ES2618531T3 - Sistemas, métodos y composiciones de componentes de CRISPR-Cas para manipulación de secuencias - Google Patents

Abstract

Un método para seleccionar una o más células procariotas por introducción de una o más mutaciones en una o más células procariotas, comprendiendo el método: introducir uno o más vectores en la célula o las células procariotas; en el que uno o más vectores conducen la expresión de uno o más de: una enzima CRISPR, una secuencia guía ligada a una secuencia de emparejamiento tracr, una secuencia tracr y una plantilla de edición para recombinación en un lugar cromosómico fijado como objetivo que comprende un polinucleótido fijado como objetivo y todo de, una enzima CRISPR, una secuencia guía ligada a una secuencia de emparejamiento tracr y una secuencia tracr y una plantilla de edición, se produce en la célula o las células procariotas; introducir la plantilla de edición en un polinucleótido fijado como objetivo por recombinación, en el que la plantilla de edición comprende una o más mutaciones del polinucleótido fijado como objetivo que modifiquen la secuencia unidad adyacente al protoespaciador (PAM) o la secuencia protoespaciadora y que anula la escisión de la enzima CRISPR del polinucleótido fijado como objetivo; permitir que un complejo CRISPR se una al polinucleótido fijado como objetivo para efectuar escisión del polinucleótido fijado como objetivo; en el que el complejo CRISPR comprende la enzima CRISPR complejada con (1) la secuencia guía que se hibrida a una secuencia diana dentro del polinucleótido fijado como objetivo y (2) la secuencia de emparejamiento tracr que se hibrida a una secuencia tracr; en el que la escisión del polinucleótido fijado como objetivo por el complejo CRISPR induce muerte celular; permitir según lo cual que se seleccione una o más células procariotas en las que se han introducido una o más mutaciones.

Description

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(azul), directamente aguas arriba de una unidad adyacente protoespaciadora 5'-NGG (PAM; magenta) requisito y Cas9 media una doble rotura de cadena (DRC) ~3 pb aguas arriba de la PAM (triángulo rojo).

La Figura 2A-F muestra un sistema CRISPR ejemplar, un posible mecanismo de acción, una adaptación de ejemplo para la expresión en células eucariotas y los resultados de los ensayos que evalúan la localización nuclear y la actividad de CRISPR.

La Figura 3 muestra una casete de expresión ejemplar para expresión de elementos del sistema CRISPR en células eucariotas, estructuras previstas de secuencias guía de ejemplo y actividad del sistema CRISPR cuando se mide en células eucariotas y procariotas.

La Figura 4A-D muestra los resultados de una evaluación de especificidad de SpCas9 para un objetivo de ejemplo.

La Figura 5A-G muestra un sistema vector ejemplar y los resultados para su uso en dirigir recombinación homóloga en células eucariotas.

La Figura 6 proporciona una tabla de secuencias protoespaciadoras y resume los resultados de eficacia de modificación para objetivos protoespaciadores diseñados basándose en sistemas CRISPR de S. pyogenes y S. thermophilus ejemplares con las correspondientes PAM contra sitios en genomas humanos y de ratón. Se transinfectaron células con Cas9 y pre-ARNcr/ARNtracr o ARN quimérico y se analizaron 72 horas después de transinfección. Se calculan los porcentajes de inserciones o supresiones basándose en los resultados de la prueba Surveyor de estirpes celulares indicadas (N=3 para todos los objetivos protoespaciadores, los errores son E. E. M.,

N. D. indica no detectable usando la prueba Surveyor y

N. E. indica no ensayado en este estudio).

La Figura 7A-C muestra una comparación de diferentes transcritos de ARNtracr para fijar como objetivo genes mediados por Cas9.

La Figura 8 muestra un esquema de una prueba de nucleasa surveyor para detección de microinserciones y microsupresiones inducidas por doble rotura de cadena.

La Figura 9A-B muestra vectores de expresión bicistrónicos ejemplares para expresión de elementos del sistema CRISPR en células eucariotas.

La Figura 10 muestra un ensayo de interferencia de transformación de plásmidos bacterianos, casetes de expresión y plásmidos usados en el mismo y eficacias de transformación de células usadas en el mismo.

La Figura 11A-C muestra histogramas de distancias entre PAM del sitio 1 SF370 de S. pyogenes (NGG) (Figura 10A) y PAM del sitio 2 de LMD9 de S. thermophilus (NNAGAAW) (Figura 10B) en el genoma humano y las distancias para cada PAM por cromosoma (Chr) (Figura 10C).

La Figura 12A-C muestra un sistema CRISPR ejemplar, una adaptación de ejemplo para expresión en células eucariotas y los resultados de ensayos que evalúan la actividad CRISPR.

La Figura 13A-C muestra manipulaciones ejemplares de un sistema CRISPR para fijar como objetivo sitios genómicos en células de mamífero.

La Figura 14A-B muestra los resultados de un análisis por el método Northern de tratamiento de ARNcr en células de mamífero.

La Figura 15 muestra una selección ejemplar de protoespaciadores en los sitios PVALB humano y Th de ratón.

La Figura 16 muestra protoespaciador de ejemplo y los correspondientes objetivos de secuencia PAM del sistema CRISPR de S. thermophilus en el sitio EMX1 humano.

La Figura 17 muestra una tabla de secuencias para cebadores y sondas usados para pruebas Surveyor, RFLP, secuenciación genómica y método de Northern.

La Figura 18A-C muestra manipulación ejemplar de un sistema CRISPR con ARN quiméricos y los resultados de pruebas SURVEYOR para actividad del sistema en células eucariotas.

La Figura 19A-B muestra una representación gráfica de los resultados de pruebas SURVEYOR para actividad del sistema CRISPR en células eucariotas.

La Figura 20 muestra una visualización ejemplar de algunos sitios objetivo de Cas9 de S. pyogenes en el genoma humano usando el buscador de genomas UCSC.

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La Figura 21 muestra estructuras secundarias previstas para ARN quiméricos ejemplares que comprenden una secuencia guía, secuencia de emparejamiento tracr y secuencia tracr.

La Figura 22 muestra vectores de expresión bicistrónicos ejemplares para expresión de elementos del sistema CRISPR en células eucariotas.

La Figura 23 muestra que la actividad de la nucleasa Cas9 frente a objetivos endógenos puede explotarse para edición de genomas. (a) Concepto de edición de genomas usando el sistema CRISPR. La construcción que fija como objetivo CRISPR dirigió la escisión de un sitio cromosómico y se cotransformó con una plantilla de edición que se recombinó con el objetivo para evitar la escisión. Los transformados resistentes a la kanamicina que sobrevivieron al ataque de CRISPR contenían modificaciones introducidas por la plantilla de edición. ARN de CRISPR trans-activante, tracr; gen de resistencia a la kanamicina, aphA-3. (b) Transformación de ADN crR6M en células R68.232,5 sin plantilla de edición, srtA natural R6 o las plantillas de edición de R6370,1. La recombinación de srtA R6 o R6370,1 evitó la escisión por Cas9. Se calculó la eficacia de transformación como unidades formadoras de colonias (ufc) por µg de ADN de crR6M; se muestran los valores medios con desviaciones estándar de al menos tres experimentos independientes. Se realizó análisis PCR sobre 8 clones en cada transformación. “No.” indica el sitio srtA no editado de la cepa R68232,5; “Ed.” muestra la plantilla de edición. Los objetivos R68232,5 y R6370,1 se distinguen por restricción con EaeI.

La Figura 24 muestra análisis de PAM y secuencias de siembra que eliminan la escisión de Cas9. (a) Se transformaron los productos PCR con secuencias PAM aleatoriadas o secuencias de siembra aleatoriadas en células crR6. Estas células expresaron Cas9 cargado con un ARNcr que fijó como objetivo una región cromosómica de células R68232,5 (resaltado en rosa) que está ausente a partir del genoma R6. Más de 2x105 transformados resistentes al cloranfenicol, soportando PAM o secuencias de siembra inactivas, se combinaron para multiplicación y secuenciación intensa de la región fijada como objetivo. (b) Proporción relativa de número de lecturas después de la transformación de las construcciones PAM aleatorias en células crR6 (comparado con el número de lecturas en transformados R6). Se muestra la abundancia relativa para cada secuencia PAM de 3 nucleótidos. Se muestran secuencias seriamente infrarrepresentadas (NGG) en rojo; una parcialmente infrarrepresentada en naranja (NAG)

(c) Proporción relativa de número de lecturas después de transformación de las construcciones de secuencias de siembra aleatorias en células crR6 (comparado con el número de lecturas en transformados de R6). Se muestra la abundancia relativa de cada nucleótido para cada posición de los primeros 20 nucleótidos de la secuencia protoespaciadora. La abundancia alta indica ausencia de escisión por Cas9, es decir, una mutación que inactiva CRISPR. La línea gris muestra el nivel de la secuencia TN. La línea de puntos representa el nivel por encima del cual una mutación interrumpe significativamente la escisión (Véase la sección “Analysis of deep sequencing data” en el Ejemplo 5)).

La Figura 25 muestra la introducción de mutaciones únicas y múltiples usando el sistema CRISPR en S. pneumoniae, (a) Secuencias de nucleótidos y aminoácidos de bgaA tipo natural y editado (nucleótidos verdes; restos de aminoácidos subrayados). Se muestra el protoespaciador, PAM y sitios de restricción. (b) Eficacia de transformación de células transformadas con construcciones fijadoras de objetivo en presencia de una plantilla o control de edición. (c) Análisis PCR para 8 transformados de cada experimento de edición seguido por digestión con BtgZI (R→A) y TseI (NE→AA). La supresión de bgaA se reveló como un producto PCR más pequeño. (d) Prueba de Miller para medir la actividad de la β-galactosidasa de cepas TN y editadas. (e) Para una doble supresión de una sola etapa, la construcción fijadora de objetivo contenía dos espaciadores (en este caso emparejando srtA y bgaA) y se cotransformó con dos plantillas de edición diferentes (f) Análisis PCR para 8 transformados para detectar supresiones en los sitios srtA y bgaA. Los transformados 6/8 contenían supresiones de los dos genes.

La Figura 26 proporciona mecanismos que subrayan la edición usando el sistema CRISPR. (a) Se introdujo un codón de terminación en el gen de resistencia a eritromicina ermAM para generar cepa JEN53. Se puede restaurar la secuencia natural fijando como objetivo el codón de terminación con la construcción CRISPR::ermAM(terminación) y usando la secuencia natural ermAM como una plantilla de edición. (b) Secuencias ermAM mutantes y de tipo natural. (c) Fracción de ufc (ermR) resistente a eritromicina calculada a partir de las ufc totales o resistentes a kanamicina (kanR). (d) Fracción de células totales que adquieren tanto la construcción CRISPR como la plantilla de edición. La cotransformación de la construcción que fija como objetivo CRISPR produjo más transformados (ensayo t, p=0,011). En todos los casos los valores muestran la media ± d. e. para tres experimentos independientes.

La Figura 27 ilustra edición de genomas con el sistema CRISPR en E. coli. (a) Un plásmido resistente a kanamicina que soporta la matriz CRISPR (pCRISPR) que fija como objetivo el gen para editar puede transformarse en la cepa de recombinación de HME63 que contiene un plásmido resistente a cloranfenicol que alberga cas9 y tracr (pCas9), junto con un oligonucleótido que especifica la mutación. (b) Se introdujo una mutación de K42T que confería resistencia a la estreptomicina en el gen rpsL (c) Fracción de ufc resistentes a estreptomicina (strepR) calculada a partir de ufc totales o resistentes a kanamicina (kanR). (d) Fracción de células totales que adquieren tanto el plásmido pCRISPR como el oligonucleótido de edición. La cotransformación del plásmido que fija como objetivo

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pCRISPR produjo más transformados (ensayo t, p=0,004). En todos los casos los valores mostraron la media ± d. e. para tres experimentos independientes.

La Figura 28 ilustra que la transformación de ADN genómico de crR6 conduce a la edición del sitio fijado como objetivo (a) El elemento IS1167 deR6 de S. pneumoniae fue reemplazado por el sitio CRISPR01 de SF370 de S. pyogenes para generar cepa crR6. Este sitio codifica la nucleasa Cas9, una matriz CRISPR con seis espaciadores, el ARNtracr que se requiere para biogénesis de ARNcr y Cas1, Cas2 y Csn2, proteínas no necesarias para fijación como objetivo. La cepa crR6M contiene un sistema CRISPR funcional mínimo sin cas1, cas2 y csn2. El gen aphA-3 codifica resistencia a kanamicina. Se fusionaron protoespaciadores de los bacteriófagos de estreptococos φ8232,5 y φ370,1 a un gen de resistencia a cloranfenicol (cat) y se integraron en el gen srtA de cepa R6 para generar las cepas R68232,5 y R6370,1. (b) Panel izquierdo: Transformación de ADN genómico crR6 y crR6M en R68232,5 y R6370,1. Como un control de competencia celular también se transformó un gen resistente a estreptomicina. Panel derecho: Análisis PCR de 8 transformados R68232,5 con ADN genómico crR6. Se usaron cebadores que multiplican el sitio srtA por PCR. 7/8 colonias genotipadas reemplazaron el sitio srtA R68232,5 por el sitio TN del ADN genómico de crR6.

La Figura 29 proporciona cromatogramas de secuencias de ADN de células editadas obtenidas en este estudio. En todos los casos, se indica el protoespaciador natural y mutante y secuencias PAM (o su complemento inverso). Cuando es relevante, se proporciona la secuencia de aminoácidos codificada por el protoespaciador. Para cada experimento de edición, se secuenciaron todas las cepas para las que el análisis PCR y de restricción corroboró la introducción de la modificación deseada. Se muestra un cromatograma representativo. (a) Cromatograma para la introducción de una mutación PAM en el objetivo R68232,5 (Figura 23d). (b) Cromatogramas para la introducción de las mutaciones R>A y NE>AA en β-galactosidasa (bgaA) (Figura 25c). (c) Cromatograma para la introducción de una supresión de 6.664 pb en ORF (marco de lectura abierta, por sus siglas en inglés) de bgaA (Figuras 25c y 25f). La línea de puntos indica los límites de la supresión. (d) Cromatograma para la introducción de una supresión de 729 pb en ORF de srtA (Figura 25f). La línea de puntos indica los límites de la supresión. (e) Cromatogramas para la generación de un codón de terminación prematuro en ermAM (Figura 33). (f) Edición de rpsL en E. coli (Figura 27).

La Figura 30 ilustra inmunidad de CRISPR contra objetivos de S. pneumoniae aleatorios conteniendo diferentes PAM. (a) Posición de los 10 objetivos aleatorios en el genoma R6 de S. pneumoniae. Los objetivos elegidos presentan diferentes PAM y están en ambas cadenas. (b) Se clonaron los espaciadores correspondientes a los objetivos en una matriz de CRISPR mínima en plásmido pLZ12 y se transformaron en cepa crR6Rc, que suministra la maquinaria de tratamiento y fijación como objetivo en trans. (c) Eficacia de transformación de los diferentes plásmidos en cepa R6 y crR6Rc. No se recuperaron colonias para la transformación de pDB99-108 (T1-T10) en crR6Rc. La línea de puntos representa el límite de detección de la prueba.

La Figura 31 proporciona un esquema general para editar genoma fijado como objetivo. Para facilitar la edición de genoma fijado como objetivo, se logró además que crR6M contuviera ARNtracr, Cas9 y sólo una repetición de la matriz CRISPR seguido por marcador de resistencia a kanamicina (aphA-3), generando cepa crR6Rk. Se usa ADN de esta cepa como una plantilla para PCR con cebadores diseñados para introducir un nuevo espaciador (recuadro verde designado con N). Las PCR izquierda y derecha se reúnen usando el método de Gibson para crear la construcción fijadora de objetivo. Después se transforman las construcciones tanto fijadora de objetivo como de edición en cepa crR6Rc, que es una cepa equivalente a crR6Rk, pero presenta el marcador de resistencia a kanamicina reemplazado por un marcador de resistencia a cloranfenicol (cat). Aproximadamente el 90% de los transformados resistentes a kanamicina contienen la mutación deseada.

La Figura 32 ilustra la distribución de distancias entre las PAM. NGG y CCN que se consideran que son PAM válidas. Se muestran los datos para el genoma R6 de S. pneumoniae, así como para una secuencia aleatoria de la misma longitud y con el mismo contenido en GC (39,7%). La línea de puntos representa la distancia promedio (12) entre las PAM en el genoma R6.

La Figura 33 ilustra edición mediada por CRISPR del sitio ermAM usando ADN genómico como construcción fijadora de objetivo. Para usar ADN genómico como construcción fijadora de objetivo es necesario evitar autoinmunidad de CRISPR y, por lo tanto, se debe usar un espaciador contra una secuencia no presente en el cromosoma (en este caso el gen de resistencia a eritromicina ermAM). (a) Secuencias de nucleótidos y aminoácidos del gen ermAM natural y mutado (letras rojas). Se muestra el protoespaciador y las secuencias PAM. (b) Un esquema para la edición mediada por CRISPR del sitio ermAM usando ADN genómico. Una construcción que soporta un espaciador que fija como objetivo ermAM (recuadro azul) se prepara por PCR y ensamblaje de Gibson y se transforma en cepa crR6Rc, que genera cepa JEN37. Después se usó el ADN genómico de JEN37 como una construcción fijadora de objetivo y se cotransformó con la plantilla de edición en JEN38, una cepa en la que el gen srtA fue reemplazado por una copia natural de ermAM. Los transformados resistentes a kanamicina contienen el genotipo editado (JEN43). (c)Número de células resistentes a kanamicina obtenidas después de co-transformación de plantillas de fijación como objetivo y de edición o control. En presencia de la plantilla de control se obtuvieron 5,4×103 ufc/ml y 4,3×105 ufc/ml cuando se usó la plantilla de edición. Esta diferencia indica una eficacia de edición de aproximadamente 99%

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reparación en la forma de un plásmido u oligodesoxinucleótidos monocatenarios (ODNss) para potenciar la ruta de reparación dirigida por homología (HDR, por sus siglas en inglés), que permite alta fidelidad y edición precisa.

La Figura 60 muestra la cronología y resumen de los experimentos. Las etapas para diseño de reactivo, construcción, validación y expansión de estirpes celulares. Los ARNsg de costumbre (barras azul claro) para cada objetivo, así como cebadores de genotipado, se diseñan in silico vía nuestra herramienta de diseño on-line (disponible en el sitio web genome-engineering.org/tools). Los vectores de expresión ARNsg se clonaron después en un plásmido que contenía Cas9 (PX330) y se verificó por secuenciación de ADN. Los plásmidos completos (los pCRISPR) y las plantillas de reparación opcionales para facilitar la reparación dirigida por homología, se transinfectan después a células y se prueba su capacidad para mediar la escisión fijada como objetivo. Finalmente, las células transinfectadas pueden expandirse de manera clonal para obtener estirpes celulares isogénicas con mutaciones definidas.

La Figura 61A-C muestra selección de objetivo y preparación de reactivo. (a) Para Cas9 de S. pyogene, los objetivos de 20 pb (resaltado en azul) deben ir seguidos por 5'-NGG, que puede tener lugar en cualquier cadena en ADN genómico. Se recomienda usar la herramienta on-line descrita en este protocolo para ayudar a la selección de objetivo (www.genome-engineering.org/tools). (b) Esquema para cotransinfección de plásmido de expresión de Cas9 (PX165) y casete de expresión de ARNsg conducida por U6 multiplicada por PCR. Usar una plantilla de PCR que contenga activador de U6 y un cebador directo fijado (U6 Dir), puede agregarse ADN codificador de ARNsg sobre el cebador inverso de U6 (U6 Inv) y sintetizarse como un oligo ADN extendido (Oligo ultrámeros de IDT). Obsérvese que la secuencia guía (de N azul) en U6 Inv es el complemento inverso de la secuencia objetivo flanqueadora de 5'-NGG. (c) Esquema para clonación sin marca de las oligo secuencias guía en un plásmido que contiene andamio Cas9 y ARNsg (PX330). Los oligos guía (de N azul) contienen salientes para ligadura en el par de sitios de BbsI en PS330, igualándose las orientaciones de las cadenas superior y del fondo a aquéllas del objetivo genómico (es decir, oligo superior es la secuencia de 20 pb que precede 5'-NGG en ADN genómico). La digestión de PX330 con BbsI permite el reemplazo de los sitios de restricción de tipo IIs (trazado azul) con inserción directa de oligos hibridados. Cabe señalar que se puso una G extra antes de la primera base de la secuencia guía. Los solicitantes han encontrado que una G extra delante de la secuencia guía no afecta negativamente a la eficacia de la fijación como objetivo. En los casos en los que la secuencia guía de 20 nucleótidos de elección no empieza con guanina, la guanina extra asegurará que el ARNsg se transcriba de manera eficaz por el activador de U6, que prefiere una guanina en la primera base de la transcripción.

La Figura 62A-D muestra los resultados anticipados para NHEJ múltiplex. (a) Esquema de la prueba SURVEYOR usada para determinar el porcentaje de inserciones o supresiones. Primero, se multiplica por PCR ADN genómico de la población heterogénea de células fijadas como objetivo de Cas9. Se vuelven a hibridar después lentamente los amplicones para generar los heterodúplex. Se escinden los heterodúplex hibridados de nuevo mediante nucleasa SURVEYOR, mientras se dejan intactos los homodúplex. Se calcula la eficacia de escisión mediada por Cas9 (% indel) basándose en la fracción de ADN escindido, cuando se determina por intensidad integrada de bandas de gel.

