JPH078273A - 接着性動物細胞の無血清培養法 - Google Patents
接着性動物細胞の無血清培養法Info
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 接着性動物細胞、特に血管内皮細胞の接着性
と増殖性を効果的に促進する接着性動物細胞の無血清培
養法を提供する。 【構成】 細胞接着活性を有する１または２以上の高分
子化合物を細胞培養用担体の表面の少なくとも一部に存
在させ、血清を含有せず、少なくとも血清アルブミンを
含有する動物細胞培養用培地で接着性動物細胞を培養す
ることを特徴とする接着性動物細胞の無血清培養法。
と増殖性を効果的に促進する接着性動物細胞の無血清培
養法を提供する。 【構成】 細胞接着活性を有する１または２以上の高分
子化合物を細胞培養用担体の表面の少なくとも一部に存
在させ、血清を含有せず、少なくとも血清アルブミンを
含有する動物細胞培養用培地で接着性動物細胞を培養す
ることを特徴とする接着性動物細胞の無血清培養法。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は接着性動物細胞、特に血
管内皮細胞を無血清条件下で培養する方法に関する。
管内皮細胞を無血清条件下で培養する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】血管内皮細胞は血管新生や動脈硬化など
の血管病変の際に主要な役割を演ずる細胞であり、その
増殖や分化の研究は盛んに行われている。また、血管内
皮細胞が産生する生理活性物質であるエンドセリン、イ
ンターロイキン類、コロニー刺激因子、プロスタグラン
ジン類等も盛んに研究されている。このような研究のた
めには当該細胞をイン・ビトロで培養することが不可欠
である。
の血管病変の際に主要な役割を演ずる細胞であり、その
増殖や分化の研究は盛んに行われている。また、血管内
皮細胞が産生する生理活性物質であるエンドセリン、イ
ンターロイキン類、コロニー刺激因子、プロスタグラン
ジン類等も盛んに研究されている。このような研究のた
めには当該細胞をイン・ビトロで培養することが不可欠
である。
【０００３】しかしながら血管内皮細胞などの接着性動
物細胞は、培養容器の器壁等、担体表面への接着がない
と増殖しないため、該細胞の培養には通常牛胎児血清あ
るいは仔牛血清等の血清を１０％程度含有する培地を用
いる。血清は様々な成分の混合物であるが、その一つと
して細胞を接着させる性質を有する成分（ビトロネクチ
ン）が含まれており、この成分の作用によって培養液中
の接着性動物細胞は培養容器の器壁等へ接着して伸展
し、増殖する。
物細胞は、培養容器の器壁等、担体表面への接着がない
と増殖しないため、該細胞の培養には通常牛胎児血清あ
るいは仔牛血清等の血清を１０％程度含有する培地を用
いる。血清は様々な成分の混合物であるが、その一つと
して細胞を接着させる性質を有する成分（ビトロネクチ
ン）が含まれており、この成分の作用によって培養液中
の接着性動物細胞は培養容器の器壁等へ接着して伸展
し、増殖する。
【０００４】血清は大量生産ができず、非常に高価であ
る。また、その組成は個体差（ロット差）が大きく、１
ロットの量が限られているため、ロットを変更するたび
にロットチェック、培養条件の調整や管理等に煩雑な操
作を必要とするという問題がある。さらに血清は、血液
細胞あるいは血管内皮細胞等の細胞の生産する生理活性
物質等を含む数多くの物質の混合物であるために、血清
添加培地で培養した培養細胞の産生物を分析あるいは利
用する場合には高度の精製操作を必要とするという問題
もある。このような問題を解消するために、接着性動物
細胞の無血清培養法が望まれている。
る。また、その組成は個体差（ロット差）が大きく、１
ロットの量が限られているため、ロットを変更するたび
にロットチェック、培養条件の調整や管理等に煩雑な操
作を必要とするという問題がある。さらに血清は、血液
細胞あるいは血管内皮細胞等の細胞の生産する生理活性
物質等を含む数多くの物質の混合物であるために、血清
添加培地で培養した培養細胞の産生物を分析あるいは利
用する場合には高度の精製操作を必要とするという問題
もある。このような問題を解消するために、接着性動物
細胞の無血清培養法が望まれている。
【０００５】従来から、幾つかの血管内皮細胞の無血清
培養法が提案されている。例えば、血管内皮細胞を、培
地中にヘパリンや細胞増殖因子を添加した無血清培地中
で培養する方法（特開平１−１８７０８３号公報参
照）、血管内皮細胞を亜鉛または銅塩を添加した無血清
培地中で培養する方法（特開平２−９７３７９号公報参
照）等が報告されている。
培養法が提案されている。例えば、血管内皮細胞を、培
地中にヘパリンや細胞増殖因子を添加した無血清培地中
で培養する方法（特開平１−１８７０８３号公報参
照）、血管内皮細胞を亜鉛または銅塩を添加した無血清
培地中で培養する方法（特開平２−９７３７９号公報参
照）等が報告されている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、接着性動物
細胞、特に血管内皮細胞の接着性と増殖性を効果的に促
進する接着性動物細胞の無血清培養法を提供することを
目的とする。
細胞、特に血管内皮細胞の接着性と増殖性を効果的に促
進する接着性動物細胞の無血清培養法を提供することを
目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】すなわち本発明は細胞接
着活性を有する１または２以上の高分子化合物を細胞培
養用担体の少なくとも一部に存在させ、血清を含有せ
ず、少なくとも血清アルブミンを含有する動物細胞培養
用培地で接着性動物細胞を培養することを特徴とする接
着性動物細胞の無血清培養法に関する。
着活性を有する１または２以上の高分子化合物を細胞培
養用担体の少なくとも一部に存在させ、血清を含有せ
ず、少なくとも血清アルブミンを含有する動物細胞培養
用培地で接着性動物細胞を培養することを特徴とする接
着性動物細胞の無血清培養法に関する。
【０００８】本発明の培養法において使用できる細胞接
着活性を有する高分子化合物は、細胞を接着させる活性
を有するものであれば天然高分子化合物および合成高分
子化合物のいずれであってもよい。または両者の混合物
であっても良い。
着活性を有する高分子化合物は、細胞を接着させる活性
を有するものであれば天然高分子化合物および合成高分
子化合物のいずれであってもよい。または両者の混合物
であっても良い。
【０００９】天然高分子化合物としては、コラーゲン、
ゼラチン、ケラチン、ファイブロネクチン、ビトロネク
チンおよびラミニン等が好適に用いられる。これらの天
然高分子化合物は細胞外マトリックス成分から得られる
ものであり、いずれも細胞接着活性を有することが知ら
れている。これらの化合物はそれぞれ接着特性が異なる
ため、被培養細胞の由来する動物種、臓器や血管の部位
等によって選択すればよい。例えばヒト臍帯静脈血管内
皮細胞の場合にはコラーゲンタイプＩが好適に用いられ
る。
ゼラチン、ケラチン、ファイブロネクチン、ビトロネク
チンおよびラミニン等が好適に用いられる。これらの天
然高分子化合物は細胞外マトリックス成分から得られる
ものであり、いずれも細胞接着活性を有することが知ら
れている。これらの化合物はそれぞれ接着特性が異なる
ため、被培養細胞の由来する動物種、臓器や血管の部位
等によって選択すればよい。例えばヒト臍帯静脈血管内
皮細胞の場合にはコラーゲンタイプＩが好適に用いられ
る。
【００１０】合成高分子化合物としては、細胞接着活性
を有するペプチドで化学修飾した合成高分子化合物、正
電荷を有する高分子化合物等が挙げられる。このうちで
も特に細胞接着性ペプチドで化学修飾した高分子化合
物、特に水不溶性高分子化合物が好適に用いられる。
を有するペプチドで化学修飾した合成高分子化合物、正
電荷を有する高分子化合物等が挙げられる。このうちで
も特に細胞接着性ペプチドで化学修飾した高分子化合
物、特に水不溶性高分子化合物が好適に用いられる。
【００１１】細胞接着活性を有するペプチドはフィブロ
ネクチンやラミニン等の細胞接着活性を有する蛋白質の
活性部位の解析から、多くのものが知られるようになっ
た。本発明に用いられるペプチドは細胞接着活性を有す
るものであればよく、既に知られているものを目的とす
る細胞によって選択すればよい。
ネクチンやラミニン等の細胞接着活性を有する蛋白質の
活性部位の解析から、多くのものが知られるようになっ
た。本発明に用いられるペプチドは細胞接着活性を有す
るものであればよく、既に知られているものを目的とす
る細胞によって選択すればよい。
【００１２】好ましいペプチドとしては、ＲＧＤＶ（Ａ
ｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｖａｌ）、ＲＧＤＳ（Ａｒｇ−
Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ）、ＲＧＤＮ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ
