KR20190061741A

KR20190061741A - 톨-유사 수용체3 리간드를 포함하는 나노복합체 기반 면역 자극 조성물, 및 이의 제조 방법

Info

Publication number: KR20190061741A
Application number: KR1020170160420A
Authority: KR
Inventors: 임용택
Original assignee: 성균관대학교산학협력단
Priority date: 2017-11-28
Filing date: 2017-11-28
Publication date: 2019-06-05

Abstract

나노복합체 기반 면역 자극 조성물, 및 상기 나노복합체 기반 면역 자극 조성물의 제조 방법에 관한 것이다.

Description

톨-유사 수용체3 리간드를 포함하는 나노복합체 기반 면역 자극 조성물, 및 이의 제조 방법{IMMUNOSTIMULATORY COMPOSTION BASED ON NANOCOMPOSITE CONTAINING TOLL-LIKE RECEPTOR 3 LIGAND, AND PREPARING METHOD OF THE SAME}

본원은, 나노복합체 기반 면역 자극 조성물, 및 상기 나노복합체 기반 면역 자극 조성물의 제조 방법에 관한 것이다.

현재 다양한 면역활성화 물질이 백신 면역증강제로 사용되고 있다. 상업화되어 널리 사용되고 있는 면역보조제인 알룸 (aluminum salt, Alum)이나 MF59 등은 체액성 면역반응의 향상을 유도하는데 효과적이지만, 강력한 세포성 면역 반응이 요구되는 항암이나 항바이러스 예방/치료와 관련된 활용 분야에는 효과적이지 못하다는 치명적인 단점이 있다. 세포성 면역증강에 사용되는 대표적인 면역활성화 물질로 다양한 톨유사 수용체(TLR)들이 이용되고 있다. 이러한 TLR 중에서, TLR3를 제외한 대부분의 TLR은 MyD88-dependent 신호전달 체계를 통하여, 면역반응 유도한다. 이중에서, TLR4는 MyD88-dependent 와 MyD88-independent 양 방향의 신호전달을 통하여 면역반응을 유도하는 것으로 알려져 있다. 한편, TLR3는 MyD88-independent 신호전달 체계를 통하여, pro-inflammatory cytokines이나 type I interferon등을 유도하는 것으로 알려져 있다. TLR3는 바이러스 복제과정에서 생성되는 dsRNA (double strand RNA)의 자극에 반응하며, dsRNA는 PKR (ds RNA activated protein kinase)와 접합하여 활성화를 유도하고 이때 발생하는 신호전달은 궁극적으로 바이러스의 증식억제와 염증성 사이토카인의 생성으로 이어진다. 하지만, 대표적인 TLR3 리간드인 Poly(I:C)는 음이온성 특성을 갖고 있어, 단독으로는 세포 내부의 엔도좀에 있는 TLR3와 반응하는 효율이 매우 낮다. 이 때문에 다양한 양이온성 물질과 결합된 형태로 사용되고 있다. 대표적인 예로, Poly-ICLC 는 Poly(I:C)와 Lysine과의 콤플렉스로 구성되어 사용되고 있다. 그럼에도 불구하고, Poly(I:C)기반 면역증강제는 MYD88-independent 신호전달 경로를 통하여 면역활성화를 유도하기 때문에, 다양한 면역신호전달체계를 통하여 면역기능을 조율하는 데는 여전히 한계점이 있다. 따라서, MyD88-dependent 신호전달체계를 갖는 다른 톨유사수용체 및 TLR 이외의 다른 신호전달체계를 통하여 면역반응을 유도하는 면역활성화 물질과의 조합을 통하여, 이러한 Poly(I:C)의 단점을 극복하는 것이 매우 중요하다. 이러한 조합된 면역활성화 약물을 제조할 때, 가장 문제가 되는 것은 어떠한 제형기술을 이용하여, Poly(I:C)와 다른 면역활성화 물질을 조합해야 하는 것이다. 예를 들어, TLR4와 작용하는 MPLA와 같이 리피드 성분인 물질, TLR5와 작용하는 플라겔렌 단백질, QS21과 같은 양친성 물질, TLR1 또는 TLR2와 반응하는 펩타이드 등의 물질을 Poly(I:C)와 어떻게 결합시키느냐 하는 것이 중요한 문제이다. 더구나, 조합된 면역활성화 물질들은 세포내부로 효과적으로 전달되어야 면역활성화 반응을 유도할 수 있기 때문에, 세포내 전달효율(intracellular delivery)을 높일 수 있는 제형이어야 한다.

대한민국 등록특허 제10-1591927호는, 고분자 나노입자 기반의 암 백신 조성물에 대해 개시하고 있다.

본원은, 톨-유사 수용체3 리간드를 포함하는 나노복합체 기반 면역 자극 조성물, 및 상기 나노복합체 기반 면역 자극 조성물의 제조 방법을 제공하고자 한다.

그러나, 본원이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본원의 제 1 측면은, 톨-유사 수용체3 리간드를 포함하는 나노복합체로서, 양이온성 지질 및 면역활성화 물질을 추가 포함하는 것인, 면역 자극 조성물을 제공한다.

본원의 제 2 측면은, 양이온성 지질 및 면역활성화 물질을 제 1 용매에 용해하는 것; 상기 제 1 용매를 증발시켜 지질 막을 형성하는 것; 및 음이온성 톨-유사 수용체3 리간드를 함유하는 제 2 용매에 상기 지질 막을 용해함으로써, 나노복합체를 포함하는 면역 자극 조성물을 제조하는 것을 포함하는, 면역 자극 조성물의 제조 방법을 제공한다.

