KR20010013699A - 헬리코박터 파일로리 ＦｌｇＥ 폴리펩티드 함유 백신 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 헬리코박터 파일로리 감염에 대한 보호 면역 반응 폴리펩티드 및 백신 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 헬리코박터 파일로리 감염의 치료 또는 예방용 조성물을 제조하는데 있어서의 헬리코박터 파일로리 폴리펩티드의 용도에 관한 것이다.

Description

헬리코박터 파일로리 ＦｌｇＥ 폴리펩티드 함유 백신 조성물 {Vaccine Compositions Comprising the Helicobacter Pylori FlgE Polypeptide}

(1) GENERAL INFORMATION:

(i) APPLICANT:

(A) NAME: Astra AB

(B) STREET: Vastra Malarehamnen 9

(C) CITY: Sodertalje

(E) COUNTRY: Sweden

(F) POSTAL CODE (ZIP): S-151 85

(G) TELEPHONE: +46 8 553 260 00

(H) TELEFAX: +46 8 553 288 20

(ii) TITLE OF INVENTION: Vaccine Compositions V

(iii) NUMBER OF SEQUENCES: 4

(iv) COMPUTER READABLE FORM:

(A) MEDIUM TYPE: Floppy disk

(B) COMPUTER: IBM PC compatible

(C) OPERATING SYSTEM: PC-DOS/MS-DOS

(D) SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (EPO)

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 1:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 2550 base pairs

(B) TYPE: nucleic acid

(C) STRANDEDNESS: double

(D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: cDNA

(vi) ORIGINAL SOURCE:

(A) ORGANISM: Helicobacter pylori

(ix) FEATURE:

(A) NAME/KEY: CDS

(B) LOCATION:321..2477

(D) OTHER INFORMATION:/product= "FlgE flagellar hook

protein"

(x) PUBLICATION INFORMATION:

(A) AUTHORS: O'Toole, Paul W.

Kostrzynska, Magdalena

Trust, Trevor J.

(B) TITLE: Non-motile mutants of Helicobacter pylori and

Helicobacter mustelae defective in flagellar hook

production

(C) JOURNAL: Mol. Microbiol.

(D) VOLUME: 14

(E) ISSUE: 4

(F) PAGES: 691-703

(G) DATE: 1994

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 1:

