KR101809863B1 - 줄기 세포 유래 심근세포 배양용 합성 표면 - Google Patents
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Abstract
줄기 세포 유래 심근세포를 배양하는데 적합한 합성 표면은 1 종 이상의 아크릴레이트 단량체로부터 형성되는 아크릴레이트 중합체를 함유한다. 아크릴레이트 표면은 많은 경우, 줄기 세포 유래 심근세포를 화학적으로 규정된 배지에서 배양하는데 적합하다.
Description
우선권
본 출원은 그 전문이 참조로 인용되는, 2008 년 1 월 30 일에 출원된 미국 가출원 제 61/062,921 호에 대한 우선권을 주장한다.
기술분야
본 개시물은 세포 배양 물품 및 이의 사용 방법, 더욱 특히 줄기 세포 유래 심근세포의 배양을 지지하기에 적합한 물품에 관한 것이다.
인간 배아 줄기 세포 (hESC) 와 같은 다능성 줄기 세포는 인체에서 임의의 성체 세포 유형으로 성장하는 3 가지 배엽 중 임의의 것으로 분화되는 능력을 갖는다. 이러한 고유한 특성은 당뇨병, 척수 손상, 심장 질환 등과 같은 수많은 심각한 세포 퇴행성 질환에 대한 새로운 치료법을 개발하기 위한 잠재성을 제공한다. 예를 들어, 피부 또는 간과 같은 기관과 달리, 심장은 광범위한 복구가 일어날만한 충분한 심근세포를 발생시킬 수 없다. 그러므로 심장 복구는, hESC 또는 기타 다능성 줄기 세포로부터 분화될 수 있는, 심장 내에 이식되는 심근세포로부터 유리할 것이다.
그러나 이러한 hESC-기초 치료 개발에는 장애물이 남아 있다. 이러한 장애물에는, 조직 배양물에서 적절한 수의 미분화된 hESC 를 수득하고 유지하는 것, 및 특이적 세포 유형을 생성하기 위해 이의 분화를 제어하는 것이 포함된다. hES 세포 배양물과 같은 줄기 세포 배양물은 통상적으로 세포 은행 또는 저장물로부터 소수의 세포를 파종한 후, 주어진 치료 용도를 위해 분화를 필요로 하기 전까지 미분화된 상태에서 증폭시킨다. 이를 달성하기 위해서, hESC 또는 이의 분화된 세포는 현재, 영양세포 층, 우태 혈청 또는 MATRIGEL 과 같은 동물-유래 성분을 함유하는 배지 또는 표면의 존재 하에 배양된다. 배양 환경에 대한 이들 동물-유래 첨가물은, 세포를 환자에게 전달되거나 hESC 의 일반적인 배양 및 유지를 위태롭게 할 수 있는 잠재적으로 유해한 바이러스 또는 기타 감염성 제제에 노출시킨다. 또한, 이러한 생물학적 생성물은 배치 변화, 면역 반응 및 제한된 저장 수명에 취약하다.
동물-유래 성분이 없는 표면 또는 배지에서 hESC 를 배양하기 위해 일부 단계가 수행된다. 그러나, hESC 또는 이의 분화된 유도체의 반응은 표면 또는 배양 배지 변화의 성분으로서 예측하기에 어렵다. 그러나 일부 진전이 이루어지고 있다. 예를 들어, hESC-유래 심근세포가 규정된 무-혈청 배지에서 배양되었다. 사용된 매트릭스가 젤라틴 및 MATRIGEL 과 같은 동물-유래 성분을 함유하는 경우 이러한 배양 시스템은 완전한 이종성분 불포함 배양 시스템은 아니지만, hESC-유래 심근세포의 궁극적 임상 적용을 향한 단계를 제공한다. 추가 예로서, 일부 합성 표면이 인간 상피 줄기 세포의 상피 세포로의 분화를 지지할 수 있는 것으로 확인되었다. 그러나, 세포 배양을 위한 혈청 배지에 의존하여 사용되는 시스템은 모든 생물학적 동물 유래 성분에 대한 이전에 기재한 바와 같은 문제점을 여전히 잠재적으로 일으킨다. 지금까지, 줄기 세포 또는 줄기 세포 유래 세포를 배양하기 위해 화학적으로 규정된 배지 및 합성 표면을 사용하는 완전한 동물-유래 성분 불포함 시스템은 확인되지 않았다.
발명의 개요
본 개시에는 특히, 화학적으로 규정된 배지에서 줄기 세포-유래 심근세포를 배양하는데 유용한 합성 표면이 기재되어 있다.
한 구현예에서는, 줄기 세포-유래 심근세포의 배양 방법이 제공된다. 상기 방법은 줄기 세포-유래 심근세포를 함유하는 현탁액을 중합체 물질 상에 적층시키고 적층된 줄기 세포-유래 심근세포를 세포 배양 배지에서 배양하는 것을 포함한다. 상기 중합체 물질은 선택된 1 종 이상의 아크릴레이트 단량체의 공중합체 또는 단일중합체를 포함한다.
한 구현예에서는, 줄기 세포-유래 심근세포의 배양물이 제공된다. 상기 배양물은 표면 상에 적층된 중합체 물질을 갖는 물품을 포함한다. 배양물은 또한 중합체 물질 상에 적층된 줄기 세포-유래 심근세포, 및 줄기 세포-유래 심근세포가 배양되는 배양 배지를 추가로 포함한다. 중합체 물질은 선택된 1 종 이상의 아크릴레이트 단량체의 공중합체 또는 단일중합체를 포함한다.
한 구현예에서는, 화학적으로 규정된 배지에서 줄기 세포-유래 심근세포를 배양하기 위한 세포 배양 물품이 제공된다. 상기 물품은 표면을 갖는 기질 및 표면 상에 적층된 중합체 물질을 포함한다. 중합체 물질은 선택된 1 종 이상의 아크릴레이트 단량체의 공중합체 또는 단일중합체를 포함한다.
본원에 제시된 하나 이상의 다양한 구현예에서는 줄기 세포-유래 심근세포를 배양하기 위한 종래 기술의 표면에 비해 하나 이상의 이점이 제공된다. 예를 들어, 합성 표면은 동물 기원에서 유래되거나 이로부터 수득된 성분을 갖는 표면과 연관된 잠재적 오염 문제를 감소시킨다. 이러한 표면은 또한 생물학적 성분을 갖는 이들 표면과 비교하여 향상된 저장 수명을 제공할 수 있다. 화학적으로 규정된 배지에서 줄기 세포-유래 심근세포를 배양하는 능력은 잠재적 오염 문제를 추가적으로 감소시킨다. 또한, 합성 표면 또는 화학적으로 규정된 배지의 능력에 있어서의 배치 대 배치 변화가 적을 것으로 생각되어, 배양 결과 및 기대치의 재현성이 향상된다. 이들 이점 및 기타 이점은 첨부된 도면과 함께 독해할 때 하기의 상세한 설명으로부터 쉽게 이해될 것이다.
도 1A-B 는 합성 중합체 층으로 코팅된 물품 측면의 도식이다.
도 2A-C 는 멀티-웰 세포 배양 플레이트의 횡단면의 도식이다. 플레이트는 비코팅되고 (도 2A), 코팅된다 (2B-C).
도 3 은 실시예 1 에서 기재되는 바와 같은 제형 1 (A), 제형 18 (B), 및 Matrigel (C) 의 표면 상에서 그리고 화학적으로 규정된 배지에서 배양된 줄기 세포 유래 심근세포의 형광 이미지이다. 녹색: Nkx 2.5. 적색: 알파-액티닌.
