CN105920599B - 以阳离子脂质体dotap为佐剂的疫苗及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种以阳离子脂质体DOTAP(2,3‑二油氧基丙基三甲基氯化铵)作为佐剂的疫苗及其制备方法。该疫苗由蛋白质抗原与阳离子脂质体DOTAP制备而成，抗原分子与DOTAP脂质形成0－500nm±的胶束结构，抗原分子包裹在胶束的亲水内核中或镶嵌在胶束膜中。DOTAP作为疫苗佐剂通过与抗原分子形成胶束结构，可明显提高抗原提呈细胞对抗原的摄取和提呈；同时与传统佐剂通过Toll样受体途径激活抗原提呈细胞不同，DOTAP可通过促细胞分裂原活化蛋白激酶(MAP)途径激活抗原提呈细胞，从而诱导特异性的免疫应答，该途径炎症因子释放少，炎症反应低，因此安全性更好；DOTAP作为疫苗佐剂既可诱导体液免疫应答和又可诱导细胞免疫应答，克服了传统铝佐剂只能诱导体液免疫应答的缺陷。

Description

以阳离子脂质体DOTAP为佐剂的疫苗及其制备方法

技术领域

本文涉及一种以阳离子脂质体DOTAP作为佐剂的疫苗及其制备方法，属于生物技术领域。

背景技术

佐剂是指加入疫苗制剂后能促进、增强或延长机体对抗原特异性免疫应答的物质。佐剂增强免疫应答的机制尚未完全阐明，不同佐剂也不尽相同，但概括而言，可归纳为：一，佐剂和抗原一起进入机体后，可改变抗原的物理性状，形成抗原储存库，有利于抗原的缓释，延长抗原在体内存留的时间；二，被佐剂吸附的抗原更易被吞噬细胞吞噬，促进对抗原的处理，易在局部形成炎症反应；三，刺激淋巴细胞增殖和分化，从而增强和扩大免疫应答的效应；四，增强巨噬细胞和淋巴细胞膜的通透性，促进其对抗原的有效处理和提呈。自从1926年Glenny首次用明矾沉淀白喉类毒素制成抗原免疫豚鼠，取得了较强的免疫效果，铝佐剂已广泛应用于百白破、乙肝等多种疫苗中，并取得了良好的效果，其安全性和有效性得到了公认，成为人用疫苗中使用最广泛的一种佐剂。然而，随着铝佐剂的广泛应用，其不足之处也逐渐暴露。首先铝佐剂不能冻干；制备的凝胶批与批之间差异大，质量难控制且对佐剂的效果很难做出准确的评价；更为重要的是，铝佐剂只能诱导产生体液免疫应答，不能诱导产生细胞免疫应答；还可诱导产生IgE抗体，增加了发生超敏反应的危险。而一个理想的疫苗佐剂应具有以下特点：可增强抗原的免疫原性，特别是一些无免疫原性或弱免疫原性的抗原物质；可增强机体的免疫反应性，特别是那些免疫机能低下人群；能诱导产生高亲和力的抗体的同时，可诱导产生细胞免疫应答；可引起或增强迟发型超敏反应；对机体固有免疫的激活适度，诱导产生较低水平的引起不良反应的炎症因子IL-1、TNF-α等，免疫副反应小。

2,3-二油氧基丙基三甲基氯化铵(DOTAP)是一种常用的阳离子脂质体，由于它与DNA或RNA形成稳定的转染复合物进入细胞，并将核酸释放入细胞内，因此一直作为一种真核细胞转染试剂用于真核细胞的转染和DNA疫苗的载体。近年来的研究发现，DOTAP还是一种很好的免疫调节剂，将多肽或蛋白质抗原与DOTAP包装制备成阳离子脂质体可明显提高抗原提呈细胞对抗原的提呈能力，同时与传统佐剂通过Toll样受体途径激活抗原提呈细胞不同，DOTAP可通过促细胞分裂原活化蛋白激酶(MAP)途径激活抗原提呈细胞，从而诱导特异性的免疫应 答。该途径炎症因子释放少，炎症反应低。因此如果将DOTAP作为一种新的疫苗佐剂既可以增强免疫应答的强度，又避免了传统铝佐剂免疫副反应强的缺点。目前国内外尚无使用DOTAP作为蛋白质疫苗佐剂的报道。

发明内容

本发明提供了一种以阳离子脂质体DOTAP作为佐剂的疫苗，该疫苗通过将蛋白质抗原与阳离子脂质体DOTAP包装、挤压形成0－500nm的蛋白质阳离子脂质体纳米颗粒，疫苗的免疫原性明显提高，同时可降低疫苗免疫后的不良反应。