AACAAAGCGA TAACTCCTTT GTCTTATTAG CGACACAATT TAACCCATTG ACTTTAAATC 60

GCGCTTCAGC CGAAGAGATT CAAGATCATG AATGCGCGAT TTTGCACTAA AGCGAGTTAG 120

ATTCTTAAAT TTGAGCGATA ACCTTTAAAA AGCGTAATTA AGGGGTGGTG TTACAAAACC 180

CCCTATCCCC TTATGAATTT GACCGATCTT TTTGATTAAC AAAACTTTAA AATCCGCAAT 240

CAATCATTCT AAAAAGCTAT TTAGGAACAA CTTTTGCTTT ATTTTGCATA GATTGAATTT 300

CTTTAAATTA AAGGATAACC ATG CTT AGG TCT TTA TGG TCT GGT GTC AAT 350

Met Leu Arg Ser Leu Trp Ser Gly Val Asn

1 5 10

GGG ATG CAA GCC CAC CAA ATC GCT TTG GAT ATT GAG AGT AAC AAT ATT 398

Gly Met Gln Ala His Gln Ile Ala Leu Asp Ile Glu Ser Asn Asn Ile

15 20 25

GCG AAC GTG AAT ACC ACT GGT TTT AAG TAT TCT AGG GCT TCT TTT GTG 446

Ala Asn Val Asn Thr Thr Gly Phe Lys Tyr Ser Arg Ala Ser Phe Val

30 35 40

GAT ATG CTT TCT CAA GTC AAA CTC ATC GCT ACC GCA CCC TAT AAA AAC 494

Asp Met Leu Ser Gln Val Lys Leu Ile Ala Thr Ala Pro Tyr Lys Asn

45 50 55

GGG TTA GCA GGG CAG AAT GAT TTT TCT GTG GGG CTT GGG GTA GGC GTG 542

Gly Leu Ala Gly Gln Asn Asp Phe Ser Val Gly Leu Gly Val Gly Val

60 65 70

GAT GCG ACG ACT AAA ATC TTT TCA CAA GGC AAT ATC CAA AAC ACA GAT 590

Asp Ala Thr Thr Lys Ile Phe Ser Gln Gly Asn Ile Gln Asn Thr Asp

75 80 85 90

GTC AAA ACC GAT CTA GCG ATT CAA GGC GAT GGC TTT TTT ATC ATT AAC 638

Val Lys Thr Asp Leu Ala Ile Gln Gly Asp Gly Phe Phe Ile Ile Asn

95 100 105

CCT GAT AGG GGG ATC ACG CGC AAT TTC ACT AGA GAT GGG GAG TTC CTT 686

Pro Asp Arg Gly Ile Thr Arg Asn Phe Thr Arg Asp Gly Glu Phe Leu

110 115 120

TTT GAC TCG CAA GGG AGT TTG GTT ACC ACC GGC GGG CTT GTG GTG CAA 734

Phe Asp Ser Gln Gly Ser Leu Val Thr Thr Gly Gly Leu Val Val Gln

125 130 135

GGG TGG GTG AGA AAT GGG AGC GAT ACC GGC AAT AAA GGG AGC GAT ACA 782

Gly Trp Val Arg Asn Gly Ser Asp Thr Gly Asn Lys Gly Ser Asp Thr

140 145 150

GAC GCT TTA AAA GTG GAT AAC ACC GGT CCT TTA GAA AAC ATT AGG ATT 830

Asp Ala Leu Lys Val Asp Asn Thr Gly Pro Leu Glu Asn Ile Arg Ile

155 160 165 170

GAT CCT GGA ATG GTG ATG CCA GCC AGA GCG AGT AAC CGC ATT TCT ATG 878

Asp Pro Gly Met Val Met Pro Ala Arg Ala Ser Asn Arg Ile Ser Met

175 180 185

AGG GCG AAT TTA AAC GCT GGA AGG CAT GCC GAT CAA ACA GCG GCG ATA 926

Arg Ala Asn Leu Asn Ala Gly Arg His Ala Asp Gln Thr Ala Ala Ile

190 195 200

TTC GCT TTG GAT TCT TCA GCC AAA ACC CCT TCA GAT GGC ATT AAT CCG 974

Phe Ala Leu Asp Ser Ser Ala Lys Thr Pro Ser Asp Gly Ile Asn Pro

205 210 215

GTG TAT GAT TCA GGC ACG AAT CTT GCT CAA GTC GCC GAA GAC ATG GGA 1022

Val Tyr Asp Ser Gly Thr Asn Leu Ala Gln Val Ala Glu Asp Met Gly

220 225 230

TCT TTA TAC AAT GAA GAT GGC GAC GCT CTT TTG TTG AAT GAA AAT CAA 1070

Ser Leu Tyr Asn Glu Asp Gly Asp Ala Leu Leu Leu Asn Glu Asn Gln

235 240 245 250

GGG ATT TGG GTG AGC TAT AAG AGT CCA AAA ATG GTC AAA GAC ATC CTC 1118

Gly Ile Trp Val Ser Tyr Lys Ser Pro Lys Met Val Lys Asp Ile Leu

255 260 265

CCT TCT GCA GAA AAC AGC ACG CTT GAA TTG AAT GGC GTT AAG ATT TCT 1166

Pro Ser Ala Glu Asn Ser Thr Leu Glu Leu Asn Gly Val Lys Ile Ser

270 275 280

TTC ACA AAC GAT TCA GCG GTG AGC CGG ACT TCA AGC TTA GTG GCG GCT 1214

Phe Thr Asn Asp Ser Ala Val Ser Arg Thr Ser Ser Leu Val Ala Ala

285 290 295

AAA AAT GCG ATC AAT GCA GTC AAA AGC CAA ACA GGC ATT GAA GCT TAT 1262

Lys Asn Ala Ile Asn Ala Val Lys Ser Gln Thr Gly Ile Glu Ala Tyr

300 305 310

TTA GAC GGC AAG CAA TTG CGT TTG GAA AAC ACC AAT GAA TTA GAC GGC 1310

Leu Asp Gly Lys Gln Leu Arg Leu Glu Asn Thr Asn Glu Leu Asp Gly

315 320 325 330

GAT GAA AAG CTT AAA AAC ATT GTA GTT ACT CAA GCC GGA ACC GGA GCG 1358

Asp Glu Lys Leu Lys Asn Ile Val Val Thr Gln Ala Gly Thr Gly Ala

335 340 345

TTC GCT AAC TTT TTA GAC GGC GAT AAA GAT GTA ACG GCT TTC AAA TAC 1406

Phe Ala Asn Phe Leu Asp Gly Asp Lys Asp Val Thr Ala Phe Lys Tyr

350 355 360

AGC TAC ACG CAT TCT ATT AGC CCT AAC GCC AAT AGC GGG CAG TTT AGG 1454

Ser Tyr Thr His Ser Ile Ser Pro Asn Ala Asn Ser Gly Gln Phe Arg

365 370 375

ACC ACT GAA GAC TTG CGC GCC TTA ATC CAG CAT GAC GCT AAT ATC GTT 1502

Thr Thr Glu Asp Leu Arg Ala Leu Ile Gln His Asp Ala Asn Ile Val

380 385 390

AAA GAT CCT AGC CTA GCG GAC AAT TAC CAA GAC TCA GCC GCT TCT ATA 1550

Lys Asp Pro Ser Leu Ala Asp Asn Tyr Gln Asp Ser Ala Ala Ser Ile

395 400 405 410

GGA GTT ACA ATC AAC CAA TAC GGC ATG TTT GAA ATC AAC AAT AAA GAC 1598

Gly Val Thr Ile Asn Gln Tyr Gly Met Phe Glu Ile Asn Asn Lys Asp

415 420 425

AAT AAA AAT GTC ATT AAA GAA AAT CTT AAT ATC TTT GTG AGC GGG TAT 1646

Asn Lys Asn Val Ile Lys Glu Asn Leu Asn Ile Phe Val Ser Gly Tyr

430 435 440

TCT TCA GAC AGC GTA ACG AAC AAT GTT TTG TTT AAA AAT GCG ATG AAA 1694

Ser Ser Asp Ser Val Thr Asn Asn Val Leu Phe Lys Asn Ala Met Lys

445 450 455

GGG CTT AAT ACC GCT TCT TTA ATT GAA GGG GGA GCG TCA GCG AGC AGT 1742

Gly Leu Asn Thr Ala Ser Leu Ile Glu Gly Gly Ala Ser Ala Ser Ser

460 465 470

TCT AAA TTC ACC CAC GCT ACG CAT GCG ACA AGC ATT GAT GTG ATA GAC 1790

Ser Lys Phe Thr His Ala Thr His Ala Thr Ser Ile Asp Val Ile Asp

475 480 485 490

AGC TTA GGC ACT AAA CAC GCC ATG CGC ATT GAG TTT TAT AGG AGT GGG 1838

Ser Leu Gly Thr Lys His Ala Met Arg Ile Glu Phe Tyr Arg Ser Gly

495 500 505

GGA GCG GAT TGG AAT TTT AGA GTG ATC GTG CCT GAG CCT GGG GAA TTA 1886

Gly Ala Asp Trp Asn Phe Arg Val Ile Val Pro Glu Pro Gly Glu Leu

510 515 520

GTA GGG GGG TCA GCG GCT AGG CCT AAT GTG TTT GAA GGA GGC CGT TTG 1934

Val Gly Gly Ser Ala Ala Arg Pro Asn Val Phe Glu Gly Gly Arg Leu

525 530 535

CAC TTC AAT AAT GAC GGA TCG CTT GCA GGC ATG AAC CCG CCT CTT TTG 1982

His Phe Asn Asn Asp Gly Ser Leu Ala Gly Met Asn Pro Pro Leu Leu

540 545 550

CAA TTT GAC CCT AAA AAT GGT GCT GAT GCC CCC CAA CGC ATC AAT TTA 2030

Gln Phe Asp Pro Lys Asn Gly Ala Asp Ala Pro Gln Arg Ile Asn Leu

555 560 565 570

GCT TTT GGT TCC TCA GGG AGT TTT GAC GGG CTA ACG AGC GTG GAT AAG 2078

Ala Phe Gly Ser Ser Gly Ser Phe Asp Gly Leu Thr Ser Val Asp Lys

575 580 585

ATT TCT GAA ACT TAT GCG ATT GAG CAA AAC GGC TAT CAA GCG GGC GAT 2126

Ile Ser Glu Thr Tyr Ala Ile Glu Gln Asn Gly Tyr Gln Ala Gly Asp

590 595 600

TTG ATG GAT GTC CGC TTT GAT TCA GAT GGG GTG CTT TTA GGA GCG TTC 2174

Leu Met Asp Val Arg Phe Asp Ser Asp Gly Val Leu Leu Gly Ala Phe

605 610 615

AGT AAT GGC AGG ACT TTA GCG CTC GCT CAA GTG GCT TTA GCG AAT TTC 2222

Ser Asn Gly Arg Thr Leu Ala Leu Ala Gln Val Ala Leu Ala Asn Phe

620 625 630

GCT AAC GAT GCG GGC TTG CAG GCT TTA GGC GGG AAT GTC TTT TCT CAA 2270

Ala Asn Asp Ala Gly Leu Gln Ala Leu Gly Gly Asn Val Phe Ser Gln

635 640 645 650

ACC GGA AAC TCA GGG CAA GCC TTA ATC GGT GCG GCT AAT ACG GGG CGT 2318

Thr Gly Asn Ser Gly Gln Ala Leu Ile Gly Ala Ala Asn Thr Gly Arg

655 660 665

AGG GGT TCA ATT TCA GGA TCT AAA CTG GAG TCT AGT AAT GTG GAT TTG 2366

Arg Gly Ser Ile Ser Gly Ser Lys Leu Glu Ser Ser Asn Val Asp Leu

670 675 680

AGC CGG AGT TTA ACG AAT TTG ATT GTG GTT CAA AGG GGC TTT CAA GCA 2414

Ser Arg Ser Leu Thr Asn Leu Ile Val Val Gln Arg Gly Phe Gln Ala

685 690 695

AAC TCT AAA GCG GTA ACC ACA TCC GAT CAA ATC CTT AAT ACC CTA TTG 2462

Asn Ser Lys Ala Val Thr Thr Ser Asp Gln Ile Leu Asn Thr Leu Leu

700 705 710

AAT CTT AAG CAA TAA ACTAAAGGAT TACTCTAATA CAATATAATA GGGGCTAATT 2517

Asn Leu Lys Gln *

715

TAAAGATTAA GGTTTAGTAT GCATGAATAC TCG 2550

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 2:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 719 amino acids

(B) TYPE: amino acid

(D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: protein

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 2:

