CN107326046A

CN107326046A - 一种提高外源基因同源重组效率的方法

Info

Publication number: CN107326046A
Application number: CN201610272812.0A
Authority: CN
Inventors: 韩红辉; 李大力; 刘明耀
Original assignee: Shanghai Bioray Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Shanghai Bioray Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2016-04-28
Filing date: 2016-04-28
Publication date: 2017-11-07

Abstract

本发明涉及一种利用CRISPR技术提高外源基因同源重组效率的方法，通过在目的基因组中导入切割效率至少15.4%的sgRNA、同源重组修复模板DNA和cas9的方法获得同源重组修复机制途径成功的转基因体。

Description

一种提高外源基因同源重组效率的方法

技术领域：

本发明属于基因编辑领域，尤其涉及CRISPR/Cas9系统和同源重组修复模板进行外源基因同源重组突变改造。

背景技术：

基因测序和全基因组技术的发展，对于研究基因表达、基因多态性和调控研究与特定基因、特定细胞功能和疾病状态的关联性提出了重大变革。这为研究基因组中编码和非编码序列的功能预测提供了便利。近年来，序列特异性的内切酶技术在模式动物精确基因编辑方面的应用取得了很大的进步，对我们对生物体发展和疾病研究起了很大的推动作用。

锌指核酸酶技术(Zinc-fingers)和转录激活因子样效应物核酸酶(TALENs)以及由RNA介导的CRISPR/Cas9核酸酶系统都已运用于基因编辑，在目的基因中引入所需要的突变，进而进一步的研究基因的功能已经运用于多物种。其中CRISPR/Cas9系统与其他基因组工程技术比较拥有以下技术优势：(1)无物种限制，靶向精确性高，可实现对靶基因多个位点同时敲除；(2)使用方便，费用更低，无论是锌指核酸酶技术(Zinc-fingers)还是转录激活因子样效应物核酸酶(TALENs)都需要针对不同靶点改变核酸酶前面的识别序列，这些识别序列的合成或者组装耗时费力且费用很高，但Cas9蛋白不具特异性，只需合成一个sgRNA就能实现对基因的特异性修饰；(3)CRISPR/Cas9系统只需要改变很短的RNA序列(不超过100bp)就可以实现不同位点的特异性识别，可避免超长、高度重复的TALENs编码载体带来的并发症。

CRISPR簇是一个广泛存在于细菌和古生菌基因组中的特殊DNA重复序列家族，其序列由一个前导区(Leader)、多个短而高度保守的重复序列区(Repeat)和多个间隔区(Spacer)组成。前导区一般位于CRISPR簇上游，是富含AT长度为300～500bp的区域，被认为可能是CRISPR簇的启动子序列。重复序列区长度为21～48bp，含有回文序列，可形成发卡结构。重复序列之间被长度为26～72bp的间隔区隔开。Spacer区域由俘获的外源DNA组成，类似免疫记忆，当含有同样序列的外源DNA入侵时，可被细菌机体识别，并进行剪切使之表达沉默，达到保护自身安全的目的。

目前发现的CRISPR/Cas系统有三种不同类型即I型、II型和III型，它们存在于大约40％已测序的真细菌和90％已测序的古细菌中。其中II型的组成较为简单，以Cas9蛋白以及向导RNA(sgRNA)为核心组成，也是目前研究中最深入的类型。

在II型系统中pre-crRNA的加工由Cas家族中的Cas9单独参与。Cas9含有在氨基末端的RuvC和蛋白质中部的HNH2个独特的活性位点，在crRNA成熟和双链DNA剪切中发挥作用。此外，pre-crRNA转录的同时，与其重复序列互补的反式激活crRNA(Trans-activatingcrRNA，tracrRNA)也转录出来，并且激发Cas9和双链RNA特异性RNase III核酸酶对pre-crRNA进行加工。加工成熟后，crRNA、tracrRNA和Cas9组成复合体，识别并结合于crRNA互补的序列，然后解开DNA双链，形成R-loop，使crRNA与互补链杂交，另一条链保持游离的单链状态，然后由Cas9中的HNH活性位点剪切crRNA的互补DNA链，RuvC活性位点剪切非互补链，最终引入DNA双链断裂(DSB)。CRISPR/Cas9的剪切位点位于crRNA互补序列下游邻近的PAM区(Protospacer Adjacent Motif)的5'-N20-NGG-3'特征区域中的NGG位点人们发现通过人工构建模拟crRNA：tracrRNA复合体的单链嵌合体引导RNA(guide RNA)，即可有效的介导Cas9蛋白对靶点的识别和切割，DNA双链断裂缺口(DSB)出现之后，细胞会启动非同源末端连接(nonhomologous end-joining，NHEJ)和同源重组修复机制(Homology-directedrepair，HDR)，NHEJ修复机制可以将断裂的DSB末端直接连接起来。由于在这种修复中不会用到同源模板链，所以在断裂处容易出现小的插入或者缺失突变，常常会导致移码突变，使基因的功能遭到破坏。HDR修复机制是以同源链为模板，对DSB进行修复。由于这种修复是以同源链作为模板，所以其保真度非常高，利用HDR可以插入一个或多个基因，也可以进行单碱基替换。CRISPR/Cas9系统目前已成为一个研究基因功能的有效工具，可以用来删除、添加、激活或抑制其他生物体的目标基因，CRISPR/Cas9系统可以适用于任何可以导入sgRNA的物种进行基因编辑，这些目标基因包括人、老鼠、斑马鱼、细菌、果蝇、酵母、线虫和农作物细胞内的基因。CRISPR/Cas9系统对靶向相同基因的不同sgRNA，其效率之间的差别可以达到10以上，并且CRISPR/Cas9介导的同源重组修复途径HDR的效率通常低于5.0％，并且在不同基因中很少能达到10％，不同结合位点的sgRNA设计在靶点处的切割效率是不同的，这种现象可能是多方面的原因造成的，比如sgRNA的二级结构，sgRNA和DNA结合复合物的热稳定性以及目的DNA的可及性有关。因此，sgRNA的设计对突变成功率有很大影响。