本发明提供了一种以阳离子脂质体DOTAP作为佐剂的疫苗的制备方法。

本发明提供的H5N1型流感阳离子脂质体DOTAP佐剂疫苗的制备方法，通过以下技术方案完成：

疫苗组成成分：H5N1型流感裂解疫苗原液(H5N1型血凝素抗原0－100μg/ml，总蛋白与血凝素含量比为1：2－1：4)；阳离子脂质DOTAP(0－3000μg/ml)；含30mM氯化钠的等渗葡萄糖溶液。

所述的H5N1型流感裂解疫苗原液是采用WHO发布的购置于英国NIBSC的毒株按照中国药典2010版3部中流感疫苗生产工艺的方法制备而成，并用等渗葡萄糖溶液稀释而成。

所述的的阳离子脂质体DOTAP(2,3-二油氧基丙基三甲基氯化铵)购置于加拿大TRC公司，纯度>98％。

H5N1型流感阳离子脂质体DOTAP佐剂疫苗的制备方法：将DOTAP溶解于1：1的甲醇和氯仿溶剂中，真空旋转蒸发2小时后形成脂膜，加入一定浓度的H5N1型流感病毒裂解疫苗原液，30℃充分混合2小时后，通过800nm、400nm、200nm孔径的碳酸纤维酯膜分别4次挤压。马尔文粒度分析仪检测脂质体粒径，平均粒径应在200nm±，粒径分散指数PDI值应≤0.25,和zata电位为正电荷。

DOTAP阳离子脂质体包封率检测：以40000g的离心力超速离心，将脂质体微粒完全沉淀，用微量BCA法检测上清中的游离抗原的蛋白浓度，从而计算脂质体包封率的检测方法。计算公式为：包封率＝[1－(上清中抗原浓度×溶液体积)/(抗原给药浓度×给药体积)]×100％。包封率应≥50％。

附图说明

图1：0.1μg剂量不同实验组血凝抑制抗体动态变化曲线。

图2：1μg剂量不同实验组血凝抑制抗体动态变化曲线。

图3：10μg剂量不同实验组血凝抑制抗体动态变化曲线。

图4：不同剂量实验组免疫后42天血清抗体保护率。

图5：不同剂量实验组免疫后42天血清总IgG抗体水平比较。

图6：不同剂量实验组免疫后42天血清亚型抗体IgG1水平比较。

图7：不同剂量实验组免疫后42天血清亚型抗体IgG2a水平比较。

图8：不同剂量DOTAP组免疫后血清总IgG抗体水平比较。

图9：不同剂量DOTAP组免疫后42天血凝抑制抗体水平比较。

图10：不同实验组脾脏淋巴细胞体外培养IL-2分泌水平比较。

图11：不同实验组脾脏淋巴细胞体外培养IFN-γ分泌水平比较。

图12：不同实验组脾脏淋巴细胞体外培养IL-4分泌水平比较。

图13：HBsAg阳离子脂质体佐剂疫苗SDS-PAGE电泳结果,1：HBsAg原液；2：HBsAg脂质体溶液；3：HBsAg脂质体离心后沉淀；4：HBsAg脂质体离心后上清；5：空白脂质体；6:蛋白质标准。

图14：透射电子显微镜观察HBSAg阳离子脂质体(20μg/ml HBs)。

图15：不同实验组HBs IgG抗体几何平均滴度比较(A:免疫后14天；B:免疫后28天；C:免疫后42天)

图16：初免后42天不同实验组亚型抗体几何平均滴度比较(A:IgG1；B:IgG2a)

具体实施方式

以下通过实例对本发明进行进一步说明，本发明包括但不仅限于以下实例。

实施例1含H5N1型血凝素抗原10μg/ml，DOTAP3000μg/ml的阳离子脂质体佐剂疫苗的制备。

将H5N1型流感裂解疫苗原液用含30mM氯化钠的等渗葡萄糖溶液稀释至血凝素抗原10μg/ml。

准确称取DOTAP30mg至茄型瓶中，加入甲醇、氯仿各2ml，充分溶解后，在30℃，30rpm条件下真空旋转蒸发2小时，至有机溶剂完全挥发，DOTAP在瓶底形成均匀的脂膜。

