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CN116535472B - 一种幽门螺杆菌重组蛋白抗原FlgK及其制备方法与应用 - Google Patents

一种幽门螺杆菌重组蛋白抗原FlgK及其制备方法与应用 Download PDF

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CN116535472B CN202310632584.3A CN202310632584A CN116535472B CN 116535472 B CN116535472 B CN 116535472B CN 202310632584 A CN202310632584 A CN 202310632584A CN 116535472 B CN116535472 B CN 116535472B
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Abstract

本发明提供了一种幽门螺杆菌重组蛋白抗原FlgK，氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明还提供了一种编码幽门螺杆菌重组蛋白抗原FlgK的核酸，其核酸序列如SEQ NO:2所示。本发明提供的幽门螺杆菌重组蛋白抗原FlgK，能够有效刺激体液免疫应答，血清IgG显著提高，也能有效刺激黏膜免疫应答，产生较高的sIgA，并经免疫保护力评价实验证实具有非常好的保护效果。

Description

一种幽门螺杆菌重组蛋白抗原FlgK及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于生物制药领域，涉及一种新型幽门螺杆菌重组蛋白抗原及其制备技术。
背景技术
幽门螺杆菌(Helicobacter prlor，HP)是存在于胃及十二指肠黏膜中的一种革兰氏阴性菌，是很多消化道疾病甚至黏膜相关组织淋巴瘤，胃癌等疾病的重要诱发因素。因此，早预防、早发现、早治疗可以有效的降低HP感染患者的发病率和死亡率，但是目前对于HP感染的治疗常采用抗生素联合治疗的方式；这种治疗方式常有一些缺陷，如再次感染、世界范围内的抗生素耐药性越来越强、副作用、患者依从性和成本过高等。因此，研发出针对HP的疫苗才是控制HP感染、阻断传播的可靠方法。
众所周知，细菌能够产生致病性的前提是其能够在宿主体内定殖，而其中发挥重要作用的就是细菌鞭毛。在疾病相关致病过程中，鞭毛参与包括粘附、生物膜形成、毒力因子分泌、运动性和趋化性等，是细菌感染定殖的重要影响因素。细菌鞭毛是由基质、钩状体和细丝三部分组成，分别含有不同的蛋白质分子，具有不同的功能。其中鞭毛钩是连接鞭毛基质和细丝的万向节，由多个鞭毛钩蛋白(FlgK)组装而成，可以将基质产生的扭矩平稳地传递到细丝上，柔性钩和刚性丝具有明显的力学结构特征，需要钩丝连接作为缓冲结构。而鞭毛细丝则由单个鞭毛蛋白聚合，并赋予细菌运动性。不管在鞭毛的形成中还是功能维持中FlgK都发挥了重要的作用。
因此，针对于幽门螺杆菌，如果能够让机体产生针对抗体破坏其功能，就可以阻碍正确的鞭毛组装，使得HP丧失黏附能力、运动能力等基础功能，从而阻断其定殖。
发明内容
本发明目的旨在提供了一种幽门螺杆菌重组蛋白抗原FlgK，能够有效刺激机体产生免疫应答并具备良好的免疫保护作用。
本发明的另一目的旨在提供上述幽门螺杆菌重组蛋白抗原FlgK的制备方法。
本发明的第三目的旨在提供上述幽门螺杆菌重组蛋白抗原FlgK的应用。
为达到上述目的，本发明采用以下技术方案来实现。