发明内容：

为了提高外源基因在目的基因组中同源重组效率，获得转基因突变体，本发明提供一种提高外源基因同源重组效率的方法，包括在目的基因组中导入cas9，靶向目的基因的sgRNA和同源重组修复模板DNA，其中所述sgRNA介导的Cas9对目的基因组PAM序列上游的切割效率至少为15.4％。Cas9系统中sgRNA可以靶向任何目的基因中5’-NGG-3’序列，其中3’端的NGG序列为前间区序列邻近基序(protospacer adjacent motif PAM)可以被Cas9蛋白特异性识别并切割，有研究结果表明NGG序列也可以是NAG序列，一旦结合，Cas9中两个独立的核酸酶结构域将会在PAM区上游～3bp对基因组DNA进行切割，造成DNA双链断裂(DSB)。

进一步的技术方案是，所述目的基因组的PAM序列为NGG或NAG。

进一步地，所述Cas9为Cas9mRNA或Cas9蛋白。将所述Cas9mRNA或Cas9蛋白导入目的基因组的切割效率比直接导入Cas9DNA的效率高。

进一步地，sgRNA和目的DNA互补的序列为17nt-22nt。CRISPR/Ca9的特异性是由sgRNA序列的5’端20nt的DNA序列决定的，Cas9/sgRNA复合物结合到与sgRNA的前17-20个核苷酸相匹配的双链DNA序列上，以NGG序列形式存在的的前间区序列邻近基序(protospaceradjacent motif,PAM)紧随在这一靶序列之后，也17nt-20nt所介导的突变效率大致相同，但是21nt和22nt的效率会显著减少。S.pyogenes系统的体外实验中能够容忍sgRNA 20bp序列中的前6个不匹配。

进一步地，所述sgRNA和目的DNA互补的序列为18nt-20nt。

进一步地，所述sgRNA和目的DNA互补的序列为18nt。

DSB可通过非同源末端连接(nonhomologous end-joining，NHEJ)信号通路或是同源重组修复机制(Homology-directed repair，HDR)来获得修复。NHEJ通常会在切割位点附近造成短插入/删除(indels)，而在提供外源模板DNA的情况下可以利用HDR将特异序列导入到切割位点。外源模板DNA有两种形式：单链DNA(ssDNA)，单链DNA可以合成至200nt，用于整合小的序列，比如在蛋白编码区整合一个多肽标记或者通过在蛋白质编码区突变特定氨基酸构建疾病模型或者是在非编码区突变特定序列以研究其功能；长双链DNA(dsDNA),双链DNA可以构建长达上百或者上千的同源臂序列。双链DNA的修复模板可以整合比较长的序列，同过这种方法在DNA的特定区域引入marker基因，比如GFP等。

通常，目的基因的修复模板包括需要改变或者需要插入的DNA序列，并在需要改变的序列左右两边加上与目的基因组相同的左右同源臂，左右同源臂的长度可以根据实验的要求进行调整，但是通常情况下长双链DNA(dsDNA修复模板所选用的同源臂通常大于500bp，有研究结果表明注射环状质粒作为修复模板可以减少非定点插入的几率，实验操作中也可以对环状质粒进行线性化后导入目的基因组进行同源重组修复；如果是选用单链DNA(ssDNA)作为修复模板，左右同源臂的长度至少为40bp，ssDNA可以是与目的基因相同的正义链或者是反义链。

进一步地，所述同源重组修复模板DNA为环状质粒或者线性化双链DNA。

进一步地，所述同源重组修复模板进行同义突变，同义突变后的DNA可以减少被Cas9再次切割的风险。

进一步地，所述同源重组修复模板DNA左右同源臂至少为500bp。

进一步地，所述同源重组修复模板DNA左右同源臂不对称。

进一步地，所述同源重组修复模板DNA为线性化单链DNA。

进一步地，所述同源重组修复模板进行同义突变。

进一步地，所述同源重组修复模板DNA左右同源臂至少为40bp。

进一步地，所述同源重组修复模板DNA左右同源臂不对称。

CRISPR/Cas9系统可以适用于任何可以导入sgRNA的物种进行基因编辑，这些目标基因包括人、老鼠、斑马鱼、细菌、果蝇、酵母、线虫和农作物细胞内的基因。所以进一步地，所述目的基因组为人、老鼠、斑马鱼、细菌、果蝇、酵母、线虫或农作物细胞内的基因。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是CRISPR/Cas9系统作用原理示意图。

