SK173099A3 - Vaccine compositions comprising the helicobacter pylori flge polypeptide - Google Patents

Description

Kompozície očkovacej látky obsahujúce FlgE polypeptid Helicobacter pylorí

Oblasť techniky

Predložený vynález sa týka polypeptidov a kompozícií očkovacej látky na vyvolanie ochrannej imunitnej odozvy voči infekcii Helicobacter pylón. Vynález sa ďalej týka použitia polypeptidov Helicobacter pylorí na prípravu kompozícií na liečenie alebo profýlaxiu infekcie Helicobacter pylorí.

Doterajší stav techniky

Helicobacter pylorí

Gram-negatívna baktéria Helicobacter pylorí (H. pylorí) je významným ľudským patogénom, ktorý je príčinou niektorých gastroduodenálnych ochorení. Kolonizácia epitelu žalúdka baktériami vedie k aktívnemu zápalu a progresívnej chronickej gastritíde, so značne zvýšeným rizikom progresie kpeptickému vredovému ochoreniu. Dlhodobý zápal sliznice žalúdka je vo veľmi úzkom vzájomnom vzťahu so signifikantne zvýšeným rizikom rakoviny žalúdka.

Pri kolonizácii sliznice žalúdka H. pylorí sa uplatňuje celý rad virulentných faktorov. Takéto virulentné faktory zahrňujú adhezíny (zrasty), ktorými sa baktéria spája so sliznicou a/alebo sa viaže k epiteliálnym bunkám; močoviny, ktoré pomáhajú neutralizovať kyslé prostredie; a proteolytické enzýmy, ktoré robia sliznicu tekutejšou. Okrem toho H. pylorí je veľmi pohyblivá, steká v sliznici a dolu do vnútra. Ukázalo sa, že pohyblivosť je základným virulentným faktorom, pretože H. pylorí nedokázala infikovať sliznicu pri experimentálnych modeloch, ktoré uskutočnili Eaton a kol. (Infection & Immunity 64(7), 2455-2448 1996).

Pre toto jestvuje veľa možných príčin, najpochopiteľnejšou z nich je neschopnosť stekať dolu a dosiahnuť bunky sliznice a neschopnosť vyhnúť sa škodlivým činidlám v žalúdku.

Napriek silnej zdanlivej imunitnej odozve hostiteľa na H. pylorí, pri produkcii ako lokálnych (mukozálnych) tak i systémových protilátok, patogén zotrváva v sliznici žalúdka bežne počas života pacienta. Dôvodom tohto je pravdepodobne to, že spontánne vyvolané imunitné odozvy sú neadekvátne alebo zamerané voči

-2nesprávnym epitopom antigénov. Alternatívne môže byť imunitná odozva nesprávneho druhu, pretože imunitný systém môže pokladať H. pylori za symbiotickú (ako je znázornené zo vzájomného pomeru životnosť hostiteľa/baktérie).

Aby sme pochopili patogenézu a imunológiu infekcií H. pylori, má veľký význam definovať antigénnu štruktúru tejto baktérie. Predovšetkým, jestvuje tu potreba charakterizácie vystaveného povrchu, spojeného povrchu ako aj vylúčených proteínov, ktoré, ako sa preukázalo, predstavujú pri mnohých bakteriálnych patogénoch hlavný virulentné faktory, a ktoré môžu byť užitočné pri diagnóze H. pylori a pri príprave očkovacích kompozícií. Ak sú takéto proteíny okrem toho, že sú povrchovo pripojené, tiež základnými pre prežitie a/alebo kolonizáciu, ich využiteľnosť ako cieľ pre očkovacou látkou sprostredkované imunoterapeutické ciele sa zvyšuje.

Pri strese alebo v ohrození sa bunka H. pylori transformuje z bacilárnej formy na kokoidnú formu. V kokoidnej forme je bunka H. pylori menej citlivá voči antibiotikám a ďalším antibakteriálnym činidlám. Podrobné výskumy naznačujú, že H. pylori sa môže prenášať medzi jednotlivcami v tejto forme, pravdepodobne vodou alebo priamym kontaktom (orálno-orálne, fekálno-orálne). Účinná kompozícia očkovacej látky by teda mala vyvolať imunitnú odozvu voči obom formám H. pylori, kokoidnej a bacilárnej. Pretože systémová imunita hrá pravdepodobne iba obmedzenú úlohu pri ochrane pred infekciami sliznice, je tiež dôležité, aby kompozícia očkovacej látky zvyšovala ochranný imunitný mechanizmus lokálne v žalúdku.

Flagelámy hook proteín

Ukázalo sa, že Flagelárne hook z H. pylori pozostávajú z FlgE podjednotiek 78kDa (O'Toole a kol., Molecular Microbiology, 14(4), 691 - 703, 1994). Úlohou Flagelámeho hook je spojiť Flagela so submembránovým Flagelárnym hook pohybom. Časť hook vytláčaná mimo membránu je krátka, približne 60 nanometrov (v porovnaní ku približne 10 mikrometrom pre Flagela). Podobne ako Flagela H. pylori, hook je pravdepodobne pokrytý poťahom (Geis a kol., (1993), J. Med. Microbiol. 38(5), 371 - 377).

-3Aminokyselinová sekvencia FlgE polypeptidu má signifikantnú podobnosť s ďalšími známymi hook proteínmi, vrátane limitovanej homológie k ďalším druhom Helicobacter, ako je mustelae (O'Toole a kol., uvedené vyššie). Polyklonálne protilátky vyvolané proti FlgE polypetidu vykázali skríženú reaktivitu voči Flagelámym proteínom A a B, čo pravdepodobne indikuje existenciu spoločných epitopov. Produkcia FlgE paralyzuje H. pylón, výsledkom čoho je aflageláma nepohyblivá baktéria, kde sa FlgE polypetid produkoval, ale mohol sa znova zachytiť v cytoplazme.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obrázok 1

Vplyv terapeutickej imunizácie myší infikovaných H. pylorí (n = 9-10/skupinu) s FlgE polypeptidom. Výsledky sú uvedené ako stredná ±SEM počtu H. pylorí spojených s antrum (=A), telieskom (=B) alebo celkovo (A+B) (=C). Skratky: CFU, jednotky tvoriace kolóniu (počet baktérií); nešrafované stĺpce = DOC+CT, fosfátom pufrovaný fyziologický roztok s 0,5 % deoxycholátu sa podával spolu s toxínom cholery 10 pg/myš; šrafované stĺpce = FlgE+CT, myši dostávali 100 pg FlgE a 10pg toxínu cholery. Pokles CFU bol signifikantný vantrume a vypočítal sa pre celý žalúdok.

**p<0,01; *p<0,05 (Wilcoxon-Mann-Whittneyov klasifikačný test znakov)

Obrázok 2

Sérum IgG z myší merané pomocou ELISA metodiky: odozvy na infekciu a na imunizáciu s FlgE. Hodnoty boli vyjadrené ako priemerné titre ±SEM, n = 9 až 10/skupinu. ELISA pokrytá s kmeňom H. pylorí 244; ako príznak infekcie H. pylorí sa v sére zvierat ošetrených s DOC + CT (=A, kontrola/244) dali zistiť špecifické protilátky. Následná imunizácia s FlgE + toxínom cholery (=B, FlgE/244) túto reaktivitu zvyšovala štvornásobne (**p<0,01; (Wicoxon-Mann-Whittneyov klasifikačný test znakov). C = FlgE špecifické. Špecifické FlgE sa zvyšovalo u zvierat, ktoré dostávali FlgE + CT, avšak nedalo sa stanoviť pre kontrolné zvieratá.

-4Podstata vynálezu

Cieľom tohto vynálezu je poskytnúť antigénny polypetid H. pylori, ktorý sa môže použiť na vyvolanie ochrannej imunitnej odozvy voči H. pylori a na diagnostikovanie infekcie H. pylori. Tento cieľ sa dosiahol pomocou rekombinantného klonovania génu H. pylori, ktorý kóduje dobre uchovaný základný polypeptid. Sekvencia nukleových kyselín tohto génu je podobná sekvencií génu FlgE, ako publikovali O'Toole a kol., Molecular Microbiology, 14(4), 691 - 703, 1994. Ako základný proteín motility je gén FlgE exprimovaný všetkými kmeňmi H. pylori.

Prekvapujúco sa zistilo, že FlgE polypetid H. pylori, napriek skutočnosti, že len malá časť hook proteínu jestvuje mimo baktérie a že je pravdepodobne pokrytý poťahom, môže slúžiť ako terapeutický antigén pri modele myší infikovaných H. pylori, ak sa podáva spolu s pomocnou látkou toxínom cholery. Nižšie uvedené experimentálne údaje teda indikujú, že FlgE polypetid H. pylori, ak sa použije ako orálny imunogén, pôsobí ako stimulátor imunitnej odozvy, ktorý vedie k signifikantnému zníženiu kolonizácie H. pylori u myší, ktoré boli infikované s H. pylori jeden mesiac pred imunizáciou.

