ｎＭの高さのイピリムマブの濃度および同様に２０００ｎＭというイピリムマブとＬ３Ｄ１０の混和物の濃度をそれぞれ試験したところ、それらの力価測定曲線は、１０００ｎＭの範囲内でプラトーに達したと思われ、また、活性比は１０～１５の範囲にとどまった。

ＣＴＬＡ４に沿ってＣＴＬＡ４のリガンド結合性部位よりも遠位の結合性部位が新規の特性を有することが本明細書において同定される。そのような部位の１つは、^６５ＳＩＣＴ^６８である。米国特許第７０３４１２１Ｂ２号（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている抗ヒトＣＴＬＡ４マウス抗体である抗体（以下「抗体２６」または「２６抗体」）は、この部位に結合し、ＣＴＬＡ４とＢ７の結合をアロステリックに遮断する。抗体２６のＶＨおよびＶＬドメインと、ヒトＩｇＧ１足場、イピリムマブの本質的に同じＩｇＧ１フレームワークとを融合することによってキメラ抗体を生成した。このキメラ抗体は２６ ＨｕＩｇＧ１と称される。図３に示されている通り、２６ ＨｕＩｇＧ１は、ＣＴＬＡ４遮断アッセイにおいて活性であったが、観察された最大の活性は、イピリムマブまたはＬ３Ｄ１０の活性のたった半分であった。さらに、２６ ＨｕＩｇＧ１の最大半量活性は、イピリムマブではおよそ５０ｎＭであったのと比較して、約１００ｎＭであった。抗ＣＤ３２抗体が１ｍｌ当たり１０μｇで存在し、ＦｃγＲＩＩ結合が遮断された場合、イピリムマブ、Ｌ３Ｄ１０、および２６ ＨｕＩｇＧ１についての活性力価測定曲線全体がより低いＲＬＵ比の方に約５０％移行した（図３）。抗ＣＤ３２抗体の作用から、抗ＣＴＬＡ４抗体のＦｃ領域が活性に必須であるが、Ｆｃと受容体の結合という単純なものではない可能性があることが実証された。

図４は、２６ ＨｕＩｇＧ１と、ＦｃγＲとＣ１ｑの相互作用を消滅させるＬＡＬＡ変異を有する２６ ＨｕＩｇＧ１の活性の比較を示す（Schlothauer et al. (2016) Protein Engineering, Design & Selection 10: 457-466）。このアッセイの実験的分解能の範囲内では、この変異によってＦｃ受容体結合を排除する実質的な効果は認められず、また、抗ＣＤ３２抗体の添加による検出可能な効果も全く認められなかった。特にイピリムマブについては、抗ＣＤ３２の添加により、活性がほぼ５０％低下し、これは、図３において、およびPromega and Waight et al. (2018) Cancer Cell 33: 1033-1047によって観察された結果と一致するものであった。したがって、抗体のＦｃ領域を介して生じるＦｃγＲと抗ＣＴＬＡ４抗体の相互作用が、十分なＣＴＬＡ４遮断活性のために必要である。

（実施例３）
Ｆｃ領域を欠くＣＴＬＡ４結合性タンパク質の驚くべき予想外の活性
Ｃ_Ｈ２ Ｃ_Ｈ３ドメインを有さず、したがって、ＦｃγＲと結合するためのいかなる手段も欠く２６抗体誘導体である２６ Ｆ（ａｂ’）_２（合成）を、真菌タンパク質二量体化ドメイン（Ａｂｓｏｌｕｔｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（商標）の独自の技術）を使用して、各２６ Ｆａｂ’が分子的に操作された２６Ｖ_Ｈ Ｃ_Ｈ１と２６Ｖ_ＬＣ_Ｌである２つの２６ Ｆａｂの二量体を合成的に構築することによって工学的に作製した。Ｆｃ領域を有さない２６ ＨｕＩｇＧ１の工学的に作製された抗体誘導体、具体的には２６ Ｆ（ａｂ’）_２（ｓｙｎ）および２６ Ｆａｂ’の実験では、２６ ＨｕＩｇＧ１または２６ ＨｕＩｇＧ１＋抗ＣＤ３２のいずれよりも活性が高い活性曲線が予想外に示された（図５）。著しいことに、図５では、Ｆ（ａｂ’）_２形態の２６の活性力価測定曲線がより高レベルの活性にシフトし、２６ ＨｕＩｇＧ１の２倍を超え、Ｌ３Ｄ１０よりも約１０％よりも大きく活性が高いことが示された。しかし、２６ Ｆ（ａｂ’）_２がより高い活性に移行することは、力価測定を通じて均一なものではなく、高濃度で明白である。２６ Ｆ（ａｂ’）_２（ｓｙｎ）の力価測定に対して抗ＣＤ３２抗体を１ｍｌ当たり１０ｕｇで添加しても活性力価測定プロファイルに影響はなかった（図６）。２６ Ｆａｂ’は２６ ＨｕＩｇＧ１と同様の活性力価測定曲線を有した。２６ Ｆａｂ’は一価の結合物質であるが、一方２６ＨｕＩｇＧ１は二価であり、２６ Ｆａｂ’の活性力価測定曲線は２６ ＨｕＩｇＧ１と比較して上方にシフトすることにも注目すべきである。

２６ ＦｖおよびＦｃドメインについて観察された構造的な影響は、２６抗体の誘導体にのみ特異的なものではなかった。本明細書において実証されている通り、ＣＴＬＡ４遮断アッセイにおけるイピリムマブの活性は抗ＣＤ３２抗体によって低下した。したがって、イピリムマブの十分な活性にはＦｃγＲＩＩとの結合が必須である。それにもかかわらず、Ｉｐｉ Ｆ（ａｂ’）_２およびＩｐｉ ＳｃＦｖ構築物では、Ｆｃ領域の排除が、抗ＣＤ３２抗体によるＦｃ領域とＦｃγＲＩＩの相互作用の遮断と等価ではないことが示された。図７は、Ｉｐｉ Ｆ（ａｂ’）_２（Ａｂｓｏｌｕｔｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（商標）によりＩｐｉ Ｆａｂの合成二量体として構築されたもの）およびＩｐｉ Ｖ_Ｌ（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_３ Ｉｐｉ Ｖ_Ｈ内のＩｐｉ Ｆｖ領域の従来のｓｃＦｖの活性力価測定曲線を示す。図７に示されている通り、Ｉｐｉ Ｆ（ａｂ’）_２（ｓｙｎ）についての活性力価測定曲線は、曲線の高濃度に関してはイピリムマブの２倍の大きさであったが、低濃度では、活性はなおより高いとしてもその程度はより低いものであった。１０００ｎＭの最高濃度では、Ｉｐｉ ＳｃＦｖの活性はイピリムマブと等価であったが、低濃度ではより低かった。２００ｎＭ、４０ｎＭ、および８ｎＭの濃度でのＩｐｉ ＳｃＦｖの活性は、このアッセイにおいてイピリムマブ対照で認められた活性の約５０％であり、これは、イピリムマブ＋抗ＣＤ３２抗体の組合せについて観察されたものと同様であった。