−Ａｓｐ−Ａｓｎ）、ＤＧＥＡ（Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌ
ｕ−Ａｌａ）およびＹＩＧＳＲ（Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌ
ｙ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ）が挙げられる。これらのペプチド
は通常の方法で各アミノ酸より合成すればよい。
ｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｖａｌ）、ＲＧＤＳ（Ａｒｇ−
Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ）、ＲＧＤＮ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ
−Ａｓｐ−Ａｓｎ）、ＤＧＥＡ（Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌ
ｕ−Ａｌａ）およびＹＩＧＳＲ（Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌ
ｙ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ）が挙げられる。これらのペプチド
は通常の方法で各アミノ酸より合成すればよい。
【００１３】なお、本明細書においてはアミノ酸、ペプ
チドおよび保護基等の記載を簡略化するため、以下に示
す略号を用いる： Ａｌａ：アラニン Ｇｌｕ：グルタミン酸 Ａｒｇ：アルギニン Ｇｌｙ：グリシン Ａｓｎ：アスパラギン Ｓｅｒ：セリン Ａｓｐ：アスパラギン酸 Ｔｙｒ：チロシン Ｉｌｅ：イソロイシン Ｖａｌ：バリン Ｂｏｃ：ｔ−ブチルオキシカルボニル ＯcＨex：シクロヘキシル ＯＢzl：ベンジル Ｔｏｓ：トシル
チドおよび保護基等の記載を簡略化するため、以下に示
す略号を用いる： Ａｌａ：アラニン Ｇｌｕ：グルタミン酸 Ａｒｇ：アルギニン Ｇｌｙ：グリシン Ａｓｎ：アスパラギン Ｓｅｒ：セリン Ａｓｐ：アスパラギン酸 Ｔｙｒ：チロシン Ｉｌｅ：イソロイシン Ｖａｌ：バリン Ｂｏｃ：ｔ−ブチルオキシカルボニル ＯcＨex：シクロヘキシル ＯＢzl：ベンジル Ｔｏｓ：トシル
【００１４】細胞接着性ペプチドで化学修飾した高分子
化合物は、例えば該ペプチドを、これと反応性を有する
適当な重合性モノマーと反応させて調製されるペプチド
修飾モノマーを他の重合性モノマーと反応させることに
よって得られる。
化合物は、例えば該ペプチドを、これと反応性を有する
適当な重合性モノマーと反応させて調製されるペプチド
修飾モノマーを他の重合性モノマーと反応させることに
よって得られる。
【００１５】細胞接着性ペプチドと反応させる重合性モ
ノマーとしては（メタ）アクリル酸、（メタ）アクリル
アミド、グリシジル（メタ）アクリレート、Ｎ−（メ
タ）アクリロイルオキシスクシンイミド等が例示され
る。また細胞接着性ペプチドで化学修飾したモノマーと
共重合させる他の重合性モノマーとしては、親水性モノ
マー、例えばヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、
ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート、グリセリン
（メタ）アクリレート、ペンタエリスリトール（メタ）
アクリレート、オリゴエチレングリコール（メタ）アク
リレート、オリゴプロピレングリコール（メタ）アクリ
レート、およびこれらの混合物等、疎水性モノマー、例
えばメチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アク
リレート、ｎ−プロピル（メタ）アクリレート、イソプ
ロピル（メタ）アクリレート、ｎ−ブチル（メタ）アク
リレート、イソブチル（メタ）アクリレート、ｔ−ブチ
ル（メタ）アクリレートおよびこれらの混合物等、等が
例示される。なお、本明細書において「（メタ）アクリ
レート」という語は「アクリレート」および「メタアク
リレート」を意味する。
ノマーとしては（メタ）アクリル酸、（メタ）アクリル
アミド、グリシジル（メタ）アクリレート、Ｎ−（メ
タ）アクリロイルオキシスクシンイミド等が例示され
る。また細胞接着性ペプチドで化学修飾したモノマーと
共重合させる他の重合性モノマーとしては、親水性モノ
マー、例えばヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、
ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート、グリセリン
（メタ）アクリレート、ペンタエリスリトール（メタ）
アクリレート、オリゴエチレングリコール（メタ）アク
リレート、オリゴプロピレングリコール（メタ）アクリ
レート、およびこれらの混合物等、疎水性モノマー、例
えばメチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アク
リレート、ｎ−プロピル（メタ）アクリレート、イソプ
ロピル（メタ）アクリレート、ｎ−ブチル（メタ）アク
リレート、イソブチル（メタ）アクリレート、ｔ−ブチ
ル（メタ）アクリレートおよびこれらの混合物等、等が
例示される。なお、本明細書において「（メタ）アクリ
レート」という語は「アクリレート」および「メタアク
リレート」を意味する。
【００１６】細胞接着性ペプチドで化学修飾した高分子
化合物中、細胞接着性ペプチドは２μｇ/ｍｇ以上導入
されるのが好ましい。細胞接着性ペプチドの量が２μｇ
/ｍｇ未満である場合には細胞培養用担体の表面に被覆
しても被培養細胞の接着性を十分増加させることができ
ず、該細胞の効果的な増殖は期待できない。
化合物中、細胞接着性ペプチドは２μｇ/ｍｇ以上導入
されるのが好ましい。細胞接着性ペプチドの量が２μｇ
/ｍｇ未満である場合には細胞培養用担体の表面に被覆
しても被培養細胞の接着性を十分増加させることができ
ず、該細胞の効果的な増殖は期待できない。
【００１７】なお、上記ペプチド類の細胞接着能は、そ
の種類によってある程度選択性があるので、例えば血管
内皮細胞を培養する場合に混入してくる血管の平滑筋細
胞を除くことができる。
の種類によってある程度選択性があるので、例えば血管
内皮細胞を培養する場合に混入してくる血管の平滑筋細
胞を除くことができる。
【００１８】本発明の培養方法においては、上記のごと
き天然高分子化合物または合成高分子化合物を単独で用
いてもまたは２またはそれ以上を混合して用いてもよ
い。両者混合して細胞培養用担体の表面に被覆すること
によって、より良好な接着性および増殖性を得ることが
できる。両者の混合比は１：９〜９：１とすることが好
ましく、特に１：１で混合するのが好ましい。
き天然高分子化合物または合成高分子化合物を単独で用
いてもまたは２またはそれ以上を混合して用いてもよ
い。両者混合して細胞培養用担体の表面に被覆すること
によって、より良好な接着性および増殖性を得ることが
できる。両者の混合比は１：９〜９：１とすることが好
ましく、特に１：１で混合するのが好ましい。
【００１９】高分子化合物を細胞培養用担体の表面上に
存在させるには、上記の天然もしくは合成高分子化合物
１または２以上を適当な溶媒に溶解、または懸濁させた
溶液または懸濁液を用いて、担体に塗布、噴霧または浸
漬等して被覆するのが好ましい。該溶液または懸濁液の
濃度は特に限定的ではないが、通常は０.０００１％
（１μｇ/ｍｌ）〜０.１％（１ｍｇ/ｍｌ）、好ましく
は０.０００１〜０.０１％で十分である。溶媒は蒸発除
去する。特に好適な溶媒は低級アルコールあるいは低級
アルコールと水との混合溶媒である。特に好ましい低級
アルコールは、炭素原子数１から４のアルコールまたは
これらのアルコールと水との混合溶媒、例えば５０〜９
０％含水メタノール、エタノール、プロパノール等であ
る。殺菌作用のある低級アルコールを用いることによ
り、比較的広範囲の材質からなる容器を用いることがで
き、被覆後の付加的な滅菌処理が不要となり、取り扱い
も簡単になる。
存在させるには、上記の天然もしくは合成高分子化合物
１または２以上を適当な溶媒に溶解、または懸濁させた
溶液または懸濁液を用いて、担体に塗布、噴霧または浸
漬等して被覆するのが好ましい。該溶液または懸濁液の
濃度は特に限定的ではないが、通常は０.０００１％
（１μｇ/ｍｌ）〜０.１％（１ｍｇ/ｍｌ）、好ましく
は０.０００１〜０.０１％で十分である。溶媒は蒸発除
去する。特に好適な溶媒は低級アルコールあるいは低級
アルコールと水との混合溶媒である。特に好ましい低級
アルコールは、炭素原子数１から４のアルコールまたは
これらのアルコールと水との混合溶媒、例えば５０〜９
０％含水メタノール、エタノール、プロパノール等であ
る。殺菌作用のある低級アルコールを用いることによ
り、比較的広範囲の材質からなる容器を用いることがで
き、被覆後の付加的な滅菌処理が不要となり、取り扱い
も簡単になる。
【００２０】低級アルコール水溶液を用いる細胞培養用
