Nothing Special   »   [go: up one dir, main page]

JP6261500B2 - ヌクレアーゼ切断特異性の評価および改善 - Google Patents

ヌクレアーゼ切断特異性の評価および改善 Download PDF

Info

Publication number
JP6261500B2
JP6261500B2 JP2014522918A JP2014522918A JP6261500B2 JP 6261500 B2 JP6261500 B2 JP 6261500B2 JP 2014522918 A JP2014522918 A JP 2014522918A JP 2014522918 A JP2014522918 A JP 2014522918A JP 6261500 B2 JP6261500 B2 JP 6261500B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
site
nuclease
sequence
target
nucleic acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
JP2014522918A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2014523747A (ja
JP2014523747A5 (ja
Inventor
リウ，デービッド，アール．
ギリンジャー，ジョン，ポール
パッタナヤク，ヴィクラム
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Harvard College
Original Assignee
Harvard College
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Harvard College filed Critical Harvard College
Publication of JP2014523747A publication Critical patent/JP2014523747A/ja
Publication of JP2014523747A5 publication Critical patent/JP2014523747A5/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP6261500B2 publication Critical patent/JP6261500B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/44—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving esterase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C12Q1/6874—Methods for sequencing involving nucleic acid arrays, e.g. sequencing by hybridisation

