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KR20150083857A - 피롤로벤조디아제핀-항체 컨주게이트 - Google Patents

피롤로벤조디아제핀-항체 컨주게이트 Download PDF

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KR20150083857A
KR20150083857A KR1020157012366A KR20157012366A KR20150083857A KR 20150083857 A KR20150083857 A KR 20150083857A KR 1020157012366 A KR1020157012366 A KR 1020157012366A KR 20157012366 A KR20157012366 A KR 20157012366A KR 20150083857 A KR20150083857 A KR 20150083857A
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KR
South Korea
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conjugate
group
alkyl
antibody
seq
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KR1020157012366A
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KR101995619B1 (ko
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파트리시우스 헨드리쿠스 코르넬리스 반 베르켈
필립 윌슨 하워드
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에이디씨 테라퓨틱스 에스에이알엘
메디뮨 리미티드
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Abstract

PBD 이량체를 CD25에 결합시키는 항체의 컨주게이트.

Description

피롤로벤조디아제핀-항체 컨주게이트 {PYRROLOBENZODIAZEPINE-ANTIBODY CONJUGATES}
본 발명은 항체에 대한 링커 형태의 불안정한 C2 또는 N10 보호 기를 갖는 피롤로벤조디아제핀 (PBD)에 관한 것이다.
피롤로벤조디아제핀
일부의 피롤로벤조디아제핀 (PBD)은 DNA의 특이적 서열을 인식하고, 그에 결합하는 능력을 가지며; 바람직한 서열은 PuGPu이다. 최초의 PBD 항종양 항생제인 안트라마이신은 1965 년에 발견되었다 [Lei㎎ruber, et al., J. Am. Chem. Soc., 87, 5793-5795 (1965); Lei㎎ruber, et al., J. Am. Chem. Soc., 87, 5791-5793 (1965)]. 그때 이후로, 다수의 천연적으로 존재하는 PBD가 보고되었으며, 10 개 이상의 합성경로는 다양한 유사체를 개발하였다 [Thurston, et al., Chem. Rev. 1994, 433-465 (1994); Antonow, D. and Thurston, D.E., Chem. Rev. 2011 111 (4), 2815-2864)]. 패밀리 구성원에는 아베이마이신 (abbeymycin) [Hochlowski, et al., J. Antibiotics, 40, 145-148 (1987)], 치카마이신 (chicamycin) [Konishi, et al., J. Antibiotics, 37, 200-206 (1984)], DC-81 [일본 특허 58-180 487; Thurston, et al., Chem. Brit., 26, 767-772 (1990); Bose, et al., 테트라헤드론 (Tetrahedron), 48, 751-758 (1992)], 마제트라마이신 (mazethramycin) [Kuminoto, et al., J. Antibiotics, 33, 665-667 (1980)], 네오트라마이신 (neothramycins) A and B [Takeuchi, et al., J. Antibiotics, 29, 93-96 (1976)], 포로트라마이신 (porothramycin) [Tsunakawa, et al., J. Antibiotics, 41, 1366-1373 (1988)], 프로트라카르신 (prothracarcin) [Shimizu, et al, J. Antibiotics, 29, 2492-2503 (1982); Langley and Thurston, J. Org. Chem., 52, 91-97 (1987)], 시바노마이신 (sibanomicin) (DC-102) [Hara, et al., J. Antibiotics, 41, 702-704 (1988); Itoh, et al., J. Antibiotics, 41, 1281-1284 (1988)], 시비로마이신 (sibiromycin) [Leber, et al., J. Am. Chem. Soc., 110, 2992-2993 (1988)] 및 토마마이신 (tomamycin) [Arima, et al., J. Antibiotics, 25, 437-444 (1972)]이 포함된다. PBD는 하기의 일반 구조를 갖는다:
Figure pct00001
이들은 치환체의 수, 형태 및 위치에서, 이들의 방향족 A 환 및 피롤로 C 환 둘 다에서, 및 C 환의 포화도에 있어서 상이하다. B-환에는 DNA를 알킬화하는데 책임이 있는 친전자성 중심인 N10-C11 위치에 이민 (N=C), 카비놀아민 (NH-CH(OH)), 또는 카비놀아민 메틸 에테르 (NH-CH(OMe))가 존재한다. 공지된 천연 생성물은 모두 C 환으로부터 A 환 쪽으로 볼 때 오른손 쪽으로의 트위스트를 갖는 생성물을 제공하는 것으로 키랄 C11a 위치에서 (S)-배열을 갖는다. 이것은 이들에게, 결합부위에서 적합한 스너그 (snug)를 유도하도록 B-형태 DNA의 작은 그루브 (minor groove)를 갖는 이소헬리시티 (isohelicity)를 위해서 적절한 삼차원 형상을 제공한다 [Kohn, In Antibiotics III. Springer-Verlag, New York, pp. 3-11 (1975); Hurley 및 Needham-Vandevanter, Acc. Chem. Res., 19, 230-237 (1986)]. 작은 그루브 내에 부가물 (adduct)을 형성하는 그들의 능력은 이들이 DNA 처리 (processing)를 저해하고, 따라서 이들의 용도가 항종양제가 될 수 있도록 한다.
특히 유리한 피롤로벤조디아제핀 화합물이 화합물 1로서 문헌 [Gregson et al. (Chem. Commun. 1999, 797-798)]에, 화합물 4a로서 문헌 [Gregson et al. (J. Med. Chem. 2001, 44, 1161-1174)]에 개시되어 있다. 또한 SG2000으로 알려진 이 화합물을 하기에 제시한다:
Figure pct00002
WO 2007/085930는 항체와 같은 세포 결합제와 연결하는 링커 기를 갖는 이량체 PBD 화합물의 제조에 관해 기술하고 있다. 상기 링커는 상기 이량체의 단량체 PBD 단위를 연결하는 가교에 존재한다.
본 발명자들은 WO 2011/130613 및 WO 2011/130616의 항체와 같이, 세포 결합제와 연결하는 링커 기를 갖는 이량체 PBD 화합물에 관해 기술하였다. 이들 화합물의 링커는 C2 위치를 통해 PBD 코어에 부착되고, 일반적으로 링커 기에서 효소의 작용에 의해 절단된다. 본 발명자들은 WO 2011/130598에서 항체와 같은 세포 결합제와 연결하는 링커 기를 갖는 이량체 PBD 화합물에 관해 기술하였다. 이들 화합물의 링커는 N10의 가용 위치 중 하나에 부착되고, 일반적으로, 상기 링커 기에서 효소의 작용에 의해 분리된다.
항체-약물 컨주게이트
암, 면역성 및 혈관성 질환 환자의 표적 치료를 위한 항체 치료법이 개발되었다 (Carter, P. (2006) Nature Reviews Immunology 6:343-357). 세포독성 또는 세포정지 제제, 즉 암 치료에서 종양 세포를 사멸시키거나 또는 억제하는 약물의 국소 전달을 위한 항체-약물 컨주게이트 (ADC), 즉 면역컨주게이트의 용도, 종양으로의 상기 약물 모이어티의 표적 전달 및 세포내 축적, 여기서 이러한 비컨주게이트 약물 제제의 전신 투여는 정상 세포에 허용 불가능한 수준의 독성을 초래할 수 있다 (Xie et al (2006) Expert. Opin. Biol. Ther. 6(3):281-291; Kovtun et al (2006) Cancer Res. 66(6):3214-3121; Law et al (2006) Cancer Res. 66(4):2328-2337; Wu et al (2005) Nature Biotech. 23(9):1137-1145; Lambert J. (2005) Current Opin. in Pharmacol. 5:543-549; Hamann P. (2005) Expert Opin. Ther. Patents 15(9):1087-1103; Payne, G. (2003) Cancer Cell 3:207-212; Trail et al (2003) Cancer Immunol. Immunother. 52:328-337; Syrigos and Epenetos (1999) 항cancer Research 19:605-614).
따라서 최소 독성, 최대 효능의 치료법이 연구되고 있다. 약물의 활성 메커니즘, 약물-결합, 약물/항체 비율 (부하) 및 약물-방출성뿐만 아니라 모노클로날 항체 (mAb)의 선택에 ADC의 설계 및 정제에 대한 노력이 집중되고 있다 (Junutula, et al., 2008b Nature Biotech., 26(8):925-932; Dornan et al (2009) Blood 114(13):2721-2729; US 7521541; US 7723485; WO2009/052249; McDonagh (2006) Protein Eng. Design & Sel. 19(7): 299-307; Doronina et al (2006) Bioconj. Chem. 17:114-124; Erickson et al (2006) Cancer Res. 66(8):1-8; Sanderson et al (2005) Clin. Cancer Res. 11:843-852; Jeffrey et al (2005) J. Med. Chem. 48:1344-1358; Hamblett et al (2004) Clin. Cancer Res. 10:7063-7070). 약물 모이어티는 튜불린 결합, DNA 결합, 프로테아좀 및/또는 토포이소머라아제 억제를 포함하는 메커니즘에 의한 세포독성 및 세포정지 효과에 영향을 줄 수 있다. 일부 세포독성 약물은 거대 항체 또는 단백질 수용체 리간드에 컨주게이트되는 경우, 불활성화되거나 또는 거의 활성을 나타내지 않는 경향이 있다.
본 발명자들은 특정 PBD 이량체 항체 컨주게이트를 개발하였다.
본 발명의 제1 측면은 화학식 L - (DL)p의 컨주게이트를 포함하고, 여기서 DL은 하기 화학식 I 또는 II이다:
Figure pct00003
여기서,
L은 하기에서 정의되는 바와 같은 항체 (Ab)이고,
C2' 및 C3' 사이에 이중 결합이 존재하는 경우, R12는 하기 군에서 선택되고:
(ia) 할로, 니트로, 시아노, 에테르, 카르복시, 에스테르, C1 -7 알킬, C3 -7 헤테로시클릴 및 비스-옥시-C1 -3 알킬렌을 포함하는 군에서 선택되는 하나 또는 이상의 치환기에 의해 임의 치환된, C5 -10 아릴기;
(ib) C1 -5 포화 지방족 알킬;
(ic) C3 -6 포화 시클로알킬;
(id)
Figure pct00004
(여기서 각각의 R21, R22 및 R23 는 독립적으로 H, C1 -3 포화 알킬, C2 -3 알케닐, C2 -3 알키닐 및 시클로프로필에서 선택되며, 여기서 R12 기에서 탄소 원자의 총 수는 5 이하임);
(ie)
Figure pct00005
(여기서 R25a 및 R25b 중 하나는 H이고 나머지 하나는: 할로, 메틸, 메톡시에서 선택되는 기에 의해 임의 치환된 페닐; 피리딜; 및 티오페닐에서 선택됨); 및
(if)
Figure pct00006
(여기서 R24가 H; C1 -3 포화 알킬; C2 -3 알케닐; C2 -3 알키닐; 시클로프로필; 할로, 메틸, 메톡시에서 선택되는 기에 의해 임의 치환된 페닐; 피리딜; 및 티오페닐에서 선택됨);
C2' 및 C3' 사이에 단일 결합이 존재하는 경우, R12는
Figure pct00007
이고, 여기서 R26a 및 R26b 는 H, F, C1 -4 포화 알킬, C2 -3 알케닐에서 독립적으로 선택되거나(여기서 알킬 및 알케닐기는 C1 -4 알킬 아미도 및 C1 -4 알킬 에스테르에서 선택되는 기에 의해 임의 치환됨), 또는 R26a 및 R26b 중 하나가 H인 경우, 나머지 하나는 니트릴 및 C1-4 알킬 에스테르에서 선택되고;
R6 및 R9는 독립적으로 H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR', 니트로, Me3Sn 및 할로에서 선택되고;
여기서, R 및 R'는 독립적으로 임의로 치환된 C1 -12 알킬, C3 -20 헤테로시클릴 및 C5 -20 아릴기에서 선택되며;
R7은 H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NHRR', 니트로, Me3Sn 및 할로에서 선택되고;
R"는 사슬에 하나 이상의 헤테로 원자, 예를 들어 O, S, NRN2(여기서 RN2는 H 또는 C1 -4 알킬임) 및/또는 방향족 고리, 예를 들어 벤젠 또는 피리딘이 개재할 수 있는 C3 -12 알킬렌기이며;
Y 및 Y'는 O, S 또는 NH에서 선택되며;
R6', R7', R9'는 각각 R6, R7 및 R9와 동일한 기에서 선택되고,
[화학식 I]
RL1'은 항체 (Ab)와의 연결을 위한 링커이고;
R11a는 OH, ORA (여기서, RA는 C1 -4 알킬임) 및 SOzM (여기서, z는 2 또는 3이고, M은 1가의 약학적으로 허용가능한 양이온임)에서 선택되고;
R20 및 R21은 함께 결합되는 질소 원자와 탄소 원자 사이에 이중 결합을 형성하거나;
R20은 H 및 RC (여기서, RC는 캡핑기임)에서 선택되고;
R21은 OH, ORA 및 SOzM에서 선택되고;
C2 및 C3 사이에 이중 결합이 존재하는 경우, R2는 하기로 이루어진 군에서 선택되고:
(ia) 할로, 니트로, 시아노, 에테르, 카르복시, 에스테르, C1 -7 알킬, C3 -7 헤테로시클릴 및 비스-옥시-C1 -3 알킬렌을 포함하는 군에서 선택되는 하나 이상의 치환기에 의해 임의 치환된 C5 -10 아릴 기;
(ib) C1 -5 포화 지방족 알킬;
(ic) C3 -6 포화 시클로알킬;
(id)
Figure pct00008
(여기서, R11, R12 및 R13 각각은 독립적으로 H, C1 -3 포화 알킬, C2 -3 알케닐, C2 -3 알키닐 및 시클로프로필에서 선택되고, 여기서 R2 기의 탄소 원자의 총 수는 5 이하임);
(ie)
Figure pct00009
(여기서, R15a 및 R15b 중 하나는 H이고, 나머지 하나는 할로, 메틸, 메톡시에서 선택되는 기에 의해 임의 치환된 페닐; 피리딜; 및 티오페닐에서 선택됨);
(if)
Figure pct00010
(여기서, R14는 H; C1 -3 포화 알킬; C2 -3 알케닐; C2 -3 알키닐; 시클로프로필; 할로, 메틸, 메톡시에서 선택되는 기에 의해 임의 치환된 페닐; 피리딜; 및 티오페닐에서 선택됨);
C2 및 C3 사이에 단일 결합이 존재하는 경우,
R2는
Figure pct00011
이고, 여기서, R16a 및 R16b는 독립적으로 H, F, C1 -4 포화 알킬, C2 -3 알케닐 (여기서, 알킬 및 알케닐 기가 C1 -4 알킬 아미도 및 C1 -4 알킬 에스테르에서 선택되는 기에 의해 임의 치환됨)에서 선택되거나; R16a 및 R16b 중 하나가 H인 경우, 나머지 하나는 니트릴 및 C1 -4 알킬 에스테르에서 선택되고;
[화학식 II ]
R22는 화학식 IIIa, 화학식 IIIb 또는 화학식 IIIc이고:
(a)
Figure pct00012
(여기서, A는 C5 -7 아릴 기이고,
(i) Q1은 단일 결합이고, Q2는 단일 결합 및 -Z-(CH2)n- (여기서, z는 단일 결합, O, S 및 NH에서 선택되고, n은 1 내지 3임)에서 선택되거나;
(ii) Q1은 -CH=CH-이고, Q2는 단일 결합임);
(b)
Figure pct00013
(여기서, RC1, RC2 및 RC3 은 독립적으로 H 및 치환되지 않은 C1 -2 알킬에서 선택됨);
(c)
Figure pct00014
(여기서, Q는 O-RL2', S-RL2', 및 NRN-RL2'에서 선택되고, RN은 H, 메틸 및 에틸에서 선택됨)
X는 O-RL2', S-RL2', CO2-RL2', CO-RL2', NH-C(=O)-RL2', NHNH-RL2', CONHNH-RL2',
Figure pct00015
, NRNRL2' (여기서, RN은 H 및 C1 -4 알킬을 포함하는 군에서 선택됨) 포함하는 군에서 선택되고;
RL2'은 항체 (Ab)와의 연결을 위한 링커이고;
R10 및 R11은 함께 결합된 질소 원자 및 탄소 원자 사이에서 이중 결합을 형성하거나;
R10은 H이고, R11은 OH, ORA 및 SOzM에서 선택되고;
R30 및 R31은 함께 결합된 질소 원자 및 탄소 원자 사이에서 이중 결합을 형성하거나;
R30은 H이고, R31은 OH, ORA 및 SOzM에서 선택된다.
일부 실시형태에서, 상기 컨주게이트는 하기 화합물이 아니다:
ConjA
Figure pct00016
;
ConjB
Figure pct00017
;
ConjC
Figure pct00018
;
ConjD
Figure pct00019
; 또는
ConjE:
Figure pct00020
.
다른 실시형태에서, 상기 컨주게이트가 화학식 ConjA, ConjB, ConjC, ConjD 및 ConjE의 컨주게이트에서 선택되는 것이 바람직할 수 있다.
화학식 I의 아래 첨자 p는 1 내지 20의 정수이다.
따라서, 상기 컨주게이트는 링커 단위에 의해 적어도 하나의 약물 단위에 공유적으로 연결된 하기에서 정의된 바와 같은 항체 (Ab)를 포함한다. 하기에서 더욱 상세하기 개시되는 리간드 단위는 표적 모이어티에 결합하는 표적제이다. 따라서, 본 발명은 또한, 예를 들어 다양한 암 및 자가면역 질환의 치료를 위한 방법을 제공한다. 약물 부하는 항체 당 약물 분자의 수인 p로 제시된다. 약물 부하는 항체 당 1 내지 20 약물 단위 (DL)일 수 있다. 조성물에서, p는 조성물의 컨주게이트의 평균 약물 부하를 나타내고, 1 내지 20의 범위이다.
본 발명의 제2 측면은 화학식 I L 또는 II L 의 화합물을 하기에서 정의되는 바와 같은 항체 (Ab)에 컨주게이팅하는 단계를 포함하는, 본 발명의 제1 측면에 따른 컨주게이트의 제조 방법을 제공한다:
Figure pct00021
I L
Figure pct00022
II L
여기서,
RL1은 항체 (Ab)와의 컨주게이션에 적합한 링커이고;
R22L은 화학식 IIIaL, 화학식 IIIbL 또는 화학식 IIIcL이고:
(a)
Figure pct00023
;
(b)
Figure pct00024
;
(c)
Figure pct00025
QL은 O-RL2, S-RL2 및 NRN-RL2에서 선택되고, RN은 H, 메틸 및 에틸에서 선택되고,
XL은 O-RL2, S-RL2, CO2-RL2, CO-RL2, N=C=O-RL2, NHNH-RL2, CONHNH-RL2,
Figure pct00026
, NRNRL (여기서, RN은 H 및 C1 -4 알킬을 포함하는 군에서 선택됨)을 포함하는 군에서 선택되고;
RL2는 항체 (Ab)와의 컨주게이션에 적합한 링커이고; 나머지 모든 기는 제1 측면에서 정의된 바와 같다.
따라서, 제2 측면에서, 본 발명이 각각 하기에서 선택되는 화합물을 하기에서 정의되는 바와 같은 항체와 컨주게이팅하는 단계를 포함하는, ConjA, ConjB, ConjC, ConjD 및 ConjE로 이루어진 기에서 선택되는 컨주게이트의 제조 방법이 제공되는 것이 바람직할 수 있다:
A:
Figure pct00027
B:
Figure pct00028
C:
Figure pct00029
D:
Figure pct00030
및 E:
Figure pct00031

WO 2011/130615는 A의 모 화합물인 화합물 26을 기술한다:
Figure pct00032
화합물 A는 세포 결합제와의 부착을 위한 링커를 갖는 PBD를 포함한다. 세포 결합제는 컨주게이트의 합성에 유용한 용해도를 제공하는 에틸렌 글리콜 모이어티의 갯수를 제공한다.
WO 2010/043380 및 WO 2011/130613은 화합물 30을 기술한다:
Figure pct00033

WO 2011/130613은 또한 화합물 51을 기술한다:
Figure pct00034
화합물 B는 단지 (CH2)5 테테르 대신에, PBD 모이어티 사이에 (CH2)3 테테르를 가지고, 이로 인해 방출되는 PBD 이량체의 친유성이 저하된다는 점에서 화합물 30과 다르다. 링커 기는 메타 위치가 아닌 파라 위치에서 C2-페닐 기에 부착된다.
WO 2011/130613은 화합물 93을 기술한다:
Figure pct00035
화합물 C는 2 가지 관점에서 상기 화합물과 다르다. 세포 결합제는 컨주게이트의 합성에 유용한 용해도를 제공하는 증가된 수의 에틸렌 글리콜 모이어티를 제공하고, 페닐 치환기는 또한 용해도를 보조하는 것으로서, 1 개가 아닌 2 개의 산소 원자를 제공한다. 화합물 C의 구조는 또한, 작은 그루브에서 더욱 강하게 결합한다는 것을 의미할 수 있다.
화합물 A, B 및 C는 각각의 C-고리에서 2 개의 sp2 중심을 가지고, 이로 인해 각각의 C-고리에서 단지 1 개의 sp2 중심을 갖는 화합물 보다, DNA의 작은 그루브에서 더욱 강한 결합을 할 수 있다.
WO 2011/130598은 화합물 80을 기술한다:
Figure pct00036
.
화합물 D는 세포 결합제와의 결합을 위해 요오도아세트아미드 기를 포함한다는 점에서 상기 화합물과 다르다. 이러한 기에 의해, 세포 결합제와 결합시, 용해도에서 화합물 80 보다 유리할 수 있다 (하기 참조). 화합물 80의 말레미드 기는 세포 결합제로부터 비컨주게이팅되게하는 역 마이클 반응에 적용될 수 있고, 따라서 알부민 및 글루타티온과 같은 생물학적 분자를 포함하는 기타 티올에 의해 자발적으로 포집될 수 있다. 이러한 비컨주게이션은 화합물 A의 경우에는 일어날 수 있다. 또한, 요오도아세트아미드 기는 기타 비의도 부반응을 회피할 수 있다.
화합물 E는 더욱 작은, 친유성이 작은 C2 치환기, 예를 들어 4F-페닐, 프로필렌을 가진다는 점에서, C2-3 내-이중 결합을 갖는 약물 링커를 가지는 종래에 개시된 PBD 이량체와 다르다. 이와 같이, 화합물 B의 컨주게이트 (하기 참조)는 합성시, 거의 응집되지 않는다. 컨주게이트의 이러한 응집은 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)에 의해 측정할 수 있다.
두 화합물 D 및 E는 모두 각각의 C-고리에서 단지 1 개의 sp2 중심을 갖는 화합물이 아닌, DNA의 작은 그루브에서 더욱 강하게 결합할 수 있도록 하는 것으로서, 2 개의 sp2 중심을 갖는다.
WO 2010/043880, WO 2011/130613, WO 2011/130598 및 WO 2011/130616에 개시된 약물 링커가 본 발명에 사용될 수 있고, 본 명세서에서 참조로서 포함된다. 본 명세서에서 개시되는 약물 링커는 이들 개시 내용에서 기술되는 바와 같이 합성될 수 있다.
본 발명은 대상체의 목적 위치로 PBD 화합물을 제공하는데 사용하기에 적합하다. 상기 컨주게이트는 링커 부분이 전혀 포함되지 않은 활성 PBD 화합물을 방출시킨다. PBD 화합물의 반응성에 영향을 줄 수 있는 것은 전혀 존재하지 않는다. 따라서, ConjA는 화합물 RelA를 방출하고:
Figure pct00037
ConjB는 화합물 RelB를 방출하고:
Figure pct00038
ConjC는 화합물 RelC를 방출하고:
Figure pct00039
ConjD는 화합물 RelD를 방출하고:
Figure pct00040
ConjE는 화합물 RelE를 방출한다:
Figure pct00041

본 발명에서, PBD 이량체와 항체 사이의 특정 링크는 바람직하게는 세포외에서 안정하다. 세포로의 수송 또는 전달 전에, 항체-약물 컨주게이트 (ADC)는 바람직하게는 안정하고, 손상되지 않는다. 즉 항체가 약물 모이어티에 결합된 채로 유지된다. 링커는 표적 세포 외부에서 안정하고, 세포 내부에서 일정한 효율로 분리될 수 있다. 효과적인 링커는: (i) 항체의 특이적 결합성을 유지시키고; (ii) 컨주게이트 또는 약물 모이어티의 세포내 전달을 가능하게 하며; (iii) 컨주게이트가 목표 위치로 전달되거나 수송될 때까지, 안정하고 손상되지 않은 채로 유지되고, 즉, 분리되지 않고; (iv) PBD 약물 모이어티의 세포독성, 세포-사멸 효과 또는 세포분열억제 효과를 유지시킨다. ADC의 안정성은 질량 분광분석, HPLC 및 분리/분석 기술 LC/MS와 같은 표준 분석 방법에 의해 측정할 수 있다.
화학식 RelA, RelB, RelC, RelD 또는 RelE의 화합물의 전달은 링커 기, 특히 발린-알라닌 디펩티드 모이어티에서, 카텝신과 같은 효소의 작용에 의해 화학식 ConjA, ConjB, ConjC, ConjD 또는 ConjE의 컨주게이트의 목표 작용 위치에서 성취된다.
항체
일 측면에서, 항체는 CD19에 결합하는 항체이며, 서열번호 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 중 임의의 하나에 따른 서열을 갖는 VH 도메인을 포함한다.
항체는 VL 도메인을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항체는 서열번호 7, 8, 9, 10, 11 또는 12 중 임의의 하나에 따른 서열을 갖는 VL 도메인을 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 항체는 VL 도메인과 쌍을 이루는 VH 도메인을 포함하고, VH 도메인 및 VL 도메인은 하기로 이루어진 군에서 선택되는 서열을 갖는다:
서열번호 1은 서열번호 7, 8, 9, 10, 11 또는 12 중 임의의 하나와 쌍을 이루고;
서열번호 2는 서열번호 7, 8, 9, 10, 11 또는 12 중 임의의 하나와 쌍을 이루고;
서열번호 3은 서열번호 7, 8, 9, 10, 11 또는 12 중 임의의 하나와 쌍을 이루고;
서열번호 4는 서열번호 7, 8, 9, 10, 11 또는 12 중 임의의 하나와 쌍을 이루고;
서열번호 5는 서열번호 7, 8, 9, 10, 11 또는 12 중 임의의 하나와 쌍을 이루고;
서열번호 6은 서열번호 7, 8, 9, 10, 11 또는 12 중 임의의 하나와 쌍을 이룬다. 예를 들어, 서열번호 1은 서열번호 7과 쌍을 이루거나, 서열번호 2는 서열번호 8과 쌍을 이루거나, 서열번호 3은 서열번호 9와 쌍을 이루거나, 서열번호 4는 서열번호 10과 쌍을 이루거나, 서열번호 5는 서열번호 11과 쌍을 이루거나 또는 서열번호 6은 서열번호 12와 쌍을 이룬다.
VH 및 VL 도메인 (들)은 CD19에 결합하는 항체 항원 결합 자리를 형성하기 위해 쌍을 이룰 수 있다.
일부 실시형태에서, 항체는 VL 도메인과 쌍을 이루는 VH 도메인을 포함하는 본래의 항체 (intact antibody)이고, VH 및 VL 도메인은 하기로 이루어진 군에서 선택되는 서열을 갖는다:
서열번호 1은 서열번호 7, 8, 9, 10, 11 또는 12 중 임의의 하나와 쌍을 이루고;
서열번호 2는 서열번호 7, 8, 9, 10, 11 또는 12 중 임의의 하나와 쌍을 이루고;
서열번호 3은 서열번호 7, 8, 9, 10, 11 또는 12 중 임의의 하나와 쌍을 이루고;
서열번호 4는 서열번호 7, 8, 9, 10, 11 또는 12 중 임의의 하나와 쌍을 이루고;
서열번호 5는 서열번호 7, 8, 9, 10, 11 또는 12 중 임의의 하나와 쌍을 이루고;
서열번호 6은 서열번호 7, 8, 9, 10, 11 또는 12 중 임의의 하나와 쌍을 이룬다. 예를 들어, 서열번호 1은 서열번호 7과 쌍을 이루거나, 서열번호 2는 서열번호 8과 쌍을 이루거나, 서열번호 3은 서열번호 9와 쌍을 이루거나, 서열번호 4는 서열번호 10과 쌍을 이루거나, 서열번호 5는 서열번호 11과 쌍을 이루거나 또는 서열번호 6은 서열번호 12와 쌍을 이룬다.
일부 실시형태에서, 상기 항체는 CD19와 결합하기 위해, 하이브리도마 ATCC 기탁 번호 HB-305에 의해 분비되는 항체와 경쟁한다. 일 실시형태에서, 상기 항체는 CD19와 결합하고, 상기 하이브리도마에 의해 분비되는 항체 보다 2, 5 또는 10 배 이상 작지 않은 결합 상수 (Ka)를 갖는다.
일 측면에서, 상기 항체는 하기에서 개시되는 바와 같이 변형되는 (또는 추가로 변형되는), 본 명세서에서 개시된 바와 같은 항체이다. 일부 실시형태에서, 상기 항체는 본 명세서에서 개시되는 항체의 인간화, 탈면역화 또는 재표면화 버전이다.
용어
본 발명에서 용어 "항체"는 가장 광범한 개념으로 사용되며, 구체적으로는 이들이 CD19 결합성 같은 바람직한 생물학적 활성을 나타내는 한은 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 이량체, 다중특이성 (multispecific) 항체 (예를 들어, 이중특이성 항체), 온전한 항체 (intact antibodies) 및 항체 단편을 포함한다 [Miller et al (2003) Jour. of Immunology 170:4854-4861]. 항체는 쥐, 인간, 인간화, 키메릭 항체이거나, 또는 다른 종으로부터 유도된 것일 수 있다. 항체는 특이적 항원을 인식하고, 그에 대해 결합할 수 있는 면역 시스템에 의해서 생성된 단백질이다 [Janeway, C., Travers, P., Walport, M., Shlomchik (2001) Immuno Biology, 5th Ed., Garland Publishing, New York]. 표적 항원은 일반적으로 다수의 항체 상의 CDRs에 의해서 인식되는 것으로, 에피토프 (epitope)로도 불리는 다수의 결합 부위를 갖는다. 상이한 에피토프에 특이적으로 결합하는 각각의 항체는 상이한 구조를 갖는다. 따라서, 하나의 항원은 하나 이상의 상응하는 항체를 가질 수 있다. 항체는 전체-길이 면역글로불린 분자 또는 전체-길이 면역글로불린 분자의 면역학적으로 활성인 부분, 즉 관련 표적의 항원 또는 그의 일부분 (이러한 표적은 자가면역 질병과 연관된 자가면역 항체를 생산하는 암세포 또는 세포들을 포함하나 이들로 제한되지 않는다)을 면역특이적으로 결합시키는 항원 결합 부위를 함유하는 분자를 포함한다. 면역글로불린은 임의의 타입 (예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, 및 IgA), 클래스 (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 서브클래스 또는 알로타입 (예를 들어, 인간 G1m1, G1m2, G1m3, 비-G1m1 [즉, G1m1 외의 임의의 알로타입], G1m17, G2m23, G3m21, G3m28, G3m11, G3m5, G3m13, G3m14, G3m10, G3m15, G3m16, G3m6, G3m24, G3m26, G3m27, A2m1, A2m2, Km1, Km2 and Km3) 중 어느하나의 면역글로불린 분자일 될 수 있다. 면역글로불린은 인간, 쥐 또는 토끼 기원을 포함하는 어떤 종으로부터라도 유도될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "CD19와의 결합"은, 항체가 소 혈청 알부민과 같은 비특이적 대응물 보다 높은 친화도로 CD19와 결합한다는 의미로 사용된다 (BSA, 유전자 은행 등록번호 CAA76847, 버전 번호 CAA76847.1 GI:3336842, 기록된 갱신 일자: Jan 7, 2011 02:30 PM). 일부 실시형태에서, 상기 항체는, 생리 조건에서 측정시, BSA의 항체 결합 상수 보다 적어도 2, 3, 4, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1000, 2000, 5000, 104, 105 또는 106-배 더 큰 결합 상수 (Ka)로 CD19와 결합한다. 본 발명의 항체는 높은 친화도로 CD19와 결합할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 상기 항체는 1 x 10-6, 10-7, 10-8, 10-9,10-10, 10-11, 10-12, 10-13 또는 10-14와 같이, 약 10-6 M 이하의 KD로 CD19와 결합할 수 있다.