担体の好ましい被覆方法の一例としては、高分子化合物
を０.０１％（１００μｇ/ｍｌ：合計量）含有する７０
％のエタノール溶液として細胞培養用担体、例えば３５
ｍｍディッシュに１ｍl加えてこの底面が覆われるよう
にし、その後クリーンベンチ内で乾燥させ、完全にエタ
ノールを蒸発させる方法が挙げられる。
担体の好ましい被覆方法の一例としては、高分子化合物
を０.０１％（１００μｇ/ｍｌ：合計量）含有する７０
％のエタノール溶液として細胞培養用担体、例えば３５
ｍｍディッシュに１ｍl加えてこの底面が覆われるよう
にし、その後クリーンベンチ内で乾燥させ、完全にエタ
ノールを蒸発させる方法が挙げられる。
【００２１】高分子化合物が低級アルコールに不溶の場
合には、ベンゼン、ジオキサンまたはＮ,Ｎ−ジメチル
ホルムアミド等の有機溶媒に懸濁あるいは溶解した溶液
を細胞培養用担体に塗布し、該溶媒を蒸発除去した後、
該担体をオートクレーブ滅菌あるいはガンマ線滅菌によ
り滅菌処理に付してもよい。この場合には、耐溶媒性あ
るいは耐熱性の高分子化合物および担体を使用する。
合には、ベンゼン、ジオキサンまたはＮ,Ｎ−ジメチル
ホルムアミド等の有機溶媒に懸濁あるいは溶解した溶液
を細胞培養用担体に塗布し、該溶媒を蒸発除去した後、
該担体をオートクレーブ滅菌あるいはガンマ線滅菌によ
り滅菌処理に付してもよい。この場合には、耐溶媒性あ
るいは耐熱性の高分子化合物および担体を使用する。
【００２２】特に天然高分子化合物を被覆する場合に
は、分解や変性によってその細胞接着活性が消失するこ
とのないよう、溶媒および滅菌方法を選択する必要があ
る。例えばフィブロネクチンを被覆する場合、ＰＢＳ
(−)（Ｃa2+、Ｍｇ2+を含まないリン酸緩衝溶液）で所
定濃度に調製した後、ポアサイズが０.２０〜０.４５μ
ｍのメンブレンフィルターで濾過滅菌し、直ちに培養容
器に添加して３７℃、１５分間以上放置する。これは使
用直前にＰＢＳ(−)で洗浄して使用する。
は、分解や変性によってその細胞接着活性が消失するこ
とのないよう、溶媒および滅菌方法を選択する必要があ
る。例えばフィブロネクチンを被覆する場合、ＰＢＳ
(−)（Ｃa2+、Ｍｇ2+を含まないリン酸緩衝溶液）で所
定濃度に調製した後、ポアサイズが０.２０〜０.４５μ
ｍのメンブレンフィルターで濾過滅菌し、直ちに培養容
器に添加して３７℃、１５分間以上放置する。これは使
用直前にＰＢＳ(−)で洗浄して使用する。
【００２３】細胞培養用担体としてはガラス製、ポリス
チレン製、ポリカーボネート製、ポリエチレン製または
ポリプロピレン製等のマルチトレイ、ディッシュまたは
ボトル等の通常使用されている培養容器を用いればよ
い。常法によって予め滅菌処理に付された培養容器の内
壁面を、前述の細胞接着活性を有する高分子化合物で被
覆する。樹脂製培養容器はプラズマ処理に付し、親水化
したものを用いるのが好ましい。
チレン製、ポリカーボネート製、ポリエチレン製または
ポリプロピレン製等のマルチトレイ、ディッシュまたは
ボトル等の通常使用されている培養容器を用いればよ
い。常法によって予め滅菌処理に付された培養容器の内
壁面を、前述の細胞接着活性を有する高分子化合物で被
覆する。樹脂製培養容器はプラズマ処理に付し、親水化
したものを用いるのが好ましい。
【００２４】本発明の血管内皮細胞の無血清培養法にお
いては、細胞培養を上述の細胞接着活性を有する高分子
化合物で被覆した担体を存在させた無血清培地中で行っ
てもよい。この実施態様によれば、細胞が接着する面積
を大幅に増大させることができるので、比較的小さな体
積の無血清培地による細胞の大量培養が可能となる。
いては、細胞培養を上述の細胞接着活性を有する高分子
化合物で被覆した担体を存在させた無血清培地中で行っ
てもよい。この実施態様によれば、細胞が接着する面積
を大幅に増大させることができるので、比較的小さな体
積の無血清培地による細胞の大量培養が可能となる。
【００２５】このような目的に使用する担体としてはガ
ラス製、各種合成樹脂製またはセラミックス製等の微粒
子や薄片等が例示される。この種の担体の形状や大きさ
は、培養方法や培養規模によって左右され特に限定的で
はないが、例えば懸濁培養する場合には培養液のゆるや
かな撹拌や還流によって担体が浮遊状態を維持出来るよ
うに大きさや比重等を選定すべきである。
ラス製、各種合成樹脂製またはセラミックス製等の微粒
子や薄片等が例示される。この種の担体の形状や大きさ
は、培養方法や培養規模によって左右され特に限定的で
はないが、例えば懸濁培養する場合には培養液のゆるや
かな撹拌や還流によって担体が浮遊状態を維持出来るよ
うに大きさや比重等を選定すべきである。
【００２６】微粒子状担体としては、前述のペプチドで
化学修飾した重合性モノマーと他の重合性モノマーとを
懸濁重合して得られる水不溶性高分子粒子を用いても良
い。この種の高分子粒子の大きさは、通常１００μｍ〜
５ｍｍ、好ましくは１００μｍ〜２５０μｍである。
化学修飾した重合性モノマーと他の重合性モノマーとを
懸濁重合して得られる水不溶性高分子粒子を用いても良
い。この種の高分子粒子の大きさは、通常１００μｍ〜
５ｍｍ、好ましくは１００μｍ〜２５０μｍである。
【００２７】本発明の無血清培養法においては、動物細
胞の培養に用いられる一般的な基礎培地に少なくとも血
清アルブミンを添加した培地を用いる。
胞の培養に用いられる一般的な基礎培地に少なくとも血
清アルブミンを添加した培地を用いる。
【００２８】接着性動物細胞が血管内皮細胞である場合
について説明すると、動物細胞培養用の基礎培地として
は具体的にはＢＭＥ、Ｄ−ＭＥＭ、ＭＥＭアルファ、イ
ーグルＭＥＭ、Ｍ１９９、Ｆ−１０、Ｆ−１２、ＲＰＭ
Ｉ１６４１(「細胞培養マニュアル」宗村庚修編、講談
社、第１１０〜１１５頁（１９８２年５月）参照）、Ｍ
ＣＤＢ１０７（極東製薬社カタログ参照）、ＭＣＤＢ１
３１（Knedler, A andHam, R. G. In Vitro Cellular &
Developmental Biology ２３ ７：４８１〜４８１
（１９８７年）参照）、ＭＣＤＢ１５２、ＭＣＤＢ１５
３（Growth and Differentiation of Mammary Epitheli
al cells in Culture; Japan ScientificSocieties Pre
ss 第７２〜７３頁（１９８７年）参照）、Ｅ−ＢＭ
（倉敷紡績社カタログ参照）等、およびこれらの培地を
適宜混合したものが用いられる。基礎培地は細胞が由来
する動物の種類、血管の部位によって適宜選択すればよ
い。
について説明すると、動物細胞培養用の基礎培地として
は具体的にはＢＭＥ、Ｄ−ＭＥＭ、ＭＥＭアルファ、イ
ーグルＭＥＭ、Ｍ１９９、Ｆ−１０、Ｆ−１２、ＲＰＭ
Ｉ１６４１(「細胞培養マニュアル」宗村庚修編、講談
社、第１１０〜１１５頁（１９８２年５月）参照）、Ｍ
ＣＤＢ１０７（極東製薬社カタログ参照）、ＭＣＤＢ１
３１（Knedler, A andHam, R. G. In Vitro Cellular &
Developmental Biology ２３ ７：４８１〜４８１
（１９８７年）参照）、ＭＣＤＢ１５２、ＭＣＤＢ１５
３（Growth and Differentiation of Mammary Epitheli
al cells in Culture; Japan ScientificSocieties Pre
ss 第７２〜７３頁（１９８７年）参照）、Ｅ−ＢＭ
（倉敷紡績社カタログ参照）等、およびこれらの培地を
適宜混合したものが用いられる。基礎培地は細胞が由来
する動物の種類、血管の部位によって適宜選択すればよ
い。
【００２９】血清アルブミンは血清中に存在するタンパ
ク質であり、無血清培養でのアルブミンの添加が動物細
胞の増殖を刺激したり、繊維芽細胞の長期継代培養での
成績を改善することが報告されている（Nilausen, S:
J. Cell Physiol. ９６：１〜１４（１９７８年））。
この血清アルブミンは長鎖不飽和脂肪酸の担体として脂
肪酸の細胞への供給を制御することにより増殖促進的に
働くことが知られている。
ク質であり、無血清培養でのアルブミンの添加が動物細
胞の増殖を刺激したり、繊維芽細胞の長期継代培養での
成績を改善することが報告されている（Nilausen, S:
J. Cell Physiol. ９６：１〜１４（１９７８年））。
この血清アルブミンは長鎖不飽和脂肪酸の担体として脂
肪酸の細胞への供給を制御することにより増殖促進的に
働くことが知られている。
【００３０】本発明の培養法において、血清アルブミン
としては例えばウシ、ウマ、ヒト等の血清より得られる
ものがいずれも好適に用いられる。価格、ウイルス等に
よる感染の危険性等を考慮すればウシ血清アルブミン
（ＢＳＡ）を用いるのが特に有利である。
としては例えばウシ、ウマ、ヒト等の血清より得られる
ものがいずれも好適に用いられる。価格、ウイルス等に
よる感染の危険性等を考慮すればウシ血清アルブミン
（ＢＳＡ）を用いるのが特に有利である。
【００３１】本発明の方法を血管内皮細胞に用いる場合
には、血清アルブミンは動物の種類あるいは血管の部位