加入10ml含H5N1型血凝素抗原10μg/ml的稀释后的H5N1型流感裂解疫苗原液，30℃，60rpm旋转茄型瓶2小时，使脂膜与抗原溶液充分融合。

将复水后的脂质体抗原溶液分别通过800nm、400nm、200nm孔径的碳酸纤维酯膜各挤压4次得到微乳光澄清透明溶液。

马尔文粒度分析仪检测脂质体粒径，平均粒径应在200nm±，粒径分散指数PDI值应≤0.25，和zata电位为正电荷。

实施例2含H5N1型血凝素抗原50μg/ml，DOTAP3000μg/ml的阳离子脂质体佐剂疫苗的制备。

将H5N1型流感裂解疫苗原液用含30mM氯化钠的5％葡萄糖溶液稀释至血凝素抗原50μg/ml。

准确称取DOTAP30mg至茄型瓶中，加入甲醇、氯仿各2ml,充分溶解后，在30℃，30rpm条件下真空旋转蒸发2小时，至有机溶剂完全挥发，DOTAP在瓶 底形成均匀的脂膜。

加入10ml含H5N1型血凝素抗原50μg/ml的稀释后的H5N1型流感裂解疫苗原液，30℃，60rpm旋转茄型瓶2小时，使脂膜与抗原溶液充分融合。

将复水后的脂质体抗原溶液分别通过800nm、400nm、200nm孔径的碳酸纤维酯膜各挤压4次得到微乳光澄清透明溶液。

马尔文粒度分析仪检测脂质体粒径，平均粒径应在200nm±，粒径分散指数PDI值应≤0.25,和zata电位为正电荷。

实施例3 H5N1型流感阳离子脂质体佐剂疫苗与其它佐剂疫苗的免疫原性比较。

将6周龄雌性BALB/c小鼠随机分为DOTAP阳离子脂质体流感疫苗组(DOTAP300μg/只)、裂解疫苗组、裂解疫苗加铝佐剂组(Al 500μg/只)、裂解疫苗加CPG-ODN佐剂组(CPG-ODN10μg/只)、PBS空白对照组。以0.1，1，10μg/只HA作为免疫剂量，每个剂量10只小鼠，于0，21天皮下注射，0，21，42天采血分离血清，血凝抑制实验(HI)检测各组免疫后21，42天小鼠血清血凝抑制抗体水平，ELISA法检测各组42天血清总IgG抗体、亚型抗体(IgG1,IgG2a)水平。将各组几何平均滴度取对数后进行组与组之间双侧t检验，以P<0.05作为有统计学差异标准。

表1 H5N1型流感阳离子脂质体佐剂疫苗与其它佐剂疫苗的免疫原性比较的实验分组

表2免疫后21天各实验组血凝抑制抗体的几何平均滴度

表3加强免疫后21天(42天)各实验组血凝抑制抗体的几何平均滴度

表4加强免疫后21天(42天)各实验组血凝抑制抗体的几何平均滴度的统计分析(*表示有统计学差异，P<0.05)

表5加强免疫后21天(42天)各实验组血清抗体保护率比较

表6加强免疫后21天(42天)各实验组总IgG抗体的几何平均滴度

表7加强免疫后21天(42天)各实验组总IgG抗体的几何平均滴度的统计分析(*表示有统计学差异，P<0.05)

表8加强免疫后21天(42天)各实验组亚型抗体IgG1的几何平均滴度

表9加强免疫后21天(42天)各实验组亚型抗体IgG1的几何平均滴度的统计分析(*表示有统计学差异，P<0.05)

表10加强免疫后21天(42天)各实验组亚型抗体IgG2a的几何平均滴度

表11加强免疫后21天(42天)各实验组亚型抗体IgG2a的几何平均滴度的统计分析(*表示有统计学差异，P<0.05)

血凝抑制实验(HI)检测结果显示，各组初次免疫后21天血凝抑制抗体水平均较低，加强免疫后21天血凝抑制抗体水平大幅升高(图1，2，3)。以加强免疫后21天血凝抑制抗体水平进行比较，DOTAP阳离子脂质体流感疫苗组在低、中、高剂量组其血凝抑制抗体滴度均明显高于裂解苗组，其中在中、高剂量组有显著性差异(P<0.05)；DOTAP阳离子脂质体流感疫苗与铝佐剂在不同剂量组均无明显性差异(P>0.05)，和CpG-ODN佐剂相比中、高剂量组无显著性差异(P>0.05)，低剂量组明显低于CpG-ODN佐剂组(P<0.05)(见表2－4)血凝抑制抗体是流感疫苗接种后诱导机体产生的保护性抗体，一般认为，血凝抑制抗 体滴度达到1：40以上就有免疫保护作用。以加强免疫后21天各组之间血清抗体保护率的比较发现，DOTAP阳离子脂质体组保护率在中、低剂量组要高于铝佐剂(图4)。从以上结果可以看出，DOTAP阳离子脂质体具有明显的佐剂效应，并且其诱导流感疫苗中和抗体的能力明显不低于甚至优于传统铝佐剂，在中、高剂量组也不低于目前已广泛应用的核酸佐剂CPG-ODN。