图2是Cas9mRNA与sgRNA表达载体示意图。

图3是sgRNA体外转录模板的构建示意图。

图4是本发明实施例7的鉴定结果。

图5是本发明实施例8的鉴定结果。

图6是本发明实施例9的鉴定结果。

图7是本发明实施例9的鉴定结果。

具体实施例

下面将结合本发明的实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1 sgRNA体外转录模板的构建

对于任意一个欲靶向的靶点，需要设计并合成两条引物(图3)，其中一条依次含有用于体外转录的T7启动子序列，靶点特异性序列，以及sgRNA骨架序列的前一部分，另一条含有sgRNA骨架序列的其余部分。两条引物的3’端存在互补配对。使用这对引物进行PCR扩增即可得到用来体外转录的模板DNA。

实施例2 Cas9以及sgRNA的体外转录

PCR产物形式的sgRNA模板通过酚氯仿抽提和乙醇沉淀进行纯化，使用In vitro转录T7试剂盒进行转录，并通过酚氯仿抽提和异丙醇沉淀进行回收。使用NotI处理带有SP6启动子序列的pX260质粒(该质粒只有一个NotI酶切位点，位于Cas9下游的polyA序列之后)，使用mMESSAGESP6体外转录试剂盒进行体外转录，并通过氯化锂沉淀进行纯化回收。

实施例3 sgRNA/Cas9mRNA的显微注射

显微注射所使用的受精卵来自与同品系雄鼠交配后超排的母鼠。注射前将受精卵培养在KSOM胚胎培养基当中。用显微注射用TE缓冲液将针对目的基因的sgRNA、Cas9和DNA修复模板混合并稀释至12.5ng/ul的sgRNA、25ng/ul的Cas9以及10ng/ul的DNA修复模板。使用Eppendorf transferMan NK2显微操作装置将上述溶液通过显微注射针头注入单细胞期的受精卵胞核中。本发明实施例7和实施例8注射的为Cas9mRNA，实施例9注射的为Cas9蛋白。注射后的受精卵被立即或者经KSOM过夜培养后移植进假孕ICR母鼠。将以上母鼠饲养于12小时照明节律下，食物与饮水充足的无菌环境下。

实施例4 大鼠小鼠基因组鉴定DNA提取：

A、消化：大鼠或者小鼠出生约一周后，剪取0.5cm小鼠脚趾，放入1.5mlEP管中，加入500ul裂解液((裂解液：100mM Tris(pH8.0)，5mM EDTA(pH8.0)，0.5％SDS，NaCl 1.17g/100ml；)、0.5ul蛋白酶K(蛋白酶K(Proteinase K)：20mg/ml(溶解在pH7.4,20mM Tris和1mMCaCl2中,50％甘油缓冲液，-20℃保存)，混匀55℃水浴消化过夜；

B、酚氯仿抽提：取出EP管，来回颠倒混匀，12000rpm，离心10分钟吸上清400ul到新EP管中，加入等体积苯酚/氯仿，用力摇晃3min；12000rpm，离心5分钟。轻轻吸取上清至一新的1.5mlEP管中(宁可少吸，也不要吸到下层的苯酚或沉淀物)。向上清中加入等体积氯仿，用力摇晃2分钟；12000rpm，离心3分钟。吸取上清至另一新的1.5mlEP管中，加入1/10体积的醋酸钠溶液和2.5倍体积的无水乙醇，摇匀，-20℃放置约30min。4℃离心机上，12000rpm，离心10分钟，去上清，将EP管倒置在吸水纸上，以吸干乙醇。用无菌ddH2O,30ul溶解DNA，-20℃保存。

实施例5 PCR鉴定

针对靶点上下游约200～300bp区域分别设计正反向PCR引物。建立包含下列成分的50微升PCR反应体系：

使用下列循环条件进行扩增反应：

实施例6 测序分析

测序结果比对分析PCR产物测序后，通过chromas彩图看结果，如果是单峰，直接跟WT序列比对(DNAMAN软件)，看是WT还是纯合子；彩图为后双峰的，通过截图与WT序列比对，分析出mutant序列。

实施例7 Cyld点突变小鼠构建

Cyld小鼠野生型目的基因组序列(SEQ ID NO.1)：

ctccttccatgaactccttgtctagcgagaacagattctccttacccttcagcctgacaaagatgcccaatactaatggcagcatggctcatagtc

方框标注的为目的基因组的PAM序列

Cyld sgRNA引物序列(SEQ ID NO.2)：

GATCACTAATACGACTCACTATAGGAGGCTGAAGGGTAAGGAGGTTTTAGAGCTAGAAAT

Cyld小鼠第418位氨基酸由S突变为A的同源重组修复模板序列(SEQ ID NO.3)ctccttccatgaactccttgtctagcgagaacagattTcaTGCACtTccGttcagcctgacaaagatgcccaatactaatggcagcatggctcatagtc