본원의 일 구현예에 따르면, Poly(I:C)와 1 개 이상의 다른 면역활성화 물질을, 나노리포좀 또는 나노에멀젼 제형으로 용이하게 조합할 수 있으며, 음이온성 특성을 보이는 Poly(I:C)는 양이온성 지질을 이용하여 나노리포좀 또는 나노에멀젼 형태의 면역 자극 조성물을 제조할 수 있다 (도 1).

본원의 일 구현예에 따르면, MyD88-independent 신호전달을 통하여 면역활성화 작용을 나타내는 Poly(I:C)는 MyD88-dependent 신호전달체계를 갖는 다른 톨-유사 수용체 및 TLR 이외의 다른 신호전달체계를 통하여 면역반응을 유도하는 면역활성화 물질과의 조합을 통하여, 면역활성화 효과를 극대화 할 수 있다 (도 2).

본원의 일 구현예에 따른 면역 자극 조성물은, 나노리포좀 또는 나노에멀젼을 기반으로 하여 제조됨으로써, 난용성 지질 성분의 면역활성화 물질인 TLR4 리간드 또는 T 세포의 활성을 증가시키는 역할을 할 수 있는 면역활성화 물질인 톨-유사 수용체3 리간드를 용이하게 조합할 수 있다.

상기 Poly(I:C)는 나노리포좀 또는 나노에멀젼 형태의 제형으로 제조됨으로써, 파고사이토시스 기능이 있는 면역세포 내부로의 효율을 높임으로써, 세포 내부 엔도좀에 위치한 TLR3과의 상호 작용을 최대화할 수 있다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 면역 자극 조성물은 항원(antigen)과 함께 처리되었을 때, 체액성 면역 및 세포성 면역을 동시에 향상시킬 수 있다.

본원의 일 구현예에 따른 면역 자극 조성물은, 면역 치료에서 중요한 역할을 담당하는 T 세포의 활성화를 효과적으로 유도하며, 암의 예방과 치료 모델에 적용될 경우 치료 효능이 현저하게 향상될 수 있다.

도 1은, 본원의 일 구현예에 있어서, 톨-유사 수용체3 리간드와 1 개 이상의 추가적인 면역활성화 물질을 포함하는 나노복합체기반 면역 자극 조성물의 구조를 나타낸다.
도 2는, 본원의 일 구현예에 있어서, 톨-유사 수용체3 리간드와 1 개 이상의 추가적인 면역활성화 물질을 포함하는 나노복합체기반 면역 자극 조성물의 면역활성화 메커니즘을 나타낸다.
도 3은, 본원의 일 구현예에 있어서, 본원의 일 실시예에 있어서, 폴리아이씨, 엠피엘에이 및 양이온성 지질로 구성된 나노리포좀기반 면역활성화 물질의 전자현미경 사진(TEM)을 나타낸다.
도 4는, 본원의 일 구현예에 있어서, 폴리아이씨, 엠피엘에이, 스쿠알렌 및 양이온성 지질로 구성된 나노에멀젼기반 면역활성화 물질의 구조를 나타낸다.
도 5는, 본원의 일 실시예에 있어서, 면역 자극 조성물의 HA (hemaglutinin) 바이러스 항원에 대한 체액성 면역 효과를 나타내는 그래프이다.
도 6은, 본원의 일 실시예에 있어서, 면역 자극 조성물의 OVA (ovalbumin) 암 항원에 대한 체액성 면역 효과를 나타내는 그래프이다.
도 7은, 본원의 일 실시예에 있어서, 면역 자극 조성물의 OVA (ovalbumin) 암 항원에 대한 세포성 면역 유도 효과를 나타내는 그래프이다.

아래에서는 첨부한 도면을 참조하여 본원이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본원의 실시예를 상세히 설명한다. 그러나 본원은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다. 그리고 도면에서 본원을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였으며, 명세서 전체를 통하여 유사한 부분에 대해서는 유사한 도면 부호를 붙였다.

본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 다른 부분과 “연결”되어 있다고 할 때, 이는 “직접적으로 연결”되어 있는 경우뿐 아니라, 그 중간에 다른 소자를 사이에 두고 “전기적으로 연결”되어 있는 경우도 포함한다.

본원 명세서 전체에서, 어떤 부재가 다른 부재 “상에” 위치하고 있다고 할 때, 이는 어떤 부재가 다른 부재에 접해 있는 경우뿐 아니라 두 부재 사이에 또 다른 부재가 존재하는 경우도 포함한다.

본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 “포함” 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다. 본원 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 “약”, “실질적으로” 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본원의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다. 본원 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 “~(하는) 단계” 또는 “~의 단계”는 “~ 를 위한 단계”를 의미하지 않는다.

본원 명세서 전체에서, 마쿠시 형식의 표현에 포함된 “이들의 조합(들)”의 용어는 마쿠시 형식의 표현에 기재된 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 혼합 또는 조합을 의미하는 것으로서, 상기 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 의미한다.

본원 명세서 전체에서, “A 및/또는 B”의 기재는 “A 또는 B, 또는 A 및 B”를 의미한다.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본원의 구현예 및 실시예를 상세히 설명한다. 그러나, 본원이 이러한 구현예 및 실시예와 도면에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 나노복합체는 면역활성화 물질을 추가 포함할 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 나노복합체는 양이온성 지질; 음이온성 톨-유사 수용체3 리간드; 및 면역활성화 물질을 포함하는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 음이온성 톨-유사 수용체3 리간드는, 양이온성 나타내는 지질과 결합하여 이온성 나노복합체를 형성할 수 있으며, 면역활성화 물질을 추가 포함함에 따라 T 세포의 활성화를 유도할 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 나노복합체는 직경이 약 70 nm 내지 500 nm 크기를 갖는 나노리포좀 또는 나노에멀젼 형태를 포함하는 것인,