42天各组血清总IgG抗体的水平检测结果显示，DOTAP阳离子脂质体组42天总抗体水平在低、中、高剂量组均显著性高于裂解疫苗组(P<0.05)；在中、高剂量组均高于铝佐剂和CpG-ODN佐剂，其中在高剂量组与铝佐剂和CpG-ODN佐剂相比有显著性差异(P<0.05)；在低剂量组低于铝佐剂和CpG-ODN佐剂，其中与CpG-ODN佐剂组有显著性差异(P<0.05)。(见表6－7)这一结果与血凝抑制抗体检测的结果基本一致。进一步表明了DOTAP阳离子脂质体良好的佐剂效果。

不同类型的佐剂在协助抗原产生免疫应答过程中，可刺激抗原提呈细胞释放不同类型的细胞因子诱导Th细胞分化为Th1或Th2型细胞，Th1细胞通过释放Th1型细胞因子IFN-γ、TNF－β等诱导免疫应答倾向细胞免疫应答，同时诱导产生IgG2a亚型抗体(在小鼠体内)；而Th2型细胞通过释放Th2型细胞因子IL－10、IL－4等诱导免疫应答倾向体液免疫应答，并诱导产生IgG1亚型抗体(在小鼠体内)。因此我们比较了DOTAP佐剂组与其它组别免疫后42天血清亚型抗体的差异。结果显示，DOTAP佐剂流感疫苗产生的抗体主要为高滴度的IgG1型抗体，但IgG2a型抗体水平在低、中、高剂量组均显著性高于裂解疫苗组(P<0.05)在中、高剂量组高于铝佐剂组，其中在高剂量组显著性高于铝佐剂(P<0.05)；CPG-ODN佐剂作为一个常用的细胞免疫刺激剂，我们的研究发现其诱导产生的IgG2a型抗体水平在低、高剂量组要显著性明显高于DOTAP佐剂(P<0.05)；铝佐剂通常不能诱导细胞免疫，我们的研究发现，铝佐剂流感疫苗免疫后，产生了高滴度的IgG1型抗体,但IgG2a型抗体水平较低(见表8－11)。

实施例4比较不同剂量DOTAP作为H5N1型流感病毒裂解疫苗佐剂的免疫效果差异。

将6周龄雌性BALB/c小鼠随机分为3组，每组10只，于0，21天分别免疫含低、中、高剂量DOTAP的阳离子脂质体流感疫苗，DOTAP佐剂剂量分别为100μg/只、300μg/只、600μg/只，抗原剂量为2μgHA/只。0，21，42天采血分离血清，血凝抑制实验检测不同DOTAP剂量组免疫后42天小鼠血清血凝抑制抗体(HI)水平；ELISA法检测各组血清21天、42天总IgG抗体水平。将各剂量组几何平均滴度取对数后进行组与组之间双侧t检验，以P<0.05作为有统计学差异标准。

结果显示，免疫后21天、42天小鼠血清总抗体水平和42天的血凝抑制抗体水平在DOTAP低、中、高剂量组之间存在明显的量效关系。除42天总抗体水平 300μg组和600μg组之间无显著性差异(P>0.05)外，其余各组抗体水平和血凝抑制抗体水平水平在不同剂量之间均存在显著性差异(P<0.05)。(见表12－16)以上结果进一步表明DOTAP的佐剂效应不仅仅是通过DOTAP阳离子脂质体对抗原包装后，促进了抗原提呈细胞对抗原的摄取和提呈，DOTAP本身具有对抗原提呈细胞的活化能力，而这种活化能力存在这一定的量效关系。

表12不同剂量DOTAP佐剂H5N1型流感病毒裂解疫苗免疫后总IgG抗体几何平均滴度

表13不同剂量DOTAP佐剂H5N1型流感病毒裂解疫苗免疫21天后总IgG抗体几何平均滴度统计分析(*表示有统计学差异，P<0.05)

表14不同剂量DOTAP佐剂H5N1型流感病毒裂解疫苗加强免疫后21天(42天)总IgG抗体几何平均滴度统计分析(*表示有统计学差异，P<0.05)