大写字母无突变或同义突变碱基，修复模板为单链DNA(ssDNA)同源臂左臂为37bp，同源臂右臂为49bp。

Cyld小鼠基因型鉴定序列(SEQ ID NO.4)：

GAGATGAAGAAGAGAAACAAGGACAGACGTTATTTAGTCAGTAGGTTTGTAGTACTGTGAGCATACTTGCAAAGGGATCATGTGCTCAGTTAGACTAGATCTTTTTATTGTTTTTAGAGATACAAGCATATTTAATGTTCTTGAACAACTTTTTCTAATTAAGAACAATTTTTCATAGTTGCAGAAGACCCTGCAAAGTCACTTACAGAGATGTCTTCGGACTTCGGACATTCATCTCCTCCACCGCAGCCTCCTTCCATGAACTCCTTGTCTAGCGAGAACAGATTCCACTCCTTACCCTTCAGCCTGACAAAGATGCCCAATACTAATGGCAGCATGGCTCATAGTCCACTCTCTCTGTCAGTGCAGTCTGTGATGGGGGAGCTGAACAGCACACCTGTCCAGGAGAGTCCACCCTTGCCCATCTCTTCTGGGAATGCACACGGGCTAGAGGTGGGCTCACTGGCTGAAGTAAAAGAGAACCCCCCGTTCTATGGGGTTATCCGTTGGATTGGCCAGCCACCAGGGCTCAGTGACGTGCTAGCTGGACTGGAACTGGTAATTTAATTTGGCCAAAAATCTACAACTCTTTTCCTGCAT

Cyld S418A-F0代生13只，其中1#和8#小鼠被sgRNA介导的cas9蛋白切开，其余为野生型(WT)小鼠，切割效率约为15.4％，其中8#小鼠为构建成功的点突变小鼠(图4)。

实施例8 megf6小鼠插入cre大片段小鼠构建

megf6小鼠野生型目的基因组序列(SEQ ID NO.5)

CTGGGACTCTCGGTTGCAGAGAGAGGGAGCGCAAGTGAAATTGGAAAGCTTTAGGGGAAAGTACTGGGAAGCGAGCTTAGCCTTAAAGGTAGGACCAGGAGCCGGAGAGGGGAGGGGCTGAAGCGGGGCTGGAAGTGGGCTCTCCCTATTGGGATTGTCTGGGCGGGGCCGAAGGCGGAACGGGCGTGGCTTGGGCTGGGGGTGGGGCCAAAAGGGGCGGGAGCGGGGTCGGGAAAGAGGGGGCTGGGGTCGGGCCGGGGGGCGTGCGGCGGGCGGGCCTGACGTCTGCTGCGTCCCGCTCCGAGTTTGCTCTCCATCACTCCTGGCAAGTGTCTGGCCGCGCCGAACCGAGCGCGAAGGTCTCGGAGGTCCGGGCAACTGTCCCATCTGCACCTGCGGGAACCTCGCGCCCCGCACCTGGCGCGACTGGGTTGTGGTGCTCCGCTGTCCTCTGGGGGTATGGCGCCCGTGAAGACAGCGTCTACTGGCCGTAAGGGCCGCCTGTGAGTCGAAGATCCCAGGACCGAGTGGGAGCGCGACGCGCACTATGCCTGTCGGGGTGGAGGCGAGGGCGTCTTGGCGCGTGGTGGCCCTGACGCTGCTGCTGCTCCCCGCCGTGCCTGCAGCCTCCCAGCCGCTACCCCCGCGCCCGCTGCAGCCGAGCATGTGAGTAGCGCGAGTCGTGAGGCTCCTGGCGGCGAAGCTGACCCGGACAGAACTCGGGGCTTTGTCCCTGGGGCCACAAACAATGGGCTCTTTGCTTTAACTGAGGAGGGGATGGTCTAGACCCGGGGTCCCGGACTGGATTTGGTGCCCTCGAGTCTGCCGCAGGGCCCATAGCCTCCGGGTTCCCGCCCCTGCAGCAAGGGTCCTGCAGACTTAGACGGATGCCGAACTCCGGAGAGGTGAGGAATCCAAGCCCCTGCGGCGCAGGGTCCAGCTGGGGAGCCAGCTTGGAGGCGGCCGAGAGGAAGCAGCCTGGTCCCACTTCCTCCCCAAGCTAGTCTCCTGGGGTCCGAGGGCCTGCGCAGGGGCGGGGGTGCCCAGAGGGGGCTGCCAGCACTGTTTTGTGTGTTAAACACGTGCGCT

方框标注的为目的基因组的PAM序列

megf6sgRNA引物序列(SEQ ID NO.6)：

GATCACTAATACGACTCACTATAGGCGACAGGCATAGTGCGCGGTTTTAGAGCTAGAAAT

megf6小鼠插入cre大片段同源重组修复模板序列(SEQ ID NO.7)