일부 실시형태에서, CD19 폴리펩티드는 유전자은행 기탁번호 NP_001171569, 버전 번호 NP_001171569.1 GI:296010921, 갱신 일자: Sep 10, 2012 12:43 AM에 해당한다. 일 실시형태에서, CD19 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산은 유전자 은행 기탁번호 NM_001178098, 버전 번호 NM_001178098.1 GI:296010920, 갱신 일자: Sep 10, 2012 12:43 AM에 해당한다.
"항체 단편"은 일반적으로 그의 항원 결합 또는 가변 영역인 전체 길이 항체의 일부분을 포함한다. 항체 단편의 예로는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 scFv 단편; 디아바디 (diabodies); 선형 항체; Fab 발현 라이브러리에 의해서 생산된 단편, 항-이디오타입 (안티-Id) 항체, CDR (상보성 결정 영역), 및 암세포 항원, 바이러스 항원 EH느느 미생물 항원에 면역특이적으로 결합하는 상기한 것 중의 어느하나의 에피토프-결합 단편, 단일-쇄 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이성 항체가 포함된다.
본 발명에서 사용된 것으로서 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 균질한 항체의 집단으로부터 수득된 항체, 즉 소량으로 존재할 수 있는 천연적으로 존재하는 가능한 돌연변이를 제외하고는 동일한 집단을 포함하는 개별적인 항체를 나타낸다. 모노클로날 항체는 단일 항원 부위에 대해 유도되는 것으로서 매우 특이적이다. 더구나, 상이한 결정인자 (에피토프)에 대해 유도되는 상이한 항체를 포함하는 폴리클로날 항체 제제와는 대조적으로, 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정인자에 대해 유도된다. 그들의 특이성 이외에도, 모노클로날 항체는 이들이 다른 항체에 의해서 오염되지 않고 합성될 수 있다는 점에서 유리하다. 수식어구 "모노클로날"은 항체의 실질적으로 균일한 집단으로부터 수득된 것으로서의 항체의 특징을 나타내며, 어떤 특별한 방법에 의한 항체의 생산을 필요로 하는 것으로 해석되지는 않는다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용될 모노클로날 항체는 쾰러 (Kohler) 등에 의해서 최초로 기술된 하이브리도마 방법 [Kohler et al (1975) Nature 256:495]에 의해서 제조될 수 있거나, 재조합 DNA 방법 (참조: US 4816567)에 의해서 제조될 수 있다. 모노클로날 항체는 또한, 문헌 [Clackson et al (1991) Nature, 352:624-628; Marks et al (1991) J. Mol. Biol., 222:581-597]에 개시된 기술을 사용하여 파지 항체 라이브러리 또는 전체 인간 면역글로불린 시스템 (Lonberg (2008) Curr. Opinion 20(4):450-459)을 보유하는 형질전환 마우스로부터 분리될 수도 있다.
본 발명에서 모노클로날 항체는 구체적으로, 중쇄 및/또는 경쇄의 일부분이 특별한 종으로부터 유도되거나 특별한 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 그와 상동성인 한편 쇄(들)의 나머지는 또 다른 종으로부터 유도되거나 또 다른 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 그와 상동성인 "키메릭" 항체뿐만 아니라, 이들이 바람직한 생물학적 활성을 나타내는 한 이러한 항체의 단편을 포함한다 [US 4816567; and Morrison et al (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855]. 키메릭 항체는 비-인간 영장류(예를들어 협비원류 또는 유인원)로부터 유도된 가변 도메인 항원-결합 서열 및 인간 불변 영역 서열을 포함하는 "영장류화된" 항체를 포함한다.
본 발명에서 "온전한 항체"는 VL 및 VH 도메인뿐만 아니라 경쇄 불변 도메인 (CL) 및 중쇄 불변 도메인 CH1, CH2 및 CH3을 포함하는 것이다. 불변 도메인은 천연 서열 불변 도메인 (예를 들어, 인간 천연 서열 불변 도메인) 또는 그의 아미노산 서열 변이체일 수 있다. 온전한 항체는 항체의 Fc 영역 (천연 서열 Fc 영역 또는 아미노산 서열 변이체 Fc 영역)에 기인하는 이들 생물학적 활성을 나타내는 하나 또는 그 이상의 "효과기 기능"을 가질 수 있다. 항체 효과기 기능의 예로는 C1q 결합; 보체 의존성 세포독성; Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC); 식작용; 및 B 세포 수용체 및 BCR과 같은 세포 표면 수용체의 하향 조절이 포함된다.
그들의 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라서, 온전한 항체는 상이한 "클래스"로 지정될 수 있다. 온전한 항체에는 5 가지의 주된 클래스 IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM가 있으며, 이들 중의 몇 가지는 "서브클래스" (이소타입), 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, 및 IgA2로 더 분류될 수 있다. 항체의 상이한 클래스에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ로 불린다. 면역글로불린의 상이한 클래스의 서브유니트 구조 및 삼차원 배열은 잘 알려져 있다.
항체의 변형
본 명세서에서 개시되는 항체는 변형될 수 있다. 예를 들어, 인간 대상체에서 면역성이 저하되도록 변형된다. 이는 당업자에 친숙한 다양한 기술 중 임의의 것을 사용하여 달성될 수 있다. 이러한 기술 일부가 하기에서 더욱 상세하게 기술된다.
인간화
비인간 항체 또는 항체 단편의 생체 내 면역원성을 저하시키는 기술은 용어 "인간화"에 속하는 것을 포함한다.
"인간화된 항체"는 인간 항체의 변형된 가변 영역의 적어도 일부를 포함하는 폴리펩티드를 의미하고, 여기서 가변 영역의 일부, 바람직하게는 전체 인간 가변 도메인 보다 실질적으로 작은 부분은 비인간 종으로부터 해당 서열에 의해 치환되고, 변형된 가변 영역은 다른 단백질의 적어도 또 따른 부분에, 바람직하게는 인간 항체의 불변 영역에 연결된다. 표현 "인간화된 항체"는 하나 이상의 상보적 결정 영역 ("CDR") 아미노산 잔기 및/또는 하나 이상의 프레임워크 영역 ("FW" 또는 "FR") 아미노산 잔기가 설치류 또는 다른 비인간 항체의 유사한 위치에서 아미노산 잔기에 의해 치환된 인간 항체를 포함한다. 표현 "인간화된 항체"는 또한 면역글로불린 아미노산 서열 변이체, 또는 실질적으로, 비인간 면역글로불린의 아미노산 서열을 갖는 CDR 및 실질적으로, 인간 면역글로불린의 아미노산 서열을 갖는 FR을 포함하는 면역글로불린 아미노산 서열 변이체의 단편을 포함한다.
비인간 (예를 들어, 쥐과) 항체의 "인간화된" 형태는 비인간 면역글로불린으로부터 유래하는 최소 서열을 포함하는 키메라 항체이다. 또는, 다른 관점에서 봤을때, 인간화된 항체는 인간 서열 자리에 비인간 (예를 들어, 쥐과) 항체로부터의 선택된 서열을 또한 포함하는 인간 항체이다. 인간화된 항체는 그 결합 활성 및/또는 생물학적 활성이 현저하게 변하지 않은 동일하거나 다른 종으로부터의 보존적 아미노산 치환 또는 비천연 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 항체는 비인간 면역글로불린으로부터 유래하는 최소 서열을 포함하는 키메라 항체이다.
인간화 기술에는 'CDR 이식방법', '유도 선택', '탈면역화', '리서피싱 (resurfacing)' (또한 '베니어링 (veneering)'으로 알려짐), '복합 항체', '인간 스트링 콘텐츠 최적화 (인간 String Content Optimisation)' 및 프레임워크 셔플링 (프레임워크 shuffling)이 포함된다.
CDR 이식방법
이 기술에서, 인간화된 항체는, 인간 면역글로불린(수용 항체)로써 수용항체의 상보적 결정 영역 (CDR)으로부터의 잔기가 목적 특성을 가진 마우스, 랫트, 낙타, 소, 염소 또는 토끼와 같은 비인간 종 (기증 항체)의 CDR로부터의 잔기에 의해 교체된다 (결과적으로, 비인간 CDR이 인간 프레임워크로 이식됨). 일부 예에서, 인간 면역글로불린의 프레임워크 영역 (FR) 잔기는 대응하는 비인간 잔기에 의해 대체된다 (예를 들어 특정 FR 잔기가 항원 결합에 현저한 영향을 갖는 경우, 일어날 수 있음).
또한, 인간화된 항체는 도입된 CDR 또는 프레임워크 서열 또는 수용 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 추가로 정제하고 항체 성능을 극대화하기 위한 변형이 이루어진다. 따라서, 일반적으로 인간화된 항체는, 전부 또는 과가변 루프의 전부가 비인간 면역글로불린에 해당하고, FR 영역의 전부 또는 실질적으로 전부가 인간 면역글로불린 서열인, 적어도 하나의 및 일측면에서 두 개의 가변 도메인 전부를 포함할 것이다. 인간화된 항체는 또한 임의적으로, 인간 면역글로불린 또는 면역글로불린 불변 영역 (Fc)의 적어도 일부를 포함할 것이다.
유도 선택
이 방법은, 인간 VH 또는 VL 라이브러리와 특정 에피토프에 특이적인 주어진 비인간 항체의 VH 또는 VL 도메인을 조합시키는 단계로 구성되고, 특이적 인간 V 도메인을 목적 항원에 대해 선택한다. 그후 이렇게 선택된 인간 VH를 VL 라이브러리와 조합시켜서, 완전한 인간 VHxVL 조합을 생성시킨다. 이 방법은 문헌 [Nature Biotechnology (N.Y.) 12, (1994) 899-903]에 개시되어 있다.
복합 항체
이 방법에서, 인간 항체로부터의 아미노산 서열의 2 이상의 절편을 최종 항체 분자 내에서 조합시킨다. 이것은 최종 복합 항체 V 영역에서 인간 T 세포 에피토프를 제한하거나 회피하는 조합에서, 다중 인간 VH 및 VL 서열 절편을 조합시킴으로써 작제된다. 필요한 경우, T 세포 에피토프를 회피하는 대안적 절편으로 T 세포 에피토프를 인코딩하거나 그 원인이 되는 V 영역 절편을 교환함으로써, T 세포 에피토프를 제한하거나 회피한다. 이 방법은 US 2008/0206239 A1에 개시되어 있다.
탈면역화
이 방법은 치료 항체 (또는 다른 분자)의 V 영역으로부터 인간 (또는 다른 제2 종류) T-세포 에피토프의 제거 단계를 포함한다. 치료 항체 V-영역 서열은, 예를 들어 MHC-결합 모티프의 데이타 베이스와 비교하여, MHC 클래스 II-결합 모티프의 존재에 대해 분석한다 (이러한 "모티프" 데이타베이스는 www.wehi.edu.au에서 관리함). 대안으로, MHC 클래스 II- 결합 모티프는 문헌 [Altuvia et al. (J. Mol. Biol. 249 244-250 (1995))]에서 Altuvia 등에 의해 고안된 것과 같은 컴퓨터 스레딩 (threading) 방법을 사용하여 확인할 수 있다; 이들 방법에서, V-영역 서열로부터의 연속 중첩 펩티드는 MHC 클래스 II 단백질에 대한 결합 에너지에 대해 시험한다. 그후 이 데이타는 양쪽친매성, Rothbard 모티프 및 카텝신 B 및 다른 처리 효소의 개열 위치와 같이, 성공적으로 제공된 펩티드와 관련된 다른 서열 특성에 대한 정보와 결합시킬 수 있다.
가능한 제2 종류 (예를 들어, 인간) T-세포 에피토프가 확인된 경우, 이것은 하나 이상의 아미노산 변경에 의해 제거된다. 변형된 아미노산은 일반적으로 T-세포 에피토프 자체 내에 존재하고, 상기 단백질의 일차 또는 이차 구조의 관점에서 에피토프에 인접 위치할 수 있다 (그리고 따라서, 일차 구조에서 인접할 수 없음). 가장 일반적으로는, 상기 변경은 치환 방식에 의하나, 일부 경우, 아미노산 부가 또는 결실이 더욱 적절할 수 있다.
모든 변경은 재조합 DNA 기술에 의해 성취될 수 있으며, 이에 따라 위치 선택적 돌연변이와 같은 잘 성취된 방법을 이용하여 재조합 호스트로부터 발현에 의해 최종 분자를 제조할 수 있다. 그러나, 단백질 화학 또는 분자성 변경의 임의의 다른 방법이 또한 가능하다.
리서피싱 (Resurfacing)
이 방법은:
(a) 비인간 항체 가변 영역의 3차원 모델을 작제함으로써, 비인간 (예를 들어, 설치류) 항체 (또는 그의 단편)의 가변 영역의 형태 구조를 결정하는 단계;
(b) 중쇄 및 경쇄 프레임워크 위치의 일 세트를 제공하기 위해, 상당 수의 비인간 및 인간 항체 가변 영역 중쇄 및 경쇄의 x-선 결정 구조로부터의 상대 접근성 분포를 사용하여 서열 정렬을 생성하는 단계로서, 정렬 위치가 상당 수의 비인간 항체 중쇄 및 경쇄의 98%에서 확인되는 것인 단계;
(c) 단계 (b)에서 생성된 프레임워크 위치 세트를 이용하여 경쇄 및 중쇄 표면 노출 아미노산 잔기의 일 세트를 인간화될 비인간 항체에 대해 정의하는 단계;
(d) 단계 (c)에서 정의된 표면 노출 아미노산 잔기의 세트와 가장 근접하게 동일한 중쇄 및 경쇄 표면 노출 아미노산 잔기의 일 세트를 인간 항체 아미노산으로부터 확인하는 단계로서, 인간 항체로부터의 중쇄 및 경쇄가 자연적으로 쌍을 이루는 것인 단계;
(e) 인간화될 비인간 항체의 아미노산 서열에서, 단계 (c)에서 정의된 중쇄 및 경쇄 표면 노출 아미노산 잔기의 세트를 단계 (d)에서 확인된 중쇄 및 경쇄 표면 노출 아미노산 잔기의 세트와 치환하는 단계;
(f) 단계 (e)에서 명시된 치환에 의해 생성된 비인간 항체의 가변 영역의 3차원 모델을 작제하는 단계;
(g) 단계 (a) 및 (f)에서 작제된 3차원 모델을 비교함으로써, 인간화될 비인간 항체의 상보성 결정 영역의 임의의 잔기의 임의의 원자의 5Å 내이거나 또는 단계 (c) 또는 (d)에서 확인된 세트로부터의 임의의 아미노산 잔기를 확인하는 단계; 및
(h) 단계 (g)에서 확인된 임의의 잔기를 인간 아미노산 잔기로부터 본래의 비인간 아미노산 잔기로 변경하여, 표면 노출 아미노산 잔기의 비인간 항체 인간화 세트를 정의하는 단계로서; 단, 단계 (a)를 첫 번째로 수행할 필요는 없으나, 단계 (g) 전에는 수행해야 하는 것인 단계를 포함한다.
슈퍼인간화
이 방법에서는 기능성 인간 생식세포 유전자 레퍼토리를 비인간 서열과 비교한다. 비인간 서열과 동일하거나 또는 매우 유사한 표준 구조를 인코딩하는 인간 유전자를 선택한다. CDR 내의 상동성이 큰 이렇게 선택된 인간 유전자를 FR 기증체로 선택한다. 마지막으로, 비인간 CDR을 인간 FR에 이식한다. 이 방법은 특허 WO 2005/079479 A2에 개시되어 있다.
인간 스트링 콘텐츠 최적화
이 방법에서는 인간 생식세포 유전자의 레퍼토리와 비인간 (예를 들어, 마우스) 서열을 비교하고, 가능한 MHC/T-세포 에피토프의 수준에서 서열을 정량화하는 인간 스트리밍 콘텐츠 (HSC)로서 차이를 기록한다. 그후, 전역 동일성 측정을 사용하기 보다는 HSC를 극대화함으로써 표적 서열을 인간화하여, 다중 다기능 인간화 변이체를 생성시킨다 (문헌 [Molecular Immunology, 44, (2007) 1986-1998]에 기재됨).
프레임워크 셔플링
비인간 항체의 CDR을 모든 공지된 중쇄 및 경쇄 인간 생식세포 유전자 프레임워크를 포함하는 cDNA 풀로 인프레임 (in-frame) 융합시킨다. 그후 예를 들어, 파지 디스플레이 항체 라이브러리의 패닝 (panning)에 의해 인간화된 항체를 선택한다. 이것은 문헌 [Methods 36, 43-60 (2005)]에 개시되어 있다.
정의
약학적으로 허용가능한 양이온
약학적으로 허용가능한 1가 및 2가 양이온의 예는 본 명세서에서 참고로 인용하는 문헌[Berge, et al., J. Pharm. Sci., 66, 1-19 (1977)]에 논의되어 있다.
약학적으로 허용가능한 양이온은 무기 또는 유기 양이온일 수 있다.
약학적으로 허용가능한 1가 무기 양이온의 예는 Na+ 및 K+와 같은 알칼리 금속 이온을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 약학적으로 허용가능한 2가 무기 양이온의 예는 Ca2+ 및 Mg2+와 같은 알칼리 토금속 양이온을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 약학적으로 허용가능한 유기 양이온의 예는 암모늄 이온(즉, NH4 +) 및 치환된 암모늄 이온(예를 들어 NH3R+, NH2R2 +, NHR3 +, NR4 +)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 적절한 치환된 암모늄 이온의 예는 에틸아민, 디에틸아민, 디시클로헥실아민, 트리에틸아민, 부틸아민, 에틸렌디아민, 에탄올아민, 디에탄올아민, 피페라진, 벤질아민, 페닐벤질아민, 콜린, 멜구민 및 트로메타민 뿐 아니라, 리신 및 아르기닌과 같은 아미노산으로부터 유도된 것들이다. 통상적인 4차 암모늄 이온의 예는 N(CH3)4 +이다.
치환기
본 명세서에서 사용되는 문구 "임의로 치환된"은 비치환될 수 있거나 또는 치환될 수 있는 모 기(parent group)에 관한 것이다.
달리 명시되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 용어 "치환된"은 하나 이상의 치환기를 갖는 모 기에 관한 것이다. 용어 "치환기"는 본 명세서에서 통상적인 의미로 사용되며, 모 기에 공유 결합되거나 또는 적절한 경우 모 기에 융합된 화학적 부분을 지칭한다. 매우 다양한 치환기가 공지되어 있으며, 이를 형성시키는 방법 및 다양한 모 기에 도입하는 방법도 잘 알려져 있다.
치환기의 예를 하기에 더욱 상세히 설명한다.
C1-12 알킬: 본 명세서에서 사용된 바의 용어 "C1-12 알킬"은 지방족 또는 지환족일 수 있고 포화 또는 불포화(예를 들어 부분 불포화, 완전 불포화)될 수 있는, 1 내지 12 개의 탄소 원자를 갖는 탄화수소 화합물의 탄소 원자로부터 수소 원자를 제거하여 얻어진 1가 부분에 관한 것이다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "C1-4 알킬"은 지방족 또는 지방족고리일 수 있고, 포화 또는 불포화 (예를 들어, 일부 불포화, 전부 불포화)될 수 있는, 1 내지 4 개의 탄소 원자를 갖는 탄화수소 화합물의 탄소 원자로부터 수소 원자를 제거함으로써 수득되는 1가 모이어티를 의미한다. 따라서, 용어 "알킬"은 하기에 논의되는 하위 부류 알케닐, 알키닐, 시클로알킬 등을 포함한다.
포화 알킬기의 예는 메틸(C1), 에틸(C2), 프로필(C3), 부틸(C4), 펜틸(C5), 헥실(C6) 및 헵틸(C7)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
포화 선형 알킬기의 예는 메틸(C1), 에틸(C2), n-프로필(C3), n-부틸(C4), n-펜틸(아밀)(C5), n-헥실(C6) 및 n-헵틸(C7)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
포화 분지쇄형 알킬기의 예는 이소-프로필(C3), 이소-부틸(C4), 섹(sec)-부틸(C4), 터트(tert)-부틸(C4), 이소-펜틸(C5) 및 네오-펜틸(C5)을 포함한다.
C2-12 알케닐: 본 명세서에서 사용된 바의 용어 "C2-12 알케닐"은 하나 이상의 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 알킬기에 관한 것이다.
불포화 알케닐기의 예는, 에테닐(비닐, -CH=CH2), 1-프로페닐(-CH=CH-CH3), 2-프로페닐(알릴, -CH-CH=CH2), 이소프로페닐(1-메틸비닐, -C(CH3)=CH2), 부테닐(C4), 펜테닐(C5), 및 헥세닐(C6)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
C2-12 알키닐: 본 명세서에서 사용된 바의 용어 "C2-12 알키닐"은 하나 이상의 탄소-탄소 삼중 결합을 갖는 알킬기에 관한 것이다.
불포화 알키닐기의 예는 에티닐(-C≡CH) 및 2-프로피닐(프로파르길, -CH2-C≡CH)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
C3-12 시클로알킬: 본 명세서에서 사용된 바의 용어 "C3-12 시클로알킬"은 역시 시클릴기인 알킬기; 즉 부분이 3 내지 7 개의 고리 원자를 비롯한, 3 내지 7 개의 탄소 원자를 갖는, 고리(cyclic) 탄화수소(고리탄소) 화합물의 지환족 고리 원자로부터 수소 원자를 제거하여 얻어진 1가 부분에 관한 것이다.
시클로알킬기의 예는 하기로부터 유도된 것들을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다:
포화 단일고리 탄화수소 화합물: 시클로프로판(C3), 시클로부탄(C4), 시클로펜탄(C5), 시클로헥산(C6), 시클로헵탄(C7), 메틸시클로프로판(C4), 디메틸시클로프로판(C5), 메틸시클로부탄(C5), 디메틸시클로부탄(C6), 메틸시클로펜탄(C6), 디메틸시클로펜탄(C7) 및 메틸시클로헥산(C7);
불포화 단일고리 탄화수소 화합물: 시클로프로펜(C3), 시클로부텐(C4), 시클로펜텐(C5), 시클로헥센(C6), 메틸시클로프로펜(C4), 디메틸시클로프로펜(C5), 메틸시클로부텐(C5), 디메틸시클로부텐(C6), 메틸시클로펜텐(C6), 디메틸시클로펜텐(C7) 및 메틸시클로헥센(C7); 및
포화 헤테로사이클릭 탄화수소 화합물: 노르카란(C7), 노르피난(C7), 노르보르난(C7).
C3-20 헤테로사이클릴: 본 명세서에서 사용된 바의 용어 "C3-20 헤테로사이클릴"은 헤테로사이클릭 화합물의 고리 원자로부터 수소 원자를 제거하여 얻어진 1가 부분에 관한 것이며, 부분은 1 내지 10 개가 고리 헤테로 원자인 3 내지 20 개의 고리 원자를 갖는다. 바람직하게는, 각각의 고리는 1 내지 4 개가 고리 헤테로 원자인 3 내지 7 개의 고리 원자를 갖는다.
본 문맥에서, 접두사(예를 들어 C3-20, C3-7, C5-6 등)는 탄소 원자 또는 헤테로 원자인지 여부와 상관없이 고리 원자의 수 또는 고리 원자의 수의 범위를 지칭한다. 예를 들어, 본 명세서에서 사용된 바의 용어 "C5-6 헤테로사이클릴"은 5 또는 6 개의 고리 원자를 갖는 헤테로사이클릴기에 관한 것이다.
단일고리 헤테로사이클릴기의 예는 하기로부터 유도된 것들을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다:
N1: 아지리딘(C3), 아제티딘(C4), 피롤리딘(테트라하이드로피롤)(C5), 피롤린(예를 들어, 3-피롤린, 2,5-디하이드로피롤)(C5), 2H-피롤 또는 3H-피롤(이소피롤, 이소아졸)(C5), 피페리딘(C6), 디하이드로피리딘(C6), 테트라하이드로피리딘(C6), 아제핀(C7);
O1: 옥시란(C3), 옥세탄(C4), 옥솔란(테트라하이드로푸란)(C5), 옥솔(디하이드로푸란)(C5), 옥산(테트라하이드로피란)(C6), 디하이드로피란(C6), 피란(C6), 옥세핀(C7);
S1: 티이란(C3), 티에탄(C4), 티올란(테트라하이드로티오펜)(C5), 티안(테트라하이드로티오피란)(C6), 티에판(C7);
O2: 디옥솔란(C5), 디옥산(C6) 및 디옥세판(C7);
O3: 트리옥산(C6);
N2: 이미다졸리딘(C5), 피라졸리딘(디아졸리딘)(C5), 이미다졸린(C5), 피라졸린(디하이드로피라졸)(C5), 피페라진(C6);
N1O1: 테트라하이드로옥사졸(C5), 디하이드로옥사졸(C5), 테트라하이드로이속사졸(C5), 디하이드로이속사졸(C5), 모르폴린(C6), 테트라하이드로옥사진(C6), 디하이드로옥사진(C6), 옥사진(C6);
N1S1: 티아졸린(C5), 티아졸리딘(C5), 티오모르폴린(C6);
N2O1: 옥사디아진(C6);
O1S1: 옥사티올(C5) 및 옥사티안(티옥산)(C6); 및
N1O1S1: 옥사티아진(C6).
치환된 단일고리 헤테로사이클릴기의 예는 고리 형태의 당류로부터 유도된 것들, 예를 들어 아라비노푸라노오스, 릭소푸라노오스(lyxofuranose), 리보푸라노오스 및 크실로푸란스 같은 푸라노오스(C5), 및 알로피라노오스, 알트로피라노오스, 글루코피라노오스, 만노피라노오스, 글루오피라노오스, 이도피라노오스, 갈락토피라노오스 및 탈로피라노오스와 같은 피라노오스(C6)를 포함한다.
C5-20 아릴: 본 명세서에서 사용된 바의 용어 "C5-20 아릴"은 방향족 화합물의 방향족 고리 원자로부터 수소 원자를 제거하여 얻어진 1가 모이어티에 관한 것이며, 상기 모이어티는 3 내지 20 개의 고리 원자를 갖는다. 본 명세서에서 사용된 바의 용어 "C5-7 아릴"은 모이어티가 5 내지 7 개의 고리 원자를 갖는 것으로서, 방향족 화합물의 방향족 고리 원자로부터 수소 원자를 제거함으로써 수득되는 1 가 모이어티를 의미하고, 본 명세서에서 사용된 바의 용어 "C5-10 아릴"은 모이어티가 5 내지 10 개의 고리 원자를 갖는 것으로서, 방향족 화합물의 방향족 고리 원자로부터 수소 원자를 제거함으로써 수득되는 1 가 모이어티를 의미한다. 바람직하게는 각각의 고리는 5 내지 7 개의 고리 원자를 갖는다.
본 문맥에서, 접두사(예를 들어 C3-20, C5-7, C5-6 등)는 탄소 원자 또는 헤테로 원자인지 여부와 상관 없이 고리 원자의 수 또는 고리 원자의 수의 범위를 지칭한다. 예를 들어, 본 명세서에서 사용된 바의 용어 "C5-6 아릴"은 5 또는 6 개의 고리 원자를 갖는 아릴기에 관한 것이다.
고리 원자는 "카르보아릴기"에서와 같이 모두 탄소 원자일 수 있다.
카르보아릴기의 예는 벤젠(즉, 페닐)(C6), 나프탈렌(C10), 아줄렌(C10), 안트라센(C14), 페난트렌(C14), 나프타센(C18) 및 피렌(C16)으로부터 유도된 것들을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
적어도 하나가 방향족 고리인 융합 고리를 포함하는 아릴기의 예는 인단(예를 들어 2,3-디하이드로-1H-인덴)(C9), 인덴(C9), 이소인덴(C9), 테트랄린(1,2,3,4-테트라하이드로나프탈렌)(C10), 아세나프텐(C12), 플루오렌(C13), 페날렌(C13), 아세페난트렌(C15) 및 아세안트렌(C16)으로부터 유도된 기를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
대안적으로, 고리 원자는 "헤테로아릴기"에서와 같이 하나 이상의 헤테로 원자를 포함할 수 있다. 단일고리 헤테로아릴기의 예는 하기로부터 유도된 것들을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다:
N1: 피롤(아졸)(C5), 피리딘(아진)(C6);
O1: 푸란(옥솔)(C5);
S1: 티오펜(티올)(C5);
N1O1: 옥사졸(C5), 이속사졸(C5), 이속사진(C6);
N2O1: 옥사디아졸(푸라잔)(C5);
N3O1: 옥사트리아졸(C5);
N1S1: 티아졸(C5), 이소티아졸(C5);
N2: 이미다졸(1,3-디아졸)(C5), 피라졸(1,2-디아졸)(C5), 피리다진(1,2-디아진)(C6), 피리미딘(1,3-디아진)(C6)(예를 들어 사이토신, 티민, 우라실), 피라진(1,4-디아진)(C6);
N3: 트리아졸(C5), 트리아진(C6); 및
N4: 테트라졸(C5).
융합 고리를 포함하는 헤테로아릴의 예는 하기를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다:
벤조푸란(O1), 이소벤조푸란(O1), 인돌(N1), 이소인돌(N1), 인돌리진(N1), 인돌린(N1), 이소인돌린(N1), 퓨린(N4)(예를 들어 아데닌, 구아닌), 벤즈이미다졸(N2), 인다졸(N2), 벤즈옥사졸(N1O1), 벤즈이속사졸(N1O1), 벤조디옥솔(O2), 벤조푸란(N2O1), 벤조트리아졸(N3), 벤조티오푸란(S1), 벤조티아졸(N1S1), 벤조티아디아졸(N2S)로부터 유도된 C9(2개의 융합 고리를 가짐);
크로멘(O1), 이소크로멘(O1), 크로만(O1), 이소크로만(O1), 벤조디옥산(O2), 퀴놀린(N1), 이소퀴놀린(N1), 퀴놀리진(N1), 벤족사진(N1O1), 벤조디아진(N2), 피리도피리딘(N2), 퀴녹살린(N2), 퀴나졸린(N2), 신놀린(N2), 프탈라진(N2), 나프티리딘(N2), 프테리딘(N4)으로부터 유도된 C10(2개의 융합 고리를 가짐);
벤조디아제핀(N2)으로부터 유도된 C11(2개의 융합 고리를 가짐);
카르바졸(N1), 디벤조푸란(O1), 디벤조티오펜(S1), 카르볼린(N2), 페리미딘(N2), 피리도인돌(N2)로부터 유도된 C13(3개의 융합 고리를 가짐); 및
아크리딘(N1), 크산텐(O1), 티오크산텐(S1), 옥산트렌(O2), 페녹사티인(O1S1), 페나진(N2), 페녹사진(N1O1), 페노티아진(N1S1), 티안트렌(S2), 페난트리딘(N1), 페난트롤린(N2), 페나진(N2)으로부터 유도된 C14(3개의 융합 고리를 가짐).