抗ＣＴＬＡ４結合性ドメインにＦｃ領域を付加することが、Ｆｃ受容体結合を通じた、このアッセイではＲａｊｉ細胞であるアクセサリー免疫細胞（Waight et al. (2018) Cancer Cell 33: 1033-1047）との「橋渡し」になり得、それにより、ＣＴＬＡ４リガンド結合の遮断という得られる生物学（Ｔ細胞活性化）が影響を受け得る。Ｆｃと受容体の結合を分解または増強する変異の結果、抗ＣＴＬＡ４抗体について見られる活性力価測定曲線が影響を受ける；Ｆｃ結合親和性の低下により力価測定曲線全体が下方にシフトするので、この橋渡しが構造的プロセスであることがWaight et al. (2018)により示されている。しかし、抗ＣＴＬＡ４生物学的製剤の治療への適用に関しては、Ｆｃ領域を付加することにより、Ｔ細胞活性化および他の想定外の活性、例えば、ＣＴＬＡ４発現細胞、例えばＴ_ＲＥＧ細胞のＦｃにより方向付けられる枯渇などの正または負のモジュレーションが付加され得る。これらの生物活性は、ＣＴＬＡ４とそのリガンドの結合を遮断するという基本的な作用への付加的なものであるが、より機能的に抗ＣＴＬＡ４に焦点が当てられるものである。図７に示されている通り、ＣＴＬＡ４遮断アッセイにおけるＩｐｉ Ｆ（ａｂ’）_２（ｓｙｎ）の活性はイピリムマブのほぼ２倍であり得る。活性力価測定曲線が５０００ｎＭの高さの濃度で開始され、イピリムマブが１０００ｎＭでプラトーに達したこと；Ｆｃ領域の付加が従来の抗ＣＴＬＡ４抗体の遮断効力に影響を及ぼし、限定することに留意されたい。

２６抗体およびイピリムマブのＦ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ’、およびＳｃＦｖ形態については、活性に対して濃度依存的に影響を及ぼすと思われ、これらの形態の活性力価測定曲線を綿密に調査すれば明らかである。イピリムマブおよび２６ ＨｕＩｇＧ１とそれらの下位抗体誘導体であるＦ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ’、およびＳｃＦｖ形態の活性曲線の比較では、わずかな屈曲、一般に２００ｎＭ未満での活性の低下が認められる。

１２１ Ｈｕ ＩｇＧ１は、マウス抗体２６のヒト形態である。表３に、抗体２６のヒト化形態のヒトＶ_ｋ軽鎖が示されている。表３には、ヒト化抗体２６のヒトＶ_Ｈ重鎖も示されている。１２１ ＨｕＩｇＧ１は、これらをアセンブリして完全な抗体にしたものである。Ｖ_ＬおよびＶ_Ｈ配列を除いて、イピリムマブにおいて見いだされるＩｇＧ１（Ｃ_Ｌ Ｃ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２、Ｃ_Ｈ３）と同一の配列である。したがって、イピリムマブと１２１ ＨｕＩｇＧ１は、Ｖ_ＬおよびＶ_Ｈ可変ドメインのみが異なる。図７および図８は、１２１ ＨｕＩｇＧ１についての活性力価測定曲線を示す。これは、イピリムマブと比較して低い方に移行した活性曲線であり、２６のヒト化形態ＨｕＩｇＧ１であることと一致する。

１２１ ＳｃＦｖは、１２１ ＶＬおよび１２１ ＶＨを含有する単鎖形態である：１２１ＶＬ－（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_３－１２１ＶＨ－Ｈｉｓ_６。

図７および図８は、１２１ ＳｃＦｖおよび１２１ ＨｕＩｇＧ１についての活性力価測定曲線を示す。

図１６は、イピリムマブ、Ｉｐｉ ＳｃＦｖ、およびＩｐｉ Ｆ（ａｂ’）_２についてのＲＬＵの比を示す。Ｉｐｉ ＳｃＦｖは低い活性を示したが、Ｆ（ａｂ’）_２は高い活性を示した。上記の通り、これは、ＦｃγＲＩＩ受容体がイピリムマブＦｃ領域と相互作用することを遮断するために抗ＣＤ３２抗体をイピリムマブに添加した場合に観察されたＣＴＬＡ４遮断活性の低下に反するものであった。同じく上記の通り、これは、Waight et al. (2018)および上に列挙されているその他ならびにＰｒｏｍｅｇａによる公開された研究に反するものであった。したがって、このＦ（ａｂ’）_２についての活性の増大は驚くべき、予想外のものであった。

図１７は、ＢｉｏＥ２０２１（Ｉｐｉ ｓｃＦｖ）、ＢｉｏＥ２０３１（１２１ ｓｃＦｖ）、ＢｉｏＥ２０２２（Ｉｐｉ Ｆ（ａｂ’）_２）、ＢｉｏＥ２０３３（１２１ Ｆ（ａｂ’）_２）、およびイピリムマブのＣＴＬＡ４遮断活性を示す。イピリムマブ対照を２連でのみアッセイした以外は実験を３連で行った。上記の通り、プレート当たり６０の試料のみをアッセイすることができ、したがって、同様の実験条件で公式にアッセイされる試料の数が限定されるようにアッセイをフォーマットした。予めパッケージングされたＰｒｏｍｅｇａアッセイそれぞれで、１２０の試料、６０×２プレートが可能である。ＢｉｏＥ２０２１＝Ｉｐｉ ＳｃＦｖ、ＢｉｏＥ２０３１＝１２１ ＳｃＦｖ、ＢｉｏＥ２０２２＝Ｉｐｉ Ｆ（ａｂ’）_２、ＢｉｏＥ２０３３＝１２１ Ｆ（ａｂ’）_２。

（実施例４）
ＣＴＬＡ４をモジュレートし、Ｔ細胞を活性化するバイパラトピックＣＴＬＡ４結合性タンパク質
本明細書に記載の知見から、抗ＣＴＬＡ４結合性タンパク質の結合力をより良好になるよう操作し、それにより、局所的な分子濃度を上昇させることにより、はるかに大きな効力を導くことができることが示唆された。さらに、Ｆｃ領域を含まない抗体設計を用いて、Ｆｃにより駆動される免疫アクセサリー細胞活性、特にＴ_ＲＥＧ枯渇を結果として伴わない、より原始的なＣＴＬＡ４治療薬が可能になり得る。この目的で、ＣＴＬＡ４上の２つの異なるエピトープに結合し得るバイパラトピック抗ＣＴＬＡ４構築物を設計した。

図９Ａは、例示的なダイアボディ設計の概略図を示す（Kipriyanov et al. (1999)、Volkel et al. (2001)、Gall et al. (2004)、およびReusch et al. (2014)を参照されたい）。基本的なダイアボディは、ＶＬおよびＶＨドメインだけを含み、それ自体で単量体形態に、またはそれ自体と二量体化してホモ二量体ダイアボディのいずれかにフォールディングされるように配置される。ＶＬドメインとＶＨドメインのリンカーと、それと併せて各ＶＬ ＶＨドメインに独特のアミノ酸配列により、ダイアボディが単量体であるか二量体であるかが決定される。図９Ａは、例示的なリンカーのバリエーションを用いた４つの形態を示す。これらの形態は構築のための単なるガイドであり、最適な構築物を予測することはできない。

図１０Ａは、実行された例示的な２つの構築物；ＢｉｏＥ２０５１およびＢｉｏＥ２０５２の概略図を示す。ＢｉｏＥ２０５１およびＢｉｏＥ２０５２遺伝子構築物を、従来の手段によって合成し、Ａｂｓｏｌｕｔｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（商標）の独自の哺乳動物発現ベクターに挿入し、２９３細胞において発現させた。タンパク質産物をＮｉカラムによって精製し、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって分析した。ＢｉｏＥ２０５１産生収量は、２９３細胞２５０リットル当たりおよそ０．５ｍｇと少なく、また、ＳＥＣにおける２つのピークが明らかになり、ＢｉｏＥ２０５１ Ｐ１、ＢｉｏＥ２０５１ Ｐ２と名付けた。ＢｉｏＥ２０５２の最終的な収量は２９３細胞２５０ｍｌ当たり４ｍｇであり、ＳＥＣで単一のピークが明らかになった。ＢｉｏＥ２０５１ Ｐ１、ＢｉｏＥ２０５１ Ｐ２およびＢｉｏＥ２０５２の内毒素レベルは１ｍｇ当たり＜０．１の内毒素単位であった。