表15不同剂量DOTAP佐剂H5N1型流感病毒裂解疫苗加强免疫后21天(42天)血凝抑制抗体几何平均滴度

表16不同剂量DOTAP佐剂H5N1型流感病毒裂解疫苗加强免疫后21天(42天)血凝抑制抗体几何平均滴度统计分析(*表示有统计学差异，P<0.05)

比较DOTAP阳离子脂质体流感疫苗与H5N1型流感全病毒疫苗、裂解疫苗、铝佐剂裂解疫苗、CPG-ODN佐剂裂解疫苗免疫后小鼠脾脏淋巴细胞细胞因子分泌的差异。

将6周龄雌性BALB/c小鼠随机分为DOTAP阳离子脂质体流感疫苗组、H5N1型流感全病毒疫苗组、裂解疫苗组、铝佐剂裂解疫苗组、CPG-ODN佐剂裂解疫苗组，以2μg HA作为免疫剂量，每组5只，于0，21天皮下注射免疫小鼠，于初次免疫后42天取小鼠脾脏单个核细胞体外培养，抗原刺激后，ELISA法检测培养上清中IL-2、IL-4、IL－10、IFN－γ水平。

实施例5小鼠脾脏淋巴细胞体外抗原刺激和细胞因子检测

无菌取小鼠脾脏，剪碎后研磨，并用100目的尼龙网过滤，将细胞悬液置于5ml淋巴细胞分离液上层，1500rpm，20分钟速度区带离心，取中间层单个核细胞，0.01M PBS，2000rpm，10分钟离心洗2次，细胞计数，用含10％小牛血清的RPMI-1640培养基将细胞悬液稀释到2×10⁶个活细胞/ml后，加入96孔细胞板，0.1ml/孔，补加1640培养基100μl，同时加入H5N1裂解疫苗原液1μg/ml；37℃，5％CO₂培养72小时，收上清，采用细胞因子ELISA检测试剂盒进行检测，检测方法按试剂盒说明书要求进行。

表17不同实验组小鼠脾脏淋巴细胞细胞因子分泌的差异

免疫后小鼠脾脏淋巴细胞体外经抗原刺激后细胞因子检测的结果显示，所有实验组均分泌高水平的IL-2提示脾脏淋巴细胞中存在抗原特异性淋巴细胞。DOTAP阳离子脂质体流感疫苗组既分泌高水平的Th1型细胞因子IFN-γ，同时也分泌一定水平的Th2型细胞因子IL-4；铝佐剂组仅分泌较高水平的Th2型细胞因子IL-4，几乎不分泌Th1型细胞因子IFN-γ；CPG-ODN佐剂组IFN-γ水平较高，但Th2型细胞因子IL-4分泌水平较低。以上结果进一步提示DOTAP脂质体佐剂即可诱导流感疫苗产生体液免疫应答，又可诱导细胞免疫应答，而铝佐剂仅能诱导体液免疫应答，CPG-ODN佐剂诱导的细胞免疫应答较强。没有加任何佐剂的裂解疫苗IFN-γ、IL-4水平均很低，提示在没有佐剂的情况下，其免疫应答强度较低，这与前面抗体水平的检测结果是一致的。

脂质体(Liposomes)是由脂质双分子层组成的内部为水相的闭合囊泡型球型微粒。1965年由Bangham首次发现并命名[1]，1971年Ryman将其用作药物载体，可作为小分子药物、多肽、核酸以及蛋白质分子的运载系统，脂质体在体内能迅速被靶细胞所捕获，具有高效靶向性，同时具有缓释效应[2]。目前聚乙二醇化脂质体和与抗体结合的免疫脂质体已广泛应用于肿瘤的靶向治疗。近年来的研究发现，部分脂质体颗粒还具有刺激机体免疫应答的作用。DOTAP(2,3-二油氧基丙基三甲基氯化铵)是目前较为常用的一类阳离子脂质体，它是一个季胺盐化合物，由两条不饱和脂肪酸通过脂键相连构成，含季胺基团和脂键的部分为其亲水端，两条不饱和脂肪酸为其疏水端。长期以来，DOTAP一直被用作一种DNA体外和体内的转染试剂。然而正是在DOTAP被用作DNA体内转染的过程中，人们发现，DOTAP脂质体实际上是一种很好的免疫佐剂，它可增强体液免疫应答，同时诱导更强的Th1细胞免疫应答，研究表明，DOTAP脂质体可能并不通过核因子NF-κB途径激活树突状细胞，而是通过启动MAPK(胞外信号调控激酶和P38)途径激活树突状细胞，导致树突状细胞高表达协同刺激分子CD80、CD83和CD86，从而诱导CD4+Th1细胞和CD 8+T细胞的免疫应答[3]。由于避开了核因子NF-κB途径激活，DOTAP脂质体作为疫苗佐剂，免疫后产生更少的炎症因子IL-1、TNF-α等，因而免疫副反应更小。美国PDS Biotechnology公司将MerckEprova公司专有的手性脂质DOTAPChloride包裹HPV相关多肽抗原制备的纳米脂质体疫苗，用于人类乳头瘤病毒引起的宫颈癌等相关疾病的治疗，临床前研究结果显示该治疗性疫苗可明显提高抗原特异性的CD8+T细胞的细胞免疫功能，抑瘤效果明显，并且安全性良好[4]。该药物已进入Ⅰ期临床研究。但目前 DOTAP作为预防用疫苗佐剂研究的报道还较少。