本发明提供的幽门螺杆菌重组蛋白抗原FlgK，其氨基酸序列如SEQ NO:1所示。
本发明还提供了一种编码所述幽门螺杆菌重组蛋白抗原FlgK的核酸，其核酸序列如SEQ NO:2所示。
本发明还提供了上述幽门螺杆菌重组蛋白抗原FlgK按照以下步骤制备得到：
a、质粒构建，原核表达
将核酸序列如SEQ ID NO:2所示的基因链接在表达载体质粒中，构建质粒并转入宿主菌中进行诱导表达；
b、破菌、离心
收集表达后的菌体用pH为6.0-8.0的破菌液重悬混匀，高压均质破菌，低速离心，收集包涵体沉淀；
c、包涵体洗涤及溶解
经过步骤b收集的沉淀使用包涵体洗涤液及破菌液进行反复交替重悬清洗3次，再使用A液重悬洗涤包涵体，之后于2-8℃溶解过夜；所述A液pH值为6.0-8.0，其组成为：20-50mM PB、0.1-0.5M NaCl、10-50mM咪唑、6-8M尿素，去离子水为溶剂；
d、Ni柱亲和层析
使用A液平衡层析柱，再将经过步骤c溶解后的获得的上清液上样，之后使用的A液和B液的混合液进行洗脱；所述B液pH值为6.0-8.0，其组成为20-50mM PB、0.1-0.5M NaCl、6-8M尿素、0.5-1M咪唑，去离子水为溶剂；
e、Q柱阴离子交换层析
使用C液平衡Q层析柱，再将经步骤d纯化的目的蛋白上样，之后依次使用D液复性、D液和E液的混合液进行洗脱，得到幽门螺杆菌疫苗重组蛋白抗原FlgK；所述C液pH值为6.0-8.0，其组成为10-30mM PB，0-10mM NaCl，6-8M尿素，去离子水为溶剂；所述D液pH值为6.0-8.0，其组成为10-30mM PB，0-10mM NaCl，0.1-0.6％精氨酸，去离子水为溶剂；所述E液pH值为6.0-8.0，其组成为10-30mM PB，0.5-1M NaCl，0.1-0.6％精氨酸，去离子水为溶剂。
上述步骤a中，所述SEQ ID NO:2为优化后编码抗原FlgK的核酸序列。
上述步骤a中，所述表达载体为pET28a。
上述步骤a中，所述宿主菌为E.coli BL21 DE3。
上述步骤a中，所述诱导表达条件为温度16-37℃，转速180-220rpm，诱导表达采用浓度为0.1-0.5mM的异丙基硫代半乳糖苷。
上述步骤b中，所述破菌液为pH 6.0-8.0的20-50mM PB，0.1-0.5M NaCl的溶液，去离子水为溶剂；破菌条件为外循环温度-4-0℃、压力600-850bar、4-6个循环；离心条件为2000-5000rpm，10-30min。
上述步骤c中，所述包涵体洗涤液组成为：pH 6.0-8.0的20-50mM PB，0.1-1％Triton X-100，1-5mM EDTA，0.1-0.5M NaCl；离心条件为12000-17000rpm，15-30min。
上述步骤d中，所述Ni亲和填料为Ni Sepharose High Performance(cytiva，货号：17526802)。
上述步骤e中，所述Q柱阴离子交换层析柱填料为Q Sepharose High performance(cytiva，货号：17101401)。
本发明还提供了上述幽门螺杆菌疫苗重组蛋白抗原FlgK在制备预防或治疗幽门螺杆菌感染药物中的用途；主要是用于制备预防或治疗幽门螺杆菌感染疫苗。
本发明通过对HP鞭毛蛋白进行了空间及结构分析，结合抗原表位分析预测，筛选出了其中特异性高、抗原性好的部分鞭毛钩蛋白结构，命名为FlgK蛋白，并根据FlgK的核酸序列，进行大肠杆菌偏嗜性密码子优化，获得目的基因片段，将其导入载体重组表达后，得到大肠杆菌表达的基因工程重组幽门螺杆菌抗原蛋白。
