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JPS58146280A - 増殖能を有する酵母固定化物の製造方法 - Google Patents

増殖能を有する酵母固定化物の製造方法

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Publication number
JPS58146280A
JPS58146280A JP2887082A JP2887082A JPS58146280A JP S58146280 A JPS58146280 A JP S58146280A JP 2887082 A JP2887082 A JP 2887082A JP 2887082 A JP2887082 A JP 2887082A JP S58146280 A JPS58146280 A JP S58146280A
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JP
Japan
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yeast
carrier
immobilized
porous carrier
irradiation
Prior art date
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Application number
JP2887082A
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JPH0339673B2 (ja
Inventor
Isao Kaetsu
嘉悦 勲
Taku Fujimura
卓 藤村
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Japan Atomic Energy Agency
Original Assignee
Japan Atomic Energy Research Institute
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Publication date
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  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】
本発明は増殖能を有する酵母固定化物およびその製造方
法に関する。 石油に代る新しいエネルギー源として醗酵法によるエタ
ノールの製造に関心が高1っている。しかしながら、エ
タノールは酵ffiを用いて糖から生産されて来たが、
回分式反応であり、またその醗酵反応速度も遅く、今や
連続生産によび反応高速化の技術が要望されている。 近年、酵@、を含む微生物の固定1ヒ法が検討さ汽合成
捷たは天然高分子物質全坦体として用いる固定化法が提
案されている。本願発明者等も微生物や酵素全モノマー
と混合し低温で放射腺重合金行うことによって、本来の
活性をあまり失うことなしにこれらの微生物や酵素を有
効に固定化する方法全すでに提案した。本、顆発明者等
のこの提案の方法を含めて、所謂包括法による固定化法
(Cおいては、微生物や酵素など全重合性単量体または
温度を上げて溶解した天然高分子に混合し、これを光ま
たは放射線照射、触媒の使用寸たは冷却などの手段音用
いて固化して固定化物を作る方法が採用されている。従
って、このような従来の包括法においては、微生物や酵
素は固定化担体の製造の過程にすでに存在し固定化反応
によって失活する怖れがある。 本発明の目的は、酵母の固定化においてこのような失活
の怖れがないばかシではなく、担体の表面または内部で