상기 나노복합체는 나노리포좀 또는 나노에멀젼 형태를 포함함으로써, 체내 투여 시, 나노리포좀 및 나노에멀젼에서 면역활성화 물질이 방출되는 시간이 길어짐으로써, 상기 면역활성화 물질의 유효 지속시간이 증가시킬 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 양이온성 지질에 의하여 상기 나노복합체가 나노리포좀 또는 나노에멀젼 형태로 제조되는 것일 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 양이온성 지질에 의하여, 음이온성인 세포막과의 정전기적 인력이 유도되어, 상기 항원 및/또는 면역활성화 물질의 세포 내 전달 효율이 더 향상될 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 양이온성 지질은 DC-콜레스테롤 (3β-[N-(N',N'-dimethylaminoethane)-carbamoyl]cholesterol hydrochloride), DDA (dimethyldioctadecylammonium), DDAB(dimethyldioctadecylammonium bromide), DOTAP (1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane), DOTMA (1,2-di-O-octadecenyl-3-trimethylammonium propane), EPC (1,2-dimyristoleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine), MVL5 (N1-[2-((1S)-1-[(3-aminopropyl)amino]-4-[di(3-amino-propyl)amino]butylcarboxamido)ethyl]-3,4-di[oleyloxy]-benzamide), DODAP (lipids1,2-dioleoyl-3-dimethylammonium-propane), 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 물질을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 음이온성 톨-유사 수용체3 리간드는 폴리아이시 [poly(I:C)] 계열, 폴리에이유 [poly(A:U)], 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 물질을 포함하는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 폴리아이시 계열은 poly(I:C) (polyinosinic:polycytidylic acid), poly-ICLC [poly(I:C) stabilized with polylysine and carboxymethyl cellulose], poly(IC12U), 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 물질을 포함하는 것일 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 면역활성화 물질은 스트레스를 받은 암세포에서 발현되는 면역활성화 물질, 예를 들어 열-충격 단백질(heat-shock protein)일 수 있으며, 또는 T 세포의 활성화를 유도하는 물질일 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 면역활성화 물질은 톨-유사 수용체 아고니스트(toll-like receptor agonist), 사포닌, 항바이러스성 펩티드, 인플라머좀 인듀서(inflammasome inducer), NOD 리간드(NOD ligand), CDS 리간드(cytosolic DNA sensor ligand), STING(stimulator of interferon genes) 리간드, 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 물질을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 톨-유사 수용체 아고니스트는 천연 톨-유사 수용체 아고니스트 또는 합성 톨-유사 수용체 아고니스트일 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 톨-유사 수용체 아고니스트는 TLR-1을 통해 신호전달 반응을 야기시킬 수 있는 것일 수 있으며, 예를 들어, 트리-아실화된 지질펩티드(LP); 페놀-가용성 모듈린(modulin); 코박테리움튜베르쿨로시스(Mycobacteriumtuberculosis) 지질펩티드; S-(2,3-비스(팔미토일옥시)-(2-RS)-프로필)-N-팔미토일-(R)-Cys-(S)-Ser-(S)-Lys(4)-OH; 보렐리아 부르그도르페이(Borrelia burgdorfei)로부터의 박테리아 지질펩티드; OspA 지질펩티드의 아세틸화된 아미노 말단을 모방하는 트리히드로클로라이드(Pam3Cys) 지질펩티드; 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 물질을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 톨-유사 수용체 아고니스트는 TLR-2 아고니스트를 포함하는 것일 수 있으며, 예를 들어, Pam3Cys-Lip을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 톨 유사 아고니스트는 TLR-7 아고니스트 또는 TLR-8 아고니스트를 포함하는 것일 수 있으며, 예를 들어, 이미퀴모드, R837, 레스퀴모드, 또는 R848와 같은 이미다조퀴놀린 분자; VTX-2337; CRX642; 인지질 기 또는 포스포노지질 기에 공유적으로 결합된 이미다조퀴놀린; 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 물질을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 사포닌은 QS21, Quil A, QS7, QS17, β-에스킨, 디지토닌 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 항바이러스성 펩티드는 케이엘케이(KLK) 를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 인플러머좀 인듀서는 TDB(trehalose-6,6-dibehenate)일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 NOD 리간드는 M-TriLYS(NOD2 아고니스트-합성 무라밀 트리펩티드) 또는 NOD2 아고니스트(N-glycolylated muramyldipeptid)일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 CDS 리간드는 Poly(dA:dT)일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 STING 리간드는 cGAMP, di-AMP, 또는 di-GMP 일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 면역활성화 물질은 하나 또는 둘 이상의 톨-유사 수용체 아고니스트의 조합을 포함할 수 있으며, 예를 들어, CL401(듀얼 TLR2 및 TLR7 아고니스트)또는 CL429(듀얼 TLR2 및 NOD2 아고니스트)를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 톨 유사 아고니스트는 TLR-4 아고니스트를 포함하는 것일 수 있으며, 예를 들어, 시겔라 플렉시네리(Shigella flexineri) 외막 단백질 제조물, AGP, CRX-527, MPLA, PHAD, 3D-PHAD, GLA, 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 물질을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 면역 자극 조성물은 항원과 함께 투여될 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 항원은 단백질, 세포, 바이러스, 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 단백질은 오버알부민, 재조합 단백질, 서브유닛 (subunit), 스플릿 (split) 단백질 항원을 포함할 수 있으며, 상기 세포는, 예를 들어, 수지상 세포, T 세포를 포함할 수 있으며, 상기 바이러스는, 예를 들어, 인플루엔자, HBV (hepatitis B virus), HAV (hepatitis A virus), HPV (human papilloma virus)를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 일 구현에에 있어서, 상기 항원은 약독화된 살아있는 완전체 미생물, 불활성 미생물, 파열 미생물, 병원체의 단백질, 재조합 단백질, 당단백질, 펩티드, 다당류, 지질다당류, 리포펩티드, 폴리뉴클레오티드, 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 항원은 인플루엔자 유래 항원 또는 암세포 유래 항원을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 피내 투여용 면역 자극 조성물은 하나 이상의 항원을 포함함으로써 체내에서 다중 면역 반응을 유도될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 암세포는 암세포 주 (cell line)를 이용하여 수득되거나, 체내에 존재하는 암 조직 (tumor tissue)으로부터 분리되는 것일 수 있다. 또한, 실제 암 조직에서 항암제나 방사선을 가함으로써 세포 내 스트레스와 관련된 단백질의 생성을 유도한 후에, 암세포를 용해함으로써 제조되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 암세포는 폐, 결장, 중추신경계, 피부, 난소, 신장, 유방, 위, 또는 대장의 암세포를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 제 2 측면에 따른 제조 방법에 대하여, 본원의 제 1측면과 중복되는 부분들에 대해서는 상세한 설명을 생략하였으나, 그 설명이 생략되었더라도 본원의 제 1 측면에 기재된 내용은 본원의 제 2 측면에 동일하게 적용될 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 면역 자극 조성물은 양이온성 지질 및 음이온성 톨-유사 수용체3 (TLR3) 리간드를 포함하는, 나노복합체를 포함할 수 있으며, 상기 나노복합체는, 면역활성화 물질을 추가 포함하는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 음이온성 톨-유사 수용체3 리간드는, 양이온성 나타내는 지질과 결합하여 이온성 나노복합체를 형성할 수 있으며, 면역활성화 물질을 추가 포함함에 따라 T 세포의 활성화를 유도할 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 제 1 용액과 상기 음이온성 톨-유사 수용체3 리간드-함유 용액을 혼합하는 것은 면역활성화 물질을 혼합하는 것을 추가 포함할 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 나노복합체는 나노리포좀 또는 나노에멀젼 형태를 포함하는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 나노복합체는 나노리포좀 또는 나노에멀젼 형태를 포함함으로써, 체내 투여 시 상기 면역활성화 물질의 유효 지속시간이 증가시킬 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 양이온성 지질은 DC-콜레스테롤 (3β-[N-(N',N'-dimethylaminoethane)-carbamoyl]cholesterol hydrochloride), DDA (dimethyldioctadecylammonium), DOTAP (1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane), DOTMA (1,2-di-O-octadecenyl-3-trimethylammonium propane), EPC (1,2-dimyristoleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine), MVL5 (N1-[2-((1S)-1-[(3-aminopropyl)amino]-4-[di(3-amino-propyl)amino]butylcarboxamido)ethyl]-3,4-di[oleyloxy]-benzamide), DODAP (lipids1,2-dioleoyl-3-dimethylammonium-propane), 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 물질을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 음이온성 톨-유사 수용체3 리간드는 폴리아이시 계열, 씨피지 올리고뉴클레오티드, 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 물질을 포함하는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 폴리아이시 계열은 poly(I:C) (polyinosinic:polycytidylic acid), poly-ICLC [poly(I:C) stabilized with polylysine and carboxymethyl cellulose], poly(IC12U), 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 물질을 포함하는 것일 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 면역활성화 물질은 톨-유사 수용체 아고니스트(toll-like receptor agonist, TLR), 사포닌, 항바이러스성 펩티드, 인플라머좀 인듀서(inflammasome inducer), NOD 리간드(NOD ligand), CDS 리간드(cytosolic DNA sensor ligand), STING(stimulator of interferon genes) 리간드, 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 물질을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