本发明采用特别的蛋白纯化方法，能够纯化得到纯度在99％以上的重组蛋白，并验证发现该重组蛋白能够有效刺激体液免疫应答，血清IgG显著提高，也能有效刺激黏膜免疫应答，产生较高的sIgA，并经免疫保护力评价实验证实具有非常好的保护效果，可以作为预防幽门螺杆菌感染的抗原成分使用，后续用来制备预防或治疗幽门螺杆菌感染的疫苗。
附图说明
图1为重组质粒FlgK双酶切鉴定结果；M：Takara DL5000 DNA Marker；泳道1：质粒FlgK-pET28a；泳道2：双酶切FlgK-pET28a；鉴定结果显示分离片段约为5270bp和1205bp。
图2为FlgK蛋白诱导鉴定结果；泳道1：pET28a/FlgK/BL21(DE3)+全菌液；泳道2：pET28a/FlgK/BL21(DE3)+破菌上清；泳道3：pET28a/FlgK/BL21(DE3)+破菌沉淀；M：ThermoScientific Protein Ruler；鉴定结果显示FlgK蛋白约为46.47KD，pET28a/FlgK/BL21(DE3)包涵体表达。
图3为Ni亲和层析电泳结果；1：破菌液；2：2000g上清；M：Thermo ScientificProtein Ruler；3：上样；4：流穿；5：5％-1B液；6：5％-2B液；7：5％-3B液。
图4为Q柱离子层析电泳结果；M：Thermo Scientific Protein Ruler；1：30％ E液。
图5为LTs63K电泳图；1：上样；2：流穿；3：洗脱1；4：洗脱2；M：Thermo ScientificProtein Ruler。
图6为血清特异性抗体IgG效价统计结果。
图7为阴道灌洗液特异性抗体sIgA效价统计结果。
具体实施方式
以将结合附图对本发明各实施例的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施例，都属于本发明。
以下实施例所使用的菌株及试剂如下：
(1)幽门螺杆菌菌株：
幽门螺杆菌购自美国ATCC(J99/Helicobacter pylori(700824))；
(2)试剂：
1)质粒pET-28a购自GE Healthcare Life Sciences公司；
2)大肠杆菌菌株BL21(DE3)购自上海超研生物科技有限公司；
3)DNA Marker、限制性内切酶Nco I和Xho I、T4 DNA Ligase、蛋白Marker为Thermo Fisher产品；
4)质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒、细菌基因组提取试剂盒及超薄回收试剂盒为天根生化科技(北京)有限公司产品。
其余试剂和设备为普通市售产品。
实施例1：FlgK基因重组质粒的构建、筛选及鉴定
首先通过生物信息学技术采用“反向疫苗学”对HP鞭毛蛋白进行了空间及结构分析，结合抗原表位分析预测，筛选出了其中特异性高、抗原性好的部分鞭毛钩蛋白结构，命名为FlgK蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。。
根据FlgK蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)，进行大肠杆菌偏嗜性密码子优化(参见Villalobos A,Ness JE,Gustafsson C,Minshull J,Govindarajan S.Gene Designer:asynthetic biology tool for constructing artificial DNAsegments.BMCBioinformatics.2006)，获得目的基因片段，序列为SEQ ID NO:2。