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Description

関連出願
本出願は、米国特許法第１１９（ｅ）項に基づいて、２０１１年７月２２日に出願された米国仮特許出願第６１／５１０，８４１号明細書に対する優先権を主張するものであり、この仮特許出願の内容全体は、参照により本明細書に組み込まれるものとする。
政府の支援
本発明は、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）／国立総合医科学研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）からの助成金第Ｒ０１ ＧＭ０６５４００号および第Ｒ０１ ＧＭ０８８０４０号、国防総省国防高等研究事業局（Ｄｅｆｅｎｓｅ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ Ａｇｅｎｃｙ）からの助成金第ＨＲ００１１−１１−２−０００３号、および国立衛生研究所からの助成金第ＤＰ１ ＯＤ００６８６２号の下で、米国政府の支援によりなされた。米国政府は本発明において特定の権利を有する。
部位特異的エンドヌクレアーゼは、理論的には、ゲノム内の単一部位の標的化操作を可能にし、遺伝子ターゲティングおよび治療用途の文脈において有用である。哺乳動物を含む種々の生物において、部位特異的エンドヌクレアーゼ、例えばジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、非相同末端連結または相同組換えのいずれかを促進することによりゲノム工学に使用されている。強力な研究ツールを提供することに加えて、ＺＦＮは、遺伝子治療剤としての能力も有し、２つのＺＦＮが最近臨床試験に入った：その１つであるＣＣＲ５−２２４６は、抗ＨＩＶ治療の手法の一部としてヒトＣＣＲ−５対立遺伝子を標的とし（ＮＣＴ００８４２６３４、ＮＣＴ０１０４４６５４、ＮＣＴ０１２５２６４１）、もう１つのＶＦ２４６８４は、抗癌治療手法の一部としてヒトＶＥＧＦ−Ａプロモーターを標的とする（ＮＣＴ０１０８２９２６）。
操作された部位特異的結合ドメインの一部にある不完全な特異性が細胞毒性につながっていたので、目的の標的部位に正確にターゲティングすることが、特に治療用途では、部位特異的ヌクレアーゼの望ましくないオフターゲット作用を最小化するために重要である。しかしながら、二量体形成後にその標的部位を切断する、現行のＺＦＮを含む、操作された部位特異的ヌクレアーゼの部位選択性は、単量体タンパク質の結合および切断特異性の算出に限定される方法を使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｓｉｌｉｃｏでこれまで評価されてきたにすぎない。
したがって、ヌクレアーゼおよび他の核酸切断剤のオフターゲット部位を評価するための改善されたシステムが必要であり、それは、特に治療用途のための、より優れた特異性を有するヌクレアーゼの設計に有用となろう。
本発明は、操作された部位特異的エンドヌクレアーゼの一部について報告された毒性が、単にオフターゲット結合によるのではなく、オフターゲットＤＮＡ切断に基づいているという認識に少なくとも一部は基づいている。部位特異的ヌクレアーゼの特異性に関するこれまでの情報は、以下の仮定に基づいていた、すなわち、（ｉ）二量体ヌクレアーゼは、単離の単量体ドメインがＤＮＡに結合する場合と同じ配列特異性でＤＮＡを切断すること；および（ｉｉ）所与の二量体ヌクレアーゼにおいて、一方のドメインの結合は、他方のドメインの結合に影響を及ぼさないこと。これまでの研究では、活性な二量体部位特異的ヌクレアーゼの幅広いＤＮＡ切断特異性を決定するための方法が報告されていない。そのような方法は、ヌクレアーゼのＤＮＡ切断特異性を決定するのに有用であるだけでなく、ＤＮＡを切断する小分子などの他のＤＮＡ切断剤の切断特異性を評価するのにも有用であることがわかるであろう。
本発明は、部位特異的ヌクレアーゼ、特に、標的配列を切断するために二量体または多量体を形成するヌクレアーゼの配列特異性を評価し特徴づける以前の試みの欠点に取り組む。本発明の一部の態様は、活性ヌクレアーゼの切断特異性を幅広く調べるｉｎ ｖｉｔｒｏ選択法を提供する。一部の態様では、本発明は、オフターゲット切断をまったくかまたは少なくとも最小限にしか伴うことなく所与のヌクレアーゼによる特異的切断を達成するために、ゲノム内の他のいかなる部位とも十分異なる適切なヌクレアーゼ標的部位を同定する方法を提供する。本発明は、現行のヌクレアーゼと比較して特異性が向上した部位特異的ヌクレアーゼを評価、選択、および／または設計する方法を提供する。例えば、結合親和性が低下した結合ドメインを有する変異ヌクレアーゼの設計によるヌクレアーゼ特異性の向上、ヌクレアーゼの最終濃度の低減、およびゲノム中の最も近縁の配列類縁体と少なくとも３塩基対は異なる標的部位の選択によって、所与のヌクレアーゼによるオフターゲット切断を最小化するための方法を提供する。本発明の方法の実施に有用な組成物およびキットも提供する。提供する方法、組成物、およびキットは、当業者が認識するように、他の核酸（例えば、ＤＮＡ）切断剤の評価、設計、および選択にも有用である。
別の態様では、本発明は、提供するシステムを使用して設計または選択されるヌクレアーゼおよび他の核酸切断剤を提供する。本明細書に提供する方法によって設計、評価、または選択される単離のＺＦＮおよびＴＡＬＥＮならびにそのようなヌクレアーゼを含む医薬組成物も提供する。
本発明の一部の態様は、ヌクレアーゼの標的部位を同定するための方法を提供する。一部の実施形態では、この方法は、（ａ）二本鎖核酸の標的部位を切断し、５’オーバーハングを生成するヌクレアーゼを準備するステップであって、標的部位が［左ハーフサイト］−［スペーサー配列］−［右ハーフサイト］（ＬＳＲ）構造を含み、ヌクレアーゼがスペーサー配列内の標的部位を切断するステップを含む。一部の実施形態では、この方法は、（ｂ）ヌクレアーゼがヌクレアーゼの標的部位を含む候補核酸分子を切断するのに適切な条件下で、候補核酸分子のライブラリーにヌクレアーゼを接触させるステップであって、各核酸分子が、候補ヌクレアーゼ標的部位および一定の挿入配列を含む配列のコンカテマーを含むステップを含む。一部の実施形態では、この方法は、（ｃ）ヌクレアーゼにより２回切断され、一方の側に左ハーフサイトおよび切断スペーサー配列が隣接し、他方の側に右ハーフサイトおよび切断スペーサー配列が隣接した一定の挿入配列を含む核酸分子の５’オーバーハングを充填し、それによって平滑末端を作製するステップを含む。一部の実施形態では、この方法は、（ｄ）ステップ（ｃ）の核酸分子の左ハーフサイト、右ハーフサイト、および／またはスペーサー配列の配列を決定することにより、ヌクレアーゼにより切断されたヌクレアーゼ標的部位を同定するステップを含む。一部の実施形態では、ステップ（ｄ）の配列決定は、ステップ（ｃ）の核酸分子の平滑末端にシークエンシングアダプターを連結し、核酸分子の増幅および／またはシークエンシングを行うステップを含む。一部の実施形態では、この方法は、シークエンシングアダプターの連結後、ＰＣＲにより核酸分子を増幅するステップを含む。一部の実施形態では、この方法は、単一の一定挿入配列を含む分子について、ステップ（ｃ）またはステップ（ｄ）の核酸分子を濃縮するステップをさらに含む。一部の実施形態では、濃縮ステップはサイズ分画を含む。一部の実施形態では、サイズ分画はゲル精製により行われる。一部の実施形態では、この方法は、５’オーバーハングが充填された相補対を核酸分子が含まなかった場合、ステップ（ｄ）で決定されたいかなる配列も廃棄するステップをさらに含む。一部の実施形態では、この方法は、ステップ（ｄ）で同定された複数のヌクレアーゼ標的部位を編集し、それによってヌクレアーゼ標的部位のプロファイルを作製するステップをさらに含む。一部の実施形態では、ヌクレアーゼは、疾患に関連した遺伝子中の特定のヌクレアーゼ標的部位を切断する治療用ヌクレアーゼである。一部の実施形態では、この方法は、治療用ヌクレアーゼが特定のヌクレアーゼ標的部位を切断し、かつ１０を超える、５を超える、４を超える、３を超える、２を超える、１を超える、さらなるヌクレアーゼ標的部位を切断しないか、またはまったく切断しない治療用ヌクレアーゼの最大濃度を決定するステップをさらに含む。一部の実施形態では、この方法は、最大濃度以下の最終濃度を生じさせるのに有効な量で、治療用ヌクレアーゼを被験体に投与するステップをさらに含む。一部の実施形態では、ヌクレアーゼは非特異的核酸切断ドメインを含む。一部の実施形態では、ヌクレアーゼはＦｏｋＩ切断ドメインを含む。一部の実施形態では、ヌクレアーゼは、切断ドメインが二量体形成すると標的配列を切断する核酸切断ドメインを含む。一部の実施形態では、ヌクレアーゼは、核酸配列に特異的に結合する結合ドメインを含む。一部の実施形態では、結合ドメインはジンクフィンガーを含む。一部の実施形態では、結合ドメインは、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つのジンクフィンガーを含む。一部の実施形態では、ヌクレアーゼはジンクフィンガーヌクレアーゼである。一部の実施形態では、結合ドメインは転写活性化因子様エレメントを含む。一部の実施形態では、ヌクレアーゼは、転写活性化因子様エレメントヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）である。一部の実施形態では、ヌクレアーゼは有機化合物を含む。一部の実施形態では、ヌクレアーゼはエンジインを含む。一部の実施形態では、ヌクレアーゼは抗生物質である。一部の実施形態では、化合物は、ジネミシン（ｄｙｎｅｍｉｃｉｎ）、ネオカルチノスタチン、カリチアマイシン、エスペラマイシン、ブレオマイシン、またはそれらの誘導体である。一部の実施形態では、ヌクレアーゼはホーミングエンドヌクレアーゼである。
本発明の一部の態様は、核酸分子のライブラリーを提供する。一部の実施形態では、複数の核酸分子を含む、核酸分子のライブラリーであって、各核酸分子が、候補ヌクレアーゼ標的部位および一定の挿入配列スペーサー配列のコンカテマーを含むライブラリーを提供する。一部の実施形態では、候補ヌクレアーゼ標的部位は、［左ハーフサイト］−［スペーサー配列］−［右ハーフサイト］（ＬＳＲ）構造を含む。一部の実施形態では、左ハーフサイトおよび／または右ハーフサイトは、１０〜１８ヌクレオチド長の間である。一部の実施形態では、ライブラリーは、ＦｏｋＩ切断ドメインを含むヌクレアーゼにより切断され得る候補ヌクレアーゼ標的部位を含む。一部の実施形態では、ライブラリーは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ホーミングエンドヌクレアーゼ、有機化合物ヌクレアーゼ、エンジイン、抗生物質ヌクレアーゼ、ジネミシン、ネオカルチノスタチン、カリチアマイシン、エスペラマイシン、および／またはブレオマイシンにより切断され得る候補ヌクレアーゼ標的部位を含む。一部の実施形態では、ライブラリーは、少なくとも１０５、少なくとも１０６、少なくとも１０７、少なくとも１０８、少なくとも１０９、少なくとも１０１０、少なくとも１０１１、または少なくとも１０１２の異なる候補ヌクレアーゼ標的部位を含む。一部の実施形態では、ライブラリーは、少なくとも５ｋＤａ、少なくとも６ｋＤａ、少なくとも７ｋＤａ、少なくとも８ｋＤａ、少なくとも９ｋＤａ、少なくとも１０ｋＤａ、少なくとも１２ｋＤａ、または少なくとも１５ｋＤａの分子量の核酸分子を含む。一部の実施形態では、候補ヌクレアーゼ標的部位は、部分的に無作為化された左ハーフサイト、部分的に無作為化された右ハーフサイト、および／または部分的に無作為化されたスペーサー配列を含む。一部の実施形態では、ライブラリーは、目的のヌクレアーゼの公知の標的部位のテンプレートである。一部の実施形態では、目的のヌクレアーゼは、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ホーミングエンドヌクレアーゼ、有機化合物ヌクレアーゼ、エンジイン、抗生物質ヌクレアーゼ、ジネミシン、ネオカルチノスタチン、カリチアマイシン、エスペラマイシン、ブレオマイシン、またはそれらの誘導体である。一部の実施形態では、部分的に無作為化された部位は、二項分布的に、平均して５％超、１０％超、１５％超、２０％超、２５％超、または３０％超、コンセンサス部位と異なる。一部の実施形態では、部分的に無作為化された部位は、二項分布的に、平均して１０％以下、１５％以下、２０％以下、２５％以下、３０％以下、４０％以下、または５０％以下、コンセンサス部位と異なる。一部の実施形態では、候補ヌクレアーゼ標的部位は無作為化されたスペーサー配列を含む。
本発明の一部の態様は、切断特異性の評価に基づいて、ヌクレアーゼを選択する方法を提供する。一部の実施形態では、コンセンサス標的部位を特異的に切断するヌクレアーゼを複数のヌクレアーゼから選択する方法を提供する。一部の実施形態では、この方法は、（ａ）同じコンセンサス配列を切断する複数の候補ヌクレアーゼを準備するステップと、（ｂ）ステップ（ａ）の候補ヌクレアーゼのそれぞれについて、コンセンサス標的部位とは異なる、候補ヌクレアーゼにより切断されたヌクレアーゼ標的部位を同定するステップと、（ｃ）ステップ（ｂ）で同定された１つまたは複数のヌクレアーゼ標的部位に基づいて、ヌクレアーゼを選択するステップとを含む。一部の実施形態では、ステップ（ｃ）で選択されるヌクレアーゼは、最高の特異性でコンセンサス標的部位を切断するヌクレアーゼである。一部の実施形態では、最高の特異性でコンセンサス標的部位を切断するヌクレアーゼは、コンセンサス部位とは異なる標的部位の切断数が最小である候補ヌクレアーゼである。一部の実施形態では、最高の特異性でコンセンサス標的部位を切断する候補ヌクレアーゼは、標的ゲノムの文脈においてコンセンサス部位とは異なる標的部位の切断数が最小である候補ヌクレアーゼである。一部の実施形態では、ステップ（ｃ）で選択される候補ヌクレアーゼは、コンセンサス標的部位以外のいかなる標的部位も切断しないヌクレアーゼである。一部の実施形態では、ステップ（ｃ）で選択される候補ヌクレアーゼは、ヌクレアーゼの治療有効濃度で、被験体のゲノム内のコンセンサス標的部位以外のいかなる標的部位も切断しないヌクレアーゼである。一部の実施形態では、この方法は、ステップ（ｃ）で選択されたヌクレアーゼとゲノムを接触させるステップをさらに含む。一部の実施形態では、ゲノムは、脊椎動物、哺乳動物、ヒト、非ヒト霊長類、げっ歯類、マウス、ラット、ハムスター、ヤギ、ヒツジ、ウシ、イヌ、ネコ、爬虫類、両生類、魚類、線虫、昆虫、またはハエのゲノムである。一部の実施形態では、ゲノムは生細胞内にある。一部の実施形態では、ゲノムは被験体内にある。一部の実施形態では、コンセンサス標的部位は、疾患または障害に関連する対立遺伝子内にある。一部の実施形態では、コンセンサス標的部位の切断は、疾患または障害の治療または予防をもたらす。一部の実施形態では、コンセンサス標的部位の切断は、疾患または障害の症候の緩和をもたらす。一部の実施形態では、この疾患はＨＩＶ／ＡＩＤＳまたは増殖性疾患である。一部の実施形態では、対立遺伝子はＣＣＲ５またはＶＥＧＦＡの対立遺伝子である。
本発明の一部の態様は、ゲノム内のヌクレアーゼ標的部位を選択するための方法を提供する。一部の実施形態では、この方法は、（ａ）候補ヌクレアーゼ標的部位を同定するステップと、（ｂ）汎用コンピューターを使用して、候補ヌクレアーゼ標的部位をゲノム内の他の配列と比較するステップであって、候補ヌクレアーゼ標的部位が、ゲノム内の他のいかなる配列とも、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、または少なくとも１０ヌクレオチド異なる場合、そのヌクレアーゼ部位を選択するステップとを含む。一部の実施形態では、候補ヌクレアーゼ標的部位は、［左ハーフサイト］−［スペーサー配列］−［右ハーフサイト］（ＬＳＲ）構造を含む。一部の実施形態では、左ハーフサイトおよび／または右ハーフサイトは、１０〜１８ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、スペーサーは、１０〜２４ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、この方法は、ステップ（ｂ）で選択された候補ヌクレアーゼ部位を標的とするヌクレアーゼを設計および／または作製するステップをさらに含む。一部の実施形態では、設計および／または作製は、組換え技術により行われる。一部の実施形態では、設計および／または作製は、選択された候補標的部位またはそのハーフサイトに特異的に結合する結合ドメインを設計するステップを含む。一部の実施形態では、設計および／または作製は、結合ドメインと核酸切断ドメインとをコンジュゲートするステップを含む。一部の実施形態では、核酸切断ドメインは非特異的切断ドメインであり、かつ／またはその核酸切断ドメインは核酸を切断するために二量体または多量体を形成しなければならない。一部の実施形態では、核酸切断ドメインはＦｏｋＩ切断ドメインを含む。一部の実施形態では、この方法はヌクレアーゼを単離するステップをさらに含む。一部の実施形態では、ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）もしくは転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ホーミングエンドヌクレアーゼであるか、あるいは有機化合物ヌクレアーゼ、エンジイン、抗生物質ヌクレアーゼ、ジネミシン、ネオカルチノスタチン、カリチアマイシン、エスペラマイシン、ブレオマイシン、もしくはそれらの誘導体であるかまたはそれらを含む。一部の実施形態では、候補標的部位は、その切断が疾患または障害の症候の緩和に関連することが知られているゲノム配列内にある。一部の実施形態では、この疾患はＨＩＶ／ＡＩＤＳまたは増殖性疾患である。一部の実施形態では、このゲノム配列はＣＣＲ５またはＶＥＧＦＡの配列である。
本発明の一部の態様は、特異性が向上した単離ヌクレアーゼおよびそのようなヌクレアーゼをコードする核酸を提供する。一部の実施形態では、ゲノム内の標的部位を切断するように操作された単離ヌクレアーゼであって、本明細書に記載の任意の選択方法によって選択されたヌクレアーゼを提供する。一部の実施形態では、本明細書に記載の任意の方法によって選択された標的部位を切断する単離ヌクレアーゼを提供する。一部の実施形態では、本明細書に記載の任意の概念またはパラメーターによって設計または操作された単離ヌクレアーゼを提供する。一部の実施形態では、ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）もしくは転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ホーミングエンドヌクレアーゼであるか、あるいは有機化合物ヌクレアーゼ、エンジイン、抗生物質ヌクレアーゼ、ジネミシン、ネオカルチノスタチン、カリチアマイシン、エスペラマイシン、ブレオマイシン、もしくはそれらの誘導体であるかまたはそれらを含む。
本発明の一部の態様は、ヌクレアーゼおよびヌクレアーゼ組成物を含むキットを提供する。一部の実施形態では、本明細書に記載の単離ヌクレアーゼを含むキットを提供する。一部の実施形態では、キットは、単離ヌクレアーゼの標的部位を含む核酸をさらに含む。一部の実施形態では、キットは、賦形剤ならびにヌクレアーゼと賦形剤を接触させてヌクレアーゼと核酸を接触させるのに適した組成物を生成させるためのインストラクションを含む。一部の実施形態では、核酸はゲノムまたはゲノムの一部である。一部の実施形態では、ゲノムは細胞内にある。一部の実施形態では、ゲノムは被験体内にあり、賦形剤は薬学的に許容される賦形剤である。
本発明の一部の態様は、本明細書に記載のヌクレアーゼまたはヌクレアーゼをコードする核酸を含む医薬組成物を提供する。一部の実施形態では、被験体に投与するための医薬組成物を提供する。一部の実施形態では、組成物は、本明細書に記載の単離ヌクレアーゼまたはそのようなヌクレアーゼをコードする核酸および薬学的に許容される賦形剤を含む。
本発明の他の利点、特徴、および用途は、特定の非限定的実施形態の詳細な説明；図面（これらは、概略図であり、計測のための描写を意図するものではない）；および特許請求の範囲から明らかになるであろう。
ＺＦＮ媒介の切断に対するインビトロ選択を示す図である。プレ選択ライブラリーメンバーは、５’リン酸を欠く同一のＺＦＮ標的部位のコンカテマー（矢印により表わす）である。Ｌ＝左ハーフサイト；Ｒ＝右ハーフサイト、Ｓ＝スペーサー；Ｌ’、Ｓ’、Ｒ’＝Ｌ、Ｓ、Ｒに対して相補的な配列。ＺＦＮ切断により５’リン酸が現れるが、これはシークエンシングアダプターの連結に必要である。アダプターに相補的なプライマーを使用して、ＰＣＲにより増幅することができる唯一の配列は、２回切断されて両末端にアダプターを有する配列である。隣接した部位で切断されたＤＮＡをゲル電気泳動法により精製し、配列決定する。シークエンシング後のコンピュータスクリーニングステップにより、充填されたスペーサー配列（ＳおよびＳ’）が相補的であり、したがって同じ分子由来であることが確認される。 ＣＣＲ５−２２４およびＶＦ２４６８のＺＦＮについてのＤＮＡ切断配列特異性プロファイルを示す図である。ヒートマップは、（ａ）２ｎＭのＣＣＲ５−２２４または（ｂ）１ｎＭのＶＦ２４６８による１４ｎＭのＤＮＡライブラリーの切断に対する選択で同定されたすべての配列から編集された特異性スコアである。標的ＤＮＡ配列を各ハーフサイトの下に示す。黒枠は標的塩基対を示す。特異性スコアは、プレ選択プールに比較した、ポスト選択ＤＮＡプールでの各位置における各塩基対の頻度変化を、各位置における各塩基対のプレ選択ライブラリーからポスト選択ライブラリーにかけての可能な最大頻度変化によって割ることにより算出した。青色ボックスは、所与の位置でのある塩基対の濃縮を示し、白色ボックスは濃縮がないことを示し、赤色ボックスは、所与の位置でのある塩基対の反濃縮を示す。凡例で示す最も濃い青色は、所与の塩基対に対する絶対的な選択性（特異性スコア＝１．０）に対応し、最も濃い赤色は、所与の塩基対に対する絶対的な反選択性（特異性スコア＝−１．０）に対応する。 ＺＦＮ標的部位認識の補償モデルについての証拠を示す図である。ヒートマップは、（ａ）２ｎＭのＣＣＲ５−２２４または（ｂ）１ｎＭのＶＦ２４６８による選択において、黒枠位置での突然変異で特異性スコアが変化することを示す。各行は、異なる突然変異位置に対応する（図１２にグラフ的に説明する）。サイトはそれらのゲノム配向で記載する；したがって、ＣＣＲ５−２２４の（＋）ハーフサイトおよびＶＦ２４６８の（＋）ハーフサイトは、図２で見出された配列の逆相補鎖として記載する。青色の陰影は、黒枠の位置が突然変異したときの特異性スコアの増大（より多くのストリンジェンシー）を示し、赤色の陰影は、特異性スコアの低下（より少ないストリンジェンシー）を示す。 ＺＦＮが、３つ以下の突然変異を含む標的部位の大きな割合をｉｎ ｖｉｔｒｏで切断することができることを示す図である。（ａ）ＣＣＲ５−２２４ ＺＦＮおよび（ｂ）ＶＦ２４６８ ＺＦＮによるｉｎ ｖｉｔｒｏ切断に対して濃縮される（濃縮係数＞１）１つ、２つ、または３つの突然変異を含む配列の百分率を示す。濃縮係数は、選択で同定された各配列について、ポスト選択の配列決定ライブラリーにおけるその配列の観察頻度を、プレ選択ライブラリーにおけるその配列の頻度によって割ることにより算出する。 標的部位ライブラリーのｉｎ ｖｉｔｒｏ合成について示す図である。ライブラリーメンバーは、部分的に無作為化された左ハーフサイト（Ｌ）、完全に無作為化された４〜７ヌクレオチドのスペーサー配列（Ｓ）、および部分的に無作為化された右ハーフサイト（Ｒ）からなる。ＤＮＡプライマー上で存在するライブラリーメンバーを、約５４５塩基対の線状二本鎖ＤＮＡの中にＰＣＲにより組み込んだ。ＰＣＲの間、ライブラリーメンバー（Ｌ Ｓ Ｒ）を有するプライマーは、異なるライブラリーメンバー（Ｌ＊Ｓ＊Ｒ＊）を有するＤＮＡ鎖にアニーリングする可能性があり、一方の末端に２つの異なるライブラリーを有する二本鎖ＤＮＡが生じる。Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼおよび５’−３’ポリメラーゼ活性により、ミスマッチしたライブラリーメンバーが除去され、マッチした相補的なライブラリーメンバー（Ｌ’Ｓ’Ｒ’）がそれらに置き換わった。Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼによる５’リン酸化の後、ライブラリーＤＮＡを、平滑末端連結反応に供し、線状および環状の単量体および多量体種の混合物を得た。環状モノマーは、ゲル電気泳動法により精製し、Φ２９ ＤＮＡポリメラーゼによるローリングサークル増幅を介して連結した。 ＺＦＮの発現および定量を示す図である。ＣＣＲ５−２２４およびＶＦ２４６８についてのウエスタンブロットを、（ａ）ｉｎ ｖｉｔｒｏ選択に使用するＺＦＮ試料に関して、（ｂ）定量に関して示す。（ｃ）既知量のＮ末端ＦＬＡＧタグ付き細菌アルカリホスファターゼ（ＦＬＡＧ−ＢＡＰ）を使用して、ＺＦＮ定量のための標準曲線を作成した。菱形は、（ｂ）に示すウエスタンブロットからのＦＬＡＧ−ＢＡＰ標準の強度を示し、プラス記号は、ＺＦＮのバンド強度を示し、直線は、ＺＦＮを定量するために使用した、ＦＬＡＧ−ＢＡＰ標準の最良適合曲線を示す。（ｄ）１つの標的切断部位を含有する８ｎＭの線状基質に対するＣＣＲ５−２２４およびＶＦ２４６８の活性アッセイのゲルを示す。それぞれのＺＦＮを、それぞれの基質と共に３７℃で４時間インキュベートした。「＋溶解物」レーン中のＤＮＡは、２．５ｎＭのＺＦＮ反応で使用した量と等量のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／翻訳混合物と共にインキュベートした。ＺＦＮ媒介の切断は、長さが約７００ｂｐおよび３００ｂｐの２つの線状断片をもたらす。２ｎＭのＣＣＲ５−２２４および１ｎＭのＶＦ２４６８が、線状基質の５０％を切断するのに必要な量であった。 ＺＦＮによる、ライブラリーの切断を示す図である。種々の量のＣＣＲ５−２２４またはＶＦ２４６８による、それぞれＣＣＲ５−２２４（ａ）またはＶＦ２４６８（ｂ）の標的部位のコンカテマーライブラリー１μｇの切断を示す。「＋溶解物」と標示したレーンは、４ｎＭのＣＣＲ５−２２４または４ｎＭのＶＦ２４６８を含有する試料に含有された量のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／翻訳混合物と共にインキュベートしたプレ選択コンカテマーライブラリーを指す。「＋溶解物」レーンで観察されるであろう非切断ＤＮＡは、長さが１２ｋｂ超であり、その大きさのために精製すると失われ、したがって、ゲル上には存在しない。「＋ＰｖｕＩ」と標示したレーンは、ライブラリーメンバーに隣接して導入されたＰｖｕＩ部位でのプレ選択ライブラリーの消化物である。ゲル上のラダーは、２つ以上の部位でのプレ選択ＤＮＡコンカテマーの切断に起因する。最下部バンドの量が用量依存的に増加しており、同じプレ選択ＤＮＡ分子中の２つの隣接したライブラリー部位での切断に対応する。ＤＮＡのこの最下部バンドをＰＣＲおよびゲル精製により濃縮した後、シークエンシングを行った。 ＺＦＮオフターゲット切断が酵素濃度に依存することを示す図である。（ａ）ＣＣＲ５−２２４および（ｂ）ＶＦ２４６８の両方について、ｉｎ ｖｉｔｒｏ選択により示された切断可能部位の分布は、ＺＦＮ濃度の増加につれて標的部位に対する類似性が低い部位を含むようにシフトする。ＣＣＲ５−２２４およびＶＦ２４６８の選択は両方とも、プレ選択ライブラリーよりも、少数の突然変異を有する部位を濃縮する。選択ストリンジェンシーのすべての組合せについて、プレ選択ライブラリーおよびポスト選択ライブラリー手段の間で比較すると、Ｐ値が１．７×１０−１４である０．５ｎＭと１ｎＭのＶＦ２４６８選択間の比較を例外として、Ｐ値は０である。 個々の配列の切断効率は選択ストリンジェンシーに関連する。ｉｎ ｖｉｔｒｏのＤＮＡ消化を、種々のストリンジェンシーの選択で同定された配列（「×」の印をつけた）について実施した。２ｎＭのＣＣＲ５−２２４（ａ）または１ｎＭのＶＦ２４６８（ｂ）を、図示した配列を含有する８ｎＭの線状基質と共にインキュベートした。１ｋｂの線状基質は、ＣＣＲ５−２２４（「ＣＴＧＡＴ」）またはＶＦ２４６８（「ＴＣＧＡＡ」）のゲノム標的中に見出されたスペーサー配列と、表示する（＋）および（−）のハーフサイトとを含む単一切断部位を含有した。突然変異塩基対を小文字で示す。最高のストリンジェンシー選択（０．５ｎＭのＺＦＮ）で同定されたＣＣＲ５−２２４部位およびＶＦ２４６８部位は、最も効率的に切断されるが、最低のストリンジェンシー選択（４ｎＭのＺＦＮ）でのみ同定された部位は、切断効率が最も低い。 ＣＣＲ５−２２４およびＶＦ２４６８のＺＦＮについての濃度依存的配列プロファイルを示す図である。ヒートマップは、種々の量の（ａ）ＣＣＲ５−２２４または（ｂ）ＶＦ２４６８による１４ｎＭの全ＤＮＡライブラリーの切断についての特異性スコアを示す。標的ＤＮＡ配列を各ハーフサイトの下に示す。黒枠は標的塩基対を示す。特異性スコアは、プレ選択プールに比較した、ポスト選択ＤＮＡプールでの各位置における各塩基対の頻度変化を、各位置における各塩基対の可能な最大頻度変化によって割ることにより算出した。青色ボックスは、所与の位置においてある塩基対に対して特異性があることを示し、白色ボックスは特異性がないことを示し、赤色ボックスは、所与の位置においてある塩基対に対して反特異性があることを示す。凡例で示す最も濃い青色は、所与の塩基対に対する絶対的な選択性（特異性スコア＝１．０）に対応し、最も濃い赤色は、所与の塩基対に対する絶対的な反選択性（特異性スコア＝−１．０）に対応する。 ＣＣＲ５−２２４が（−）ハーフサイト中の高度に特異的な塩基対に突然変異を有する部位を切断する場合、（＋）ハーフサイトのストリンジェンシーは増大することを示す図である。ヒートマップは、２ｎＭのＣＣＲ５−２２４によるｉｎ ｖｉｔｒｏ選択で同定された配列の特異性スコアを示す。黒色ボックスで示す（−）Ａ３および（−）Ｇ６の場合、特異性スコアを算出する前に、プレ選択ライブラリー配列およびポスト選択配列の両方をフィルターにかけて、それぞれ、（−）ハーフサイトの位置３にＡを含有する、または（−）ハーフサイトの位置６にＧを含有するいかなる配列も除外した。いずれかの（−）ハーフサイト突然変異を有する部位について、（＋）ハーフサイトの特異性は増大する。黒枠は標的塩基対を示す。特異性スコアは、プレ選択プールに比較した、ポスト選択ＤＮＡプールでの各位置における各塩基対の頻度変化を、各位置における各塩基対の可能な最大頻度変化によって割ることにより算出した。青色ボックスは、所与の位置においてある塩基対に対して特異性があることを示し、白色ボックスは特異性がないことを示し、赤色ボックスは、所与の位置においてある塩基対に対して反特異性があることを示す。凡例で示す最も濃い青色は、所与の塩基対に対する絶対的な選択性（特異性スコア＝１．０）に対応し、最も濃い赤色は、所与の塩基対に対する絶対的な反選択性（特異性スコア＝−１．０）に対応する。 突然変異補償差マップを作成するために使用するデータ処理ステップを示す図である。図３の差マップの各列を作成するステップを、位置（−）Ａ３の突然変異の例について示す。（ａ）図１１に記載のタイプのヒートマップを、目的の標的部位ヌクレオチドの特異性スコアのみを示すために、１列に圧縮する。（図１１の黒く縁取りされたボックス）（ｂ）次いで、この圧縮ヒートマップを、図２からのフィルターにかけられていないベースラインプロファイルに対応する圧縮ヒートマップと比較して、特異性スコアプロファイル上の黒枠の白色ボックスにより指定される位置での突然変異の相対的効果を示す圧縮差ヒートマップを作成する。青色ボックスは、白色ボックスにより指示される位置に突然変異を含有する切断部位の位置での配列ストリンジェンシーの増大を示し、赤色ボックスは、配列ストリンジェンシーの低下を示し、白色ボックスは、配列ストリンジェンシーの変化がないことを示す。（＋）ハーフサイト差マップは、ＺＦＮのジンクフィンガードメインが認識するようにではなく、ゲノム中に見出されるように、（＋）ハーフサイトの配向を一致させるために逆にする。 両方のハーフサイトの１番目の塩基対が突然変異した部位をＶＦ２４６８が切断する場合、両方のハーフサイトのストリンジェンシーが増大することを示す図である。ヒートマップは、４ｎＭのＶＦ２４６８によるｉｎ ｖｉｔｒｏ選択で同定された配列の特異性スコアを示す。黒色ボックスで示した（＋）Ｇ１、（−）Ｇ１、および（＋）Ｇ１／（−）Ｇ１の場合、特異性スコアを算出する前に、プレ選択ライブラリー配列およびポスト選択配列の両方をフィルターにかけて、（＋）ハーフサイトの位置１にＧを含有し、かつ／または（−）ハーフサイトの位置１にＧを含有するいかなる配列も除外した。いずれかの突然変異を含む部位の場合、反対側のハーフサイトにおける突然変異許容性が低下し、同じハーフサイトにおける突然変異許容性が極めてわずか低下した。両方の突然変異を含む部位は、両方のハーフサイトでストリンジェンシーの顕著な増大を示す。黒枠はオンターゲット塩基対を示す。特異性スコアは、プレ選択プールに比較した、ポスト選択ＤＮＡプールでの各位置における各塩基対の頻度変化を、各位置における各塩基対の可能な最大頻度変化によって割ることにより算出した。青色ボックスは、所与の位置においてある塩基対に対して特異性があることを示し、白色ボックスは特異性がないことを示し、赤色ボックスは、所与の位置においてある塩基対に対して反特異性があることを示す。凡例で示す最も濃い青色は、所与の塩基対に対する絶対的な選択性（特異性スコア＝１．０）に対応し、最も濃い赤色は、所与の塩基対に対する絶対的な反選択性（特異性スコア＝−１．０）に対応する。 ＺＦＮ切断がＤＮＡ標的部位中の特定の位置で起こることを示す図である。このプロットは、（ａ）４ｎＭのＣＣＲ５−２２４または（ｂ）４ｎＭのＶＦ２４６８による、ｉｎ ｖｉｔｒｏ選択で同定された切断部位の位置を示す。切断部位の位置は、４塩基のオーバーハングを有する５塩基対スペーサーの場合を除いて、両方のＺＦＮについて同様のパターンを示す。表題は、プロットするスペーサーの長さ／オーバーハングの長さの組合せを表す（例えば、６塩基対スペーサーおよび４塩基オーバーハングを含む部位は、「６／４」と称する）。黒色バーは、スペーサーの長さとオーバーハングの長さとの各組合せについて、切断された配列の相対数を示す。「Ｐ」は、（＋）標的ハーフサイト中のヌクレオチドを表し、「Ｍ」は、（−）標的ハーフサイト中のヌクレオチドを表し、「Ｎ」は、スペーサー中のヌクレオチドを表す。４ｎＭのＶＦ２４６８選択からは、「７／７」配列はなかった。少なくとも４塩基のオーバーハングを含む配列のみを示した。 ＣＣＲ５−２２４は、５塩基対および６塩基対のスペーサーを優先的に切断し、５塩基対のスペーサーを切断して５ヌクレオチドのオーバーハングを残すことを示す図である。ヒートマップは、図示するスペーサーおよびオーバーハングの長さを有する、ＣＣＲ５−２２４の４つのｉｎ ｖｉｔｒｏ選択（ａ〜ｄ）のそれぞれにおいて残存するすべての配列の百分率を示す。 ＶＦ２４６８は、５塩基対および６塩基対のスペーサーを優先的に切断し、５塩基対のスペーサーを切断して５ヌクレオチドのオーバーハングを残し、６塩基対のスペーサーを切断して４ヌクレオチドのオーバーハングを残すことを示す図である。ヒートマップは、図示するスペ−サーおよびオーバーハングの長さを有する、ＶＦ２４６８の４つのｉｎ ｖｉｔｒｏ選択（ａ〜ｄ）のそれぞれにおいて残存するすべての配列の百分率を示す。 ＺＦＮが、スペーサーの長さに依存した配列選択性を示すことを示す図である。ＣＣＲ５−２２４（ａ〜ｃ）およびＶＦ２４６８（ｄ〜ｆ）は両方とも、５塩基対および６塩基対のスペーサーを挟むハーフサイトに対してよりも、４塩基対および７塩基対のスペーサーを挟むハーフサイトに対して特異性が高いことを示す。両方のＺＦＮについて、一方のハーフサイトは、他方よりも突然変異許容性が大きく変化し、突然変異許容性の変化は濃度依存的である。 オフターゲット配列のＺＦＮ許容性についてのモデルを示す図である。本発明者らの結果は、一部のＺＦＮが、所与の一連の条件（点線）下の切断に対して必要とされる結合エネルギーよりも多くの結合エネルギーで目的の標的部位（上段、×のない黒色ＤＮＡ）を認識することを示唆する。１つまたは２つの突然変異（１つまたは２つの×）を含む配列は、切断に必要な閾値よりも下にＺＦＮ：ＤＮＡ結合エネルギーを低下させないため、概ね許容される。さらなる突然変異を含む配列の一部は、さらなる突然変異がすでに破壊されたジンクフィンガー結合接触面の領域に生じる場合（点線の上にある３つの×）、ＺＦＮ：ＤＮＡ結合接触面の他の場所に存在する最適相互作用が閾値を超える結合エネルギーを維持する限り、依然として切断され得る。しかしながら、ＺＦＮ：ＤＮＡ接触面の他の場所にある重要な相互作用を破壊するさらなる突然変異では、結合エネルギーが切断閾値に達しない結果になる。 ＴＡＬヌクレアーゼの特異性のプロファイリングを示す図である。選択１：ＴＡＬのＤＮＡ結合ドメインとＦｏｋ１の切断ドメインとの間の＋２８アミノ酸リンカー対＋６３アミノ酸リンカー。 ＴＡＬのＤＮＡ結合ドメインおよびＲＶＤの構造を示す図である。 ＴＡＬＮ選択からの標的部位の突然変異を示す図である。＋２８リンカーは突然変異がより少ない切断配列を濃縮し、＋２８リンカーがより特異的であることが示唆される。プレ選択ライブラリー配列に比較して、ポスト選択配列は突然変異が顕著に少なく、選択が成功したことが示される。 以前のＴＡＬＮ選択の左ハーフサイトと右ハーフサイトとの間の全標的部位での突然変異の濃縮を示す図である。ハーフサイトの突然変異の数と濃縮との間の比較的規則的な（対数的な関係）傾向は、塩基対を結合する１つの反復結合が他の反復結合に左右されないことと一致している。 ＤＮＡスペーサーの長さに対するＴＡＬＮ切断の依存性を示す図である。本発明者らのｉｎ ｖｉｔｒｏ選択における切断部位スペーサーの長さについての選択性は、以前の研究と比較して同様である。ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＴＡＬＮ切断。リンカーの長さおよびスペーサーの長さに対する依存性。Ｍｕｓｓｏｌｉｎｏ（２０１１）による。 個々の塩基での特異性スコアを示す図である。 個々の塩基での特異性スコアを示す図である。個々それぞれの位置で特異性は様々であり、再度、＋２８リンカーが顕著により優れた特異性を示す。 ＴＡＬＮ分析の特異性における差が補償されることを示す図である。 Ｌ１６ Ｒ１６ ＴＡＬＮの特異性の差が補償されることを示す図である。切断部位における１つの突然変異は、他の突然変異の分布を変化させることはなく、ＴＡＬ反復ドメインが独立して結合することが示唆される。 ＴＡＬＮの特異性のプロファイリングを示す図である。選択ＩＩ：種々のＴＡＬＮの長さ。 共通標的部位における突然変異の濃縮を示す図である。 プレ選択ライブラリーに対する、ＴＡＬＮ消化の全標的部位における突然変異の分布を示す図である。 プレ選択ライブラリーに対する、ＴＡＬＮ消化の全標的部位における突然変異の分布を示す図である。 ＴＡＬＮ対の右ハーフサイトと左ハーフサイトとの間の全標的部位における突然変異の濃縮を示す図である。 ＴＡＬＮ対の右ハーフサイトと左ハーフサイトとの間の全標的部位における突然変異の濃縮を示す図である。 Ｌ１０ Ｒ１０ ＴＡＬＮ対について、プレ選択ライブラリーに対する、ＴＡＬＮ消化の全標的部位における突然変異の濃縮を示す図である。 ＤＮＡスペーサーのプロファイルを示す図である。大多数の配列にはスペーサー選択性があるが、スペーサーの長さを変化させる代替のフレームから予想されるように、高度に突然変異した配列には顕著なスペーサー選択性がない。 切断点プロファイルを示す図である。大多数の配列が、予想されるようにスペーサー内で切断される一方、Ｒ１６ Ｌ１６の高度に突然変異した配列は、スペーサー内で優位に切断されることはないが、Ｌ１０ Ｒ１０の高度に突然変異した配列は、スペーサー内で切断され、これはフレームシフトした結合部位が生産的なスペーサー切断をもたらすことをおそらく示している。 Ｌ１０ Ｒ１０ ＴＡＬＮ対における高度に突然変異したハーフサイトを示す図である。目的のフレームの外側にあるフレームにおける多くの潜在的な結合部位には、目的の標的に類似性が高い部位がある。 フレームシフトした結合部位について編集された、ＴＡＬＮ対の左ハーフサイトと右ハーフサイトとの間の全標的部位における突然変異の濃縮を示す図である。 Ｌ１６ Ｒ１６ ＴＡＬＮ対における高度に突然変異したハーフサイトを示す図である。 Ｌ１６ Ｒ１６ ＴＡＬＮ対における高度に突然変異したハーフサイトを示す図である。Ｌ１６ Ｒ１６からの高度に突然変異した配列は、フレームシフト（左図）によって説明することができず、ＤＮＡスペーサー選択性がなく（スライド１１を参照のこと）、またＤＮＡスペーサーの外側で切断されることが多いように見える（右図）。これは、おそらく、ＴＡＬドメイン結合標的部位ＤＮＡとは無関係なホモ二量体切断（ヘテロ二量体と一緒のことも）またはヘテロ二量体切断（すなわち、Ｆｏｋ１切断ドメインを介する二量体形成）を示す。 ＴＡＬＮ対の特異性スコアのヒートマップを示す図である。 Ｌ１６ Ｒ１６ ＴＡＬＮの特異性における差の補償を示す図である。切断部位の１つの突然変異が他の突然変異の分布を変化させることはなく、ＴＡＬ反復ドメインが独立して結合することが示唆される。 ＴＡＬＮ対の完全な全標的部位における突然変異の濃縮を示す図である。濃縮は、突然変異が少ない範囲では同様の対数的勾配を示すように見え、ＴＡＬＮが認識する１６ｂｐを含有する選択は例外的であるように見えるが、これは、Ｒ１６結合が一部の極めて少数の突然変異部位を飽和している可能性を示す（ａｋａ Ｒ１６＆Ｌ１６は、野生型部位に対するＫｄに近いかそれより上であった）。 ヒトゲノムにおけるＴＡＬＮオフターゲット部位を示す図である。 ＴＡＬＮオフターゲット部位予測切断を示す図である。 検出限界を下回る、実際に突然変異した標的部位に関して、ＴＡＬＮオフターゲット部位予測切断を示す図である。 検出限界を下回る、実際に突然変異した標的部位に関して、ＴＡＬＮオフターゲット部位予測切断を示す図である。 配列に関して、ＴＡＬＮオフターゲット部位予測切断（突然変異の数だけでなく）を示す図である。全ターゲット部位突然変異の増加に伴う、切断効率（濃縮）の規則的な対数的低下と、各位置における濃縮とを組み合わせれば、任意の配列のオフサイト切断部位を予測することができるであろう。 ＴＡＬＮとＺＦＮとの比較を示す図である。大体において、ＴＡＬＮ選択では、濃縮は両方のハーフサイトにおける突然変異の合計に依存し、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）の場合のようにハーフサイト間の突然変異の分布に依存することはない。この観察を、ＺＦＮの文脈に依存した結合と組み合わせると、ＺＦＮの特異性は、そのＴＡＬ等価物よりもはるかに低下したものになる。
定義
本明細書および特許請求の範囲において使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、他に明示されない限り、単数および複数への言及を含む。したがって、例えば、「薬剤（ａｎ ａｇｅｎｔ）」への言及は、１つの薬剤および複数のそのような薬剤を含む。
用語「コンカテマー」は、核酸分子の文脈において本明細書で使用する場合、連続して連結した、同じＤＮＡ配列の複数コピーを含有する核酸分子を指す。例えば、特定のヌクレオチド配列を１０コピー含むコンカテマー（例えば、［ＸＹＺ］１０）は、連続して互いに連結した同じ特定配列を１０コピー、例えば、５’−ＸＹＺＸＹＺＸＹＺＸＹＺＸＹＺＸＹＺＸＹＺＸＹＺＸＹＺＸＹＺ−３’として含むことになる。コンカテマーは、反復単位または反復配列の任意の数のコピー、例えば、少なくとも２コピー、少なくとも３コピー、少なくとも４コピー、少なくとも５コピー、少なくとも１０コピー、少なくとも１００コピー、少なくとも１０００コピー等を含むことができる。ヌクレアーゼ標的部位と一定の挿入配列とを含む核酸配列のコンカテマーの一例は、［（標的部位）−（一定の挿入配列）］３００である。コンカテマーは、線状の核酸分子であっても環状であってもよい。
用語「コンジュゲートしている」、「コンジュゲートされた」、および「コンジュゲーション」は、２つの実体、例えば、２つのタンパク質、２つのドメイン（例えば、結合ドメインと切断ドメイン）、またはタンパク質と薬剤（例えばタンパク質ドメインと小分子）などの２つの分子の結合を指す。この結合は、例えば、直接的または間接的な（例えば、リンカーを介する）共有結合であることも、非共有結合的相互作用であることもある。一部の実施形態では、この結合は共有結合である。一部の実施形態では、２つの分子が両方の分子を連結するリンカーを介してコンジュゲートする。例えば、２つのタンパク質、例えば、操作されたヌクレアーゼの結合ドメインと切断ドメインとを、互いにコンジュゲートして、タンパク質融合体を形成させる一部の実施形態では、２つのタンパク質は、ポリペプチドリンカー、例えば、一方のタンパク質のＣ末端を他方のタンパク質のＮ末端に結合するアミノ酸配列、を介してコンジュゲートさせることができる。
核酸配列の文脈において本明細書で使用する場合、用語「コンセンサス配列」は、複数の類似配列の各位置で最も頻度高く見出されるヌクレオチド残基を表す計算上の配列を指す。典型的には、コンセンサス配列は、類似配列を互いに比較し、類似配列モチーフを評価する配列アラインメントにより決定される。ヌクレアーゼ標的部位配列の文脈では、ヌクレアーゼ標的部位のコンセンサス配列は、一部の実施形態では、所与のヌクレアーゼにより、最も頻度高く結合される配列であっても、最も高い親和性で結合される配列であってもよい。
用語「有効量」は、本明細書で使用する場合、所望の生物反応を誘発するのに十分な生理活性物質の量を指す。例えば、一部の実施形態では、ヌクレアーゼの有効量は、ヌクレアーゼが特異的に結合して切断する標的部位の切断を誘導するのに十分なヌクレアーゼの量を指すことができる。当業者が認識するように、薬剤、例えばヌクレアーゼ、ハイブリッドタンパク質、またはポリヌクレオチドの有効量は、例えば、所望の生物反応、特定の対立遺伝子、ゲノム、標的部位、細胞、または標的組織、および使用する薬剤のような種々の因子に依存して異なり得る。
用語「エンジイン」は、本明細書で使用する場合、二重結合により分離された２つの三重結合を含有する９員環および１０員環のいずれかを特徴とする細菌性天然物のクラスを指す（例えば、Ｋ．Ｃ．Ｎｉｃｏｌａｏｕ；Ａ．Ｌ．Ｓｍｉｔｈ；Ｅ．Ｗ．Ｙｕｅ（１９９３）．“Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｎａｔｕｒａｌ ａｎｄ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｅｎｅｄｉｙｎｅｓ”．ＰＮＡＳ ９０（１３）：５８８１−５８８８を参照のこと；この内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる）。一部のエンジインは、Ｂｅｒｇｍａｎ環化を受けることができ、その結果生じるジラジカルである１，４−デヒドロベンゼン誘導体は、ＤＮＡの糖骨格から水素原子を引き抜き、ＤＮＡ鎖切断をもたらすことができる（例えば、Ｓ．Ｗａｌｋｅｒ；Ｒ．Ｌａｎｄｏｖｉｔｚ；Ｗ．Ｄ．Ｄｉｎｇ；Ｇ．Ａ．Ｅｌｌｅｓｔａｄ；Ｄ．Ｋａｈｎｅ（１９９２）．“Ｃｌｅａｖａｇｅ ｂｅｈａｖｉｏｒ ｏｆ ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ ｇａｍｍａ １ ａｎｄ ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ Ｔ”．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．８９（１０）：４６０８−１２を参照のこと；この内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる）。ＤＮＡとのエンジインの反応性は、多くのエンジインに抗生物質的特性を付与し、一部のエンジインは、抗癌抗生物質として臨床試験されている。エンジインの非限定例として、ジネミシン、ネオカルチノスタチン、カリチアマイシン、エスペラマイシンがある（例えば、Ａｄｒｉａｎ Ｌ．Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｋ．Ｃ．Ｂｉｃｏｌａｏｕ，“Ｔｈｅ Ｅｎｅｄｉｙｎｅ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ”Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，１９９６，３９（１１），ｐｐ２１０３−２１１７；およびＤｏｎａｌｄ Ｂｏｒｄｅｒｓ，“Ｅｎｅｄｉｙｎｅ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ａｓ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ａｇｅｎｔｓ，”Ｉｎｆｏｒｍａ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；１ｓｔ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２３，１９９４，ＩＳＢＮ−１０：０８２４７８９３８５を参照のこと；これらの内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる）。
用語「ホーミングエンドヌクレアーゼ」は、本明細書で使用する場合、イントロンまたはインテインにより通常コードされる一種の制限酵素を指す、Ｅｄｇｅｌｌ ＤＲ（Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２００９）．“Ｓｅｌｆｉｓｈ ＤＮＡ：ｈｏｍｉｎｇ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｆｉｎｄ ａ ｈｏｍｅ”．Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ １９（３）：Ｒ１１５−Ｒ１１７；Ｊａｓｉｎ Ｍ（Ｊｕｎ １９９６）．“Ｇｅｎｅｔｉｃ ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｏｍｏｎｔｈ ｗｉｔｈ ｒａｒｅ−ｃｕｔｔｉｎｇ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ”．Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ １２（６）：２２４−８；Ｂｕｒｔ Ａ，Ｋｏｕｆｏｐａｎｏｕ Ｖ（Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２００４）．“Ｈｏｍｉｎｇ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｇｅｎｅｓ：ｔｈｅ ｒｉｓｅ ａｎｄ ｆａｌｌ ａｎｄ ｒｉｓｅ ａｇａｉｎ ｏｆ ａ ｓｅｌｆｉｓｈ ｅｌｅｍｅｎｔ”．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｇｅｎｅｔ Ｄｅｖ １４（６）：６０９−１５；これらの内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。ホーミングエンドヌクレアーゼの認識配列は、極めて低い確率でのみ無作為に生じるほど十分に長く（７×１０１０ｂｐごとに約１つ）、通常、１ゲノム当たりわずか１つの実例が見つかるだけである。
用語「ライブラリー」は、核酸またはタンパク質の文脈において本明細書で使用する場合、それぞれ、２つ以上の異なる核酸またはタンパク質の集団を指す。例えば、ヌクレアーゼ標的部位のライブラリーは、異なるヌクレアーゼ標的部位を含む少なくとも２つの核酸分子を含む。一部の実施形態では、ライブラリーは、少なくとも１０１、少なくとも１０２、少なくとも１０３、少なくとも１０４、少なくとも１０５、少なくとも１０６、少なくとも１０７、少なくとも１０８、少なくとも１０９、少なくとも１０１０、少なくとも１０１１、少なくとも１０１２、少なくとも１０１３、少なくとも１０１４、または少なくとも１０１５の異なる核酸またはタンパク質を含む。一部の実施形態では、ライブラリーのメンバーは、無作為化された配列、例えば、完全にまたは部分的に無作為化された配列を含んでもよい。一部の実施形態では、ライブラリーは、互いに無関係な核酸分子、例えば、完全に無作為化された配列を含む核酸を含む。他の実施形態では、ライブラリーの少なくとも一部のメンバーは、関連していることがあり、例えば、それらは、コンセンサス標的部位配列などの特定の配列の変異体または派生体であることがある。
用語「リンカー」は、本明細書で使用する場合、２つの隣接した分子または部分、例えば、ヌクレアーゼの結合ドメインと切断ドメイン、を連結する化学基または分子を指す。典型的には、リンカーは、２つの基、分子、もしくは他の部分の間に位置するかまたはそれらに挟まれており、共有結合を介して互いに連結して、その２つを連結する。一部の実施形態では、リンカーは、アミノ酸または複数のアミノ酸（例えば、ペプチドまたはタンパク質）である。一部の実施形態では、リンカーは、有機分子、基、ポリマー、または化学的部分である。
用語「ヌクレアーゼ」は、本明細書で使用する場合、核酸分子中のヌクレオチド残基を連結するリン酸ジエステル結合を切断することができる薬剤、例えばタンパク質または小分子を指す。一部の実施形態では、ヌクレアーゼは、タンパク質、例えば、核酸分子に結合し、核酸分子内のヌクレオチド残基を連結するリン酸ジエステル結合を切断することができる酵素である。ヌクレアーゼは、ポリヌクレオチド鎖内のリン酸ジエステル結合を切断するエンドヌクレアーゼであっても、ポリヌクレオチド鎖の末端にあるリン酸ジエステル結合を切断するエキソヌクレアーゼであってもよい。一部の実施形態では、ヌクレアーゼは、特定のヌクレオチド配列内の特定のリン酸ジエステル結合に結合し、かつ／またはそれを切断する部位特異的ヌクレアーゼであり、この特定のヌクレオチド配列は、本明細書では「認識配列」、「ヌクレアーゼ標的部位」、または「標的部位」とも呼ばれる。一部の実施形態では、ヌクレアーゼは、一本鎖の標的部位を認識するが、他の実施形態では、ヌクレアーゼは、二本鎖の標的部位、例えば、二本鎖のＤＮＡ標的部位を認識する。多くの天然のヌクレアーゼ、例えば、多くの天然のＤＮＡ制限ヌクレアーゼの標的部位は、当業者には周知である。多くの場合、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、またはＢａｍＨＩなどのＤＮＡヌクレアーゼは、長さが４〜１０塩基対のパリンドロームの二本鎖ＤＮＡ標的部位を認識し、標的部位内の特定の位置で２つのＤＮＡ鎖のそれぞれを切断する。一部のエンドヌクレアーゼは、二本鎖の核酸標的部位を対称的に切断する、すなわち、同じ位置で両方の鎖を切断し、その結果、その末端は塩基対を形成したヌクレオチドを含む。これは、本明細書で平滑末端とも呼ばれる。他のエンドヌクレアーゼは、二本鎖の核酸標的部位を非対称的に切断する、すなわち、異なる位置でそれぞれの鎖を切断し、その結果その末端は対を形成していないヌクレオチドを含む。二本鎖ＤＮＡ分子の末端にある、対を形成していないヌクレオチドは、「オーバーハング」とも呼ばれ、例えば、１つまたは複数の対を形成していないヌクレオチドがそれぞれのＤＮＡ鎖の５’末端か５’末端のいずれを形成するかに応じて、「５’−オーバーハング」または「３’−オーバーハング」と呼ばれる。１つまたは複数の対を形成していないヌクレオチドで終わる二本鎖ＤＮＡ分子の末端は、対を形成していない、１つまたは複数の相補的なヌクレオチドを含む他の二本鎖ＤＮＡ分子の末端「に粘着する」ことができるため、粘着末端とも呼ばれる。ヌクレアーゼタンパク質は、典型的には、このタンパク質と核酸基質との相互作用を媒介し、一部の場合には、さらに標的部位に特異的に結合する「結合ドメイン」と、核酸骨格内のリン酸ジエステル結合の切断を触媒する「切断ドメイン」とを含む。一部の実施形態では、ヌクレアーゼタンパク質は、単量体の形態で核酸分子に結合し切断することができるが、他の実施形態では、ヌクレアーゼタンパク質は、標的核酸分子を切断するために、二量体または多量体を形成しなければならない。天然ヌクレアーゼの結合ドメインおよび切断ドメイン、ならびに融合して特定の標的部位に結合するヌクレアーゼを形成することができるモジュール性の結合ドメインおよび切断ドメインが当業者に周知である。例えば、ジンクフィンガーまたは転写活性化因子様エレメントを、所望の標的部位に特異的に結合する結合ドメインとして使用し、切断ドメイン、例えばＦｏｋＩの切断ドメインに融合またはコンジュゲートして、標的部位を切断する操作されたヌクレアーゼを形成させることができる。
用語「核酸」および「核酸分子」は、本明細書で使用する場合、核酸塩基および酸性部分を含む化合物、例えば、ヌクレオシド、ヌクレオチド、またはヌクレオチドポリマーを指す。典型的には、ポリマー核酸、例えば、３つ以上のヌクレオチドを含む核酸分子は線状分子であり、隣接したヌクレオチドはホスホジエステル結合を介して互いに連結している。一部の実施形態では、「核酸」は、個々の核酸残基（例えば、ヌクレオチドおよび／またはヌクレオシド）を指す。一部の実施形態では、「核酸」は、３つ以上の個々のヌクレオチド残基を含むオリゴヌクレオチド鎖を指す。本明細書で使用する場合、用語「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチドのポリマー（例えば、少なくとも３つのヌクレオチドのストリング）を指すために互換的に使用することができる。一部の実施形態では、「核酸」は、ＲＮＡならびに一本鎖ＤＮＡおよび／または二本鎖ＤＮＡを包含する。核酸は、例えば、ゲノム、転写物、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、プラスミド、コスミド、染色体、染色分体、または他の天然核酸分子の文脈において、天然であってもよい。一方、核酸分子は、非天然分子、例えば、組換えのＤＮＡもしくはＲＮＡ、人工染色体、操作されたゲノムもしくはその断片、または合成のＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、または非天然のヌクレオチドもしくはヌクレオシドを含むものであってもよい。さらに、用語「核酸」、「ＤＮＡ」、「ＲＮＡ」、および／または同様の用語には、核酸アナログ、すなわちリン酸ジエステル骨格以外を有するアナログが含まれる。核酸は、天然供給源から精製すること、組換え発現系を使用して産生し、場合によっては精製すること、化学的に合成すること等が可能である。適切な場合、例えば化学的に合成された分子の場合には、核酸は、化学的に修飾された塩基または糖を有するアナログなどのヌクレオシドアナログおよび骨格修飾を含んでもよい。他に指示がない限り、核酸配列は５’から３’方向で提示される。一部の実施形態では、核酸は、天然ヌクレオシド（例えば、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン、およびデオキシシチジン）；ヌクレオシドアナログ（例えば、２−アミノアデノシン、２−チオチミジン、イノシン、ピロロ−ピリミジン、３−メチルアデノシン、５−メチルシチジン、２−アミノアデノシン、Ｃ５−ブロモウリジン、Ｃ５−フルオロウリジン、Ｃ５−ヨードウリジン、Ｃ５−プロピニル−ウリジン、Ｃ５−プロピニル−シチジン、Ｃ５−メチルシチジン、２−アミノアデノシン、７−デアザアデノシン、７−デアザグアノシン、８−オキソアデノシン、８−オキノグアノシン、Ｏ（６）−メチルグアニン、および２−チオシチジン）；化学的に修飾された塩基；生物学的に修飾された塩基（例えば、メチル化された塩基）；インターカレートされた塩基；修飾された糖（例えば、２’−フルオロリボース、リボース、２’−デオキシリボース、アラビノース、およびヘキソース）；ならびに／または修飾されたリン酸基（例えば、ホスホロチオエートおよび５’−Ｎ−ホスホラミダイト結合）であるかまたはそれらを含む。
用語「医薬組成物」は、本明細書で使用する場合、疾患または障害の治療の文脈において、被験体に投与することができる組成物を指す。一部の実施形態では、医薬組成物は、活性成分、例えばヌクレアーゼ、ヌクレアーゼをコードする核酸と、薬学的に許容される賦形剤とを含む。
用語「増殖性疾患」は、本明細書で使用する場合、細胞または細胞集団が異常に高い増殖速度を示すという点で、細胞または組織ホメオスタシスを撹乱する任意の疾患を指す。増殖性疾患には、新生物発生前の過形成症状および新生物疾患など、過剰増殖性疾患が含まれる。新生物疾患は、異常な細胞増殖を特徴とし、良性および悪性の新生物を含む。悪性新生物は、癌とも呼ばれる。
用語「タンパク質」、「ペプチド」、および「ポリペプチド」は、本明細書で互換的に使用され、ペプチド（アミド）結合により相互に連結されるアミノ酸残基のポリマーを指す。この用語は、任意のサイズ、構造、または機能のタンパク質、ペプチド、またはポリペプチドを指す。典型的には、タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドは、少なくとも３アミノ酸長である。タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドは、個々のタンパク質を指しても、タンパク質の集合を指してもよい。タンパク質、ペプチド、またはポリペプチド中の１つまたは複数のアミノ酸は、例えば、コンジュゲーション、官能化、または他の修飾等のために、炭水化物基、ヒドロキシル基、リン酸基、ファルネシル基、イソファルネシル基、脂肪酸基、リンカーなどの化学成分を付加することによって修飾してもよい。タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドはまた、単一分子であっても、複数分子複合体であってもよい。タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドは、天然のタンパク質またはペプチドの単に断片であってもよい。タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドは、天然、組換え体、もしくは合成、またはそれらの任意の組合せであってもよい。タンパク質は、異なるドメイン、例えば、核酸結合ドメインと核酸切断ドメインとを含んでもよい。一部の実施形態では、タンパク質は、タンパク質部分、例えば、核酸結合ドメインを構成するアミノ酸配列と、有機化合物、例えば、核酸切断剤として作用することができる化合物とを含む。
用語「無作為化された」は、核酸配列の文脈において本明細書で使用する場合、遊離ヌクレオチドの混合物、例えば、４つのヌクレオチドであるＡ、Ｔ、Ｇ、およびＣのすべての混合物を組み込むように合成された配列またはその配列内の残基を指す。無作為化された残基は、通常、ヌクレオチド配列内で文字Ｎによって表す。一部の実施形態では、無作為化された配列または残基は、完全に無作為化されており、その場合には、無作為化された残基は、それぞれの配列残基の合成ステップの間に組み込まれるヌクレオチドを等量（例えば、２５％のＴ、２５％のＡ、２５％のＧ、および２５％のＣ）加えることにより合成される。一部の実施形態では、無作為化された配列または残基は、部分的に無作為化されており、その場合には、無作為化された残基は、それぞれの配列残基の合成ステップの間に組み込まれるヌクレオチドを非等量（例えば、７９％のＴ、７％のＡ、７％のＧ、および７％のＣ）加えることにより合成される。部分的な無作為化は、所与の配列のテンプレートになるが、所望の頻度で突然変異を組み込んだ配列の生成を可能にする。例えば、公知のヌクレアーゼ標的部位を合成テンプレートとして使用する場合、各ステップに、それぞれの残基で表されるヌクレオチドをその合成に７９％で加え、他の３つのヌクレオチドをそれぞれ７％で加える部分的無作為化により、部分的に無作為化された標的部位の混合物が合成されることになり、それは依然として、元の標的部位のコンセンサス配列を表すが、そのように合成された各残基について、２１％の統計的頻度（二項分布）で各残基が元の標的部位と異なる。一部の実施形態では、部分的に無作為化された配列は、二項分布的に、平均して５％超、１０％超、１５％超、２０％超、２５％超、または３０％超、コンセンサス配列と異なる。一部の実施形態では、部分的に無作為化された配列は、二項分布的に、平均して１０％以下、１５％以下、２０％以下、２５％以下、３０％以下、４０％以下、または５０％以下、コンセンサス部位と異なる。
用語「小分子」および「有機化合物」は、本明細書において互換的に使用し、天然であるかまたは人為的に形成させたもの（例えば、化学合成を介して）であるかにかかわらず、比較的低分子量の分子を指す。典型的には、有機化合物は炭素を含有する。有機化合物は、複数の炭素−炭素結合、立体中心、および他の官能基（例えば、アミン、ヒドロキシル、カルボニル、または複素環）を含有することができる。一部の実施形態では、有機化合物は、単量体であり、約１５００ｇ／モル未満の分子量を有する。特定の実施形態では、小分子の分子量は、約１０００ｇ／モル未満または約５００ｇ／モル未満である。特定の実施形態では、小分子は、薬物、例えば、適切な政府機関または規制団体によりヒトまたは動物での使用が安全かつ効果的であるとすでに認められた薬物である。特定の実施形態では、有機分子は、核酸に結合および／切断することが公知である。一部の実施形態では、有機化合物はエンジインである。一部の実施形態では、有機化合物は、抗生物質、例えば、ジネミシン、ネオカルチノスタチン、カリチアマイシン、エスペラマイシン、ブレオマイシン、またはそれらの誘導体などの抗癌抗生物質である。
用語「被験体」は、本明細書で使用する場合、個々の生物、例えば、個々の哺乳動物を指す。一部の実施形態では、被験体はヒトである。一部の実施形態では、被験体は非ヒト哺乳動物である。一部の実施形態では、被験体は非ヒト霊長類である。一部の実施形態では、被験体はげっ歯類である。一部の実施形態では、被験体は、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ネコ、またはイヌである。一部の実施形態では、被験体は、脊椎動物、両生類、爬虫類、魚類、昆虫、ハエ、または線虫である。
用語「標的核酸」および「標的ゲノム」は、ヌクレアーゼの文脈において本明細書で使用する場合、所与のヌクレアーゼの少なくとも１つの標的部位を含む、それぞれ核酸分子またはゲノムを指す。
用語「ヌクレアーゼ標的部位」と本明細書で互換的に使用する用語「標的部位」は、ヌクレアーゼが結合および切断する核酸分子内の配列を指す。標的部位は、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。二量体を形成するヌクレアーゼ、例えば、ＦｏｋＩ ＤＮＡ切断ドメインを含むヌクレアーゼの文脈では、標的部位は、典型的には、左ハーフサイト（ヌクレアーゼの一方の単量体が結合する）、右ハーフサイト（ヌクレアーゼの他方の単量体が結合する）、および切断がなされる、ハーフサイト間のスペーサー配列を含む。この構造（［左ハーフサイト］−［スペーサー配列］−［右ハーフサイト］）は、本明細書ではＬＳＲ構造と呼ばれる。一部の実施形態では、左ハーフサイトおよび／または右ハーフサイトは、１０〜１８ヌクレオチド長の間である。一部の実施形態では、ハーフサイトのいずれかまたは両方がより短いかまたはより長い。一部の実施形態では、左ハーフサイトと右ハーフサイトは異なる核酸配列を含む。
用語「転写活性化因子様エフェクター」（ＴＡＬＥ）は、本明細書で使用する場合、ＤＮＡ結合ドメインを含む細菌タンパク質を指し、これは、高度に可変な２つのアミノ酸モチーフ（反復可変二残基（Ｒｅｐｅａｔ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｄｉｒｅｓｉｄｕｅ）、ＲＶＤ）を含む、高度に保存された３３〜３４アミノ酸配列を含有する。ＲＶＤモチーフは、核酸配列への結合特異性を決定し、所望のＤＮＡ配列に特異的に結合するように、当業者に周知の方法によって操作することができる（例えば、Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊｅｆｆｒｅｙ；ｅｔ．ａｌ．（Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２０１１）．“Ａ ＴＡＬＥ ｎｕｃｌｅａｓｅ ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ ｆｏｒ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ”．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２９（２）：１４３−８；Ｚｈａｎｇ，Ｆｅｎｇ；ｅｔ．ａｌ．（Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２０１１）．“Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＴＡＬ ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ”．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２９（２）：１４９−５３；Ｇｅｉβｌｅｒ，Ｒ．；Ｓｃｈｏｌｚｅ，Ｈ．；Ｈａｈｎ，Ｓ．；Ｓｔｒｅｕｂｅｌ，Ｊ．；Ｂｏｎａｓ，Ｕ．；Ｂｅｈｒｅｎｓ，Ｓ．Ｅ．；Ｂｏｃｈ，Ｊ．（２０１１），Ｓｈｉｕ，Ｓｈｉｎ−Ｈａｎ．ｅｄ．“Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ Ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｓ ｗｉｔｈ Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ＤＮＡ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ”．ＰＬｏＳ ＯＮＥ ６（５）：ｅ１９５０９；Ｂｏｃｈ，Ｊｅｎｓ（Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２０１１）．“ＴＡＬＥｓ ｏｆ ｇｅｎｏｍｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ”．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２９（２）：１３５−６；Ｂｏｃｈ，Ｊｅｎｓ；ｅｔ．ａｌ．（Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２００９）．“Ｂｒｅａｋｉｎｇ ｔｈｅ Ｃｏｄｅ ｏｆ ＤＮＡ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ＴＡＬ−Ｔｙｐｅ ＩＩＩ Ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ”．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２６（５９５９）：１５０９−１２；およびＭｏｓｃｏｕ，Ｍａｔｔｈｅｗ Ｊ．； Ａｄａｍ Ｊ．Ｂｏｇｄａｎｏｖｅ（Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２００９）．“Ａ Ｓｉｍｐｌｅ Ｃｉｐｈｅｒ Ｇｏｖｅｒｎｓ ＤＮＡ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｂｙ ＴＡＬ Ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ”．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２６（５９５９）：１５０１を参照のこと；これらそれぞれの内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる）。アミノ酸配列とＤＮＡ認識との間に簡単な関係があるため、適切なＲＶＤを含有する反復セグメントの組合せを選択することにより、特定のＤＮＡ結合ドメインの操作が可能になっている。
用語「転写活性化因子様エレメントヌクレアーゼ」（ＴＡＬＥＮ）は、本明細書で使用する場合、ＤＮＡ切断ドメイン、例えばＦｏｋＩドメインに加えて転写活性化因子様エフェクターのＤＮＡ結合ドメインを含む人為的なヌクレアーゼを指す。操作されたＴＡＬＥ構築物を作製するためのいくつかのモジュール構築スキームが報告されている（Ｚｈａｎｇ，Ｆｅｎｇ；ｅｔ．ａｌ．（Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２０１１）．“Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＴＡＬ ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ”．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２９（２）：１４９−５３；Ｇｅｉβｌｅｒ，Ｒ．；Ｓｃｈｏｌｚｅ，Ｈ．；Ｈａｈｎ，Ｓ．；Ｓｔｒｅｕｂｅｌ，Ｊ．；Ｂｏｎａｓ，Ｕ．；Ｂｅｈｒｅｎｓ，Ｓ．Ｅ．；Ｂｏｃｈ，Ｊ．（２０１１），Ｓｈｉｕ，Ｓｈｉｎ−Ｈａｎ．ｅｄ．“Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ Ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｓ ｗｉｔｈ Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ＤＮＡ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ”．ＰＬｏＳ ＯＮＥ ６（５）：ｅ１９５０９；Ｃｅｒｍａｋ，Ｔ．；Ｄｏｙｌｅ，Ｅ．Ｌ．；Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ，Ｍ．；Ｗａｎｇ，Ｌ．；Ｚｈａｎｇ，Ｙ．；Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｃ．；Ｂａｌｌｅｒ，Ｊ．Ａ．；Ｓｏｍｉａ，Ｎ．Ｖ．ｅｔ ａｌ．（２０１１）．“Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ｃｕｓｔｏｍ ＴＡＬＥＮ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ＴＡＬ ｅｆｆｅｃｔｏｒ−ｂａｓｅｄ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ ｆｏｒ ＤＮＡ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ”．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ；Ｍｏｒｂｉｔｚｅｒ，Ｒ．；Ｅｌｓａｅｓｓｅｒ，Ｊ．；Ｈａｕｓｎｅｒ，Ｊ．；Ｌａｈａｙｅ，Ｔ．（２０１１）．“Ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ｃｕｓｔｏｍ ＴＡＬＥ−ｔｙｐｅ ＤＮＡ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎｓ ｂｙ ｍｏｄｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ”．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ；Ｌｉ，Ｔ．；Ｈｕａｎｇ，Ｓ．；Ｚｈａｏ，Ｘ．；Ｗｒｉｇｈｔ，Ｄ．Ａ．；Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ，Ｓ．；Ｓｐａｌｄｉｎｇ，Ｍ．Ｈ．；Ｗｅｅｋｓ，Ｄ．Ｐ．；Ｙａｎｇ，Ｂ．（２０１１）．“Ｍｏｄｕｌａｒｌｙ ａｓｓｅｍｂｌｅｄ ｄｅｓｉｇｎｅｒ ＴＡＬ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｆｏｒ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｇｅｎｅ ｋｎｏｃｋｏｕｔ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｉｎ ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ”．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．；Ｗｅｂｅｒ，Ｅ．；Ｇｒｕｅｔｚｎｅｒ，Ｒ．；Ｗｅｒｎｅｒ，Ｓ．；Ｅｎｇｌｅｒ，Ｃ．；Ｍａｒｉｌｌｏｎｎｅｔ，Ｓ．（２０１１）．Ｂｅｎｄａｈｍａｎｅ，Ｍｏｈａｍｍｅｄ．ｅｄ．“Ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ Ｄｅｓｉｇｎｅｒ ＴＡＬ Ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ ｂｙ Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ”．ＰＬｏＳ ＯＮＥ ６（５）：ｅ１９７２２；これらそれぞれの内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる）。
用語「治療」、「治療する」、および「治療すること」は、本明細書に記載するように、疾患もしく障害、またはその１つもしくは複数の症候の反転、緩和、発症の遅延、もしくは進行の抑制を目的とした臨床的介入を指す。本明細書で使用する場合、用語「治療」、「治療する」、および「治療すること」は、本明細書に記載するように、疾患もしく障害、またはその１つもしくは複数の症候の反転、緩和、発症の遅延、もしくは進行の抑制を目的とした臨床的介入を指す。一部の実施形態では、治療は、１つまたは複数の症候が発症した後に、かつ／または疾患が診断された後に実施してもよい。他の実施形態では、治療は、例えば、症候の発症を防止もしくは遅延させるために、または疾患の発症もしくは進行を抑制するために、症候のない状態で実施してもよい。例えば、治療は、症候の発症前に、罹患しやすい個体に（例えば、症候履歴に照らして、かつ／または遺伝的因子もしくは他の感受性因子に照らして）実施してもよい。治療はまた、症候が消散した後に、例えば、再発を防止または遅延させるために継続することができる。
用語「ジンクフィンガー」は、本明細書で使用する場合、折り畳みおよびその折り畳みを安定化する１つまたは複数の亜鉛イオンの配位を特徴とする、小さな核酸結合タンパク質構造モチーフを指す。ジンクフィンガーは、多種多様の異なるタンパク質構造を包含する（例えば、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｋｌｕｇ Ａ，Ｒｈｏｄｅｓ Ｄ（１９８７）．“Ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒｓ：ａ ｎｏｖｅｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｏｌｄ ｆｏｒ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ”．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ．Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５２：４７３−８２を参照のこと）。特定のヌクレオチド配列に結合するように、ジンクフィンガーを設計することができ、また所望の任意の標的配列に実際に結合するように、一連のジンクフィンガーの融合物を含むジンクフィンガーアレイを設計することができる。そのようなジンクフィンガーアレイを、例えば核酸切断ドメインにコンジュゲートすれば、タンパク質、例えばヌクレアーゼの結合ドメインを形成することができる。異なるタイプのジンクフィンガーモチーフが当業者に公知であり、それには、これらに限定されないが、Ｃｙｓ２Ｈｉｓ２、Ｇａｇ ｋｎｕｃｋｌｅ、Ｔｒｅｂｌｅ ｃｌｅｆ、亜鉛リボン、Ｚｎ２／Ｃｙｓ６、およびＴＡＺ２ドメイン様モチーフが含まれる（例えば、Ｋｒｉｓｈｎａ ＳＳ，Ｍａｊｕｍｄａｒ Ｉ，Ｇｒｉｓｈｉｎ ＮＶ（Ｊａｎｕａｒｙ ２００３）．“Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒｓ：ｓｕｒｖｅｙ ａｎｄ ｓｕｍｍａｒｙ”．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１（２）：５３２−５０を参照のこと）。典型的には、単一ジンクフィンガーモチーフは、核酸分子の３または４ヌクレオチドに結合する。したがって、２つのジンクフィンガーモチーフを含むジンクフィンガードメインは、６〜８ヌクレオチドに結合することができ、３つのジンクフィンガーモチーフを含むジンクフィンガードメインは、９〜１２ヌクレオチドに結合することができ、４つのジンクフィンガーモチーフを含むジンクフィンガードメインは、１２〜１６ヌクレオチドに結合することができる等がある。ジンクフィンガーのＤＮＡ結合特異性を変更するために、かつ／または長さが３〜３０ヌクレオチドの所望の任意の標的配列に実際に結合するような新規のジンクフィンガー融合物を設計するために、任意の適切なタンパク質工学手法を使用することができる（例えば、Ｐａｂｏ ＣＯ，Ｐｅｉｓａｃｈ Ｅ，Ｇｒａｎｔ ＲＡ（２００１）．“Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ｃｙｓ２Ｈｉｓ２ Ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎｓ”．Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ７０：３１３−３４０；Ｊａｍｉｅｓｏｎ ＡＣ，Ｍｉｌｌｅｒ ＪＣ，Ｐａｂｏ ＣＯ（２００３）．“Ｄｒｕｇ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｗｉｔｈ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｚｉｎｃ−ｆｉｎｇｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎｓ”．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ２（５）：３６１−３６８；およびＬｉｕ Ｑ，Ｓｅｇａｌ ＤＪ，Ｇｈｉａｒａ ＪＢ，Ｂａｒｂａｓ ＣＦ（Ｍａｙ １９９７）．“Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｐｏｌｙｄａｃｔｙｌ ｚｉｎｃ−ｆｉｎｇｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｏｒ ｕｎｉｑｕｅ ａｄｄｒｅｓｓｉｎｇ ｗｉｔｈｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｇｅｎｏｍｅｓ”．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９４（１１）を参照のこと；これらそれぞれの内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる）。操作されたジンクフィンガーアレイと核酸を切断するタンパク質ドメインとの間を融合して、「ジンクフィンガーヌクレアーゼ」を生成することができる。ジンクフィンガーヌクレアーゼは、典型的には、核酸分子内の特定の標的部位に結合するジンクフィンガードメインと、結合ドメインが結合した標的部位内またはその近傍の核酸分子を切断する核酸切断ドメインとを含む。典型的な操作されたジンクフィンガーヌクレアーゼは、３〜６個の間の個々のジンクフィンガーモチーフを有し、長さが９塩基対〜１８塩基対の範囲にある標的部位に結合する結合ドメインを含む。より長い標的部位は、所与のゲノムにユニークな標的部位に結合し切断することが望ましい状況では特に魅力的である。
用語「ジンクフィンガーヌクレアーゼ」は、本明細書で使用する場合、ジンクフィンガーアレイを含む結合ドメインにコンジュゲートした核酸切断ドメインを含むヌクレアーゼを指す。一部の実施形態では、切断ドメインは、ＩＩ型制限酵素ＦｏｋＩの切断ドメインである。切断する所与の核酸分子中の任意の所望の配列を実際に標的にするように、ジンクフィンガーヌクレアーゼを設計することができ、設計のジンクフィンガー結合ドメインが複雑なゲノムの文脈においてユニークな部位に結合する可能性があれば、例えば、治療価値のある標的ゲノム改変を達成するような、生細胞中の単一ゲノム部位の標的切断が可能になる。所望のゲノム遺伝子座に対する二本鎖切断のターゲティングは、非相同ＤＮＡ修復経路の誤りがちな性質のため、遺伝子のコード配列にフレームシフト突然変異を導入するように使用することができる。ジンクフィンガーヌクレアーゼは、当業者に周知の方法により目的の部位を標的にするように作製することができる。例えば、所望の特異性を有するジンクフィンガー結合ドメインは、特異性の知られた個々のジンクフィンガーモチーフを組み合わせることにより設計することができる。ＤＮＡに結合したジンクフィンガータンパク質Ｚｉｆ２６８の構造が、この分野の研究の多くに伝えられ、６４通りの可能な塩基対トリプレットのそれぞれに対するジンクフィンガーを得て、次いでこれらのジンクフィンガーモジュールを混合し、マッチさせて、所望の任意の配列特異性を有するタンパク質を設計するという概念が記載された（Ｐａｖｌｅｔｉｃｈ ＮＰ，Ｐａｂｏ ＣＯ（Ｍａｙ １９９１）．“Ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ−ＤＮＡ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ：ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ａ Ｚｉｆ２６８−ＤＮＡ ｃｏｍｐｌｅｘ ａｔ ２．１ Ａ”．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２（５００７）：８０９−１７、この内容全体は、本明細書に組み込まれる）。一部の実施形態では、３塩基対ＤＮＡ配列をそれぞれ認識する別々のジンクフィンガーを組み合わせて、長さが９塩基対〜１８塩基対の範囲にある標的部位を認識する３−、４−、５−、または６−フィンガーアレイを作製する。一部の実施形態では、より長いアレイを企図する。他の実施形態では、６〜８ヌクレオチドを認識する２−フィンガーモジュールを組み合わせて、４−、６−、または８−ジンクフィンガーアレイを作製する。一部の実施形態では、細菌またはファージのディスプレイを使用して、所望の核酸配列、例えば、長さが３〜３０ｂｐの所望のヌクレアーゼ標的部位を認識するジンクフィンガードメインを開発する。ジンクフィンガーヌクレアーゼは、一部の実施形態では、リンカー、例えばポリペプチドリンカーを介して互いに融合した、またはそうでなければコンジュゲートしたジンクフィンガー結合ドメインおよび切断ドメインを含む。リンカーの長さは、ジンクフィンガードメインが結合する核酸配列から切断箇所までの距離を決定する。短いリンカーを使用すると、切断ドメインは、結合核酸配列に近い核酸を切断することになり、一方、長いリンカーでは、切断と結合との核酸配列間の距離が大きくなる。一部の実施形態では、ジンクフィンガーヌクレアーゼの切断ドメインは、結合した核酸を切断するために二量体を形成しなければならない。一部のそのような実施形態では、二量体は、それぞれが異なるジンクフィンガー結合ドメインを含む２つの単量体のヘテロ二量体である。例えば、一部の実施形態では、二量体は、ＦｏｋＩ切断ドメインにコンジュゲートしたジンクフィンガードメインＡを含む１つの単量体と、ＦｏｋＩ切断ドメインにコンジュゲートしたジンクフィンガードメインＢを含む１つの単量体とを含むことができる。この非限定例では、ジンクフィンガードメインＡは、標的部位の一方の側にある核酸配列に結合し、ジンクフィンガードメインＢは、標的部位の反対側にある核酸配列に結合し、二量体形成したＦｏｋＩドメインは、ジンクフィンガードメイン結合部位の間にある核酸を切断する。
本発明の特定の実施形態の詳細な説明
緒言
部位特異的ヌクレアーゼは、ゲノムの標的改変のための強力なツールである。一部の部位特異的ヌクレアーゼは、理論的には、他のいかなるゲノム部位にも影響を及ぼすことなく、切断のための、ゲノム中の単一のユニーク部位を標的にすることを可能にする、標的切断部位に対する特異性レベルを達成することができる。生細胞におけるヌクレアーゼ切断は、切断され修復されたゲノム配列の改変をもたらすことが多い、例えば相同組換えを介するＤＮＡ修復機序を誘発することが報告されている。したがって、ゲノム内の特定のユニーク配列の標的切断により、多くのヒト体細胞または胚性幹細胞など、従来の遺伝子ターゲティング法により操作することが困難である細胞を含む生細胞における遺伝子ターゲティングおよび遺伝子改変のための新しい手段が開かれる。疾患関連配列、例えばＨＩＶ／ＡＩＤＳ患者のＣＣＲ−５対立遺伝子、または腫瘍血管新生に必要な遺伝子のヌクレアーゼ媒介の改変は、臨床的文脈において使用することが可能であり、現在、２つの部位特異的ヌクレアーゼが臨床試験中である。
部位特異的ヌクレアーゼを媒介とする改変の分野で重要な一側面は、オフターゲットヌクレアーゼ効果、例えば、目的の標的配列と１つまたは複数のヌクレオチドが異なるゲノム配列の切断である。オフターゲット切断の望ましくない副作用の範囲としては、遺伝子ターゲティング事象の間の望まれない遺伝子座への挿入から臨床的シナリオにおける重度の合併症まである。被験体に投与されたヌクレアーゼによる、必須遺伝子機能または癌抑制遺伝子をコードする配列のオフターゲット切断は、被験体に疾患または死さえもたらす可能性がある。したがって、ヌクレアーゼの有効性および安全性を決定するために、実験室または病院でそれを使用する前に、その切断選択性を特徴づけることが望ましい。さらに、ヌクレアーゼ切断特性の特徴づけにより、一群の候補ヌクレアーゼから特定の課題に最も適したヌクレアーゼを選択すること、または既存のヌクレアーゼから得られる放出産物を選択することが可能になる。また、ヌクレアーゼ切断特性のそのような特徴づけにより、向上した特異性または有効性などの向上した特性を有するヌクレアーゼの新規設計がもたらされ得る。
ヌクレアーゼが核酸の標的操作のために使用される多くのシナリオでは、切断特異性が重要な特徴になる。操作されたヌクレアーゼ結合ドメインの一部の不完全な特異性は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方において、オフターゲット切断および望ましくない作用をもたらす可能性がある。ＥＬＩＳＡアッセイ、マイクロアレイ、ワンハイブリッドシステム、ＳＥＬＥＸおよびその変形、ならびにＲｏｓｅｔｔａベースの計算予測を含む、部位特異的ヌクレアーゼの特異性を評価する現行の方法はすべて、ヌクレアーゼ分子の結合特異性がその切断特異性に等価または比例しているという仮定を前提としている。
しかしながら、ここに提示した研究は、オフターゲット結合作用の予測が、望ましくない生物学的作用をもたらし得るヌクレアーゼ切断作用の不完全な近似を与えるという発見に基づいている。この発見は、一部の部位特異的ＤＮＡヌクレアーゼに関して報告された毒性が、単にオフターゲット結合によるのではなく、オフターゲットＤＮＡ切断に起因するという考えと一致する。
本明細書に提供する方法および試薬は、所与のヌクレアーゼの標的部位特異性の正確な評価を可能にし、適切なユニークな標的部位の選択および複雑なゲノムの文脈において、単一部位の標的切断に対して高度に特異的なヌクレアーゼの設計のための戦略を提供する。さらに、本明細書に提供する方法、試薬、および戦略により、当業者が所与の任意の部位特異的ヌクレアーゼの特異性を向上させ、かつオフターゲット作用を最小化させることが可能になる。一方、ＤＮＡおよびＤＮＡ切断ヌクレアーゼに具体的に関連して、本明細書に提供する発明概念、方法、戦略、および試薬は、この点において限定されないが、任意の核酸：ヌクレアーゼ対に適用することができる。
部位特異的ヌクレアーゼにより切断されたヌクレアーゼ標的部位の同定
本発明の一部の態様は、任意の部位特異的ヌクレアーゼにより切断された核酸標的部位を決定するための方法および試薬を提供する。一般に、そのような方法は、ヌクレアーゼが標的部位に結合し切断するのに適した条件下で所与のヌクレアーゼと標的部位のライブラリーとを接触させるステップと、ヌクレアーゼが実際に切断する標的部位を決定するステップとを含む。実際の切断に基づいた、ヌクレアーゼの標的部位プロファイルの決定は、部位特異的ヌクレアーゼの望ましくないオフターゲット作用の媒介に関連するパラメーターを測定するという、結合に基づく方法にまさる利点を有する。
一部の実施形態では、ヌクレアーゼの標的部位を同定する方法を提供する。一部の実施形態では、この方法は、（ａ）二本鎖核酸の標的部位を切断し、５’オーバーハングを生成するヌクレアーゼを準備するステップであって、標的部位が［左ハーフサイト］−［スペーサー配列］−［右ハーフサイト］（ＬＳＲ）構造を含み、ヌクレアーゼがスペーサー配列内の標的部位を切断するステップを含む。一部の実施形態では、この方法は、（ｂ）ヌクレアーゼがヌクレアーゼの標的部位を含む候補核酸分子を切断するのに適切な条件下で、候補核酸分子のライブラリーにヌクレアーゼを接触させるステップであって、各核酸分子が、候補ヌクレアーゼ標的部位および一定の挿入配列を含む配列のコンカテマーを含むステップを含む。一部の実施形態では、この方法は、（ｃ）ヌクレアーゼにより２回切断され、一方の側に左ハーフサイトおよび切断スペーサー配列が隣接し、他方の側に右ハーフサイトおよび切断スペーサー配列が隣接した一定の挿入配列を含む核酸分子の５’オーバーハングを充填し、それによって平滑末端を作製するステップを含む。一部の実施形態では、この方法は、（ｄ）ステップ（ｃ）の核酸分子の左ハーフサイト、右ハーフサイト、および／またはスペーサー配列の配列を決定することにより、ヌクレアーゼにより切断されたヌクレアーゼ標的部位を同定するステップを含む。一部の実施形態では、この方法は、ヌクレアーゼを準備するステップと、そのヌクレアーゼを、候補標的部位を含む候補核酸分子のライブラリーと接触させるステップとを含む。一部の実施形態では、候補核酸分子は二本鎖核酸分子である。一部の実施形態では、候補核酸分子はＤＮＡ分子である。一部の実施形態では、ヌクレアーゼは標的部位で二量体を形成し、標的部位はＬＳＲ構造（［左ハーフサイト］−［スペーサー配列］−［右ハーフサイト］）を含む。一部の実施形態では、ヌクレアーゼは、スペーサー配列内の標的部位を切断する。一部の実施形態では、ヌクレアーゼは、二本鎖の核酸標的部位を切断し、５’オーバーハングを生成するヌクレアーゼである。一部の実施形態では、ライブラリー中の各核酸分子は、候補ヌクレアーゼ標的部位と一定の挿入配列とを含む配列のコンカテマーを含む。
例えば、一部の実施形態では、ライブラリーの候補核酸分子は、構造Ｒ１−［（ＬＳＲ）−（定常領域）］Ｘ−Ｒ２を含み、式中、Ｒ１およびＲ２は独立して、［（ＬＳＲ）−（定常領域）］反復単位の断片を含み得る核酸配列であり、Ｘは２とｙとの間の整数である。一部の実施形態では、ｙは、少なくとも１０１、少なくとも１０２、少なくとも１０３、少なくとも１０４、少なくとも１０５、少なくとも１０６、少なくとも１０７、少なくとも１０８、少なくとも１０９、少なくとも１０１０、少なくとも１０１１、少なくとも１０１２、少なくとも１０１３、少なくとも１０１４、または少なくとも１０１５である。一部の実施形態では、ｙは、１０２未満、１０３未満、１０４未満、１０５未満、１０６未満、１０７未満、１０８未満、１０９未満、１０１０未満、１０１１未満、１０１２未満、１０１３未満、１０１４未満、または１０１５未満である。定常領域は、一部の実施形態では、単一反復単位の効率的な自己連結反応を可能にする長さである。適切な長さは当業者には明らかである。例えば、一部の実施形態では、定常領域の長さは、１００〜１０００塩基対の間であり、例えば、約１００塩基対、約２００塩基対、約３００塩基対、約４００塩基対、約４５０塩基対、約５００塩基対、約６００塩基対、約７００塩基対、約８００塩基対、約９００塩基対、約１０００塩基対であり、一部の実施形態では、定常領域は、約１００塩基対よりも短いか、または約１０００塩基対よりも長い。
ヌクレアーゼとライブラリー核酸とのインキュベーションにより、ヌクレアーゼが結合し切断することができる標的部位を含む、ライブラリー中のコンカテマーが切断されることになる。所与のヌクレアーゼが特異的な標的部位を高効率に切断する場合、標的部位を含むコンカテマーは、複数回切断されて、単一の反復単位を含む断片が生成することになる。ヌクレアーゼ切断によりコンカテマーから放出された反復単位は、構造Ｓ２Ｒ−（定常領域）−ＬＳ１になる。式中、Ｓ１およびＳ２は、ヌクレアーゼにより切断された後の相補的なスペーサー領域断片を表す。次いで、ライブラリー候補分子から放出された任意の反復単位を単離することができ、かつ／または放出された反復単位のＳ２ＲおよびＬＳ１領域をシークエンシングすることにより、ヌクレアーゼにより切断されたＬＳＲの配列を同定することができる。
反復単位の単離およびシークエンシングに適した任意の方法を使用して、ヌクレアーゼにより切断されたＬＳＲ配列を解明することができる。例えば、定常領域の長さが既知であるので、放出された個々の反復単位を、より大きな未切断ライブラリー核酸分子および複数の反復単位を含むライブラリー核酸分子の断片（ヌクレアーゼによる非効率的な標的切断を示す）から、そのサイズに基づいて分離することができる。サイズに基づいて核酸分子を分離および／または単離するのに適した方法は、当業者には周知であり、例えば、ゲル電気泳動法、密度勾配遠心分離法、および適切な分子カットオフ値を有する半透膜上の透析などのサイズ分画法が挙げられる。次いで、分離／単離した核酸分子は、例えば、切断末端にＰＣＲおよび／またはシークエンシングのアダプターを連結し、かつそれぞれの核酸を増幅および／またはシークエンシングすることにより、さらに特徴づけることができる。さらに、定常領域の長さが、放出された個々の反復単位の自己連結反応が容易になるように選択されている場合、そのような放出された個々の反復単位は、ヌクレアーゼで処理されたライブラリー分子をリガーゼと接触させ、次いで、自己連結した個々の反復単位の環状特性に基づいて増幅および／またはシークエンシングすることにより濃縮することができる。
標的核酸の切断の結果として５’オーバーハングを生成するヌクレアーゼを使用する一部の実施形態では、切断された核酸分子の５’オーバーハングを充填する。５’オーバーハングを充填するための方法は当業者に周知であり、例えば、エキソヌクレアーゼ活性（Ｋｌｅｎｏｗ（３’→５’エキソ−））を欠くＤＮＡポリメラーゼＩ Ｋｌｅｎｏｗ断片を使用する方法が挙げられる。５’オーバーハングの充填により、陥凹鎖のオーバーハングをテンプレートとした伸張が起こり、次いで平滑末端が得られる。ライブラリーコンカテマーから放出された単一反復単位の場合には、得られる構造は、平滑末端のＳ２’Ｒ−（定常領域）−ＬＳ１’であり、Ｓ１’およびＳ２’が平滑末端を含む。次いで、ＰＣＲおよび／またはシークエンシングのアダプターを、平滑末端連結反応により末端に付加することができ、それぞれの反復単位（Ｓ２’ＲおよびＬＳ１’領域を含む）を配列決定することができる。配列データから、元のＬＳＲ領域を推定することができる。ヌクレアーゼ切断過程の間に生成したオーバーハングの平滑末端化はまた、それぞれのヌクレアーゼにより適切に切断された標的部位と、例えば、物理的な剪断などの非ヌクレアーゼ作用に基づいて非特異的に切断された標的部位との間の識別を可能にする。正確に切断されたヌクレアーゼ標的部位は、オーバーハングの充填の結果としてオーバーハングヌクレオチドの重複を含む、相補的なＳ２’ＲおよびＬＳ１’領域の存在により認識することができるが、それぞれのヌクレアーゼにより切断されなかった標的部位は、オーバーハングヌクレオチドの重複を含まないと考えられる。一部の実施形態では、この方法は、放出された個々の反復単位の左ハーフサイト、右ハーフサイト、および／またはスペーサー配列の配列を決定することにより、ヌクレアーゼにより切断されたヌクレアーゼ標的部位を同定するステップを含む。それぞれのヌクレアーゼにより切断された標的部位のＬＳＲ配列を同定するために、増幅および／またはシークエンシングのための任意の適切な方法を使用することができる。核酸分子の増幅および／またはシークエンシングのための方法は当業者に周知であり、本発明はこの点において限定されない。
本明細書に提供する方法および戦略の一部は、所与の任意のヌクレアーゼに対する可能な切断標的として複数の候補標的部位を同時に評価することを可能にする。したがって、そのような方法から得られたデータを使用して、所与のヌクレアーゼにより切断された標的部位のリストを編集することができ、これは、本明細書において標的部位プロファイルとも呼ばれる。定量的なシークエンシングデータの生成を可能にするシークエンシング法を使用する場合、それぞれのヌクレアーゼにより切断される、任意のヌクレアーゼ標的部位の検出された相対存在量を記録することも可能である。ヌクレアーゼがより効率的に切断する標的部位は、シークエンシングステップにおいてより頻度高く検出されることになるが、効率的に切断されない標的部位では、候補コンカテマーから個々の反復単位が放出されることはほとんどなく、したがって、何らかのシークエンシングリードがあっても、この標的部位が生成することはほとんどないであろう。このような定量的シークエンシングデータを標的部位プロファイルに統合して、高度に好まれるヌクレアーゼ標的部位およびあまり好まれないヌクレアーゼ標的部位のランク付けされたリストを作成することができる。
本明細書に提供する、ヌクレアーゼ標的部位プロファイリングの方法および戦略は、例えば、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、およびホーミングエンドヌクレアーゼを含む、任意の部位特異的ヌクレアーゼに適用することができる。本明細書に詳細に記載するように、ヌクレアーゼ特異性は、通常は、ヌクレアーゼ濃度の増加と共に低下し、本明細書に記載の方法は、所与のヌクレアーゼがその目的の標的部位を効率的に切断するが、いかなるオフターゲット配列も効率的に切断することがない濃度を決定するために使用することができる。一部の実施形態では、目的のヌクレアーゼ標的部位を切断するが、１０を超える、５を超える、４を超える、３を超える、２を超える、１を超える、またはいかなる新たなヌクレアーゼ標的部位も切断しない治療用ヌクレアーゼの最大濃度を決定する。一部の実施形態では、治療用ヌクレアーゼは、上記に記載のように決定された最大濃度以下の最終濃度が生じるのに有効な量で、被験体に投与される。
ヌクレアーゼ標的部位ライブラリー
本発明の一部の実施形態は、ヌクレアーゼ標的部位プロファイリングのための核酸分子ライブラリーを提供する。一部の実施形態では、そのようなライブラリーは複数の核酸分子を含み、それぞれの核酸分子は、候補ヌクレアーゼ標的部位および一定の挿入配列スペーサー配列のコンカテマーを含む。例えば、一部の実施形態では、ライブラリーの候補核酸分子は、構造Ｒ１−［（ＬＳＲ）−（定常領域）］Ｘ−Ｒ２を含み、式中、Ｒ１およびＲ２は独立して、［（ＬＳＲ）−（定常領域）］反復単位の断片を含み得る核酸配列であり、Ｘは２とｙとの間の整数である。一部の実施形態では、ｙは、少なくとも１０１、少なくとも１０２、少なくとも１０３、少なくとも１０４、少なくとも１０５、少なくとも１０６、少なくとも１０７、少なくとも１０８、少なくとも１０９、少なくとも１０１０、少なくとも１０１１、少なくとも１０１２、少なくとも１０１３、少なくとも１０１４、または少なくとも１０１５である。一部の実施形態では、ｙは、１０２未満、１０３未満、１０４未満、１０５未満、１０６未満、１０７未満、１０８未満、１０９未満、１０１０未満、１０１１未満、１０１２未満、１０１３未満、１０１４未満、または１０１５未満である。定常領域は、一部の実施形態では、単一反復単位の効率的な自己連結反応を可能にする長さである。一部の実施形態では、定常領域は、２つ以上の反復単位を含む断片から単一反復単位を効率的に分離することを可能にする長さである。一部の実施形態では、その集合物は、１つのシークエンシングリードでの完全な反復単位の効率的なシークエンシングを可能にする長さを超えている。適切な長さは当業者には明らかである。例えば、一部の実施形態では、定常領域の長さは、１００〜１０００塩基対の間であり、例えば、約１００塩基対、約２００塩基対、約３００塩基対、約４００塩基対、約４５０塩基対、約５００塩基対、約６００塩基対、約７００塩基対、約８００塩基対、約９００塩基対、約１０００塩基対であり、一部の実施形態では、定常領域は、約１００塩基対よりも短いか、または約１０００塩基対よりも長い。
ＬＳＲ部位は、典型的には、［左ハーフサイト］−［スペーサー配列］−［右ハーフサイト］構造を含む。ハーフサイトおよびスペーサー配列の長さは、評価する特定のヌクレアーゼに依存することになる。一般に、ハーフサイトは６〜３０ヌクレオチド長、好ましくは、１０〜１８ヌクレオチド長である。例えば、各ハーフサイトは個々に、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ヌクレオチド長であってよい。一部の実施形態では、ＬＳＲ部位は、３０ヌクレオチドよりも長くてもよい。一部の実施形態では、ＬＳＲの左ハーフサイトと右ハーフサイトは、同じ長さである。一部の実施形態では、ＬＳＲの左ハーフサイトと右ハーフサイトは、異なる長さである。一部の実施形態では、ＬＳＲの左ハーフサイトと右ハーフサイトは、異なる配列である。一部の実施形態では、ＦｏｋＩ切断ドメイン、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ホーミングエンドヌクレアーゼ、有機化合物ヌクレアーゼ、エンジイン、抗生物質ヌクレアーゼ、ジネミシン、ネオカルチノスタチン、カリチアマイシン、エスペラマイシン、および／またはブレオマイシンにより切断され得るＬＳＲを含む候補核酸を含むライブラリーを提供する。
一部の実施形態では、少なくとも１０５、少なくとも１０６、少なくとも１０７、少なくとも１０８、少なくとも１０９、少なくとも１０１０、少なくとも１０１１、または少なくとも１０１２の異なる候補ヌクレアーゼ標的部位を含む候補核酸分子のライブラリーを提供する。一部の実施形態では、ライブラリーの候補核酸分子は、ローリングサイクル増幅によって、環状化されたテンプレートから産生されるコンカテマーである。一部の実施形態では、ライブラリーは、少なくとも５ｋＤａ、少なくとも６ｋＤａ、少なくとも７ｋＤａ、少なくとも８ｋＤａ、少なくとも９ｋＤａ、少なくとも１０ｋＤａ、少なくとも１２ｋＤａ、または少なくとも１５ｋＤａの分子量の核酸分子、例えば、コンカテマーを含む。一部の実施形態では、ライブラリー内の核酸分子の分子量は、１５ｋＤａより大きくてもよい。一部の実施形態では、ライブラリーは、特定のサイズ範囲、例えば、５〜７ｋＤａ、５〜１０ｋＤａ、８〜１２ｋＤａ、１０〜１５ｋＤａ、もしくは１２〜１５ｋＤａ、もしくは５〜１０ｋＤａ、または任意の可能な部分範囲の範囲内にある核酸分子を含む。本発明の一部の態様による、核酸コンカテマーの生成に適した一部の方法が、大幅に異なる分子量の核酸分子の生成をもたらすが、核酸分子のそのような混合物は、所望のサイズ分布を得るためにサイズ分画することができる。所望のサイズの核酸分子の濃縮または所望のサイズの核酸分子の排除に適した方法は、当業者に周知であり、本発明は、この点において限定されない。
一部の実施形態では、部分的に無作為化された左ハーフサイト、部分的に無作為化された右ハーフサイト、および／または部分的に無作為化されたスペーサー配列を有する標的部位を含む候補核酸分子を含むライブラリーを提供する。一部の実施形態では、部分的に無作為化された左ハーフサイト、完全に無作為化されたスペーサー配列、および部分的に無作為化された右ハーフサイトを有する標的部位を含む候補核酸分子を含むライブラリーを提供する。一部の実施形態では、部分的に無作為化された部位は、二項分布的に、平均して５％超、１０％超、１５％超、２０％超、２５％超、または３０％超、コンセンサス部位と異なる。一部の実施形態では、部分的に無作為化された部位は、二項分布的に、平均して１０％以下、１５％以下、２０％以下、２５％以下、３０％以下、４０％以下、または５０％以下、コンセンサス部位と異なる。例えば、一部の実施形態では、部分的に無作為化された部位は、５％超であるが１０％以下；１０％超であるが２０％以下；２０％超であるが２５％以下；５％超であるが２０％以下等、コンセンサス部位と異なる。ライブラリー中の部分的に無作為化されたヌクレアーゼ標的部位の使用は、コンセンサス部位に密接に関連のある、例えば、１残基のみ、２残基のみ、３残基のみ、４残基のみ、または５残基のみコンセンサス部位と異なる標的部位を含むライブラリーメンバーの濃度を増加させるのに有用である。この背後にある理論的根拠は、所与のヌクレアーゼ、例えば所与のＺＦＮがその目的の標的部位および密接に関連する任意の標的部位を切断する可能性はあるが、目的の標的部位と大幅に異なるか完全に関連のない標的部位を切断する可能性は低いということである。したがって、部分的に無作為化された標的部位を含むライブラリーの使用は、所与の任意のヌクレアーゼに関する、いかなるオフターゲット切断事象の検出においても、感度を損なうことなく、完全に無作為化された標的部位を含むライブラリーの使用よりも効率がよくなり得る。したがって、部分的に無作為化されたライブラリーの使用は、所与のヌクレアーゼの実際上すべてのオフターゲット部位を包含する可能性が高いライブラリーを作製するのに必要なコストおよび負担を顕著に軽減する。しかしながら、一部の実施形態では、例えば、所与のヌクレアーゼの特異性を、所与のゲノム中の任意の可能な部位の文脈において評価しなければならない実施形態では、標的部位の完全に無作為化されたライブラリーを使用することが望ましい場合がある。
部位特異的ヌクレアーゼの選択および設計
本発明の一部の態様は、複雑なゲノムの文脈において、単一のユニークな部位の標的切断が可能である部位特異的ヌクレアーゼの選択および設計のための方法および戦略を提供する。一部の実施形態では、同じコンセンサス配列を切断するように設計されたかまたは切断することが公知である複数の候補ヌクレアーゼを準備するステップと、各候補ヌクレアーゼにより実際に切断された標的部位をプロファイリングし、それによりあらゆる切断されたオフターゲット部位（コンセンサス標的配列とは異なる標的部位）を検出するステップと、そのように同定された１つまたは複数のオフターゲット部位に基づいて候補ヌクレアーゼを選択するステップとを含む方法を提供する。一部の実施形態では、この方法は、一群の候補ヌクレアーゼ、例えば、コンセンサス標的部位を最高の特異性で切断するヌクレアーゼ、切断するオフターゲット部位の数が最少であるヌクレアーゼ、標的ゲノムの文脈において、切断するオフターゲット部位の数が最少であるヌクレアーゼ、またはコンセンサス標的部位以外の標的部位をまったく切断しないヌクレアーゼ、から最も特異的なヌクレアーゼを選択するために使用される。一部の実施形態では、この方法は、被験体のゲノムの文脈において、ヌクレアーゼの治療有効濃度以上の濃度で、いかなるオフターゲット部位も切断しないヌクレアーゼを選択するために使用される。