Tieto výsledky silne podporujú použitie FlgE polypeptidu H. pylori v orálnych prípravkoch očkovacej látky na použitie pri liečení alebo prevencii infekcií H. pylori u človeka. Samotný FlgE proteín bude využiteľný ako pri stanovení infekcií H. pylori tak aj pri výrobe kompozícií očkovacej látky, ktoré, ak sa podajú vo vhodných farmaceutických prípravkoch, budú vyvolávať ochrannú alebo terapeutickú imunitnú odozvu voči takýmto infekciám.

Preto vynález ďalej poskytuje FlgE polypetid Helicobacter pylori na použitie na vyvolanie ochrannej imunitnej odozvy voči infekciám. Termín “FlgE polypetid Helicobacter pylori je mienený ako polypetid, ktorý opísali O'Toole a kol. v Molecular Microbiology, 14(4), 691 - 703, 1994, a ktorý je kódovaný pomocou génu, ktorého nukleotidová sekvencia je uvedená ako SEQ ID NO. 1, alebo sa môže získať z National Center for Biotechnology Information (Accession number (prírastkové číslo) U09549) alebo v podstate podobná modifikovaná forma uvedeného polypeptidu, ktorá si zachováva funkčnú ekvivalentnú antigenicitu.

-5Pod termínom ochranná imunitná odozvy” je potrebné rozumieť imunitnú odozvu, ktorá robí kompozíciu vhodnou na terapeutické a/alebo profylaktické účely.

Pod termínom “funkčná ekvivalentná antigenicita” treba chápať ako schopnosť vyvolať systémovú a mukozálnu imunitnú odozvu, pričom sa znižuje počet buniek H. pylori spojených so sliznicou žalúdka. Odborníci skúsení v odbore budú schopní identifikovať modifikované formy FlgE polypeptidu, ktorý si zachováva funkčnú ekvivalentnú antigenicitu, s použitím známych postupov, ako je zobrazenie epitopov s protilátkami vyvolanými in vivo.

Vo výhodnom spôsobe uskutočnenia vynálezu FlgE polypeptid Heiicobacter pylori na použitie na vyvolanie ochrannej imunitnej odozvy voči infekcii Heiicobacter pylori, má v podstate aminokyselinovú sekvenciu uvedenú ako SEQ ID NO. 2 v zozname sekvencií, alebo jej modifikovanú formu, ktorá sa zachováva funkčnú ekvivalentnú antigenicitu.

Preto je treba chápať, že definícia FlgE polypeptidu Heiicobacter pylori nie je prísne obmedzená na polypeptid, s aminokyselinovou sekvenclou, ktorý je identický s SEQ ID č. 2 v zozname sekvencií. Vynález skôr zahrňuje polypeptidy, ktoré nesú modifikácie, ako sú substitúcie, malé vyradenia, vloženia alebo inverzie, pričom tieto polypeptidy napriek tomu majú v podstate biologickú aktivitu FlgE polypeptidu Heiicobacter pylori a zachováva sa funkčná ekvivalentná antigenicita. Do definície FlgE polypetidu Heiicobacter pylori sú preto zahrnuté polypeptidy, aminokyselinová sekvencia ktorých je najmenej na 90 % homologických, výhodne najmenej na 95 % homologických, s aminokyselinovou sekvenciou uvedenou ako SEQ ID No 2, v zozname sekvencií.

Vynález sa ďalej poskytuje kompozíciu očkovacej látky na vyvolanie ochrannej imunitnej odozvy voči infekcii Heiicobacter pylori, ktorá obsahuje imunogénne účinné množstvo FlgE polypetidu Heiicobacter pylori, ako je definovaný vyššie, prípadne spolu s farmaceutický prijateľným nosičom alebo riedidlom.

V uvedenom kontexte termín “imunologický účinné množstvo treba chápať ako množstvo, ktoré vyvolá signiflkantnú ochrannú odozvu Heiicobacter pylori, ktorá vykorení infekciu H. pylori u infikovaných cicavcov alebo zabráni infekcii u náchylných cicavcov. Typicky bude imunologický účinné množstvo obsahovať

-6približne 1 gg až 1000 mg, výhodne približne 10 pg až 100 mg, antigénu H. pylori na orálne podávanie alebo približne menej ako 100 pg na parenterálne podávanie.

Kompozícia očkovacej látky obsahuje prípadne okrem farmaceutický prijateľného nosiča alebo riedidla jeden alebo viac ďalších farmaceutický účinných antigénov na profylaktické alebo terapeutické použitie. Fyziologicky prijateľné nosiče a riedidlá sú pre odborníkov v odbore dobre známe a zahrňujú napríklad fosfátom pufrovaný fyziologický roztok (PBS) alebo, v prípade orálnych očkovacích látok, prípravky na báze HCO3- alebo entericky poťahované práškové prípravky.

Kompozícia očkovacej látky môže prípadne obsahovať alebo sa môže podávať spolu s inhibítormi sekrécie, výhodne inhibítormi protónovej pumpy (PPI), napríklad omeprazolom. Očkovacia látka sa potom môže formulovať do známych systémov dodávania, ako sú lipozómy, ISCOM, kochley, a podobne (pozri napríklad Rabinovich a kol., (1994), Science 265, 1401 až 1404) alebo sa pripojiť alebo začleniť do mikrosfér polyméru odbúrateľnej alebo neodbúrateľnej povahy. Antigény môžu byť spojené so živými oslabenými baktériami, vírusmi alebo fágmi alebo s usmrtenými vektormi rovnakého druhu. Antigény môžu byť chemicky alebo geneticky pripojené k proteínom nosiča inertného alebo pomocného typu (napríklad podjednotka cholery B). Ďalej sa vynález týka kompozície očkovacej látky podľa vyššie uvedeného, ktorá okrem toho obsahuje pomocnú látku, ako je toxín cholery. Takéto farmaceutický prijateľné formy toxínu cholery sú známe z doterajšieho stavu techniky, napríklad z Rappuoli a kol., (1995), Int. Árch. Allergy & Immunol. 108(4), 327 až 333; a Dickinson a kol., (1995), Infection and Immunity 63(5), 1617 až 1623.

Kompozícia očkovacej látky podľa vynálezu sa môže použiť ako na terapeutické tak i na profylaktické účely. Vynález teda zahrňuje kompozíciu očkovacej látky, ako je definovaná vyššie, na použitie ako liečivo alebo profylaktickú očkovaciu látku pre cicavca, vrátane človeka, ktorý je infikovaný Helicobacter pylori. V tomto kontexte termín “profylaktický účel” znamená vyvolanie imunitnej odozvy, ktorá zabráni budúcej infekcii s Helicobacter pylori, zatiaľ čo termín “terapeutický účel” znamená vyvolanie imunitnej odozvy, ktorá môže vykoreniť jestvujúce infekcie Helicobacter pylori.

-7Kompozícia očkovacej látky podľa vynálezu sa výhodne podáva cez sliznicu cicavca, napríklad cez bukáinu, nasálnu, tonzilárnu, žalúdočnú alebo intestinálnu (tenké a hrubé črevo), rektálnu a vaginálnu sliznicu. Mukozálna očkovacia látka sa môže podávať spolu s pomocnými látkami vhodnými na tento účel. Očkovacia látka sa môže podávať tiež orálne alebo parenterálne, subkutánnou, intrakutánnou alebo intramuskulárnou cestou, prípadne spolu s vhodnými pomocnými látkami. Kompozícia očkovacej látky sa môže prípadne podávať spolu s vhodnou pomocnou látkou. Kompozícia účinnej látky sa môže prípadne podávať spolu s antimikrobiálnym terapeutickým činidlom.

Vynález sa ďalej týka použitia FlgE polypeptidu Helicobacter pylorí, ako je definovaný vyššie, na prípravu (i) kompozície na liečenie, profylaxiu alebo diagnostikovanie infekcie Helicobacter pylón;

(ii) očkovacej látky na použitie pri vyvolaní ochrannej imunitnej odozvy proti Helicobacter pylón; a (iii) diagnostického kitu na diagnostikovanie infekcie Helicobacter pylorí.

Okrem toho vynález ešte poskytuje spôsob in vitro diagnostikovania infekcie Helicobacter pylorí, ktorý zahrňuje najmenej jeden krok, pričom FlgE polypetid Helicobacter pylorí, definovaný vyššie, sa prípadne použije značený alebo spojený s pevným podkladom. Uvedený spôsob by mohol napríklad zahrňovať kroky (a) uvedenie do kontaktu uvedeného FlgE polypeptidu Helicobacter pylorí , prípadne viazaného k pevnému podkladu, s telesnou kvapalinou odobranou cicavcovi; a (b) detegovaním protilátok z uvedenej telesnej kvapaliny naviazaním na uvedený FlgE polypeptid. Výhodnými spôsobmi detekcie protilátok sú spôsoby ELISA (Enzýme linked imunoabsorbed assay, enzýmom viazané imunoabsorbčné skúšky), ktoré sú dobre známe z doterajšieho stavu techniky.