对目的基因进行合成，通过Nco I和Xho I酶切位点，将目的基因片段插入表达质粒pET28a中，质粒测序结果与提交合成的序列信息比对，核酸序列(SEQ ID NO:2)完全相同。
将合成质粒用40μl无菌水溶解，取2μl转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，冰浴30min，之后42℃热休克90s，再迅速冰浴3min。加入1ml SOC培养基，混匀，置37℃摇床中220rpm振荡45min。
取100μl菌液涂布于Kana抗性LB平板，置37℃培养箱中培养16h。
然后进行pET28a/FlgK/BL21(DE3)阳性重组质粒的筛选、鉴定，包括以下步骤：
(1)挑取转化平板上分隔良好的单个菌落，接种于Kana抗性LB培养基中，37℃振荡培养过夜；
(2)参照质粒提取试剂盒说明书进行质粒提取；
(3)将提取的质粒DNA在37℃进行Nco I和Xho I双酶切，酶切时间为2h；双酶切反应体系如表1所示；
(4)使用浓度为1.0％的琼脂糖凝胶(1.0g琼脂糖溶解于100mLTAE缓冲液中)电泳检测双酶切结果，结果如图1，表明基因重组质粒构建成功。
表1双酶切反应体系
试剂 体积μl
CutSmart Buffer 2
Xho I 0.2
Nco I 0.2
质粒 6
Water,nuclease-free Up to 20
实施例2：重组蛋白FlgK在原核表达系统-大肠杆菌中诱导表达、纯化及表达形式的鉴定
取过夜培养的pET28a/FlgK/BL21(DE3)菌液100μl加入10mL Kana抗性的LB培养基中，于220rpm、37℃振荡过夜培养；取过夜培养的菌液200μl加入20mLKana抗性的LB培养基中，于220rpm、37℃培养3h，二次活化至OD600为0.8时，加入IPTG异丙基-β-D-硫代半乳糖苷10μl，使其终浓度为0.5mM，再置于摇床于220rpm、37℃诱导表达5h。
将诱导表达后的菌液取出，以8000g离心15min，弃去上清，加入3ml破菌液(50mMPB，0.3M NaCl，pH 7.0，去离子水为溶剂)混匀，冰浴超声裂解10min(超声5s停止6s)，再在4℃、12000rpm离心30min，分离上清及沉淀。
处理样品：在沉淀中加入3ml破菌液重悬，分别取裂菌液、上清、重悬沉淀各40μl加入10μl 5X蛋白上样缓冲液(生工，货号：C508320-0010)，于100℃静置10min，之后于12000rpm离心3min。
SDS-PAGE电泳：将处理好的裂菌液、上清和沉淀分别取10μl上样，进行浓度为15％的SDS-PAGE电泳。电泳结束后，将胶取出，置于考马斯亮蓝染色液中染色，再置于脱色液中脱色，采用凝胶扫描成像系统(ChemiDoc MP，Bio-Rad)扫描，扫描结果如图2所示。结果表明，pET28a/FlgK/BL21(DE3)正常表达，分子质量约为46.47KD，表达量高。
实施例3：重组蛋白抗原FlgK的制备
放大培养获取重组蛋白FlgK：取过夜培养的pET28a/FlgK/BL21(DE3)菌液30mL加入3L Kana抗性的TB培养基中，于220rpm、37℃培养3h，培养至OD600为1时，加入1M IPTG1.5ml，使其终浓度为0.5mM，于220rpm、37℃诱导表达4h。将诱导后的菌液，于8000rpm离心15min收集菌体，再加入200ml破菌液(同实施例2)重悬菌体后，将菌液进行高压均质破碎(外循环温度-4℃、压力650bar、6个循环)。之后，于2000rpm离心10min，取沉淀。
重组蛋白FlgK纯化，包括以下步骤：