CTGGGACTCTCGGTTGCAGAGAGAGGGAGCGCAAGTGAAATTGGAAAGCTTTAGGGGAAAGTACTGGGAAGCGAGCTTAGCCTTAAAGGTAGGACCAGGAGCCGGAGAGGGGAGGGGCTGAAGCGGGGCTGGAAGTGGGCTCTCCCTATTGGGATTGTCTGGGCGGGGCCGAAGGCGGAACGGGCGTGGCTTGGGCTGGGGGTGGGGCCAAAAGGGGCGGGAGCGGGGTCGGGAAAGAGGGGGCTGGGGTCGGGCCGGGGGGCGTGCGGCGGGCGGGCCTGACGTCTGCTGCGTCCCGCTCCGAGTTTGCTCTCCATCACTCCTGGCAAGTGTCTGGCCGCGCCGAACCGAGCGCGAAGGTCTCGGAGGTCCGGGCAACTGTCCCATCTGCACCTGCGGGAACCTCGCGCCCCGCACCTGGCGCGACTGGGTTGTGGTGCTCCGCTGTCCTCTGGGGGTATGGCGCCCGTGAAGACAGCGTCTACTGGCCGTAAGGGCCGCCTGTGAGTCGAAGATCCCAGGACCGAGTGGGAGCGCGACCGCGCGCACTATGAAGAAGAGGAAGGTGTCCAATTTACTGACCGTACACCAAAATTTGCCTGCATTACCGGTCGATGCAACGAGTGATGAGGTTCGCAAGAACCTGATGGACATGTTCAGGGATCGCCAGGCGTTTTCTGAGCATACCTGGAAAATGCTTCTGTCCGTTTGCCGGTCGTGGGCGGCATGGTGCAAGTTGAATAACCGGAAATGGTTTCCCGCAGAACCTGAAGATGTTCGCGATTATCTTCTATATCTTCAGGCGCGCGGTCTGGCAGTAAAAACTATCCAGCAACATTTGGGCCAGCTAAACATGCTTCATCGTCGGTCCGGGCTGCCACGACCAAGTGACAGCAATGCTGTTTCACTGGTTATGCGGCGGATCCGAAAAGAAAACGTTGATGCCGGTGAACGTGCAAAACAGGCTCTAGCGTTCGAACGCACTGATTTCGACCAGGTTCGTTCACTCATGGAAAATAGCGATCGCTGCCAGGATATACGTAATCTGGCATTTCTGGGGATTGCTTATAACACCCTGTTACGTATAGCCGAAATTGCCAGGATCAGGGTTAAAGATATCTCACGTACTGACGGTGGGAGAATGTTAATCCATATTGGCAGAACGAAAACGCTGGTTAGCACCGCAGGTGTAGAGAAGGCACTTAGCCTGGGGGTAACTAAACTGGTCGAGCGATGGATTTCCGTCTCTGGTGTAGCTGATGATCCGAATAACTACCTGTTTTGCCGGGTCAGAAAAAATGGTGTTGCCGCGCCATCTGCCACCAGCCAGCTATCAACTCGCGCCCTGGAAGGGATTTTTGAAGCAACTCATCGATTGATTTACGGCGCTAAGGATGACTCTGGTCAGAGATACCTGGCCTGGTCTGGACACAGTGCCCGTGTCGGAGCCGCGCGAGATATGGCCCGCGCTGGAGTTTCAATACCGGAGATCATGCAAGCTGGTGGCTGGACCAATGTAAATATTGTCATGAACTATATCCGTAACCTGGATAGTGAAACAGGGGCAATGGTGCGCCTGCTGGAAGATGGCGATTAGCCTGTCGGGGTGGAGGCGAGGGCGTCTTGGCGCGTGGTGGCCCTGACGCTGCTGCTGCTCCCCGCCGTGCCTGCAGCCTCCCAGCCGCTACCCCCGCGCCCGCTGCAGCCGAGCATGTGAGTAGCGCGAGTCGTGAGGCTCCTGGCGGCGAAGCTGACCCGGACAGAACTCGGGGCTTTGTCCCTGGGGCCACAAACAATGGGCTCTTTGCTTTAACTGAGGAGGGGATGGTCTAGACCCGGGGTCCCGGACTGGATTTGGTGCCCTCGAGTCTGCCGCAGGGCCCATAGCCTCCGGGTTCCCGCCCCTGCAGCAAGGGTCCTGCAGACTTAGACGGATGCCGAACTCCGGAGAGGTGAGGAATCCAAGCCCCTGCGGCGCAGGGTCCAGCTGGGGAGCCAGCTTGGAGGCGGCCGAGAGGAAGCAGCCTGGTCCCACTTCCTCCCCAAGCTAGTCTCCTGGGGTCCGAGGGCCTGCGCAGGGGCGGGGGTGCCCAGAGGGGGCTGCCAGCACTGTTTTGTGTGTTAAACACGTGCGCT

同源臂之间敲入的cre序列，修复模板为双链DNA(dsDNA)同源臂左右臂为500bp，同源重组修复模板未做同义突变。

megf6-cre F0代生7只，其中3#4#5#小鼠被sgRNA介导的cas9蛋白切开，其余为野生型(WT)小鼠，切割效率43％，其中1#小鼠为构建成功的cre插入小鼠(图5)。