상기 도면들은 측량화될 필요는 없다. 도면에 사용된 대략적 수치는 대략적 성분, 단계 등을 나타낸다. 그러나, 주어진 도면에서의 성분을 나타내는 수치의 사용이 동일한 수치로 표기된 또 다른 도면에서의 성분을 제한하는 것으로 의도되지 않는다는 것이 이해될 것이다. 또한, 성분을 나타내는 상이한 수치의 사용은 상이한 수치가 매겨진 성분이 동일하거나 유사할 수 없다는 것을 나타내는 것으로 의도되지 않는다.
도 2A-C 는 멀티-웰 세포 배양 플레이트의 횡단면의 도식이다. 플레이트는 비코팅되고 (도 2A), 코팅된다 (2B-C).
도 3 은 실시예 1 에서 기재되는 바와 같은 제형 1 (A), 제형 18 (B), 및 Matrigel (C) 의 표면 상에서 그리고 화학적으로 규정된 배지에서 배양된 줄기 세포 유래 심근세포의 형광 이미지이다. 녹색: Nkx 2.5. 적색: 알파-액티닌.
상기 도면들은 측량화될 필요는 없다. 도면에 사용된 대략적 수치는 대략적 성분, 단계 등을 나타낸다. 그러나, 주어진 도면에서의 성분을 나타내는 수치의 사용이 동일한 수치로 표기된 또 다른 도면에서의 성분을 제한하는 것으로 의도되지 않는다는 것이 이해될 것이다. 또한, 성분을 나타내는 상이한 수치의 사용은 상이한 수치가 매겨진 성분이 동일하거나 유사할 수 없다는 것을 나타내는 것으로 의도되지 않는다.
상세한 설명
하기의 상세한 설명에서는 이의 일부를 형성하는 첨부 도면을 참조로 하며, 이는 장치, 시스템 및 방법의 여러 특정 구현예의 설명으로서 나타난다. 본 개시물의 범주 또는 취지를 벗어나지 않으면서 다른 구현예가 고려되고 언급될 수 있음이 이해될 것이다. 그러므로 하기 상세한 설명은 제한적 의미로서 받아들여지지 않는다.
본원에 사용되는 모든 과학적 및 기술적 용어는 달리 명시되지 않는 한 당업계에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는다. 본원에 제공된 정의는 본원에 종종 사용되는 특정 용어의 이해를 돕기 위한 것이며, 본 개시물의 범주를 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
본 명세서 및 특허청구범위에서 사용되는 바와 같이, 문맥에서 달리 명백히 표시되지 않는 한 단수형은 복수형 대상을 갖는 구현예를 포함한다. 본 명세서 및 특허청구범위에서 사용되는 바와 같이, 문맥에서 달리 명백히 표시되지 않는 한 용어 "또는" 은 일반적으로 "및/또는" 을 포함하는 의미로 사용된다.
달리 언급되지 않는 한, 용액과 같은 조성물 중 화합물의 비율은 부피 기준으로 표기된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "갖는다", "갖는", "포함된다", "포함되는", "포함한다", "포함하는" 등은 개방적 의미로 사용되며, 일반적으로 "~ 를 포함하나, 이에 제한되지 않는" 을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "아크릴레이트" 라는 용어에는 아크릴레이트 부분 또는 메타크릴레이트 부분을 함유하는 화합물이 포함된다. 아크릴레이트 부분은 하기 화학식: CH2CHC(O)O- 의 부분이다. 메타크릴레이트 부분은 하기 화학식: CH2C(CH3)C(O)O- 의 부분이다. 본 명세서의 목적을 위해, "아크릴레이트" 라는 용어에는 표 1 에 기술된 구체적인 화합물이 포함된다. "아크릴레이트" 및 "메타크릴레이트" 는 본원에서 상호교환적으로 사용되나, 단 그 내용이 명백히 다르게 표시되는 경우, 예를 들어, 구체적인 화합물 또는 화합물의 기가 명시된 경우는 제외된다.
본 개시물은 특히, 줄기 세포-유래 심근세포를 배양하기 위한 합성 표면을 갖는 물품, 및 상기 표면 상에서 줄기 세포-유래 심근세포를 배양하기 위한 방법을 기재한다. 일부 구현예에서는, 합성 표면이 화학적으로 규정된 배지와 함께 줄기 세포-유래 심근세포를 배양하는데 사용된다. 상기 표면은 hESC 와 같은 줄기 세포를 심근세포로 분화시키는데 유용할 수 있다.
1. 세포 배양 물품
도 1 을 참조하여, 세포를 배양하기 위한 물품 100 의 도식이 제시된다. 물품 100 은 표면 15 를 갖는 기재 물질 기질 10 을 포함한다. 합성 중합체 코팅층 20 은 기재 물질 10 의 표면 15 상에 적층된다. 제시되지는 않았지만, 합성 중합체 코팅 20 이 기재 물질 10 의 일부 상에 적층될 수 있음이 이해될 것이다. 기재 물질 10 은 세라믹 성분, 유리, 플라스틱, 중합체 또는 공중합체, 이의 임의 조합, 또는 한 물질의 또 다른 물질 상의 코팅을 포함하는, 세포 배양에 적합한 임의의 물질일 수 있다. 이러한 기재 물질 10 은 유리 물질 예컨대 소다-라임 유리, 파이렉스 유리, 바이코어 유리, 석영 유리; 규소; 플라스틱 또는 중합체 (수지상 중합체 포함), 예컨대 폴리(염화비닐), 폴리(비닐 알코올), 폴리(메틸 메타크릴레이트), 폴리(비닐 아세테이트-말레산 무수물), 폴리(디메틸실록산) 모노메타크릴레이트, 시클릭 올레핀 중합체, 플루오로카본 중합체, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌이민; 공중합체 예컨대 폴리(비닐 아세테이트-공-말레산 무수물), 폴리(스티렌-공-말레산 무수물), 폴리(에틸렌-공-아크릴산) 또는 이의 유도체 등을 포함한다.
세포 배양에 적합한 물품 100 의 예는 싱글 및 멀티-웰 플레이트 (예를 들어 6, 12, 96, 384 및 1536 웰 플레이트), 단지, 페트리 디쉬, 플라스크, 비이커, 플레이트, 롤러 바틀, 슬라이드 (예를 들어 챔버 및 멀티챔버 배양 슬라이드), 튜브, 커버 슬립, 컵, 스피너 바틀, 관류 챔버, 생물반응기 및 발효기를 포함한다.
합성 중합체 코팅 20 은 세포가 배양될 수 있는 표면 25 를 제공한다. 상기 합성 중합체 표면 20 은 하기 표 1 에 제시되는 단량체 그룹으로부터 선택되는 중합된 (메트)아크릴레이트 단량체를 포함한다. 펩티드와 같은 다른 물질 (제시되어 있지 않음) 이 합성 중합체 표면 내에 혼입되거나 그에 접합되어 생체모방적 표면이 제조될 수 있다.
| 아크릴레이트 및 메타크릴레이트 단량체 목록 | |
| 단량체 명칭 | 단량체 구조 |
| 테트라(에틸렌 글리콜)디아크릴레이트 |
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| 글리세롤 디메타크릴레이트 |
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| 트리에틸렌 글리콜 디메타크릴레이트 |
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| 1,4-부탄디올 디메타크릴레이트 |
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| 폴리(에틸렌 글리콜)디아크릴레이트 (평균 Mn ~ 258) |
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| 디(에틸렌 글리콜)디메타크릴레이트 |
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| 테트라(에틸렌 글리콜)디메타크릴레이트 |
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| 1,6-헥산디올 프로필레이트 디아크릴레이트 |
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| 네오펜틸 글리콜 디아크릴레이트 |
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| 네오펜틸 글리콜 디메타크릴레이트 |
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| 트리메틸올프로판 벤조에이트 디아크릴레이트 |
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| 트리메틸올프로판 에톡실레이트 (1EO/OH) 메틸 |
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| 트리시클로[5.2.1.02,6]데칸디메탄올 디아크릴레이트 |
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| 네오펜틸 글리콜 에톡실레이트 디아크릴레이트 |
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| 트리메틸올프로판 트리아크릴레이트 |
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표 1 에 열거된 아크릴레이트는 당업계에 공지된 바와 같이 합성될 수 있거나, [Polysciences, Inc., Sigma Aldrich, Inc., 및 Sartomer, Inc.] 와 같은 상업적 판매자로부터 수득될 수 있다.