本研究以重组乙肝疫苗作为实验抗原，意在探讨了DOTAP对预防用蛋白质类疫苗的免疫增强效果。在本研究中，我们选择了传统的铝佐剂和CpG-ODN核酸佐剂作为对照佐剂，初步比较了DOTAP作为乙肝疫苗佐剂与传统佐剂对乙肝疫苗体液免疫增强效果上的差异。为进一步开发新型乙肝疫苗佐剂奠定了基础。

材料和方法

抗原：重组乙肝表面抗原(HBSAg)从北京天坛生物股份有限公司购买。

试剂DOTAP购置于加拿大TRC公司；铝佐剂购置于SIGMA公司；核酸佐剂CPG－ODN由上海生工合成；HRP标记羊抗鼠IgG抗体，HRP标记羊抗鼠IgG1亚型抗体、HRP标记羊抗鼠IgG2a亚型抗体购置于Biolegend公司；BCA法蛋白质微量检测试剂盒购置于Thermo公司，RDE酶购置于SIGMA公司。

实验动物：6周龄SPF级雌性BABL/c小鼠武汉生物制品研究所有限责任公司实验动物室饲养。

仪器设备：RE-52系列旋转蒸发器，马尔文粒度分析仪，酶标检测仪

实施例6薄膜蒸发复水法制备DOTAP阳离子脂质体乙肝疫苗

将DOTAP溶解于1：1的甲醇和氯仿溶剂中，真空旋转蒸发2小时后，加入一定浓度的重组乙肝表面抗原原液，30℃充分混合2小时后，通过一定孔径的碳酸纤维膜多次挤压制备而成。马尔文粒度分析仪检测脂质体粒径和zata电位。

实施例7 DOTAP阳离子脂质体包封率检测

以40000g的离心力超速离心，将脂质体完全沉淀，用BCA法检测上清中的游离抗原的蛋白浓度，从而计算脂质体包封率的检测方法。计算公式为：包封率＝[1－(上清中抗原浓度×溶液体积)/(抗原给药浓度×给药体积)]×100％

实施例8 SDS-PAGE电泳检测

将HBSAg原液、HBsAg脂质体溶液、HBsAg脂质体超速离心后沉淀、HBsAg脂质体超速离心后上清以及空白脂质体样品进行SDS-PAGE电泳，然后银染，观察HBSAg在各组分中的分布。

实施例9投射电镜检测

用磷钨酸负染法制备HbsAg阳离子脂质体电镜样品，将制备好的负染色样品置于220kV透射电镜观察室，抽真空，观察脂质体并照相。

实施例10动物免疫

将BALB/c小鼠随机分为DOTAP阳离子脂质体乙肝疫苗组、不加佐剂的乙肝疫苗组、乙肝疫苗加铝佐剂组、乙肝疫苗加CPG-ODN佐剂组以及PBS组作为对照，以0.2μg/只，2μg/只重组乙肝表面抗原作为免疫剂量，每个剂量10只小鼠，于0，28天肌肉免疫，0，14，28，42天采血分离血清，ELISA法检测各组血清抗HBS特异性IgG抗体、亚型抗体(IgG1,IgG2a)滴度。