实施例9myl4点突变大鼠构建

myl4大鼠野生型目的基因组序列(SEQ ID NO.8)：

CCCACGTCCACTGGAGATCCTAAGGCAGCATGCCTCCCAAGAAGCCTGAGCAGAAGACTGCCAAGGCAGCCGCAGCCCCTGCCCCAGCTCCTG方框标注的为目的基因组的PAM序列

myl4sgRNA引物序列1(SEQ ID NO.9)：

GATCACTAATACGACTCACTATAGGCCTTGGCAGTCTCCTTCTGTTTTAGAGCTAGAAAT

myl4sgRNA引物序列2(SEQ ID NO.10)：

GATCACTAATACGACTCACTATAGGAGAAGCCTGAGCCCAAGAGTTTTAGAGCTAGAAAT

myl4大鼠第11位氨基酸由E突变为K的同源重组修复模板序列(SEQ ID NO.11)：

CCCACGTCCACTGGAGATCCTAAGGCAGCATGCCTCCCAAGAAGCCTGAGCAGAAGACTGCCAAGGCAGCCGCAGCCCCTGCCCCAGCTCCTG未进行同义突变，修复模板为单链DNA(ssDNA)同源臂左臂为59bp，同源臂右臂为39bp。

myl4大鼠基因型鉴定序列(SEQ ID NO.12)：

GGAGGACGAACTGGTGACAATAATGAGATGTCAGCTGCACCCTGCTGGTGTCCCTTCCTTTTATAGTCAGCAGCAGTTGCTCCAGCTCTCACCAGCCCCTCTGTGGGGGCTCCTACCCAGAATAAAAGCAGGGGAAGGCCTTCCAGTCTCCCATCTTCCTCTCAGGAGCCACCTTTCCTCAGTTTTTAGGTCCCACGTCCACTGGAGATCCTAAGGCAGCATGCCTCCCAAGAAGCCTGAGCCCAAGAAGGAGACTGCCAAGGCAGCCGCAGCCCCTGCCCCAGCTCCTGCCCCAGCTCCCGAGCCCCTCAGGGACTCTGCCTTTGATCCCAAGAGTGTGAAGGTAAGTGAAGGCCAGCGCTGACGACAGTCAGGATCCTGTTTTTCCTGTTGCAGAGAGATCTATTCTCTCAGGCCAGAGATGAGAGCCATGACCTATAGCC

Myl4RAT E11K F0代大鼠生24只，其中10#13#14#23#被sgRNA介导的cas9蛋白切开，1#2#5#6#15#大鼠为构建成功的点突变小鼠其余为野生型(WT)小鼠，切割效率约为37.5％(图6，图7)。

序列表

<110> 上海邦耀生物科技有限公司

<120> 一种提高外源基因同源重组效率的方法

<160> 12

<210> 1

<211> 99

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 1

ctccttccat gaactccttg tctagcgaga acagattcca ctccttaccc ttcagcctga 60

caaagatgcc caatactaat ggcagcatgg ctcatagtc 99

<210> 2

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gatcactaat acgactcact ataggaggct gaagggtaag gaggttttag agctagaaat 60

<210> 3

<211> 99

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ctccttccat gaactccttg tctagcgaga acagatttca tgcacttccg ttcagcctga 60