本明細書に提供する方法および試薬は、例えば、同じ目的標的部位を標的とする複数の異なるヌクレアーゼ、例えば、所与の部位特異的ヌクレアーゼ（例えば、所与のジンクフィンガーヌクレアーゼ）の複数の変異体を評価するために使用することができる。したがって、このような方法は、特異性が改善した新規の部位特異的ヌクレアーゼの展開または設計における選択ステップとして使用することができる。
ゲノム内のユニークなヌクレアーゼ標的部位の同定
本発明の一部の実施形態は、ゲノム内のヌクレアーゼ標的部位を選択するための方法を提供する。本明細書の他の箇所で詳細に記載するように、驚くべきことに、所与のヌクレアーゼにより切断されたオフターゲット部位が、通例、コンセンサス標的部位に高度に類似している、例えば、コンセンサス標的部位と、１ヌクレオチド残基のみ、２ヌクレオチド残基のみ、３ヌクレオチド残基のみ、４ヌクレオチド残基のみ、または５ヌクレオチド残基のみ異なることが発見された。この発見に基づいて、ゲノム内のヌクレアーゼ標的部位を選択して、この部位を標的とし、ゲノム内のいかなるオフターゲット標的部位も切断しないヌクレアーゼの可能性を増大させることができる。例えば、一部の実施形態では、候補ヌクレアーゼ標的部位を同定するステップと、候補ヌクレアーゼ標的部位をゲノム内の他の配列と比較するステップとを含む方法を提供する。候補ヌクレアーゼ標的部位をゲノム内の他の配列と比較するための方法は、当業者に周知であり、例えば、汎用コンピューター上でＢＬＡＳＴなどの配列アラインメントソフトウェアまたはアルゴリズムを使用する、配列アラインメント法などが挙げられる。次いで、配列比較の結果に基づいて、適切なユニークなヌクレアーゼ標的部位を選択することができる。一部の実施形態では、候補ヌクレアーゼ標的部位が、ゲノム内の他のいかなる配列とも、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、または少なくとも１０ヌクレオチド異なる場合、そのヌクレアーゼ標的部位は、ゲノム内のユニークな部位として選択され、一方、その部位がこの基準を満たさない場合、その部位は廃棄することができる。一部の実施形態では、上記に概説するように、配列比較に基づいていったん部位が選択されると、その選択部位を標的とする部位特異的ヌクレアーゼが設計される。例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼは、標的部位に結合するジンクフィンガーアレイを構築し、そのジンクフィンガーアレイにＤＮＡ切断ドメインをコンジュゲートすることにより、任意の選択された標的部位を標的とするように設計することができる。ＤＮＡ切断ドメインがＤＮＡを切断するために二量体形成する必要がある実施形態では、それぞれがヌクレアーゼのハーフサイトに結合し、それぞれが切断ドメインにコンジュゲートするジンクフィンガーアレイが設計される。一部の実施形態では、ヌクレアーゼの設計および／または作製は、組換え技術により行われる。適切な組換え技術は当業者に周知であり、本発明はこの点において限定されない。
一部の実施形態では、本発明の態様に従って設計または作製した部位特異的ヌクレアーゼを、単離および／または精製する。本発明の態様による部位特異的ヌクレアーゼを設計するための方法および戦略は、これらに限定されないが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ホーミングエンドヌクレアーゼ、有機化合物ヌクレアーゼ、エンジインヌクレアーゼ、抗生物質ヌクレアーゼ、およびジネミシン、ネオカルチノスタチン、カリチアマイシン、エスペラマイシン、ブレオマイシン、またはそれらの誘導体、変異体または誘導体を含む、任意の部位特異的ヌクレアーゼの設計または作製に適用することができる。
部位特異的ヌクレアーゼ
本発明の一部の態様は、本明細書に記載の方法および戦略を使用して設計される、特異性が向上した単離の部位特異的ヌクレアーゼを提供する。本発明の一部の実施形態は、そのようなヌクレアーゼをコードする核酸を提供する。本発明の一部の実施形態は、そのようなコード核酸を含む発現構築物を提供する。例えば、一部の実施形態では、ゲノム内の所望の標的部位を切断するように操作され、本明細書に提供する方法に従って、ヌクレアーゼがその目的の標的部位を切断するのに有効な濃度で、１未満、２未満、３未満、４未満、５未満、６未満、７未満、８未満、９未満、または１０未満のオフターゲット部位を切断すると評価された単離ヌクレアーゼを提供する。一部の実施形態では、ゲノム内の他のいかなる部位とも、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、または少なくとも１０ヌクレオチド残基、異なるように選択された所望のユニークな標的部位を切断するように操作された単離ヌクレアーゼを提供する。一部の実施形態では、単離ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）もしくは転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ホーミングエンドヌクレアーゼであるか、あるいは有機化合物ヌクレアーゼ、エンジイン、抗生物質ヌクレアーゼ、ジネミシン、ネオカルチノスタチン、カリチアマイシン、エスペラマイシン、ブレオマイシン、もしくはそれらの誘導体であるかまたはそれらを含む。一部の実施形態では、単離ヌクレアーゼは、疾患または障害に関連する対立遺伝子内のコンセンサス標的部位を切断する。一部の実施形態では、単離ヌクレアーゼは、その切断が疾患または障害の治療または予防をもたらすコンセンサス標的部位を切断する。一部の実施形態では、この疾患はＨＩＶ／ＡＩＤＳまたは増殖性疾患である。一部の実施形態では、対立遺伝子は、ＣＣＲ５（ＨＩＶ／ＡＩＤＳの治療用）またはＶＥＧＦＡ対立遺伝子（増殖性疾患の治療用）である。
一部の実施形態では、単離ヌクレアーゼは、医薬組成物の一部として提供される。例えば、一部の実施形態は、本明細書に提供するヌクレアーゼまたはそのようなヌクレアーゼをコードする核酸と、薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。医薬組成物は、場合によっては、１つまたは複数のさらなる治療上活性な物質を含むことができる。
一部の実施形態では、被験体、例えばヒト被験体に、その被験体内に標的ゲノム改変をもたらすために、本明細書に提供する組成物を投与する。一部の実施形態では、細胞を被験体から採取し、ヌクレアーゼまたはヌクレアーゼをコードする核酸とｅｘ ｖｉｖｏで接触させ、所望のゲノム改変が細胞にもたらされたか検出された後に、被験体に戻す。本明細書に提供する医薬組成物の説明は、ヒトへの投与に適した医薬組成物に主に向けられるが、そのような組成物は、一般に、あらゆる種類の動物への投与に適していることを、当業者ならば理解している。種々の動物への投与に適する組成物にするために、ヒトへの投与に適した医薬組成物を改変することは、十分理解されることであり、普通に熟練した獣医学の薬理学者は、もしあるとしても通常の実験作業のみでそのような改変を設計および／または実施することができる。医薬組成物の投与が企図される被験体としては、これらに限定されないが、ヒトおよび／または他の霊長類；哺乳動物、例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ネコ、イヌ、マウス、および／またはラットなどの商業的に価値のある哺乳動物；および／または鳥類、例えば、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、および／またはシチメンチョウなどの商業的に価値のある鳥類が挙げられる。
本明細書に記載する医薬組成物の製剤は、薬理学の技術分野で公知であるかまたは今後開発される任意の方法によって調製することできる。一般に、そのような調製方法は、活性成分を賦形剤および／または１つもしくは複数の副成分と一緒に合わせ、次いで、必要かつ／または所望ならば、所望の単回または複数回用量単位にその製品を成形および／または包装するステップを含む。
医薬製剤は、薬学的に許容される賦形剤をさらに含むことができ、賦形剤としては、本明細書で使用する場合、所望の特定の投与剤形に適する、すべての溶媒、分散媒、希釈剤、または他の液体ビヒクル、分散または懸濁の補助剤、界面活性剤、等張剤、増粘剤または乳化剤、防腐剤、固体結合剤、滑沢剤等が挙げられる。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ，２００６；参照により本明細書に組み込まれる）に、医薬組成物の製剤化において使用する種々の賦形剤および医薬組成物の調製のための公知の手法が開示されている。任意の従来の賦形剤媒体が、例えば、何らかの望ましくない生物学的作用をもたらすことによって、またはそうでなければ医薬組成物の他のいずれかの構成要素と有害性をもたらすように相互作用することによって、物質またはその誘導体と適合しない場合を除いて、その使用は、本発明の範囲内であることが企図される。
本発明のこれらおよび他の実施形態の機能および利点は、以下の実施例からより完全に理解されるであろう。以下の実施例は、本発明の利点を示し、特定の実施形態を説明することを意図するものであるが、本発明の全範囲を例示することを意図するものではない。したがって、実施例は本発明の範囲を限定することを意図するものではないことが理解されるであろう。
実施例
実施例１−ジンクフィンガーヌクレアーゼ
緒言
ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、所望の標的ＤＮＡ配列を認識し切断するように操作された酵素である。ＺＦＮ単量体は、非特異的なＦｏｋＩ制限エンドヌクレアーゼ切断ドメイン１と融合したジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインからなる。ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインは、ＤＮＡを切断するためには、二量体を形成して、２つのＤＮＡハーフサイトを架橋しなければならないため２、ＺＦＮは、二量体としてＤＮＡに結合する場合にのみ、可変長のスペーサー配列を挟む２つのユニークな配列を認識し、切断するように設計される。ＺＦＮは、非相同末端結合または相同組換えのいずれかを促進することにより、哺乳動物を含む種々の生物におけるゲノム工学のために使用されてきた３−９。強力な研究ツールの提供に加えて、ＺＦＮには、遺伝子治療剤としての能力もある。実際、２つのＺＦＮが最近臨床試験に入った：一つは、抗ＨＩＶ治療のアプローチ（ＮＣＴ００８４２６３４、ＮＣＴ０１０４４６５４、ＮＣＴ０１２５２６４１）の一部としてであり、もう一つは、抗癌治療（ＮＣＴ０１０８２９２６）として使用される細胞を改変するためのものである。
ＤＮＡ切断特異性はＺＦＮの重要な特徴である。操作されたジンクフィンガードメインの一部にある不完全な特異性は、細胞毒性に結びついており１０、したがって、ＺＦＮの特異性を決定することは、重大な関心事である。ＥＬＩＳＡアッセイ１１、マイクロアレイ１２、細菌ワンハイブリッドシステム１３、ＳＥＬＥＸおよびその変形１４−１６、Ｒｏｓｅｔｔａベースの計算予測１７はすべて、単離状態の単量体ジンクフィンガードメインのＤＮＡ結合特異性を特徴づけるために使用されている。しかしながら、ＺＦＮの毒性は、単に結合によるのではなく、ＤＮＡ切断に起因すると考えられる１８、１９。その結果、ジンクフィンガーヌクレアーゼの特異性に関する情報は、これまで、以下の証明されていない仮定に基づいていた、すなわち、（ｉ）二量体ジンクフィンガーヌクレアーゼは、単離の単量体ジンクフィンガードメインがＤＮＡに結合する場合と同じ配列特異性でＤＮＡを切断すること；および（ｉｉ）所与のＺＦＮにおいて、一方のジンクフィンガードメインの結合は、他方のジンクフィンガードメインの結合には影響を及ぼさないこと。単量体ジンクフィンガードメインのＤＮＡ結合特異性は、ゲノムにおける、二量体ＺＦＮの潜在的なオフターゲット切断部位を予測するために使用されているが６、２０、本発明者らが知る限りでは、これまでの研究では、活性な二量体ジンクフィンガーヌクレアーゼの幅広いＤＮＡ切断特異性を決定するための方法は報告されていない。
この研究において、本発明者らは、活性なＺＦＮのＤＮＡ切断特異性を幅広く検討するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ選択法を提示する。本発明者らの選択は、１０１１の潜在的な標的部位のそれぞれを切断する能力について、２つの真正ヘテロ二量体のＺＦＮ、すなわち、現在臨床試験（ＮＣＴ００８４２６３４、ＮＣＴ０１０４４６５４、ＮＣＴ０１２５２６４１）中のＣＣＲ５−２２４６およびヒトＶＥＧＦ−Ａプロモーターを標的とするＶＦ２４６８４を評価するためのハイスループットＤＮＡシークエンシング手法と結びついている。本発明者らは、ＣＣＲ５−２２４によりｉｎ ｖｉｔｒｏで切断され得る、ヒトゲノム中に存在する３７個の部位、ＶＦ２４６８によりｉｎ ｖｉｔｒｏで切断され得る、ヒトゲノム中の２，６５２個の部位、およびヒトゲノム中に存在しない、両ＺＦＮがｉｎ ｖｉｔｒｏで切断可能な数十万の部位を同定した。本発明者らのｉｎ ｖｉｔｒｏ選択により同定された部位が、細胞においてもＺＦＮにより切断され得ることを実証するために、本発明者らは、ＣＣＲ５−２２４またはＶＦ２４６８のＺＦＮを発現する培養ヒトＫ５６２細胞における、ＺＦＮ誘導の突然変異誘発を証明するために、それぞれ３４個または９０個の部位を検討した。試験したＣＣＲ５−２２４部位のうちの１０個、ＶＦ２４６８部位のうちの３２個が、ヒト細胞において、ＺＦＮ媒介の切断と一致するＤＮＡ配列の変化を示した。ただし、本発明者らは、切断は、細胞型およびＺＦＮ濃度に依存するであろうと予想する。１つのＣＣＲ５−２２４オフターゲット部位が悪性腫瘍に関連するＢＴＢＤ１０遺伝子のプロモーターに存在する。
単量体ジンクフィンガードメイン単独の結合特異性の決定によっては得ることができなかったであろう本発明者らの結果は、過剰なＤＮＡ結合エネルギーが、オフターゲットＺＦＮ切断活性の増加をもたらすことを示し、結合特異性が低下したＺＦＮを設計することにより、ＺＦＮ発現レベルを低下させることにより、またゲノムにおいて、最も近縁な配列と少なくとも３塩基対異なる標的部位を選ぶことによりＺＦＮ特異性が向上する可能性があることを示唆する。
結果
ＺＦＮ媒介のＤＮＡ切断に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ選択
潜在的な切断部位のライブラリーを、合成プライマーおよびＰＣＲを使用して二本鎖ＤＮＡとして調製した（図５）。プライマー中の部分的に無作為化された位置はそれぞれ、７９％の野生型ホスホラミダイトと、他の３つのホスホラミダイトすべての等量混合物との混合物を組み込むことにより合成した。したがって、ライブラリーの配列は、二項分布的に、平均して２１％が、正規のＺＦＮ切断部位と異なった。平滑連結反応の戦略を使用して、１０１２メンバーの小環状ライブラリーを作製した。ローリングサークル増幅を使用して、このライブラリーの１０１１超のメンバーを増幅すると共に、連結して高分子量（１２ｋｂ超）ＤＮＡ分子にした。理論上、このライブラリーは、野生型標的配列から７つ以下の突然変異があるＤＮＡ配列をすべて、少なくとも１０倍過剰量で包含する。
ＣＣＲ５−２２４またはＶＦ２４６８のＤＮＡ切断部位ライブラリーを１４ｎＭの全切断部位濃度で、０．５ｎＭ〜４ｎＭの範囲の２倍希釈系列のｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳の粗ＣＣＲ５−２２４またはＶＦ２４６８とインキュベートした（図６）。消化後、得られたＤＮＡ分子（図７）を、ＤＮＡ切断に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ選択およびその後の対末端ハイスループットＤＮＡシークエンシングに供した。手短に言えば、３つの選択ステップ（図１）によって、切断されなかった配列から切断された配列を分離できるようになった。第１に、切断された部位のみが、シークエンシングに必要となるアダプターの連結に必要な５’リン酸を含有した。第２に、ＰＣＲの後、ゲル精製ステップにより、切断されたライブラリーメンバーが濃縮された。最後に、標的部位コンカテマー切断のホールマークである両末端上の充填された相補的５’オーバーハングを有する、考慮すべき配列のみをシークエンシングした後、計算フィルターを適用した（図２およびプロトコール１〜９）。ライブラリー配列に隣接したＰｖｕＩ制限ヌクレアーゼ認識部位でライブラリーを切断し、ＺＦＮ消化のライブラリー配列と同じプロトコールに消化産物を供することによって、シークエンシングのためのプレ選択ライブラリー配列を準備した。ハイスループットシークエンシングにより、ローリングサークルで増幅したプレ選択ライブラリーが予想される突然変異分布を含有することが確認された（図８）。
ＺＦＮ媒介のＤＮＡ切断に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ選択の設計
活性ＺＦＮのＤＮＡ切断特異性を包括的に特徴づけるために、ノイズを増幅しバイアスを導入する可能性のある反復濃縮ステップを必要とすることなく、１ステップでＤＮＡ切断に対して選択することができる、潜在的なＤＮＡ基質の大規模なライブラリーを最初に作製した。ライブラリー中の各分子が１０１１超の潜在的な基質配列のうちの１つのコンカテマーであるように、基質ライブラリーを設計した（図５）。ＺＦＮとのインキュベーションにより、切断されない分子、１回切断された分子、および少なくとも２回切断された分子が得られる。少なくとも２回切断された分子には、切断されたＤＮＡ配列の各半分からなる末端がある（図１）。切断されたライブラリーメンバーは、３つの方法で、切断されないライブラリーメンバーに対して濃縮される（図１）。第１に、２回切断された配列には、２つの相補的５’オーバーハングがあり、これらは、本物の切断産物のホールマークとして、ＤＮＡシークエンシング後に計算的に同定することができる。第２に、ＺＦＮ媒介の切断により、プレ選択ライブラリー中に存在しない５’リン酸が現れるので、切断を受けたＤＮＡのみにシークエンシングアダプター連結反応が可能である。第３に、シークエンシングアダプターに相補的なプライマーを使用するＰＣＲの後に、ゲル精製ステップにより、配列決定される材料すべてが、２つの隣接した部位で切断されたライブラリーメンバーと一致する長さであることが保証される。このゲル精製材料は、イルミナ法を使用するハイスループットＤＮＡシークエンシングに供される（Ｂｅｎｔｌｅｙ，Ｄ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．Ａｃｃｕｒａｔｅ ｗｈｏｌｅ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｎａｔｕｒｅ ４５６，５３−９（２００８））。理想的には、ＺＦＮ切断選択に使用されるライブラリーは、ＺＦＮにより認識される長さのあらゆる可能なＤＮＡ配列からなるであろう。しかしながら、そのようなライブラリーの１０５メンバーごとに１つのメンバーのみが、２４塩基対の認識配列のうち突然変異が７つ以内である配列を含有するであろう。オフターゲット認識配列は標的認識部位に類似している可能性が極めて高いため、その代わりとして、野生型認識配列と最大７つの突然変異だけ異なるハーフサイト配列をすべて１０倍超で含有するバイアスのかかったライブラリーを使用した。ライブラリーメンバーは、認識部位の５’末端に隣接した完全に無作為化された塩基対、４−、５−、６−、または７−ｂｐの完全に無作為化されたスペーサーを挟む２つの部分的に無作為化されたハーフサイト、および認識部位の３’末端に隣接した、別の完全に無作為化された塩基対からなる。完全に無作為化された５塩基対タグが、各ライブラリーメンバーに続く。このタグは、無作為化された隣接塩基対および無作為化されたスペーサー配列と共に、各ライブラリーメンバーに対するユニークな識別子「キー」として使用した。このユニークなキーが同一のライブラリーメンバーを含有する２つ以上の配列リードと関連する場合、これらの重複したシークエンシングリードは、ＰＣＲ増幅の間に生じたと考えられ、したがって、１つのデータポイントとして処理される。
ＤＮＡ切断選択を使用する、ＣＣＲ５−２２４およびＶＦ２４６８のＺＦＮに関する分析
配列対の各メンバーは、スペーサーの断片、全ハーフサイト、隣接したヌクレオチド、および一定配列から構成された。スペーサーの一方の末端は、通例、一方の配列に見出され、他方の末端は、その対応する対配列に見出されるが、アダプターの連結前に伸長によってオーバーハングが平滑化されるので、オーバーハング配列は両方の対配列のリードの中に存在する。スペーサー配列は、共有のオーバーハング配列を最初に同定し、次いで、オーバーハング配列とハーフサイト配列との間に存在するすべてのヌクレオチドを同定することにより再構築した。曖昧さのないヌクレオチドおよび少なくとも４ヌクレオチドのオーバーハングを含有する配列のみを分析した。全体として、同一のライブラリーメンバー上の２つの切断事象に由来するユニーク配列に対する計算スクリーニングから、切断されたライブラリーメンバーのリードを合計２００万取得した（表２）。０．５ｎＭ、１ｎＭ、および２ｎＭのＣＣＲ５−２２４およびＶＦ２４６８の選択について分析された配列は、上記のユニークな識別子キーの使用により同定されたが、数多くの配列反復のために、４ｎＭの選択と比較してはるかに少ない。反復配列が除去される前における、０．５ｎＭ、１ｎＭ、および２ｎＭの選択における、大量の反復配列の存在は、それらの選択で得られたシークエンシングリードの数が、すべての実験的選択ステップで残存した個々のＤＮＡ配列の数よりも大きいことを示す。すべての対のリードにおける一定ヌクレオチドの分析によって、シークエンシングのエラー率をヌクレオチド当たり０．０８６％と推定した。このエラー率を使用して、ポスト選択のＺＦＮ標的部位配列の９８％はエラーを含有しないと推定した。
オフターゲット切断は、ＺＦＮ濃度に依存する
予想されるように、ライブラリーメンバーのサブセットのみが各酵素により切断された。ＣＣＲ５−２２４およびＶＦ２４６８に対するプレ選択ライブラリーはそれぞれ、完全な標的部位（２つのハーフサイト）当たり平均４．５６および３．４５の突然変異を含有したが、使用した最高濃度のＺＦＮ（４ｎＭのＣＣＲ５−２２４および４ｎＭのＶＦ２４６８）に曝露されたポスト選択ライブラリーはそれぞれ、標的部位当たり平均２．７９および１．５３の突然変異を有した（図８）。ＺＦＮ濃度が低下するにつれて、両方のＺＦＮのオフターゲット配列に対する許容性が低下した。最低濃度（０．５ｎＭのＣＣＲ５−２２４および０．５ｎＭのＶＦ２４６８）において、切断された部位はそれぞれ、平均１．８４および１．１０の突然変異を含有した。新しいＤＮＡの文脈において、同定された部位の小規模なサブセットを設けて、２ｎＭのＣＣＲ５−２２４または１ｎＭのＶＦ２４６８と、３７℃で４時間、ｉｎ ｖｉｔｒｏでインキュベートした（図９）。試験した部位すべてについて切断が観察され、よりストリンジェントな（低いＺＦＮ濃度）選択から得られた部位は、低ストリンジェントな選択に由来する部位よりも効率的に切断された。試験した配列はすべて、幾つかの突然変異を含有するが、配列の中には、設計された標的よりも効率的にｉｎ ｖｉｔｒｏで切断されるものがあったことに留意されたい。
二量体ＣＣＲ５−２２４ ＺＦＮのＤＮＡ切断特異性プロファイル（図２ａおよび図１０ａ、ｂ）は、ＳＥＬＥＸにより以前に決定されたＣＣＲ５−２２４単量体のＤＮＡ結合特異性プロファイル６と顕著に異なっていた。例えば、ＳＥＬＥＸ研究によって予測されなかった、（＋）Ａ５および（＋）Ｔ９などの一部の位置が、本発明者らの切断選択においては、オフターゲット塩基対に対する許容性を示した。ＶＦ２４６８は、ＤＮＡ結合特異性に関してもＤＮＡ切断特異性に関しても以前に特徴づけがなされていないが、限定的な配列選択性を示す２つの位置、（−）Ｃ５および（＋）Ａ９を示し、これらの位置がＺＦＮにより認識されにくいことが示唆された（図２ｂおよび図１０ｃ、ｄ）。
ハーフサイト間の補償はＤＮＡ認識に影響を及ぼす
本発明者らの結果は、一方のハーフサイト中に突然変異を含むＺＦＮ基質は、プレ選択ライブラリーに比較して、同じハーフサイト中の近傍の位置にさらなる突然変異を有する可能性が高く、他方のハーフサイト中にさらなる突然変異を有する可能性が低いことを示す。この効果は、最も強力に認識される塩基対が変異した場合に最大であることが見出されたが（図１１）、ＣＣＲ５およびＶＥＧＦターゲティングＺＦＮの両方に対する指定のハーフサイト位置すべてについてこの補償現象が観察された（図３および図１２）。ＶＦ２４６８標的部位位置（＋）Ｇ１、（−）Ｇ１、（−）Ａ２、および（−）Ｃ３などの切断部位の少数派となるヌクレオチドの場合は、変異により、他方のハーフサイト中の塩基対における突然変異許容性が低下し、また、同じハーフサイトにおける突然変異許容性も、増大ではなくわずかに低下した。これらの突然変異のうちの２つ、（＋）Ｇ１および（−）Ｇ１が同時に実行された場合は、他のすべての位置での突然変異許容性が低下した（図１３）。まとめると、これらの結果から、一方のハーフサイトの突然変異許容性が他方のハーフサイトにおけるＤＮＡ認識によって影響を受けることがわかる。
ＺＦＮ部位認識についてのこの補償モデルは、理想的でないハーフサイトのみならず、理想的でない長さのスペーサーにも当てはまる。一般に、ＺＦＮはスペーサー内の特定の位置で切断し（図１４）、５および６塩基対のスペーサーが４および７塩基対のスペーサーよりも好まれる（図１５および１６）。しかしながら、５または６塩基対のスペーサーの切断部位は、４または７塩基対のスペーサーの部位よりも、隣接するハーフサイトの配列許容性が大きいことを示す（図１７）。したがって、スペーサーの不完全性により、ハーフサイトの突然変異と同様に、ＤＮＡ基質の他の領域のｉｎ ｖｉｔｒｏ認識がよりストリンジェントになる。
ＺＦＮは、最大３つの突然変異を含む多くの配列を切断することができる
ポスト選択ライブラリー中の各配列の出現頻度をプレ選択ライブラリー中のその出現頻度で割ることにより、３つ以下の突然変異を含有する配列すべてについて濃縮係数を算出した。切断により濃縮された配列（濃縮係数＞１）の中で、ＣＣＲ５−２２４は、すべてのユニークな単一突然変異配列、すべてのユニークな二重突然変異配列の９３％、およびすべての可能な三重突然変異配列の半分を、使用した最高酵素濃度で切断することができた（図４ａおよび表３ａ）。ＶＦ２４６８は、すべてのユニークな単一突然変異配列の９８％、すべてのユニークな二重突然変異配列の半分、およびすべての三重突然変異配列の１７％を切断することができた（図４ｂおよび表３ｂ）。
本発明者らの手法では、活性なＺＦＮ二量体をアッセイするので、切断され得るＺＦＮ部位の完全な配列が示される。スペーサーの配列を無視すると、選択により、ＣＣＲ５−２２４によりｉｎ ｖｉｔｒｏで切断され得る５または６塩基対のスペーサーを有する、ヒトゲノム中の３７部位（表１および表４）、およびＶＦ２４６８により切断され得る、ヒトゲノム中の２，６５２部位（ＶＦ２４６８のデータ）が明らかになった。ＶＦ２４６８によりｉｎ ｖｉｔｒｏで切断されるゲノム部位の中で、１，４２８部位は、正規の標的部位（スペーサー配列を除く）に対して３つ以下の突然変異を有していた。ＣＣＲ５−２２４に比較して、ＶＦ２４６８による、単一、二重、および三重突然変異配列に対する大きな識別力にもかかわらず（図４および表３）、ｉｎ ｖｉｔｒｏで切断可能なＶＦ２４６８部位の数が多いことは、ＶＦ２４６８標的部位（３，４５０部位）と３つ以下の突然変異だけ異なる、ヒトゲノム中の部位の数と、ＣＣＲ５−２２４標的部位（８部位）と３つ以下の突然変異だけ異なる、ヒトゲノム中の部位の数との差を反映している（表５）。
同定された部位は、ヒト細胞においてＺＦＮにより切断される
Ｋ５６２細胞においてＣＣＲ５−２２４を発現させることにより、そしてＺＦＮ誘導の突然変異を証明するために、ＰＣＲおよびハイスループットＤＮＡシークエンシングを使用して、ヒトゲノム内の３４個の潜在的な標的部位を調べることにより、ヒト細胞において、選択により同定された部位でＣＣＲ５−２２４が切断することができるか否かを試験した。空ベクターを含有する対照細胞と比較して、活性なＣＣＲ５−２２４を発現する細胞において有意（Ｐ＜０．０５）に濃縮された、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）修復に特徴的な挿入または欠失突然変異（インデル）を有する部位を（表６）、ＺＦＮ媒介の切断の証拠となる部位と定義した。分析する各部位について、約１００，０００配列以上を取得し、これによって、１０，０００中に約１の頻度で有意に改変された部位の検出が可能になった。分析により、１０のそのような部位が同定された、すなわち、ＣＣＲ５における目的の標的配列、ＣＣＲ２において以前に同定された配列、および８つのオフターゲット配列（表１、４、および６）、そのうちの１つはＢＴＢＤ１０遺伝子のプロモーター内に位置する。８つの新たに同定されたオフターゲット部位は、１／３００〜１／５，３００の頻度で改変されている。さらに、培養Ｋ５６２細胞においてＶＦ２４６８を発現させ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ選択により同定された、９０の最も高度に切断された部位について上記の分析を実施した。分析された９０のＶＦ２４６８部位のうち３２が、Ｋ５６２細胞において、ＺＦＮ媒介ターゲティングと一致するインデルを示した（表７）。３つのＣＣＲ５−２２４部位および７つのＶＦ２４６８部位について、部位特異的ＰＣＲ増幅を得ることができなかったため、それらの遺伝子座でのＮＨＥＪの発生を分析することができなかった。まとめると、これらの観察から、ｉｎ ｖｉｔｒｏ選択法により同定されたオフターゲット配列には、ヒト細胞において、ＺＦＮにより切断され得る多くのＤＮＡ配列が含まれることがわかる。
考察
ここに提示した方法により、ヒト細胞のゲノム中に存在し、かつ切断され得る多くの配列を含めて、２つの活性な二量体ＺＦＮにより切断され得る数十万の配列が同定された。ＣＣＲ５−２２４ ＺＦＮについて新たに同定された切断部位の１つは、ＢＴＢＤ１０遺伝子のプロモーター内にある。ダウンレギュレートされると、ＢＴＢＤ１０は、悪性腫瘍２１および膵臓β細胞のアポトーシス２２と関連した。アップレギュレートされると、ＢＴＢＤ１０は、Ａｋｔファミリータンパク質２２、２３のリン酸化を介して、神経細胞の増殖２３および膵臓β細胞の増殖を促進することが示された。この潜在的に重要なオフターゲット切断部位および本発明者らが細胞において観察した７つの他の部位は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ単量体結合データを使用して、潜在的なＣＣＲ５−２２４基質を予測する最近の研究６では同定されなかった。
本発明者らは、１つの細胞株において複数部位で切断することができるＺＦＮが、おそらくはクロマチン構造の局所的な相違により、異なる細胞株４で必ずしも機能することができるとは限らないことを以前示した。したがって、ＣＣＲ５−２２４またはＶＦ２４６８が異なる細胞株で発現された場合、ｉｎ ｖｉｔｒｏで切断可能なオフターゲット部位の異なるサブセットが、それらにより改変される可能性がある。ホーミングエンドヌクレアーゼオフターゲット切断２４に関する最近の研究など、エンドヌクレアーゼ特異性に関する純粋に細胞レベルの研究も、同様に細胞株の選択により影響を受けることがある。本発明者らのｉｎ ｖｉｔｒｏの方法は、細胞内ＤＮＡのいくつかの特徴を考慮しないが、この方法は、目的の細胞型で実施されるその後の研究に伝えることができる、エンドヌクレアーゼ特異性およびオフターゲット部位に関する、細胞型に依存しない一般的な情報を提供する。加えて、本発明者らのプレ選択ライブラリーは、目的のＺＦＮ標的部位の突然変異が７つ以内のすべての配列を少なくとも１０倍のカバレッジでオーバーサンプリングしているが、選択当たり得られる配列リードの数（約１００万）は、ポスト選択ライブラリー中に存在するすべての切断配列をカバーするには不十分であるように思われる。したがって、シークエンシング性能の改善が続いているので、ＣＣＲ５−２２４およびＶＦ２４６８についてのさらなるオフターゲット切断部位が、ヒトゲノムにおいて同定され得る可能性がある。
本発明者らが分析したＺＦＮは両方とも、ヒトゲノム中のユニーク配列に対して操作されたが、両方とも細胞中の相当数のオフターゲット部位を切断する。この結果は、４フィンガーＣＣＲ５−２２４対の理論上の特異性が、３フィンガーＶＦ２４６８対よりも４，０９６倍優れていることを考えると、４フィンガーＣＣＲ５−２２４対については、特に驚くべきことである（ＣＣＲ５−２２４は、１８塩基対のＶＦ２４６８部位よりも６塩基対長い２４塩基対の部位を認識するはずである）。ＣＣＲ５−２２４およびＶＦ２４６８の切断プロファイル（図２）ならびに３つ以下の突然変異を含む配列の突然変異許容性（図４）を検討すると、オフターゲット切断活性が低下した、これらのＺＦＮの変異体を操作するための異なる戦略が必要となり得ることが示唆される。４フィンガーＣＣＲ５−２２４ ＺＦＮは、３フィンガーＶＦ２４６８ ＺＮＦよりも、広範囲の位置で特異性が緩和しており、かつ３つ以下の突然変異を含む突然変異配列に高い許容性を示した。ＶＦ２４６８の場合は、フィンガーのサブセットのみの再最適化により、望ましくない切断事象の実質的な減少を可能することができる。これに対して、ＣＣＲ５−２２４の場合は、フィンガーの多くまたはすべての広範囲な再最適化が、オフターゲット切断事象を除去するために必要となる可能性がある。
４フィンガーおよび３フィンガーのすべてのＺＦＮが、この研究で試験した２つのＺＦＮほど特異的であるとは必ずしも限らないことに留意する。ＣＣＲ５−２２４およびＶＦ２４６８は両方とも、ＺＦＮの結合活性を最適化するように設計する方法を使用して操作された。以前の研究から、３フィンガーおよび４フィンガーの両方のＺＦＮの場合、ＺＦＮ対を操作するために使用する具体的な方法が、ヌクレアーゼの品質および特異性に多大な影響を及ぼし得ることがわかっている７、１３、２５、２６。
本発明者らの発見は、特異性が向上したＺＦＮの設計および適用にとって重要な意味をもつ。１つまたは２つの部位に突然変異を有するすべての潜在的な基質の半分以上がＺＦＮにより切断される可能性があり、このことは、ＺＦＮとＤＮＡ基質との間の結合親和性が、突然変異した位置での分子相互作用が最適以下の場合でも切断を起こすのに十分高いことを示唆する。本発明者らはまた、一方のハーフサイト中に突然変異を有する部位を提示されたＺＦＮは、突然変異したハーフサイト内の他の部位でのより高い突然変異許容性および他方のハーフサイトの位置でのより低い許容性を示すことを観察した。これらの結果をまとめると、切断のための最小の親和性閾値を満たすためには、オフターゲット塩基対を包含するハーフサイトからの結合エネルギーの不足が、別のハーフサイトにおける過剰なジンクフィンガー：ＤＮＡ結合エネルギーによってエネルギー的に補償されなければならず、これには、変異していないハーフサイトでの配列認識ストリンジェンシーの増大が要求される（図Ｓ１８）。逆に、変異したハーフサイトの他の位置でのストリンジェンシーの緩和は、全体のＺＦＮ結合エネルギーへの変異したハーフサイトの寄与が低下したことにより説明することができる。この仮説は、ＺＦＮにおけるジンクフィンガーの数が減少すると、実際には、活性が低下するよりもむしろ増大することを示す最近の研究によって支持される２７。
このモデルはまた、おそらくＺＦＮによりそれほど有利に結合されない、スペーサーの長さが最適以下の部位が、スペーサーの長さが最適な部位よりも高いストリンジェンシーで認識されたという本発明者らの観察を説明する。ｉｎ ｖｉｔｒｏでのスペーサー選択性は、必ずしも細胞でのスペーサー選択性を反映するものではない２８、２９；しかしながら、本発明者らの結果は、二量体のＦｏｋＩ切断ドメインがＺＦＮ標的部位認識に影響を及ぼすことができることを示唆する。このモデルと一致して、Ｗｏｌｆｅおよび共同研究者は、ジンクフィンガードメインは同じであるが、ＦｏｋＩドメイン変異体が異なる２つのＺＦＮにおける、ゼブラフィッシュでのオフターゲット事象の頻度の差を最近観察した２０。
まとめると、本発明者らの発見は、以下のことを示唆する、すなわち、（ｉ）ＺＦＮの特異性は、過剰なＤＮＡ結合エネルギーを有するＺＦＮの設計を回避することにより、向上させることができること；（ｉｉ）オフターゲット切断は、突然変異が３つ以内の類縁部位をゲノム中に有さない標的部位に対して、ＺＦＮを設計することにより、最小化することができること；および（ｉｉｉ）ＺＦＮは、標的配列を所望の程度に切断するのに必要な最低濃度で使用されるべきであること。この研究はＺＦＮに焦点を合わせたが、本発明者らの方法は、操作されたホーミングエンドヌクレアーゼおよび操作された転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）ヌクレアーゼを含む、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＤＮＡを切断する配列特異的エンドヌクレアーゼすべてに適用可能である。この手法は、配列特異的エンドヌクレアーゼのためにゲノム中の標的部位を選ぶ場合、および特に治療用途のためにこれらの酵素を操作する場合、重要な情報を提供することができる。
方法
オリゴヌクレオチドおよび配列。オリゴヌクレオチドはすべて、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓまたはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入したものであり、表８に収載する。縮重した位置を有するプライマーは、指定の塩基を７９％および他の標準ＤＮＡ塩基のそれぞれを７％含有する、手動で混合したホスホラミダイトを使用して、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓにより合成された。
この研究で使用したＺＦＮの配列。この研究で使用したＺＦＮについてのＤＮＡおよびタンパク質の配列を示す。Ｔ７プロモーターに下線を付し、開始コドンを太字で示す。
ライブラリーの構築。標的部位のライブラリーを、プライマーの「Ｎ５−ＰｖｕＩ」および「ＣＣＲ５−２２４−Ｎ４」、「ＣＣＲ５−２２４−Ｎ５」、「ＣＣＲ５−２２４−Ｎ６」、「ＣＣＲ５−２２４−Ｎ７」、「ＶＦ２４６８−Ｎ４」、「ＶＦ２４６８−Ｎ５」、「ＶＦ２４６８−Ｎ６」、または「ＶＦ２４６８−Ｎ７」を用い、ｐＵＣ１９開始テンプレート上でのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）によるＰＣＲによって、二本鎖ＤＮＡに組み込み、ライブラリー配列に隣接してＰｖｕＩ制限部位を含む約５４５ｂｐの産物を生じさせ、Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲ精製キットで精製した。
ライブラリーをコードするオリゴヌクレオチドは、５’骨格−ＰｖｕＩ部位−ＮＮＮＮＮＮ−部分的に無作為化されたハーフサイト−Ｎ４−７−部分的に無作為化されたハーフサイト−Ｎ−骨格３’の形態にした。精製したオリゴヌクレオチド混合物（約１０μｇ）を平滑化し、１×ＮＥＢＮｅｘｔ末端修復反応緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭ ＡＴＰ、０．４ｍＭ ｄＡＴＰ、０．４ｍＭ ｄＣＴＰ、０．４ｍＭ ｄＧＴＰ、０．４ｍＭ ｄＴＴＰ、ｐＨ７．５）中の５０単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼと１５単位のＴ４ ＤＮＡポリメラーゼとの混合物を用いて、室温で１．５時間リン酸化した。平滑末端を有しリン酸化されたＤＮＡを、製造業者のプロトコールに従ってＱｉａｇｅｎ ＰＣＲ精製キットにより精製し、ＮＥＢ Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭ ＡＴＰ、ｐＨ７．５）中で１０ｎｇ／μＬに希釈し、２００単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）による、室温で１５．５時間の連結反応により環状化した。環状単量体を、１％のＴＡＥ−アガロースゲル上でゲル精製した。７０ｎｇの環状単量体を、Ｉｌｌｕｓｔｒａ ＴｅｍｐｌｉＰｈｉ １００増幅キット（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、１００μＬの反応液中にて、３０℃で２０時間、ローリングサークル増幅の基質として使用した。反応を６５℃で１０分間のインキュベーションにより停止させた。標的部位ライブラリーは、Ｑｕａｎｔ−ｉＴ ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ ｄｓＤＮＡ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により定量した。部分的に無作為化されたハーフサイト間にＮ４、Ｎ５、Ｎ６、およびＮ７のスペーサー配列を含むライブラリーを、ＣＣＲ５−２２４およびＶＦ２４６８の両方のために、等モル濃度でプールした。
ジンクフィンガーヌクレアーゼの発現および特徴づけ。ＣＣＲ５−２２４およびＶＦ２４６８のための３×ＦＬＡＧタグ付きジンクフィンガータンパク質を、ｐＭＬＭ２９０およびｐＭＬＭ２９２に由来する哺乳動物発現ベクター４中の、ＦｏｋＩ真正ヘテロ二量体への融合物として発現させた。ＤＮＡおよびタンパク質の配列は、本明細書の他の箇所に示す。完全なベクター配列は、要請により入手可能である。ＺＦＮをコードするベクター２μｇを、ＴＮＴ Ｑｕｉｃｋ Ｃｏｕｐｌｅｄウサギ網状赤血球システム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写および翻訳した。塩化亜鉛（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を５００μＭで加え、転写／翻訳反応を３０℃で２時間実施した。グリセロールを５０％の最終濃度まで加えた。ウエスタンブロットを用い、抗ＦＬＡＧ Ｍ２モノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用してタンパク質を視覚化した。ＺＦＮ濃度は、ウエスタンブロットを行い、Ｎ末端ＦＬＡＧタグ付き細菌アルカリホスファターゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の標準曲線と比較することにより決定した。
ＣＣＲ５−２２４およびＶＦ２４６８に対する試験基質は、ｐＵＣ１９のＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩ部位にクローニングすることにより構築した。プライマーの「ｔｅｓｔ ｆｗｄ」および「ｔｅｓｔ ｒｅｖ」ならびにＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを用いるＰＣＲにより、適切なＺＦＮによりサイズが約３００ｂｐおよび約７００ｂｐの２つの断片に切断され得る、１ｋｂの線状ＤＮＡが得られた。ジンクフィンガーヌクレアーゼに対する活性プロファイルは、Ｍｉｌｌｅｒら３０およびＣｒａｄｉｃｋら３１が使用したｉｎ ｖｉｔｒｏ切断プロトコールを改変して取得した。１ｋｂの線状ＤＮＡ１μｇを、１×ＮＥＢｕｆｆｅｒ ４（５０ｍＭ酢酸カリウム、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−酢酸、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、１ｍＭジチオスレイトール、ｐＨ７．９）中で、種々の濃度のＺＦＮにより３７℃で４時間消化した。ＲＮアーゼＡ（Ｑｉａｇｅｎ）１００μｇを、室温で１０分間反応物に加えて、精製およびゲル分析を妨害する可能性のあるＲＮＡをｉｎ ｖｉｔｒｏの転写／翻訳混合物から除去した。反応物をＱｉａｇｅｎ ＰＣＲ精製キットにより精製し、１％のＴＡＥアガロースゲルで分析した。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ選択。種々の濃度のＺＦＮ、タンパク質をコードするＤＮＡテンプレートをまったく含まない、使用したＺＦＮの最大濃度に等しい量のＴＮＴ反応混合物（「溶解物」）、または５０単位のＰｖｕＩ（ＮＥＢ）を、１×ＮＥＢｕｆｆｅｒ ４（５０ｍＭ酢酸カリウム、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−酢酸、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、１ｍＭジチオスレイトール、ｐＨ７．９）中で、３７℃で４時間、ローリングサークル増幅ライブラリー１μｇとインキュベートした。ＲＮアーゼＡ（Ｑｉａｇｅｎ）１００μｇを、室温で１０分間反応物に加えて、精製およびゲル分析を妨害する可能性のあるＲＮＡをｉｎ ｖｉｔｒｏの転写／翻訳混合物から除去した。反応物をＱｉａｇｅｎ ＰＣＲ精製キットにより精製した。反応混合物の１／１０を、１％のＴＡＥアガロースゲル上でのゲル電気泳動およびＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ核酸ゲル染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）による染色によって視覚化した。
精製したＤＮＡを、室温で３０分間、５００μＭ ｄＮＴＰ混合物（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を含有する１×ＮＥＢｕｆｆｅｒ ２（５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭジチオスレイトール、ｐＨ７．９）中で、５単位のＤＮＡポリマラーゼＩ、ラージ（Ｋｌｅｎｏｗ）フラグメント（ＮＥＢ）により平滑化した。反応混合物をＱｉａｇｅｎ ＰＣＲ精製キットにより精製し、最終容量５０μＬにて、２４０μＭ ｄＡＴＰ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を含有する１×ＮＥＢｕｆｆｅｒ ２（５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭジチオスレイトール、ｐＨ７．９）中で、３７℃で３０分間、５単位のＫｌｅｎｏｗフラグメント（３’ｅｘｏ−）（ＮＥＢ）とインキュベートした。１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．５を９０μＬ容量まで加え、反応物を７５℃で２０分間インキュベートして、酵素を不活性化した後、１２℃に冷却した。酵素濃度に従ってバーコードが付けられた、３００ｆｍｏｌの「アダプター１／２」またはＰｖｕＩ消化のための６ｐｍｏｌの「アダプター１／２」を、１０×ＮＥＢ Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ反応緩衝液（５００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭ ＭｇＣｌ２、１００ｍＭジチオスレイトール、１０ｍＭ ＡＴＰ）１０ｕｌと共に、反応混合物に加えた。アダプターを、室温で１７．５時間、４００単位のＴ４ＤＮＡリガーゼにより平滑ＤＮＡ末端上に連結し、連結したＤＮＡを、Ｉｌｌｕｓｔｒａ Ｍｉｃｒｏｓｐｉｎ Ｓ−４００ ＨＲセファクリルカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて精製し、連結していないアダプターを除去した。アダプターが連結したＤＮＡを、２単位のＰｈｕｓｉｏｎ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＩＩ ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）ならびにそれぞれ１０ｐｍｏｌのプライマー「ＰＥ１」および「ＰＥ２」を用いて、３％ＤＭＳＯおよび１．７ｍＭ ＭｇＣｌ２を添加した１×Ｐｈｕｓｉｏｎ ＧＣ緩衝液中で増幅した。ＰＣＲ条件は、９８℃で３分間に続く、９８℃で１５秒間、６０℃で１５秒間、および７２℃で１５秒間のサイクル、および７２℃での最終的な５分間伸長とした。ＰＣＲは、ゲル上で産物を可視化するのに十分なサイクル（典型的には２０〜３０）行った。反応物を等モル量でプールし、Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲ精製キットにより精製した。精製したＤＮＡを、１％のＴＡＥアガロースゲル上でゲル精製し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ３６塩基対末端シークエンシングのために、Ｈａｒｖａｒｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌ Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ Ｆａｃｉｌｉｔｙに提出した。
データ解析。Ｉｌｌｕｍｉｎａシークエンシングリードを、Ｃ＋＋で書かれたプログラムを使用して解析した。アルゴリズムは、本明細書の他の箇所（例えば、プロトコール１〜９）に別記されており、要請によりソースコードは入手可能である。両方の対配列上に同じバーコードを含有し、品質スコアが「Ｂ」の位置を含有しない配列をバーコードによりビニングした（ｂｉｎｎｅｄ）。ハーフサイト配列、オーバーハングおよびスペーサー配列、ならびに隣接した無作為化された位置を、一定配列との位置的関係および設計したＣＣＲ５−２２４およびＶＦ２４６８の認識配列に類似した配列の検索により決定した。これらの配列を、２つの隣接しかつ同一の部位で切断されたローリングサークルコンカテマーに対応する、少なくとも４塩基対の相補的な充填されたオーバーハング末端に対する計算選択ステップに供した。特異性スコアを以下の式により算出した：正の特異性スコア＝（その位置の塩基対の頻度［ポスト選択］−その位置の塩基対の頻度［プレ選択］）／（１−その位置の塩基対の頻度［プレ選択］）および負の特異性スコア＝（その位置の塩基対の頻度［ポスト選択］−その位置の塩基対の頻度［プレ選択］）／（その位置の塩基対の頻度［プレ選択］）。
正の特異性スコアは、所与の位置において、出発ライブラリーよりもポスト選択ライブラリーで高い頻度で出現する塩基対を反映する；負の特異性スコアは、所与の位置において、出発ライブラリーよりもポスト選択ライブラリーで頻度が低い塩基対を反映する。＋１のスコアは絶対的な選択性を示し、−１のスコアは完全な非許容性を示し、０のスコアは選択性がないことを示す。
ヒト細胞における切断部位でのゲノム改変のアッセイ。ＣＣＲ５−２２４ ＺＦＮを、ＣＭＶ駆動哺乳動物発現ベクターの中にクローニングした。この発現ベクターでは、両方のＺＦＮ単量体が、以前に記載のベクター３２と同様の自己切断Ｔ２Ａペプチド配列を使用して、化学量論的量で同じｍＲＮＡ転写物から翻訳される。このベクターはまた、ＺＦＮ発現カセットの下流にあるＰＧＫプロモーターから高感度緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）を発現する。ｅＧＦＰのみを発現する空ベクターを、陰性対照として使用した。
細胞内にＺＦＮ発現プラスミドを送達するために、活性なＣＣＲ５−２２４ ＺＦＮのＤＮＡまたは空ベクターＤＮＡのいずれか１５μｇを、Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｋｉｔ Ｖ（Ｌｏｎｚａ）についての製造業者の使用説明書に従って、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔ ２×１０６ Ｋ５６２細胞に二つ組の反応で使用した。ＧＦＰ陽性細胞をトランスフェクションの２４時間後にＦＡＣＳにより単離し、増殖させ、トランスフェクションの５日後にＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｂｌｏｏｄ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）により回収した。
３７の潜在的なＣＣＲ５−２２４基質および９７の潜在的なＶＦ２４６８基質に対するＰＣＲを、Ｐｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）およびプライマー「［ＺＦＮ］［＃］ｆｗｄ」および「［ＺＦＮ］［＃］ｒｅｖ」（表９）を用いて、３％ＤＭＳＯを添加した１×Ｐｈｕｓｉｏｎ ＨＦ緩衝液中で実施した。プライマーはＰｒｉｍｅｒ３３３を使用して設計した。増幅したＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲ精製キットにより精製し、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．５で溶出し、ＬａｂＣｈｉｐ ＧＸ機器（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）上で、１Ｋ Ｃｈｉｐにより定量し、触媒活性ベクター試料および空ベクター対照試料について、別々の等モルプールにまとめた。３つのＣＣＲ５部位および７つのＶＦ２４６８部位に対するＰＣＲ産物は得られなかったので、これらの試料はさらなる解析から除外した。多重Ｉｌｌｕｍｉｎａライブラリーの調製を、アダプター連結反応およびＰＣＲ濃縮ステップの後に精製のためにＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズ（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ）を使用することを除いて、製造業者の説明書に従って実施した。Ｉｌｌｕｍｉｎａインデックス１１（「ＧＧＣＴＡＣ」）および１２（「ＣＴＴＧＴＡ」）をＺＦＮ処理ライブラリー用に使用し、インデックス４（「ＴＧＡＣＣＡ」）および６（「ＧＣＣＡＡＴ」）を空ベクター対照用に使用した。ライブラリー濃度は、Ｉｌｌｕｍｉｎａゲノムアナライザープラットフォーム（Ｋａｐａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）用のＫＡＰＡライブラリー定量キットにより定量した。活性ベクターおよび空ベクター処理細胞に由来する、等量のバーコード付きライブラリーを１０ｎＭに希釈し、Ｈａｒｖａｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ＦＡＳ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｅ ｆａｃｉｌｉｔｙのＩｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ ２０００上のシングルリードシークエンシングに供した。活性ＺＦＮ試料および空ベクター対照について、プロトコール９を使用して配列を解析した。
統計解析。図８では、Ｐ値を、ＣＣＲ５−２２４またはＶＦ２４６８に関し、プレ選択、０．５ｎＭのポスト選択、１ｎＭのポスト選択、２ｎＭのポスト選択、および４ｎＭのポスト選択のライブラリー間のあらゆる可能なペアワイズ比較における、標的部位の突然変異数の平均値の差の片側検定について算出した。ｔ−統計は、ｔ＝（ｘ＿ｂａｒ１−ｘ＿ｂａｒ２）／ｓｑｒｔ（ｌ×ｐ＿ｈａｔ１×（１−ｐ＿ｈａｔ１）／ｎ１＋ｌ×ｐ＿ｈａｔ２×（１−ｐ＿ｈａｔ２）／ｎ２）として算出した。式中、ｘ＿ｂａｒ１およびｘ＿ｂａｒ２は比較する分布の平均であり、ｌは標的部位の長さ（ＣＣＲ５−２２４については２４；ＶＦ２４６８については１８）であり、ｐ＿ｈａｔ１およびｐ＿ｈａｔ２は各ライブラリーついての突然変異の計算確率（ｘ＿ｂａｒ／ｌ）であり、ｎ１およびｎ２は各選択について分析した配列の総数である（表２）。プレ選択ライブラリーおよびポスト選択ライブラリーはすべて、二項分布すると仮定した。
表４および７では、Ｐ値を、活性なＺＦＮ試料および空ベクター対照試料に由来する挿入または欠失を含む配列の割合における差の片側検定について算出した。ｔ−統計は、ｔ＝（ｐ＿ｈａｔ１−ｐ＿ｈａｔ２）／ｓｑｒｔ（（ｐ＿ｈａｔ１×（１−ｐ＿ｈａｔ１）／ｎ１）＋（ｐ＿ｈａｔ２×（１−ｐ＿ｈａｔ２）／ｎ２））として算出した。式中、ｐ＿ｈａｔ１およびｎ１はそれぞれ、活性な試料に由来する配列の割合および総数であり、ｐ＿ｈａｔ２およびｎ２はそれぞれ、空ベクター対照試料に由来する配列の割合および総数である。
プロット。ヒートマップはすべて、下記のコマンドを用いて、Ｒソフトウェアパッケージで生成した：ｉｍａｇｅ（［ｖａｒｉａｂｌｅ］，ｚｌｉｍ ＝ｃ（−１，１），ｃｏｌ＝ｃｏｌｏｒＲａｍｐＰａｌｅｔｔｅ（ｃ（”ｒｅｄ”，”ｗｈｉｔｅ”，”ｂｌｕｅ”），ｓｐａｃｅ＝”Ｌａｂ”）（２５００）。
プロトコール１：品質スコアフィルタリングおよび配列ビニング（ｂｉｎｎｉｎｇ）。
１）シークエンシングリードの両方の対のそれぞれの位置を品質スコアについて検索し、いずれかの位置が品質スコア＝「Ｂ」である場合、拒絶する。
２）対中の最初の配列がバーコード（「ＡＡＴ」、「ＡＴＡ」、「ＴＡＡ」、「ＣＡＣ」、「ＴＣＧ」）で開始するすべての配列リードを別々のファイルに出力し、各バーコードに対応する配列の数をカウントする。
プロトコール２：ＺＦＮ（「ＡＡＴ」、「ＡＴＡ」、「ＴＡＡ」、「ＣＡＣ」）によるフィルタリング
各ビニングされたファイルについて、
１）対中の両方の配列が同じバーコードで開始する配列対のみを受け入れる。
２）定常領域の検索によってシークエンスリードの配向を同定する。
−配向１は、定常領域「ＣＧＡＴＣＧＴＴＧＧ」により同定する。
−配向２は、定常領域「ＣＡＧＴＧＧＡＡＣＧ」により同定する。
３）同定された定常領域に対応する、ＣＣＲ５−２２４およびＶＦ２４６８のハーフサイトと比較して最少の突然変異を有する部分配列について、位置４（バーコード後）から定常領域の最初の位置までの配列を検索する。
−「ＧＡＴＧＡＧＧＡＴＧＡＣ」（ＣＣＲ５−２２４（＋））および「ＧＡＣＧＣＴＧＣＴ」（ＶＦ２４６８（−））について、配向１の配列を検索する。
−「ＡＡＡＣＴＧＣＡＡＡＡＧ」（ＣＣＲ５−２２４（−））および「ＧＡＧＴＧＡＧＧＡ」（ＶＦ２４６８（＋））について、配向２の配列を検索する。
４）両方のハーフサイトにわたって最少の突然変異について調べることによって、ＣＣＲ５−２２４またはＶＦ２４６８として配列をビニングする。
５）ハーフサイトおよび一定配列の位置を使用して、オーバーハング／スペーサー配列、隣接するヌクレオチド配列、およびタグ配列を決定する。
−配向１のハーフサイトと定常領域との間の部分配列はタグ配列である。
ｏタグ配列がない場合は、タグ配列は「Ｘ」と表示される。
−オーバーハング配列は、バーコードの後に開始する、配向１と配向２の部分配列間の最長の逆相補的部分配列を検索することにより決定する。
−スペーサー配列は、オーバーハングとハーフサイト（もしあれば）との間にある、配向１の部分配列の逆相補鎖を、オーバーハングとハーフサイトとの間にある、配向２の部分配列に連結することにより決定する。
ｏオーバーハングとハーフサイトとの間にオーバーラップがある場合は、オーバーハングの中に存在するオーバーラップしていない部分配列のみをスペーサーの一部としてカウントする。
６）重複配列を除去するために、各配列対をツリーの中にソートする。
−ツリーの各レベルは配列の位置に対応する。
−各レベルの各ノードは、特定の塩基（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、またはＸ＝ｎｏｔ（Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴ））に対応し、次の位置の塩基（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、Ｘ）を指す。
−配列対をノードにコードし、スペーサー配列、隣接するヌクレオチド配列、およびタグ配列の連結からなる部分配列をツリーにソートする。
−ツリーの終端ノードにおいて、新たに加わる各配列を、重複を回避するためにノードにおける他のすべての配列と比較する。
７）ツリーのコンテンツを、バーコードおよびＺＦＮに基づいて別々のファイルに再帰的に出力する。
プロトコール３：ライブラリーのフィルタリング（「ＴＣＧ」）
１）対中の両方の配列が同じバーコードで開始する配列対のみを受け入れる。
２）配列「ＴＣＧＴＴＧＧＧＡＡＣＣＧＧＡＧＣＴＧＡＡＴＧＡＡＧＣＣＡＴＡＣＣＡＡＡＣＧＡＣ」を含有しない配列対を分析する（他方の対はライブラリー配列を含有する）。
３）ＺＦＮハーフサイトについて配列を検索し、突然変異がより少ないＺＦＮ部位によってビニングする。
−「ＧＴＣＡＴＣＣＴＣＡＴＣ」および「ＡＡＡＣＴＧＣＡＡＡＡＧ」（ＣＣＲ５−２２４）ならびに「ＡＧＣＡＧＣＧＴＣ」および「ＧＡＧＴＧＡＧＧＡ」（ＶＦ２４６８）について検索する。
４）ハーフサイトの位置に基づいて、スペーサー、隣接するヌクレオチド、およびヌクレオチドタグ配列を同定する。
５）ＺＦＮによるフィルタリングの下で、ステップ６のツリーアルゴリズムを使用して、重複配列を除去する。
プロトコール４：配列プロファイル
１）「Ｎ」位置を含有せず、スペーサーの長さが４〜７の間である配列のみを分析する。
２）突然変異の総数、スペーサーの長さ、オーバーハングの長さ、（＋）および（−）ハーフサイトに関するヌクレオチド頻度、長さが４−ｂｐ、５−ｂｐ、６−ｂｐ、および７−ｂｐのスペーサーに関するヌクレオチド頻度、および隣接するヌクレオチドおよびタグ配列に関するヌクレオチド頻度を表にする。
３）ライブラリー配列について、ステップ１および２を反復する。
４）各位置での特異性スコアを、正の特異性スコア＝（その位置の塩基対の頻度［ポスト選択］−その位置の塩基対の頻度［プレ選択］）／（１−その位置の塩基対の頻度［プレ選択］）、負の特異性スコア＝（その位置の塩基対の頻度［ポスト選択］−その位置の塩基対の頻度［プレ選択］）／（その位置の塩基対の頻度［プレ選択］）を使用して算出する。
プロトコール５：ゲノムのマッチ
１）ヒトゲノム配列を、５または６塩基のすべてのスペーサー配列を受け入れた正規標的部位の９つの突然変異（ＣＣＲ５−２２４）または６つの突然変異（ＶＦ２４６８）以内のすべての部位について、２４および２５の塩基ウィンドウ（ＣＣＲ５−２２４）および１８および１９の塩基ウィンドウ（ＶＦ２４６８）で検索した。
２）各ポスト選択配列を、ＣＣＲ５−２２４およびＶＦ２４６８のそれぞれ９つおよび６つの突然変異以内のゲノム配列セットと比較した。
プロトコール６：０、１つ、２つ、または３つの突然変異を含む配列に対する濃縮係数
１）各配列について、ポスト選択ライブラリー中の出現頻度を、プレ選択ライブラリー中の出現頻度で割る。
プロトコール７：フィルタリングされた配列のプロファイル
１）配列プロファイルにおいて、プレ選択およびポスト選択の両方のデータについて、所与の位置にオフターゲット塩基を有する配列のみをさらに分析することを除いて、上記のアルゴリズムを使用する。
プロトコール８：補償差マップ
１）両方のハーフサイトにおけるあらゆる位置での突然変異について、フィルタリングされた配列プロファイルアルゴリズムを使用する。
２）Δ（特異性スコア）＝フィルタリングされた特異性スコア−フィルタリングされていない特異性スコア、を計算する。
プロトコール９：ＮＨＥＪ検索
１）正確な隣接配列を検索することにより部位を同定する。
２）計算部位の長さを予測部位の長さと比較し、非改変標的部位（目的部位と比較して５つ以下の突然変異を含む配列を非改変とカウントした）との類似性を検索することにより、挿入または欠失の塩基の数をカウントする。
３）本当の挿入または欠失を同定するために、ＣＣＲ５、ＣＣＲ２、およびＶＥＧＦ−Ａプロモーター以外のすべての部位を手動で点検する。
参考文献
１． Ｋｉｍ， Ｙ．Ｇ．， Ｃｈａ， Ｊ． ＆ Ｃｈａｎｄｒａｓｅｇａｒａｎ， Ｓ． Ｈｙｂｒｉｄ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅｓ： ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｆｕｓｉｏｎｓ ｔｏ Ｆｏｋ Ｉ ｃｌｅａｖａｇｅ ｄｏｍａｉｎ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ９３， １１５６−６０ （１９９６）．
２． Ｖａｎａｍｅｅ， Ｅ．Ｓ．， Ｓａｎｔａｇａｔａ， Ｓ． ＆ Ａｇｇａｒｗａｌ， Ａ．Ｋ． ＦｏｋＩ ｒｅｑｕｉｒｅｓ ｔｗｏ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＤＮＡ ｓｉｔｅｓ ｆｏｒ ｃｌｅａｖａｇｅ． Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３０９， ６９−７８ （２００１）．
３． Ｈｏｃｋｅｍｅｙｅｒ， Ｄ． ｅｔ ａｌ． Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ａｎｄ ｓｉｌｅｎｔ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ＥＳＣｓ ａｎｄ ｉＰＳＣｓ ｕｓｉｎｇ ｚｉｎｃ−ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ． Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２７， ８５１−７ （２００９）．
４． Ｍａｅｄｅｒ， Ｍ．Ｌ． ｅｔ ａｌ． Ｒａｐｉｄ “ｏｐｅｎ−ｓｏｕｒｃｅ” ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｃｕｓｔｏｍｉｚｅｄ ｚｉｎｃ−ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｆｏｒ ｈｉｇｈｌｙ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｇｅｎｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ． Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ３１， ２９４−３０１ （２００８）．
５． Ｚｏｕ， Ｊ． ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ａ ｄｉｓｅａｓｅ−ｒｅｌａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ａｎｄ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ． Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ５， ９７−１１０ （２００９）．
６． Ｐｅｒｅｚ， Ｅ．Ｅ． ｅｔ ａｌ． Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ ＨＩＶ−１ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ ＣＤ４＋ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｚｉｎｃ−ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ． Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２６， ８０８−１６ （２００８）．
７． Ｕｒｎｏｖ， Ｆ．Ｄ． ｅｔ ａｌ． Ｈｉｇｈｌｙ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｅ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｚｉｎｃ−ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ． Ｎａｔｕｒｅ ４３５， ６４６−５１ （２００５）．
８． Ｓａｎｔｉａｇｏ， Ｙ． ｅｔ ａｌ． Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｇｅｎｅ ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｚｉｎｃ−ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０５， ５８０９−１４ （２００８）．
９． Ｃｕｉ， Ｘ． ｅｔ ａｌ． Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｒａｔ ａｎｄ ｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏｓ ｗｉｔｈ ｚｉｎｃ−ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ． Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２９， ６４−７ （２０１１）．
１０． Ｃｏｒｎｕ， Ｔ．Ｉ． ｅｔ ａｌ． ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｉｓ ａ ｍａｊｏｒ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ ｚｉｎｃ−ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ． Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １６， ３５２−８ （２００８）．
１１． Ｓｅｇａｌ， Ｄ．Ｊ．， Ｄｒｅｉｅｒ， Ｂ．， Ｂｅｅｒｌｉ， Ｒ．Ｒ． ＆ Ｂａｒｂａｓ， Ｃ．Ｆ．， ３ｒｄ． Ｔｏｗａｒｄ ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｔ ｗｉｌｌ： ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｄｏｍａｉｎｓ ｒｅｃｏｇｎｉｚｉｎｇ ｅａｃｈ ｏｆ ｔｈｅ ５’−ＧＮＮ−３’ ＤＮＡ ｔａｒｇｅｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ９６， ２７５８−６３ （１９９９）．
１２． Ｂｕｌｙｋ， Ｍ．Ｌ．， Ｈｕａｎｇ， Ｘ．， Ｃｈｏｏ， Ｙ． ＆ Ｃｈｕｒｃｈ， Ｇ．Ｍ． Ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ ｔｈｅ ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ ｏｆ ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒｓ ｗｉｔｈ ＤＮＡ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ９８， ７１５８−６３ （２００１）．
１３． Ｍｅｎｇ， Ｘ．， Ｔｈｉｂｏｄｅａｕ−Ｂｅｇａｎｎｙ， Ｓ．， Ｊｉａｎｇ， Ｔ．， Ｊｏｕｎｇ， Ｊ．Ｋ． ＆ Ｗｏｌｆｅ， Ｓ．Ａ． Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｔｈｅ ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ ｏｆ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｃｙｓ２Ｈｉｓ２ ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｄｏｍａｉｎｓ ｕｓｉｎｇ ａ ｒａｐｉｄ ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄ ｍｅｔｈｏｄ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３５， ｅ８１ （２００７）．
１４． Ｗｏｌｆｅ， Ｓ．Ａ．， Ｇｒｅｉｓｍａｎ， Ｈ．Ａ．， Ｒａｍｍ， Ｅ．Ｉ． ＆ Ｐａｂｏ， Ｃ．Ｏ． Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒｓ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｖｉａ ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ： ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｕｔｉｌｉｔｙ ｏｆ ａ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｃｏｄｅ． Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２８５， １９１７−３４ （１９９９）．
１５． Ｓｅｇａｌ， Ｄ．Ｊ． ｅｔ ａｌ． Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｍｏｄｕｌａｒ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ｐｏｌｙｄａｃｔｙｌ ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４２， ２１３７−４８ （２００３）．
１６． Ｚｙｋｏｖｉｃｈ， Ａ．， Ｋｏｒｆ， Ｉ． ＆ Ｓｅｇａｌ， Ｄ．Ｊ． Ｂｉｎｄ−ｎ−Ｓｅｑ： ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｐｒｏｔｅｉｎ−ＤＮＡ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｕｓｉｎｇ ｍａｓｓｉｖｅｌｙ ｐａｒａｌｌｅｌ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３７， ｅ１５１ （２００９）．
１７． Ｙａｎｏｖｅｒ， Ｃ． ＆ Ｂｒａｄｌｅｙ， Ｐ． Ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ＤＮＡ ｂａｃｋｂｏｎｅ ｓａｍｐｌｉｎｇ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｂａｓｅｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｃ２Ｈ２ ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒｓ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ （２０１１）．
１８． Ｂｅｕｍｅｒ， Ｋ．， Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙｙａ， Ｇ．， Ｂｉｂｉｋｏｖａ， Ｍ．， Ｔｒａｕｔｍａｎ， Ｊ．Ｋ． ＆ Ｃａｒｒｏｌｌ， Ｄ． Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｇｅｎｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｉｎ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｗｉｔｈ ｚｉｎｃ−ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ． Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １７２， ２３９１−４０３ （２００６）．
１９． Ｂｉｂｉｋｏｖａ， Ｍ．， Ｇｏｌｉｃ， Ｍ．， Ｇｏｌｉｃ， Ｋ．Ｇ． ＆ Ｃａｒｒｏｌｌ， Ｄ． Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｃｌｅａｖａｇｅ ａｎｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｕｓｉｎｇ ｚｉｎｃ−ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ． Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １６１， １１６９−７５ （２００２）．
２０． Ｇｕｐｔａ， Ａ．， Ｍｅｎｇ， Ｘ．， Ｚｈｕ， Ｌ．Ｊ．， Ｌａｗｓｏｎ， Ｎ．Ｄ． ＆ Ｗｏｌｆｅ， Ｓ．Ａ． Ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｎｄ −ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ ｔｏ ｔｈｅ ｉｎ ｖｉｖｏ ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３９， ３８１−９２ （２０１１）．
２１． Ｃｈｅｎ， Ｊ． ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｈｕｍａｎ ＢＴＢ ｄｏｍａｉｎ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｇｅｎｅ， ＢＴＢＤ１０， ｗｈｉｃｈ ｉｓ ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｉｎ ｇｌｉｏｍａ． Ｇｅｎｅ ３４０， ６１−９ （２００４）．
２２． Ｗａｎｇ， Ｘ． ｅｔ ａｌ． Ｇｌｕｃｏｓｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ−ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ １ （ＧＭＲＰ１） ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｂｅｔａ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｖｉａ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｋｔ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ ｉｎ ｒａｔｓ ａｎｄ ｍｉｃｅ． Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ ５４， ８５２−６３ （２０１１）．
２３． Ｎａｗａ， Ｍ．， Ｋａｎｅｋｕｒａ， Ｋ．， Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ， Ｙ．， Ａｉｓｏ， Ｓ． ＆ Ｍａｔｓｕｏｋａ， Ｍ． Ａ ｎｏｖｅｌ Ａｋｔ／ＰＫＢ−ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｆａｍｉｌｉａｌ ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ−ｌｉｎｋｅｄ ｍｕｔａｎｔ ＳＯＤ１−ｉｎｄｕｃｅｄ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｄｅａｔｈ ｖｉａ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ＰＰ２Ａ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｅｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｋｔ／ＰＫＢ． Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌ ２０， ４９３−５０５ （２００８）．
２４． Ｐｅｔｅｋ， Ｌ．Ｍ．， Ｒｕｓｓｅｌｌ， Ｄ．Ｗ． ＆ Ｍｉｌｌｅｒ， Ｄ．Ｇ． Ｆｒｅｑｕｅｎｔ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｃｌｅａｖａｇｅ ａｔ ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ ｌｏｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｖｉｖｏ． Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １８， ９８３−６ （２０１０）．
２５． Ｈｕｒｔ， Ｊ．Ａ．， Ｔｈｉｂｏｄｅａｕ， Ｓ．Ａ．， Ｈｉｒｓｈ， Ａ．Ｓ．， Ｐａｂｏ， Ｃ．Ｏ． ＆ Ｊｏｕｎｇ， Ｊ．Ｋ． Ｈｉｇｈｌｙ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｂｙ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｄｏｍａｉｎ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ ａｎｄ ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １００， １２２７１−６ （２００３）．
２６． Ｒａｍｉｒｅｚ， Ｃ．Ｌ． ｅｔ ａｌ． Ｕｎｅｘｐｅｃｔｅｄ ｆａｉｌｕｒｅ ｒａｔｅｓ ｆｏｒ ｍｏｄｕｌａｒ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒｓ． Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ５， ３７４−５ （２００８）．
２７． Ｓｈｉｍｉｚｕ， Ｙ． ｅｔ ａｌ． Ａｄｄｉｎｇ Ｆｉｎｇｅｒｓ ｔｏ ａｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｚｉｎｃ Ｆｉｎｇｅｒ Ｎｕｃｌｅａｓｅ Ｃａｎ Ｒｅｄｕｃｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５０， ５０３３−４１ （２０１１）．
２８． Ｂｉｂｉｋｏｖａ， Ｍ． ｅｔ ａｌ． Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｃｌｅａｖａｇｅ ｂｙ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ． Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２１， ２８９−９７ （２００１）．
２９． Ｈａｎｄｅｌ， Ｅ．Ｍ．， Ａｌｗｉｎ， Ｓ． ＆ Ｃａｔｈｏｍｅｎ， Ｔ． Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ ｏｒ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｎｇ ｔｈｅ ｔａｒｇｅｔ ｓｉｔｅ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ ｏｆ ｚｉｎｃ−ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ： ｔｈｅ ｉｎｔｅｒ−ｄｏｍａｉｎ ｌｉｎｋｅｒ ａｓ ａ ｍａｊｏｒ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ ｏｆ ｔａｒｇｅｔ ｓｉｔｅ ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ． Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １７， １０４−１１ （２００９）．
３０． Ｍｉｌｌｅｒ， Ｊ．Ｃ． ｅｔ ａｌ． Ａｎ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｚｉｎｃ−ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅ ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ ｆｏｒ ｈｉｇｈｌｙ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ． Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２５， ７７８−８５ （２００７）．
３１． Ｃｒａｄｉｃｋ， Ｔ．Ｊ．， Ｋｅｃｋ， Ｋ．， Ｂｒａｄｓｈａｗ， Ｓ．， Ｊａｍｉｅｓｏｎ， Ａ．Ｃ． ＆ ＭｃＣａｆｆｒｅｙ， Ａ．Ｐ． Ｚｉｎｃ−ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ ａｓ ａ ｎｏｖｅｌ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ ＤＮＡｓ． Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １８， ９４７−５４ （２０１０）．
３２． Ｄｏｙｏｎ， Ｙ． ｅｔ ａｌ． Ｈｅｒｉｔａｂｌｅ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｇｅｎｅ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ｉｎ ｚｅｂｒａｆｉｓｈ ｕｓｉｎｇ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｚｉｎｃ−ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ． Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２６， ７０２−８ （２００８）．
３３． Ｒｏｚｅｎ， Ｓ． ＆ Ｓｋａｌｅｔｓｋｙ， Ｈ． Ｐｒｉｍｅｒ３ ｏｎ ｔｈｅ ＷＷＷ ｆｏｒ ｇｅｎｅｒａｌ ｕｓｅｒｓ ａｎｄ ｆｏｒ ｂｉｏｌｏｇｉｓｔ ｐｒｏｇｒａｍｍｅｒｓ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １３２， ３６５−８６ （２０００）．
本明細書に記述のすべての刊行物、特許、およびデータベースエントリーは、上記に収載のアイテムを含めて、あたかも個々の刊行物または特許がそれぞれ、具体的かつ個別に参照により組み込まれるように指示されたかのように、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれるものとする。矛盾がある場合は、本出願が、本明細書のいかなる定義も含めて、統制するものとする。
実施例２−ＴＡＬＥＮ
種々のＴＡＬＥＮの部位選択性を、上記のＺＦＮプロファイリングについてなされた研究と同様にしてプロファイリングした。実験および結果を図１９〜４９に記載する。選択１は、＋２８リンカー対＋６３リンカーのＴＡＬＥＮ間の比較を含む。選択２は、ＴＡＬドメインの長さが異なるＴＡＬＥＮの比較を含む。
ＴＡＬ ＤＮＡ結合ドメインは、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよび細胞の両方において、標的ＤＮＡを具体的に調節する変形技術に基づいている。設計可能なＴＡＬ ＤＮＡ結合ドメインは、他のＤＮＡ結合ドメイン、例えばジンクフィンガーと比較して、標的化可能な配列空間および構築の容易さにおいて利点を有する。これらのＴＡＬ ＤＮＡ結合ドメインは、標的ＤＮＡ配列中の単一塩基対の認識をコードする高度に可変なジ−アミノ酸（ＲＶＤ）を含有する、３４アミノ酸のドメインの反復で構成される（図２０）。このＲＶＤコードの頑健性およびそのＤＮＡ標的に結合したＴＡＬの結晶構造に基づくと、単一反復の塩基対への結合は、隣接する反復結合に比較的左右されないように思われる。ＴＡＬ ＤＮＡ結合ドメイン（反復アレイ）は、ヘテロ二量体性のヌクレアーゼドメインの単量体に連結して、ＴＡＬヌクレアーゼを形成することができる。したがって、２つの別々のＴＡＬヌクレアーゼが、隣接する標的ハーフサイトに結合して、特定配列を切断することにより、ｉｎ ｖｉｖｏでゲノム改変がもたらされ得る（図１９および２０）。いくつかの研究で、ＴＡＬ ＤＮＡ結合の特異性について検討がなされているが、本発明者らが知るかぎり、ＴＡＬヌクレアーゼの特異性を大規模にプロファイリングした研究はない。本発明者らは、容易に設計可能なことから予測されるＴＡＬ反復の独立したモジュール結合を確認するだけでなく、治療に関連するＴＡＬヌクレアーゼによるゲノムオフターゲット配列を同定するためにも、実施例１のＺＦＮについて概説した、ヌクレアーゼ特異性に対するハイスループットｉｎ ｖｉｔｒｏ選択の概念を適用した。
ｉｎ ｖｉｔｒｏライブラリースクリーニングを介してＴＡＬヌクレアーゼの特異性をプロファイリングするための選択スキームは、実施例でＺＦＮについて記載された選択スキームと同様であった。詳細なプロトコールを、以下に示す。
部分的に無作為化された標的部位のライブラリーの調製
２ｕｌ １０ｐｍｏｌのＴＡＬＮＣＣＲ５ライブラリーＯｌｉｇｏ（各ｏｌｉｇｏに対して別々の反応）
２ｕｌ １０×ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ ＩＩ １０×反応緩衝液
１ｕｌ ５０ｍＭのＭｎＣｌ２
１ｕｌ ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ ＩＩ ｓｓＤＮＡリガーゼ（１００Ｕ）［Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ］
Ｘｕｌの水で全容積２０ｕＬにする
６０℃で１６時間インキュベートする。８５℃で１０分間インキュベートして不活化する。
各Ｃｉｒｃｌｉｇａｓｅ ＩＩ反応液（精製していない）２．５ｕｌを加える。
ＴｅｍｐｌｉＰｈｉ（商標）［ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ］１００試料緩衝液２５ｕｌを加える。
９５℃で３分間インキュベートする。４℃に徐々に冷却する。
ＴｅｍｐｌｉＰｈｉ（商標）反応緩衝液２５ｕｌ／酵素混合物１ｕｌを加える。
３０℃で１６時間インキュベートする。５５℃で１０分間熱不活化する。
Ｑｕａｎｔ−ｉＴ（商標）ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）ｄｓＤＮＡ［Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ］を使用して、ｄｓＤＮＡ量を定量する。
等モルのＴｅｍｐｌｉＰｈｉ（商標）反応液を合わせて、切断部位の数に関して最終２ｕＭにする。
ＴＡＬＮ発現
１６ｕｌ ＴｎＴ（登録商標）Ｑｕｉｃｋ Ｃｏｕｐｌｅｄ［Ｐｒｏｍｅｇａ］
０．４ｕｌ １ｍＭメチオニン
２ｕＬ ．８ｕｇのＴＡＬＮベクター発現プラスミドまたは空溶解物のための水
１．６ｕＬ 水
３０で１．５時間インキュベートした後、４℃で一晩保存する。
ウエスタンブロットにより、溶解物中のＴＡＬＮ量を定量する。
ＴＡＬＮ消化
２５ｕＬ １０×ＮＥＢ Ｂｕｆｆｅｒ ３［Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ］
１０ｕＬ ２ｕＭのＴｅｍｐｌｉＰｈライブラリーＤＮＡ
１６５ｕＬ 水
レフトＴＡＬＮ溶解物を２０ｎＭの全レフトＴＡＬＮに加える。
ライトＴＡＬＮ溶解物を２０ｎＭの全ライトＴＡＬＮに加える。
空溶解物を合計５０ｕＬの溶解物に加える。
３７℃で２時間インキュベートする。５ｕｌ（５０ｕｇ）のＲＮアーゼＡ（Ｑｉａｇｅｎ）を加える。室温で１０分間インキュベートする。Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲ精製キットにより精製する。５０ｕＬの１ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０に溶出する。
ＴＡＬＮ消化物のアダプター連結反応、ＰＣＲ、およびゲル精製
５０ｕｌ 消化されたＤＮＡ
３ｕｌ ｄＮＴＰ混合物
６ｕｌ ＮＥＢ ２
１ｕｌ Ｋｌｅｎｏｗ［Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ］
室温で３０分間インキュベートする。Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲ精製キットにより精製する。
５０ｕｌ 溶出ＤＮＡ
５．９ｕｌ Ｔ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液（ＮＥＢ）
２ｕｌ（２０ｐｍｏｌ）の加熱／冷却アダプター（選択ごとに異なるアダプター）
１ｕｌ Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ、４００単位）
室温で２０時間インキュベートする。Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲ精製キットにより精製する。
６ｕＬ ＴＡＬＮ消化ＤＮＡ
３０ｕＬ ５×Ｂｕｆｆｅｒ ＨＦ
１．５ｕＬ １００ｕＭのＩｌｌｕｍｉｎａ＿ｆｗｄプライマー
１．５ｕＬ １００ｕＭのＰＥ＿ＴＡＬＮ＿ｒｅｖ１プライマー
３ｕｌ １０ｍＭのｄＮＴＰ
１．５ｕＬ Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＩＩ
１０６．５ｕＬ 水
９８℃で３分間、そして９８℃で１５秒間、６０℃で１５秒間、７２℃で１分間を１５サイクル行う。ＱｉａｇｅｎＰＣＲ精製キットにより精製する。
１０％グリセロール４０ｕＬ中の溶出ＤＮＡ１ｕｇを負荷して、２％アガロースゲル上でゲル精製する。１３５Ｖで３５分間、ゲル上で泳動させる。切断ハーフサイト＋完全ハーフサイト＋アダプターに相当する長さのバンドを、濾紙を用いてゲル精製する。濾紙を除去して、上清を回収する。Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲ精製キットにより精製する。
６ｕＬ ＴＡＬＮ消化ＤＮＡ（５−２６−１２）
３０ｕＬ ５×Ｂｕｆｆｅｒ ＨＦ
１．５ｕＬ １００ｕＭのＩｌｌｕｍｉｎａ＿ｆｗｄプライマー
１．５ｕＬ １００ｕＭのＰＥ＿ＴＡＬＮ＿ｒｅｖ２プライマー
３ｕｌ １０ｍＭのｄＮＴＰ
１．５ｕＬ Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＩＩ
１０６．５ｕＬ 水
９８℃で３分間、そして９８℃で１５秒間、６０℃で１５秒間、７２℃で１分間を６サイクル行う。Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲ精製キットにより精製する。
プレ選択ライブラリーの調製
２５ｕＬ １０×ＮＥＢ Ｂｕｆｆｅｒ ４
１０ｕＬ ２ｕＭのＴｅｍｐｌｉＰｈライブラリーＤＮＡ
１６５ｕＬ 水
５ｕＬ 適切な制限酵素［Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ］
２１０ｕＬ 水
３７℃で１時間インキュベートする。Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲ精製キットにより精製する。
５０ｕｌ 溶出ＤＮＡ
５．９ｕｌ Ｔ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液（ＮＥＢ）
２ｕｌ（２０ｐｍｏｌ）の加熱／冷却アダプター（４アダプター配列のプール）
１ｕｌ Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ、４００単位）
室温で２０時間インキュベートする。Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲ精製キットにより精製する。
６ｕＬ 制限酵素消化ＤＮＡ（５−２６−１２）
３０ｕＬ ５×Ｂｕｆｆｅｒ ＨＦ
１．５ｕＬ １００ｕＭのＩｌｌｕｍｉｎａ＿ｒｅｖプライマー
１．５ｕＬ １００ｕＭのＴＡＬＮＬｉｂＰＣＲプライマー
３ｕｌ １０ｍＭのｄＮＴＰ
１．５ｕＬ Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＩＩ
１０６．５ｕＬ 水
９８℃で３分間、そして９８℃で１５秒間、６０℃で１５秒間、７２℃で１分間を１２サイクル。Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲ精製キットにより精製する。
ハイスループットシークエンシング
ＲＴ−ｑＰＣＲにより定量する
１２．５ｕＬ ＩＱ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ
１ｕＬ １０ｕＭのＩｌｌｕｍｉｎａ＿ｒｅｖ
１ｕＬ １０ｕＭのＩｌｌｕｍｉｎａ＿ｆｗｄ
９．５ｕＬ 水
１ｕＬ ＤＮＡテンプレート（プレ選択ライブラリーおよびＴＡＬＮ消化の両方）
９５℃で５分間、そして９５℃で３０秒間、６５℃で３０秒間、７２℃で４０秒間を３０サイクル行う。
ＤＮＡを２ｎＭに希釈する（シークエンシング標準に比較して）
５ｕＬ ＴＡＬＮ消化 ２ｎＭのＤＮＡ
２．５ｕＬ プレ選択ライブラリー ２ｎＭのＤＮＡ
１０ｕＬ ．１ＮのＮａＯＨ
室温で５分間インキュベートする
Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｍｉ−Ｓｅｑによりシークエンシングする
計算フィルタリング
ＴＡＬＮ消化配列について、２つの適切に間隔があいた一定オリゴ配列を見出す。
プレ選択ライブラリー配列について、適切に間隔があいた一定オリゴ配列およびライブラリーアダプター配列を見出す。
切断オーバーハング、左ハーフサイト、スペーサー、右ハーフサイトに配列を構文解析する。
ハーフサイト中に悪いＩｌｌｕｍｉｎａ塩基スコアを有する配列を除去する（＜Ｂ＝拒絶）。
結論
ハーフサイトの突然変異の数と濃縮との間の比較的規則的な（対数的な関係）傾向は、塩基対結合する１つのＴＡＬ反復結合が他の反復結合に左右されないことと一致している。補償差分析では、切断部位の１つの突然変異が他の突然変異の分布を顕著に変化させることはなく、ＴＡＬ反復ドメインが独立して結合することが示唆される。＋２８のリンカーのＴＡＬＮ構築物は、＋６３のリンカーのＴＡＬＮ構築物よりも特異的である。より大きな標的部位を認識するＴＡＬＮほど、より多くの突然変異を許容することができるという点で、特異性が低下するが、突然変異したより大きな配列の存在量は、濃縮の増加よりも少なく、したがって、ｉｎ ｖｉｔｒｏ選択データおよびオフターゲット部位の存在量からは、より長いＴＡＬＮ対ではオフターゲット切断が起こる可能性がかなり低いことが示される。全体の標的部位突然変異が増加するにつれて、切断効率（濃縮）が規則的に低下することと各位置での濃縮とを組み合わせると、任意の配列のオフターゲット部位切断を予測することが可能になる。大体において、ＴＡＬＮ選択では、濃縮は両方のハーフサイトにおける突然変異の合計に依存し、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）の場合に観察されたようにハーフサイト間の突然変異の分布に依存することはない。この観察をＺＦＮの文脈依存の結合と組み合わせるとＴＡＬＥＮは、そのＺＦＮ相当物と同等またはそれより高い特異性に容易に操作することができることがわかる。
本明細書に記述のすべての刊行物、特許、およびデータベースエントリーは、上記に収載のアイテムを含めて、あたかも個々の刊行物または特許がそれぞれ、具体的かつ個別に参照により組み込まれるように指示されたかのように、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれるものとする。矛盾がある場合は、本出願が、本明細書のいかなる定義も含めて、統制するものとする。
均等物および範囲
当業者ならば、単なるルーチン的な実験作業を使用して、本明細書に記載する本発明の特定の実施形態に対する多くの均等物を認識するか、または確認することができるであろう。本発明の範囲は、上記の説明に限定するように意図されるものではなく、添付の特許請求の範囲に示されるとおりである。
特許請求の範囲において、「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」などの冠詞は、それに反する指示がない限り、または別途文脈から明らかでない限り、１つまたは複数を意味することができる。ある群の１つまたは複数のメンバー間に「または」を含む特許請求の範囲または説明は、それに反する指示がない限り、または別途文脈から明らかでない限り、その群のメンバーの１つ、２つ以上、またはすべてが、所与の生成物または方法に存在するか、使用されるか、またはそうでなければ関連する場合に満足されると見なされる。本発明は、その群の正確に１つのメンバーが所与の生成物または方法に存在するか、使用されるか、またはそうでなければ関連する実施形態を含む。本発明はまた、その群のメンバーの２つ以上またはすべてが所与の生成物または方法に存在するか、使用されるか、またはそうでなければ関連する実施形態を含む。
さらに、本発明は、あらゆる変更、組合せ、および置換を包含し、そこでは、特許請求の範囲の１つもしくは複数からの、または説明の関連部分からの１つまたは複数の限定、要素、条項、記述用語等が、別の請求項に導入されると理解されたい。例えば、別の請求項に従属している任意の請求項は、同じ基本請求項に従属する他の任意の請求項に見られる１つまたは複数の限定を含むように修飾され得る。さらに、請求項が組成物を列挙する場合、別途指示されない限り、または矛盾もしくは不一致が生じることが当業者に明らかでない限り、本明細書に開示される任意の目的のために組成物を使用する方法が含まれ、また本明細書に開示の任意の製造方法または当技術分野で公知の他の方法に従って組成物を製造する方法が含まれることを理解されたい。
要素が一覧として、例えば、マーカッシュ群形式で提示される場合、それらの要素の各部分群もまた開示されること、また任意の要素がその群から除去され得ることを理解されたい。さらに、用語「含む」は、オープンであることを意図し、さらなる要素または工程の包含を許容することに留意されたい。一般に、本発明または本発明の態様が特定の要素、特徴、工程等を含むとして言及される場合、本発明または本発明の態様の特定の実施形態は、そのような要素、特徴、工程等からなるか、またはそれらから本質的になると理解されたい。単純化の目的のために、それらの実施形態は、本明細書中に、これらの言葉で具体的に示されていない。したがって、１つまたは複数の要素、特徴、工程等を含む、本発明の各実施形態に対して、本発明は、それらの要素、特徴、工程等からなるか、またはそれらから本質的になる実施形態も提供する。
範囲が与えられる場合、端点は含まれる。さらに、別途指示されないか、文脈および／または当業者の理解から別途明らかでない限り、範囲として表示される値は、別途文脈から明確に指示されない限り、本発明の種々の実施形態で記述の範囲内の任意の特定の値を、その範囲の下限の単位の１／１０まで想定することができると理解されたい。さらに、別途指示されないか、文脈および／または当業者の理解から別途明らかでない限り、部分範囲の端点が、その範囲の下限の単位の１／１０と同程度の正確さで表示されている、所与の範囲内の任意の部分範囲を想定することができると理解されたい。
加えて、本発明の特定の任意の実施形態は、特許請求の範囲の任意の１つまたは複数から明示的に除外され得ると理解されたい。範囲が与えられる場合、その範囲内の任意の値は、特許請求の範囲の１つまたは複数から明示的に除外され得る。本発明の組成物および／または方法の任意の実施形態、要素、特徴、用途、態様は、特許請求の範囲の１つまたは複数から除外され得る。簡潔さのために、１つまたは複数の要素、特徴、目的、または態様が除外される実施形態のすべてが、本明細書に明示的に示されることはない。
表１：ヒトＫ５６２細胞のゲノム中のＣＣＲ５−２２４オフターゲット部位。小文字は、標的部位に対する突然変異を示す。「Ｘ」マークが付いた部位は、対応するｉｎ ｖｉｔｒｏ選択データセット中に見出された部位である。「Ｔ」は、部位中の突然変異の総数を指し、「（＋）」および「（−）」はそれぞれ、（＋）および（−）のハーフサイト中の突然変異の数を指す。部位の配列は、５’（＋）ハーフサイト／スペーサー／（−）ハーフサイト３’として記載しており、したがって、（＋）ハーフサイトは、配列プロファイルとは逆のセンスで記載されている。Ｋ５６２改変頻度は、空ベクターを発現する細胞に比較した、活性ＺＦＮを発現する細胞における、非相同末端結合修復（方法を参照のこと）の重要な証拠となる観察配列の頻度である。統計的に有意な改変の証拠を示さなかった部位は、検出されない（ｎ．ｄ．）として記載し、ゲノムからの非特異的ＰＣＲ増幅のため、分析されなかった３つの部位についてのＫ５６２改変頻度は空白とした。表４に、Ｋ５６２改変頻度を決定するために使用した試験部位の配列数およびＰ値を示し、表６に、各部位について得られた改変配列を示す。
表２：シークエンシングの統計。解釈可能な配列の総数（「全配列」）、および各ｉｎ ｖｉｔｒｏ選択条件ごとの分析配列の数を示す。分析配列は、ポスト選択配列の場合は、ＺＦＮ媒介切断のホールマークとしてこの研究で使用したサインである、少なくとも４塩基の逆相補的オーバーハング配列を含有した、曖昧なヌクレオチドを含有しない非反復配列である。「不適合オーバーハング」は、少なくとも４塩基の逆相補的オーバーハング配列を含有しなかった配列を指す。０．５ｎＭ、１ｎＭ、および２ｎＭの選択において反復配列が多く存在することは、反復配列が除去される前の、それらの選択で得られたシークエンシングリードの数が、すべての実験的選択ステップで残存した個々のＤＮＡ配列の数よりも大きかったことを示す。
表３：試験した両方のＺＦＮには、３つ以下の突然変異を含む標的部位の大部分を切断する能力がある。（ａ）ＣＣＲ５−２２４ ＺＦＮおよび（ｂ）ＶＦ２４６８ ＺＦＮにより切断され得る、１つ、２つ、または３つの突然変異（ｍｕｔ）を含む配列セットの百分率を示す。選択で同定された各配列に対する濃縮係数（ＥＦ）を、ポスト選択配列決定ライブラリー中のその配列の観察頻度を、プレ選択ライブラリー中のその配列の観察頻度で割ることによって算出した。各ｉｎ ｖｉｔｒｏ選択ストリンジェンシーについて計算した、野生型配列（ｗｔ ＥＦ）に対する濃縮係数を表の第１列に示す。
表４：潜在的なＣＣＲ５−２２４ゲノムオフターゲット部位。ヒトゲノムを、ＣＣＲ５−２２４切断に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ選択で残存したＤＮＡ配列について検索した。「Ｘ」マークが付いた部位は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ選択データセット中に見出された部位である。「Ｔ」は、部位中の突然変異の総数を指し、「（＋）」および「（−）」はそれぞれ、（＋）および（−）のハーフサイト中の突然変異の数を指す。ヒトゲノムのビルド（ｂｕｉｌｄ）３６からの染色体座標を記載する。各部位の突然変異頻度は、活性なＣＣＲ５−２２４を発現する培養Ｋ５６２細胞に由来する、配列決定されたＤＮＡ中の挿入または欠失（インデル）を含む配列の百分率である。赤色太字の部位は、空ベクターを含有する細胞に比較して、活性なヌクレアーゼ試料中に有意に濃縮されたインデル百分率を有する。部位の配列は、５’（＋）ハーフサイト／スペーサー／（−）ハーフサイト３’として記載しており、したがって、（＋）ハーフサイトは、配列プロファイルとは逆のセンスで記載されている。３つの部位は、部位特異的ＰＣＲ増幅産物を生じなかったので、試験しなかった。試験しなかったそれらの部位のインデルおよび合計は示していない。表示したＰ値は、インデル頻度が、ＺＦＮを発現しない細胞に対してよりも活性ＺＦＮ処理細胞に対して大きいという片側対立仮説に対するものである。
表５：ＣＣＲ５−２２４標的部位よりも多くの潜在的なゲノムＶＦ２４６８標的部位がある。ヒトゲノムを、正規ＣＣＲ５−２２４標的部位と最大９つの突然変異だけ異なる部位、および正規ＶＦ２４６８標的部位と最大６つの突然変異だけ異なる部位について、計算的に検索した。反復配列を含む、ゲノム中の５または６塩基対スペーサーを含有する部位の出現数を表に記載する。
表６：培養ヒトＫ５６２細胞において同定されたＣＣＲ５−２２４媒介ゲノムＤＮＡ改変配列。ＣＣＲ５−２２４を発現する培養Ｋ５６２細胞に由来する潜在的なＣＣＲ５−２２４オフターゲット部位をシークエンシングした後に同定された挿入（青）および欠失（赤）を含む配列を示す。出現数を各配列の右側に示す。他の突然変異は小文字で示すが、ＰＣＲまたはシークエンシングの間に発生した突然変異を反映している可能性がある。非改変部位は、遺伝子名または座標（ビルド３６）の下に記載し、またスペーサー配列に下線を付した。
表７：潜在的なＶＦ２４６８ゲノムオフターゲット部位。９７の潜在的なＶＦ２４６８ゲノム標的部位のうちの９０に対するＤＮＡを、活性なＶＦ２４６８ ＺＦＮを発現する培養Ｋ５６２細胞から、または空発現ベクターを含有する細胞からＰＣＲによって増幅した。各部位の突然変異頻度は、活性なＶＦ２４６８を発現する培養Ｋ５６２細胞に由来する、配列決定されたＤＮＡ中の挿入または欠失（インデル）を含む配列の百分率である。赤色太字の部位は、ヌクレアーゼを発現しない細胞に比較して、活性なヌクレアーゼ試料中に有意に濃縮されたインデル百分率を有する。部位の配列は、５’（＋）ハーフサイト／スペーサー／（−）ハーフサイト３’として記載されており、したがって、（＋）ハーフサイトは、配列プロファイルとは逆のセンスで記載されている。７つの部位は、部位特異的ＰＣＲ増幅産物を生じなかったので、試験しなかった。試験しなかったそれらの部位のインデルおよび合計は示していない。表示したＰ値は、インデル頻度が、ＺＦＮを発現しない細胞に対してよりも活性ＺＦＮ処理細胞に対して大きいという片側対立仮説に対するものである。
表８：この研究で使用したオリゴヌクレオチド。オリゴヌクレオチド「［ＺＦＮ］［＃］ｆｗｄ／ｒｅｖ」は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎに注文した。他のすべてのオリゴヌクレオチドは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓに注文した。「Ｎ」は、「Ａ」、「Ｃ」、「Ｇ」、または「Ｔ」の機械的な混合取り込みを指す。アスタリスクは、その前のヌクレオチドが、そのヌクレオチドを７９モル％含有し、かつ他の正規ヌクレオチドのそれぞれを７モル％含有する混合物として取り込まれたことを示す。「／５Ｐｈｏｓ」／は、合成の間に付加された５’リン酸基を示す。
ＶＦ２４６８データ
潜在的なＶＦ２４６８ゲノムオフターゲット部位。ヒトゲノムを、ＶＦ２４６８切断に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ選択で残存したＤＮＡ配列について検索した。「Ｘ」マークが付いた部位は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ選択データセット中に見出された部位である。「Ｔ」は、部位中の突然変異の総数を指し、「（＋）」および「（−）」はそれぞれ、（＋）および（−）のハーフサイト中の突然変異の数を指す。部位の配列は、ゲノム中に出現するとおりに記載しており、したがって、（−）ハーフサイトは、配列プロファイルとは逆のセンスで記載されている。