Predložený vynález v ďalšom poskytuje diagnostický kit na detegovanie infekcie Helicobacter pylorí u cicavca, vrátane človeka, obsahujúci zložky, ktoré umožňujú uskutočnenie spôsobu diagnostikovania in vitro, ako je opísané vyššie. Uvedený diagnostický kit môže obsahovať napríklad: (a) FlgE polypeptid Helicobacter pylorí;

-8a (b) reagenty na detegovanie protilátok viažúcich sa k uvedenému FlgE polypeptidu. Uvedenými reagentami na detegovanie protilátok by mohol byť napríklad enzýmom značený anti-imunoglobulín a chromogénny substrát pre uvedený enzým.

Ešte ďalej sa vynález týka poskytnutia spôsobu vyvolania u cicavca, vrátane človeka, ochrannej Imunitnej odozvy proti infekcii Helicobacter pylón, pričom uvedený spôsob zahrňuje krok podávania uvedenému cicavcovi imunologický účinné množstvo FlgE polypeptidu Helicobacter pylori ako je definovaný vyššie, alebo alternatívne podávanie uvedenému cicavcovi imunologický účinné množstvo kompozície očkovacej látky, definovanej vyššie.

Experimentálne metódy

V celom tomto opise termín “štandardný protokol” a “štandardný postup” použité v kontexte metód génového inžinierstva, treba chápať ako protokoly a postupy nájdené v štandardnom laboratórnom manuále, ako je: Current Protocols in Molecular Biology, Ed. F. Ausubel a kol., John Woley and Sons, Inc. 1994, alebo Sambrook, J., Fritsch, E. F. a Maniatis, T., Molecular Cloning: A laboratory manual, 2^nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY 1989. Príprava rekombinantného FlgE polypeptidu Helicobacter pylori

DNA sekvenčná informácia

Sekvečná informácia pre gén kódovaný pre FlgE polypeptid sa získala od National Center for Biotechnology Information (Accession number (prírastkové číslo) U09549; SEQ ID No: 1).

PCR amplifikácia a klonovanie DNA sekvencií obsahujúcich ORF pre membrány a vylúčené proteíny z J99 kmeňa Helicobacter pylori.

Sekvencie sa klonovali zJ99 kmeňa H. pylori amplifikačným klonovaním s použitím polymerázovej reťazovej reakcie (PCR). Navrhli a získali sa syntetické oligonukleotidové priméry (pozri nižšie) špecifické pre 5'a 3'-konce otvorených čítacích rámcov (GibcoBRL Life Technologies, Gaithersburg, MD, USA). Pôvodné priméry (špecifické pre 5'-konce sekvencie) pre FlgE sa navrhli tak, aby zahrňovali

-9Ncol klonované miesto na extrémnom 5'-konci, pričom reverzné priméry zahrňovali EcoRI miesto na extrémnom 5'-konci, aby sa umožnilo klonovanie každej sekvencie H. pylori do čítacieho rámca vektora pET-28b. Inzerty klonované do NcolEcoR\ miest vektora pET-28b sa fúzovali na vektor sekvencie DNA kódujúci prídavných 20 karboxy-terminálnych amino, vrátane šesť histidínových zvyškov (na extrémnom C-konci).

Pôvodný primér (SEQ ID NO: 3)

5'-TAT ACC ATG GTG CTT AGG TCT TTA T-3'

Reverzný primér (SEQ ID NO: 4)

5'-GCG AAT TCA ATT GCT TAA GAT TCA A-3'

Genómová DNA pripravená z kmeňa J99 Helicobacter pylori sa použila ako zdroj matrice DNA na PCR amplifikačné reakcie (Current Protocols in Molecular Biology, Ed. F. Ausubel a kol., John Wiley and Sons, Inc. 1994). Na amplifikovanie DNA sekvencie obsahujúcej ORF H. pylori, sa genómová DNA (50 ng) zaviedla do reakčnej fľaštičky, obsahujúcej 2 mM MgCI2, 1 μΜ syntetických oligonukleotidových primérov (pôvodné a reverzné priméry) komplementárna k a lemujúca definovanú ORF H. pylori, 0,2 mM každého deoxynukleotidového trifosfátu dATP, dGTP, dCTP, dTTP a 2,5 jednotiek tepelne stabilizovanej DNA polymerázy (Amplitaq, Roche Molecular Systems, Inc. Branchburg, NJ, USA) v konečnom objeme 100 μΙ. Použili sa nasledovné cyklické podmienky na získanie amplifikovaných DNA produktov pre každý použitý ORF, s použitím Perkin Elmer Cetus/GeneAmp PCR systému 9600 termálneho cyklu:

Denaturácia pri +94 °C počas 2 min;

cykly pri +94 “C počas 15 sek., +30 °C počas 15 sek. a +72 ^eC počas 1,5 min.;

cyklov pri +94 °C počas 15 sek., +58 °C počas 15 sek. a +72 °C počas 1,5 min.; Reakcie sa ukončili pri +72 ^eC počas 6 minút.

Po ukončení termálnych cyklických reakcií sa každá vzorka amplifikovanej DNA sa premyla a prečistila s použitím Qiaquick Spin PCR kitu na prečistenie (Qiagen, Gaithersburg, MD, USA). Amplifikované DNA vzorky sa podrobili digescii

-10s reštrikčnými endonukleázami Nde\ a EcoRI s použitím štandardných postupov. Vzorky DNA sa potom podrobili elektroforéze na 1,0 % NuSeive (FMC BioProducts, Rockland, ME, USA) agarózovom géle. DNA sa vizualizovala expozíciou etídiumbromidu a ožiareniu UV dlhými vlnami. DNA obsiahnutá v podieloch izolovaných zagarózového gélu sa prečistila s použitím Bio 101 GeneClean Kit protokolu (Bio 101 Vista, CA, USA).

Klonovanie DNA sekvencií H. pylori do pET-28b prokaryotického expresívneho vektora pET-28b vektor sa pripravil na klonovanie digesciou s Λ/col a EcoRI podľa štandardných postupov. Po digescii sa DNA inzerty klonovali podľa štandardných postupov do pôvodne digerovaného pET-28b expresívneho vektora. Produkty ligačnej reakcie sa potom použili na transformovanie BL21 kmeňa E. coli, ako je opísané ďalej.

Transformácia vhodnej baktérie s rekombinantnými plazmidmi

Vhodné baktérie E. coli kmeňa BL21 alebo E. coli kmeňa BL21(DE3) sa transformovali s rekombinantnými pET expresívnymi plazmidmi, ktoré nesú klonované sekvencie H. pylori podľa štandardných postupov. Stručne 1 μΙ ligačnej reakčnej zmesi sa zmiešalo s 50 μΙ elektrokompetentných buniek a podrobilo sa impulzu s vysokým napätím, po ktorom sa vzorky inkubovali v 0,45 ml SOC média (0,5 % extrakt kvasiniek, 2,0 % tryptónu, 10 mM NaCI, 2,5 mM KCI, 10 mM MgCI₂, 10 mM MgSO₄ a 20 mM glukózy) pri teplote +37 °C za trepania počas jednej hodiny. Vzorky sa potom naniesli na LB agarové platne obsahujúce 25 μg/ml kanamynsulfátu na a nechali sa rásť cez noc. Transformované kolónie BL21 sa potom zozbierali a analyzovali sa na vyhodnotenie kolovaných inzertov opísaných nižšie.

Identifikácia rekombinantných pET expresívnych plazmidov nesúcich sekvencie H. pylori

Jednotlivé BL21 klony transformované s rekombinantnými pET-28b génmi H. pylori sa analyzovali pomocou PCR amplifikácie klonovaných inzertov s použitím pôvodných a reverzných primérov, špecificky pre každú sekvenciu H. pylori , ktoré

-11sa použili v pôvodných PCR amplifikačných klonovacích reakciách. Následná amplifikácia verifikovala integráciu sekvencií H. pylón v expresívnom vektore podľa štandardných postupov.

Izolácia a príprava plazmidu DNA z BL21 transformantov

Jednotlivé klony rekombinantných pET-28b vektorov, ktoré nesú vhodne klonované ORF H. pylorí sa zozbierali a inkubovali sa cez noc v 5 ml LB bujónu plus 25 pg/ml kanamycínsulfátu. Nasledujúci deň sa plazmid DNA izoloval a prečistil s použitím Qiagen plazmidového čistiaceho protokolu (Qiagen Inc., Chatsworth, CA, USA).