(b)

Se diseñan dos ARNsg (barras naranja y azul) para fijar como objetivo los sitios (GRIN2B y DYRK1A humanos. El gel SURVEYOR muestra la modificación en ambos sitios en células transinfectadas. Las flechas coloreadas indicaron los tamaños de fragmento esperados para cada sitio. (c) Se diseña un par de ARNsg (barras azul claro y verde) para escindir un exón (azul oscuro) en el sitio EMX1 humano. Las secuencias objetivo y los PAM (rojo) se muestran en los respectivos colores y los sitios de escisión se indican por triángulo rojo. La unión prevista se muestra a continuación. Los clones individuales aislados de poblaciones de células transinfectadas con ARNsg 3, 4

o ambos se ensayan mediante PCR (OUT Dir, OUT Inv), que refleja una supresión de ∼270 pb. Se muestran los clones representativos sin modificación (12/23), modificaciones monoalélicas (10/23) y bi-alélicas (1/23). Se usan cebadores IN Dir e IN Inv para identificar sistemáticamente sucesos de inversión (Fig. 6d). (d) Cuantificación de estirpes clonales con supresiones de exones EMX1. Se usan dos pares de ARNsg (ARNsg de flanqueado izquierdo 3.1, 3.2; ARNsg de flanqueado derecho 4.1, 4.2) para mediar las supresiones de tamaños variables alrededor de un exón EMX1. Se aíslan de manera clonal células transinfectadas y se expanden por análisis de genotipado para supresiones y sucesos de inversión. De los 105 clones se detectan sistemáticamente, 51 (49%) y 11 (10%) soportando supresiones heterozigóticas y homozigóticas, respectivamente. Se proporcionan tamaños de supresión aproximados puesto que las uniones pueden ser variables.

La Figura 63A-C muestra la aplicación de ssODN (del inglés, oligodesoxirribonucleótido de cadena sencilla) y vector de fijación como objetivo para mediar la RH con mutante tanto natural como nickasa de Cas9 en células HEK293FT y HUES9 con eficacias que oscilan de 1,0-27%.

La Figura 64 muestra un esquema de un método basado en PCR para fijar como objetivo CRISPR de manera rápida y eficaz en células de mamífero. Un plásmido que contiene el activador U6 de polimerasa III de ARN humano se multiplica por PCR usando un cebador directo específico de U6 y un cebador inverso que soporta el complemento

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inverso de parte del cebador U6, el andamio ARNsg(+85) con secuencia guía y nucleótidos 7 T para terminación transcripcional. Se purifica el producto PCR resultante y se suministra conjuntamente con un plásmido que soporta Cas9 conducido por el activador CBh.

La Figura 65 muestra estuche de detección de mutación SURVEYOR de resultados transgenómicos para cada ARNg y respectivos controles. Un resultado SURVEYOR positivo es una banda grande que corresponde al PCR genómico y dos bandas más pequeñas que son el producto de la nucleasa SURVEYOR que haga una rotura de doble cadena en el sitio de una mutación. Se validó cada ARNg en la estirpe celular de ratón, Neuro-N2a, por cotransinfección transitoria liposomal con hSpCas9. 72 horas postransinfección se purificó ADN genómico usando ADN QuickExtract de Epicentre. Se realizó PCR para multiplicar el sitio de interés.

La Figura 66 muestra los resultados Surveyor para 38 crías vivas (rutas 1-38) 1 cría muerta (ruta 39) y 1 cría natural para comparación (ruta 40). Se inyectó ARNg Chd8.2 a las crías 1-19 y ARNg Chd8.3 a las crías 20-38. De las 38 crías vivas, 13 fueron positivas para una mutación. Una cría muerta también tuvo una mutación. No se detectó mutación en la muestra natural. La secuenciación PCR genómica fue consistente con los hallazgos de la prueba SURVEYOR.

La Figura 67 muestra un diseño de diferentes construcciones de NLS Cas9. Todos los Cas9 fueron la versión de codón optimizado humano de Sp Cas9. Las secuencias NLS se ligaron al gen cas9 en cualquier N-terminal o Cterminal. Todas las variantes de Cas9 con diferentes diseños NLS se clonaron en un vector de esqueleto que conteniendo eso es conducido por un activador de EF1a. En el mismo vector hay un sitio EMX1 humano que fija como objetivo ARN quimérico conducido por activador U6, formando un sistema de dos componentes.

La Figura 68 muestra la eficacia de la escisión genómica inducida por variantes de Cas9 que soportan diferentes diseños NLS. El porcentaje indica la porción de ADN genómico de EMX1 humano que se escindió por cada construcción. Todos los experimentos son de 3 replicados biológicos. n = 3, el error indica E.E.M.

La Figura 69A muestra un diseño del CRISPR-TF (factor de transcripción) con actividad de activación transcripcional. Se expresa el ARN quimérico por el activador U6, mientras una versión de doble mutante, de codón optimizado humano de la proteína Cas9 (hSpCas9m), ligada de manera operable a NLS triple y un dominio funcional VP64 se expresa por un activador de EF1a. Las dobles mutaciones, D10A y H840A, hacen a la proteína cas9 incapaz de introducir escisión pero mantiene su capacidad para fijar como objetivo ADN cuando se guía por el ARN quimérico.

La Figura 69B muestra la activación de la transcripción del gen SOX2 humano con sistema CRISPR-TF (ARN quimérico y la proteína de fusión Cas9-NLS-VP64). Se transinfectaron células 293FT con plásmidos que soportaban dos componentes: (1) diferentes ARN quiméricos conducidos por U6 que fijan como objetivo secuencias de 20 pb en

o alrededor del sitio genómico SOX2 humano y (2) proteína de fusión hSpCas9m (doble mutante)-NLS-VP64 conducida por EF1a. 96 horas postransinfección, se recogieron las células 293FT y se midió el nivel de activación por la inducción de expresión de ARNm usando una prueba qRT-PCR (del inglés, reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa). Se normalizan todos los niveles de expresión contra el grupo de control (barra gris), que representa los resultados de células transinfectadas con el plásmido de esqueleto de CRISPR-TF sin ARN quimérico. Las sondas de qRT-PCR usadas para detectar el ARNm de SOX2 es la prueba de expresión de genes humanos Taqman (Life Technologies). Todos los experimentos representan datos de 3 replicados biológicos, n=3, las barras de error muestran E.E.M.

La Figura 70 representa la optimización de la arquitectura NLS para SpCas9.

La Figura 71 muestra una representación gráfica de QQ para las secuencias NGGNN.

La Figura 72 muestra un histograma de la densidad de datos con distribución normal fijada (línea negra) y 0,99 de cuantil (línea de puntos).

La Figura 73A-C muestra represión guiada por ARN de expresión de bgaA por ARNdg::cas9**. a. La proteína Cas9 se une al ARNtracr y al precursor de ARN de CRISPR que se trata por RNAseIII para formar el ARNcr. El ARNcr dirige la unión de Cas9 al activador de bgaA y reprime la transcripción. b. Se representan los objetivos usados para dirigir Cas9** al activador de bgaA. El codón putativo -35, -10 así como el codón de partida bgaA están en negrita. c. La actividad de la betagalactosidasa cuando se mide por la prueba de Miller en ausencia de fijación como objetivo y para los cuatro objetivos diferentes.

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La Figura 74A-E muestra caracterización de represión mediada por Cas9**. a. El gen gfpmut2 y su activador, incluyendo las señales -35 y -10 se representan junto con la posición de los diferentes sitios objetivo usados en el estudio. b. Fluorescencia relativa en la fijación como objetivo de la cadena codificadora. c. Fluorescencia relativa en la fijación como objetivo de la cadena no codificadora. d. Método de Northern con sondas B477 y B478 sobre ARN extraído de T5, T10, B10 o una cepa de control sin un objetivo. e. Efecto de un número creciente de mutaciones en el extremo 5' del ARNcr de B1, T5 y B10.

Las figuras en la presente memoria son sólo para fines ilustrativos y no están necesariamente dibujadas a escala.

Descripción detallada de la invención

Los términos "polinucleótido", "nucleótido", "secuencia de nucleótidos", "ácido nucleico" y "oligonucleótido" se usan de forma intercambiable. Se refieren a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos o análogos de los mismos. Los polinucleótidos pueden tener cualquier estructura tridimensional y pueden realizar cualquier función, conocida o desconocida. Los siguientes no son ejemplos limitantes de los polinucleótidos: regiones codificadoras o no codificadoras de un gen o fragmento de gen, sitios (sitio) definidos a partir de análisis de unión, exones, intrones, ARN mensajero (ARNm), ARN de transferencia, ARN ribosómico, ARN de interferencia corta (ARNic), ARN de horquilla corta (ARNhc), micro-ARN (ARNmi), ribozimas y ADNc, polinucleótidos recombinantes, polinucleótidos ramificados, plásmidos, vectores, ADN aislado de cualquier secuencia, ARN aislado de cualquier secuencia, sondas de ácidos nucleicos y cebadores. Un polinucleótido puede comprender uno o más nucleótidos modificados, tales como nucleótidos metilados y análogos de nucleótidos. Si hay, se pueden impartir modificaciones a la estructura del nucleótido antes o después del ensamblado del polímero. La secuencia de nucleótidos puede ser interrumpida por componentes no nucleótidos. Un polinucleótido puede ser modificado además después de polimerización, tal como por conjugación con un componente etiquetado.

En aspectos de la invención, los términos "ARN quimérico", "ARN guía quimérico", "ARN guía", "ARN guía único" y "ARN guía sintético" se usan de forma intercambiable y se refieren a la secuencia de polinucleótidos que comprende la secuencia guía, la secuencia tracr y la secuencia de emparejamiento tracr. El término "secuencia guía" se refiere a la secuencia de aproximadamente 20 pb dentro del ARN guía que especifica el sitio objetivo y se puede usar de manera intercambiable con los términos "guía" o "espaciador". El término "secuencia de emparejamiento tracr" también se puede usar de forma intercambiable con el término "repetición o repeticiones directas".

Como se usa en la presente memoria el término "natural" es un término de la técnica entendido por los expertos y significa la forma típica de un organismo, cepa, gen o característica como se encuentra en la naturaleza como se distingue de formas mutantes o variantes.

Como se usa en la presente memoria, el término "variante" se debería considerar que significa la exhibición de cualidades que presentan un patrón que se desvía de lo que ocurre en la naturaleza.

Los términos "que no se encuentra en la naturaleza" o "logrado" se usan de forma intercambiable e indican la implicación de la mano del hombre. Los términos, cuando se refieren a moléculas de ácido nucleico o polipéptidos significan que la molécula de ácido nucleico o el polipéptido está al menos sustancialmente exento de al menos otro componente con el que se asocian de manera natural en la naturaleza y como se encuentran en la naturaleza.

"Complementariedad" se refiere a la capacidad de un ácido nucleico para formar el enlace o enlaces de hidrógeno con otra secuencia de ácidos nucleicos por emparejamiento de bases de Watson-Crick tradicional u otros tipos no tradicionales. Un porcentaje de complementariedad indica el porcentaje de restos en una molécula de ácido nucleico que puede formar enlaces de hidrógeno (por ej., emparejamiento de bases de Watson-Crick) con una segunda secuencia de ácidos nucleicos (por ej., 5, 6, 7, 8, 9, 10 de un total de 10 siendo complementariedad del 50%, 60%, 70%, 80%, 90% y 100%). "Perfectamente complementario" significa que todos los restos contiguos de una secuencia de ácidos nucleicos formarán enlace de hidrógeno con el mismo número de restos contiguos en una segunda secuencia de ácidos nucleicos. "Sustancialmente complementario" como se usa en la presente memoria se refiere a un grado de complementariedad que es al menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%%, 95%, 97%, 98%, 99% o 100% por una región de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o más nucleótidos o se refiere a dos ácidos nucleicos que se hibridan en condiciones rigurosas.

Como se usa en la presente memoria, "condiciones rigurosas" para hibridación se refiere a las condiciones en las cuales un ácido nucleico que tiene complementariedad a una secuencia objetivo se hibrida predominantemente con la secuencia objetivo y sustancialmente no se hibrida a las secuencias no objetivo. Las condiciones rigurosas son en general dependientes de la secuencia y varían dependiendo de una serie de factores. En general, cuanto más larga la secuencia, mayor la temperatura a la que se hibrida de manera específica la secuencia a su secuencia objetivo. Se describen con detalle ejemplos no limitantes de condiciones rigurosas en Tijssen (1.993), Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization With Nucleic Acid Probes Part I, Segundo Capítulo "Overview of

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Varios aspectos de la invención se refieren a sistemas vector que comprenden uno o más vectores o vectores como tales. Se pueden diseñar vectores para expresión de transcritos CRISPR (por ejemplo, transcritos de ácidos nucleicos, proteínas o enzimas) en células procariotas o eucariotas. Por ejemplo, se pueden expresar transcritos de CRISPR en células bacterianas tales como Escherichia coli, células de insecto (usando vectores de expresión de baculovirus), células de levaduras o células de mamíferos. Las células huésped adecuadas se discuten además en Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego; Calif. (1.990). Alternativamente, el vector de expresión recombinante se puede transcribir y traducir in vitro, por ejemplo, usando secuencias reguladoras de activador T7 y polimerasa T7.

Se pueden introducir vectores y propagar en una procariota. En algunas realizaciones, se usa una procariota para multiplicar copias de un vector que se tiene que introducir en una célula eucariota o como un vector intermedio en la producción de un vector que se tiene que introducir en una célula eucariota (por ej., multiplicando un plásmido como parte de un sistema de empaquetamiento de vector vírico). En algunas realizaciones, se usa una procariota para multiplicar copias de un vector y expresar uno o más ácidos nucleicos, tal como para proporcionar una fuente de una

o más proteínas para suministro a una célula huésped u organismo huésped. La expresión de proteínas en procariotas se lleva a cabo lo más frecuentemente en Escherichia coli con vectores que contienen activadores constitutivos o inducibles que dirigen la expresión de proteínas de fusión o de no fusión. Los vectores de fusión añaden una serie de aminoácidos a una proteína codificada allí, tal como al término amino de la proteína recombinante. Dichos vectores de fusión pueden servir para uno o más fines, tales como: (i) para aumentar la expresión de proteína recombinante; (ii) para aumentar la solubilidad de la proteína recombinante y (iii) para ayudar en la purificación de la proteína recombinante actuando como un ligando en purificación de afinidad. Con frecuencia, en vectores de expresión de fusión, se introduce un sitio de escisión proteolítico en la unión del resto de fusión y la proteína recombinante para permitir la separación de la proteína recombinante del resto de fusión posterior a la purificación de la proteína de fusión. Tales enzimas, y sus secuencias de reconocimiento afines, incluyen Factor Xa, trombina y enterocinasa. Vectores de expresión de fusión de ejemplo incluyen pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith y Johnson, 1.988. Gene 67: 31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, Mass.) y pRIT5 (Pharmacia, Piscataway,

N.

J.) que condensan glutationa S-transferasa (GST), proteína de unión de maltosa E o proteína A, respectivamente, a la proteína recombinante objetivo.

Ejemplos de vectores de expresión de E. coli no de fusión, inducibles, adecuados, incluyen pTrc (Amrann et al.,

(1.988) Gene 69: 301-315) y pET 11d (Studier et al., GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1.990) 60-89).

En algunas realizaciones, un vector es un vector de expresión de levadura. Ejemplos de vectores para expresión en levadura Saccharomyces cerivisae incluyen pYepSec1 (Baldari, et al., 1.987. EMBO J. 6: 229-234), pMFa (Kuijan y Herskowitz, 1.982. Cell 30: 933-943), pJRY88 (Schultz et al., 1.987. Gene 54: 113-123), pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, Calif.) y picZ (InVitrogen Corp, San Diego, Calif.).

En algunas realizaciones, un vector conduce la expresión de proteínas en células de insecto usando vectores de expresión de baculovirus. Los vectores baculovirus disponibles para expresión de proteínas en células de insecto cultivadas (por ej., células SF9) incluyen la serie pAc (Smith, et al., 1.983. Mol. Cell. Biol. 3: 2.156-2.165) y la serie pVL (Lucklow y Summers, 1.989. Virology 170: 31-39).

En algunas realizaciones, un vector es capaz de conducir la expresión de una o más secuencias en células de mamífero usando un vector de expresión de mamífero. Ejemplos de vectores de expresión de mamífero incluyen pCDM8 (Seed, 1.987. Nature 329: 840) y pMT2PC (Kaufman, et al., 1.987. EMBO J. 6: 187-195). Cuando se usa en células de mamífero, las funciones de control del vector de expresión se proporcionan típicamente por uno o más elementos reguladores. Por ejemplo, los activadores usados comúnmente proceden de polioma, adenovirus 2, citomegalovirus, virus 40 de simio y otros descritos en la presente memoria y conocidos en la técnica. Para otros sistemas de expresión adecuados para células tanto procariotas como eucariotas véanse, por ejemplo, los Capítulos 16 y 17 de Sambrook, et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL. 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1.989.

En algunas realizaciones, el vector de expresión de mamíferos recombinante es capaz de dirigir la expresión del ácido nucleico preferentemente en un tipo de célula particular (por ejemplo, se usan elementos reguladores específicos del tejido para expresar el ácido nucleico). Los elementos reguladores específicos del tejido son conocidos en la técnica. Ejemplos no limitantes de activadores específicos del tejido adecuados incluyen el activador de albúmina (específico del hígado; Pinkert, et al., 1.987. Genes Dev. 1: 268-277), activadores específicos linfoides (Calame y Eaton, 1.988. Adv. Immunol. 43: 235-275), en particular activadores de receptores de células T (Winoto y Baltimore, 1.989. EMBO J. 8: 729-733) e inmunoglobulinas (Baneiji, et al., 1.983. Cell 33: 729-740; Queen y Baltimore, 1.983. Cell 33: 741-748), activadores específicos de las neuronas (por ej., el activador de neurofilamentos; Byrne y Ruddle, 1.989. Proc. Natl. Acad Sci. USA 86: 5.473-5.477), activadores específicos del páncreas (Edlund, et al., 1.985. Science 230: 912-916) y activadores específicos de las glándulas mamarias (por ej., activador de suero de leche; Patente de EE.UU. Nº 4. 873. 316 y Publicación de la Solicitud de Patente Europea Nº

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264.166). También se incluyen activadores regulados por el desarrollo, por ej., los activadores de hox de murina (Kessel y Gruss, 1.990. Science 249: 374-379) y el activador de α-fetoproteína (Campes y Tilghman, 1.989. Genes Dev. 3: 537-546).

En algunas realizaciones, un elemento regulador se une de manera operable a uno o más elementos de un sistema CRISPR a fin de conducir la expresión de uno o más elementos del sistema CRISPR. En general, las CRISPR (Repeticiones Palindrómicas Cortas Agrupadas y Regularmente Interespaciadas, por sus siglas en inglés), también conocidas como las SPIDR (Repeticiones Directas Intercaladas Separadas, por sus siglas en inglés), constituyen una familia de sitios de ADN que son normalmente específicos para una especie bacteriana particular. El sitio de CRISPR comprende una clase distinta de repeticiones de secuencias cortas intercaladas (las SSR, por sus siglas en inglés) que se reconocieron en E. coli (Ishino et al., J. Bacteriol., 169: 5.429-5.433 [1.987] y Nakata et al., J. Bacteriol., 171: 3.553-3.556 [1.989]) y genes asociados. Las SSR intercaladas similares han sido identificadas en Haloferax mediterranei, Streptococcus pyogenes, Anabaena y Mycobacterium tuberculosis (Véase, Groenen et al., Mol. Microbiol., 10: 1.057-1.065 [1.993]; Hoe et al., Emerg. Infect. Dis., 5: 254-263 [1.999]; Masepohl et al., Biochim. Biophys. Acta 1.307: 26-30 [1.996] y Mojica et al., Mol. Microbiol., 17: 85-93 [1.995]). El sitio de CRISPR difiere típicamente de las otras SSR por la estructura de las repeticiones, que se han denominado repeticiones espaciadas regularmente cortas (las SRSR, por sus siglas en inglés) (Janssen et al. OMICS J. Integ. Biol., 6: 23-33 [2.002] y Mojica et al., Mol. Microbiol., 36: 244-246 [2.000]). En general, las repeticiones son elementos cortos que tienen lugar en agrupaciones que están regularmente espaciadas por secuencias de intervención únicas con una longitud sustancialmente constante (Mojica et al., [2.000], supra). Aunque las secuencias de repeticiones se conservan mucho entre cepas, el número de repeticiones intercaladas y las secuencias de las regiones espaciadoras difieren típicamente de cepa a cepa (van Embden et al., J. Bacteriol., 182: 2.393-2.401 [2.000]). Se ha identificado el sitio de CRISPR en más de 40 procariotas (Véase por ej., Jansen et al., Mol. Microbiol., 43: 1.565-1.575 [2.002] y Mojica et al., [2.005]) incluyendo, pero no limitado a Aeropyrum, Pyrobaculum, Sulfolobus, Archaeoglobus. Halocarcula, Methanobacterium, Methanococcus, Methanosarcina, Methanopyrus, Pyrococcus, Picrophilus, Thermoplasma, Corynebacterium, Mycobacterium, Streptomyces, Aquifex, Porphyromonas, Chlorobium, Thermus, Bacillus, Listeria, Staphylococcus, Clostridium, Thermoanaerobacter, Mycoplasma, Fusobacterium, Azarcus, Chromobacterium, Neisseria, Nitrosomonas, Desulfovibrio, Geobacter, Myxococcus, Campylobacter, Wolinella. Acinetobacter, Erwinia, Escherichia, Legionella, Methylococcus, Pastaurella, Photobacterium, Salmonella, Xanthomonas, Yersinia, Treponema y Thermotoga.

En general, "sistema CRISPR" se refiere colectivamente a transcritos y otros elementos implicados en la expresión de o dirigidos a la actividad de genes asociados a CRISPR ("Cas"), incluyendo secuencias que codifican un gen Cas, una secuencia tracr (CRISPR trans-activante) (por ej., ARNtracr o un ARNtracr parcial activo), una secuencia de emparejamiento tracr (incluyendo una "repetición directa" y una repetición directa parcial tratada por ARNtracr en el contexto de un sistema CRISPR endógeno), una secuencia guía (también referida como un "espaciador" en el contexto de un sistema CRISPR endógeno) u otras secuencias y transcritos de un sitio CRISPR. En algunas realizaciones, uno o más elementos de un sistema CRISPR proceden de un sistema CRISPR tipo I, tipo II o tipo III. En algunas realizaciones, uno o más elementos de un sistema CRISPR proceden de un organismo particular que comprende un sistema CRISPR endógeno, tal como Streptococcus pyogenes. En general, un sistema CRISPR se caracteriza por elementos que activan la formación de un complejo CRISPR en el sitio de una secuencia objetivo (también referido como un protoespaciador en el contexto de un sistema CRISPR endógeno). En el contexto de formación de un complejo CRISPR, "secuencia objetivo" se refiere a una secuencia para la que se diseña una secuencia guía que presente complementariedad, donde la hibridación entre una secuencia objetivo y una secuencia guía active la formación de un complejo CRISPR. No se requiere necesariamente complementariedad completa, siempre que haya suficiente complementariedad para producir hibridación y activar la formación de un complejo CRISPR. Una secuencia objetivo puede comprender cualquier polinucleótido, tal como polinucleótidos de ADN o ARN. En algunas realizaciones, se sitúa una secuencia objetivo en el núcleo o citoplasma de una célula. En algunas realizaciones, la secuencia objetivo puede estar dentro de un organelo de una célula eucariota, por ejemplo, mitocondria o cloroplasto. Una secuencia o plantilla que se puede usar para recombinación en el sitio fijado como objetivo que comprende las secuencias objetivo se refiere como una “plantilla de edición” o “polinucleótido de edición” o “secuencia de edición”. En aspectos de la invención, un polinucleótido de plantilla exógeno se puede referir como una plantilla de edición. En un aspecto de la invención la recombinación es recombinación homóloga.