Claims (30)

  1. 部位特異的ヌクレアーゼの標的部位を同定するための方法であって、前記方法が、
    （ａ）二本鎖の核酸標的部位を切断し、５’オーバーハングを生成する部位特異的ヌクレアーゼを準備するステップであって、前記標的部位が、［左ハーフサイト］−［スペーサー配列］−［右ハーフサイト］（ＬＳＲ）構造を含み、前記ヌクレアーゼが、スペーサー配列内の標的部位を切断するステップと、
    （ｂ）前記部位特異的ヌクレアーゼが前記部位特異的ヌクレアーゼの標的部位を含む候補核酸分子を切断するのに適切な条件下で、候補核酸分子のライブラリーに前記部位特異的ヌクレアーゼを接触させるステップであって、各核酸分子が、候補ヌクレアーゼ標的部位および一定の挿入配列を含む配列のコンカテマーを含むステップと、
    （ｃ）前記部位特異的ヌクレアーゼにより２回切断され、一方の側に左ハーフサイトおよび切断スペーサー配列が隣接し、他方の側に右ハーフサイトおよび切断スペーサー配列が隣接した一定の挿入配列を含む核酸分子の５’オーバーハングを充填し、それによって平滑末端を作製するステップと、
    （ｄ）ステップ（ｃ）の核酸分子の左ハーフサイト、右ハーフサイト、および／またはスペーサー配列の配列を決定することにより、前記部位特異的ヌクレアーゼにより切断された前記ヌクレアーゼ標的部位を同定するステップとを含む、前記方法。
  2. ステップ（ｄ）の前記配列決定が、ステップ（ｃ）の核酸分子の平滑末端にシークエンシングアダプターを連結し、前記核酸分子の増幅および／またはシークエンシングを行うステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記方法が、前記シークエンシングアダプターの連結後、ＰＣＲにより前記核酸分子を増幅するステップをさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
  4. 単一の一定挿入配列を含む分子について、ステップ（ｃ）またはステップ（ｄ）の核酸分子を濃縮するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
  5. 前記濃縮ステップがサイズ分画を含む、請求項４に記載の方法。
  6. 前記サイズ分画がゲル精製によりなされる、請求項５に記載の方法。
  7. 前記方法が、５’オーバーハングが充填された相補対を前記核酸分子が含まなかった場合、ステップ（ｄ）で決定されたいかなる配列も廃棄するステップをさらに含む、および／または、
    ステップ（ｄ）で同定された複数のヌクレアーゼ標的部位を編集し、それによってヌクレアーゼ標的部位のプロファイルを作成するステップをさらに含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記部位特異的ヌクレアーゼが、疾患に関連した遺伝子中の特定のヌクレアーゼ標的部位を切断する治療用ヌクレアーゼである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記方法が、前記治療用ヌクレアーゼが、前記特定のヌクレアーゼ標的部位を切断し、かつ１０を超える、５を超える、４を超える、３を超える、２を超える、１を超える、さらなるヌクレアーゼ標的部位を切断しないか、またはまったく切断しない前記治療用ヌクレアーゼの最大濃度を決定するステップをさらに含む、請求項８に記載の方法。
  10. 前記部位特異的ヌクレアーゼが、切断ドメインが二量体形成すると標的配列を切断する核酸切断ドメインを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記部位特異的ヌクレアーゼがＦｏｋＩ切断ドメインを含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記部位特異的ヌクレアーゼが、核酸配列に特異的に結合する結合ドメインを含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 前記結合ドメインがジンクフィンガーを含む、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記結合ドメインが、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つのジンクフィンガーを含む、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記部位特異的ヌクレアーゼがジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）である、請求項１４に記載の方法。
  16. 前記結合ドメインが転写活性化因子様エレメントを含む、請求項１２に記載の方法。
  17. 前記部位特異的ヌクレアーゼが、転写活性化因子様エレメントヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）である、請求項１６に記載の方法。
  18. 前記部位特異的ヌクレアーゼが有機化合物、エンジイン、ホーミングエンドヌクレアーゼ、抗生物質、ジネミシン（ｄｙｎｅｍｉｃｉｎ）、ネオカルチノスタチン、カリチアマイシン、エスペラマイシン、ブレオマイシン、またはそれらの誘導体を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
  19. ゲノム内で部位特異的ヌクレアーゼについて標的部位を選択するための方法であって、前記方法が、
    （ａ）請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法を使用して候補ヌクレアーゼ標的部位を同定するステップと、
    （ｂ）汎用コンピューターを使用して、前記候補ヌクレアーゼ標的部位を前記ゲノム内の他の配列と比較するステップであって、前記候補ヌクレアーゼ標的部位が、ゲノム内の他のいかなる配列とも、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、または少なくとも１０ヌクレオチド異なる場合、そのヌクレアーゼ部位を選択するステップと
    を含む方法。
  20. ステップ（ｂ）で選択された候補ヌクレアーゼ部位を標的とするヌクレアーゼを設計および／または作製するステップをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
  21. 設計および／または作製が、組換え技術により行われる、請求項２０に記載の方法。
  22. 設計および／または作製が、前記選択された候補標的部位またはそのハーフサイトに特異的に結合する結合ドメインを設計するステップを含む、請求項２０または２１に記載の方法。
  23. 設計および／または作製が、前記結合ドメインと核酸切断ドメインとをコンジュゲートするステップを含む、請求項２０〜２２のいずれか一項に記載の方法。
  24. 前記部位特異的ヌクレアーゼを単離するステップをさらに含む、請求項１９〜２３のいずれか一項に記載の方法。
  25. 前記ヌクレアーゼが二量体ヌクレアーゼである、請求項１９〜２４のいずれか一項に記載の方法。
  26. 前記部位特異的ヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、もしくはホーミングエンドヌクレアーゼであるか、あるいは有機化合物ヌクレアーゼ、任意に、抗生物質ヌクレアーゼ、任意に、エンジイン、ジネミシン、ネオカルチノスタチン、カリチアマイシン、エスペラマイシン、ブレオマイシン、もしくはそれらの誘導体であるかまたはそれらを含む、請求項１９〜２４のいずれか一項に記載の方法。
  27. 前記候補標的部位が、その切断が疾患または障害の症候の緩和に関連することが知られているゲノム配列内にある、請求項１９〜２６のいずれか一項に記載の方法。
  28. 前記疾患がＨＩＶ／ＡＩＤＳまたは増殖性疾患である、請求項２７に記載の方法。
  29. 前記ゲノム配列がＣＣＲ５またはＶＥＧＦＡ配列である、請求項２７に記載の方法。
  30. 候補標的部位がゲノム内にあり、ここでゲノムが、脊椎動物、哺乳動物、ヒト、非ヒト霊長類、げっ歯類、マウス、ラット、ハムスター、ヤギ、ヒツジ、ウシ、イヌ、ネコ、爬虫類、両生類、魚類、線虫、昆虫、またはハエのゲノムである、請求項１９〜２９のいずれか一項に記載の方法。
JP2014522918A 2011-07-22 2012-07-22 ヌクレアーゼ切断特異性の評価および改善 Active JP6261500B2 (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161510841P 2011-07-22 2011-07-22
US61/510,841 2011-07-22
PCT/US2012/047778 WO2013066438A2 (en) 2011-07-22 2012-07-22 Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2017153168A Division JP6586136B2 (ja) 2011-07-22 2017-08-08 ヌクレアーゼ切断特異性の評価および改善

Publications (3)

Publication Number Publication Date
JP2014523747A JP2014523747A (ja) 2014-09-18
JP2014523747A5 JP2014523747A5 (ja) 2015-09-10
JP6261500B2 true JP6261500B2 (ja) 2018-01-17

Family

ID=48192977

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2014522918A Active JP6261500B2 (ja) 2011-07-22 2012-07-22 ヌクレアーゼ切断特異性の評価および改善
JP2017153168A Active JP6586136B2 (ja) 2011-07-22 2017-08-08 ヌクレアーゼ切断特異性の評価および改善
JP2019163067A Active JP7054686B2 (ja) 2011-07-22 2019-09-06 ヌクレアーゼ切断特異性の評価および改善

Family Applications After (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2017153168A Active JP6586136B2 (ja) 2011-07-22 2017-08-08 ヌクレアーゼ切断特異性の評価および改善
JP2019163067A Active JP7054686B2 (ja) 2011-07-22 2019-09-06 ヌクレアーゼ切断特異性の評価および改善

Country Status (6)

Country Link
US (3) US10323236B2 (ja)
EP (2) EP3613852A3 (ja)
JP (3) JP6261500B2 (ja)
AU (1) AU2012333134B2 (ja)
CA (1) CA2853829C (ja)
WO (1) WO2013066438A2 (ja)

Families Citing this family (54)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6261500B2 (ja) 2011-07-22 2018-01-17 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ ヌクレアーゼ切断特異性の評価および改善
GB2527450A (en) 2013-03-14 2015-12-23 Caribou Biosciences Inc Compositions and methods of nucleic acid-targeting nucleic acids
US9163284B2 (en) * 2013-08-09 2015-10-20 President And Fellows Of Harvard College Methods for identifying a target site of a Cas9 nuclease
US9359599B2 (en) 2013-08-22 2016-06-07 President And Fellows Of Harvard College Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof
US9322037B2 (en) 2013-09-06 2016-04-26 President And Fellows Of Harvard College Cas9-FokI fusion proteins and uses thereof
US9340800B2 (en) 2013-09-06 2016-05-17 President And Fellows Of Harvard College Extended DNA-sensing GRNAS
US9737604B2 (en) 2013-09-06 2017-08-22 President And Fellows Of Harvard College Use of cationic lipids to deliver CAS9
KR102523466B1 (ko) 2013-11-07 2023-04-20 에디타스 메디신, 인코포레이티드 지배적인 gRNA를 이용하는 CRISPR-관련 방법 및 조성물
EP3077510B1 (en) * 2013-12-02 2020-05-06 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Antisense compounds and uses thereof
US20150166982A1 (en) 2013-12-12 2015-06-18 President And Fellows Of Harvard College Methods for correcting pi3k point mutations
WO2015134812A1 (en) 2014-03-05 2015-09-11 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for treating usher syndrome and retinitis pigmentosa
US9938521B2 (en) 2014-03-10 2018-04-10 Editas Medicine, Inc. CRISPR/CAS-related methods and compositions for treating leber's congenital amaurosis 10 (LCA10)
US11339437B2 (en) 2014-03-10 2022-05-24 Editas Medicine, Inc. Compositions and methods for treating CEP290-associated disease
US11141493B2 (en) 2014-03-10 2021-10-12 Editas Medicine, Inc. Compositions and methods for treating CEP290-associated disease
WO2015148863A2 (en) 2014-03-26 2015-10-01 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for treating sickle cell disease
KR102425438B1 (ko) 2014-06-23 2022-07-27 더 제너럴 하스피탈 코포레이션 서열결정에 의해 평가된 DSB의 게놈 전체에 걸친 비편향된 확인 (GUIDE-Seq)
US10077453B2 (en) 2014-07-30 2018-09-18 President And Fellows Of Harvard College CAS9 proteins including ligand-dependent inteins
WO2016172727A1 (en) 2015-04-24 2016-10-27 Editas Medicine, Inc. Evaluation of cas9 molecule/guide rna molecule complexes
WO2017044843A1 (en) 2015-09-11 2017-03-16 The General Hospital Corporation Full interrogation of nuclease dsbs and sequencing (find-seq)
JP7109784B2 (ja) 2015-10-23 2022-08-01 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ 遺伝子編集のための進化したＣａｓ９蛋白質
US11512311B2 (en) 2016-03-25 2022-11-29 Editas Medicine, Inc. Systems and methods for treating alpha 1-antitrypsin (A1AT) deficiency
US10077459B2 (en) * 2016-05-04 2018-09-18 General Electric Company Cell-free protein expression using rolling circle amplification product
BR112019000430A2 (pt) * 2016-07-13 2019-07-09 Dsm Ip Assets Bv sistema crispr-cas para uma célula hospedeira de algas
AU2017305404B2 (en) 2016-08-02 2023-11-30 Editas Medicine, Inc. Compositions and methods for treating CEP290 associated disease
IL264565B2 (en) 2016-08-03 2024-07-01 Harvard College Adenosine nuclear base editors and their uses
EP3497214B1 (en) 2016-08-09 2023-06-28 President and Fellows of Harvard College Programmable cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof
WO2018039438A1 (en) 2016-08-24 2018-03-01 President And Fellows Of Harvard College Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing
JP2019530464A (ja) 2016-10-14 2019-10-24 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ 核酸塩基エディターのａａｖ送達
US10745677B2 (en) 2016-12-23 2020-08-18 President And Fellows Of Harvard College Editing of CCR5 receptor gene to protect against HIV infection
EP3592853A1 (en) 2017-03-09 2020-01-15 President and Fellows of Harvard College Suppression of pain by gene editing
KR20190127797A (ko) 2017-03-10 2019-11-13 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 시토신에서 구아닌으로의 염기 편집제
EP3596217A1 (en) 2017-03-14 2020-01-22 Editas Medicine, Inc. Systems and methods for the treatment of hemoglobinopathies
IL306092A (en) 2017-03-23 2023-11-01 Harvard College Nucleic base editors that include nucleic acid programmable DNA binding proteins
WO2018209158A2 (en) 2017-05-10 2018-11-15 Editas Medicine, Inc. Crispr/rna-guided nuclease systems and methods
US11560566B2 (en) 2017-05-12 2023-01-24 President And Fellows Of Harvard College Aptazyme-embedded guide RNAs for use with CRISPR-Cas9 in genome editing and transcriptional activation
CN111801345A (zh) 2017-07-28 2020-10-20 哈佛大学的校长及成员们 使用噬菌体辅助连续进化(pace)的进化碱基编辑器的方法和组合物
BR112020003596A2 (pt) 2017-08-23 2020-09-01 The General Hospital Corporation nucleases de crispr-cas9 engenheiradas com especificidade de pam alterada
US11319532B2 (en) 2017-08-30 2022-05-03 President And Fellows Of Harvard College High efficiency base editors comprising Gam
WO2019075197A1 (en) 2017-10-11 2019-04-18 The General Hospital Corporation METHODS OF DETECTION OF INDIVIDUAL SITE-SPECIFIC PARASITE GENOMIC DEAMINATION BY BASE EDITING TECHNOLOGIES
CA3082251A1 (en) 2017-10-16 2019-04-25 The Broad Institute, Inc. Uses of adenosine base editors
WO2019135816A2 (en) * 2017-10-23 2019-07-11 The Broad Institute, Inc. Novel nucleic acid modifiers
KR20200132924A (ko) 2018-03-14 2020-11-25 에디타스 메디신, 인코포레이티드 혈색소병증 치료를 위한 시스템 및 방법
EP3781585A4 (en) 2018-04-17 2022-01-26 The General Hospital Corporation SENSITIVE IN VITRO TESTS FOR SUBSTRATE PREFERENCES AND SITE FOR NUCLEIC ACID BINDERS, MODIFIERS AND CLEAVAGE AGENTS
KR20210003819A (ko) 2018-04-19 2021-01-12 더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아 유전자 편집을 위한 조성물 및 방법
AU2020242032A1 (en) 2019-03-19 2021-10-07 Massachusetts Institute Of Technology Methods and compositions for editing nucleotide sequences
WO2020264220A1 (en) * 2019-06-25 2020-12-30 The Translational Genomics Research Institute Detection and treatment of residual disease using circulating tumor dna analysis
WO2021226558A1 (en) 2020-05-08 2021-11-11 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for simultaneous editing of both strands of a target double-stranded nucleotide sequence
TW202208628A (zh) * 2020-05-13 2022-03-01 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 靶向顆粒蛋白前體之寡核苷酸促效劑
AU2022375820A1 (en) 2021-11-01 2024-06-13 Tome Biosciences, Inc. Single construct platform for simultaneous delivery of gene editing machinery and nucleic acid cargo
EP4452335A1 (en) 2021-12-22 2024-10-30 Tome Biosciences, Inc. Co-delivery of a gene editor construct and a donor template
WO2023205744A1 (en) 2022-04-20 2023-10-26 Tome Biosciences, Inc. Programmable gene insertion compositions
WO2023225670A2 (en) 2022-05-20 2023-11-23 Tome Biosciences, Inc. Ex vivo programmable gene insertion
WO2024020587A2 (en) 2022-07-22 2024-01-25 Tome Biosciences, Inc. Pleiopluripotent stem cell programmable gene insertion
WO2024138194A1 (en) 2022-12-22 2024-06-27 Tome Biosciences, Inc. Platforms, compositions, and methods for in vivo programmable gene insertion

