CN104109687A - 运动发酵单胞菌CRISPR-Cas9系统的构建与应用 - Google Patents
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Abstract
构建CRISPR-Cas系统表达质粒pSUZM1a-Cas9，pSUZM2a-Cas9，pSUZM3a-Cas9，包含运动发酵单胞菌内源性基因启动子、筛选标记基因和CRISPR系统的Cas9基因。构建表达质粒pUC-T7sgRNA，含复制起点、筛选标记基因、T7基因启动子和终止子、BbsI识别序列和crRNA-tracrRNA序列。设计相应的靶序列，DNA模板经T7RNA聚合酶体外转录，经纯化后获得的sgRNA与Cas9基因表达质粒共电转化大肠杆菌和Z.mobilisZM4。结果表明，利用CRISPR技术能够成功敲除大肠杆菌DH5α的upp基因、有效地消除运动单胞菌中的天然质粒。在研究过程中所建立的Cas9基因表达质粒、sgRNA表达质粒以及成套研究方法可以广泛地用于运动发酵单胞菌基因组中基因的敲除，具有很好的市场应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及运动发酵单胞菌CRISPR-Cas9表达质粒pSUZM1a-Cas9、pSUZM2a-Cas9、pSUZM3a-Cas9、pUC-T7sgRNA的构建以及CRISPR-Cas9系统在大肠杆菌和运动发酵单胞菌中的应用，属于基因工程技术领域。
背景技术
运动发酵单胞菌具有乙醇产率高，吸收糖效率高；酸和乙醇耐受性强；发酵时无需控制加氧；耐高渗透压；基因组小（约2Mbp），易于开展基因（组）工程（gene or genome engineering）育种等诸多优点。但是，目前运动发酵单胞菌未能大规模地、广泛应用于乙醇发酵生产，主要限制因素为：其不能将纤维素、半纤维素和淀粉等复杂的碳水化合物多聚体转化为乙醇；产生多种副产物，如山梨醇、3-羟基丁酮、甘油、乙醛及乙酸、胞外果聚糖等。此外，运动发酵单胞菌含有的天然质粒较多，如Z.mobilis ZM4中就有5个天然质粒，总长度约为138kb，占该菌染色体长度的6.7%。大量天然质粒的存在，使细菌在生长时浪费了大量的能量和脱氧核苷酸用于质粒的复制，而质粒上存在的多个基因及其编码的蛋白质参与了一些生化反应，其产物可能又会污染环境。
CRISPR（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats）称为“成簇规则间隔的短回文重复序列”（简称为CRISPR），是Janse等人于2002年在详细比较和分析各种原核生物基因组后发现了这种重复序列，同时还发现在此重复序列的旁侧经常伴随出现保守的基因。根据重复序列的排列特征，他们将这种独特的重复序列命名为CRISPR，保守基因编码的蛋白质统称为CRISPR附属蛋白（Cas，CRISPR-association proteins）。研究发现在CRISPR位点的转录产物crRNA (CRISPR RNA)较基因序列短，是经过核酸酶修饰加工后产生的，而Cas蛋白往往包含核酸结合、切割、修饰的功能域，所以人们推断CRISPR-Cas系统可能与DNA复制、修复等DNA代谢有关。
CRISPR-Cas9编辑技术主要由两个部分组成：靶序列sgRNA（single-guide RNA）和Cas9蛋白质。sgRNA分子是由两段序列构成：1）靶序列长度为20nt，它必须位于PAM序列之前，需要自行设计；2）crRNA-tracrRNA，该序列实际上是把CRISPR基因中的同向重复序列（directed repeat）和tracrRNA用4个碱基GAAA连接在一起，以便形成可以为Cas9蛋白质识别的茎环结构。sgRNA分子可以通过体外或体内转录而成，Cas9基因则是用相应的表达质粒导入细胞内产生。
当把sgRNA和Cas9基因表达质粒共转化受体细胞后，sgRNA通过靶序列与基因对应的互补序列配对，sgRNA中的其他序列则形成茎环结构，此结构能为Cas9所识别，然后在PAM（Protospacer-Adjacent Motif）序列上游2-3碱基间将靶基因的DNA双链切断。断裂的双链DNA可以经过两种修复机制产生Indel突变或基因编辑：在非同源末端连接NHEJ（Non-homologous End Joining）修复机制下，断裂的双链DNA经过DNA修复和重新连接，从而产生随机的Indel突变。若突变发生在编码区内，会导致码组移动（frameshift），造成编码区提前出现终止密码子。如果在转化时同时导入新的DNA模板（质粒DNA，双链DNA，单链寡聚核苷酸single strand oligonucleotide, ssODN），断裂的双链DNA就可以通过HDR（homology-directed repair）途径进行准确的基因组重组。综上所述，细菌中内源性质粒的消除也可采用CRISPR-Cas9编辑技术。常规的质粒消除方法有物理、化学等方法，这些方法的效率并不高，而且实验过程比较复杂。CRISPR-Cas技术可以用于任何细菌内源质粒的消除，具有极高的应用价值；敲除了天然质粒的运动发酵单胞菌，可以更好地用于燃料乙醇发酵的研究和生产；此方法可以应用于运动发酵单胞菌染色体基因的敲出和敲入，建立各种基因工程菌。
发明内容
本发明的目的是提供运动发酵单胞菌中CRISPR-Cas9系统表达质粒pSUZM1a-Cas9、pSUZM2a-Cas9、 pSUZM3a-Cas9和pUC-T7sgRNA的构建。
本发明提供的运动发酵单胞菌中CRISPR-Cas9系统表达质粒分别命名为pSUZM1a-Cas9、pSUZM2a-Cas9、pSUZM3a-Cas9、pUC-T7sgRNA。
其中pSUZM1a-Cas9包含运动发酵单胞菌染色体上复制起点oriC、质粒pUC18上的复制起点、卡那霉素筛选标记基因、运动发酵单胞菌丙酮酸脱羧酶pdc基因的启动子Ppdc，来自于化脓性链球菌（Streptococcus）CICC10464的Cas9基因。
其中pSUZM2a-Cas9包含运动发酵单胞菌内源性质粒pZZM401的复制蛋白序列、质粒pUC18上的复制起点、卡那霉素筛选标记基因、运动发酵单胞菌丙酮酸脱羧酶pdc基因的启动子Ppdc，来自于化脓性链球菌CICC 10464的Cas9基因。
其中pSUZM3a-Cas9包含运动发酵内源性质粒pZZM402上的复制蛋白序列、质粒pUC18上的复制起点、卡那霉素筛选标记基因、运动发酵单胞菌丙酮酸脱羧酶pdc基因的启动子Ppdc，来自于化脓性链球菌CICC10464的Cas9基因。
pUC-T7sgRNA包含质粒pUC19上的复制起点、氨苄青霉素筛选标记基因、T7基因启动子和终止子、BbsI识别序列和crRNA-tracrRNA序列。
本发明所提供的pSUZM1a-Cas9、pSUZM2a-Cas9、pSUZM3a-Cas9载体的构建方法，包括如下步骤：
1）以运动发酵单胞菌表达载体pSUZM1a、pSUZM2a、pSUZM3a为模板，用以下引物5‘-CTAGGAGGTGACTGAAGGTAGCTTGCAGTGGG-3’和5‘-GAGTATTTCTTATCCATTGCTTACTCCATATAT-3’,进行PCR扩增，获得载体骨架片段A(pSUZM1a)、B(pSUZM2a)和C（pSUZM3a）.