이하, 본원의 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 하나, 하기의 실시예는 본원의 이해를 돕기 위하여 예시하는 것 일뿐, 본원의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1. DDA + MPLA + Poly(I:C) 나노리포좀 (nanoliposome) 제조 및 특성화

DOPC (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 1 mg/mL, 시그마알드리치, 미국), DDA (dimethyldioctadecylammonium bromide, 1 mg/mL, 시그마알드리치, 미국), 콜레스테롤 (Cholesterol 0.25 mg/mL, 시그마알드리치, 미국), MPLA [monophosphoryl lipid a, 0.2 mg/mL, 아반띠 폴라 리피드(avanti polar lipids, 미국)]을 에탄올 (ethanol) 1 mL에 용해시켰다. 상기 용액을 둥근 플라스크에 옮긴 뒤, 회전농축기 (rotary evaporator)를 이용하여 상기 에탄올을 완전히 증발시키면 얇은 지질 막 (thin-film) 형태가 만들어진다. 그런 다음, 인산 완충 용액 (PBS, 0.0067 M PO₄) 2 mL을 넣은 뒤에 교반기 (stirrer)를 이용하여서 60℃에서 30분 동안 600 rpm 속도로 상기 지질 (lipid)을 용액에 분산시켰다. 분산시킨 상기 용액을 4 mL 유리병 (vial)에 옮긴 뒤, 초음파 분산기 (tip sonicator)를 이용하여서 1 분 동안 인산 완충 용액에 지질이 완전하게 분산되도록 풀어주었다. 그런 다음, 회전기 (tube revolve)를 사용하여 2 시간 정도 교반 후에 사용 전까지 4℃ 냉장고에 보관하였다. 마지막으로, Poly(I:C) (polyinosinic: polycytidylic acid, 2 mg/mL. 인비보젠, 미국)를 인산 완충 용액 (0.0067 M PO₄)을 녹인 후에 나노리포좀과 1:1 부피 비율로 섞어주어, 2 시간 정도 교반 후에 사용 전까지 4℃ 냉장고에 보관하였다. 제조된 나노리포좀의 크기와 표면전하를 DLS와 전자현미경 (도 3)을 이용하여 측정 하였다.