増殖し単位体積当りの数が同定化時よりもはるか(て高
くそれによって活性が著しく高められた増殖能を有する
酵母固定化物を提供することであり、さらにこのような
酵母固定化物の製造方法ケ提供することである。 本願発明者等は、この目的達成のため観意研究の結果、
酵母の非存在下で種々の手段によってまづ多孔質担体を
作製し、この多孔質担体全酵母を含む@養液中で振とう
して酵母全多孔性担体の表面に吸着させ、次にその一!
ま振とうを続けることによって、酵母全増殖させながら
固定化するか、あるいは、酵母を吸着した多孔性1月体
に重合性単量体を付着させこれを重合させて固定し、次
に酵母培養液中で振と9することによって増殖させる方
法を開発し本発明の多孔質担体上に固定された増殖能ケ
有する酵母固定化物及び水゛または非重合性溶媒を含む
重合性単量体を室温以下において重合して多孔質担体ケ
作製し、該担体ケ水で十分に膨潤させ念後、酵母培養液
中で伽とうして相体表面に酵母全吸着せしめ、さらに重
合性車体の低濃度溶液に浸し該単体を重合して担体表面
に高分子皮膜を形成させるかあるいはその1まざらに酵
母培養液中で振と9することから成る増殖能を有する酵
母固定化物の製造方法に到達した。 このように本発明の方法は、酵母の非存在下で種々の化
学反応によって固定化担体全まづ作製し、次に酵母の存
在下で少量の重合性単量体を種々の化学反応によって重
合させるか、または重合性単量体、化学反応を全く使用
しないで固定化する。 従って本発明の方法は、担体を作る際に酵母がすでに存
在し反応によって酵母が失活しやすい従来の包括法に比
較して、酵母の失活が少ないという利点がある。また固
定化時に存在した酵母のみを利用する従来の大部分の方
法に対して、本発明は固定化物の表面捷たは内部で酵母
を増殖させて、酵母の単位体積当りの数を固定化時より
もはるかに高くシ、それによって固定化物の活性を著し
く高めるという特徴ケ有する。 本発明(でおいては、多孔性担体の適度な柔軟性は吸着
した酵母を活発に増殖させ、酵母の増Mによる酵母の体
積の増加を受は入れる受容性を担体が持つ為に不可欠で
あり、担体を作る素材の撰択および、作製した多孔性担
体を水に長期間浸して十分膨潤させることによう達成さ
れる。普た多孔性担体の孔の大きさは酵母の大きさの制
限から5に以上であることが望ましい。 次に、本発明の方法を具体的に説明する。 まづ、本発明の方法に使用される重合性単量体は下記の
[A1群に属し単独で室温〜低温においても結晶化せず
安定な過冷却状態になる1種以上の単量体、もしくは、
それ自体は過冷却性ケ有しないが[A]群単量体と30
%以下で混合する時混合した単量体全体として過冷却性
を保持するごときCB]群の単量体である。 〔A〕群単量体: ヒドロキシブチルアクリレート、ヒドロキンエチルアク
リレート、ヒドロキシプロピルメタクリレート、ヒドロ
キシゾロピルアクリレート、ヒドロキシブチルメタクリ
レート、ヒドロキシブチルアクリレート、ヒドロキシペ
ンチルメタクリレート、ヒドロキシペンチルアクリレー
ト、ヒドロキシへキシルメタクリレート、ヒドロキシへ
キシルアクリレート、ヒドロキシへブチルメタクリレー
ト、ヒドロキシへブチルアクリレート、グリシジルメタ
クリレート、グリシジルアクリレート、ジエチレングリ
コールジメタクリレート、ジェチレンゲリコールジアク
リレート、テトラエチレングリコールジアクリレート、
テトラエチレングリコールジアクリレート、ポリエチレ
ングリコールジアクリレート、ポリエチレングリコール
ジアクリレート、エチレングリコールジメタクリレート
、エチレングリコールジアクリレート、フ0ピレングリ
コールジメタクリレート、プロピレングリコールジアク
リレート、ジプロピレングリコールジメタクリレート、
ジプロピレングリコール)シフクリL/−ト・ ボリプ
°′v7グリ゛−″ジメタクリレート、ポリプロピレン