ＢｉｏＥ２０５１ Ｐ１、ＢｉｏＥ２０５２ Ｐ２、およびＢｉｏＥ２０５２をＰｒｏｍｅｇａ ＣＴＬＡ４遮断アッセイにおいてアッセイし、３つのダイアボディ構築物の全てが、活性力価測定曲線全体を通してイピリムマブまたは１２１ ＨｕＩｇＧ１のいずれよりも有意に高い活性であった（図１１）。ＢｉｏＥ２０５２をさらに分析し、Ｉｐｉ ＳｃＦｖと１２１ ＳｃＦｖの混合物と比較した（図１２）。Ｉｐｉ ＳｃＦｖと１２１ ＳｃＦｖの活性曲線は相加的であったが、それらのダイアボディ形態の共有結合性の組合せよりも相当に活性が低かった。ＢｉｏＥ２０５２の活性は、曲線の低濃度部分で、第１の希釈点後に、対応する濃度のＩｐｉ ＳｃＦｖと１２１ ＳｃＦｖの混合物の３倍超の活性が示されたので、プラトーである。

図１３は、３連で実施したＰｒｏｍｅｇａ ＣＴＬＡ４遮断バイオアッセイの結果を示し、Ｇｌｏｗ－Ｍａｘ Ｎａｖｉｇａｔｏｒで測定された相対ルシフェラーゼ単位で読み取りが示されている。示されているエラーバーは標準偏差である。図１４は、イピリムマブおよびＢｉｏＥ２０５２についての比として表した読み取りを示す。ＢｉｏＥ２０５２についての活性力価測定曲線が力価測定曲線全体を通して３倍高いレベルに移行している。最大半量活性濃度は８ｎＭから４０ｎＭの間である。Ｖ_ＬおよびＶ_Ｈドメインをダイアボディ構成に配置することにより、Ｐｒｏｍｅｇａ ＣＴＬＡ４遮断アッセイにおける絶対的活性の予測されていない増大および最大半量濃度の低下の両方が導かれた。効力および特異的活性のそのような有意な増大は予測されておらず、単なる結合力の効果を超えるものであった。

Ｉｐｉおよび１２１のＶＨドメインとＶＬドメインの共有結合性の配置により、ＣＴＬＡ４遮断アッセイにおいて予測されていない前例のない生物活性を有するダイアボディがもたらされた。

上記の通り、図１４は、相対ルシフェラーゼ単位をバックグラウンドの試験薬剤なしの相対ルシフェラーゼ単位で割った比として表した結果を示す。この比の測定値により、アッセイ間およびアッセイ内での比較が可能になった。エラーバーは標準偏差である。アッセイを３連で行った。

図１５は、図１３と同じであるが、エラーバーを伴う比として表したものである。これは図１４と同様であるが、ＢｉｏＥ２０３２（ＢｉｏＥ２０３２＝１２１ ＨｕＩｇＧ１）が含まれている。

図１８は、抗ＣＴＬＡ４ダイアボディ（ＢｉｏＥ２０５２）、ＢｉｏＥ２０２１（Ｉｐｉ ｓｃＦｖ）＋ＢｉｏＥ２０３１（１２１ ｓｃＦｖ）の組合せ、およびＢｉｏＥ２０２２（Ｉｐｉ Ｆ（ａｂ’）_２）＋ＢｉｏＥ２０３３（１２１ Ｆ（ａｂ’）_２）の組合せのＣＴＬＡ４遮断活性を示す。グラフの右２つの試料はＢｉｏＥ２０２１＋ＢｉｏＥ２０３１（Ｉｐｉ ＳｃＦｖ＋１２１ ＳｃＦｖの混合物、それぞれ１０００ｎＭ、２００ｎＭ、４０ｎＭおよび８ｎＭ）ならびにＢｉｏＥ２０２２＋ＢｉｏＥ２０３３（Ｉｐｉ Ｆ（ａｂ’）_２＋１２１ Ｆ（ａｂ’）_２の混合物）である。このアッセイは３連で行った。左３つのＢｉｏＥ２０５２試料は、ＢｉｏＥ２０５２（０７４０９）、ＦＴ ＢｉｏＥ２０５２およびＢｉｏＥ２０５２（０６９６６）である。ＢｉｏＥ２０５２（０７４０９）は、Ａｂｓｏｌｕｔｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（商標）によって発現および精製がなされたＢｉｏＥ２０５２の新しいロットであるＢｉｏＥ２０５２（０７４０９）である。これは、Ａｂｓｏｌｕｔｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（商標）プロジェクト０７４０９からのものである。ＦＴ ＢｉｏＥ２０５２は、０７４０９ロットからの凍結解凍試料であり、組換えタンパク質を－８０℃で凍結し、次いで解凍することにより、その活性に対する限界効果が生じることを実証するものである。試料ＢｉｏＥ２０５２（０６９６６）は、元の材料（Ａｂｓｏｌｕｔｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（商標）プロジェクト０６９６６）である。これは、４℃で保管され、少なくとも４カ月にわたって活性が維持されているものである。この材料を２連でアッセイした。

図１９は、抗ＣＴＬＡ４ダイアボディ（ＢｉｏＥ２０５２）、ＢｉｏＥ２２０１（Ｉｐｉ Ｆａｂ’）、ＢｉｏＥ２２０２（１２１ Ｆａｂ’）、ＢｉｏＥ２２０１（Ｉｐｉ Ｆａｂ’）＋ＢｉｏＥ２２０２（１２１ Ｆａｂ’）の組合せ、およびイピリムマブのＣＴＬＡ４遮断活性を示す。混合物の活性のレベルが、最良で各構成成分の活性の相加的なものであり、活性の相乗作用が実証されたダイアボディＢｉｏＥ２０５２と比較して劣ることに注目されたい。

要約すると、活性は、ＢｉｏＥ２０５２＞Ｉｐｉ Ｆ（ａｂ’）_２＋１２１ Ｆ（ａｂ’）_２＞Ｉｐｉ Ｆ（ａｂ’）_２＞イピリムマブ≒Ｉｐｉ ＳｃＦｖ＋１２１ ＳｃＦｖ＞＞Ｉｐｉ Ｆａｂ’＋１２１ Ｆａｂ’（１０００ｎＭ以外）＞Ｉｐｉ ＳｃＦｖ、１２１ ＳｃＦｖ＞Ｉｐｉ Ｆａｂ’、１２１ Ｆａｂ’である。

図２０は、抗ＣＴＬＡ４ダイアボディ（ＢｉｏＥ２０５２（０６９６６））、ＢｉｏＥ２０２２（Ｉｐｉ Ｆ（ａｂ’）_２）、ＢｉｏＥ２０３３（１２１ Ｆ（ａｂ’）_２）、およびイピリムマブのＣＴＬＡ４遮断活性を示す。これらは３連で実施され、データが比として表されている。

ＣＴＬＡ４結合性タンパク質ＢｉｏＥ２０５１、ＢｉｏＥ２０５２、ＢｉｏＥ２０８１、ＢｉｏＥ２０８２、ＢｉｏＥ２０９１、ＢｉｏＥ２０９２、ＢｉｏＥ２１２１、ＢｉｏＥ２０１２、およびイピリムマブのＣＴＬＡ４遮断活性が図２１に示されている。