실시예 2. DDA + MPLA + QS21 + Poly(I:C) 나노리포좀 제조 및 특성화

DOPC (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 1 mg/mL, 시그마알드리치, 미국), DDA (dimethyldioctadecylammonium bromide, 1 mg/mL, 시그마알드리치, 미국), 콜레스테롤 (0.25 mg/mL, 시그마알드리치, 미국), MPLA [0.2 mg/mL, 아반띠 폴라 리피드(avanti polar lipids, 미국)], QS21 (QS21, 0.2 mg/mL)을 에탄올 1 mL에 용해시켰다. 상기 용액을 둥근 플라스크에 옮긴 뒤, 회전농축기를 이용하여 상기 에탄올을 완전히 증발시켜 얇은 지질 막 형태를 형성하였다. 그런 다음, 인산 완충 용액 (0.0067 M PO4) 2 mL을 넣은 뒤에 교반기를 이용하여 60℃에서 30 분 동안 600 rpm 속도로 상기 지질을 용액에 분산시켰다. 그 후 용액을 4 mL 유리병에 옮긴 뒤, 초음파 분산기를 이용하여 1 분 동안 인산 완충 용액에 지질이 완전하게 분산되도록 풀어주었다. 그런 다음, 회전기를 사용하여 2 시간 정도 교반 후에 사용 전까지 4℃ 냉장고에 보관하였다. 마지막으로, Poly(I:C) (2 mg/mL. 인비보젠, 미국)을 인산 완충 용액 (0.0067 M PO₄)을 녹인 후에 나노리포좀과 1:1 부피 비율로 섞어주어 2 시간 정도 교반 후에, 사용 전까지 4℃ 냉장고에 보관하였다.

실시예 3. DDA + Pam3Cys-Lip + QS21+ Poly-ICLC 나노리포좀 제조 및 특성화

DOPC (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 1 mg/mL, 시그마알드리치, 미국), DDA (dimethyldioctadecylammonium bromide, 1 mg/mL, 시그마알드리치, 미국), 콜레스테롤 (0.25 mg/mL, 시그마알드리치, 미국), Pam3Cys-Lip (0.2 mg/mL, InvivoGen, 미국), QS21 (QS21, 0.2 mg/mL)을 에탄올 1 mL에 용해시켰다. 상기 용액을 둥근 플라스크에 옮긴 뒤, 회전농축기를 이용하여서 에탄올을 완전히 증발시켜 얇은 지질 막 형태를 형성하였다. 그런 다음, 인산 완충 용액 (0.0067 M PO₄) 2 mL을 넣은 뒤에 교반기를 이용하여서 60℃에서 30 분 동안 600 rpm 속도로 지질을 용액에 분산시켰다. 상기 용액을 4 mL 유리병에 옮긴 뒤, 초음파 분산기를 이용하여 1 분 동안 인산 완충 용액에 지질이 완전하게 분산되도록 풀어주었다. 그런 다음, 회전기를 사용하여 2 시간 정도 교반 후, 사용 전까지 4℃ 냉장고에 보관하였다. 마지막으로, Poly-ICLC [Poly(I:C) stabilized with polylysine and carboxymethyl cellulose, 2 mg/mL, Oncovir, Washington, USA]을 인산 완충 용액 (0.0067 M PO₄)을 녹인 후에 나노리포좀과 1:1 부피 비율로 섞어주어 2 시간 정도 교반 후, 사용 전까지 4℃ 냉장고에 보관하였다.

실시예 4. DDA + STING (cyclic DNA) + Poly(I:C) 나노리포좀 제조 및 특성화

DOPC (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 1 mg/mL, 시그마알드리치, 미국), DDA (dimethyldioctadecylammonium bromide, 1 mg/mL, 시그마알드리치, 미국), 콜레스테롤 (0.25 mg/mL, 시그마알드리치, 미국)을 에탄올 1 mL에 용해시켰다. 용액을 둥근 플라스크에 옮긴 뒤, 회전농축기를 이용하여 에탄올을 완전히 증발시켜 얇은 지질 막 형태를 형성하였다. 그런 다음, 인산 완충 용액 (0.0067 M PO₄) 2 mL을 넣은 뒤 교반기를 이용하여 60℃에서 30 분 동안 600 rpm 속도로 지질을 용액에 분산시켰다. 상기 용액을 4 mL 유리병에 옮긴 뒤에 초음파 분산기를 이용하여 1 분 동안 인산 완충 용액에 지질이 완전하게 분산되도록 풀어주었다. 그런 다음, 회전기를 사용하여 2 시간 정도 교반 후, 사용 전까지 4℃ 냉장고에 보관하였다. 마지막으로, Poly(I:C) (2 mg/mL. 인비보젠, 미국), c-di-AMP (2 mg, Invivo Gen, 샌디에고, 미국)를 인산 완충 용액 (0.0067 M PO₄)을 녹인 후에 나노리포좀과 1:1:1 부피 비율로 섞어주어 2 시간 정도 교반 후, 사용 전까지 4℃ 냉장고에 보관하였다.

실시예 5. DDA + Pam3CSK4 + Poly(I:C) 나노리포좀 제조 및 특성화

DOPC (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 1 mg/mL, 시그마알드리치, 미국), DDA (dimethyldioctadecylammonium bromide, 1 mg/mL, 시그마알드리치, 미국), 콜레스테롤 (0.25 mg/mL, 시그마알드리치, 미국)을 에탄올 1 mL에 용해시켰다. 용액을 둥근 플라스크에 옮긴 뒤 회전농축기를 이용하여 에탄올을 완전히 증발시켜 얇은 지질 막 형태를 형성하였다. 그런 다음, 인산 완충 용액 (0.0067 M PO₄) 2 mL을 넣은 뒤에 교반기를 이용하여서 60℃에서 30 분 동안 600 rpm 속도로 지질을 용액에 분산시켰다. 용액을 4 mL 유리병에 옮긴 뒤에 초음파 분산기를 이용하여 1 분 동안 인산 완충 용액에 지질이 완전하게 분산되도록 풀어준다. 그런 다음, 회전기를 사용하여 2 시간 정도 교반 후, 사용 전까지 4℃ 냉장고에 보관하였다. 마지막으로, Poly(I:C) (2 mg/mL. 인비보젠, 미국), Pam3CSK4 (2 mg, Invivo Gen, 샌디에고, 미국)를 인산 완충 용액 (0.0067 M PO₄)을 녹인 후에 나노리포좀과 1:1:1 부피 비율로 섞어주어 2 시간 정도 교반 후, 사용 전까지 4℃ 냉장고에 보관하였다.