Met Leu Arg Ser Leu Trp Ser Gly Val Asn Gly Met Gln Ala His Gln

1 5 10 15

Ile Ala Leu Asp Ile Glu Ser Asn Asn Ile Ala Asn Val Asn Thr Thr

20 25 30

Gly Phe Lys Tyr Ser Arg Ala Ser Phe Val Asp Met Leu Ser Gln Val

35 40 45

Lys Leu Ile Ala Thr Ala Pro Tyr Lys Asn Gly Leu Ala Gly Gln Asn

50 55 60

Asp Phe Ser Val Gly Leu Gly Val Gly Val Asp Ala Thr Thr Lys Ile

65 70 75 80

Phe Ser Gln Gly Asn Ile Gln Asn Thr Asp Val Lys Thr Asp Leu Ala

85 90 95

Ile Gln Gly Asp Gly Phe Phe Ile Ile Asn Pro Asp Arg Gly Ile Thr

100 105 110

Arg Asn Phe Thr Arg Asp Gly Glu Phe Leu Phe Asp Ser Gln Gly Ser

115 120 125

Leu Val Thr Thr Gly Gly Leu Val Val Gln Gly Trp Val Arg Asn Gly

130 135 140

Ser Asp Thr Gly Asn Lys Gly Ser Asp Thr Asp Ala Leu Lys Val Asp

145 150 155 160

Asn Thr Gly Pro Leu Glu Asn Ile Arg Ile Asp Pro Gly Met Val Met

165 170 175

Pro Ala Arg Ala Ser Asn Arg Ile Ser Met Arg Ala Asn Leu Asn Ala

180 185 190

Gly Arg His Ala Asp Gln Thr Ala Ala Ile Phe Ala Leu Asp Ser Ser

195 200 205

Ala Lys Thr Pro Ser Asp Gly Ile Asn Pro Val Tyr Asp Ser Gly Thr

210 215 220

Asn Leu Ala Gln Val Ala Glu Asp Met Gly Ser Leu Tyr Asn Glu Asp

225 230 235 240

Gly Asp Ala Leu Leu Leu Asn Glu Asn Gln Gly Ile Trp Val Ser Tyr

245 250 255

Lys Ser Pro Lys Met Val Lys Asp Ile Leu Pro Ser Ala Glu Asn Ser

260 265 270

Thr Leu Glu Leu Asn Gly Val Lys Ile Ser Phe Thr Asn Asp Ser Ala

275 280 285

Val Ser Arg Thr Ser Ser Leu Val Ala Ala Lys Asn Ala Ile Asn Ala

290 295 300

Val Lys Ser Gln Thr Gly Ile Glu Ala Tyr Leu Asp Gly Lys Gln Leu

305 310 315 320

Arg Leu Glu Asn Thr Asn Glu Leu Asp Gly Asp Glu Lys Leu Lys Asn

325 330 335

Ile Val Val Thr Gln Ala Gly Thr Gly Ala Phe Ala Asn Phe Leu Asp

340 345 350

Gly Asp Lys Asp Val Thr Ala Phe Lys Tyr Ser Tyr Thr His Ser Ile

355 360 365

Ser Pro Asn Ala Asn Ser Gly Gln Phe Arg Thr Thr Glu Asp Leu Arg

370 375 380

Ala Leu Ile Gln His Asp Ala Asn Ile Val Lys Asp Pro Ser Leu Ala

385 390 395 400

Asp Asn Tyr Gln Asp Ser Ala Ala Ser Ile Gly Val Thr Ile Asn Gln

405 410 415

Tyr Gly Met Phe Glu Ile Asn Asn Lys Asp Asn Lys Asn Val Ile Lys

420 425 430

Glu Asn Leu Asn Ile Phe Val Ser Gly Tyr Ser Ser Asp Ser Val Thr

435 440 445

Asn Asn Val Leu Phe Lys Asn Ala Met Lys Gly Leu Asn Thr Ala Ser

450 455 460

Leu Ile Glu Gly Gly Ala Ser Ala Ser Ser Ser Lys Phe Thr His Ala

465 470 475 480

Thr His Ala Thr Ser Ile Asp Val Ile Asp Ser Leu Gly Thr Lys His

485 490 495

Ala Met Arg Ile Glu Phe Tyr Arg Ser Gly Gly Ala Asp Trp Asn Phe

500 505 510

Arg Val Ile Val Pro Glu Pro Gly Glu Leu Val Gly Gly Ser Ala Ala

515 520 525

Arg Pro Asn Val Phe Glu Gly Gly Arg Leu His Phe Asn Asn Asp Gly

530 535 540

Ser Leu Ala Gly Met Asn Pro Pro Leu Leu Gln Phe Asp Pro Lys Asn

545 550 555 560

Gly Ala Asp Ala Pro Gln Arg Ile Asn Leu Ala Phe Gly Ser Ser Gly

565 570 575

Ser Phe Asp Gly Leu Thr Ser Val Asp Lys Ile Ser Glu Thr Tyr Ala

580 585 590

Ile Glu Gln Asn Gly Tyr Gln Ala Gly Asp Leu Met Asp Val Arg Phe

595 600 605

Asp Ser Asp Gly Val Leu Leu Gly Ala Phe Ser Asn Gly Arg Thr Leu

610 615 620

Ala Leu Ala Gln Val Ala Leu Ala Asn Phe Ala Asn Asp Ala Gly Leu

625 630 635 640

Gln Ala Leu Gly Gly Asn Val Phe Ser Gln Thr Gly Asn Ser Gly Gln

645 650 655

Ala Leu Ile Gly Ala Ala Asn Thr Gly Arg Arg Gly Ser Ile Ser Gly

660 665 670

Ser Lys Leu Glu Ser Ser Asn Val Asp Leu Ser Arg Ser Leu Thr Asn

675 680 685

Leu Ile Val Val Gln Arg Gly Phe Gln Ala Asn Ser Lys Ala Val Thr

690 695 700

Thr Ser Asp Gln Ile Leu Asn Thr Leu Leu Asn Leu Lys Gln *

705 710 715

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 3:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 25 base pairs

(B) TYPE: nucleic acid

(C) STRANDEDNESS: single

(D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: other nucleic acid

(A) DESCRIPTION: /desc = "PCR primer"

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 3:

TATACCATGG TGCTTAGGTC TTTAT 25

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 4:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 25 base pairs

(B) TYPE: nucleic acid

(C) STRANDEDNESS: single

(D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: other nucleic acid

(A) DESCRIPTION: /desc = "PCR primer"

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 4:

GCGAATTCAA TTGCTTAAGA TTCAA 25

헬리코박터 파일로리 (Helicobacter pylori)

그램 음성 세균인 헬리코박터 파일로리 (H. pylori)는 여러 위십이지장 질병에 관여하는 중요 사람 병원균이다. 이 세균이 위 상피에서 증식하면 활발한 염증 반응 및 진행성 만성 위염이 야기되며, 이는 소화성 궤양으로 진행될 위험성이 상당이 크다. 위 점막에서의 염증이 장기간 지속되는 것은 위 암의 위험성이 크게 증가하는 것과 매우 밀접하게 관련되어 있다.

헬리코박터 파일로리가 위 점막에서 증식하려면 많은 독성 인자가 사용된다. 그러한 독성 인자로는, 세균이 위 점막에 붙거나 상피 세포에 결합하는데 쓰이는 각종 부착인자 (adhesin), 산성 환경을 중화시키는 우레아제, 점막을 더 유동적으로 만드는 단백질 분해 효소 등이 있다. 또한 헬리코박터 파일로리는 운동성이 크고 점막에서 헤엄쳐서 음와(陰窩, crypt)로 내려간다. 실험 모델에서 비운동성 헬리코박터 파일로리는 점막을 감염시키지 못했는데, 이는 운동성이 필수적인 독성 인자임을 입증한다 (Eaton et al., Infection ＆ Immunity 64(7), 2445-2448, 1996). 이런 사실을 설명할 수 있는 몇가지 가능한 근거가 있다. 가장 분명한 이유로는 헤엄쳐서 점막 세포에 부착할 수 있는 능력이 없다는 점과 위 내의 유독 물질을 피할 수 있는 능력의 결여를 꼽을 수 있다.

국부 (점막) 항체 및 전신 항체 둘다를 생산하는, 헬리코박터 파일로리에 대한 강력하고 명백한 숙주의 면역 반응에도 불구하고 이 병원균은 위 점막에 계속해서 잔존하며, 보통은 숙주의 전생애 동안 남아있다. 그 이유는 아마도 자발적으로 유도된 면역 반응이 부적합하든가 또는 그 항원의 잘못된 에피토프에 대해 면역 반응이 유발되기 때문일 것이다. 또한 면역계가 (전생애 동안의 숙주/세균 관계에서 알 수 있듯이) 헬리코박터 파일로리를 공생체로 취급하여 면역 반응이 적절하게 일어나지 않을 수도 있다.

헬리코박터 파일로리 감염의 발병학 및 면역학적 이해를 위해서는 이 세균의 항원 구조를 규정하는 것이 매우 중요하다. 특히 표면 노출 단백질과 표면 결합 단백질 뿐만 아니라 분비 단백질의 특징을 규명할 필요가 있다. 분비 단백질은 여러 병원성 세균의 주요한 독성 인자를 구성하는 것으로 입증되었기 때문에 헬리코박터 파일로리의 진단과 백신 조성물의 제조에 유용할 수 있다. 만일 이런 단백질이 표면 결합 단백질과 더불어 생존 및(또는) 증식에 필수적이라면 이 단백질들은 백신 매개 면역요법의 표적으로서의 유용성이 크다.