Expresia rekombinantnej sekvencie H. pylón v E. coli

Vektor pET sa môže množiť v ktoromkoľvek K-12 kmeni E. coli, napríklad HMS174, HB101, JM109, DH5a, a podobne, pre účely klonovania alebo prípravy plazmidu. Hostitelia pre expresiu zahrňujú kmene E. coli obsahujúce chromozomálnu kópiu génu pre T7 RNA polymerázu. Týmito hostiteľmi sú lyzogény bakteriofágu DE3, lambda derivát, ktorý nesie lacl gén, lacUV5 promótor a gén pre T7 RNA polymerázu. T7 RNA polymeráza sa vyvolá pridaním izopropyl-p-Dtiogalaktozidu (IPTG) a T7 RNA polymeráza transkribuje akýkoľvek cieľový plazmid, ako je pET-28b, nesúci svoj významný gén. Kmene použité v našom laboratóriu zahrňujú: BL21(DE3), (Studier, F. W., Rosenberg, A.H., Dunn, J. J. a Dubendorff, J. W. (1990), Methods Enzymol. 185, 60 -89).

Na expresiu rekombinantných sekvencií H. pylorí sa použilo 50 ng plazmidu DNA, izolovaného ako je opísané vyššie, na transformovanie príslušnej BL21(DE3) baktérie, ako je opísané vyššie (ktorú poskytol Novagen ako súčasť kitu pET expresívneho systému). Transformované bunky sa kultivovali v SOC médiu počas jednej hodiny a kultúry sa potom naniesli na LB platne obsahujúce 25 pg/ml kanamycínsulfátu. Nasledujúci deň sa bakteriálne kolónie spojili a nechali sa rásť v LB médiu obsahujúcom kanamycínsulfát (25 pg/ml) do optickej hustoty pri 600 nm 0,5 až 1,0 O.D. jednotiek, pričom v tomto bode sa ku kultúre pridal počas 3 hodín 1mM IPTG na vyvolanie expresie H. pylorí rekombinantných DNA konštrukcií.

-12Po vyvolaní expresie génu sIPTG sa baktérie granulovali centrifúgovaním v Sorval RC-3B centrifúge pri 3500 x g počas 15 minút pri teplote 4 “C. Granule sa resuspendovali v 50 ml chladného 10 mM Tris-HCI, pH 8,0, 0,1 M NaCI a 0,1 mM EDTA (STE pufer). Bunky sa potom centrifúgovali pri 2000 x g počas 20 minút pri teplote +4 °C. Vlhké granule sa odvážili a zmrazili pri teplote -80 °C, až kým boli pripravené na prečistenie proteínu.

Analytické metódy

Koncentrácie prečistených proteínových prípravkov sa kvantifikovali spektrofotometricky s použitím koeficientov absorbancie vypočítaných z obsahu aminokyseliny (Perkins, S. J., 1986 Eur. J. Biochem, 157,169 - 180). Koncentrácie proteínu sa tiež merali pomocou metódy, ktorú opísal Bradford, M. M. (1976) Anál. Biochem. 72, 248 - 254 a Lowry, O. H., Rosebrough, N., Farr, A. L. & Randall, R. J. (1951), s použitím albumínu hovädzieho séra ako štandardu.

Gély dodecylsulfát sodný-polyakrylamid (SDS-PAGE) (gradient akrylamidu 12 % alebo 4 až 25 %) sa získali od BioRad (Hercules, CA, USA) a zafarbili sa s použitím Coomasie Brilliant Blue. Markéry molekulovej hmotnosti obsahujúce skeletálny svalový myozín králika (200 kDa), E. coli β-galaktozidázu (116 kDa), svalovú fosforylázu B králika (97,4 kDa), albumín hovädzieho séra (66,2 kDa), ovalbumín (45 kDa), hovädziu uhličitú anhydrázu (31 kDa), inhibítor trypsínu sóje (21,5 kDa), lyzozým vaječného bielka (14,4 kDa) a hovädzí aprotinín (6,5 kDa).

Prečistenie FlgE z implikovaných teliesok

Nasledujúce kroky sa uskutočnili pri teplote +4 °C. Granule buniek sa resuspendovali v lýznom pufre s 10 % glycerolu, 200 pg/ml lyzozómu, 5 mM EDTA, mM PMSF a 0,1 % β-merkaptoetanolu. Po pasáži cez rozrušovač buniek sa výsledný homogenizát spracoval s 0,2 % DOC, miešal sa počas 10 minút, potom sa centrifúgoval (10,000 x g 30 min). Granule sa najskôr premyli s lýznym pufrom obsahujúcim 10 % glycerolu, 10 mM EDTA, 1 % Triton X-100,1 mM PMSF a 0,1 % β-merkaptoetanolu, potom s lýznym pufrom obsahujúcim 1 M močoviny, 1 mM PMSF a 0,1 % β-merkaptoetanolu. Výsledné biele granule primárne pozostávali

-13z implikovaných teliesok, ktoré neobsahovali rozrušené bunky a membranózne materiály.

Nasledujúce kroky sa uskutočnili pri laboratórnej teplote, implikované telieska sa rozpustili v 20 ml 8 M močoviny v lýznom roztoku s 1 mM PMSF a 0,1 % βmerkaptoetanolu a inkubovali sa pri laboratórnej teplote počas jednej hodiny. Látky, ktoré sa nerozpustili sa odstránili centrifúgovaním (100,00 x g počas 30 min). Číry supernatant sa odfiltroval a naniesol na Ni²⁺-NTA agarózovú kolónu, ktorá sa ekvilibrovala s 8 M močoviny v lýznom pufre. Kolóna sa premyla s 250 ml (50 vrstvových objemov) lýzneho pufra obsahujúceho 8 M močoviny, 1 mM PMSF a 0,1 % β-merkaptoetanolu a vyvíjala sa s postupnými krokmi lýzneho roztoku obsahujúceho 8 mM močoviny, 1 mM PMSF, 0,1 % β-merkaptoetanolu a 20, 100, 200 a 500 mM imidazolu. Frakcie sa monitorovali pomocou absorbancie pri OD280 nm a piky frakcií sa analyzovali s SDS-PAGE. Dva pásy sa vizualizovali vyfarbením s použitím Coomassie Brilliant Blue, hlavný pás Mr=78 kDa a minoritný pás Mr=60 kDa. Čistota rekombinantnej FlgE (78 kDa) sa vyhodnotila vyššia ako 90 %. Tak ako pri prečistení rozpustných proteínov, frakcie obsahujúce rekombinantný proteín sa eluovali pri 100 mM midazolu.

Močovina sa pomaly odstránila z FlgE polypeptidu dialýzou oproti TBS obsahujúcom 0,5 % DOC s nasledovným postupným znížením močoviny: 6 M, 4 M, 3 M, 2 M, 1 M, 0,5 M a potom 0 M. Každý krok dialýzy sa uskutočňoval počas najmenej 4 hodín pri laboratórnej teplote.

Po dialýze sa vzorky zahustili tlakovou filtráciou s použitím Amicon miešaných buniek. Koncentrácie proteínu sa potom stanovili pomocou postupov Perkinsa, Bradforda a Lowryho.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Terapeutická imunizácia

1. Materiál a metódy

- ΜΙ. 1. Zvieratá

Samice SPF BALB/c myší sa získali od Bomholt Breeding centre (Dánsko).

Udržiavali sa v bežných makrokolónových klietkach s voľným podávaním vody a potravy. Pri dodaní boli zvieratá vo veku 4 až 6 týždňov.

1.2. Infikovanie

Po minimálne jednom týždni aklimatizácie sa zvieratá nainfikovali s typom 2 kmeňa H. pylori (kmeň 244, pôvodne izolovaný od ulceratívneho pacienta). Tento kmeň sa už predtým preukázal ako dobrý kolonizátor v žalúdku myší. Baktérie z kmeňa udržiavané pri teplote -70 °C sa nechali rásť cez noc v Brucela bujóne doplnenom s 10 % fetálneho teľacieho séra, pri teplote +37 °C v mikroaerofilnej atmosfére (10 % CO2, 5 % O2). Zvieratám sa podala orálna dávka omeprazolu (400 pmol/kg) a po 3 až 5 hodinách orálna inokulácia H. pylori (približne 10'⁷ až 10 ⁸ CFU/zviera). Infekcia sa skúmala na kontrolných zvieratách 2 až 3 týždne po inokulácii.

1.3. Imúnizácia

Jeden mesiac po infekcii sa dve skupiny myší (10 myší/skupina) imunizovali štyrikrát v priebehu 34-dňového obdobia (deň 1, 15, 25 a 35). Prečistený rekombinantný FlgE rozpustený v PBS plus 0,5 % deoxycholátu (DOC) sa podával v dávke 100 mikrogramov/myš.