도 1B 에서 제시된 바와 같이, 중간층 30 은 기재 물질 10 의 표면 15 와 합성 중합체 코팅 20 사이에 적층될 수 있다. 중간층 30 은 코팅 20 의 기질 10 에 대한 결합을 향상시켜, 단량체 퍼짐을 용이하게 하고, 비코팅된 세포친화성 (cytophobic) 인 표면 10 의 일부가 코팅된 영역 상에서의 세포 성장을 장려시키도록 하고, 기재 물질 10 과 비상용성인 단량체 또는 용매와 상용성인 기질을 제공하여, 예를 들어 패턴 프린팅 등을 통해 필요한 경우 지형적 특징을 제공하도록 배치될 수 있다. 예를 들어, 기질 10 이 유리 기질인 경우 유리 기질의 표면을 에폭시 코팅 또는 실란 코팅으로 처리하는 것이 바람직할 수 있다. 다양한 중합체 기재 물질 10 에 대해서는, 폴리아미드, 폴리이미드, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌 또는 폴리아크릴레이트의 중간층 30 을 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 제시되어 있지 않지만, 합성 중합체 코팅 20 이 중간층 30 의 일부에 적층될 수 있는 것으로 이해될 것이다. 또한, 중간층 30 이 기재 물질 10 의 일부에 적층될 수 있는 것으로 이해될 것이다.
다양한 구현예에서는, 기재 물질 10 의 표면 15 는 표면 15 에 바람직한 특성 또는 특징이 부여되도록 물리적 또는 화학적으로 처리된다. 예를 들어, 그리고 하기 논의되는 바와 같이, 표면 15 는 코로나 처리되거나 플라스마 처리될 수 있다. 진공 또는 대기압 플라스마의 예는 고주파 (RF) 및 마이크로파 플라스마 (1 차 및 2 차 모두), 유전체 장벽 방전, 및 공기, 산소, 질소, 아르곤, 이산화탄소, 아산화질소, 또는 수증기를 포함하는 분자 또는 혼합 기체에서 생성된 코로나 방전을 포함한다.
중간층 30 또는 기재 물질 10 상에 적층되는 합성 중합체 코팅층 20 은, 바람직하게는 기저 기질을 균일하게 코팅한다. "균일하게 코팅된" 은 제시된 영역, 예를 들어 배양 플레이트의 웰의 표면에서의 층 20 이 약 5 nm 이상의 두께로 해당 영역을 완전히 코팅하는 것을 의미한다. 균일하게 코팅된 표면의 두께는 표면에 걸쳐 다양할 수 있으나, 이를 통해 기저층 (중간층 30 또는 기재 물질 10) 이 노출되는 균일하게 코팅된 표면 영역은 없다. 불균일한 표면에 걸친 세포 반응은 균일한 표면에 걸친 세포 반응보다 더욱 가변적인 경향이 있다.
합성 중합체 코팅층 20 은 임의 바람직한 두께를 가질 수 있다. 그러나, 두꺼운 코팅, 예를 들어 약 10 ㎛ 초과의 코팅은 표면 장력으로 인해 코팅의 주변부가 불균일한 경향이 있다는 것이 발견되었다. 다양한 구현예에서는, 코팅층 20 의 두께는 약 10 ㎛ 미만이다. 예를 들어, 두께는 약 5 ㎛ 미만, 약 2 ㎛ 미만, 약 1 ㎛ 미만, 약 0.5 ㎛ 미만 또는 약 0.1 ㎛ 미만일 수 있다.
합성 중합체 층 20 을 형성하는 중합체 물질은 임의의 적합한 정도로 가교될 수 있다. 높은 가교도는 폐기물 및 세포 독성을 감소시킬 수 있다.
많은 구현예에서는, 물품 100 은 페트리 디쉬, 멀티-웰 플레이트, 플라스크, 비이커 또는 기타 웰 포함 용기와 같은 웰을 갖는 세포 배양 물품이다. 이제 도 2 를 참조하여, 기재 물질 10 으로부터 형성된 물품 100 은 하나 이상의 웰 50 을 포함할 수 있다. 웰 50 은 측벽 55 및 표면 15 를 포함한다. 도 2B-C 를 참조하여, 합성 중합체 코팅 20 은 표면 15 또는 측벽 55 (또는 상기 도 1 에서 논의된 바와 같이, 하나 이상의 중간층 30 이 표면 15 또는 측벽 55 와 합성 중합체 코팅 20 사이에 적층될 수 있음) 또는 이의 일부에 적층될 수 있다.
다양한 구현예에서는, 물품 100 은 약 5 ㎟ 초과의 영역으로 표면 25 를 갖는 균일하게 코팅된 층 20 을 포함한다. 인간 배아 줄기 세포와 같은 일부 세포가 세포의 콜로니 또는 덩어리 (예를 들어 약 0.5 mm 의 직경을 가짐) 로서 파종되고 정량적 세포 반응을 생성하기에 충분한 수의 콜로니의 부착을 확실하게 하기 위해 적절한 표면이 필요하기 때문에, 표면 15 의 영역이 지나치게 좁은 경우 신뢰성 있는 세포 반응이 용이하게 관찰되지 않을 수 있다. 많은 구현예에서는, 물품 100 이, 약 0.1 ㎠ 초과, 약 0.3 ㎠ 초과, 약 0.9 ㎠ 초과, 또는 약 1 ㎠ 초과의 영역을 갖는 균일하게 코팅된 표면 15 를 갖는 웰 50 을 갖는다.
2. 합성 중합체 층의 코팅
합성 중합체 층은 임의의 공지된 또는 미래에 개발될 방법을 통해 세포 배양 물품의 표면 상에 적층될 수 있다. 바람직하게는, 합성 중합체 층은 전형적인 세포 배양 조건 동안 층이 분리되지 않는 균일한 층을 제공한다. 합성 중합체 표면은 공유 또는 비-공유 상호작용을 통해 기재 물질 기질과 조합될 수 있다. 합성 중합체 표면을 기질과 조합시킬 수 있는 비-공유 상호작용의 예에는 화학적 흡착, 수소 결합, 표면 상호침투, 이온 결합, 반데르발스 힘, 소수성 상호작용, 쌍극자-쌍극자 상호작용, 기계적 맞물림, 및 이의 조합이 포함된다.
다양한 구현예에서는, 기재 물질 기질 표면은, 본원에 제시된 내용과 상충되지 않는 범위로 모든 목적을 위해 전문이 참조로서 본원에 인용된, 발명자 [Gehman et al.] 의 위임번호 20726, 표제 "STEM CELL CULTURE ARTICLE AND SCREENING" 인 그 날짜에 출원된 동시 계속 출원 일련 번호. 호의 교시에 따라 코팅된다.
많은 구현예에서는, 단량체는 세포 배양 물품의 표면 상에 적층되고, 제 자리에서 중합된다. 이러한 구현예에서는, 기재 물질은 본원에서 합성 중합체 물질이 적층되는 "기질" 로서 언급될 것이다. 중합은 용액 상 또는 벌크 상에서 수행될 수 있다.