헬리코박터 파일로리는 스트레스나 위협을 받을 때마다 간균 형태 (bacillary)에서 구상 형태 (coccoid)로 변형된다. 구상 형태의 헬리코박터 파일로리 세포는 항생제 및 여타의 항균제에 훨씬 덜 민감하다. 정황 증거로 볼 때 헬리코박터 파일로리의 개체간 전염은 구상 형태로, 아마도 물을 통해 또는 직접적인 접촉 (구강-구강, 항문-구강)을 통해서 일어날 것이다. 따라서 효과적인 백신 조성물은 헬리코박터 파일로리의 구상 형태 및 간균 형태 모두에 대해 면역 반응을 유발해야 한다. 전신 면역성은 점막 감염으로부터 보호하는데 제한된 역할만을 하는 것으로 보이므로, 백신 조성물을 써서 위 내에서 국부적으로 보호 면역 기작을 강화시키는 것도 중요하다.

편모 훅크 단백질

헬리코박터 파일로리의 편모 훅크는 78 kDa의 FlgE 서브유닛으로 구성되어 있다고 밝혀져 있다 (O'Toole et al. Molecular Microbiology, 14(4), 691-703, 1994). 편모 훅크는 막아래 편모 모터와 편모를 연결하는 역할을 한다. 막 바깥쪽으로 돌출된 후쿠 부분은 짧으며, 대략 60 nm이다 (편모 대략 10 ㎛에 대조적). 헬리코박터 파일로리의 편모처럼 훅크도 시트로 싸여있을 것이다 (Geis et al. (1993) J. Med. Microbiol. 38(5), 371-377).

FlgE 폴리펩티드의 아미노산 서열은 다른 헬리코박터 종, 예를 들면 뮤스텔래 (mustelae)에 제한된 상동성이 있는 것을 비롯해서 여타의 공지된 훅크 단백질의 아미노산 서열과 상당히 유사하다 (O'Toole et al., 앞의 책). FlgE 폴리펩티드에 대해 유발된 폴리클로날 항체는 편모 단백질 A 및 B에 대해 교차반응성을 보였는데, 이는 공통의 에피토프가 존재함을 의미하는 것이다. FlgE을 녹아웃시켜 생성된 헬리코박터 파일로리는 편모가 없는 비운동성 세균이 되며, FlgE가 여전히 생산되기는 하지만 세포질에서만 회수될 수 있었다.

본 발명은 헬리코박터 파일로리의 감염에 대한 보호 면역 반응을 유도하기 위한 폴리펩티드 및 백신 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 헬리코박터 파일로리의 감염을 치료 및 예방하는 조성물의 제조에 있어서의 헬리코박터 파일로리 폴리펩티드의 용도에 관한 것이다.

도 1은 헬리코박터 파일로리로 감염된 생쥐 (한 군당 9-10 마리)를 FlgE 폴리펩티드로 치료 면역접종한 효과를 보여준다. 그 결과는 강(腔)(antrum) (A) 및 체(體) (corpus) (B)와 전체 (A+B) (=C)에 결합된 헬리코박터 파일로리의 수의 평균 ±SEM로 주어진다. 약어 CFU는 콜로니 형성 단위 (세균의 수)이다. 빗금이 없는 막대는 DOC + CT (생쥐 한 마리당 콜레라 독소 10 ㎍과 함께 0.5 % 데옥시콜레이트가 함유된 인산 완충 염수를 투여한 경우)이며, 빗금 친 막대는 FlgE + CT (FlgE 100 ㎍ 및 콜레라 독소 10 ㎍을 생쥐에 투여한 경우)이다. CFU의 감소는 강(腔)에서는 상당했으며, 위 전체에 대해 계산한 바와 같았다.

** p＜0.01, *p＜0.05 (Wilcoxon-Mann-Whittney 기호 순위 시험)

도 2는 ELISA 기술로 생쥐의 혈청 IgG를 측정한 것이며, 감염 및 FlgE를 이용한 면역접종에 대한 반응을 보여준다. 이 값은 평균 적정 농도 ±SEM (n = 9-10 마리/군)으로 표현된다. ELISA에서 헬리코박터 파일로리 균주 244로 코팅하면, DOC + CT (=A. 대조구/244)로 처리한 동물의 혈청에서 감염의 징후로서, 헬리코박터 파일로리 특이적 항체가 발견될 수 있다. FlgE + 콜레라 독소 (=B. FlgE/244)로 면역접종하면, 이 반응성은 4배 증가했다 (** p ＜ 0.01, Wilcoxon-Mann-Whittney 기호 순위 시험). C = FlgE 특이적, FlgE + CT를 투여한 동물에게서는 특이적 FlgE IgG가 증가했지만 대조구 동물에서는 검출되지 않았다.

본 발명의 목적은 헬리코박터 파일로리 감염의 진단 및 이 감염을 억제하는 보호 면역 반응의 유발에 유용한 항원성 헬리코박터 파일로리 폴리펩티드를 제공하는 것이다. 이런 본 발명의 목적은 잘 보존된 필수 폴리펩티드를 코딩하는 헬리코박터 파일로리 유전자를 재조합 복제하여 달성되었다. 이 유전자의 핵산은 문헌 (O'Toole et al., Molecular Microbiology, 14(4), 691-703, 1994)에 공개된 flgE 유전자의 서열과 유사하다. 운동에 필수적인 단백질이기 때문에 flgE 유전자는 모든 헬리코박터 파일로리 균주에서 발현된다.

헬리코박터 파일로리 FlgE 폴리펩티드는 이 후크 단백질의 작은 부분만이 세균의 외부에 존재하는데다 시트로 둘러싸여 있을 것으로 추정되는데도 불구하고, 이 폴리펩티드를 헬리코박터 파일로리에 의해 감염된 생쥐 모델에 보조제인 콜레라 독소와 함께 투여하면 치료용 항원으로서 기능할 수 있다는 것이 의외로 발견되었다. 아래의 실험 데이타에 따르면, 헬리코박터 파일로리 FlgE 폴리펩티드가 경구용 면역원으로 투여되면 면역 반응의 자극인자로 작용하여, 이 면역접종 한 달전에 헬리코박터 파일로리로 감염시킨 생쥐에게서 헬리코박터 파일로리의 증식을 상당히 감소시킨다.

이 결과는 사람에게서 헬리코박터 파일로리의 감염을 치료 및 예방하는데 사용할 경구 백신 제제에 헬리코박터 파일로리 FlgE 폴리펩티드를 사용할 수 있음을 강력하게 뒷받침해 준다. 이와 같이 FlgE 폴리펩티드는 헬리코박터 파일로리의 감염을 검출하고 백신 조성물의 제조하는데 유용하다. 이 백신 조성물은 적절한 제약 제제 중에 포함되면, 헬리코박터 파일로리 감염에 대한 보호 또는 치료 면역 반응을 유발할 것이다.

결론적으로 본 발명의 한 측면에서는 헬리코박터 파일로리 FlgE 폴리펩티드를 헬리코박터 파일로리 감염에 대한 보호 면역 반응의 유도용으로 제공한다. 여기서 헬리코박터 파일로리 FlgE 폴리펩티드란 용어는 문헌 (O'Toole et al., Molecular Microbiology, 14(4), 691-703, 1994)에 기재된 것으로서, 서열 1의 뉴클레오타이드 서열을 갖거나, 국립생명공학정보센터 (National Center for Biological Information) (수탁번호 U09549)로부터 얻을 수 있는 서열의 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드 또는 이와 기능적으로 등가의 항원성을 보유한 이 폴리펩티드의 실질적으로 유사한 변형태를 의미하는 것이다.

"보호 면역 반응"이란 용어는 해당 조성물을 치료 및(또는) 예방 목적에 적절하게 만드는 면역 반응으로 이해되어야 한다.

"기능적으로 등가의 항원성"이란 용어는 전신 및 점막 면역 반응을 유도함과 동시에 위 점막에 결합된 헬리코박터 파일로리의 세포수를 감소시키는 능력으로 이해되어야 한다. 당업자라면, 생체내 유도 항체를 이용한 에피토프 지도화 등의 공지된 방법을 써서 기능적으로 등가의 항원성을 보유한 FlgE 폴리펩티드의 변형태를 동정할 수 있을 것이다.