によっても異なるが、例えばヒト臍帯静脈血管内皮細胞
を培養する場合には培地中に血清アルブミンを１〜１０
００μｇ／ｍｌ、好ましくは１００μｇ／ｍｌ添加す
る。血清アルブミンが１μｇ／ｍｌ以下であると細胞の
増殖率が低下し、培養細胞を維持することが困難とな
る。また１０００μｇ／ｍｌを越えると、培養後に細胞
の分泌する成分を単離するような場合にタンパク質であ
る血清アルブミンの除去に手間がかかり、好ましくな
い。
には、血清アルブミンは動物の種類あるいは血管の部位
によっても異なるが、例えばヒト臍帯静脈血管内皮細胞
を培養する場合には培地中に血清アルブミンを１〜１０
００μｇ／ｍｌ、好ましくは１００μｇ／ｍｌ添加す
る。血清アルブミンが１μｇ／ｍｌ以下であると細胞の
増殖率が低下し、培養細胞を維持することが困難とな
る。また１０００μｇ／ｍｌを越えると、培養後に細胞
の分泌する成分を単離するような場合にタンパク質であ
る血清アルブミンの除去に手間がかかり、好ましくな
い。
【００３２】本発明の無血清培養方法においては、好ま
しくは基礎培地にさらにトランスフェリンを添加する。
トランスフェリンはＦｅ3+運搬糖タンパクであり、Ｆｅ
を効率良く細胞に与えることによって細胞成長促進作用
を増加させる働きをする。トランスフェリンの添加量は
１〜１０００μｇ／ｍｌ、好ましくは１〜１００μｇ／
ｍｌである。トランスフェリンが１μｇ／ｍｌ以下であ
ると、細胞の増殖率は低下し、培養細胞を維持すること
が困難となる。１０００μｇ／ｍｌ以上となるとトラン
スフェリンが高価である上に、培養後に細胞の分泌する
成分を単離するような場合、除去に手間がかかるため好
ましくない。
しくは基礎培地にさらにトランスフェリンを添加する。
トランスフェリンはＦｅ3+運搬糖タンパクであり、Ｆｅ
を効率良く細胞に与えることによって細胞成長促進作用
を増加させる働きをする。トランスフェリンの添加量は
１〜１０００μｇ／ｍｌ、好ましくは１〜１００μｇ／
ｍｌである。トランスフェリンが１μｇ／ｍｌ以下であ
ると、細胞の増殖率は低下し、培養細胞を維持すること
が困難となる。１０００μｇ／ｍｌ以上となるとトラン
スフェリンが高価である上に、培養後に細胞の分泌する
成分を単離するような場合、除去に手間がかかるため好
ましくない。
【００３３】本発明の無血清培養法において、動物細胞
培養用の基礎培地には、さらに通常の細胞培養に用いら
れる抗生物質および各種成長因子やホルモン等を適宜添
加してもよい。
培養用の基礎培地には、さらに通常の細胞培養に用いら
れる抗生物質および各種成長因子やホルモン等を適宜添
加してもよい。
【００３４】抗生物質としてはゲンタマイシン、アンフ
ォテリシン、アンピシリン、ミノマイシン、カナマイシ
ン、ペニシリン、ストレプトマイシン、ゲンタシン、タ
イロシン、オーレオマイシン等、通常の動物細胞の培養
に用いられるものが好適に用いられる。抗生物質は培地
中に０.１μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ、より好まし
くは０.２５μｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌ添加する。
ォテリシン、アンピシリン、ミノマイシン、カナマイシ
ン、ペニシリン、ストレプトマイシン、ゲンタシン、タ
イロシン、オーレオマイシン等、通常の動物細胞の培養
に用いられるものが好適に用いられる。抗生物質は培地
中に０.１μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ、より好まし
くは０.２５μｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌ添加する。
【００３５】成長因子またはホルモンとしては、従来よ
り血管内皮細胞やその他の動物細胞の培養において使用
されるものが挙げられる。具体的にはサイクリックＡＭ
Ｐ（ｃＡＭＰ）、軟骨由来成長因子（ＣＤＧＦ）、内皮
細胞成長因子（ＥＣＧＦ）、内皮細胞増殖因子（ＥＣＧ
Ｆ）、眼由来成長因子（ＥＤＧＦ）、上皮成長因子（Ｅ
ＧＦ）、酸性繊維芽細胞増殖因子（acidic ＦＧＦ)、
塩基性繊維芽細胞増殖因子(basic ＦＧＦ）、脳由来繊
維芽細胞増殖因子（brain ＦＧＦ）、インスリン様成長
因子−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、インターロイキン−１（ＩＬ
−１）、マクロファージ由来成長因子（ＭＤＧＦ）、血
小板由来内皮細胞マイトジェン（ＰＤＥＣＭ）、腫瘍血
管新生因子（ＴＡＦ）、血小板由来血管内皮細胞増殖因
子（４５Ｋ−ＧＦ）、ウシ脳抽出液（ＢＢＥ）、ウシ脳
下垂体抽出液（ＢＰＥ）、ヒト血清由来トロンビン、イ
ンスリン、糖質コーチコイド（ハイドロコーチゾン、コ
ーチゾン、コーチコステロン、デキサメサゾン、トリア
ムシノロン、プレドニゾロン等）、コレステロール、ヘ
パリン、ヘパラン硫酸、高密度リポタンパク（ＨＬ
Ｄ）、各種ビタミン等である。これらは単独であるいは
適宜混合して添加する。
り血管内皮細胞やその他の動物細胞の培養において使用
されるものが挙げられる。具体的にはサイクリックＡＭ
Ｐ（ｃＡＭＰ）、軟骨由来成長因子（ＣＤＧＦ）、内皮
細胞成長因子（ＥＣＧＦ）、内皮細胞増殖因子（ＥＣＧ
Ｆ）、眼由来成長因子（ＥＤＧＦ）、上皮成長因子（Ｅ
ＧＦ）、酸性繊維芽細胞増殖因子（acidic ＦＧＦ)、
塩基性繊維芽細胞増殖因子(basic ＦＧＦ）、脳由来繊
維芽細胞増殖因子（brain ＦＧＦ）、インスリン様成長
因子−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、インターロイキン−１（ＩＬ
−１）、マクロファージ由来成長因子（ＭＤＧＦ）、血
小板由来内皮細胞マイトジェン（ＰＤＥＣＭ）、腫瘍血
管新生因子（ＴＡＦ）、血小板由来血管内皮細胞増殖因
子（４５Ｋ−ＧＦ）、ウシ脳抽出液（ＢＢＥ）、ウシ脳
下垂体抽出液（ＢＰＥ）、ヒト血清由来トロンビン、イ
ンスリン、糖質コーチコイド（ハイドロコーチゾン、コ
ーチゾン、コーチコステロン、デキサメサゾン、トリア
ムシノロン、プレドニゾロン等）、コレステロール、ヘ
パリン、ヘパラン硫酸、高密度リポタンパク（ＨＬ
Ｄ）、各種ビタミン等である。これらは単独であるいは
適宜混合して添加する。
【００３６】これらの成長因子等の種類および添加量は
動物の種類あるいは血管の部位によって異なるが、例え
ばヒト臍帯静脈血管内皮細胞を培養する場合には、基礎
培地に血清アルブミンとトランスフェリンの他にＥＧ
Ｆ、ハイドロコーチゾン、インスリンおよびＢＢＥを添
加するのが好ましい。場合によってはさらにα−トコフ
ェロールやコレステロール等を添加してもよい。
動物の種類あるいは血管の部位によって異なるが、例え
ばヒト臍帯静脈血管内皮細胞を培養する場合には、基礎
培地に血清アルブミンとトランスフェリンの他にＥＧ
Ｆ、ハイドロコーチゾン、インスリンおよびＢＢＥを添
加するのが好ましい。場合によってはさらにα−トコフ
ェロールやコレステロール等を添加してもよい。
【００３７】本発明の無血清培養法により培養される血
管内皮細胞としては、広範囲の動物種の様々な部位の血
管より単離される血管内皮細胞が対象となり、特に限定
的ではない。上記培養条件については血管内皮細胞につ
いて説明したが、他の接着性動物細胞、例えば線維芽細
胞、表皮角化細胞、気管支上皮細胞、血管平滑筋細胞、
神経細胞、グリア細胞、乳腺上皮細胞、肝実質細胞、角
膜上皮細胞等の正常細胞、神経膠腫細胞、神経膠芽腫細
胞、線維肉腫細胞等の癌細胞ならびに株化細胞などの培
養についても基本的に同様の条件を採用すればよい。但
し基礎培地についてはそれぞれ好適な培地が知られてい
るので、それに基づいて培養条件を選定すればよい。
管内皮細胞としては、広範囲の動物種の様々な部位の血
管より単離される血管内皮細胞が対象となり、特に限定
的ではない。上記培養条件については血管内皮細胞につ
いて説明したが、他の接着性動物細胞、例えば線維芽細
胞、表皮角化細胞、気管支上皮細胞、血管平滑筋細胞、
神経細胞、グリア細胞、乳腺上皮細胞、肝実質細胞、角
膜上皮細胞等の正常細胞、神経膠腫細胞、神経膠芽腫細
胞、線維肉腫細胞等の癌細胞ならびに株化細胞などの培
養についても基本的に同様の条件を採用すればよい。但
し基礎培地についてはそれぞれ好適な培地が知られてい
るので、それに基づいて培養条件を選定すればよい。
【００３８】本発明の無血清培養法においては、細胞接
着活性を有する高分子化合物、特に水不溶性高分子化合
物で被覆した培養器中にて無血清状態で接着性動物細胞
を培養する。被培養細胞は低血清状態での２次培養細
胞、あるいは動物より単離した直後の細胞でも、直接無
血清の環境下で培養することができる。このため、血清
量を少しずつ減少させていく「慣らし」の過程が不必要
となる。すなわち、通常の血清含有培地で培養している
細胞株あるいは正常細胞を最初から無血清培地へ播種し
ても正常な増殖が見られる。本発明の方法で無血清培養
した接着性動物細胞は血清を添加した場合と同程度の増
殖性を示すだけでなく、細胞の諸機能をそのまま維持す