Típicamente, en el contexto de un sistema CRISPR endógeno, la formación de un complejo CRISPR (que comprende una secuencia guía hibridada a una secuencia objetivo y complejada con una o más proteínas Cas) da como resultado la escisión de una o más cadenas en o cerca de (por ej., dentro de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 50

o más pares de bases de) la secuencia objetivo. Sin desear estar limitados por la teoría, la secuencia tracr, que puede comprender o constar de toda o una porción de una secuencia tracr natural (por ej., aproximadamente o más de aproximadamente 20, 26, 32, 45, 48, 54, 63, 67, 85 o más nucleótidos de una secuencia tracr natural), también puede formar parte de un complejo CRISPR, tal como por hibridación a lo largo de al menos una porción de la secuencia tracr a toda o una porción de una secuencia de emparejamiento tracr que esté ligada de manera operable a la secuencia guía. En algunas realizaciones, la secuencia tracr presenta suficiente complementariedad a una secuencia de emparejamiento tracr para hibridar y participar en la formación de un complejo CRISPR. Como con la

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mutagénico. Una única nickasa (Cas9-D10A con un único ARNsg) es incapaz de inducir NHEJ y crear inserciones o supresiones (las indel) pero los Solicitantes han demostrado que la nickasa doble (Cas9-D10A y dos ARNsg fijados como objetivo a diferentes cadenas en la misma posición) lo puede hacer en células madre embrionarias humanas (las hESC, por sus siglas en inglés). La eficacia es aproximadamente 50% de nucleasa (es decir, Cas9 regular sin mutación D10) en las hESC.

Como un ejemplo más, dos o más dominios catalíticos de Cas9 (RuvC I, RuvC II y RuvC III) pueden mutar para producir un Cas9 mutado que carece sustancialmente de toda actividad de escisión de ADN. En algunas realizaciones, una mutación de D10A se combina con una o más de las mutaciones H840A, N854A o N863A para producir una enzima Cas9 que carece sustancialmente de toda actividad de escisión de ADN. En algunas realizaciones, se considera que una enzima CRISPR carece sustancialmente de toda actividad de escisión de ADN cuando la actividad de escisión de ADN de la enzima mutada es menor que aproximadamente 25%, 10%, 5%, 1%, 0,1%, 0,01% o menor con respecto a su forma no mutada. Pueden ser útiles otras mutaciones; en el caso de que la Cas9 u otra enzima CRISPR sea de una especie distinta de S. pyogenes, se pueden realizar mutaciones en los correspondientes aminoácidos para conseguir efectos similares.

En algunas realizaciones, una secuencia codificadora de enzimas que codifica una enzima CRISPR es codón optimizada para expresión en células particulares, tales como células eucariotas. Las células eucariotas pueden ser aquéllas de, o procedentes de, un organismo particular, tal como un mamífero, incluyendo, pero no limitado a, ser humano, ratón, rata, conejo, perro o primate no ser humano. En general, optimización de codón se refiere a un procedimiento para modificar una secuencia de ácidos nucleicos para mejorar la expresión en las células huésped de interés reemplazando al menos un codón (por ej., aproximadamente o más de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50 o más codones) de la secuencia natural con codones que se usan más frecuentemente o lo más frecuentemente en los genes de esa célula huésped al tiempo que se mantiene la secuencia de aminoácidos natural. Diversas especies presentan sesgo particular para ciertos codones de un aminoácido particular. El sesgo de codones (diferencias en el uso de codones entre organismos) con frecuencia se correlaciona con la eficacia de traducción de ARN mensajero (ARNm), que se cree a su vez que depende de, entre otras cosas, las propiedades de los codones que se están traduciendo y la disponibilidad de moléculas de ARN de transferencia (ARNt) particulares. La predominancia de los ARNt seleccionados en una célula es en general un reflejo de los codones usados lo más frecuentemente en síntesis de péptidos. De acuerdo con esto, se pueden adaptar los genes para expresión óptima de los genes en un organismo determinado basándose en optimización de codones. Las tablas de utilización de codones están fácilmente disponibles, por ejemplo, en la “Base de Datos de Uso de Codones” y estas tablas se pueden adaptar de una serie de maneras. Véase Nakamura Y., et al. "Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases: status for the year 2000" Nucl. Acids Res. 28: 292 (2.000). También están disponibles algoritmos de ordenador para codones optimizando una secuencia particular para expresión en una célula huésped particular, también están disponibles tales como Gene Forge (Aptagen; Jacobus, PA). En algunas realizaciones, uno

o más codones (por ej., 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50 o más o todos los codones) en una secuencia codificando una enzima CRISPR corresponden al codón usado lo más frecuentemente para un aminoácido particular.

En algunas realizaciones, un vector codifica una enzima CRISPR que comprende una o más secuencias de localización nuclear (las NLS, por sus siglas en inglés), tales como aproximadamente o más de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más NLS. En algunas realizaciones, la enzima CRISPR comprende aproximadamente o más de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más NLS en o cerca del amino terminal, aproximadamente o más de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más NLS en o cerca del carboxi terminal o una combinación de éstos (por ejemplo, una o más NLS en el amino terminal y una o más NLS en el carboxi terminal). Cuando está presente más de una NLS, cada una se puede seleccionar independientemente de las otras, de manera que puede estar presente una sola NLS en más de una copia y/o junto con otra u otras NLS más presentes en una o más copias. En una realización preferida de la descripción, la enzima CRISPR comprende a lo sumo 6 NLS. En algunas realizaciones, se considera una NLS cerca del N-o C-terminal cuando el aminoácido más cercano de la NLS está dentro de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50 o más aminoácidos a lo largo de la cadena polipeptídica del N o C-terminal. Típicamente, una NLS consta de una o más secuencias cortas de lisinas o argininas cargadas positivamente expuestas en la superficie de la proteína, pero se conocen otros tipos de NLS. Ejemplos no limitantes de las NLS incluyen una secuencia de NLS procedente de: la NLS del antígeno T grande del virus SV40, que tiene la secuencia de aminoácidos PKKKRKV; la NLS de nucleoplasmina (por ej., la NLS bipartita de nucleoplasmina con la secuencia KRPAATKKAGQAKKKK); la NLS de c-myc que tiene la secuencia de aminoácidos PAAKRVKLD o RQRRNELKRSP; la NLS M9 del hRNPA1 que tiene la secuencia NQSSNFGPMKGGNFGGRSSGPYGGGGQYFAKPRNQGGY; la secuencia RMRIZFKNKGKDTAELRRRRVEVSVELRKAKKDEQILKRRNV del dominio IBB de importina-alfa; las secuencias VSRKRPRP y PPKKARED de la proteína T de mioma; la secuencia POPKKKPL de p53 humano; la secuencia SALIKKKKKMAP de c-abl IV de ratón; las secuencias DRLRR y PKQKKRK del virus de la influenza NS1; la secuencia RKLKKKIKKL del antígeno delta del virus de la Hepatitis; la secuencia REKKKFLKRR de la proteína Mx1 del ratón; la secuencia KRKGDEVDGVDEVAKKKSKK de la poli(ADP-ribosa) polimerasa humana y la secuencia RKCLQAGMNLEARKTKK del glucocorticoide de receptores de hormonas esteroideas (humano).

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En algunas realizaciones, se selecciona una secuencia guía para reducir el grado de estructura secundaria dentro de la secuencia guía. La estructura secundaria se puede determinar por cualquier algoritmo de plegamiento de polinucleótidos adecuado. Algunos programas se basan en calcular la energía libre mínima de Gibbs. Un ejemplo de uno de tales algoritmos es mFold, como se describe por Zuker y Stiegler (Nucleic Acids Res. 9 (1.981), 133-148). Otro algoritmo de plegamiento de ejemplo es el RNAfold webserver online, desarrollado en el Instituto para Química Teórica de la Universidad de Viena, usando el algoritmo de predicción de estructura centroide (véase por ej., A. R. Gruber et al., 2.008, Cell 106 (1): 23-24 y PA Carr y GM Church, 2.009, Nature Biotechnology 27 (12): 1.151-62).

En general, una secuencia de emparejamiento tracr incluye cualquier secuencia que presente suficiente complementariedad con una secuencia tracr para activar uno o más de: (1) escisión de una secuencia guía flanqueada por secuencias de emparejamiento tracr en una célula que contiene la correspondiente secuencia tracr y

(2) formación de un complejo CRISPR en una secuencia objetivo, en la que el complejo CRISPR comprende la secuencia de emparejamiento tracr hibridada a la secuencia tracr. En general, el grado de complementariedad es con referencia al alineamiento óptimo de la secuencia de emparejamiento tracr y la secuencia tracr, junto con la longitud del acortador de las dos secuencias. El alineamiento óptimo se puede determinar por cualquier algoritmo de alineamiento adecuado y puede justificar además estructuras secundarias, tal como autocomplementareidad dentro de cualquiera, la secuencia tracr o la secuencia de emparejamiento tracr. En algunas realizaciones, el grado de complementariedad entre la secuencia tracr y la secuencia de emparejamiento tracr junto con la longitud del acortador de las dos cuando se alinean de manera óptima es aproximadamente o más de aproximadamente 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97,5%, 99% o mayor. Las ilustraciones de ejemplo de alineación óptima entre una secuencia tracr y una secuencia de emparejamiento tracr se proporcionan en las Figuras 12B y 13B. En algunas realizaciones, la secuencia tracr es aproximadamente o más de aproximadamente 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50 o más nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, la secuencia tracr y secuencia de emparejamiento tracr están contenidas dentro de un transcripto único, de manera que la hibridación entre las dos produce un transcripto con una estructura secundaria, tal como una horquilla. Las secuencias formadoras de bucle preferidas para uso en estructuras de horquilla tienen cuatro nucleótidos de longitud y lo más preferiblemente tienen la secuencia GAAA. Sin embargo, se pueden usar secuencias de bucle más largas o más cortas, como se pueden usar secuencias alternativas. Las secuencias incluyen preferiblemente un triplete nucleótido (por ejemplo, AAA) y un nucleótido adicional (por ejemplo, C o G). Ejemplos de secuencias formadoras de bucle incluyen CAAA y AAAG. En una realización de la descripción, el transcripto o secuencia de polinucleótidos transcrita presenta al menos dos o más horquillas. En realizaciones preferidas, el transcripto presenta dos, tres, cuatro o cinco horquillas. En una realización más de la descripción, el transcripto presenta a lo sumo cinco horquillas. En algunas realizaciones, el transcripto único incluye además una secuencia de terminación de la transcripción; preferiblemente esta es una secuencia poliT, por ejemplo, seis nucleótidos T. Una ilustración de ejemplo de dicha estructura de horquilla se proporciona en la porción inferior de la Figura 13B, donde la porción de la secuencia 5' del "N" final y aguas arriba del bucle corresponde a la secuencia de emparejamiento tracr y la porción de la secuencia 3' del bucle corresponde a la secuencia tracr. Ejemplos no limitantes adicionales de polinucleótidos únicos que comprenden una secuencia guía, una secuencia de emparejamiento tracr y una secuencia tracr son como sigue (enumerados 5' a 3'), donde "N" representa una base de una secuencia guía, el primer bloque de letras de la caja inferior representan la secuencia de emparejamiento tracr y el segundo bloque de letras de la caja inferior representa la secuencia tracr y la secuencia poli-T final representa el terminador de la transcripción: (1)

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En algunas realizaciones, las secuencias (1) a (3) se usan junto con Cas9 de CRISPR1 de S. thermophilus. En algunas realizaciones, las secuencias (4) a (6) se usan junto con Cas9 de S. pyogenes. En algunas realizaciones, la secuencia tracr es un transcrito separado de un transcrito que comprende la secuencia de emparejamiento tracr (tal como se ilustra en la porción superior de la Figura 13B).

En algunas realizaciones, también se proporciona una plantilla de recombinación. Una plantilla de recombinación puede ser un componente de otro vector como se describe en la presente memoria, contenido en un vector separado o proporcionado como un polinucleótido separado. En algunas realizaciones, se diseña una plantilla de recombinación para servir como una plantilla en recombinación homóloga, tal como dentro de o cerca de una secuencia objetivo nickeada o escindida por una enzima CRISPR como parte de un complejo CRISPR. Un polinucleótido de plantilla puede ser de cualquier longitud adecuada, tal como aproximadamente o más aproximadamente 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 500, 1.000 o más nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, el polinucleótido de plantilla es complementario a una porción de un polinucleótido que comprende la secuencia objetivo. Cuando se alinea de manera óptima, un polinucleótido de plantilla puede solaparse con uno o más nucleótidos de una secuencia objetivo (por ej., aproximadamente o más de aproximadamente 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100 o más nucleótidos). En algunas realizaciones, cuando una secuencia de plantilla y un polinucleótido que comprende una secuencia de plantilla se alinean de manera óptima, el nucleótido más cercano del polinucleótido de plantilla está dentro de aproximadamente 1, 5, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 200, 300, 400, 500, 1.000, 5.000, 10.000 o más nucleótidos de la secuencia objetivo.

En algunas realizaciones, la enzima CRISPR es parte de una proteína de fusión que comprende uno o más dominios de proteína heteróloga (por ej., aproximadamente o más de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más dominios además de la enzima CRISPR). Una proteína de fusión de enzima CRISPR puede comprender cualquier secuencia de proteínas adicional y opcionalmente una secuencia ligadora entre dos dominios cualesquiera. Ejemplos de dominios de proteínas que se pueden condensar a una enzima CRISPR incluyen, sin limitación, etiquetas de epítopos, secuencias de genes informadores y dominios de proteínas con una o más de las siguientes actividades: actividad de metilasa, actividad de desmetilasa, actividad de activación de la transcripción, actividad de represión de la transcripción, actividad del factor de liberación de la transcripción, actividad de modificación de histona, actividad de escisión de ARN y actividad de unión de ácidos nucleicos. Ejemplos no limitantes de etiquetas de epítopos incluyen etiquetas de histidina (His), etiquetas V5, etiquetas FLAG, etiquetas de hemaglutinina de la influenza (HA), etiquetas Myc, etiquetas VSV-G y etiquetas de tioredoxina (Trx). Los ejemplos de genes informadores incluyen, pero no se limitan a, glutationa-S-transferasa (GST), peroxidasa de rábano (HRP, por sus siglas en inglés), cloramfenicol acetiltransferasa (CAT, por sus siglas en inglés) beta-galactosidasa, betaglucuronidasa, luciferasa, proteína fluorescente verde (PFV), HcRed, DsRed, proteína fluorescente cian (PFC) proteína fluorescente amarilla (PFAm) y proteínas autofluorescentes incluyendo proteína fluorescente azul (PFA). Una enzima CRISPR se puede condensar a una secuencia de genes que codifique una proteína o un fragmento de una proteína que una moléculas de ADN o una otras moléculas celulares, incluyendo pero no limitándose a (por sus siglas en inglés), proteína de unión de maltosa (MBP), etiqueta S, fusiones de dominios de unión de ADN Lex A (DBD), fusiones de dominios de unión de ADN GAL4 y fusiones de proteínas BP16 de virus del herpes simple (HSV). Los dominios adicionales que pueden formar parte de una proteína de fusión que comprende una enzima CRISPR se describen en la patente de EE.UU. 20110059502. En algunas realizaciones, se usa una enzima CRISPR etiquetada para identificar la posición de una secuencia objetivo.

En algunos aspectos, la descripción proporciona métodos que comprenden suministrar uno o más polinucleótidos, tales como o uno o más vectores como se describe en la presente memoria, uno o más transcritos de los mismos y/o una o proteínas transcritas de allí, a una célula huésped. En algunos aspectos, la descripción proporciona además células producidas por tales métodos y organismos (tales como animales, plantas u hongos) que comprenden o son producidos de tales células. En algunas realizaciones, se suministra una enzima CRISPR junto con (y opcionalmente complejada con) una secuencia guía a una célula. Se pueden usar métodos de transferencia de genes con base vírica y no vírica convencionales para introducir ácidos nucleicos en células de mamífero o tejidos objetivo. Se pueden usar dichos métodos para administrar componentes que codifican ácidos nucleicos de un

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polinucleótido de manera que dicha unión dé como resultado expresión aumentada o disminuida de dicho polinucleótido; en el que el complejo CRISPR comprende una enzima CRISPR complejada con una secuencia guía hibridada a una secuencia fijada como objetivo dentro de dicho polinucleótido, en el que dicha secuencia guía está ligada a una secuencia de emparejamiento tracr que a su vez hibrida a una secuencia tracr.

Con los recientes avances en la genómica de cultivos, la capacidad para usar sistemas CRISPR-Cas para realizar edición y manipulación de genes eficaz y de coste eficaz permitirá la rápida selección y la comparación de manipulaciones genéticas únicas y multiplexadas para transformar dichos genomas para producción mejorada y cebos mejorados. Con respecto a esto se hace referencia a las Patentes y publicaciones de EE.UU.: Patente de EE.UU. Nº 6.603.061 -Agrobacterium-Mediated Plant Transformation Method; la Patente de EE.UU. Nº 7.868.149 -Plant Genome Sequences and Uses Thereof y la Patente de EE.UU. 2009/0100536 -Transgenic Plants with Enhanced Agronomic Traits, Morrell et al "Crop genomics: advances and applications" Nat Inv Genet. 29 de diciembre de 2.011; 13 (2): 85-96. En una realización ventajosa de la invención, el sistema CRISPR/Cas9 se usa para lograr microalgas (Ejemplo 15). De acuerdo con esto, la referencia en la presente memoria a células de animales puede aplicarse también, mutatis mutandis, a células de plantas a menos que sea evidente de otro modo.

En un aspecto, la descripción proporciona métodos para modificar un polinucleótido objetivo en una célula eucariota, que puede ser in vivo, ex vivo o in vitro. En algunas realizaciones, el método comprende muestrear una célula o población de células de un animal humano o no humano o planta (incluyendo microalgas) y modificar la célula o células. Puede tener lugar cultivo en cualquier fase ex vivo. La célula o las células pueden ser introducidas de nuevo incluso en el animal no humano o planta (incluyendo microalgas).

En las plantas, los patógenos son con frecuencia específicos del huésped. Por ejemplo, Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici produce marchitamiento del tomate pero ataca sólo al tomate y F. oxysporum f. dianthii Puccinia graminis

f. sp. tritici ataca sólo al trigo. Las plantas tienen defensas existentes e inducidas para resistir a la mayoría de los patógenos. Las mutaciones y los casos de recombinación a través de generaciones de plantas conducen a variabilidad genética que da lugar a susceptibilidad, especialmente ya que los patógenos se reproducen con más frecuencia que las plantas. En las plantas puede haber resistencia al no huésped, por ej., el huésped y el patógeno son incompatibles. También puede haber Resistencia Horizontal, por ej., resistencia parcial frente a todas las razas de un patógeno, controlado típicamente por muchos genes y Resistencia Vertical, por ej., resistencia completa a algunas razas de un patógeno pero no a otras razas, controlado típicamente por unos genes. En un nivel de Gen por Gen, las plantas y los patógenos evolucionan juntos y los cambios genéticos en uno equilibran los cambios en otro. De acuerdo con eso, usando Variabilidad Natural, los criadores combinan genes lo más útiles para Rendimiento, Calidad, Uniformidad, Dureza, Resistencia. Las fuentes de genes de resistencia incluyen Variedades naturales o extrañas, Variedades Heirloom, Mutaciones relativas a plantas silvestres e inducidas, por ej., tratando material vegetal con agentes mutagénicos. Usando la presente descripción, se les proporciona a los criadores de plantas una nueva herramienta para inducir mutaciones. De acuerdo con esto, un experto en la materia puede analizar el genoma de fuentes de genes de resistencia y en Variedades con características o rasgos deseados se emplea la presente descripción para inducir la elevación de genes de resistencia con más precisión que los agentes mutagénicos previos y por lo tanto se aceleran y mejoran los programas de cultivo de plantas.

En un aspecto, la descripción proporciona estuches que contienen uno o más cualesquiera de los elementos descritos en los métodos y composiciones anteriores. En algunas realizaciones, el estuche comprende un sistema vector e instrucciones para usar el estuche. En algunas realizaciones, el sistema vector comprende (a) un primer elemento regulador unido de manera operable a una secuencia de emparejamiento tracr y uno o más sitios de inserción para insertar una secuencia guía aguas arriba de la secuencia de emparejamiento tracr, en el que cuando se expresa, la secuencia guía dirige la unión específica de la secuencia de un complejo CRISPR a una secuencia fijada como objetivo en una célula eucariota, en la que el complejo CRISPR comprende una enzima CRISPR complejada con (1) la secuencia guía que se hibrida a la secuencia objetivo y (2) la secuencia de emparejamiento tracr que se hibrida a la secuencia tracr y/o (b) un segundo elemento regulador unido de manera operable a una secuencia codificadora de enzima que codifica dicha enzima CRISPR que comprende una secuencia de localización nuclear. Los elementos se pueden proporcionar de manera individual o en combinaciones y se pueden proporcionar en cualquier envase adecuado, tal como un vial, un frasco o un tubo. En algunas realizaciones, el estuche incluye instrucciones en uno o más idiomas, por ejemplo, en más de un idioma.