본 발명의 바람직한 양태에서는 헬리코박터 파일로리 감염에 대한 보호 면역 반응을 유도하는데 사용되는 헬리코박터 파일로리 FlgE 폴리펩티드는 아미노산 서열이 실질적으로 서열 목록의 서열 2에 기재된 것이나 또는 그것의 기능적으로 등가의 항원성을 보유한 변형태이다.

이와 같이 헬리코박터 파일로리 FlgE 폴리펩티드의 정의는 아미노산 서열이 서열 목록의 서열 2와 동일한 폴리펩티드만으로 엄격하게 제한되는 것이 아님이 이해되어야 한다. 오히려 본원 발명은 치환, 약간의 결실, 삽입 또는 전도 (inversion) 등에 의해 변형되었더라도 실질적으로 헬리코박터 파일로리 FlgE 폴리펩티드의 생체 활성이 있고 기능적으로 등가의 항원성을 보유한 폴리펩티드를 포괄한다. 결론적으로 헬리코박터 파일로리 FlgE 폴리펩티드의 정의에 포함되는 폴리펩티드란 그 아미노산 서열이 서열 목록의 서열 2에 기재된 아미노산 서열과 90 % 이상의 상동성, 바람직하게는 95 % 이상의 상동성이 있는 것이다.

본원 발명의 다른 측면에서는 상기 정의된 헬리코박터 파일로리 FlgE 폴리펩티드의 면역적 유효량과 함께 임의로는 제약상 허용가능한 담체 또는 희석제를 함유하는, 헬리코박터 파일로리 감염에 대한 보호 면역 반응을 유도하기 위한 백신 조성물을 제공한다.

이런 맥락에서 "면역적 유효량"이란 용어는 헬리코박터 파일로리에 대한 상당한 보호 면역 반응을 유도하여 감염된 포유 동물에게서 헬리코박터 파일로리 감염을 일소하거나 감수성 포유동물에게서 감염을 예방하는 양으로 이해되어야 한다. 면역적 유효량은 통상적으로 경구 투여의 경우에는 헬리코박터 파일로리 항원 약 1 ㎍ 내지 1000 mg, 바람직하게는 약 10 ㎍ 내지 100 mg을 포함하며 비경구 투여의 경우에는 약 100 ㎍ 미만을 포함한다.

본 발명의 백신 조성물은 경우에 따라 제약상 허용가능한 담체나 희석제 이외에도 예방 및 치료용의 다른 면역적 활성 항원을 하나 이상 포함한다. 생리적으로 허용가능한 담체 및 희석제는 당업자에게 잘 알려져 있으며, 예를 들면 인산 완충 염수 (PBS) 등이 있으며, 경구 백신의 경우에는 HCO₃ ^-기재 제제 또는 장 코팅 입제 등이 있다.

이 백신 조성물은 경우에 따라 산 분비 억제제, 바람직하게는 양성자 펌프 억제제 (PPI) (예: 오메프라졸 (omeprazole))를 포함하거나 또는 함께 투여될 수 있다. 이 백신은 림포솜, ISCOM, 코킬레이트 등의 공지된 운반계로 제형화될 수 있거나 (Rabinvovich et al. (1994), Science 265, 1401-1404), 또는 분해성 또는 비분해성 중합체 미소구체 (microsphere)에 부착 또는 혼입될 수 있다. 여기서 항원은 살아있는 감독(減毒) 세균, 바이러스 또는 파아지에 수반되거나 동종의 죽은 벡터에 수반될 수 있다. 이 항원은 불활성 또는 보조 형태의 담체 단백질 (즉, 콜레라 B 서브유닛)에 화학적으로나 유전공학적으로 결합시킬 수 있다. 결론적으로 본 발명의 다른 측면에서는 상기한 바와 같이 추가로 콜레라 독소 등의 보조제가 함유된 백신 조성물을 제공한다. 이러한 제약상 허용가능한 형태의 콜레라 독소는 문헌 (Rappuoli et al., (1995) Int. Arch. Allergy ＆ Immunol. 108 (4), 327-333, 및 Dickinson et al. (1995) Infection and Immunity 63 (5), 1617-1623) 등에서와 같이 당업계에 공지되어 있다.

본 발명에 따른 백신 조성물은 치료 및 예방 둘다의 목적을 위해 사용할 수 있다. 즉, 본 발명에는 상기 정의된 바와 같이, 헬리코박터 파일로리로 감염된 사람을 비롯한 포유동물에게서 치료 또는 예방용 백신으로 사용되는 백신 조성물이 포함된다. 이런 맥락에서 "예방 목적"이란 헬리코박터 파일로리에 의한 미래 감염으로부터 보호하는 면역 반응의 유도를 뜻하며, "치료 목적"이란 기존의 헬리코박터 파일로리 감염을 일소할 수 있는 면역 반응의 유도를 의미한다.

본 발명에 따른 백신 조성물은 협측, 비강, 편도선, 위, 장 (소장 및 대장), 직장, 질 점막 등의 포유 동물의 임의의 점막에 투여하는 것이 바람직하다. 점막 백신은 이 목적에 적합한 보조제와 함께 투여할 수 있다. 이 백신은 또한 경구 또는 비경구, 피하, 피내, 또는 근육내 경로로, 경우에 따라서는 적절한 보조제와 함께 투여할 수 있다. 백신 조성물은 경우에 따라 항균성 치료제와 함께 투여될 수도 있다.

본 발명의 다른 측면에서는 헬리코박터 파일로리 FlgE 폴리펩티드의

(i) 헬리코박터 파일로리 감염의 치료, 예방 또는 진단용 조성물의 제조

(ii) 헬리코박터 파일로리에 대한 보호 면역 반응을 유발하기 위한 백신의 제조 및

(iii) 헬리코박터 파일로리 감염의 진단용 키트의 제조에 있어서의 용도를 제공한다.

본 발명의 또다른 측면에서는 상기 정의된 헬리코박터 파일로리 FlgE 폴리펩티드를 경우에 따라 고체 지지체로 표지하거나 고체 지지체에 결합시켜 사용하는 단계를 하나 이상 포함하는, 헬리코박터 파일로리의 감염의 시험관내 진단 방법을 제공한다. 이 방법은 예를 들면 (a) 상기한 (경우에 따라 고체 지지체에 결합되어 있는) 헬리코박터 파일로리 FlgE 폴리펩티드를 포유동물에서 채취한 체액과 접촉시키는 단계 및 (b) 이 체액으로부터 상기 FlgE 폴리펩티드에 결합하는 항체를 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 항체의 바람직한 검출 방법은 당업계에 잘 알려진 ELISA법 (효소 연결 면역 흡착 분석법)이다.

본 발명의 또다른 측면에서는 상기한 바와 같은 시험관내 진단 방법의 수행을 가능하게 하는 성분이 포함된, 사람을 비롯한 포유동물의 헬리코박터 파일로리 감염의 검출용 진단 키트를 제공한다. 이 진단 키트에는 예를 들면 (a) 헬리코박터 파일로리 FlgE 폴리펩티드 및 (b) 상기 FlgE 폴리펩티드에 결합하는 항체의 검출용 시약이 포함된다. 이런 항체 검출용 시약은 예를 들면 효소로 표지된 항면역글로불린이거나 이 효소에 대한 색유발성 기질일 수 있다.

본 발명의 또다른 측면에서는 사람을 비롯한 포유동물에게서 헬리코박터 파일로리 감염에 대한 보호 면역 반응을 유발하는 방법이 제공되며, 이 방법은 상기 포유동물에게 상기 정의된 헬리코박터 파일로리 FlgE 폴리펩티드의 면역적 유효량을 투여하는 단계 또는 이와 달리 상기 포유동물에게 상기 정의된 백신 조성물의 면역적 유효량을 투여하는 단계를 포함한다.

실험 방법

이 명세서 전체에서 "표준 프로토콜" 및 "표준 절차"란 용어가 분자 클로닝 기술과 관련해서 사용될 경우에는 문헌 (Current Protocols in Molecular Biology, F. Ausubel et al. (편), John Wiley and Sons Inc. 1994, 또는 Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T., Molecular Cloning: A laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) 등의 통상적인 실험 매뉴얼에 기재된 프로토콜 및 절차로 이해되어야 한다.

재조합 헬리코박터 파일로리 FlgE 폴리펩티드의 제조

DNA 서열 정보

FlgE 폴리펩티드를 코딩하는 유전자에 대한 서열 정보는 국립생명공학정보센터 (National Center for Biological Information) (수탁번호 U09549, 서열 1)로부터 얻었다.