グリコールジアクリレート、ブチレングリコールジメタ
クリレート。 ブチレングリコールジアクリレート、ベンタンジオール
ジメタクリレート、ベンタンジオールジアクリレート、
ヘキサンジオールジメタクリレート、ヘキサンジオール
ジアクリレート、ヘプタンジオールジメタクリレート、
ヘプタンジオールジアクリレート、ネオペンチルグリコ
ールジメタクリレート、ネオペンチルグリコールジアク
リレート、トリメチロールエタントリメタクリレート、
トリメチロールエタントリアクリレート、トリメチロー
ルゾロノξントリメタクリレート、トリメチロールプロ
バントl/アクリレート、グリセロールモノメタクリレ
ート、グリセロールモノアクリレート、グリセロールジ
メタクリレート、グリセロールジアクリレート、グリセ
ロールトリメタクリレート、グリセロールトリアク1ル
−ト、ジエチルアミノエチルメタクリレート、ジエチル
アミノエチルアクリレート、ジエチルアミンブチルメタ
クリレート、ジエチルアミノブチルアクリレート、ジメ
チルアミノエチルメタクリレート、ジメチルアミノエチ
ルアクリレート、ジメチルアミンブチルメタクリレート
、ジメチルアミノブチルアクリレート、ベンジルメタク
リレート、メトキシポリエチレングリコールメタクリレ
ート、メトキシポリエチレンクリコールアクリレート、
エトキシポリエチレングリコールメタアクリレート、エ
トキシポリエチレングリコールアクリレート、メトキシ
プロピレングリコールメタクリレート、メトキシプロピ
レンクリコールアクリレート、エトキシプロピレングリ
コールメタクリレート、エトキシプロピレングリコール
アクリレート、等。 [B]群単量体: 酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル、酪酸ビニル、メチル
メタクリレート、メチルアクリレート、エチルメタクリ
レート、エチルアクリレート、プロピルメタクリレート
、プロピルアクリレート、ブチルメタクリレート、ブチ
ルアクリレート、ペンチルメタクリレート、ペンチルア
クリレート、ヘキシルメタクリレート、ヘキシルアクリ
レート、ラウリルメタクリレート、ラウリルアクリレー
ト、ステアリルメタクリレート、ステアリルアクリレー
ト、スチレン、ビニルトルエン、スルフォン化スチレン
、アクリル酸、メタクリル酸、アミノスチレン、ビニル
ピロリドン、アクリルアミド、メタクリルアミド、メチ
レンビスアクリルアミド、メチロールアクリルアミド、
アクリロニトリル、メタクリレートリル、シア リ・ル
ンタレート、イタコン酸、無水マレイン酸、ジアリルイ
ンフタレート、コハク酸ジアリル、イタコン酸ジアリル
、ジビニルベンゼン、トリアリルシアヌレート、等。 次に、本発明に使用される非重合性情aは下記のごとき
〔03群の溶媒である:
〔0〕群: アセトン、メチルエチルケトン、エチレングリコールジ
エチルエーテル、ギ酸メチル、ギ酸エチル、酢酸メチル
、グリコールカルボネート、酢酸エチル、エチレンクリ
コールモノメチルエーテルのアセタート、エチレングリ
コールモノエテルエーテルのアセタート、グリコールジ
アセテート、グリコールモノメチルエーテル、クリコー
ルモノエチルエーテル、クリコールモノブチルエーテル
、ジエチレングリコール、ジエチレングリコールモノメ
チルエーテル、ジエチレングリコールモノエチルエーテ
ル、メチルアルコール、エチルアルコール、n 、/J
ロピルアルコール、インプロピルアルコール、エチレン
クリコール、  5ec−メチルアルコール、等。 〔A3群及び[E]群に示す重合性単量体を、水または
[0]群に示す非重合性溶媒と混合して、室温以下に赴
いて光重たけ電離性放射線の照射による重合反応によっ
て高分子の多孔質担体を作る。次にこの多孔質担体を水
に数日1’i1浸1〜でおき、水で十分膨、藺させたの
ち、高圧蒸気滅菌器なとで滅菌することが望−ましい。 (1)  こうして作製した多孔質担体全酵母培養液中