表18.DOTAP阳离子脂质乙肝疫苗与其它对照佐剂乙肝疫苗免疫原性比较的实验分组

实施例11小鼠血清IgG抗体、IgG1,IgG2a亚型抗体水平检测

以1μg/ml的重组乙肝表面抗原包被酶标板，0.1ml/孔，4℃过夜；加入1％的BSA,150μl/孔，37℃封闭4小时；加入系列对倍稀释的血清，0.1ml/孔，37℃温育1小时；PBST洗涤5次，加入工作浓度的羊抗鼠IgG-HRP或羊抗鼠IgG1,2a-HRP。0.1ml/孔，37℃温育1小时,PBST洗涤5次,加入底物A、B液，各50μl/孔，37℃温育10分钟；加入2mol/lH₂SO₄,50μl/孔,经酶标仪检测A450吸光值，以吸光值>0.1的血清最高稀释度作为血清抗体滴度。

1.5.7统计分析应用SPSS 19软件进行统计分析，将抗体滴度进行对数处理后，采用组间单样本双测学生t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

实验结果

1通过薄膜蒸发复水法制备的含DOTAP阳离子脂质体乙肝疫苗呈乳白色胶体状，粒径分布均匀，集中度好，脂质体带正电荷，以2μg/ml和20μg/ml抗原浓度制备的脂质体包封率均达到50％以上。(见表19)。

表19. 1000μg/mlDOTAP条件下，不同浓度的HBSAg阳离子脂质体的物理特征。

2 SDS-PAGE电泳后银染结果显示(图12)，通过超速离心可将HBSAg阳离子脂质体完全沉淀，HBSAg主要分布在脂质体沉淀中，上清中抗原明显较少。以上结果提示HBSAg阳离子脂质体疫苗有较高的包封率，大部分抗原都包裹在了阳离子脂质体中，游离抗原相对较少。

3透射电镜检测的结果显示，HBSAg阳离子脂质体呈圆形，外表光滑，粒径在nm(见图14)。

4动物免疫后血清学检测结果显示，各实验组在初次免疫后12天和28天抗HBS IgG抗体均维持在较低的水平，但DOTAP阳离子脂质体佐剂组和其它对照佐剂组均明显高于不加佐剂的HBS组，加强免疫后14天(42天)各实验组抗体水平均显著性升高，以42天各实验组抗体几何平均滴度进行比较显示，DOTAP阳离子脂质体佐剂组在0.2μg和2μg剂量组均高于HBS组，其中2μg剂量组有显著性差异(P<0.05)，DOTAP阳离子脂质体佐剂0.2μg剂量组IgG抗体几何平均滴度与HBS组2μg剂量组相当；DOTAP阳离子脂质体佐剂组在0.2μg和2μg剂量组与铝佐剂组均无显著性差异(P>0.05)，在2μg剂量组与CPG-ODN佐剂组无显著性差异(P>0.05)，但在0.2μg剂量组要显著性低于CPG-ODN佐剂组(P<0.05)(见表19，20)。

表20.不同实验组在初次免疫后14，21，42天HBS IgG抗体的几何平均滴度。

表21.不同实验组在初次免疫后42天HBS IgG抗体的几何平均滴度的统计学分析(*表示有统计学差异，P<0.05)。

免疫后42天的血清亚型抗体IgG1、IgG2a检测结果显示，DOTAP佐剂HBsAg疫苗可同时产生高滴度的IgG1型和IgG2a抗体。DOTAP佐剂HBsAg疫苗产生的IgG1型抗体滴度与铝佐剂相当，没有显著性差异(P>0.05)，但是IgG2a型抗体滴度明显高于铝佐剂，低、高剂量组都有显著性差异(P<0.05)；DOTAP佐剂HBsAg疫苗产生的IgG1型、IgG2a型抗体滴度略低于CpG-ODN-HBsAg疫苗，但均无显著性差异(P>0.05；DOTAP佐剂HBsAg疫苗产生的IgG1型、IgG2a型抗体滴度相对于单独使用HBsAg，有大幅的提高，除低剂量IgG1型抗体外，都具有显著性差异(P<0.05)。

表22.不同实验组在初次免疫后42天HBS亚型抗体IgG1、IgG2a的几何平均滴度

表23.不同实验组在初次免疫后42天HBS亚型抗体IgG1、IgG2a几何平均滴度的统计学分析(*表示有统计学差异，P<0.05)。

讨论

本研究以重组乙肝疫苗作为实验抗原，探讨了阳离子脂质体DOTAP作为蛋白质疫苗佐剂的免疫增强效果。在实验中我们选取了传统的铝佐剂和核酸佐剂CPG-ODN作为对照佐剂。铝佐剂是目前乙肝疫苗所使用的佐剂，其安全性和有效性得到了公认，成为人用疫苗中使用最广泛的一种佐剂。但铝佐剂存在的最大的缺点在于只能诱导产生体液免疫应答，不能诱导产生细胞免疫应答，还可诱导产生IgE抗体，增加了发生超敏反应的危险[5]。与铝佐剂进行比较，主要在于评估阳离子脂质体DOTAP作为蛋白质疫苗佐剂对体液免疫应答的增强作用。核酸佐剂CPG-ODN是目前一种常用的细胞免疫刺激剂，具有较强的Th1细胞的激活能力[6]。与核酸佐剂CPG-ODN进行比较意在评估离子脂质体DOTAP作为蛋白质疫苗佐剂潜在的诱导细胞免疫应答的能力。