2)以化脓性链球菌CICC10464 为模板，用以下引物5‘-ATATATGGAGTAAGCAATGGATAAGAAATACTC-3’和5‘-CCCACTGCAAGCTACCT TCAGTCACCTCCTAG-3’, 进行PCR扩增，获得基因片段Cas9。
3）分别将载体骨架片段A、B、C和基因片段Cas9经电泳凝胶回收后等摩尔混合，混合片段用T4 DNA聚合酶进行处理，然后进行退火反应重组，转化大肠杆菌，获得重组载体pSUZM1a-Cas9、pSUZM2a-Cas9、pSUZM3a-Cas9。
本发明目的提供运动发酵单胞菌表达质粒pUC-T7sgRNA构建方法：
1）T7sgRNA基因的设计：人工合成一段双链DNA，全长为177bp，包含T7基因启动子和终止子、BbsI识别序列和crRNA-tracrRNA序列，序列两端分别为HindIII和EcoRI位点。
T7sgRNA基因序列如下所示：
GGAAGCTTAA TACGACTCAC TATAGGTCTT CGAGAAGACC TGTTTTAGAG CTAGAAATAG CAAGTTAAAA TAAGGCTAGT CCGTTATCAA CTTGAAAAAG TGGCACCGAG TCGGTGCTTT TTCTAGCATA ACCCCTTGGG GCCTCTAAAC GGGTCTTGAG GGGTTTTTTG AATTCCC
2）质粒pUC19和T7sgRNA基因片段分别采用HindIII和EcoRI进行双酶切。
3）酶切后产物进行T4 DNA ligase连接，转化大肠杆菌，获得表达质粒pUC-T7sgRNA。
本发明的运动发酵单胞菌CRISPR-Cas9系统表达质粒可以用于运动发酵单胞菌基因组编辑，具有很好的应用前景。
附图说明
图1 pUC-T7sgRNA 基因表达质粒的物理图谱。
图2表达质粒pSUZM1a-Cas9的构建策略。
图3表达质粒pSUZM2a-Cas9的构建策略。
图4表达质粒pSUZM3a-Cas9的构建策略。
图5构建表达质粒pSUZM1a-Cas9、pSUZM2a-Cas9、pSUZM3a-Cas9的PCR片段电泳A: M, λEcoT14 DNA marker, 1: pSUZM1a载体骨架; 2: Cas9基因；B: M, λEcoT14 DNA marker, 1: pSUZM2a载体骨架; 2: Cas9基因；C: M, λEcoT14 DNA marker, 1: pSUZM3a载体骨架; 2: Cas9基因。
图6表达质粒pSUZM1a-Cas9、pSUZM2a-Cas9、pSUZM3a-Cas9的酶切鉴定A: M, λEcoT14 DNA marker, 1: pSUZM1a-KpnI; 2: pSUZM1a-Cas9-KpnI; B: M, λEcoT14 DNA marker, 1: pSUZM2a-KpnI; 2: pSUZM2a-Cas9-KpnI; C: M, λEcoT14 DNA marker, 1: pSUZM3a-KpnI; 2: pSUZM3a-Cas9-KpnI。
图7表达质粒pSUZM1a-Cas9，pSUZM2a-Cas9，pSUZM3a-Cas9的PCR鉴定 M, λEcoT14 DNA marker, 1: pSUZM1a-Cas9; 2: pSUZM2a-Cas9; 3: pSUZM3a-Cas9; 4: 阴性对照。
图8 upp靶序列重组质粒转化子的正反向引物PCR扩增M, DL1000 DNA marker, 1: pUC-upp1重组子(pUC19上游/upp1下游);2:对照菌株(pUC19上游/upp1下游);3: pUC-upp1重组菌(upp1上游/pUC19下游);4:对照菌株(upp1上游/pUC19下游);5:pUC-upp2重组子(pUC19上游/upp2下游);6:对照菌株(pUC19上游/upp2下游);7: pUC-upp2重组菌(upp2上游/pUC19下游);4:对照菌株(upp2上游/pUC19下游)。
图9 upp-sgRNA转录模板纯化后电泳检测M, λEcoT14 DNA marker; 1: pUC-upp1; 2: pUC-upp2。
图10 upp转录和纯化后的sgRNA电泳检测1: pUC-upp1; 2: pUC-upp2。
图11载体pSUZM2a-Cas9/upp转化子PCR验证电泳检测M, DL1000 DNA marker，1-10：转化子；11：阴性对照。
图12 5号样品与野生型测序结果比对。
图135号样品与野生型测序结果图谱 A： 5号样品测序结果图谱 B：野生型测序结果图谱。
图14 Z.mobilisZM4质粒中DNA复制酶编码区同源性分析。
图15靶序列重组质粒转化子的正反向引物PCR扩增A：靶序列重组质粒转化子的正向引物pUC19上游/ZM401-1下游, pUC19上游/ZM401-3下游, pUC19上游/ZM402345-1下游, pUC19上游/ZM402345-1下游PCR扩增 B：靶序列重组质粒转化子的反向引物pUC19下游/ZM401-1上游, pUC19下游/ZM401-3上游, pUC19下游/ZM402345-1上游, pUC19下游/ZM402345-1上游PCR扩增各泳道重组质粒转化子的靶序列：（1-2道）ZM401-1;（3-5道）ZM401-3;（6道）ZM402345-1; （7道）ZM 402345-3; M: DL1000分子量标准物。
图16 sgRNA转录模板纯化后电泳检测各泳道的靶序列模板：（1道）ZM401-1;（2道）ZM401-3;（3道）ZM402345-1; （4道）402345-3; M: DL1000分子量标准物。
图17转录和纯化后的sgRNA电泳检测各泳道的靶sgRNA：（1道）ZM401-1;（2道）ZM401-3;（3道）ZM402345-1; （4道）402345-3。
图18 Z. mobilisZM4内源性质粒的PCR鉴定 1: pZZM401; 2: pZZM402; 3: pZZM403; 4: pZZM404; 5: pZZM405; M: DL1000。
图19质粒pZZM403被敲除的菌落PCR筛选各道PCR产物：通用引物pZM4-GF与pZM403-R配对
图20 1-4号敲除菌株的PCR鉴定 A：1号敲除菌株的PCR鉴定 B：2-4号敲除菌株的PCR鉴定，第1-5道：2号菌株；第6-10道：3号菌株；第11-15道：4号菌株。各道PCR产物使用的引物1、6、11道:通用引物pZM4-GF与pZM401-R配对；2、7、12道：通用引物pZM4-GF与pZM402-R配对；3、8、13道：通用引物pZM4-GF与pZM403-R配对；4、9、14道：通用引物pZM4-GF与pZM404-R配对; 5、10、15道:染色体引物；M: λEcoT14。
图21 pZZM403质粒被敲除的PCR检测a、b、c分别是2-4号菌株（1-5道）和对照菌株ZM4(6-10道)PCR扩增产物各道的PCR引物是1、6道:01-testF/R; 2、7道: 02-testF/R; 3、8道: 03-testF/R; 4、9道: 04-testF/R; 5、10道:pdcDLF/R；M: DL1000分子量标准物。