(1)包涵体的洗涤及溶解：取上述沉淀，加入200ml包涵体洗涤液(50mM PB，1％Triton X-100，1mM EDTA，0.1M NaCl，pH 7.0，去离子水为溶剂)洗涤1次，洗涤条件为：振荡，彻底分散重悬，12000rpm离心15min，弃上清，再向沉淀中加入200ml破菌液洗涤1次，洗涤条件为：振荡、彻底分散重悬，12000rpm离心15min，弃上清；重复此步骤3次，洗涤完成后向沉淀中加入200ml A液(50mM PB，0.15M NaCl，8M尿素，20mM咪唑，pH7.0，去离子水为溶剂)，于室温搅拌溶解1h，之后于4℃放置溶解过夜。
(1)Ni柱亲和层析：取上述溶解液的上清液，于12000rpm离心15min，之后取上清液并过0.45μm滤膜备用。使用A液平衡Ni柱亲和层析柱(Ni Sepharose High Performance(cytiva，货号：17526802))，再取过滤后上清液上样，再使用5％B液(50mM PB，0.15MNaCl，8M尿素，1M咪唑，pH 7.0，去离子水为溶剂)+95％A液洗脱目的蛋白三遍。Ni柱亲和层析柱的层析图如图3所示。
(2)Q柱阴离子交换层析
取(2)中洗脱的蛋白60ml加入C液(20mM PB，8M尿素，pH 7.0，去离子水为溶剂)稀释至400ml备用。用C液平衡Q柱阴离子交换层析柱(Q Sepharose High performance(cytiva，货号：17101401))，取稀释液上样，C液冲洗平衡，再使用D液(20mM PB，0.6％精氨酸，10mM NaCl，pH 7.0，去离子水为溶剂)复性，再使用30％ E液(20mM PB，1M NaCl，0.6％精氨酸，pH 7.0，去离子水为溶剂)+70％D液洗脱目的蛋白(即重组蛋白FlgK)保存4℃备用。Q柱层析的层析图如图4所示，Q柱层析后经SDS-PAGE的电泳结果如图5所示，获得了纯度大于99％的目的蛋白。
实施例4：动物的免疫及血清特异性抗体IgG检测
(1)重组蛋白抗原FlgK与氢氧化铝佐剂联合免疫小鼠
Balb/C小鼠，雌性，7-8周龄，购自江苏集萃药康生物科技股份有限公司。分为免疫组(FlgK抗原+氢氧化铝佐剂，F-Al)和对照组(氢氧化铝佐剂，Al)，每组20只。
重组蛋白抗原FlgK与氢氧化铝佐剂联合免疫小鼠过程包括以下步骤：
1)首次免疫，50μg重组蛋白抗原FlgK和氢氧化铝佐剂按照等体积添加，混匀仪于4℃轻柔混匀30min后，置于冰盒中免疫备用，双侧大腿肌肉注射(100μl/鼠)；
2)第二次免疫，第14天进行二次免疫，注射量与免疫方式同上；
3)第三次免疫，第21天进行第三次免疫，注射量与免疫方式同上；
4)第四次免疫，第28天进行第三次免疫，注射量与免疫方式同上。
第四次免疫后5天，采集Balb/C小鼠眼眶静脉血，于4℃静置3h，之后于3000rpm离心5min分离血清，用Elisa检测NC-1特异性IgG水平变化，包括以下步骤：
1)抗原包被：取包被液将实施例3制备的FlgK纯化蛋白稀释至4μg/mL，然后按照100μL/孔包被酶标板，4℃过夜；包被液为50mM碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液pH9.6(15mM Na2CO3，35mM NaHCO3)。
2)封闭：封闭液300μL/孔，37℃孵育1h，PBST洗板后，于4℃保存备用；封闭液为10mM PBS(pH7.4)+1％BSA。
3)标本稀释：将血清从1:16384开始进行系列倍比稀释至1:262144。