Family Cites Families (1748)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4217344A (en) 1976-06-23 1980-08-12 L'oreal Compositions containing aqueous dispersions of lipid spheres
US4235871A (en) 1978-02-24 1980-11-25 Papahadjopoulos Demetrios P Method of encapsulating biologically active materials in lipid vesicles
US4186183A (en) 1978-03-29 1980-01-29 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Liposome carriers in chemotherapy of leishmaniasis
US4182449A (en) 1978-04-18 1980-01-08 Kozlow William J Adhesive bandage and package
US4261975A (en) 1979-09-19 1981-04-14 Merck & Co., Inc. Viral liposome particle
US4663290A (en) 1982-01-21 1987-05-05 Molecular Genetics, Inc. Production of reverse transcriptase
US4485054A (en) 1982-10-04 1984-11-27 Lipoderm Pharmaceuticals Limited Method of encapsulating biologically active materials in multilamellar lipid vesicles (MLV)
US4501728A (en) 1983-01-06 1985-02-26 Technology Unlimited, Inc. Masking of liposomes from RES recognition
US4880635B1 (en) 1984-08-08 1996-07-02 Liposome Company Dehydrated liposomes
US4897355A (en) 1985-01-07 1990-01-30 Syntex (U.S.A.) Inc. N[ω,(ω-1)-dialkyloxy]- and N-[ω,(ω-1)-dialkenyloxy]-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US4946787A (en) 1985-01-07 1990-08-07 Syntex (U.S.A.) Inc. N-(ω,(ω-1)-dialkyloxy)- and N-(ω,(ω-1)-dialkenyloxy)-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US5049386A (en) 1985-01-07 1991-09-17 Syntex (U.S.A.) Inc. N-ω,(ω-1)-dialkyloxy)- and N-(ω,(ω-1)-dialkenyloxy)Alk-1-YL-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US4797368A (en) 1985-03-15 1989-01-10 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Adeno-associated virus as eukaryotic expression vector
US4921757A (en) 1985-04-26 1990-05-01 Massachusetts Institute Of Technology System for delayed and pulsed release of biologically active substances
US4774085A (en) 1985-07-09 1988-09-27 501 Board of Regents, Univ. of Texas Pharmaceutical administration systems containing a mixture of immunomodulators
US5139941A (en) 1985-10-31 1992-08-18 University Of Florida Research Foundation, Inc. AAV transduction vectors
US4737323A (en) 1986-02-13 1988-04-12 Liposome Technology, Inc. Liposome extrusion method
US5017492A (en) 1986-02-27 1991-05-21 Life Technologies, Inc. Reverse transcriptase and method for its production
DE3751873T2 (de) 1986-04-09 1997-02-13 Genzyme Corp Genetisch transformierte Tiere, die ein gewünschtes Protein in Milch absondern
US5374553A (en) 1986-08-22 1994-12-20 Hoffmann-La Roche Inc. DNA encoding a thermostable nucleic acid polymerase enzyme from thermotoga maritima
US4889818A (en) 1986-08-22 1989-12-26 Cetus Corporation Purified thermostable enzyme
US5079352A (en) 1986-08-22 1992-01-07 Cetus Corporation Purified thermostable enzyme
US4920016A (en) 1986-12-24 1990-04-24 Linear Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US4837028A (en) 1986-12-24 1989-06-06 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
JPH0825869B2 (ja) 1987-02-09 1996-03-13 株式会社ビタミン研究所 抗腫瘍剤包埋リポソ−ム製剤
US4911928A (en) 1987-03-13 1990-03-27 Micro-Pak, Inc. Paucilamellar lipid vesicles
US4917951A (en) 1987-07-28 1990-04-17 Micro-Pak, Inc. Lipid vesicles formed of surfactants and steroids
ATE80604T1 (de) 1987-04-23 1992-10-15 Fmc Corp Insektizide cyclopropyl-substituierte di(aryl)verbindungen.
US4873316A (en) 1987-06-23 1989-10-10 Biogen, Inc. Isolation of exogenous recombinant proteins from the milk of transgenic mammals
HUT54407A (en) 1987-12-15 1991-02-28 Commw Scient Ind Res Org Process for producing ribozimes
US5244797B1 (en) 1988-01-13 1998-08-25 Life Technologies Inc Cloned genes encoding reverse transcriptase lacking rnase h activity
FR2632821B1 (fr) 1988-06-22 1990-11-16 Inst Kriobiologii Procede de conservation a basse temperature des embryons
EP1541682A3 (en) 1988-09-02 2005-07-06 Dyax Corp. Generation and selection of recombinant varied binding proteins
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
US5047342A (en) 1989-08-10 1991-09-10 Life Technologies, Inc. Cloning and expression of T5 DNA polymerase
US5270179A (en) 1989-08-10 1993-12-14 Life Technologies, Inc. Cloning and expression of T5 DNA polymerase reduced in 3'- to-5' exonuclease activity
CA2039718C (en) 1989-08-31 2003-02-25 John J. Rossi Chimeric dna-rna catalytic sequences
US5264618A (en) 1990-04-19 1993-11-23 Vical, Inc. Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
WO1991017424A1 (en) 1990-05-03 1991-11-14 Vical, Inc. Intracellular delivery of biologically active substances by means of self-assembling lipid complexes
US5580737A (en) 1990-06-11 1996-12-03 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. High-affinity nucleic acid ligands that discriminate between theophylline and caffeine
US5637459A (en) 1990-06-11 1997-06-10 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: chimeric selex
AU663474B2 (en) 1990-09-28 1995-10-12 F. Hoffmann-La Roche Ag 5' to 3' exonuclease mutations of thermostable DNA polymerases
JPH06502303A (ja) 1990-10-05 1994-03-17 バーネス，ウェーン・エム 熱安定性ｄｎａポリメラーゼ
CA2093664C (en) 1990-10-12 2003-07-29 Fritz Eckstein Modified ribozymes
US5173414A (en) 1990-10-30 1992-12-22 Applied Immune Sciences, Inc. Production of recombinant adeno-associated virus vectors
NZ314629A (en) 1991-01-17 2000-08-25 Gen Hospital Corp Use trans-splicing ribozymes to prepare medicaments for gene therapies
NZ241311A (en) 1991-01-17 1995-03-28 Gen Hospital Corp Rna sequence having trans-splicing activity, plant strains
DK0580737T3 (da) 1991-04-10 2004-11-01 Scripps Research Inst Heterodimere receptorbiblioteker ved anvendelse af phagemider
DE4216134A1 (de) 1991-06-20 1992-12-24 Europ Lab Molekularbiolog Synthetische katalytische oligonukleotidstrukturen
US6872816B1 (en) 1996-01-24 2005-03-29 Third Wave Technologies, Inc. Nucleic acid detection kits
US5652094A (en) 1992-01-31 1997-07-29 University Of Montreal Nucleozymes
JPH05274181A (ja) 1992-03-25 1993-10-22 Nec Corp ブレークポイント設定・解除方式
US5587308A (en) 1992-06-02 1996-12-24 The United States Of America As Represented By The Department Of Health & Human Services Modified adeno-associated virus vector capable of expression from a novel promoter
US5834247A (en) 1992-12-09 1998-11-10 New England Biolabs, Inc. Modified proteins comprising controllable intervening protein sequences or their elements methods of producing same and methods for purification of a target protein comprised by a modified protein
US5496714A (en) 1992-12-09 1996-03-05 New England Biolabs, Inc. Modification of protein by use of a controllable interveining protein sequence
US5434058A (en) 1993-02-09 1995-07-18 Arch Development Corporation Apolipoprotein B MRNA editing protein compositions and methods
US5436149A (en) 1993-02-19 1995-07-25 Barnes; Wayne M. Thermostable DNA polymerase with enhanced thermostability and enhanced length and efficiency of primer extension
EP0702716A4 (en) 1993-05-17 1999-05-26 Univ California GENTHERAPY FOR HIV INFECTION AND AIDS WITH THE AID OF RIBOZYMS
US5512462A (en) 1994-02-25 1996-04-30 Hoffmann-La Roche Inc. Methods and reagents for the polymerase chain reaction amplification of long DNA sequences
US5651981A (en) 1994-03-29 1997-07-29 Northwestern University Cationic phospholipids for transfection
US5874560A (en) 1994-04-22 1999-02-23 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Melanoma antigens and their use in diagnostic and therapeutic methods
US5912155A (en) 1994-09-30 1999-06-15 Life Technologies, Inc. Cloned DNA polymerases from Thermotoga neapolitana
US5614365A (en) 1994-10-17 1997-03-25 President & Fellow Of Harvard College DNA polymerase having modified nucleotide binding site for DNA sequencing
US5449639A (en) 1994-10-24 1995-09-12 Taiwan Semiconductor Manufacturing Company Ltd. Disposable metal anti-reflection coating process used together with metal dry/wet etch
US5767099A (en) 1994-12-09 1998-06-16 Genzyme Corporation Cationic amphiphiles containing amino acid or dervatized amino acid groups for intracellular delivery of therapeutic molecules
US6057153A (en) 1995-01-13 2000-05-02 Yale University Stabilized external guide sequences
US5795587A (en) 1995-01-23 1998-08-18 University Of Pittsburgh Stable lipid-comprising drug delivery complexes and methods for their production
US5830430A (en) 1995-02-21 1998-11-03 Imarx Pharmaceutical Corp. Cationic lipids and the use thereof
US5851548A (en) 1995-06-07 1998-12-22 Gen-Probe Incorporated Liposomes containing cationic lipids and vitamin D
US5773258A (en) 1995-08-25 1998-06-30 Roche Molecular Systems, Inc. Nucleic acid amplification using a reversibly inactivated thermostable enzyme
NO953680D0 (no) 1995-09-18 1995-09-18 Hans Prydz Cellesyklusenzymer
US5962313A (en) 1996-01-18 1999-10-05 Avigen, Inc. Adeno-associated virus vectors comprising a gene encoding a lyosomal enzyme
US6077705A (en) 1996-05-17 2000-06-20 Thomas Jefferson University Ribozyme-mediated gene replacement
US6887707B2 (en) 1996-10-28 2005-05-03 University Of Washington Induction of viral mutation by incorporation of miscoding ribonucleoside analogs into viral RNA
GB9701425D0 (en) 1997-01-24 1997-03-12 Bioinvent Int Ab A method for in vitro molecular evolution of protein function
US5981182A (en) 1997-03-13 1999-11-09 Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University Vector constructs for the selection and identification of open reading frames
US20040203109A1 (en) 1997-06-06 2004-10-14 Incyte Corporation Human regulatory proteins
US5849528A (en) 1997-08-21 1998-12-15 Incyte Pharmaceuticals, Inc.. Polynucleotides encoding a human S100 protein
US6355415B1 (en) 1997-09-29 2002-03-12 Ohio University Compositions and methods for the use of ribozymes to determine gene function
US6156509A (en) 1997-11-12 2000-12-05 Genencor International, Inc. Method of increasing efficiency of directed evolution of a gene using phagemid
US6429301B1 (en) 1998-04-17 2002-08-06 Whitehead Institute For Biomedical Research Use of a ribozyme to join nucleic acids and peptides
US6183998B1 (en) 1998-05-29 2001-02-06 Qiagen Gmbh Max-Volmer-Strasse 4 Method for reversible modification of thermostable enzymes
US8097648B2 (en) 1998-06-17 2012-01-17 Eisai R&D Management Co., Ltd. Methods and compositions for use in treating cancer
AU1115300A (en) 1998-10-13 2000-05-01 Advanced Research And Technology Institute, Inc. Assays for identifying functional alterations in the p53 tumor suppressor
ATE383331T1 (de) 1998-11-12 2008-01-15 Invitrogen Corp Transportreagentien
US7013219B2 (en) 1999-01-12 2006-03-14 Sangamo Biosciences, Inc. Regulation of endogenous gene expression in cells using zinc finger proteins
US6453242B1 (en) 1999-01-12 2002-09-17 Sangamo Biosciences, Inc. Selection of sites for targeting by zinc finger proteins and methods of designing zinc finger proteins to bind to preselected sites
US6599692B1 (en) 1999-09-14 2003-07-29 Sangamo Bioscience, Inc. Functional genomics using zinc finger proteins
US6534261B1 (en) 1999-01-12 2003-03-18 Sangamo Biosciences, Inc. Regulation of endogenous gene expression in cells using zinc finger proteins
US20090130718A1 (en) * 1999-02-04 2009-05-21 Diversa Corporation Gene site saturation mutagenesis
CA2365601A1 (en) 1999-03-29 2000-10-05 Kansai Technology Licensing Organization Co., Ltd. Novel cytidine deaminase
US6365410B1 (en) 1999-05-19 2002-04-02 Genencor International, Inc. Directed evolution of microorganisms
GB9920194D0 (en) 1999-08-27 1999-10-27 Advanced Biotech Ltd A heat-stable thermostable DNA polymerase for use in nucleic acid amplification
AU1661201A (en) 1999-11-18 2001-05-30 Epimmune, Inc. Heteroclitic analogs and related methods
JP2003514564A (ja) 1999-11-24 2003-04-22 エムシーエス マイクロ キャリア システムズ ゲーエムベーハー 核局在化シグナルまたはタンパク質導入領域の多量体を含むポリペプチド、および分子を細胞内へ移入するためのその使用法
IL150069A0 (en) 1999-12-06 2002-12-01 Sangamo Biosciences Inc Methods of using randomized libraries of zinc finger proteins for the identification of gene function
EP2207032A1 (en) 2000-02-08 2010-07-14 Sangamo BioSciences, Inc. Cells expressing zinc finger protein for drug discovery
US7378248B2 (en) 2000-03-06 2008-05-27 Rigel Pharmaceuticals, Inc. In vivo production of cyclic peptides for inhibiting protein-protein interaction
US7078208B2 (en) 2000-05-26 2006-07-18 Invitrogen Corporation Thermostable reverse transcriptases and uses thereof
US6573092B1 (en) 2000-10-10 2003-06-03 Genvec, Inc. Method of preparing a eukaryotic viral vector
AU2002227383B2 (en) 2000-10-30 2004-07-08 Euro-Celtique S.A. Controlled release hydrocodone formulations
US20040003420A1 (en) 2000-11-10 2004-01-01 Ralf Kuhn Modified recombinase
US7067650B1 (en) 2000-11-22 2006-06-27 National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology Ribozymes targeting bradeion transcripts and use thereof
AU2002227882B2 (en) * 2001-01-25 2007-06-28 Evolva Ltd Concatemers of differentially expressed multiple genes
US20050222030A1 (en) 2001-02-21 2005-10-06 Anthony Allison Modified annexin proteins and methods for preventing thrombosis
JP2004521625A (ja) 2001-02-27 2004-07-22 ユニバーシティー オブ ロチェスター アポリポタンパク質ＢｍＲＮＡ編集を改変するための方法および組成物
US7476500B1 (en) 2001-03-19 2009-01-13 President And Fellows Of Harvard College In vivo selection system for enzyme activity
US7678554B2 (en) 2001-03-19 2010-03-16 President And Fellows Of Harvard College Nucleic acid shuffling
US7807408B2 (en) 2001-03-19 2010-10-05 President & Fellows Of Harvard College Directed evolution of proteins
EP1832567A3 (en) 2001-03-19 2009-08-26 President And Fellows Of Harvard College Evolving new molecular function
US20040197892A1 (en) 2001-04-04 2004-10-07 Michael Moore Composition binding polypeptides
DK2322631T3 (en) 2001-04-19 2015-01-12 Scripps Research Inst Methods and compositions for the production of orthogonal tRNA-aminoacyl-tRNA syntetasepar
AU2002330714A1 (en) 2001-05-30 2003-01-02 Biomedical Center In silico screening for phenotype-associated expressed sequences
WO2003025118A2 (en) 2001-07-26 2003-03-27 Stratagene Multi-site mutagenesis
US20030167533A1 (en) 2002-02-04 2003-09-04 Yadav Narendra S. Intein-mediated protein splicing
ES2421596T3 (es) 2002-05-10 2013-09-04 Medical Res Council Desaminasa inducida por activación (AID)
WO2003104413A2 (en) 2002-06-05 2003-12-18 University Of Florida Production of pseudotyped recombinant aav virions
US9388459B2 (en) * 2002-06-17 2016-07-12 Affymetrix, Inc. Methods for genotyping
AU2003251905A1 (en) * 2002-07-12 2004-02-02 Affymetrix, Inc. Synthetic tag genes
EP1540013B1 (en) 2002-08-19 2015-07-08 The President and Fellows of Harvard College Evolving new molecular function
US7794931B2 (en) 2002-09-20 2010-09-14 Yale University Riboswitches, methods for their use, and compositions for use with riboswitches
US8017323B2 (en) 2003-03-26 2011-09-13 President And Fellows Of Harvard College Free reactant use in nucleic acid-templated synthesis
ATE412902T1 (de) 2003-04-14 2008-11-15 Caliper Life Sciences Inc Reduktion der migrations-shift-assay-interferenz
WO2004113495A2 (en) 2003-05-23 2004-12-29 The President And Fellows Of Harvard College Rna-based transcriptional regulators
WO2005002527A2 (en) 2003-07-03 2005-01-13 Massachusetts Institute Of Technology Sirt1 modulation of adipogenesis and adipose function
US7638297B2 (en) 2003-07-07 2009-12-29 The Scripps Research Institute Compositions of orthogonal lysyl-tRNA and aminoacyl-tRNA synthetase pairs and uses thereof
EP3222715A1 (en) 2003-08-08 2017-09-27 Sangamo BioSciences, Inc. Methods and compositions for targeted cleavage and recombination
US7670807B2 (en) 2004-03-10 2010-03-02 East Tennessee State Univ. Research Foundation RNA-dependent DNA polymerase from Geobacillus stearothermophilus
US7192739B2 (en) 2004-03-30 2007-03-20 President And Fellows Of Harvard College Ligand-dependent protein splicing
US7595179B2 (en) 2004-04-19 2009-09-29 Applied Biosystems, Llc Recombinant reverse transcriptases
US7919277B2 (en) 2004-04-28 2011-04-05 Danisco A/S Detection and typing of bacterial strains
US7476734B2 (en) 2005-12-06 2009-01-13 Helicos Biosciences Corporation Nucleotide analogs
US9012140B2 (en) 2004-07-06 2015-04-21 Societe de Commercialisation des Produits de la Recherche Appliquée Socpra Sciences et Génie S.E.C. Target-dependent nucleic acid adapter
US7851658B2 (en) 2004-08-17 2010-12-14 President And Fellows Of Harvard College Palladium-catalyzed carbon-carbon bond forming reactions
US8728526B2 (en) 2004-08-19 2014-05-20 The United States of America, Represented by Secretary of Department of Health and Human Services, NIH Coacervate microparticles useful for the sustained release administration of therapeutic agents
EP1799825B1 (en) 2004-10-05 2011-06-29 The California Institute of Technology Aptamer regulated nucleic acids and uses thereof
WO2006089045A2 (en) 2005-02-18 2006-08-24 Monogram Biosciences, Inc. Methods and compositions for determining hypersusceptibility of hiv-1 to non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors
JP2006248978A (ja) 2005-03-10 2006-09-21 Mebiopharm Co Ltd 新規なリポソーム製剤
US8183178B2 (en) 2005-06-17 2012-05-22 President And Fellows Of Harvard College Iterated branching reaction pathways via nucleic acid-mediated chemistry
WO2007011722A2 (en) 2005-07-15 2007-01-25 President And Fellows Of Harvard College Reaction discovery system
US9783791B2 (en) 2005-08-10 2017-10-10 Agilent Technologies, Inc. Mutant reverse transcriptase and methods of use
AU2015252023B2 (en) 2005-08-26 2017-06-29 Dupont Nutrition Biosciences Aps Use
EP2336362B1 (en) 2005-08-26 2018-09-19 DuPont Nutrition Biosciences ApS Use of crispr associated genes (cas)
AU2012244264B2 (en) 2005-08-26 2015-08-06 Dupont Nutrition Biosciences Aps Use
US20080241917A1 (en) 2005-09-30 2008-10-02 Hidetaka Akita Vector For Delivering Target Substance Into Nucleus or Cell
KR100784478B1 (ko) 2005-12-05 2007-12-11 한국과학기술원 기능요소의 동시 삽입에 의한 신기능을 갖는 단백질을제조하는 방법
US20080051317A1 (en) 2005-12-15 2008-02-28 George Church Polypeptides comprising unnatural amino acids, methods for their production and uses therefor
JP5364574B2 (ja) 2006-05-05 2013-12-11 モレキュラー、トランスファー、インコーポレイテッド 真核細胞のトランスフェクションのための新規試薬
ES2590925T3 (es) 2006-05-19 2016-11-24 Dupont Nutrition Biosciences Aps Microorganismos marcados y métodos de marcado
CA2656298A1 (en) 2006-06-02 2007-12-13 President And Fellows Of Harvard College Protein surface remodeling
EP2028272B1 (en) 2006-06-06 2014-01-08 Panasonic Corporation Method of modifying nucleotide chain
US7572618B2 (en) 2006-06-30 2009-08-11 Bristol-Myers Squibb Company Polynucleotides encoding novel PCSK9 variants
WO2008005529A2 (en) 2006-07-07 2008-01-10 The Trustees Columbia University In The City Of New York Cell-mediated directed evolution
US20120322861A1 (en) 2007-02-23 2012-12-20 Barry John Byrne Compositions and Methods for Treating Diseases
ES2719789T3 (es) 2007-03-02 2019-07-16 Dupont Nutrition Biosci Aps Cultivos con resistencia mejorada a fagos
WO2009002418A2 (en) 2007-06-21 2008-12-31 Merck & Co., Inc. T-cell peptide epitopes from carcinoembryonic antigen, immunogenic analogs, and uses thereof
FR2919804B1 (fr) 2007-08-08 2010-08-27 Erytech Pharma Composition et vaccin therapeutique anti-tumoral
WO2009033027A2 (en) 2007-09-05 2009-03-12 Medtronic, Inc. Suppression of scn9a gene expression and/or function for the treatment of pain
WO2009042163A2 (en) * 2007-09-27 2009-04-02 Sangamo Biosciences, Inc. Rapid in vivo identification of biologically active nucleases
US9029524B2 (en) 2007-12-10 2015-05-12 California Institute Of Technology Signal activated RNA interference
EP2087789A1 (en) 2008-02-06 2009-08-12 Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf Fto-modified non-human mammal
US20090215878A1 (en) 2008-02-08 2009-08-27 Sangamo Biosciences, Inc. Treatment of chronic pain with zinc finger proteins
GB0806562D0 (en) 2008-04-10 2008-05-14 Fermentas Uab Production of nucleic acid
WO2009146179A1 (en) 2008-04-15 2009-12-03 University Of Iowa Research Foundation Zinc finger nuclease for the cftr gene and methods of use thereof
EP2297182A4 (en) 2008-04-28 2012-08-15 Harvard College SUPER-LOADED PROTEINS FOR CELL PENETRATION
US8394604B2 (en) 2008-04-30 2013-03-12 Paul Xiang-Qin Liu Protein splicing using short terminal split inteins
WO2010011961A2 (en) 2008-07-25 2010-01-28 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Prokaryotic rnai-like system and methods of use
FR2934346B1 (fr) 2008-07-28 2010-09-03 Claude Benit Valve pour installation sanitaire et dispositif multifonction pour appareil sanitaire comprenant une telle valve
JP2010033344A (ja) 2008-07-29 2010-02-12 Azabu Jui Gakuen 核酸構成塩基の偏在性を表す方法
EP2159286A1 (en) 2008-09-01 2010-03-03 Consiglio Nazionale Delle Ricerche Method for obtaining oligonucleotide aptamers and uses thereof
JP5723774B2 (ja) 2008-09-05 2015-05-27 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ タンパク質および核酸の連続的指向性進化
US8790664B2 (en) 2008-09-05 2014-07-29 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Multimodular assembly useful for intracellular delivery
US8636884B2 (en) 2008-09-15 2014-01-28 Abbott Diabetes Care Inc. Cationic polymer based wired enzyme formulations for use in analyte sensors
US20100076057A1 (en) 2008-09-23 2010-03-25 Northwestern University TARGET DNA INTERFERENCE WITH crRNA
US9404098B2 (en) 2008-11-06 2016-08-02 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Method for cleaving a target RNA using a Cas6 polypeptide
DK2362915T3 (en) 2008-11-07 2017-03-27 Dupont Nutrition Biosci Aps CRISPR SEQUENCES OF BIFIDOBACTERIA
US20110016540A1 (en) 2008-12-04 2011-01-20 Sigma-Aldrich Co. Genome editing of genes associated with trinucleotide repeat expansion disorders in animals
CA2746632C (en) 2008-12-11 2020-06-30 Pacific Biosciences Of California, Inc. Characterization of modified nucleic acids
US9175338B2 (en) 2008-12-11 2015-11-03 Pacific Biosciences Of California, Inc. Methods for identifying nucleic acid modifications
WO2010075424A2 (en) 2008-12-22 2010-07-01 The Regents Of University Of California Compositions and methods for downregulating prokaryotic genes
EP2393933A4 (en) 2009-02-04 2013-05-01 Lucigen Corp RNA AND DNA COPIERING ENZYMES
US20100305197A1 (en) 2009-02-05 2010-12-02 Massachusetts Institute Of Technology Conditionally Active Ribozymes And Uses Thereof
WO2010091294A2 (en) 2009-02-05 2010-08-12 The Regents Of The University Of California New targeted antimicrobial moieties
JP5713925B2 (ja) 2009-03-06 2015-05-07 シンセティック ジェノミクス インコーポレーテッド ゲノムのクローニングおよび操作のための方法
WO2010129019A2 (en) 2009-04-27 2010-11-11 Pacific Biosciences Of California, Inc. Real-time sequencing methods and systems
US9221886B2 (en) 2009-04-28 2015-12-29 President And Fellows Of Harvard College Supercharged proteins for cell penetration
WO2010144150A2 (en) 2009-06-12 2010-12-16 Pacific Biosciences Of California, Inc. Real-time analytical methods and systems
JP5798116B2 (ja) 2009-06-30 2015-10-21 サンガモ バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド 生物活性のあるヌクレアーゼの迅速なスクリーニングおよびヌクレアーゼ修飾細胞の単離
WO2011000106A1 (en) 2009-07-01 2011-01-06 Protiva Biotherapeutics, Inc. Improved cationic lipids and methods for the delivery of therapeutic agents
NZ598457A (en) 2009-08-03 2014-06-27 Recombinetics Inc Methods and compositions for targeted gene modification
US20120178647A1 (en) 2009-08-03 2012-07-12 The General Hospital Corporation Engineering of zinc finger arrays by context-dependent assembly
GB0913681D0 (en) 2009-08-05 2009-09-16 Glaxosmithkline Biolog Sa Immunogenic composition
US8889394B2 (en) 2009-09-07 2014-11-18 Empire Technology Development Llc Multiple domain proteins
DK2494060T3 (en) 2009-10-30 2016-08-01 Synthetic Genomics Inc Coding of text for nucleic acid sequences
BR112012010202A2 (pt) 2009-11-02 2015-09-22 Univ Washington molécula de nuclease hibrida polipeptideo dimerico, composição farmacêutica molécula de acido nucleico vetor de expressão recombinante célula hospedeira transformada metodo para preparar a molécula de nuclease e metodo para tratar ou previnir uma condição associada com uma imune anormal
US20110104787A1 (en) 2009-11-05 2011-05-05 President And Fellows Of Harvard College Fusion Peptides That Bind to and Modify Target Nucleic Acid Sequences
EP3403647A1 (en) 2009-12-01 2018-11-21 Translate Bio, Inc. Delivery of mrna for the augmentation of proteins and enzymes in human genetic diseases
WO2011068916A1 (en) 2009-12-01 2011-06-09 Intezyne Technologies, Incorporated Pegylated polyplexes for polynucleotide delivery
KR102110725B1 (ko) 2009-12-10 2020-05-13 리전츠 오브 더 유니버스티 오브 미네소타 Ｔａｌ 이펙터-매개된 ｄｎａ 변형
JP2013514779A (ja) 2009-12-18 2013-05-02 ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティ 脱メチル化および細胞の再プログラミングを促進するためのシチジンデアミナーゼ関連薬剤の使用
EA031356B1 (ru) 2010-01-22 2018-12-28 ДАУ АГРОСАЙЕНСИЗ ЭлЭлСи Вырезание трансгенов в генетически измененных организмах
EA031322B1 (ru) * 2010-01-22 2018-12-28 Дау Агросайенсиз Ллс Клетка или клеточная линия для экспрессии экзогенных нуклеотидных последовательностей и применение клетки или клеточной линии
WO2011091396A1 (en) 2010-01-25 2011-07-28 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of mylip/idol gene
JP2013520989A (ja) 2010-03-05 2013-06-10 シンセティック ジェノミクス インコーポレーテッド ゲノムのクローニングおよび操作のための方法
GB201004575D0 (en) 2010-03-19 2010-05-05 Immatics Biotechnologies Gmbh Composition of tumor associated peptides and related anti cancer vaccine for the treatment of gastric cancer and other cancers
WO2011123830A2 (en) 2010-04-02 2011-10-06 Amunix Operating Inc. Alpha 1-antitrypsin compositions and methods of making and using same
SG185481A1 (en) 2010-05-10 2012-12-28 Univ California Endoribonuclease compositions and methods of use thereof
JP6208580B2 (ja) 2010-05-17 2017-10-04 サンガモ セラピューティクス， インコーポレイテッド 新規のｄｎａ結合タンパク質及びその使用
GB201008267D0 (en) 2010-05-18 2010-06-30 Univ Edinburgh Cationic lipids
US20130164271A1 (en) 2010-05-27 2013-06-27 Max-Planck-Gesellschaft Zur Foederug Der Wissensch E.V. Tailored recombinase for recombining asymmetric target sites in a plurality of retrovirus strains
EP2575767B1 (en) 2010-06-04 2017-01-04 Sirna Therapeutics, Inc. Novel low molecular weight cationic lipids for oligonucleotide delivery
EP2392208B1 (en) 2010-06-07 2016-05-04 Helmholtz Zentrum München Deutsches Forschungszentrum für Gesundheit und Umwelt (GmbH) Fusion proteins comprising a DNA-binding domain of a Tal effector protein and a non-specific cleavage domain of a restriction nuclease and their use
JP2013534417A (ja) 2010-06-14 2013-09-05 アイオワ ステート ユニバーシティ リサーチ ファウンデーション，インコーポレーティッド Ｔａｌエフェクターとｆｏｋｉの融合タンパク質のヌクレアーゼ活性
CA2807552A1 (en) 2010-08-06 2012-02-09 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
JPWO2012020759A1 (ja) 2010-08-13 2013-10-28 国立大学法人京都大学 変異型逆転写酵素
WO2012040234A1 (en) 2010-09-20 2012-03-29 Spi Pharma, Inc. Microencapsulation process and product
US9951341B2 (en) 2010-10-20 2018-04-24 Dupont Nutrition Biosciences Aps Lactococcus CRISPR-Cas sequences
WO2012054727A1 (en) 2010-10-22 2012-04-26 Bio-Rad Laboratories, Inc. Reverse transcriptase mixtures with improved storage stability
WO2012070031A1 (en) 2010-11-26 2012-05-31 University Of The Witwatersrand, Johannesburg Polymeric matrix of polymer-lipid nanoparticles as a pharmaceutical dosage form
KR101255338B1 (ko) 2010-12-15 2013-04-16 포항공과대학교 산학협력단 표적 세포에 대한 폴리뉴클레오티드 전달체
JP6143675B2 (ja) 2010-12-16 2017-06-07 セルジーン コーポレイション 難溶性薬物の制御放出経口剤形及びその使用
AU2011348204B2 (en) 2010-12-22 2017-03-02 President And Fellows Of Harvard College Continuous directed evolution
US9499592B2 (en) 2011-01-26 2016-11-22 President And Fellows Of Harvard College Transcription activator-like effectors
KR101818126B1 (ko) 2011-02-09 2018-01-15 (주)바이오니아 열안정성이 증가된 역전사효소
US9528124B2 (en) 2013-08-27 2016-12-27 Recombinetics, Inc. Efficient non-meiotic allele introgression
US9200045B2 (en) 2011-03-11 2015-12-01 President And Fellows Of Harvard College Small molecule-dependent inteins and uses thereof
US9164079B2 (en) 2011-03-17 2015-10-20 Greyledge Technologies Llc Systems for autologous biological therapeutics
US20120244601A1 (en) 2011-03-22 2012-09-27 Bertozzi Carolyn R Riboswitch based inducible gene expression platform
JP2012210172A (ja) 2011-03-30 2012-11-01 Japan Science & Technology Agency 外部環境に応答して内部の物質組成を変えるリポソーム
US8709466B2 (en) 2011-03-31 2014-04-29 International Business Machines Corporation Cationic polymers for antimicrobial applications and delivery of bioactive materials
WO2012138939A1 (en) 2011-04-05 2012-10-11 Philippe Duchateau New tale-protein scaffolds and uses thereof
WO2012138487A2 (en) 2011-04-07 2012-10-11 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Oligonucleotide modulation of splicing
US10092660B2 (en) 2011-04-25 2018-10-09 Stc.Unm Solid compositions for pharmaceutical use
KR102068107B1 (ko) 2011-04-27 2020-01-20 아미리스 인코퍼레이티드 게놈 변형 방법
US20140201858A1 (en) 2011-05-17 2014-07-17 Transposagen Biopharmaceuticals, Inc Methods for site-specific genetic modification in stem cells using xanthomonas tal nucleases (xtn) for the creation of model organisms
US8691750B2 (en) 2011-05-17 2014-04-08 Axolabs Gmbh Lipids and compositions for intracellular delivery of biologically active compounds
WO2012158985A2 (en) 2011-05-17 2012-11-22 Transposagen Biopharmaceuticals, Inc. Methods for site-specific genetic modification in spermatogonial stem cells using zinc finger nuclease (zfn) for the creation of model organisms
WO2012164565A1 (en) 2011-06-01 2012-12-06 Yeda Research And Development Co. Ltd. Compositions and methods for downregulating prokaryotic genes
ES2740248T3 (es) 2011-06-08 2020-02-05 Translate Bio Inc Composiciones de nanopartículas lipídicas y métodos para la administración ARNm
JP6214530B2 (ja) 2011-07-15 2017-10-18 ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション 転写活性化因子様エフェクターの組立て方法
WO2013013105A2 (en) 2011-07-19 2013-01-24 Vivoscript,Inc. Compositions and methods for re-programming cells without genetic modification for repairing cartilage damage
JP6261500B2 (ja) 2011-07-22 2018-01-17 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ ヌクレアーゼ切断特異性の評価および改善
WO2013039857A1 (en) 2011-09-12 2013-03-21 modeRNA Therapeutics Engineered nucleic acids and methods of use thereof
EP3384938A1 (en) 2011-09-12 2018-10-10 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
CA2850346C (en) 2011-09-28 2020-02-18 Ribomic Inc. Ngf aptamer and application thereof
EP2761006B1 (en) 2011-09-28 2016-12-14 Zera Intein Protein Solutions, S.L. Split inteins and uses thereof
CN103088008B (zh) 2011-10-31 2014-08-20 中国科学院微生物研究所 胞苷脱氨酶及其编码基因和它们的应用
US9066967B2 (en) 2011-12-08 2015-06-30 Sarepta Therapeutics, Inc. Oligonucleotide analogues targeting human LMNA
EP2790708B1 (en) 2011-12-16 2024-10-23 Targetgene Biotechnologies Ltd. Compositions and methods for modifying a predetermined target nucleic acid sequence
RU2649364C2 (ru) 2011-12-16 2018-04-02 Модерна Терапьютикс, Инк. Составы на основе модифицированного нуклеозида, нуклеотида и нуклеиновой кислоты
GB201122458D0 (en) 2011-12-30 2012-02-08 Univ Wageningen Modified cascade ribonucleoproteins and uses thereof
US9737480B2 (en) 2012-02-06 2017-08-22 President And Fellows Of Harvard College ARRDC1-mediated microvesicles (ARMMs) and uses thereof
RU2650811C2 (ru) 2012-02-24 2018-04-17 Фред Хатчинсон Кэнсер Рисерч Сентер Композиции и способы лечения гемоглобинопатии
CA2865011C (en) 2012-02-29 2021-06-15 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for treating huntington's disease
BR112014023005A2 (pt) 2012-03-17 2017-07-18 Univ California diagnóstico rápido e tratamentos personalizados para acne
WO2013141680A1 (en) 2012-03-20 2013-09-26 Vilnius University RNA-DIRECTED DNA CLEAVAGE BY THE Cas9-crRNA COMPLEX
US9637739B2 (en) 2012-03-20 2017-05-02 Vilnius University RNA-directed DNA cleavage by the Cas9-crRNA complex
WO2013152359A1 (en) 2012-04-06 2013-10-10 The Regents Of The University Of California Novel tetrazines and method of synthesizing the same
CA2871008C (en) 2012-04-23 2022-11-22 Bayer Cropscience Nv Targeted genome engineering in plants
RU2658437C2 (ru) 2012-05-02 2018-06-21 ДАУ АГРОСАЙЕНСИЗ ЭлЭлСи Направленная модификация малатдегидрогеназы
RU2650819C2 (ru) 2012-05-07 2018-04-17 Сангамо Терапьютикс, Инк. Способы и композиции для опосредованной нуклеазой направленной интеграции трансгенов
US11120889B2 (en) 2012-05-09 2021-09-14 Georgia Tech Research Corporation Method for synthesizing a nuclease with reduced off-site cleavage
CA3133545C (en) 2012-05-25 2023-08-08 Cellectis Use of pre t alpha or functional variant thereof for expanding tcr alpha deficient t cells
US20150017136A1 (en) 2013-07-15 2015-01-15 Cellectis Methods for engineering allogeneic and highly active t cell for immunotherapy
HUE038850T2 (hu) 2012-05-25 2018-11-28 Univ California Eljárások és kompozíciók cél-DNS RNS-irányított módosításához és transzkripció RNS-irányított modulálásához
BR112014030007A2 (pt) 2012-05-30 2017-06-27 Baylor College Medicine minivetores superenrolados como uma ferramenta para reparação, alteração e substituição de dna
US9102936B2 (en) 2012-06-11 2015-08-11 Agilent Technologies, Inc. Method of adaptor-dimer subtraction using a CRISPR CAS6 protein
MX2014015204A (es) 2012-06-12 2015-08-07 Genentech Inc Metodos y composiciones para generar alelos con inactivacion condicional.
EP2674501A1 (en) 2012-06-14 2013-12-18 Agence nationale de sécurité sanitaire de l'alimentation,de l'environnement et du travail Method for detecting and identifying enterohemorrhagic Escherichia coli
WO2013188638A2 (en) 2012-06-15 2013-12-19 The Regents Of The University Of California Endoribonucleases and methods of use thereof
US20150225734A1 (en) 2012-06-19 2015-08-13 Regents Of The University Of Minnesota Gene targeting in plants using dna viruses
US9267127B2 (en) 2012-06-21 2016-02-23 President And Fellows Of Harvard College Evolution of bond-forming enzymes
US20150344549A1 (en) 2012-06-27 2015-12-03 The Trustees Of Princeton University Split inteins, conjugates and uses thereof
DK2867361T3 (da) 2012-06-29 2018-01-29 Massachusetts Inst Technology Omfangsrig parallel kombinatorisk genetik
US9125508B2 (en) 2012-06-30 2015-09-08 Seasons 4, Inc. Collapsible tree system
EP2872154B1 (en) 2012-07-11 2017-05-31 Sangamo BioSciences, Inc. Methods and compositions for delivery of biologics
HUE041553T2 (hu) 2012-07-11 2019-05-28 Sangamo Therapeutics Inc Lizoszomális tárolási betegségek (LSD) kezelése és génterápia
CN105188767A (zh) 2012-07-25 2015-12-23 布罗德研究所有限公司 可诱导的dna结合蛋白和基因组干扰工具及其应用
US10058078B2 (en) 2012-07-31 2018-08-28 Recombinetics, Inc. Production of FMDV-resistant livestock by allele substitution
EP2879678B1 (en) 2012-07-31 2023-03-01 Yeda Research and Development Co. Ltd. Enoxacin for treating amyotrophic lateral sclerosis
WO2014022702A2 (en) 2012-08-03 2014-02-06 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for controlling gene expression by rna processing
SG11201500852WA (en) 2012-08-29 2015-04-29 Sangamo Biosciences Inc Methods and compositions for treatment of a genetic condition
AU2013312801B2 (en) 2012-09-04 2018-11-15 The Scripps Research Institute Chimeric polypeptides having targeted binding specificity
CA2883502C (en) 2012-09-04 2021-05-04 Cellectis Multi-chain chimeric antigen receptor and uses thereof
WO2014039513A2 (en) 2012-09-04 2014-03-13 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Inhibition of diacylglycerol kinase to augment adoptive t cell transfer
UA119135C2 (uk) 2012-09-07 2019-05-10 ДАУ АГРОСАЙЄНСІЗ ЕлЕлСі Спосіб отримання трансгенної рослини
CN105264067B (zh) 2012-09-07 2020-11-10 美国陶氏益农公司 Fad3性能基因座及相应的能够诱导靶向断裂的靶位点特异性结合蛋白
US20140075593A1 (en) 2012-09-07 2014-03-13 Dow Agrosciences Llc Fluorescence activated cell sorting (facs) enrichment to generate plants
UA118090C2 (uk) 2012-09-07 2018-11-26 ДАУ АГРОСАЙЄНСІЗ ЕлЕлСі Спосіб інтегрування послідовності нуклеїнової кислоти, що представляє інтерес, у ген fad2 у клітині сої та специфічний для локусу fad2 білок, що зв'язується, здатний індукувати спрямований розрив
WO2014043143A1 (en) 2012-09-11 2014-03-20 Life Technologies Corporation Nucleic acid amplification
GB201216564D0 (en) 2012-09-17 2012-10-31 Univ Edinburgh Genetically edited animal
US10612053B2 (en) 2012-09-18 2020-04-07 The Translational Genomics Research Institute Isolated genes and transgenic organisms for producing biofuels
US9181535B2 (en) 2012-09-24 2015-11-10 The Chinese University Of Hong Kong Transcription activator-like effector nucleases (TALENs)
US10047352B2 (en) 2012-10-03 2018-08-14 Agrivida, Inc. Intein-modified proteases, their production and industrial applications
EP3763810A3 (en) 2012-10-10 2021-07-14 Sangamo Therapeutics, Inc. T cell modifying compounds and uses thereof
EP2906602B1 (en) 2012-10-12 2019-01-16 The General Hospital Corporation Transcription activator-like effector (tale) - lysine-specific demethylase 1 (lsd1) fusion proteins
ES2926021T3 (es) 2012-10-23 2022-10-21 Toolgen Inc Composición para escindir un ADN objetivo que comprende un ARN guía específico para el ADN objetivo y ácido nucleico codificador de proteína Cas o proteína Cas, y uso de la misma
US20140115728A1 (en) 2012-10-24 2014-04-24 A. Joseph Tector Double knockout (gt/cmah-ko) pigs, organs and tissues
MX2015005255A (es) 2012-10-30 2015-10-29 Recombinetics Inc Control de la maduracion sexual en animales.
US20150291967A1 (en) 2012-10-31 2015-10-15 Luc Mathis Coupling herbicide resistance with targeted insertion of transgenes in plants
AR093296A1 (es) 2012-10-31 2015-05-27 Kiss György Botond Identificacion de un gen de resistencia a xanthomonas euvesicatoria de pimienta (capsicum annuum) y metodo para generar plantas a esa resistencia
US20150315576A1 (en) 2012-11-01 2015-11-05 Massachusetts Institute Of Technology Genetic device for the controlled destruction of dna
RU2019143431A (ru) 2012-11-01 2020-04-28 Фэктор Байосайенс Инк. Способы и продукты для экспрессии белков в клетках
US20140127752A1 (en) 2012-11-07 2014-05-08 Zhaohui Zhou Method, composition, and reagent kit for targeted genomic enrichment
EP2917336B1 (en) 2012-11-09 2018-06-27 Marco Archetti Diffusible factors and cancer cells
EP2922960A4 (en) 2012-11-20 2016-06-29 Cold Spring Harbor Lab MUTATIONS FOR SOLANACEAE PLANTS FOR MODULATING SPRING ARCHITECTURE AND IMPROVING PERFORMANCE-RELATED PHENOTYPES
US9756871B2 (en) 2012-11-20 2017-09-12 J.R. Simplot Company TAL-mediated transfer DNA insertion
US20140140969A1 (en) 2012-11-20 2014-05-22 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for muscular dystrophies
CN109554350B (zh) 2012-11-27 2022-09-23 儿童医疗中心有限公司 用于胎儿血红蛋白再诱导的靶向bcl11a远端调控元件
US20140150135A1 (en) 2012-11-29 2014-05-29 North Carolina State University Synthetic Pathway for Biological Carbon Dioxide Sequestration
WO2014085830A2 (en) 2012-11-30 2014-06-05 The Parkinson's Institute Screening assays for therapeutics for parkinson's disease
WO2014082644A1 (en) 2012-11-30 2014-06-05 WULFF, Peter, Samuel Circular rna for inhibition of microrna
AU2013355327A1 (en) 2012-12-05 2015-06-11 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for regulation of metabolic disorders
WO2014089533A2 (en) 2012-12-06 2014-06-12 Synthetic Genomics, Inc. Algal mutants having a locked-in high light acclimated phenotype
EP3141604A1 (en) 2012-12-06 2017-03-15 Sigma-Aldrich Co. LLC Crispr-based genome modification and regulation
US9447422B2 (en) 2012-12-06 2016-09-20 Synthetic Genomics, Inc. Autonomous replication sequences and episomal DNA molecules
WO2014089348A1 (en) 2012-12-07 2014-06-12 Synthetic Genomics, Inc. Nannochloropsis spliced leader sequences and uses therefor
EP2928303A4 (en) 2012-12-07 2016-07-13 Haplomics Inc FACTOR VIII MUTATION REPAIR AND TOLERANCE INDUCTION
WO2014093479A1 (en) 2012-12-11 2014-06-19 Montana State University Crispr (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) rna-guided control of gene regulation
IL239317B (en) 2012-12-12 2022-07-01 Broad Inst Inc Providing, engineering and optimizing systems, methods and compositions for sequence manipulation and therapeutic applications
BR122021008308B1 (pt) 2012-12-12 2022-12-27 The Broad Institute, Inc. Sistemas de componente crispr-cas, métodos e composições para manipulação de sequência
CN105121648B (zh) 2012-12-12 2021-05-07 布罗德研究所有限公司 用于序列操纵的系统、方法和优化的指导组合物的工程化
ES2618531T3 (es) 2012-12-12 2017-06-21 The Broad Institute, Inc. Sistemas, métodos y composiciones de componentes de CRISPR-Cas para manipulación de secuencias
AU2013359212B2 (en) 2012-12-12 2017-01-19 Massachusetts Institute Of Technology Engineering and optimization of improved systems, methods and enzyme compositions for sequence manipulation
WO2014093701A1 (en) 2012-12-12 2014-06-19 The Broad Institute, Inc. Functional genomics using crispr-cas systems, compositions, methods, knock out libraries and applications thereof
WO2014093709A1 (en) 2012-12-12 2014-06-19 The Broad Institute, Inc. Methods, models, systems, and apparatus for identifying target sequences for cas enzymes or crispr-cas systems for target sequences and conveying results thereof
WO2014093655A2 (en) 2012-12-12 2014-06-19 The Broad Institute, Inc. Engineering and optimization of systems, methods and compositions for sequence manipulation with functional domains
US20140310830A1 (en) 2012-12-12 2014-10-16 Feng Zhang CRISPR-Cas Nickase Systems, Methods And Compositions For Sequence Manipulation in Eukaryotes
US8697359B1 (en) 2012-12-12 2014-04-15 The Broad Institute, Inc. CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products
EP3031921A1 (en) 2012-12-12 2016-06-15 The Broad Institute, Inc. Delivery, engineering and optimization of systems, methods and compositions for sequence manipulation and therapeutic applications
EP2931901A1 (en) 2012-12-13 2015-10-21 Dow AgroSciences LLC Precision gene targeting to a particular locus in maize
JP6473419B2 (ja) 2012-12-13 2019-02-20 ダウ アグロサイエンシィズ エルエルシー 部位特異的ヌクレアーゼ活性のｄｎａ検出方法
WO2014093852A1 (en) 2012-12-13 2014-06-19 Massachusetts Institute Of Technology Recombinase-based logic and memory systems
WO2014099750A2 (en) 2012-12-17 2014-06-26 President And Fellows Of Harvard College Rna-guided human genome engineering
CA2895909C (en) 2012-12-21 2021-07-06 Cellectis Potatoes with reduced cold-induced sweetening
CN105025701B (zh) 2012-12-27 2018-09-25 凯津公司 去除植物中遗传连锁的方法
AU2014205648B2 (en) 2013-01-10 2017-05-04 Dharmacon, Inc. Templates, libraries, kits and methods for generating molecules
EP2943060A4 (en) 2013-01-14 2016-11-09 Recombinetics Inc LIVESTOCK WITHOUT HORN
CN113005148A (zh) 2013-01-16 2021-06-22 爱默蕾大学 Cas9-核酸复合物及其相关用途
CN103233028B (zh) 2013-01-25 2015-05-13 南京徇齐生物技术有限公司 一种无物种限制无生物安全性问题的真核生物基因打靶方法及螺旋结构dna序列
MX2015010017A (es) 2013-02-05 2016-03-04 Univ Georgia Lineas celulares para la produccion de virus y metodos de uso.
US10660943B2 (en) 2013-02-07 2020-05-26 The Rockefeller University Sequence specific antimicrobials
PL2963113T3 (pl) 2013-02-14 2020-07-13 Osaka University Sposób izolowania określonych regionów genomowych z wykorzystaniem cząsteczki zdolnej do specyficznego wiązania się z endogenną sekwencją DNA
WO2014127287A1 (en) 2013-02-14 2014-08-21 Massachusetts Institute Of Technology Method for in vivo tergated mutagenesis
KR102209979B1 (ko) 2013-02-20 2021-02-01 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 랫트의 유전자 변형
US20150353885A1 (en) 2013-02-21 2015-12-10 Cellectis Method to counter-select cells or organisms by linking loci to nuclease components
ES2522765B2 (es) 2013-02-22 2015-03-18 Universidad De Alicante Método para dectectar inserciones de espaciadores en estructuras CRISPR
CA2901676C (en) 2013-02-25 2023-08-22 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for enhancing nuclease-mediated gene disruption
WO2014131833A1 (en) 2013-02-27 2014-09-04 Helmholtz Zentrum München Deutsches Forschungszentrum Für Gesundheit Und Umwelt (Gmbh) Gene editing in the oocyte by cas9 nucleases
US10047366B2 (en) 2013-03-06 2018-08-14 The Johns Hopkins University Telomerator-a tool for chromosome engineering
US10612043B2 (en) 2013-03-09 2020-04-07 Agilent Technologies, Inc. Methods of in vivo engineering of large sequences using multiple CRISPR/cas selections of recombineering events
RU2694686C2 (ru) 2013-03-12 2019-07-16 Е.И.Дюпон Де Немур Энд Компани Способы идентификации вариантных сайтов распознавания для редкощепящих сконструированных средств для индукции двунитевого разрыва, и композиции с ними, и их применения
EP2970886B1 (en) 2013-03-12 2018-05-23 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for modification of hla
US9777262B2 (en) 2013-03-13 2017-10-03 President And Fellows Of Harvard College Mutants of Cre recombinase
WO2014153118A1 (en) 2013-03-14 2014-09-25 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Treatment of diseases and conditions associated with dysregulation of mammalian target of rapamycin complex 1 (mtorc1)
US20160184458A1 (en) 2013-03-14 2016-06-30 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Mrna therapeutic compositions and use to treat diseases and disorders
GB2527450A (en) 2013-03-14 2015-12-23 Caribou Biosciences Inc Compositions and methods of nucleic acid-targeting nucleic acids
US20140283156A1 (en) 2013-03-14 2014-09-18 Cold Spring Harbor Laboratory Trans-splicing ribozymes and silent recombinases
US20140273230A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Sigma-Aldrich Co., Llc Crispr-based genome modification and regulation
US20140349400A1 (en) 2013-03-15 2014-11-27 Massachusetts Institute Of Technology Programmable Modification of DNA
US9234213B2 (en) 2013-03-15 2016-01-12 System Biosciences, Llc Compositions and methods directed to CRISPR/Cas genomic engineering systems
AU2014228981B2 (en) 2013-03-15 2019-11-28 The General Hospital Corporation Using truncated guide RNAs (tru-gRNAs) to increase specificity for RNA-guided genome editing
US10760064B2 (en) 2013-03-15 2020-09-01 The General Hospital Corporation RNA-guided targeting of genetic and epigenomic regulatory proteins to specific genomic loci
US20140363561A1 (en) 2013-03-15 2014-12-11 J.R. Simplot Company Tal-mediated transfer dna insertion
US11332719B2 (en) 2013-03-15 2022-05-17 The Broad Institute, Inc. Recombinant virus and preparations thereof
US20160046959A1 (en) 2013-03-15 2016-02-18 Carlisle P. Landel Reproducible method for testis-mediated genetic modification (tgm) and sperm-mediated genetic modification (sgm)
AU2014227831B2 (en) 2013-03-15 2020-01-30 Regents Of The University Of Minnesota Engineering plant genomes using CRISPR/Cas systems
DK3527068T3 (da) 2013-03-15 2022-06-27 Cibus Us Llc Fremgangsmåder og sammensætninger til forøgelse af effektivitet af målrettet genmodifikation under anvendelse af oligonukleotid-medieret genreparation
AU2014235968B2 (en) 2013-03-21 2018-05-24 Ospedale San Raffaele Srl Targeted disruption of T cell receptor genes using engineered zinc finger protein nucleases
BR112015025006A2 (pt) 2013-04-02 2017-10-10 Bayer Cropscience Nv engenharia genômica alvejada em eucariontes
CA2908668C (en) 2013-04-03 2023-03-14 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Effective generation of tumor-targeted t cells derived from pluripotent stem cells
WO2014165349A1 (en) 2013-04-04 2014-10-09 Trustees Of Dartmouth College Compositions and methods for in vivo excision of hiv-1 proviral dna
CN105518146B (zh) 2013-04-04 2022-07-15 哈佛学院校长同事会 利用CRISPR/Cas系统的基因组编辑的治疗性用途
CN105263312A (zh) 2013-04-05 2016-01-20 美国陶氏益农公司 用于在植物基因组内整合外源序列的方法和组合物
US20150056629A1 (en) 2013-04-14 2015-02-26 Katriona Guthrie-Honea Compositions, systems, and methods for detecting a DNA sequence
EP2986709A4 (en) 2013-04-16 2017-03-15 University Of Washington Through Its Center For Commercialization Activating an alternative pathway for homology-directed repair to stimulate targeted gene correction and genome engineering
US20160186208A1 (en) 2013-04-16 2016-06-30 Whitehead Institute For Biomedical Research Methods of Mutating, Modifying or Modulating Nucleic Acid in a Cell or Nonhuman Mammal
AU2014253942B9 (en) 2013-04-16 2020-08-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Targeted modification of rat genome
EP2796558A1 (en) 2013-04-23 2014-10-29 Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn Improved gene targeting and nucleic acid carrier molecule, in particular for use in plants
CN103224947B (zh) 2013-04-28 2015-06-10 陕西师范大学 一种基因打靶系统
WO2014182700A1 (en) 2013-05-10 2014-11-13 Sangamo Biosciences, Inc. Delivery methods and compositions for nuclease-mediated genome engineering
US10471099B2 (en) 2013-05-10 2019-11-12 Whitehead Institute For Biomedical Research In vitro production of red blood cells with proteins comprising sortase recognition motifs
CN105378067A (zh) 2013-05-13 2016-03-02 塞勒克提斯公司 工程化用于免疫治疗的高活性t细胞的方法
EA036200B1 (ru) 2013-05-13 2020-10-14 Селлектис Cd19-специфический химерный антигенный рецептор и его применения
AU2014265331B2 (en) 2013-05-15 2019-12-05 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for treatment of a genetic condition
WO2014186686A2 (en) 2013-05-17 2014-11-20 Two Blades Foundation Targeted mutagenesis and genome engineering in plants using rna-guided cas nucleases
US20140349405A1 (en) 2013-05-22 2014-11-27 Wisconsin Alumni Research Foundation Rna-directed dna cleavage and gene editing by cas9 enzyme from neisseria meningitidis
AU2014273490B2 (en) 2013-05-29 2019-05-09 Cellectis Methods for engineering T cells for immunotherapy by using RNA-guided Cas nuclease system
EP3004349B1 (en) 2013-05-29 2018-03-28 Cellectis S.A. A method for producing precise dna cleavage using cas9 nickase activity
US9873907B2 (en) 2013-05-29 2018-01-23 Agilent Technologies, Inc. Method for fragmenting genomic DNA using CAS9
EP3004339B1 (en) 2013-05-29 2021-07-07 Cellectis New compact scaffold of cas9 in the type ii crispr system
WO2014194190A1 (en) 2013-05-30 2014-12-04 The Penn State Research Foundation Gene targeting and genetic modification of plants via rna-guided genome editing
CA2913872C (en) 2013-05-31 2022-01-18 Cellectis A laglidadg homing endonuclease cleaving the t-cell receptor alpha gene and uses thereof
WO2014191525A1 (en) 2013-05-31 2014-12-04 Cellectis A laglidadg homing endonuclease cleaving the c-c chemokine receptor type-5 (ccr5) gene and uses thereof
US20140359796A1 (en) 2013-05-31 2014-12-04 Recombinetics, Inc. Genetically sterile animals
US9267135B2 (en) 2013-06-04 2016-02-23 President And Fellows Of Harvard College RNA-guided transcriptional regulation
KR20230042154A (ko) 2013-06-04 2023-03-27 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 Rna-가이드된 전사 조절
EP3004370B1 (en) 2013-06-05 2024-08-21 Duke University Rna-guided gene editing and gene regulation
EP3008181B1 (en) 2013-06-11 2019-11-06 The Regents of The University of California Methods and compositions for target dna modification
CN105283553B (zh) 2013-06-11 2021-06-25 克隆技术实验室有限公司 蛋白质富集的微泡及其制备和使用方法
US20150315252A1 (en) 2013-06-11 2015-11-05 Clontech Laboratories, Inc. Protein enriched microvesicles and methods of making and using the same
EP3008186B1 (en) 2013-06-14 2018-11-28 Cellectis Methods for non-transgenic genome editing in plants
CA2915845A1 (en) 2013-06-17 2014-12-24 The Broad Institute, Inc. Delivery, engineering and optimization of systems, methods and compositions for targeting and modeling diseases and disorders of post mitotic cells
CN113425857A (zh) 2013-06-17 2021-09-24 布罗德研究所有限公司 用于肝靶向和治疗的crispr-cas系统、载体和组合物的递送与用途
EP3011034B1 (en) 2013-06-17 2019-08-07 The Broad Institute, Inc. Delivery, use and therapeutic applications of the crispr-cas systems and compositions for targeting disorders and diseases using viral components
WO2014204723A1 (en) 2013-06-17 2014-12-24 The Broad Institute Inc. Oncogenic models based on delivery and use of the crispr-cas systems, vectors and compositions
EP3725885A1 (en) 2013-06-17 2020-10-21 The Broad Institute, Inc. Functional genomics using crispr-cas systems, compositions methods, screens and applications thereof
AU2014281026B2 (en) 2013-06-17 2020-05-28 Massachusetts Institute Of Technology Delivery, engineering and optimization of tandem guide systems, methods and compositions for sequence manipulation
JP6665088B2 (ja) 2013-06-17 2020-03-13 ザ・ブロード・インスティテュート・インコーポレイテッド 配列操作のための最適化されたＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ二重ニッカーゼ系、方法および組成物
CN105555948A (zh) 2013-06-19 2016-05-04 西格马-奥尔德里奇有限责任公司 靶向整合
US10011850B2 (en) 2013-06-21 2018-07-03 The General Hospital Corporation Using RNA-guided FokI Nucleases (RFNs) to increase specificity for RNA-Guided Genome Editing
CA2915779A1 (en) 2013-06-25 2014-12-31 Cellectis Modified diatoms for biofuel production
US20160369268A1 (en) 2013-07-01 2016-12-22 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Transcription activator-like effector (tale) libraries and methods of synthesis and use
SG10201800111SA (en) 2013-07-09 2018-02-27 Harvard College Multiplex rna-guided genome engineering
JP2016528890A (ja) 2013-07-09 2016-09-23 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を用いるゲノム編集の治療用の使用
SG11201600115SA (en) 2013-07-10 2016-02-26 Novartis Ag Multiple proteases deficient filamentous fungal cells and methods of use thereof
EP3019204B1 (en) 2013-07-10 2020-01-01 President and Fellows of Harvard College Orthogonal cas9 proteins for rna-guided gene regulation and editing
CN105555132B (zh) 2013-07-10 2018-07-17 约瑟夫·A·玛吉朱布 Mrap2敲除
RS62529B1 (sr) 2013-07-11 2021-11-30 Modernatx Inc Kompozicije koje sadrže sintetičke polinukleotide koji kodiraju proteine povezane sa crispr i sintetičke sgrnk i postupci upotrebe
WO2015007194A1 (zh) 2013-07-16 2015-01-22 中国科学院上海生命科学研究院 植物基因组定点修饰方法
US9663782B2 (en) 2013-07-19 2017-05-30 Larix Bioscience Llc Methods and compositions for producing double allele knock outs
GB201313235D0 (en) 2013-07-24 2013-09-04 Univ Edinburgh Antiviral Compositions Methods and Animals
US10563225B2 (en) 2013-07-26 2020-02-18 President And Fellows Of Harvard College Genome engineering
CN103388006B (zh) 2013-07-26 2015-10-28 华东师范大学 一种基因定点突变的构建方法
US10421957B2 (en) 2013-07-29 2019-09-24 Agilent Technologies, Inc. DNA assembly using an RNA-programmable nickase
ES2915377T3 (es) 2013-08-02 2022-06-22 Enevolv Inc Procedimientos y células huésped para ingeniería genómica, de vías y biomolécular
ITTO20130669A1 (it) 2013-08-05 2015-02-06 Consiglio Nazionale Ricerche Vettore adeno-associato ricombinante muscolo-specifico e suo impiego nel trattamento di patologie muscolari
US9163284B2 (en) 2013-08-09 2015-10-20 President And Fellows Of Harvard College Methods for identifying a target site of a Cas9 nuclease
US20150044772A1 (en) 2013-08-09 2015-02-12 Sage Labs, Inc. Crispr/cas system-based novel fusion protein and its applications in genome editing
WO2015024017A2 (en) 2013-08-16 2015-02-19 President And Fellows Of Harvard College Rna polymerase, methods of purification and methods of use
WO2015021990A1 (en) 2013-08-16 2015-02-19 University Of Copenhagen Rna probing method and reagents
CN105705640B (zh) 2013-08-20 2019-02-15 非营利性组织佛兰芒综合大学生物技术研究所 抑制lncRNA用于治疗黑素瘤
US9359599B2 (en) 2013-08-22 2016-06-07 President And Fellows Of Harvard College Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof
CA3109801C (en) 2013-08-22 2024-01-09 Andrew Cigan Plant genome modification using guide rna/cas endonuclease systems and methods of use
GB201315321D0 (en) 2013-08-28 2013-10-09 Koninklijke Nederlandse Akademie Van Wetenschappen Transduction Buffer
CA3131284C (en) 2013-08-28 2023-09-19 David Paschon Compositions for linking dna-binding domains and cleavage domains
MX2016002586A (es) 2013-08-29 2016-06-14 Univ Temple Métodos y composiciones para el tratamiento guiado por rna de infección por hiv.
US9765404B2 (en) 2013-09-04 2017-09-19 Dow Agrosciences Llc Rapid assay for identifying transformants having targeted donor insertion
EP3636750A1 (en) 2013-09-04 2020-04-15 Csir Site-specific nuclease single-cell assay targeting gene regulatory elements to silence gene expression
PL3041345T3 (pl) 2013-09-04 2024-07-22 KWS SAAT SE & Co. KGaA Roślina odporna na helminthosporium turcicum
WO2015034872A2 (en) 2013-09-05 2015-03-12 Massachusetts Institute Of Technology Tuning microbial populations with programmable nucleases
US9340800B2 (en) 2013-09-06 2016-05-17 President And Fellows Of Harvard College Extended DNA-sensing GRNAS
US9737604B2 (en) 2013-09-06 2017-08-22 President And Fellows Of Harvard College Use of cationic lipids to deliver CAS9
US9322037B2 (en) 2013-09-06 2016-04-26 President And Fellows Of Harvard College Cas9-FokI fusion proteins and uses thereof
CN105637087A (zh) 2013-09-18 2016-06-01 科马布有限公司 方法、细胞与生物体
WO2015040075A1 (en) 2013-09-18 2015-03-26 Genome Research Limited Genomic screening methods using rna-guided endonucleases
EP3046932B1 (en) 2013-09-20 2020-04-29 President and Fellows of Harvard College Evolved sortases and uses thereof
PT3049116T (pt) 2013-09-23 2019-04-03 Rensselaer Polytech Inst Distribuição genética mediada por nanopartículas, edição genómica e modificação direcionada a ligantes em várias populações celulares
US20160237455A1 (en) 2013-09-27 2016-08-18 Editas Medicine, Inc. Crispr-related methods and compositions
US10822606B2 (en) 2013-09-27 2020-11-03 The Regents Of The University Of California Optimized small guide RNAs and methods of use
US20160237451A1 (en) 2013-09-30 2016-08-18 Regents Of The University Of Minnesota Conferring resistance to geminiviruses in plants using crispr/cas systems
CA2925050A1 (en) 2013-09-30 2015-04-02 The Regents Of The University Of California Identification of cxcr8, a novel chemokine receptor
CA2932580A1 (en) 2013-10-02 2015-04-09 Northeastern University Methods and compositions for generation of developmentally-incompetent eggs in recipients of nuclear genetic transfer
JP5774657B2 (ja) 2013-10-04 2015-09-09 国立大学法人京都大学 エレクトロポレーションを利用した哺乳類の遺伝子改変方法
CA2932581A1 (en) 2013-10-07 2015-04-16 Northeastern University Methods and compositions for ex vivo generation of developmentally competent eggs from germ line cells using autologous cell systems
US20150098954A1 (en) 2013-10-08 2015-04-09 Elwha Llc Compositions and Methods Related to CRISPR Targeting
WO2015052231A2 (en) 2013-10-08 2015-04-16 Technical University Of Denmark Multiplex editing system
DE102013111099B4 (de) 2013-10-08 2023-11-30 Eberhard Karls Universität Tübingen Medizinische Fakultät Permanente Genkorrektur mittels nukleotidmodifizierter messenger RNA
AU2014333776B2 (en) 2013-10-11 2021-01-28 Cellectis Methods and kits for detecting nucleic acid sequences of interest using DNA-binding protein domain
WO2015057671A1 (en) 2013-10-14 2015-04-23 The Broad Institute, Inc. Artificial transcription factors comprising a sliding domain and uses thereof
ES2845924T3 (es) 2013-10-15 2021-07-28 Scripps Research Inst Interruptores de células T con receptores de antígenos quiméricos peptídicos y usos de los mismos
KR102357968B1 (ko) 2013-10-15 2022-02-03 더 스크립스 리서치 인스티튜트 키메라 항원 수용체 t 세포 스위치 및 이의 용도
CA2926078C (en) 2013-10-17 2021-11-16 Sangamo Biosciences, Inc. Delivery methods and compositions for nuclease-mediated genome engineering in hematopoietic stem cells
CA2926094C (en) 2013-10-17 2024-04-02 Sangamo Biosciences, Inc. Delivery methods and compositions for nuclease-mediated genome engineering
US10759764B2 (en) 2013-10-18 2020-09-01 President And Fellows Of Harvard College Fluorination of organic compounds
KR102251168B1 (ko) 2013-10-25 2021-05-13 셀렉티스 고 반복 모티프를 포함하는 dna 서열에 대한 효율적이고 특이적인 표적화를 위한 희소-절단 엔도뉴클레아제의 설계
WO2015065964A1 (en) 2013-10-28 2015-05-07 The Broad Institute Inc. Functional genomics using crispr-cas systems, compositions, methods, screens and applications thereof
US10584358B2 (en) 2013-10-30 2020-03-10 North Carolina State University Compositions and methods related to a type-II CRISPR-Cas system in Lactobacillus buchneri
TWI659103B (zh) 2013-11-04 2019-05-11 陶氏農業科學公司 最適大豆基因座（二）
AU2014341928B2 (en) 2013-11-04 2017-11-30 Corteva Agriscience Llc A universal donor system for gene targeting
US10273493B2 (en) 2013-11-04 2019-04-30 Dow Agrosciences Llc Optimal maize loci
UY35815A (es) 2013-11-04 2015-05-29 Dow Agrosciences Llc ?locus óptimos del maíz?
RU2016120636A (ru) 2013-11-04 2017-12-06 ДАУ АГРОСАЙЕНСИЗ ЭлЭлСи Оптимальные локусы сои
WO2015069682A2 (en) 2013-11-05 2015-05-14 President And Fellows Of Harvard College Precise microbiota engineering at the cellular level
KR102523466B1 (ko) 2013-11-07 2023-04-20 에디타스 메디신, 인코포레이티드 지배적인 gRNA를 이용하는 CRISPR-관련 방법 및 조성물
WO2015077058A2 (en) 2013-11-08 2015-05-28 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods for selecting a treatment for b-cell neoplasias
BR112016010175A2 (pt) 2013-11-11 2017-10-03 Sangamo Biosciences Inc Repressor genético, seus usos, e composição farmacêutica
WO2015070193A1 (en) 2013-11-11 2015-05-14 Liu Oliver Compositions and methods for targeted gene disruption in prokaryotes
HRP20211706T1 (hr) 2013-11-13 2022-02-04 The Children's Medical Center Corporation Nukleazom posredovana regulacija ekspresije gena
WO2015073867A1 (en) 2013-11-15 2015-05-21 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services Engineering neural stem cells using homologous recombination
JP2016538342A (ja) 2013-11-18 2016-12-08 イエール ユニバーシティ トランスポゾンを使用する組成物および方法
CA2930877A1 (en) 2013-11-18 2015-05-21 Crispr Therapeutics Ag Crispr-cas system materials and methods
US10787684B2 (en) 2013-11-19 2020-09-29 President And Fellows Of Harvard College Large gene excision and insertion
US9074199B1 (en) 2013-11-19 2015-07-07 President And Fellows Of Harvard College Mutant Cas9 proteins
WO2015075056A1 (en) 2013-11-19 2015-05-28 Thermo Fisher Scientific Baltics Uab Programmable enzymes for isolation of specific dna fragments
EP3071592B1 (en) 2013-11-20 2021-01-06 Fondazione Telethon Artificial dna-binding proteins and uses thereof
KR102252561B1 (ko) 2013-11-22 2021-05-20 미나 테라퓨틱스 리미티드 Ｃ/ｅｂｐ 알파 짧은 활성화 ｒｎａ 조성물 및 사용 방법
EP3071686B1 (en) 2013-11-22 2020-07-22 Cellectis SA Method for generating batches of allogeneic t-cells with averaged potency
KR102348577B1 (ko) 2013-11-22 2022-01-06 셀렉티스 면역요법을 위한 화학요법 약물 저항성 ｔ―세포들의 조작 방법
CN103642836A (zh) 2013-11-26 2014-03-19 苏州同善生物科技有限公司 一种基于crispr基因敲除技术建立脆性x综合症灵长类动物模型的方法
CN103614415A (zh) 2013-11-27 2014-03-05 苏州同善生物科技有限公司 一种基于crispr基因敲除技术建立肥胖症大鼠动物模型的方法
CA2928635C (en) 2013-11-28 2022-06-21 Horizon Genomics Gmbh Somatic haploid human cell line
CA2931848A1 (en) 2013-12-09 2015-06-18 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for genome engineering
SG10201700961TA (en) 2013-12-11 2017-04-27 Regeneron Pharma Methods and compositions for the targeted modification of a genome
AU2014362248A1 (en) 2013-12-12 2016-06-16 Massachusetts Institute Of Technology Compositions and methods of use of CRISPR-Cas systems in nucleotide repeat disorders
DK3079725T3 (da) 2013-12-12 2020-01-20 Broad Inst Inc Administration, brug og terapeutiske anvendelser af crispr-cas-systemerne og sammensætninger til genomredigering
JP6793547B2 (ja) 2013-12-12 2020-12-02 ザ・ブロード・インスティテュート・インコーポレイテッド 最適化機能ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系による配列操作のための系、方法および組成物
US9994831B2 (en) 2013-12-12 2018-06-12 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for modifying a single stranded target nucleic acid
WO2015089364A1 (en) 2013-12-12 2015-06-18 The Broad Institute Inc. Crystal structure of a crispr-cas system, and uses thereof
CN105899657A (zh) 2013-12-12 2016-08-24 布罗德研究所有限公司 用于改变基因产物表达的crispr-cas系统和方法、结构信息以及诱导型模块化cas酶
US20150166982A1 (en) 2013-12-12 2015-06-18 President And Fellows Of Harvard College Methods for correcting pi3k point mutations
EP4219699A1 (en) 2013-12-12 2023-08-02 The Broad Institute, Inc. Engineering of systems, methods and optimized guide compositions with new architectures for sequence manipulation
CA2932475A1 (en) 2013-12-12 2015-06-18 The Broad Institute, Inc. Delivery, use and therapeutic applications of the crispr-cas systems and compositions for targeting disorders and diseases using particle delivery components
JP2017527256A (ja) 2013-12-12 2017-09-21 ザ・ブロード・インスティテュート・インコーポレイテッド ＨＢＶ及びウイルス性疾患及び障害のためのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系及び組成物の送達、使用及び治療適用
CA2933134A1 (en) 2013-12-13 2015-06-18 Cellectis Cas9 nuclease platform for microalgae genome engineering
AU2014363479A1 (en) 2013-12-13 2016-06-23 Cellectis New method of selection of algal-transformed cells using nuclease
US20150191744A1 (en) 2013-12-17 2015-07-09 University Of Massachusetts Cas9 effector-mediated regulation of transcription, differentiation and gene editing/labeling
AU2014368982B2 (en) 2013-12-19 2021-03-25 Amyris, Inc. Methods for genomic integration
CA2935032C (en) 2013-12-26 2024-01-23 The General Hospital Corporation Multiplex guide rnas
DK3090062T3 (da) 2013-12-30 2020-09-21 Univ Pittsburgh Commonwealth Sys Higher Education Fusionsgener associeret med fremadskridende prostatakræft
WO2015103153A1 (en) 2013-12-31 2015-07-09 The Regents Of The University Of California Cas9 crystals and methods of use thereof
CN103668472B (zh) 2013-12-31 2014-12-24 北京大学 利用CRISPR/Cas9系统构建真核基因敲除文库的方法
SG11201605550QA (en) 2014-01-08 2016-08-30 Harvard College Rna-guided gene drives
KR20160128306A (ko) 2014-01-14 2016-11-07 램 테라퓨틱스, 인코포레이티드 돌연변이유발 방법
US10774338B2 (en) 2014-01-16 2020-09-15 The Regents Of The University Of California Generation of heritable chimeric plant traits
US10179911B2 (en) 2014-01-20 2019-01-15 President And Fellows Of Harvard College Negative selection and stringency modulation in continuous evolution systems
EP3097194A4 (en) 2014-01-21 2017-08-23 Institute Of Genetics And Developmental Biology, Chinese Academy Of Sciences Modified plants
GB201400962D0 (en) 2014-01-21 2014-03-05 Kloehn Peter C Screening for target-specific affinity binders using RNA interference
WO2015112790A2 (en) 2014-01-24 2015-07-30 Children's Medical Center Corporation High-throughput mouse model for optimizing antibody affinities
JP2017503514A (ja) 2014-01-24 2017-02-02 ノースカロライナ ステート ユニバーシティーＮｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃａｓ９ターゲッティングをガイドする配列に関する方法および組成物
WO2015113063A1 (en) 2014-01-27 2015-07-30 Georgia Tech Research Corporation Methods and systems for identifying crispr/cas off-target sites
CN104805078A (zh) 2014-01-28 2015-07-29 北京大学 用于高效基因组编辑的rna分子的设计、合成及其应用
US9850525B2 (en) 2014-01-29 2017-12-26 Agilent Technologies, Inc. CAS9-based isothermal method of detection of specific DNA sequence
US10233456B2 (en) 2014-01-30 2019-03-19 The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Method, vectors, cells, seeds and kits for stacking genes into a single genomic site
US20150291969A1 (en) 2014-01-30 2015-10-15 Chromatin, Inc. Compositions for reduced lignin content in sorghum and improving cell wall digestibility, and methods of making the same
GB201401707D0 (en) 2014-01-31 2014-03-19 Sec Dep For Health The Adeno-associated viral vectors
AU2015210769B2 (en) 2014-01-31 2019-02-07 Factor Bioscience Inc. Methods and products for nucleic acid production and delivery
PL3102673T3 (pl) 2014-02-03 2020-11-02 Sangamo Therapeutics, Inc. Sposoby i kompozycje do leczenia talasemii beta
WO2015115903A1 (en) 2014-02-03 2015-08-06 Academisch Ziekenhuis Leiden H.O.D.N. Lumc Site-specific dna break-induced genome editing using engineered nucleases
EP3795697B1 (en) 2014-02-04 2024-09-18 Jumpcode Genomics, Inc. Genome fractioning
EP3102680B1 (en) 2014-02-07 2018-12-19 VIB vzw Inhibition of neat1 for treatment of solid tumors
US10266849B2 (en) 2014-02-11 2019-04-23 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate CRISPR enabled multiplexed genome engineering
US10150985B2 (en) 2014-02-13 2018-12-11 Takara Bio Usa, Inc. Methods of depleting a target molecule from an initial collection of nucleic acids, and compositions and kits for practicing the same