ることができる。
着活性を有する高分子化合物、特に水不溶性高分子化合
物で被覆した培養器中にて無血清状態で接着性動物細胞
を培養する。被培養細胞は低血清状態での２次培養細
胞、あるいは動物より単離した直後の細胞でも、直接無
血清の環境下で培養することができる。このため、血清
量を少しずつ減少させていく「慣らし」の過程が不必要
となる。すなわち、通常の血清含有培地で培養している
細胞株あるいは正常細胞を最初から無血清培地へ播種し
ても正常な増殖が見られる。本発明の方法で無血清培養
した接着性動物細胞は血清を添加した場合と同程度の増
殖性を示すだけでなく、細胞の諸機能をそのまま維持す
ることができる。
【００３９】
【実施例】本発明を実施例を用いてさらに詳細に説明す
る。細胞接着性ペプチドの合成 ＲＧＤＶ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｖａｌ）、ＤＧＥ
Ａ（Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｌａ）およびＹＩＧＳ
Ｒ（Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ）ペプチ
ドを通常の液相法を用いて合成した。ＲＧＤＶペプチド
の合成スキームを表１に示す。
る。細胞接着性ペプチドの合成 ＲＧＤＶ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｖａｌ）、ＤＧＥ
Ａ（Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｌａ）およびＹＩＧＳ
Ｒ（Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ）ペプチ
ドを通常の液相法を用いて合成した。ＲＧＤＶペプチド
の合成スキームを表１に示す。
【００４０】
【表１】
【００４１】ＲＧＤＶペプチドのＣ末端となるＶａｌの
カルボキシル基をベンジル基で保護したものと、アミノ
基をＢｏｃで、側鎖のカルボキシル基をＯｃＨｅｘで保
護したＡｓｐをＷＳＣＩ−ＨＯＢｔ法により縮合した。
その後、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を用いてＢｏｃ基
を脱保護した。同様にしてＮ末端側にＧｌｙ、Ａｒｇと
つなげ、最後にすべての保護基をフッ酸（ＨＦ）処理す
ることにより外してＲＧＤＶペプチドを得た。さらにＤ
ＧＥＡおよびＹＩＧＳＲペプチドを、ＲＧＤＶペプチド
と同様にして各構成アミノ酸より合成した。
カルボキシル基をベンジル基で保護したものと、アミノ
基をＢｏｃで、側鎖のカルボキシル基をＯｃＨｅｘで保
護したＡｓｐをＷＳＣＩ−ＨＯＢｔ法により縮合した。
その後、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を用いてＢｏｃ基
を脱保護した。同様にしてＮ末端側にＧｌｙ、Ａｒｇと
つなげ、最後にすべての保護基をフッ酸（ＨＦ）処理す
ることにより外してＲＧＤＶペプチドを得た。さらにＤ
ＧＥＡおよびＹＩＧＳＲペプチドを、ＲＧＤＶペプチド
と同様にして各構成アミノ酸より合成した。
【００４２】細胞接着性合成高分子化合物［I］の合成 先に合成したＲＧＤＶペプチド０.５ｇおよびＮ−メタ
クリロイルオキシスクシンイミド０.５ｇを２.５ｍｌの
Ｎ,Ｎ'−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解し、室
温で一晩撹拌した。ここへ２−ヒドロキシエチルメタク
リレート１.０ｇ、ｎ−ブチルメタクリレート０.５ｇお
よびＤＭＦ１ｍｌを加えた。開始剤としてα,α'−アゾ
ビスイソブチロニトリル２０ｍｇを添加し、窒素気流
下、６５℃で１５時間加熱した。続いて反応溶液を激し
く撹拌した５リットルの蒸留水に滴下し、白色粘調な高
分子化合物を得た。
クリロイルオキシスクシンイミド０.５ｇを２.５ｍｌの
Ｎ,Ｎ'−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解し、室
温で一晩撹拌した。ここへ２−ヒドロキシエチルメタク
リレート１.０ｇ、ｎ−ブチルメタクリレート０.５ｇお
よびＤＭＦ１ｍｌを加えた。開始剤としてα,α'−アゾ
ビスイソブチロニトリル２０ｍｇを添加し、窒素気流
下、６５℃で１５時間加熱した。続いて反応溶液を激し
く撹拌した５リットルの蒸留水に滴下し、白色粘調な高
分子化合物を得た。
【００４３】この高分子化合物をメタノールに溶解し、
再度激しく撹拌した５リットルの蒸留水に滴下する操作
を３度繰り返し、最後に吸引濾過、続いて４０℃にて真
空乾燥を行い粉末状の結晶である細胞接着性合成高分子
化合物［Ｉ］を得た。
再度激しく撹拌した５リットルの蒸留水に滴下する操作
を３度繰り返し、最後に吸引濾過、続いて４０℃にて真
空乾燥を行い粉末状の結晶である細胞接着性合成高分子
化合物［Ｉ］を得た。
【００４４】この化合物の一部を１６６℃で３０分間、
６Ｎの塩酸で酸加水分解した後、アミノ酸分析をおこな
ったところ、ＲＧＤＶペプチドが高分子化合物１ｍｇに
つき１７.９μｇ導入されていた。平均分子量は５００
００であった。
６Ｎの塩酸で酸加水分解した後、アミノ酸分析をおこな
ったところ、ＲＧＤＶペプチドが高分子化合物１ｍｇに
つき１７.９μｇ導入されていた。平均分子量は５００
００であった。
【００４５】細胞接着性高分子化合物［II］の合成 ［I］のＲＧＤＶペプチドを０.１ｇとする以外は［I］
と同様にして細胞接着性合成高分子化合物［II］を得
た。アミノ酸分析の結果、高分子化合物［II］１ｍｇ中
にＲＧＤＶペプチドが２.１μｇ導入されていることを
確認した。
と同様にして細胞接着性合成高分子化合物［II］を得
た。アミノ酸分析の結果、高分子化合物［II］１ｍｇ中
にＲＧＤＶペプチドが２.１μｇ導入されていることを
確認した。
【００４６】細胞接着性高分子化合物［III］の合成 ［I］のＲＧＤＶペプチドをＤＧＥＡペプチド０.１ｇと
する以外は［I］と同様にして粉末状の細胞接着性合成
高分子化合物［III］を得た。アミノ酸分析の結果、化
合物［III］１ｍｇ中にＤＧＥＡペプチドが３.０μｇ導
入されていることを確認した。また平均分子量は５９０
００であった。
する以外は［I］と同様にして粉末状の細胞接着性合成
高分子化合物［III］を得た。アミノ酸分析の結果、化
合物［III］１ｍｇ中にＤＧＥＡペプチドが３.０μｇ導
入されていることを確認した。また平均分子量は５９０
００であった。
【００４７】細胞接着性合成高分子化合物［IV］の合成 ［I］のＲＧＤＶペプチドをＹＩＧＳＲペプチド０.１ｇ
とする以外は、［I］と同様にして粉末状の細胞接着性
合成高分子化合物［IV］を得た。アミノ酸分析の結果、
高分子化合物［IV］１ｍｇ中にはＹＩＧＳＲペプチドが
２.４μｇ導入されていることを確認した。
とする以外は、［I］と同様にして粉末状の細胞接着性
合成高分子化合物［IV］を得た。アミノ酸分析の結果、
高分子化合物［IV］１ｍｇ中にはＹＩＧＳＲペプチドが
２.４μｇ導入されていることを確認した。
【００４８】細胞培養 ディッシュの調製 （ｉ） 合成高分子化合物［I］を７０％(v/v)エタノー
ルに溶解して０.０１％（ｗ／ｖ）（１００μｇ／ｍ
ｌ）溶液を調製した。市販のポリスチレン製細胞培養用
３５ｍｍディッシュ（細胞培養用シャーレ（親水化処理
ずみ）：住友ベークライト社製）に１ｍｌ添加し、クリ
ーンベンチ内で一晩放置して乾燥させ、合成高分子化合
物［I］で被覆したディッシュ（ａ）を得た。
ルに溶解して０.０１％（ｗ／ｖ）（１００μｇ／ｍ
ｌ）溶液を調製した。市販のポリスチレン製細胞培養用
３５ｍｍディッシュ（細胞培養用シャーレ（親水化処理
ずみ）：住友ベークライト社製）に１ｍｌ添加し、クリ
ーンベンチ内で一晩放置して乾燥させ、合成高分子化合
物［I］で被覆したディッシュ（ａ）を得た。
【００４９】（ii） コラーゲンタイプＩ（Cellmatrix
-IC：新田ゼラチン製）を７０％エタノールに溶解して
０.０１％（ｗ／ｖ）の溶液を調製した。得られた溶液
を（ｉ）と同様にして培養容器に被覆し、コラーゲンタ
イプＩで被覆したディッシュ（ｂ）を得た。
-IC：新田ゼラチン製）を７０％エタノールに溶解して
０.０１％（ｗ／ｖ）の溶液を調製した。得られた溶液
を（ｉ）と同様にして培養容器に被覆し、コラーゲンタ
イプＩで被覆したディッシュ（ｂ）を得た。
【００５０】（iii） 上記（ｉ）および（ii）で得ら
れた合成高分子化合物ＩとコラーゲンタイプＩのエタノ
ール溶液を１：１で混合した。得られた混合溶液を
（ｉ）と同様にして細胞培養用ディッシュに被覆し、合
成高分子化合物［I］とコラーゲンタイプＩの混合物で
被覆したディッシュ（ｃ）を得た。
れた合成高分子化合物ＩとコラーゲンタイプＩのエタノ
ール溶液を１：１で混合した。得られた混合溶液を
（ｉ）と同様にして細胞培養用ディッシュに被覆し、合
成高分子化合物［I］とコラーゲンタイプＩの混合物で
被覆したディッシュ（ｃ）を得た。
【００５１】（iv） （ｉ）と同様にして合成高分子化
合物［II］〜［IＶ］を７０％エタノールに溶解した０.