상기 표 1 에서 확인된 단량체 중 많은 것이 점성이 있기 때문에, 표면 상에 적층되기 전에 점도를 감소시키기 위해 단량체를 적합한 용매에 희석하는 것이 바람직할 수 있다. 점도를 감소시키면 형성되는 합성 중합체 물질의 층을 더 얇고 더욱 균일하게 할 수 있다. 당업자는 적합한 용매를 쉽게 선택할 수 있을 것이다. 바람직하게는 용매는 세포 배양 물품을 형성하는 물질 및 단량체와 상용성이다. 배양되는 세포에 무독성이고 중합 반응에 개입하지 않는 단량체를 선택하는 것이 바람직할 수 있다. 대안적으로는, 또는 부가적으로는, 실질적으로 완전히 제거될 수 있거나, 무독성인 또는 더이상 중합에 개입하지 않는 정도로 제거될 수 있는 용매를 선택하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 상황에서, 진공 또는 극한 열과 같은 엄격한 조건 없이 쉽게 제거가능한 용매가 바람직할 수 있다. 휘발성 용매가 이러한 쉽게 제거가능한 용매의 예이다.
본원에 기재되는 바와 같은 코팅 물품에 대해 다양한 상황에서 적합할 수 있는 일부 용매는 에탄올, 이소프로파놀, 아세틸 아세테이트, 디메틸포름아미드 (DMF), 및 디메틸술폭시드 (DMSO) 를 포함한다. 동시 계속 출원 일련 번호. 호에 기재되는 바와 같이, 중합 전에 용매를 제거하는 것이 바람직한 경우 에탄올은 특히 적합한 용매일 수 있다.
단량체는 원하는 점도 및 단량체 농도를 달성하기 위해 임의의 적합한 양으로 용매로 희석될 수 있다. 일반적으로는 본원에 제시된 교시에 따라 사용되는 단량체 조성물은 약 1% 내지 약 99% 의 단량체를 함유한다. 예를 들어, 단량체는 에탄올 용매로 희석되어 부피로 약 1% 내지 약 50% 단량체, 또는 약 1% 내지 약 10% 단량체를 갖는 조성물을 제공할 수 있다. 단량체는 중합체 층 20 이 원하는 두께를 달성하도록 용매로 희석될 수 있다. 상기 논의된 바와 같이, 적층된 단량체가 너무 두꺼우면 불균일한 표면이 산출될 수 있다. 실시예에서 더욱 상세히 기재되는 바와 같이, 단량체-용매 조성물이 웰 50 의 표면 15 상에, 표면 15 1 ㎠ 당 약 8 ㎕ 초과의 부피로 적층되는 경우에 불균일한 표면이 관찰될 수 있다. 다양한 구현예에서는, 단량체-용매 조성물은 웰 50 의 표면 15 상에, 표면 15 1 ㎠ 당 약 7 ㎕ 이하의 부피로 적층된다. 예를 들어, 단량체-용매 조성물은 웰 50 의 표면 15 상에, 표면 15 1 ㎠ 당 약 5 ㎕ 이하의 부피로, 또는 표면 15 1 ㎠ 당 약 2 ㎕ 이하의 부피로 적층될 수 있다.
다양한 구현예에서는, 합성 중합체 표면은 직접 또는 1 종 이상의 부가적인 중간층 (제시되지는 않음) 을 통해 공유 또는 비-공유 상호작용에 의해 기재 물질과 조합되는 중간층의 표면 상에 적층된다. 이러한 구현예에서는, 중간층은 합성 중합체 표면이 적층되는 "기질" 로서 본원에서 언급될 것이다.
다양한 구현예에서는, 기재 물질의 표면은 처리된다. 표면은 기재 물질 표면에 대한 합성 중합체 표면의 결합을 증가시키기 위해, 기재 물질 표면 상에 단량체 퍼짐을 용이하게 하는 등을 위해 처리될 수 있다. 물론, 기재 물질은 중간층과 관련하여 유사한 목적으로 처리될 수 있다. 다양한 구현예에서는, 표면은 코로나 처리되거나 진공 플라즈마 처리된다. 이러한 처리로부터 수득가능한 고 표면 에너지는 단량체 퍼짐과 균일한 코팅을 용이하게 할 수 있다. 사용될 수 있는 진공 플라즈마 처리의 예에는 마이크로파 진공 플라즈마 처리 및 고주파 진공 플라즈마 처리가 포함된다. 진공 플라즈마 처리는 반응성 기체, 예컨대 산소, 질소, 암모니아 또는 일산화질소의 존재하에서 수행될 수 있다.
합성 중합체 표면을 형성하기 위해, 상기 표 1 에 제시된 1 종 이상의 단량체를 중합시킨다. 하나의 단량체가 사용되는 경우, 중합체는 단량체의 단일중합체로서 언급될 것이다. 2 종 이상의 상이한 단량체가 사용되는 경우, 중합체는 단량체의 공중합체로서 언급될 것이다. 사용되는 단량체는 일관능성, 이관능성 또는 고차관능성일 수 있다. 2 종 이상의 단량체가 사용되는 경우, 단량체의 비율은 다양할 수 있다. 다양한 구현예에서는, 2 개의 단량체가 사용되고, 제 1 단량체 대 제 2 단량체의 부피비는 약 5:95 내지 약 95:5 의 범위이다. 예를 들어, 제 1 단량체 대 제 2 단량체의 비는 약 10:90 내지 약 90:10, 약 20:80 내지 약 80:20, 약 30:70 내지 약 70:30 의 범위이다. 일부 구현예에서는, 제 1 단량체 대 제 2 단량체의 비는 약 50:50, 30:70, 또는 10:90 이다. 단량체의 농도 또는 이관능성 또는 고차관능성 단량체 대 일관능성 단량체의 비를 조정함으로써 중합체의 분자량이 조절될 수 있다는 것으로 이해될 것이다. 이관능성 또는 고차관능성 단량체의 농도 증가는 사슬 내 가교결합도를 증가시킬 것이다.
중합체 층을 형성하는 단량체 외에, 층을 형성하는 조성물은 1 종 이상의 부가적인 화합물, 예컨대 계면활성제, 습윤제, 광개시제, 열 개시제, 촉매, 활성화제, 및 가교결합제를 포함할 수 있다.
임의의 적합한 중합 개시제를 사용할 수 있다. 당업자는 표 1 에 열거된 단량체와 사용하기에 적당한, 적합한 개시제, 예를 들어, 라디칼 개시제 또는 양이온성 개시제를 쉽게 선택할 수 있을 것이다. 다양한 구현예에서는, 사슬 중합을 개시하는 자유 라디칼 단량체를 발생시키기 위해 UV 광이 사용된다.
임의의 적합한 개시제를 사용할 수 있다. 중합 개시제의 예에는 유기 퍼옥시드, 아조 화합물, 퀴논, 니트로소 화합물, 아실 할라이드, 히드라존, 메르캅토 화합물, 피릴리움 화합물, 이미다졸, 클로로트리아진, 벤조인, 벤조인 알킬 에테르, 디케톤, 페논, 또는 이의 혼합물이 포함된다. 적합한 시판되는 UV-활성화 및 가시광선-활성화 광개시제의 예는 상표명 예컨대 IRGACURE 651, IRGACURE 184, IRGACURE 369, IRGACURE 819, DAROCUR 4265 및 DAROCUR 1173 [Ciba Specialty Chemicals, Tarrytown, N.Y. 사제] 및 LUCIRIN TPO 및 LUCIRIN TPO-L [BASF (Charlotte, N.C.) 사제] 이다.