CA2937711C (en) 2014-02-14 2020-10-20 Cellectis Cells for immunotherapy engineered for targeting antigen present both on immune cells and pathological cells
AU2015219167A1 (en) 2014-02-18 2016-09-08 Duke University Compositions for the inactivation of virus replication and methods of making and using the same
CA2939053C (en) 2014-02-20 2022-02-22 Dsm Ip Assets B.V. Phage insensitive streptococcus thermophilus
US10196608B2 (en) 2014-02-21 2019-02-05 Cellectis Method for in situ inhibition of regulatory T cells
US20170015994A1 (en) 2014-02-24 2017-01-19 Massachusetts Institute Of Technology Methods for in vivo genome editing
CA2939942A1 (en) 2014-02-24 2015-08-27 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for nuclease-mediated targeted integration
US10301636B2 (en) 2014-02-25 2019-05-28 National Research And Development Agency National Agriculture And Food Research Organization Plant cell comprising mutation introduced in target DNA, and method for producing the plant cell
EP3971283A1 (en) 2014-02-27 2022-03-23 Monsanto Technology LLC Compositions and methods for site directed genomic modification
JP6996844B2 (ja) 2014-02-27 2022-02-03 ジャンプコード ゲノミクス，インク． 体細胞可動要素の分析のための方法、およびその使用
CN103820441B (zh) 2014-03-04 2017-05-17 黄行许 CRISPR‑Cas9特异性敲除人CTLA4基因的方法以及用于特异性靶向CTLA4基因的sgRNA
CN103820454B (zh) 2014-03-04 2016-03-30 上海金卫生物技术有限公司 CRISPR-Cas9特异性敲除人PD1基因的方法以及用于特异性靶向PD1基因的sgRNA
WO2015134812A1 (en) 2014-03-05 2015-09-11 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for treating usher syndrome and retinitis pigmentosa
CN111471675A (zh) 2014-03-05 2020-07-31 国立大学法人神户大学 特异性转变靶向dna序列的核酸碱基的基因组序列的修饰方法、及其使用的分子复合体
US9938521B2 (en) 2014-03-10 2018-04-10 Editas Medicine, Inc. CRISPR/CAS-related methods and compositions for treating leber's congenital amaurosis 10 (LCA10)
EP4368705A3 (en) 2014-03-11 2024-07-31 Cellectis Method for generating t-cells compatible for allogenic transplantation
DK3116533T3 (da) 2014-03-12 2020-08-24 Prec Biosciences Inc Deletion af dystrophingenexon under anvendelse af genmanipulerede nukleaser
WO2015138870A2 (en) 2014-03-13 2015-09-17 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for targeted epigenetic modification
SI3116305T1 (sl) 2014-03-14 2024-05-31 Cibus Us Llc Metode in sestavki za povečanje učinkovitosti ciljne genske modifikacije z uporabo popravila gena, posredovanega z oligonukleotidi
US20170088845A1 (en) 2014-03-14 2017-03-30 The Regents Of The University Of California Vectors and methods for fungal genome engineering by crispr-cas9
CN106459894B (zh) 2014-03-18 2020-02-18 桑格摩生物科学股份有限公司 用于调控锌指蛋白表达的方法和组合物
WO2015139139A1 (en) 2014-03-20 2015-09-24 UNIVERSITé LAVAL Crispr-based methods and products for increasing frataxin levels and uses thereof
US10612041B2 (en) 2014-03-21 2020-04-07 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Genome editing without nucleases
SI3122878T1 (sl) 2014-03-24 2019-05-31 Translate Bio, Inc. MRNA terapija za zdravljenje očesnih bolezni
EP3916007A1 (en) 2014-03-24 2021-12-01 Immco Diagnostics, Inc. Improved anti-nuclear antibody detection and diagnostics for systemic and non-systemic autoimmune disorders
EP3129484A1 (en) 2014-03-25 2017-02-15 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for treating hiv infection and aids
WO2015148680A1 (en) 2014-03-25 2015-10-01 Ginkgo Bioworks, Inc. Methods and genetic systems for cell engineering
US10349639B2 (en) 2014-03-26 2019-07-16 University Of Maryland, College Park Targeted genome editing in zygotes of domestic large animals
WO2015148860A1 (en) 2014-03-26 2015-10-01 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for treating beta-thalassemia
WO2015148863A2 (en) 2014-03-26 2015-10-01 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for treating sickle cell disease
WO2015145417A1 (en) 2014-03-28 2015-10-01 Ilan Ziv Compounds and methods for trans-membrane delivery of molecules
US9993563B2 (en) 2014-03-28 2018-06-12 Aposense Ltd. Compounds and methods for trans-membrane delivery of molecules
WO2015153760A2 (en) 2014-04-01 2015-10-08 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for prevention or treatment of a nervous system disorder
WO2015153791A1 (en) 2014-04-01 2015-10-08 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for treating herpes simplex virus type 2 (hsv-2)
WO2015153789A1 (en) 2014-04-01 2015-10-08 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for treating herpes simplex virus type 1 (hsv-1)
US10507232B2 (en) 2014-04-02 2019-12-17 University Of Florida Research Foundation, Incorporated Materials and methods for the treatment of latent viral infection
WO2015153780A1 (en) 2014-04-02 2015-10-08 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for treating primary open angle glaucoma
CN103911376B (zh) 2014-04-03 2017-02-15 黄行许 CRISPR‑Cas9靶向敲除乙肝病毒cccDNA及其特异性sgRNA
WO2015153940A1 (en) 2014-04-03 2015-10-08 Massachusetts Institute Of Technology Methods and compositions for the production of guide rna
CN106460003A (zh) 2014-04-08 2017-02-22 北卡罗来纳州立大学 用于使用crispr相关基因rna引导阻遏转录的方法和组合物
EP3129485B2 (en) 2014-04-09 2022-12-21 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for treating cystic fibrosis
EP3129488B1 (en) 2014-04-10 2019-06-12 The Regents of The University of California Methods and compositions for using argonaute to modify a single stranded target nucleic acid
EP3129473B8 (en) 2014-04-11 2020-12-23 Cellectis Method for generating immune cells resistant to arginine and/or tryptophan depleted microenvironment
SG11201608503UA (en) 2014-04-14 2016-11-29 Maxcyte Inc Methods and compositions for modifying genomic dna
US20170037414A1 (en) 2014-04-14 2017-02-09 Nemesis Bioscience Ltd Therapeutic
CN103923911B (zh) 2014-04-14 2016-06-08 上海金卫生物技术有限公司 CRISPR-Cas9特异性敲除人CCR5基因的方法以及用于特异性靶向CCR5基因的sgRNA
GB201406970D0 (en) 2014-04-17 2014-06-04 Green Biologics Ltd Targeted mutations
GB201406968D0 (en) 2014-04-17 2014-06-04 Green Biologics Ltd Deletion mutants
CN108138183A (zh) 2014-04-18 2018-06-08 爱迪塔斯医药公司 用于癌症免疫疗法的crispr-cas相关方法、组合物和组分
CN105039399A (zh) 2014-04-23 2015-11-11 复旦大学 多能干细胞-遗传性心肌病心肌细胞及其制备方法
US20170076039A1 (en) 2014-04-24 2017-03-16 Institute For Basic Science A Method of Selecting a Nuclease Target Sequence for Gene Knockout Based on Microhomology
WO2015164748A1 (en) 2014-04-24 2015-10-29 Sangamo Biosciences, Inc. Engineered transcription activator like effector (tale) proteins
ES2730325T3 (es) 2014-04-24 2019-11-11 Univ Texas Aplicación de citoblastos pluripotentes inducidos para generar productos de terapia celular adoptiva
BR112016024945A2 (pt) 2014-04-28 2017-10-24 Recombinetics Inc edição de gene multiplex em suínos
RU2016143352A (ru) 2014-04-28 2018-05-28 ДАУ АГРОСАЙЕНСИЗ ЭлЭлСи Трансформация гаплоидной кукурузы
WO2015168158A1 (en) 2014-04-28 2015-11-05 Fredy Altpeter Targeted genome editing to modify lignin biosynthesis and cell wall composition
GB2540694A (en) 2014-04-29 2017-01-25 Seattle Children's Hospital (Dba Seattle Children's Res Institute) CCR5 disruption of cells expressing anti-hiv chimeric antigen receptor (CAR) derived from broadly neutralizing antibodies
WO2015165275A1 (zh) 2014-04-30 2015-11-05 清华大学 利用tale转录抑制子在哺乳动物细胞中模块化构建合成基因线路
WO2015168404A1 (en) 2014-04-30 2015-11-05 Massachusetts Institute Of Technology Toehold-gated guide rna for programmable cas9 circuitry with rna input
CN104178506B (zh) 2014-04-30 2017-03-01 清华大学 Taler蛋白通过空间位阻发挥转录抑制作用及其应用
WO2015165276A1 (zh) 2014-04-30 2015-11-05 清华大学 利用tale转录抑制子在哺乳动物细胞中模块化构建合成基因线路的试剂盒
EP3137120A4 (en) 2014-05-01 2018-03-14 University Of Washington In vivo gene engineering with adenoviral vectors
GB201407852D0 (en) 2014-05-02 2014-06-18 Iontas Ltd Preparation of libraries od protein variants expressed in eukaryotic cells and use for selecting binding molecules
WO2015171603A1 (en) 2014-05-06 2015-11-12 Two Blades Foundation Methods for producing plants with enhanced resistance to oomycete pathogens
KR102380324B1 (ko) 2014-05-08 2022-03-30 상가모 테라퓨틱스, 인코포레이티드 헌팅턴병을 치료하기 위한 방법 및 조성물
US10280419B2 (en) 2014-05-09 2019-05-07 UNIVERSITé LAVAL Reduction of amyloid beta peptide production via modification of the APP gene using the CRISPR/Cas system
EP3139954A4 (en) 2014-05-09 2018-02-28 Indiana University Research and Technology Corporation Methods and compositions for treating hepatitis b virus infections
WO2015171894A1 (en) 2014-05-09 2015-11-12 The Regents Of The University Of California Methods for selecting plants after genome editing
WO2015175642A2 (en) 2014-05-13 2015-11-19 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for prevention or treatment of a disease
CN104017821B (zh) 2014-05-16 2016-07-06 安徽省农业科学院水稻研究所 定向编辑颖壳颜色决定基因OsCHI创制褐壳水稻材料的方法
US20170088819A1 (en) 2014-05-16 2017-03-30 Vrije Universiteit Brussel Genetic correction of myotonic dystrophy type 1
CN103981212B (zh) 2014-05-16 2016-06-01 安徽省农业科学院水稻研究所 将黄色颖壳的水稻品种的颖壳颜色改为褐色的育种方法
CN103981211B (zh) 2014-05-16 2016-07-06 安徽省农业科学院水稻研究所 一种创制闭颖授粉水稻材料的育种方法
CN104004782B (zh) 2014-05-16 2016-06-08 安徽省农业科学院水稻研究所 一种延长水稻生育期的育种方法
JP2017517256A (ja) 2014-05-20 2017-06-29 リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ ミネソタ 遺伝子配列を編集する方法
CA2852593A1 (en) 2014-05-23 2015-11-23 Universite Laval Methods for producing dopaminergic neurons and uses thereof
WO2015183885A1 (en) 2014-05-27 2015-12-03 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Methods and compositions for perturbing gene expression in hematopoietic stem cell lineages in vivo
JP2017516500A (ja) 2014-05-28 2017-06-22 ツールゲン インコーポレイテッドＴｏｏｌｇｅｎ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ 標的特異的ヌクレアーゼを用いた標的ｄｎａの敏感な検出方法
JP2017518075A (ja) 2014-05-30 2017-07-06 ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー 潜伏性ウイルス感染を処置するための組成物および方法
WO2015188056A1 (en) 2014-06-05 2015-12-10 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for nuclease design
WO2015188135A1 (en) 2014-06-06 2015-12-10 The California Institute For Biomedical Research Constant region antibody fusion proteins and compositions thereof
CN104004778B (zh) 2014-06-06 2016-03-02 重庆高圣生物医药有限责任公司 含有CRISPR/Cas9系统的靶向敲除载体及其腺病毒和应用
CN106661128A (zh) 2014-06-06 2017-05-10 加州生物医学研究所 构建氨基末端免疫球蛋白融合蛋白的方法及其组合物
WO2015188191A1 (en) 2014-06-06 2015-12-10 Wong Wilson W Dna recombinase circuits for logical control of gene expression
US20170198307A1 (en) 2014-06-06 2017-07-13 President And Fellows Of Harvard College Methods for targeted modification of genomic dna
HUE049776T2 (hu) 2014-06-06 2020-10-28 Regeneron Pharma Módszerek és készítmények egy célzott lókusz módosítására
US11274302B2 (en) 2016-08-17 2022-03-15 Diacarta Ltd Specific synthetic chimeric Xenonucleic acid guide RNA; s(XNA-gRNA) for enhancing CRISPR mediated genome editing efficiency
WO2015191693A2 (en) 2014-06-10 2015-12-17 Massachusetts Institute Of Technology Method for gene editing
EP3155098A4 (en) 2014-06-11 2018-01-03 Howard, Tom E. FACTOR VIII MUTATION REPAIR AND TOLERANCE INDUCTION AND RELATED CDNAs, COMPOSITIONS, METHODS AND SYSTEMS
HUE061007T2 (hu) 2014-06-11 2023-05-28 Univ Duke Gyors és dinamikus áramlásszabályozásra szolgáló összetételek és módszerek szintetikus matabolikus szelepek segítségével
US11584936B2 (en) 2014-06-12 2023-02-21 King Abdullah University Of Science And Technology Targeted viral-mediated plant genome editing using CRISPR /Cas9
WO2015191911A2 (en) 2014-06-12 2015-12-17 Clontech Laboratories, Inc. Protein enriched microvesicles and methods of making and using the same
WO2015195547A1 (en) 2014-06-16 2015-12-23 University Of Washington Methods for controlling stem cell potential and for gene editing in stem cells
CA2952697A1 (en) 2014-06-16 2015-12-23 The Johns Hopkins University Compositions and methods for the expression of crispr guide rnas using the h1 promoter
AU2015277180A1 (en) 2014-06-17 2017-01-12 Poseida Therapeutics, Inc. A method for directing proteins to specific loci in the genome and uses thereof
EP3158072B1 (en) 2014-06-20 2021-01-13 Cellectis Potatoes with reduced granule-bound starch synthase
KR102425438B1 (ko) 2014-06-23 2022-07-27 더 제너럴 하스피탈 코포레이션 서열결정에 의해 평가된 DSB의 게놈 전체에 걸친 비편향된 확인 (GUIDE-Seq)
LT3354732T (lt) 2014-06-23 2020-04-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Nukleazės tarpininkaujamas dnr surinkimas
WO2015200555A2 (en) 2014-06-25 2015-12-30 Caribou Biosciences, Inc. Rna modification to engineer cas9 activity
GB201411344D0 (en) 2014-06-26 2014-08-13 Univ Leicester Cloning
PT3161128T (pt) 2014-06-26 2018-11-21 Regeneron Pharma Métodos e composições para modificações genéticas alvejadas e métodos de utilização
EP3163059A4 (en) 2014-06-30 2017-06-21 Nissan Motor Co., Ltd Internal combustion engine
SG11201610591XA (en) 2014-06-30 2017-01-27 Kao Corp Adhesive sheet for cooling
US20180187172A1 (en) 2014-07-01 2018-07-05 Board Of Regents, The University Of Texas System Regulated gene expression from viral vectors
EP3167071B1 (en) 2014-07-09 2020-10-07 Gen9, Inc. Compositions and methods for site-directed dna nicking and cleaving
EP2966170A1 (en) 2014-07-10 2016-01-13 Heinrich-Pette-Institut Leibniz-Institut für experimentelle Virologie-Stiftung bürgerlichen Rechts - HBV inactivation
BR112017000621B1 (pt) 2014-07-11 2024-03-12 Pioneer Hi-Bred International, Inc Método para melhorar um traço agronômico de uma planta de milho ou de soja
BR112017000482A2 (pt) 2014-07-11 2017-11-07 Du Pont métodos para produzir uma planta mutante e para gerar uma planta, planta, semente, rna, métodos para produzir uma célula, para duplicar um fragmento gênico, para substituir uma primeira sequência promotora, para inserir um elemento regulador em uma sequência de nucleotídeos e para inserir um íntron em uma sequência de nucleotídeos, planta de milho e célula vegetal
WO2016011080A2 (en) 2014-07-14 2016-01-21 The Regents Of The University Of California Crispr/cas transcriptional modulation
CN104109687A (zh) 2014-07-14 2014-10-22 四川大学 运动发酵单胞菌CRISPR-Cas9系统的构建与应用
EP3169773B1 (en) 2014-07-15 2023-07-12 Juno Therapeutics, Inc. Engineered cells for adoptive cell therapy
WO2016011428A1 (en) 2014-07-17 2016-01-21 University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education Methods of treating cells containing fusion genes
US9944933B2 (en) 2014-07-17 2018-04-17 Georgia Tech Research Corporation Aptamer-guided gene targeting
US10975406B2 (en) 2014-07-18 2021-04-13 Massachusetts Institute Of Technology Directed endonucleases for repeatable nucleic acid cleavage
US20160053272A1 (en) 2014-07-18 2016-02-25 Whitehead Institute For Biomedical Research Methods Of Modifying A Sequence Using CRISPR
US20160053304A1 (en) 2014-07-18 2016-02-25 Whitehead Institute For Biomedical Research Methods Of Depleting Target Sequences Using CRISPR
CA2955382C (en) 2014-07-21 2023-07-18 Illumina, Inc. Polynucleotide enrichment using crispr-cas systems
SG11201700476VA (en) 2014-07-21 2017-02-27 Novartis Ag Treatment of cancer using humanized anti-bcma chimeric antigen receptor
CN106415742B (zh) 2014-07-22 2019-07-26 松下知识产权经营株式会社 复合磁性材料、使用其的线圈部件以及复合磁性材料的制造方法
DK3172315T3 (da) 2014-07-24 2020-12-21 Dsm Ip Assets Bv Fagresistente mælkesyrebakterier
US20170211048A1 (en) 2014-07-25 2017-07-27 Boehringer Ingelheim International Gmbh Enhanced reprogramming to ips cells
WO2016014837A1 (en) 2014-07-25 2016-01-28 Sangamo Biosciences, Inc. Gene editing for hiv gene therapy
US9816074B2 (en) 2014-07-25 2017-11-14 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for modulating nuclease-mediated genome engineering in hematopoietic stem cells
US10301367B2 (en) 2014-07-26 2019-05-28 Consiglio Nazionale Delle Ricerche Compositions and methods for treatment of muscular dystrophy
WO2016019144A2 (en) 2014-07-30 2016-02-04 Sangamo Biosciences, Inc. Gene correction of scid-related genes in hematopoietic stem and progenitor cells
FR3024464A1 (fr) 2014-07-30 2016-02-05 Centre Nat Rech Scient Ciblage de vecteurs integratifs non-viraux dans les sequences d'adn nucleolaires chez les eucaryotes
US10077453B2 (en) 2014-07-30 2018-09-18 President And Fellows Of Harvard College CAS9 proteins including ligand-dependent inteins
US9850521B2 (en) 2014-08-01 2017-12-26 Agilent Technologies, Inc. In vitro assay buffer for Cas9
US20160076093A1 (en) 2014-08-04 2016-03-17 University Of Washington Multiplex homology-directed repair
EP2982758A1 (en) 2014-08-04 2016-02-10 Centre Hospitalier Universitaire Vaudois (CHUV) Genome editing for the treatment of huntington's disease
KR20180015731A (ko) 2014-08-06 2018-02-13 주식회사 툴젠 캄필로박터 제주니 crispr/cas 시스템 유래 rgen을 이용한 유전체 교정
KR101826904B1 (ko) 2014-08-06 2018-02-08 기초과학연구원 조직적합성항원 유전자들의 교정을 통하여 구축한, 면역적합형 세포
US9932566B2 (en) 2014-08-07 2018-04-03 Agilent Technologies, Inc. CIS-blocked guide RNA
US11299732B2 (en) 2014-08-07 2022-04-12 The Rockefeller University Compositions and methods for transcription-based CRISPR-Cas DNA editing
JP6837429B2 (ja) 2014-08-11 2021-03-03 ザ ボード オブ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティー オブ テキサス システム Ｃｒｉｓｐｒ／ｃａｓ９媒介遺伝子編集による筋ジストロフィーの予防
US10513711B2 (en) 2014-08-13 2019-12-24 Dupont Us Holding, Llc Genetic targeting in non-conventional yeast using an RNA-guided endonuclease
CN107429241A (zh) 2014-08-14 2017-12-01 北京百奥赛图基因生物技术有限公司 Dna敲入系统
CN104178461B (zh) 2014-08-14 2017-02-01 北京蛋白质组研究中心 携带cas9的重组腺病毒及其应用
US9879270B2 (en) 2014-08-15 2018-01-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Constructs and methods for genome editing and genetic engineering of fungi and protists
EP3686279B1 (en) 2014-08-17 2023-01-04 The Broad Institute, Inc. Genome editing using cas9 nickases
KR20170036801A (ko) 2014-08-19 2017-04-03 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 핵산의 프로빙 및 맵핑을 위한 ｒｎａ-가이드된 시스템
WO2016028887A1 (en) 2014-08-19 2016-02-25 Pacific Biosciences Of California, Inc. Compositions and methods for enrichment of nucleic acids
WO2016026444A1 (en) 2014-08-20 2016-02-25 Shanghai Institutes For Biological Sciences, Chinese Academy Of Sciences Biomarker and therapeutic target for triple negative breast cancer
EP3186368B1 (en) 2014-08-25 2020-01-15 Geneweave Biosciences Inc. Non-replicative transduction particles and transduction particle-based reporter systems
EP3194427A1 (en) 2014-08-26 2017-07-26 The Regents of The University of California Hypersensitive aba receptors
SG11201701245QA (en) 2014-08-27 2017-03-30 Caribou Biosciences Inc Methods for increasing cas9-mediated engineering efficiency
EP3633032A3 (en) 2014-08-28 2020-07-29 North Carolina State University Novel cas9 proteins and guiding features for dna targeting and genome editing
EP3188763B1 (en) 2014-09-02 2020-05-13 The Regents of The University of California Methods and compositions for rna-directed target dna modification
DK3189140T3 (en) 2014-09-05 2020-02-03 Univ Vilnius Programmerbar RNA-fragmentering ved hjælp af TYPE III-A CRISPR-Cas-systemet af Streptococcus thermophilus
EP3188746B1 (en) 2014-09-05 2024-06-19 The Johns Hopkins University Targeting capn9 activity as a therapeutic strategy for the treatment of myofibroblast differentiation and associated pathologies
US20170298450A1 (en) 2014-09-10 2017-10-19 The Regents Of The University Of California Reconstruction of ancestral cells by enzymatic recording
US11560568B2 (en) 2014-09-12 2023-01-24 E. I. Du Pont De Nemours And Company Generation of site-specific-integration sites for complex trait loci in corn and soybean, and methods of use
US10435677B2 (en) 2014-09-16 2019-10-08 Sangamo Therapeutics, Inc. Genetically modified human cell with a corrected mutant sickle cell mutation
CA2960436C (en) 2014-09-16 2021-01-05 Gilead Sciences, Inc. Solid forms of a toll-like receptor modulator
WO2016049163A2 (en) 2014-09-24 2016-03-31 The Broad Institute Inc. Use and production of chd8+/- transgenic animals with behavioral phenotypes characteristic of autism spectrum disorder
BR112017005892A2 (pt) 2014-09-24 2017-12-12 Hope City variantes de vetor de vírus adeno-associado para edição de genoma de alta eficácia e métodos da mesma
WO2016049251A1 (en) 2014-09-24 2016-03-31 The Broad Institute Inc. Delivery, use and therapeutic applications of the crispr-cas systems and compositions for modeling mutations in leukocytes
WO2016049024A2 (en) 2014-09-24 2016-03-31 The Broad Institute Inc. Delivery, use and therapeutic applications of the crispr-cas systems and compositions for modeling competition of multiple cancer mutations in vivo
WO2016049258A2 (en) 2014-09-25 2016-03-31 The Broad Institute Inc. Functional screening with optimized functional crispr-cas systems
WO2016046635A1 (en) 2014-09-25 2016-03-31 Institut Pasteur Methods for characterizing human papillomavirus associated cervical lesions
WO2016054225A1 (en) 2014-09-30 2016-04-07 Stc.Unm Plasmid delivery in the treatment of cancer and other disease states
KR102630014B1 (ko) 2014-10-01 2024-01-25 더 제너럴 하스피탈 코포레이션 뉴클레아제-유도 상동성-지정 복구의 효율 증가 방법
AU2015330775B2 (en) 2014-10-09 2021-06-24 Seattle Children' S Hospital (Dba Seattle Children' S Research Institute) Long poly (A) plasmids and methods for introduction of long poly (A) sequences into the plasmid
EP3998344A1 (en) 2014-10-09 2022-05-18 Life Technologies Corporation Crispr oligonucleotides and gene editing
CA2963693A1 (en) 2014-10-10 2016-04-14 Editas Medicine, Inc. Compositions and methods for promoting homology directed repair
CA2964234A1 (en) 2014-10-10 2016-04-14 Massachusetts Eye And Ear Infirmary Efficient delivery of therapeutic molecules in vitro and in vivo
WO2016061073A1 (en) 2014-10-14 2016-04-21 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Composition and method for in vivo engineering of chromosomal rearrangements
KR20170070136A (ko) 2014-10-15 2017-06-21 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 만능성 세포를 생성하거나 유지하는 방법 및 조성물
BR112017007923B1 (pt) 2014-10-17 2023-12-12 The Penn State Research Foundation Método para produzir manipulação genética mediada por reações multiplex com rna em uma célula receptora, construção de ácido nucleico,cassete de expressão, vetor, célula receptora e célula geneticamente modificada
CN104342457A (zh) 2014-10-17 2015-02-11 杭州师范大学 一种将外源基因定点整合到靶标基因的方法
EP3207131B1 (en) 2014-10-17 2022-09-28 Howard Hughes Medical Institute Genomic probes
BR112017008082A2 (pt) 2014-10-20 2017-12-26 Envirologix Inc composições e métodos para detectar um vírus de rna
US20170247762A1 (en) 2014-10-27 2017-08-31 The Board Institute Inc. Compositions, methods and use of synthetic lethal screening
EP3212221B1 (en) 2014-10-29 2023-12-06 Massachusetts Eye & Ear Infirmary Efficient delivery of therapeutic molecules in vitro and in vivo
MA40880A (fr) 2014-10-30 2017-09-05 Temple Univ Of The Commonwealth Éradication guidée par l'arn du virus jc humain et d'autres polyomavirus
EP4434997A2 (en) 2014-10-30 2024-09-25 President And Fellows Of Harvard College Delivery of negatively charged proteins using cationic lipids
US9816080B2 (en) 2014-10-31 2017-11-14 President And Fellows Of Harvard College Delivery of CAS9 via ARRDC1-mediated microvesicles (ARMMs)
EP4219725A3 (en) 2014-10-31 2023-08-30 The Trustees of the University of Pennsylvania Altering gene expression in modified t cells and uses thereof
WO2016070037A2 (en) 2014-10-31 2016-05-06 Massachusetts Institute Of Technology Massively parallel combinatorial genetics for crispr
US10435697B2 (en) 2014-11-03 2019-10-08 Nanyang Technological University Recombinant expression system that senses pathogenic microorganisms
CN104404036B (zh) 2014-11-03 2017-12-01 赛业（苏州）生物科技有限公司 基于CRISPR/Cas9技术的条件性基因敲除方法
CN104504304B (zh) 2014-11-03 2017-08-25 深圳先进技术研究院 一种成簇的规律间隔的短回文重复序列识别方法及装置
US10920215B2 (en) 2014-11-04 2021-02-16 National University Corporation Kobe University Method for modifying genome sequence to introduce specific mutation to targeted DNA sequence by base-removal reaction, and molecular complex used therein
US20180291382A1 (en) 2014-11-05 2018-10-11 The Regents Of The University Of California Methods for Autocatalytic Genome Editing and Neutralizing Autocatalytic Genome Editing
DK3597740T3 (da) 2014-11-06 2022-06-20 Dupont Us Holding Llc Peptidmedieret indføring af rna-styret endonuklease i celler
WO2016073990A2 (en) 2014-11-07 2016-05-12 Editas Medicine, Inc. Methods for improving crispr/cas-mediated genome-editing
EP3218513B1 (en) 2014-11-11 2018-10-31 Illumina, Inc. Polynucleotide amplification using crispr-cas systems
WO2016077273A1 (en) 2014-11-11 2016-05-19 Q Therapeutics, Inc. Engineering mesenchymal stem cells using homologous recombination
KR101828933B1 (ko) 2014-11-14 2018-02-14 기초과학연구원 유전체에서 유전자 가위의 비표적 위치를 검출하는 방법
EP3467110A1 (en) 2014-11-15 2019-04-10 Zumutor Biologics Inc. Dna-binding domain, non-fucosylated and partially fucosylated proteins, and methods thereof
WO2016080097A1 (ja) 2014-11-17 2016-05-26 国立大学法人東京医科歯科大学 簡便で高効率の遺伝子改変非ヒト哺乳動物の作製方法
EP3222728B1 (en) 2014-11-19 2021-07-14 Institute for Basic Science Method for regulating gene expression using cas9 protein expressed from two vectors
WO2016081924A1 (en) 2014-11-20 2016-05-26 Duke University Compositions, systems and methods for cell therapy
US10227661B2 (en) 2014-11-21 2019-03-12 GeneWeave Biosciences, Inc. Sequence-specific detection and phenotype determination
RS58893B1 (sr) 2014-11-21 2019-08-30 Regeneron Pharma Postupci i kompozicije za ciljanu genetičku modifikaciju korišćenjem parnih vodećih rnk
WO2016086177A2 (en) 2014-11-25 2016-06-02 Drexel University Compositions and methods for hiv quasi-species excision from hiv-1-infected patients
EP3224353B9 (en) 2014-11-26 2023-08-09 Technology Innovation Momentum Fund (Israel) Limited Partnership Targeted elimination of bacterial genes
WO2016082135A1 (zh) 2014-11-27 2016-06-02 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 一种利用定点切割系统对猪h11位点定点插入的方法
KR20170081268A (ko) 2014-11-27 2017-07-11 단지거 이노베이션즈 엘티디. 게놈 편집용 핵산 구조체
CN105695485B (zh) 2014-11-27 2020-02-21 中国科学院上海生命科学研究院 一种用于丝状真菌Crispr-Cas系统的Cas9编码基因及其应用
GB201421096D0 (en) 2014-11-27 2015-01-14 Imp Innovations Ltd Genome editing methods
WO2016089883A1 (en) 2014-12-01 2016-06-09 Novartis Ag Compositions and methods for diagnosis and treatment of prostate cancer
US20170266320A1 (en) 2014-12-01 2017-09-21 President And Fellows Of Harvard College RNA-Guided Systems for In Vivo Gene Editing
US10900034B2 (en) 2014-12-03 2021-01-26 Agilent Technologies, Inc. Guide RNA with chemical modifications
CN104450774A (zh) 2014-12-04 2015-03-25 中国农业科学院作物科学研究所 一种大豆CRISPR/Cas9体系的构建及其在大豆基因修饰中的应用
WO2016090385A1 (en) 2014-12-05 2016-06-09 Applied Stemcell, Inc. Site-directed crispr/recombinase compositions and methods of integrating transgenes
CN104531705A (zh) 2014-12-09 2015-04-22 中国农业大学 利用CRISPR-Cas9系统敲除动物myostatin基因的方法
CN104531704B (zh) 2014-12-09 2019-05-21 中国农业大学 利用CRISPR-Cas9系统敲除动物FGF5基因的方法
KR102656470B1 (ko) 2014-12-10 2024-04-09 리전츠 오브 더 유니버스티 오브 미네소타 질환을 치료하기 위한 유전적으로 변형된 세포, 조직 및 장기
CN104480144B (zh) 2014-12-12 2017-04-12 武汉大学 用于艾滋病基因治疗的CRISPR/Cas9重组慢病毒载体及其慢病毒
WO2016094874A1 (en) 2014-12-12 2016-06-16 The Broad Institute Inc. Escorted and functionalized guides for crispr-cas systems
WO2016094872A1 (en) 2014-12-12 2016-06-16 The Broad Institute Inc. Dead guides for crispr transcription factors
EP3889260A1 (en) 2014-12-12 2021-10-06 The Broad Institute, Inc. Protected guide rnas (pgrnas)
US20170362580A1 (en) 2014-12-12 2017-12-21 James Zhu Methods and compositions for selectively eliminating cells of interest
WO2016094880A1 (en) 2014-12-12 2016-06-16 The Broad Institute Inc. Delivery, use and therapeutic applications of crispr systems and compositions for genome editing as to hematopoietic stem cells (hscs)
WO2016094845A2 (en) 2014-12-12 2016-06-16 Woolf Tod M Compositions and methods for editing nucleic acids in cells utilizing oligonucleotides
CA2971205A1 (en) 2014-12-16 2016-06-23 Synthetic Genomics, Inc. Compositions of and methods for in vitro viral genome engineering
CA2971187C (en) 2014-12-16 2023-10-24 Danisco Us Inc. Fungal genome modification systems and methods of use
BR112017012765A2 (pt) 2014-12-17 2018-01-16 Du Pont ?métodos para editar uma sequência de nucleotídeos, célula e linhagem de e. coli e método para produzir uma célula de e. coli?
RU2711506C2 (ru) 2014-12-17 2020-01-17 ПРОКЬЮЭР ТЕРАПЬЮТИКС II Би.Ви. Редактирование целевой рнк
EP3233095A2 (en) 2014-12-17 2017-10-25 Cellectis INHIBITORY CHIMERIC ANTIGEN RECEPTOR (iCAR OR N-CAR) EXPRESSING NON-T CELL TRANSDUCTION DOMAIN
CN112877327A (zh) 2014-12-18 2021-06-01 综合基因技术公司 基于crispr的组合物和使用方法
WO2016097751A1 (en) 2014-12-18 2016-06-23 The University Of Bath Method of cas9 mediated genome engineering
CN104745626B (zh) 2014-12-19 2018-05-01 中国航天员科研训练中心 一种条件性基因敲除动物模型的快速构建方法及应用
WO2016100974A1 (en) 2014-12-19 2016-06-23 The Broad Institute Inc. Unbiased identification of double-strand breaks and genomic rearrangement by genome-wide insert capture sequencing
AU2015364286B2 (en) 2014-12-20 2021-11-04 Arc Bio, Llc Compositions and methods for targeted depletion, enrichment, and partitioning of nucleic acids using CRISPR/Cas system proteins
CN104560864B (zh) 2014-12-22 2017-08-11 中国科学院微生物研究所 利用CRISPR‑Cas9系统构建的敲除IFN‑β基因的293T细胞系
US10190106B2 (en) 2014-12-22 2019-01-29 Univesity Of Massachusetts Cas9-DNA targeting unit chimeras
WO2016106239A1 (en) 2014-12-23 2016-06-30 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for nucleic acid integration
WO2016106236A1 (en) 2014-12-23 2016-06-30 The Broad Institute Inc. Rna-targeting system
CA2968939A1 (en) 2014-12-24 2016-06-30 The Johns Hopkins University Systems and methods for genome modification and regulation
EP3237615B2 (en) 2014-12-24 2023-07-26 The Broad Institute, Inc. Crispr having or associated with destabilization domains
AU2015101792A4 (en) 2014-12-24 2016-01-28 Massachusetts Institute Of Technology Engineering of systems, methods and optimized enzyme and guide scaffolds for sequence manipulation
CN104651398A (zh) 2014-12-24 2015-05-27 杭州师范大学 利用CRISPR-Cas9特异敲出microRNA基因家族的方法
US10863730B2 (en) 2014-12-26 2020-12-15 Riken Gene knockout method
CN104498493B (zh) 2014-12-30 2017-12-26 武汉大学 CRISPR/Cas9特异性敲除乙型肝炎病毒的方法以及用于特异性靶向HBV DNA的gRNA
WO2016108926A1 (en) 2014-12-30 2016-07-07 The Broad Institute Inc. Crispr mediated in vivo modeling and genetic screening of tumor growth and metastasis
WO2016109255A1 (en) 2014-12-30 2016-07-07 University Of South Florida Methods and compositions for cloning into large vectors
CN104651399B (zh) 2014-12-31 2018-11-16 广西大学 一种利用CRISPR/Cas系统在猪胚胎细胞中实现基因敲除的方法
US11339399B2 (en) 2014-12-31 2022-05-24 Viridos, Inc. Compositions and methods for high efficiency in vivo genome editing
WO2016110512A1 (en) 2015-01-06 2016-07-14 Dsm Ip Assets B.V. A crispr-cas system for a yeast host cell
WO2016110453A1 (en) 2015-01-06 2016-07-14 Dsm Ip Assets B.V. A crispr-cas system for a filamentous fungal host cell
DK3242948T3 (da) 2015-01-06 2022-03-07 Dsm Ip Assets Bv Crispr-cas-system til en yarrowia-værtscelle
JP6603721B2 (ja) 2015-01-06 2019-11-06 インダストリー−アカデミック コーポレーション ファウンデーション，ヨンセイ ユニバーシティ 血液凝固因子ｖｉｉｉ遺伝子をターゲットとするエンドヌクレアーゼ及びそれを含む血友病治療用組成物
CN104651392B (zh) 2015-01-06 2018-07-31 华南农业大学 一种利用CRISPR/Cas9系统定点突变P/TMS12-1获得温敏不育系的方法
US20180155708A1 (en) 2015-01-08 2018-06-07 President And Fellows Of Harvard College Split Cas9 Proteins
CN104593422A (zh) 2015-01-08 2015-05-06 中国农业大学 一种抗蓝耳病克隆猪的制备方法
CN113388670B (zh) 2015-01-09 2024-02-02 生物辐射实验室股份有限公司 检测基因组编辑
AU2016206870B2 (en) 2015-01-12 2022-02-17 Massachusetts Institute Of Technology Gene editing through microfluidic delivery
US11208638B2 (en) 2015-01-12 2021-12-28 The Regents Of The University Of California Heterodimeric Cas9 and methods of use thereof
WO2016112963A1 (en) 2015-01-13 2016-07-21 Riboxx Gmbh Delivery of biomolecules into cells
MA41349A (fr) 2015-01-14 2017-11-21 Univ Temple Éradication de l'herpès simplex de type i et d'autres virus de l'herpès associés guidée par arn
CN107429263A (zh) 2015-01-15 2017-12-01 斯坦福大学托管董事会 调控基因组编辑的方法
CN104611370A (zh) 2015-01-16 2015-05-13 深圳市科晖瑞生物医药有限公司 一种剔除β2-微球蛋白基因片段的方法
WO2016116032A1 (en) 2015-01-19 2016-07-28 Institute Of Genetics And Developmental Biology,Chinese Academy Of Sciences A method for precise modification of plant via transient gene expression
CN104725626B (zh) 2015-01-22 2016-06-29 漳州亚邦化学有限公司 一种适用于人造石英石的不饱和树脂的制备方法
CN105821072A (zh) 2015-01-23 2016-08-03 深圳华大基因研究院 用于DNA组装的CRISPR-Cas9系统及DNA组装方法
WO2016123071A1 (en) 2015-01-26 2016-08-04 Cold Spring Harbor Laboratory Methods of identifying essential protein domains
US10059940B2 (en) 2015-01-27 2018-08-28 Minghong Zhong Chemically ligated RNAs for CRISPR/Cas9-lgRNA complexes as antiviral therapeutic agents
CN104561095B (zh) 2015-01-27 2017-08-22 深圳市国创纳米抗体技术有限公司 一种能够生产人神经生长因子的转基因小鼠的制备方法
EP3250689B1 (en) 2015-01-28 2020-11-04 The Regents of The University of California Methods and compositions for labeling a single-stranded target nucleic acid
RS64527B1 (sr) 2015-01-28 2023-09-29 Caribou Biosciences Inc Hibridni polinukleotidi crispr dnk/rnk i postupci upotrebe
ES2894882T3 (es) 2015-01-29 2022-02-16 Meiogenix Procedimiento para inducir recombinaciones meióticas dirigidas
AU2016211161C1 (en) 2015-01-30 2023-11-23 The Regents Of The University Of California Protein delivery in primary hematopoietic cells
ES2873400T3 (es) 2015-02-02 2021-11-03 Meiragtx Uk Ii Ltd Regulación de la expresión génica a través de la modulación mediada por un aptámero del corte y empalme alternativo
CN104593418A (zh) 2015-02-06 2015-05-06 中国医学科学院医学实验动物研究所 一种人源化大鼠药物评价动物模型建立的方法
WO2016130600A2 (en) 2015-02-09 2016-08-18 Duke University Compositions and methods for epigenome editing
KR101584933B1 (ko) 2015-02-10 2016-01-13 성균관대학교산학협력단 항생제 내성 억제용 재조합 벡터 및 이의 용도
WO2016130697A1 (en) 2015-02-11 2016-08-18 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Methods and kits for generating vectors that co-express multiple target molecules
CN104928321B (zh) 2015-02-12 2018-06-01 中国科学院西北高原生物研究所 一种由Crispr/Cas9诱导的鳞片缺失斑马鱼模式及建立方法
CN104726494B (zh) 2015-02-12 2018-10-23 中国人民解放军第二军医大学 CRISPR-Cas9技术构建染色体易位干细胞及动物模型的方法
EP3256170B1 (en) 2015-02-13 2020-09-23 University of Massachusetts Compositions and methods for transient delivery of nucleases
US20160244784A1 (en) 2015-02-15 2016-08-25 Massachusetts Institute Of Technology Population-Hastened Assembly Genetic Engineering
WO2016132122A1 (en) 2015-02-17 2016-08-25 University Of Edinburgh Assay construct
US20180064073A1 (en) 2015-02-19 2018-03-08 Tokushima University Method for Transferring Cas9 mRNA Into Mammalian Fertilized Egg by Electroporation
WO2016135558A2 (en) 2015-02-23 2016-09-01 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for treatment of hemoglobinopathies
EP3262162A4 (en) 2015-02-23 2018-08-08 Voyager Therapeutics, Inc. Regulatable expression using adeno-associated virus (aav)
US12129471B2 (en) 2015-02-23 2024-10-29 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Materials and methods for treatment of human genetic diseases including hemoglobinopathies
KR20160103953A (ko) 2015-02-25 2016-09-02 연세대학교 산학협력단 Crispr 시스템을 이용한 다중 위치 염기서열의 동시 포획 방법
CN107406858A (zh) 2015-02-25 2017-11-28 先锋国际良种公司 用于指导rna/cas内切核酸酶复合物的调节型表达的组合物和方法
WO2016135507A1 (en) 2015-02-27 2016-09-01 University Of Edinburgh Nucleic acid editing systems
CN104805099B (zh) 2015-03-02 2018-04-13 中国人民解放军第二军医大学 一种安全编码Cas9蛋白的核酸分子及其表达载体
KR102598856B1 (ko) 2015-03-03 2023-11-07 더 제너럴 하스피탈 코포레이션 변경된 PAM 특이성을 갖는 조작된 CRISPR-Cas9 뉴클레아제
CN104651401B (zh) 2015-03-05 2019-03-08 东华大学 一种mir-505双等位基因敲除的方法
CN104673816A (zh) 2015-03-05 2015-06-03 广东医学院 一种pCr-NHEJ载体及其构建方法及其用于细菌基因定点敲除的应用
EP3268044A2 (en) 2015-03-11 2018-01-17 The Broad Institute Inc. Prmt5 inhibitors for the treatment of cancer with reduced mtap activty
GB201504223D0 (en) 2015-03-12 2015-04-29 Genome Res Ltd Biallelic genetic modification
AR103927A1 (es) 2015-03-12 2017-06-14 Inst Genetics & Dev Biolog Cas Método para mejorar la habilidad de resistir a adn de virus que infectan plantas
AU2016233648B2 (en) 2015-03-13 2019-11-07 The Jackson Laboratory A three-component crispr/cas complex system and uses thereof
EP3279321A4 (en) 2015-03-16 2018-10-31 Institute Of Genetics And Developmental Biology, Chinese Academy Of Sciences Method of applying non-genetic substance to perform site-directed reform of plant genome
CN106032540B (zh) 2015-03-16 2019-10-25 中国科学院上海生命科学研究院 CRISPR/Cas9核酸内切酶体系的腺相关病毒载体构建及其用途
WO2016149484A2 (en) 2015-03-17 2016-09-22 Temple University Of The Commonwealth System Of Higher Education Compositions and methods for specific reactivation of hiv latent reservoir
EP3271849B1 (en) 2015-03-17 2021-09-08 Bio-Rad Laboratories, Inc. Detection of genome editing
MA41382A (fr) 2015-03-20 2017-11-28 Univ Temple Édition génique basée sur le système crispr/endonucléase à induction par tat
US20180163196A1 (en) 2015-03-20 2018-06-14 Danmarks Tekniske Universitet Crispr/cas9 based engineering of actinomycetal genomes
CN104726449A (zh) 2015-03-23 2015-06-24 国家纳米科学中心 一种用于预防和/或治疗HIV的CRISPR-Cas9系统及其制备方法和用途
CN106148416B (zh) 2015-03-24 2019-12-17 华东师范大学 Cyp基因敲除大鼠的培育方法及其肝微粒体的制备方法
US20180112213A1 (en) 2015-03-25 2018-04-26 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods, compositions and components
WO2016154579A2 (en) 2015-03-26 2016-09-29 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-mediated gene conversion
WO2016161004A1 (en) 2015-03-30 2016-10-06 The Board Of Regents Of The Nevada System Of Higher Educ. On Behalf Of The University Of Nevada, La Compositions comprising talens and methods of treating hiv
US20180080051A1 (en) 2015-03-31 2018-03-22 Exeligen Scientific, Inc. Cas 9 retroviral integrase and cas 9 recombinase systems for targeted incorporation of a dna sequence into a genome of a cell or organism
EP3748004A1 (en) 2015-04-01 2020-12-09 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for treating duchenne muscular dystrophy and becker muscular dystrophy
WO2016161260A1 (en) 2015-04-02 2016-10-06 Agenovir Corporation Gene delivery methods and compositions
CN106434737A (zh) 2015-04-03 2017-02-22 内蒙古中科正标生物科技有限责任公司 基于CRISPR/Cas9技术的单子叶植物基因敲除载体及其应用
CA2981077A1 (en) 2015-04-03 2016-10-06 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Composition and methods of genome editing of b-cells
US20170166928A1 (en) 2015-04-03 2017-06-15 Whitehead Institute For Biomedical Research Compositions And Methods For Genetically Modifying Yeast
KR102648489B1 (ko) 2015-04-06 2024-03-15 더 보드 어브 트러스티스 어브 더 리랜드 스탠포드 주니어 유니버시티 Crispr/cas-매개 유전자 조절을 위한 화학적으로 변형된 가이드 rna
US11214779B2 (en) 2015-04-08 2022-01-04 University of Pittsburgh—of the Commonwealth System of Higher Education Activatable CRISPR/CAS9 for spatial and temporal control of genome editing
US11390860B2 (en) 2015-04-13 2022-07-19 The University Of Tokyo Set of polypeptides exhibiting nuclease activity or nickase activity with dependence on light or in presence of drug or suppressing or activating expression of target gene
US10155938B2 (en) 2015-04-14 2018-12-18 City Of Hope Coexpression of CAS9 and TREX2 for targeted mutagenesis
GB201506509D0 (en) 2015-04-16 2015-06-03 Univ Wageningen Nuclease-mediated genome editing
WO2016168631A1 (en) 2015-04-17 2016-10-20 President And Fellows Of Harvard College Vector-based mutagenesis system
US10738290B2 (en) 2015-04-21 2020-08-11 Novartis Ag RNA-guided gene editing system and uses thereof
CN104805118A (zh) 2015-04-22 2015-07-29 扬州大学 一种苏禽黄鸡胚胎干细胞特定基因进行靶向敲除方法
CN104762321A (zh) 2015-04-22 2015-07-08 东北林业大学 基于CRISPR/Cas9系统靶向敲除KHV基因的敲除载体构建方法及其crRNA原件
WO2016172359A2 (en) 2015-04-24 2016-10-27 The Regents Of The University Of California Systems for detecting, monitoring or treating diseases or conditions using engineered cells and methods for making and using them
WO2016172727A1 (en) 2015-04-24 2016-10-27 Editas Medicine, Inc. Evaluation of cas9 molecule/guide rna molecule complexes
US11268158B2 (en) 2015-04-24 2022-03-08 St. Jude Children's Research Hospital, Inc. Assay for safety assessment of therapeutic genetic manipulations, gene therapy vectors and compounds
CN104746260A (zh) 2015-04-27 2015-07-01 苏州市吴中区甪直明达漂染厂 一种蒸汽辊压染色装置
JP6851319B2 (ja) 2015-04-27 2021-03-31 ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア ヒト疾患のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介性の修正のためのデュアルＡＡＶベクター系
EP3289081B1 (en) 2015-04-27 2019-03-27 Genethon Compositions and methods for the treatment of nucleotide repeat expansion disorders
EP3087974A1 (en) 2015-04-29 2016-11-02 Rodos BioTarget GmbH Targeted nanocarriers for targeted drug delivery of gene therapeutics
US20190002920A1 (en) 2015-04-30 2019-01-03 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Methods and kits for cloning-free genome editing
EP3289080B1 (en) 2015-04-30 2021-08-25 The Trustees of Columbia University in the City of New York Gene therapy for autosomal dominant diseases
US20160346359A1 (en) 2015-05-01 2016-12-01 Spark Therapeutics, Inc. Adeno-associated Virus-Mediated CRISPR-Cas9 Treatment of Ocular Disease
EP4015633A1 (en) 2015-05-01 2022-06-22 Precision Biosciences, Inc. Precise deletion of chromosomal sequences in vivo and treatment of nucleotide repeat expansion disorders using engineered nucleases
CN104894068A (zh) 2015-05-04 2015-09-09 南京凯地生物科技有限公司 一种利用CRISPR/Cas9制备CAR-T细胞的方法
CN108026566A (zh) 2015-05-04 2018-05-11 特拉维夫大学拉莫特有限公司 用于使dna片段化的方法和试剂盒
GB2531454A (en) 2016-01-10 2016-04-20 Snipr Technologies Ltd Recombinogenic nucleic acid strands in situ
CA2984975A1 (en) 2015-05-06 2016-11-10 Snipr Technologies Limited Altering microbial populations & modifying microbiota
WO2016182893A1 (en) 2015-05-08 2016-11-17 Teh Broad Institute Inc. Functional genomics using crispr-cas systems for saturating mutagenesis of non-coding elements, compositions, methods, libraries and applications thereof
JP7288302B2 (ja) 2015-05-08 2023-06-07 ザ チルドレンズ メディカル センター コーポレーション 胎児型ヘモグロビン再誘導のための、ｂｃｌ１１ａエンハンサー機能性領域を標的とする方法
EP3294896A1 (en) 2015-05-11 2018-03-21 Editas Medicine, Inc. Optimized crispr/cas9 systems and methods for gene editing in stem cells
AU2016262521A1 (en) 2015-05-11 2017-12-14 Editas Medicine, Inc. CRISPR/CAS-related methods and compositions for treating HIV infection and AIDS
BR112017024115A2 (pt) 2015-05-12 2018-08-07 Sangamo Therapeutics Inc regulação de expressão genética mediada por nuclease
KR101785847B1 (ko) 2015-05-12 2017-10-17 연세대학교 산학협력단 선형 이중가닥 ＤＮＡ를 활용한 ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ 시스템을 이용한 표적 유전체 교정
CA2985650A1 (en) 2015-05-13 2016-11-17 Seattle Children's Hospital (dba Seattle Children's Research Institute) Enhancing endonuclease based gene editing in primary cells
US10920221B2 (en) 2015-05-13 2021-02-16 President And Fellows Of Harvard College Methods of making and using guide RNA for use with Cas9 systems
CN105886498A (zh) 2015-05-13 2016-08-24 沈志荣 CRISPR-Cas9特异性敲除人PCSK9基因的方法以及用于特异性靶向PCSK9基因的sgRNA
EP3294774B1 (en) 2015-05-13 2024-08-28 Zumutor Biologics, Inc. Afucosylated protein, cell expressing said protein and associated methods
WO2016183448A1 (en) 2015-05-14 2016-11-17 University Of Southern California Optimized gene editing utilizing a recombinant endonuclease system
WO2016183438A1 (en) 2015-05-14 2016-11-17 Massachusetts Institute Of Technology Self-targeting genome editing system
JP2018515142A (ja) 2015-05-15 2018-06-14 ダーマコン，インコーポレイテッド． Ｃａｓ９介在遺伝子編集用の合成シングルガイドｒｎａ
MX2017014560A (es) 2015-05-15 2018-03-01 Pioneer Hi Bred Int Caracterizacion rapida de sistemas de endonucleasa cas, secuencias pam y elementos arn de guia.
ES2952598T3 (es) 2015-05-16 2023-11-02 Genzyme Corp Edición génica de mutaciones intrónicas profundas
WO2016185411A1 (en) 2015-05-18 2016-11-24 King Abdullah University Of Science And Technology Method of inhibiting plant virus pathogen infections by crispr/cas9-mediated interference
CN104846010B (zh) 2015-05-18 2018-07-06 安徽省农业科学院水稻研究所 一种删除转基因水稻筛选标记基因的方法
EP3095870A1 (en) 2015-05-19 2016-11-23 Kws Saat Se Methods for the in planta transformation of plants and manufacturing processes and products based and obtainable therefrom
CN106011104B (zh) 2015-05-21 2019-09-27 清华大学 利用拆分Cas系统进行基因编辑和表达调控方法
WO2016187904A1 (zh) 2015-05-22 2016-12-01 深圳市第二人民医院 CRISPR-Cas9特异性敲除猪CMAH基因的方法及用于特异性靶向CMAH基因的sgRNA
CN105518135B (zh) 2015-05-22 2020-11-24 深圳市第二人民医院 CRISPR-Cas9特异性敲除猪CMAH基因的方法及用于特异性靶向CMAH基因的sgRNA
WO2016187717A1 (en) 2015-05-26 2016-12-01 Exerkine Corporation Exosomes useful for genome editing
CN105624146B (zh) 2015-05-28 2019-02-15 中国科学院微生物研究所 基于CRISPR/Cas9和酿酒酵母细胞内源的同源重组的分子克隆方法
US20180148711A1 (en) 2015-05-28 2018-05-31 Coda Biotherapeutics, Inc. Genome editing vectors
CN104894075B (zh) 2015-05-28 2019-08-06 华中农业大学 CRISPR/Cas9和Cre/lox系统编辑伪狂犬病毒基因组制备疫苗方法和应用
GB2543873A (en) 2015-05-29 2017-05-03 Agenovir Corp Compositions and methods for cell targeted HPV treatment
GB2542653A (en) 2015-05-29 2017-03-29 Agenovir Corp Methods and compositions for treating cells for transplant
EP3331571A4 (en) 2015-05-29 2019-04-10 Agenovir Corporation COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING VIRAL INFECTIONS
US20160346362A1 (en) 2015-05-29 2016-12-01 Agenovir Corporation Methods and compositions for treating cytomegalovirus infections
US20180148486A1 (en) 2015-05-29 2018-05-31 Clark Atlanta University Human cell lines mutant for zic2
US20160350476A1 (en) 2015-05-29 2016-12-01 Agenovir Corporation Antiviral methods and compositions
CN108026536A (zh) 2015-05-29 2018-05-11 北卡罗来纳州立大学 使用crispr核酸筛选细菌、古细菌、藻类和酵母的方法
US10117911B2 (en) 2015-05-29 2018-11-06 Agenovir Corporation Compositions and methods to treat herpes simplex virus infections
KR102553518B1 (ko) 2015-06-01 2023-07-07 템플 유니버시티-오브 더 커먼웰쓰 시스템 오브 하이어 에듀케이션 Hiv 감염의 rna-가이드된 치료를 위한 방법 및 조성물
CA2987684A1 (en) 2015-06-01 2016-12-08 The Hospital For Sick Children Delivery of structurally diverse polypeptide cargo into mammalian cells by a bacterial toxin
CN105112445B (zh) 2015-06-02 2018-08-10 广州辉园苑医药科技有限公司 一种基于CRISPR-Cas9基因敲除技术的miR-205基因敲除试剂盒
WO2016196655A1 (en) 2015-06-03 2016-12-08 The Regents Of The University Of California Cas9 variants and methods of use thereof
CN108368502B (zh) 2015-06-03 2022-03-18 内布拉斯加大学董事委员会 使用单链dna的dna编辑
US10626393B2 (en) 2015-06-04 2020-04-21 Arbutus Biopharma Corporation Delivering CRISPR therapeutics with lipid nanoparticles
WO2016197132A1 (en) 2015-06-04 2016-12-08 Protiva Biotherapeutics Inc. Treating hepatitis b virus infection using crispr
CN105039339B (zh) 2015-06-05 2017-12-19 新疆畜牧科学院生物技术研究所 一种以RNA介导的特异性敲除绵羊FecB基因的方法及其专用sgRNA
US11279926B2 (en) 2015-06-05 2022-03-22 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for generating CRISPR/Cas guide RNAs
CN108026526B (zh) 2015-06-09 2023-05-12 爱迪塔斯医药公司 用于改善移植的crispr/cas相关方法和组合物
WO2016198500A1 (en) 2015-06-10 2016-12-15 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for rna-guided treatment of human cytomegalovirus (hcmv) infection
JP6961494B2 (ja) 2015-06-10 2021-11-05 フイルメニツヒ ソシエテ アノニムFirmenich Sa 匂い物質および芳香の受容体をスクリーニングするための細胞株
US20160362667A1 (en) 2015-06-10 2016-12-15 Caribou Biosciences, Inc. CRISPR-Cas Compositions and Methods
SG10202011241TA (en) 2015-06-10 2020-12-30 Firmenich & Cie Method of identifying musk compounds
CN105492608B (zh) 2015-06-11 2021-07-23 深圳市第二人民医院 CRISPR-Cas9特异性敲除猪PDX1基因的方法及用于特异性靶向PDX1基因的sgRNA
WO2016197361A1 (zh) 2015-06-11 2016-12-15 深圳市第二人民医院 CRISPR-Cas9特异性敲除猪GGTA1基因的方法及用于特异性靶向GGTA1基因的sgRNA
WO2016197362A1 (zh) 2015-06-11 2016-12-15 深圳市第二人民医院 CRISPR-Cas9特异性敲除猪vWF基因的方法及用于特异性靶向vWF基因的sgRNA
WO2016197360A1 (zh) 2015-06-11 2016-12-15 深圳市第二人民医院 CRISPR-Cas9特异性敲除猪GFRA1基因的方法及用于特异性靶向GFRA1基因的sgRNA
CN105518137B (zh) 2015-06-11 2021-04-30 深圳市第二人民医院 CRISPR-Cas9特异性敲除猪SALL1基因的方法及用于特异性靶向SALL1基因的sgRNA
WO2016197358A1 (zh) 2015-06-11 2016-12-15 深圳市第二人民医院 CRISPR-Cas9特异性敲除猪FGL2基因的方法及用于特异性靶向FGL2基因的sgRNA
CN105593367A (zh) 2015-06-11 2016-05-18 深圳市第二人民医院 CRISPR-Cas9特异性敲除猪SLA-1基因的方法及用于特异性靶向SLA-1基因的sgRNA
CN105518134A (zh) 2015-06-11 2016-04-20 深圳市第二人民医院 CRISPR-Cas9特异性敲除猪SLA-2基因的方法及用于特异性靶向SLA-2基因的sgRNA
CN106414740A (zh) 2015-06-11 2017-02-15 深圳市第二人民医院 CRISPR‑Cas9特异性敲除猪SLA‑3基因的方法及用于特异性靶向SLA‑3基因的sgRNA
GB201510296D0 (en) 2015-06-12 2015-07-29 Univ Wageningen Thermostable CAS9 nucleases
US20180142222A1 (en) 2015-06-12 2018-05-24 The Regents Of The University Of California Reporter cas9 variants and methods of use thereof
US20180187190A1 (en) 2015-06-12 2018-07-05 Erasmus University Medical Center Rotterdam New crispr assays
WO2016205276A1 (en) 2015-06-15 2016-12-22 North Carolina State University Methods and compositions for efficient delivery of nucleic acids and rna-based antimicrobials
WO2016205623A1 (en) 2015-06-17 2016-12-22 North Carolina State University Methods and compositions for genome editing in bacteria using crispr-cas9 systems
US11555207B2 (en) 2015-06-17 2023-01-17 The Uab Research Foundation CRISPR/Cas9 complex for introducing a functional polypeptide into cells of blood cell lineage
WO2016205728A1 (en) 2015-06-17 2016-12-22 Massachusetts Institute Of Technology Crispr mediated recording of cellular events
JP2018518182A (ja) 2015-06-17 2018-07-12 ザ ユーエービー リサーチ ファンデーション ゲノム編集のためのｃｒｉｓｐｒ／ｃａｓ９複合体
WO2016205749A1 (en) 2015-06-18 2016-12-22 The Broad Institute Inc. Novel crispr enzymes and systems
WO2016205613A1 (en) 2015-06-18 2016-12-22 The Broad Institute Inc. Crispr enzyme mutations reducing off-target effects
US9790490B2 (en) 2015-06-18 2017-10-17 The Broad Institute Inc. CRISPR enzymes and systems
WO2016205745A2 (en) 2015-06-18 2016-12-22 The Broad Institute Inc. Cell sorting
WO2016205759A1 (en) 2015-06-18 2016-12-22 The Broad Institute Inc. Engineering and optimization of systems, methods, enzymes and guide scaffolds of cas9 orthologs and variants for sequence manipulation
US9957501B2 (en) 2015-06-18 2018-05-01 Sangamo Therapeutics, Inc. Nuclease-mediated regulation of gene expression
EP3666895A1 (en) 2015-06-18 2020-06-17 The Broad Institute, Inc. Novel crispr enzymes and systems
EP3310395A4 (en) 2015-06-18 2019-05-22 Robert D. Bowles REGULATION OF RNA GUIDED TRANSCRIPTION AND METHODS OF USE THEREOF FOR THE TREATMENT OF LOMBALGIA
GB201511376D0 (en) 2015-06-29 2015-08-12 Ecolab Usa Inc Process for the treatment of produced water from chemical enhanced oil recovery
AU2016285724A1 (en) 2015-06-29 2017-11-16 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Modified CRISPR RNA and modified single CRISPR RNA and uses thereof
US11279928B2 (en) 2015-06-29 2022-03-22 Massachusetts Institute Of Technology Compositions comprising nucleic acids and methods of using the same
AU2016287440B2 (en) 2015-06-30 2022-02-10 Cellectis Methods for improving functionality in NK cell by gene inactivation using specific endonuclease
CN108350446A (zh) 2015-07-02 2018-07-31 约翰霍普金斯大学 基于crispr/cas9的治疗
EP3320091B1 (en) 2015-07-06 2020-11-11 DSM IP Assets B.V. Guide rna assembly vector
US20170009242A1 (en) 2015-07-06 2017-01-12 Whitehead Institute For Biomedical Research CRISPR-Mediated Genome Engineering for Protein Depletion
CN105132451B (zh) 2015-07-08 2019-07-23 电子科技大学 一种CRISPR/Cas9单一转录单元定向修饰骨架载体及其应用
AU2016291778B2 (en) 2015-07-13 2021-05-06 Sangamo Therapeutics, Inc. Delivery methods and compositions for nuclease-mediated genome engineering
US20170014449A1 (en) 2015-07-13 2017-01-19 Elwha LLC, a limited liability company of the State of Delaware Site-specific epigenetic editing
EP3322797B1 (en) 2015-07-13 2023-11-29 Institut Pasteur Improving sequence-specific antimicrobials by blocking dna repair
WO2017010556A1 (ja) 2015-07-14 2017-01-19 学校法人福岡大学 部位特異的ｒｎａ変異導入方法およびそれに使用する標的編集ガイドｒｎａならびに標的ｒｎａ－標的編集ガイドｒｎａ複合体
MA42895A (fr) 2015-07-15 2018-05-23 Juno Therapeutics Inc Cellules modifiées pour thérapie cellulaire adoptive
CA2992580C (en) 2015-07-15 2022-09-20 Rutgers, The State University Of New Jersey Nuclease-independent targeted gene editing platform and uses thereof
US20170020922A1 (en) 2015-07-16 2017-01-26 Batu Biologics Inc. Gene editing for immunological destruction of neoplasia
WO2017015015A1 (en) 2015-07-17 2017-01-26 Emory University Crispr-associated protein from francisella and uses related thereto
WO2017015101A1 (en) 2015-07-17 2017-01-26 University Of Washington Methods for maximizing the efficiency of targeted gene correction
EP3325018A4 (en) 2015-07-22 2019-04-24 Duke University HIGH EFFICIENCY SCREENING OF REGULATORY ELEMENT FUNCTION USING EPIGENOUS EDITING TECHNOLOGIES
WO2017015545A1 (en) 2015-07-22 2017-01-26 President And Fellows Of Harvard College Evolution of site-specific recombinases
CA2997535A1 (en) 2015-07-23 2017-01-26 Mayo Foundation For Medical Education And Research Editing mitochondrial dna
ES2948559T3 (es) 2015-07-25 2023-09-14 Habib Frost Un sistema, un dispositivo y un método para proporcionar una terapia o una cura para el cáncer y otros estados patológicos
CN106399360A (zh) 2015-07-27 2017-02-15 上海药明生物技术有限公司 基于crispr技术敲除fut8基因的方法
WO2017019867A1 (en) 2015-07-28 2017-02-02 Danisco Us Inc Genome editing systems and methods of use
CN105063061B (zh) 2015-07-28 2018-10-30 华南农业大学 一种水稻千粒重基因tgw6突变体及其制备方法与应用
CN106701808A (zh) 2015-07-29 2017-05-24 深圳华大基因研究院 Dna聚合酶i缺陷型菌株及其构建方法
WO2017019895A1 (en) 2015-07-30 2017-02-02 President And Fellows Of Harvard College Evolution of talens
US20170119820A1 (en) 2015-07-31 2017-05-04 Regents Of The University Of Minnesota Modified cells and methods of therapy
US20200123533A1 (en) 2015-07-31 2020-04-23 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York High-throughput strategy for dissecting mammalian genetic interactions
WO2017024047A1 (en) 2015-08-03 2017-02-09 Emendobio Inc. Compositions and methods for increasing nuclease induced recombination rate in cells
US20180230450A1 (en) 2015-08-03 2018-08-16 President And Fellows Of Harvard College Cas9 Genome Editing and Transcriptional Regulation
EP3331906A1 (en) 2015-08-06 2018-06-13 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Tunable endogenous protein degradation
BR112018002558A2 (pt) 2015-08-07 2018-09-25 Commw Scient Ind Res Org método para produção de um animal compreendendo uma modificação genética na linhagem germinativa
CN104962523B (zh) 2015-08-07 2018-05-25 苏州大学 一种测定非同源末端连接修复活性的方法
US9580727B1 (en) 2015-08-07 2017-02-28 Caribou Biosciences, Inc. Compositions and methods of engineered CRISPR-Cas9 systems using split-nexus Cas9-associated polynucleotides
WO2017025323A1 (en) 2015-08-11 2017-02-16 Cellectis Cells for immunotherapy engineered for targeting cd38 antigen and for cd38 gene inactivation
CN105255937A (zh) 2015-08-14 2016-01-20 西北农林科技大学 一种真核细胞III型启动子表达CRISPR sgRNA的方法及其应用
AU2016309392A1 (en) 2015-08-14 2018-02-22 Institute Of Genetics And Developmental Biology, Chinese Academy Of Sciences Method for obtaining glyphosate-resistant rice by site-directed nucleotide substitution
AU2016308283B2 (en) 2015-08-19 2022-04-21 Arc Bio, Llc Capture of nucleic acids using a nucleic acid-guided nuclease-based system
CN105112519A (zh) 2015-08-20 2015-12-02 郑州大学 一种基于crispr的大肠杆菌o157:h7菌株检测试剂盒及检测方法
WO2017031483A1 (en) 2015-08-20 2017-02-23 Applied Stemcell, Inc. Nuclease with enhanced efficiency of genome editing
CN105177126B (zh) 2015-08-21 2018-12-04 东华大学 一种利用荧光pcr技术对小鼠的分型鉴定方法
AU2016311454C1 (en) 2015-08-25 2023-10-19 Duke University Compositions and methods of improving specificity in genomic engineering using RNA-guided endonucleases
CN106480083B (zh) 2015-08-26 2021-12-14 中国科学院分子植物科学卓越创新中心 CRISPR/Cas9介导的大片段DNA拼接方法
JP6799586B2 (ja) 2015-08-28 2020-12-16 ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション 遺伝子操作ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ヌクレアーゼ
US9512446B1 (en) 2015-08-28 2016-12-06 The General Hospital Corporation Engineered CRISPR-Cas9 nucleases
US9926546B2 (en) 2015-08-28 2018-03-27 The General Hospital Corporation Engineered CRISPR-Cas9 nucleases
US20170058272A1 (en) 2015-08-31 2017-03-02 Caribou Biosciences, Inc. Directed nucleic acid repair
CN105087620B (zh) 2015-08-31 2017-12-29 中国农业大学 一种过表达猪共刺激受体4‑1bb载体及其应用
US10526590B2 (en) 2015-08-31 2020-01-07 Agilent Technologies, Inc. Compounds and methods for CRISPR/Cas-based genome editing by homologous recombination
WO2017040793A1 (en) 2015-09-01 2017-03-09 Dana-Farber Cancer Institute Inc. Systems and methods for selection of grna targeting strands for cas9 localization
EP3344756A4 (en) 2015-09-02 2019-09-04 University of Massachusetts DETECTION OF LOCI OF GENES COMPRISING MATRIX REPETITIONS OF CRISPR AND / OR POLYCHROMATIC MONO-GUIDE RIBONUCLEIC ACIDS
US20180251789A1 (en) 2015-09-04 2018-09-06 Massachusetts Institute Of Technology Multilayer genetic safety kill circuits based on single cas9 protein and multiple engineered grna in mammalian cells
CN105400810B (zh) 2015-09-06 2019-05-07 吉林大学 采用敲除技术建立低磷性佝偻病模型的方法
WO2017044419A1 (en) 2015-09-08 2017-03-16 University Of Massachusetts Dnase h activity of neisseria meningitidis cas9
US10767173B2 (en) 2015-09-09 2020-09-08 National University Corporation Kobe University Method for converting genome sequence of gram-positive bacterium by specifically converting nucleic acid base of targeted DNA sequence, and molecular complex used in same
WO2017043573A1 (ja) 2015-09-09 2017-03-16 国立大学法人神戸大学 標的化したｄｎａ配列の核酸塩基を特異的に変換するゲノム配列の改変方法及びそれに用いる分子複合体
WO2017044776A1 (en) 2015-09-10 2017-03-16 Texas Tech University System Single-guide rna (sgrna) with improved knockout efficiency
EP3347469A4 (en) 2015-09-10 2019-02-27 Youhealth Biotech, Limited METHOD AND COMPOSITIONS FOR TREATING GLAUCOMA
CN105274144A (zh) 2015-09-14 2016-01-27 徐又佳 通过CRISPR/Cas9技术得到敲除铁调素基因斑马鱼的制备方法
US10301613B2 (en) 2015-09-15 2019-05-28 Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University Targeted remodeling of prokaryotic genomes using CRISPR-nickases
CN105210981B (zh) 2015-09-15 2018-09-28 中国科学院生物物理研究所 建立可应用于人类疾病研究的雪貂模型的方法及其应用
CN105112422B (zh) 2015-09-16 2019-11-08 中山大学 基因miR408和UCL在培育高产水稻中的应用
WO2017049129A2 (en) 2015-09-18 2017-03-23 President And Fellows Of Harvard College Methods of making guide rna
CN105132427B (zh) 2015-09-21 2019-01-08 新疆畜牧科学院生物技术研究所 一种以RNA介导的特异性敲除双基因获得基因编辑绵羊的方法及其专用sgRNA
EP3353298B1 (en) 2015-09-21 2023-09-13 Arcturus Therapeutics, Inc. Allele selective gene editing and uses thereof
US20180237800A1 (en) 2015-09-21 2018-08-23 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for target nucleic acid modification
AU2016325613B2 (en) 2015-09-23 2020-06-25 Sangamo Therapeutics, Inc. Htt repressors and uses thereof
WO2017053762A1 (en) 2015-09-24 2017-03-30 Sigma-Aldrich Co. Llc Methods and reagents for molecular proximity detection using rna-guided nucleic acid binding proteins
WO2017064546A1 (en) 2015-09-24 2017-04-20 Crispr Therapeutics Ag Novel family of rna-programmable endonucleases and their uses in genome editing and other applications
EP3353296B1 (en) 2015-09-24 2020-11-04 Editas Medicine, Inc. Use of exonucleases to improve crispr/cas-mediated genome editing
KR101795999B1 (ko) 2015-09-25 2017-11-09 전남대학교산학협력단 Crispr/cas9 시스템을 이용한 베타2-마이크로글로불린 유전자 제거용 시발체
KR101745863B1 (ko) 2015-09-25 2017-06-12 전남대학교산학협력단 Crispr/cas9 시스템을 이용한 프로히비틴2 유전자 제거용 시발체
WO2017053713A1 (en) 2015-09-25 2017-03-30 Tarveda Therapeutics, Inc. Compositions and methods for genome editing
WO2017053729A1 (en) 2015-09-25 2017-03-30 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Nuclease-mediated genome editing of primary cells and enrichment thereof
EP3147363B1 (en) 2015-09-26 2019-10-16 B.R.A.I.N. Ag Activation of taste receptor genes in mammalian cells using crispr-cas-9
JP2018527943A (ja) 2015-09-28 2018-09-27 テンプル ユニバーシティー オブ ザ コモンウェルス システム オブ ハイヤー エデュケーション Ｒｎａ誘導性の、ｈｉｖ感染の処置のための、方法および組成物
CN105177038B (zh) 2015-09-29 2018-08-24 中国科学院遗传与发育生物学研究所 一种高效定点编辑植物基因组的CRISPR/Cas9系统
WO2017058795A1 (en) 2015-09-29 2017-04-06 Agenovir Corporation Compositions and methods for latent viral transcription regulation
US20170088587A1 (en) 2015-09-29 2017-03-30 Agenovir Corporation Antiviral fusion proteins and genes
AU2016332704A1 (en) 2015-09-29 2018-04-19 Agenovir Corporation Delivery methods and compositions
US20170088828A1 (en) 2015-09-29 2017-03-30 Agenovir Corporation Compositions and methods for treatment of latent viral infections
CN105331627B (zh) 2015-09-30 2019-04-02 华中农业大学 一种利用内源CRISPR-Cas系统进行原核生物基因组编辑的方法
WO2017059241A1 (en) 2015-10-02 2017-04-06 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Lentiviral protein delivery system for rna-guided genome editing
US11497816B2 (en) 2015-10-06 2022-11-15 The Children's Hospital Of Philadelphia Compositions and methods for treating fragile X syndrome and related syndromes
US10760081B2 (en) 2015-10-07 2020-09-01 New York University Compositions and methods for enhancing CRISPR activity by POLQ inhibition
US10959413B2 (en) 2015-10-08 2021-03-30 President And Fellows Of Harvard College Multiplexed genome editing
WO2017062886A1 (en) 2015-10-08 2017-04-13 Cellink Corporation Battery interconnects
AU2016334225B2 (en) 2015-10-09 2022-11-10 Monsanto Technology Llc Novel RNA-guided nucleases and uses thereof
WO2017062983A1 (en) 2015-10-09 2017-04-13 The Children's Hospital Of Philadelphia Compositions and methods for treating huntington's disease and related disorders
EP4144844A1 (en) 2015-10-12 2023-03-08 DuPont US Holding, LLC Protected dna templates for gene modification and increased homologous recombination in cells and methods of use
EP4089175A1 (en) 2015-10-13 2022-11-16 Duke University Genome engineering with type i crispr systems in eukaryotic cells
EP3362102A1 (en) 2015-10-14 2018-08-22 Life Technologies Corporation Ribonucleoprotein transfection agents
CN105400779A (zh) 2015-10-15 2016-03-16 芜湖医诺生物技术有限公司 嗜热链球菌CRISPR-Cas9系统识别的人CCR5基因的靶序列和sgRNA及其应用
JP2018531261A (ja) 2015-10-16 2018-10-25 テンプル ユニバーシティー オブ ザ コモンウェルス システム オブ ハイヤー エデュケーション Ｃｐｆ１を用いた、ｒｎａガイド遺伝子編集方法および組成物
CA3001518A1 (en) 2015-10-16 2017-04-20 Astrazeneca Ab Inducible modification of a cell genome
FR3042506B1 (fr) 2015-10-16 2018-11-30 IFP Energies Nouvelles Outil genetique de transformation de bacteries clostridium
EP3365269A4 (en) 2015-10-19 2019-06-19 The Methodist Hospital DISTRIBUTION, BY MEMBRANE DEFORMATION, FROM CRISPR-CAS9 TO DIFFICULT CELLS TO BE TRANSFERRED
CN105331607A (zh) 2015-10-19 2016-02-17 芜湖医诺生物技术有限公司 嗜热链球菌CRISPR-Cas9系统识别的人CCR5基因的靶序列和sgRNA及其应用
CN105316337A (zh) 2015-10-20 2016-02-10 芜湖医诺生物技术有限公司 嗜热链球菌CRISPR-Cas9系统识别的人CXCR4基因的靶序列和sgRNA及其应用
JP2018531024A (ja) 2015-10-20 2018-10-25 パイオニア ハイ−ブレッド インターナショナル， イン マーカーフリーゲノム改変のための方法および組成物
CN105316324A (zh) 2015-10-20 2016-02-10 芜湖医诺生物技术有限公司 嗜热链球菌CRISPR-Cas9系统识别的人CXCR4基因的靶序列和sgRNA及其应用
CN105331608A (zh) 2015-10-20 2016-02-17 芜湖医诺生物技术有限公司 脑膜炎双球菌CRISPR-Cas9系统识别的人CXCR4基因的靶序列和sgRNA及其应用
US10968253B2 (en) 2015-10-20 2021-04-06 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Methods and products for genetic engineering
CN105331609A (zh) 2015-10-20 2016-02-17 芜湖医诺生物技术有限公司 脑膜炎双球菌CRISPR-Cas9系统识别的人CCR5基因的靶序列和sgRNA及其应用
WO2017070284A1 (en) 2015-10-21 2017-04-27 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for treating hepatitis b virus
CN105219799A (zh) 2015-10-22 2016-01-06 天津吉诺沃生物科技有限公司 一种基于CRISPR/Cas系统的多年生黑麦草的育种方法
US20170211142A1 (en) 2015-10-22 2017-07-27 The Broad Institute, Inc. Novel crispr enzymes and systems
JP7109784B2 (ja) 2015-10-23 2022-08-01 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ 遺伝子編集のための進化したＣａｓ９蛋白質
ES2699848T3 (es) 2015-10-23 2019-02-13 Caribou Biosciences Inc Acido nucleico CRISPR clase 2 de tipo cruzado modificado que se dirige a ácidos nucleicos
EP3159407A1 (en) 2015-10-23 2017-04-26 Silence Therapeutics (London) Ltd Guide rnas, methods and uses
US9988637B2 (en) 2015-10-26 2018-06-05 National Tsing Hua Univeristy Cas9 plasmid, genome editing system and method of Escherichia coli
TW201715041A (zh) 2015-10-26 2017-05-01 國立清華大學 細菌基因編輯方法
US10280411B2 (en) 2015-10-27 2019-05-07 Pacific Biosciences of California, In.c Methods, systems, and reagents for direct RNA sequencing
EP3367788A4 (en) 2015-10-27 2019-07-31 Recombinetics, Inc. ENGINEERING OF HUMANIZED PLAQUETTES AND LYMPHOCYTES BY GENETIC COMPLEMENTATION
US20180230489A1 (en) 2015-10-28 2018-08-16 Voyager Therapeutics, Inc. Regulatable expression using adeno-associated virus (aav)
MX2018005272A (es) 2015-10-28 2018-09-18 Sangamo Therapeutics Inc Construcciones específicas del hígado, casetes de expresión del factor viii y métodos de uso de estos.
US11369692B2 (en) 2015-10-28 2022-06-28 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Materials and methods for treatment of Duchenne Muscular Dystrophy
WO2017074962A1 (en) 2015-10-30 2017-05-04 Brandeis University Modified cas9 compositions and methods of use
CA3001711A1 (en) 2015-10-30 2017-05-04 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for treating herpes simplex virus
CN105238806B (zh) 2015-11-02 2018-11-27 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种用于微生物的CRISPR/Cas9基因编辑载体的构建及其应用
CN105316327B (zh) 2015-11-03 2019-01-29 中国农业科学院作物科学研究所 小麦TaAGO4a基因CRISPR/Cas9载体及其应用
PT3371314T (pt) 2015-11-04 2023-08-31 Fate Therapeutics Inc Modificação genómica de células pluripotentes
AU2016349280B2 (en) 2015-11-04 2023-10-05 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods and compositions for gene editing in hematopoietic stem cells
WO2017079428A1 (en) 2015-11-04 2017-05-11 President And Fellows Of Harvard College Site specific germline modification
GB2544270A (en) 2015-11-05 2017-05-17 Fundació Centre De Regulació Genòmica Nucleic acids, peptides and methods
WO2017077135A1 (en) 2015-11-05 2017-05-11 Centro De Investigación Biomédica En Red Process of gene-editing of cells isolated from a subject suffering from a metabolic disease affecting the erythroid lineage, cells obtained by said process and uses thereof.
WO2017078751A1 (en) 2015-11-06 2017-05-11 The Methodist Hospital Micoluidic cell deomailiy assay for enabling rapid and efficient kinase screening via the crispr-cas9 system
CN108471731A (zh) 2015-11-06 2018-08-31 杰克逊实验室 大型基因组dna敲入及其用途
JP2018532419A (ja) 2015-11-09 2018-11-08 イフォム・フォンダツィオーネ・イスティトゥート・フィルチ・ディ・オンコロジア・モレコラーレ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ ｓｇＲＮＡライブラリー
EP3374494A4 (en) 2015-11-11 2019-05-01 Coda Biotherapeutics, Inc. CRISPR COMPOSITIONS AND METHODS OF USE FOR GENE THERAPY
EP3374501B1 (en) 2015-11-11 2023-07-12 Lonza Ltd Crispr-associated (cas) proteins with reduced immunogenicity
TW201737944A (zh) 2015-11-12 2017-11-01 輝瑞大藥廠 使用crispr-cas9之組織特異性基因組工程
KR101885901B1 (ko) 2015-11-13 2018-08-07 기초과학연구원 5' 말단의 인산기가 제거된 rna를 포함하는 리보핵산단백질 전달용 조성물
US11306308B2 (en) 2015-11-13 2022-04-19 Massachusetts Institute Of Technology High-throughput CRISPR-based library screening
US20170191047A1 (en) 2015-11-13 2017-07-06 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Adenosine-specific rnase and methods of use
MX2018006116A (es) 2015-11-16 2019-04-04 Res Institute At Nationwide Children´S Hospital Materiales y metodos para el tratamiento de miopatias basadas en titina y otras titinopatias.
CN106893739A (zh) 2015-11-17 2017-06-27 香港中文大学 用于靶向基因操作的新方法和系统
WO2017091630A1 (en) 2015-11-23 2017-06-01 The Regents Of The University Of California Tracking and manipulating cellular rna via nuclear delivery of crispr/cas9
CN105602987A (zh) 2015-11-23 2016-05-25 深圳市默赛尔生物医学科技发展有限公司 一种高效的dc细胞xbp1基因敲除方法
US20170145438A1 (en) 2015-11-24 2017-05-25 University Of South Carolina Viral Vectors for Gene Editing
JP6500293B2 (ja) 2015-11-25 2019-04-17 国立大学法人群馬大学 Ｄｎａメチル化編集用キットおよびｄｎａメチル化編集方法
US10240145B2 (en) 2015-11-25 2019-03-26 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University CRISPR/Cas-mediated genome editing to treat EGFR-mutant lung cancer
US20180346940A1 (en) 2015-11-27 2018-12-06 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for the production of hydrocarbons, hydrogen and carbon monoxide using engineered azotobacter strains
CN105505979A (zh) 2015-11-28 2016-04-20 湖北大学 一种以CRISPR/Cas9基因编辑技术打靶Badh2基因获得香稻品系的方法
WO2017095111A1 (ko) 2015-11-30 2017-06-08 기초과학연구원 F. novicida 유래 Cas9을 포함하는 유전체 교정용 조성물
CN106811479B (zh) 2015-11-30 2019-10-25 中国农业科学院作物科学研究所 利用CRISPR/Cas9系统定点修饰ALS基因获得抗除草剂水稻的系统及其应用
CN105296518A (zh) 2015-12-01 2016-02-03 中国农业大学 一种用于CRISPR/Cas9技术的同源臂载体构建方法