具体实施方式
实例1 表达质粒pUC-T7sgRNA构建
1）T7sgRNA基因的设计：人工合成一段双链DNA，全长为177bp，包含T7基因启动子和终止子、BbsI识别序列和crRNA-tracrRNA序列，序列两端分别为HindIII和EcoRI位点。
T7sgRNA基因序列如下所示：
GGAAGCTTAA TACGACTCAC TATAGGTCTT CGAGAAGACC TGTTTTAGAG CTAGAAATAG CAAGTTAAAA TAAGGCTAGT CCGTTATCAA CTTGAAAAAG TGGCACCGAG TCGGTGCTTT TTCTAGCATA ACCCCTTGGG GCCTCTAAAC GGGTCTTGAG GGGTTTTTTG AATTCCC
2）质粒pUC19和T7sgRNA基因片段分别采用HindIII和EcoRI进行双酶切
3）酶切后产物进行T4 DNA ligase连接，转化大肠杆菌，获得表达质粒pUC-T7sgRNA（见图1）。
实例2表达质粒pSUZM1a-Cas9、pSUZM2a-Cas9、pSUZM3a-Cas9的构建
表达质粒pSUZM1a-Cas9、pSUZM2a-Cas9、pSUZM3a-Cas9的构建的策略见图2、图3、图4。
1) 设计引物1V-Cas9上游，1V-Cas9下游；引物Cas9-1上游，引物Cas9-1 下游；具体序列如下：
1V-Cas9上游：5’-CTAGGAGGTGACTGAAGGTAGCTTGCAGTGGG-3’
1V-Cas9下游：5’-GAGTATTTCTTATCCATTGCTTACTCCATATAT-3’
Cas9-1上游：5’-ATATATGGAGTAAGCA ATGGATAAGAAATACTC-3’
Cas9-1下游：5’-CCCACTGCAAGCTACCT TCAGTCACCTCCTAG-3’
2)分别以质粒pSUZM1a、pSUZM2a、pSUZM3a为模板，用引物1V-Cas9上游和1V-Cas9 下游扩增载体骨架片段A、B、C；以化脓性链球菌CICC10464为模板；用引物Cas9-1 上游和Cas9-1 下游扩增Cas9基因片段。
PCR反应体系：2×PCR buffer 25μL，上游引物 1.5μL，下游引物 1.5μL，模板DNA 1 μL，加水至50μL。
载体骨架片段A、B、C的PCR反应条件：98℃变性10 s，68℃延伸2min，共30个循环，72℃最后延伸5min。
Cas9基因的PCR反应条件：98℃变性10 s，68℃延伸1min，共30个循环，72℃最后延伸2min。
结果显示，载体骨架片段A的PCR产物大小为3.3kb（图5A）、载体骨架片段B的PCR产物大小为5.0kb（图5B）和载体骨架片段C的PCR产物大小为4.6kb(图5C)，与预期结果相符。Cas9基因的PCR产物大小为4.1 kb（图5A、图5B、图5C），与预期结果相符。
3）PCR产物用DNA回收试剂盒回收，方法参考其说明书。
4）片段不依赖基因序列和连接反应克隆(SLIC)，具体步骤如下：
在3个（编号为1、2、3）0.5mL的EP管中，加入4 μL 5 X T4 DNA 聚合酶缓冲液（Fermentas），0.1 μLT4 DNA 聚合酶（5 U/μL Fermentas）；1号管再加入1μL A片段、1 μL Cas9基因片段；2号管再加入1μL B片段、1 μL Cas9基因片段；3号管再加入1μL C片段、1 μL Cas9基因片段，3管都分别加ddH2O 到20 μL。
37℃孵育6 min，然后将EP管置于70℃的水浴中孵育10min，终止反应。取8 μL上述T4 DNA 聚合酶处理的DNA到另外一个新的0.5mL EP管，加入2 μL 10 X 退火缓冲液，10 μL ddH2O。将混合物置于75℃的水浴中反应15min，然后自然冷却至室温。取5μL产物转化大肠杆菌。挑选单克隆提取质粒，质粒分别命名为pSUZM1a-Cas9, pSUZM2a-Cas9, pSUZM3a-Cas9。
实例2表达质粒pSUZM1a-Cas9, pSUZM2a-Cas9, pSUZM3a-Cas9的酶切和PCR验证
1) 表达质粒pSUZM1a-Cas9、pSUZM2a-Cas9, pSUZM3a-Cas9的酶切验证
取3个新的0.2ml的EP管，分别加入2μL的质粒pSUZM1a-Cas9、pSUZM2a-Cas9, pSUZM3a-Cas9，10* KpnI buffer 2μL，KpnI 0.8ul，ddH2O 6.2ul，37。C反应3-4h，电泳检测酶切效果。
结果显示，使用KpnI单酶切，酶切结果与预期大小相符，见图6，其中图6A为质粒pSUZM1a-Cas9的酶切结果，图6B为质粒pSUZM2a-Cas9的酶切结果，图6C为质粒pSUZM3a-Cas9的酶切结果。。
2）表达质粒pSUZM1a-Cas9、pSUZM2a-Cas9, pSUZM3a-Cas9的PCR验证
分别以质粒pSUZM1a-Cas9、pSUZM2a-Cas9, pSUZM3a-Cas9为模板，用引物Cas9-1 上游和Cas9-1 下游扩增Cas9基因。
PCR反应体系：10×PCR buffer 2.5μL，dNTP 2μL，上游引物 1.0μL，下游引物 1.0μL，模板DNA 0.5μL，加水至25μL。
PCR反应条件：94℃预变性1min，98℃变性10 s，65℃退火40s，72℃延伸4min10s，共30个循环，72℃最后延伸5min。
结果显示，Cas9基因的PCR产物大小分别为4.2kb。其结果见图7，与预期结果相符。
实例3 CRISPR-Cas9系统在大肠杆菌中的应用
1）质粒pSUZM1a-Cas9、pSUZM2a-Cas9、 pSUZM3a-Cas9转化大肠杆菌DH5α
感受态细胞的制备：挑取培养过夜的大肠杆菌菌株DH5α单菌落，接种于2 mL SOB中，37 ℃振荡培养过夜；取0.5 mL 菌液，接种于50 mL SOB中，18 ℃振荡培养约24 h或25 ℃振荡培养约12 h；将菌液转入50 mL的离心管中，冰水浴10 min，4,000 rpm离心10 min，弃上清液；加入16 mL 0℃预冷的TB缓冲液(20 mmol/L KCl， 54 mmol/L MnCl2，15 mmol/L CaCl2，12.5 mmol/L K-MES pH 6.2)，重新悬浮菌体，4,000 rpm离心10 min，再加入4 mL TB缓冲液悬浮菌体，逐滴加入280μLDMSO，混匀后置于冰浴上静置10 min或更长时间；每管200μL分装菌体细胞，立刻置于液氮中保存。
从液氮中取出感受态细胞，让其在冰水浴中融化。取质粒2μL与200μL刚融化的感受态细胞混匀，置于冰水浴上静置30 min，42℃热激90 s后放回冰水浴中，加入0.8 mL SOC培养液，37℃振荡恢复培养1 h，4,000 rpm离心收集全部转化细胞，涂布于含卡那霉素的LB平板上，37 ℃过夜培养。