또한 광감작제가 적합한 개시제 시스템에 포함될 수 있다. 대표적인 광감작제는 카르보닐기 또는 3 차 아미노기 또는 이의 혼합물을 갖는다. 카르보닐기를 갖는 광감작제에는 벤조페논, 아세토페논, 벤질, 벤즈알데히드, o-클로로벤즈알데히드, 잔톤, 티오잔톤, 9,10-안트라퀴논, 및 기타 방향족 케톤이 포함된다. 3 차 아민을 갖는 광감작제에는 메틸디에탄올아민, 에틸디에탄올아민, 트리에탄올아민, 페닐메틸에탄올아민, 및 디메틸아미노에틸벤조에이트가 포함된다. 시판되는 광감작제에는 QUANTICURE ITX, QUANTICURE QTX, QUANTICURE PTX, QUANTICURE EPD [Biddle Sawyer Corp. 사제] 가 포함된다.
일반적으로, 광감작제 또는 광개시제 시스템의 양은 약 0.01 내지 10 중량% 로 다양할 수 있다.
양이온성 개시제의 예에는 오늄 양이온의 염, 예컨대 아릴술포늄 염, 뿐 아니라 유기금속 염, 예컨대 이온 아렌 시스템이 포함된다.
단량체가 기질 표면 상에 적층되기 전에 용매에 희석되는 다양한 구현예에서는, 용매는 중합 전에 제거된다. 용매는 임의의 적합한 매카니즘 또는 방법에 의해 제거될 수 있다. 동시 계속 출원 일련 번호. 호에서 기재된 바와 같이, 경화 전 실질적으로 모든 용매를 제거하는 것이 경화 동역학 및 전환되는 단량체의 양을 양호하게 조절할 수 있다는 것이 밝혀졌다. 단량체의 전환률이 증가하는 경우, 폐기물 발생 및 세포독성이 감소된다.
벌크상 (실질적으로 용매가 없음) 또는 용매상으로 중합되는 지의 여부와 상관없이, 단량체는 적합한 개시 매카니즘을 통해 중합된다. 이러한 매카니즘 중 많은 것이 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 온도는 열 개시제를 활성화시키기 위해 증가될 수 있고, 광개시제는 적합한 광 파장에 노출됨 등에 의해 활성화될 수 있다. 수 많은 구현예에 따르면, 단량체 또는 단량체 혼합물은 UV 광을 사용하여 경화된다. 경화는 바람직하게는 산소 억제를 방지하기 위해 비활성 기체 보호, 예컨대 질소 보호 하에서 발생한다. 기체 보호와 조합된 적합한 UV 광은 중합체 전환율을 증가시키고, 코팅 완결성을 확보하고 세포독성을 감소시킬 수 있다.
경화된 합성 중합체 층은 미반응된 단량체 또는 저 분자량 중합체 종류와 같은 불순물을 제거하기 위해 1 회 이상 용매로 세척할 수 있다. 다양한 구현예에서는, 층을 에탄올 용매, 예를 들어, 약 70% 초과의 에탄올, 약 90% 초과의 에탄올, 약 95% 초과의 에탄올 또는 약 99% 초과의 에탄올로 세척한다. 에탄올 용매로의 세척은 세포독성일 수 있는 불순물을 제거할 수 있을 뿐 아니라, 또한 세포로의 인큐베이션 전 표면을 살균하는 역할을 할 수도 있다.
3. 합성 중합체 층 상에서의 세포 인큐베이션
줄기 세포-유래 심근세포는 임의의 적합한 프로토콜에 따라 상기 기재된 바와 같이 합성 중합체 층 상에서 배양될 수 있다. 본원에 사용되는 바와 같은, "줄기 세포 유래 심근세포" 는 줄기 세포의 분화로부터 수득된 심근세포를 의미한다. 일부 구현예에서는, 줄기 세포는 다능 (multipotent), 전능 또는 다능성 (pluripotent) 줄기 세포이다. 일부 구현예에서는, 세포는 대상의 기관 또는 조직에 존재할 수 있다. 많은 구현예에서는, 줄기 세포는 배아 줄기 세포, 예컨대 인간 배아 줄기 세포이다.
인간 배아 줄기 세포 (hES) 가 미분화 상태로 배양시에도 계속 성장하는 능력을 가지기 때문에, 본 발명에 사용하기 위한 hES 세포는 성립된 세포주로부터 수득될 수 있다. 성립된 인간 배아 줄기 세포주의 예로는, H1, H7, H9, H13 또는 H14 (University of Wisconsin 에 의해 설립된 WiCell 로부터 이용가능) (Thompson (1998) Science 282:1145); hESBGN-01, hESBGN-02, hESBGN-03 (BresaGen, Inc., Athens, GA); HES-1, HES-2, HES-3, HES-4, HES-5, HES-6 (ES Cell International, Inc., Singapore); HSF-1, HSF-6 (University of California, San Francisco); I 3, I 3.2, I 3.3, I 4, I 6, I 6.2, J 3, J 3.2 (Technion-Israel Institute of Technology, Haifa, Israel 에서 유도됨); UCSF-1 및 UCSF-2 (Genbacev et al., Fertil. Steril. 83(5):1517-29, 2005); 계통 HUES 1-17 (Cowan et al., NEJM 350(13): 1353-56, 2004); 및 계통 ACT-14 (Klimanskaya et al., Lancet, 365(9471):1636-41, 2005) 가 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에 사용되는 배아 줄기 세포는 또한 일차 배아 조직으로부터 직접 수득될 수 있다. 전형적으로는 이것은 포배 단계의 동결 시험관 내 수정란 (이것은 다르게는 폐기될 수도 있다) 을 사용하여 수행된다.
본 발명에 따른 심근세포는 또한 유도된 영장류 다능성 줄기 (iPS) 세포로부터 분화될 수 있다. iPS 세포는 hES 세포와 같은 다능성 줄기 세포의 표현형을 획득하기 위해 재프로그램화되는 식으로, 예를 들어, 1 종 이상의 적합한 벡터로의 트랜스펙션에 의해 유전적으로 개질된 인간과 같은 청년기 또는 성체 포유류로부터 수득되는 세포를 말한다. 이러한 재프로그램된 세포에 의해 획득된 표현형 특성에는 포배로부터 단리된 줄기 세포를 닮은 형태학 뿐 아니라 배아 줄기 세포 유래의 포배를 닮은 표면 항원 발현, 유전자 발현 및 텔로머라아제 활성이 포함된다. iPS 세포는 전형적으로 일차 배엽: 외배엽, 내배엽 및 중배엽 각각으로부터 1 종 이상의 세포로 분화하는 능력을 가지므로, 심근세포로의 분화에 적합하다. 또한, iPS 세포는 hES 세포와 유사하게 면역-결핍 마우스, 예를 들어, SCID 마우스 내에 주입되는 경우에 기형종을 형성한다. (Takahashi et al., (2007) Cell 131(5):861; Yu et al., (2007) Science318:5858).