En algunas realizaciones, un estuche comprende uno o más reactivos para uso en un procedimiento utilizando uno o más de los elementos descritos en la presente memoria. Los reactivos se pueden proporcionar en cualquier envase adecuado. Por ejemplo, un estuche puede proporcionar uno o más tampones de reacción o de almacenamiento. Los reactivos se pueden proporcionar en una forma que sea utilizable en un ensayo particular o en una forma que requiera la adición de otro u otros componentes más antes de uso (por ejemplo, en forma concentrada o liofilizada). Un tampón puede ser cualquier tampón, incluyendo, pero no limitándose a un tampón de carbonato de sodio, un tampón de bicarbonato de sodio, un tampón de borato, un tampón de Tris, un tampón de MOPS, un tampón de HEPES y combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, el tampón es alcalino. En algunas realizaciones, el tampón presenta un pH de aproximadamente 7 a aproximadamente 10. En algunas realizaciones, el estuche

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ENFERMEDAD/TRASTORNOS

GEN (ES)

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miembros (5 miembros: 1, 2, 3, 4, 5); CDKN2a; APC; RB

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(retinoblastoma); MEN1; VHL; BRCA1; BRCA2; AR

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(Receptor Andrógenos); TSG101; IGF; Receptor IGF; Igf1 (4

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variantes); Igf2 (3 variantes); Receptor Igf 1; Receptor Igf 2;

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Bax; Bcl2; familia caspasas (9 miembros:

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1, 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 12); Kras; Apc

Degeneración

Abcr; Cc12; Cc2; cp (ceruloplasmina); Timp3; catepsina D;

Macular relacionada con la edad

Vldlr; Ccr2

Esquizofrenia

Neuregulina1 (Nrg1); Erb4 (receptor para Neuregulina);

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Complexina1 (Cplx1); Tph1 Triptófano hidroxilasa; Tph2

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Triptófano hidroxilasa 2; Neurexina 1; GSK3; GSK3a;

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GSK3b

Trastornos

5-HTT (Slc6a4); COMT; DRD (Drd1a); SLC6A3; DAOA;

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DTNBP1; Dao (Dao1)

Repetición del trinucleótido

HTT (Huntington's Dx); SBMA/SMAX1/AR (Kennedy's

Trastornos

Dx); FXN/X25 (Friedrich's Ataxia); ATX3 (Machado

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Joseph's Dx); ATXN1 y ATXN2 (ataxias

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espinocerebelares); DMPK (distrofia miotónica); Atrophin-1 y Atn1

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(DRPLA Dx); CBP (Creb-BP -inestabilidad global); VLDLR

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(Alzheimer's); Atxn7; Atxn10

Síndrome frágil X

FMR2; FXR1; FXR2; mGLUR5

Trastornos

APH-1 (alfa y beta); Presenilina (Psen1); nicastrina

Relacionados con la secretasa

(Ncstn); PEN-2

Otros

Nos1; Parp1; Nat1; Nat2

Trastornos relacionados con priones

Prp

ALS

SOD1; ALS2; STEX; FUS; TARDBP; VEGF (VEGF-a;

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VEGF-b; VEGF-c)

Drogadicción

Prkce (alcohol); Drd2; Drd4; ABAT (alcohol); GRIA2;

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Grm5; Grin1; Htr1b; Grin2a; Drd3; Pdyn; Gria1 (alcohol)

Autismo

Mecp2; BZRAP1; MDGA2; Sema5A; Neurexina 1; Frágil X

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(FMR2 (AFF2); FXR1; FXR2; Mglur5)

Enfermedad de Alzheimer

E1; CHIP; UCH; UBB; Tau; LRP; PICALM.; Clusterina; PS1;

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SORL1; CR1; Vldlr; Uba1; Uba3; CHIP28 (Aqp1,

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Aquaporina 1); Uchl1; Uchl3; APP

Inflamación

IL-10; IL-1 (IL-1a; IL-1b); IL-13; IL-17 (IL-17a (CTLA8); IL

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17b; IL-17c; IL-17d; IL-17f); II-23; Cx3cr1; ptpn22; TNFa;

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NOD2/CARD15 para IBD; IL-6; IL-12 (IL-12a; IL-12b);

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CTLA4; Cx3cl1

Enfermedad de Parkinson

x-Synuclein; DJ-1; LRRK2; Parkin; PINK1

Tabla B

Enfermedades y trastornos

Anemia (CDAN1, CDA1, RPS19, DBA, PKLR, PK1, NT5C3, UMPH1, PSN1, RHAG,

de la sangre y la coagulación

RH50A, NRAMP2, SPTB, ALAS2, ANH1, ASB, ABCB7, ABC7, ASAT); síndrome de

linfocito desnudo (TAPBP, TPSN, TAP2, ABCB3, PSF2, RING11, MHC2TA, C2TA,

RFX5, RFXAP, RFX5), Trastornos de sangrado (TBXA2R, P2RX1, P2X1); Factor H y

factor H tipo -1 (HF1, CFH, HUS); Factor V y factor VIII (MCFD2); deficiencia de

Factor VII (F7); deficiencia de Factor X (F10); deficiencia de Factor XI (F11);

deficiencia de Factor XII (F12, HAF); deficiencia de Factor XIIIA (F13A1, F13A);

deficiencia de Factor XIIIB (F13B); anemia Fanconi (FANCA, FACA, FA1, FA, FAA,

FAAP95, FAAP90, FLJ34064, FANCB, FANCC, FACC, BRCA2, FANCD1, FANCD2,

FANCD, FACD, FAD, FANCE, FACE, FANCF, XRCC9, FANCG, BRIP1, BACH1,

FANCJ, PHF9, FANCL, FANCM, KIAA1596); trastornos Linfohistiocitosis

Hemofagocítica (PRF1, HPLH2, UNC13D, MUNC13-4, HPLH3, HLH3, FHL3);

Hemofilia A (F8, F8C, HEMA); Hemofilia B (F9, HEMB), trastornos hemorrágicos (PI,

ATT, F5); deficiencias y trastornos de leucocia (ITGB2, CD18, LCAMB, LAD, EIF2B1,

EIF2BA, EIF2B2, EIF2B3, EIF2B5, LVWM, CACH, CLE, EIF2B4); anemia

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depranocítica (HBB); Talasemia (HBA2, HBB, HBD, LCRB, HBA1).

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Desrregulación celular y

Linfoma no de Hodgkin de células B (BCL7A, BCL7); Leucemia (TAL1, TCL5, SCL,

enfermedades y trastornos

TAL2, FLT3, NBS1, NBS, ZNFN1A1, IK1, LYF1, HOXD4, HOX4B, BCR, CML, PHL,

oncológicos

ALL, ARNT, KRAS2, RASK2, GMPS, AF10, ARHGEF12, LARG, KIAA0382, CALM,

CLTH, CEBPA, CEBP, CHIC2, BTL, FLT3, KIT, PBT, LPP, NPM1, NUP214, D9S46E,

CAN, CAIN, RUNX1, CBFA2, AML1, WHSC1L1, NSD3, FLT3, AF1Q, NPM1, NUMA1,

ZNF 145, PLZF, PML, MYL, STAT5B, AF 10, CALM, CLTH, ARL11, ARLTS1, P2RX7,

P2X7, BCR, CML, PHL, ALL, GRAF, NF1, VRNF, WSS, NFNS, PTPN11, PTP2C,

SHP2, NS1, BCL2, CCND1, PRAD1, BCL1, TCRA, GATA1, GF1, ERYF1, NFE1,

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ABL1, NQO1, DIA4, NMOR1, NUP214, D9S46E, CAN, CAIN).

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Inflamación y enfermedades

SIDA (KIR3DL1, NKAT3, NKB1, AMB11, KIR3DS1, IFNG, CXCL12, SDF1); síndrome

y trastornos

linfoproliferativo autoinmunitario (TNFRSF6, APT1, FAS, CD95, ALPS1A);

inmunorelacionados

immunodeficiencia combinada, (IL2RG, SCIDX1, SCIDX, IMD4); VIH-1 (CCL5,

SCYA5, D17S136E, TCP228), susceptibilidad o infección por VIH (IL10, CSIF,

CMKBR2, CCR2, CMKBR5, CCCKR5 (CCR5)); Inmunodeficiencias (CD3E, CD3G,

AICDA, AID, HIGM2, TNFRSF5, CD40, UNG, DGU, HIGM4, TNFSF5, CD40LG,

HIGM1, IGM, FOXP3, IPEX, AIID, XPID, PIDX, TNFRSF14B, TACI); Inflamación (IL

10, IL-1 (IL-1a, IL-1b), IL-13, IL-17 (IL-17a (CTLA8), IL-17b, IL-17c, IL-17d, IL-17f), II

23, Cx3cr1, ptpn22, TNFa, NOD2/CARD15 para IBD, IL-6, IL-12 (IL-12a, IL-12b),

CTLA4, Cx3cl1); inmunodeficiencias combinadas severas (SCIDs)(JAK3, JAKL,

DCLRE1C, ARTEMIS, SCIDA, RAG1, RAG2, ADA, PTPRC, CD45, LCA, IL7R, CD3D,

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T3D, IL2RG, SCIDX1, SCIDX, IMD4).

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Enfermedades y trastornos

Neuropatía amiloide (TTR, PALB); Amiloidosis (APOA1, APP, AAA, CVAP, AD1,

metabólicos, hepáticos,

GSN, FGA, LYZ, TTR, PALB); Cirrosis (KRT18, KRT8, C1RH1A, NAIC, TEX292,

renales y proteínicos

K1AA1988); fibrosis quística (CFTR, ABCC7, CF, MRP7); enfermedades de

almacenamiento de glucógeno (SLC2A2, GLUT2, G6PC, G6PT, G6PT1, GAA,

LAMP2, LAMPB, AGL, GDE, GBE1, GYS2, PYGL, PFKM); adenoma hepático,

142330 (TCF1, HNF1A, MODY3), fallo hepático, comienzo temprano y trastorno

neurológico (SCOD1, SCO1), deficiencia de lipasa hepática (LIPC), Hepatoblastoma,

cáncer y carcinomas (CTNNB1, PDGFRL, PDGRL, PRLTS, AXIN1, AXIN, CTNNB1,

TP53, P53, LFS1, IGF2R, MPRI, MET, CASP8, MCH5; enfermedad del riñón quístico

medular (UMOD, HNFJ, FJHN, MCKD2, ADMCKD2); Fenilcetonuria (PAH, PKU1,

QDPR, DHPR, PTS); enfermedad renal y hepática poliquística (FCYT, PKHD1,

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ARPKD, PKD 1, PKD2, PKD4, PKDTS, PRKCSH, G19P1, PCLD, SEC63).

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Enfermedades y trastornos musculares / del esqueleto

Distrofia muscular de Becker (DMD, BMD, MYF6), Distrofia muscular de Duchenne (DMD, BMD); Distrofia muscular de Emery-Dreifuss (LMNA, LMN1, EMD2, FPLD, CMD1A, HGPS, LGMD1B, LMNA, LMN1, EMD2, FPLD, CMD1A); Distrofia muscular Facioscapulohumeral (FSHMD1A, FSHD1A); Distrofia muscular (FKRP, MDC1C, LGMD2I, LAMA2, LAMM, LARGE, KIAA0609, MDC1D, FCMD, TTID, MYOT, CAPN3,

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CANP3, DYSF, LGMD2B, SGCG, LGMD2C, DMDA1, SCG3, SGCA, ADL, DAG2, LGMD2D, DMDA2, SGCB, LGMD2E, SGCD, SGD, LGMD2F, CMD1L, TCAP, LGMD2G, CMD1N, TRIM32, HT2A, LGMD2H, FKRP, MDC1C, LGMD21, TTN, CMD1G, TMD, LGMD2J, POMT1, CAV3, LGMD1C, SEPN1, SELN, RSMD1, PLEC1, PLTN, EBS1); Osteopetrosis (LRP5, BMND1, LRP7, LR3, OPPG, VBCH2, CLCN7, CLC7, OPTA2, OSTM1, GL, TCIRG1, TIRC7, OC116, OPTB1); Atrofia muscular (VAPB, VAPC, ALS8, SMN1, SMA1, SMA2, SMA3, SMA4, BSCL2, SPG17, GARS, SMAD1, CMT2D, HEXB, IGHMBP2, SMUBP2, CATF1, SMARD1).

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Enfermedades y trastornos

ALS (SOD1, ALS2, STEX, FUS, TARDBP, VEGF (VEGF-a, VEGF-b, VEGF-c);

neurológicos y neuronales

enfermedad de Alzheimer (APP, AAA, CVAP, AD1, APOE, AD2, PSEN2, AD4, STM2, APBB2, FE65L1, NOS3, PLAU, URK, ACE, DCP1, ACE1, MPO, PACIP1, PAXIP1L, PTIP, A2M, BLMH, BMH, PSEN1, AD3); Autismo (Mecp2, BZRAP1, MDGA2, Sema5A, Neurexina 1, GLO1, MECP2, RTT, PPMX, MRX16, MRX79, NLGN3, NLGN4, KIAA1260, AUTSX2); Síndrome frágil X (FMR2, FXR1, FXR2, mGLUR5); enfermedad de Huntington y trastornos tipo enfermedad (HD, IT15, PRNP, PRIP, JPH3, JP3, HDL2, TBP, SCA17); enfermedad de Parkinson (NR4A2, NURR1, NOT, TINUR, SNCAIP, TBP, SCA17, SNCA, NACP, PARK1, PARK4, DJ1, PARK7, LRRK2, PARK8, PINK1, PARK6, UCHL1, PARK5, SNCA, NACP, PARK1, PARK4, PRKN, PARK2, PDJ, DBH, NDUFV2); síndrome de Rett (MECP2, RTT, PPMX, MRX16, MRX79, CDKL5, STK9, MECP2, RTT, PPMX, MRX16, MRX79, x-Synuclein, DJ-1); Esquizofrenia (Neuregulin1 (Nrg1), Erb4 (receptor for Neuregulin), Complexin1 (Cplx1), Tph1 Triptófano hidroxilasa, Tph2, Triptófano hidroxilasa 2, Neurexina 1, GSK3, GSK3a, GSK3b, 5-HTT (Slc6a4), COMT, DRD (Drd1a), SLC6A3, DAOA, DTNBP1, Dao (Dao1)); Trastornos Relacionados con la secretasa (APH-1 (alfa y beta), Presenilina (Psen1), nicastrina, (Ncstn), PEN-2, Nos1, Parp1, Nat1, Nat2); Trastornos Repetición del trinucleótido (HTT (Huntington's Dx), SBMA/SMAX1/AR (Kennedy's Dx), FXN/X25 (Ataxia de Friedrich), ATX3 (Machado-Joseph's Dx), ATXN1 y ATXN2 (ataxias espinocerebelares), DMPK (distrofia miotónica), Atrofina-1 y Atn1 (DRPLA Dx), CBP (Creb-BP -inestabilidad global), VLDLR (Alzheimer's), Atxn7, Atxn10).

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Enfermedades y trastornos oculares

Degeneración macular relacionada con la edad (Abcr, Ccl2, Cc2, cp (ceruloplasmina), Timp3, catepsinaD, Vldlr, Ccr2); Catarata (CRYAA, CRYA1, CRYBB2, CRYB2, PITX3, BFSP2, CP49, CP47, CRYAA, CRYA1, PAX6, AN2, MGDA, CRYBA1, CRYB1, CRYGC, CRYG3, CCL, LIM2, MP19, CRYGD, CRYG4, BFSP2, CP49, CP47, HSF4, CTM, HSF4, CTM, MIP, AQP0, CRYAB, CRYA2, CTPP2, CRYBB1, CRYGD, CRYG4, CRYBB2, CRYB2, CRYGC, CRYG3, CCL, CRYAA, CRYA1, GJA8, CX50, CAE1, GJA3, CX46, CZP3, CAE3, CCM1, CAM, KRIT1); distrofia y turbidez de la córnea (APOA1, TGFBI, CSD2, CDGG1, CSD, BIGH3, CDG2, TACSTD2, TROP2, M1S1, VSX1, RINX, PPCD, PPD, KTCN, COL8A2, FECD, PPCD2, PIP5K3, CFD); Cornea plana congénita (KERA, CNA2); Glaucoma (MYOC, TIGR, GLC1A, JOAG, GPOA, OPTN, GLC1E, FIP2, HYPL, NRP, CYP1B1, GLC3A, OPA1, NTG, NPG, CYP1B1, GLC3A); amaurosis congénita de Leber (CRB1, RP12, CRX, CORD2, CRD, RPGRIP1, LCA6, CORD9, RPE65, RP20, AIPL1, LCA4, GUCY2D, GUC2D, LCA1, CORD6, RDH12, LCA3); Distrofia macular (ELOVL4, ADMD, STGD2, STGD3, RDS, RP7, PRPH2, PRPH, AVMD, AOFMD, VMD2).

Tabla C

FUNCIÓN CELULAR

GENES

Señalización PI3K/AKT

PRKCE; ITGAM; ITGA5; IRAK1; PRKAA2; EIF2AK2;

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PTEN; EIF4E; PRKCZ; GRK6; MAPK1; TSC1; PLK1;

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AKT2; IKBKB; PIK3CA; CDK8; CDKN1B; NFKB2; BCL2;

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PIK3CB; PPP2R1A; MAPK8; BCL2L1; MAPK3; TSC2;

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ITGA1; KRAS; EIF4EBP1; RELA; PRKCD; NOS3;

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PRKAA1; MAPK9; CDK2; PPP2CA; PIM1; ITGB7;

FUNCIÓN CELULAR

GENES

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YWHAZ; ILK; TP53; RAF1; IKBKG; RELB; DYRK1A;

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CDKN1A; ITGB1; MAP2K2; JAK1; AKT1; JAK2; PIK3R1;

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CHUK; PDPK1; PPP2R5C; CTNNB1; MAP2K1; NFKB1;

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PAK3; ITGB3; CCND1; GSK3A; FRAP1; SFN; ITGA2;

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TTK; CSNK1A1; BRAF; GSK3B; AKT3; FOXO1; SGK;

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HSP90AA1; RPS6KB1

Señalización ERK/MAPK

PRKCE; ITGAM; ITGA5; HSPB1; IRAK1; PRKAA2;

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EIF2AK2; RAC1; RAP1A; TLN1; EIF4E; ELK1; GRK6;

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MAPK1; RAC2; PLK1; AKT2; PIK3CA; CDK8; CREB1;

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PRKCI; PTK2; FOS; RPS6KA4; PIK3CB; PPP2R1A;

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PIK3C3; MAPK8; MAPK3; ITGA1; ETS1; KRAS; MYCN;

imagen70

EIF4EBP1; PPARG; PRKCD; PRKAA1; MAPK9; SRC;

imagen71

CDK2; PPP2CA; PIM1; PIK3C2A; ITGB7; YWHAZ;

imagen72

PPP1CC; KSR1; PXN; RAF1; FYN; DYRK1A; ITGB1;

imagen73

MAP2K2; PAK4; PIK3R1; STAT3; PPP2R5C; MAP2K1;

imagen74

PAK3; ITGB3; ESR1; ITGA2; MYC; TTK; CSNK1A1;

imagen75

CRKL; BRAF; ATF4; PRKCA; SRF; STAT1; SGK

Señalización

RAC1; TAF4B; EP300; SMAD2; TRAF6; PCAF; ELK1;

Receptor Glucocorticoide

MAPK1; SMAD3; AKT2; IKBKB; NCOR2; UBE2I;

imagen76

PIK3CA; CREB1; FOS; HSPA5; NFKB2; BCL2;

imagen77

MAP3K14; STAT5B; PIK3CB; PIK3C3; MAPKB; BCL2L1;

imagen78

MAPK3; TSC22D3; MAPK10; NRIP1; KRAS; MAPK13;

imagen79

RELA; STAT5A; MAPK9; NOS2A; PBX1; NR3C1;

imagen80

PIK3C2A; CDKN1C; TRAF2; SERPINE1; NCOA3;

imagen81

MAPK14; TNF; RAF1; IKBKG; MAP3K7; CREBBP;

imagen82

CDKN1A; MAP2K2; JAK1; IL8; NCOA2; AKT1; JAK2;

imagen83

PIK3R1; CHUK; STAT3; MAP2K1; NFKB1; TGFBR1;

imagen84

ESR1; SMAD4; CEBPB; JUN; AR; AKT3; CCL2; MMP1; STAT1; IL6; HSP90AA1

Señalización Guía Axonal

PRKCE; ITGAM; ROCK1; ITGA5; CXCR4; ADAM12;

imagen85

IGF1; RAC1; RAP1A; EIF4E; PRKCZ; NRP1; NTRK2;

imagen86

ARHGEF7; SMO; ROCK2; MAPK1; PGF; RAC2;

imagen87

PTPN11; GNAS; AKT2; PIK3CA; ERBB2; PRKCI; PTK2;

imagen88

CFL1; GNAQ; PIK3CB; CXCL12; PIK3C3; WNT11;

imagen89

PRKD1; GNB2L1; ABL1; MAPK3; ITGA1; KRAS; RHOA;

imagen90

PRKCD; PIK3C2A; ITGB7; GLI2; PXN; VASP; RAF1;

imagen91

FYN; ITGB1; MAP2K2; PAK4; ADAM17; AKT1; PIK3R1;

imagen92

GLI1; WNT5A; ADAM10; MAP2K1; PAK3; ITGB3;

imagen93

CDC42; VEGFA; ITGA2; EPHA8; CRKL; RND1; GSK3B;