2）靶基因sgRNA的制备
大肠杆菌的upp基因表达产物为尿嘧啶磷酸核糖转移酶(UPRT)。UPRT能将5-氟尿嘧啶转化成5-氟单磷酸脱氧尿嘧啶，从而抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶活性，导致细胞死亡。利用这一特性，upp基因可用来作为反向筛选筛标记基因，大肠杆菌DH5α的upp基因编码区为627bp。
根据靶序列设计原则设计靶序列，即（i）GC含量不低于50%；（ii）第1位必须是G。如果难于满足此条件，可以在靶序列的前面增加1个G；（iii）第2-8位可以是任意碱基，第9-14位可以是除已标明“不可”的碱基外的任意碱基，第15-20位的碱基最好按已注明的碱基设计；（iv）设计出的靶序列在整个基因组中应该是唯一的，因此需要将查询到的靶序列进行全基因组序列比对；（v）靶序列设计是按照5’→3’方向进行的。
（1）设计出2个靶序列，分别命名为upp-1和upp-2。设计靶序列的引物upp1上游,upp1下游；引物upp2上游,upp2下游；pUC19上游，pUC19下游，具体序列如下：
upp1上游：5’-CTATGTAACTATCGAAGGCTGGAA-3’
upp1下游：5’-AAACTTCCAGCCTTCGATAGTTACA-3’
upp2上游：5’-CTATGATGCCGGTGACAAAATCTT-3’
upp2下游：5’-AAACAAGATTTTGTCACCGGCATCA-3’
pUC19上游：5’-GCCACCTCTGACTTGA-3’
pUC19下游：5’-GTCTCATGAGCGGATAC-3’
设计的靶序列送公司合成后经磷酸化、复性、与BbsI酶切后的pUC-T7sgRNA质粒连接、转化大肠杆菌，获得转化子，使用正反向筛选引物筛选与靶序列引物配对进行PCR验证。（2）用BbsI限制酶切pUC-T7sgRNA载体，经凝胶电泳回收进行纯化；
BbsI限制酶切体系：10* buffer G 1μL，pUC-T7sgRNA载体 2 μL，BbsI 0.8 μL，ddH2O 6.2μL，37°C过夜酶切。
（3）将合成的2条互补的靶序列upp1上游，upp1下游；upp2上游，upp2下游等量混合后进行磷酸化处理，然后进行复性变成双链DNA；加样体系：靶序列上游5 μL，下游5 μL，10*buffer A for T4 PNK2 μL，ATP 10mM 2 μL，T4 PNK2 μL，ddH2O 4μL。37°C处理20 min，然后复性：水浴加热10min，再缓慢降至室温。
（4）将BbsI酶切后的载体pUC-T7sgRNA与靶序列进行连接；先将复性片段稀释10倍，连接体系：酶切后载体1 μL，T4 DNA Ligase1 μL，10* T4 DNA Ligase buffer 2 μL，稀释后复性片段16 μL，18°C过夜连接。
（5）连接产物转化大肠杆菌DH5α，挑取单菌落进行PCR筛选和鉴定。
以转化子单菌落为模板，分别用引物pUC19上游和upp1下游，引物upp1上游和pUC19下游，引物pUC19上游和upp2下游，引物upp2上游和pUC19下游进行扩增。
PCR反应体系：10×PCR buffer 2.5μL，dNTP 2μL，上游引物 1.0μL，下游引物 1.0μL，模板DNA 0.5μL，加水至25μL。
PCR反应条件：94℃预变性1min，98℃变性10 s，65℃退火40s，72℃延伸4min10s，共30个循环，72℃最后延伸5min。
结果显示，PCR扩增的片段大小分别为为0.7kb和0.5kb（图8），与预期结果相符。质粒pUC-T7sgRNA在靶序列成功插入后，包含质粒pUC19上的复制起点、氨苄青霉素筛选标记基因、T7基因启动子和终止子、靶序列（upp-1和upp-2）和crRNA-tracrRNA序列。
（6）DNA模板的制备
以获得的靶序列重组的阳性克隆大肠杆菌菌落为模板，使用引物pUC19上游和pUCT7下游进行PCR扩增，扩增产物使用cycle pure kit试剂盒进行纯化，纯化产物进行电泳检查（图9）。
pUC19上游：5’-GCCACCTCTGACTTGA-3’
pUCT7下游：5’-CAAAAAACCCCTCAAGACCCG-3’
PCR反应体系：2×PCR buffer 25μL，上游引物 1.5μL，下游引物 1.5μL，模板DNA 1 μL，加水至50μL。
PCR反应条件：94℃预变性1min，98℃变性10 s，55℃退火40s，68℃延伸30s，共30个循环，68℃最后延伸5min。
（7）sgRNA的体外转录
sgRNA的转录，即用上述纯化后获得的DNA为模板，利用T7 RNA聚合酶（T7 RNA polymerase）进行体外转录。对转录产物进行纯化（图10）。sgRNA转录体系：5X Transcription Buffer 5μl，ATP/ GTP/ CTP/ UTP Mix 10μl (10 Mm each)，upp1 (upp2)DNA 1μg，RNase Inhibitor 1.25μl，T7 RNA Polymerase 30 UDEPC-treated water to 50μl（Thermo scientific#EP0111）。37℃保温2 h。
DNase I去除模板DNA：Transcription product 50 μl ，10X Reaction Buffer 6 μl，DNase I，RNase-free 4 μl（Thermo scientific #EN0521。37℃保温15 min。
sgRNA的纯化：按miRNA纯化试剂盒的操作说明纯化RNA分子。
3）sgRNA电转化大肠杆菌DH5α
分别挑取含有质粒pSUZM1a-Cas9, pSUZM2a-Cas9, pSUZM3a-Cas9的大肠杆菌DH5α单菌落培养于3 mL SOB培养基中，得到菌液全部接种于100 mL LB培养基中，培养至OD600为0.5-0.6。于4℃ 6000 rpm 10 min收集菌体，用20 mL灭菌的ddH2O清洗菌体，于4℃ 6000 rpm 10 min收集菌体，重复清洗一次，再用10 mL 10%甘油清洗菌体，于4℃ 6000 rpm 10 min收集菌体，重复清洗一次，将收集到的菌体悬浮于1 mL 10%甘油中，制备感受态。
采用美国BTX 公司的ECM830脉冲导入仪。将1μg的upp1-sgRNA和upp2-sgRNA与200 μL大肠杆菌DH5α（pSUZM1(2,3)a-Cas9）感受态混合后在1750 V、200 Ω、25 μF条件下电击，电击后把菌液迅速转移至1mL SOC培养基中静止恢复3 h，将全部菌液离心收集后涂布于含5Fu（10μM）的平板，1 d后出现转化子。
4）转化子的鉴定
为验证敲除结果，检测大肠杆菌DH5α的upp是否发生突变。挑取5Fu（10μM）LB平板上的单菌落，接种到5Fu的液体LB中，设计引物upptest上游和upptest下游，进行PCR验证，具体序列如下：
upptest上游：5’-TAATCTTCTTTCATAACCATCTG-3’，