줄기 세포 유래 심근세포는 임의의 적합한 방법에 의해 수득될 수 있다. 이러한 세포를 수득하기 위한 하나의 방법은 [Laflamme et al., "Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infracted rats", Nature Biotechnology, 25: 1015 - 1024 (2007)] 에 기재되어 있다. 간략하게는, 미분화된 인간 배아 줄기 세포, 예컨대 여성 H7 인간 배아 줄기 세포주로부터 유래된 세포를 MATRIGEL-코팅 플레이트 상에 약 100,000 세포/㎠ 의 밀도로 파종하고, 매일 hES 세포 성장 배지 (KO DMEM + 20% 혈청 대체물, 1 mM 1-글루타민, 1% NEAA, 0.1 mM 2-ME + hbFGF, 80 ng/ml 및 TGFb1, 0.5 ng/ml) 를 새롭게 공급한다. 분화를 유도하기 위해, 성장 배지를 약 100 ng/ml 인간 재조합 액티빈 A (R&D Systems) 가 보충된 RPMI-B27 배지 (Invitrogen) 로 약 24 시간 동안 그 다음, 10 ng/ml 인간 재조합 BMP4 (R&D Systems) 가 보충된 RPMI-B27 배지 (Invitrogen) 로 4 일 동안 대체할 수 있다. 물론, 임의의 기타 적합한 방법이 사용될 수 있다 (예를 들어, US 특허 제 7,425,448 호 참조).
세포를 파종하기 전에 세포를 수확하고 성장 배지와 같은 적합한 배지에 현탁할 수 있고, 일단 파종되면 세포는 표면 상에서 배양된다. 예를 들어, 세포는 혈청-함유 배지, 조건화 배지 또는 화학적으로 규정된 배지에 현탁 및 배양될 수 있다. 본원에 사용되는 바와 같은, "화학적으로 규정된 배지" 는 미공지된 조성의 성분을 함유하고 있지 않은 세포 배양 배지를 의미한다. 화학적으로 규정된 배지는 다양한 구현예에서는, 미공지된 기원의 단백질, 가수분해물, 또는 펩티드를 함유하지 않는다. 일부 구현예에서는, 조건화 배지는 공지된 조성의 폴리펩티드 또는 단백질, 예컨대 재조합 성장 호르몬을 함유한다. 화학적으로 규정된 배지의 모든 성분이 공지된 화학적 구조 및 조성을 갖기 때문에, 배양 조건의 가변성이 감소하므로 세포 반응이 더욱 재현가능할 수 있다. 또한, 오염 가능성이 감소한다. 또한, 적어도 일부는 상기 논의된 인자들로 인해, 규모화 능력이 보다 용이해진다. 화학적으로 규정된 세포 배양 배지는 Invitrogen (Invitrogen Corporation, 1600 Faraday Avenue, PO Box 6482, Carlsbad, California 92008) 의 인간 배아 줄기 세포 (hESC) 의 성장 및 증식을 위해 특별하게 제형화된 완전히 규정된 혈청 및 영양세포가 없는 배지 (SFM) 인 StemPro® 및 StemCell Technologies, Inc. 의 인간 배아 줄기 세포에 대한 유지 배지인 mTeSR™1 로서 시판된다.
세포는 임의의 적합한 농도로 파종될 수 있다. 전형적으로는, 세포는 약 10,000 세포/㎠ (기질) 내지 약 500,000 세포/㎠ 로 파종된다. 예를 들어, 세포는 약 50,000 세포/㎠ (기질) 내지 약 150,000 세포/㎠ 로 파종될 수 있다. 그러나, 그 초과 및 미만의 농도도 쉽게 사용될 수 있다. 인큐베이션 시간 및 조건, 예컨대 온도, CO2 및 O2 수준, 성장 배지 등은 배양되는 세포의 특성에 따라 다를 것이고, 쉽게 변형이 가능하다. 세포가 표면 상에 인큐베이션되는 시간은 연구되는 세포 반응 또는 원하는 세포 반응에 따라 다를 수 있다.
줄기 세포 유래 심근세포가 정말로 심근세포인지 또는 사용된 줄기 세포가 심근세포로 성공적으로 분화되었는지를 확인하기 위해, 필요하다면 임의의 적합한 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 특정 심근세포-선별 마커의 존재를 조사할 수 있다. 이러한 마커에는 Nkx2.5 및 α-액티닌, 심장 트로포닌 I 이 포함된다. 이러한 마커에 대한 항체는 표준 면역세포화학 또는 유세포 분석 기술에 사용될 수 있다. 부가적으로는 또는 대안적으로는, 세포가 심근세포의 특성을 갖는 지의 여부를 결정하기 위해 배양 시 심근세포의 박동을 관찰함으로써 또는 다양한 전기생리학적 분석을 수행함으로써 세포 형태학 또는 기능을 평가할 수 있다.
배양된 줄기 세포 유래 심근세포는 치료 용도의 개발을 위해, 약물 발견 및 독성학을 위해 또는 치료 목적을 위한, 동물에서 배양시 조사 연구를 비롯하여 임의의 적합한 목적에 사용될 수 있다. 하나의 잠재적인 치료 또는 조사 목적은 예를 들어, [Laflamme et al., Nature Biotechnology, 25: 1015 - 1024 (2007)] 에 기재되어 있는 바와 같은 경색으로 인한 심장 손상의 복구이다. 또한 세포는 공지된 방법에 따라 cDNA 라이브러리를 제작하는데 사용될 수 있다. cDNA 라이브러리는 분화된 심근세포에서 유전자 발현을 연구하는데 사용될 수 있다. 예를 들어 분화된 심근세포로부터 수득된 라이브러리를 심근세포가 유래된 미분화된 줄기 세포로부터의 cDNA 라이브러리와 비교하여, 심근세포의 분화 및 발달과 관련된 유전자의 확인 및 단리를 가능하게 할 수 있다.
이하, 비제한적인 실시예가 제시되며, 상기 논의된 물품 및 방법의 다양한 구현예를 기술한다.
실시예
실시예 1: 화학적으로 규정된 배지에서 줄기 세포 유래 심근세포를 배양하는데 적합한 아크릴 코팅 표면의 확인
1. 코팅 제조
다양한 아크릴레이트 및 메타크릴레이트 단량체의 단일단량체 또는 공중합체로부터 아크릴 코팅 표면을 제조하였다. 공중합체의 경우 2 가지 상이한 아크릴레이트 또는 메타크릴레이트 단량체를 사용하였다. 간략하게는, 단량체를 1% w/w 의 광개시제 Irgacure 819 (Ciba Specialty Chemiscals, Inc.) 와 혼합하고, 단독으로 사용하거나 70:30 의 부피비에 따라 다른 단량체 제형 (단량체와 1% w/w 의 광개시제) 과 혼화하였다. 그 다음 진공 플라즈마 처리된 시클릭 올레핀 공중합체 플레이트 (Corning Life Science Development 그룹 사제) 의 웰에 상기 제형을 2.5 ㎕ 의 부피로 넣었다. 상기 플레이트를 수평으로 평평하게 30 분 동안 두어 제형이 퍼지도록 두었다. N2 퍼지 박스 (융합된 실리카 윈도우를 가짐) 에서 13 mW/㎠ 펄스 (100 Hz) UV 광 (Xenon RC-700) 으로 1 분 동안 상기 코팅을 경화시켰다. 세포 배양 전 모든 플레이트를 25-35 kGy Gamma 방사선으로 멸균하였다.