で24時間振とうすることにより酵母が多孔質担体の表
面に吸着する。この酵母の吸着した多孔質担体を重合性
単量体の低濃度溶液に短時間浸し、光または電離性放射
線重合によシ担体表面に薄い高分子の皮膜を形成させる
ことによシ固定イヒする。 この固定化物全酵母培養液中で振とうによって好気的な
酵母の増殖に適した条件を保つことにより、固定化増殖
114母が得られる。 (2)上記のように作製した多孔性担体を酵母培二赫液
中で伽とうすることによυ、酵母が多孔性担体の表面に
@未的に吸着する。酵母が吸着した多孔性担体をそのま
ま史に酵@@舎液中で振と9によって好気的な酵母の増
殖(C適した条件を保つことによジ、吸着した酵母は増
殖しながら多孔性担体内部に侵入する。以上の過程を経
て酵母は活発な増殖状態を保ちながら多孔性担体の表面
および内部に固定化される。酵母が増少直し々から多孔
性)8体内部に侵入する際に、多孔性担体が適度な柔軟
性を持つことは不可欠で、この柔軟性(でよって相体内
部の細孔の壁が適当Qτ変形することにより酵母の増殖
による酵母の体積の増加ケ受は入れる。 本発明の方法全実施するにあたって重合反応温度として
採用される温度(は室温25℃ないし一196℃である
。 本発明の方法全実施するKあたって酵母は例えばpH4
〜5の糖、ペプトン、酵母油田液、食塩を含む前培養液
で培養した状態で使用される。 本発明の方法において、採用される線源(は低圧または
高圧水銀灯からの光、X線、ガンマ線、ベータ線、電子
線、α線、化学用原子炉からの混合放射線、使用済み燃
料、核分裂生成物からの〕ゲンマ腺のいずれでも良い。 照射線量は多孔質担体を作製するための照射においては
酵母に光や放射線が照射されることかがいためその選択
は比較的自由であるが、重合性単量体を少なくとも50
%以上硬rヒさせるに必要なIX]O’R以上の照射を
行なう。放射線の場合、IX]、03〜109跋宵の線
量率で]、X]、O’)(、〜]、 X ] O’ 1
(、の照射線量が望ましI/−1゜こうして作製した多
孔質担体に酵母全吸着させた後の照射に寂いては太線量
Gτなると酵母Oて悪影響全およぼすので極力少ない方
が望捷しいが、重合性単量体を50%以上硬化させるに
はlX10’R以上の照射が必要である。従って放射線
の場合lX10’〜IX]、09)t/14の線量率で
1. X ]、 O”〜5X]、06R1好寸しくは5
.X10’〜IXI、Q’Rの放射線量が必要である。 本発明の方法における光または電離性放射線゛の照射に
よる重合の代りにレドックス触媒丑たはその他の触媒を
用いて重合を行うことができる。しかしながら、光重た
は電離性放射線による照射重合では触媒重合の場合にお
けるごとき触媒残査などが固定化物中に残る可能性が全
くなく酵母の増殖がより良好に行われる。捷だ照射重合
では重合が短詩mjに簡単に行われ、さらに種々の単量
体の組み合わせで多種類の性質を広い範囲に亘って変え
ることができる。 以下実施例によシ本発明をより具体的に説明する。実施
例において生成したエタノールはアルコールデヒドロゲ
ナーゼを用いて定量した。 実施例1 単量体としてメトキシポリエチレングリコールメタクリ
レ−) (M−23G)2.5ゴに対し水を50 ml加え十分混合した後−78℃で Coからのγ線を
I X ]、 06)L  照射して多孔質担体全作シ
、小片に細断してから水中にて4日間振とうして十分水
に膨潤させた。酵母を好気的条件、30℃で1%グルコ
ース、0.1%糖蜜、0.5%ペプトン、0.3%酵母
エキス、0.3%麦芽エキスを含む前培養培地で24時
間前培養し、この酵母の前培養液1ゴを12襲グルコー
ス、?予糖蜜、0.15酵母エキス、0.25 %NH
<OL、  0.5 5  %に2HPO4、O−02
5%Mg−8O4,7H20,0,1%N’aO/1.