실시예 6. DDA + CL401 + Poly(I:C) 나노리포좀 제조 및 특성화

DOPC (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 1 mg/mL, 시그마알드리치, 미국), DDA (dimethyldioctadecylammonium bromide, 1 mg/mL, 시그마알드리치, 미국), 콜레스테롤 (0.25 mg/mL, 시그마알드리치, 미국)을 에탄올 1 mL에 용해시켰다. 용액을 둥근 플라스크에 옮긴 뒤 회전농축기를 이용하여 에탄올을 완전히 증발시켜 얇은 지질 막 형태를 형성하였다. 그런 다음, 인산 완충 용액 (0.0067 M PO₄) 2 mL을 넣은 뒤에 교반기를 이용하여서 60℃에서 30 분 동안 600 rpm 속도로 지질을 용액에 분산시켰다. 용액을 4 mL 유리병에 옮긴 뒤에 초음파 분산기를 이용하여 1 분 동안 인산 완충 용액에 지질이 완전하게 분산되도록 풀어준다. 그런 다음, 회전기를 사용하여 2 시간 정도 교반 후, 사용 전까지 4℃ 냉장고에 보관하였다. 마지막으로, Poly(I:C) (2 mg/mL. 인비보젠, 미국), CL401 (2 mg, Invivo Gen, 샌디에고, 미국)를 인산 완충 용액 (0.0067 M PO₄)을 녹인 후에 나노리포좀과 1:1:1 부피 비율로 섞어주어 2 시간 정도 교반 후, 사용 전까지 4℃ 냉장고에 보관하였다.

실시예 7. DDA + CL429 + Poly(I:C) 나노리포좀 제조 및 특성화

DOPC (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 1 mg/mL, 시그마알드리치, 미국), DDA (dimethyldioctadecylammonium bromide, 1 mg/mL, 시그마알드리치, 미국), 콜레스테롤 (0.25 mg/mL, 시그마알드리치, 미국)을 에탄올 1 mL에 용해시켰다. 용액을 둥근 플라스크에 옮긴 뒤 회전농축기를 이용하여 에탄올을 완전히 증발시켜 얇은 지질 막 형태를 형성하였다. 그런 다음, 인산 완충 용액 (0.0067 M PO₄) 2 mL을 넣은 뒤에 교반기를 이용하여서 60℃에서 30 분 동안 600 rpm 속도로 지질을 용액에 분산시켰다. 용액을 4 mL 유리병에 옮긴 뒤에 초음파 분산기를 이용하여 1 분 동안 인산 완충 용액에 지질이 완전하게 분산되도록 풀어준다. 그런 다음, 회전기를 사용하여 2 시간 정도 교반 후, 사용 전까지 4℃ 냉장고에 보관하였다. 마지막으로, Poly(I:C) (2 mg/mL. 인비보젠, 미국), CL429 (2 mg, Invivo Gen, 샌디에고, 미국)를 인산 완충 용액 (0.0067 M PO₄)을 녹인 후에 나노리포좀과 1:1:1 부피 비율로 섞어주어 2 시간 정도 교반 후, 사용 전까지 4℃ 냉장고에 보관하였다.

실시예 8. DDA + MPLA + Poly(I:C) 나노에멀젼 제조 및 특성화

DOPC (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 1 mg/mL, 시그마알드리치, 미국), DDA (dimethyldioctadecylammonium bromide, 1 mg/mL, 시그마알드리치, 미국), 콜레스테롤 (0.25 mg/mL, 시그마알드리치, 미국), MPLA [0.2 mg/mL, 아반띠 폴라 리피드(avanti polar lipids, 미국)]을 에탄올 1 mL에 용해시켰다. 용액을 둥근 플라스크에 옮긴 뒤 회전농축기를 이용하여 에탄올을 완전히 증발시켜 얇은 지질 막 형태를 형성하였다. 그런 다음, 스쿠알렌 (squalene, 2.5% v/v, 시그마알드리치, 미국)과 Tween (1% v/v)이 포함된 인산 완충 용액 (0.0067 M PO4) 2 mL을 넣은 뒤에 교반기를 이용하여서 60℃에서 30 분 동안 600 rpm 속도로 지질을 용액에 분산시켰다 용액을 4 mL 유리병에 옮긴 뒤에 초음파 분산기를 이용하여 1 분 동안 인산 완충 용액에 지질이 완전하게 분산되도록 풀어준다. 그런 다음, 회전기를 사용하여 2 시간 정도 교반 후, 사용 전까지 4℃ 냉장고에 보관하였다. 마지막으로, Poly(I:C) (2 mg/mL. 인비보젠, 미국)를 인산 완충 용액 (0.0067 M PO₄)을 녹인 후에 에멀젼 (emulsion)과 1:1 부피 비율로 섞어주어 2 시간 정도 교반 후, 사용 전까지 4℃ 냉장고에 보관하였다. 이렇게 제조된 나노에멸젼 면역활성화 조성물의 구조는 도 4와 같다.