상기 기들은 단독이든지 또는 다른 치환기의 일부이든지 간에 그 자체로 선택적으로 그 자신 및 하기 열거한 추가의 치환기에서 선택되는 하나 이상의 기로 치환될 수 있다.
할로: -F, -Cl, -Br 및 -I.
히드록시: -OH.
에테르: -OR, 여기서 R은 에테르 치환기, 예를 들어 C1-7 알킬기(하기 논의되는바처럼 C1-7 알콕시기로도 지칭됨), C3-20 헤테로사이클릴기(C3-20 헤테로사이클릴옥시기로도 지칭됨) 또는 C5-20 아릴기(C5-20 아릴옥시기로도 지칭됨), 바람직하게는 C1-7 알킬기임.
알콕시: -OR, 여기서 R은 알킬기, 예를 들어 C1-7 알킬기임. C1-7 알콕시기의 예는 -OMe(메톡시), -OEt(에톡시), -O(nPr)(N-프로폭시), -O(iPr)(이소프로폭시), -O(nBu)(N-부톡시), -O(sBu)(sec-부톡시), -O(iBu)(이소부톡시) 및 -O(tBu)(터트-부톡시)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
아세탈: -CH(OR1)(OR2), 여기서 R1 및 R2는 독립적으로 아세탈 치환기, 예를 들어 C1-7 알킬기, C3-20 헤테로사이클릴기 또는 C5-20 아릴기, 바람직하게는 C1-7 알킬기, 또는 "고리" 아세탈기의 경우, R1 및 R2는 이들이 부착된 2개의 산소 원자 및 이들이 부착된 탄소 원자와 함께 4 내지 8 개의 고리 원자를 갖는 헤테로사이클릭 고리를 형성함. 아세탈기의 예는 -CH(OMe)2, -CH(OEt)2 및 -CH(OMe)(OEt)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
헤미아세탈: -CH(OH)(OR1), 여기서 R1은 헤미아세탈 치환기, 예를 들어 C1-7 알킬기, C3-20 헤테로사이클릴기 또는 C5-20 아릴기, 바람직하게는 C1-7 알킬기임. 헤미아세탈기의 예는 -CH(OH)(OMe) 및 -CH(OH)(OEt)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
케탈: -CR(OR1)(OR2), 여기서 R1 및 R2는 아세탈에 대해 정의된 바와 같고, R은 수소 이외의 케탈 치환기, 예를 들어 C1-7 알킬기, C3-20 헤테로사이클릴기 또는 C5-20 아릴기, 바람직하게는 C1-7 알킬기임. 케탈기의 예는 -C(Me)(OMe)2, -C(Me)(OEt)2, -C(Me)(OMe)(OEt), -C(Et)(OMe)2, -C(Et)(OEt)2 및 -C(Et)(OMe)(OEt)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
헤미케탈: -CR(OH)(OR1), 여기서 R1은 헤미아세탈에 대해 정의된 바와 같고, R은 수소 이외의 헤미케탈 치환기, 예를 들어 C1-7 알킬기, C3-20 헤테로사이클릴기 또는 C5-20 아릴기, 바람직하게는 C1-7 알킬기임. 헤미케탈기의 예는 -C(Me)(OH)(OMe), -C(Et)(OH)(OMe), -C(Me)(OH)(OEt) 및 -C(Et)(OH)(OEt)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
옥소(케토, -온): =O.
티온(티오케톤): =S.
이미노(이민): =NR, 여기서 R은 이미노 치환기, 예를 들어 수소, C1-7 알킬기, C3-20 헤테로사이클릴기 또는 C5-20 아릴기, 바람직하게는 수소 또는 C1-7 알킬기임. 에스테르기의 예는 =NH, =NMe, =NEt 및 =NPh를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
포르밀(카르발데하이드, 카르복스알데하이드): -C(=O)H.
아실(케토): -C(=O)R, 여기서 R은 아실 치환기, 예를 들어 C1-7 알킬기(C1-7 알킬아실 또는 C1-7 알카노일로도 지칭됨), C3-20 헤테로사이클릴기(C3-20 헤테로사이클릴아실로도 지칭됨) 또는 C5-20 아릴기(C5-20 아릴아실로도 지칭됨), 바람직하게는 C1-7 알킬기임. 아실기의 예는 -C(=O)CH3(아세틸), -C(=O)CH2CH3(프로피오닐), -C(=O)C(CH3)3(t-부티릴) 및 -C(=O)Ph(벤조일, 페논)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
카르복시(카르복실산): -C(=O)OH.
티오카르복시(티오카르복실산): -C(=S)SH.
티올로카르복시(티올로카르복실산): -C(=O)SH.
티오노카르복시(티오노카르복실산): -C(=S)OH.
이미드산: -C(=NH)OH.
하이드록삼산: -C(=NOH)OH.
에스테르(카르복실레이트, 카르복실산 에스테르, 옥시카르보닐): -C(=O)OR, 여기서 R은 에스테르 치환기, 예를 들어 C1-7 알킬기, C3-20 헤테로사이클릴기 또는 C5-20 아릴기, 바람직하게는 C1-7 알킬기임. 에스테르기의 예는 -C(=O)OCH3, -C(=O)OCH2CH3, -C(=O)OC(CH3)3 및 -C(=O)OPh를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
아실옥시(역 에스테르): -OC(=O)R, 여기서 R은 아실옥시 치환기, 예를 들어 C1-7 알킬기, C3-20 헤테로사이클릴기 또는 C5-20 아릴기, 바람직하게는 C1-7 알킬기임. 아실옥시기의 예는 -OC(=O)CH3(아세톡시), -OC(=O)CH2CH3, -OC(=O)C(CH3)3, -OC(=O)Ph 및 -OC(=O)CH2Ph를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
옥시카르보닐옥시: -OC(=O)OR, 여기서 R은 에스테르 치환기, 예를 들어 C1-7 알킬기, C3-20 헤테로사이클릴기 또는 C5-20 아릴기, 바람직하게는 C1-7 알킬기임. 에스테르기의 예는 -OC(=O)OCH3, -OC(=O)OCH2CH3, -OC(=O)OC(CH3)3 및 -OC(=O)OPh를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
아미노: -NR1R2, 여기서 R1 및 R2는 독립적으로 아미노 치환기, 예를 들어 수소, C1-7 알킬기(C1-7 알킬아미노 또는 디-C1-7 알킬아미노로도 지칭됨), C3-20 헤테로사이클릴기 또는 C5-20 아릴기, 바람직하게는 H 또는 C1-7 알킬기이거나, 또는 "고리" 아미노기의 경우, R1 및 R2는 이들이 부착되는 질소 원자와 함께 4 내지 8 개의 고리 원자를 갖는 헤테로사이클릭 고리를 형성함. 아미노기는 1차(-NH2), 2차(-NHR1) 또는 3차(-NHR1R2)일 수 있고, 양이온 형태에서는 4차(-+NR1R2R3)일 수 있다. 아미노기의 예는 -NH2, -NHCH3, -NHC(CH3)2, -N(CH3)2, -N(CH2CH3)2 및 -NHPh를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 고리 아미노기의 예는 아지리디노, 아제티디노, 피롤리디노, 피페리디노, 피페라지노, 모르폴리노 및 티오모르폴리노를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
아미도(카르바모일, 카르바밀, 아미노카르보닐, 카르복사미드): -C(=O)NR1R2, 여기서 R1 및 R2는 독립적으로 아미노기에 대해 정의된 바의 아미노 치환기임. 아미도기의 예는 -C(=O)NH2, -C(=O)NHCH3, -C(=O)N(CH3)2, -C(=O)NHCH2CH3 및 -C(=O)N(CH2CH3)2 뿐 아니라, R1 및 R2가 이들이 부착된 질소 원자와 함께 예를 들어 피페리디노카르보닐, 모르폴리노카르보닐, 티오모르폴리노카르보닐 및 피페라지노카르보닐에서와 같이 헤테로사이클릭 구조를 형성하는 아미도기도 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
티오아미도(티오카르바밀): -C(=S)NR1R2, 여기서 R1 및 R2는 독립적으로 아미노기에 대해 정의된 바의 아미노 치환기임. 아미도기의 예는 -C(=S)NH2, -C(=S)NHCH3, -C(=S)N(CH3)2 및 -C(=S)NHCH2CH3을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
아실아미도(아실아미노): -NR1C(=O)R2, 여기서 R1은 아미드 치환기, 예를 들어 수소, C1-7 알킬기, C3-20 헤테로사이클릴기 또는 C5-20 아릴기, 바람직하게는 수소 또는 C1-7 알킬기이고, R2는 아실 치환기, 예를 들어 C1-7 알킬기, C3-20 헤테로사이클릴기 또는 C5-20아릴기, 바람직하게는 수소 또는 C1-7 알킬기임. 아실아미드기의 예는 -NHC(=O)CH3, -NHC(=O)CH2CH3 및 -NHC(=O)Ph를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. R1 및 R2는 함께 예를 들어 숙신이미딜, 말레이미딜 및 프탈이미딜에서와 같이 고리 구조를 형성할 수 있다:
Figure pct00042
아미노카르보닐옥시: -OC(=O)NR1R2, 여기서 R1 및 R2는 독립적으로 아미노기에 대해 정의된 바의 아미노 치환기임. 아미노카르보닐옥시기의 예는 -OC(=O)NH2, -OC(=O)NHMe, -OC(=O)NMe2 및 -OC(=O)NEt2를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
우레이도: -N(R1)CONR2R3, 여기서 R2 및 R3은 독립적으로 아미노기에 대해 정의된 바의 아미노 치환기이고, R1은 우레이도 치환기, 예를 들어 수소, C1-7 알킬기, C3-20 헤테로사이클릴기 또는 C5-20 아릴기, 바람직하게는 수소 또는 C1-7 알킬기임. 우레이도기의 예는 -NHCONH2, -NHCONHMe, -NHCONHEt, -NHCONMe2, -NHCONEt2, -NMeCONH2, -NMeCONHMe, -NMeCONHEt, -NMeCONMe2 및 -NMeCONEt2를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
구아니디노: -NH-C(=NH)NH2.
테트라졸일: 4개의 질소 원자 및 1개의 탄소 원자를 갖는 5원 방향족 고리.
Figure pct00043
이미노: =NR, 여기서 R은 이미노 치환기, 예를 들어 수소, C1-7 알킬기, C3-20 헤테로사이클릴기 또는 C5-20 아릴기, 바람직하게는 H 또는 C1-7 알킬기임. 이미노기의 예는 =NH, =NMe 및 =NEt를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
아미딘(아미디노): -C(=NR)NR2, 여기서 각각의 R은 아미딘 치환기, 예를 들어 수소, C1-7 알킬기, C3-20 헤테로사이클릴기 또는 C5-20 아릴기, 바람직하게는 H 또는 C1-7 알킬기임. 아미딘기의 예는 -C(=NH)NH2, -C(=NH)NMe2 및 -C(=NMe)NMe2를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
니트로: -NO2.
니트로소: -NO.
아지도: -N3.
시아노(니트릴, 카르보니트릴): -CN.
이소시아노: -NC.
시아네이토: -OCN.
이소시아네이토: -NCO.
티오시아노(티오시아네이토): -SCN.
이소티오시아노(이소티오시아네이토): -NCS.
설프하이드릴(티올, 머캅토): -SH.
티오에테르(설피드): -SR, 여기서 R은 티오에테르 치환기, 예를 들어 C1-7 알킬기(C1-7 알킬티오기로도 지칭됨), C3-20 헤테로사이클릴기 또는 C5-20 아릴기, 바람직하게는 C1-7 알킬기임. C1-7 알킬티오기의 예는 -SCH3 및 -SCH2CH3을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
디설파이드: -SS-R, 여기서 R은 디설파이드 치환기, 예를 들어 C1-7 알킬기, C3-20 헤테로사이클릴기 또는 C5-20 아릴기, 바람직하게는 C1-7 알킬기(본 명세서에서는 C1-7 알킬 디설파이드로도 지칭됨)임. C1-7 알킬 디설파이드기의 예는 -SSCH3 및 -SSCH2CH3을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
설핀(설피닐, 설폭시드): -S(=O)R, 여기서 R은 설핀 치환기, 예를 들어 C1-7 알킬기, C3-20 헤테로사이클릴기 또는 C5-20 아릴기, 바람직하게는 C1-7 알킬기임. 설핀기의 예는 -S(=O)CH3 및 -S(=O)CH2CH3을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
설폰(설포닐): -S(=O)2R, 여기서 R은 설폰 치환기, 예를 들어 C1-7 알킬기, C3-20 헤테로사이클릴기 또는 C5-20 아릴기, 예를 들어 플루오르화 또는 퍼플루오르화 C1-7 알킬기를 포함하는 바람직하게는 C1-7 알킬기임. 설폰기의 예는 -S(=O)2CH3(메탄설포닐, 메실), -S(=O)2CF3(트리플일), -S(=O)2CH2CH3(에실), -S(=O)2C4F9(노나플일), -S(=O)2CH2CF3(트레실), -S(=O)2CH2CH2NH2(타우릴), -S(=O)2Ph(페닐설포닐, 베실), 4-메틸페닐설포닐(토실), 4-클로로페닐설포닐(클로실), 4-브로모페닐설포닐(브로실), 4-니트로페닐(노실), 2-나프탈렌설포네이트(납실) 및 5-디메틸아미노-나프탈렌-1-일설포네이트(단실)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
설핀산(설피노): -S(=O)OH, -SO2H.
설폰산(설포): -S(=O)2OH, -SO3H.
설피네이트(설핀산 에스테르): -S(=O)OR, 여기서 R은 설피네이트 치환기, 예를 들어 C1-7 알킬기, C3-20 헤테로사이클릴기 또는 C5-20 아릴기, 바람직하게는 C1-7 알킬기임. 설피네이트기의 예는 -S(=O)OCH3(메톡시설피닐; 메틸 설피네이트) 및 -S(=O)OCH2CH3(에톡시설피닐; 에틸 설피네이트)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
설포네이트(설폰산 에스테르): -S(=O)2OR, 여기서 R은 설포네이트 치환기, 예를 들어 C1-7 알킬기, C3-20 헤테로사이클릴기 또는 C5-20 아릴기, 바람직하게는 C1-7 알킬기임. 설포네이트기의 예는 -S(=O)2OCH3(메톡시설포닐; 메틸 설포네이트) 및 -S(=O)2OCH2CH3(에톡시설포닐; 에틸 설포네이트)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
설피닐옥시: -OS(=O)R, 여기서 R은 설피닐옥시 치환기, 예를 들어 C1-7 알킬기, C3-20 헤테로사이클릴기 또는 C5-20 아릴기, 바람직하게는 C1-7 알킬기임. 설피닐옥시기의 예는 -OS(=O)CH3 및 -OS(=O)CH2CH3을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
설포닐옥시: -OS(=O)2R, 여기서 R은 설포닐옥시 치환기, 예를 들어 C1-7 알킬기, C3-20 헤테로사이클릴기 또는 C5-20 아릴기, 바람직하게는 C1-7 알킬기임. 설포닐옥시기의 예는 -OS(=O)2CH3(메실레이트) 및 -OS(=O)2CH2CH3(에실레이트)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
설페이트: -OS(=O)2OR, 여기서 R은 설페이트 치환기, 예를 들어 C1-7 알킬기, C3-20 헤테로사이클릴기 또는 C5-20 아릴기, 바람직하게는 C1-7 알킬기임. 설페이트기의 예는 -OS(=O)2OCH3 및 -SO(=O)2OCH2CH3을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
설파밀(설파모일; 설핀산 아미드; 설핀아미드): -S(=O)NR1R2, 여기서 R1 및 R2는 독립적으로 아미노기에 대해 정의된 바의 아미노 치환기임. 설파밀기의 예는 -S(=O)NH2, -S(=O)NH(CH3), -S(=O)N(CH3)2, -S(=O)NH(CH2CH3), -S(=O)N(CH2CH3)2 및 -S(=O)NHPh를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
설폰아미도(설핀아모일; 설폰산 아미드; 설폰아미드): -S(=O)2NR1R2, 여기서 R1 및 R2는 독립적으로 아미노기에 대해 정의된 바의 아미노 치환기임. 설폰아미도기의 예는 -S(=O)2NH2, -S(=O)2NH(CH3), -S(=O)2N(CH3)2, -S(=O)2NH(CH2CH3), -S(=O)2N(CH2CH3)2 및 -S(=O)2NHPh를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
설파미노: -NR1S(=O)2OH, 여기서 R1은 아미노기에 대해 정의된 바의 아미노 치환기임. 설파미노기의 예는 -NHS(=O)2OH 및 -N(CH3)S(=O)2OH를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
설폰아미노: -NR1S(=O)2R, 여기서 R1은 아미노기에 대해 정의된 바의 아미노 치환기이고, R은 설폰아미노 치환기, 예를 들어 C1-7 알킬기, C3-20 헤테로사이클릴기 또는 C5-20 아릴기, 바람직하게는 C1-7 알킬기임. 설폰아미노기의 예는 -NHS(=O)2CH3 및 -N(CH3)S(=O)2C6H5를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
설핀아미노: -NR1S(=O)R, 여기서 R1은 아미노기에 대해 정의된 바의 아미노 치환기이고, R은 설핀아미노 치환기, 예를 들어 C1-7 알킬기, C3-20 헤테로사이클릴기 또는 C5-20 아릴기, 바람직하게는 C1-7 알킬기임. 설핀아미노기의 예는 -NHS(=O)CH3 및 -N(CH3)S(=O)C6H5를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
포스피노(포스핀): -PR2, 여기서 R은 포스피노 치환기, 예를 들어 -H, C1-7 알킬기, C3-20 헤테로사이클릴기 또는 C5-20 아릴기, 바람직하게는 -H, C1-7 알킬기 또는 C5-20 아릴기임. 포스피노기의 예는 -PH2, -P(CH3)2, -P(CH2CH3)2, -P(t-Bu)2 및 -P(Ph)2를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
포스포: -P(=O)2.
포스피닐(산화포스핀): -P(=O)R2, 여기서 R은 포스피닐 치환기, 예를 들어 C1-7 알킬기, C3-20 헤테로사이클릴기 또는 C5-20 아릴기, 바람직하게는 C1-7 알킬기 또는 C5-20 아릴기임]. 포스피닐기의 예는 -P(=O)(CH3)2, -P(=O)(CH2CH3)2, -P(=O)(t-Bu)2 및 -P(=O)(Ph)2를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
포스폰산(포스포노): -P(=O)(OH)2.
포스포네이트(포스포노 에스테르): -P(=O)(OR)2, 여기서 R은 포스포네이트 치환기, 예를 들어 -H, C1-7 알킬기, C3-20 헤테로사이클릴기 또는 C5-20 아릴기, 바람직하게는 -H, C1-7 알킬기 또는 C5-20 아릴기임. 포스포네이트기의 예는 -P(=O)(OCH3)2, -P(=O)(OCH2CH3)2, -P(=O)(O-t-Bu)2 및 -P(=O)(OPh)2를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
인산(포스포노옥시): -OP(=O)(OH)2.
포스페이트(포스포노옥시 에스테르): -OP(=O)(OR)2, 여기서 R은 포스페이트 치환기, 예를 들어 -H, C1-7 알킬기, C3-20 헤테로사이클릴기 또는 C5-20 아릴기, 바람직하게는 -H, C1-7 알킬기 또는 C5-20 아릴기임. 포스페이트기의 예는 -OP(=O)(OCH3)2, -OP(=O)(OCH2CH3)2, -OP(=O)(O-t-Bu)2 및 -OP(=O)(OPh)2를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
아인산: -OP(OH)2.
포스파이트: -OP(OR)2, 여기서 R은 포스파이트 치환기, 예를 들어 -H, C1-7 알킬기, C3-20 헤테로사이클릴기 또는 C5-20 아릴기, 바람직하게는 -H, C1-7 알킬기 또는 C5-20 아릴기임. 포스파이트기의 예는 -OP(OCH3)2, -OP(OCH2CH3)2, -OP(O-t-Bu)2 및 -OP(OPh)2를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
포스포르아미다이트: -OP(OR1)-NR2 2, 여기서 R1 및 R2는 포스포르아미다이트 치환기, 예를 들어 -H, (임의로 치환된) C1-7 알킬기, C3-20 헤테로사이클릴기 또는 C5-20 아릴기, 바람직하게는 -H, C1-7 알킬기 또는 C5-20 아릴기임. 포스르아미다이트기의 예는 -OP(OCH2CH3)-N(CH3)2, -OP(OCH2CH3)-N(i-Pr)2 및 -OP(OCH2CH2CN)-N(i-Pr)2를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
포스포르아미데이트: -OP(=O)(OR1)-NR2 2, 여기서 R1 및 R2는 포스포르아미데이트 치환기, 예를 들어 -H, (임의로 치환된) C1-7 알킬기, C3-20 헤테로사이클릴기 또는 C5-20 아릴기, 바람직하게는 -H, C1-7 알킬기 또는 C5-20 아릴기이다. 포스포르아미데이트기의 예는 -OP(=O)(OCH2CH3)-N(CH3)2, -OP(=O)(OCH2CH3)-N(i-Pr)2 및 -OP(=O)(OCH2CH2CN)-N(i-Pr)2이다.
알킬렌
C3-12 알킬렌: 본 명세서에서 사용된 바의 용어 "C3-12 알킬렌"은 지방족 또는 지환족일 수 있고 포화, 부분 불포화 또는 완전 불포화될 수 있는, (달리 명시되지 않는 한) 3 내지 12 개의 탄소 원자를 갖는 탄화수소 화합물의 동일한 탄소 원자로부터 둘 모두, 또는 2개의 상이한 탄소 원자 각각으로부터 하나씩, 2개의 수소 원자를 제거하여 얻어진 이좌의(bidentate) 부분에 관한 것이다. 따라서, 용어 "알킬렌"은 하기 논의되는 하위 부류인 알케닐렌, 알키닐렌, 시클로알킬렌 등을 포함한다.
선형 포화 C3-12 알킬렌기의 예는 -(CH2)n- (여기서 n은 3 내지 12의 정수임), 예를 들어 -CH2CH2CH2-(프로필렌), -CH2CH2CH2CH2-(부틸렌), -CH2CH2CH2CH2CH2-(펜틸렌) 및 -CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-(헵틸렌)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
분지쇄형 포화 C3-12 알킬렌기의 예는 -CH(CH3)CH2-, -CH(CH3)CH2CH2-, -CH(CH3)CH2CH2CH2-, -CH2CH(CH3)CH2-, -CH2CH(CH3)CH2CH2-, -CH(CH2CH3)-, -CH(CH2CH3)CH2- 및 -CH2CH(CH2CH3)CH2-를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
선형 부분 불포화 C3-12 알킬렌기(C3-12 알케닐렌 및 알키닐렌 기)의 예는 -CH=CH-CH2-, -CH2-CH=CH2-, -CH=CH-CH2-CH2-, -CH=CH-CH2-CH2-CH2-, -CH=CH-CH=CH-, -CH=CH-CH=CH-CH2-, -CH=CH-CH=CH-CH2-CH2-, -CH=CH-CH2-CH=CH-, -CH=CH-CH2-CH2-CH=CH- 및 -CH2-C≡C-CH2-를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
분지쇄형 부분 불포화 C3-12 알킬렌기(C3-12 알케닐렌 및 알키닐렌 기)의 예는 -C(CH3)=CH-, -C(CH3)=CH-CH2-, -CH=CH-CH(CH3) 및 -C≡C-CH(CH3)-을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
지환족 포화 C3-12 알킬렌기(C3-12 시클로알킬렌)의 예는 시클로펜틸렌(예를 들어 시클로펜트-1,3-일렌) 및 시클로헥실렌(예를 들어 시클로헥스-1,4-일렌)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
지환족 부분 불포화 C3-12 알킬렌기(C3-12 시클로알킬렌)의 예는 시클로펜테닐렌(예를 들어 4-시클로펜텐-1,3-일렌), 시클로헥세닐렌(예를 들어 2-시클로헥센-1,4-일렌; 3-시클로헥센-1,2-일렌; 2,5-시클로헥사디엔-1,4-일렌)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
카르바메이트 질소 보호기: 용어 "카르바메이트 질소 보호기"는 이민 결합 내 질소를 차폐하는 부분에 관한 것이며, 이는 당업계에 잘 알려져 있다. 이 기는 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00044
여기서 R'10은 상기 정의된 바의 R이다. 다수의 적절한 기는 본 명세서에서 참고로 인용하는 문헌(Greene, T.W. and Wuts, G.M., Protective 기s in Organic Synthesis, 3rd Edition, John Wiley & Sons, Inc., 1999)의 503 내지 549 페이지에 기재되어 있다.
헤미아민 질소 보호기: 용어 "헤미아민 질소 보호기"는 하기 구조를 갖는 기에 관한 것이다:
Figure pct00045
여기서 R'10은 상기 정의된 바의 R이다. 다수의 적절한 기는 본 명세서에서 참고로 인용하는 문헌(Greene, T.W. and Wuts, G.M., Protective 기s in Organic Synthesis, 3rd Edition, John Wiley & Sons, Inc., 1999)의 633 내지 647 페이지에 아미드 보호기로서 기재되어 있다.
카바메이트 질소 보호 기 및 반동물 질소 보호기는 또한 "합성을 위한 질소 보호기"로 언급될 수 있다.
컨주게이트
본 발명은 링커 단위를 통해 항체에 연결된 PBD 화합물을 포함하는 컨주게이트를 제공한다. 일 실시형태에서, 상기 컨주게이트는 항체가 스페이서 연결 기에 연결되고, 스페이서가 개시자 (trigger)에 연결되고, 개시자가 자가 희생 링커 (self-immolative linker)에 연결되고, 자가 희생 링커가 PBD 화합물의 N10 위치에 연결된 것을 포함한다. 이러한 컨주게이트는 하기와 같이 개시된다:
Figure pct00046

여기서, Ab는 상기에서 정의되는 바와 같은 항체이고, PBD는 본 명세서에서 개시되는 바와 같은 피롤로벤조디아제핀 화합물 (D)이다. 본 발명의 특정 실시형태에서, RL' A, L1 및 L2의 해당 부분이 개시된다. RL'은 RL1' 또는 RL2'일 수 있다. D는 RL1' 또는 RL2'이 제거된 DL이다.
본 발명은 대상체의 목표 위치에 PBD 화합물을 제공하는데 사용하기에 적합하다. 바람직한 실시형태에서, 상기 컨주게이트는 링커 부분을 전혀 보유하지 않는 활성 PBD 화합물을 방출시킨다. PBD 화합물의 반응성에 영향을 줄 수 있는 것은 전혀 존재하지 않는다.
링커는 공유 결합(들)을 통해 PBD 약물 모이어티 D에 항체를 부착시킨다. 상기 링커는 하나 이상의 약물 모이어티 (D) 및 항체 단위 (Ab)를 연결시켜, 항체-약물 컨주게이트 (ADC)를 생성하는데 사용될 수 있는 이중기능 또는 다기능 모이어티이다. 상기 링커 (RL')는 세포 외부에서, 즉 세포외에서 안정할 수 있거나, 효소 작용, 가수분해 또는 기타 대사 조건에 의해 분리될 수 있다. 항체-약물 컨주게이트 (ADC)는 약물 모이어티 및 항체와의 결합을 위해 반응 기능성을 갖는 링커를 사용하여 통상적으로 제조될 수 있다. 항체 (Ab)의 시스테인 티올, 아민, 예를 들어 N-말단 또는 아미노산 사슬, 예를 들어 리신은 링커 또는 스페이서 시약의 작용기, PBD 약물 모이어티 (D) 또는 약물-링커 시약 (DL, D -RL) (RL 은 RL1 또는 RL2일 수 있음)과 결합을 형성할 수 있다.
ADC의 링커는 바람직하게는 ADC 분자의 응집을 방지하고, ADC를 수성 배지에서 1가 상태로 자유롭게 용해될 수 있도록 유지시킨다.
ADC의 링커는 바람직하게는 세포외에서 안정하다. 세포로의 수송 또는 전달 전에, 항체-약물 컨주게이트 (ADC)는 바람직하게는 안정하고, 손상되지 않은 채 남아 있다. 즉, 항체가 약물 모이어티에 연결된 채 유지된다. 링커는 표적 세포 외에서 안정하고, 세포 내에서 일정 효율로 분리될 수 있다. 효과적인 링커는: (i) 항체의 특이적 결합성을 유지시키고; (ii) 컨주게이트 또는 약물 모이어티의 세포내 전달을 가능하게 하며; (iii) 컨주게이트가 목표 위치로 전달되거나 수송될 때까지, 안정하고 손상되지 않은 채로 유지되고, 즉, 분리되지 않고; (iv) PBD 약물 부분의 세포독성, 세포-사멸 효과 또는 세포분열억제 효과를 유지시킨다. ADC의 안정성은 질량 분광분석, HPLC 및 분리/분석 기술 LC/MS와 같은 표준 분석 방법에 의해 측정할 수 있다.
항체 및 약물 모이어티의 공유적 부착은 링커가 2 개의 반응성 작용 기를 가져야 한다, 즉 반응 관점에서 2가성이어야 한다. 펩티드, 핵산, 약물, 독소, 항체, 합텐 및 리포터 군과 같은 2 이상의 작용성 또는 생물학적 활성 모이어티와의 결합에 유용한 2가 링커 시약이 공지되어 있으며, 방법은 그 생성 컨주게이트를 개시한다 (Hermanson, G.T. (1996) Bioconjugate Techniques; Academic Press: New York, p 234-242).
다른 실시형태에서, 상기 링커는 응집, 용해도 또는 반응성을 조절하는 기로 치환될 수 있다. 예를 들어, ADC의 제조에 사용되는 합성 경로에 따라, 술포네이트 치환기는 시약의 수용성을 증가시키고, 항체 또는 약물 모이어티와 링커 시약의 커플링 반응을 촉진시키거나 Ab와 DL -L 또는 DL과 Ab-L의 커플링 반응을 촉진시킬 수 있다.
일 실시형태에서, L-RL'은 하기와 같다:
Figure pct00047
상기 식에서, 별표는 약물 단위 (D)와의 부착 지점을 나타내고, Ab는 항체 (L)이고, L1은 링커이고, A는 L1을 항체에 연결시키는 연결 기이고, L2는 공유 결합이거나 또는 -OC(=O)-와 함께 자가 희생 링커를 형성하고, L1 또는 L2 는 분리성 링커이다.
L1은 바람직하게는 분리성 링커이고, 분리를 위한 링커 작용의 개시자로서 언급될 수 있다.
L1 및 L2의 특성은 광범위하게 변화할 수 있다. 이들 기들은 접합체가 전달되는 부위에서의 조건에 의하여 일부 영향을 받을 수 있는 이들의 특성에 기초하여 선택한다. pH (예를 들어, 불안정한 산 또는 염기), 온도 또는 방사선 (예를 들어, 광불안정 (photolabile)) 변화가 사용될 수 있다 할지라도, 효소의 작용에 의해 분리되는 기가 바람직하다. 환원 또는 산화 조건 하에서 분리될 수 있는 링커가 또한 본 발명에서 사용될 수 있다.
L1은 하나의 아미노산 또는 아미노산의 연속 서열을 포함할 수 있다. 상기 아미노산 서열은 효소적 분리에 의해 N10 위치로부터 L-RL'을 방출시키기 위한 표적 기질일 수 있다.