０１％溶液を調製した。この溶液と（ii）で得られたコ
ラーゲンタイプＩの溶液を１：１で混合し、（ｉ）と同
様にして培養容器に被覆し、合成高分子化合物［II］〜
［IV］のそれぞれとコラーゲンタイプＩの混合物で被覆
したディッシュ（ｄ）〜（ｆ）を得た。
合物［II］〜［IＶ］を７０％エタノールに溶解した０.
０１％溶液を調製した。この溶液と（ii）で得られたコ
ラーゲンタイプＩの溶液を１：１で混合し、（ｉ）と同
様にして培養容器に被覆し、合成高分子化合物［II］〜
［IV］のそれぞれとコラーゲンタイプＩの混合物で被覆
したディッシュ（ｄ）〜（ｆ）を得た。
【００５２】（ｖ） コントロールとしてノンコートの
ディッシュ（ｇ）を用いた。
ディッシュ（ｇ）を用いた。
【００５３】実施例１ 細胞 ＨＵＶＥＣは低血清血管内皮細胞増殖培地（Ｅ−ＧＭ
ＵＶ：倉敷紡績社製）で２次培養された正常ヒト臍帯静
脈血管内皮細胞培養キット（エンドセル、倉敷紡績社
製）を用いた。なおＥ−ＧＭ ＵＶは血管内皮細胞基礎
培地（Ｅ−ＢＭ）にＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、ハイド
ロコーチゾン（１μＧ／ＭＬ）、抗菌剤（ゲンタマイシ
ン：５０μｇ／ｍｌ、アンフォテリシンＢ：０.２５μ
ｇ／ｍｌ）ＢＢＥ（０.４％ｖ／ｖ）およびウシ胎児血
清（２％（ｖ／ｖ））を添加したものである。
ＵＶ：倉敷紡績社製）で２次培養された正常ヒト臍帯静
脈血管内皮細胞培養キット（エンドセル、倉敷紡績社
製）を用いた。なおＥ−ＧＭ ＵＶは血管内皮細胞基礎
培地（Ｅ−ＢＭ）にＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、ハイド
ロコーチゾン（１μＧ／ＭＬ）、抗菌剤（ゲンタマイシ
ン：５０μｇ／ｍｌ、アンフォテリシンＢ：０.２５μ
ｇ／ｍｌ）ＢＢＥ（０.４％ｖ／ｖ）およびウシ胎児血
清（２％（ｖ／ｖ））を添加したものである。
【００５４】無血清培地 基礎培地としてＭＣＤＢ１３１培地（Knedler, A and H
am, R. G. In Vitro Cellular & Developmental Biolog
y ２３ ７：４８１〜４８１（１９８７）に従って調製
した）を用いた。ここへ添加物としてＥＧＦ（１０ｎｇ
／ｍｌ）（倉敷紡績社製）、ハイドロコーチゾン（１μ
ｇ／ｍｌ）（倉敷紡績社製）、抗菌剤（ゲンタマイシ
ン：５０μｇ／ｍｌ、アンフォテリシンＢ：０.２５μ
ｇ／ｍｌ（倉敷紡績社製）、ＢＢＥ（０.４％（ｖ／
ｖ））（倉敷紡績社製）およびインスリン（１０μｇ／
ｍｌ）（シグマ社製）を添加した。さらに表２に示す各
濃度のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（シグマ社製）と
トランスフェリン（シグマ社製）を添加して無血清培地
Ａ〜Ｄを調製した。
am, R. G. In Vitro Cellular & Developmental Biolog
y ２３ ７：４８１〜４８１（１９８７）に従って調製
した）を用いた。ここへ添加物としてＥＧＦ（１０ｎｇ
／ｍｌ）（倉敷紡績社製）、ハイドロコーチゾン（１μ
ｇ／ｍｌ）（倉敷紡績社製）、抗菌剤（ゲンタマイシ
ン：５０μｇ／ｍｌ、アンフォテリシンＢ：０.２５μ
ｇ／ｍｌ（倉敷紡績社製）、ＢＢＥ（０.４％（ｖ／
ｖ））（倉敷紡績社製）およびインスリン（１０μｇ／
ｍｌ）（シグマ社製）を添加した。さらに表２に示す各
濃度のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（シグマ社製）と
トランスフェリン（シグマ社製）を添加して無血清培地
Ａ〜Ｄを調製した。
【００５５】
【表２】
【００５６】培養 上記方法で調製した（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のディ
ッシュおよびコントロールのノンコートディッシュ
（ｇ）に表２に示したＡ〜Ｄの無血清培地を各２ｍｌず
つ添加し、３７℃に設定した炭酸ガスインキュベーター
で２時間以上インキュベートした。ＭＣＤＢ１３１培地
に４.６×１０5個／ｍｌの濃度に懸濁したＨＵＶＥＣを
各ディッシュに１００μｌずつ添加し、各ディッシュに
細胞が５０００個／ｃｍ２となるように播種した。３時
間炭酸ガスインキュベーターで３７℃にて培養した後に
位相差顕微鏡で細胞の形態を観察し、接着している細胞
数をカウントして初期接着率を求めた。初期接着率は以
下の式： 初期接着率（％）＝（接着細胞数／播種細胞数）×１０
０ により求めた。結果を表３に示す。
ッシュおよびコントロールのノンコートディッシュ
（ｇ）に表２に示したＡ〜Ｄの無血清培地を各２ｍｌず
つ添加し、３７℃に設定した炭酸ガスインキュベーター
で２時間以上インキュベートした。ＭＣＤＢ１３１培地
に４.６×１０5個／ｍｌの濃度に懸濁したＨＵＶＥＣを
各ディッシュに１００μｌずつ添加し、各ディッシュに
細胞が５０００個／ｃｍ２となるように播種した。３時
間炭酸ガスインキュベーターで３７℃にて培養した後に
位相差顕微鏡で細胞の形態を観察し、接着している細胞
数をカウントして初期接着率を求めた。初期接着率は以
下の式： 初期接着率（％）＝（接着細胞数／播種細胞数）×１０
０ により求めた。結果を表３に示す。
【００５７】
【表３】
【００５８】（ａ）〜（ｃ）の被覆処理を施したディッ
シュを用いれば、ＢＳＡおよびトランスフェリンを添加
した無血清培地Ａ〜Ｃのいずれを用いた場合であっても
ＨＵＶＥＣの初期接着率は各ディッシュともほぼ同じく
１００％に近い値を示した。一方、ＢＳＡおよびトラン
スフェリンを添加していない無血清培地Ｄを用いた場合
にはＨＵＶＥＣの初期接着率がかなり低く、本発明の培
養法においてはＢＳＡおよびトランスフェリンの培地へ
の添加必須であることを示す。またノンコートディッシ
ュでは無血清培地での培養による初期接着率は非常に低
かった。
シュを用いれば、ＢＳＡおよびトランスフェリンを添加
した無血清培地Ａ〜Ｃのいずれを用いた場合であっても
ＨＵＶＥＣの初期接着率は各ディッシュともほぼ同じく
１００％に近い値を示した。一方、ＢＳＡおよびトラン
スフェリンを添加していない無血清培地Ｄを用いた場合
にはＨＵＶＥＣの初期接着率がかなり低く、本発明の培
養法においてはＢＳＡおよびトランスフェリンの培地へ
の添加必須であることを示す。またノンコートディッシ
ュでは無血清培地での培養による初期接着率は非常に低
かった。
【００５９】位相差顕微鏡で観察したところ、被覆処理
を施した各ディッシュとも細胞が接着し、伸展している
のが観察できた。しかし、ノンコートディッシュの無血
清培養においては細胞の接着率が低いばかりでなく、細
胞がディッシュの中央部に集まっている傾向を示した。
これは細胞とディッシュの間の接着がノンコートのディ
ッシュにおいては細胞同士の接着より弱いためであると
考えられる。細胞接着活性を有する天然高分子化合物お
よび／または天然高分子化合物の被覆によって細胞のデ
ィッシュ表面への接着性および伸展性が向上したことが
わかる。
を施した各ディッシュとも細胞が接着し、伸展している
のが観察できた。しかし、ノンコートディッシュの無血
清培養においては細胞の接着率が低いばかりでなく、細
胞がディッシュの中央部に集まっている傾向を示した。
これは細胞とディッシュの間の接着がノンコートのディ
ッシュにおいては細胞同士の接着より弱いためであると
考えられる。細胞接着活性を有する天然高分子化合物お
よび／または天然高分子化合物の被覆によって細胞のデ
ィッシュ表面への接着性および伸展性が向上したことが
わかる。
【００６０】実施例２ 実施例１と同様の方法でＨＵＶＥＣを５日間培養し、生
存細胞数を計数した。結果を表４に示す。
存細胞数を計数した。結果を表４に示す。
【００６１】
【表４】
【００６２】ＢＳＡおよびトランスフェリンを含有する
無血清培地を用い、合成高分子化合物あるいはコラーゲ
ンタイプＩで被覆した容器を用いればＨＵＶＥＣは少な
くとも数日間は維持することができた。また、コラーゲ
ンと合成高分子化合物を混合して被覆したディッシュ
（ｃ）では顕著な増殖が認められた。
無血清培地を用い、合成高分子化合物あるいはコラーゲ
ンタイプＩで被覆した容器を用いればＨＵＶＥＣは少な
くとも数日間は維持することができた。また、コラーゲ
ンと合成高分子化合物を混合して被覆したディッシュ
（ｃ）では顕著な増殖が認められた。
【００６３】一方ＢＳＡおよびトランスフェリンを含有
しない培地では、ＨＵＶＥＣの増殖が認められなかっ
た。実施例１および２の結果から本発明の血管内皮細胞
の無血清培養法においては血清アルブミンおよびトラン
スフェリンの培地中への添加が必須であることが示され
る。
しない培地では、ＨＵＶＥＣの増殖が認められなかっ
た。実施例１および２の結果から本発明の血管内皮細胞
の無血清培養法においては血清アルブミンおよびトラン
スフェリンの培地中への添加が必須であることが示され
る。
【００６４】実施例３ 無血清培地 基礎培地としてＭＣＤＢ１３１およびＭＣＤＢ１０７
（極東製薬工業社製）を用い、これにＥＧＦ（１０ｎｇ
／ｍｌ）、ハイドロコーチゾン（１μｇ／ｍｌ）、抗菌
剤（ゲンタマイシン：５０μｇ／ｍｌ、アンフォテリシ
ンＢ：０.２５μｇ／ｍｌ）、ＢＢＥ（０.４％ｖ／
ｖ）、インスリン（１０μｇ／ｍｌ）およびトランスフ
ェリン（１０μｇ／ｍｌ）を添加し、さらに各濃度のウ
シ血清アルブミン（ＢＳＡ）を添加した無血清培地を調
製した。