Ako pomocná látka sa zvieratám v oboch kontrolných skupinách ako aj FlgE skupine podávalo 10 pg/myš toxínu cholery (CT) s každou imunizáciou. Omeprazol (400 μηιοΙ/kg) sa podával orálne všetkým zvieratám 3 až 5 hodín pred imunizáciou ako spôsob ochrany antigénov pred kyslou degradáciou. Zvieratá sa utratili 1 až 2 týždne po poslednej imunízácii.

Skupina 1: 300 μΙ PBS s 0,5 % DOC obsahujúceho 10 gg CT

Skupina 2: 300 μΙ PBS s 0,5 % DOC obsahujúceho 100 μg FlgE a 10 μg CT.

1.4. Analýza infekcie

-15Myši sa utratili pomocou CO₂ a zlomenia šije. Brucho a hrudná dutina sa otvorili a krv sa odobrala punkciou zo srdca. Následne sa žalúdok odstránil. Po rozrezaní žalúdka pozdĺž najväčšieho zakrivenia, sa žalúdok premyl fyziologickým roztokom a potom sa rozrezal na dve rovnaké časti. Oblasť 25 mm² sliznice zantrumu a z korpusu sa zoškrabali oddelene s použitím chirurgického skalpela. Zoškrabaná sliznica sa suspendovala vBrucela bujóne, zriedila sa a naniesla na Blood Skirrowove platničky. Platničky sa inkubovali pri mikroaerofilných podmienkach počas 3 až 5 dní a počítal sa počet kolónií. Identita H. pylón sa vyhodnotila pomocou močoviny a testu s katalázou a priamou mikroskopiou alebo Gram vyfarbením.

1.5. Meranie protilátok

Protilátky v sére sa odobrali z krvi. Pred centifúgovaním sa krv zriedila rovnakým množstvom PBS. Sérum sa udržiavalo pri teplote -20 °C až do analýzy. Protilátky v sére sa merali s použitím ELISA, pričom platničky boli potiahnuté buď rozdrobenými frakciami kmeňa 244 H. pylón alebo s FlgE a následne sa pridali rozličné zriedenia séra. ELISA sa vyvíjala s alkalickou fosfatázou značenými myšími anti-lg-protilátkami. Anti-lg protilátky boli typu reťazca anti-ťažký/anti-ľahký, ktorý by mal detegovať všetky typy protilátok.

2. Výsledky

2.1. Terapeutická imunizácia: vplyv na CFU

Zvieratá v tejto štúdii boli infikované kmeňom 244 H. pylori jeden mesiac pred imunizáciou. Myši v skupinách po desať sa potom imunizovali buď s toxínom cholery (CT) alebo CT spolu s rekombinantným FlgE polypeptídom. Štyri týždne po poslednej imunizácii sa zvieratá utratili a stanovila sa CFU (Obrázok 1). Zvieratá ošetrené so samotným CT boli vysoko infikované, ako v korpuse tak i v antrume. Zvieratá aktívne imunizované s rekombinantným FlgE polypeptidom a CT vykazovali signifikantné zníženie CFU hodnôt v antrume a v žalúdku, v porovnaní so zvieratami imunizovanými s CT (p<0,01 a p<0,05; Wilcoxon-Mann-Whittneyov klasifikačný test znakov).

2.2. Terapeutická imunizácia: vplyv na tvorbu protilátok a sekréciu

-16Ako príznak infekcie H. pylorí sa môžu v sére nájsť špecifické protilátky (kontrola/244). U zvierat, ktoré dostávali FlgE + CT sa titer voči kmeňu 244 (ako membránové proteíny) zvýšil štvornásobne (p<0.01). Len u zvierat, ktoré dostávali

FlgE + CT sa dal namerať špecifický IgG titer voči FlgE (Obrázok 2).

FlgE špecifická IgG sa zvýšila u zvierat, ktoré dostávali FlgE + CT, avšak nedala sa detegovať pri kontrolných zvieratách.

Uvedené výsledky ukazujú, že rekombinantný FlgE polypeptid H. pylón je vysoko imunogénny, ak sa podáva orálne, spolu s toxínom cholery ako pomocnou látkou, merané ako zvýšenie systémových FlgE špecifických Ig protilátok. Imunizácia s FlgE mala tiež za následok signifikantné zvýšenie ig titrov voči rozdrobenej frakcii H. pylón. Okrem toho sa zistilo dramatické zníženie počtu H. pylorí kolonizujúcich sliznicu žalúdka infikovaných myší po imunizácii s FlgE spolu s toxínom cholery.

-17Zoznam sekvencií (1) Všeobecné informácie (i) Prihlasovateľ (A) Meno: Astra AB (B) Ulica: Västra Mälarehamnen 9 (C) Mesto: Sôdertälje (E) Štát: Švédsko (F) Kód pošty (ZIP): S-151 85 (G) Telefón: +46 8 553 260 00 (H) Telefax: +46 8 553 288 20 (i) Názov vynálezu: Kompozície očkovacej látky obsahujúce FlgE polypeptid Helicobacter pylori (ii) Počet sekvencií: 4 (iii) Počítačom čitateľná forma:

(A) Typ média: Floppy disk (B) Počítač: IBM PC kompatibilný (C) Operačný systém: PC-DOS/MS-DOS (D) Software: Patentln Reease #1.0, verzia #1,30 (EPO) (2) Informácie pre SEQ ID NO: 1:

(i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 2550 základných párov (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazec: dvojitý (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: cDNA (vi) Pôvodný zdroj:

(A) Organizmus: Helicobacter pylori (ix) Charakteristika:

(A) Názov/kľúč: CDS (B) Lokalizácia: 321..2477 (D) Ďalšie informácie: /produkt = “FlgE Flagelámy hook proteín (x) Publikačné informácie:

-18(A) Autori: O'Toole, Paul W., Kostrzynska, Magdaléna, Trust, Trevor J.

(B) Názov: Non-motile mutants of Helicobacter pylón and Helicobacter mustelae defective in flagellar hook production (C) Časopis: Mol. Microbiology (D) Ročník: 14 (E) Číslo: 4 (F) Strany: 691 - 703 (G) Dátum: 1994 (xi) Popis sekvencie: SEQ ID NO:1:

AACAAAGCGA TAACTCCTTT GTCTTATTAG CGACACAATT TAACCCATTG ACTTTAAATC GCGCTTCAGC cgaagagatt caagatcatg aatgcgcgat tttgcactaa AGCGAGTTÄG attcttaäat ttgagcgata acctttaaaa AGCGTAATTA AGGGGTGGTG ttacaaaacc