일 실시형태에서, L1은 효소의 작용에 의해 분리가능하다. 일 실시형태에서, 효소는 에스터라제 또는 펩티다제이다.
일 실시형태에서, L2가 존재하고 -C(=O)O-와 함께 자가-희생 링커를 형성한다. 일부 실시형태에서, L2는 효소적 분리에 의해 N10 위치로부터 L-RL'을 방출시키기 위한 기질이다.
일 실시형태에서, L1이 효소의 작용에 의해 분리가능하고 L2가 존재하는 경우, 효소는 L1 및 L2 사이의 결합을 분리시킨다.
존재하는 경우, L1 및 L2는 하기로부터 선택되는 결합으로 연결될 수 있다:
-C(=O)NH-,
-C(=O)O-,
-NHC(=O)-,
-OC(=O)-,
-OC(=O)O-,
-NHC(=O)O-,
-OC(=O)NH-, 및
-NHC(=O)NH.
L2에 연결하는 L1의 아미노기는 아미노산의 N-말단이거나 또는 예를 들어, 리신 아미노산 측쇄와 같은 아미노산 측쇄의 아미노기로부터 유래할 수 있다.
L2에 연결하는 L1의 카르복실기는 아미노산의 C-말단이거나 또는 예를 들어, 글루탐산 아미노산 측쇄와 같은 아미노산 측쇄의 카르복실기로부터 유래할 수 있다.
L2에 연결하는 L1의 히드록시기는 예를 들어 세린 아미노산 측쇄와 같은 아미노산 측쇄의 히드록시기로부터 유래할 수 있다.
용어 "아미노산 측쇄"는 (i) 천연 발생 아미노산, 예를 들어 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 및 발린; (ii) 작은 아미노산, 예를 들어 오르니틴 및 시트룰린; (iii) 비천연 아미노산, 베타 아미노산, 천연 발생 아미노산의 합성 유사체 및 유도체; 및 (iv) 모든 거울상 이성질체, 부분입체 이성질체, 이성질적으로 풍부하고, 동위 원소 표지 (예를 들어, 2H, 3H, 14C, 15N)된 보호 형태 및 그의 라세미 혼합물에서 발견되는 군을 포함한다.
일 실시형태에서, -C(=O)O- 및 L2 는 함께 하기의 기를 형성한다:
Figure pct00048
상기 식에서 별표는 약물 단위에 대한 부착 지점을 나타내고, 물결선은 L1에 대한 부착 지점을 나타내며, Y는 -N(H)-, -O-, -C(=O)N(H)- 또는 -C(=O)O-이고, n은 0 내지　3이다. 페닐렌 고리는 선택적으로 본 명세서에 기재된 바의 1개, 2개 또는 3개의 치환기로 치환된다. 일 실시형태에서, 페닐렌 기는 할로, NO2, R 또는 OR에 의해 임의 치환된다.
일 실시형태에서, Y는 NH이다.
일 실시형태에서, n은 0 또는 1이다. 바람직하게는, n은 0이다.
Y가 NH이고 n이 0인 경우, 자가-희생 기는 p-아미노벤질카르보닐 링커(PABC)로서 언급될 수 있다.
자가-희생 기는 하기 나타낸 라인(n=0의 경우)에 따라 진행되어, 원거리 위치가 활성화되는 경우, 보호된 화합물을 방출시킨다:
Figure pct00049
상기 식에서 L2는 링커의 잔여 부분의 활성화된 형태이다. 이들 기들은 보호되는 화합물로부터 활성화 위치를 분리시키는 이점을 갖는다. 상기에서 개시된 바와 같이, 페닐렌 기는 임의로 치환될 수 있다.
본 명세서에서 개시되는 일 실시형태에서, L2는 디펩티드 기를 포함할 수 있는, 본 명세서에서 개시된 바와 같은 L1이다.
다른 실시형태에서, -C(=O)O- 및 L2는 함께 하기로부터 선택된 기를 형성한다:
Figure pct00050
상기 식에서 별표, 물결선, Y 및 n은 상기 정의된 바와 같다. 각각의 페닐렌 고리는 선택적으로 본 명세서에 기재된 바의 1개, 2개 또는 3개의 치환기로 치환된다. 일 실시형태에서, Y 치환기를 갖는 페닐렌 고리는 임의로 치환되고 Y 치환기를 갖지 않는 페닐렌 고리는 비치환된다. 일 실시형태에서, Y 치환기를 갖는 페닐렌 고리는 치환되지 않고, Y 치환기를 갖지 않는 페닐렌 고리는 임의로 치환된다.
다른 실시형태에서, -C(=O)O- 및 L2 는 함께 하기로부터 선택된 기를 형성한다:
Figure pct00051
상기 식에서, 별표, 물결선, Y 및 n은 상기 정의된 바와 같고, E는 O, S 또는 NR이며, D는 N, CH, 또는 CR이고, F는 N, CH, 또는 CR이다.
일 실시형태에서, D는 N이다.
일 실시형태에서, D는 CH이다.
일 실시형태에서, E는 O 또는 S이다.
일 실시형태에서, F는 CH이다.
바람직한 실시형태에서, 링커는 카텝신 불안정 링커이다.
일 실시형태에서, L1은 디펩티드를 포함한다. 디펩티드는 -NH-X1-X2-CO- (-NH- 및 -CO-는 각각 아미노산 기 X1 및 X2의 N- 및 C-말단을 나타냄)로 표시된다. 디펩티드 내의 아미노산은 천연 아미노산의 임의의 조합일 수 있다. 링커가 카텝신 불안정 링커인 경우, 디펩티드는 카텝신-매개 분리를 위한 활성 위치일 수 있다.
또한, 카르복실 또는 아미노 측쇄 작용성, 예를 들어 각각 Glu 및 Lys를 갖는 아미노산 기의 경우, CO 및 NH는 상기 측쇄 작용성을 나타낼 수 있다.
일 실시형태에서, 디펩티드 -NH-X1-X2-CO- 내 -X1-X2- 기는 하기로부터 선택된다:
-Phe-Lys-,
-Val-Ala-,
-Val-Lys-,
-Ala-Lys-,
-Val-Cit-,
-Phe-Cit-,
-Leu-Cit-,
-Ile-Cit-,
-Phe-Arg-,
-Trp-Cit-;
상기에서, Cit는 시트룰린이다.
바람직하게는, 디펩티드 -NH-X1-X2-CO- 내 -X1-X2- 기는 하기로부터 선택된다:
-Phe-Lys-,
-Val-Ala-,
-Val-Lys-,
-Ala-Lys-,
-Val-Cit-.
가장 바람직하게는, 디펩티드 -NH-X1-X2-CO- 내 -X1-X2- 기는 -Phe-Lys-, Val-Cit 또는 -Val-Ala-이다.
본 명세서에서 참고로 인용하는 문헌[Dubowchik et　al., Bioconjugate Chemistry, 2002, 13,855-869]에 기재된 것들을 포함하여, 다른 디펩티드 조합이 사용될 수 있다.
일 실시형태에서, 아미노산 측쇄는 적절한 경우 화학적으로 보호된다. 예를 들어, 아미노산 측쇄의 아미노기 또는 카르복시기는 유도체화될 수 있다. 일 실시형태에서, 리신과 같은 측쇄 아미노산의 아미노기 NH2는 NHR 및 NRR'으로 이루어진 군에서 선택되는 유도체화 형태이다. 일 실시형태에서, 아스파르트산과 같은 측쇄 아미노산의 카르복시기 COOH는 COOR, CONH2, CONHR 및 CONRR'으로 이루어진 군에서 선택되는 유도체화 형태이다.
일 실시형태에서, 아미노산 측쇄는 적절한 경우, 화학적으로 보호된다. 측쇄 보호기는 기 RL과 관련하여 하기에서 논의되는 바와 같은 기일 수 있다. 본 발명자들은 보호된 아미노산 서열의 효소에 의한 분리를 확립하였다. 예를 들어, Boc 측쇄-보호 Lys 잔기를 포함하는 디펩티드 서열이 카텝신에 의해 분리될 수 있다는 것을 확립하였다.
아미노산 측쇄를 위한 보호기는 당업계에 잘 알려져 있으며, 노바바이오켐 카달로그(Novabiochem Catalo)에 기재되어 있다. 추가적인 보호기 전략(strategy)이 [Protective 기s in Organic Synthesis, Greene and Wuts]에 기재되어 있다.
반응성 측쇄 기를 갖는 이들 아미노산을 위한 가능한 측쇄 보호기를 하기에 나타낸다:
Arg: Z, Mtr, Tos;
Asn: Trt, Xan;
Asp: Bzl, t-Bu;
Cys: Acm, Bzl, Bzl-OMe, Bzl-Me, Trt;
Glu: Bzl, t-Bu;
Gln: Trt, Xan;
His: Boc, Dnp, Tos, Trt;
Lys: Boc, Z-Cl, Fmoc, Z;
Ser: Bzl, TBDMS, TBDPS;
Thr: Bz;
Trp: Boc;
Tyr: Bzl, Z, Z-Br.
일 실시형태에서, 측쇄 보호는 존재하는 경우, 캡핑 기로서 또는 그 일부로서 제공되는 기에 직교되도록 선택된다. 따라서, 측쇄 보호기의 제거는 캡핑 기 또는, 캡핑 기의 일부인 임의의 보호 기 작용성을 제거하지 않는다.
본 발명의 다른 실시형태에서, 선택되는 아미노산은 반응성 측쇄 작용성을 갖지 않는 것이다. 예를 들어, 아미노산은 Ala, Gly, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, 및 Val에서 선택될 수 있다. 일 실시형태에서, 디펩티드는 자가 희생 링커와 조합하여 사용된다. 자가-희생 기(들)는 -X2-에 연결될 수 있다.
자가-희생 기가 존재하는 경우, -X2-는 자가-희생 기에 직접적으로 연결된다. 바람직하게는, 기 -X2-CO-는 Y (Y는 NH임)기에 연결되어, 기 -X2-CO-NH-를 형성한다.
NH-X1-은 A에 직접 연결된다. A는 작용성 -CO-를 포함함으로써 -X1-과 함께 아미드 결합을 형성할 수 있다.
일 실시형태에서, -OC(=O)-와 함께 L1 및 L2는 기 NH-X1-X2-CO-PABC-를 포함한다. PABC 기는 N10 위치에 직접 연결된다.
바람직하게는, 자가-희생 기 및 디펩티드는 함께, 하기에 도시된, 기 -NH-Phe-Lys-CO-NH-PABC-를 형성한다:
Figure pct00052
상기 식에서, 별표는 N10 위치에 대한 부착 지점을 나타내고, 물결선은 L1의 나머지 부분에 대한 부착 지점 또는 A에 대한 부착 지점을 나타낸다. 바람직하게는, 물결선은 A에 대한 부착 지점을 나타낸다. Lys 아미노산의 측쇄는, 예를 들어 상기에서 개시된 바와 같이, Boc, Fmoc, 또는 Alloc에 의해 보호될 수 있다.
대안적으로, 자가-희생 기 및 디펩티드는 함께, 하기에 도시된, 기 -NH-Val-Ala-CO-NH-PABC-를 형성한다:
Figure pct00053
상기 식에서, 별표 및 물결선은 상기에서 정의된 바와 같다.
대안적으로, 자가-희생 기 및 디펩티드는 함께, 하기에 도시된, 기 -NH-Val-Cit-CO-NH-PABC-를 형성한다:
Figure pct00054
상기 식에서, 별표 및 물결선은 상기에서 정의된 바와 같다.
일 실시형태에서, A는 공유 결합이다. 따라서, L1 및 항체는 직접 연결된다. 예를 들어, L1이 연속 아미노산 서열을 포함하는 경우, 서열의 N-말단은 항체에 직접 연결될 수 있다.
따라서, A가 공유 결합인 경우, 항체와 L1 사이의 연결은 하기로부터 선택될 수 있다:
-C(=O)NH-,
-C(=O)O-,
-NHC(=O)-,
-OC(=O)-,
-OC(=O)O-,
-NHC(=O)O-,
-OC(=O)NH-,
-NHC(=O)NH-,
-C(=O)NHC(=O)-,
-S-,
-S-S-,
-CH2C(=O)-, 및
=N-NH-.
항체에 연결되는 L1의 아미노기는 아미노산의 N-말단일 수 있거나 또는 아미노산 측쇄, 예를 들어 리신 아미노산 측쇄의 아미노기로부터 유도될 수 있다. 항체에 연결되는 L1의 카르복시기는 아미노산의 C-말단일 수 있거나 또는 아미노산 측쇄, 예를 들어 글루탐산 아미노산 측쇄의 카르복시기로부터 유도될 수 있다. L1의 하이드록시기는 아미노산 측쇄, 예를 들어 세린 아미노산 측쇄의 하이드록시기로부터 유도될 수 있다. L1의 티올기는 아미노산 측쇄, 예를 들어 세린 아미노산 측쇄의 티올기로부터 유도될 수 있다.
L1의 아미노, 카르복시기, 하이드록시기 및 티올기와 관련된 상기 설명은 또한 항체의 경우에도 적용된다.
일 실시형태에서, L2는 -OC(=O)- 와 함께 하기와 같이 제시된다:
Figure pct00055
상기 식에서, 별표는 N10 위치에 대한 부착 지점을 나타내고, 물결선은 L1의 부착 지점을 나타내고, n은 0 내지 3이고, Y는 공유 결합이거나 작용 기이고, E는, 예를 들어 효소 작용 또는 빛에 의한 활성화되어, 자가 희생 단위를 생성시키는 활성 기이다. 페닐렌 고리는 본 명세서에서 개시된 바와 같이, 1, 2 또는 3 개의 치환기에 의해 임의로 추가 치환된다. 일 실시형태에서, 페닐렌 기는 할로, NO2, R 또는 OR에 의해 임의로 추가 치환된다. 바람직하게는 n은 0 또는 1이거나, 가장 바람직하게는 0이다.
E는, 기가, 예를 들어 빛 또는 효소의 작용에 의한 활성에 민감할 수 있도록 선택된다. E는 -NO2 또는 글루코론산일 수 있다. 전자의 경우, 나이트로리덕타아제의 작용에 민감할 수 있고, 후자의 경우에는, β-글루쿠로니다아제의 작용에 민감할 수 있다.
이 실시형태에서, 하기에서 제시된 바와 같이, 화살표 방향을 따라 진행되는 것으로서 (n=0), E가 활성화되는 경우, 자가-희생 링커는 보호된 화합물을 방출시킨다:
Figure pct00056
상기 식에서, 별표는 N10 위치에 대한 부착 지점을 나타내고, E_는 E의 활성화된 형태이고, Y는 상기에서 개시된 바와 같다. 이들 기는 보호되는 화합물로부터 활성화 위치를 분리시키는 이점을 갖는다. 상기에서 개시된 바와 같이, 페닐렌 기는 임의로 추가 치환될 수 있다.
기 Y는 L1에 공유 결합될 수 있다.
기 Y는 하기에서 선택되는 작용 기일 수 있다:
-C(=O)-
-NH-
-O-
-C(=O)NH-,
-C(=O)O-,
-NHC(=O)-,
-OC(=O)-,
-OC(=O)O-,
-NHC(=O)O-,
-OC(=O)NH-,
-NHC(=O)NH-,
-NHC(=O)NH,
-C(=O)NHC(=O)-, 및
-S-.
L1이 디펩티드인 경우, Y는 -NH- 또는 -C(=O)-이어서, L1 및 Y 사이에 아미드 결합이 형성되는 것이 바람직하다. 이 실시형태에서, 디펩티드 서열은 효소 활성을 위한 기질이 요구되지 않는다.
다른 실시형태에서, A는 스페이서 기이다. 따라서, L1 및 항체는 간접적으로 연결된다.
L1 및 A는 하기로부터 선택되는 결합에 의해 연결될 수 있다:
-C(=O)NH-,
-C(=O)O-,
-NHC(=O)-,
-OC(=O)-,
-OC(=O)O-,
-NHC(=O)O-,
-OC(=O)NH-, 및
-NHC(=O)NH-.
일 실시형태에서, A1 기는 하기 식이다:
Figure pct00057
상기 식에서, 별표는 L1에 대한 부착 지점을 나타내고, 물결선은 항체에 대한 부착 지점을 나타내며, n은 0 내지 6이다. 일 실시형태에서,n은 5이다.
일 실시형태에서, A는 하기 식이다:
Figure pct00058
상기 식에서, 별표는 L1에 대한 부착 지점을 나타내고, 물결선은 항체에 대한 부착 지점을 나타내며, n은 0 내지 6이다. 일 실시형태에서,n은 5이다.
일 실시형태에서, A1 기는 하기 식이다:
Figure pct00059
상기 식에서, 별표는 L1에 대한 부착 지점을 나타내고, 물결선은 항체에 대한 부착 지점을 나타내며, n은 0 또는 1이고, m은 0 내지 30이다. 바람직한 실시형태에서, n은 1이고 m은 0 내지 10, 1 내지 8, 바람직하게는 4 내지 8, 가장 바람직하게는 4 또는　8이다. 다른 실시형태에서, m은 10 내지 30이고, 바람직하게는 20 내지 30이다. 대안적으로, m은 0 내지 50이다. 이 실시형태에서, m은 바람직하게는 10 내지 40이고, n은 1이다.
일 실시형태에서, A는 하기 식이다:
Figure pct00060
상기 식에서, 별표는 L1에 대한 부착 지점을 나타내고, 물결선은 항체에 대한 부착 지점을 나타내며, n은 0 또는 1이고, m은 0 내지 30이다. 바람직한 실시형태에서, n은 1이고 m은 0 내지 10, 1 내지 8, 바람직하게는 4 내지 8, 가장 바람직하게는 4 또는　8이다. 다른 실시형태에서, m은 10 내지 30이고, 바람직하게는 20 내지 30이다. 대안적으로, m은 0 내지 50이다. 이 실시형태에서, m은 바람직하게는 10 내지 40이고, n은 1이다.
일 실시형태에서, 항체와 A 사이의 연결은 A의 말레이미드 기 및 항체의 티올 잔기를 통해 이루어진다.
일 실시형태에서, 항체 및 A 사이의 연결은 하기와 같다:
Figure pct00061
상기 식에서, 별표는 A의 나머지 부분에 대한 부착 지점을 나타내고, 물결선은 항체의 나머지 부분에 대한 부착 지점을 나타낸다. 이 실시형태에서, S 원자는 전형적으로 항체로부터 유래한다.
상기 각각의 실시형태에서, 대안적인 작용성이 하기에 나타낸 말레이미드-유래 기 대신에 사용될 수 있다:
Figure pct00062
상기 식에서, 물결선은 이전과 같이 항체에 대한 부착 지점을 나타내고, 별표는 A 기의 나머지 부분에 대한 결합을 나타낸다.
일 실시형태에서, 말레이미드-유래 기는 하기 기로 대체된다:
Figure pct00063
상기 식에서, 물결선은 항체에 대한 부착 지점을 나타내고, 별표는 A 기의 나머지 부분에 대한 결합을 나타낸다.
일 실시형태에서, 말레이미드-유래 기는, 선택적으로 항체와 함께, 하기로부터 선택되는 기로 대체된다:
-C(=O)NH-,
-C(=O)O-,
-NHC(=O)-,
-OC(=O)-,
-OC(=O)O-,
-NHC(=O)O-,
-OC(=O)NH-,
-NHC(=O)NH-,
-NHC(=O)NH,
-C(=O)NHC(=O)-,
-S-,
-S-S-,
-CH2C(=O)-
-C(=O)CH2-,
=N-NH-, 및
-NH-N=.
일 실시형태에서, 말레이미드-유래 기는, 선택적으로 항체와 함께, 하기로부터 선택되는 기로 대체된다:
Figure pct00064
상기 식에서, 물결선은 항체에 대한 부착 지점 또는 A 기의 나머지 부분에 대한 결합을 나타내고, 별표는 항체에 대한 다른 부착 지점 또는 A 기의 나머지 부분에 대한 결합을 나타낸다.
항체에 L1을 연결하기 위한 적절한 다른 기는 WO　2005/082023에 기재되어 있다.
일 실시형태에서, 연결하는 A 기가 존재하고, 개시자 (trigger) L1은 존재하며 자가-희생 링커 L2는 존재하지 않는다. 따라서, L1 및 약물 단위가 결합을 통해 직접적으로 연결된다. 동등하게 이 실시형태에서, L2는 결합이다.
화학식II의 DL 일때 특히 관련이 있을 수 있다.
L1 및 D는 하기로부터 선택되는 결합으로 연결될 수 있다:
-C(=O)NH<,
-C(=O)O-,
-NHC(=O)-,
-OC(=O)-,
-OC(=O)O-,
-NHC(=O)O-,
-OC(=O)N<, 및
-NHC(=O)N<,
상기 식에서, N< 또는 O-는 D의 일부이다.
일 실시형태에서, L1 및 D는 바람직하게는 하기로부터 선택되는 결합으로 연결된다:
-C(=O)N<, 및
-NHC(=O)-.
일 실시형태에서, L1은 디펩티드를 포함하고 디펩티드의 일 말단은 D에 결합된다. 상기에서 기재한 바와 같이, 디펩티드 내 아미노산은 천연 아미노산 및 비-천연 아미노산의 임의의 조합일 수 있다. 일부의 실시형태에서, 디펩티드는 천연 아미노산을 포함한다. 링커가 카텝신 불안정성 링커인 경우, 디펩티드는 카텝신-매개 분리을 위한 작용 부위이다. 이경우 디펩티드는 카텝신을 위한 인식 부위이다.
일 실시형태에서, 디펩티드 -NH-X1-X2-CO- 내 -X1-X2- 기는 하기로부터 선택된다:
-Phe-Lys-,
-Val-Ala-,
-Val-Lys-,
-Ala-Lys-,
-Val-Cit-,
-Phe-Cit-,
-Leu-Cit-,
-Ile-Cit-,
-Phe-Arg-, 및
-Trp-Cit-;
상기에서, Cit는 시트룰린이다. 이러한 디펩티드에서, -NH-는 X1의 아미노기이고, CO는 X2의 카르보닐기이다.
바람직하게는, 디펩티드 -NH-X1-X2-CO- 내 -X1-X2- 기는 하기로부터 선택된다:
-Phe-Lys-,
-Val-Ala-,
-Val-Lys-,
-Ala-Lys-, 및
-Val-Cit-.
가장 바람직하게는, 디펩티드 -NH-X1-X2-CO- 내 -X1-X2- 기는 -Phe-Lys- 또는 -Val-Ala-이다.
관심있는 다른 디펩티드 조합은 하기를 포함한다:
-Gly-Gly-,
-Pro-Pro-, 및
-Val-Glu-.
다른 디펩티드 조합은 상기 기재된 것들을 포함하여 사용될 수 있다.
일 실시형태에서, L1-D는 하기 식이다:
Figure pct00065
상기 식에서, -NH-X1-X2-CO는 디펩티드이고, -N< 는 약물 단위의 일부이며, 별표는 약물 단위의 나머지에 대한 부착 지점을 나타내고, 물결선은 L1의 나머지 부분에 대한 부착 지점 또는 A에 대한 부착 지점을 나타낸다. 바람직하게는 물결선은 A에 대한 부착 지점을 나타낸다.
일 실시형태에서, 디펩티드는 발린-알라닌이고 L1-D는 하기 식이다:
Figure pct00066
상기 식에서, 별표, -N< 및 물결선은 상기에서 정의한 바와 같다.
일 실시형태에서, 디펩티드는 페닐알라닌-리신이고 L1-D는 하기 식이다:
Figure pct00067
상기 식에서, 별표, -N< 및 물결선은 상기에서 정의한 바와 같다.
일 실시형태에서, 디펩티드는 발린-시트룰린이다.
일 실시형태에서, A-L1 기는 하기 식이다:
Figure pct00068
상기 식에서, 별표는 L2 또는 D에 대한 부착 지점을 나타내고, 물결선은 리간드 단위에 대한 부착 지점을 나타내며, n은 0 내지 6이다. 일 실시형태에서, n은 5이다.
일 실시형태에서, A-L1 기는 하기 식이다:
Figure pct00069
상기 식에서, 별표는 L2 또는 D에 대한 부착 지점을 나타내고, 물결선은 리간드 단위에 대한 부착 지점을 나타내며, n은 0 내지 6이다. 일 실시형태에서, n은 5이다.
일 실시형태에서, A-L1 기는 하기 식이다:
Figure pct00070
상기 식에서, 별표는 L2 또는 D에 대한 부착 지점을 나타내고, 물결선은 리간드 단위에 대한 부착 지점을 나타내며, n은 0 또는 1이고, m은 0 내지 30이다. 바람직한 실시형태에서, n은 1이고 m은 0 내지 10, 1 내지 8, 바람직하게는 4 내지 8, 가장 바람직하게는 4 또는　8이다.
일 실시형태에서, A1-L1 기는 하기 식이다:
Figure pct00071
상기 식에서, 별표는 L2 또는 D에 대한 부착 지점을 나타내고, 물결선은 리간드 단위에 대한 부착 지점을 나타내며, n은 0 또는 1이고, m은 0 내지 30이다. 바람직한 실시형태에서, n은 1이고 m은 0 내지 10, 1 내지 7, 바람직하게는 3 내지 7, 가장 바람직하게는 3 또는　7이다.
일 실시형태에서, A-L1 기는 하기 식이다:
Figure pct00072
상기 식에서, 별표는 L2 또는 D에 대한 부착 지점을 나타내고, 물결선은 리간드 단위에 대한 부착 지점을 나타내며, n은 0 내지 6이다. 일 실시형태에서, n은 5이다.
일 실시형태에서, A-L1 기는 하기 식이다:
Figure pct00073
상기 식에서, 별표는 L2 또는 D에 대한 부착 지점을 나타내고, 물결선은 리간드 단위에 대한 부착 지점을 나타내며, n은 0 내지 6이다. 일 실시형태에서, n은 5이다.
일 실시형태에서, A-L1 기는 하기 식이다:
Figure pct00074
상기 식에서, 별표는 L2 또는 D에 대한 부착 지점을 나타내고, 물결선은 리간드 단위에 대한 부착 지점을 나타내며, n은 0 또는 1이고, m은 0 내지 30이다. 바람직한 실시형태에서, n은 1이고 m은 0 내지 10, 1 내지 8, 바람직하게는 4 내지 8, 가장 바람직하게는 4 또는　8이다.
일 실시형태에서, A-L1 기는 하기 식이다:
Figure pct00075
상기 식에서, 별표는 L2 또는 D에 대한 부착 지점을 나타내고, 물결선은 리간드 단위에 대한 부착 지점을 나타내며, n은 0 또는 1이고, m은 0 내지 30이다. 바람직한 실시형태에서, n은 1이고 m은 0 내지 10, 1 내지 8, 바람직하게는 4 내지 8, 가장 바람직하게는 4 또는　8이다.
일 실시형태에서, A-L1 기는 하기 식이다:
Figure pct00076
상기 식에서, 별표는 L2 또는 D에 대한 부착 지점을 나타내고, S는 리간드 단위의 황(sulfur)기이며, 물결선은 리간드 단위의 나머지에 대한 부착 지점을 나타내며, n은 0 내지 6이다. 일 실시형태에서, n은 5이다.
일 실시형태에서, A-L1 기는 하기 식이다:
Figure pct00077
상기 식에서, 별표는 L2 또는 D에 대한 부착 지점을 나타내고, S는 리간드 단위의 황기이며, 물결선은 리간드 단위의 나머지에 대한 부착 지점을 나타내며, n은 0 내지 6이다. 일 실시형태에서, n은 5이다.
일 실시형태에서, A1-L1 기는 하기 식이다:
Figure pct00078
상기 식에서, 별표는 L2 또는 D에 대한 부착 지점을 나타내고, S는 리간드 단위의 황기이며, 물결선은 리간드 단위의 나머지에 대한 부착 지점을 나타내며, n은 0 또는 1이고, m은 0 내지 30이다. 바람직한 실시형태에서, n은 1이고 m은 0 내지 10, 1 내지 8, 바람직하게는 4 내지 8, 가장 바람직하게는 4 또는　8이다.
일 실시형태에서, A1-L1 기는 하기 식이다:
Figure pct00079
상기 식에서, 별표는 L2 또는 D에 대한 부착 지점을 나타내고, 물결선은 리간드 단위에 대한 부착 지점을 나타내며, n은 0 또는 1이고, m은 0 내지 30이다. 바람직한 실시형태에서, n은 1이고 m은 0 내지 10, 1 내지 7, 바람직하게는 4 내지 8, 가장 바람직하게는 4 또는　8이다.
일 실시형태에서, A1-L1 기는 하기 식이다:
Figure pct00080
상기 식에서, 별표는 L2 또는 D에 대한 부착 지점을 나타내고, 물결선은 리간드 단위의 나머지에 대한 부착 지점을 나타내며, n은 0 내지 6이다. 일 실시형태에서, n은 5이다.
일 실시형태에서, A1-L1 기는 하기 식이다:
Figure pct00081
상기 식에서, 별표는 L2 또는 D에 대한 부착 지점을 나타내고, 물결선은 리간드 단위의 나머지에 대한 부착 지점을 나타내며, n은 0 내지 6이다. 일 실시형태에서, n은 5이다.
일 실시형태에서, A1-L1 기는 하기 식이다:
Figure pct00082
상기 식에서, 별표는 L2 또는 D에 대한 부착 지점을 나타내고, 물결선은 리간드 단위의 나머지에 대한 부착 지점을 나타내며, n은 0 또는 1이고, m은 0 내지 30이다. 바람직한 실시형태에서, n은 1이고 m은 0 내지 10, 1 내지 8, 바람직하게는 4 내지 8, 가장 바람직하게는 4 또는　8이다.
일 실시형태에서, A1-L1 기는 하기 식이다:
Figure pct00083
상기 식에서, 별표는 L2 또는 D에 대한 부착 지점을 나타내고, 물결선은 리간드 단위의 나머지에 대한 부착 지점을 나타내며, n은 0 또는 1이고, m은 0 내지 30이다. 바람직한 실시형태에서,n은 1이고 m은 0 내지 10, 1 내지 8, 바람직하게는 4 내지 8, 가장 바람직하게는 4 또는　8이다.라라
기 RL'은 기 RL에서 유도된다. 기 RL은 RL의 작용 기와 항체의 연결에 의해 기 RL'에 연결될 수 있다. RL을 RL'으로 전환시키기 위해 다른 단계를 선택할 수 있다. 이들 단계들은, 존재하는 경우, 보호 기의 제거 또는 적절한 작용 기의 설정 단계를 포함할 수 있다.
R L
링커는 하나 이상의 아미노산 단위를 포함하는 프로테아제-분리성 펩티딕 모이어티를 포함할 수 있다. 펩티드 링커 시약은 자동 합성기, 예를 들어 Rainin Symphony Peptide Synthesizer (Protein Technologies, Inc., Tucson, AZ), 또는 모델 433 (Applied Biosystems, Foster City, CA)에서, t-BOC 화학 (Geiser et al "Automation of solid-phase peptide synthesis" in Macromolecular Sequencing and Synthesis, Alan R. Liss, Inc., 1988, pp. 199-218) 및 Fmoc/HBTU 화학 (Fields, G. and Noble, R. (1990) "Solid phase peptide synthesis utilizing 9-fluoroenylmethoxycarbonyl amino acids", Int. J. Peptide Protein Res. 35:161-214)를 비롯한, 펩티드 화학 분야에서 잘 공지되어 있는 고체상 또는 액체상 합성 방법 (E. Schroder and K. Lubke, The Peptides, volume 1, pp 76-136 (1965) Academic Press)에 의해 제조될 수 있다.