헬리코박터 파일로리 J99 균주의 막 단백질 및 분비 단백질의 ORF를 포함하는 DNA 서열의 PCR 증폭 및 복제

이 서열은 헬리코박터 파일로리 J99 균주로부터 중합효소 연쇄반응(PCR)을 통해 증폭 복제했다. 유전자의 오픈 리딩 프레임 (ORF)의 5'- 및 3'-말단에 특이적인 합성 올리고뉴클레오타이드 프라이머 (하기 참조)는 이미 제작되어 시판 중이다 (GibcoBRL Life Technologies, 미국 메릴랜드주 게이터스버그 소재). FlgE에 대한 순방향 프라이머 (상기 서열의 5' 말단에 특이적)는 5' 말단의 최극단에 NcoI 클로닝 위치가 포함되도록 설계되었으며, 역방향 프라이머는 5' 말단의 최극단에 EcoRI 위치가 포함되도록 설계되어, 헬리코박터 파일로리 서열 각각을 pET28b 벡터의 리딩 프레임 내로 복제할 수 있다. pET-28b 벡터의 NcoI-EcoRI 위치 내로 복제된 삽입체는 히스티딘 잔기 6개를 (C-말단의 최극단에) 포함하는 추가의 20개 카르복시-말단 아미노산을 코딩하는 벡터 DNA 서열에 융합된다.

순방향 프라이머 (서열 3) : 5'-TAT ACC ATG GTG CTT AGG TCT TTA T-3'

역방향 프라이머 (서열 4):5'-GCG AAT TCA ATT GCT TAA GAT TCA A-3'

헬리코박터 파일로리 J99 균주로부터 제조된 게놈 DNA를 PCR 증폭 반응을 위한 주형 DNA 공급원으로 사용했다 (Current Protocols in Molecular Biology, F. Ausubel et al. (편), John Wiley and Sons, Inc. 1994). 헬리코박터 파일로리 ORF를 포함하는 DNA 서열을 증폭시키기 위해서 최종 부피 100 ㎕ 내에 2 mM MgCl₂, 1 μM의 상기 정의된 합성 올리고뉴클레오타이드 프라이머 (헬리코박터 파일로리 ORF에 상보적이고 그의 양 말단에 해당하는 순방향 및 역방향 프라이머), 0.2 mM씩의 데옥시뉴클레오타이드 삼인산염 (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), 및 열안정성 DNA 중합효소 (Amplitaq, Roche Molecular Systems, Inc., 미국 뉴저지주 브랜치버그 소재) 2.5 유닛이 들어있는 반응 유리병으로 게놈 DNA (50 ng)을 가했다. 다음의 가열 주기 조건으로 Perkin Elmer Cetus/GeneAmp PCR 시스템 9600 주기적 가열기를 써서 각 ORF를 증폭시켜 DNA 생성물을 얻었다.

(1) +94 ℃에서 2분간 변성

(2) +94 ℃에서 15초, +30 ℃에서 15초, +72 ℃에서 1.5분을 한 주기로 하여 2주기 수행

(3) +94 ℃에서 15초, +58 ℃에서 15초, +72 ℃에서 1.5분을 한 주기로 하여 23 주기 수행

(4) +72 ℃에서 6분간 두어 반응을 종결시킴

주기적 가열 반응이 완료되면 증폭된 DNA의 각 샘플을 세척하고 Qiaquick Spin PCR 정제 키트 (Qiagen, 미국 메릴랜드주 게이터스버그 소재)를 써서 정제했다. 이 증폭된 DNA 샘플을 표준 절차에 따라 제한 엔도뉴클레아제 Nde I 및 EcoR I를 사용하여 소화시킨다. 그 다음 DNA 샘플을 1.0 % NuSeive (FMC BioProducts, 미국 메인주 록클랜드 소재) 아가로오즈 겔 상에서 전기영동시켰다. 브롬화에티듐을 가하고 장파장 UV선에 노출시켜 DNA를 육안으로 확인했다. 아가로오즈 겔로부터 DNA가 담겨있는 조각을 떼어내어 Bio 101 GeneClean 키트 프로토콜 (Bio 101 Vista, 미국 캘리포니아주 소재)을 써서 DNA를 정제했다.

헬리코박터 파일로리 DNA 서열을 pET-28b 원핵생물 발현 벡터 내로 클로닝 하기

pET-28b 벡터를 클로닝에 사용하기 위해 표준 절차에 따라 Nco I 및 EcoR I을 사용하여 소화시켰다. 소화시킨 후, 이 소화된 pET-28b 발현 벡터 내로 DNA 삽입체를 표준 절차에 따라서 클로닝했다. 그 다음 이 라이게이션 반응의 생성물을 사용하여 아래에 설명한 바와 같이, 대장균 (E. coli) BL21 균주를 형절전환시켰다.

재조합 플라스미드를 이용한 감응성 (competent) 세균의 형질전환

감응성 세균인 대장균 BL21 균주 또는 대장균 BL21(DE3) 균주를 헬리코박터 파일로리 서열이 클로닝된 재조합 pET 발현 플라스미드로 표준 방법에 따라 형질전환시켰다. 간단하게 요약하면, 라이게이션 반응물 1 ㎕를 전기감응성 세포 50 ㎕와 혼합하고, 고압 펄스를 가한 후, 샘플을 +37 ℃에서 SOC 배지 (0.5 % 이스트 추출물, 2.0 % 트립톤, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl₂, 10 mM MgSO₄및 20 mM 포도당) 0.45 ml 중에서 1 시간 동안 진탕시키면서 인큐베이션시켰다. 그 다음 샘플을 25 ㎍/ml 카나마이신 황산염이 함유된 LB 아가 플레이트에 펴발라 밤새 증식시켰다. 그 다음 형질전환된 BL21 콜로니를 골라내어 다음과 같이 분석하여 클로닝된 삽입체를 평가했다.

헬리코박터 파일로리 서열이 포함된 재조합 pET 발현 플라스미드의 동정

재조합 pET-28b 헬리코박터 파일로리 유전자로 형질전환된 BL21 클론 각각을 클로닝된 삽입체의 PCR 증폭을 통해 분석했다. 이때 사용된 순방향 및 역방향 프라이머는 헬리코박터 파일로리 서열 각각에 특이적이고, 최초의 PCR 증폭 클로닝 반응에 사용했던 것과 동일한 것이었다. 성공적인 증폭 반응 결과, 표준 절차에 따라 발현 벡터 내에 헬리코박터 파일로리 서열이 통합되어 있음을 확인했다.

BL21 형질전환체로부터 플라스미드 DNA의 단리 및 정제

적절히 클로닝된 헬리코박터 파일로리 ORF가 포함된 재조합 pET-28b 벡터의 개별적인 클론을 골라내어 25 ㎍/ml 카나마이신 황산염 함유 LB 배양액 5 ml 중에서 밤새 인큐베이션시켰다. 다음날 Qiagen 플라스미드 정제 프로토콜 (Qigen Inc., 미국 캘리포니아주 채츠워쓰 소재)을 사용하여 플라스미드 DNA를 단리 및 정제했다.

대장균에서 재조합 헬리코박터 파일로리 서열의 발현

클로닝 또는 플라스미드 정제를 위해 임의의 대장균 K-12 균주, 예를 들면 HMS174, HB101, JM109, DH5α내에서 pET 벡터를 번식시켰다. 발현을 위한 숙주로는 T7 RNA 중합효소의 유전자가 염색체내에 포함된 대장균 균주를 들 수 있다. 이들 숙주는 lacI 유전자, lacUV5 프로모터 및 T7 RNA 중합효소 유전자가 있는 람다 유도체인 박테리오파아지 DE3의 용원균 (lysogen)이다. T7 RNA 중합효소는 이소프로필-β-D-티오갈락토시드 (IPTG)를 가하면 유도되어, 원하는 유전자를 보유한 임의의 표적 플라스미드 (예를 들면 pET-28b)를 전사시킨다. 본 발명자들의 실험실에서 사용한 균주는 BL21(DE3)이다 (Studier, F.W., Rosenberg, A.H., Dunn, J.J., and Dubendorff, J.W. (1990) Methods Enzymol. 185, 60-89).