caaagatgcc caatactaat ggcagcatgg ctcatagtc 99

<210> 4

<211> 600

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 4

gagatgaaga agagaaacaa ggacagacgt tatttagtca gtaggtttgt agtactgtga 60

gcatacttgc aaagggatca tgtgctcagt tagactagat ctttttattg tttttagaga 120

tacaagcata tttaatgttc ttgaacaact ttttctaatt aagaacaatt tttcatagtt 180

gcagaagacc ctgcaaagtc acttacagag atgtcttcgg acttcggaca ttcatctcct 240

ccaccgcagc ctccttccat gaactccttg tctagcgaga acagattcca ctccttaccc 300

ttcagcctga caaagatgcc caatactaat ggcagcatgg ctcatagtcc actctctctg 360

tcagtgcagt ctgtgatggg ggagctgaac agcacacctg tccaggagag tccacccttg 420

cccatctctt ctgggaatgc acacgggcta gaggtgggct cactggctga agtaaaagag 480

aaccccccgt tctatggggt tatccgttgg attggccagc caccagggct cagtgacgtg 540

ctagctggac tggaactggt aatttaattt ggccaaaaat ctacaactct tttcctgcat 600

<210> 5

<211> 1092

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 5

ctgggactct cggttgcaga gagagggagc gcaagtgaaa ttggaaagct ttaggggaaa 60

gtactgggaa gcgagcttag ccttaaaggt aggaccagga gccggagagg ggaggggctg 120

aagcggggct ggaagtgggc tctccctatt gggattgtct gggcggggcc gaaggcggaa 180

cgggcgtggc ttgggctggg ggtggggcca aaaggggcgg gagcggggtc gggaaagagg 240

gggctggggt cgggccgggg ggcgtgcggc gggcgggcct gacgtctgct gcgtcccgct 300

ccgagtttgc tctccatcac tcctggcaag tgtctggccg cgccgaaccg agcgcgaagg 360

tctcggaggt ccgggcaact gtcccatctg cacctgcggg aacctcgcgc cccgcacctg 420

gcgcgactgg gttgtggtgc tccgctgtcc tctgggggta tggcgcccgt gaagacagcg 480

tctactggcc gtaagggccg cctgtgagtc gaagatccca ggaccgagtg ggagcgcgac 540

cgcgcgcact atgcctgtcg gggtggaggc gagggcgtct tggcgcgtgg tggccctgac 600

gctgctgctg ctccccgccg tgcctgcagc ctcccagccg ctacccccgc gcccgctgca 660

gccgagcatg tgagtagcgc gagtcgtgag gctcctggcg gcgaagctga cccggacaga 720

actcggggct ttgtccctgg ggccacaaac aatgggctct ttgctttaac tgaggagggg 780

atggtctaga cccggggtcc cggactggat ttggtgccct cgagtctgcc gcagggccca 840

tagcctccgg gttcccgccc ctgcagcaag ggtcctgcag acttagacgg atgccgaact 900

ccggagaggt gaggaatcca agcccctgcg gcgcagggtc cagctgggga gccagcttgg 960

aggcggccga gaggaagcag cctggtccca cttcctcccc aagctagtct cctggggtcc 1020

gagggcctgc gcaggggcgg gggtgcccag agggggctgc cagcactgtt ttgtgtgtta 1080

aacacgtgcg ct 1092

<210> 6

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gatcactaat acgactcact ataggcgaca ggcatagtgc gcggttttag agctagaaat 60

<210> 7

<211> 2136

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ctgggactct cggttgcaga gagagggagc gcaagtgaaa ttggaaagct ttaggggaaa 60