실시예 9. DDA + Pam3Cys-Lip + Poly(I:C) 나노에멀젼 제조 및 특성화

DOPC (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 1 mg/mL, 시그마알드리치, 미국), DDA (dimethyldioctadecylammonium bromide, 1 mg/mL, 시그마알드리치, 미국), 콜레스테롤 (0.25 mg/mL, 시그마알드리치, 미국), Pam3Cys-Lip (0.2 mg/mL, InvivoGen, 미국)을 에탄올 1 mL에 용해시켰다. 용액을 둥근 플라스크에 옮긴 뒤 회전농축기를 이용하여 에탄올을 완전히 증발시켜 얇은 지질 막 형태를 형성하였다. 그런 다음, 스쿠알렌 (squalene, 2.5% v/v, 시그마알드리치, 미국)과 Tween (1% v/v)이 포함된 인산 완충 용액 (0.0067 M PO₄) 2 mL을 넣은 뒤에 교반기를 이용하여서 60℃에서 30 분 동안 600 rpm 속도로 지질을 용액에 분산시켰다. 용액을 4 mL 유리병에 옮긴 뒤에 초음파 분산기를 이용하여 1 분 동안 인산 완충 용액에 지질이 완전하게 분산되도록 풀어준다. 그런 다음, 회전기를 사용하여 2 시간 정도 교반 후, 사용 전까지 4℃ 냉장고에 보관하였다. 마지막으로, Poly(I:C) (2 mg/mL. 인비보젠, 미국)를 인산 완충 용액 (0.0067 M PO₄)을 녹인 후에 에멀젼 (emulsion)과 1:1 부피 비율로 섞어주어 2 시간 정도 교반 후, 사용 전까지 4℃ 냉장고에 보관하였다.

실시예 10. DDA + STING + Poly(I:C) 나노에멀젼 제조 및 특성화

DOPC (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 1 mg/mL, 시그마알드리치, 미국), DDA (dimethyldioctadecylammonium bromide, 1 mg/mL, 시그마알드리치, 미국), 콜레스테롤 (0.25 mg/mL, 시그마알드리치, 미국), Pam3Cys-Lip (0.2 mg/mL, InvivoGen, 미국)을 에탄올 1 mL에 용해시켰다. 용액을 둥근 플라스크에 옮긴 뒤 회전농축기를 이용하여 에탄올을 완전히 증발시켜 얇은 지질 막 형태를 형성하였다. 그런 다음, 스쿠알렌 (squalene, 2.5% v/v, 시그마알드리치, 미국)과 Tween (1% v/v)이 포함된 인산 완충 용액 (0.0067 M PO₄) 2 mL을 넣은 뒤에 교반기를 이용하여서 60℃에서 30 분 동안 600 rpm 속도로 지질을 용액에 분산시켰다. 용액을 4 mL 유리병에 옮긴 뒤에 초음파 분산기를 이용하여 1 분 동안 인산 완충 용액에 지질이 완전하게 분산되도록 풀어준다. 그런 다음, 회전기를 사용하여 2 시간 정도 교반 후, 사용 전까지 4℃ 냉장고에 보관하였다. 마지막으로, Poly(I:C) (2 mg/mL. 인비보젠, 미국), c-di-AMP (2 mg, Invivo Gen, 샌디에고, 미국)를 인산 완충 용액 (0.0067 M PO₄)을 녹인 후에 에멀젼 (emulsion)과 1:1 부피 비율로 섞어주어 2 시간 정도 교반 후, 사용 전까지 4℃ 냉장고에 보관하였다.

실시예 11. 바이러스에 대한 면역효과 검증

상기 실시예 1-10에서 제조된 면역 자극 조성물들의 조류 인플루엔자 바이러스에 대한 특이적 면역 효과를 조사하기 위하여, 항체 특이적인 면역 반응 중, 특히 항체 생산과 관련이 있는 B 세포에 의한 체액성 면역 반응에 미치는 영향을 조사하였다. 첫 번째 근육 주사 후, 각 1 주마다 마우스 혈청을 채취하여 혈청 중의 HA (hemagglutinin) 단백질에 대한 항체 역가 (titer)를 ELISA (enzyme linked immunosorbent assay)법으로 측정하였다. 상기 ELISA법은 HA 단백질이 코팅된 플레이트를 PBS/3% BSA (bovine serum albumin)를 사용하여 블록킹한 후, 대조 실험군 혈청을 다양한 일련의 희석율에서 인큐베이션 하였다. 그 후, 호스 래디쉬 퍼옥사이드 (horseradish peroxide)가 부착된 마우스 IgG를 첨가하였다. 상기 모든 인큐베이션은 37℃에서 1 시간 동안 수행하였으며, 언급된 각각의 단계 후에는 PBS/0.05 % Tween 20을 사용하여 3회 세척하였다. 기질로는 TMB (tetramethylbenzidine, BD biosciences, USA) 100 μL를 첨가하여 반응을 전개시킨 후, 450 nm에서 흡광도를 ELISA 판독기로 측정하고 그 결과를 도 5에 나타냈다.