（極東製薬工業社製）を用い、これにＥＧＦ（１０ｎｇ
／ｍｌ）、ハイドロコーチゾン（１μｇ／ｍｌ）、抗菌
剤（ゲンタマイシン：５０μｇ／ｍｌ、アンフォテリシ
ンＢ：０.２５μｇ／ｍｌ）、ＢＢＥ（０.４％ｖ／
ｖ）、インスリン（１０μｇ／ｍｌ）およびトランスフ
ェリン（１０μｇ／ｍｌ）を添加し、さらに各濃度のウ
シ血清アルブミン（ＢＳＡ）を添加した無血清培地を調
製した。
【００６５】培養 実施例１と同様にして（ａ）〜（ｃ）の各ディッシュを
用いてＨＵＶＥＣを培養し、５日後の細胞数を計数し
た。結果を表５に示した。
用いてＨＵＶＥＣを培養し、５日後の細胞数を計数し
た。結果を表５に示した。
【００６６】
【表５】
【００６７】ＢＳＡを添加した無血清培地中では細胞の
増殖が認められた。特にＢＳＡが１μｇ／ｍｌ以上、好
ましくは１００μｇ／ｍｌ以上の添加により飛躍的な増
殖が認められた。一方、ＢＳＡを添加しない培地では増
殖率が劣り、培養細胞を維持することができない場合も
認められた。
増殖が認められた。特にＢＳＡが１μｇ／ｍｌ以上、好
ましくは１００μｇ／ｍｌ以上の添加により飛躍的な増
殖が認められた。一方、ＢＳＡを添加しない培地では増
殖率が劣り、培養細胞を維持することができない場合も
認められた。
【００６８】実施例４ 無血清培地 基礎培地として実施例１と同じＭＣＤＢ１３１培地を用
いた。ここへＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、ハイドロコー
チゾン（１μｇ／ｍｌ）、抗菌剤（ゲンタマイシン：５
０μｇ／ｍｌ、アンフォテリシンＢ：０.２５μｇ／ｍ
ｌ）、ＢＢＥ（０.４％ｖ／ｖ）、インスリン（１０μ
ｇ／ｍｌ）、トランスフェリン（１０μｇ／ｍｌ）、お
よびＢＳＡ（１００μｇ／ｍｌ）を添加して無血清培地
を調製した。
いた。ここへＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、ハイドロコー
チゾン（１μｇ／ｍｌ）、抗菌剤（ゲンタマイシン：５
０μｇ／ｍｌ、アンフォテリシンＢ：０.２５μｇ／ｍ
ｌ）、ＢＢＥ（０.４％ｖ／ｖ）、インスリン（１０μ
ｇ／ｍｌ）、トランスフェリン（１０μｇ／ｍｌ）、お
よびＢＳＡ（１００μｇ／ｍｌ）を添加して無血清培地
を調製した。
【００６９】培養 コラーゲンタイプＩで被覆したディッシュ（ｂ）および
合成高分子化合物［I］〜［IV］とコラーゲンタイプＩ
の混合物で被覆したディッシュ（ｃ）〜（ｇ）を用い、
実施例１と同様にしてＨＵＶＥＣを培養した。５日間培
養後の細胞数をカウントした。結果を表６に示す。
合成高分子化合物［I］〜［IV］とコラーゲンタイプＩ
の混合物で被覆したディッシュ（ｃ）〜（ｇ）を用い、
実施例１と同様にしてＨＵＶＥＣを培養した。５日間培
養後の細胞数をカウントした。結果を表６に示す。
【００７０】
【表６】
【００７１】合成高分子化合物［I］〜［IV］のいずれ
かとコラーゲンタイプＩの混合物の被覆により、コラー
ゲンタイプＩを単独で被覆した場合よりもＨＵＶＥＣの
増殖性が有意に増加した。
かとコラーゲンタイプＩの混合物の被覆により、コラー
ゲンタイプＩを単独で被覆した場合よりもＨＵＶＥＣの
増殖性が有意に増加した。
【００７２】実施例５ 本発明の方法により無血清培養した正常ヒト臍帯静脈血
管内皮細胞のエンドセリン産生能を調べた。実施例４で
用いた無血清培地を用いてＨＵＶＥＣを５日間培養した
後、培地の全量を新しい培地と交換し、更に２４時間培
養した。培養上清を採取し、培養上清中のエンドセリン
量を測定した。比較例として２％のウシ胎児血清を含有
する低血清培地であるＥ−ＧＭ ＵＶ培地を用いて培養
を行ったＨＵＶＥＣのエンドセリン産生能を同様にして
測定した。測定はエンドセリン−１測定用キット（国際
試薬社製）を用いて行った。結果を表７に示す。
管内皮細胞のエンドセリン産生能を調べた。実施例４で
用いた無血清培地を用いてＨＵＶＥＣを５日間培養した
後、培地の全量を新しい培地と交換し、更に２４時間培
養した。培養上清を採取し、培養上清中のエンドセリン
量を測定した。比較例として２％のウシ胎児血清を含有
する低血清培地であるＥ−ＧＭ ＵＶ培地を用いて培養
を行ったＨＵＶＥＣのエンドセリン産生能を同様にして
測定した。測定はエンドセリン−１測定用キット（国際
試薬社製）を用いて行った。結果を表７に示す。
【００７３】
【表７】
【００７４】本発明の無血清培養法で培養した血管内皮
細胞は、その細胞当たりのエンドセリン産生能が血清を
含有する培地で培養した場合と同程度の細胞当たりのエ
ンドセリン産生能を維持してる。
細胞は、その細胞当たりのエンドセリン産生能が血清を
含有する培地で培養した場合と同程度の細胞当たりのエ
ンドセリン産生能を維持してる。
【００７５】
【発明の効果】本発明の方法により、従来困難であった
接着性動物細胞、特に血管内皮細胞の無血清培養を容易
に行うことができる。本発明の方法によって培養された
細胞は血清を含有する培地で培養された場合と同等の機
能を維持している。
接着性動物細胞、特に血管内皮細胞の無血清培養を容易
に行うことができる。本発明の方法によって培養された
細胞は血清を含有する培地で培養された場合と同等の機
能を維持している。
フロントページの続き (72)発明者 西野 豊和 大阪府寝屋川市下木田町14番５号 倉敷紡 績株式会社技術研究所内
Claims (7)
- 【請求項１】 細胞接着活性を有する１または２以上の
高分子化合物を細胞培養用担体の表面の少なくとも一部
に存在させ、血清を含有せず、少なくとも血清アルブミ
ンを含有する動物細胞培養用培地で接着性動物細胞を培
養することを特徴とする接着性動物細胞の無血清培養
法。 - 【請求項２】 動物細胞培養用培地にさらにトランスフ
ェリンを含有する請求項１記載の無血清培養法。 - 【請求項３】 細胞接着活性を有する１または２以上の
高分子化合物が、コラーゲン、ゼラチン、ケラチン、フ
ァイブロネクチン、ビトロネクチンおよびラミニンから
なる群より選択される天然高分子化合物を含有する請求
項１または２記載の無血清培養法。 - 【請求項４】 細胞接着活性を有する１または２以上の
高分子化合物が細胞接着活性を有するペプチドで修飾し
た合成高分子化合物である請求項１または２記載の無血
清培養法。 - 【請求項５】 細胞接着活性を有するペプチドが、ＲＧ
ＤＶ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｖａｌ）、ＲＧＤＳ
（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ）、ＲＧＤＮ（Ａｒ
ｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｓｎ）、ＤＧＥＡ（Ａｓｐ−Ｇ
ｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｌａ）およびＹＩＧＳＲ（Ｔｙｒ−Ｉ
ｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ）からなる群から選択さ
れるペプチドである請求項４記載の無血清培養法。 - 【請求項６】 細胞接着活性を有する高分子化合物が天
然高分子化合物と細胞接着活性を有するペプチドで修飾
した合成高分子化合物の混合物である請求項１または２
記載の無血清培養法。 - 【請求項７】 接着性動物細胞が血管内皮細胞である請
求項１〜６のいずれかに記載の無血清培養法。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5141984A JPH078273A (ja) | 1993-06-14 | 1993-06-14 | 接着性動物細胞の無血清培養法 |
| US08/128,225 US5691203A (en) | 1993-06-14 | 1993-09-29 | Method for serum-free culture of human vascular endothelial cells |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5141984A JPH078273A (ja) | 1993-06-14 | 1993-06-14 | 接着性動物細胞の無血清培養法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH078273A true JPH078273A (ja) | 1995-01-13 |
Family
ID=15304696
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5141984A Pending JPH078273A (ja) | 1993-06-14 | 1993-06-14 | 接着性動物細胞の無血清培養法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5691203A (ja) |
| JP (1) | JPH078273A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005078070A1 (ja) * | 2004-02-13 | 2005-08-25 | Reprocell, Inc. | 胚性幹細胞用フィーダー細胞作成培地およびフィーダー細胞 |