RU2634395C1 (ru) 2015-12-01 2017-10-26 Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Балтийский Федеральный Университет имени Иммануила Канта" (БФУ им. И. Канта) Генетическая конструкция на основе системы редактирования генома crispr/cas9, кодирующая нуклеазу cas9, специфически импортируемую в митохондрии клеток человека
EP3383409A4 (en) 2015-12-02 2019-10-02 The Regents of The University of California COMPOSITIONS AND METHODS FOR MODIFYING TARGET NUCLEIC ACID
EP3383168A4 (en) 2015-12-02 2019-05-08 Ceres, Inc. METHOD FOR THE GENETIC MODIFICATION OF PLANTS
WO2017093370A1 (en) 2015-12-03 2017-06-08 Technische Universität München T-cell specific genome editing
CN105779448B (zh) 2015-12-04 2018-11-27 新疆农业大学 一种棉花启动子GbU6-7PS及应用
CN105779449B (zh) 2015-12-04 2018-11-27 新疆农业大学 一种棉花启动子GbU6-5PS及应用
CN105462968B (zh) 2015-12-07 2018-10-16 北京信生元生物医学科技有限公司 一种靶向apoCⅢ的CRISPR-Cas9系统及其应用
CN106845151B (zh) 2015-12-07 2019-03-26 中国农业大学 CRISPR-Cas9系统sgRNA作用靶点的筛选方法及装置
WO2017100431A2 (en) 2015-12-09 2017-06-15 Excision Biotherapeutics, Inc. Gene editing methods and compositions for eliminating risk of jc virus activation and pml (progressive multifocal leukoencephalopathy) during immunosuppresive therapy
CN105463003A (zh) 2015-12-11 2016-04-06 扬州大学 一种消除卡那霉素耐药基因活性的重组载体及其构建方法
US20180362961A1 (en) 2015-12-11 2018-12-20 Danisco Us Inc. Methods and compositions for enhanced nuclease-mediated genome modification and reduced off-target site effects
CN105296537A (zh) 2015-12-12 2016-02-03 西南大学 一种基于睾丸内注射的基因定点编辑技术
CN105400773B (zh) 2015-12-14 2018-06-26 同济大学 应用于大规模筛选癌症基因的CRISPR/Cas9富集测序方法
WO2017105350A1 (en) 2015-12-14 2017-06-22 Cellresearch Corporation Pte Ltd A method of generating a mammalian stem cell carrying a transgene, a mammalian stem cell generated by the method and pharmaceuticals uses of the mammalian stem cell
NO343153B1 (en) 2015-12-17 2018-11-19 Hydra Systems As A method of assessing the integrity status of a barrier plug
WO2017106616A1 (en) 2015-12-17 2017-06-22 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Varicella zoster virus encoding regulatable cas9 nuclease
CN105463027A (zh) 2015-12-17 2016-04-06 中国农业大学 一种高肌肉量及肥厚型心肌病模型克隆猪的制备方法
CN117137947A (zh) 2015-12-18 2023-12-01 桑格摩生物治疗股份有限公司 Mhc细胞受体的靶向破坏
WO2017104404A1 (ja) 2015-12-18 2017-06-22 国立研究開発法人科学技術振興機構 遺伝子改変非ヒト生物、卵細胞、受精卵、及び標的遺伝子の改変方法
WO2017105991A1 (en) 2015-12-18 2017-06-22 Danisco Us Inc. Methods and compositions for t-rna based guide rna expression
CA3008010A1 (en) 2015-12-18 2017-06-22 Danisco Us Inc. Methods and compositions for polymerase ii (pol-ii) based guide rna expression
US11761007B2 (en) 2015-12-18 2023-09-19 The Scripps Research Institute Production of unnatural nucleotides using a CRISPR/Cas9 system
WO2017106657A1 (en) 2015-12-18 2017-06-22 The Broad Institute Inc. Novel crispr enzymes and systems
WO2017106528A2 (en) 2015-12-18 2017-06-22 Sangamo Biosciences, Inc. Targeted disruption of the t cell receptor
US11118194B2 (en) 2015-12-18 2021-09-14 The Regents Of The University Of California Modified site-directed modifying polypeptides and methods of use thereof
WO2017112620A1 (en) 2015-12-22 2017-06-29 North Carolina State University Methods and compositions for delivery of crispr based antimicrobials
JP6949845B2 (ja) 2015-12-22 2021-10-13 キュアバック アーゲー Ｒｎａ分子組成物の作製方法
WO2017109757A1 (en) 2015-12-23 2017-06-29 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for treatment of amyotrophic lateral sclerosis and/or frontal temporal lobular degeneration
CN105543270A (zh) 2015-12-24 2016-05-04 中国农业科学院作物科学研究所 双抗性CRISPR/Cas9载体及应用
CN105543266A (zh) 2015-12-25 2016-05-04 安徽大学 一种维吉尼亚链霉菌IBL14中的CRISPR-Cas系统及应用其进行基因编辑的方法
CN105505976A (zh) 2015-12-25 2016-04-20 安徽大学 一种维吉尼亚链霉菌ibl14产青霉素重组菌株的构建方法
CA3009727A1 (en) 2015-12-28 2017-07-06 Novartis Ag Compositions and methods for the treatment of hemoglobinopathies
CN118374475A (zh) 2015-12-29 2024-07-23 孟山都技术公司 新型crispr相关转座酶及其用途
CN105441451B (zh) 2015-12-31 2019-03-22 暨南大学 一种特异靶向人ABCB1基因的sgRNA导向序列及应用
CN105567735A (zh) 2016-01-05 2016-05-11 华东师范大学 一种凝血因子基因突变的定点修复载体系统及方法
EP3400296A1 (en) 2016-01-08 2018-11-14 Novozymes A/S Genome editing in bacillus host cells
US11441146B2 (en) 2016-01-11 2022-09-13 Christiana Care Health Services, Inc. Compositions and methods for improving homogeneity of DNA generated using a CRISPR/Cas9 cleavage system
CN105647922A (zh) 2016-01-11 2016-06-08 中国人民解放军疾病预防控制所 基于一种新gRNA序列的CRISPR-Cas9系统在制备乙肝治疗药物中的应用
US11427837B2 (en) 2016-01-12 2022-08-30 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for enhanced genome editing
SG11201806002SA (en) 2016-01-14 2018-08-30 Memphis Meats Inc Methods for extending the replicative capacity of somatic cells during an ex vivo cultivation process
CA3011458A1 (en) 2016-01-14 2017-07-20 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Genome editing for treating glioblastoma
EP3402327A1 (en) 2016-01-15 2018-11-21 The Jackson Laboratory Genetically modified non-human mammals by multi-cycle electroporation of cas9 protein
CN105567734A (zh) 2016-01-18 2016-05-11 丹弥优生物技术（湖北）有限公司 一种基因组dna序列精准编辑方法
CN105567738A (zh) 2016-01-18 2016-05-11 南开大学 使用基因组编辑技术CRISPR-Cas9诱导CCR5Δ32缺失的方法
WO2017126987A1 (ru) 2016-01-18 2017-07-27 Анатолий Викторович ЗАЗУЛЯ Эритроциты для направленного транспорта лекарственного средства
WO2017127807A1 (en) 2016-01-22 2017-07-27 The Broad Institute Inc. Crystal structure of crispr cpf1
JP2019506156A (ja) 2016-01-25 2019-03-07 エクシジョン バイオセラピューティクス インコーポレイテッド Ｈｉｖ感染症のｒｎａ誘導型治療のための方法及び組成物
CA3011270A1 (en) 2016-01-25 2018-06-14 Temple University Of The Commonwealth System Of Higher Education Rna guided eradication of human jc virus and other polyomaviruses
CN105543228A (zh) 2016-01-25 2016-05-04 宁夏农林科学院 一种快速将水稻转化为香稻的方法
CN105567689B (zh) 2016-01-25 2019-04-09 重庆威斯腾生物医药科技有限责任公司 CRISPR/Cas9靶向敲除人TCAB1基因及其特异性gRNA
EP3199632A1 (en) 2016-01-26 2017-08-02 ACIB GmbH Temperature-inducible crispr/cas system
CN105567688A (zh) 2016-01-27 2016-05-11 武汉大学 一种可用于艾滋病基因治疗的CRISPR/SaCas9系统
CN108884154A (zh) 2016-01-29 2018-11-23 普林斯顿大学理事会 具有独特剪接活性的断裂内含肽
CA3013179A1 (en) 2016-01-30 2017-08-03 Bonac Corporation Artificial single guide rna and use thereof
CN105647968B (zh) 2016-02-02 2019-07-23 浙江大学 一种CRISPR/Cas9工作效率快速测试系统及其应用
CN107022562B (zh) 2016-02-02 2020-07-17 中国种子集团有限公司 利用CRISPR/Cas9系统对玉米基因定点突变的方法
CN105671083B (zh) 2016-02-03 2017-09-29 安徽柯顿生物科技有限公司 PD‑1基因重组病毒质粒及构建、重组逆转录病毒Lenti‑PD‑1‑Puro及包装与应用
WO2017136794A1 (en) 2016-02-03 2017-08-10 Massachusetts Institute Of Technology Structure-guided chemical modification of guide rna and its applications
US11208652B2 (en) 2016-02-04 2021-12-28 President And Fellows Of Harvard College Mitochondrial genome editing and regulation
US20190038780A1 (en) 2016-02-05 2019-02-07 Regents Of The University Of Minnesota Vectors and system for modulating gene expression
WO2017139264A1 (en) 2016-02-09 2017-08-17 President And Fellows Of Harvard College Dna-guided gene editing and regulation
RU2016104674A (ru) 2016-02-11 2017-08-16 Анатолий Викторович Зазуля Устройство модификации эритроцита с механизмом направленного транспорта лекарственного средства для функций генной терапии crispr/cas9
CA3048963A1 (en) 2016-02-11 2017-08-17 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for modifying a mutant dystrophin gene in a cell's genome
EP3417062B1 (en) 2016-02-15 2024-06-26 Temple University - Of The Commonwealth System of Higher Education Excision of retroviral nucleic acid sequences
US9896696B2 (en) 2016-02-15 2018-02-20 Benson Hill Biosystems, Inc. Compositions and methods for modifying genomes
CN105647962A (zh) 2016-02-15 2016-06-08 浙江大学 运用CRISPR-Cas9系统敲除水稻MIRNA393b茎环序列的基因编辑方法
CN105594664B (zh) 2016-02-16 2018-10-02 湖南师范大学 一种基因敲除选育stat1a基因缺失型斑马鱼的方法
CA3014792A1 (en) 2016-02-16 2017-08-24 Carnegie Mellon University Compositions for enhancing targeted gene editing and methods of use thereof
CN105647969B (zh) 2016-02-16 2020-12-15 湖南师范大学 一种基因敲除选育stat1a基因缺失型斑马鱼的方法
CN105624187A (zh) 2016-02-17 2016-06-01 天津大学 酿酒酵母基因组定点突变的方法
CN109072243A (zh) 2016-02-18 2018-12-21 哈佛学院董事及会员团体 通过crispr-cas系统进行的分子记录的方法和系统
CN105646719B (zh) 2016-02-24 2019-12-20 无锡市妇幼保健院 一种高效定点转基因的工具及其应用
US20170247703A1 (en) 2016-02-25 2017-08-31 Agenovir Corporation Antiviral nuclease methods
CA3015353A1 (en) 2016-02-25 2017-08-31 Agenovir Corporation Viral and oncoviral nuclease treatment
US11530253B2 (en) 2016-02-25 2022-12-20 The Children's Medical Center Corporation Customized class switch of immunoglobulin genes in lymphoma and hybridoma by CRISPR/CAS9 technology
US20170246260A1 (en) 2016-02-25 2017-08-31 Agenovir Corporation Modified antiviral nuclease
CA3015665C (en) 2016-02-26 2020-09-22 Lanzatech New Zealand Limited Crispr/cas systems for c1-fixing bacteria
US10538750B2 (en) 2016-02-29 2020-01-21 Agilent Technologies, Inc. Methods and compositions for blocking off-target nucleic acids from cleavage by CRISPR proteins
CN105671070B (zh) 2016-03-03 2019-03-19 江南大学 一种用于枯草芽孢杆菌基因组编辑的CRISPRCas9系统及其构建方法
KR102587132B1 (ko) 2016-03-04 2023-10-11 에디타스 메디신, 인코포레이티드 암 면역요법을 위한 crispr-cpf1-관련 방법, 조성물 및 구성성분
CN107177591A (zh) 2016-03-09 2017-09-19 北京大学 利用CRISPR技术编辑CCR5基因的sgRNA序列及其用途
CN105821039B (zh) 2016-03-09 2020-02-07 李旭 联合免疫基因抑制HBV复制的特异性sgRNA、表达载体及其应用
CN105821040B (zh) 2016-03-09 2018-12-14 李旭 联合免疫基因抑制高危型HPV表达的sgRNA、基因敲除载体及其应用
CN105861547A (zh) 2016-03-10 2016-08-17 黄捷 身份证号码永久嵌入基因组的方法
US20190100762A1 (en) 2016-03-11 2019-04-04 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Novel cas9 systems and methods of use
US20200255857A1 (en) 2016-03-14 2020-08-13 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for treating beta hemoglobinopathies
WO2017160752A1 (en) 2016-03-14 2017-09-21 Intellia Therapeutics, Inc. Methods and compositions for gene editing
EP3430332B1 (en) 2016-03-15 2020-01-01 Carrier Corporation Refrigerated sales cabinet
US11530394B2 (en) 2016-03-15 2022-12-20 University Of Massachusetts Anti-CRISPR compounds and methods of use
EP3219799A1 (en) 2016-03-17 2017-09-20 IMBA-Institut für Molekulare Biotechnologie GmbH Conditional crispr sgrna expression
WO2017161068A1 (en) 2016-03-18 2017-09-21 President And Fellows Of Harvard College Mutant cas proteins
US11597924B2 (en) 2016-03-25 2023-03-07 Editas Medicine, Inc. Genome editing systems comprising repair-modulating enzyme molecules and methods of their use
US11512311B2 (en) 2016-03-25 2022-11-29 Editas Medicine, Inc. Systems and methods for treating alpha 1-antitrypsin (A1AT) deficiency
WO2017172645A2 (en) 2016-03-28 2017-10-05 The Charles Stark Draper Laboratory, Inc. Bacteriophage engineering methods
CN106047803A (zh) 2016-03-28 2016-10-26 青岛市胶州中心医院 CRISPR/Cas9靶向敲除兔BMP2基因的细胞模型及其应用
WO2017173004A1 (en) 2016-03-30 2017-10-05 Mikuni Takayasu A method for in vivo precise genome editing
KR102617874B1 (ko) 2016-03-30 2023-12-22 인텔리아 테라퓨틱스, 인크. Crispr/cas 성분을 위한 지질 나노입자 제제
GB2565461B (en) 2016-03-31 2022-04-13 Harvard College Methods and compositions for the single tube preparation of sequencing libraries using Cas9
WO2017173092A1 (en) 2016-03-31 2017-10-05 The Regents Of The University Of California Methods for genome editing in zygotes
CN106167525B (zh) 2016-04-01 2019-03-19 北京康明百奥新药研发有限公司 筛选超低岩藻糖细胞系的方法和应用
US10301619B2 (en) 2016-04-01 2019-05-28 New England Biolabs, Inc. Compositions and methods relating to synthetic RNA polynucleotides created from synthetic DNA oligonucleotides
CN118185874A (zh) 2016-04-04 2024-06-14 苏黎世联邦理工学院 一种重组哺乳动物b细胞
WO2017176529A1 (en) 2016-04-06 2017-10-12 Temple Univesity-Of The Commonwealth System Of Higher Education Compositions for eradicating flavivirus infections in subjects
CN105802980A (zh) 2016-04-08 2016-07-27 北京大学 Gateway兼容性CRISPR/Cas9系统及其应用
CN106399306B (zh) 2016-04-12 2019-11-05 西安交通大学第一附属医院 靶向人lncRNA-UCA1抑制膀胱癌的sgRNA、基因载体及其应用
EP3443086B1 (en) 2016-04-13 2021-11-24 Editas Medicine, Inc. Cas9 fusion molecules, gene editing systems, and methods of use thereof
EP3443081A4 (en) 2016-04-13 2019-10-30 Duke University CRISPR / CAS9-BASED REPRESSORS FOR IN VIVO SHUT-OFF OF GEN-TARGETS AND METHOD OF USE
EP3443088B1 (en) 2016-04-13 2024-09-18 Editas Medicine, Inc. Grna fusion molecules, gene editing systems, and methods of use thereof
CA3020181A1 (en) 2016-04-14 2017-10-19 Boco Silicon Valley, Inc. Genome editing of human neural stem cells using nucleases
US20190167814A1 (en) 2016-04-14 2019-06-06 Université de Lausanne Treatment And/Or Prevention Of DNA-Triplet Repeat Diseases Or Disorders
CN105821116A (zh) 2016-04-15 2016-08-03 扬州大学 一种绵羊mstn基因定向敲除及其影响成肌分化的检测方法
WO2017181107A2 (en) 2016-04-16 2017-10-19 Ohio State Innovation Foundation Modified cpf1 mrna, modified guide rna, and uses thereof
WO2017184334A1 (en) 2016-04-18 2017-10-26 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Generation of genetically engineered animals by crispr/cas9 genome editing in spermatogonial stem cells
US20190119678A1 (en) 2016-04-18 2019-04-25 Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg Means and methods for inactivating therapeutic dna in a cell
US11286478B2 (en) 2016-04-19 2022-03-29 The Broad Institute, Inc. Cpf1 complexes with reduced indel activity
US20210155911A1 (en) 2016-04-19 2021-05-27 The Broad Institute, Inc. Novel crispr enzymes and systems
CN106086062A (zh) 2016-04-19 2016-11-09 上海市农业科学院 一种获得番茄基因组定点敲除突变体的方法
AU2017257274B2 (en) 2016-04-19 2023-07-13 Massachusetts Institute Of Technology Novel CRISPR enzymes and systems
CN105886616B (zh) 2016-04-20 2020-08-07 广东省农业科学院农业生物基因研究中心 一种用于猪基因编辑的高效特异性sgRNA识别位点引导序列及其筛选方法
CN107304435A (zh) 2016-04-22 2017-10-31 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 一种Cas9/RNA系统及其应用
CN105821075B (zh) 2016-04-22 2017-09-12 湖南农业大学 一种茶树咖啡因合成酶CRISPR/Cas9基因组编辑载体的构建方法
WO2017189336A1 (en) 2016-04-25 2017-11-02 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for genomic editing
CN105861552B (zh) 2016-04-25 2019-10-11 西北农林科技大学 一种T7 RNA聚合酶介导的CRISPR/Cas9基因编辑系统的构建方法
CN107326046A (zh) 2016-04-28 2017-11-07 上海邦耀生物科技有限公司 一种提高外源基因同源重组效率的方法
EP4166660A1 (en) 2016-04-29 2023-04-19 BASF Plant Science Company GmbH Improved methods for modification of target nucleic acids using fused guide rna - donor molecules
CN105821049B (zh) 2016-04-29 2019-06-04 中国农业大学 一种Fbxo40基因敲除猪的制备方法
CN105886534A (zh) 2016-04-29 2016-08-24 苏州溯源精微生物科技有限公司 一种抑制肿瘤转移的方法
GB201819504D0 (en) 2016-05-01 2019-01-16 Neemo Inc Harnessing heterologous and endogenous crispr-cas machineries for efficient markerless genome editing in clostridium
US10751423B2 (en) 2016-05-02 2020-08-25 Massachusetts Institute Of Technology Nanoparticle conjugates of highly potent toxins and intraperitoneal administration of nanoparticles for treating or imaging cancer
WO2017191210A1 (en) 2016-05-04 2017-11-09 Novozymes A/S Genome editing by crispr-cas9 in filamentous fungal host cells
EP3452101A2 (en) 2016-05-04 2019-03-13 CureVac AG Rna encoding a therapeutic protein
CN105950639A (zh) 2016-05-04 2016-09-21 广州美格生物科技有限公司 金黄色葡萄球菌CRISPR/Cas9系统的制备及其在构建小鼠模型中的应用
CN105907785B (zh) 2016-05-05 2020-02-07 苏州吉玛基因股份有限公司 化学合成的crRNA用于CRISPR/Cpf1系统在基因编辑中的应用
ES2957660T3 (es) 2016-05-05 2024-01-23 Univ Duke Composiciones relacionadas con crispr/cas para tratar la distrofia muscular de duchenne
CN106244591A (zh) 2016-08-23 2016-12-21 苏州吉玛基因股份有限公司 修饰crRNA在CRISPR/Cpf1基因编辑系统中的应用
US20190093092A1 (en) 2016-05-05 2019-03-28 Temple University - Of The Commonwealth System Of Higher Education Rna guided eradication of varicella zoster virus
WO2017190664A1 (zh) 2016-05-05 2017-11-09 苏州吉玛基因股份有限公司 化学合成的crRNA和修饰crRNA在CRISPR/Cpf1基因编辑系统中的应用
CA3022319A1 (en) 2016-05-06 2017-11-09 Tod M. Woolf Improved methods for genome editing with and without programmable nucleases
CN105985985B (zh) 2016-05-06 2019-12-31 苏州大学 Crispr技术编辑并用igf优化的异体间充质干细胞的制备方法及在治疗心梗中应用
US20190161743A1 (en) 2016-05-09 2019-05-30 President And Fellows Of Harvard College Self-Targeting Guide RNAs in CRISPR System
CN105861554B (zh) 2016-05-10 2020-01-31 华南农业大学 一种基于对Rbmy基因进行编辑来实现动物性别控制的方法和应用
US20190225956A1 (en) 2016-05-10 2019-07-25 United States Government As Represented By The Department Of Veterans Affairs Lentiviral delivery of crispr/cas constructs that cleave genes essential for hiv-1 infection and replication
CN107365786A (zh) 2016-05-12 2017-11-21 中国科学院微生物研究所 一种将spacer序列克隆至CRISPR-Cas9系统中的方法及其应用
WO2017197238A1 (en) 2016-05-12 2017-11-16 President And Fellows Of Harvard College Aav split cas9 genome editing and transcriptional regulation
CN109152342A (zh) 2016-05-12 2019-01-04 布赖恩.P.汉利 Crispr和其他基因疗法安全递送到人类和动物中的大部分体细胞
CN105907758B (zh) 2016-05-18 2020-06-05 世翱（上海）生物医药科技有限公司 CRISPR-Cas9引导序列及其引物、转基因表达载体及其构建方法
CN106011171B (zh) 2016-05-18 2019-10-11 西北农林科技大学 一种利用CRISPR/Cas9技术基于SSA修复的基因无缝编辑方法
CN105838733A (zh) 2016-05-18 2016-08-10 云南省农业科学院花卉研究所 Cas9 介导的香石竹基因编辑载体和应用
MX2018014172A (es) 2016-05-20 2019-08-22 Regeneron Pharma Métodos para romper la tolerancia inmunológica usando múltiples arn guías.
CN106446600B (zh) 2016-05-20 2019-10-18 同济大学 一种基于CRISPR/Cas9的sgRNA的设计方法
WO2017205423A1 (en) 2016-05-23 2017-11-30 Washington University Pulmonary targeted cas9/crispr for in vivo editing of disease genes
US20190300867A1 (en) 2016-05-23 2019-10-03 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Bypassing the pam requirement of the crispr-cas system
CN105950560B (zh) 2016-05-24 2019-07-23 苏州系统医学研究所 人源化pd-l1肿瘤细胞系及具有该细胞系的动物模型与应用
CN106011167B (zh) 2016-05-27 2019-11-01 上海交通大学 雄性不育基因OsDPW2的应用及水稻育性恢复的方法
BR112018074494A2 (pt) 2016-06-01 2019-03-19 Kws Saat Se & Co Kgaa sequências de ácidos nucleicos híbridas para engenharia genômica
GB2578802B8 (en) 2016-06-02 2020-11-04 Sigma Aldrich Co Llc Programmable DNA binding proteins that increase efficiency and/or specificity of genome targeting in eukaryotic cells for use in therapy
US20190100732A1 (en) 2016-06-02 2019-04-04 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. Assay for the removal of methyl-cytosine residues from dna
RU2018144877A (ru) 2016-06-03 2020-07-09 Темпл Юниверсити - Оф Де Коммонвелт Систем Оф Хаер Эдьюкейшн Регуляция HIV-1 по механизму отрицательной обратной связи с помощью стратегии редактирования генов
US11140883B2 (en) 2016-06-03 2021-10-12 Auburn University Gene editing of reproductive hormones to sterilize aquatic animals
WO2017213898A2 (en) 2016-06-07 2017-12-14 Temple University - Of The Commonwealth System Of Higher Education Rna guided compositions for preventing and treating hepatitis b virus infections
CN106119275A (zh) 2016-06-07 2016-11-16 湖北大学 基于CRISPR/Cas9技术将非糯性水稻株系改造成糯性株系的打靶载体和方法
US10767175B2 (en) 2016-06-08 2020-09-08 Agilent Technologies, Inc. High specificity genome editing using chemically modified guide RNAs
WO2017222834A1 (en) 2016-06-10 2017-12-28 City Of Hope Compositions and methods for mitochondrial genome editing
CN106086008B (zh) 2016-06-10 2019-03-12 中国农业科学院植物保护研究所 烟粉虱MED隐种TRP基因的CRISPR/cas9系统及其应用
MX2018014993A (es) 2016-06-14 2019-09-06 Pioneer Hi Bred Int Uso de endonucleasa cpf1 para modificaciones de genoma de planta.
CN106434752A (zh) 2016-06-14 2017-02-22 南通大学附属医院 敲除Wnt3a基因的过程及其验证方法
CN106167821A (zh) 2016-06-16 2016-11-30 郑州大学 一种金黄色葡萄球菌crispr位点检测试剂盒及检测方法
CN106167808A (zh) 2016-06-16 2016-11-30 郑州大学 一种基于CRISPR/Cas9技术消除mecA质粒的方法
CN105950633B (zh) 2016-06-16 2019-05-03 复旦大学 基因OsARF4在控制水稻粒长和千粒重中的应用
WO2017219027A1 (en) 2016-06-17 2017-12-21 The Broad Institute Inc. Type vi crispr orthologs and systems
CN105950626B (zh) 2016-06-17 2018-09-28 新疆畜牧科学院生物技术研究所 基于CRISPR/Cas9获得不同毛色绵羊的方法及靶向ASIP基因的sgRNA
US20190323038A1 (en) 2016-06-17 2019-10-24 Montana State Univesity Bidirectional targeting for genome editing
EP3472321A2 (en) 2016-06-17 2019-04-24 Genesis Technologies Limited Crispr-cas system, materials and methods
WO2017223107A1 (en) 2016-06-20 2017-12-28 Unity Biotechnology, Inc. Genome modifying enzyme therapy for diseases modulated by senescent cells
JP7160465B2 (ja) 2016-06-20 2022-10-25 キージーン ナムローゼ フェンノートシャップ 植物細胞における標的化ｄｎａ変更のための方法
US20170362635A1 (en) 2016-06-20 2017-12-21 University Of Washington Muscle-specific crispr/cas9 editing of genes
WO2017222773A1 (en) 2016-06-20 2017-12-28 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Novel cas systems and methods of use
CN106148370A (zh) 2016-06-21 2016-11-23 苏州瑞奇生物医药科技有限公司 肥胖症大鼠动物模型和构建方法
JP2019522481A (ja) 2016-06-22 2019-08-15 アイカーン スクール オブ メディシン アット マウント サイナイ 自己切断リボザイムを利用したｒｎａのウイルス送達およびそのｃｒｉｓｐｒベースの適用
CN109477103A (zh) 2016-06-22 2019-03-15 ProQR治疗上市公司Ⅱ 单链rna-编辑寡核苷酸
CN106047877B (zh) 2016-06-24 2019-01-11 中山大学附属第一医院 一种靶向敲除FTO基因的sgRNA及CRISPR/Cas9慢病毒系统与应用
CN105925608A (zh) 2016-06-24 2016-09-07 广西壮族自治区水牛研究所 一种利用CRISPR-Cas9靶向敲除ALK6基因的方法
CN106119283A (zh) 2016-06-24 2016-11-16 广西壮族自治区水牛研究所 一种利用CRISPR‑Cas9靶向敲除MSTN基因的方法
CN106148286B (zh) 2016-06-29 2019-10-29 牛刚 一种用于检测热原的细胞模型的构建方法和细胞模型及热原检测试剂盒
WO2018005873A1 (en) 2016-06-29 2018-01-04 The Broad Institute Inc. Crispr-cas systems having destabilization domain
WO2018002719A1 (en) 2016-06-29 2018-01-04 Crispr Therapeutics Ag Compositions and methods for gene editing
WO2018005691A1 (en) 2016-06-29 2018-01-04 The Regents Of The University Of California Efficient genetic screening method
US10927383B2 (en) 2016-06-30 2021-02-23 Ethris Gmbh Cas9 mRNAs
US10892034B2 (en) 2016-07-01 2021-01-12 Microsoft Technology Licensing, Llc Use of homology direct repair to record timing of a molecular event
WO2018005117A1 (en) 2016-07-01 2018-01-04 Microsoft Technology Licensing, Llc Storage through iterative dna editing
US20180004537A1 (en) 2016-07-01 2018-01-04 Microsoft Technology Licensing, Llc Molecular State Machines
CA3029874A1 (en) 2016-07-05 2018-01-11 The Johns Hopkins University Crispr/cas9-based compositions and methods for treating retinal degenerations
WO2018009520A1 (en) 2016-07-06 2018-01-11 Novozymes A/S Improving a microorganism by crispr-inhibition
CN106191057B (zh) 2016-07-06 2018-12-25 中山大学 一种用于敲除人CYP2E1基因的sgRNA序列、CYP2E1基因缺失细胞株的构建方法及其应用
CN106051058A (zh) 2016-07-07 2016-10-26 上海格昆机电科技有限公司 用于航天贮箱和粒子治疗仪的旋转机架及其传动机构
WO2018009822A1 (en) 2016-07-08 2018-01-11 Ohio State Innovation Foundation Modified nucleic acids, hybrid guide rnas, and uses thereof
CN107586777A (zh) 2016-07-08 2018-01-16 上海吉倍生物技术有限公司 人PDCD1基因sgRNA的用途及其相关药物
CN106047930B (zh) 2016-07-12 2020-05-19 北京百奥赛图基因生物技术有限公司 一种PS1基因条件性敲除flox大鼠的制备方法
BR112019000430A2 (pt) 2016-07-13 2019-07-09 Dsm Ip Assets Bv sistema crispr-cas para uma célula hospedeira de algas
WO2018013990A1 (en) 2016-07-15 2018-01-18 Zymergen Inc. Scarless dna assembly and genome editing using crispr/cpf1 and dna ligase
CN106191061B (zh) 2016-07-18 2019-06-18 暨南大学 一种特异靶向人ABCG2基因的sgRNA导向序列及其应用
CN106190903B (zh) 2016-07-18 2019-04-02 华中农业大学 鸭疫里氏杆菌Cas9基因缺失突变株及其应用
CN106191062B (zh) 2016-07-18 2019-06-14 广东华南疫苗股份有限公司 一种tcr-/pd-1-双阴性t细胞及其构建方法
CN106434651B (zh) 2016-07-19 2021-05-18 广西大学 根癌农杆菌和CRISPR-Cas9介导的基因定点插入失活方法及其应用
EP3487523B1 (en) 2016-07-19 2023-09-06 Duke University Therapeutic applications of cpf1-based genome editing
EP3487992A4 (en) 2016-07-21 2020-03-18 Maxcyte, Inc. METHODS AND COMPOSITIONS FOR MODIFYING GENOMIC DNA
CN106191107B (zh) 2016-07-22 2020-03-20 湖南农业大学 一种降低水稻籽粒落粒性的分子改良方法
WO2018015444A1 (en) 2016-07-22 2018-01-25 Novozymes A/S Crispr-cas9 genome editing with multiple guide rnas in filamentous fungi
CN106191064B (zh) 2016-07-22 2019-06-07 中国农业大学 一种制备mc4r基因敲除猪的方法
US20190270980A1 (en) 2016-07-25 2019-09-05 Mayo Foundation For Medical Education And Research Treating cancer
AU2017302551B2 (en) 2016-07-26 2023-04-27 The General Hospital Corporation Variants of CRISPR from Prevotella and Francisella 1 (Cpf1)
CN106222193B (zh) 2016-07-26 2019-09-20 浙江大学 一种重组载体及无转基因基因编辑植株的筛选方法
WO2018018979A1 (zh) 2016-07-26 2018-02-01 浙江大学 植物重组载体及无转基因成分的基因编辑植株的筛选方法
CN106191099A (zh) 2016-07-27 2016-12-07 苏州泓迅生物科技有限公司 一种基于CRISPR‑Cas9系统的酿酒酵母基因组并行多重编辑载体及其应用
CN106086061A (zh) 2016-07-27 2016-11-09 苏州泓迅生物科技有限公司 一种基于CRISPR‑Cas9系统的酿酒酵母基因组编辑载体及其应用
CN106191124B (zh) 2016-07-29 2019-10-11 中国科学院重庆绿色智能技术研究院 一种利用鱼卵保存液提高CRISPR-Cas9基因编辑和传代效率的鱼类育种方法
CN106434748A (zh) 2016-07-29 2017-02-22 中国科学院重庆绿色智能技术研究院 一种热激诱导型 Cas9 酶转基因斑马鱼的研制及应用
GB201613135D0 (en) 2016-07-29 2016-09-14 Medical Res Council Genome editing
CN106191114B (zh) 2016-07-29 2020-02-11 中国科学院重庆绿色智能技术研究院 利用CRISPR-Cas9系统敲除鱼类MC4R基因的育种方法
CN106191113B (zh) 2016-07-29 2020-01-14 中国农业大学 一种mc3r基因敲除猪的制备方法
CN106434688A (zh) 2016-08-01 2017-02-22 云南纳博生物科技有限公司 一种水稻直立密穗dep1基因人工定点突变体及其应用
EP3491134B1 (en) 2016-08-01 2023-10-11 University of Pittsburgh - of The Commonwealth System of Higher Education Human induced pluripotent stem cells for high efficiency genetic engineering
CN106011150A (zh) 2016-08-01 2016-10-12 云南纳博生物科技有限公司 一种水稻穗粒数Gn1a基因人工定点突变体及其应用
WO2018025206A1 (en) 2016-08-02 2018-02-08 Kyoto University Method for genome editing
AU2017305404B2 (en) 2016-08-02 2023-11-30 Editas Medicine, Inc. Compositions and methods for treating CEP290 associated disease
IL264565B2 (en) 2016-08-03 2024-07-01 Harvard College Adenosine nuclear base editors and their uses
CN106282241A (zh) 2016-08-05 2017-01-04 无锡市第二人民医院 通过CRISPR/Cas9得到敲除bmp2a基因的斑马鱼的方法
EP3497214B1 (en) 2016-08-09 2023-06-28 President and Fellows of Harvard College Programmable cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof
KR101710026B1 (ko) 2016-08-10 2017-02-27 주식회사 무진메디 Cas9 단백질 및 가이드 RNA의 혼성체를 함유하는 나노 리포좀 전달체 조성물
CN106222203A (zh) 2016-08-10 2016-12-14 云南纳博生物科技有限公司 利用CRISPR/Cas技术获得家蚕丝素重链基因突变体及突变方法和应用
CN106172238B (zh) 2016-08-12 2019-01-22 中南大学 miR-124基因敲除小鼠动物模型的构建方法和应用
CN106222177B (zh) 2016-08-13 2018-06-26 江苏集萃药康生物科技有限公司 一种靶向人STAT6的CRISPR-Cas9系统及其用于治疗过敏性疾病的应用
US11810649B2 (en) 2016-08-17 2023-11-07 The Broad Institute, Inc. Methods for identifying novel gene editing elements
US20210000091A1 (en) 2016-08-17 2021-01-07 The Regents Of The University Of California Split Trans-Complementing Gene-Drive System for Suppressing Aedes Aegypti Mosquitos
US20210166783A1 (en) 2016-08-17 2021-06-03 The Broad Institute, Inc. Methods for identifying class 2 crispr-cas systems
CA3034089A1 (en) 2016-08-18 2018-02-22 The Regents Of The University Of California Crispr-cas genome engineering via a modular aav delivery system
WO2018035423A1 (en) 2016-08-19 2018-02-22 Bluebird Bio, Inc. Genome editing enhancers
EP3500677A4 (en) 2016-08-20 2020-04-01 Avellino Lab USA, Inc. UNIQUE GUIDE RNA, CRISPR / CAS9 SYSTEMS AND METHODS OF USE
CN106191116B (zh) 2016-08-22 2019-10-08 西北农林科技大学 基于CRISPR/Cas9的外源基因敲入整合系统及其建立方法和应用
CN106191071B (zh) 2016-08-22 2018-09-04 广州资生生物科技有限公司 一种CRISPR-Cas9系统及其用于治疗乳腺癌疾病的应用
CN106086028B (zh) 2016-08-23 2019-04-23 中国农业科学院作物科学研究所 一种通过基因组编辑提高水稻抗性淀粉含量的方法及其专用sgRNA
CN106244555A (zh) 2016-08-23 2016-12-21 广州医科大学附属第三医院 一种提高基因打靶的效率的方法及β‑球蛋白基因位点的碱基原位修复方法
EP3964573A1 (en) 2016-08-24 2022-03-09 Sangamo Therapeutics, Inc. Engineered target specific nucleases
CN106244609A (zh) 2016-08-24 2016-12-21 浙江理工大学 一种调节pi3k‑akt信号通路的非编码基因的筛选系统及筛选方法
HRP20212025T1 (hr) 2016-08-24 2022-04-01 Sangamo Therapeutics, Inc. Regulacija ekspresije gena pomoću projektiranih nukleaza
WO2018039438A1 (en) 2016-08-24 2018-03-01 President And Fellows Of Harvard College Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing
CN106109417A (zh) 2016-08-24 2016-11-16 李因传 一种肝细胞膜仿生脂质体药物载体、制作方法及其应用
KR101856345B1 (ko) 2016-08-24 2018-06-20 경상대학교산학협력단 CRISPR/Cas9 시스템을 이용하여 APOBEC3H 및 APOBEC3CH 이중-넉아웃 고양이를 제조하는 방법
CN106544357B (zh) 2016-08-25 2018-08-21 湖南杂交水稻研究中心 一种培育镉低积累籼稻品种的方法
CN106350540A (zh) 2016-08-26 2017-01-25 苏州系统医学研究所 一种由慢病毒介导的高效可诱导型CRISPR/Cas9基因敲除载体及其应用
CN106318973B (zh) 2016-08-26 2019-09-13 深圳市第二人民医院 一种基于CRISPR-Cas9的基因调控装置及基因调控方法
CN107784200B (zh) 2016-08-26 2020-11-06 深圳华大生命科学研究院 一种筛选新型CRISPR-Cas系统的方法和装置
CN106480097A (zh) 2016-10-13 2017-03-08 南京凯地生物科技有限公司 利用CRISPR/Cas9技术敲除人PD‑1基因构建可靶向MSLN新型CAR‑T细胞的方法及其应用
CN106399375A (zh) 2016-08-31 2017-02-15 南京凯地生物科技有限公司 利用CRISPR/Cas9敲除人PD‑1基因构建靶向CD19CAR‑T细胞的方法
CN106399367A (zh) 2016-08-31 2017-02-15 深圳市卫光生物制品股份有限公司 提高crispr介导的同源重组效率的方法
CN107794272B (zh) 2016-09-06 2021-10-12 中国科学院上海营养与健康研究所 一种高特异性的crispr基因组编辑体系
WO2018048827A1 (en) 2016-09-07 2018-03-15 Massachusetts Institute Of Technology Rna-guided endonuclease-based dna assembly
CN106399311A (zh) 2016-09-07 2017-02-15 同济大学 用于Chip‑seq全基因组结合谱的内源蛋白标记的方法
CN106367435B (zh) 2016-09-07 2019-11-08 电子科技大学 一种水稻miRNA定向敲除的方法
CN106399377A (zh) 2016-09-07 2017-02-15 同济大学 一种基于CRISPR/Cas9高通量技术筛选药物靶点基因的方法
CN107574179B (zh) 2016-09-09 2018-07-10 康码（上海）生物科技有限公司 一种为克鲁维酵母优化的CRISPR/Cas9高效基因编辑系统
EP3510151B1 (en) 2016-09-09 2024-07-03 The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University High-throughput precision genome editing
WO2018051347A1 (en) 2016-09-14 2018-03-22 Yeda Research And Development Co. Ltd. Crisp-seq, an integrated method for massively parallel single cell rna-seq and crispr pooled screens
CN106318934B (zh) 2016-09-21 2020-06-05 上海交通大学 胡萝卜β(1,2)木糖转移酶的基因全序列及用于转染双子叶植物的CRISPR/CAS9的质粒构建
CN106957858A (zh) 2016-09-23 2017-07-18 西北农林科技大学 一种利用CRISPR/Cas9系统共同敲除绵羊MSTN、ASIP、BCO2基因的方法
US20180127786A1 (en) 2016-09-23 2018-05-10 Casebia Therapeutics Limited Liability Partnership Compositions and methods for gene editing
WO2017216392A1 (en) 2016-09-23 2017-12-21 Dsm Ip Assets B.V. A guide-rna expression system for a host cell
WO2018062866A2 (en) 2016-09-28 2018-04-05 Cellivery Therapeutics, Inc. CELL-PERMEABLE (CP)-Cas9 RECOMBINANT PROTEIN AND USES THEREOF
CN107880132B (zh) 2016-09-30 2022-06-17 北京大学 一种融合蛋白及使用其进行同源重组的方法
MX2019003674A (es) 2016-09-30 2021-01-08 Univ California Enzimas modificadoras de ácido nucleico guiadas por arn y métodos de uso de estas.
CN106480027A (zh) 2016-09-30 2017-03-08 重庆高圣生物医药有限责任公司 CRISPR/Cas9 靶向敲除人PD‑1基因及其特异性gRNA
CN107881184B (zh) 2016-09-30 2021-08-27 中国科学院分子植物科学卓越创新中心 一种基于Cpf1的DNA体外拼接方法
EA201990860A1 (ru) 2016-09-30 2019-10-31 Рнк-направляемые модифицирующие нуклеиновые кислоты ферменты и способы их применения
EP3518656A4 (en) 2016-09-30 2020-09-30 Monsanto Technology LLC METHOD OF SELECTING TARGETS FOR SITE-SPECIFIC GENOME MODIFICATION IN PLANTS
US11730823B2 (en) 2016-10-03 2023-08-22 President And Fellows Of Harvard College Delivery of therapeutic RNAs via ARRDC1-mediated microvesicles
US20190241899A1 (en) 2016-10-05 2019-08-08 President And Fellows Of Harvard College Methods of Crispr Mediated Genome Modulation in V. Natriegens
US10669539B2 (en) 2016-10-06 2020-06-02 Pioneer Biolabs, Llc Methods and compositions for generating CRISPR guide RNA libraries
CA3039409A1 (en) 2016-10-07 2018-04-12 Integrated Dna Technologies, Inc. S. pyogenes cas9 mutant genes and polypeptides encoded by same
CN106479985A (zh) 2016-10-09 2017-03-08 上海吉玛制药技术有限公司 病毒介导的Cpf1蛋白在CRISPR/Cpf1基因编辑系统中的应用
CN106434663A (zh) 2016-10-12 2017-02-22 遵义医学院 CRISPR/Cas9靶向敲除人ezrin基因增强子关键区的方法及其特异性gRNA
US20190365862A1 (en) 2016-10-12 2019-12-05 Temple University - Of The Commonwealth System Of Higher Education Combination therapies for eradicating flavivirus infections in subjects
IT201600102542A1 (it) 2016-10-12 2018-04-12 Univ Degli Studi Di Trento Plasmide e sistema lentivirale contenente un circuito autolimitante della Cas9 che ne incrementa la sicurezza.
KR102662249B1 (ko) 2016-10-14 2024-05-03 더 제너럴 하스피탈 코포레이션 후성적으로 조절되는 부위-특이적 뉴클레아제
JP2019530464A (ja) 2016-10-14 2019-10-24 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ 核酸塩基エディターのａａｖ送達
CN106434782B (zh) 2016-10-14 2020-01-10 南京工业大学 一种产顺式-4-羟脯氨酸的方法
US20190330620A1 (en) 2016-10-14 2019-10-31 Emendobio Inc. Rna compositions for genome editing
SG10201913505WA (en) 2016-10-17 2020-02-27 Univ Nanyang Tech Truncated crispr-cas proteins for dna targeting
US10640810B2 (en) 2016-10-19 2020-05-05 Drexel University Methods of specifically labeling nucleic acids using CRISPR/Cas
WO2018081534A1 (en) 2016-10-28 2018-05-03 President And Fellows Of Harvard College Assay for exo-site binding molecules
US20180127759A1 (en) 2016-10-28 2018-05-10 Massachusetts Institute Of Technology Dynamic genome engineering
WO2018081504A1 (en) 2016-10-28 2018-05-03 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for treating herpes simplex virus
WO2018080573A1 (en) 2016-10-28 2018-05-03 Massachusetts Institute Of Technology Crispr/cas global regulator screening platform
BR112019001996A2 (pt) 2016-10-31 2019-05-07 Eguchi High Frequency Co., Ltd. reator
WO2018081728A1 (en) 2016-10-31 2018-05-03 Emendobio Inc. Compositions for genome editing
WO2018085288A1 (en) 2016-11-01 2018-05-11 President And Fellows Of Harvard College Inhibitors of rna guided nucleases and uses thereof
EP3535396A1 (en) 2016-11-01 2019-09-11 Novartis AG Methods and compositions for enhancing gene editing
GB201618507D0 (en) 2016-11-02 2016-12-14 Stichting Voor De Technische Wetenschappen And Wageningen Univ Microbial genome editing
US11732258B2 (en) 2016-11-02 2023-08-22 President And Fellows Of Harvard College Engineered guide RNA sequences for in situ detection and sequencing
CN106544353A (zh) 2016-11-08 2017-03-29 宁夏医科大学总医院 一种利用CRISPR‑Cas9清除鲍曼不动杆菌耐药性基因的方法
US11180778B2 (en) 2016-11-11 2021-11-23 The Regents Of The University Of California Variant RNA-guided polypeptides and methods of use
CN106755088A (zh) 2016-11-11 2017-05-31 广东万海细胞生物科技有限公司 一种自体car‑t细胞制备方法及应用
CN106566838B (zh) 2016-11-14 2019-11-01 上海伯豪生物技术有限公司 一种基于CRISPR-Cas9技术的miR-126全长基因敲除试剂盒及其应用
WO2018086623A1 (en) 2016-11-14 2018-05-17 Institute Of Genetics And Developmental Biology, Chinese Academy Of Sciences A method for base editing in plants
CN106554969A (zh) 2016-11-15 2017-04-05 陕西理工学院 基于抑菌杀菌的多靶点CRISPR/Cas9表达载体
CN106754912B (zh) 2016-11-16 2019-11-08 上海交通大学 一类定向清除肝细胞中HBVcccDNA的质粒及制剂
AU2017361379B2 (en) 2016-11-16 2023-06-08 The Regents Of The University Of California Inhibitors of CRISPR-Cas9
US20180282722A1 (en) 2016-11-21 2018-10-04 Massachusetts Institute Of Technology Chimeric DNA:RNA Guide for High Accuracy Cas9 Genome Editing
CN106480067A (zh) 2016-11-21 2017-03-08 中国农业科学院烟草研究所 烟草NtNAC096基因控制烟草衰老的应用
AU2017364084B2 (en) 2016-11-22 2024-07-04 Integrated Dna Technologies, Inc. CRISPR/Cpf1 systems and methods
CN110382695A (zh) 2016-11-28 2019-10-25 得克萨斯州大学系统董事会 通过crispr/cpf1介导的基因编辑来预防肌营养不良
CN106755091A (zh) 2016-11-28 2017-05-31 中国人民解放军第三军医大学第附属医院 基因敲除载体，mh7a细胞nlrp1基因敲除方法
CN106480036B (zh) 2016-11-30 2019-04-09 华南理工大学 一种具有启动子功能的dna片段及其应用
CN106834323A (zh) 2016-12-01 2017-06-13 安徽大学 一种基于维吉尼亚链霉菌IBL14基因cas7‑5‑3的基因编辑方法
WO2018098587A1 (en) 2016-12-01 2018-06-07 UNIVERSITé LAVAL Crispr-based treatment of friedreich ataxia
CN107043779B (zh) 2016-12-01 2020-05-12 中国农业科学院作物科学研究所 一种CRISPR/nCas9介导的定点碱基替换在植物中的应用
US9816093B1 (en) 2016-12-06 2017-11-14 Caribou Biosciences, Inc. Engineered nucleic acid-targeting nucleic acids
CN106701830B (zh) 2016-12-07 2020-01-03 湖南人文科技学院 一种敲除猪胚胎p66shc基因的方法
CN108165573B (zh) 2016-12-07 2022-01-14 中国科学院分子植物科学卓越创新中心 叶绿体基因组编辑方法
AU2017374044B2 (en) 2016-12-08 2023-11-30 Intellia Therapeutics, Inc. Modified guide RNAs
CN106544351B (zh) 2016-12-08 2019-09-10 江苏省农业科学院 CRISPR-Cas9体外敲除耐药基因mcr-1的方法及其专用细胞穿透肽
US11192929B2 (en) 2016-12-08 2021-12-07 Regents Of The University Of Minnesota Site-specific DNA base editing using modified APOBEC enzymes
WO2018107103A1 (en) 2016-12-09 2018-06-14 The Broad Institute, Inc. Crispr-systems for modifying a trait of interest in a plant
DK3551753T3 (da) 2016-12-09 2022-09-05 Broad Inst Inc Diagnostik baseret på crispr-effektorsystem
US20190032131A1 (en) 2016-12-12 2019-01-31 Integrated Dna Technologies, Inc. Genome editing detection
WO2018111947A1 (en) 2016-12-12 2018-06-21 Integrated Dna Technologies, Inc. Genome editing enhancement
CN107893074A (zh) 2016-12-13 2018-04-10 广东赤萌医疗科技有限公司 一种用于敲除CXCR4基因的gRNA、表达载体、敲除系统、试剂盒
WO2018108272A1 (en) 2016-12-14 2018-06-21 Wageningen Universiteit Thermostable cas9 nucleases
WO2018109101A1 (en) 2016-12-14 2018-06-21 Wageningen Universiteit Thermostable cas9 nucleases
WO2018112336A1 (en) 2016-12-16 2018-06-21 Ohio State Innovation Foundation Systems and methods for dna-guided rna cleavage
KR101748575B1 (ko) 2016-12-16 2017-06-20 주식회사 엠젠플러스 Ins 유전자 녹아웃 당뇨병 또는 당뇨병 합병증 동물모델 및 이의 제조방법
CN106755026A (zh) 2016-12-18 2017-05-31 吉林大学 sgRNA表达载体的构建及牙釉质钙化不全模型的建立
CN110268269A (zh) 2016-12-18 2019-09-20 赛隆特拉有限公司 使用apoe4基序介导的基因以用于诊断和治疗阿尔茨海默氏病
WO2018119354A1 (en) 2016-12-23 2018-06-28 President And Fellows Of Harvard College Gene editing of pcsk9
US10745677B2 (en) 2016-12-23 2020-08-18 President And Fellows Of Harvard College Editing of CCR5 receptor gene to protect against HIV infection
CN107354173A (zh) 2016-12-26 2017-11-17 浙江省医学科学院 基于crispr技术和水动力尾静脉注射建立肝脏特异性敲除小鼠模型的方法
CN106755424B (zh) 2016-12-26 2020-11-06 郑州大学 一种基于crispr的大肠杆菌st131系菌株检测引物、试剂盒及检测方法
CN106755097A (zh) 2016-12-27 2017-05-31 安徽省农业科学院畜牧兽医研究所 一种山羊tlr4基因敲除载体及其构建方法
CN106834347A (zh) 2016-12-27 2017-06-13 安徽省农业科学院畜牧兽医研究所 一种山羊cdk2基因敲除载体及其构建方法
CN106868008A (zh) 2016-12-30 2017-06-20 重庆高圣生物医药有限责任公司 CRISPR/Cas9靶向敲除人Lin28A基因及其特异性gRNA
CN106701763B (zh) 2016-12-30 2019-07-19 重庆高圣生物医药有限责任公司 CRISPR/Cas9靶向敲除人乙肝病毒P基因及其特异性gRNA
CN106834341B (zh) 2016-12-30 2020-06-16 中国农业大学 一种基因定点突变载体及其构建方法和应用
CN106755077A (zh) 2016-12-30 2017-05-31 华智水稻生物技术有限公司 利用crispr‑cas9技术对水稻cenh3基因定点突变的方法
CN106701818B (zh) 2017-01-09 2020-04-24 湖南杂交水稻研究中心 一种培育水稻普通核不育系的方法
CN107012164B (zh) 2017-01-11 2023-03-03 电子科技大学 CRISPR/Cpf1植物基因组定向修饰功能单元、包含该功能单元的载体及其应用
US20190352634A1 (en) 2017-01-11 2019-11-21 Oxford University Innovation Limited Crispr rna
KR102084186B1 (ko) 2017-01-17 2020-03-03 기초과학연구원 Dna 단일가닥 절단에 의한 염기 교정 비표적 위치 확인 방법
CN106701823A (zh) 2017-01-18 2017-05-24 上海交通大学 生产无岩藻糖单克隆抗体的cho细胞系建立及其应用
CN107058372A (zh) 2017-01-18 2017-08-18 四川农业大学 一种应用于植物上的CRISPR/Cas9载体的构建方法
US20180201921A1 (en) 2017-01-18 2018-07-19 Excision Biotherapeutics, Inc. CRISPRs
CN106801056A (zh) 2017-01-24 2017-06-06 中国科学院广州生物医药与健康研究院 一种sgRNA及其构建的慢病毒载体和应用
US20190352626A1 (en) 2017-01-30 2019-11-21 KWS SAAT SE & Co. KGaA Repair template linkage to endonucleases for genome engineering
TWI608100B (zh) 2017-02-03 2017-12-11 國立清華大學 Ｃａｓ９表達質體、大腸桿菌基因剪輯系統及其方法
AU2018218280B2 (en) 2017-02-07 2024-10-17 The Regents Of The University Of California Gene therapy for haploinsufficiency
WO2018148246A1 (en) 2017-02-07 2018-08-16 Massachusetts Institute Of Technology Methods and compositions for rna-guided genetic circuits
WO2018148647A2 (en) 2017-02-10 2018-08-16 Lajoie Marc Joseph Genome editing reagents and their use
IT201700016321A1 (it) 2017-02-14 2018-08-14 Univ Degli Studi Di Trento Mutanti di cas9 ad alta specificita' e loro applicazioni.
WO2018152197A1 (en) 2017-02-15 2018-08-23 Massachusetts Institute Of Technology Dna writers, molecular recorders and uses thereof
CN106957855B (zh) 2017-02-16 2020-04-17 上海市农业科学院 使用CRISPR/Cas9技术靶向敲除水稻矮杆基因SD1的方法
WO2018152418A1 (en) 2017-02-17 2018-08-23 Temple University - Of The Commonwealth System Of Higher Education Gene editing therapy for hiv infection via dual targeting of hiv genome and ccr5
WO2018149418A1 (en) 2017-02-20 2018-08-23 Institute Of Genetics And Developmental Biology, Chinese Academy Of Sciences Genome editing system and method
CN110582570A (zh) 2017-02-22 2019-12-17 克里斯珀医疗股份公司 用于治疗前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/Kexin 9型(PCSK9)相关的病症的组合物和方法
CA3054031A1 (en) 2017-02-22 2018-08-30 Crispr Therapeutics Ag Compositions and methods for gene editing
US11407997B2 (en) 2017-02-22 2022-08-09 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for treatment of primary hyperoxaluria type 1 (PH1) and other alanine-glyoxylate aminotransferase (AGXT) gene related conditions or disorders
EP3585807A1 (en) 2017-02-22 2020-01-01 CRISPR Therapeutics AG Materials and methods for treatment of early onset parkinson's disease (park1) and other synuclein, alpha (snca) gene related conditions or disorders
US20190365929A1 (en) 2017-02-22 2019-12-05 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for treatment of dystrophic epidermolysis bullosa (deb) and other collagen type vii alpha 1 chain (col7a1) gene related conditions or disorders
WO2018156372A1 (en) 2017-02-22 2018-08-30 The Regents Of The University Of California Genetically modified non-human animals and products thereof
US20200216857A1 (en) 2017-02-22 2020-07-09 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for treatment of spinocerebellar ataxia type 2 (sca2) and other spinocerebellar ataxia type 2 protein (atxn2) gene related conditions or disorders
US11559588B2 (en) 2017-02-22 2023-01-24 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for treatment of Spinocerebellar Ataxia Type 1 (SCA1) and other Spinocerebellar Ataxia Type 1 Protein (ATXN1) gene related conditions or disorders
US20200095579A1 (en) 2017-02-22 2020-03-26 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for treatment of merosin-deficient cogenital muscular dystrophy (mdcmd) and other laminin, alpha 2 (lama2) gene related conditions or disorders
US20190380314A1 (en) 2017-02-23 2019-12-19 President And Fellows Of Harvard College Methods of Genetic Modification of a Cell
CN106868031A (zh) 2017-02-24 2017-06-20 北京大学 一种基于分级组装的多个sgRNA串联并行表达的克隆方法及应用
WO2018161009A1 (en) 2017-03-03 2018-09-07 Yale University Aav-mediated direct in vivo crispr screen in glioblastoma
US11111492B2 (en) 2017-03-06 2021-09-07 Florida State University Research Foundation, Inc. Genome engineering methods using a cytosine-specific Cas9
JP2020510038A (ja) 2017-03-09 2020-04-02 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ がんワクチン
EP3592853A1 (en) 2017-03-09 2020-01-15 President and Fellows of Harvard College Suppression of pain by gene editing
KR20190127797A (ko) 2017-03-10 2019-11-13 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 시토신에서 구아닌으로의 염기 편집제
EP3595694A4 (en) 2017-03-14 2021-06-09 The Regents of The University of California CONSTRUCTION OF CAS9 CRISPR IMMUNE FURTIF
CN106978428A (zh) 2017-03-15 2017-07-25 上海吐露港生物科技有限公司 一种Cas蛋白特异结合靶标DNA、调控靶标基因转录的方法及试剂盒
EP3596218B1 (en) 2017-03-15 2023-08-23 The Broad Institute, Inc. Crispr effector system based diagnostics for virus detection
CN106906242A (zh) 2017-03-16 2017-06-30 重庆高圣生物医药有限责任公司 一种提高CRIPSR/Cas9靶向敲除基因产生非同源性末端接合效率的方法
WO2018175502A2 (en) 2017-03-21 2018-09-27 Shuber Anthony P Treating cancer with cas endonuclease complexes
IL306092A (en) 2017-03-23 2023-11-01 Harvard College Nucleic base editors that include nucleic acid programmable DNA binding proteins
CN107012213A (zh) 2017-03-24 2017-08-04 南开大学 结直肠癌的生物标记物
CN106947780A (zh) 2017-03-28 2017-07-14 扬州大学 一种兔mstn基因的编辑方法
PT3526324T (pt) 2017-03-28 2021-10-20 Locanabio Inc Proteína associada a crispr (cas)
CN106906240A (zh) 2017-03-29 2017-06-30 浙江大学 运用CRISPR‑Cas9系统敲除大麦VE合成通路中的关键基因HPT的方法
WO2018179578A1 (ja) 2017-03-30 2018-10-04 国立大学法人京都大学 ゲノム編集によるエクソンスキッピング誘導方法
CN108660161B (zh) 2017-03-31 2023-05-09 中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心 基于CRISPR/Cas9技术的制备无嵌合基因敲除动物的方法
CN107058358B (zh) 2017-04-01 2020-06-09 中国科学院微生物研究所 一种双spacer序列识别切割CRISPR-Cas9载体构建及其在疣孢菌中的应用
US9938288B1 (en) 2017-04-05 2018-04-10 President And Fellows Of Harvard College Macrocyclic compound and uses thereof
CN106967726B (zh) 2017-04-05 2020-12-29 华南农业大学 一种创建亚洲栽培稻与非洲栽培稻种间杂种亲和系的方法和应用
CN107142282A (zh) 2017-04-06 2017-09-08 中山大学 一种利用CRISPR/Cas9在哺乳动物细胞中实现大片段DNA定点整合的方法
CN107034229A (zh) 2017-04-07 2017-08-11 江苏贝瑞利生物科技有限公司 一种植物中高效筛选CRISPR/CAS9基因编辑系统候选sgRNA系统及应用
CN107058320B (zh) 2017-04-12 2019-08-02 南开大学 Il7r基因缺失斑马鱼突变体的制备及其应用
CN106916852B (zh) 2017-04-13 2020-12-04 上海科技大学 一种碱基编辑系统及其构建和应用方法
CN108728476A (zh) 2017-04-14 2018-11-02 复旦大学 一种利用crispr系统产生多样性抗体文库的方法
CN107298701B (zh) 2017-04-18 2020-10-30 上海大学 玉米转录因子ZmbZIP22及其应用
CN116555353A (zh) 2017-04-20 2023-08-08 E开创生物技术股份有限公司 产生基因修改的动物的方法
CN106957844A (zh) 2017-04-20 2017-07-18 华侨大学 一种能有效敲除HTLV‑1病毒基因组的CRISPR/Cas9的gRNA序列
WO2018195555A1 (en) 2017-04-21 2018-10-25 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Crispr/cas 9-mediated integration of polynucleotides by sequential homologous recombination of aav donor vectors
WO2018195545A2 (en) 2017-04-21 2018-10-25 The General Hospital Corporation Variants of cpf1 (cas12a) with altered pam specificity
EP3615665A1 (en) 2017-04-24 2020-03-04 DuPont Nutrition Biosciences ApS Novel anti-crispr genes and proteins and methods of use
CN107043775B (zh) 2017-04-24 2020-06-16 中国农业科学院生物技术研究所 一种能促进棉花侧根发育的sgRNA及其应用
CN206970581U (zh) 2017-04-26 2018-02-06 重庆威斯腾生物医药科技有限责任公司 一种用于辅助CRISPR/cas9基因敲除的试剂盒
WO2018197020A1 (en) 2017-04-27 2018-11-01 Novozymes A/S Genome editing by crispr-cas9 using short donor oligonucleotides
WO2018202800A1 (en) 2017-05-03 2018-11-08 Kws Saat Se Use of crispr-cas endonucleases for plant genome engineering
CN107012174A (zh) 2017-05-04 2017-08-04 昆明理工大学 CRISPR/Cas9技术在获得家蚕锌指蛋白基因突变体中的应用
US12029760B2 (en) 2017-05-04 2024-07-09 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for gene editing in T cells using CRISPR/Cpf1
CN107254485A (zh) 2017-05-08 2017-10-17 南京农业大学 一种能够快速构建植物基因定点敲除载体的新反应体系
CN107129999A (zh) 2017-05-09 2017-09-05 福建省农业科学院畜牧兽医研究所 利用稳转CRISPR/Cas9系统对病毒基因组进行靶向编辑的方法
WO2018208755A1 (en) 2017-05-09 2018-11-15 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for tagging target proteins in proximity to a nucleotide sequence of interest
WO2018209158A2 (en) 2017-05-10 2018-11-15 Editas Medicine, Inc. Crispr/rna-guided nuclease systems and methods
EP3622062A4 (en) 2017-05-10 2020-10-14 The Regents of the University of California DIRECTED EDITING OF CELLULAR RNA BY NUCLEAR ADMINISTRATION OF CRISPR / CAS9
CN107130000B (zh) 2017-05-12 2019-12-17 浙江卫未生物医药科技有限公司 一种同时敲除KRAS基因和EGFR基因的CRISPR-Cas9系统及其应用
US11560566B2 (en) 2017-05-12 2023-01-24 President And Fellows Of Harvard College Aptazyme-embedded guide RNAs for use with CRISPR-Cas9 in genome editing and transcriptional activation
CN106957831B (zh) 2017-05-16 2021-03-12 上海交通大学 一种Cas9核酸酶K918A及其用途
CN106967697B (zh) 2017-05-16 2021-03-26 上海交通大学 一种Cas9核酸酶G915F及其用途
CN106957830B (zh) 2017-05-16 2020-12-25 上海交通大学 一种Cas9核酸酶ΔF916及其用途
CN106916820B (zh) 2017-05-16 2019-09-27 吉林大学 能有效编辑猪ROSA26基因的sgRNA及其应用
CN106987570A (zh) 2017-05-16 2017-07-28 上海交通大学 一种Cas9核酸酶R780A及其用途
CN107326042A (zh) 2017-05-16 2017-11-07 上海交通大学 水稻tms10基因的定点敲除系统及其应用
CN106939303B (zh) 2017-05-16 2021-02-23 上海交通大学 一种Cas9核酸酶R919P及其用途
CN107012250B (zh) 2017-05-16 2021-01-29 上海交通大学 一种适用于CRISPR/Cas9系统的基因组DNA片段编辑精准度的分析方法及应用
CN106947750B (zh) 2017-05-16 2020-12-08 上海交通大学 一种Cas9核酸酶Q920P及其用途
WO2018213771A1 (en) 2017-05-18 2018-11-22 Cargill, Incorporated Genome editing system
WO2018213726A1 (en) 2017-05-18 2018-11-22 The Broad Institute, Inc. Systems, methods, and compositions for targeted nucleic acid editing
EP3625359A4 (en) 2017-05-18 2021-03-03 Children's National Medical Center APTAMERIC AND NUCLEIC ACID PAYLOAD COMPOSITIONS AND METHODS OF USE
AU2018270088B2 (en) 2017-05-18 2024-05-16 Massachusetts Institute Of Technology Systems, methods, and compositions for targeted nucleic acid editing
CN107236737A (zh) 2017-05-19 2017-10-10 上海交通大学 特异靶向拟南芥ILK2基因的sgRNA序列及其应用
CN107043787B (zh) 2017-05-19 2017-12-26 南京医科大学 一种基于CRISPR/Cas9获得MARF1定点突变小鼠模型的构建方法和应用
WO2018217852A1 (en) 2017-05-23 2018-11-29 Gettysburg College Crispr based tool for characterizing bacterial serovar diversity
CN107034188B (zh) 2017-05-24 2018-07-24 中山大学附属口腔医院 一种靶向骨的外泌体载体、CRISPR/Cas9基因编辑系统及应用
CA3063449A1 (en) 2017-05-25 2018-11-29 The General Hospital Corporation Using split deaminases to limit unwanted off-target base editor deamination
CN107177625B (zh) 2017-05-26 2021-05-25 中国农业科学院植物保护研究所 一种定点突变的人工载体系统及定点突变方法
US20200263186A1 (en) 2017-05-26 2020-08-20 North Carolina State University Altered guide rnas for modulating cas9 activity and methods of use
CN107287245B (zh) 2017-05-27 2020-03-17 南京农业大学 一种基于CRISPR/Cas9技术的Glrx1基因敲除动物模型的构建方法
CN107142272A (zh) 2017-06-05 2017-09-08 南京金斯瑞生物科技有限公司 一种控制大肠杆菌中质粒复制的方法
CN107177595A (zh) 2017-06-07 2017-09-19 浙江大学 用于猪CD163基因编辑的靶向sgRNA、修饰载体及其制备方法和应用
CN107119071A (zh) 2017-06-07 2017-09-01 江苏三黍生物科技有限公司 一种降低植物直链淀粉含量的方法及应用
CN107034218A (zh) 2017-06-07 2017-08-11 浙江大学 用于猪APN基因编辑的靶向sgRNA、修饰载体及其制备方法和应用
CN107236739A (zh) 2017-06-12 2017-10-10 上海捷易生物科技有限公司 CRISPR/SaCas9特异性敲除人CXCR4基因的方法
CN106987757A (zh) 2017-06-12 2017-07-28 苏州双金实业有限公司 一种耐腐蚀型奥氏体镍基合金
CN107227352A (zh) 2017-06-13 2017-10-03 西安医学院 基于eGFP的GPR120基因表达的检测方法及应用
CN107083392B (zh) 2017-06-13 2020-09-08 中国医学科学院病原生物学研究所 一种CRISPR/Cpf1基因编辑系统及其在分枝杆菌中的应用
CN107245502B (zh) 2017-06-14 2020-11-03 中国科学院武汉病毒研究所 Cd2结合蛋白(cd2ap)和其相互作用蛋白
CN107312798B (zh) 2017-06-16 2020-06-23 武汉大学 含特异靶向CCR5基因的gRNA序列的CRISPR/Cas9重组慢病毒载体及应用
CN107099850B (zh) 2017-06-19 2018-05-04 东北农业大学 一种通过酶切基因组构建CRISPR/Cas9基因组敲除文库的方法
CN107266541B (zh) 2017-06-20 2021-06-04 上海大学 玉米转录因子ZmbHLH167及其应用
CN107446951B (zh) 2017-06-20 2021-01-08 温氏食品集团股份有限公司 一种通过CRISPR/Cas9系统快速筛选重组鸡痘病毒的方法及其应用
CN107058328A (zh) 2017-06-22 2017-08-18 江苏三黍生物科技有限公司 一种提高植物直链淀粉含量的方法及应用
CN107119053A (zh) 2017-06-23 2017-09-01 东北农业大学 一种特异靶向猪MC4R基因的sgRNA导向序列及其应用
CN107099533A (zh) 2017-06-23 2017-08-29 东北农业大学 一种特异靶向猪IGFBP3基因的sgRNA导向序列及应用
US9982279B1 (en) 2017-06-23 2018-05-29 Inscripta, Inc. Nucleic acid-guided nucleases
CN107227307A (zh) 2017-06-23 2017-10-03 东北农业大学 一种特异靶向猪IRS1基因的sgRNA导向序列及其应用
WO2019005884A1 (en) 2017-06-26 2019-01-03 The Broad Institute, Inc. CRISPR / CAS-ADENINE DEAMINASE COMPOSITIONS, SYSTEMS AND METHODS FOR TARGETED NUCLEIC ACID EDITION
CN107177631B (zh) 2017-06-26 2020-11-24 中国农业大学 利用CRISPR-CAS9技术敲除NRK细胞Slc22a2基因的方法
WO2019005886A1 (en) 2017-06-26 2019-01-03 The Broad Institute, Inc. CRISPR / CAS-CYTIDINE DEAMINASE COMPOSITIONS, SYSTEMS AND METHODS FOR TARGETED EDITING OF NUCLEIC ACIDS
CN107217075B (zh) 2017-06-28 2021-07-02 西安交通大学医学院第一附属医院 一种构建epo基因敲除斑马鱼动物模型的方法及引物、质粒与制备方法
CN107356793A (zh) 2017-07-01 2017-11-17 合肥东玖电气有限公司 一种防火电表箱
CN107312793A (zh) 2017-07-05 2017-11-03 新疆农业科学院园艺作物研究所 Cas9介导的番茄基因编辑载体及其应用
CN107190006A (zh) 2017-07-07 2017-09-22 南通大学附属医院 一种靶向IGF‑IR基因的sgRNA及其应用
US20200202981A1 (en) 2017-07-07 2020-06-25 The Broad Institute, Inc. Methods for designing guide sequences for guided nucleases
CN107190008A (zh) 2017-07-19 2017-09-22 苏州吉赛基因测序科技有限公司 一种基于Crispr/cas9的捕获基因组目标序列的方法及其在高通量测序中的应用
CN107236741A (zh) 2017-07-19 2017-10-10 广州医科大学附属第五医院 一种敲除野生型T细胞TCR alpha链的gRNA及方法
CN107354156B (zh) 2017-07-19 2021-02-09 广州医科大学附属第五医院 一种敲除野生型T细胞TCR beta链的gRNA及方法
CN107400677B (zh) 2017-07-19 2020-05-22 江南大学 一种基于CRISPR-Cas9系统的地衣芽孢杆菌基因组编辑载体及其制备方法
CN111801345A (zh) 2017-07-28 2020-10-20 哈佛大学的校长及成员们 使用噬菌体辅助连续进化(pace)的进化碱基编辑器的方法和组合物
CN107435069A (zh) 2017-07-28 2017-12-05 新乡医学院 一种细胞系CRISPR/Cas9基因敲除的快速检测方法
CN107446954A (zh) 2017-07-28 2017-12-08 新乡医学院 一种sd大鼠t细胞缺失遗传模型的制备方法
CN107267515B (zh) 2017-07-28 2020-08-25 重庆医科大学附属儿童医院 CRISPR/Cas9靶向敲除人CNE10基因及其特异性gRNA
CN107384922A (zh) 2017-07-28 2017-11-24 重庆医科大学附属儿童医院 CRISPR/Cas9靶向敲除人CNE9基因及其特异性gRNA
CN107418974A (zh) 2017-07-28 2017-12-01 新乡医学院 一种利用单克隆细胞分选快速获得CRISPR/Cas9基因敲除稳定细胞株的方法
CN107435051B (zh) 2017-07-28 2020-06-02 新乡医学院 一种通过CRISPR/Cas9系统快速获得大片段缺失的细胞系基因敲除方法
CN107217042B (zh) 2017-07-31 2020-03-06 江苏东抗生物医药科技有限公司 一种生产无岩藻糖基化蛋白的基因工程细胞系及其建立方法
CN107446922A (zh) 2017-08-03 2017-12-08 无锡市第二人民医院 一种敲除人成骨细胞株中hepcidin基因的gRNA序列及其使用方法
CN107502618B (zh) 2017-08-08 2021-03-12 中国科学院微生物研究所 可控载体消除方法及易用型CRISPR-Cas9工具
CN107312785B (zh) 2017-08-09 2019-12-06 四川农业大学 OsKTN80b基因在降低水稻株高方面的应用
CN107446923B (zh) 2017-08-13 2019-12-31 中国人民解放军疾病预防控制所 rAAV8-CRISPR-SaCas9系统及在制备乙肝治疗药物中的应用
CN107365804B (zh) 2017-08-13 2019-12-20 中国人民解放军疾病预防控制所 一种使用温和噬菌体载体包装CRISPR-Cas9系统的方法
CN107384926B (zh) 2017-08-13 2020-06-26 中国人民解放军疾病预防控制所 一种靶向清除细菌耐药性质粒的CRISPR-Cas9系统及应用
CN107815463A (zh) 2017-08-15 2018-03-20 西南大学 CRISPR/Cas9技术介导miR167前体序列编辑体系的建立方法
CN108034656A (zh) 2017-08-16 2018-05-15 四川省农业科学院生物技术核技术研究所 与水稻红褐色颖壳性状有关的sgRNA、CRISPR/Cas9载体、载体构建、应用
CN107446924B (zh) 2017-08-16 2020-01-14 中国科学院华南植物园 一种基于CRISPR-Cas9的猕猴桃基因AcPDS编辑载体及其构建方法和应用
CN107384894B (zh) 2017-08-21 2019-10-22 华南师范大学 功能化氧化石墨烯高效运载CRISPR/Cas9用于基因编辑的方法
CN107299114B (zh) 2017-08-23 2021-08-27 中国科学院分子植物科学卓越创新中心 一种高效的酵母菌染色体融合方法
CN107557393B (zh) 2017-08-23 2020-05-08 中国科学院上海应用物理研究所 一种磁性纳米材料介导的CRISPR/Cas9 T细胞内递送系统及其制备方法和应用
CN107312795A (zh) 2017-08-24 2017-11-03 浙江省农业科学院 运用CRISPR/Cas9系统创制粉色果实番茄的基因编辑方法
CN107460196A (zh) 2017-08-25 2017-12-12 同济大学 一种免疫缺陷小鼠动物模型的构建方法及应用
CN107488649A (zh) 2017-08-25 2017-12-19 南方医科大学 一种Cpf1和p300核心结构域的融合蛋白、相应的DNA靶向激活系统和应用
CN107541525B (zh) 2017-08-26 2021-12-10 内蒙古大学 一种基于CRISPR/Cas9技术介导山羊Tβ4基因定点敲入的方法
CN107446932B (zh) 2017-08-29 2020-02-21 江西省农业科学院 一个控制水稻雄性生殖发育基因及其应用
US11319532B2 (en) 2017-08-30 2022-05-03 President And Fellows Of Harvard College High efficiency base editors comprising Gam
CN107519492B (zh) 2017-09-06 2019-01-25 武汉迈特维尔生物科技有限公司 使用CRISPR技术敲除miR-3187-3p在冠状动脉粥样硬化性心脏病中的应用
CN107641631A (zh) 2017-09-07 2018-01-30 浙江工业大学 一种由化学转化介导的基于CRISPR/Cas9系统敲除大肠杆菌基因的方法
CN107362372B (zh) 2017-09-07 2019-01-11 佛山波若恩生物科技有限公司 使用crispr技术在冠状动脉粥样硬化性心脏病中的应用
CN107502608B (zh) 2017-09-08 2020-10-16 中山大学 用于敲除人ALDH2基因的sgRNA、ALDH2基因缺失细胞株的构建方法及应用
CN107557455A (zh) 2017-09-15 2018-01-09 国家纳米科学中心 一种基于CRISPR‑Cas13a的特异性核酸片段的检测方法
CN107557390A (zh) 2017-09-18 2018-01-09 江南大学 一种筛选cho细胞系高表达位点的方法
WO2019056002A1 (en) 2017-09-18 2019-03-21 President And Fellows Of Harvard College CONTINUOUS EVOLUTION FOR STABILIZED PROTEINS
CN107475300B (zh) 2017-09-18 2020-04-21 上海市同济医院 Ifit3-eKO1基因敲除小鼠动物模型的构建方法和应用
CN107523583A (zh) 2017-09-19 2017-12-29 安徽大学 一种源于I型CRISPR‑Cas系统中基因cas5‑3的原核基因编辑方法
CN107557378A (zh) 2017-09-19 2018-01-09 安徽大学 一种基于I型CRISPR‑Cas系统中基因cas7‑3的真核基因编辑方法
CN107630041A (zh) 2017-09-19 2018-01-26 安徽大学 一种基于维吉尼亚链霉菌IBL14 I‑B型Cas系统的真核基因编辑方法
CN107630042A (zh) 2017-09-19 2018-01-26 安徽大学 一种源于I型Cas系统4个cas基因的原核生物基因编辑方法
CN107557373A (zh) 2017-09-19 2018-01-09 安徽大学 一种基于I‑B型CRISPR‑Cas系统基因cas3的基因编辑方法
CN107619837A (zh) 2017-09-20 2018-01-23 西北农林科技大学 利用Cas9切割核酸酶介导Ipr1定点插入获取转基因牛胎儿成纤维细胞的方法
CN107513531B (zh) 2017-09-21 2020-02-21 无锡市妇幼保健院 用于内源性过表达lncRNA-XIST的gRNA靶点序列及其应用
CN107686848A (zh) 2017-09-26 2018-02-13 中山大学孙逸仙纪念医院 转座子协同CRISPR/Cas9系统的稳定敲除单质粒载体及其应用
CN107760652A (zh) 2017-09-29 2018-03-06 华南理工大学 CRISPR/CAS9介导药物转运体靶向性敲除的caco‑2细胞模型及其方法
CN107557394A (zh) 2017-09-29 2018-01-09 南京鼓楼医院 降低CRISPR/Cas9介导的胚胎基因编辑脱靶率的方法
CN107760663A (zh) 2017-09-30 2018-03-06 新疆大学 油莎草pepc基因的克隆及表达载体的构建和应用
CN107828794A (zh) 2017-09-30 2018-03-23 上海市农业生物基因中心 一种水稻耐盐基因OsRR22突变体、其编码的氨基酸序列、植株及该突变体的创制方法
CN107630006B (zh) 2017-09-30 2020-09-11 山东兴瑞生物科技有限公司 一种制备tcr与hla双基因敲除的t细胞的方法
CN107604003A (zh) 2017-10-10 2018-01-19 南方医科大学 一种基于线性化crispr‑cas9慢病毒载体基因敲除试剂盒及其应用
CN107557381A (zh) 2017-10-12 2018-01-09 南京农业大学 一种白菜CRISPR‑Cas9基因编辑体系的建立及其应用
CN108102940B (zh) 2017-10-12 2021-07-13 中石化上海工程有限公司 一株利用CRISPR/Cas9系统敲除XKS1基因的工业酿酒酵母菌株及构建方法
CN107474129B (zh) 2017-10-12 2018-10-19 江西汉氏联合干细胞科技有限公司 特异性增强crispr-cas系统基因编辑效率的方法
CN108103586A (zh) 2017-10-13 2018-06-01 上海科技大学 一种CRISPR/Cas9随机文库及其构建和应用
CN107619829B (zh) 2017-10-14 2018-08-24 南京平港生物技术有限公司 使用crispr-cas系统对间充质干细胞进行gins2基因敲除的方法
CN107586779B (zh) 2017-10-14 2018-08-28 天津金匙生物科技有限公司 使用crispr-cas系统对间充质干细胞进行casp3基因敲除的方法
CA3082251A1 (en) 2017-10-16 2019-04-25 The Broad Institute, Inc. Uses of adenosine base editors
CN107523567A (zh) 2017-10-16 2017-12-29 遵义医学院 一种敲除人ezrin基因增强子的食管癌细胞株的构建方法
CN107760715B (zh) 2017-10-17 2021-12-10 张业胜 一种转基因载体及其构建方法和应用
CN107937427A (zh) 2017-10-20 2018-04-20 广东石油化工学院 一种基于CRISPR/Cas9体系的同源修复载体构建方法
EP3701025A4 (en) 2017-10-23 2021-07-28 The Broad Institute, Inc. SYSTEMS, PROCEDURES AND COMPOSITIONS FOR TARGETED NUCLEIC ACID EDITING
CN107893086B (zh) 2017-10-24 2021-09-03 中国科学院武汉植物园 快速构建配对sgRNA的Cas9双元表达载体文库的方法
CN107760684B (zh) 2017-11-03 2018-09-25 上海拉德钫斯生物科技有限公司 使用crispr-cas系统对间充质干细胞进行rbm17基因敲除的方法
CN107858346B (zh) 2017-11-06 2020-06-16 天津大学 一种敲除酿酒酵母染色体的方法
CN107794276A (zh) 2017-11-08 2018-03-13 中国农业科学院作物科学研究所 一种crispr介导快速有效的农作物定点基因片段或等位基因替换方法和体系
CN107630043A (zh) 2017-11-14 2018-01-26 吉林大学 采用敲除技术建立Gadd45a敲除兔模型的方法
CN108441519A (zh) 2017-11-15 2018-08-24 中国农业大学 在crispr/cas9基因编辑中提高同源修复效率的方法
CN107858373B (zh) 2017-11-16 2020-03-17 山东省千佛山医院 内皮细胞条件性敲除ccr5基因小鼠模型的构建方法
CN107893075A (zh) 2017-11-17 2018-04-10 和元生物技术（上海）股份有限公司 CRISPR‑Cas9靶向敲除人肠癌细胞RITA基因及其特异性的sgRNA
CN108192956B (zh) 2017-11-17 2021-06-01 东南大学 一种基于Cas9核酸酶的DNA检测分析方法及其应用
CN107828874B (zh) 2017-11-20 2020-10-16 东南大学 一种基于crispr的dna检测和分型方法及其应用
CN107904261A (zh) 2017-11-21 2018-04-13 福州大学 CRISPR/Cas9纳米基因系统的制备及其在转染方面的应用
CN107653256A (zh) 2017-11-21 2018-02-02 云南省烟草农业科学研究院 一种烟草多酚氧化酶基因NtPPO1及其定点突变方法与应用
CN107893076A (zh) 2017-11-23 2018-04-10 和元生物技术（上海）股份有限公司 CRISPR‑Cas9靶向敲除人乳腺癌细胞RASSF2基因及其特异性的sgRNA
CN107937501A (zh) 2017-11-24 2018-04-20 安徽师范大学 一种快速简便的筛选CRISPR/Cas基因编辑阳性对象的方法
CN107937432B (zh) 2017-11-24 2020-05-01 华中农业大学 一种基于crispr系统的基因组编辑方法及其应用
CN107828738A (zh) 2017-11-28 2018-03-23 新乡医学院 一种dna甲基转移酶缺陷型cho细胞系及其制备方法及应用
CN107988256B (zh) 2017-12-01 2020-07-28 暨南大学 人亨廷顿基因敲入用重组载体及其构建方法和在模型猪构建中的应用
CN108148873A (zh) 2017-12-06 2018-06-12 南方医科大学 一种cav-1基因缺失斑马鱼及其制备方法
CN108570479B (zh) 2017-12-06 2020-04-03 内蒙古大学 一种基于CRISPR/Cas9技术介导绒山羊VEGF基因定点敲入的方法
CN108148835A (zh) 2017-12-07 2018-06-12 和元生物技术（上海）股份有限公司 CRISPR-Cas9靶向敲除SLC30A1基因及其特异性的sgRNA
CN107974466B (zh) 2017-12-07 2020-09-29 中国科学院水生生物研究所 一种鲟鱼CRISPR/Cas9基因编辑方法
CN108315330B (zh) 2017-12-07 2020-05-19 嘉兴市第一医院 CRISPR-Cas9系统特异性靶向人RSPO2基因的sgRNA及敲除方法和应用
CN108251423B (zh) 2017-12-07 2020-11-06 嘉兴市第一医院 CRISPR-Cas9系统特异性靶向人RSPO2基因的sgRNA及激活方法和应用
CN107828826A (zh) 2017-12-12 2018-03-23 南开大学 一种体外高效获得神经干细胞的方法
CN108103098B (zh) 2017-12-14 2020-07-28 华南理工大学 一种化合物皮肤致敏体外评估细胞模型及其构建方法
US20220238182A1 (en) 2017-12-15 2022-07-28 The Broad Institute, Inc. Systems and methods for predicting repair outcomes in genetic engineering
CN107988268A (zh) 2017-12-18 2018-05-04 湖南师范大学 一种基因敲除选育tcf25基因缺失型斑马鱼的方法
CN108018316A (zh) 2017-12-20 2018-05-11 湖南师范大学 一种基因敲除选育rmnd5b基因缺失型斑马鱼的方法
CN108048466B (zh) 2017-12-21 2020-02-07 嘉兴市第一医院 CRISPR-Cas13a系统特异性靶向人RSPO2基因的crRNA及系统和应用
RU2652899C1 (ru) 2017-12-28 2018-05-03 Федеральное бюджетное учреждение науки "Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора) РНК-проводники для подавления репликации вируса гепатита B и для элиминации вируса гепатита B из клетки-хозяина
CN107893080A (zh) 2017-12-29 2018-04-10 江苏省农业科学院 一种靶向大鼠Inhba基因的sgRNA及其应用
CN107988229B (zh) 2018-01-05 2020-01-07 中国农业科学院作物科学研究所 一种利用CRISPR-Cas修饰OsTAC1基因获得分蘖改变的水稻的方法
CN107988246A (zh) 2018-01-05 2018-05-04 汕头大学医学院 一种基因敲除载体及其斑马鱼胶质瘤模型
CN108103092B (zh) 2018-01-05 2021-02-12 中国农业科学院作物科学研究所 利用CRISPR-Cas系统修饰OsHPH基因获得矮化水稻的系统及其应用
CN108559760A (zh) 2018-01-09 2018-09-21 陕西师范大学 基于CRISPR靶向基因组修饰技术建立荧光素酶knock-in细胞系的方法
CN108148837A (zh) 2018-01-12 2018-06-12 南京医科大学 ApoE-CRISPR/Cas9载体及其在敲除ApoE基因中的应用
CN108559730B (zh) 2018-01-12 2021-09-24 中国人民解放军第四军医大学 利用CRISPR/Cas9技术构建Hutat2:Fc基因敲入单核细胞的实验方法
CN108251451A (zh) 2018-01-16 2018-07-06 西南大学 HTT的CRISPR/Cas9-gRNA打靶序列对、质粒及其应用
CN108251452A (zh) 2018-01-17 2018-07-06 扬州大学 一种表达Cas9基因的转基因斑马鱼及其构建方法和应用
CN108359712B (zh) 2018-02-09 2020-06-26 广东省农业科学院农业生物基因研究中心 一种快速高效筛选SgRNA靶向DNA序列的方法
CN108559745A (zh) 2018-02-10 2018-09-21 和元生物技术（上海）股份有限公司 基于CRISPR-Cas9技术提高B16F10细胞转染效率的方法
CN108359691B (zh) 2018-02-12 2021-09-28 中国科学院重庆绿色智能技术研究院 利用mito-CRISPR/Cas9系统敲除异常线粒体DNA的试剂盒及方法
CN108486145A (zh) 2018-02-12 2018-09-04 中国科学院遗传与发育生物学研究所 基于CRISPR/Cas9的植物高效同源重组方法
US12060586B2 (en) 2018-02-15 2024-08-13 The Broad Institute, Inc. Cell data recorders and uses thereof
CN109021111B (zh) 2018-02-23 2021-12-07 上海科技大学 一种基因碱基编辑器
WO2019168953A1 (en) 2018-02-27 2019-09-06 President And Fellows Of Harvard College Evolved cas9 variants and uses thereof
CN108396027A (zh) 2018-02-27 2018-08-14 和元生物技术（上海）股份有限公司 CRISPR-Cas9靶向敲除人肠癌细胞DEAF1基因及其特异性的sgRNA
CN108486159B (zh) 2018-03-01 2021-10-22 南通大学附属医院 一种敲除GRIN2D基因的CRISPR-Cas9系统及其应用
CN108342480B (zh) 2018-03-05 2022-03-01 北京医院 一种基因变异检测质控物及其制备方法
CN108410906A (zh) 2018-03-05 2018-08-17 淮海工学院 一种适用于海洋甲壳类线粒体基因组的CRISPR/Cpf1基因编辑方法
CN108410907B (zh) 2018-03-08 2021-08-27 湖南农业大学 一种基于CRISPR/Cas9技术实现HMGCR基因敲除的方法
CN108410911B (zh) 2018-03-09 2021-08-20 广西医科大学 基于CRISPR/Cas9技术构建的LMNA基因敲除的细胞系
CN108486146B (zh) 2018-03-16 2021-02-19 中国农业科学院作物科学研究所 LbCpf1-RR突变体用于CRISPR/Cpf1系统在植物基因编辑中的应用
CN108486108B (zh) 2018-03-16 2020-10-09 华南农业大学 一种敲除人hmgb1基因的细胞株及其应用
CN108384784A (zh) 2018-03-23 2018-08-10 广西医科大学 一种利用CRISPR/Cas9技术敲除Endoglin基因的方法
CN108410877A (zh) 2018-03-27 2018-08-17 和元生物技术（上海）股份有限公司 CRISPR-Cas9靶向敲除人细胞SANIL1基因及其特异性的sgRNA
CN108504685A (zh) 2018-03-27 2018-09-07 宜明细胞生物科技有限公司 一种利用CRISPR/Cas9系统同源重组修复IL-2RG缺陷基因的方法
CN108424931A (zh) 2018-03-29 2018-08-21 内蒙古大学 CRISPR/Cas9技术介导山羊VEGF基因定点整合的方法
CN108486234B (zh) 2018-03-29 2022-02-11 东南大学 一种crispr分型pcr的方法及其应用
CN108486111A (zh) 2018-04-04 2018-09-04 山西医科大学 CRISPR-Cas9靶向敲除人SMYD3基因的方法及其特异性sgRNA
CN108441520B (zh) 2018-04-04 2020-07-31 苏州大学 利用CRISPR/Cas9系统构建的基因条件性敲除方法
CN108504693A (zh) 2018-04-04 2018-09-07 首都医科大学附属北京朝阳医院 利用Crispr技术敲除T合酶基因构建的O-型糖基化异常的结肠癌细胞系
CN108753772B (zh) 2018-04-04 2020-10-30 南华大学 基于CRISPR/Cas技术敲除CAPNS1基因的人神经母细胞瘤细胞系的构建方法
CN108486154A (zh) 2018-04-04 2018-09-04 福州大学 一种唾液酸酶基因敲除小鼠模型的构建方法及其应用
CN108504657B (zh) 2018-04-12 2019-06-14 中南民族大学 利用crispr-cas9技术敲除hek293t细胞kdm2a基因的方法
CN108588182A (zh) 2018-04-13 2018-09-28 中国科学院深圳先进技术研究院 基于crispr-链取代的等温扩增及检测技术
CN108753817A (zh) 2018-04-13 2018-11-06 北京华伟康信生物科技有限公司 增强细胞的抗癌能力的方法及采用该方法获得的增强型细胞
CN108753832A (zh) 2018-04-20 2018-11-06 中山大学 一种利用CRISPR/Cas9编辑大白猪CD163基因的方法
CN108823248A (zh) 2018-04-20 2018-11-16 中山大学 一种利用CRISPR/Cas9编辑陆川猪CD163基因的方法
CN108588071A (zh) 2018-04-25 2018-09-28 和元生物技术（上海）股份有限公司 CRISPR-Cas9靶向敲除人肠癌细胞CNR1基因及其特异性的sgRNA
CN108707621B (zh) 2018-04-26 2021-02-12 中国农业科学院作物科学研究所 一种CRISPR/Cpf1系统介导的以RNA转录本为修复模板的同源重组方法
CN108588128A (zh) 2018-04-26 2018-09-28 南昌大学 一种高效率大豆CRISPR/Cas9系统的构建方法及应用
CN108546712B (zh) 2018-04-26 2020-08-07 中国农业科学院作物科学研究所 一种利用CRISPR/LbCpf1系统实现目的基因在植物中同源重组的方法
CN108642053A (zh) 2018-04-28 2018-10-12 和元生物技术（上海）股份有限公司 CRISPR-Cas9靶向敲除人肠癌细胞PPP1R1C基因及其特异性的sgRNA
CN108611364A (zh) 2018-05-03 2018-10-02 南京农业大学 一种非转基因crispr突变体的制备方法
CN108588123A (zh) 2018-05-07 2018-09-28 南京医科大学 CRISPR/Cas9载体组合在制备基因敲除猪的血液制品中的应用
CN108610399B (zh) 2018-05-14 2019-09-27 河北万玛生物医药有限公司 特异性增强crispr-cas系统在表皮干细胞中进行基因编辑效率的方法
CN108546717A (zh) 2018-05-15 2018-09-18 吉林大学 反义lncRNA介导顺式调控抑制靶基因表达的方法
CN108546718B (zh) 2018-05-16 2021-07-09 康春生 crRNA介导的CRISPR/Cas13a基因编辑系统在肿瘤细胞中的应用
CN108624622A (zh) 2018-05-16 2018-10-09 湖南艾佳生物科技股份有限公司 一种基于CRISPR-Cas9系统构建的能分泌小鼠白细胞介素-6的基因工程细胞株
CN108642055B (zh) 2018-05-17 2021-12-03 吉林大学 能有效编辑猪miR-17-92基因簇的sgRNA
CN108642090A (zh) 2018-05-18 2018-10-12 中国人民解放军总医院 基于CRISPR/Cas9技术获得Nogo-B敲除模式小鼠的方法及应用
CN108642077A (zh) 2018-05-18 2018-10-12 江苏省农业科学院 基于CRISPR/Cas9基因编辑技术选育绿豆不育突变体的方法及专用gRNA
CN108642078A (zh) 2018-05-18 2018-10-12 江苏省农业科学院 基于CRISPR/Cas9基因编辑技术选育绿豆开花传粉突变体的方法及专用gRNA
CN108559732A (zh) 2018-05-21 2018-09-21 陕西师范大学 基于CRISPR/Cas9靶向基因组修饰技术建立KI-T2A-luciferase细胞系的方法
CN108707620A (zh) 2018-05-22 2018-10-26 西北农林科技大学 一种Gene drive载体及构建方法
EP3797160A1 (en) 2018-05-23 2021-03-31 The Broad Institute Inc. Base editors and uses thereof
CN108690844B (zh) 2018-05-25 2021-10-15 西南大学 HTT的CRISPR/Cas9-gRNA打靶序列对、质粒及HD细胞模型
CN108823249A (zh) 2018-05-28 2018-11-16 上海海洋大学 CRISPR/Cas9构建notch1a突变体斑马鱼的方法
CN108707629A (zh) 2018-05-28 2018-10-26 上海海洋大学 斑马鱼notch1b基因突变体的制备方法
CN108707628B (zh) 2018-05-28 2021-11-23 上海海洋大学 斑马鱼notch2基因突变体的制备方法
CN108753835A (zh) 2018-05-30 2018-11-06 中山大学 一种利用CRISPR/Cas9编辑猪BMP15基因的方法
CN108707604B (zh) 2018-05-30 2019-07-23 江西汉氏联合干细胞科技有限公司 表皮干细胞中采用CRISPR-Cas系统进行CNE10基因敲除
CN108753836B (zh) 2018-06-04 2021-10-12 北京大学 一种利用rna干扰机制的基因调控或编辑系统
CN108715850B (zh) 2018-06-05 2020-10-23 艾一生命科技(广东)有限公司 表皮干细胞中采用CRISPR-Cas系统进行GING2基因敲除
CN108753813B (zh) 2018-06-08 2021-08-24 中国水稻研究所 获得无标记转基因植物的方法
CN108753783A (zh) 2018-06-13 2018-11-06 上海市同济医院 Sqstm1全基因敲除小鼠动物模型的构建方法和应用
WO2019241649A1 (en) 2018-06-14 2019-12-19 President And Fellows Of Harvard College Evolution of cytidine deaminases
CN108728486A (zh) 2018-06-20 2018-11-02 江苏省农业科学院 一种茄子CRISPR/Cas9基因敲除载体的构建方法和应用
CN108841845A (zh) 2018-06-21 2018-11-20 广东石油化工学院 一种带有筛选标记的CRISPR/Cas9载体及其构建方法
CN108893529A (zh) 2018-06-25 2018-11-27 武汉博杰生物医学科技有限公司 一种基于CRISPR技术特异性检测人KRAS基因2号及3号外显子突变的crRNA
CN108866093B (zh) 2018-07-04 2021-07-09 广东三杰牧草生物科技有限公司 一种利用CRISPR/Cas9系统对紫花苜蓿基因定点突变的方法
CN108913714A (zh) 2018-07-05 2018-11-30 江西省超级水稻研究发展中心 一种利用CRISPR/Cas9系统敲除BADH2基因创制香稻的方法
CN108795902A (zh) 2018-07-05 2018-11-13 深圳三智医学科技有限公司 一种安全高效的CRISPR/Cas9基因编辑技术
US20220033785A1 (en) 2018-07-09 2022-02-03 The Broad Institute, Inc. Rna programmable epigenetic rna modifiers and uses thereof
CN108913691B (zh) 2018-07-16 2020-09-01 山东华御生物科技有限公司 表皮干细胞中采用CRISPR-Cas系统进行Card3基因敲除
CN108913664B (zh) 2018-07-20 2020-09-04 嘉兴学院 一种CRISPR/Cas9基因编辑方法敲除卵巢癌细胞中CFP1基因的方法
CN108823291B (zh) 2018-07-25 2022-04-12 领航医学科技(深圳)有限公司 基于crispr技术的特异性核酸片段定量检测方法
CN108853133A (zh) 2018-07-25 2018-11-23 福州大学 一种PAMAM与CRISPR/Cas9系统重组质粒递送纳米粒的制备方法
KR20210053898A (ko) 2018-07-31 2021-05-12 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 신규 crispr 효소 및 시스템
CN108913717A (zh) 2018-08-01 2018-11-30 河南农业大学 一种利用CRISPR/Cas9系统对水稻PHYB基因定点突变的方法
EP3841203A4 (en) 2018-08-23 2022-11-02 The Broad Institute Inc. CAS9 VARIANTS WITH NON-CANONICAL PAM SPECIFICITIES AND USES OF THEM
JP2021534798A (ja) 2018-08-28 2021-12-16 フラッグシップ パイオニアリング イノベーションズ シックス，エルエルシー ゲノムを調節するための方法及び組成物
US20240173430A1 (en) 2018-09-05 2024-05-30 The Broad Institute, Inc. Base editing for treating hutchinson-gilford progeria syndrome
US20220380740A1 (en) 2018-10-24 2022-12-01 The Broad Institute, Inc. Constructs for improved hdr-dependent genomic editing
US20220389395A1 (en) 2018-10-29 2022-12-08 The Broad Institute, Inc. Nucleobase editors comprising geocas9 and uses thereof
US20220282275A1 (en) 2018-11-15 2022-09-08 The Broad Institute, Inc. G-to-t base editors and uses thereof
CN109517841B (zh) 2018-12-05 2020-10-30 华东师范大学 一种用于核苷酸序列修饰的组合物、方法与应用
WO2020154500A1 (en) 2019-01-23 2020-07-30 The Broad Institute, Inc. Supernegatively charged proteins and uses thereof
US20220177877A1 (en) 2019-03-04 2022-06-09 President And Fellows Of Harvard College Highly multiplexed base editing
WO2020181193A1 (en) 2019-03-06 2020-09-10 The Broad Institute, Inc. T:a to a:t base editing through adenosine methylation
WO2020181180A1 (en) 2019-03-06 2020-09-10 The Broad Institute, Inc. A:t to c:g base editors and uses thereof
WO2020181195A1 (en) 2019-03-06 2020-09-10 The Broad Institute, Inc. T:a to a:t base editing through adenine excision
WO2020181202A1 (en) 2019-03-06 2020-09-10 The Broad Institute, Inc. A:t to t:a base editing through adenine deamination and oxidation
WO2020181178A1 (en) 2019-03-06 2020-09-10 The Broad Institute, Inc. T:a to a:t base editing through thymine alkylation
AU2020242032A1 (en) 2019-03-19 2021-10-07 Massachusetts Institute Of Technology Methods and compositions for editing nucleotide sequences
US20220204975A1 (en) 2019-04-12 2022-06-30 President And Fellows Of Harvard College System for genome editing
WO2020214842A1 (en) 2019-04-17 2020-10-22 The Broad Institute, Inc. Adenine base editors with reduced off-target effects
WO2020236982A1 (en) 2019-05-20 2020-11-26 The Broad Institute, Inc. Aav delivery of nucleobase editors
WO2021025750A1 (en) 2019-08-08 2021-02-11 The Broad Institute, Inc. Base editors with diversified targeting scope
WO2021030666A1 (en) 2019-08-15 2021-02-18 The Broad Institute, Inc. Base editing by transglycosylation
WO2021072328A1 (en) 2019-10-10 2021-04-15 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for prime editing rna
WO2021108717A2 (en) 2019-11-26 2021-06-03 The Broad Institute, Inc Systems and methods for evaluating cas9-independent off-target editing of nucleic acids
US20230049737A1 (en) 2019-12-30 2023-02-16 The Broad Institute, Inc. Genome editing using reverse transcriptase enabled and fully active crispr complexes
EP4097124A1 (en) 2020-01-28 2022-12-07 The Broad Institute Inc. Base editors, compositions, and methods for modifying the mitochondrial genome
EP4100032A1 (en) 2020-02-05 2022-12-14 The Broad Institute Inc. Gene editing methods for treating spinal muscular atrophy
US20230123669A1 (en) 2020-02-05 2023-04-20 The Broad Institute, Inc. Base editor predictive algorithm and method of use
EP4100519A2 (en) 2020-02-05 2022-12-14 The Broad Institute, Inc. Adenine base editors and uses thereof
US20230127008A1 (en) 2020-03-11 2023-04-27 The Broad Institute, Inc. Stat3-targeted base editor therapeutics for the treatment of melanoma and other cancers
EP4143315A1 (en) 2020-04-28 2023-03-08 The Broad Institute Inc. <smallcaps/>? ? ?ush2a? ? ? ? ?targeted base editing of thegene
WO2021226558A1 (en) 2020-05-08 2021-11-11 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for simultaneous editing of both strands of a target double-stranded nucleotide sequence