2. 세포 조제 및 어세이
실험 전, H7 hES 세포를 SR 배지 (KO-DMEM, 20 % KO-혈청 대체물, 1 mM L-글루타민, 0.1 mM β-메르캅토에탄올, 1% 비필수 아미노산, 80 ng/ml hbFGF 및 0.5 ng/ml TGFb1) 에서의 MATRIGEL-코팅 플레이트 상에서 미분화 상태로 유지하였다. 직접 분화 프로토콜을 사용하여 hESC-유래 심근세포를 발생시켰다. 간략하게는, 미분화 H7 세포를 200 U/ml 콜라게나아제 IV 에 의해 수확하고, MATRIGEL-코팅 플레이트 상에 SR 배지 중 100,000 세포/㎠ 의 밀도로 파종하였다. 매일 배지를 교환하면서 세포를 6 일 동안 배양하였다. SR 배지를, 100 ng/ml 인간 재조합 액티빈 A 가 보충된 RPMI-B27 배지로 24 시간, 그 후 10 ng/ml 인간 재조합 BMP4 가 보충된 RPMI-B27 배지로 4 일 동안 대체하여 심장 분화를 개시하였다. 이 시점에서, 애큐타아제 (Accutase) 처리에 의해 세포를 탈락시키고, RPMI-B27 배지 (w/o 성장 인자) 에 재현탁하고, 양성 대조군으로서 아크릴레이트 또는 MATRIGEL 의 상이한 2 원 혼합물로 코팅된 Corning CB/TOPAS 96-웰 플레이트 상에 100,000 세포/㎠ 의 밀도로 파종하였다. 매 2 ~ 3 일 마다 동일한 배지 교환을 하면서 다시 2 ~ 3 주 동안 세포를 배양하였다. 웰을 현미경으로 관찰하고, 자발적 박동 활성을 기록하였다.
분화 프로토콜 종료시, 세포를 4% 파라포름알데하이드로 고정하고 심근세포 (CM) 의 경우 특이적 마커, Nkx2.5 및 α-액티닌에 대해 면역염색하고, 핵을 염색하기 위해 4'-6-디아미디노-2-페닐인돌 (DAPI) 로 대응염색하였다. 각 플레이트를 ArrayScan 으로 스캐닝한 후, 각각의 표면에 대해 하기 정량 분석을 수행하였다: 1) TNC: DAPI 양성 세포 수에 근거한 세포의 총 수, 2) TNC: Nkx2.5-양성 세포 수에 근거한 CM 의 총 수, 3) CM 수율 = TNC/TNC.
3. 결과
시험된 표면의 오직 일부분만이 일부 핵심 특성 및 기능을 유지하면서 세포 성장을 지지하는 것으로 밝혀졌다. 화학적으로 규정된 배지에서 분화된 인간 배아 심근세포의 성장을 지지하는 코팅 표면의 예는 표 2 에 열거되어 있고, 단량체 (1) 대 단량체 (2) 의 부피비는 70:30 이다. 이러한 표면은 세포의 형태학 및 표면에 대한 세포의 부착의 정량적 평가에 근거하여 특징분석 및 "등급" 을 매겼다. 아크릴레이트 표면 등급은 하기 범주를 고려하여 수행되었다: 1) 총 세포수, 2) 총 CM 수, 3) CM 수율, 4) 박동 영역의 존재, 5) Matrigel 유래 CM 형태학과의 유사성. 관찰된 분화된 배아 근세포에 대한 특성 뿐 아니라 평가된 등급에 대한 주석이 표 2 에 제시되어 있다. 예를 들어, "Sim MA" 는 상기 표면 상에서 성장하는 세포가 Matrigel™ 상에서 성장한 세포와 유사하였다는 것을 나타내는 주석이다. "Sim TOP" 는 상기 표면 상에서 성장하는 세포가 TOPAS® 표면 [TOPAS, Florence, Kentucky] 으로서 판매되는 플라즈마 처리된 시클릭 올레핀 공중합체 표면 상에서 성장한 세포와 유사하였다는 것을 나타내는 주석이다. 또한 주석은 표면 중 일부가 배양 시 박동을 시작하였던 분화된 배아 근세포를 지지하였다는 것을 나타낸다.
| 화학적으로 규정된 배지에서 hES 세포 유래 심근세포의 배양을 지지하는 아크릴 중합체의 예시 조성 | ||
| 제형 ID | 단량체 (1) | 단량체 (2) |
| 95-1 | 테트라(에틸렌 글리콜)디아크릴레이트 100% | |
| 95-2 | 글리세롤 디메타크릴레이트 100% | |
| 90-2 | 트리에틸렌 글리콜 디메타크릴레이트 100% | |
| 90-4 | 1,4-부틴디올 디메타크릴레이트 100% | |
| 95-3 | 폴리(에틸렌 글리콜)디아크릴레이트 100% | |
| 122-1 | 테트라(에틸렌 글리콜)디아크릴레이트 70% | 글리세롤 디메타크릴레이트 30% |
| 122-3 | 테트라(에틸렌 글리콜)디아크릴레이트 70% | 1,4-부틴디올 디메타크릴레이트 30% |
| 27-2 | 테트라(에틸렌 글리콜)디아크릴레이트 70% | 트리메틸올프로판 트리아크릴레이트 30% |
| 123-1 | 글리세롤 디메타크릴레이트 70% | 테트라(에틸렌 글리콜)디아크릴레이트 30% |
| 123-2 | 글리세롤 디메타크릴레이트 70% | 트리(에틸렌 글리콜)디메타크릴레이트 30% |
| 123-3 | 글리세롤 디메타크릴레이트 70% | 1,4-부틴디올 디메타크릴레이트 30% |
| 123-4 | 글리세롤 디메타크릴레이트 70% | 폴리(에틸렌 글리콜)디아크릴레이트 30% |
| 123-6 | 트리에틸렌 글리콜 디메타크릴레이트 70% | 글리세롤 디메타크릴레이트 30% |
| 123-7 | 트리에틸렌 글리콜 디메타크릴레이트 70% | 1,4-부틴디올 디메타크릴레이트 30% |
| 124-2 | 1,4-부틴디올 디메타크릴레이트 70% | 글리세롤 디메타크릴레이트 30% |
| 124-3 | 1,4-부틴디올 디메타크릴레이트 70% | 트리에틸렌 글리콜 디메타크릴레이트 30% |
| 124-5 | 폴리(에틸렌 글리콜)디아크릴레이트 70% | 테트라(에틸렌 글리콜)디아크릴레이트 30% |
| 133-1 | 디(에틸렌 글리콜)디메타크릴레이트 70% | 트리에틸렌 글리콜 디메타크릴레이트 30% |
| 134-1 | 테트라에틸렌 글리콜 디메타크릴레이트 70% | 디(에틸렌 글리콜)디메타크릴레이트 30% |
| 140-1 | 트리메틸올프로판 트리아크릴레이트 70% | 네오펜틸 글리콜 에톡실레이트 디아크릴레이트 30% |
| 아크릴레이트 중합체 표면 상에서 배양된 h7 분화된 심근세포의 세포 계수, 세포 표면 마커, 및 기능 | ||||||
| ID | 등급 | 박동 | 평균 세포 계수 (웰 당) |
평균 % Nkx2.5 |
심 수율 (Nkx2.5 계수에 근거함) |
주석 |
| 95-2 | A | y | 19970 | 7 | 1397.9 | Sim MA |
| 90-2 | C- | 5420 | 14 | 758.8 | Sim MA, 박리된 덩어리 | |
| 90-4 | B- | y | 6907 | 24 | 1657.68 | Sim TOP |
| 95-3 | C | y | 3788 | 24 | 909.12 | |
| 122-3 | B | 6061 | 3 | 181.83 | Sim as MA, 박동 무 | |
| 123-1 | B+ | y | 5250 | 5 | 262.5 | Sim MA, 박동 |
| 123-2 | A | 6327 | 7 | 442.89 | 양호한 부착, 박동 무 | |
| 123-3 | A | 6223 | 8 | 497.84 | 양호한 부착, 박동 무 | |
| 123-4 | B- | 4954 | 4 | 198.16 | 다수 부착, 죽음 | |
| 123-7 | C | 4246 | 15 | 636.9 | 박리됨 | |
| 124-2 | A | y | 3798 | 21 | 797.58 | Sim TOP 박동 |
| 124-3 | B | y | 2267 | 8 | 497.84 | Sim TOP 박동 |
| 124-5 | C | y | 940 | 27 | 253.8 | 박동, 그러나 부착 열등 |
| 140-1 | B- | y | 2886 | 33 | 952.38 | Sim TOP |
다른 시험된 단일중합체 및 공중합체 조합의 경우, 적은 총 세포수 또는 적은 Nkx2.5-양성 세포가 표면 상에 존재하기 때문에, 분화 과정 종료시에 심근세포 수율이 매우 낮거나 거의 없이 관찰되었다.