19CCCTATCCCC TTATGAATTT

CÄATCATTCT AAAAAGCTAT

CTTTAAATTA AAGGATAACC

GACCGATCTT TTTGATTAAC AAAACTTTAA AATCCGCAAT

TTAGGAACAA CTTTTGCTTT ATTTTGCATA GATTGAATTT

ATG CTT AGG TCT TTA TGG TCT GGT GTC AAT Met Leu Arg Ser Leu Tro Ser Gly Val Asn

10

GGG

ATG

CAA

GCC

CAC

CAA

ATC

GCT

TTG

GAT

ATT

GAG

AGT

AAC

AAT

ATT

Gly

Met

Gin

Ala

His 15

Gin

íle

Ala

Leu

Aso 20

íle

Glu

Ser

Asn

Asn 25

íle

GCG

AAC

GTG

AAT

ACC

ACT

GGT

TTT

AAG

TAT

TCT

AGG

GCT

TCT

TTT

GTG

Ala

Asn

Val

Asn 30

Thr

Thr

Gly

Phe

Lys 35

Tyr

Ser

Arg

Ala

Ser 40

Phe

Val

GAT

ATG

CTT

TCT

CAA

GTC

AAA

CTC

ATC

GCT

ACC

GCA

CCC

TAT

AAA

AAC

Asp

Met

Leu 45

Ser

Gin

Val

Lys

Leu 50

íle

Ala

Thr !·

Ala

Pro 55

Tyr

Lys

Asn

GGG

TTA

GCA

GGG

CAG

AAT

GAT

TTT

TCT

GTG

GGG

CTT

GGG

GTA

GC-C

GTG

Gly

Leu 60

Ala

Gly

Gin

Asn

Aso 65

Phe

Ser

Val

Gly

Leu 70

Gly

Val

Gly

Val

GAT

GCG

ACG

ACT

AAA

ATC

TTT

TCA

CAA

GGC

AAT

ATC

CAA

AAC

ACA

GAT

Aso 75

Ala

Thr

Thr

Lys

íle 30

Phe

Ser

Gin

Gly

Asn 85

íle

Gin

Asn

Thr

Aso 90

GTC

AAA

ACC

GAT

CTA

GCG

ATT

CAA

GGC

GAT

GGC

TTT

TTT

ATC

ATT

AAC

Val

Lys

Thr

Asp

Leu 95

Ala

íle

Gin

Gly Aso 10Ô

Gly

Phe

Phe

íle

íle 105

Asn

CCT

GAT

AGG

GGG

ATC

ACG

CGC

AAT

TTC

ACT

AGA

GAT

GGG

GAG

TTC

CTT

Pro

Asp

Arg Gly 110

íle

Thr

Arg

Asn

Phe 115

Thr

Arg

Asp

Gly

Glu 120

Phe

Leu

fflipip

GAC

TCG

CAA

GGG

AGT

TTG

GTT

ACC

ACC

GGC

GGG

CTT

GTG

GTG

CAA

Phe

Asp

Ser 125

Gin

Gly

Ser

Leu

Val 130

Thr

Thr

Gly

Gly

Leu 135

Val

Val

Gin

GGG

TGG

GTG

AGA

AAT

GGG

AGC

GAT

ACC

GGC

AAT

AAA

GGG

AGC

GAT

ACA

Gly

Trp 140

Val

Arg

Asn

Gly

Ser 145

Asp

Thr

Gly

Asn

Lys 150

Gly

Ser

Asp

Thr

GAC

GCT

TTA

AAA

GTG

GAT

AAC

ACC

GGT

CCT

TTA

GAA

AAC

ATT

AGG

ATT

Asp 155

Ala

Leu

Lys

Val

Asp 160

Asn

Thr

Gly

Pro

Leu 165

Glu

Asn

íle

Arg

íle 170

GAT

CCT

GGA

ATG

GTG

ATG

CCA

GCC

AGA

GCG

AGT

AAC

CGC

ATT

TCT

ATG

Asp

Pro

Gly

Met

Val 175

Met

Pro

Ala

Arg

Ala 180

Ser

Asn

Arg

íle

Ser 185

Met

AGG

GCG

AAT

TTA

AAC

GCT

GGA

AGG

CAT

GCC

GAT

CAA

ACA

GCG

GCG

ATA

Arg

Ala

Asn

Leu 190

Asn

Ala

Gly

Arg

His 195

Ala

Asp

Gin

Thr

Ala 200

Ala

íle

TTC

GCT

TTG

GAT

TCT

TCA

GCC

AAA

ACC

CCT

TCA

GAT

GGC

ATT

AAT

CCG

Phe

Ala

Leu 205

Asp

Ser

Ser

Ala

Lys 210

Thr

Pro

Ser

Asp

Gly 215

Zle

Asn

Pro

GTG

TAT

GAT

TCA

GGC

ACG

AAT

CTT

GCT

CAA

GTC

GCC

GAA

GAC

ATG

GGA

Val

Tyr

Asp

Ser

Gly

Thr

Asn

Leu

Ala

Gin

Val

Ala

Glu

Asp

Met

Gly

220 225 230 'CT TTA TAC AAT GAA GAT GGC GAC GCT CTT TTG TTG AAT GAA AAT CAA

Ser

Leu

Tyr

Asn

Glu

Asp

Gly

Asp

Ala

. Leu

Leu

Leu

, Asn

. Glu

. Asn

i Gin

235

240

245

250.

GGG

ATT

TGG

GTG

AGC

TAT

AAG

AGT

CCA

AAA

ATG

GTC

: AAA

GAC

ATC

CTC

Gly

íle

Trp

Val

Ser

Tyr

Lys

Ser

Pro

Lys

Met

Val

Lys

Asp

íle

Leu

255

260

265

CCT

TCT

GCA

GAA

AAC

AGC

ACG

CTT

GAA

TTG

AAT

GGC

GTT

AAG

ATT

TCT

Pro

Ser

Ala

Glu

Asn

Ser

Thr

Leu

Glu

Leu

Asn

Gly

Val

Lys

íle

Ser

270

275

280

TTC

ACA

AAC

GAT

TCA

GCG

GTG

AGC

CGG

ACT

TCA

AGC

TTA

GTG

GCG

GCT

Phe

Thr

Asn

Asp

Ser

Ala

Val

Ser

Arg

Thr

Ser

Ser

Leu

Val

Ala

Ala

285

290

295

AAA

AAT

GCG

ATC

AAT

GCA

.GTC

.AAA

AGC

CAA

ACA

GGC

ATT

GAA

GCT

TAT

Lys

' Asn

Ala

íle

Asn

Ala

Val

Lys

Ser

Gin

Thr

Gly

íle

Glu

Ala

Tyr

300

305

310

TTA

GAC

GGC

AAG

CAA

TTG

CGT

TTG

GAA

AAC

ACC

AAT

GAA

TTA

GAC

GGC

Leu

Asp

Gly

Lys

Gin

Leu

Arg

Leu

Glu

Asn

Thr

Asn

Glu

Leu

Asp

Gly

315

320

325

330

GAT

GAA

AAG

CTT

AAA

AAC

ATT

GTA

GTT

ACT

CAA

GCC

GGA

ACC

GGA

GCG

Asp

Glu

Lys

Leu

Lys

Asn

íle

Val

Val

Thr

Gin

Ala

Gly

Thr

Gly

Ala

335

340

345

TTC

GCT

AAC

TTT

TTA

GAC

GC-C

GAT

AAA

GAT

GTA

ACG

GCT

TTC

AAA

TAC

Phe

Ala

Asn

Phe

Leu

Asp

Gly Asp

Lys

Aso

Val

Thr

Ala

Phe

Lys

Tyr

350

355

360

AGC

TAC

ACG

CAT

TCT

ATT

AGC

CCT

AAC

GCC

AAT

AGC

GGG

CAG

TTT

AGG

Ser

Tyr

Thr

His

Ser

íle

Ser

Pro

Asn

Ala

Asn

Ser

Gly

Gin

Phe

Arg

365

370

375

ACC

ACT

GAA

GAC

TTG

CGC

GCC

TTA

ATC

CAG

CAT

GAC

GCT

AAT

ATC

GTT

Thr

Thr

Glu

Asp

Leu

Arg

Ala

Leu

íle

Gin

His

Asp

Ala

Asn

íle

Val

380

385

390

AAA

GAT

CCT

AGC

CTA

GCG

GAC

AAT

TAC

CAA

GAC

TCA

GCC

GCT

TCT

ATA

Lys

Asp

Pro

Ser

Leu

Ala

Asp

Asn

Tyr

Gin

Asd

Ser

Ala

Ala

Ser

íle

395

400

405

410

GGA

GTT

ACA

ATC

AAC

CAA

TAC

GGC

ATG

TTT

GAA

ATC

AAC

AAT

AAA

GAC

Gly

Val

Thr

íle

Asn

Gin

Tyr

Gly

Met

Phe

Glu

íle

Asn

Asn

Lys

Asp

415

420

425

AAT

AAA

AAT

GTC

ATT

AAA

GAA

AAT

CTT

AAT

ATC

TTT

GTG

AGC

GGG

TAT

Asn

Lys

Asn

Val

íle

Lys

Glu

Asn

Leu

Asn

íle

Phe

Val

Ser

Gly

Tyzr

430

435

440

TCT

TCA

GAC

AGC

GTA

ACG

AAC

AAT

GTT

TTG

TTT

AAA

AAT

GCG

ATG

AAA

Ser

Ser

Aso

Ser

Val

Thr

Asn

A.sn

Val

Leu

Phe

Lys

Asn

Ala

Met

Lys

445

450

455

GGG

CTT

AAT

ACC

GCT

ψΓ·ΠΊ

TTA

ATT

GAA

GGG

GGA

ľG

TCA

G77

AGC

AGT

Gly

Leu

Asn

Tr.r

Ala

Se.-

Leu

íle

Glu

Giy

Gly

. a

Ser

A_s.