upptest下游：5’-CTAAGCGGGATTGTCTGT-3’，
对upp突变株进行检测。以单菌落为模板，引物upptest上游和upptest下游，进行PCR扩增，结果显示，PCR扩增的片段大小为0.5kb。每个载体相应的平板各挑取10个转化子，进行PCR验证，其中仅质粒pSUZM2a-Cas9的10个转化子中5号样品的PCR扩增的片段较野生型PCR扩增的片段小（图11）。
PCR反应体系：10×PCR buffer 2.5μL，dNTP 2μL，上游引物 1.0μL，下游引物 1.0μL，模板DNA 1μL，加水至25μL。
PCR反应条件：94℃预变性1min，98℃变性10 s， 63℃延伸0.5min，共30个循环，72℃最后延伸5min。
为进一步验证结果，将大肠杆菌DH5α（pSUZM2a-Cas9）的5号PCR产物送公司进行测序，发现在upp基因中有一段缺失（图12，图13），综上所述CRISPR-Cas系统在大肠杆菌能够发挥作用，成功敲除大肠杆菌DH5α的upp基因。
实例4CRISPR-Cas9系统在运动发酵单胞菌中的应用
1）靶基因sgRNA的制备
ZM4菌株中的5个质粒长度都在30kb以上，但是它们的ORF数却有较大差异，如长度最长和最短的质粒中的ORF数相差近一倍，而长度仅有7kb差异；每个质粒中均有复制酶基因，这些基因的长度及其编码的蛋白质也存在一定差异。
将复制酶基因编码区序列进行同源性性分析，结果表明，pZZM401与其他4个基因的同源性相对较低，而pZZM402与pZZM403的同源性最高（图14）。
利用DNAman对5个质粒复制酶编码区序列进行了多重比对，然后根据比对结果设计了各个复制酶基因的打靶序列和各种引物。
根据靶序列设计原则，质粒pZZM401设计2个靶序列，命名为ZM401-1、ZM401-3；质粒pZZM402、pZZM403、pZZM404、pZZM405设计2个相同的靶序列，命名为ZM402345-1、ZM402345-3，设计的靶序列送公司合成后经磷酸化、复性、与BbsI酶切的pUC-T7sgRNA载体连接、转化大肠杆菌，获得转化子，使用正反向筛选引物筛选与靶序列引物配对进行PCR验证。
设计引物ZM401-1上游，ZM401-1下游；引物ZM401-3上游, ZM401-3下游；设计引物ZM402345-1上游，ZM402345-1下游；引物ZM402345-3上游，ZM402345-3下游，具体序列如下：
ZM401-1上游：5’-CATATGGCTGCTCAAGATGCTGTTT-3’
ZM401-1下游：5’-AAACAAACAGCATCTTGAGCAGCCA-3’
ZM401-3上游：5’-CATATGCGCTCAACTGCCGAAATTT-3’
ZM401-3下游：5’-AAACAAATTTCGGCAGTTGAGCGCA-3’
ZM402345-1上游：5’-CATATGGCCTTATCGCTTAAGCCCT-3’
ZM402345-1下游：5’-AAACAGGGCTTAAGCGATAAGGCCA-3’
ZM402345-3上游：5’-CATATGGTATCCTCCTTAGGTGTTT-3’
ZM402345-3下游：5’-AAACAAACACCTAAGGAGGATACCA-3’
（1）用BbsI限制酶切pUC-T7sgRNA质粒，经凝胶电泳回收进行纯化；
BbsI限制酶切体系：10* buffer G 1μL，pUC-T7sgRNA质粒 2 μL，BbsI 0.8 μL，ddH2O 6.2μL。37°C过夜酶切。
（2）将合成的2条互补的靶序列ZM401-1上游，ZM401-1下游； ZM401-3上游，ZM401-3下游； ZM402345-1上游，ZM402345-1下游； ZM402345-3上游，ZM402345-3下游等量混合后进行磷酸化处理，然后进行变复性成双链DNA；
加样体系：靶序列上游5 μL，下游5 μL，10*buffer A for T4 PNK2 μL，ATP 10mM 2 μL，T4 PNK2 μL，ddH2O 4μL。37°C处理20 min，然后复性：水浴加热10min，再缓慢降至室温。
（3）将BbsI限制酶酶切后的载体pUC-T7sgRNA与靶序列进行连接；
先将复性片段稀释10倍，连接体系：酶切后载体1 μL，T4 DNA Ligase1 μL，10* T4 DNA Ligase buffer 2 μL，稀释后复性片段16 μL，18°C过夜连接。
（4）连接产物转化大肠杆菌DH5α，挑取单菌落进行PCR筛选和鉴定。
以转化子单菌落为模板，分别用引物pUC19上游和ZM401-1下游，引物pUC19下游和ZM401-1上游，引物pUC19上游和ZM401-3下游，引物pUC19下游和ZM401-3上游，引物pUC19上游和ZM402345-1下游，引物pUC19下游和ZM402345-1上游，引物pUC19上游和ZM402345-1下游，引物pUC19下游和ZM402345-3上游，进行扩增。
PCR反应体系：10×PCR buffer 2.5μL，dNTP 2μL，上游引物 1.0μL，下游引物 1.0μL，模板DNA 0.5μL，加水至25μL。
PCR反应条件：94℃预变性1min，98℃变性10 s，65℃退火40s，72℃延伸1min，共30个循环，72℃最后延伸5min。
结果显示，pUC19上游与配对引物的PCR扩增的片段大小分别为0.7kb，pUC19下游与配对引物的PCR扩增的片段大小分别为0.5kb（图15），与预期结果相符。
5）DNA模板的制备
以获得的靶序列重组的阳性克隆大肠杆菌菌落为模板，使用引物pUC19上游和pUCT7下游进行PCR扩增，扩增产物使用cycle pure kit试剂盒进行纯化，纯化产物进行电泳检查（图16）。
PCR反应体系：2×PCR buffer 25μL，上游引物 1.5μL，下游引物 1.5μL，模板DNA 1 μL，加水至50μL。
PCR反应条件：94℃预变性1min，98℃变性10 s，55℃退火40s，68℃延伸30s，共30个循环，68℃最后延伸5min。
6）sgRNA的体外转录
具体加样体系和操作与实例3相同，结果见图17。
3）sgRNA与CRISPR-Cas系统表达质粒共电转化Z.mobilis ZM4
pSUZM1a-Cas9、 pSUZM2a-Cas9、 pSUZM3a-Cas9复制起点分别来自于运动发酵单胞菌染色体上的复制起点，pZZM401的复制起点及其复制酶基因，pZZM402的复制起点及其复制酶基因。因此，在敲除天然质粒pZZM401时，我们采用含有pZZM402复制起点的质粒pSUZM3a-Cas9，在敲除其余3个质粒时，则采用含有pZZM401的复制起点的质粒pSUZM2a-Cas9。
挑取Z.mobilis ZM4单菌落培养于RM培养基中，得到菌液取1ml接种于100 ml RM培养基中，培养至OD600为0.3-0.4。于4℃ 6000 rpm 10 min收集菌体，灭菌的ddH2O洗涤菌体3次， 10%甘油清洗菌体2次，均同上离心。将收集到的菌体悬浮于1 ml10%甘油中，感受态制备完成。