4)加样：取包被好的酶标板，依次加入稀释血清，100μL/孔，每个样品做两个重复，37℃孵育1h，之后PBST洗涤4次；PBST洗液为10mM PBS(pH7.4)+0.05％ Tween-20。
5)加二抗：用抗体稀释液1:10000稀释HRP标记羊抗小鼠IgG(生工，货号：
D110087-0100)，100μL/孔，37℃孵育30min，之后PBST洗涤4次；抗体稀释液为10mMPBS(pH7.4)+0.05％ Tween-20+0.5％BSA。
6)显色：加入底物显色液100μL/孔，37℃孵育10min后加入终止液50μL/孔，酶标仪上以450nm波长测定OD值；显色液为TMB储存液：底物缓冲液﹕3％过氧化氢＝10﹕90﹕1；TMB储存液为1mg/mL TMB溶于DMSO；底物缓冲液为柠檬酸0.1M(pH5.0)、Na2HPO4 0.2M；中终止液为2M H2SO4。
7)结果判断：A样品/A阴性≥2.1为阳性。
结果：如图2及图6所示，检测FlgK蛋白抗原免疫小鼠产生的抗体IgG最高效价达1:262144；重组蛋白FlgK免疫小鼠对其几何平均滴度为1:110217.97，抗体阳性率达到100％，说明重组蛋白FlgK与铝佐剂免疫后能够诱导小鼠体内产生较高水平特异性抗体。
表2免疫小鼠血IgG几何平均滴度
(2)重组蛋白抗原FlgK与LTs63K佐剂联合滴鼻免疫小鼠
Balb/C小鼠，雌性，7-8周龄，购自江苏集萃药康生物科技股份有限公司，LTs63K自制(制备方法如文献：冯强.重组大肠杆菌不耐热肠毒素及其突变体以及其B亚单位的构建表达与性质研究.[D].重庆大学.2003)，制备结果如图5所示。动物分组如下表3所示：
表3FlgK与LTs63K佐剂联合免疫小鼠分组
重组蛋白抗原FlgK与LTs63K佐剂联合免疫小鼠过程包括以下步骤：
1)首次免疫，重组蛋白抗原FlgK和LTs63K佐剂混合后，利用混匀仪于4℃轻柔混匀30min，置于冰盒中免疫备用，吸取已配制的免疫原，缓慢滴于小鼠鼻腔小鼠：10μL/
侧，共20μL/鼠；
2)第二次免疫，第14天进行二次免疫，注射剂量与免疫方式同上；
3)第三次免疫，在第21天进行第三次免疫，注射剂量与免疫方式同上；
4)第四次免疫，在第28天进行第三次免疫，注射剂量与免疫方式同上。
第四次免疫后5天，用PBST(含0.05％吐温20的PBS)采集Balb/C小鼠阴道灌洗液，75μL/次，灌洗4次，300μL/鼠。采集后涡旋1min，然后于12000rpm离心3min取上清液用于Elisa检测FlgK特异性sIgA水平变化。
1)抗原包被：取包被液将FlgK纯化蛋白稀释至4μg/mL，然后按照100μL/孔包被酶标板，4℃过夜；包被液为50mM碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液pH9.6(15mM Na2CO3，35mM NaHCO3)。
2)封闭：封闭液300μL/孔，37℃孵育1h，PBST洗板后，于4℃保存备用；封闭液为10mM PBS(pH7.4)+1％BSA。
3)标本稀释：将血清从1:32开始进行系列倍比稀释至1:256。
4)加样：取包被好的酶标板，依次加入稀释血清，100μL/孔，每个样品做两个重复，37℃孵育1h，之后PBST洗涤4次；PBST洗液为10mM PBS(pH7.4)+0.05％ Tween-20；
5)加二抗：用抗体稀释液1:10000稀释HRP标记羊抗小鼠IgA(Abcam，货号：Ab97235)，100μL/孔，37℃孵育30min，PBST洗涤4次；抗体稀释液为10mM PBS(pH7.4)+0.05％Tween-20+0.5％BSA；