예시적 아미노산 링커는 디펩티드, 트리펩티드, 테트라펩티드 또는 펜타펩티드를 포함한다. 예시적 디펩티드에는 발린-시트룰린 (vc 또는 val-cit), 알라닌-페닐알라닌 (af 또는 ala-phe)이 포함된다. 예시적 트리펩티드에는 글리신-발린-시트룰린 (gly-val-cit) 및 글리신-글리신-글리신 (gly-gly-gly)이 포함된다. 아미노산 링커 성분을 포함하는 아미노산 잔기에는 천연 발생의 것뿐만 아니라, 작은 아미노산 및 비천연 발생 아미노산 유사체, 예를 들어 시트룰린이 포함된다. 아미노산 링커 성분은 특정 효소, 예를 들어 종양-관련 프로테아제, 카텝신 B, C 및 D, 또는 플라스민 프로테아제에 의한 효소적 분리에 대한 선택성으로 설계되고, 최적화될 수 있다.
아미노산 측쇄에는 천연 발생의 것뿐만 아니라, 작은 아미노산 및 비천연 발생 아미노산 유사체, 예를 들어 시트룰린이 포함된다. 아미노산 측쇄에는 수소, 메틸, 이소프로필, 이소부틸, sec-부틸, 벤질, p-하이드록시벤질, -CH2OH, -CH(OH)CH3, -CH2CH2SCH3, -CH2CONH2, -CH2COOH, -CH2CH2CONH2, -CH2CH2COOH, -(CH2)3NHC(=NH)NH2, -(CH2)3NH2, -(CH2)3NHCOCH3, -(CH2)3NHCHO, -(CH2)4NHC(=NH)NH2, -(CH2)4NH2, -(CH2)4NHCOCH3, -(CH2)4NHCHO, -(CH2)3NHCONH2, -(CH2)4NHCONH2, -CH2CH2CH(OH)CH2NH2, 2-피리딜메틸-, 3-피리딜메틸-, 4-피리딜메틸-, 페닐, 시클로헥실뿐만 아니라, 하기 구조의 것이 포함된다:
Figure pct00084
아미노산 측쇄가 수소 이외의 것 (글리신)을 포함하는 경우, 아미노산 측쇄에 부착되는 탄소 원자는 키랄성이다. 아미노산 측쇄에 부착되는 탄소 원자 각각은 (S) 또는 (R) 배열, 또는 라세미 혼합물에 독립적으로 존재한다. 따라서, 약물-링커 시약은 거울상 이성질체적으로 순수하거나, 라세미이거나 부분입체 이성질체일 수 있다.
예시적 실시형태에서, 아미노산 측쇄는 알라닌, 2-아미노-2-시클로헥실아세트산, 2-아미노-2-페닐아세트산, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 노르류신, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신, 발린, g-아미노부티르산, a,a-디메틸 g-아미노부티르산, b,b-디메틸 g-아미노부티르산, 오르니틴, 및 시트룰린 (Cit)을 비롯하여, 천연 및 비천연 아미노산에서 선택된다.
파라-아미노벤질카르바모일 (PAB) 자가 희생 스페이서를 갖는, 항체와의 컨주게이션을 위한 링커-PBD 약물 모이어티 중간체의 제조에 유용한 예시적 발린-시트룰린 (val-cit 또는 vc) 디펩티드 링커 시약은 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00085

상기 식에서, Q는 C1-C8 알킬, -O-(C1-C8 알킬), -할로겐, -NO2 또는 -CN이고; m은 0-4 범위의 정수이다.
p-아미노벤질 기를 갖는 예시적 phe-lys(Mtr) 디펩티드 링커 시약은 문헌 [Dubowchik, et al. (1997) Tetrahedron Letters, 38:5257-60]에 따라 제조할 수 있으며, 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00086

상기 식에서, Mtr은 모노-4-메톡시트리틸이고, Q는 C1-C8 알킬, -O-(C1-C8 알킬), -할로겐, -NO2 또는 -CN이고; m은 0-4 범위의 정수이다.
"자가 희생 링커" PAB (파라-아미노벤질옥시카르보닐)는 항체 약물 컨주게이트에서 항체에 약물 모이어티를 부착시킨다 (Carl et al (1981) J. Med. Chem. 24:479-480; Chakravarty et al (1983) J. Med. Chem. 26:638-644; US 6214345; US20030130189; US20030096743; US6759509; US20040052793; US6218519; US6835807; US6268488; US20040018194; WO98/13059; US20040052793; US6677435; US5621002; US20040121940; WO2004/032828). PAB 옆의 자가 희생 스페이서의 기타 예에는, 이로 제한하는 것은 아니나, (i) PAB 기와 전자적으로 유사한 방향족 화합물, 예를 들어 2-아미노이미다졸-5-메탄올 유도체 (Hay et al. (1999) Bioorg. Med. Chem. Lett. 9:2237), 티아졸 (US 7375078), 다중, 연장 PAB 단위 (de Groot et al (2001) J. Org. Chem. 66:8815-8830); 및 오르쏘 또는 파라-아미노벤질아세탈; 및 (ii) 동종 스티릴 PAB 유사체 (US 7223837)가 포함된다. 치환 및 비치환된 4-아미노부티르산 아미드 (Rodrigues et al (1995) Chemistry Biology 2:223), 적절히 치환된 바이시클로[2.2.1] 및 바이시클로[2.2.2] 고리 시스템 (Storm et al (1972) J. Amer. Chem. Soc. 94:5815) 및 2-아미노페닐프로피온산 아미드 (Amsberry, et al (1990) J. Org. Chem. 55:5867)와 같이, 아미드 결합 가수분해에서 고리화되는 스페이서를 사용할 수 있다. 글리신에서 치환된 아민-함유 약물의 제거가 또한 ADC에 유용한 자가 희생 스페이서의 예이다 (Kingsbury et al (1984) J. Med. Chem. 27:1447).
일 실시형태에서, 발린-시트룰린 디펩티드 PAB 유사체 시약은 2,6 디메틸 페닐 기를 가지고, 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00087
본 발명의 항체 약물 컨주게이트에 유용한 링커 시약에는 이로 제한하는 것은 아니나,: BMPEO, BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, 술포-EMCS, 술포-GMBS, 술포-KMUS, 술포-MBS, 술포-SIAB, 술포-SMCC, 및 술포-SMPB, 및 SVSB (숙신이미딜-(4-비닐술폰)벤조에이트), 및 비스-말레이미드 시약: DTME, BMB, BMDB, BMH, BMOE, 1,8-비스-말레이미도디에틸렌글리콜 (BM(PEO)2), 및 1,11-비스-말레이미도트리에틸렌글리콜 (BM(PEO)3) (Pierce Biotechnology, Inc., ThermoScientific, Rockford, IL, 및 기타 시약 공급자로부터 상업적으로 구할 수 있음)이 포함된다. 비스-말레이미드 시약은 순차적으로 또는 동시에, 티올-함유 약물 모이어티, 표지 또는 링커 중간체에 항체의 시스테인 잔지의 유리 티올 기를 부착시킨다. 항체, PBD 약물 모이어티 또는 링커 중간체의 티올기와 반응하는 것으로서, 말레이미드 외의 기타 작용 기에는 요오드아세트아미드, 브로모아세트아미드, 비닐 피리딘, 디술피드, 피리딜 디술피드, 이소시아네이트 및 이소티오시아네이트가 포함된다.
Figure pct00088
링커 시약의 기타 실시형태에는: N-숙신이미딜-4-(2-피리딜티오)펜타노에이트 (SPP), N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트 (SPDP, Carlsson et al (1978) Biochem. J. 173:723-737), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실레이트 (SMCC), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이중기능 유도체 (예를 들어, 디메틸 아디피미데이트 HCl), 활성 에스테르 (예를 들어, 디숙신이미딜 수베레이트), 알데하이드 (예를 들어, 글루타르알데하이드), 비스-아지도 화합물 (예를 들어, 비스 (p-아지도벤조일) 헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예를 들어, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예를 들어, 톨루엔 2,6-디이소시아네이트) 및 비스-활성 플루오린 화합물 (예를 들어, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)이 있다. 또한, 유용한 링커 시약은 기타 상업적 공급원, 예를 들어, Molecular Biosciences Inc.(Boulder, CO)를 통해 수득하거나 또는 문헌 [Toki et al (2002) J. Org. Chem. 67:1866-1872; US 6214345; WO 02/088172; US 2003130189; US2003096743; WO 03/026577; WO 03/043583; 및 WO 04/032828]에 개시된 과정에 따라 합성할 수 있다.
링커는 분지, 다기능 링커 모이어티를 통해 항체에의 하나 이상의 약물 모이어티의 공유적 부착을 위한 수지형 링커 (dendritic type linker)일 수 있다 (US 2006/116422; US 2005/271615; de Groot et al (2003) Angew. Chem. Int. Ed. 42:4490-4494; Amir et al (2003) Angew. Chem. Int. Ed. 42:4494-4499; Shamis et al (2004) J. Am. Chem. Soc. 126:1726-1731; Sun et al (2002) Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 12:2213-2215; Sun et al (2003) Bioorganic & Medicinal Chemistry 11:1761-1768; King et al (2002) Tetrahedron Letters 43:1987-1990). 수지상 링커는 ADC의 효능과 관련된 것으로서, 약물 대 항체의 몰비, 즉 부하율을 증가시킬 수 있다. 따라서, 항체가 단지 하나의 반응성 시스테인 티올 기를 보유한 경우, 약물 모이어티 부분은 수지상 또는 분지형 링커를 통해 부착될 수 있다.
수지형 링커의 일례의 실시형태는 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00089
상기 식에서, 별표는 PBD 모이어티의 N10 위치에 대한 부착 지점을 나타낸다.
Rc, 캡핑 기
본 발명의 제1 측면의 컨주게이트는 N10 위치에서 캡핑 기 RC를 가질 수 있다. 화합물 E는 캡핑 기 RC를 가질 수 있다.
일 실시형태에서, 상기 컨주게이트가 화학식 (A)의 각각의 단량체에 의한 이량체인 경우, 단량체 단위 중 하나의 기 R10은 캡핑 기 RC이거나 기 R10이다.
일 실시형태에서, 상기 컨주게이트가 화학식 (A)의 각각의 단량체에 의한 이량체인 경우, 단량체 단위 중 하나의 기 R10은 캡핑 기 RC이다.
일 실시형태에서, 화합물 E가 화학식 (E)의 각각의 단량체에 의한 이량체인 경우, 단량체 단위 중 하나의 기 RL은 캡핑 기 RC이거나 항체와의 연결을 위한 링커이다.
일 실시형태에서, 화합물 E가 화학식 (E)의 각각의 단량체에 의한 이량체인 경우, 단량체 단위 중 하나의 기 RL은 캡핑 기 RC이다.
기 RC는 PBD 모이어티의 N10 위치로부터 제거되어, N10-C11 이민 결합, 카르비놀아민, 치환된 카르비놀아민 (QR11은 OSO3M임), 비술피트 부가체, 티오카르비올아민, 치환된 티오카르비놀아민 또는 치환된 카르비날아민이 남는다.
일 실시형태에서, RC는 제거되어, N10-C11 이민 결합, 카르비놀아민, 치환된 카르비놀아민 또는 (QR11은 OSO3M임), 비술피트 부가체가 남게 되는 보호 기일 수 있다. 일 실시형태에서, RC는 제거되어, N10-C11 이민 결합이 남게 되는 보호 기이다.
기 Rc는 기 R10의 제거에 요구되는 바와 동일한 조건 하에서 제거되어, 예를 들어 N10-C11 이민 결합, 카르비놀아민 등을 생성시킬 수 있다. 캡핑 기는 N10 위치에서 의도된 작용성을 위해 보호 기로서 작용한다. 캡핑 기는 항체에 대해 반응성이 아니어야 한다. 예를 들어, RC는 RL과 동일하지 않다.
캡핑 기를 갖는 화합물은 이민 단량체를 갖는 이량체의 합성에서 중간체로서 사용할 수 있다. 대안적으로, 캡핑 기를 갖는 화합물은, 캡핑 기가 표적 위치에서 제거되어, 이민, 카르비놀아민, 치환된 카르비놀아민 등을 생성시키는 경우, 컨주게이트로서 사용될 수 있다. 따라서, 이 실시형태에서, 캡핑 기는 본 발명자들의 이전 출원 WO 00/12507에서 정의된 바와 같이, 치료적으로 제거가능한 질소 보호 기로서 언급될 수 있다.
일 실시형태에서, 기 RC는 기 R10의 링커 RL을 분리시키는 조건 하에서 제거가능하다. 따라서, 일 실시형태에서, 캡핑 기는 효소의 작용에 의해 분리될 수 있다.
대안적 실시형태에서, 캡핑 기는 항체와 링커 RL의 연결 전에 제거될 수 있다. 이 실시형태에서, 캡핑 기는 링커 RL을 분리시키지 않는 조건 하에서 제거될 수 있다.
화합물이 항체와의 연결을 형성하기 위한 작용 기 G1을 포함하는 경우, 캡핑 기는 G1의 비차폐 또는 첨가 전에 제거될 수 있다.
캡핑 기는 이량체의 단량체 단위 중 하나만이 항체에 연결되도록 하기 위한 보호 기 전략의 일부로서 사용할 수 있다.
캡핑 기는 N10-C11 이민 결합의 차폐로서 사용할 수 있다. 캡핑 기는 이민 작용성이 화합물에 요구되는 시점에 제거될 수 있다. 또한 캡핑 기는 상기에서 개시된 바와 같이, 카르비놀아민, 치환된 카르비놀아민 및 비술피트 부가체의 차폐이다.
RC는 N10 보호 기, 예를 들어 본 발명자들의 이전 출원 WO 00/12507에 개시된 기들일 수 있다. 일 실시형태에서, RC는 본 발명자들의 이전 출원 WO 00/12507에 개시된 바와 같은 치료적으로 제거가능한 질소 보호 기이다.
일 실시형태에서, RC는 카르바메이트 보호 기이다.
일 실시형태에서, 카르바메이트 보호 기는 Alloc, Fmoc, Boc, Troc, Teoc, Psec, Cbz 및 PNZ에서 선택된다.
임의적으로, 카르바메이트 보호 기는 Moc에서 추가로 선택된다.
일 실시형태에서, RC는 항체와의 연결을 위한 작용 기가 결핍된 링커 기 RL이다.
이 출원은 특히 카르바메이트인 RC 기와 관련된 것이다.
일 실시형태에서, RC는 하기의 기이다:
Figure pct00090
상기 식에서, 별표는 N10 위치에 대한 부착 지점을 나타내고, G2는 종결 기이고, L3은 공유 결합이거나, 분리가능한 링커 L1이고, L2는 공유 결합이거나 또는 OC(=O)와 함께 자가 희생 링커를 형성한다.
여기서, L3 및 L2는 둘 모두 공유 결합이고, G2 및 OC(=O)는 함께, 상기에서 정의된 바와 같은 카르바메이트 보호 기를 형성한다.
L1은 상기에서 R10과 관련하여 정의된 바와 같다.
L2는 상기에서 R10과 관련하여 정의된 바와 같다.
잘 알려진 보호 기를 토대로 한 것을 비롯하여, 다양한 종결 기가 하기에서 개시된다.
일 실시형태에서 L3은 분리성 링커 L1이고, L2는 OC(=O)와 함께 자가 희생 링커를 형성한다. 이 실시형태에서, G2는 Ac (아세틸) 또는 Moc, 또는 Alloc, Fmoc, Boc, Troc, Teoc, Psec, Cbz 및 PNZ에서 선택되는 카르바메이트 보호 기이다:
임의적으로, 카르바메이트 보호 기는 Moc에서 추가로 선택된다.
다른 실시형태에서, G2는 아실 기 -C(=O)G3이고, G3은 알킬 (시클로알킬, 알케닐 및 알키닐 포함), 헤테로알킬, 헤테로시클릴 및 아릴 (헤테로아릴 및 카르보아릴 포함)에서 선택된다. 이들 기들은 임의로 치환될 수 있다. 아실 기는 적절한 경우, L3 또는 L2의 아미노 기와 함께 아미드 결합을 형성할 수 있다. 아실 기는 적절한 경우 L3 또는 L2의 하이드록시 기와 함께 에스테르 결합을 형성할 수 있다.
일 실시형태에서, G3은 헤테로알킬이다. 헤테로알킬 기는 폴리에틸렌 글리콜을 포함할 수 있다. 헤테로알킬 기는 아실 기에 인접한 이종원자, 예를 들어 O 또는 N을 가질 수 있고, 이에 의해, 적절한 경우, 기 L3 또는 L2에 존재하는 이종원자와 함께 카르바메이트 또는 카르보네이트 기를 형성할 수 있다.
일 실시형태에서, G3은 NH2, NHR 및 NRR'에서 선택된다. 바람직하게는, G3은 NRR'이다.
일 실시형태에서 G2는 하기 기이다:
Figure pct00091
상기 식에서, 별표는 L3에 대한 부착 지점을 나타내고, n은 0 내지 6이고, G4는 OH, OR, SH, SR, COOR, CONH2, CONHR, CONRR', NH2, NHR, NRR', NO2, 및 할로에서 선택된다. 기 OH, SH, NH2 및 NHR은 보호된다. 일 실시형태에서, n은 1 내지 6이고, 바람직하게는 n은 5이다. 일 실시형태에서, G4는 OR, SR, COOR, CONH2, CONHR, CONRR', 및 NRR'이다. 일 실시형태에서, G4는 OR, SR, 및 NRR'이다. 바람직하게는 G4는 OR 및 NRR'에서 선택된다. 가장 바람직하게는 G4는 OR이다. 가장 바람직하게는 G4는 OMe이다.
일 실시형태에서, 기 G2는 하기와 같다:
Figure pct00092
상기 식에서 별표는 L3에 대한 부착 지점을 나타내고, n 및 G4는 상기에서 정의된 바와 같다.
일 실시형태에서, 기 G2는 하기와 같다:
Figure pct00093
상기 식에서, 별표는 L3에 대한 부착 지점을 나타내고, n은 0 또는 1이고, m은 0 내지 50이고, G4는 OH, OR, SH, SR, COOR, CONH2, CONHR, CONRR', NH2, NHR, NRR', NO2, 및 할로에서 선택된다. 바람직한 실시형태에서, n은 1이고, m은 0 내지 10, 1 내지 2, 바람직하게는 4 내지 8, 가장 바람직하게는 4 또는 8이다. 다른 실시형태에서, n은 1이고, m은 10 내지 50, 바람직하게는 20 내지 40이다. 기 OH, SH, NH2 및 NHR은 보호된다. 일 실시형태에서, G4는 OR, SR, COOR, CONH2, CONHR, CONRR', 및 NRR'이다. 일 실시형태에서, G4는 OR, SR, 및 NRR'이다. 바람직하게는 G4는 OR 및 NRR'에서 선택된다. 가장 바람직하게는 G4는 OR이다. 바람직하게는 G4는 OMe이다.
일 실시형태에서, 기 G2는 하기와 같다:
Figure pct00094
상기 식에서 별표는 L3에 대한 부착 지점을 나타내고, n, m 및 G4는 상기에서 정의된 바와 같다.
일 실시형태에서, 기 G2는 하기와 같다:
Figure pct00095
상기 식에서, n은 1 내지 20이고, m은 0 내지 6이고, G4는 OH, OR, SH, SR, COOR, CONH2, CONHR, CONRR', NH2, NHR, NRR', NO2, 및 할로에서 선택된다. 일 실시형태에서, n은 1 내지 10이다. 다른 실시형태에서, n은 10 내지 50이고, 바람직하게는 20 내지 40이다. 일 실시형태에서, n은 1이다. 일 실시형태에서, m은 1이다. 기 OH, SH, NH2 및 NHR은 보호된다. 일 실시형태에서, G4는 OR, SR, COOR, CONH2, CONHR, CONRR', 및 NRR'이다. 일 실시형태에서, G4는 OR, SR, 및 NRR'이다. 바람직하게는 G4는 OR 및 NRR'에서 선택된다. 가장 바람직하게는 G4는 OR이다. 바람직하게는 G4는 OMe이다.
일 실시형태에서, 기 G2는 하기와 같다:
Figure pct00096
상기 식에서 별표는 L3에 대한 부착 지점을 나타내고, n, m 및 G4는 상기에서 정의된 바와 같다.
상기의 각 실시형태에서, G4는 OH, SH, NH2 및 NHR일 수 있다. 바람직하게는, 이들 기들은 보호된다.
일 실시형태에서, OH는 Bzl, TBDMS, 또는 TBDPS에 의해 보호된다.
일 실시형태에서, SH는 Acm, Bzl, Bzl-OMe, Bzl-Me, 또는 Trt에 의해 보호된다.
일 실시형태에서, NH2 또는 NHR은 Boc, Moc, Z-Cl, Fmoc, Z, 또는 Alloc에 의해 보호된다.
일 실시형태에서, 기 G2는 기 L3와 조합하여 존재하고, 기는 디펩티드이다.
캡핑 기는 항체에 연결되지 않는다. 따라서, 이량체에 존재하는 다른 단량체가 링커를 통한 항체와의 연결 관점에서 기능한다. 따라서, 캡핑 기에 존재하는 작용성이 항체와의 반응에 적용되지 않는 것이 바람직하다. 따라서 반응성 작용 기, 예를 들어, OH, SH, NH2, COOH는 피하는 것이 바람직하다. 그러나, 상기에서 정의된 바와 같이, 보호되는 경우에는, 이러한 작용성도 캡핑 기에 존재할 수 있다.
실시형태
본 발명의 실시형태에는 항체가 상기에서 정의된 바와 같은 ConjA가 포함된다.
본 발명의 실시형태에는 항체가 상기에서 정의된 바와 같은 ConjB가 포함된다.
본 발명의 실시형태에는 항체가 상기에서 정의된 바와 같은 ConjC가 포함된다.
본 발명의 실시형태에는 항체가 상기에서 정의된 바와 같은 ConjD가 포함된다.
본 발명의 실시형태에는 항체가 상기에서 정의된 바와 같은 ConjE가 포함된다.
상기에서 언급된 바와 같이, 본 발명의 일부 실시형태는 ConjA, ConjB, ConjC, ConjD 및 ConjE를 포함하지 않는다.
약물 부하
약물 부하는 항체와 같은 항체 당 PBD 약물의 평균 개수이다. 본 발명의 화합물이 시스테인에 결합하는 경우, 약물 부하는 항체 당 1 내지 8 약물 (DL)의 범위일 수 있다. 즉 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 및 8 약물 모이어티가 항체에 공유적으로 부착된다. 컨주게이트의 조성물은 1 내지 8의 범위의 약물과 컨주게이트된 항체의 집합을 포함한다. 본 발명의 화합물이 리신에 결합하는 경우, 약물 부하는, 40, 20, 10 또는 8의 상한이 바람직할 수 있다 할지라도, 항체 당 1 내지 80 약물 (DL)의 범위일 수 있다. 컨주게이트의 조성물은 1 내지 80, 1 내지 40, 1 내지 20, 1 내지 10 또는 1 내지 8의 범위의 약물과 컨주게이트된 항체와 같은 항체의 집합을 포함한다.
컨주게이션 반응으로부터의 ADC의 제조에서 항체 당 약물의 평균 개수는 UV, 역상 HPLC, HIC, 질량 분광분석법, ELISA 분석 및 전기영동과 같은 통상의 수단에 의해 특성화될 수 있다. 또한 p의 관점에서 ADC의 정량 분포가 결정될 수 있다. ELISA에 의해, ADC의 특정 제조에서, p의 평균 값이 결정될 수 있다 (Hamblett et al (2004) Clin. Cancer Res. 10:7063-7070; Sanderson et al (2005) Clin. Cancer Res. 11:843-852). 그러나, p (약물) 값의 분포는 ELISA의 항체-항원 결합 및 검출 한계에 의해 구별될 수 없다. 또한, 항체-약물 컨주게이트의 검출을 위한 ELISA 분석은, 특정 아미노산 잔기 또는 중쇄 또는 경쇄 단편과 같이, 약물 모이어티가 항체에 부착되는 경우에는 고려하지 않는다. 일부 예에서, p가 다른 약물 부하의 ADC로부터의 특정 값인 경우, 동종 ADC의 분리, 정제 및 특성화는 역상 HPLC 또는 전기영동과 같은 수단에 의해 성취될 수 있다. 이러한 기술은 또한 다른 유형의 컨주게이트에도 적용될 수 있다.
일부 항체-약물 컨주게이트에서, p는 항체 상의 부착 위치의 수에 의해 제한될 수 있다. 예를 들어, 항체는 단지 하나의 또는 수 개의 시스테인 티올 기를 가질 수 있고, 링커가 부착될 수 있는 하나의 또는 수 개의 충분한 반응성의 티올 기를 가질 수 있다. 고 약물 부하, 예를 들어 p >5는 특정 항체-약물 컨주게이트의 세포 투과성의 손실, 응집, 불용성 또는 독성을 야기할 수 있다.
일반적으로, 이론적 최대치 보다 적은 수의 약물 모이어티가 컨주게이션 반응 동안 항체에 컨주게이트된다. 항체는, 예를 들어 링커 시약 또는 약물-링커 중간체 (D-L)와 반응하지 않는 다수의 리신 잔기를 포함할 수 있다. 가장 반응성이 큰 리신 기만이 아민-반응 링커 시약과 반응할 수 있다. 또한, 가장 반응성이 큰 시스테인 기만이 티올-반응 링커 시약과 반응할 수 있다. 일반적으로, 항체는 존재하는 경우, 약물 모이어티에 연결될 수 있는 다수의 유리 및 반응성 시스테인 티올을 포함하지 않는다. 상기 화합물의 항체 내의 대부분의 시스테인 티올 잔기는 이황화 가교로서 존재하고, 부분적 또는 전체적 환원 조건에서, 디티오트레이톨 (DTT) 또는 TCEP와 같은 환원제에 의해 환원될 수 있다. ADC의 부하 (약물/항체 비율)는 하기의 방법을 포함하는 다수의 상이한 방법으로 조절될 수 있다: (i) 항체와 관련된 링커 시약 또는 몰 과량의 약물-링커 중간체 (D-L)의 제한, (ii) 컨쥬게이션 반응 시간 또는 온도의 제한, 및 (iii) 시스테인 티올 변형을 위한 환원 조건의 부분적 또는 제한.
특정 항체는 사슬 간 환원성 이황화물, 즉 시스테인 가교를 갖는다. 항체는 DTT (디티오트레이톨)와 같은 환원제를 이용한 처리에 의해 링커 시약과 컨쥬게이션을 위해 반응할 수 있다. 각각의 시스테인 가교는 따라서 이론적으로 2 개의 반응성 티올 친핵체를 형성할 것이다. 추가의 친핵성 기가 2-이미노티올란 (Traut 시약)과 리신의 반응을 통하여 항체로 도입될 수 있고, 이에 따라 아민의 티올로의 전환이 초래될 수 있다. 반응성 티올 기는 1, 2, 3, 4, 또는 그 이상의 시스테인 잔기를 조작 (예를 들어, 하나 이상의 비네이티브 시스테인 아미노산 잔기를 포함하는 돌연변이 항체 제조)함으로써, 항체 (또는 그의 단편)로 도입될 수 있다. US 7521541은 반응성 시스테인 아미노산의 도입에 의한 항체 조작에 대해 교시하고 있다.
시스테인 아미노산은, 사슬내 또는 분자간 이황화 가교를 형성하지 않는 항체 내의 반응성 위치에서 조작될 수 있다 (Junutula, et al., 2008b Nature Biotech., 26(8):925-932; Dornan et al (2009) Blood 114(13):2721-2729; US 7521541; US 7723485; WO2009/052249). 조작된 시스테인 티올은 말레이미드 또는 알파-할로 아미드와 같은 티올-반응성, 친전자성 기를 갖는 약물-링커 시약 또는 링커 시약과 반응할 수 있고, 이에 따라 시스테인 조작 항체 및 PBD 약물 모이어티를 갖는 ADC를 형성할 수 있다. 따라서, 약물 모이어티의 위치는 설계 및 조절될 수 있고, 알 수 있다. 조작된 시스테인 티올 기는 일반적으로 고 수율로 티올-반응성 링커 시약 또는 약물-링커 시약과 반응하기 때문에, 약물 부하가 조절될 수 있다. 중쇄 또는 경쇄의 단일 위치에서 치환에 의해 시스테인 아미노산을 도입시키는 IgG 항체의 조작은 대칭 항체에 2 개의 새로운 시스테인을 제공한다. 약 2의 약물 부하는 컨쥬게이션 생성물 ADC의 대략적인 동종성에 의해 성취된다.
대안적으로, 위치 특이적 컨주게이션은 문헌 [Axup et al. ((2012), Proc Natl Acad Sci U S A. 109(40):16101-16116)]에 개시된 바와 같이, 중쇄 및/또는 경쇄에서 비천연 아미노산을 포함하도록 항체를 조작함으로써 성취될 수 있다. 비천연 아미노산은, 링커 시약 및 약물의 부착을 위한 직교 화학구조가 설계될 수 있는 추가 이점을 제공한다.
항체의 하나 이상의 친핵성 또는 친전자성 기가 약물-링커 중간체 또는 링커 시약과 반응한 다음, 약물 모이어티 시약과 반응하는 경우, 그후 생성된 생성물은, 예를 들어 1, 2, 3, 등과 같은 항체에 부착된 약물 모이어티의 분포를 갖는 ADC 화합물의 혼합물이다. 중합체 역상 (PLRP) 및 소수성 상호작용 (HIC)과 같은 액체 크로마토그래피 방법은 약물 부하 값에 의해 혼합물에서 화합물을 분리시킬 수 있다. 단일 약물 부하 값 (p)을 갖는 ADC의 제조물이 단리될 수 있으나, 이러한 단일 부하 값 ADC는, 약물 모이어티가 항체의 상이한 위치에서 링커를 통해 부착될 수 있기 때문에, 여전히 이종 혼합물일 수 있다.
따라서, 항체가 하나 이상의 PBD 약물 모이어티를 가지고, 약물 모이어티가 다양한 아미노산 잔기에서 항체에 부착될 수 있는 경우, 본 발명의 항체-약물 컨주게이트 조성물은 항체-약물 컨주게이트 화합물의 혼합물을 포함한다.
일 실시형태에서, 항체당 이량체 피롤로벤조디아제핀 기의 평균 수는 1 내지 20의 범위 내이다. 일부 실시형태에서, 상기 범위는 1 내지 8, 2 내지 8, 2 내지 6, 2 내지 4, 및 4 내지 8로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 항체당 하나의 이량체 피롤로벤조디아제핀 기가 존재한다.
그 밖의 다른 형태를 포함
다른 식으로 명시되지 않는 한, 상기한 것에는 이들 치환체의 잘 알려진 이온, 염, 용매화물, 및 보호된 형태가 포함된다. 예를 들어, 카복실산 (-COOH)에 대한 언급은 또한 음이온 (카복실레이트) 형태 (-COO-), 그의 염 또는 용매화물뿐만 아니라 통상적인 보호된 형태를 포함한다. 마찬가지로, 아미노 그룹에 대한 언급은 양자화된 형태 (-N+HR1R2), 아미노 그룹의 염 또는 용매화물, 예를 들어, 염화수소산염염뿐만 아니라 아미노 그룹의 통상적인 보호된 형태를 포함한다. 마찬가지로, 하이드록실 기에 대한 언급은 또한 음이온 형태 (-O-), 그의 염 또는 용매화물뿐만 아니라 통상적인 보호된 형태를 포함한다.