采用美国BTX 公司的ECM830脉冲导入仪。将纯化的sgRNA分别与质粒pSUZM1a-Cas9、pSUZM2a-Cas9, pSUZM3a-Cas9按不同的克分子比混合，与200μl Z. mobilis电击感受态混合后在2500 V、200 Ω、50 μF条件下电击，电击后把菌液迅速转移至3ml RM培养基中静止恢复16 h，转化细胞涂布在含有卡那霉素（kanamycin）平板上，筛选卡那霉素抗性（kanamycin-resistant, Kanr）菌落。
4）转化子的鉴定
在筛选质粒DNA复制酶基因敲除菌株的过程中，只能采用菌落PCR方法进行。根据同源比对结果设计一条通用引物pZM4G上游，再分别设计引物pZM401下游、pZM402下游、pZM403下游、pZM404下游和pZM405下游与之配对，分别用于筛选质粒pZZM401、pZZM402、pZZM403、pZZM404和pZZM405中DNA复制酶基因被敲除的菌株，具体序列如下：
pZM4G上游：5’-GATGCTGTTTCGGATGGTC(G)GAC-3’
pZM401下游：5’-GTCTTGACGGTAACCGCGAG-3’
pZM402下游：5’-GATCAGGACGATAACCGCGAG-3’
pZM403下游：5’-GGTCGGGACG ATAACCACG-3’
pZM404下游：5’-ATCGGGGCGATAACCACGAG-3’
pZM405下游：5’-CTGATCAGGCCTTAGGTTCAGG-3’
为了确证运动发酵单胞菌ZM4中是否存在5个天然质粒，首先以培养的野生型ZM4菌液作为模板，使用引物pZM4G上游分别与引物pZM401下游、pZM402下游、pZM403下游、pZM404下游和pZM405下游配对，进行PCR扩增。
PCR反应体系：10×PCR buffer 2.5μL，dNTP 2μL，上游引物 1.0μL，下游引物 1.0μL，模板DNA 1μL，加水至25μL。
PCR反应条件：94℃预变性1min，98℃变性10 s， 56℃退火40s，72℃延伸1.0min，共30个循环，72℃最后延伸5min。
结果如图18所示。该菌株中有4个质粒复制酶基因有扩增DNA带，质粒pZZM405则没有扩增带。重复实验的结果与之相同。
以靶序列ZM402345-1sgRNA和 ZM402345-3sgRNA转化得到的60个Kanr菌落为模板，使用引物pZM4G上游分别与引物pZM401下游、pZM402下游、pZM403下游、pZM404下游和pZM405下游配对，进行PCR扩增。PCR反应体系：10×PCR buffer 2.5μL，dNTP 2μL，上游引物 1.0μL，下游引物 1.0μL，模板DNA 1μL，加水至25μL。
PCR反应条件：94℃预变性1min，98℃变性10 s， 56℃退火40s，72℃延伸1.0min，共30个循环，72℃最后延伸5min。
结果筛选到4个候选的pZZM403质粒DNA复制酶基因被敲除的菌株，分别为图19A中的5道的转化子和7道的转化子，图19B中的4道的转化子，图19C中的2道的转化子，分别命名为1，2，3，4菌株，但是有一个菌株所扩增到的DNA带比较弱（图19C第2泳道）。
为了确认上述4个候选菌株是来自运动发酵单胞菌，而不是来自因操作不当所带来的污染菌，以菌液为模板，利用引物pZM4G上游，分别与引物pZM401下游、pZM402下游、pZM403下游、pZM404下游和pZM405下游配对，对其进行菌液PCR鉴定。
同时根据染色体基因组上丙酮酸脱羧酶基因(pdc)序列设计染色体引物pdcDL上游、pdcDL下游，具体序列如下：
pdcDL上游：5’-ATGAGTTATACTGTCGGTACCTATT3-3’
pdcDL下游：5’-GAGGTGCCGATGTAATGC-3’
同时，以菌液为模板，利用引物pdcDL上游、pdcDL下游进行PCR扩增。
PCR反应体系：10×PCR buffer 2.5μL，dNTP 2μL，上游引物 1.0μL，下游引物 1.0μL，模板DNA 1μL，加水至25μL。
PCR反应条件：94℃预变性1min，98℃变性10 s， 56℃退火40s，72℃延伸1.0min，共30个循环，72℃最后延伸5min。
电泳结果显示，上述4个候选菌株均来自Z.mobilis ZM4（图20）。1号菌株可以扩增出pZZM403质粒的复制酶基因（图20A），其余3个菌株中均未扩增出pZZM403质粒的复制酶基因（图20B）。此外，以上述4个候选菌株为模板，PCR扩增出的pZZM402质粒的条带，与以出发菌株为模板PCR扩增出产物相比（图18第2道），其DNA带明显减弱（图20A第2道，图20B第2、7、12道）。该结果说明，用于打靶的ZM402345-1、ZM402345-3，不仅可以将pZZM403的复制酶基因敲出，而且还使pZZM402质粒的拷贝数降低了。
为了检测进一步检测pZZM403质粒是否已被消除，每个质粒中设计了一对特异性引物，该引物远离复制酶基因。如果此引物仍不能扩增出DNA片段，那么就可以断定整个质粒已被消除。在4个内源性质粒上分别设计特异性引物，质粒pZZM401上选取tail sheath protein基因，设计引物01上游、01下游，质粒pZZM402上选取oxidoreductase domain protein基因，设计引物02上游、02下游，质粒pZZM403上选取UDP-N-acetylglucosamine 2-epimerase基因，设计引物03上游、03下游，质粒pZZM404上选取secretory lipase基因，设计引物04上游、04下游，具体序列如下：
01上游：5’-TCCATTATTCACGGGATTTC-3’
01下游：5’-GTAGTCACGATCTGAGGTTGC-3’
02上游：5’-TAAATCTCAAGGGGATAAAACA-3’
02下游：5’-GCCTTGTCACCGATTGC-3’
03上游：5’-TGGATGCCCATTTCAAAG-3’
03下游：5’-TAAGGACTGACTGGATGACTCA-3’
04上游：5’-GGCATCGTCCTTTTTACCA-3’
04下游：5’-TTCATCGTCGGATACTGCAT-3’
以单菌落为模板，PCR反应体系：10×PCR buffer 2.5μL，dNTP 2μL，上游引物 1.0μL，下游引物 1.0μL，模板DNA 1μL，加水至25μL。
PCR反应条件：94℃预变性1min，98℃变性10 s，56℃退火40s，72℃延伸1.0min，共30个循环，72℃最后延伸5min。
使用4个质粒特异性引物01上游、01下游；02上游、02下游；；03上游、03下游；04上游、04下游和染色体引物pdcDL上游、pdcDL下游对3个敲除菌株进行的PCR检测结果。结果显示，在3个菌株中，用于检测pZZM403的特异性引物03上游、03下游均未扩增出DNA带（图21a/b/c中的第3道），而对照菌株Z.mobilis ZM4则可以扩增到相应的DNA片段（图21a/b/c中的第8道），其余的3个质粒pZZM401、pZZM402和pZZM404特异性引物均可以扩增出DNA带。