6)显色：加入底物显色液100μL/孔，37℃孵育10min后加入终止液50μL/孔，酶标仪上以450nm波长测定OD值；显色液为TMB储存液﹕底物缓冲液﹕3％过氧化氢＝10﹕90﹕1；TMB储存液为1mg/mL TMB溶于DMSO；底物缓冲液为柠檬酸0.1M(pH5.0)、Na2HPO4 0.2M；中终止液为2M H2SO。
7)结果判断：A样品/A阴性≥2.1为阳性。
结果：如表4及图7所示，检测重组蛋白抗原FlgK免疫小鼠产生的sIgA抗体效价达到1:256；FlgK免疫小鼠对重组蛋白抗原FlgK的几何平均滴度为132.51；免疫后抗体阳性率达到100％，说明重组蛋白抗原FlgK与佐剂LTs63K免疫后能够诱导小鼠产生较高水平的黏膜免疫应答。
表4FlgK免疫后小鼠阴道灌洗液sIgA几何平均滴度
实施例5：重组蛋白抗原FlgK免疫后攻毒保护力评价
对末次滴鼻免疫后10天的小鼠按照以下步骤进行重组蛋白抗原FlgK免疫后攻毒保护力评价：
(1)灌胃：在末次滴鼻免疫后10天进行口服灌胃幽门螺杆菌J99活菌进行攻毒实验，灌胃前24h断食，17h断水，每只小鼠感染剂量为2.0×107CFU，灌胃后2h恢复水食。
(2)平板培养：灌胃后一周宰杀小鼠取其胃组织剪碎后放入PBS缓冲液中，涡旋3min，然后将其洗涤原液与10倍稀释液涂布于含有5％脱纤维绵羊血(南京茂捷生物)与0.5％复合抗生素(万古霉素1.67mg/mL、多粘菌素0.0694mg/mL、甲氧苄啶0.5mg/mL、两性霉素B 0.2mg/m)Skirrow平板上(月示蛋白胨15g/L(海博生物)、胰蛋白胨2.5g/L(Oxoid)、酵母浸粉5g/L(Oxoid)、氯化钠5g/L(科隆试剂)，以去离子水为溶剂，pH7.4)，37℃微需氧(5％O2、10％CO2、85％N2)培养4d后观察。
(3)结合Hp菌落特征，快速尿素酶试剂以及镜检等方式来检测平板上是否存在阳性菌落，以此来确定小鼠是否成功感染Hp；其中，疫苗保护率＝(对照组感染阳性率-免疫组感染阳性率)/对照组感染阳性率*100％。
结果：对照组与实验组各20只小鼠平板培养情况统计如下表5，对照组20只小鼠中有17只平板培养检测均为阳性，感染率为85％，实验组小鼠20只小鼠中有2只小鼠平板培养阳性，感染率为10％，那么本疫苗的保护效率为88.2％。
因此，本发明制备的重组蛋白抗原FlgK具有良好的免疫原性，能够诱导小鼠产生较强的免疫应答，并且能有效抑制小鼠胃内的幽门螺杆菌定植。
表5小鼠免疫后Hp灌胃攻毒其感染阳性统计
小鼠编号 对照组 实验组 小鼠编号 对照组 实验组
1 + - 11 - -
2 + + 12 + -
3 + - 13 + -
4 + - 14 + -
5 + - 15 + +
6 + - 16 + -
7 + - 17 + -
8 - - 18 + -
9 + - 19 - -
10 + - 20 + -
注:“+”表示为快速尿素酶试剂与镜检均为阳性，“-”表示为快速尿素酶试剂与镜检阴性
由此可见，本发明制备的重组蛋白具有良好的免疫原性，能够诱导小鼠产生较强的免疫应答，并且能有效抑制小鼠胃内的幽门螺杆菌定殖。本发明提供的制备FlgK重组蛋白的方法，能够快速获得纯度高的目的蛋白，同时能够刺激机体产生免疫应答反应，有望作为疫苗成分，用于幽门螺杆菌的预防和治疗上。
本领域的普通技术人员将会意识到，这里所述的实施例是为了帮助读者理解本发明的原理，应被理解为本发明的保护范围并不局限于这样的特别陈述和实施例。本领域的普通技术人员可以根据本发明公开的这些技术启示做出各种不脱离本发明实质的其它各种具体变形和组合，这些变形和组合仍然在本发明的保护范围内。

Claims (9)