실시예 12. 나노리포좀 및 나노에멀젼의 OVA 특이 항체 생성 확인

상기 실시예 1-10에서 제조된 면역 자극 조성물들의 OVA 항원에 대하여 특이적 면역 증진 효과를 나타내는지 조사하기 위하여, 항체 특이적인 면역 반응 중, 특이 항체 생산과 관련이 있는 B 세포에 의한 체액성 면역 반응에 미치는 영향을 조사하였다. 먼저, 대조군으로 OVA (20 ㎍)를 C57BL/6 마우스에 근육 주사 하였고, 실험군으로서 나노리포좀 및 나노에멀젼과 OVA (20 ㎍)을 섞어서 근육 주사로 투여하였다. 1 주에 한 번씩 3 회 근육주사 투여 후, 4 주째에 마우스 혈청을 채취하여 혈청 중 각각의 OVA에 대한 항체 역가를 ELISA법으로 측정하였다. 상기 ELISA법은 OVA (1 ㎍/mL)가 코팅된 플레이트를 PBS/3% BSA를 블록킹한 후, 대조군과 실험군 혈청을 다양한 일련의 희석율로 37℃에서 배양하였다. 그 후 호스 래디쉬 퍼옥사이드가 부착된 마우스 IgG 항체를 1 시간 동안 첨가하고, 혈청을 2 시간 동안 보관하였다. 언급된 각각의 단계 후에는 PBS/0.05% Tween 20을 사용하여 3 회 세척하였다. 기질로는 TMB (BD biosciences, USA) 100 μL를 첨가하여 반응을 전개시킨 후 450 nm에서 흡광도를 ELISA 판독기로 측정하였다. 도 6에 나타낸 바와 같이, 대부분의 나노리포좀 및 나노에멀젼 그룹에서 항체가 (IgG)가 높게 나옴을 확인하였다. 이러한 실험 결과는, 제조된 백신 제형의 아주번트가 체액성 면역을 증진 시키는데 효과적임을 나타낸다.

실시예 13. 나노리포좀 및 나노에멀젼의 세포매개 특정 T 세포 반응 확인

상기 실시예 1-10에서 제조된 면역 자극 조성물들에 의한 마우스 비장 내 T 세포의 PMQ에 대한 세포성 면역 반응을 조사하였다. 상기 실시예 12에서 접종된 마우스 중에서 OVA 및 OVA와 면역 자극 조성물 (나노리포좀, 나노에멀젼)을 처리한 그룹 중, 3 마리의 마우스를 선택하여, 2 주 후 각각의 마우스에서 비장을 적출한 후, 멸균된 페트리 디쉬에 상기 비장 조직을 옮기고, 셀 스트레이너 (cell strainer)를 이용하여 상기 비장을 갈아 조직 피막으로부터 세포를 분리하였다. 상기 페트리디쉬 내의 모든 내용물을 50 mL 튜브에 옮기고 RPMI 배지로 가득 채운 후, 1,500 rpm에서 5 분간 원심분리한 후, 상층액을 제거한 펠렛에 적혈구 용출 버퍼 (sigma Aldrich, Germany)를 5 mL 넣고 30℃ 수조에서 5 분 내지 10 분간 방치하여, 적혈구를 용혈시켰다. 튜브에 포함된 세포를 PBS로 세척한 후, RPMI 배지에 부유시켜 비장세포 (splenocyte)를 분리하였다. 분리된 비장세포를 IFN-r와 IL-4로 코팅된 플레이트에 5 × 10⁵ cell/100 μL로 96-웰에 깔고 MHC 클래스 I-제한 OVA 펩티드를 5 ㎍/mL의 농도로 48 시간 동안 처리하였다. 그 후에 호스 레디쉬 퍼옥사이드가 부착된 IFN-r를 첨가하였다. 기질로는 ACE (3-amino-9-ethyl-carbazole, BD biosciences, USA) 100 μL를 첨가하여 반응을 전개시킨 후, ELSPOT (enzyme-linked immunospot)법으로 측정하였다. 그 결과, 대부분의 아주번트 그룹에서 OVA 항원만을 사용한 대조군에 비해 IFN-r가 현저하게 높은 반응을 나타내는 것을 확인하였다 (도 7).

전술한 본원의 설명은 예시를 위한 것이며, 본원이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본원의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.

본원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims

톨-유사 수용체3 리간드를 포함하는 나노복합체로서,
양이온성 지질 및 면역활성화 물질을 추가 포함하는 것인,
면역 자극 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 나노복합체는 직경이 70 nm 내지 500 nm 크기를 갖는 나노리포좀 또는 나노에멀젼 형태를 포함하는 것인,
면역 자극 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 나노복합체는 톨-유사 수용체 3 리간드 이외에 1 개 이상의 면역활성화 물질을 추가 포함하는 것인, 면역 자극 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 면역활성화 물질은 톨-유사 수용체 아고니스트, 사포닌, 항바이러스성 펩티드, 인플라머좀 인듀서, NOD 리간드, CDS 리간드, STING 리간드, 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 물질을 포함하는 것인, 면역 자극 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 톨-유사 수용체3 리간드는, 양이온성 지질인 DC-콜레스테롤, DDA, DDAB, DOTAP, DOTMA, EPC, MVL5, DODAP, 및 이들의 조합들로 이루어진 군과의 상호작용에 의해 나노복합체에 로딩되는 것인 면역 자극 조성물.
양이온성 지질 및 면역활성화 물질을 제 1 용매에 용해하는 것;
상기 제 1 용매를 증발시켜 지질 막을 형성하는 것; 및
음이온성 톨-유사 수용체3 리간드를 함유하는 제 2 용매에 상기 지질 막을 용해함으로써, 나노복합체를 포함하는 면역 자극 조성물을 제조하는 것을 포함하는, 면역 자극 조성물의 제조 방법.
제 6 항에 있어서,
상기 제 2 용매는 하나 이상의 면역활성화 물질이 혼합되어 있는 것인, 면역 자극 조성물의 제조 방법.
제 7 항에 있어서,
상기 면역활성화 물질은 톨-유사 수용체 아고니스트, 사포닌, 항바이러스성 펩티드, 인플라머좀 인듀서, NOD 리간드, CDS 리간드, STING 리간드, 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 물질을 포함하는 것인, 면역 자극 조성물의 제조 방법.
제 6 항에 있어서,
상기 양이온성 지질은 DC-콜레스테롤, DDA, DDAB, DOTAP, DOTMA, EPC, MVL5, DODAP, 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 물질을 포함하는 것인, 면역 자극 조성물의 제조 방법.