염
활성 화합물의 상응하는 염, 예를 들어, 약제학적으로 허용되는 염을 제조, 정제 및/또는 취급하는 것이 편리하거나 바람직할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 염의 예는 문헌 [Berge, et al., J.　Pharm. Sci., 66, 1-19 (1977)]에 기술되어 있다.
예를 들어, 화합물이 음이온성이거나, 음이온성일 수 있는 작용 기를 갖는 경우에 (예를 들어, -COOH는 -COO-일 수 있다), 염은 적합한 양이온에 의해서 형성될 수 있다. 적합한 무기 양이온의 예로는 Na+ 및 K+와 같은 알칼리 금속 이온, Ca2+ 및 Mg2+와 같은 알칼리 토금속 양이온, 및 Al+3과 같은 그 밖의 다른 양이온이 포함되나 이들로 제한되지 않는다. 적합한 유기 양이온의 예로는 암모늄 이온 (즉 NH4 +) 및 치환된 암모늄 이온 (예를 들어, NH3R+, NH2R2 +, NHR3 +, NR4 +)이 포함되나 이들로 제한되지 않는다. 일부의 적합한 치환된 암모늄 이온의 예는 에틸아민, 디에틸아민, 디사이클로헥실아민, 트리에틸아민, 부틸아민, 에틸렌디아민, 에탄올아민, 디에탄올아민, 피페라진, 벤질아민, 페닐벤질아민, 콜린, 메글루민, 및 트로메타민뿐만 아니라 리신 및 아르기닌과 같은 아미노산으로부터 유도된 것이다. 통상적인 4급 암모늄 이온의 예는 N(CH3)4 +이다.
화합물이 양이온성이거나 양이온성일 수 있는 작용 그룹을 갖는 경우에 (예를 들어, -NH2는 -NH3 +일 수 있다), 염은 적합한 음이온에 의해서 형성될 수 있다. 적합한 무기 음이온의 예로는 다음의 무기산으로부터 유도된 것이 포함되나 이들로 제한되지 않는다: 염산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 황산, 아황산, 질산, 아질산, 인산 및 아인산.
적합한 유기 음이온의 예로는 다음의 유기산으로부터 유도된 것이 포함되나 이들로 제한되지 않는다: 2-아세톡시벤조산, 아세트산, 아스코르브산, 아스파르트산, 벤조산, 캄포설폰산, 신남산, 시트르산, 에데트산, 에탄디설폰산, 에탄설폰산, 푸마르산, 글루켑톤산, 글루콘산, 글루탐산, 글리콜산, 하이드록시말레산, 하이드록시나프탈렌 카복실산, 이세티온산, 락트산, 락토비온산, 라우르산, 말레산, 말산, 메탄설폰산, 무스산, 올레산, 옥살산, 팔미트산, 파모산, 판토텐산, 페닐아세트산, 페닐설폰산, 프로피온산, 피루브산, 살리실산, 스테아르산, 석신산, 설파닐산, 타르타르산, 톨루엔설폰산, 트리플루오로아세트산 및 발레르산. 적합한 폴리머 유기 음이온의 예로는 다음의 폴리머산으로부터 유도된 것이 포함되나 이들로 제한되지 않는다: 탄닌산, 카복시메틸 셀룰로즈.
용매화물
활성 화합물의 상응하는 용매화물을 제조, 정제 및/또는 취급하는 것이 편리하거나 바람직할 수 있다. 용어 "용매화물"은 용매의 컴플렉스 (예를 들어, 활성 화합물, 활성 화합물의 염)와 용질을 나타내기 위한 통상적인 개념으로 본 명세서에서 사용된다. 용매가 물이면, 용매화물은 편리하게는 하이드레이트, 예를 들어, 모노-하이드레이트, 디-하이드레이트, 트리-하이드레이트 등으로 불릴 수 있다.
본 발명은 용매가 PBD 모이어티의 이민 결합을 가로질러서 부가된 화합물을 포함하며, 이것은 이하에 예시되고, 여기에서 용매는 물 또는 알콜 (RAOH, 여기에서 RA는 C1-4 알킬이다)이다:
Figure pct00097
이들 형태는 PBD의 카비놀아민 및 카비놀아민 에테르 형태 (상기 R10에 관한 항목에 기술된 바와 같음)로 불릴 수 있다. 이들 평형상태의 균형은 화합물이 존재하는 조건뿐만 아니라 그 모이어티 자체의 성질에 따라 좌우된다.
이들 특별한 화합물은 예를 들어, 동결건조에 의해 고체 형태로 분리될 수 있다.
이성체
본 발명의 특정한 화합물은 시스- 및 트랜스-형태; E- 및 Z-형태; c-, t-, 및 r-형태; 엔도- 및 엑소-형태; R-, S-, 및 메소-형태; D- 및 L-형태; d- 및 l-형태; (+) 및 (-) 형태; 케토-, 에놀-, 및 에놀레이트-형태; syn- 및 안티 (anti)-형태; 향사 (synclinal)- 및 배사 (anticlinal)-형태; α- 및 β-형태; 축 및 수평 방향 형태; 보트-, 체어-, 트위스트-, 엔벨로프 (envelope)-, 및 하프체어 (halfchair)-형태; 및 이들의 조합을 포함한 (단, 이들로 제한되지 않는다) 하나 또는 그 이상의 특별한 기하이성체, 광학이성체, 에난티오머, 부분입체이성체, 에피머, 회전장애 (atropic) 이성체, 입체이성체, 호변이성체, 형태이성체 또는 아노머 (anomeric) 형태로 존재할 수 있으며, 이하에서는 총괄적으로 "이성체" (또는 "이성체 형태") 로 칭한다.
용어 "키랄"은 거울상 파트너의 비-중첩성 (non-superimposability)의 특성을 갖는 분자를 나타내는 반면에, 용어 "아키랄 (achiral)"은 그들의 거울상 파트너 상에 중첩할 수 있는 분자를 나타낸다.
용어 "입체이성체"는 동일한 화학적 구성을 갖지만, 공간에서 원자 또는 그룹의 배열에 관해서는 상이한 화합물을 나타낸다.
"부분입체이성체"는 2 개 또는 그 이상의 키랄 중심을 가지며, 그의 분자가 서로의 거울상이 아닌 입체이성체를 나타낸다. 부분입체이성체는 상이한 물리적 특성, 예를 들어, 융점, 비점, 분광 특성 및 반응성을 갖는다. 부분입체이성체의 혼합물은 전기영동 및 크로마토그래피와 같은 고분할 분석절차에 따라 분리시킬 수 있다.
"에난티오머"는 서로의 비-중첩성 거울상인 화합물의 2 개의 입체이성체를 나타낸다.
본 명세서에서 사용된 입체화학적 정의 및 규약은 문헌 [S. P. Parker, Ed., McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (1984) McGraw-Hill Book Company, New York; and Eliel, E. and Wilen, S., "Stereochemistry of Organic Compounds", John Wiley & Sons, Inc., New York, 1994]에 따른다. 본 발명의 화합물은 비대칭 또는 키랄 중심을 함유할 수 있으며, 따라서 상이한 입체이성체 형태로 존재할 수 있다. 부분입체이성체, 에난티오머 및 회전장애 이성체뿐만 아니라 라세미 혼합물과 같은 이들의 혼합물을 포함한 (단, 이들로 제한되지 않는다) 본 발명의 화합물의 모든 입체이성체 형태는 본 발명의 일부를 형성하는 것으로 한다. 다수의 유기 화합물은 광학적 활성 형태로 존재하며, 즉 이들은 평면-편광의 평면을 회전하는 능력을 갖는다. 광학적 활성 화합물을 기술하는 경우에, 접두어 D 및 L, 또는 R 및 S는 그의 키랄 중심(들)에 관한 분자의 절대배열을 나타내기 위해서 사용된다. 접두어 d 및 l 또는 (+) 및 (-)는 화합물에 의한 평면-편광의 회전의 사인을 지정하기 위해서 사용되는데, 여기에서 (-) 또는 l은 화합물이 좌선성인 것을 나타낸다. (+) 또는 d가 접두어인 화합물은 우선성이다. 소정의 화학적 구조에 대해서 이들 입체이성체는 이들이 서로의 거울상인 것을 제외하고는 동일하다. 특정의 입체이성체는 또한 에난티오머로 불릴 수 있으며, 이러한 이성체의 혼합물은 종종 에난티오머 혼합물로 칭할 수 있다. 에난티오머의 50:50 혼합물은 라세미 혼합물 또는 라세메이트로 불리며, 이것은 화학적 반응 또는 과정에서 입체선택성 또는 입체특이성이 없는 경우에 나타날 수 있다. 용어 "라세미 혼합물" 및 "라세메이트"는 광학적 활성이 없는 2 개의 에난티오머 종의 동몰성 혼합물을 나타낸다.
호변이성체 형태에 대해서 이하에 거론된 것을 제외하고, 특히 본 발명에서 사용된 용어 "이성체"로부터 구조 (또는 구성) 이성체 (즉, 단순히 공간에서의 원자의 위치에 의해서가 아니라 원자들 사이의 연결이 상이한 이성체)는 제외되는 것을 유의하여야 한다. 예를 들어, 메톡시 기 -OCH3에 대한 언급은 그의 구조 이성체인 하이드록시메틸 기 -CH2OH에 대한 언급으로 이해되지 않는다. 마찬가지로, 오르토-클로로페닐에 대한 언급은 그의 구조 이성체인 메타-클로로페닐에 대한 언급으로 이해되지 않는다. 그러나, 구조의 클래스에 대한 언급은 그 클래스 내에 속하는 구조적 이성체 형태를 역시 포함할 수 있다 (예를 들어, C1-7 알킬은 n-프로필 및 이소-프로필을 포함하고; 부틸은 n-, 이소-, sec-, 및 테르트-부틸을 포함하며; 메톡시페닐은 오르토-, 메타-, 및 파라-메톡시페닐을 포함한다).
상기의 배제사항은 예를 들어, 다음의 호변이성체 쌍에서와 같은 호변이성체 형태, 예를 들어, 케토-, 에놀-, 및 에놀레이트-형태에 관한 것은 아니다: 케토/에놀 (이하에 예시됨), 이민/엔아민, 아미드/이미노 알콜, 아미딘/아미딘, 니트로소/옥심, 티오케톤/에네티올, N-니트로소/하이드록시아조, 및 니트로/아시-니트로.
Figure pct00098
용어 "호변이성체" 또는 "호변이성체 형태"는 저에너지 장벽을 통해서 상호전환가능한 상이한 에너지의 구조 이성체를 나타낸다. 예를 들어, 양자 호변이성체 (또한 프로토트로픽 (prototropic) 호변이성체로 공지됨)는 케토-에놀 및 이민-엔아민 이성체화와 같은 양자의 이동을 통한 상호전환을 포함한다. 원자가 호변이성체는 결합 전자 중의 일부의 개편에 의한 상호전환을 포함한다.
용어 "이성체"에는 특히 하나 또는 그 이상의 동위원소 치환이 있는 화합물이 포함된다는 것을 유의하여야 한다. 예를 들어, H는 1H, 2H (D), 및 3H (T)를 포함한 어떤 동위원소 형태라도 될 수 있으며; C는 16O 및 18O 등을 비롯하여, 12C, 13C, 및 14C를 포함한 어떤 동위원소 형태라도 될 수 있다.
본 발명의 화합물 내에 통합될 수 있는 동위원소의 예로는 2H (중수소, D), 3H (삼중수소), 11C, 13C, 14C, 15N, 18F, 31P, 32P, 35S, 36Cl, 및 125I와 같은 (단 이들로 제한되지 않는다) 수소, 탄소, 질소, 산소, 인, 불소 및 염소의 동위원소가 포함된다. 본 발명의 다양한 동위원소 표지된 화합물은 예를 들어, 3H, 13C, 및 14C와 같은 방사성 동위원소가 통합된 것이다. 이러한 동위원소 표지된 화합물은 약물 또는 기질 조직 분포시험을 포함한 양전자 방출 단층촬영 (PET) 또는 단일-양자 방출 컴퓨터 촬영 (SPECT)과 같은 대사 연구, 반응속도 연구, 검출 또는 영상화 기술에서, 또는 환자의 방사성 치료에서 유용할 수 있다. 본 발명의 중수소 표지되거나 치환된 치료학적 화합물은 분포, 대사 및 배설 (ADME)에 관한 개선된 DMPK (약물 대사 및 약력학) 특성을 가질 수 있다. 중수소와 같은 더 중질의 동위원소에 의한 치환은 더 큰 대사 안정성, 예를 들어, 증가된 생체내 반감기 또는 감소된 투약량 필요조건으로 인한 특정의 치료학적 이점을 제공할 수 있다. 18F 표지된 화합물은 PET 또는 SPECT 연구에 유용할 수 있다. 본 발명의 동위원소 표지된 화합물 및 그의 프로드럭은 일반적으로 반응식에, 또는 비-동위원소 표지된 시약을 쉽게 이용할 수 있는 동위원소 표지된 시약으로 치환시켜 이하에 기술된 실시예 및 제조예에 기술된 절차를 수행함으로써 제조될 수 있다. 또한, 더 중질의 동위원소, 특히 중수소 (즉, 2H 또는 D)에 의한 치환은 더 큰 대사 안정성, 예를 들어, 증가된 생체내 반감기 또는 감소된 투약량 필요조건 또는 치료지수의 개선으로 인한 특정의 치료학적 이점을 제공할 수 있다. 이러한 관계에서 중수소는 치환체로 간주되는 것으로 이해된다. 이러한 더 중질의 동위원소, 특히 중수소의 농도는 동위원소 부화계수 (isotopic enrichment factor)에 의해서 정의될 수 있다. 본 발명의 화합물에서, 특별한 동위원소로 구체적으로 지정되지 않은 어떤 원자는 그 원자의 모든 안정한 동위원소를 나타내는 것을 의미한다.
다른 식으로 명시되지 않는 한, 특별한 화합물에 대한 언급은 (전체적으로 또는 부분적으로) 라세미 및 그 밖의 다른 이들의 혼합물을 포함한 이러한 이성체 형태 모두를 포함한다. 이러한 이성체 형태의 제조 (예를 들어, 비대칭 합성) 및 분리 (예를 들어, 분별 결정화 및 크로마토그래피 방법)를 위한 방법은 본 기술분야에서 공지되어 있거나, 본 명세서에 교시된 방법 또는 공지된 방법을 공지된 방식으로 변경함으로써 쉽게 수득된다.
생물학적 활성
시험관내 세포 증식시험
일반적으로, 항체-약물 컨주게이트 (ADC)의 세포독성 또는 세포증식 억제활성은 수용체 단백질을 갖는 포유동물 세포를 세포 배양 배지 내의 ADC의 항체에 노출시키고; 세포를 약 6 시간 내지 약 5일의 기간 동안 배양하고; 세포 생존도를 측정함으로써 측정된다. 세포-기반 시험관내 시험을 사용하여 본 발명의 ADC의 생존도 (증식), 세포독성, 및 세포소멸 (카스파제 활성화)의 유도를 측정한다.
항체-약물 컨주게이트의 시험관내 효력은 세포 증식시험에 의해서 측정될 수 있다. 셀타이터-글로 (CellTiter-Glo®) 발광 세포 생존도 시험은 콜레오프테라 (Coleoptera) 루시퍼라제의 재조합체 발현을 기초로 하는 상업적으로 이용할 수 있는 (Promega Corp., Madison, WI) 균질한 시험방법이다 (U.S. 특허 제 5583024; 5674713 및 5700670 호). 이 세포 증식시험은 대사적으로 활성인 세포의 지표인 존재하는 ATP의 정량화에 근거한 배양물 내의 생존 세포의 수를 결정한다 [Crouch et al (1993) J. Immunol. Meth. 160:81-88; US 6602677]. 셀타이터-글로 (CellTiter-Glo®) 시험은 자동화된 초고속 스크리닝 (HTS)에 따라서 96 웰 포맷 (format)으로 수행된다 [Cree et al (1995) AntiCancer Drugs 6:398-404]. 균질한 시험절차는 단일 시약 (CellTiter-Glo® 시약)을 혈청-보충된 배지에서 배양된 세포에 직접 첨가하는 것을 포함한다. 세포 세척, 배지의 제거 및 다수의 피펫팅 (pipetting) 단계는 필요하지 않다. 이 시스템은 시약을 첨가하고 혼합시킨 후 10 분 이내에 384-웰 포맷에서 최소 15 세포/웰 까지 검출한다. 세포는 ADC에 의해서 연속적으로 처리할 수 있거나, 이들은 처리하고 ADC로부터 분리시킬 수 있다. 일반적으로, 간단히, 즉 3 시간 동안 처리된 세포는 연속적으로 처리된 세포와 동일한 효력 효과를 나타내었다.
균질한 "첨가-혼합-측정 (add-mix-measure)" 포맷은 세포 용해 및 존재하는 ATP의 양에 비례하는 발광 신호의 생성을 제공한다. ATP의 양은 배양물 내에 존재하는 세포의 수에 정비례한다. 셀타이터-글로 (CellTiter-Glo®) 시험은 사용된 세포 타입 및 배지에 따라 일반적으로 5 시간보다 더 큰 반감기를 갖는 루시퍼라제 반응에 의해서 생산된 "글로-타입 (glow-type)" 발광 신호를 생성시킨다. 생존 세포는 상대적 발광 유니트 (relative luminescence units; RLU)에 반영된다. 기질인 딱정벌레 (Beetle) 루시페린은 재조합체 개똥벌레 루시퍼라제에 의해서 ATP의 AMP로의 동시 전환 및 양자의 생성과 함께 산화적으로 탈카복실화된다.
또한, 항체-약물 컨주게이트의 시험관내 효능은 세포독성 분석에 의해 측정할 수 있다. 배양된 부착 세포를 PBS로 세척하고, 트립신으로 분리하고, 10% FCS를 포함하는 완전 배지에서 희석하고, 원심분리하고, 새로운 배지에 재현탁시키고, 혈구계산기를 이용하여 계수한다. 현탁 배양물을 직접 계수한다. 계수에 적합한 단순 분산 세포 현탁액은 세포 무리를 깨기 위해 반복 흡인에 의한 현탁액의 교반을 필요로 할 수 있다.
세포 현탁액을 목적 접종 밀도로 희석하고, 흑색 96 웰 플레이트에 분산시켰다 (100μL/웰). 부착 세포주의 플레이트를 하룻밤 동안 인큐베이션시켜, 부착될 수 있게 하였다. 현탁 세포 배양물은 접종 당일 사용할 수 있다.
ADC (20μg/ml)의 스탁 용액 (1ml)을 적당한 세포 배양 배지에서 제조한다. 스탁 ADC의 일련의 10 배 희석액을 100μL를 900μL의 세포 배양 배지로 연속적으로 옮김으로써, 15ml 원심분리 튜브에서 제조한다.
각 ADC 희석액 (100μL)의 4 개의 복제 웰을 세포 현탁액 (100μL)으로 이미 플레이팅한 96 웰 흑색 플레이트에 분산시켜서, 최종 용적이 200 μL가 되게 한다. 대조군 웰에 세포 배양 배지 (100μL)를 제공한다.
상기 세포주의 배가 시간 (doubling time)이 30 시간을 초과하는 경우, ADC를 5 일 동안 인큐베이션시키고, 달리는 4 일 동안 인큐베이션한다.
상기 인큐베이션 기간 종결시, 세포 생존도를 알라마르 블루 분석 (Alamar blue assay)을 이용하여 평가한다. 알라마르 블루 (Invitrogen)를 전체 플레이트 (20μL/웰)에 분산시키고, 4 시간 동안 인큐베이션시킨다. 알라마르 블루 형광도를 바리오스칸 플래쉬 플레이트 판독기 (Varioskan 플래쉬 plate reader)에서 여기 570nm, 방출 585nm에서 측정한다. 세포 생존 백분율을 대조군 웰의 평균 형광도와 비교하여, ADC 처리 웰의 평균 형광도로부터 계산한다.
용도
본 발명의 컨주게이트를 사용하여 표적 위치에서 PBD 화합물을 제공할 수 있다.
표적 위치는 바람직하게는 증식성 세포 집단이다. 항체는 증식성 세포 집단에 존재하는 항원에 대한 항체이다.
한가지 실시양태에서, 항원은 증식성 세포 집단, 예를 들어, 종양 세포 집단에 존재하는 항원의 양에 비해 비-증식성 세포 집단에서는 부재하거나 감소된 수준으로 존재한다.
표적 위치에서 링커는 화합물 RelA. RelB, RelC, RelD, 또는 RelE를 방출하도록 분해될 수 있다. 따라서, 컨주게이트는 표적 위치에서 화합물 RelA, RelB, RelC, RelD, 또는 RelE를 선택적으로 제공하기 위해서 사용될 수 있다.
링커는 표적 위치에 존재하는 효소에 의해서 분해될 수 있다.
표적 위치는 시험관내, 생체내 또는 생체외일 수 있다.
본 발명의 항체-약물 컨주게이트 (ADC) 화합물은 항암 활성에 대한 유용성을 갖는 것이 포함된다. 특히, 화합물은 PBD 약물 모이어티, 즉 독소에 컨주게이트된, 즉 링커에 의해서 공유적으로 부착된 항체를 포함한다. 약물이 항체에 컨주게이트되지 않은 경우에, PBD 약물은 세포독성 효과를 갖는다. 따라서, PBD 약물 모이어티의 생물학적 활성은 항체에 대한 컨주게이션에 의해서 변조된다. 본 발명의 항체-약물 컨주게이트 (ADC)는 유효량의 세포독성제를 종양 조직에 선택적으로 송달함으로써 더 큰 선택성, 즉 더 작은 유효량이 달성될 수 있다.
따라서, 한가지 관점에서 본 발명은 치료에 사용하기 위한, 본 발명에 기술된 바와 같은 컨주게이트 화합물을 제공한다.
추가의 관점에서는 또한, 증식성 질환의 치료에서 사용하기 위한, 본 발명에 기술된 바와 같은 컨주게이트 화합물이 제공된다. 본 발명의 두 번째 관점은 증식성 질환을 치료하기 위한 의약의 제조에 있어서의 컨주게이트 화합물의 용도를 제공한다.
본 기술분야에서 통상적으로 숙련된 전문가는 후보 컨주게이트가 어떤 특별한 세포 타입에 대한 증식성 상태를 치료하는지 여부에 대해서 쉽게 결정할 수 있다. 예를 들어, 특별한 화합물에 의해서 제공되는 활성을 평가하기 위해서 편리하게 사용될 수 있는 시험방법은 이하의 실시예에 기술된다.
용어 "증식성 질환"은 시험관내이든 생체내이든, 신생물성 또는 과형성성 성장과 같은 바람직하지 않은 과도하거나 비정상적인 세포의 원치않거나 제어되지 않은 세포 증식에 관한 것이다.
증식성 상태의 예로는 신생물 및 종양 (예를 들어, 조직구종, 신경교종, 성상세포종, 골종), 암 (예를 들어, 폐암, 소세포 폐암, 위장암, 대장암, 결장암, 유방암, 난소암, 전립선암, 고환암, 간암, 신장암, 방광암, 췌장암, 뇌암, 육종, 골육종, 카포시 (Kaposi) 육종, 흑색종), 림프종, 백혈병, 건선, 골질환, 섬유증식성 장애 (예를 들어, 결합조직의) 및 아테롬성 경화증을 포함한 (단, 이들로 제한되지 않는다) 양성, 전-악성 및 악성 세포 증식이 포함되나 이들로 제한되지 않는다. 특별히 관심이 있는 암에는 백혈병 및 난소암이 포함되나 이들로 제한되지 않는다.
폐, 위장 (예를 들어, 대장, 결장을 포함), 유방 (유선), 난소, 전립선, 간 (간성), 신장 (신성), 방광, 췌장, 뇌 및 피부를 포함한 (단, 이들로 제한되지 않는다) 어떤 타입의 세포라도 치료될 수 있다.
구체적인 관심 대상 질환에는 이로 제한하는 것은 아니나, 모발세포 백혈병 (HCL), 모발세포 백혈병 변종 (HCL-v), 및 급성 림프모구 림프종 (ALL) 등의 만성 림프계 림프종 (chronic lymphatic lymphoma) (CLL) 백혈병, 미만성 큰 B-세포 림프종 (DLBCL), 소포성 림프종 (FL), 외투세포림프종 (MCL)을 비롯한 비-호지킨 림프종이 포함된다.
본 발명의 항체-약물 컨주게이트 (ADC)는 예를 들어, 종양 항원의 과발현을 특징으로 하는 다양한 질환 또는 장애를 치료하기 위해서 사용될 수 있는 것으로 생각된다. 예시적인 상태 또는 과증식성 장애에는 양성 또는 악성 종양; 백혈병, 혈액학적 및 림프성 악성 종양이 포함된다. 그 밖의 다른 것에는 뉴론성, 신경교성, 성상세포성, 시상하부성, 선성, 대식세포성, 상피성, 기질성, 분할강성, 염증성, 혈관형성성, 및 자가면역을 포함한 면역학적 장애가 포함된다.
일반적으로, 치료될 질환 또는 장애는 암과 같은 과증식성 질환이다. 본 발명에서 치료될 암의 예로는 암종, 림프종, 아세포종, 육종 및 백혈병 또는 림프성 악성종양이 포함되나, 이들로 제한되지 않는다. 이러한 암의 더욱 특별한 예로는 편평세포암 (예를 들어, 상피 편평세포암), 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 폐의 선암, 및 폐의 편평세포 암종을 포함하는 폐암, 복막의 암, 간세포암, 위장암을 포함한 위 또는 위부의 암, 췌장암, 교아종, 경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간종양, 유방암, 결장암, 직장암, 결장직장암, 내피 또는 자궁 암종, 타액선 암종, 신장 또는 신성 암, 전립선암, 외음암, 갑상선암, 간암종, 항문함종, 음경암종뿐만 아니라 두경부암이 포함된다.
치료에 ADC 화합물이 사용될 수 있는 자가면역 질환에는 류마티스성 장애 (예를 들어, 류마티스성 관절염, 쇼그렌 (Sjogren) 증후군, 경피증, SLE 및 루푸스 신염과 같은 루푸스, 다발성근염/피부근염, 한랭글로불린혈증, 항-인지질 항체 증후군, 및 건선성 관절염), 골관절염, 자가면역 위장 및 간 장애 (예를 들어, 염증성 장 질환 (예를 들어, 궤양성 대장염 및 크론병), 자가면역 위염 및 악성 빈혈, 자가면역 간염, 원발성 담즙성 경화증, 원발성 경화성 담관염, 및 셀리악병), 맥관염 (예를 들어, 처그-스트라우스 (Churg-Strauss) 맥관염, 베게너 (Wegener) 육아종증 및 다발동맥염을 포함한 ANCA-관련된 맥관염),　자가면역 신경학적 장애 (예를 들어, 다발성 경화증, 안진전-근간대 증후군, 중증 근무력증, 신경성 척수염, 파킨슨병, 알츠하이머병, 및 자가면역 다발신경병증), 신장 장애 (예를 들어, 사구체신염, 굿파스춰 (Goodpasture) 증후군, 및 버거 (Berger)병), 자가면역 피부과적 장애 (예를 들어, 건선, 담마진, 두드러기, 심상성 천포창, 수포성 유천포창, 및 피부 홍반성 루푸스), 혈액학적 장애 (예를 들어, 혈소판감소성 자반병, 혈전성 혈소판감소성 자반병, 수혈-후 자반병, 및 가자면역 용혈성 빈혈), 아테롬성 경화증, 포도막염, 자가면역 청각 질환 (예를 들어, 내이 질환 및 청력 상실), 베체트 (Behcet)병, 레이노드 (Raynaud) 증후군, 기관 이식, 및 자가면역 내분비 장애 (예를 들어, 인슐린-의존성 진성 당뇨병 (IDDM)과 같은 당뇨병-관련 자가면역 질환, 애디슨 (Addison)병, 및 자가면역 갑상선 질환 (예를 들어, 그레이브스 (Graves)병 및 갑상선염))이 포함된다. 더욱 바람직한 이러한 질환에는 예를 들어, 류마티스성 관절염, 궤양성 대장염, ANCA-관련된 맥관염, 루푸스, 다발성 경화증, 쇼그렌 증후군, 그레이브스병, IDDM, 악성 빈혈, 갑상선염, 및 사구체신염이 포함된다.
치료의 방법
본 발명의 컨주게이트는 치료방법에서 사용될 수 있다. 또한, 치료가 필요한 대상체에게 본 발명의 컨주게이트 화합물의 치료학적 유효량을 투여하는 것을 포함하는 치료방법이 제공된다. 용어 "치료학적 유효량"은 환자에게 효과를 나타내는데 충분한 양이다. 이러한 효과는 적어도, 적어도 하나의 증상의 개선일 수 있다. 투여되는 실제량, 및 투여의 속도 및 경과는 치료되는 것의 성질 및 중증도에 따라 달라질 것이다. 치료의 처방, 예를 들어, 투약량에 대한 결정은 일반 개업의 및 그 밖의 다른 의사의 책임 하에 있다.
본 발명의 화합물은 단독으로 또는 다른 치료와 함께, 치료될 상태에 따라 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 치료 및 치료법의 예로는 화학요법 (예를 들어, 화학요법제와 같은 약물을 포함하는 활성 약제의 투여); 수술; 및 방사선 요법이 포함되나 이들로 제한되지 않는다.
"화학요법제"는 작용의 기전과는 관계가 없이 암의 치료에 유용한 화학적 화합물이다. 화학요법제의 클래스에는 알킬화제, 항대사산물, 스핀들 독 (spindle poison) 식물 알칼로이드, 세포독성/항종양 항생제, 토포이소머라제 억제제, 항체, 감광제, 및 키나제 억제제가 포함되나 이들로 제한되지 않는다. 화학요법제에는 "표적화 요법" 및 통상적인 화학요법에서 사용되는 화합물이 포함된다.
화학요법제의 예로는 다음이 포함된다: 에를로티닙 (erlotinib) (타르세바 (TARCEVA®), Genentech/OSI Pharm.), 도세탁셀 (탁소테레 (TAXOTERE®), Sanofi-Aventis), 5-FU (플루오로우라실, 5-플루오로우라실, CAS No. 51-21-8), 젬시타빈 (젬자르 (GEMZAR®), Lilly), PD-0325901 (CAS No. 391210-10-9, Pfizer), 시스플라틴 (시스-디아민, 디클로로플라티늄(II), CAS No. 15663-27-1), 카보플라틴 (CAS No. 41575-94-4), 파클리탁셀 (탁솔 (TAXOL®), Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), 트라스투주맙 (trastuzumab) (헤르셉틴 (HERCEPTIN®), Genentech), 테모졸로미드 (4-메틸-5-옥소-2,3,4,6,8-펜트아자비사이클로[4.3.0]노나-2,7,9-트리엔-9-카복사미드, CAS No. 85622-93-1, 테모다르 (TEMODAR®), 테모달 (TEMODAL®), Schering Plough), 타목시펜 ((Z)-2-[4-(1,2-디페닐부트-1-에닐)페녹시]-N,N-디메틸에탄아민, 놀바덱스 (NOLVADEX®), 이스투발 (ISTUBAL®), 발로덱스 (VALODEX®)), 및 독소루비신 (아드리아마이신 (ADRIAMYCIN®)), Akti-1/2, HPPD, 및 라파마이신.