재조합 헬리코박터 파일로리 서열을 발현시키기 위해서 상기한 바와 같이 단리한 플라스미드 DNA 50 ng을 써서 상기한 바와 같은 감응성 BL21(DE3) 세균을 형질전환시켰다 (pET 발현 시스템 키트의 일부로서 Novagen사 제공). 형질전환된 세포를 1 시간 동안 SOC 배지에서 배양하고, 이 배양물을 25 ㎍/ml 카나마이신 황산염 함유 LB 플레이트에 플레이팅했다. 다음날 박테리아 콜로니를 모으고, 흡광도 (600 nm)가 0.5 내지 1.0 O.D.가 될 때까지 카나마이신 황산염 (25 ㎍/ml) 함유 LB 배지에서 증식시켰다. 이 시점에서 1 mM IPTG를 배양물에 가하고, 3 시간 동안 헬리코박터 파일로리 재조합 DNA 제작물의 유전자 발현을 유도했다.

IPTG로 유전자 발현을 유도한 후, Sorvall RC-3B 원심분리기로 원심분리 (4 ℃, 3500 x g, 15 분)하여 세균을 펠렛화했다. 펠렛을 차가운 10 mM Tris-HCl, (pH 8.0), 0.1 M NaCl 및 0.1 mM EDTA (STE 완충액) 50 ml에 재현탁시켰다. 그 다음 세포를 +4 ℃에서 2000 x g으로 20분간 원심분리했다. 젖은 상태의 펠렛의 중량을 달고, 단백질의 정제 준비가 될 때까지 -80 ℃로 냉동시켰다.

분석 방법

정제된 단백질 제제의 농도를 아미노산 함량으로부터 계산된 흡광 계수를 이용, 분광기로 정량했다 (Perkins, S.J., 1986, Eur. J. Biochem. 157, 169-180). 또한 단백질 농도는 소 혈청 알부민을 표준물로서 사용하여 문헌 (Bradford, M.M. (1976) Anal. Biochem. 72, 248-254) 및 (Lowry, O.H., Rosebrough, N., Farr, A.L. ＆ Randall, R.J. (1951))의 방법으로도 측정했다.

나트륨 도데실 황산염-폴리아크릴아미드 (SDS-PAGE) 겔 (12 % 또는 4 내지 25 % 구배 아크릴아미드)은 BioRad사 (미국 캘리포니아주 허큘리스 소재)로부터 구입했으며, 쿠마지에 브릴리언트 블루 (Coomassie Brilliant Blue)로 염색했다. 분자량 마커로는 토키 골격근 미오신 (200 kDa), 대장균 β-갈락토시다제 (116 kDa), 토끼 근육 포스포릴라제 B (97.4 kDa), 소 혈청 알부민 (66.2 kDa), 오브알브민 (45 kDa), 소 탄산 안히드라제 (31 kDa), 대두 트립신 억제제 (21.5 kDa), 알 흰자위 리조짐 (14.4 kDa) 및 소 아프로티닌 (6.5 kDa) 등이 있었다.

봉입체 (inclusion body)로부터 FlgE의 정제

다음 단계들은 +4 ℃에서 수행했다. 세포 펠렛을 10 % 글리세롤, 200 ㎍/ml 리소짐, 5 mM EDTA, 1 mM PMSF 및 0.1 % β-메르캅토에탄올이 함유된 용해 (lysis) 완충액에 재현탁시켰다. 세포 분쇄기를 통과시킨 후, 생성된 균질물을 0.2 % DOC로 만들고, 10 분 동안 교반시킨 후 원심분리했다 (10,000 g x 30 분). 우선 펠렛을 10 % 글리세롤, 10 mM EDTA, 1 % 트리톤 X-100, 1 mM PMSF 및 0.1 β-메르캅토에탄올이 함유된 용해 완충액으로 세척한 후, 1 M 우레아, 1 mM PMSF 및 0.1 % 메르캅토에탄올이 함유된 용해 완충액으로 세척했다. 생성된 백색 펠렛은 주로 봉입체로 이루어져 있었으며, 비분쇄 세포와 막(膜) 물질은 없었다.

다음 단계는 실온에서 수행했다. 봉입체를 1 mM PMSF 및 0.1 % β-메르캅토에탄올이 함유된 용해 완충액 중의 8 M 우레아 20 ml에 용해시키고, 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션시켰다. 용해되지 않은 물질을 원심분리를 통해 제거했다 (100,000 x g, 30분). 맑은 상층액을 여과하고, 용해 완충액 중의 8 M 우레아로 평형화된 Ni²⁺-NTA 아가로오즈 컬럼으로 로딩했다. 이 컬럼을 8 M 우레아, 1 mM PMSF, 0.1 % β-메르캅토에탄올이 함유된 용해 완충액 250 ml (50 베드 부피)로 세척하고, 순차적인 단계를 통해 8 M 우레아, 1 mM PMSF, 0.1 % β-메르캅토에탄올 및 20, 100, 200, 500 mM 이미다졸이 함유된 용해 완충액을 써서 현상했다. 각 분획의 흡광도 (280 nm) OD₂₈₀를 관찰하고, 피크 분획을 SDS-PAGE로 분석했다. 쿠마지에 브릴리언트 블루로 염색한 결과 두 개의 밴드가 육안으로 확인되었으며, 그 중 주요한 밴드는 M_r= 78 kDa이고, 부차적인 밴드는 M_r= 60 kDa이었다. 재조합 FlgE (78 kDa)의 순도는 90 %를 넘는 것으로 확인되었다. 가용성 단백질의 정제와 관련하여, 재조합 단백질 함유 분획은 100 mM 이미다졸에서 용출되었다.

우레아는 0.5 % DOC 함유 TBS에 대해 투석하여 FlgE 폴리펩티드로부터 서서히 제거했으며, 이 때 우레아는 6 M, 4 M, 3 M, 2 M, 1 M, 0.5 M에 이어서 0 M로 순차적으로 감소했다. 각 투석 단계는 실온에서 최소 4 시간 동안 수행했다.

투석 이후, Amicon 교반 장치를 사용하여 샘플을 가압 여과함으로써 농축했다. 그 다음 퍼킨스(Perkins), 브래드포드(Bradford) 및 로우리(Lowry)법으로 단백질 농도를 측정했다.

＜실시예 1＞

치료 면역화

1. 재료 및 방법

1.1 동물

봄홀트 (Bomholt) 육종 센터 (덴마크)로부터 SPF BALB/c 생쥐 암컷을 구입했다. 이 생쥐를 통상의 마크롤론 (makrolon) 우리에 가두고, 물과 음식을 자유롭게 섭취하도록 해 주었다. 이 동물은 도착했을 때 4-6주령이었다.

1.2 감염

최소 1 주일의 적응기간 후에 이 동물을 헬리코박터 파일로리의 2형 균주 (본래 궤양 환자에게서 분리된 244 균주)로 감염시켰다. 이 균주는 생쥐의 위에서 잘 번식하는 것으로 이전부터 밝혀져 있었다. -70 ℃에 놓아두었던 스톡으로부터 세균을 취하여, 미소호기성 (microaerophilic) 조건 (10 % CO₂, 5 % O₂)에서 10 % 태송아지 혈청을 보충한 Brucella 배양액 내에 증식시켰다 (37 ℃). 상기 동물에게 오메프라졸 (400 μ㏖/kg)의 경구 투여량을 투여하고 3-5 시간 후에 헬리코박터 파일로리 (약 10⁷-10⁸CFU/동물)로 경구 접종했다. 접종한 지 2-3주 후에 대조구 동물에게서 감염 여부를 검사했다.

1.3 면역화

감염시킨 지 1 개월 후 34일의 기간 동안 2개의 생쥐군을 4회 면역접종했다 (1일, 15일, 25일, 35일). 정제된 재조합 FlgE를 0.5 % 데옥시콜레이트 (DOC)가 함유된 PBS에 용해시켜서 생쥐 1 한 마리당 100 ㎍을 투여했다.

보조제는 대조구 및 FlgE군 모두에게 생쥐 1 마리당 콜레라 독소 (CT) 10 ㎍를 매 접종시 함께 투여했다. 오메프라졸 (400 μ㏖/kg)은 산 분해로부터 항원을 보호하기 위해서 면역접종 3-5 시간 전에 모든 동물에게 경구 투여했다. 최종 면역접종한 지 1-2 주 후에 동물을 죽였다.