Also Published As

Publication number Publication date
EP2734621B1 (en) 2019-09-04
US20150010526A1 (en) 2015-01-08
EP3613852A2 (en) 2020-02-26
AU2012333134B2 (en) 2017-05-25
CA2853829A1 (en) 2013-05-10
AU2012333134A1 (en) 2014-02-20
JP2014523747A (ja) 2014-09-18
WO2013066438A2 (en) 2013-05-10
EP2734621A4 (en) 2015-11-11
JP2020014466A (ja) 2020-01-30
WO2013066438A3 (en) 2013-08-15
JP6586136B2 (ja) 2019-10-02
US20140234289A1 (en) 2014-08-21
EP3613852A3 (en) 2020-04-22
CA2853829C (en) 2023-09-26
US9322006B2 (en) 2016-04-26
JP7054686B2 (ja) 2022-04-14
JP2018019694A (ja) 2018-02-08
US10323236B2 (en) 2019-06-18
US12006520B2 (en) 2024-06-11
US20200010818A1 (en) 2020-01-09
EP2734621A2 (en) 2014-05-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6586136B2 (ja) ヌクレアーゼ切断特異性の評価および改善
JP7227619B2 (ja) ヌクレアーゼプロファイリングシステム
JP6633524B2 (ja) 操作された転写活性化因子様エフェクター（ｔａｌｅ）ドメインおよびその使用
KR102425438B1 (ko) 서열결정에 의해 평가된 DSB의 게놈 전체에 걸친 비편향된 확인 (GUIDE-Seq)
US10640820B2 (en) Methods relating to the detection of recurrent and non-specific double strand breaks in the genome
Lin et al. Function and molecular mechanisms of APE2 in genome and epigenome integrity
KR20220084322A (ko) 세포에서 하나 이상의 표적-특이적인 프로그램 가능한 뉴클레아제의 오프-타겟 활성을 프로파일링하는 진정한 편향되지 않은 시험관내 분석(abnoba-seq)
Gao Combining CRISPR-Cas9 and Proximity Labeling to Illuminate Chromatin Composition, Organization, and Regulation

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20140709

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20150722

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20150722

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20160627

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20160927

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20161128

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20161227

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20170508

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20170808

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20171121

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20171212

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 6261500

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250