화학요법제의 추가의 예로는 다음이 포함된다: 옥살리플라틴 (엘록사틴 (ELOXATIN®), Sanofi), 보르테조밉 (bortezomib) (벨케이드 (VELCADE®), Millennium Pharm.), 수텐트 (수니티닙 (SUNITINIB®), SU11248, Pfizer), 레트로졸 (페마라 (FEMARA®), Novartis), 이마티닙 메실레이트 (글리벡 (GLEEVEC®), Novartis), XL-518 (Mek 억제제, 엑셀릭시스 (Exelixis), WO 2007/044515), ARRY-886 (Mek 억제제, AZD6244, Array BioPharma, Astra Zeneca), SF-1126 (PI3K 억제제, Semafore Pharmaceuticals), BEZ-235 (PI3K 억제제, Novartis), XL-147 (PI3K 억제제, Exelixis), PTK787/ZK 222584 (Novartis), 풀베스트란트 (파슬로덱스 (FASLODEX®), AstraZeneca), 류코보린 (폴린산), 라파마이신 (시롤리무스, 라파뮨 (RAPAMUNE®), Wyeth), 라파티닙 (타이커브 (TYKERB®), GSK572016, Glaxo Smith Kline), 로나파르닙 (사라사르 (SARASAR®), SCH 66336, Schering Plough), 소라페닙 (넥사바르 (NEXAVAR®), BAY43-9006, Bayer Labs), 제피티닙 (이레사 (IRESSA®), AstraZeneca), 이리노테칸 (캄프토사르 (CAMPTOSAR®), CPT-11, Pfizer), 티피파르닙 (자르네스트라 (ZARNESTRA™), Johnson & Johnson), 아브락산 (ABRAXANE™) (무-크레모포 (Cremophor-free)), 파클리탁셀의 알부민-조작된 나노입자 제제 (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Il), 반데타닙 (rINN, ZD6474, 작티마 (ZACTIMA®), AstraZeneca), 클로람부실, AG1478, AG1571 (SU 5271; Sugen), 템시롤리무스 (토리셀 (TORISEL®), Wyeth), 파조파닙 (GlaxoSmithKline), 칸포스파미드 (텔사이타 (TELCYTA®), Telik), 티오테파 및 사이클로포스파미드 (사이톡산 (CYTOXN®), 네오사르 (NEOSAR®)); 부설판, 임프로설판 및 피포설판과 같은 알킬 설포네이트; 벤조도파, 카보쿠온, 메트유레도파 및 유레도파와 같은 아지리딘; 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포르아미드, 트리에틸렌티오포스포르아미드 및 트리메틸로멜라민을 포함한 에틸렌이민 및 메틸라멜라민; 아세토게닌 (특히 불라타신 및 불라타시논); 캄프토테신 (합성 유사체 토포테칸을 포함); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065 (그의 아도젤레신, 카르젤레신 및 비젤레신 합성 유사체를 포함); 크립토피신 (특히 크립토피신 1 및 크립토피신 8); 돌라스타틴; 듀오카르마이신 (합성 유사체, KW-2189 및 CB1-TM1을 포함); 엘류테로빈; 판크래티스타틴; 사르코딕티인; 스폰지스타틴; 클로람부실, 클로르나파진, 클로로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥사이드 염화수소산염, 멜파란, 노벰비친, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드와 같은 질소 머스타드; 카무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 및 라니무스틴과 같은 니트로소우레아; 항생제, 예를 들어, 엔디인 항생제 (예를 들어, 칼리케아미신, 칼리케아미신 감마1I, 칼리케아미신 오메가I1 [Angew Chem. Intl. Ed. Engl. (1994) 33:183-186]; 다이네미신, 다이네미신 A; 클로드로네이트와 같은 비포스포네이트; 에스페라미신뿐만 아니라 네오카르지노스타틴 크로모포어 및 관련된 크로모프로테인 엔디인 항생제 크로모포어), 아클라시노마이신, 액티노마이신, 아우트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신 및 데옥시독소루비신, 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 네모루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신 C와 같은 미토마이신, 마이코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포르피로마이신, 퓨로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 유베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실 (5-FU)과 같은 항-대사산물; 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트와 같은 엽산 유사체; 플루다라빈, 6-머캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌과 같은 퓨린 유사체; 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자유리딘, 카르모푸어, 사이타라빈, 디데옥시유리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록스유리딘과 같은 피리미딘 유사체; 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤과 같은 안드로겐; 아미노글루테트이미드, 미토테인, 트릴로스테인과 같은 항-아드레날 (anti-adrenals); 프롤린산과 같은 엽산 보충제; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 에닐루라실; 암사크린; 베스트라부실; 비스안트렌; 에다트렉세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르니틴; 엘립티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 갈륨 니트레이트; 하이드록시우레아; 렌티난; 로니다이닌; 메이탄신 및 안사미토신과 같은 메이탄시노이드; 미토구아존; 미톡산트론; 모피단몰; 니트라에린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로속산트론; 포도필린산; 2-에틸하이드라지드; 프로카르바진; PSK® 폴리사카라이드 컴플렉스 (JHS Natural Products, Eugene, OR); 라족산; 리족신; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센 (특히 T-2 독소, 베라큐린 A, 로리딘 A 및 안구이딘); 우레탄; 빈데신; 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미톨락톨; 피포브로만; 가사이토신; 아라비노사이드 ("Ara-C"); 사이클로포스파미드; 티오테파; 6-티오구아닌; 머캅토퓨린; 메토트렉세이트; 시스플라틴 및 카보플라틴과 같은 백금 유사체; 빈블라스틴; 에토포시드 (VP-16); 이포스파미드; 미톡산트론; 빈크리스틴; 비노렐빈 (나벨빈 (NAVELBINE®)); 노반트론; 테니포시드; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 카페시타빈 (젤로다 (XELODA®), Roche); 이반드로네이트; CPT-11; 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴 (DMFO); 레티노산과 같은 레티노이드; 및 상기한 것 중의 어떤 것의 약제학적으로 허용되는 염, 산 및 유도체.
또한 "화학요법제"의 정의에는 다음이 포함된다: (i) 예를 들어, 타목시펜 (놀바덱스 (NOLVADEX®)를 포함; 타목시펜 시트레이트), 랄록시펜, 드롤록시펜, 4-하이드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤, 및 파레스톤 (FARESTON®) (토레미핀 시트레이트)을 포함하는, 항-에스트로겐 및 선택적 에스트로겐 수용체 변조물질 (SERMs)과 같이 종양에 대한 호르몬 작용을 조절하거나 억제하는 작용을 하는 항호르몬제; (ii) 예를 들어, 4(5)-이미다졸, 아미노글루테트이미드, 메가세 (MEGASE®) (메게스트롤 아세테이트), 아로마신 (AROMASIN®) (엑세메스탄; Pfizer), 포르메스타니, 파드로졸, 리비소르 (RIVISOR®) (보로졸), 페마라 (FEMARA®) (레트로졸; Novartis), 및 아리미덱스 (ARIMIDEX®) (아나스트로졸; AstraZeneca)와 같은, 부신에서 에스트로겐 생산을 조절하는 효소 아로마타제를 억제하는 아로마타제 억제제; (iii) 플루타미드, 닐루타미드, 비칼루타미드, 류프롤리드 및 고세렐린뿐만 아니라 트록사시타빈 (1,3-디옥솔란 뉴클레오사이드 시토신 유사체)과 같은 항-안드로겐; (iv) MEK 억제제 (WO 2007/044515)와 같은 단백질 키나제 억제제; (v) 지질 키나제 억제제; (vi) 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 특히 비정상적인 세포 증식에 연루된 신호전달 경로에서 유전자의 발현을 억제하는 것, 예를 들어, 오블리머센 (제나센스 (GENASENSE®), Genta Inc.)와 같은 PKC-알파, Raf 및 H-Ras; (vii) VEGF 발현 억제제 (예를 들어, 안지오자임 (ANGIOZYME®)) 및 HER2 발현 억제제와 같은 리보자임; (viii) 유전자 요법 백신, 예를 들어, 알로벡틴 (ALLOVECTIN®), 류벡틴 (LEUVECTIN®) 및 백시드 (VAXID®); 프로류킨 (PROLEUKIN®) rIL-2와 같은 백신; 류르토테칸 (LURTOTECAN®); 아바렐릭스 (ABARELIX®) rmRH와 같은 토포이소머라제 1 억제제; (ix) 베바시주맙 (아바스틴 (AVASTIN®), Genentech)과 같은 항-혈관형성제; 및 상기한 것 중의 어떤 것의 약제학적으로 허용되는 염, 산 및 유도체.
"화학요법제"의 정의에는 또한 알렘투주맙 (캄패스 (Campath)), 베바시주맙 (아바스틴 (AVASTIN®), Genentech); 세툭시맙 (에르비툭스 (ERBITUX®), Imclone); 파니투무맙 (벡티빅스 (VECTIBIX®), A㎎en), 리툭시맙 (리툭산 (RITUXAN®), Genentech/Biogen Idec), 오파투무맙 (아르제라 (ARZERRA®, GSK)), 퍼투주맙 (페르제타 (PERJETATM), 옴니타그 (OMNITARG®), 2C4, Genentech), 트라스투주맙 (헤르셉틴 (HERCEPTIN®), Genentech), 토시투모맙 (벡사르 (Bexxar), Corixia), 및 항체 약물 컨주게이트, 젬투주맙 오조가미신 (마일로타그 (MYLOTARG®), Wyeth)과 같은 치료학적 항체가 포함된다.
본 발명의 컨주게이트와 함께 화학요법제로서 치료학적 잠재력을 갖는 인간화된 모노클로날 항체에는 다음이 포함된다: 알렘투주맙, 아폴리주맙, 아셀리주맙, 아틀리주맙, 바피뉴주맙, 베바시주맙, 비바투주맙 메르탄신, 칸투주맙 메르탄신, 세델리주맙, 세르톨리주맙 페골, 시드푸시투주맙, 시드투주맙, 다클리주맙, 에쿨리주맙, 에팔리주맙, 에프라투주맙, 에를리주맙, 펠비주맙, 폰톨리주맙, 젬투주맙 오조가미신, 이노투주맙 오조가미신, 이필리무맙, 라베투주맙, 린투주맙, 마투주맙, 메폴리주맙, 모타비주맙, 모토비주맙, 나탈리주맙, 니모투주맙, 놀로비주맙, 누마비주맙, 오크렐리주맙, 오말리주맙, 팔리비주맙, 파스콜리주맙, 펙푸시투주맙, 펙투주맙, 퍼투주맙, 펙셀리주맙, 랄리비주맙, 라니비주맙, 레슬리비주맙, 레슬리주맙, 레시비주맙, 로벨리주맙, 루플리주맙, 시브로투주맙, 시플리주맙, 손투주맙, 타카투주맙 테트락세탄, 타도시주맙, 탈리주맙, 테피바주맙, 토실리주맙, 토랄리주맙, 트라스투주맙, 투코투주맙 셀모류킨, 투쿠시투주맙, 우마비주맙, 유르톡사주맙, 및 비실리주맙.
본 발명에 따르며 본 발명에 따라서 사용하기 위한 약제학적 조성물은 활성 성분, 즉 컨주게이트 화합물 이외에 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 잘 알려진 약제학적으로 허용되는 부형제, 담체, 완충제, 안정화제 또는 그 밖의 다른 물질을 포함할 수 있다. 이러한 물질은 비-독성이어야 하며, 활성 성분의 효능을 저해하지 않아야 한다. 담체 또는 다른 물질의 정확한 성질은 경구적이거나 주사, 예를 들어, 피부, 피하, 또는 정맥내 주사에 의한 것일 수 있는 투여의 경로에 따라 좌우될 것이다.
경구 투여를 위한 약제학적 조성물은 정제, 캅셀제, 분말 또는 액체 형태일 수 있다. 정제는 고체 담체 또는 보조제를 포함할 수 있다. 액체 약제학적 조성물은 일반적으로 물, 석유, 동물성 또는 식물성 오일, 광유 또는 합성유와 같은 액체 담체를 포함한다. 생리식염수 용액, 덱스트로즈 또는 그 밖의 다른 사카라이드 용액 또는 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 글리콜이 포함될 수 있다. 캅셀제는 젤라틴과 같은 고체 담체를 포함할 수 있다.
정맥내, 피부 또는 피하 주사, 또는 질병 부위에서의 주사의 경우에, 활성 성분은 발열성 물질이 없고, 적합한 pH, 등장성 및 안정성을 갖는 비경구적으로 허용되는 수용액의 형태일 수 있다. 본 기술분야에서 숙련된 전문가는 예를 들어, 염화나트륨 주사, 링거 주사, 락테이트화 링거 주사와 같은 등장성 비히클을 사용하여 적합한 용액을 잘 제조할 수 있다. 보존제, 안정화제, 완충제, 항산화제 및/또는 다른 첨가제가 필요에 따라 포함될 수 있다.
제형
컨주게이트 화합물은 단독으로 사용될 (예를 들어, 투여될) 수 있지만, 이것은 종종 조성물 또는 제형으로 존재하는 것이 바람직하다.
한가지 실시양태에서, 조성물은 본 발명에 기술된 바와 같은 컨주게이트 화합물, 및 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물 (예를 들어, 제형, 제제, 의약)이다.
한가지 실시양태에서, 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제, 부형제, 보조제, 충진제, 완충제, 보존제, 항산화제, 윤활제, 안정화제, 가용화제, 계면활성제 (예를 들어, 습윤제), 차폐제, 착색제, 향미제, 및 감미제를 포함하는 (단, 이들로 제한되지 않는다) 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 잘 알려진 하나 또는 그 이상의 다른 약제학적으로 허용되는 성분과 함께 본 발명에 기술된 바와 같은 적어도 하나의 컨주게이트 화합물을 포함하는 약제학적 조성물이다.
한가지 실시양태에서, 조성물은 추가로 다른 활성 약제, 예를 들어, 다른 치료학적 또는 예방적 약제를 포함한다.
적합한 담체, 희석제, 부형제 등은 표준 약제학 텍스트에서 확인될 수 있다 [참조: 예를 들어, Handbook의 Pharmaceutical Additives, 2nd Edition (eds. M. Ash and I. Ash), 2001 (Synapse Information Resources, Inc., Endicott, New York, USA), Remington's Pharmaceutical Sciences, 20th edition, pub. Lippincott, Williams & Wilkins, 2000; 및 Handbook의 Pharmaceutical Excipients, 2nd edition, 1994].
본 발명의 또 다른 관점은 본 발명에서 정의된 바와 같은 적어도 하나의 [11C]-방사성 표지된 컨주게이트 또는 컨주게이트-유사 화합물을 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 잘 알려진 하나 또는 그 이상의 다른 약제학적으로 허용되는 성분, 예를 들어, 담체, 희석제, 부형제 등과 함께 혼합시키는 것을 포함하여 약제학적 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 분리된 유니트 (예를 들어, 정제 등)으로 제형화되는 경우에, 각각의 유니트는 예정된 양 (투약량)의 활성 화합물을 함유한다.
본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "약제학적으로 허용되는"은 정상적인 의학적 판단의 범위 내에서, 이상적인 이익-위험 비 (benefit/risk 비율)와 균형을 이루어 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응, 또는 다른 문제 또는 합병증이 없이 문제가 되는 대상체 (예를 들어, 인간)의 조직과 접촉시켜 사용하는데 적합한 화합물, 성분, 물질, 조성물, 투약형 등에 관한 것이다. 각각의 담체, 희석제, 부형제 등도 또한 제형의 다른 성분들과 상화적이라는 개념에서 반드시 "허용되어야" 한다.
제형은 약제학의 기술분야에서 잘 알려진 어떤 방법에 의해서라도 제조될 수 있다. 이러한 방법은 활성 화합물을 하나 또는 그 이상의 보조 성분을 구성하는 담체와 회합하도록 유도하는 단계를 포함한다. 일반적으로, 제형은 활성 화합물을 담체 (예를 들어, 액체 담체, 미분된 고체 담체 등)와 균일하고 긴밀하게 회합하도록 한 다음에, 필요한 경우에 생성물을 성형함으로써 제조된다.
제형은 빠르거나 느린 방출; 즉시, 지연, 정기적 (timed) 또는 지속 방출; 또는 이들의 조합을 제공하도록 제조될 수 있다.
비경구 투여 (예를 들어, 주사에 의함)에 적합한 제형은 활성 화합물이 용해되거나, 현탁되거나, 또는 다른 식으로 제공된 (예를 들어, 리포좀 또는 다른 미립자 내에) 수성 또는 비수성이며, 등장성이고, 무-발열성 물질인 멸균 액체 (예를 들어, 용액, 현탁액)를 포함한다. 이러한 액체는 추가로 항산화제, 완충제, 보존제, 안정화제, 정균제, 현탁화제, 농조화제, 및 제형이 계획된 수용주의 혈액 (또는 다른 적절한 체액)과 등장성이 되도록 하는 용질과 같은 그 밖의 다른 약제학적으로 허용되는 성분을 함유할 수 있다. 부형제의 예로는 예를 들어, 물, 알콜, 폴리올, 글리세롤, 식물유 등이 포함된다. 이러한 제형에서 사용하기에 적합한 등장성 담체의 예로는 염화나트륨 주사, 링거 용액, 또는 락테이트화 링거 주사가 포함된다. 전형적으로, 액체 내의 활성 성분의 농도는 약 1 ng/㎖ 내지 약 10 ㎍/㎖, 예를 들어, 약 10　ng/㎖ 내지 약 1 ㎍/㎖이다. 제형은 단위-용량 또는 수회-용량형 밀봉 용기, 예를 들어, 앰플 및 바이알 내에 제공될 수 있으며, 사용하기 직전에 단지 멸균 액체 담체, 예를 들어, 주사용 물을 첨가하는 것만을 필요로 하는 동결-건조된 (동결건조) 조건에서 저장될 수 있다. 즉석 주사 용액 및 현탁액은 멸균 분말, 과립 및 정제로부터 제조될 수 있다.
투약량
컨주게이트 화합물, 및 컨주게이트 화합물을 포함하는 조성물의 적절한 투약량이 환자에 따라서 달라질 수 있다는 것은 본 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 인식될 수 있을 것이다. 최적 투약량을 결정하는 것은 일반적으로, 치료학적 이익의 수준을 모든 위험 또는 유해한 부작용에 대해서 균형이 잡히게 하는 것을 포함한다. 선택된 투약량 수준은 개별적인 화합물의 활성, 투여의 경로, 투여의 시기, 화합물의 배설률, 치료의 지속기간, 조합물 내의 그 밖의 다른 약물, 화합물 및/또는 물질, 상태의 중증도, 및 환자의 종, 성별, 연령, 체중, 상태, 일반적인 건강 및 선형 병력을 포함하는 (단, 이들로 제한되지 않는다) 다양한 인자에 따라 좌우될 수 있다. 화합물의 양 및 투여의 경로는 궁극적으로 의사, 수의사 또는 임상의의 판단에 의할 수 있지만, 투약량은 일반적으로, 작용 부위에서 실질적으로 위험하거나 해로운 부작용을 야기함이 없이 바람직한 효과를 달성하는 국소 농도를 달성하도록 선택될 것이다.
투여는 치료의 과정 전체에 걸쳐서 단일 용량으로 연속적으로 또는 간헐적으로 (예를 들어, 적절한 간격으로 분할된 용량으로) 이루어질 수 있다. 가장 효과적인 투여의 수단 및 투약량을 결정하는 방법은 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 잘 알려져 있으며, 치료에 사용된 제형, 치료의 목적, 치료될 표적 세포(들), 및 치료될 대상체에 따라 달라질 것이다. 단일 또는 수회 투여는 치료하는 의사, 수의사 또는 임상의에 의해서 선택되는 용량 수준 및 패턴으로 수행될 수 있다.
일반적으로, 활성 화합물의 적합한 용량은 1일에 대상체의 체중 킬로그램당 약 100　ng 내지 약 25 ㎎ (더욱 전형적으로 약 1 ㎍ 내지 약 10 ㎎)의 범위이다. 활성 화합물이 염, 에스테르, 아미드, 프로드럭 등인 경우에, 투여되는 양은 모화합물을 기준으로 계산되며, 따라서 사용되는 실중량은 비례해서 증가한다.
한가지 실시양태에서, 활성 화합물은 다음의 투약 방법에 따라 인간 환자에게 투여된다: 약 100 ㎎, 1일 3 회.
한가지 실시양태에서, 활성 화합물은 다음의 투약 방법에 따라 인간 환자에게 투여된다: 약 150 ㎎, 1일 2 회.
한가지 실시양태에서, 활성 화합물은 다음의 투약 방법에 따라 인간 환자에게 투여된다: 약 200 ㎎, 1일 2 회.
그러나, 한가지 실시양태에서 컨주게이트 화합물은 다음의 투약 방법에 따라 인간 환자에게 투여된다: 약 50 또는 약 75 ㎎, 1일 3 또는 4 회.
한가지 실시양태에서, 컨주게이트 화합물은 다음의 투약 방법에 따라 인간 환자에게 투여된다: 약 100 또는 약 125 ㎎, 1일 2 회.
상술한 투약량은 컨주게이트 (PBD 모이어티 및 항체에 대한 링커를 포함)에 대해서, 또는 제공된 PBD 화합물의 유효량, 예를 들어, 링커의 분해 후에 방출될 수 있는 화합물의 양에 대해서 적용할 수 있다.
질환의 예방 또는 치료를 위해서, 본 발명의 ADC의 적절한 투약량은 상기 정의된 바와 같은 치료될 질환의 타입, 질환의 중증도 및 과정, 분자가 예방 또는 치료 목적으로 투여되는지 여부, 선행 치료법, 항체에 대한 환자의 임상력 및 반응, 및 주치의의 판단에 따라 좌우될 것이다. 분자는 적합하게는 한꺼번에 또는 일련의 치료에 걸쳐서 환자에게 투여된다. 질환의 타입 및 중증도에 따라서 약 1 ㎍/㎏ 내지 15 ㎎/㎏ (예를 들어, 0.1-20 ㎎/㎏)의 분자가 예를 들어, 하나 또는 그 이상의 별도의 투여에 의해서든, 또는 연속 주입에 의해서든, 환자에게 투여하기 위한 일차 후보 투약량이다. 전형적인 1일 투약량은 상기 언급된 인자들에 따라서 약 1 ㎍/㎏ 내지 100 ㎎/㎏ 또는 그 이상의 범위일 것이다. 환자에게 투여될 ADC의 예시적인 투약량은 환자의 체중 ㎏당 약 0.1 내지 약 10 ㎎/kg의 범위이다. 며칠 또는 그 이상에 걸친 반복 투여의 경우에, 상태에 따라 치료는 질병 증상의 원하는 억제가 일어날 때까지 지속된다. 예시적인 투약 방법은 약 4 ㎎/㎏의 초기 부하용량에 이어서 ADC를 1 주일, 2 주일 또는 3 주일마다 추가의 용량으로 투여하는 과정을 포함한다. 그 밖의 다른 투약 방법도 유용할 수 있다. 이러한 치료법의 진행은 통상적인 기술 및 시험방법에 의해서 쉽게 모니터링된다.
치료
상태를 치료하는 것과 관련하여 본 명세서에서 사용된 용어 "치료"는 일반적으로 인간 또는 동물 (예를 들어, 수의과 분야에서)의 치료 및 치료법에 관한 것이며, 여기에서 일부의 바람직한 치료학적 효과, 예를 들어, 상태의 진행의 억제가 달성되고, 진행 속도의 감소, 진행 속도의 중단, 상태의 회귀, 상태의 개선, 및 상태의 치유를 포함한다. 예방적 수단 (즉, 예방, 방지)으로서의 치료가 또한 포함된다.
본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "치료학적 유효량"은 바람직한 치료 방법에 따라 투여되는 경우에 일부의 바람직한 치료학적 효과를 제공하는데 효과적이며, 이상적인 이익/위험 비에 적합한 활성 화합물, 또는 활성 화합물을 포함하는 물질, 조성물 또는 투약형의 양에 관한 것이다.
마찬가지로, 본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "예방적 유효량"은 바람직한 치료 방법에 따라 투여되는 경우에 일부의 바람직한 예방 효과를 제공하는데 효과적이며, 이상적인 이익/위험 비에 적합한 활성 화합물, 또는 활성 화합물을 포함하는 물질, 조성물 또는 투약형의 양에 관한 것이다.
약물 컨주게이트의 제조
항체 약물 컨주게이트뿐만 아니라 기타 세포 결합제와의 컨주게이트는, 약물-링커 시약과 세포 결합제 또는 항체의 친핵성 그룹의 반응을 포함하는 것으로서, 당업자에 공지된 유기 화학 반응, 조건 및 시약을 사용하여, 다양한 방법에 의해 제조될 수 있다. 이러한 방법에는, 본 발명의 항체-약물 컨주게이트의 제조를 위해 다양한 항체 및 세포 결합제가 사용될 수 있다.
항체 상의 친핵성 그룹에는 측쇄 티올 그룹, 예를 들어, 시스테인이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다. 티올 그룹은 친핵성이며, 본 발명의 경우와 같은 링커 부분 상의 친전자성 그룹들과의 공유결합을 형성하도록 반응할 수 있다. 특정의 항체는 환원가능한 쇄간 디설파이드, 즉 시스테인 브릿지를 갖는다. 항체는 DTT (클리랜드 (Cleland) 시약, 디티오트레이톨) 또는 TCEP [트리스(2-카복시에틸)포스핀 염화수소산염; Getz et al (1999) Anal. Biochem. Vol 273:73-80; Soltec Ventures, Beverly, MA]와 같은 환원제로 처리함으로써 링커 시약과의 컨주게이션에 대해서 반응성으로 만들 수 있다. 따라서, 각각의 시스테인 디설파이드 브릿지는 이론적으로 2 개의 반응성 티올 친핵체를 형성할 것이다. 추가의 친핵성 그룹은 아민을 티올로 전환시키는 리신과 2-이미노티올란 (트라우트 (Traut) 시약)과의 반응을 통해서 항체 내에 도입될 수 있다.
대상체/환자
대상체/환자는 동물, 포유동물, 태반 포유동물, 유대류 포유동물 (예를 들어, 캥거루, 웜뱃 (wombat)), 단공류 동물 (예를 들어, 오리너구리 (duckbilled platypus)), 설치류 (예를 들어, 기니아피그, 햄스터, 랫트, 마우스), 쥐과의 동물 (예를 들어, 마우스), 토끼목 포유동물 (예를 들어, 토끼), 조류 (예를 들어, 새), 개과의 동물 (예를 들어, 개), 고양이과 동물 (예를 들어, 고양이), 말류 (예를 들어, 말), 돼지류 (예를 들어, 돼지), 양류 (예를 들어, 양), 소류 (예를 들어, 소), 영장류, 유인원류 (예를 들어, 원숭이 또는 유인원), 원숭이류 (예를 들어, 명주원숭이 (marmoset), 개코원숭이 (baboon)), 유인원류　(예를 들어, 고릴라, 침팬지, 오랑우탕, 긴팔원숭이 (gibbon)), 또는 인간일 수 있다.
더구나, 대상체/환자는 발육 중인 그의 모든 형태, 예를 들어, 태아일 수 있다. 한가지 바람직한 실시양태에서, 대상체/환자는 인간이다.
추가의 바람직한 것
하기의 바람직한 것은 상기에서 정의된 바와 같은 본 발명의 모든 측면에 적용될 수 있거나 또는 일 측면과 관련된 것일 수 있다. 이러한 바람직한 것들은 임의의 조합으로 상호 조합될 수 있다.
일부 실시형태에서, R6' R7' R9' 및 Y'은 바람직하게는 각각 R6, R7, R9, 및 Y와 동일하다.
이량체 링크
Y 및 Y'는 바람직하게는 O이다.
R"는 바람직하게는 치환기가 없는 C3 -7 알킬렌기이다. 더욱 바람직하게는, R"는 C3, C5 또는 C7 알킬렌이다. 가장 바람직하게는, R''는 C3 또는 C5 알킬렌이다.
R 6 내지 R 9
R9는 바람직하게는 H이다.
R6은 바람직하게는 H, OH, OR, SH, NH2, 니트로 및 할로에서 선택되고, 더욱 바람직하게는 H 또는 할로이고, 가장 바람직하게는 H이다.
R7은 바람직하게는 H, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR' 및 할로에서 선택되고, 더욱 바람직하게는 독립적으로 H, OH 및 OR(여기서 R은 바람직하게는 임의로 치환된 C1 -7 알킬, C3 -10 헤테로시클릴및 C5 -10 아릴기에서 선택됨)에서 선택된다. R은 더욱 바람직하게는 치환 또는 비치환될 수 있는 C1 -4 알킬기일 수 있다. 대상이 되는 치환기는 C5 -6 아릴기(예를 들어 페닐)이다. 특히 바람직한 7 위치의 치환기는 OMe 및 OCH2Ph이다. 대상이 될 가능성이 높은 다른 치환기는 디메틸아미노(즉, NMe2); -(OC2H4)qOMe(여기서, q는 0 내지 2임); 모르포리노, 피페리디닐 및 N-메틸-피페라지닐을 포함하는 니트로젠-함유 C6 헤테로시클릴이다.
이들 바람직한 것은 각각 R9', R6' 및 R7' 에 적용된다.
R 12
C2' 및 C3' 사이에 이중 결합이 존재하는 경우, R12는 하기 군에서 선택된다:
(a) 할로, 니트로, 시아노, 에테르, C1 -7 알킬, C3 -7 헤테로시클릴 및 비스-옥시-C1 -3 알킬렌을 포함하는 군에서 선택되는 하나 또는 그 이상의 치환기에 의해 임의 치환된, C5 -10 아릴기;
(b) C1 -5 포화 지방족 알킬;
(c) C3 -6 포화 시클로알킬;
(d)
Figure pct00099
(여기서 각각의 R21, R22 및 R23 는 독립적으로 H, C1 -3 포화 알킬, C2 -3 알케닐, C2 -3 알키닐 및 시클로프로필에서 선택되며, R12 기에서 탄소 원자의 총 숫자는 5 이하임);
(e)
Figure pct00100
(여기서 R25a 및 R25b 중 하나는 H이고 나머지 하나는: 할로 메틸, 메톡시에서 선택되는 기에 의해 임의 치환된 페닐; 피리딜; 및 티오페닐에서 선택됨); 및
(f)
Figure pct00101
(여기서 R24가 H; C1 -3 포화 알킬; C2 -3 알케닐; C2 -3 알키닐; 시클로프로필; 할로 메틸, 메톡시에서 선택되는 기에 의해 임의 치환된 페닐; 피리딜; 및 티오페닐에서 선택됨)
R12가 C5 -10 아릴기인 경우, C5 -7 아릴기일 수 있다. C5 -7 아릴기는 페닐기 또는 C5-7 헤테로아릴기, 예를 들면 푸라닐, 티오페닐 및 피리딜일 수 있다. 일부 실시형태에서, R12는 바람직하게는 페닐이다. 다른 실시형태에서, R12는 바람직하게는 티오페닐, 예를 들어, 티오펜-2-일 및 티오펜-3-일이다.
R12가 C5 -10 아릴기인 경우, C8 -10 아릴, 예를 들어, 퀴놀리닐 또는 이소퀴놀리닐기일 수 있다. 상기 퀴놀리닐 또는 이소퀴놀리닐기는 임의의 유효한 고리 위치를 통해 PBD 중심에 결합될 수 있다. 예를 들어, 상기 퀴놀리닐은 퀴놀린-2-일, 퀴놀린-3-일, 퀴놀린-4-일, 퀴놀린-5-일, 퀴놀린-6-일, 퀴놀린-7-일 및 퀴놀린-8-일 일 수 있다. 이 중 퀴놀린-3-일 및 퀴놀린-6-일이 바람직할 수 있다. 상기 이소퀴놀리닐은 이소퀴놀린-1-일, 이소퀴놀린-3-일, 이소퀴놀린-4-일, 이소퀴놀린-5-일, 이소퀴놀린-6-일, 이소퀴놀린-7-일 및 이소퀴놀린-8-일 일 수 있다. 이 중 이소퀴놀린-3-일 및 이소퀴놀린-6-일이 바람직할 수 있다.