도 3 은 제형 95-2 (A), 제형 27-2 (B), 및 MATRIGEL (C) 의 표면 상에 배양된 분화된 심근세포의 형광 이미지를 보여준다. 세포 형태학, Nkx 2.5 마커 발현 (녹색) 및 알파-액티닌 마커 발현 (적색) 은 MATRIGEL 과 유사하였다. 또한, 도 3 에서 묘사된 세포는 파라포름알데하이드로 고정 전에 박동을 나타냈다.
그러므로, 이상 "줄기 세포 유래 심근세포의 배양용 합성 표면 {SYNTHETIC SURFACES FOR CULTURING STEM CELL DERIVED CARDIOMYOCYTES}" 의 구현예를 기재하였다. 당업자는 본원에 기재된 어레이, 조성물, 키트 및 방법을 기재된 것 이외의 구현예로도 실시가능하다는 것을 인지할 것이다. 기재된 구현예는 제한이 아닌 설명의 목적으로 제시되어 있다.
Claims (17)
- 중합체 물질 상에 다능성 줄기 세포-유래 심근세포를 포함하는 현탁액을 적층시키는 단계; 및
적층된 다능성 줄기 세포-유래 심근세포를 세포 배양 배지에서 배양하는 단계
를 포함하는 다능성 줄기 세포-유래 심근세포의 배양 방법으로서, 상기 중합체 물질이 하기를 포함하는 방법:
(i) 테트라(에틸렌 글리콜)디아크릴레이트, 글리세롤 디메타크릴레이트, 트리에틸렌 글리콜 디메타크릴레이트, 1,4-부탄디올 디메타크릴레이트, 및 폴리(에틸렌 글리콜)디아크릴레이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 단일중합체, 또는
(ii) 하기로부터 형성되는 공중합체:
테트라(에틸렌 글리콜)디아크릴레이트 및 1,4-부탄디올 디메타크릴레이트,
글리세롤 디메타크릴레이트 및 테트라(에틸렌 글리콜)디아크릴레이트,
글리세롤 디메타크릴레이트 및 트리(에틸렌 글리콜)디메타크릴레이트,
글리세롤 디메타크릴레이트 및 1,4-부탄디올 디메타크릴레이트,
글리세롤 디메타크릴레이트 및 폴리(에틸렌 글리콜)디아크릴레이트,
트리에틸렌 글리콜 디메타크릴레이트 및 1,4-부탄디올 디메타크릴레이트,
폴리(에틸렌 글리콜)디아크릴레이트 및 테트라(에틸렌 글리콜)디아크릴레이트,
디(에틸렌 글리콜)디메타크릴레이트 및 테트라에틸렌 글리콜 디메타크릴레이트,
테트라(에틸렌 글리콜)디아크릴레이트 및 트리메틸올프로판 트리아크릴레이트,
트리메틸올프로판 트리아크릴레이트 및 네오펜틸 글리콜 에톡실레이트 디아크릴레이트, 또는
테트라(에틸렌 글리콜)디메타크릴레이트 및 디(에틸렌 글리콜)디메타크릴레이트. - 제 1 항에 있어서, 중합체 물질이 하기를 포함하는 방법:
(i) 글리세롤 디메타크릴레이트, 트리에틸렌 글리콜 디메타크릴레이트, 1,4-부탄디올 디메타크릴레이트, 및 폴리(에틸렌 글리콜)디아크릴레이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 단일중합체, 또는
(ii) 하기로부터 형성되는 공중합체:
테트라(에틸렌 글리콜)디아크릴레이트 및 1,4-부탄디올 디메타크릴레이트,
글리세롤 디메타크릴레이트 및 테트라(에틸렌 글리콜)디아크릴레이트,
글리세롤 디메타크릴레이트 및 트리(에틸렌 글리콜)디메타크릴레이트,
글리세롤 디메타크릴레이트 및 1,4-부탄디올 디메타크릴레이트,
글리세롤 디메타크릴레이트 및 폴리(에틸렌 글리콜)디아크릴레이트,
트리에틸렌 글리콜 디메타크릴레이트 및 1,4-부탄디올 디메타크릴레이트,
폴리(에틸렌 글리콜)디아크릴레이트 및 테트라(에틸렌 글리콜)디아크릴레이트, 또는
트리메틸올프로판 트리아크릴레이트 및 네오펜틸 글리콜 에톡실레이트 디아크릴레이트. - 제 1 항에 있어서, 중합체 물질이 하기를 포함하는 방법:
(i) 글리세롤 디메타크릴레이트, 1,4-부탄디올 디메타크릴레이트, 및 폴리(에틸렌 글리콜)디아크릴레이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 단일중합체, 또는
(ii) 하기로부터 형성되는 공중합체:
글리세롤 디메타크릴레이트 및 테트라(에틸렌 글리콜)디아크릴레이트,
폴리(에틸렌 글리콜)디아크릴레이트 및 테트라(에틸렌 글리콜)디아크릴레이트, 또는
트리메틸올프로판 트리아크릴레이트 및 네오펜틸 글리콜 에톡실레이트 디아크릴레이트. - 제 1 항에 있어서, 중합체 물질이 글리세롤 디메타크릴레이트를 포함하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 중합체 물질이 트리에틸렌 글리콜 디메타크릴레이트를 포함하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 중합체 물질이 1,4-부탄디올 디메타크릴레이트를 포함하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 중합체 물질이 폴리(에틸렌 글리콜)디아크릴레이트를 포함하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 중합체 물질이 테트라(에틸렌 글리콜)디아크릴레이트 및 1,4-부탄디올 디메타크릴레이트로부터 형성되는 공중합체를 포함하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 중합체 물질이 글리세롤 디메타크릴레이트 및 테트라(에틸렌 글리콜)디아크릴레이트로부터 형성되는 공중합체를 포함하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 중합체 물질이 글리세롤 디메타크릴레이트 및 트리(에틸렌 글리콜)디메타크릴레이트로부터 형성되는 공중합체를 포함하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 중합체 물질이 글리세롤 디메타크릴레이트 및 1,4-부탄디올 디메타크릴레이트로부터 형성되는 공중합체를 포함하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 중합체 물질이 글리세롤 디메타크릴레이트 및 폴리(에틸렌 글리콜)디아크릴레이트로부터 형성되는 공중합체를 포함하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 중합체 물질이 트리에틸렌 글리콜 디메타크릴레이트 및 1,4-부탄디올 디메타크릴레이트로부터 형성되는 공중합체를 포함하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 중합체 물질이 폴리(에틸렌 글리콜)디아크릴레이트 및 테트라(에틸렌 글리콜)디아크릴레이트로부터 형성되는 공중합체를 포함하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 중합체 물질이 트리메틸올프로판 트리아크릴레이트 및 네오펜틸 글리콜 에톡실레이트 디아크릴레이트로부터 형성되는 공중합체를 포함하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 적층된 다능성 줄기 세포-유래 심근세포를 세포 배양 배지에서 배양하는 것이 화학적으로 규정된 배지에서 심근세포를 배양하는 것을 포함하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 다능성 줄기 세포-유래 심근세포가 인간 배아 줄기 세포-유래 심근세포인 방법.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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