FUNCIÓN CELULAR

GENES

imagen94

AKT3; PRKCA

Señalización Receptor Efrina

PRKCE; ITGAM; ROCK1; ITGA5; CXCR4; IRAK1;

imagen95

PRKAA2; EIF2AK2; RAC I; RAP1A; GRK6; ROCK2;

imagen96

MAPK1; PGF; RAC2; PTPN11; GNAS; PLK1; AKT2;

imagen97

DOK1; CDK8; CREB1; PTK2; CFL1; GNAQ; MAP3K14;

imagen98

CXCL12; MAPK8; GNB2L1; ABL1; MAPK3; ITGA1;

imagen99

KRAS; RHOA; PRKCD; PRKAA1; MAPK9; SRC; CDK2;

imagen100

PIM1; ITGB7; PXN; RAF1; FYN; DYRK1A; ITGB1;

imagen101

MAP2K2; PAK4; AKT1; JAK2; STAT3; ADAM10;

imagen102

MAP2K1; PAK3; ITGB3; CDC42; VEGFA; ITGA2;

imagen103

EPHA8; TTK; CSNK1A1; CRKL; BRAF; PTPN13; ATF4;

imagen104

AKT3; SGK

Señalización

ACTN4; PRKCE; ITGAM; ROCK1; ITGA5; IRAK1;

cictoesqueleto de actina

PRKAA2; EIF2AK2; RAC1; INS; ARHGEF7; GRK6;

imagen105

ROCK2; MAPK1; RAC2; PLK1; AKT2; PIK3CA; CDK8;

imagen106

PTK2; CFL1; PIK3CB; MYH9; DIAPH1; PIK3C3; MAPK8;

imagen107

F2R; MAPK3; SLC9A1; ITGA1; KRAS; RHOA; PRKCD;

imagen108

PRKAA1; MAPK9; CDK2; PIM1; PIK3C2A; ITGB7;

imagen109

PPP1CC; PXN; VIL2; RAF1; GSN; DYRK1A; ITGB1;

imagen110

MAP2K2; PAK4; PIP5K1A; PIK3R1; MAP2K1; PAK3;

imagen111

ITGB3; CDC42; APC; ITGA2; TTK; CSNK1A1; CRKL;

imagen112

BRAF; VAV3; SGK

Señalización

PRKCE; IGF1; EP300; RCOR1; PRKCZ; HDAC4; TGM2;

enfermedad de Huntington

MAPK1; CAPNS1; AKT2; EGFR; NCOR2; SP1; CAPN2;

imagen113

PIK3CA; HDAC5; CREB1; PRKCI; HSPA5; REST;

imagen114

GNAQ; PIK3CB; PIK3C3; MAPKB; IGF1R; PRKD1;

imagen115

GNB2L1; BCL2L1; CAPN1; MAPK3; CASP8; HDAC2;

imagen116

HDAC7A; PRKCD; HDAC11; MAPK9; HDAC9; PIK3C2A;

imagen117

HDAC3; TP53; CASP9; CREBBP; AKT1; PIK3R1;

imagen118

PDPK1; CASP1; APAF1; FRAP1; CASP2; JUN; BAX;

imagen119

ATF4; AKT3; PRKCA; CLTC; SGK; HDAC6; CASP3

Señalización de muerte celular programada

PRKCE; ROCK1; BID; IRAK1; PRKAA2; EIF2AK2; BAK1;

imagen120

BIRC4; GRK6; MAPK1; CAPNS1; PLK1; AKT2; IKBKB;

imagen121

CAPN2; CDK8; FAS; NFKB2; BCL2; MAP3K14; MAPK8;

imagen122

BCL2L1; CAPN1; MAPK3; CASP8; KRAS; RELA;

imagen123

PRKCD; PRKAA1; MAPK9; CDK2; PIM1; TP53; TNF;

imagen124

RAF1; IKBKG; RELB; CASP9; DYRK1A; MAP2K2;

imagen125

CHUK; APAF1; MAP2K1; NFKB1; PAK3; LMNA; CASP2;

FUNCIÓN CELULAR

GENES

imagen126

BIRC2; TTK; CSNK1A1; BRAF; BAX; PRKCA; SGK;

imagen127

CASP3; BIRC3; PARP1

Señalización de Receptor de células B

RAC1; PTEN; LYN; ELK1; MAPK1; RAC2; PTPN11;

imagen128

AKT2; IKBKB; PIK3CA; CREB1; SYK; NFKB2; CAMK2A;

imagen129

MAP3K14; PIK3CB; PIK3C3; MAPK8; BCL2L1; ABL1;

imagen130

MAPK3; ETS1; KRAS; MAPK13; RELA; PTPN6; MAPK9;

imagen131

EGRI; PIK3C2A; BTK; MAPK14; RAF1; IKBKG; RELB;

imagen132

MAP3K7; MAP2K2; AKT1; PIK3R1; CHUK; MAP2K1;

imagen133

NFKB1; CDC42; GSK3A; FRAP1; BCL6; BCL10; JUN;

imagen134

GSK3B; ATF4; AKT3; VAV3; RPS6KB1

Señalización de diapédesis

ACTN4; CD44; PRKCE; ITGAM; ROCK1; CXCR4; CYBA;

imagen135

RAC1; RAP1A; PRKCZ; ROCK2; RAC2; PTPN11;

imagen136

MMP14; PIK3CA; PRKCI; PTK2; PIK3CB; CXCL12;

imagen137

PIK3C3; MAPK8; PRKD1; ABL1; MAPK10; CYBB;

imagen138

MAPK13; RHOA; PRKCD; MAPK9; SRC; PIK3C2A; BTK;

imagen139

MAPK14; NOX1; PXN; VIL2; VASP; TTGB1; MAP2K2;

imagen140

CTNND1; PIK3R1; CTNNB1; CLDN1; CDC42; F11R; ITK;

imagen141

CRKL; VAV3; CTTN; PRKCA; MMP1; MMP9

Señalización de Integrina

ACTN4; ITGAM; ROCK1; ITGA5; RAC1; PTEN; RAP1A;

imagen142

TLN1; ARHGEF7; MAPK1; RAC2; CAPNS1; AKT2;

imagen143

CAPN2; PIK3CA; PTK2; PIK3CB; PIK3C3; MAPK8;

imagen144

CAV1; CAPN1; ABL1; MAPK3; ITGA1; KRAS; RHOA;

imagen145

SRC; PIK3C2A; ITGB7; PPP1CC; ILK; PXN; VASP;

imagen146

RAF1; FYN; ITGB1; MAP2K2; PAK4; AKT1; PIK3R1;

imagen147

TNK2; MAP2K1; PAK3; ITGB3; CDC42; RND3; ITGA2;

imagen148

CRKL; BRAF; GSK3B; AKT3

Señalización

IRAK1; SOD2; MYD88; TRAF6; ELK1; MAPK1; PTPN11;

de Respuesta de fase aguda

AKT2; IKBKB; PIK3CA; FOS; NFKB2; MAP3K14;

imagen149

PIK3CB; MAPK8; RIPK1; MAPK3; IL6ST; KRAS;

imagen150

MAPK13; IL6R; RELA; SOCS1; MAPK9; FTL; NR3C1;

imagen151

TRAF2; SERPINE1; MAPK14; TNF; RAF1; PDK1;

imagen152

IKBKG; RELB; MAP3K7; MAP2K2; AKT1; JAK2; PIK3R1;

imagen153

CHUK; STAT3; MAP2K1; NFKB1; FRAP1; CEBPB; JUN;

imagen154

AKT3; IL1R1; IL6

Señalización de PTEN

ITGAM; ITGA5; RAC1; PTEN; PRKCZ; BCL2L 11;

imagen155

MAPK1; RAC2; AKT2; EGFR; IKBKB; CBL; PIK3CA;

imagen156

CDKN1B; PTK2; NFKB2; BCL2; PIK3CB; BCL2L1;

imagen157

MAPK3; ITGA1; KRAS; ITGB7; ILK; PDGFRB; INSR;

imagen158

RAF1; IKBKG; CASP9; CDKN1A; ITGB1; MAP2K2;

FUNCIÓN CELULAR

GENES

imagen159

AKT1; PIK3R1; CHUK; PDGFRA; PDPK1; MAP2K1;

imagen160

NFKB1; ITGB3; CDC42; CCND1; GSK3A; ITGA2;

imagen161

GSK3B; AKT3; FOXO1; CASP3; RPS6KB1

Señalización de p53

PTEN; EP300; BBC3; PCAF; FASN; BRCA1; GADD45A;

imagen162

BIRC5; AKT2; PIK3CA; CHEK1; TP53INP1; BCL2;

imagen163

PIK3CB; PIK3C3; MAPK8; THBS1; ATR; BCL2L1; E2F1;

imagen164

PMAIP1; CHEK2; TNFRSF10B; TP73; RB1; HDAC9;

imagen165

CDK2; PIK3C2A; MAPK14; TP53; LRDD; CDKN1A;

imagen166

HIPK2; AKT1; PIK3R1; RRM2B; APAF1; CTNNB1;

imagen167

SIRT1; CCND1; PRKDC; ATM; SFN; CDKN2A; JUN;

imagen168

SNAI2; GSK3B; BAX; AKT3

Señalización

HSPB1; EP300; FASN; TGM2; RXRA; MAPK1; NQO1;

de Receptor Arilhidrocarbonado

NCOR2; SP1; ARNT; CDKN1B; FOS; CHEK1;

imagen169

SMARCA4; NFKB2; MAPK8; ALDH1A1; ATR; E2F1;

imagen170

MAPK3; NRIP1; CHEK2; RELA; TP73; GSTP1; RB1;

imagen171

SRC; CDK2; AHR; NFE2L2; NCOA3; TP53; TNF;

imagen172

CDKN I A; NCOA2; APAF1; NFKB1; CCND1; ATM; ESR1;

imagen173

CDKN2A; MYC; JUN; ESR2; BAX; IL6; CYP1B1;

imagen174

HSP90AA1

Señalización de

PRKCE; EP300; PRKCZ; RXRA; MAPK1; NQO1;

Metabolismo Xenobiótico

NCOR2; PIK3CA; ARNT; PRKCI; NFKB2; CAMK2A;

imagen175

PIK3CB; PPP2R1A; PIK3C3; MAPK8; PRKD1;

imagen176

ALDH1A1; MAPK3; NRIP1; KRAS; MAPK13; PRKCD;

imagen177

GSTP1; MAPK9; NOS2A; ABCB1; AHR; PPP2CA; FTL;

imagen178

NFE2L2; PIK3C2A; PPARGC1A; MAPK14; TNF; RAF1;

imagen179

CREBBP; MAP2K2; PIK3R1; PPP2R5C; MAP2K1;

imagen180

NFKB1; KEAP1; PRKCA; EIF2AK3; IL6; CYP1B1;

imagen181

HSP90AA1

Señalización de SAPK/JNK

PRKCE; IRAK1; PRKAA2; EIF2AK2; RAC1; ELK1;

imagen182

GRK6; MAPK1; GADD45A; RAC2; PLK1; AKT2; PIK3CA;

imagen183

FADD; CDK8; PIK3CB; PIK3C3; MAPK8; R1PK1;

imagen184

GNB2L1; IRS1; MAPK3; MAPK10; DAXX; KRAS;

imagen185

PRKCD; PRKAA1; MAPK9; CDK2; PIM1; PIK3C2A;

imagen186

TRAF2; TP53; LCK; MAP3K7; DYRK1A; MAP2K2;

imagen187

PIK3R1; MAP2K1; PAK3; CDC42; JUN; TTK; CSNK1A1;

imagen188

CRKL; BRAF; SGK

Señalización de PPAr/RXR

PRKAA2; EP300; INS; SMAD2; TRAF6; PPARA; FASN;

imagen189

RXRA; MAPK1; SMAD3; GNAS; IKBKB; NCOR2;

imagen190

ABCA1; GNAQ; NFKB2; MAP3K14; STAT5B; MAPK8;

FUNCIÓN CELULAR

GENES

imagen191

IRS1; MAPK3; KRAS; RELA; PRKAA1; PPARGC1A;

imagen192

NCOA3; MAPK14; INSR; RAF1; IKBKG; RELB; MAP3K7;

imagen193

CREBBP; MAP2K2; JAK2; CHUK; MAP2K1; NFKB 1;

imagen194

TGFBR1; SMAD4; JUN; IL1R1; PRKCA; IL6; HSP90AA1; ADIPOQ

Señalización de NF-KB

IRAK1; EIF2AK2; EP300; INS; MYD88; PRKCZ; TRAF6;

imagen195

TBK1; AKT2; EGFR; IKBKB; PIK3CA; BTRC; NFKB2;

imagen196

MAP3K14; PIK3CB; PIK3C3; MAPK8; RIPK1; HDAC2;

imagen197

KRAS; RELA; PIK3C2A; TRAF2; TLR4; PDGFRB; TNF;

imagen198

INSR; LCK; IKBKG; RELB; MAP3K7; CREBBP; AKT1;

imagen199

PIK3R1; CHUK; PDGFRA; NFKB1; TLR2; BCL10;

imagen200

GSK3B; AKT3; TNFAIP3; IL1R1

Señalización de Neuregulina

ERBB4; PRKCE; ITGAM; ITGA5; PTEN; PRKCZ; ELK1;

imagen201

MAPK1; PTPN11; AKT2; EGFR; ERBB2; PRKCI;

imagen202

CDKN1B; STAT5B; PRKD1; MAPK3; ITGA1; KRAS;

imagen203

PRKCD; STAT5A; SRC; ITGB7; RAF1; ITGB1; MAP2K2;

imagen204

ADAM17; AKT1; PIK3R1; PDPK1; MAP2K1; ITGB3;

imagen205

EREG; FRAP1; PSEN1; ITGA2; MYC; NRG1; CRKL;

imagen206

AKT3; PRKCA; HSP90AA1; RPS6KB1

Señalización de

CD44; EP300; LRP6; DVL3; CSNK1E; GJA1; SMO;

catenina Wnt y Beta

AKT2; PIN1; CDH1; BTRC; GNAQ; MARK2; PPP2R1A;

imagen207

WNT11; SRC; DKK1; PPP2CA; SOX6; SFRP2; ILK;

imagen208

LEF1; SOX9; TP53; MAP3K7; CREBBP; TCF7L2; AKT1;

imagen209

PPP2R5C; WNT5A; LRP5; CTNNB1; TGFBR1; CCND1;

imagen210

GSK3A; DVL1; APC; CDKN2A; MYC; CSNK1A1; GSK3B;

imagen211

AKT3; SOX2

Señalización de Receptor de Insulina

PTEN; INS; EIF4E; PTPN1; PRKCZ; MAPK1; TSC1;

imagen212

PTPN11; AKT2; CBL; PIK3CA; PRKCI; PIK3CB; PIK3C3;

imagen213

MAPK8; IRS1; MAPK3; TSC2; KRAS; EIF4EBP1;

imagen214

SLC2A4; PIK3C2A; PPP1CC; INSR; RAF1; FYN;

imagen215

MAP2K2; JAK1; AKT1; JAK2; PIK3R1; PDPK1; MAP2K1;

imagen216

GSK3A; FRAP1; CRKL; GSK3B; AKT3; FOXO1; SGK;

imagen217

RPS6KB1

Señalización de IL-6

HSPB1; TRAF6; MAPKAPK2; ELK1; MAPK1; PTPN11;

imagen218

IKBKB; FOS; NFKB2; MAP3K14; MAPK8; MAPK3;

imagen219

MAPK10; IL6ST; KRAS; MAPK13; IL6R; RELA; SOCS1;

imagen220

MAPK9; ABCB1; TRAF2; MAPK14; TNF; RAF1; IKBKG;

imagen221

RELB; MAP3K7; MAP2K2; IL8; JAK2; CHUK; STAT3;

imagen222

MAP2K1; NFKB1; CEBPB; JUN; IL1R1; SRF; IL6

Colestasis Hepática

PRKCE; IRAK1; INS; MYD88; PRKCZ; TRAF6; PPARA;

FUNCIÓN CELULAR

GENES

imagen223

RXRA; IKBKB; PRKCI; NFKB2; MAP3K14; MAPK8;

imagen224

PRKD1; MAPK10; RELA; PRKCD; MAPK9; ABCB1;

imagen225

TRAF2; TLR4; TNF; INSR; IKBKG; RELB; MAP3K7; IL8;

imagen226

CHUK; NR1H2; TJP2; NFKB1; ESR1; SREBF1; FGFR4;

imagen227

JUN; IL1R1; PRKCA; IL6

Señalización de IGF-1

IGF 1; PRKCZ; ELK1; MAPK1; PTPN11; NEDD4; AKT2;

imagen228

PIK3CA; PRKCI; PTK2; FOS; PIK3CB; PIK3C3; MAPK8;

imagen229

IGF1R; IRS1; MAPK3; IGFBP7; KRAS; PIK3C2A;

imagen230

YWHAZ; PXN; RAF1; CASP9; MAP2K2; AKT1; PIK3R1;

imagen231

PDPK1; MAP2K1; IGFBP2; SFN; JUN; CYR61; AKT3;

imagen232

FOXO1; SRF; CTGF; RPS6KB1

Respuesta de Estrés

PRKCE; EP300; SOD2; PRKCZ; MAPK1; SQSTM1;

Oxidativo mediado por NRF2

NQO1; PIK3CA; PRKCI; FOS; PIK3CB; PIK3C3; MAPK8;

imagen233

PRKD1; MAPK3; KRAS; PRKCD; GSTP1; MAPK9; FTL;

imagen234

NFE2L2; PIK3C2A; MAPK14; RAF1; MAP3K7; CREBBP;

imagen235

MAP2K2; AKT1; PIK3R1; MAP2K1; PPIB; JUN; KEAP1;

imagen236

GSK3B; ATF4; PRKCA; EIF2AK3; HSP90AA1

Fibrosis Hepática /

EDN1; 1GF1; KDR; FLT1; SMAD2; FGFR1; MET; PGF;

Activación de células estelares hepáticas

SMAD3; EGFR; FAS; CSF1; NFKB2; BCL2; MYH9;

imagen237

IGF1R; IL6R; RELA; TLR4; PDGFRB; TNF; RELB; IL8;

imagen238

PDGFRA; NFKB1; TGFBR1; SMAD4; VEGFA; BAX;

imagen239

IL1R1; CCL2; HGF; MMP1; STAT1; IL6; CTGF; MMP9

Señalización de PPAR

EP300; INS; TRAF6; PPARA; RXRA; MAPK1; IKBKB;

imagen240

NCOR2; FOS; NFKB2; MAP3K14; STAT5B; MAPK3;

imagen241

NRIP1; KRAS; PPARG; RELA; STAT5A; TRAF2;

imagen242

PPARGC1A; PDGFRB; TNF; INSR; RAF1; IKBKG;

imagen243

RELB; MAP3K7; CREBBP; MAP2K2; CHUK; PDGFRA;

imagen244

MAP2K1; NFKB1; JUN; IL1R1; HSP90AA1

Señalización de Fc Epsilon RI

PRKCE; RAC1; PRKCZ; LYN; MAPK1; RAC2; PTPN11;

imagen245

AKT2; PIK3CA; SYK; PRKCI; PIK3CB; PIK3C3; MAPK8;

imagen246

PRKD1; MAPK3; MAPK10; KRAS; MAPK13; PRKCD;

imagen247

MAPK9; PIK3C2A; BTK; MAPK14; TNF; RAF1; FYN;

imagen248

MAP2K2; AKT1; PIK3R1; PDPK1; MAP2K1; AKT3;

imagen249

VAV3; PRKCA

Señalización de Receptor

PRKCE; RAP1A; RGS16; MAPK1; GNAS; AKT2; IKBKB;

Acoplado a proteína G

PIK3CA; CREB1; GNAQ; NFKB2; CAMK2A; PIK3CB;

imagen250

PIK3C3; MAPK3; KRAS; RELA; SRC; PIK3C2A; RAF1;

imagen251

IKBKG; RELB; FYN; MAP2K2; AKT1; PIK3R1; CHUK;

imagen252

PDPK1; STAT3; MAP2K1; NFKB1; BRAF; ATF4; AKT3;

FUNCIÓN CELULAR

GENES

imagen253

PRKCA

Metabolismo de

PRKCE; IRAK1; PRKAA2; EIF2AK2; PTEN; GRK6;

Inositol fosfato

MAPK1; PLK1; AKT2; PIK3CA; CDK8; PIK3CB; PIK3C3;

imagen254

MAPK8; MAPK3; PRKCD; PRKAA1; MAPK9; CDK2;

imagen255

PIM1; PIK3C2A; DYRK1A; MAP2K2; PIP5K1A; PIK3R1;

imagen256

MAP2K1; PAK3; ATM; TTK; CSNK1A1; BRAF; SGK

Señalización de PDGF

EIF2AK2; ELK1; ABL2; MAPK1; PIK3CA; FOS; PIK3CB;

imagen257

PIK3C3; MAPK8; CAV1; ABL1; MAPK3; KRAS; SRC;

imagen258

PIK3C2A; PDGFRB; RAF1; MAP2K2; JAK1; JAK2;

imagen259

PIK3R1; PDGFRA; STAT3; SPHK1; MAP2K1; MYC;

imagen260

JUN; CRKL; PRKCA; SRF; STAT1; SPHK2

Señalización de VEGF

ACTN4; ROCK1; KDR; FLT1; ROCK2; MAPK1; PGF;

imagen261

AKT2; PIK3CA; ARNT; PTK2; BCL2; PIK3CB; PIK3C3;

imagen262

BCL2L1; MAPK3; KRAS; HIF1A; NOS3; PIK3C2A; PXN;

imagen263

RAF1; MAP2K2; ELAVL1; AKT1; PIK3R1; MAP2K1; SFN;

imagen264

VEGFA; AKT3; FOXO1; PRKCA

Señalización de células

PRKCE; RAC1; PRKCZ; MAPK1; RAC2; PTPN11;

aniquilantes naturales

KIR2DL3; AKT2; PIK3CA; SYK; PRKCI; PIK3CB;

imagen265

PIK3C3; PRKD1; MAPK3; KRAS; PRKCD; PTPN6;

imagen266

PIK3C2A; LCK; RAF1; FYN; MAP2K2; PAK4; AKT1;

imagen267

PIK3R1; MAP2K1; PAK3; AKT3; VAV3; PRKCA

Ciclo celular: G1/S

HDAC4; SMAD3; SUV39H1; HDAC5; CDKN1B; BTRC;