在小鼠免疫后的血清学研究中我们对不同实验组特异性IgG抗体和IgG亚型抗体IgG1和IgG2a进行了检测。检测特异性IgG抗体水平在于比较DOTAP与其它佐剂对体液免疫应答增强作用的差异。我们的研究发现，DOTAP确实具有很好的体液免疫应答增强作用，其对体液免疫应答的增强作用明显不劣于铝佐剂和CPG-ODN佐剂，仅在低剂量组免疫后42天低于CPG-ODN佐剂。

不同类型的佐剂在协助抗原产生免疫应答过程中，可刺激抗原提呈细胞释放不同类型的细胞因子,诱导Th细胞分化为Th1或Th2型细胞，Th1细胞通过释放Th1型细胞因子IFN-γ、TNF－β等诱导免疫应答倾向细胞免疫应答，同时诱导产生IgG2a亚型抗体(在小鼠体内)；而Th2型细胞通过释放Th2型细胞因子IL－4、IL－10等诱导免疫应答倾向体液免疫应答，并诱导产生IgG1亚型抗体(在小鼠体内)，因此，血清中IgG1和IgG2a亚型抗体水平的差异可在一定程度上反应出免疫应答类型的差异[7]。我们对免疫后小鼠血清中IgG亚型抗体IgG1和IgG2a检测结果发现，DOTAP佐剂乙肝疫苗可同时产生高滴度的IgG1型和IgG2a抗体。特别是IgG1型抗体的水平与CPG-ODN佐剂相比无显著性差异，而铝佐剂乙肝疫苗仅产生了高度的IgG2a型抗体，IgG1型抗体水平显著性低于DOTAP佐剂。这一结果说明DOTAP佐剂可能与CPG-ODN佐剂一样，具有较强的细胞免疫刺激作用。我们在另外一个DOTAP佐剂流感病毒裂解疫苗的研究中，对免疫后小鼠脾脏淋巴细胞的细胞因子谱进行了检测，发现DOTAP佐剂组小鼠既高表达Th1型细胞因子IFN-γ，也高表达Th2型细胞因子IL－4、IL－10，这和我们以上的结果是一致的。

综上所述，DOTAP阳离子脂质体可能是一种很好的疫苗佐剂，其克服了铝佐剂只能诱导体液免疫应答，不能诱导细胞免疫应答的缺点，而且其对体液免疫应答的增强作用不劣于铝佐剂。

Claims (3)

1.一种疫苗，其特征在于，

所述疫苗由2,3-二油氧基丙基三甲基氯化铵脂质体和单价或多价的蛋白质抗原组成；

所述2,3-二油氧基丙基三甲基氯化铵和蛋白质抗原的质量比为300:1，抗原浓度为10ug/ml；

所述单价或多价的蛋白质抗原为流感裂解疫苗原液或重组乙肝表面抗原；

所述2,3-二油氧基丙基三甲基氯化铵为R-2,3-二油氧基丙基三甲基氯化铵。

2.根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述流感裂解疫苗原液为H5N1流感裂解疫苗原液、H5N2流感裂解疫苗原液、H7N2流感裂解疫苗原液、H7N3流感裂解疫苗原液、H7N7流感裂解疫苗原液、H9N2流感裂解疫苗原液、H10N7流感裂解疫苗原液和H7N9流感裂解疫苗原液。

3.一种权利要求1或2所述疫苗的制备方法，包括如下步骤：

(1)将R-2,3-二油氧基丙基三甲基氯化铵溶解于1：1的甲醇和氯仿溶剂中，真空旋转蒸发形成脂膜，

(2)加入蛋白质抗原，25-36℃充分混合0.5-5小时后，分别通过800nm、400nm、200nm孔径的碳酸纤维酯膜进行4次挤压；

所述的蛋白质抗原溶解于含30mM氯化钠的等渗葡萄糖溶液中。

Images