gtactgggaa gcgagcttag ccttaaaggt aggaccagga gccggagagg ggaggggctg 120

aagcggggct ggaagtgggc tctccctatt gggattgtct gggcggggcc gaaggcggaa 180

cgggcgtggc ttgggctggg ggtggggcca aaaggggcgg gagcggggtc gggaaagagg 240

gggctggggt cgggccgggg ggcgtgcggc gggcgggcct gacgtctgct gcgtcccgct 300

ccgagtttgc tctccatcac tcctggcaag tgtctggccg cgccgaaccg agcgcgaagg 360

tctcggaggt ccgggcaact gtcccatctg cacctgcggg aacctcgcgc cccgcacctg 420

gcgcgactgg gttgtggtgc tccgctgtcc tctgggggta tggcgcccgt gaagacagcg 480

tctactggcc gtaagggccg cctgtgagtc gaagatccca ggaccgagtg ggagcgcgac 540

cgcgcgcact atgaagaaga ggaaggtgtc caatttactg accgtacacc aaaatttgcc 600

tgcattaccg gtcgatgcaa cgagtgatga ggttcgcaag aacctgatgg acatgttcag 660

ggatcgccag gcgttttctg agcatacctg gaaaatgctt ctgtccgttt gccggtcgtg 720

ggcggcatgg tgcaagttga ataaccggaa atggtttccc gcagaacctg aagatgttcg 780

cgattatctt ctatatcttc aggcgcgcgg tctggcagta aaaactatcc agcaacattt 840

gggccagcta aacatgcttc atcgtcggtc cgggctgcca cgaccaagtg acagcaatgc 900

tgtttcactg gttatgcggc ggatccgaaa agaaaacgtt gatgccggtg aacgtgcaaa 960

acaggctcta gcgttcgaac gcactgattt cgaccaggtt cgttcactca tggaaaatag 1020

cgatcgctgc caggatatac gtaatctggc atttctgggg attgcttata acaccctgtt 1080

acgtatagcc gaaattgcca ggatcagggt taaagatatc tcacgtactg acggtgggag 1140

aatgttaatc catattggca gaacgaaaac gctggttagc accgcaggtg tagagaaggc 1200

acttagcctg ggggtaacta aactggtcga gcgatggatt tccgtctctg gtgtagctga 1260

tgatccgaat aactacctgt tttgccgggt cagaaaaaat ggtgttgccg cgccatctgc 1320

caccagccag ctatcaactc gcgccctgga agggattttt gaagcaactc atcgattgat 1380

ttacggcgct aaggatgact ctggtcagag atacctggcc tggtctggac acagtgcccg 1440

tgtcggagcc gcgcgagata tggcccgcgc tggagtttca ataccggaga tcatgcaagc 1500

tggtggctgg accaatgtaa atattgtcat gaactatatc cgtaacctgg atagtgaaac 1560

aggggcaatg gtgcgcctgc tggaagatgg cgattagcct gtcggggtgg aggcgagggc 1620

gtcttggcgc gtggtggccc tgacgctgct gctgctcccc gccgtgcctg cagcctccca 1680

gccgctaccc ccgcgcccgc tgcagccgag catgtgagta gcgcgagtcg tgaggctcct 1740

ggcggcgaag ctgacccgga cagaactcgg ggctttgtcc ctggggccac aaacaatggg 1800

ctctttgctt taactgagga ggggatggtc tagacccggg gtcccggact ggatttggtg 1860

ccctcgagtc tgccgcaggg cccatagcct ccgggttccc gcccctgcag caagggtcct 1920

gcagacttag acggatgccg aactccggag aggtgaggaa tccaagcccc tgcggcgcag 1980

ggtccagctg gggagccagc ttggaggcgg ccgagaggaa gcagcctggt cccacttcct 2040

ccccaagcta gtctcctggg gtccgagggc ctgcgcaggg gcgggggtgc ccagaggggg 2100

ctgccagcac tgttttgtgt gttaaacacg tgcgct 2136

<210> 8

<211> 99

<212> DNA

<213> Rattus norvegicus

<400> 8

cccacgtcca ctggagatcc taaggcagca tgcctcccaa gaagcctgag cccaagaagg 60

agactgccaa ggcagccgca gcccctgccc cagctcctg 99

<210> 9

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gatcactaat acgactcact ataggccttg gcagtctcct tctgttttag agctagaaat 60

<210> 10

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gatcactaat acgactcact ataggagaag cctgagccca agagttttag agctagaaat 60

<210> 11

<211> 99

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

cccacgtcca ctggagatcc taaggcagca tgcctcccaa gaagcctgag cccaagaaga 60

agactgccaa ggcagccgca gcccctgccc cagctcctg 99

<210> 12

<211> 443

<212> DNA

<213> Rattus norvegicus

<400> 12

ggaggacgaa ctggtgacaa taatgagatg tcagctgcac cctgctggtg tcccttcctt 60

ttatagtcag cagcagttgc tccagctctc accagcccct ctgtgggggc tcctacccag 120

aataaaagca ggggaaggcc ttccagtctc ccatcttcct ctcaggagcc acctttcctc 180

agtttttagg tcccacgtcc actggagatc ctaaggcagc atgcctccca agaagcctga 240

gcccaagaag gagactgcca aggcagccgc agcccctgcc ccagctcctg ccccagctcc 300

cgagcccctc agggactctg cctttgatcc caagagtgtg aaggtaagtg aaggccagcg 360

ctgacgacag tcaggatcct gtttttcctg ttgcagagag atctattctc tcaggccaga 420

gatgagagcc atgacctata gcc 443

Claims

1.一种提高外源基因同源重组效率的方法，包括在目的基因组中导入cas9 ，靶向目的基因的sgRNA和同源重组修复模板DNA，其特征在于，所述sgRNA介导的Cas9对目的基因组PAM序列上游的切割效率至少为15.4%。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述目的基因组的PAM序列为NGG或NAG。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述Cas9为Cas9 mRNA或Cas9蛋白。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述sgRNA和目的DNA互补的序列为17nt-22nt。

5.如权利要求4述的方法，其特征在于所述sgRNA和目的DNA互补的序列为18nt-20nt。

6.如权利要求5述的方法，其特征在于所述sgRNA和目的DNA互补的序列为18nt。

7.如权利要求1至6中任一所述的方法，其特征在于所述同源重组修复模板DNA为环状质粒或者线性化双链DNA。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于所述同源重组修复模板进行同义突变。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于所述同源重组修复模板DNA左右同源臂至少为500bp。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于所述同源重组修复模板DNA左右同源臂不对称。

11.如权利要求1至6中任一所述的方法，其特征在于所述同源重组修复模板DNA为线性化单链DNA。

12.如权利要求11所述的方法，其特征在于所述同源重组修复模板进行同义突变。

13.如权利要求12所述的方法，其特征在于所述同源重组修复模板DNA左右同源臂至少为40bp。

14.如权利要求13所述的方法，其特征在于所述同源重组修复模板DNA左右同源臂不对称。

15.如权利要求1至6中任一所述的方法，其特征在于所述目的基因组为人、老鼠、斑马鱼、细菌、果蝇、酵母、线虫或农作物细胞内的基因。

16.如权利要求7中所述的方法，其特征在于所述目的基因组为人、老鼠、斑马鱼、细菌、果蝇、酵母、线虫或农作物细胞内的基因。

17.如权利要求8中所述的方法，其特征在于所述目的基因组为人、老鼠、斑马鱼、细菌、果蝇、酵母、线虫或农作物细胞内的基因。

18.如权利要求9中所述的方法，其特征在于所述目的基因组为人、老鼠、斑马鱼、细菌、果蝇、酵母、线虫或农作物细胞内的基因。

19.如权利要求10中所述的方法，其特征在于所述目的基因组为人、老鼠、斑马鱼、细菌、果蝇、酵母、线虫或农作物细胞内的基因。

20.如权利要求11中所述的方法，其特征在于所述目的基因组为人、老鼠、斑马鱼、细菌、果蝇、酵母、线虫或农作物细胞内的基因。

21.如权利要求12中所述的方法，其特征在于所述目的基因组为人、老鼠、斑马鱼、细菌、果蝇、酵母、线虫或农作物细胞内的基因。

22.如权利要求13中所述的方法，其特征在于所述目的基因组为人、老鼠、斑马鱼、细菌、果蝇、酵母、线虫或农作物细胞内的基因。