Ser

Ser

460

465

470

AAA

TTC

ACC

CAC

GCT

ACG

CAT

GCG

ACA

AGC

ATT

GAT

GTG

ATA

GAC

Ser

Lys

Phe

Thr

His

Ala

Thr

His

Ala

Thr

Ser

Íle

Asp

Val

íle

Asp

475

480

485

490

AGC

TTA

GGC

ACT

AAA

CAC

GCC

ATG

CGC

ATT

GAG

TTT

TAT

AGG

AGT

GGG

Ser

Leu

Gly

Thr

Lys

His

Ala

Met

Arg

Zle

Glu

Phe

Tyr

Arg

Ser

Gly

495 500 505

-21GGA GCG GAT TGG AAT TTT AGA GTG ATC GTG CCT GAG CCT GGG GAA TTA Gly Ala Asp Trp Asn Phe Arg Val íle Val Pro Glu Pro Gly Glu Leu

510 515 520

GTA GGG GGG TCA GCG GCT AGG CCT AAT GTG TTT GAA GGA GGC CGT TTG Val Gly Gly Ser Ala Ala Arg Pro Asn Val Phe Glu Gly Gly Arg Leu

525 530 535

CAC TTC AAT AAT GAC GGA TCG CTT GCA GGC ATG AAC CCG CCT CTT TTG

His

Phe Asn Asn Asp Gly Ser Leu

Ala

Gly

Met

Asn 550

Pro Pro Leu

Leu

540

545

CAA

TTT

GAC

CCT

AAA

AAT

GGT

GCT

GAT

GCC

CCC

CAA

CGC

ATC

AAT

TTA

Gin

Phe

Asp

Pro

Lys

Asn

Gly

Ala

Asp

Ala

Pro

Gin

Arg

íle

Asn

Leu

555

560

565

570

GCT

TTT

GGT

TCC

TCA

GGG

AGT

TTT

GAC

GGG

CTA

ACG

AGC

GTG

GAT

AAG

Ala

Phe

Gly

Ser

Ser

Gly

Ser

Phe

Asp

Gly

Leu

Thr

Ser

Val

Aso

Lys

575

580

585

ATT

TCT

GAA

ACT

TAT

GCG

ATT

GAG

CAA

AAC

GGC

TAT

CAA

GCG

GGC

GAT

íle

Ser

Glu

Thr

Tyr

Ala

íle

Glu

Gin

Asn

Gly

Tyr

Gin

Ala

Gly

Asp

590

595

600

TTG

ATG

GAT

GTC

CGC

TTT

GAT

TCA

GAT

GGG

GTG

CTT

TTA

GGA

GCG

TTC

Leu

Met

Aso

Val

Arg

Phe

Asp

Ser

Asp

Gly

Val

Leu

Leu

Gly

Ala

Phe

605

610

615

AGT

AAT

GGC

AGG

ACT

TTA

GCG

CTC

GCT

CAA

GTG

GCT

TTA

GCG

AAT

TTC

Ser

Asn

Gly

Arg

Thr

Leu

Ala

Leu

Ala

Gin

Val

Ala

Leu

Ala

Asn

Phe

620

625

630

GCT

AAC

GAT

GCG

GGC

TTG

CAG

GCT

TTA

GGC

GGG

AAT

GTC

TTT

TCT

CAA

Ala

Asn

Asp

Ala

Gly

Leu

Gin

Ala

Leu

Gly Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Gin

635

640

645

650

ACC

GGA

AAC

TCA

GGG

CAA

GCC

TTA

ATC

GGT

GCG

GCT

AAT

ACG

GGG

CGT

Thr

Gly

Asn

Ser

Gly

Gin

Ala

Leu

íle

Gly

Ala

Ala

Asn

Thr

Gly

Arg

655

660

665

AGG

GGT

TCA

ATT

TCA

GGA

TCT

AAA

CTG

GAG

TCT

AGT

AAT

GTG

GAT

TTG

Arg

Gly

Ser

íle

Ser

Gly

Ser

Lys

Leu

Glu

Ser

Ser

Asn

Val

Asp

Leu

670

675

680

AGC

CGG

AGT

TTA

ACG

AAT

TTG

ATT

GTG

GTT

CAA

AGG

GGC

TTT

CAA

GCA

Ser

Arg

Ser

Leu

Thr

Asn

Leu

íle

Val

Val

Gin

Arg

Gly

Phe

Gin

Ala

685

690

695

AAC

TCT

AAA

GCG

GTA

ACC

ACA

TCC

GAT

CAA

ATC

CTT

AAT

ACC

CTA

TTG

Asn

Ser

Lys

Ala

Val

Thr

Thr

Ser

Asp

Gin

íle

Leu

Asn

Thr

Leu

Leu

700

705

710

AAT CTT AAG CAA TAA ACTAAAGGAT TACTCTAATA CAATATAATA GGGGCTAATT Asn Leu Lys Gin *

715

TAAAGATTAA GGTTTAGTAT GCATGAATAC TCG

-22(2) Informácie pre SEQ ID NO: 2:

(i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 719 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (C) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: proteín (xi) Popis sekvencie: SEQ ID NO:2:

Met

Leu

Arg

Ser

Leu

Trp

Ser

Gly

Val

Asn

Gly

Met

Gin

Ala

His

Gin

1

5

10

15

íle

Ala

Leu

Aso

íle

Glu

Ser

Asn

Asn

íle

Ala

Asn

Val

Asn

Thr

Thr

20

25

30

Gly

Phe

Lys

Tyr

Ser

Arg

Ala

Ser

Phe

Val

Asp

Met

Leu

Ser

Gin

Val

35

40

45

Lys

Leu

íle

Ala

Thr

Ala

Pro

Tyr

Lys

Asn

Gly

Leu

Ala

Gly

Gin

Asn

50

55

60

Aso

Phe

Ser

Val

Gly

Leu

Gly

Val

Gly

Val

Aso

Ala

Thr

Thr

Lys

íle

65

70

75

80

Phe

Ser

Gin

Gly

Asn

íle

Gin

Asn

Thr

Asp

Val

Lys

Thr

Asp

Leu

Ala

85

90

95

íle

Gin

Gly

Aso

Gly

Phe

Phe

íle

íle

Asn

?ro

Asp

Arg

Gly

íle

Thr

10Ô

105

110

Arg

Asn

Phe

Thr

Arg

Asp

Gly

Glu

Phe

Leu

Phe

Asp

Ser

Gin

Gly

Ser

115

120

125

Leu

Val

Thr

Thr

Gly

Gly

Leu

Val

Val

Gin

Gly

Trp

Val

Arg

Asn

Gly

130

135

140

Ser

Asp

Thr

Gly

Asn

Lys

Gly

Ser

Asp

Thr

Aso

Ala

Leu

Lys

Val

Asp

145

150

155

160

Asn

Thr

Gly

Pro

Leu

Glu

Asn

íle

Arg

íle

Asp

Pro

Gly

Met

Val

Met

165

170

175

Pro

Ala

Arg

Ala

Ser

Asn

Arg

íle

Ser

Met

Arg

Ala

Asn

Leu

Asn

Ala

180

185

190

Gly

Arg

His

Ala

Asp

Gin

Thr

Ala

Ala

íle

Phe

Ala

Leu

Asp

Ser

Ser

195

200

205

Ala

Lys

Thr

Pro

Ser

Asp

Gly

íle

Asn

Pro

Val

Tyr

Asp

Ser

Gly

Thr

210

215

220

Asn

Leu

Ala

Gin

Val

Ala

Glu

Asp

Met

Gly

Ser

Leu

Tyr

Asn

Glu

Asp

225

230

235

240

Gly

Asp

Ala

Leu

Leu

Leu

Asn

Glu

Asn

Gin

Gly

íle

Trp

Val

Ser

Tyr

245

250

255

Lys

Ser

Pro

Lys

Met

Val

Lys

Asp

íle

Leu

Pro

Ser

Ala

Glu

Asn

Ser

260

265

270

Thr

Leu

Glu

Leu

Asn

Gly

Val

Lys

íle

Ser

Phe

Thr

A.-

•-sp

S-::

Ala

275

280

2Sl

Val

Ser

Arg

Thr

Ser

Ser

Leu

Val

Ala

Ala

Lys

Asn

Ala

íle

Asn

Ala

290

295

300

Val

Lys

Ser

Gin

Thr

Gly

íle

Glu

Ala

Tyr

Leu

Asp

Gly

Lys

Gin

Leu

305

310

315

320

Arg

Leu

Glu

Asn

Thr

Asn

Glu

Leu

Asp

Gly

Asp

Glu

Lys

Leu

Lys

A.sn

325 330 335

íle

Val

Val

Thr

Gin

Ala

Gly

Thr

Gly

Ala

Phe

Ala

Asn

Phe

Leu

Asp

340

345

350

Gly

Asp

Lys

Asp

Val

Thr

Ala

Phe

Lys

Tyr

Ser

Tyr

Thr

His

Ser

íle

355

360

3 65

Ser

Pro

Asn

Ala

Asn

Ser

Gly

Gin

Phe

Arg

Thr

Thr

Glu

Asp

Leu

Arg

370

375

380

Ala

Leu

íle

Gin

His

Asp

Ala

Asn

íle

Val

Lys

ÄSD

Pro

Ser

Leu

Ala

385

390

395

400

Asp

Asn

Tyr

Gin

Aso

Ser

Ala

Ala

Ser

íle

Gly

Val

Thr

íle

Asn

Gin

405

410

415

Tyr

Gly

Met

Phe

Glu

íle

Asn

Asn

Lys

Asp

Asn

Lys

Asn

Val

íle

Lys

420

425

430

Glu

Asn

Leu

Asn

.Zle

Phe

Val

Ser

Gly

Tyr

Ser

Ser

Aso

Ser

Val

Thr

435

440

445

Asn

Asn

Val

Leu

Phe

Lys

Asn

Ala

Met

Lys

Gly

Leu

Asn

Thr

Ala

Ser

450

455

460

Leu

íle

Glu

Gly

Gly

Ala

Ser

Ala

Ser

Ser

Ser

Lys

Phe

Thr

His

Ala

465

470

475

480

Thr

His

Ala

Th.2ľ

Ser

Zle

Asp

Val

íle

Aso

Ser

Leu

Gly

Thr

Lvs

His

485

490

495

Ala

Met

Arg

Zle

Glu

Phe

Tyr

Arg

Ser

Gly

Gly

Ala

Asp

Trp

A.sn

Phe

500

505

510

Arg

Val

íle

Val

Pro

Glu

Pro

Gly

Glu

Leu

Val

Gly

Gly

Ser

Ala

Ala

515

520

525

Arg

Pro

Asn

Val

Phe

Glu

Gly

Gly

Arg

Leu

His

Phe

Asn

Asn

Asp

Gly

530

535

540

Ser

Leu

Ala.