Regulación de control

ATR; ABL1; E2F1; HDAC2; HDAC7A; RB1; HDAC11;

imagen268

HDAC9; CDK2; E2F2; HDAC3; TP53; CDKN1A; CCND1;

imagen269

E2F4; ATM; RBL2; SMAD4; CDKN2A; MYC; NRG1;

imagen270

GSK3B; RBL1; HDAC6

Señalización de Receptor de células T

RAC1; ELK1; MAPK1; IKBKB; CBL; PIK3CA; FOS;

imagen271

NFKB2; PIK3CB; PIK3C3; MAPK8; MAPK3; KRAS;

imagen272

RELA; PIK3C2A; BTK; LCK; RAF1; IKBKG; RELB; FYN;

imagen273

MAP2K2; PIK3R1; CHUK; MAP2K1; NFKB1; ITK; BCL10;

imagen274

JUN; VAV3

Señalización de Receptor de la muerte

CRADD; HSPB1; BID; BIRC4; TBK1; IKBKB; FADD;

imagen275

FAS; NFKB2; BCL2; MAP3K14; MAPK8; RIPK1; CASP8;

imagen276

DAXX; TNFRSF10B; RELA; TRAF2; TNF; IKBKG; RELB;

imagen277

CASP9; CHUK; APAF1; NFKB1; CASP2; BIRC2; CASP3;

imagen278

BIRC3

Señalización de FGF

RAC1; FGFR1; MET; MAPKAPK2; MAPK1; PTPN11;

imagen279

AKT2; PIK3CA; CREB1; PIK3CB; PIK3C3; MAPK8;

imagen280

MAPK3; MAPK13; PTPN6; PIK3C2A; MAPK14; RAF1;

FUNCIÓN CELULAR

GENES

imagen281

AKT1; PIK3R1; STAT3; MAP2K1; FGFR4; CRKL; ATF4;

imagen282

AKT3; PRKCA; HGF

Señalización de GM-CSF

LYN; ELK1; MAPK1; PTPN11; AKT2; PIK3CA; CAMK2A;

imagen283

STAT5B; PIK3CB; PIK3C3; GNB2L1; BCL2L1; MAPK3;

imagen284

ETS1; KRAS; RUNX1; PIM1; PIK3C2A; RAF1; MAP2K2;

imagen285

AKT1; JAK2; PIK3R1; STAT3; MAP2K1; CCND1; AKT3;

imagen286

STAT1

Señalización de esclerosis

BID; IGF1; RAC1; BIRC4; PGF; CAPNS1; CAPN2;

lateral amiotrófica

PIK3CA; BCL2; PIK3CB; PIK3C3; BCL2L1; CAPN1;

imagen287

PIK3C2A; TP53; CASP9; PIK3R1; RAB5A; CASP1;

imagen288

APAF1; VEGFA; BIRC2; BAX; AKT3; CASP3; BIRC3

Señalización de JAK/Stat

PTPN1; MAPK1; PTPN11; AKT2; PIK3CA; STAT5B;

imagen289

PIK3CB; PIK3C3; MAPK3; KRAS; SOCS1; STAT5A;

imagen290

PTPN6; PIK3C2A; RAF1; CDKN1A; MAP2K2; JAK1;

imagen291

AKT1; JAK2; PIK3R1; STAT3; MAP2K1; FRAP1; AKT3;

imagen292

STAT1

Metabolismo de

PRKCE; IRAK1; PRKAA2; EIF2AK2; GRK6; MAPK1;

Nicotinato y

imagen293

Nicotinamida

PLK1; AKT2; CDK8; MAPK8; MAPK3; PRKCD; PRKAA1;

imagen294

PBEF1; MAPK9; CDK2; PIM1; DYRK1A; MAP2K2;

imagen295

MAP2K1; PAK3; NT5E; TTK; CSNK1A1; BRAF; SGK

Señalización de quimiocinas

CXCR4; ROCK2; MAPK1; PTK2; FOS; CFL1; GNAQ;

imagen296

CAMK2A; CXCL12; MAPK8; MAPK3; KRAS; MAPK13;

imagen297

RHOA; CCR3; SRC; PPP1CC; MAPK14; NOX1; RAF1;

imagen298

MAP2K2; MAP2K1; JUN; CCL2; PRKCA

Señalización de IL-2

ELK1; MAPK1; PTPN11; AKT2; PIK3CA; SYK; FOS;

imagen299

STAT5B; PIK3CB; PIK3C3; MAPK8; MAPK3; KRAS;

imagen300

SOCS1; STAT5A; PIK3C2A; LCK; RAF1; MAP2K2;

imagen301

JAK1; AKT1; PIK3R1; MAP2K1; JUN; AKT3

Depresión sináptica

PRKCE; IGF1; PRKCZ; PRDX6; LYN; MAPK1; GNAS;

a largo lazo

PRKCI; GNAQ; PPP2R1A; IGF1R; PRKD1; MAPK3;

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KRAS; GRN; PRKCD; NOS3; NOS2A; PPP2CA;

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YWHAZ; RAF1; MAP2K2; PPP2R5C; MAP2K1; PRKCA

Señalización de

TAF4B; EP300; CARM1; PCAF; MAPK1; NCOR2;

Receptor de Estrógenos

SMARCA4; MAPK3; NRIP1; KRAS; SRC; NR3C1;

imagen304

HDAC3; PPARGC1A; RBM9; NCOA3; RAF1; CREBBP;

imagen305

MAP2K2; NCOA2; MAP2K1; PRKDC; ESR1; ESR2

Ruta de

TRAF6; SMURF1; BIRC4; BRCA1; UCHL1; NEDD4;

Ubiquitinación de proteínas

CBL; UBE2I; BTRC; HSPA5; USP7; USP10; FBXW7;

FUNCIÓN CELULAR

GENES

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USP9X; STUB1; USP22; B2M; BIRC2; PARK2; USP8;

imagen307

USP1; VHL; HSP90AA1; BIRC3

Señalización de IL-10

TRAF6; CCR1; ELK1; IKBKB; SP1; FOS; NFKB2;

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MAP3K14; MAPK8; MAPK13; RELA; MAPK14; TNF;

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IKBKG; RELB; MAP3K7; JAK1; CHUK; STAT3; NFKB1;

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JUN; IL1R1; IL6

Activación de VDR/RXR

PRKCE; EP300; PRKCZ; RXRA; GADD45A; HES1;

imagen311

NCOR2; SP1; PRKCI; CDKN1B; PRKD1; PRKCD;

imagen312

RUNX2; KLF4; YY1; NCOA3; CDKN1A; NCOA2; SPP1;

imagen313

LRP5; CEBPB; FOXO1; PRKCA

Señalización de TGF-beta

EP300; SMAD2; SMURF1; MAPK1; SMAD3; SMAD1;

imagen314

FOS; MAPK8; MAPK3; KRAS; MAPK9; RUNX2;

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SERPINE1; RAF1; MAP3K7; CREBBP; MAP2K2;

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MAP2K1; TGFBR1; SMAD4; JUN; SMAD5

Señalización de Receptor tipo Toll

IRAK1; EIF2AK2; MYD88; TRAF6; PPARA; ELK1;

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IKBKB; FOS; NFKB2; MAP3K14; MAPK8; MAPK13;

imagen318

RELA; TLR4; MAPK14; IKBKG; RELB; MAP3K7; CHUK;

imagen319

NFKB1; TLR2; JUN

Señalización de p38 MAPK

HSPB1; IRAK1; TRAF6; MAPKAPK2; ELK1; FADD; FAS;

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CREB1; DDIT3; RPS6KA4; DAXX; MAPK13; TRAF2;

imagen321

MAPK14; TNF; MAP3K7; TGFBR1; MYC; ATF4; IL1R1;

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SRF; STAT1

Señalización de Neurotrofina/TRK

NTRK2; MAPK1; PTPN11; PIK3CA; CREB1; FOS;

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PIK3CB; PIK3C3; MAPK8; MAPK3; KRAS; PIK3C2A;

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RAF1; MAP2K2; AKT1; PIK3R1; PDPK1; MAP2K1;

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CDC42; JUN; ATF4

Activación de FXR/RXR

INS; PPARA; FASN; RXRA; AKT2; SDC1; MAPK8;

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APOB; MAPK10; PPARG; MTTP; MAPK9; PPARGC1A;

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TNF; CREBBP; AKT1; SREBF1; FGFR4; AKT3; FOXO1

Potentiación sináptica

PRKCE; RAP1A; EP300; PRKCZ; MAPK1; CREB1;

a largo plazo

PRKCI; GNAQ; CAMK2A; PRKD1; MAPK3; KRAS;

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PRKCD; PPP1CC; RAF1; CREBBP; MAP2K2; MAP2K1;

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ATF4; PRKCA

Señalización de calcio

RAP1A; EP300; HDAC4; MAPK1; HDAC5; CREB1;

imagen330

CAMK2A; MYH9; MAPK3; HDAC2; HDAC7A; HDAC11;

imagen331

HDAC9; HDAC3; CREBBP; CALR; CAMKK2; ATF4;

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HDAC6

Señalización de EGF

ELK1; MAPK1; EGFR; PIK3CA; FOS; PIK3CB; PIK3C3;

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MAPK8; MAPK3; PIK3C2A; RAF1; JAK1; PIK3R1;

FUNCIÓN CELULAR

GENES

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STAT3; MAP2K1; JUN; PRKCA; SRF; STAT1

Señalización de Hipoxia en el

EDN1; PTEN; EP300; NQO1; UBE2I; CREB1; ARNT;

Sistema Cardiovascular

HIF1A; SLC2A4; NOS3; TP53; LDHA; AKT1; ATM;

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VEGFA; JUN; ATF4; VHL; HSP90AA1

Inhibición mediada por LPS/IL-1

IRAK1; MYD88; TRAF6; PPARA; RXRA; ABCA1;

de función RXR

MAPK8; ALDH1A1; GSTP1; MAPK9; ABCB1; TRAF2;

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TLR4; TNF; MAP3K7; NR1H2; SREBF1; JUN; IL1R1

Activación de LXR/RXR

FASN; RXRA; NCOR2; ABCA1; NFKB2; IRF3; RELA;

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NOS2A; TLR4; TNF; RELB; LDLR; NR1H2; NFKB1;

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SREBF1; IL1R1; CCL2; IL6; MMP9

Proceso amiloide

PRKCE; CSNK1E; MAPK1; CAPNS 1; AKT2; CAPN2;

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CAPN1; MAPK3; MAPK13; MAPT; MAPK14; AKT1;

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PSEN1; CSNK1A1; GSK3B; AKT3; APP

Señalización de IL-4

AKT2; PIK3CA; PIK3CB; PIK3C3; IRS1; KRAS; SOCS1;

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PTPN6; NR3C1; PIK3C2A; JAK1; AKT1; JAK2; PIK3R1;

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FRAP1; AKT3; RPS6KB1

Regulación

EP300; PCAF; BRCA1; GADD45A; PLK1; BTRC;

Control de daño

CHEK1; ATR; CHEK2; YWHAZ; TP53; CDKN1A;

Ciclo celular: ADN G2/M

PRKDC; ATM; SFN; CDKN2A

Señalización de óxido nítrico en el

KDR; FLT1; PGF; AKT2; PIK3CA; PIK3CB; PIK3C3;

Sistema Cardiovascular

CAV1; PRKCD; NOS3; PIK3C2A; AKT1; PIK3R1;

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VEGFA; AKT3; HSP90AA1

Metabolismo de Purina

NME2; SMARCA4; MYH9; RRM2; ADAR; EIF2AK4;

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PKM2; ENTPD1; RAD51; RRM2B; TJP2; RAD51C;

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NT5E; POLD1; NME1

Señalización mediada por cAMP

RAP1A; MAPK1; GNAS; CREB1; CAMK2A; MAPK3;

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SRC; RAF1; MAP2K2; STAT3; MAP2K1; BRAF; ATF4

Disfunción mitocondrial

SOD2; MAPK8; CASP8; MAPK10; MAPK9; CASP9;

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PARK7; PSEN1; PARK2; APP; CASP3

Señalización de Notch

HES1; JAG1; NUMB; NOTCH4; ADAM 17; NOTCH2;

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PSEN1; NOTCH3; NOTCH1; DLL4

Ruta del estrés del

HSPA5; MAPK8; XBP1; TRAF2; ATF6; CASP9; ATF4;

Retículo endoplasmático

EIF2AK3; CASP3

Metabolismo de pirimidina

NME2; AICDA; RRM2; EIF2AK4; ENTPD1; RRM2B;

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NT5E; POLD1; NME1

Señalización de Parkinson

UCHL1; MAPK8; MAPK13; MAPK14; CASP9; PARK7;

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PARK2; CASP3

Señalización

GNAS; GNAQ; PPP2R1A; GNB2L1; PPP2CA; PPP1CC;

Cardíaca y beta adrenérgica

PPP2R5C

FUNCIÓN CELULAR

GENES

Glucolisis/Gluconeogénesis

HK2; GCK; GPI; ALDH1A1; PKM2; LDHA; HK1

Señalización de interferón

IRF1; SOCS1; JAK1; JAK2; IFITM1; STAT1; IFIT3

Señalización Sonic Hedgehog

ARRB2; SMO; GLI2; DYRK1A; GLI1; GSK3B; DYRK1B

Metabolismo

PLD1; GRN; GPAM; YWHAZ; SPHK1; SPHK2

Glicerofosfolípidos

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Degradación de fosfolípidos

PRDX6; PLD1; GRN; YWHAZ; SPHK1; SPHK2

Metabolismo de triptófano

SIAH2; PRMT5; NEDD4; ALDH1A1; CYP1B1; SIAH1

Degradación de lisina

SUV39H1; EHMT2; NSD1; SETD7; PPP2R5C

Ruta

ERCC5; ERCC4; XPA; XPC; ERCC1

Reparación escisión de nucleótidos

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Metabolismo de

UCHL1; HK2; GCK; GPI; HK1

Almidón y sacarosa

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Metabolismo de aminoazúcares

NQO1; HK2; GCK; HK1

Metabolismo de

PRDX6; GRN; YWHAZ; CYP1B1

Ácido araquidónico

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Señalización de ritmo circadiano

CSNK1E; CREB1; ATF4; NR1D1

Sistema de coagulación

BDKRB1; F2R; SERPINE1; F3

Receptor de Dopamina

PPP2R1A; PPP2CA; PPP1CC; PPP2R5C

Señalización

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Metabolismo de glutationa

IDH2; GSTP1; ANPEP; IDH1

Metabolismo de glicerolípidos

ALDH1A1; GPAM; SPHK1; SPHK2

Metabolismo de ácido linoleico

PRDX6; GRN; YWHAZ; CYP1B1

Metabolismo de Metionina

DNMT1; DNMT3B; AHCY; DNMT3A

Metabolismo de piruvato

GLO1; ALDH1A1; PKM2; LDHA

Metabolismo de

ALDH1A1; NOS3; NOS2A

Arginina y Prolina

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Señalización Eicosanoide

PRDX6; GRN; YWHAZ

Metabolismo de

HK2; GCK; HK I

Fructosa y Manosa

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Metabolismo de Galactosa

HK2; GCK; HK1

Biosíntesis de estilbeno,

PRDX6; PRDX1; TYR

cumarina y lignina

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Ruta de

CALR; B2M

Presentación de antígenos

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Biosíntesis de esteroides

NQO1; DHCR7

Metabolismo de Butanoato

ALDH1A1; NLGN1

Ciclo del Citrato

IDH2; IDH1

Metabolismo de ácidos grasos

ALDH1A1; CYP1B1

Metabolismo de

PRDX6; CHKA

FUNCIÓN CELULAR

GENES

Glicerofosfolípidos

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Metabolismo de Histidina

PRMT5; ALDH1A1

Metabolismo de Inositol

ERO1L; APEX1

Metabolismo de xenobióticos

GSTP1; CYP1B1

por citocromo p450

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Metabolismo de metano

PRDX6; PRDX1

Metabolismo de fenilalanina

PRDX6; PRDX1

Metabolismo de Propanoato

ALDH1A1; LDHA

Metabolismo de

PRMT5; AHCY

Selenoaminoácido

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Metabolismo de esfingolípidos

SPHK1; SPHK2

Aminofosfonato

PRMT5

Metabolismo

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Andrógenos y estrógenos

PRMT5

Metabolismo de

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Ascorbato y Aldarato

ALDH1A1

Metabolismo de

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Biosínteis de ácidos biliares

ALDH1A1

Metabolismo de cisteína

LDHA

Biosínteis de ácidos grasos

FASN

Receptor de Glutamato

GNB2L1

Señalización de

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Respuesta de estrés

PRDX1

Oxidativa mediada por NRF2

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Ruta de

GPI

Pentosa fosfato

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Interconversiones de

UCHL1

Pentosa y Glucuronato

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Metabolismo de Retinol

ALDH1A1

Metabolismo de Riboflavina

TYR

Metabolismo de tirosina

PRMT5, TYR

Biosíntesis de Ubiquinona

PRMT5

Degradación de Valina, Leucina e

ALDH1A1

Isoleucina

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Metabolismo de Glicina, Serina y

CHKA

Treonina

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Degradación de lisina

ALDH1A1

Dolor/sabor

TRPM5; TRPA1

Dolor

TRPM7; TRPC5; TRPC6; TRPC1; Cnr1; cnr2; Grk2;

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de ejemplo para adaptar este sistema de nucleasa programable de ARN para dirigir la actividad del complejo CRISPR en el núcleo de las células eucariotas.

Cultivo celular y transinfección.

Se mantuvo la estirpe celular HEK 293FT (Life Technologies) de riñón embriónico humano (HEK, por sus siglas en inglés) en Medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM, por sus siglas en inglés) enriquecido con suero fetal bovino al 10% (HyClone), GlutaMAX 2 mM (Life Technologies), 100 U/ml de penicilina y 100 µg/ml de estreptomicina a 37°C con incubación en CO2 al 5%. Se mantuvo la estirpe celular neuro2A (N2A) de ratón (ATCC) con DMEM enriquecido con suero fetal bovino al 5% (HyClone), GlutaMAX 2 mM (Life Technologies), 100 U/ml de penicilina y 100 µg/ml de estreptomicina a 37°C con CO2 al 5%.

Se sembraron células 293FT de HEK o N2A en placas de 24 pozos (Corning) un día previamente a transinfección a una densidad de 200.000 células por pozo. Se transinfectaron las células usando Lipofectamine 2000 (Life Technologies) siguiendo el protocolo recomendado por el fabricante. Para cada pozo de una placa de 24 pozos, se usó un total de 800 ng de plásmido.

Ensayo surveyor y análisis de secuenciación para modificación de genomas.

Se transinfectaron células 293FT de HEK o N2A con ADN de plásmido como se describió anteriormente. Después de transinfección, se incubaron las células a 37°C durante 72 horas antes de extracción de ADN genómico. Se extrajo ADN genómico usando el estuche de extracción de ADN QuickExtract (Epicentre) siguiendo el protocolo del fabricante. En resumen, se volvieron a suspender las células en disolución QuickExtract y se incubaron a 65°C durante 15 minutos y 98°C durante 10 minutos. El ADN genómico extraído se trató inmediamente o se almacenó a 20ºC.

La región genómica que rodea un sitio objetivo de CRISPR para cada gen se multiplicó por PCR y se purificaron los productos usando una columna de QiaQuick Spin (Qiagen) siguiendo el protocolo del fabricante. Se mezcló un total de 400 ng los productos PCR purificados con 2 µl de tampón PCR Taq Polimerasa (Enzymatics) X 10 y agua ultrapura a un volumen final de 20 µl y se sometió a un procedimiento de rehibridación para permitir la formación de heterodúplex: 95°C durante 10 min, 95°C a 85°C descendiendo a -2°C/s, 85°C a 25°C a – 0,25°C/s y 25°C mantenidos durante 1 minuto. Después de rehibridación, se trataron los productos con nucleasa Surveyor y estimulador S Surveyor (Transgenomics) siguiendo el protocolo recomendado por el fabricante y se analizaron sobre geles de poliacrilamida Novex TBE al 4-20% (Life Technologies). Se tiñeron los geles con tinción de ADN SYBR Gold (Life Technologies) durante 30 minutos y se formaron imágenes con un sistema de formación de imágenes de gel Gel Doc (Bio-rad). La cuantificación estuvo basada en intensidades de banda relativas, como una medición de la fracción de ADN escindido. La Figura 8 proporciona una ilustración esquemática de esta prueba Surveyor.

Prueba de polimorfismo de longitud de fragmento de restricción para detección de recombinación homóloga.

Se transinfectaron células 293FT de HEK y N2A con ADN de plásmido y se incubaron a 37ºC durante 72 horas antes de extracción de ADN genómico como se describió anteriormente. La región genómica objetivo se multiplicó por PCR usando cebadores fuera de las ramas de homología de la plantilla de recombinación homóloga (RH). Los productos PCR se separaron en un gel de agarosa al 1% y se extrajo con Estuche MinElute GelExtraction (Qiagen). Se digirieron los productos purificados con HindIII (Fermentas) y se analizaron en un gel de poliacrilamida Novex TBE al 6% (Life Technologies).

Predicción y análisis de la estructura secundaria de ARN.

Se realizó la predicción de la estructura secundaria de ARN usando el webserver RNAfold online desarrollado en el Instituto para Química Teórica de la Universidad de Viena, usando el algoritmo de predicción de estructura centroide (véase por ej., A. R. Gruber et al., 2.008, Cell 106 (1): 23-24 y PA Carr y GM Church, 2.009, Nature Biotechnology 27 (12): 1.151-62).

Prueba de interferencia de transformación de plásmidos bacterianos.

Se reconstituyeron elementos del sitio 1 de CRISPR de S. pyogenes suficientes para actividad de CRISPR en E. coli usando plásmido de pCRISPR (ilustrado de manera esquemática en la Figura 10A). pCRISPR contenía ARNtracr, SpCas9, y una secuencia líder que conducía a la matriz de ARNcr. Se insertaron espaciadores (también referidos como “secuencias guía”) en la matriz de ARNcr entre los sitios BsaI usando oligonucleótidos hibridados, como se ilustra. Se construyeron plásmidos provocadores usados en la prueba de interferencia insertando la secuencia protoespaciadora (también referida como una “secuencia diana”) junto con una secuencia unidad de CRISPR adyacente (PAM) en pUC19 (véase la Figura 10B). El plásmido provocador contenía resistencia a la ampicilina. La figura 10C proporciona una representación esquemática de la prueba de interferencia. Las cepas E. coli químicamente competentes que ya soportaban pCRISPR y el espaciador apropiado se transformaron con el plásmido provocador que contenía la correspondiente secuencia protoespaciador-PAM. Se usó pUC19 para valorar

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especifica, después de identificar todos los sitios potenciales, el programa filtra secuencias basadas en el número de veces que aparecen en el genoma de referencia relevante. Para esas enzimas CRISPR para las cuales se determina la especificidad de secuencia mediante una secuencia "simiente", tal como la 5’ de 11-12 pb de la secuencia PAM, incluyendo la propia secuencia PAM, la etapa de filtración puede estar basada en la secuencia simiente. Así, para evitar la edición en sitios genómicos adicionales, los resultados se filtran basándose en el número de apariciones de la secuencia simiente:PAM en el genoma relevante. Se puede permitir que el usuario elija la longitud de la secuencia simiente. También se puede permitir que el usuario especifique el número de apariciones de la secuencia simiente:PAM en un genoma para fines de pase del filtro. El defecto es investigar secuencias únicas. El nivel de filtración se modifica cambiando tanto la longitud de la secuencia simiente como el número de apariciones de la secuencia en el genoma. El programa puede proporcionar además o alternativamente la secuencia de una secuencia guía complementaria a la secuencia o secuencias objetivo indicadas proporcionando el complemento inverso de la secuencia o secuencias objetivo identificadas.