1군 : CT 10 ㎍이 함유된 0.5 % DOC와 함께 PBS 300 ㎕ 투여

2군 : FlgE 100 ㎍ 및 CT 10 ㎍이 함유된 0.5 % DOC와 함께 PBS 300 ㎕ 투여

1.4 감염의 분석

생쥐를 CO₂와 경부 탈구를 통해 죽였다. 복부 및 흉강을 열고, 심장에 구멍을 내어 혈액을 채취했다. 이어서 위(胃)를 꺼내어, 큰 만곡을 따라 위를 가르고 염수로 세척한 후 동일한 2개의 조각으로 절단했다. 강(剛) 및 체(體)로부터 점막 25 ㎟를 외과용 메스 (scalpel)를 이용하여 따로따로 긁어냈다. 긁어낸 점막을 Brucella 배양액에 현탁시키고, 희석하고, Blood Skirrow 플레이트에 플레이팅했다. 이 플레이트를 3-5 일간 미소호기성 조건에서 인큐베이션시키고, 콜로니 수를 헤아렸다. 헬리코박터 파일로리의 정체는 우레아제와 카탈라제 테스트 및 직접적인 현미경 관찰 또는 그램 (Gram) 염색를 통해 확인했다.

1.5 항체 측정

혈액으로부터 혈청 항체를 모았다. 원심분리 전에, 혈액을 그와 동일한 양의 PBS로 희석시켰다. 이 혈청을 분석 전까지 -20 ℃에 보관했다. 혈청 항체를 ELISA를 이용하여 측정했으며, 이때 플레이트는 헬리코박터 파일로리 244 균주의 미립자 파편 또는 FlgE로 코팅한 후 여러 농도의 혈청 희석액을 가한 것이었다. ELISA는 알칼리성 포스파타제로 표지된 항-생쥐 Ig-항체로 현상시켰다. 항 Ig 항체는 항 중쇄/항 경쇄 형태일 수 있으며, 모든 형태의 항체를 검출하는 것이어야 한다.

2. 결과

2.1 치료 면역화 : CFU에 대한 효과

이 연구에서 동물은 면역접종 1개월 전에 헬리코박터 파일로리 244 균주로 감염시켰다. 그 다음 10 마리 생쥐군에게 콜레라 독소 (CT)로 면역접종하거나 또는 CT와 함께 재조합 FlgE 폴리펩티드로 면역접종했다. 마지막 면역접종한 지 4주 후에 동물을 죽이고, CFU를 측정했다 (도 1). CT만을 처리한 동물은 체(體) 및 강(腔) 모두에서 상당히 감염되어 있었다. 재조합 FlgE 폴리펩티드 및 CT로 능동적으로 면역된 동물은 CT 처리 동물(p ＜ 0.05)과는 대조적으로 강(腔) 및 위 전체에서 CFU 값이 상당이 감소했다 (p ＜ 0.01) (Wilcoxon-Mann-Whittney 기호 순위 시험).

2.2 치료 면역화: 항체 형성 및 분비에 대한 효과

감염의 징후로서 혈청 내에서 헬리코박터 파일로리 특이적 항체를 발견할 수 있다 (대조구/244). FlgE + CT를 투여한 동물에서는 244 균주 (막 단백질 형태)에 대한 적정 농도가 4배 증가했다 (p ＜ 0.01). FlgE + CT를 투여한 동물에서만 FlgE에 대해 특이적인 혈청 IgG 적정 농도를 측정할 수 있었다 (도 2).

FlgE 특이적 IgG는 FlgE + CT를 투여한 동물에서는 증가했지만, 대조구 동물에서는 검출할 수 없었다.

이 결과는 재조합 FlgE 헬리코박터 파일로리 폴리펩티드가 보조제인 콜레라 독소와 함께 경구 투여될 경우 전신 FlgE 특이적 Ig 항체의 증가에 의해 입증된 바와 같이, 상당히 큰 면역원성을 지님을 보여준다. FlgE로 면역접종하면 헬리코박터 파일로리의 미립자 파편에 대한 Ig 적정 농도도 상당히 증가되었다. 뿐만 아니라, 콜레라 독소와 FlgE를 함께 면역접종한 결과, 감염된 생쥐의 위 점막에서 헬리코박터 파일로리의 콜로니 수도 급격히 감소한다는 것이 밝혀졌다.

Claims (17)

1. 헬리코박터 파일로리 감염에 대한 보호 면역 반응을 유도하기 위한 헬리코박터 파일로리 FlgE 폴리펩티드 또는 이와 기능적으로 등가의 항원성을 보유한 이의 변형태.
2. 제1항에 있어서, 서열 목록의 서열 2에 제시한 아미노산 서열을 실질적으로 갖는, 헬리코박터 파일로리 감염에 대한 보호 면역 반응을 유도하기 위한 헬리코박터 파일로리 FlgE 폴리펩티드.
3. 제1 또는 2항에 정의된 헬리코박터 파일로리 FlgE 폴리펩티드의 면역적 유효량과 함께 임의로는 제약상 허용가능한 담체 또는 희석제를 함유하는, 헬리코박터 파일로리 감염에 대해 보호 면역 반응을 유도하기 위한 백신 조성물.
4. 제3항에 있어서, 보조제를 더 함유하는 백신 조성물.
5. 제4항에 있어서, 상기 보조제가 제약상 허용가능한 형태의 콜레라 독소인 백신 조성물.
6. 제3 내지 5항 중 어느 한 항에 있어서, 헬리코박터 파일로리에 의해 감염된 사람을 비롯한 포유동물에게 치료용 백신으로 사용하기 위한 백신 조성물.
7. 제3 내지 5항 중 어느 한 항에 있어서, 헬리코박터 파일로리에 의한 감염으로부터 사람을 비롯한 포유동물에게 예방용 백신으로 사용하기 위한 백신 조성물.
8. 제1 또는 2항에 정의된 헬리코박터 파일로리 FlgE 폴리펩티드의 헬리코박터 파일로리의 치료 또는 예방 또는 진단용 조성물의 제조에 있어서의 용도.
9. 제1 또는 2항에 정의된 헬리코박터 파일로리 FlgE 폴리펩티드의 헬리코박터 파일로리에 대한 보호 면역 반응의 유도용 백신의 제조에 있어서의 용도.
10. 제1 또는 2항에 정의된 헬리코박터 파일로리 FlgE 폴리펩티드의 헬리코박터 파일로리 감염의 진단용 진단 키트의 제조에 있어서의 용도.
11. 제1 또는 2항에 정의된 헬리코박터 파일로리 FlgE 폴리펩티드를, 경우에 따라서 고체 지지체로 표지하거나 고체 지지체에 결합시켜서 사용하는 단계를 하나 이상 포함하는 헬리코박터 파일로리 감염의 시험관내 진단 방법.
12. 제11항에 있어서,

    (a) 상기 헬리코박터 파일로리 FlgE 폴리펩티드를 임의로는 고체 지지체에 결합시켜서, 포유동물로부터 채취한 체액과 접촉시키는 단계 및

    (b) 상기 체액에서 상기 FlgE 폴리펩티드와 결합하는 항체를 검출하는 단계를 포함하는 방법.
13. 제11 또는 12항에 따른 방법의 수행을 가능하게 하는 성분이 함유된, 포유동물에게서 헬리코박터 파일로리 감염을 검출하기 위한 진단 키트.
14. 제13항에 있어서,

    (a) 헬리코박터 파일로리 FlgE 폴리펩티드 및

    (b) 상기 FlgE 폴리펩티드에 결합하는 항체를 검출하기 위한 시약을 함유하는 진단 키트.
15. 제1 또는 2항에 정의된 헬리코박터 파일로리 FlgE 폴리펩티드의 면역적 유효량을 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에게서 헬리코박터 파일로리 감염에 대한 보호 면역 반응을 유도하는 방법.
16. 제3 내지 7항 중 어느 한 항에 따른 백신 조성물의 면역적 유효량을 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에게서 헬리코박터 파일로리 감염에 대한 보호 면역 반응을 유도하는 방법.
17. 제15 또는 16항에 있어서, 상기 포유동물이 사람인 방법.