 、0.001%Oa OL2および0.3%乳酸ヲ含
む完全培地20dに混合した。水に膨潤した多孔質担体
全酵母を含む完全培地に投入し、24時時間表うによっ
て好気的条件を保った。酵母の付着、吸着した多孔質担
体全域り出し、前培養培地の中にM−230i5%溶か
した溶液の中に1分間浸した後、再び取り出して、無菌
条件下で室温で60Coからのγ線’e5X10”+を
照射し、酵母を担体に同定化した。この固定化物を完全
培地に浸t、、30℃、好気的条件下で培養した。24
時間毎に担体を取Q出し、新しい完全培地と交換した。 一定期間好気的条件を保った後、固定化物の一部全固定
化物と等量の完全培地と共にまたやか(C振とうして発
酵反応によりエタノール全製造させその最初の1時間で
生成するアルコール量ケもって、固定化物の活性の指標
とした。別に固定化担体を加えること以外は全く同様の
操作で得た固定化されていない酵母の完全培地サスペン
ションと同体積の完全培地の混合物シてよっても固定化
物と同様ぐて活性を測定した。その結果全第1図に比較
して示す。好気的条件による培養が続くと固定化物の活
性(曲線A)は急速に高くなし、固定化されていない酵
母の活性(曲線B)の10倍に達し20日以上その高い
活性が維持された。 実施例2 単量体として2ヒドロキンエチルアクリレート(1−I
EA、 ) 5 meとメトキシポリエチレングリコー
ルメタクリレート(M  23G ) 5 m12VC
水”t 20 +ne刀目え、十分混合した後、−78
℃で6000からのγ線を1×10°R5照射して多孔
質担体を作Q、小片に細断してから水中にて4日間振と
うして十分水(【膨γ閏させた。酵母を好気的条件、3
0℃で実施例]と同様のmJ培養培地で24時間前培養
し、この酵イユの前培養液]−tnl’f実施例1と同
様の完全培地20ゴに混合した。水に膨潤した多孔質担
体を酵母を含む完全培地Cて投入し、振とうによって好
気的条件ケ保った。一定期間好気的条件を保った後、固
定1に物の一部全等量の完全培地とおだやかに伽とうし
て発酵反応によりエタノール全製造させ、その最初の1
時間で生成するアルコール量をもって固定1に物の活性
の指門とした。別に固定化担体を加えること以外は全く
同様の操作で得た固定化していない酵母の完全培地ナス
ペンション小量と同体積の完全培地の混合物シてよって
も固定化物と同様に活性を測定した。その結果?第2図
に比較]−で示す。好気的条件による培養が続くと固定
化物の活性(曲線A)は急速に高くなり、固定化してい
ない酵母(曲線B)の活性の13倍に達し、20日以上
その高い活性が維持された。また第3図に固定化物シて
よる発酵反応を1時間で止めずにすべての糖がエタノー
ルに転換するまで反応を行なわせた結果を示す。固定化
物(曲aA)では150分で100%エタノール収率が
得られるが、同時間内に画定化していない酵母(曲線B
)では10係しかエタノール収率が得られず、このよう
な固定化I7ない酵母に対し、はるかに高い活性が固定
1ヒ酵母において得られた。
【図面の簡単な説明】
東1図は実施例1において得られた酵母固定化・物の活
性を固定化されていない酵母の活性と比較したグラフで
ある。 第2図及び第3図は実施1りl12において得られた酵
母固定化物の活性を固定化されていない酵母の活性と比
較したグラフである。 第1図及び第2図(ておいて、横軸は培養時間(hr)
+縦軸はアルコール濃度(%9である。 第3図において、横軸は発酵時間(分)、縦軸はアルコ
ール収率(%)である。 特許出願人  日本原子力研究所

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1 多孔質担体上に固定された増殖能を有する酵母固定
    化物。 2、該多孔性担体の孔の大きさは5′A以上である第1
    項の酵母固定化物。 3 水または非重合性溶媒を含む重合性単量体ケ室温以
    下において重合して多孔質担体を作製し、該担体を水で
    十分に膨潤させた後、酵母培養液中で振とうして担体表
    面に酵母を吸着せしめ、さらに重合性単体の低濃度浴液
    に浸し該単体を重合して担体表面に高分子皮膜全形成さ
    せるかあるいはそのま捷さらに酵母培養液中で振とうす
    ることから成る増殖能を有する酵母固定化物の製造方法
    。 4 該重合1・ま光重たは電離性放射線の照射によって
    行われる第3項の方法。 5、電離性放射線の照射による重合の場合は、照射1腺
    量はlX103〜lXl091’/  ノff1J量率
    テI×104〜時 1 X 1.071<であり、酵母吸着後の重合にかけ
    る照射iMiは]Xl、0’ 〜lXl09R/時(D
     %flJ H率テ]、X10’〜5X]06)(、で
    ある第4項の方1去。 6 該重合1−1触媒の存在において行われる第3項の
    方法。 7 該触媒はレドックス触媒である第6項の方法。
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