Ejemplo 4: Evaluación de híbridos ARNcr-ARNtracr quiméricos múltiples.

Este ejemplo describe los resultados obtenidos para los ARN quiméricos (los ARNqui; que comprenden una secuencia guía, una secuencia de emparejamiento tracr y una secuencia tracr en un transcrito único) que tienen secuencias tracr que incorporan diferentes longitudes de secuencia ARNtracr natural. La Figura 18a ilustra un esquema de un vector bicistrónico de expresión para ARN quimérico y Cas9. Cas9 es conducido por el activador CBh y el ARN quimérico es conducido por un activador U6. El ARN guía quimérico consta de una secuencia guía de 20 pb (Ns) unida a la secuencia tracr (barriendo desde la primera "U" de la cadena menor al extremo del transcrito), que se trunca en diversas posiciones como se indica. Las secuencias guía y tracr se separan mediante la secuencia de emparejamiento tracr GUUUUAGAGCUA seguido por la secuencia bucle GAAA. Los resultados de los ensayos SURVEYOR para inserciones o supresiones mediadas por Cas9 en los sitios EMX1 y PVALB humanos se ilustran en la Figura 18b y 18c, respectivamente. Las flechas indican los fragmentos SURVEYOR esperados. Los ARNqui se indican por su designación "+n" y ARNcr se refiere a un ARN híbrido donde las secuencias guía y tracr se expresan como transcritos separados. La cuantificación de estos resultados, realizados por triplicado, se ilustran por histograma en las Figuras 19a y 19b, que corresponden a las Figuras 18b y 18c, respectivamente ("N. D." indica no inserciones o supresiones detectadas). Los ID del protoespaciador y su correspondiente objetivo genómico, secuencia del protoespaciador, secuencia PAM y posición de la cadena se proporcionan en la Tabla D. Las secuencias guía se diseñaron para que fueran complementarias a la secuencia completa del protoespaciador en el caso de transcritos separados en el sistema híbrido o sólo a la porción subrayada en el caso de ARN quiméricos.

Tabla D:

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Cultivo celular y transinfección.

Se mantuvo la estirpe celular 293FT (Life Technologies) de riñón embriónico humano (HEK) en Medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) enriquecido con suero fetal bovino al 10% (HyClone), GlutaMAX 2 mM (Life Technologies), 100 U/ml de penicilina y 100 µg/ml de estreptomicina a 37°C con incubación en CO2 al 5%. Se sembraron células 293FT en placas de 24 pozos (Coming) 24 horas previamente a transinfección a una densidad de

150.000 células por pozo. Se transinfectaron las células usando Lipofectamine 2000 (Life Technologies) siguiendo el protocolo recomendado por el fabricante. Para cada pozo de una placa de 24 pozos, se usó un total de 500 ng de plásmido.

Prueba SURVEYOR para modificación de genomas.

Se transinfectaron células 293FT con ADN de plásmido como se describió anteriormente. Se incubaron las células a 51

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NLS-SpCas9-EGFP-NLS:

imagen386

imagen387

imagen388

imagen389

imagen390

imagen391

U6-St_ARNtracr(7-97):

imagen392

U6-RD-espaciador-RD (SF370 S. pyogenes)

imagen393

imagen394

imagen395

imagen396

imagen397

imagen398

(N = secuencia guía; primer subrayado = secuencia de emparejamiento tracr; segundo subrayado = secuencia tracr; negrita = terminador)

ARN quimérico de ejemplo para Cas9 de CRISPR1 LMD-9 de S. thermophilus (con PAM de NNAGAAW)

(N = secuencia guía; primer subrayado = secuencia de emparejamiento tracr; segundo subrayado = secuencia tracr; negrita = terminador)

ARN quimérico de ejemplo para Cas9 de CRISPR1 LMD-9 de S. thermophilus (con PAM de NNAGAAW)

imagen399

imagen400

10 (N = secuencia guía; primer subrayado = secuencia de emparejamiento tracr; segundo subrayado = secuencia tracr; negrita = terminador)

ARN quimérico de ejemplo para Cas9 de CRISPR1 LMD-9 de S. thermophilus (con PAM de NNAGAAW)

imagen401

(N = secuencia guía; primer subrayado = secuencia de emparejamiento tracr; segundo subrayado = secuencia tracr; 15 negrita = terminador)

ARN quimérico de ejemplo para Cas9 de CRISPR1 LMD-9 de S. thermophilus (con PAM de NNAGAAW)

imagen402

(N = secuencia guía; primer subrayado = secuencia de emparejamiento tracr; segundo subrayado = secuencia tracr; negrita = terminador)

20 ARN quimérico de ejemplo para Cas9 CRISPR1 LMD-9 de S. thermophilus (con PAM de NNAGAAW)

imagen403

(N = secuencia guía; primer subrayado = secuencia de emparejamiento tracr; segundo subrayado = secuencia tracr; negrita = terminador)

ARN quimérico de ejemplo para Cas9 CRISPR1 LMD-9 de S. thermophilus (con PAM de NNAGAAW)

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imagen409

imagen410

imagen411

imagen412

imagen413

imagen414

imagen415

Interferencia parcial de los patrones NAGNN y NNGGN

Los patrones NAGNN eran significativamente diferentes de los otros patrones pero soportan un efecto mucho menor que NGGNN (véase el ensayo de significancia verdadera de Tukey a continuación).

Finalmente, los patrones NTGGN y NCGGN son similares y muestran interferencia de CRISPR más significativamente que los patrones NTGHN y NCGHN (donde H es A,T o C), como se muestra por un ensayo de student de pares ajustados de bonferroni.

Comparaciones de pares del efecto de b4 sobre secuencias NYGNN usando ensayos t con DE agrupada.

Datos: b4

A

C G

C 1,00

- -

G 9,2e-05

2,4e-06 -

T

0,31 1,00 1,2e-08

Tomados juntos, estos resultados permiten concluir que los patrones NNGGN producen en general una interferencia 10 completa en el caso de NGGGN, o una interferencia parcial en el caso de NAGGN, NTGGN o NCGGN.

Comparaciones múltiples de Tukey de medias: 95% de nivel de confianza a nivel familiar.

sb2:b3

imagen416

dif infer super p adj

G:G-A:A

-2,76475 -2,94075 -2,58875 <1E -07

G:G-C:A

-2,79911 -2,97511 -2,62311 <1E -07

G:G-T:A

-2,7809 -2,9569 -2,6049 <1E -07

G:G-A:C

-2,81643 -2,99244 -2,64043 <1E -07

G:G-C:C

-2,77903 -2,95504 -2,60303 <1E -07

G:G-G:C

-2,64867 -2,82468 -2,47267 <1E -07

G:G-T:C

-2,79718 -2,97319 -2,62118 <1E -07

G:G-A:G

-2,67068 -2,84668 -2,49468 <1E -07

G:G-C:G

-2,73525 -2,91125 -2,55925 <1E -07

G:G-T:G

-2,7976 -2,62159 -2,9736 <1E -07

G:G-A:T

-2,76727 -2,59127 -2,94328 <1E -07

G:G-C:T

-2,84114 -2,66513 -3,01714 <1E -07

G:G-G:T

-2,76409 -2,58809 -2,94009 <1E -07

G:G-T:T

-2,76781 -2,59181 -2,64381 <1E -07

G:G-G:A

-2,13964 -2,31565 -1,96364 <1E -07

G:A-A:A

-0,62511 -0,80111 -0,4491 <1E -07

imagen417

imagen418 imagen419 imagen420

G:A-C:A

-0,65947 -0,83547 -0,48346 <1E -07

G:A-T:A

-0,64126 -0,46525 -0,81726 <1E -07

G:A-A:C

-0,67679 -0,50078 -0,85279 <1E -07

G:A-C:C

-0,63939 -0,46339 -0,81539 <1E -07

G:-A-G:C

-0,50903 -0,33303 -0,63503 <1E -07

sb2:b3

imagen421

dif imagen422 infer imagen423 super imagen424 p adj

G:A-T:C

-0,65754 -0,48154 -0,83354 <1E -07

G:A-A:G

-0,53104 -0,35503 -0,70704 <1E -07

G:A-C:G

-0,59561 -0,4196 -0,77161 <1E -07

G:A-T:G

-0,65795 -0,48195 -0,83396 <1E -07

G:A-A:T

-0,62763 -0,45163 -0,80363 <1E -07

G:A-C:T

-0,70149 -0,52549 -0,8775 <1E -07

G:A-G:T

-0,62445 -0,44844 -0,80045 <1E -07

G:A-T:T

-0,62817 -0,45216 -0,80417 <1E -07

sb3:b4

imagen425

dif imagen426 infer imagen427 super imagen428 p adj

G:G-G:A

-0,33532 -0,51133 -0,15932 <1E-07

G:G-G:C

-0,18118 -0,35719 -0,00518 0,036087

G:G-G:T

-0,31626 -0,14026 -0,49226 <1E-07

Objetivo aleatorizado

Para el experimento de objetivo aleatorizado se obtuvieron 540.726 lecturas para crR6 y 753.570 para R6. Como antes, se esperó que sólo la mitad de las lecturas secuenciara el extremo de interés del producto PCR. Después de 5 filtrar para las lecturas que soportan un objetivo que está exento de error o con una mutación puntual única, permanecieron 217.656 y 353.141 lecturas para crR6 y R6, respectivamente. Se computó la proporción relativa de cada mutante en la muestra crR6 sobre la muestra R6 (Figura 24c). Todas las mutaciones fuera de la secuencia simiente (13-20 bases lejos de la PAM) muestran interferencia completa. Esas secuencias se usaron con una referencia para determinar si se podía decir que otras mutaciones en el interior de la secuencia simiente alteraban

10 significativamente la interferencia. Se fijó una distribución normal para estas secuencias usando la función fitdistr del paquete MASS R. El cuantil 0,99 de la distribución fijada se muestra como una línea de puntos en la Figura 24c. La Figura 72 muestra un histograma de la densidad de datos con distribución normal fijada (línea negra) y el cuantil 0,99 (línea de puntos).

Tabla F. Abundancia relativa de secuencias PAM en las muestras crR6/R6 promediadas sobre las bases 1 y 5.

15

imagen429

Cebador

Secuencia 5'-3'

B217

TCCTAGCAGGATTTCTGATATTACTGTCACGTTTTAGAGCTATGCTGTTTTGA

B218

GTCACAGTAATATCAGAAATCCTGCTAGGAGTTTTGGGACCATTCAAAACAGC

B229

GGGTTTCAAGTCTTTGTAGCAAGAG

B230

GCCAATGAACGGGAACCCTTGGTC

B250

NNNNGACGAGGCAATGGCTGAAATC

B251

NNNNTTATTTGGCTCATATTTGCTG

B255

CTTTACACCAATCGCTGCAACAGAC

B256

CAAAATTTCTAGTCTTCTTTGCCTTTCCCCATAAAACCCTCCTTA

B257

AGGGTTTTATGGGGAAAGGCAAAGAAGACTAGAAATTTTGATACC

B258

CTTACGGTGCATAAAGTCAATTTCC

B269

TGGCTCGATTTCAGCCATTGC

B270

CTTTGACGAGGCAATGGCTGAAATCGAGCCAANAAAGCGCAAG

B271

CTTTGACGAGGCAATGGCTGAAATCGAGCCAAANAAGCGCAAG

B272

CTTTGACGAGGCAATGGCTGAAATCGAGCCAAAANAGCGCAAG

B273

CTTTGACGAGGCAAAGGCTGAAATCGAGCCAAAAANGCGCAAG

B274

CTTTGACGAGGCAATGGCTGAAATCGAGCCAAAAAANCGCAAG

B275

CTTTGACGAGGCAATGGCTGAAATCGAGCCAAAAAAGNGCAAG

B276

CTTTGACGAGGCAATGGCTGAAATCGAGCCAAAAAANCAAGAAG

B277

CTTTGACGAGGCAATGGCTGAAATCGAGCCAAAAAAGCGNAAGAAG

B278

CTTTGACGAGGCAATGGCTGAAATCGAGCCAAAAAAGCGCNAGAAG

B279

GCGCTTTTTTGGCTCGATTTCAG

B280

CAATGGCTGAAATCGAGCCAAAAAAGCGCANGAAGAAATC

Cebador

Secuencia 5'-3'

B281

CAATGGCTGAAATCGAGCCAAAAAAGCGCAANAAGAAATC

B282

CAATGGCTGAAATCGAGCCAAAAAAGCGCAAGNAGAAATC

B283

CAATGGCTGAAATCGAGCCAAAAAAGCGCAAGANGAAATC

B284

CAATGGTGAAATCGAGCCAAAAAAGCGCAAGAANAAATC

B285

CAATGGCTGAAATCGAGCCAAAAAAGCGCAAGAAGNAATCAACC

B286

CAATGGCTGAAATCGAGCCAAAAAAGCGCAAGAAGANATCAACC

B287

CAATGGCTGAAATCGAGCCAAAAAAAGCGCAAGAAGAANTCAACC

B288

CAATGGCTGAAATCGAGCCAAAAAAGCGCAAGAAGAAANCAACC

B289

CAATGGCTGAAATCGAGCCAAAAAAGCGCAAGAAGAAATNAACCAGC

B290

CAATGGCTGAAATCGAGCCAAAAAAGCGCAAGAAGAAATCNACCAGC

B296

gatccTCCATCCGTACAACCCACAACCCTGg

B297

aattcCAGGGTTGTGGGTTGTACGGATGGAg

B298

CATGGATCCTATTTCTTAATAACTAAAAATATGG

B299

CATGAATTCAACTCAACAAGTCTCAGTGTGCTG

B300

AAACATTTTTTCTCCATTTAGGAAAAAGGATGCTG

B301

AAAACAGCATCCTTTTTCCTAAATGGAGAAAAAT

B302

AAACCTTAAATCAGTCACAAATAGCAGCAAAATTG

B303

AAAACAATTTTGCTGCTATTTC-TGACTGATTTAAG

B304

AAACTTTTCATCATACGACCAATCTGCTTTATTTG

B305

AAAACAAATAAAGCAGATTGGTCGTATGATGAAAA

B306

AAACTCGTCCAGAAGTTATCGTAAAAGAAATCGAG

B307

AAAACTCGATTTCTTTTACGATAACTTCTGGACGA

B308

AAACAATCTCTCCAAGGTTTCCTTAAAAATCTCTG

B309

AAAACAGAGATTTTTAAGGAAACCTTGGAGAGATT

B310

AAACGCCATCGTCAGGAAGAAGCTATGCTTGAGTG

B311

AAAACACTCAAGCATAGCTTCTTCCTGACGATGGC

B312

AAACATCTCTATACTTATTGAAATTTCTTTGTATG

B313

AAAACATACAAAGAAATTTCAATAAGTATAGAGAT

B314

AAACTAGCTGTGATAGTCCGCAAAACCAGCCTTCG

B315

AAAACGAAGGCTGGTTTTGCGGACTATCACAGCTA

B316

AAACATCGGAAGGTCGAGCAAGZAAZZATCZZZZG

B317

AAAACAAAAGATAAZZACZZGCZCGACCZZCCGAZ

B318

AAACAAGATGGTATCGCAAAGTAAGTGACAATAAG

B319

AAAACTTATTGTCACTTACTTTGCGATACCATCTT

B320

GAGACCTTTGAGCTTCCGAGACTGGTCTCAGTTTTGGGACCATTCAAAACAG

B321

TGAGACCAGTCTCGGAAGCTCAAAGGTCTCGTTTTAGAGCTATGCTGTTTTG

B352

aaacTACTTTACGCAGCGCGGAGTTCGGTTTTTTg

B353

aaaacAAAAAACCGAACTCCGCGCTGCGTAAGTA

HC008_SP

ATGCCGGTACTGCCGGGCCTCTTGCGGGATTACGAAATCATCCTG

Cebador

Secuencia 5'-3'

HC009_SP

GTAGACTGGCGATGCTGTCGGAATGGACGATCACACTACTCTTCTT

HC010_SP

TTAAGAAATAATCTTCATCTAAAATATACTTCAGTCACCTCCTAGCTGAC

HC011_SP

ATTGATTTGAGTCAGCTAGGAGGTGACTGAAGTATATTTTAGATGAAG

HC014_SP

imagen430

HC015_SP

imagen431

L403

AGTCATCCCAGCAACAAATGG

L409

CGTGGTAAATCGGATAACGTTCCAAGTGAAG

L422

Tgctcttcttcacaaacaaggg

L426

AAGCCAAAGTTTGGCACCACC

L430

GTAGCTTATTCAGTCCTAGTGG

L444

CGTTTGTTGAACTAATGGGTGCAAATTACGAATCTTCTCCTGACG

L445

CGTCAGGAGAAGATTCGTAATTTGCACCCATTAGTTCAACAAACG

L446

GATATTATGGAGCCTATTTTTGTGGGTTTTTAGGCATAAAACTATATG

L447

CATATAGTTTTATGCCTAAAAACCcACAAAAATAGGCTCCATAATATG

L448

ATTATTTCTTAATAACTAAAAATATGG

L457

CGTgtacaattgccagcgcacggc

L458

GCACCGGTGATCACTAGTCCTAGG

L459

cctaggactagtgatcaccggtGCAAATATGAGCCAAATAAATATAT

L461

GCCGTACGCTAGCAATTGTACACGTTTGTTGAACTAATGGGTGC

L481

TTCAAATTTTCCCATTTGATTCTCC

L488

CCATATTTTTAGTTATTAAGAAATAATACCAGCCATCAGTCACCTCC

W256

AGACGATTCAATAGACAATAAGG

W286

GTTTTGGGACCATTCAAAACAGCATAGCTCTAAAACCTCGTAGAC

W287

GCTATGCTGTTTTGAATGGTCCCAAAACcattattttaacacacgaggtg

W288

GCTATGCTGTTTTGAATGGTCCCAAAACGCACCCATTAGTTCAACAAACG

W326

AATTCTTTTCTTCATCATCGGTC

W327

AAGAAAGAATGAAGATTGTTCATG

W341

GGTACTAATCAAAATAGTGAGGAGG

W354

GTTTTTCAAAATCTGCGGTTGCG

W355

AAAAATTGAAAAAATGGTGGAAACAC

W356

ATTTCGTAAACGGTATCGGTTTCTTTTAAAGTTTTGGGACCATTCAAAACAGC

W357

TTTAAAAGAAACCGATACCGTTTACGAAATGTTTTAGAGCTATGCTGTTTTGA

W365

AAACGGTATCGGTTTCTTTTAAATTCAATTGTTTTGGGACCATTCAAAACAGC

W366

AATTGAATTTAAAAGAAACCGATACCGTTTGTTTTAGAGCTATGCTGTTTTGA

W370

GTTCCTTAAACCAAAACGGTATCGGTTTCTTTTAAATTC

Cebador

Secuencia 5'-3'

W371

GAAACCGATACCGTTTTGGTTTAAGGAACAGGTAAAGGGCATTTAAC

W376

CGATTTCAGCCATTGCCTCGTC

W377

GCCTTTGACGAGGCAATGGCTGAAATCGNNNNNAAAAAGCGCAAGAAGAAATCAAC

W391

TCCGTACAACCCACAACCCTGCTAGTGAGCGTTTTGGGACCATTCAAAACAGC

W392

GCTCACTAGCAGGGTTGTGGGTTGTACGGAGTTTTAGAGCTATGCTGTTTTGA

W393

TTGTTGCCACTCTTCCTTCTTTC

W397

CAGGGTTGTGGGTTGTTGCGATGGAGTTAACTCCCATCTCC

W398

GGGAGTTAACTCCATCGCAACAACCCACAACCCTGCTAGTG

W403

GTGGTATCTATCGTGATGTGAC

W404

TTACCGAAACGGAATTTATCTGC

W405

AAAGCTAGAGTTCCGCAATTGG

W431

GTGGGTTGTACGGATTGAGTTAACTCCCATCTCCTTC

W432

GATGGGAGTTAACTCAATCCGTACAACCCACAACCCTG

W433

GCTTCACCTATTGCAGCACCAATTGACCACATGAAGATAG

W434

GTGGTCAATTGGTGCTGCAATAGGTGAAGCTAATGGTGATG

W463

CTAGATTTGTATTAATTTTGAGACATTATGCTTCACCTTC

W464

GCATAATGTCTCAAAATTAATACAAATCAGTGAAATCATG

W465

GTTTTGGGACCATTCAAAACAGCATAGCTCTAAAACGTGACAGTAATATCAG

W466

GTTTTAGAGCTATGCTGTTTTGAATGGTCCCAAAACGCTCACTAGCAGGGTTG

W542

ATACTTTACGCAGCGCGGAGTTCGGTTTTgTAGGAGTGGTAGTATATACACGAGTACAT

imagen432

imagen433

Nombre de cepas resultantes Cebadores usados para verificar genotipo editado

PCR SOEing

W403/W404 JEN56 W403/W404 W403/W404 JEN60 _ W403/W404

B255/B258

JEN52 W393/W405

B230/B229 JEN51 W422/W426 L422/L426 _ JEN43 L457/L458 JEN64 igual que las usadas para ΔsrtA y ΔbgaA

imagen434

imagen435

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Ejemplo 6: Optimización del ARN guía para Cas9 de Streptococcus pyogenes (referido como SpCas9).

Los solicitantes mutaron las secuencias ARNtracr y de repetición directa o mutaron el ARN guía quimérico para activar los ARN en las células.