ＣＴＬＡ４結合性タンパク質ＢｉｏＥ２０２１ Ｉｐｉ ＳｃＦｖ、ＢｉｏＥ２０２２ Ｉｐｉ Ｆ（ａｂ’）_２、ＢｉｏＥ２０５２ Ｉｐｉ１２１－１２１Ｉｐｉ、ＢｉｏＥ２０１２、ＢｉｏＥ２１１１ ＤＡＲＴ、およびイピリムマブのＣＴＬＡ４遮断活性が図２２に示されている。

（実施例５）
ＢｉｏＥ２０５２のｉｎ ｖｉｖｏ有効性
ＢｉｏＥ２０５２のｉｎ ｖｉｖｏ有効性を調査するために、ヒト化ＣＴＬＡ４を発現し、肝腫瘍細胞の異種移植片を有するマウスモデルにイピリムマブまたはＢｉｏＥ２０５２を投薬した。具体的には、Ｈ２２マウス肝腫瘍細胞の異種移植片を６～９週齢の雌ＰＤ１／ＣＴＬＡ４ ＨｕＧＥＭＭ ＢＡＬＢ／ｃマウス（本明細書ではＨ２２マウスモデルまたはＨ２２モデルと称される）の右前方側腹部に埋め込んだ。マウスにＢｉｏＥ２０５２、イピリムマブ、またはビヒクル（すなわち、生理食塩水）を表５に示されている処置スケジュールに従ってｉ．ｐ．投与した。

細胞培養
Ｈ２２腫瘍細胞株をｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、１０％ウシ胎仔血清を補充したＲＰＭＩ１６４０培地を用い、３７℃、５％ＣＯ_２で維持した。腫瘍細胞週２回、継代培養した。指数増殖期にある細胞を収集し、腫瘍接種のために計数した。

腫瘍接種
各マウスに、ＰＢＳ ０．１ｍｌ中のＨ２２腫瘍細胞（１×１０^６個）を腫瘍発達のために右前方側腹部領域に皮下接種した。腫瘍細胞の接種日を０日目とした。

ランダム化
ランダム化の２日前に、腫瘍体積（ＴＶ）が＞１００ｍｍ^３であったマウス２匹にＢｉｏＥ２０５２を注射し、ランダム化まで毎日観察した。この２匹のマウスについて、ランダム化後は３つの群の他のマウスと一緒に観察および測定を行った。

平均腫瘍サイズがおよそ８５ｍｍ^３に達したところでランダム化を開始した（６日目）。合計３０匹のマウスをこの試験に組み入れ、表５に示されている３つの群に割り当て、群当たりマウス１０匹とした。ランダム化を「Ｍａｔｃｈｅｄ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ」法に基づいて実施した（Ｓｔｕｄｙ Ｄｉｒｅｃｔｏｒ（商標）ソフトウェア、バージョン３．１．３９９．１９）。

観察およびデータ収集
腫瘍接種後、動物の罹患率および死亡率について毎日確認した。常套的なモニタリングの間、動物を、腫瘍成長および処置の挙動に対するあらゆる影響、例えば、移動性、食物および水分消費量、体重増加／減少（体重をランダム化後週２回測定する）、眼／毛のつやの喪失および何らかの他の異常などについて確認した。死亡率および観察された臨床徴候を個々の動物について詳細に記録した。

ランダム化後に週２回、腫瘍体積をカリパスを使用して２次元測定し、体積を式：Ｖ＝（ＬｘＷｘＷ）／２（式中、Ｖは腫瘍体積であり、Ｌは腫瘍の長さ（腫瘍の最長寸法）であり、Ｗは腫瘍の幅（Ｌに対して垂直である腫瘍の最長寸法）である）を使用してｍｍ^３で表した。投薬ならびに腫瘍および体重の測定を２０日間（６日目～２５日目）にわたってＬａｍｉｎａｒ Ｆｌｏｗ Ｃａｂｉｎｅｔ中で行った。

体重および腫瘍体積をＳｔｕｄｙ Ｄｉｒｅｃｔｏｒ（商標）ソフトウェア（バージョン３．１．３９９．１９）を使用して測定した。

統計解析
予め規定した日における異なる群の腫瘍体積を比較するために、バートレット検定を使用して、全ての群にわたって分散が均一であるという仮定を検証した。バートレット検定のｐ値が≧０．０５の場合、一元配置ＡＮＯＶＡを実施して、全ての群にわたる平均の全体的な均等性について検定した。一元配置ＡＮＯＶＡのｐ値が＜０．０５の場合、全てのペアワイズ比較に対してチューキーのＨＳＤ（ｈｏｎｅｓｔ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ）検定を行い、各処置群とビヒクル群の比較のためにダネット検定を行うことによって事後検定を実施した。バートレット検定のｐ値が＜０．０５の場合、クラスカル・ワリス検定を実施して、全ての群にわたる中央値の全体的な均等性について検定した。クラスカル・ワリス検定のｐ値が＜０．０５の場合、全てのペアワイズ比較または各処置群とビヒクル群の比較についてコノバーのノンパラメトリック検定を行うことによって事後検定を実施し、どちらも一段階のｐ値調整を伴った。全ての統計解析をＲ－ａ ｌａｎｇｕａｇｅ ａｎｄ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ｆｏｒ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ ａｎｄ ｇｒａｐｈｉｃｓ（バージョン３．３．１）で行った。検定は全て別段の指定がない限り両側検定であり、ｐ値＜０．０５を統計的に有意であるとみなした。

生存解析のために、生存時間をカプラン・マイヤー法によって解析した。生存時間をランダム化の日から動物が死亡するまでまたは倫理的終点までの時間と定義した。各群について、生存期間中央値（ＭＳＴ）および寿命の延長（ＩＬＳ）を算出した。各群についてカプラン・マイヤー曲線も構築し、ログランク検定を使用して生存曲線を群間で比較した。

結果
異なる時点における体重および体重変化の結果がそれぞれ図２３Ａおよび２３Ｂに示されている。

腫瘍体積も試験の間に評価した。異なる時点における平均腫瘍成長曲線が図２４に示されている。平均腫瘍成長曲線は各群において最初の動物が腫瘍サイズに起因して屠殺された時点で停止した。この試験の間に、３匹のマウスが、ＴＶ＞３０００ｍｍ^３に起因して屠殺された。割り当てなしのマウスも１匹がＴＶ＞３０００ｍｍ^３に起因して屠殺された（示されていない）。

ＢｉｏＥ２０５２で処置したマウスおよびイピリムマブで処置したマウスにおいて観察された腫瘍成長阻害を以下の表６に要約する。最初のマウスが腫瘍サイズに起因して屠殺された特定の日のデータを使用した。

この試験では、ビヒクル対照マウスの平均腫瘍サイズがランダム化２２日目に１５６２．４５ｍｍ^３に達した。

Ｈ２２モデルにおいて、ＢｉｏＥ２０５２を８０μｇ／マウス、ＱＤで投与したところ、わずかな抗腫瘍有効性がもたらされ、２２日目のＴＧＩ値は８％であった。しかし、ビヒクル対照群と比較した場合に統計的有意差（Ｐ＞０．０５）は観察されなかった。重要なことに、ＢｉｏＥ２０５２で処置した群のマウス１０匹のうち３匹で腫瘍退縮または安定化が示されたので、ＢｉｏＥ２０５２で処置した群では治療効果が観察された（図２５Ａ～２５Ｃ）。