| JP2014226097A (ja) * | 2013-05-23 | 2014-12-08 | 株式会社日立ハイテクノロジーズ | 細胞培養方法、粒子状培養担体、及び粒子包含細胞凝集体 |
| US11512764B2 (en) * | 2019-08-28 | 2022-11-29 | Chen Sound Industrial Co., Ltd. | Tool changing system with rigidity improved belt moving mechanism |
Families Citing this family (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6692961B1 (en) * | 1996-10-11 | 2004-02-17 | Invitrogen Corporation | Defined systems for epithelial cell culture and use thereof |
| WO2000002998A1 (en) | 1998-07-10 | 2000-01-20 | Brigham & Women's Hospital, Inc. | Methods for implanting cells |
| US6824549B1 (en) * | 2000-06-07 | 2004-11-30 | Iris Ginron Chao | Method & device for making reversed bypass with cultured vessel in situ |
| DE60230858D1 (de) * | 2001-02-15 | 2009-03-05 | Centocor Inc | Chemisch definiertes medium für kultivierte säugerzellen |
| NZ532170A (en) * | 2001-11-02 | 2008-05-30 | Wisconsin Alumni Res Found | Endothelial cells derived from primate embryonic stem cells |
| US7163321B2 (en) * | 2002-07-25 | 2007-01-16 | Steven Contarino | Emergency vehicle grille |
| US7989205B2 (en) * | 2005-10-06 | 2011-08-02 | American Cryostem Corporation | Cell culture media, kits and methods of use |
| AU2007217898A1 (en) * | 2006-02-17 | 2007-08-30 | Wake Forest University Health Sciences | Coatings and biomedical implants formed from keratin biomaterials |
| US8273702B2 (en) * | 2006-02-17 | 2012-09-25 | Wake Forest University Health Sciences | Wound healing compositions containing keratin biomaterials |
| EP2188367A4 (en) * | 2007-08-10 | 2010-10-27 | Whitehead Biomedical Inst | HORMONE REACTIVE TISSUE CULTURE SYSTEM, AND USES THEREOF |
| CN101939362A (zh) | 2008-01-30 | 2011-01-05 | 杰龙公司 | 用于培养干细胞衍生的少突胶质细胞前体细胞的合成表面 |
| ATE555191T1 (de) * | 2008-01-30 | 2012-05-15 | Geron Corp | Synthetische oberflächen zur kultivierung von zellen in chemisch definierten medien |
| WO2009099539A2 (en) * | 2008-01-30 | 2009-08-13 | Corning Incorporated | (meth)acrylate surfaces for cell culture, methods of making and using the surfaces |
| US8329469B2 (en) | 2008-01-30 | 2012-12-11 | Geron Corporation | Swellable (meth)acrylate surfaces for culturing cells in chemically defined media |
| WO2009097411A1 (en) | 2008-01-30 | 2009-08-06 | Geron Corporation | Synthetic surfaces for culturing stem cell derived cardiomyocytes |
| WO2010093882A1 (en) * | 2009-02-13 | 2010-08-19 | Wake Forest University Health Sciences | Keratin biomaterials for cell culture and methods of use |
| US8362144B2 (en) * | 2009-05-21 | 2013-01-29 | Corning Incorporated | Monomers for making polymeric cell culture surface |
| CN106608905B (zh) * | 2015-10-22 | 2020-10-16 | 彭莉 | 四氢异喹啉-3-甲酰-k(grpak)rgdv,其合成,活性及应用 |
| CN105647851A (zh) * | 2016-03-01 | 2016-06-08 | 赛百慷（上海）生物技术股份有限公司 | 一种内皮培养体系 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0283942B1 (en) * | 1987-03-24 | 1992-05-20 | W.R. Grace & Co.-Conn. | Basal nutrient medium for cell culture |
| US5284766A (en) * | 1989-02-10 | 1994-02-08 | Kao Corporation | Bed material for cell culture |
| DE69013764T2 (de) * | 1989-06-03 | 1995-03-30 | Kanegafuchi Chemical Ind | Kontrolle der Zellanordnung. |
| US5278063A (en) * | 1989-09-28 | 1994-01-11 | Board Of Regents The University Of Texas System | Chemical modification of promote animal cell adhesion on surfaces |
| CA2101052A1 (en) * | 1991-01-25 | 1992-07-26 | Amy P. N. Skubitz | Laminin a chain domain vi polypeptides |
-
1993
- 1993-06-14 JP JP5141984A patent/JPH078273A/ja active Pending
- 1993-09-29 US US08/128,225 patent/US5691203A/en not_active Expired - Fee Related
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005078070A1 (ja) * | 2004-02-13 | 2005-08-25 | Reprocell, Inc. | 胚性幹細胞用フィーダー細胞作成培地およびフィーダー細胞 |
| JPWO2005078070A1 (ja) * | 2004-02-13 | 2007-10-18 | 株式会社リプロセル | 胚性幹細胞用フィーダー細胞作成培地およびフィーダー細胞 |
| JP2014226097A (ja) * | 2013-05-23 | 2014-12-08 | 株式会社日立ハイテクノロジーズ | 細胞培養方法、粒子状培養担体、及び粒子包含細胞凝集体 |
| US11512764B2 (en) * | 2019-08-28 | 2022-11-29 | Chen Sound Industrial Co., Ltd. | Tool changing system with rigidity improved belt moving mechanism |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US5691203A (en) | 1997-11-25 |
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