La optimización se basa en la observación de que hay tramos de timinas (Ts) en el ARNtracr y ARN guía, que podían conducir a terminación de la transcripción temprana por el activador pol 3. Por lo tanto, los Solicitantes generaron las siguientes secuencias optimizadas. Se presentan en parejas ARNtracr optimizada y la repetición directa optimizada correspondiente.

ARNtracr optimizado 1 (mutación subrayada):

imagen437

Repetición directa optimizada 1 (mutación subrayada):

imagen438

ARNtracr optimizado 2 (mutación subrayada):

imagen439

15 Repetición directa optimizada 2 (mutación subrayada):

imagen440

Los solicitantes también optimizaron el ARN guía quimérico para actividad óptima en células eucariotas. ARN guía original :

imagen441

20 Secuencia de ARN guía quimérico optimizado 1:

imagen442

Secuencia de ARN guía quimérico optimizado 2:

imagen443

Secuencia de ARN guía quimérico optimizado 3: 5

imagen444

10

15

20

25

30

35

40

45

Los solicitantes mostraron que el ARN guía quimérico optimizado funciona mejor como se indica en la Figura 3. El experimento se realizó por cotransinfección de células 293FT con Cas9 y una casete de ADN ARN guía de U6 para expresar una de las cuatro formas de ARN mostradas anteriormente. El objetivo del ARN guía es el mismo sitio objetivo en el lugar Emx1 humano: "GTCACCTCCAATGACTAGGG".

Ejemplo 7: Optimización de Cas9 CRISPR1 LMD-9 de Streptococcus thermophilus (referido como StlCas9).

Los solicitantes diseñaron los ARN quiméricos guía como se muestra en la Figura 4.

Los ARN guía de StlCas9 pueden experimentar el mismo tipo de optimización que para los ARN guía de SpCas9, por rotura de los tramos de politiminas (Ts).

Ejemplo 8: Diversidad de Cas9 y mutaciones.

El sistema CRISPR-Cas es un mecanismo inmunitario adaptativo contra ADN exógeno invasor empleado por diversas especies a través de bacterias y arqueas. El sistema CRISPR-Cas9 de tipo II consiste en una serie de genes que codifica proteínas responsables de la “adquisición” de ADN extraño en el lugar CRISPR, así como una serie de genes que codifica la “ejecución” del mecanismo de escisión de ADN; estos incluyen la ADN nucleasa (Cas9), un ARN-cr de transactivación no codificante (ARNtracr) y una matriz de espaciadores procedentes de ADN extraño flanqueados por repeticiones directas (los ARNcr). En la maduración por Cas9, el dúplex de ARNtracr y ARNcr guía la nucleasa Cas9 para una secuencia de ADN fijada como objetivo especificada por las secuencias guía espaciadoras y media roturas de doble cadena en el ADN cerca de una unidad de secuencia corta en el ADN fijado como objetivo que se requiere para escisión y es específico para cada sistema CRISPR-Cas. Los sistemas CRISPR-Cas de tipo II se encuentran por todo el reino bacteriano y son muy diversos en secuencia y tamaño de la proteína Cas9, secuencia de repetición directa de ARNtracr y ARNcr, organización de genomas de estos elementos y el requerimiento de unidad para escisión fijada como objetivo. Una especie puede presentar múltiples sistemas CRISPR-Cas distintos.

Los solicitantes evaluaron 207 Cas9s putativas de especies bacterianas identificadas basándose en homología de secuencias para conocer Cas9s y estructuras ortólogas para conocer subdominios, incluyendo el dominio de la endonucleasa HNH y los dominios de endonucleasa RuvC [información de the Eugene Koonin and Kira Makarova]. El análisis filogenético basado en la conservación de secuencias de proteínas de este conjunto reveló cinco familias de Cas9s, incluyendo tres grupos de Cas9s grandes (∼1.400 aminoácidos) y dos de Cas9s pequeños (∼1.100 aminoácidos) (Figuras 39 y 40A-F).

En este ejemplo, los solicitantes muestran que las siguientes mutaciones pueden convertir SpCas9 en una enzima de mellado: D10A, E762A, H840A, N854A, N863A, D986A.

Los solicitantes proporcionan secuencias que muestran donde se sitúan los puntos de mutación dentro del gen SpCas9 (Figura 41). Los solicitantes muestran también que las nickasas aún pueden mediar la recombinación homóloga (Prueba indicada en la Figura 2). Además, los solicitantes muestran que SpCas9 con estas mutaciones (individualmente) no inducen doble rotura de cadena (Figura 47).

Ejemplo 9: Suplemento para especificidad de fijación como objetivo de ADN de la nucleasa Cas9 guiada por ARN.

Cultivo celular y transinfección.

Se mantuvo la estirpe celular 293FT (Life Technologies) de riñón embriónico humano (HEK) en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) enriquecido con suero fetal bovino al 10% (HyClone), GlutaMAX 2 mM (Life Technologies), 100 U/ml de penicilina y 100 µg/ml de estreptomicina a 37°C con incubación con CO2 al 5%.

Se sembraron células 293FT en placas de 6 pozos, placas de 24 pozos o placas de 96 pozos (Corning) 24 horas previas a transinfección. Se transinfectaron las células usando Lipofectamine 2000 (Life Technologies) a confluencia del 80-90% siguiendo el protocolo recomendado por el fabricante. Para cada pozo de una placa de 6 pozos, se usó un total de 1 ug de plásmido Cas9+ARNsg. Para cada pozo de una placa de 24 pozos, se usó un total de 500 ng de plásmido Cas9+ARNsg a menos que se indicara de otro modo. Para cada pozo de una placa de 96 pozos, se usaron 65 ng de plásmido Cas9 a una relación molar de 1:1 para el producto PCR de U6-ARNsg.

Se mantuvo estirpe de células madre embrionarias humanas HUES9 (núcleo del instituto de células madre de Harvard) en condiciones exentas de alimentador en GelTrex (Life Technologies) en medio mTesR (Stemcell Technologies) enriquecido con 100 ug/ml de Normocina (InvivoGen). Se transinfectaron células HUES9 con estuche Amaxa P3 Primary Cell 4-D Nucleofector (Lonza) siguiendo el protocolo del fabricante.

Prueba de la nucleasa SURVEYOR para modificación de genomas.

Se transinfectaron células 293FT con ADN de plásmido como se describió anteriormente. Se incubaron las células a 37°C durante 72 horas postransinfección previamente a extracción de ADN genómico. Se extrajo ADN genómico usando la disolución de extracción de ADN QuickExtract (Epicentre) siguiendo el protocolo del fabricante. En resumen, se volvieron a suspender las células granuladas en disolución QuickExtract y se incubaron a 65°C durante 15 minutos y 98°C durante 10 minutos.

La región genómica flanqueando el sitio fijado como objetivo de CRISPR para cada gen se multiplicó por PCR (cebadores enumerados en las Tablas J y K) y se purificaron los productos usando Columna QiaQuick Spin (Qiagen) siguiendo el protocolo del fabricante. Se mezclaron 400 ng totales de los productos PCR purificados con 2 µl de tampón PCR de ADN polimerasa 10X Taq (Enzymatics) y agua ultrapura a un volumen final de 20 µl y se sometió a un procedimiento de hibridación de nuevo para permitir la formación de heterodúplex: 95°C durante 10 min, 95°C a 85°C variando a -2°C/s, 85°C a 25°C a -0,25°C/s y se mantuvieron 25°C durante 1 minuto. Después de hibridar de nuevo, los productos se trataron con nucleasa SURVEYOR y activador S SURVEYOR (Transgenomics) siguiendo el protocolo recomendado por el fabricante y se analizaron en geles de poliacrilamida Novex TBE al 4-20% (Life Technologies). Se tiñeron los geles con tinte de ADN SYBR Gold (Life Technologies) durante 30 minutos y se formaron imágenes con un sistema de formación de imágenes de gel Doc (Bio-rad). La cuantificación se basó en intensidades de banda relativas.

Análisis de Northern de expresión de ARNtracr en células humanas.

Se realizaron análisis Northern como se describió previamente 1. En resumen, se calentaron los ARN a 95°C durante 5 min antes de la carga en geles de poliacrilamida desnaturalizadantes al 8% (SequaGel, National Diagnostics). Después, se transfirió el ARN a una membrana Hybond N+ prehibridada (GE Healthcare) y se reticuló con reticulador de UV Stratagene (Stratagene). Se etiquetaron las sondas con [gamma-32P] ATP (Perkin Elmer) con T4 polinucleótido cinasa (New England Biolabs). Después de lavado, se expuso la membrana a pantalla de fósforo durante una hora y se escaneó con fosforimager (Typhoon).

Secuenciación de bisulfito para valorar estado de metilación de ADN.

Se transinfectaron células 293FT HEK con Cas9 como se describió anteriormente. Se aisló ADN genómico con el estuche DNeasy Blood & Tissue (Qiagen) y bisulfito convertido con estuche EZ DNA Methylation-Lightning (Zymo Research). Se llevó a cabo PCR con bisulfito usando ADN polimerasa KAPA2G Robust HotStart (KAPA Biosystems) con cebadores diseñados usando el buscador de cebadores de bisulfito (Zymo Research, Tablas J y K). Los amplicones PCR resultantes se purificaron en gel, se digirieron con EcoRI y HindIII y se ligaron en una cadena principal de pUC19 previamente a transformación. Los clones individuales fueron sometidos a secuenciación de Sanger para valorar el estado de metilacion de ADN.

Prueba de transcripción y escisión in vivo.

Se transinfectaron células 293FT HEK con Cas9 como se describió anteriormente. Se prepararon después lisados celulares completos con un tampón de lisis (HEPES 20 mM, KCl 100 mM, MgCl2 5 mM, DTT 1 mM, glicerol al 5%, Tritón X-100 al 0,1%) enriquecido con cóctel de inhibidores de proteasas (Roche). Se transcribió ARNsg conducido por T7 in vitro usando oligos modificados (Ejemplo 10) y estuche de transcripción in vitro de T7 HiScribe (NEB), siguiendo el protocolo recomendado por el fabricante. Para preparar sitios fijados como objetivo metilados, se metiló plásmido de pUC19 por M.SssI y después se linearizó por NheI. Se realizó la prueba de escisión in vitro como sigue: para una reacción de escisión de 20 ul, se incuban 10 ul de lisado celular con 2 ul de tampón de escisión (HEPES 100 mM, KCl 500 mM, MgCl2 25 mM, DTT 5 mM, glicerol al 25%), el ARN transcrito in vitro y 300 ng de ADN de plásmido de pUC19.

Secuenciación profunda para valorar la especificidad de la fijación como objetivo.

Se transinfectaron células 293FT HEK en placas de 96 pozos con ADN de plásmido Cas9 y casete PCR de ARN de una sola guía (ARNsg) 72 horas previas a extracción de ADN genómico (Fig. 72). La región genómica que flanquea el sitio fijado como objetivo de CRISPR para cada gen se multiplicó (Fig. 74, Fig. 80, (Ejemplo 10) por un método PCR de fusión para unir los adaptadores Illumina P5 así como códigos de barras específicos de una muestra única para los amplicones fijados como objetivo (esquema descrito en la Fig. 73). Se purificaron los productos PCR usando placas de filtro del 96 pozos EconoSpin (Epoch Life Sciences) siguiendo el protocolo recomendado por el fabricante.

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qRT-PCR para expresión de Cas9 y ARNsg

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nombre del cebador secuencia cebadora (5' a 3')

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síntesis de cadena inversa de ARNsg AAGCACCGACTCGGTGCCAC

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F qPCR ARNsg EMX1.1 TCACCTCCAATGACTAGGGG

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R qPCR ARNsg EMX1.1 CAAGTTGATAACGGACTAGCCT

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F qPCR ARNsg EMX1.3 AGTCCGAGCAGAAGAAGAAGTTT

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R qPCR ARNsg EMX1.3 TTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCT

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F qPCR Cas9 AAACAGCAGATTCGCCTGGA

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R qPCR Cas9 TCATCCGCTCGATGAAGCTC

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F qPCR GAPDH TCCAAAATCAAGTGGGGCGA

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R qPCR GAPDH TGATGACCCTTTTGGCTCCC

PCR con bisulfito y secuenciación

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nombre del cebador secuencia de cebador (5' a 3')

F PCR con bisulfito (lugar SERPINB5)

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R PCR con bisulfito (lugar SERPINB5)

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secuenciación pUC19

CAGGAAACAGCTATGAC

Tabla K | Secuencias para cebadores para ensayar la arquitectura de ARNsg. Los cebadores se hibridan a la cadena inversa del activador U6 a menos que se indique de otro modo. El sitio para cebar U6 está en cursiva, la secuencia guía se indica como un tramo de N, la secuencia repetida directa se destaca en negrita y subrayada la secuencia de ARNtracr. La estructura secundaria de cada arquitectura de ARNsg se muestra en la Fig. 43.

nombre del cebador

secuencia cebadora (5' a 3')

Directo U6

GCCTCTAGAGGTACCTGAGGGCCTATTTCCCATGATTCC

I: ARNsg (DR +12, ARNtracr +85)

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II: ARNsg (DR +12, ARNtracr +85) mut2

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III: ARNsg (DR +22, ARNtracr +85)

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nombre del cebador

secuencia cebadora (5' a 3')

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IV: ARNsg (DR +22, ARNtracr +85) mut4

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Tabla L | Sitios fijados como objetivo con las PAM alternas para ensayar la especificidad de PAM de Cas9. Todos los sitios fijados como objetivo para ensayar la especificidad de PAM se encuentran dentro del lugar EMX1 humano.

Secuencia del sitio fijado como objetivo (5' a 3')

PAM

AGGCCCCAGTGGCTGCTCT

NAA

ACATCAACCGGTGGCGCAT

NAT

AAGGTGTGGTTCCAGAACC

NAC

CCATCACATCAACCGGTGG

NAG

AAACGGCAGAAGCTGGAGG

NTA

GGCAGAAGCTGGAGGAGGA

NTT

GGTGTGGTTCCAGAACCGG

NTC

AACCGGAGGACAAAGTACA

NTG

TTCCAGAACCGGAGGACAA

NCA

GTGTGGTTCCAGAACCGGA

NCT

TCCAGAACCGGAGGACAAA

NCC

CAGAAGCTGGAGGAGGAAG

NCG

CATCAACCGGTGGCGCATT

NGA

GCAGAAGCTGGAGGAGGAA

NGT

CCTCCCTCCCTGGCCCAGG

NGC

TCATCTGTGCCCCTCCCTC

NAA

GGGAGGACATCGATGTCAC

NAT

CAAACGGCAGAAGCTGGAG

NAC

GGGTGGGCAACCACAAACC

NAG

GGTGGGCAACCACAAACCC

NTA

GGCTCCCATCACATCAACC

NTT

GAAGGGCCTGAGTCCGAGC

NTC

CAACCGGTGGCGCATTGCC

NTG

AGGAGGAAGGGCCTGAGTC

NCA

AGCTGGAGGAGGAAGGGCC

NCT

GCATTGCCACGAAGCAGGC

NCC

ATTGCCACGAAGCAGGCCA

NCG

AGAACCGGAGGACAAAGTA

NGA

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39) y 1 cría natural para comparación (vía 40) se muestran en la Figura A2. Se inyectó a las crías 1-19 ARNg Chd8.2 y a las crías 20-38 se inyectó ARNg Chd8.3. De las 38 crías vivas, 13 fueron positivas para una mutación. La cría muerta también tuvo una mutación. No hubo mutación detectada en la muestra natural. La secuenciación por PCR genómica fue consistente con los hallazgos de la prueba SURVEYOR.

5 Ejemplo 13: Modulación transcripcional mediada por CRISPR/Cas.

La Figura 67 representa un diseño del CRISPR-FT (Factor de Transcripción) con actividad de activación transcripcional. El ARN quimérico se expresa por el activador de U6, mientras una versión de doble mutante, codón optimizada humana de la proteína Cas9 (hSpCas9m), ligada de manera operable a un dominio funcional de NLS triple y uno de VP64 se expresa por un activador de EF1a. Las dobles mutaciones, D10A y H840A, hacen la proteína

10 cas9 incapaz de introducir escisión, pero mantuvieron su capacidad para unirse a un ADN fijado como objetivo cuando se guía por el ARN quimérico.

La Figura 68 representa activación transcripcional del gen SOX2 humano con sistema CRISPR-FT (ARN quimérico y la proteína de fusión Cas9-NLS-VP64). Se transinfectaron células 293FT con plásmidos que soportaban dos componentes: (1) secuencias de 20 pb de fijación como objetivo de ARN quiméricos diferentes conducidos por U6 15 dentro o alrededor del lugar genómico SOX2 humano y (2) proteína de fusión hSpCas9m (doble mutante)-NLS-VP64 conducida por EF1a. 96 horas postransinfección, se recogieron células 293FT y se midió el nivel de activación por la inducción de expresión de ARNm usando una prueba qRT-PCR. Todos los niveles de expresión se normalizan frente al grupo de control (barra gris), que representa los resultados de células transinfectadas con el plásmido de cadena principal de CRISPR-FT sin ARN quimérico. Las ondas qRT-PCR usadas para detectar el ARNm de SOX2

20 es prueba de expresión de genes humanos de Taqman (Life Technologies). Todos los experimentos representan datos de 3 replicados biológicos, n=3, las barras de error muestran e. e. m.

Ejemplo 14: NLS: NLS de Cas9

Se transinfectaron células 293FT con plásmido que contenía dos componentes: (1) activador de EF1a que conducía la expresión de Cas9 (Sp Cas9 codón optimizada, humana, natural) con diferentes diseños NLS (2) activador de U6

25 que conducía el mismo lugar EMX1 humano que fija como objetivo ARN quimérico.

Se recogieron células en el instante de tiempo de 72 h postransinfección y se extrajeron después con 50 µl de la disolución de extracción de ADN genómico QuickExtract siguiendo el protocolo del fabricante. Se multiplicó por PCR ADN genómico de EMX1 fijado como objetivo y se purificó en gel con gel de agarosa al 1%. Se volvió a hibridar el producto PCR genómico y se sometió a la prueba Surveyor siguiendo el protocolo del fabricante. La eficacia de

30 escisión genómica de diferentes construcciones se midió usando SDS-PAGE en un gel TBE-PAGE al 4-12% (Life Technologies), se analizó y se cuantificó con el programa informático ImageLab (Bio-rad), todo siguiendo el protocolo del fabricante.

La Figura 69 representa un diseño de diferentes construcciones NLS Cas9. Todas las Cas9 eran la versión codón optimizada humana de la Sp Cas9. Se ligaron las secuencias NLS al gen cas9 en el N-terminal o C-terminal. Todas

35 las variantes de Cas9 con diferentes diseños de NLS se clonaron en una cadena principal conteniendo así vector para ser conducido por el activador de EF1a. En el mismo vector hay un lugar EMX1 humano de fijación como objetivo de ARN quimérico conducido por activador de U6, formando juntos un sistema de dos componentes.

Tabla M. Resultados de ensayo de diseño NLS Cas9. Cuantificación de escisión genómica de diferentes construcciones cas9-nls por prueba surveyor.

Porcentaje de escisión de genoma cuando se mide por prueba Surveyor

Replicado biológico 1 (%) Replicado biológico 2 (%) Replicado biológico 3 (%) Promedio (%) Error (E.E.M., error estándar de la media)

Cas9 (No NLS)

2,50 3,30 2,73 2,84 0,24

Cas9 con NLS N-term

7,61 6,29 5,46 6,45 0,63

Cas9 con NLS C-term

5,75 4,86 4,70 5,10 0,33

Cas9 con doble NLS (N-term y C-term)

9,08 9,85 7,78 8,90 0,60

La Figura 70 representa la eficacia de escisión genómica inducida por variantes de Cas9 que soportan diferentes diseños de NLS. El porcentaje indica la porción de ADN genómico de EMX1 humano que fue escindido por cada construcción. Todos los experimentos son de 3 replicados biológicos. n = 3, error indica E. E. M.

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Secuencia de ARN guía conducida por el activador T7 (activador T7, las N representan secuencia de fijación como objetivo):

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Suministro génico:

Se usarán cepas CC-124 y CC-125 de Chlamydomonas reinhardtii del centro de recursos de Chlamydomonas para electroporación. El protocol de electroporación sigue el protocolo recomendado estándar del estuche de ingeniería

10 de Chlamydomonas GeneArt.

También, los solicitantes generan una línea de Chlamydomonas reinhardtii que expresa Cas9 de manera constitutiva. Esto se puede realizar usando pChlamy1 (linearizado usando PvuI) y seleccionando colonias resistentes a higromicina. La secuencia para pChlamy1 que contiene Cas9 está a continuación. De esta manera para conseguir inactivación génica se requiere simplemente suministrar ARN para el ARN guía. Para recombinación

15 homóloga, los solicitantes suministran ARN guía, así como una plantilla de recombinación homóloga linearizada.

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Para todas las células de Chlamydomonas reinhardtii, los solicitantes usaron PCR, prueba de la nucleasa SURVEYOR y secuenciación de ADN para verificar la modificación exitosa.

5 Ejemplo 16: Uso de Cas9 como un represor transcripcional en bacterias.

La capacidad para transcripción de control de manera artificial es esencial tanto para el estudio de la función génica como para la construcción de redes de genes sintéticos con propiedades deseadas. Los solicitantes describen en la presente el uso de la proteína Cas9 guiada por ARN como un represor transcripcional programable.

Los solicitantes han demostrado previamente cómo puede usarse la proteína Cas9 de SF370 de Streptococcus

10 pyogenes para dirigir la edición de genomas en Streptococcus pneumoniae. En este estudio, los solicitantes lograron la cepa crR6Rk que contenía un sistema CRISPR mínimo, que consistía en cas9, el ARNtracr y una repetición. Se introdujeron las mutaciones D10A-H840 en cas9 en esta cepa, proporcionando cepa crR6Rk**. Se clonaron cuatro espaciadores fijando como objetivo diferentes posiciones del activador del gen de β-galactosidasa bgaA en la matriz CRISPR por el plásmido pDB98 descrito previamente. Los solicitantes observaron una reducción de X a Y veces en

15 actividad de la β-galactosidasa dependiendo de la posición fijada como objetivo, que demuestra el potencial de Cas9 como un represor programable (Figura 73).

Para conseguir la represión de Cas9** en Escherichia coli se construyó un plásmido informador de proteína

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Claims (1)

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