Ｈ２２モデルにおいて、イピリムマブを１０ｍｇ／ｋｇ、ＢＩＷで投与したところ、有意な抗腫瘍有効性がもたらされ、２２日目のＴＧＩ値は８５％であり、ビヒクル対照群と比較した場合に統計的有意差（ｐ＜０．０５）が得られた。イピリムマブで処置した動物の２匹が死亡したが、この死亡率は、イピリムマブで処置した対象において多くの場合に観察されるものである。

ｉ．ｐ．注射した際のＢｉｏＥ２０５２のβ半減期は、急速な降下（短いα相）後約３０分であった。２４時間後には、最初の材料の約１％のみがマウス循環中に見いだされた。

（実施例６）
ＢｉｏＥ２０５２－ＣＴＬＡ４相互作用
ＢｉｏＥ２５０２のＣＴＬＡ４への結合をよりよく理解するために、水素重水素交換質量分析（ＨＤＸ）を実施した。ＨＤＸでは、相互作用しているペプチドの結合領域が同定され、これは、両ペプチドが結合した領域が重水素交換から保護されるからである。ＣＴＬＡ４と抗体を、占有率を駆動する（抗体がより多く存在するほど良好である）ために、希釈せずに１：１の比で組み合わせる。０、１０秒、５分、および３０分でデータを取得した。ＨＤＸにより、ＨからＤへの交換の程度がカラースキームで示されるヒートマップを作成した。この場合、青色相が強力であるほど、抗体の存在下での保護が大きい。ＢｉｏＥ２５０２が結合するＣＴＬＡ４上のエピトープを同定した（図２６および２７）。

（実施例７）
ＢｉｏＥ２０５２－ＩｇＧ１ Ｆｃ融合タンパク質
ＢｉｏＥ２０５２の半減期および安定性を増大させるための取り組みにおいて、従来のＩｇＧ１ Ｆｃと融合した、またはＬＡＬＡＰＧ（配列番号５６）変異を有するＩｇＧ１ Ｆｃと融合したＢｉｏＥ２０５２をコードする構築物を生成した。この変異により、ＢｉｏＥ２０５２のＦｃγ受容体への結合が遮断され、したがって、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）が排除される。これにより、ＣＴＬＡ４遮断抗体ではなくもっぱらＴｒｅｇ枯渇抗体であり得るイピリムマブの著しい不足が克服される。

アルブミン結合性タンパク質のＢｉｏＥ２０５２への付加も調査した。具体的には、ＢｉｏＥ２０５２のカルボキシ末端をマウスアルブミンのアミノ末端と融合した。マウスアルブミンと融合したＢｉｏＥ２０５２のＳＥＣプロファイルでは２つのピークが示された。この２つのピークをこれらの予備実験では組み合わせたが、収集し、個別に解析することができる。

（実施例８）
ＩｇＧ Ｆｃペプチドまたはアルブミン結合性タンパク質と融合した抗原結合性タンパク質は安定性の増大を示す
２種のモノクローナル抗ＣＴＬＡ４抗原結合性タンパク質（ＢｉｏＥ２４２０およびＢｉｏＥ２４３０（それぞれ配列番号６１および６３））を、商業的に利用可能な方法を使用して生成した（ａｂｓｏｌｕｔｅａｎｔｉｂｏｄｙ．ｃｏｍ／ｏｕｒ－ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ／ｏｕｒ－ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ－ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ／）。ＢｉｏＥ２４２０は、ＦｃペプチドがＢｉｏＥ２０５２ペプチドのカルボキシ末端と融合した、ＢｉｏＥ２０５２（配列番号２４）のアミノ酸配列を含むものである。ＢｉｏＥ２４３０は、アルブミンペプチドがＢｉｏＥ２０５２ペプチドのカルボキシ末端に融合した、ＢｉｏＥ２０５２（配列番号２４）のアミノ酸配列を含むものである。

単量体をサイズ排除ＨＰＬＣ（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）によって精製した（図２８Ａおよび２８Ｂ）。これらの精製された単量体の活性を、ＣＴＬＡ４機能的遮断アッセイを使用して評価した（Ｐｒｏｍｅｇａ；実施例７を参照されたい）。図２９Ａに示されている通り、ＢｉｏＥ２４２０の抗ＣＴＬＡ４活性はＢｉｏＥ２０５２と比べて低いが、ＣＴＬＡ４を遮断すること以外の様式で作用するＩｐｉより高い。ＢｉｏＥ２４３０の活性は非常にわずかであり、陰性対照とほぼ等価である（図２９Ｂ）。これらの結果から、カルボキシ末端と融合した別のタンパク質ドメインを有するように改変された抗原結合性タンパク質が抗ＣＴＬＡ４活性を有し得ることが示される。

（実施例９）
抗原結合性タンパク質の薬物動態（ＰＫ）特性を改善または改変するために、抗原結合性ドメイン（例えば、ＢｉｏＥ２０５２）を、ＰＫモジュレーターを含むように改変（例えば、融合）した。改変された抗原結合性タンパク質をＨ２２モデルマウスに表６に示されているスケジュールに従って投与する。血液試料を一定間隔で採取し、改変された抗原結合性タンパク質の存在についてアッセイして、改変された抗原結合性タンパク質のバイオアベイラビリティを決定する。結果を、ビヒクル（例えば、生理食塩水）を投与したＨ２２マウス、イピリムマブを投与したＨ２２マウス、および抗原結合性タンパク質のみ（すなわち、Ｆｃドメインなし）を投与したＨ２２マウスにおいて観察されたものと比較する。結果から、改変された抗原結合性タンパク質のバイオアベイラビリティが正常対照群および抗原結合性タンパク質のみを投与した群と比べて改善されることが示される。さらに、改変された抗原結合性タンパク質を投与したマウスでは、正常対照群および抗原結合性タンパク質のみを投与した群と比べて生存性が改善される。

改変された抗原結合性タンパク質を投与したＨ２２マウスにおける腫瘍体積および成長を測定し、ビヒクル（例えば、生理食塩水）のみを投与したＨ２２マウス、イピリムマブを投与したＨ２２マウス、および抗原結合性タンパク質のみを投与したＨ２２マウスにおいて観察された腫瘍体積および成長と比較する。結果から、改変された抗原結合性タンパク質を受けたマウスにおいて、正常対照群および抗原結合性タンパク質のみを投与した群と比べて、腫瘍体積および成長の改善が示される。

参照による組込み
本明細書で言及されている全ての刊行物、特許および特許出願は、個々の刊行物、特許または特許出願が具体的にかつ個別に参照により組み込まれることが示されたものと同じくその全体が参照により本明細書に組み込まれる。矛盾する場合は、本明細書のあらゆる定義を含めた本出願が優先される。

等価物
本明細書に記載されている発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を当業者は理解するまたは常套的な実験だけを使用して確認することができるであろう。そのような等価物は以下の特許請求の範囲に包含されるものとする。

Claims (71)