上述结果表明，pZZM403中的DNA复制酶基因不仅被敲除，而且整个质粒也被敲除。因为3个菌株是从60个转化菌落中筛选到的，所以打靶效率为5%。这3个菌株分别命名为Z.mobilis ZM4-Δ403-1，Z.mobilis ZM4-Δ403-2和Z.mobilis ZM4-Δ403-3。
序列表
SEQUENCE LISTING
<110> 四川大学
<120>运动发酵单胞菌CRISPR-Cas9系统的构建与应用
<160> 38
<210> 1
<211> 177
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 1
ggaagcttaa tacgactcac tataggtctt cgagaagacc tgttttagag ctagaaatag caagttaaaa taaggctagt ccgttatcaa cttgaaaaag tggcaccgag tcggtgcttt ttctagcata accccttggg gcctctaaac gggtcttgag gggttttttg aattccc 177
<210> 2
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400>2
ctaggaggtg actgaaggta gcttgcagtg gg 32
<210> 3
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400>3
gagtatttct tatccattgc ttactccata tat 33
<210> 4
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400>4
atatatggag taagcaatgg ataagaaata ctc 33
<210> 5
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400>5
cccactgca agctacct tc agtcacctcc tag 32
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 6
ctatgtaact atcgaaggct ggaa 24
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 7
aaacttccag ccttcgatag ttaca 25
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 8
ctatgatgcc ggtgacaaaa tctt 24
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 9
aaacaagatt ttgtcaccgg catca 25
<210> 10
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 10
gccacctctg acttga 16
<210> 11
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 11
gtctcatgag cggatac 17
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 12
caaaaaaccc ctcaagaccc g 21
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 13
taatcttctt tcataaccat ctg 23
<210> 14
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 14
ctaagcggga ttgtctgt 18
<210> 15
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 15
catatggctg ctcaagatgc tgttt 25
<210> 16
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 16
aaacaaacag catcttgagc agcca 25
<210> 17
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 17
catatgcgct caactgccga aattt 25
<210> 18
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 18
aaacaaattt cggcagttga gcgca 25
<210> 19
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 19
catatggcct tatcgcttaa gccct 25
<210> 20
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 20
aaacagggct taagcgataa ggcca 25
<210> 21
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 21
catatggtat cctccttagg tgttt 25
<210> 22
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 22
aaacaaacac ctaaggagga tacca 25
<210> 23
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 23
gatgctgttt cggatggtc(g) g ac 22
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 24
gtcttgacgg taaccgcgag 20
<210> 25
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 25
gatcaggacg ataaccgcga g 21
<210> 26
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 26
ggtcgggacg ataaccacg 19
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 27
atcggggcga taaccacgag 20
<210> 28