Gly

Het

Asn

Pro

Pro

Leu

Leu

Gin

Phe

Asp

Pro

Lys

Asn

545

550

555

560

Gly

Ala

Asp

Ala

Pro

Gin

Arg

íle

Asn

Leu

Ala

Phe

Gly

Ser

Ser

Gly

565

570

575

Ser

Phe

Asp

Gly

Leu

Thr

Ser

Val

Asp

Lys

íle

Ser

Glu

Thr

Tyr

Ala

580

585

590

íle

Glu

Gin

Asn

Gly

Tyr

Gin

Ala

Gly

Asp

Leu

Met

Aso

Val

Arg

Phe

595

600

605

Asp

Ser

Asp

Gly

Val

Leu

Leu

Gly

Ala

Phe

Ser

Asn

Gly

Arg

Tn«

Leu

610

615

620

Ala

Leu

Ala

Gin

Val

Ala

Leu

Ala

Asn

Phe

Ala

Asn

Asp

Ala

Gly

Leu

625

630

635

640

Gin

Ala

Leu

Gly

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Gin

Thr

Gly

Asn

Ser

Gly

Gin

645

650

655

Ala

Leu

íle

Gly

Ala

Ala

Asn

Thr

Gly

Arg

Arg

Gly

Ser

íle

Ser

Gly

660

665

670

Ser Lys Leu Glu Ser Ser Asn Val Asp Leu Ser Arg Ser Leu Thr Asn

-25675 680 685

Leu íle Val Val Gin Arg Gly ?he Gin Ala Asn Ser Lys Ala Val Th’· 690 695 700

Thr Ser Asp Gin íle Leu Asn Thr Leu Leu Asn Leu Lys Gin *

705 710 715 (2) Informácie pre SEQ ID NO: 3:

(i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 25 základných párov (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazec: jednoduchý (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: Ďalšie nukleové kyseliny (A) Popis: /dese = PRC primér” (xi) Popis sekvencie: SEQ ID NO:3:

TATACCATGG TGCTTAGGTC TTTAT (2) Informácie pre SEQ ID NO: 4:

(i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 25 základných párov (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazec: jednoduchý (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: Ďalšie nukleové kyseliny (A) Popis: /dese = “PCR primér” (xi) Popis sekvencie: SEQ ID NO:4:

GCGAATTCAA TTGCTTAAGA TTCAA

Claims (28)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Kompozícia očkovacej látky, vyznačujúca sa tým, že obsahuje FlgE polypeptid Helicobacter pylori alebo jeho modifikovanú formu, ktorá si zachováva funkčnú ekvivalentnú antigenicitu, na vyvolanie ochrannej imunitnej odozvy voči infekcii Helicobacter pylori u cicavca.
2. 2. Kompozícia očkovacej látky podľa nároku 1, vyznačujúca sa tým, že FlgE polypeptid obsahuje v podstate aminokyselinovú sekvenciu znázornenú v SEQ ID NO:2 v zozname sekvencií.
3. 3. Kompozícia očkovacej látky podľa nároku 2, vyznačujúca sa tým, že polypeptid obsahuje aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je najmenej z 90 % homologická ku SEQ ID NO:2.
4. 4. Kompozícia očkovacej látky podľa nároku 2, vyznačujúca sa tým, že polypeptid obsahuje aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je najmenej z 95 % homologická ku SEQ ID NO:2.
5. 5. Kompozícia očkovacej látky podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúca sa tým, že obsahuje farmaceutický prijateľný nosič alebo riedidlo.
6. 6. Kompozícia očkovacej látky podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúca sa tým, že obsahuje pomocnú látku.
7. 7. Kompozícia očkovacej látky podľa nároku 6, vyznačujúca sa tým, že pomocnou látkou je farmaceutický prijateľná forma toxínu cholery.
8. 8. Kompozícia očkovacej látky podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, ' vyznačujúca sa tým, že obsahuje látku zvolenú z lipozómov, ISCOM, kochley a polymérnych mikrosfér.
9. 9. Kompozícia očkovacej látky podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 7, vyznačujúca sa tým, že obsahuje vektor vybraný zo živých oslabených baktérií, vírusov a fágov.

   -2710. Použitie FlgE polypeptidu Helicobacter pylori, alebo jeho modifikovanej formy, ktorá si zachováva funkčnú ekvivalentnú antigenicitu, na výrobu kompozície na liečenie, profylaxiu alebo diagnostikovanie infekcie Helicobacter pylori u cicavcov.
10. 11. Použitie FlgE polypeptidu Helicobacter pylori, alebo jeho modifikovanej formy, ktorá si zachováva funkčnú ekvivalentnú antigenicitu, na výrobu kompozície očkovacej látky na použitie na vyvolanie ochrannej imunitnej odozvy proti Helicobacter pylori u cicavcov.
11. 12. Použitie podfa nároku 10 alebo 11, pričom FlgE polypeptidom je polypeptid definovaný v ktoromkoľvek z nárokov 2 až 4.
12. 13. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 10 až 12, pričom cicavcom je človek.
13. 14. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 10 až 13, pričom kompozícia obsahuje farmaceutický prijateľný nosič alebo riedidlo.
14. 15. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 10 až 14, pričom kompozícia obsahuje pomocnú látku.
15. 16. Použitie podľa nároku 15, pričom pomocnou látkou je farmaceutický prijateľná forma toxínu cholery.
16. 17. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 10 až 16, pričom kompozícia obsahuje látku zvolenú z zvolenú z lipozómov, ISCOM, kochley a polymérnych mikrosfér.
17. 18. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 10 až 16, obsahujúca vektor vybraný zo živých oslabených baktérií, vírusov a fágov.
18. 19. Spôsob diagnostikovania infekcie Helicobacter pylori u cicavcov, vyznačujúci sa tým, že , zahrňuje kroky (a) uvedenia do kontaktu FlgE polypeptidu Helicobacter pylori alebo jeho modifikovanej formy, ktorá si zachováva funkčnú ekvivalentnú antigenicitu, s telesnou kvapalinou odobranou od cicavca; a

    -28(b) detegovania protilátok z uvedenej telesnej kvapaliny naviazaním na uvedený FlgE poiypeptid.
19. 20. Spôsob podľa nároku 19, vyznačujúci sa tým, že FlgE polypeptidom je poiypeptid definovaný v ktoromkoľvek z nárokov 2 až 4.
20. 21. Spôsob podľa nároku 19 alebo 20, vyznačujúci sa tým, že FlgE poiypeptid je naviazaný k pevnému podkladu.
21. 22. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 19 až 21, vyznačujúci sa tým, že cicavcom je človek.
22. 23. Diagnostický kit na použitie v spôsobe podľa nároku 19, vyznačujúci sa tým, že kit obsahuje FlgE poiypeptid Helicobacter pylorí alebo jeho modifikovanú formu, ktorá si zachováva funkčnú ekvivalentnú antigenicitu.
23. 24. Diagnostický kit podľa nároku 23, vyznačujúci sa tým, že FlgE polypeptidom je poiypeptid definovaný v ktoromkoľvek z nárokov 2 až 4.
24. 25. Spôsob vyvolania ochrannej imunitnej odozvy proti infekcii Helicobacter pylorí u cicavcov, vyznačujúci sa tým, že uvedený spôsob zahrňuje krok podávania cicavcovi FlgE polypeptidu Helicobacter pylorí alebo jeho modifikovanej formy, ktorá si zachováva funkčnú ekvivalentnú antigenicitu.
25. 26. Spôsob podľa nároku 25, vyznačujúci sa tým, že FlgE polypeptidom je poiypeptid definovaný v ktoromkoľvek z nárokov 2 až 4.
26. 27. Spôsob podľa nároku 25 alebo 26, vyznačujúci sa tým, že cicavcom je človek.
27. 28. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 25 až 27, vyznačujúci sa tým, že spôsob je profylaktickým spôsobom.
28. 29. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 25 až 27, vyznačujúci sa tým, že spôsob je terapeutickým spôsobom.