1. 細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原－４（ＣＴＬＡ４）の残基^１３４ＭＹＰＰＰＹ^１３９（配列番号１）によって定義されるエピトープ１および残基^６５ＳＩＣＴ^６８（配列番号２）によって定義されるエピトープ２に特異的に結合する抗原結合性ドメインを含む、操作された抗原結合性タンパク質。
2. ａ）表３に列挙されているＶＨ配列からなる群から選択されるＶＨ配列に対して少なくとももしくは約８５％の同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列；および／または
   ｂ）表３に列挙されているＶＬ配列からなる群から選択されるＶＬ配列に対して少なくとももしくは約８５％の同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列
   を含む、請求項１に記載の操作された抗原結合性タンパク質。
3. 配列番号９、１０、１２、１４、１５、１７、１９、２０～２４、２７、２８、２９～５４、および５９、６１、６３、６５、６７、および７１から選択される配列に対して少なくともまたは約８５％の同一性を有する配列を含む、請求項１または２に記載の操作された抗原結合性タンパク質。
4. ａ）配列番号：９および１０；
   ｂ）配列番号：９および１４；
   ｃ）配列番号：９および１７；
   ｄ）配列番号：１２および１０；
   ｅ）配列番号：１２および１４；
   ｆ）配列番号：１２および１７；
   ｇ）配列番号：１５および１０；
   ｈ）配列番号：１５および１４；
   ｉ）配列番号：１５および１７；
   ｊ）配列番号：９、１０、１５、および１７；
   ｋ）配列番号：１２、１４、１５、および１７；
   ｌ）配列番号：２１および２２；
   ｍ）配列番号：２７および２８；
   ｎ）配列番号：３１、３２、および３３；
   ｏ）配列番号：３４、３５、および３６；
   ｐ）配列番号：３７、３８、および３９；
   ｑ）配列番号：４０、４１、および４２；
   ｒ）配列番号：４３および４４；
   ｓ）配列番号：４５および４６；
   ｔ）配列番号：４７、４８、および４９；
   ｕ）配列番号：５０、５１、および５２；
   ｖ）配列番号：５３および５４；
   ｗ）配列番号５９；
   ｘ）配列番号６１；
   ｙ）配列番号６３；
   ｚ）配列番号６５および６７；ならびに
   ａａ）配列番号６９および７１
   から選択される配列に対して少なくともまたは約８５％の同一性を有する配列を含む、請求項１から３までのいずれか一項に記載の操作された抗原結合性タンパク質。
5. ａ）表３に列挙されているＶＨ配列からなる群から選択されるＶＨ配列；および／または
   ｂ）表３に列挙されているＶＬ配列からなる群から選択されるＶＬ配列
   を含む、請求項１または２に記載の操作された抗原結合性タンパク質。
6. 配列番号９、１０、１２、１４、１５、１７、１９、２０～２４、２７、２８、２９～５４、および５９、６１、６３、６５、６７、および７１から選択される配列を含む、請求項１から３までのいずれか一項に記載の操作された抗原結合性タンパク質。
7. ａ）配列番号：９および１０；
   ｂ）配列番号：９および１４；
   ｃ）配列番号：９および１７；
   ｄ）配列番号：１２および１０；
   ｅ）配列番号：１２および１４；
   ｆ）配列番号：１２および１７；
   ｇ）配列番号：１５および１０；
   ｈ）配列番号：１５および１４；
   ｉ）配列番号：１５および１７；
   ｊ）配列番号：９、１０、１５、および１７；
   ｋ）配列番号：１２、１４、１５、および１７；
   ｌ）配列番号：２１および２２；
   ｍ）配列番号：２７および２８；
   ｎ）配列番号：３１、３２、および３３；
   ｏ）配列番号：３４、３５、および３６；
   ｐ）配列番号：３７、３８、および３９；
   ｑ）配列番号：４０、４１、および４２；
   ｒ）配列番号：４３および４４；
   ｓ）配列番号：４５および４６；
   ｔ）配列番号：４７、４８、および４９；
   ｕ）配列番号：５０、５１、および５２；
   ｖ）配列番号：５３および５４；
   ｗ）配列番号５９；
   ｘ）配列番号６１；
   ｙ）配列番号６３；
   ｚ）配列番号６５および６７；ならびに
   ａａ）配列番号６９および７１
   から選択される配列を含む、請求項１から６までのいずれか一項に記載の操作された抗原結合性タンパク質。
8. 抗体、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ’、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ｓｃ（Ｆｖ）_２、ハーフ抗体－ｓｃＦｖ、タンデムｓｃＦｖ、タンデムバイパラトピックｓｃＦｖ、Ｆａｂ／ｓｃＦｖ－Ｆｃ、タンデムＦａｂ’、単鎖ダイアボディ、タンデムダイアボディ（ＴａｎｄＡｂ）、Ｆａｂ／ｓｃＦｖ－Ｆｃ、ヘテロ二量体Ｆａｂ／ｓｃＦｖ－Ｆｃ、ヘテロ二量体ｓｃＦｖ－Ｆｃ、ヘテロ二量体ＩｇＧ（ＣｒｏｓｓＭａｂ）、ＤＡＲＴ、およびダイアボディから選択される、請求項１から７までのいずれか一項に記載の操作された抗原結合性タンパク質。
9. ＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２Ａ、ＩｇＧ２Ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、およびＩｇＥ定常ドメインからなる群から選択される免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含む、請求項１から８までのいずれか一項に記載の操作された抗原結合性タンパク質。
10. Ｆｃドメインを含む、請求項１から８までのいずれか一項に記載の操作された抗原結合性タンパク質。
11. 前記Ｆｃドメインが、前記抗原結合性ドメインに対して異種である、請求項１０に記載の操作された抗原結合性タンパク質。
12. 前記Ｆｃドメインが、ＩｇＧ１ Ｆｃである、請求項１１に記載の操作された抗原結合性タンパク質。
13. 前記ＩｇＧ１ Ｆｃが、ＬＡＬＡＰＧアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載の操作された抗原結合性タンパク質。
14. 抗体の定常領域の（ａ）Ｆｃドメインまたは（ｂ）ＣＨ２ドメインおよび／もしくはＣＨ３ドメインを含まない、請求項１から８までのいずれか一項に記載の操作された抗原結合性タンパク質。
15. １つまたは複数のＦｃ受容体に結合しない、請求項１０から１４までのいずれか一項に記載の操作された抗原結合性タンパク質。
16. ＣＴＬＡ４に特異的に結合し、抗体の定常領域のＣＨ２ドメインおよび／またはＣＨ３ドメインを欠く、操作された抗原結合性タンパク質。
17. ａ）表３に列挙されているＶＨ配列からなる群から選択されるＶＨ配列に対して少なくとももしくは約８５％の同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列；および／または
    ｂ）表３に列挙されているＶＬ配列からなる群から選択されるＶＬ配列に対して少なくとももしくは約８５％の同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列
    を含む、請求項１６に記載の操作された抗原結合性タンパク質。
18. 配列番号９、１０、１２、１４、１５、１７、１９、２０～２４、２７、２８、２９～５４、５９、６１、６３、６５、６７、６９、および７１から選択される配列に対して少なくともまたは約８５％の同一性を有する配列を含む、請求項１６または１７に記載の操作された抗原結合性タンパク質。
19. ａ）配列番号：９および１０；
    ｂ）配列番号：９および１４；
    ｃ）配列番号：９および１７；