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 28
ctgatcaggc cttaggttca gg 22
<210> 29
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 29
atgagttata ctgtcggtac ctatt 25
<210> 30
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 30
gaggtgccga tgtaatgc 18
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 31
tccattattc acgggatttc 20
<210> 32
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 32
gtagtcacga tctgaggttg c 21
<210> 33
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 33
taaatctcaa ggggataaaa ca 22
<210> 34
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 34
gccttgtcac cgattgc 17
<210> 35
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 35
tggatgccca tttcaaag 18
<210> 36
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 36
taaggactga ctggatgact ca 22
<210> 37
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 37
ggcatcgtcc tttttacca 19
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 38
ttcatcgtcg gatactgcat 20
Claims (6)
1.一类能在运动发酵单胞菌中表达CRISPR-Cas9系统的表达质粒pSUZM1a-Cas9、pSUZM2a- Cas9和pSUZM3a- Cas9，包含运动发酵单胞菌内源性基因启动子、筛选标记基因和CRISPR系统的Cas9基因。
2.一类能够通过体外转录形成RNA分子的表达质粒pUC-T7sgRNA，包含复制起点、筛选标记基因、T7基因启动子和终止子、BbsI识别序列和crRNA-tracrRNA序列。
3.根据权利1所述的质粒，其特征在于：
1）pSUZM1a- Cas9包含运动发酵单胞菌染色体上复制起点oriC、质粒pUC18上的复制起点、卡那霉素筛选标记基因、运动发酵单胞菌丙酮酸脱羧酶pdc基因的启动子Ppdc，来自于化脓性链球菌（Streptococcus）CICC 10464的Cas9基因；
2）pSUZM2a-Cas9包含运动发酵单胞菌内源性质粒pZZM401的复制蛋白序列、质粒pUC18上的复制起点、卡那霉素筛选标记基因、运动发酵单胞菌丙酮酸脱羧酶pdc基因的启动子Ppdc，来自于化脓性链球菌CICC 10464的Cas9基因；
3）pSUZM3a-Cas9包含运动发酵内源性质粒pZZM402上的复制蛋白序列、质粒pUC18上的复制起点、卡那霉素筛选标记基因、运动发酵单胞菌丙酮酸脱羧酶pdc基因的启动子Ppdc，来自于化脓性链球菌CICC10464的Cas9基因。
4.权利3所述的质粒的构建方法，包括如下步骤：
1）分别以运动发酵单胞菌表达质粒pSUZM1a（含有运动发酵单胞菌染色体上复制起点oriC、质粒pUC18上的复制起点、运动发酵单胞菌的组成型基因启动子Ppdc）、pSUZM2a（含有运动发酵单胞菌内源性质粒pZZM401的复制起点和DNA复制酶基因序列、质粒pUC18上的复制起点、运动发酵单胞菌的组成型基因启动子Ppdc）、pSUZM3a（含有运动发酵单胞菌内源性质粒pZZM402的复制起点和DNA复制酶基因序列、质粒pUC18上的复制起点、运动发酵单胞菌的组成型基因启动子Ppdc）为模板，用以下引物5’-CTAGGAGGTGACTGAAGGTAGCTTGCAGTGGG-3’和5’- GAGTATTTCTTATCCATTGCTTACTCCATATAT-3’，进行PCR扩增，获得载体骨架片段A(pSUZM1a)、B(pSUZM2a)和C（pSUZM3a）；
2) 以化脓性链球菌CICC10464为模板，用以下引物5’- ATATATGGAGTAAGCAATGGATAAGAAATACTC-3’和5’- CCCACTGCAAGCTACCT TCAGTCACCTCCTAG-3’,进行PCR扩增，获得基因片段Cas9；
(3) 分别将载体骨架片段A、B和C与基因片段Cas9经电泳凝胶回收后等摩尔混合，混合片段用T4 DNA聚合酶进行处理，然后进行退火反应重组，转化大肠杆菌，获得重组质粒pSUZM1a-Cas9、pSUZM2a-Cas9和pSUZM3a-Cas9。
5.根据权利2所述的质粒，其特征在于：
pUC-T7sgRNA质粒包含质粒pUC19上的复制起点、氨苄青霉素筛选标记基因、T7基因启动子和终止子、BbsI识别序列和crRNA-tracrRNA序列。
6.权利4所述的质粒的构建方法，包括如下步骤：
1）T7sgRNA基因的设计：人工合成一段双链DNA，全长177bp，包含T7基因启动子和终止子、BbsI识别序列和tracrRNA序列，序列两端分别为HindIII和EcoRI位点；
T7sgRNA基因序列如下所示：
GGAAGCTTAA TACGACTCAC TATAGGTCTT CGAGAAGACC TGTTTTAGAG CTAGAAATAG CAAGTTAAAA TAAGGCTAGT CCGTTATCAA CTTGAAAAAG TGGCACCGAG TCGGTGCTTT TTCTAGCATA ACCCCTTGGG GCCTCTAAAC GGGTCTTGAG GGGTTTTTTG AATTCCC
2）质粒pUC19和T7sgRNA基因片段分别采用HindIII和EcoRI进行双酶切；
3）酶切后产物进行T4 DNA ligase连接，转化大肠杆菌，获得表达质粒pUC-T7sgRNA。
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| PB01 | Publication | ||
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| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
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Application publication date: 20141022 |