1.一种幽门螺杆菌重组蛋白抗原FlgK，其特征在于，氨基酸序列如SEQ NO:1所示。
2.一种编码权利要求1所述的幽门螺杆菌重组蛋白抗原FlgK的核酸，其特征在于，核酸序列如SEQ NO:2所示。
3.权利要求1所述的幽门螺杆菌重组蛋白抗原FlgK的制备方法，其特征在于，按照以下步骤制备得到：
a、质粒构建，原核表达
将核酸序列如SEQ ID NO:2所示的基因连接在表达载体中，构建质粒并转入宿主菌中进行诱导表达；
b、破菌、离心
收集表达后的菌体用pH为6.0-8.0的破菌液重悬混匀，高压均质破菌，低速离心，收集包涵体沉淀；
c、包涵体洗涤及溶解
经过步骤b收集的沉淀使用包涵体洗涤液及破菌液进行反复交替重悬清洗3次，再使用A液重悬洗涤包涵体，之后于2-8℃溶解过夜；所述A液pH值为6.0-8.0，其组成为：20-50 mMPB、0.1-0.5 M NaCl、10-50mM 咪唑、6-8 M 尿素，去离子水为溶剂；
d、Ni柱亲和层析
使用A液平衡层析柱，再将经过步骤c溶解后获得的上清液上样，之后使用A液和B液的混合液进行洗脱；所述A液pH值为6.0-8.0，其组成为：20-50 mM PB、0.1-0.5 M NaCl、10-50mM 咪唑、6-8 M 尿素，去离子水为溶剂；所述B液pH值为6.0-8.0，其组成为20-50 mM PB、0.1-0.5 M NaCl、0.5-1 M咪唑、6-8 M 尿素，去离子水为溶剂；
e、Q柱阴离子交换层析
使用C液平衡Q层析柱，再将经步骤d纯化的目的蛋白上样，之后依次使用D液复性、D液和E液的混合液进行洗脱，得到幽门螺杆菌疫苗重组蛋白抗原FlgK；所述Q柱阴离子交换层析柱填料为Q Sepharose High performance；所述C液pH值为6.0-8.0，其组成为10-30mMPB，0-10mM NaCl，6-8M尿素，去离子水为溶剂；所述D液pH值为6.0-8.0，其组成为10-30 mMPB，0-10 mM NaCl，0.1%-0.6%精氨酸，去离子水为溶剂；所述E液pH值为6.0-8.0，其组成为10-30 mM PB，0.5-1 M NaCl，0.1%-0.6%精氨酸，去离子水为溶剂。
4.根据权利要求3所述的幽门螺杆菌重组蛋白抗原FlgK的制备方法，其特征在于，步骤a中，所述表达载体为pET28a。
5.根据权利要求3或4所述的幽门螺杆菌重组蛋白抗原FlgK的制备方法，其特征在于，步骤a中，所述宿主菌为E. coli BL21 DE3。
6.根据权利要求5所述的幽门螺杆菌重组蛋白抗原FlgK的制备方法，其特征在于，步骤a中，所述诱导表达条件为温度16-37℃，转速180-220rpm，诱导表达采用浓度为0.1-0.5mM的异丙基硫代半乳糖苷。
7.根据权利要求3所述的幽门螺杆菌重组蛋白抗原FlgK的制备方法，其特征在于，步骤b中，所述破菌液为pH 6.0-8.0的20-50 mM PB，0.1-0.5 M NaCl的溶液，去离子水为溶剂；破菌条件为外循环温度-4-0℃、压力600-850 bar、4-6个循环；离心条件为2000-5000 rpm，10-30min。
8.根据权利要求3所述的幽门螺杆菌重组蛋白抗原FlgK的制备方法，其特征在于，步骤c中，所述包涵体洗涤液组成为：pH 6.0-8.0的20-50mM PB，0.1%-1% Triton X-100，1-5mMEDTA，0.1-0.5M NaCl。
9.权利要求1所述的幽门螺杆菌疫苗重组蛋白抗原FlgK在用于制备预防幽门螺杆菌感染疫苗中的用途。
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