    ｄ）配列番号：１２および１０；
    ｅ）配列番号：１２および１４；
    ｆ）配列番号：１２および１７；
    ｇ）配列番号：１５および１０；
    ｈ）配列番号：１５および１４；
    ｉ）配列番号：１５および１７；
    ｊ）配列番号：９、１０、１５、および１７；
    ｋ）配列番号：１２、１４、１５、および１７；
    ｌ）配列番号：２１および２２；
    ｍ）配列番号：２７および２８；
    ｎ）配列番号：３１、３２、および３３；
    ｏ）配列番号：３４、３５、および３６；
    ｐ）配列番号：３７、３８、および３９；
    ｑ）配列番号：４０、４１、および４２；
    ｒ）配列番号：４３および４４；
    ｓ）配列番号：４５および４６；
    ｔ）配列番号：４７、４８、および４９；
    ｕ）配列番号：５０、５１、および５２；
    ｖ）配列番号：５３および５４；
    ｗ）配列番号５９；
    ｘ）配列番号６１；
    ｙ）配列番号６３；
    ｚ）配列番号６５および６７；ならびに
    ａａ）配列番号６９および７１
    から選択される配列に対して少なくともまたは約８５％の同一性を有する配列を含む、請求項１６から１８までのいずれか一項に記載の操作された抗原結合性タンパク質。
20. ａ）表３に列挙されているＶＨ配列からなる群から選択されるＶＨ配列；および／または
    ｂ）表３に列挙されているＶＬ配列からなる群から選択されるＶＬ配列
    を含む、請求項１６から１９までのいずれか一項に記載の操作された抗原結合性タンパク質。
21. 配列番号９、１０、１２、１４、１５、１７、１９、２０～２４、２７、２８、２９～５４、５９、６１、６３、６５、６７、６９、および７１から選択される配列を含む、請求項１６から２０までのいずれか一項に記載の操作された抗原結合性タンパク質。
22. ａ）配列番号：９および１０；
    ｂ）配列番号：９および１４；
    ｃ）配列番号：９および１７；
    ｄ）配列番号：１２および１０；
    ｅ）配列番号：１２および１４；
    ｆ）配列番号：１２および１７；
    ｇ）配列番号：１５および１０；
    ｈ）配列番号：１５および１４；
    ｉ）配列番号：１５および１７；
    ｊ）配列番号：９、１０、１５、および１７；
    ｋ）配列番号：１２、１４、１５、および１７；
    ｌ）配列番号：２１および２２；
    ｍ）配列番号：２７および２８；
    ｎ）配列番号：３１、３２、および３３；
    ｏ）配列番号：３４、３５、および３６；
    ｐ）配列番号：３７、３８、および３９；
    ｑ）配列番号：４０、４１、および４２；
    ｒ）配列番号：４３および４４；
    ｓ）配列番号：４５および４６；
    ｔ）配列番号：４７、４８、および４９；
    ｕ）配列番号：５０、５１、および５２；
    ｖ）配列番号：５３および５４；
    ｗ）配列番号５９；
    ｘ）配列番号６１；
    ｙ）配列番号６３；
    ｚ）配列番号６５および６７；ならびに
    ａａ）配列番号６９および７１
    から選択される配列を含む、請求項１６から２１までのいずれか一項に記載の操作された抗原結合性タンパク質。
23. Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ’、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ｓｃ（Ｆｖ）_２、ハーフ抗体－ｓｃＦｖ、タンデムｓｃＦｖ、タンデムバイパラトピックｓｃＦｖ、Ｆａｂ／ｓｃＦｖ－Ｆｃ、タンデムＦａｂ’、単鎖ダイアボディ、タンデムダイアボディ（ＴａｎｄＡｂ）、Ｆａｂ／ｓｃＦｖ－Ｆｃ、ヘテロ二量体Ｆａｂ／ｓｃＦｖ－Ｆｃ、ヘテロ二量体ｓｃＦｖ－Ｆｃ、ヘテロ二量体ＩｇＧ（ＣｒｏｓｓＭａｂ）、ＤＡＲＴ、およびダイアボディから選択される、請求項１６から２２までのいずれか一項に記載の操作された抗原結合性タンパク質。
24. Ｆ（ａｂ’）_２である、請求項１６から２３までのいずれか一項に記載の操作された抗原結合性タンパク質。
25. 配列番号２１および２２の配列を含む、請求項１６から２４までのいずれか一項に記載の操作された抗原結合性タンパク質。
26. 配列番号２７および２８の配列を含む、請求項１９から２４までのいずれか一項に記載の操作された抗原結合性タンパク質。
27. ＣＴＬＡ４の２つのエピトープ：残基^１３４ＭＹＰＰＰＹ^１３９（配列番号１）によって定義されるエピトープ１および残基^６５ＳＩＣＴ^６８（配列番号２）によって定義されるエピトープ２に結合する、請求項１９から２３までのいずれか一項に記載の操作された抗原結合性タンパク質。
28. 少なくとも２つの異なるＶＨドメインおよび少なくとも２つの異なるＶＬドメインを含む、請求項２７に記載の操作された抗原結合性タンパク質。
29. ＤＡＲＴまたはダイアボディである、請求項２７または２８に記載の操作された抗原結合性タンパク質。
30. 前記ＤＡＲＴまたは前記ダイアボディが、Ｎ末端からＣ末端の方向に、
    ａ）第１のＶＨ；
    ｂ）第１のＶＬ；
    ｃ）第２のＶＨ；および
    ｄ）第２のＶＬ；
    を含み、
    前記第１のＶＨと前記第１のＶＬが、リンカーＡによって連結しており、前記第１のＶＬと前記第２のＶＨが、リンカーＢによって連結しており、前記第２のＶＨと前記第２のＶＬが、リンカーＣによって連結している、
    請求項２９に記載の操作された抗原結合性タンパク質。
31. 前記リンカーＡおよび／またはリンカーＢが、（ＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）ｎのペプチド配列を含み、ｎ＝１～２０である、請求項３０に記載の操作された抗原結合性タンパク質。
32. 前記ｎ＝０、１、２、または３である、請求項３１に記載の操作された抗原結合性タンパク質。
33. 前記ｎ＝３である、請求項３１に記載の操作された抗原結合性タンパク質。
34. 前記リンカーＣが、（ＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）ｎのペプチド配列を含み、ｎ＝１～２０である、請求項３０から３３までのいずれか一項に記載の操作された抗原結合性タンパク質。
35. 前記ｎが、４よりも大きい、請求項３４に記載の操作された抗原結合性タンパク質。
36. 前記ｎ＝０、１、２、３、または４である、請求項３４に記載の操作された抗原結合性タンパク質。
37. 前記ｎ＝３である、請求項３４に記載の操作された抗原結合性タンパク質。
38. 前記リンカーＡ、リンカーＢ、およびリンカーＣのそれぞれが、（ＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）ｎを含み、ｎ＝３である、請求項３０から３７までのいずれか一項に記載の操作された抗原結合性タンパク質。
39. 前記第１のＶＨおよび前記第２のＶＬが、前記エピトープ１（配列番号１）に結合し、前記第１のＶＬおよび前記第２のＶＨが、前記エピトープ２（配列番号２）に結合する、請求項３０から３８までのいずれか一項に記載の操作された抗原結合性タンパク質。
40. 前記第１のＶＨ、第１のＶＬ、第２のＶＨ、第２のＶＬが、それぞれ配列番号１５、配列番号１４、配列番号１２、および配列番号１７と少なくともまたは約８５％の同一性を有する配列を含む、請求項３０から３９までのいずれか一項に記載の操作された抗原結合性タンパク質。
41. 前記第１のＶＨ、第１のＶＬ、第２のＶＨ、第２のＶＬが、それぞれ配列番号１５、配列番号１４、配列番号１２、および配列番号１７の配列を含む、請求項３０から４０までのいずれか一項に記載の操作された抗原結合性タンパク質。
42. 配列番号２４（ＢｉｏＥ２０５２）と少なくともまたは約８５％の同一性を有する配列を含む、請求項３０から４１までのいずれか一項に記載の操作された抗原結合性タンパク質。
43. 配列番号２４（ＢｉｏＥ２０５２）の配列を含む、請求項３０から４２までのいずれか一項に記載の操作された抗原結合性タンパク質。
44. 前記第１のＶＨおよび前記第２のＶＬが、前記エピトープ２（配列番号２）に結合し、前記第１のＶＬおよび前記第２のＶＨが、前記エピトープ１（配列番号１）に結合する、請求項３０から３８までのいずれか一項に記載の操作された抗原結合性タンパク質。
45. 前記第１のＶＨ、第１のＶＬ、第２のＶＨ、第２のＶＬが、それぞれ配列番号１２、配列番号１７、配列番号１５、および配列番号１４と少なくともまたは約８５％の同一性を有する配列を含む、請求項３０から３８までおよび４２のいずれか一項に記載の操作された抗原結合性タンパク質。
46. 前記第１のＶＨ、第１のＶＬ、第２のＶＨ、第２のＶＬが、それぞれ配列番号１２、配列番号１７、配列番号１５、および配列番号１４に記載の配列を含む、請求項３０から３８まで、４４および４５のいずれか一項に記載の操作された抗原結合性タンパク質。
47. 配列番号２３（ＢｉｏＥ２０５１）と少なくともまたは約８５％の同一性を有する配列を含む、請求項３０から３８までおよび４４から４６までのいずれか一項に記載の操作された抗原結合性タンパク質。
48. 配列番号２３（ＢｉｏＥ２０５１）の配列を含む、請求項３０から３８までおよび４４から４７までのいずれか一項に記載の操作された抗原結合性タンパク質。
49. ＣＴＬＡ４が、ヒトＣＴＬＡ４である、請求項１から４８までのいずれか一項に記載の操作された抗原結合性タンパク質。
50. キメラ、ヒト化、複合、マウス、またはヒトである、請求項１から４９までのいずれか一項に記載の操作された抗原結合性タンパク質。
51. ペプチドタグ（例えば、Ｈｉｓ６タグ）および／またはリーダー配列をさらに含む、請求項１から５０までのいずれか一項に記載の操作された抗原結合性タンパク質。
52. コンジュゲートしたまたは検出可能に標識されたものであり、必要に応じて、ＰＥＧ化されたものである、請求項１から５１までのいずれか一項に記載の操作された抗原結合性タンパク質。
53. 自己二量体化する、請求項１から５２までのいずれか一項に記載の操作された抗原結合性タンパク質。
54. ａ）ＣＴＬＡ４とそのリガンド（例えば、ＣＤ８０（Ｂ７－１）およびＣＤ８６（Ｂ７－２））の相互作用を遮断する；かつ／または
    ｂ）Ｔ細胞によるインターロイキン－２（ＩＬ－２）発現を増大させる、
    請求項１から５３までのいずれか一項に記載の操作された抗原結合性タンパク質。
55. 請求項１から５４までのいずれか一項に記載の操作された抗原結合性タンパク質をコードする単離された核酸分子。
56. 請求項５５に記載の単離された核酸を含むベクター。
57. 請求項５５に記載の単離された核酸を含む、請求項５６に記載のベクターを含む、または請求項１から５４までのいずれか一項に記載の操作された抗原結合性タンパク質を発現する、宿主細胞。
58. 請求項１から５４までのいずれか一項に記載の操作された抗原結合性タンパク質、請求項５５に記載の単離された核酸、請求項５６に記載のベクター、または請求項５７に記載の宿主細胞の医薬組成物。
59. 少なくとも１つの、請求項１から５４までのいずれか一項に記載の操作された抗原結合性タンパク質を含むキット。
60. 少なくとも１つの、請求項１から５４までのいずれか一項に記載の操作された抗原結合性タンパク質を作製する方法であって、（ｉ）少なくとも１つの、請求項１から５１までのいずれか一項に記載の操作された抗原結合性タンパク質をコードする配列を含む核酸を含む宿主細胞を、前記操作された抗原結合性タンパク質の発現を可能にするのに適した条件下で培養するステップと、（ｉｉ）発現された操作された抗原結合性タンパク質を回収するステップとを含む、方法。
61. がんを患っている対象に対する予防または処置の方法であって、前記対象に、少なくとも１つの、請求項１から５４までのいずれか一項に記載の操作された抗原結合性タンパク質または請求項５８に記載の医薬組成物を投与するステップを含む、方法。
62. それを必要とする対象におけるがん細胞の増殖を低減させる方法であって、前記対象に、少なくとも１つの、請求項１から５４までのいずれか一項に記載の操作された抗原結合性タンパク質または請求項５８に記載の医薬組成物を投与するステップを含む、方法。
63. 前記少なくとも１つの操作された抗原結合性タンパク質または前記医薬組成物により、（ａ）前記がんにおいて増殖しているがん細胞の数が減少する；（ｂ）前記がんの腫瘍の体積もしくはサイズが低減する；（ｃ）前記がんに対する免疫応答が増大する；および／または（ｄ）Ｔ細胞が活性化される、請求項６１または６２に記載の方法。
64. 前記対象に、追加的ながん治療を施行するステップをさらに含む、請求項６１から６３までのいずれか一項に記載の方法。
65. 前記追加的ながん治療が、免疫療法、チェックポイント遮断、がんワクチン、キメラ抗原受容体、化学療法、放射線照射、標的治療、および外科手術からなる群から選択され、必要に応じて、前記追加的ながん治療が、ニボルマブである、請求項６４に記載の方法。
66. 前記がんが、膵がん、肺がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、悪性胸膜中皮腫、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）、腎細胞癌（ＲＣＣ）、乳がん、肝がん、肝細胞癌、腎がん、皮膚がん、黒色腫、甲状腺がん（ｔｈｙｒｏｉｄ ｃａｎｃｅｒ）、胆嚢がん、頭頸部（扁平上皮）がん、胃がん（ｓｔｏｍａｃｈ（ｇａｓｔｒｉｃ）ｃａｎｃｅｒ）、頭頸部がん、膀胱がん、尿路上皮癌、メルケル細胞がん、結腸がん、結腸直腸がん、腸がん、卵巣がん、子宮頸がん、精巣がん、食道がん、頬粘膜がん、脳がん、血液がん、リンパ腫（Ｂ細胞リンパ腫およびＴ細胞リンパ腫）、中皮腫、皮膚扁平上皮細胞がん、ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、ならびにこれらの悪性または転移性形態から選択される、請求項６１から６５までのいずれか一項に記載の方法。
67. 前記がんが、黒色腫（例えば、切除不能なまたは転移性黒色腫）、腎細胞癌（ＲＣＣ）、結腸直腸がん、肝細胞癌、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、悪性胸膜中皮腫、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）、乳がん、頭頸部がん、膀胱がん、尿路上皮癌、メルケル細胞がん、子宮頸がん、肝細胞癌、胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、皮膚扁平上皮細胞がん、ホジキンリンパ腫、およびＢ細胞リンパ腫から選択される、請求項６１から６６までのいずれか一項に記載の方法。
68. 対象における免疫応答を増大させる方法であって、前記対象に、少なくとも１つの、請求項１から５４までのいずれか一項に記載の操作された抗原結合性タンパク質または請求項５８に記載の医薬組成物を投与するステップを含む、方法。
69. Ｔ細胞を活性化する方法であって、Ｔ細胞を、少なくとも１つの、請求項１から５４までのいずれか一項に記載の操作された抗原結合性タンパク質または請求項５８に記載の医薬組成物と接触させるステップを含む、方法。
70. それを必要とする対象におけるＣＴＬＡ４タンパク質の異所性発現または活性を特徴とする疾患または状態を予防または処置する方法であって、前記対象に、少なくとも１つの、請求項１から５４までのいずれか一項に記載の操作された抗原結合性タンパク質または請求項５８に記載の医薬組成物を投与するステップを含む、方法。
71. 前記疾患または状態が、がん、自己免疫疾患、感染、または炎症性疾患である、請求項７０に記載の方法。

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