R12가 C5 -10 아릴기인 경우, 임의의 수의 치환기를 가질 수 있다. 바람직하게는 1 내지 3개의 치환기, 더욱 바람직하게는 1 및 2개 치환기 및 가장 바람직하게는 1개 치환기를 갖는다. 상기 치환기는 임의의 위치일 수 있다.
R12가 C5 -7 아릴기인 경우, 단일 치환기는 화합물의 나머지 부분과의 결합에 인접하지 않은 고리 원자 상에 있는 것이 바람직하다, 즉, 화합물의 나머지 부분에 대한 β 또는 γ 결합이 바람직하다. 따라서, C5 -7 아릴기가 페닐인 경우, 상기 치환기는 바람직하게는 메타- 또는 파라-위치 및 더욱 바람직하게는 파라-위치이다.
R12가 C8 -10 아릴기, 예를 들어 퀴놀리닐 또는 이소퀴놀리닐인 경우, 퀴놀린 또는 이소퀴놀린 고리의 임의의 위치에 임의의 수의 치환기를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 2 또는 3개 치환기를 가지고, 이들은 근위 및 원위 고리 중 하나 또는 모두(복수의 치환기인 경우)에 존재할 수 있다.
R 12 치환기, R 12 가 C 5 -10 아릴기인 경우
R12가 C5 -10 아릴기인 경우, R12 상 치환기가 할로이면, 치환기는 바람직하게는 F 또는 Cl, 더욱 바람직하게는 Cl이다.
R12가 C5 -10 아릴기인 경우, R12 상 치환기가 에테르이면, 치환기는 일부 실시형태에서, C1 -7 알콕시기, 예를 들면 알콕시기(예를 들어, 메톡시, 에톡시) 일 수 있거나 또는 일부 실시형태에서, C5 -7 아릴옥시기(예를 들어 페녹시, 피리딜옥시, 푸라닐옥시) 일 수 있다. 상기 알콕시기는 그 자체가, 예를 들어 아미노기(예를 들어, 디메틸아미노)에 의해 추가 치환될 수 있다.
R12가 C5 -10 아릴기인 경우, R12 상 치환기가 C1 -7 알킬이면, 치환기는 바람직하게는 C1 -4 알킬기(예를 들어, 메틸, 에틸, 프로필, 부틸) 일 수 있다.
R12가 C5 -10 아릴기인 경우, R12 상 치환기가 C3 -7 헤테로시클릴이면, 치환기는 일부 실시형태에서 헤테로시클릴기, 예를 들어, 모르폴리노, 티오모르폴리노, 피페리디닐, 피페라지닐을 포함하는 C6 질소일 수 있다. 이들 기는 질소 원자를 통해 PBD 모이어티의 나머지에 결합할 수 있다. 이들 기는, 예를 들어 C1 -4 알킬기에 의해 추가 치환될 수 있다. 헤테로시클릴기를 포함하는 C6 질소가 피페라지닐일 경우, 상기 추가 치환기는 2차 질소 고리 원자 상 일 수 있다.
R12가 C5 -10 아릴기인 경우, R12 상 치환기가 비스-옥시-C1 -3 알킬렌이면, 바람직하게는 비스-옥시-메틸렌 또는 비스-옥시-에틸렌이다.
R12가 C5 -10 아릴 기인 경우, R12의 치환기가 에스테르라면, 메틸 에스테르 또는 에틸 에스테르가 바람직하다.
R12가 C5 -10 아릴기인 경우, 특히 바람직한 치환기는 메톡시, 에톡시, 플루오로, 클로로, 시아노, 비스-옥시-메틸렌, 메틸-피페라지닐, 모르폴리노 및 메틸-티오페닐을 포함한다. R12의 특히 바람직한 다른 치환기는 디메틸아미노프로필옥시 및 카르복시이다.
R12가 C5 -10 아릴기인 경우, 특히 바람직하게 치환된 R12기는, 4-메톡시-페닐, 3-메톡시페닐, 4-에톡시-페닐, 3-에톡시-페닐, 4-플루오로-페닐, 4-클로로-페닐, 3,4-비스옥시메틸렌-페닐, 4-메틸티오페닐, 4-시아노페닐, 4-페녹시페닐, 퀴놀린-3-일 및 퀴놀린-6-일, 이소퀴놀린-3-일 및 이소퀴놀린-6-일, 2-티에닐, 2-푸라닐, 메톡시나프틸 및 나프틸을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 치환된 다른 가능한 R12기는 4-니트로페닐이다. 대상이 될 가능성이 높은 R12기는 4-(4-메틸피페라진-1-일)페닐 및 3,4-비스옥시메틸렌-페닐을 포함한다.
R12 가 C1 -5 포화 지방족 알킬인 경우, 이는 메틸, 에틸, 프로필, 부틸 또는 펜틸일 수 있다. 일부 실시형태에서, 이는 메틸, 에틸 또는 프로필(n-펜틸 또는 이소프로필)일 수 있다. 이들 실시형태의 일부에서, 이는 메틸일 수 있다. 다른 실시형태에서, 이는 선형 또는 분지형인 부틸 또는 펜틸일 수 있다.
R12 가 C3 -6 포화 시클로알킬인 경우, 이는 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸 또는 시클로헥실일 수 있다. 일부 실시형태에서, 이는 시클로프로필일 수 있다.
R12 가
Figure pct00102
인 경우, 각각의 R21, R22 및 R23 는 독립적으로 H, C1 -3 포화 알킬, C2 -3 알케닐, C2 -3 알키닐 및 시클로프로필에서 선택되며, R12 기에서 탄소 원자의 총 숫자는 5 이하이다. 일부 실시형태에서, R12 기에서 탄소 원자의 총 숫자는 4 이하 또는 3 이하이다.
일부 실시형태에서, R21, R22 및 R23 중 하나는 H이며, 이때 나머지 두 기는 H, C1-3 포화 알킬, C2 -3 알케닐, C2 -3 알키닐 및 시클로프로필에서 선택된다.
다른 실시형태에서, R21, R22 및 R23 중 둘은 H이며, 이때 나머지 기는 H, C1 -3 포화 알킬, C2 -3 알케닐, C2 -3 알키닐 및 시클로프로필로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, H가 아닌 기는 메틸 및 에틸로부터 선택된다. 이들 실시형태의 일부에서, H가 아닌 기는 메틸이다.
일부 실시형태에서, R21는 H이다.
일부 실시형태에서, R22는 H이다.
일부 실시형태에서, R23는 H이다.
일부 실시형태에서, R21 및 R22는 H이다.
일부 실시형태에서, R21 및 R23는 H이다.
일부 실시형태에서, R22 및 R23는 H이다.
대상이 될 가능성이 높은 R12기는
Figure pct00103
이다:
R12가
Figure pct00104
인 경우, R25a 및 R25b 중 하나는 H이며 나머지 하나는 페닐 (여기서 페닐은 할로, 메틸, 메톡시에서 선택되는 기에 의해 임의로 치환됨), 피리딜, 및 티오페닐에서 선택된다. 일부 실시형태에서, H가 아닌 기는 임의로 치환된 페닐이다. 페닐 임의 치환기가 할로일 경우, 이는 바람직하게는 플루오로이다. 일부 실시형태에서, 페닐기는 비치환된다.
R12가
Figure pct00105
인 경우, R24 는 H, C1 -3 포화 알킬, C2 -3 알케닐, C2 -3 알키닐, 시클로프로필, 페닐(여기서 페닐은 할로, 메틸, 메톡시에서 선택된 기에 의해 임의로 치환됨), 피리딜, 및 티오페닐에서 선택된다. 페닐 임의 치환기가 할로일 경우, 이는 바람직하게는 플루오로이다. 일부 실시형태에서, 페닐기는 비치환된다.
일부 실시형태에서, R24 는 H,메틸,에틸, 에테닐에서 선택된다. 이들 실시형태의 일부에서, R24 는 H 및 메틸에서 선택된다.
C2' 및 C3' 사이에 단일 결합이 존재하는 경우, R12는
Figure pct00106
이고, 여기서 R26a 및 R26b 는 H, F, C1 -4 포화 알킬, C2 -3 알케닐에서 독립적으로 선택되거나(알킬 및 알케닐기는 C1 -4 알킬 아미도 및 C1 -4 알킬 에스테르에서 선택되는 군에 의해 임의 치환됨), R26a 및 R26b 중 하나가 H인 경우, 나머지 하나는 니트릴 및 C1 -4 알킬 에스테르에서 선택된다.
일부 실시형태에서, R26a 및 R26b는 둘 모두 H인 것이 바람직하다.
다른 실시형태에서, R26a 및 R26b가 둘 모두 메틸인 것이 바람직하다.
추가의 실시형태에서, R26a 및 R26b 중 하나가 H인 것이 바람직하고, 나머지 하나는 C1 -4 포화 알킬, C2 -3 알케닐에서 선택된다(알킬 및 알케닐기는 임의 치환됨). 이러한 추가 실시형태에서, H가 아닌 기가 메틸 및 에틸에서 선택되는 것이 더욱 바람직할 수 있다.
R 2
R12에 대한 상기의 바람직한 것들은 R2에도 동일하게 적용된다.
R 22
일부 실시형태에서, R22는 화학식 IIa를 갖는다.
화학식 IIa인 R22의 A는 페닐 기 또는 a C5 -7 헤테로아릴 기, 예를 들어 푸라닐, 티오페닐 및 피리딜일 수 있다. 일부 실시형태에서, A는 바람직하게는 페닐이다.
Q2-X는 C5 -7 아릴 기의 유효한 임의의 고리 원자 상 존재할 수 있으나, 화합물의 나머지와의 결합과 인접하지 않은 고리 원자 상 존재하는 것이 바람직하다. 즉, 화합물의 나머지와의 결합에 대해 β 또는 γ인 것이 바람직하다. 따라서, C5 -7 아릴 기 (A)가 페닐인 경우, 치환기 (Q2-X)는 메타- 또는 파라-위치인 것이 바람직하고, 파라-위치가 더욱 바람직하다.
일부 실시형태에서, Q1은 단일 결합이다. 이들 실시형태에서, Q2는 단일 결합 및 -Z-(CH2)n- (여기서, z는 단일 결합, O, S 및 NH에서 선택되고, 1 내지 3임)에서 선택된다. 이들 실시형태 중 일부의 경우, Q2는 단일 결합이다. 다른 실시형태에서, Q2는 -Z-(CH2)n-이다. 이들 실시형태에서, Z는 O 또는 S일 수 있고, n은 1이거나 또는 2일 수 있다. 이들 실시형태 중 다른 것의 경우, Z는 단일 결합일 수 있고, n은 1일 수 있다.
다른 실시형태에서, Q1은 -CH=CH-이다.
다른 실시형태에서, R22는 화학식 IIb를 갖는다. 이들 실시형태에서, RC1, RC2 및 RC3 은 독립적으로, H 및 비치환 C1 -2 알킬에서 선택된다. 일부 바람직한 실시형태에서, RC1, RC2 및 RC3은 둘 모두 H이다. 다른 실시형태에서, RC1, RC2 및 RC3은 모두 메틸이다. 특정 실시형태에서, RC1, RC2 및 RC3 은 독립적으로 H 및 메틸에서 선택된다.
X는 O-RL2', S-RL2', CO2-RL2', CO-RL2', NH-C(=O)-RL2', NHNH-RL2', CONHNH-RL2',
Figure pct00107
, NRNRL2'으로 이루어진 목록에서 선택되는 기이고, 여기서 RN 은 H 및 C1 -4 알킬을 포함하는 군에서 선택된다. X는 바람직하게는 OH, SH, CO2H, -N=C=O 또는 NHRN일 수 있고, 더욱 바람직하게는: O-RL2', S-RL2', CO2-RL2', -NH-C(=O)-RL2' 또는 NH-RL2'일 수 있다. 특히 바람직한 기에는 O-RL2', S-RL2'및 NH-RL2'가 포함되고, NH-RL2'가 가장 바람직한 기이다.
일부 실시형태에서 R22는 화학식 IIc를 갖는다. 이들 실시형태에서, Q가 NRN-RL2'인 것이 바람직하다. 다른 실시형태에서, Q는 O-RL2'이다. 추가의 실시형태에서, Q는 S-RL2'이다. RN은 바람직하게는 H 및 메틸에서 선택된다. 일부 실시형태에서, RN은 H이다. 다른 실시형태에서, RN은 메틸이다.
일부 실시형태에서, R22는 -A-CH2-X 및 -A-X일 수 있다. 이들 실시형태에서, X는 O-RL2', S-RL2', CO2-RL2', CO-RL2' 및 NH-RL2'일 수 있다. 특히 바람직한 실시형태에서, X는 NH-RL2'일 수 있다.
R 10 , R 11
일부 실시형태에서, R10 및 R11은 함께, 이들이 결합되는 질소 원자와 탄소 원자 사이에 이중 결합을 형성한다.
일부 실시형태에서, R11은 OH이다.
일부 실시형태에서, R11은 OMe이다.
일부 실시형태에서, R11은 SOzM (여기서, z는 2 또는 3이고, M은 1가의 약학적으로 허용가능한 양이온임)이다.
R 11a
일부 실시형태에서, R11a은 OH이다.
일부 실시형태에서, R11a은 OMe이다.
일부 실시형태에서, R11a은 SOzM (여기서, z는 2 또는 3이고, M은 1가의 약학적으로 허용가능한 양이온임)이다.
R 20 , R 21
일부 실시형태에서, R20 및 R21은 함께, 이들이 결합되는 질소 원자와 탄소 원자 사이에 이중 결합을 형성한다. .
일부 실시형태에서, R20은 H이다.
일부 실시형태에서, R20은 RC이다
일부 실시형태에서, R21은 OH이다.
일부 실시형태에서, R21은 OMe이다.
일부 실시형태에서, R21은 SOzM (여기서, z는 2 또는 3이고, M은 1가의 약학적으로 허용가능한 양이온임)이다.
R 30 , R 31
일부 실시형태에서, R30 및 R31은 함께, 이들이 결합되는 질소 원자와 탄소 원자 사이에 이중 결합을 형성한다. .
일부 실시형태에서, R31은 OH이다.
일부 실시형태에서, R31은 OMe이다.
일부 실시형태에서, R31은 SOzM (여기서, z는 2 또는 3이고, M은 1가의 약학적으로 허용가능한 양이온임)이다.
M 및 z
M 은 1가의 약학적으로 허용가능한 양이온인 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 Na+이다.
z는 바람직하게는 3이다.
본 발명의 제1 측면의 바람직한 컨주게이트는 하기 화학식 Ia의 DL을 가질 수 있다:
Figure pct00108
상기 식에서,
RL1', R20 및 R21은 상기에서 정의된 바와 같고;
n은 1 또는 3이고;
R1a 는 메틸 또는 페닐이고;
R2a는 하기에서 선택된다:
(a)
Figure pct00109
(b)
Figure pct00110
(c)
Figure pct00111
(d)
Figure pct00112
(e)
Figure pct00113
(f)
Figure pct00114
(g)
Figure pct00115
; 및
(h)
Figure pct00116
본 발명의 제1 측면의 바람직한 컨주게이트는 하기 화학식 Ib의 DL을 가질 수 있다:
Figure pct00117

상기 식에서,
RL1', R20 및 R21은 상기에서 정의된 바와 같고;
n은 1 또는 3이고;
R1a는 메틸 또는 페닐이다.
본 발명의 제1 측면의 바람직한 컨주게이트는 하기 화학식 Ic의 DL을 가질 수 있다:
Figure pct00118
상기 식에서,
RL2', R10, R11, R30 및 R31은 상기에서 정의된 바와 같고;
n은 1 또는 3이고;
R12a는 하기에서 선택되고:
(a)
Figure pct00119
(b)
Figure pct00120
(c)
Figure pct00121
(d)
Figure pct00122
(e)
Figure pct00123
(f)
Figure pct00124
(g)
Figure pct00125
; 및
(h)
Figure pct00126
아미노 기는 페닐 기의 메타 또는 파라 중 하나의 위치에 존재한다.
본 발명의 제1 측면의 바람직한 컨주게이트는 하기 화학식 Id의 DL을 가질 수 있다:
Figure pct00127
상기 식에서,
RL2', R10, R11, R30 및 R31은 상기에서 정의된 바와 같고
n은 1 또는 3이고;
R1a 는 메틸 또는 페닐이고;
R12a는 하기에서 선택된다:
(a)
Figure pct00128
(b)
Figure pct00129
(c)
Figure pct00130
(d)
Figure pct00131
(e)
Figure pct00132
(f)
Figure pct00133
(g)
Figure pct00134
; 및
(h)
Figure pct00135
본 발명의 제1 측면의 바람직한 컨주게이트는 하기 화학식 Ie의 DL을 가질 수 있다:
Figure pct00136
상기 식에서,
RL2', R10, R11, R30 및 R31은 상기에서 정의된 바와 같고
n은 1 또는 3이고;
R1a 는 메틸 또는 페닐이고;
R12a는 하기에서 선택된다:
(a)
Figure pct00137
(b)
Figure pct00138
(c)
Figure pct00139
(d)
Figure pct00140
(e)
Figure pct00141
(f)
Figure pct00142
(g)
Figure pct00143
; 및
(h)
Figure pct00144
실시예
일반적인 실험 방법
ADP 220 편광계(Bellingham Stanley Ltd.) 상에서 광학 회전을 측정하고, 농도(c)를 g/100 ㎖로 제공하였다. 융점은 디지털 융점 장치(Electrothermal)를 이용하여 측정하였다. IR 스펙트럼을 Perkin-Elmer Spectrum 1000 FT IR 분광계 상에 기록하였다. 각각 400 및 100 MHz에서 Bruker Avance NMR 분광계를 이용하여 300 K에서 1H 및 13C NMR 스펙트럼을 얻었다. TMS(δ = 0.0 ppm)에 대한 화학적 이동을 기재하고, 신호를 헤르츠(Hz)로 주어지는 커플링 상수와 함께, s(단일항), d(이중항), t(삼중항), dt(이중 삼중항), dd(이중항의 이중항), ddd(이중항의 이중 이중항) 또는 m(다중항)으로 나타내었다. Waters 2996 PDA와 함께 Waters 2695 HPLC에 결합된 Waters Micromass ZQ 기기를 이용하여 질량 분광계(MS) 데이터를 수집하였다. 사용된 Waters Micromass ZQ 변수는 하기와 같다: 모세관(kV), 3.38; 원뿔(V), 35; 추출기(V), 3.0; 소스 온도(℃), 100; 탈용매화 온도(℃), 200; 원뿔 유속(L/h), 50; 탈-용매화 유속(L/h), 250. 샘플을 기기에 도입하기 위한 금속 코팅 붕규산염 유리 팁(tip)을 이용하여 포지티브 W 모드의 Waters Micromass QTOF Global 상에서 고해상도 질량 분광계(HRMS) 데이터를 기록하였다. 실리카 겔 알루미늄 플레이트(Merck 60, F254) 상에서 박층 크로마토그래피(TLC)를 수행하고, 실리카 겔(Merck 60, 230-400 메쉬 ASTM)을 사용하여 플래쉬 크로마토그래피를 수행하였다. HOBt(NovaBiochem) 및 고체-지지 시약(Argonaut)을 제외하고는, 모든 다른 화학 물질 및 용매는 시그마-알드리치로부터 구입하고, 추가의 정제 없이 공급된 대로 사용하였다. 적절한 건조제의 존재 하에 건조 질소 대기 하에서 증류에 의해 무수 용매를 제조하고, 4Å 분자체 또는 나트륨 와이어 상에 보관하였다. 석유 에테르는 40-60℃에서 비등하는 분획을 지칭한다.
일반적 LC/MS 조건:
방법 1 (디폴트 방법, 달리 언급되지 않는 경우 사용)
HPLC (Waters Alliance 2695)를 물 (A) (포름산 0.1%) 및 아세토니트릴 (B) (포름산 0.1%)의 이동상을 이용하여 구동시켰다. 구배: 초기 조성물 5% B를 1.0 min 이상 유지시킨 다음, 3 분 이상 5% B에서 95% B로 증가시켰다. 상기 조성물을 95% B에서 0.1 분 동안 유지시킨 다음, 0.03 내에 5% B로 되돌리고, 0.87 분 동안 그대로 유지하였다. 총 구동 시간은 5 분이었다.
방법 2
HPLC (Waters Alliance 2695)를 물 (A) (포름산 0.1%) 및 아세토니트릴 (B) (포름산 0.1%)의 이동상을 이용하여 구동시켰다. 구배: 초기 조성물 5% B를 1.0 min 이상 유지시킨 다음, 2.5 분 이상 5% B에서 95% B로 증가시켰다. 상기 조성물을 95% B에서 0.5 분 동안 유지시킨 다음, 0.9 분 동안 그대로 유지하였다. 총 구동 시간은 5 분이었다.
두 방법 모두의 경우
질량 분광기로 통과하는 무결점 용적 티 피스를 통해 유속 3.0 mL/min의 400μL를 분리시켰다. 파장 검출 범위: 220 내지 400 nm. 작동 유형: 다이오드 어레이 (535 스캔). 칼럼: Phenomenex Onyx Monolithic C18 50 x 4.60 mm.
역상 플래쉬 정제 조건은 하기와 같다: 플래쉬 정제 시스템 (Varian 971-Fp)을 물 (A) 및 아세토니트릴 (B)의 이동상을 이용하여 구동시켰다. 구배: 20 C.V. (칼럼 용적)에서 초기 조성물 5% B, 이후 60 C.V. 내에 5% B에서 70% B로. 상기 조성물 95% B에서 15 C.V. 동안 유지시킨 다음, 5 C.V. 내에 5% B로 되돌리고, 5%B에서 10 C.V. 동안 유지시켰다. 총 구동 시간은 120 C.V.이었다. 유속 6.0 mL/min. 파장 검출 범위: 254 nm. 칼럼: Agilent AX1372-1 SF10-5.5gC8.
예비 HPLC: 역상 초고성능 액체 크로마토그래피 (UPLC)를 하기 치수의 Phenomenex Gemini NX 5μ C-18 칼럼 상에서 수행하였다: 분석용 150 x 4.6 mm, 및 예비 작업용 150 x 21.20 mm. 모든 UPLC 실험을 구배 조건으로 수행하였다. 사용된 용리물은 용매 A (H2O, 0.1% 포름산) 및 용매 B (CH3CN, 0.1% 포름산)이었다. 사용된 유속은 분석의 경우 1.0 ml/min이었고, 예비 HPLC의 경우 20.0 ml/min이었다. 254 및 280 nm에서 검출하였다.
중간체 12의 합성
Figure pct00145
(a) 1',3'-비스[2-메톡시-4-(메톡시카르보닐)페녹시]프로판 (3)
*0-5℃ (얼음/아세톤)에서 질소 대기 하에 60 분 이상 디이소프로필 아조디카르복실레이트 (71.3 mL, 73.2 g, 362 mmol)를 미리 교반한 무수 THF (800 mL) 중의 메틸 바닐레이트 2 (60.0 g, 329 mmol) 및 Ph3P (129.4 g, 494 mmol)의 용액에 적가하였다. 0-5℃에서 추가의 1 시간 동안 상기 반응 혼합물을 교반한 다음, 20 분 이상 THF (12 mL) 중의 1,3-프로판디올 (11.4 mL, 12.0 g, 158 mmol)의 용액을 적가하였다. 상기 반응 혼합물을 실온으로 가온시키고, 5일 동안 교반하였다. 생성된 백색 침전물 3을 진공 여과에 의해 수집하고, THF로 세척하고, 진공 데시케이터에서 항량으로 건조시켰다. 수율 = 54.7 g (1,3-프로판디올을 토대로 84%). 충족 순도 LC/MS (3.20 분 (ES+) m/z (상대 강도) 427 ([M + Na]+., 10); 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ7.64 (dd, 2H, J = 1.8, 8.3 Hz), 7.54 (d, 2H, J = 1.8 Hz), 6.93 (d, 2H, J = 8.5 Hz), 4.30 (t, 4H, J = 6.1 Hz), 3.90 (s, 6H), 3.89 (s, 6H), 2.40 (p, 2H, J = 6.0 Hz).
(b) 1',3'-비스[2-메톡시-4-(메톡시카르보닐)-5-니트로페녹시]프로판 (4)
0-5℃ (얼음/아세톤)에서 고체 Cu(NO3)2.3H2O (81.5 g, 337.5 mmol)를 미리 교반한 아세트산 무수물 (650 mL) 중의 비스-에스테르 3 (54.7 g, 135 mmol)의 슬러리에 서서히 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 1 시간 동안 0-5℃에서 교반한 다음, 실온으로 가온시켰다. 상기 혼합물의 농밀화 및 NO2의 발전에 의해 수반되는 마일드 엑소덤 (약 40-50℃) 이 단계에서 관찰되었다. 추가의 아세트산 무수물 (300 mL)를 첨가하고, 상기 반응 혼합물을 16 시간 동안 실온에서 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 얼음 (~ 1.5 L)에 붓고, 교반하고, 실온으로 회복시켰다. 생성된 노란색 침전물을 진공 여과에 의해 수집하고, 데시케이터에서 건조하여, 노란색 고체로서 목적 비스-니트로 화합물 4를 제공하였다. 수율 = 66.7 g (100%). 충족 순도 LC/MS (3.25 분 (ES+) m/z (상대 강도) 517 ([M + Na]+., 40); 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ7.49 (s, 2H), 7.06 (s, 2H), 4.32 (t, 4H, J = 6.0 Hz), 3.95 (s, 6H), 3.90 (s, 6H), 2.45-2.40 (m, 2H).
(c) 1',3'-비스(4-카르복시-2-메톡시-5-니트로페녹시) 프로판 (5)
THF (700 mL) 중의 메틸 에스테르 4 (66.7 g, 135 mmol)의 슬러리를 1N NaOH (700 mL)로 처리하고, 상기 반응 혼합물을 실온에서 활발하게 교반하였다. 4일 동안 교반 후, 상기 슬러리는 어두운 색의 용액으로 변하였고, 이것은 감압 하의 회전식 증발에 적용하여, THF를 제거하였다. 생성된 수성 잔기를 농축된 HCl에 의해 pH 1로 산성화시키고,무색 침전물 5를 수집하고, 진공 오븐 (50 ℃)에서 완전히 건조하였다. 수율 = 54.5 g (87%). 충족 순도 LC/MS (2.65 분 (ES+) m/z (상대 강도) 489 ([M + Na]+., 30)); 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ7.62 (s, 2H), 7.30 (s, 2H), 4.29 (t, 4H, J = 6.0 Hz), 3.85 (s, 6H), 2.30-2.26 (m, 2H).
(d) 1,1'-[[(프로판-1,3-디일)디옥시]비스[(5-메톡시-2-니트로-1,4-페닐렌)카르보닐]]비스[(2S,4R)-메틸-4-히드록시피롤리딘-2-카르복실레이트] (6)
염화 옥살릴 (24.5 mL, 35.6 g, 281 mmol)를 무수 DCM (600mL) 중의 니트로벤조산 5 (43 g, 92.3 mmol) 및 DMF (6 mL)의 교반 현탁액에 첨가하였다. 초기 비등 후, 상기 반응 현탁액은 용액이 되었고, 상기 혼합물을 실온에서 16 시간 동안 교반하였다. 상기 반응 혼합물의 샘플을 MeOH로 처리함으로써, 산 염화물로의 전환을 확인하였고, 생성된 비스-메틸 에스테르를 LC/MS에 의해 관찰하였다. 대부분의 용매를 감압 하에 증발에 의해 제거하고; 생성된 농축된 용액을 최소량의 건조 DCM에 재용해시키고, 디에틸 에테르로 분말화하였다. 생성된 노란색 침전물을 여과에 의해 수집하고, 냉각 디에틸 에테르로 세척하고, 1 시간 동안 40℃의 진공 오븐에서 건조하였다. -40℃ (건조 얼음/CH3CN)에서 25 분 이상 고체 산 염화물을 DCM (400mL) 중의 (2S,4R)-메틸-4-히드록시피롤리딘-2-카르복실레이트 염화수소산염 (38.1 g, 210 mmol) 및 TEA (64.5 mL, g, 463 mmol)의 교반 현탁액에 한 방울씩 첨가하였다. LC/MS (2.47 분 (ES+) m/z (상대 강도) 721 ([M + H]+., 100)에 의해 판단된 바와 같이, 그 즉시, 상기 반응이 완료되었다. 상기 혼합물을 DCM (200 mL)으로 희석하고, 1N HCl (300 mL), 포화 NaHCO3 (300 mL), 염수 (400 mL)로 세척하고, 건조하고 (MgSO4), 여과하고,진공에서 용매를 증발시켜, 오렌지색 고체 (66.7 g, 100%)로서 순수 생성물 6을 제공하였다. [a]22D = -46.1°(c = 0.47, CHCl3); 1H NMR (400 MHz, CDCl3) (회전 이성질체) δ7.63 (s, 2H), 6.82 (s, 2H), 4.79-4.72 (m, 2H), 4.49-4.28 (m, 6H), 3.96 (s, 6H), 3.79 (s, 6H), 3.46-3.38 (m, 2H), 3.02 (d, 2H, J = 11.1 Hz), 2.48-2.30 (m, 4H), 2.29-2.04 (m, 4H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) (회전 이성질체) δ172.4, 166.7, 154.6, 148.4, 137.2, 127.0, 109.7, 108.2, 69.7, 65.1, 57.4, 57.0, 56.7, 52.4, 37.8, 29.0; IR (ATR, CHCl3) 3410 (br), 3010, 2953, 1741, 1622, 1577, 1519, 1455, 1429, 1334, 1274, 1211, 1177, 1072, 1050, 1008, 871 cm-1; MS (ES+) m/z (상대 강도) 721 ([M + H]+., 47), 388 (80); HRMS [M + H]+. 이론치 C31H36N4O16 m/z 721.2199, 실측치 (ES+) m/z 721.2227.
(e) 1,1'-[[(프로판-1,3-디일)디옥시]비스(11aS,2R)-2-(히드록시)-7-메톡시-1,2,3,10,11,11a-헥사하이드로-5H-피롤로[2,1-c][1,4]-벤조디아제핀-5,11-디온] (7)
방법 A: 새로 구입한 Raney®nickel (H2O 중의 ~ 50% 슬러리의 ~ 50 g) 및 비등석을 넣은 5L 3 구 둥근 바닥 플라스크에 MeOH (2.8 L)중의 니트로-에스테르 6 (44 g, 61.1 mmol)의 용액을 첨가하였다. 상기 혼합물을 환류에서 가열한 다음, MeOH (200 mL) 중의 히드라진 하이드레이트 (21.6 mL, 22.2 g, 693 mmol)의 용액을 적가하였고, 이때 활발한 비등이 관찰되었다. 첨가 완료시 (~ 45 min), 비등이 멈출 때까지 추가의 Raney®nickel을 주의하여 첨가하고,초기 노란색의 반응 혼합물을 버렸다. 추가의 5 분 동안 환류에서 상기 혼합물을 가열하고, 이때 상기 반응물은 TLC (90:10 v/v CHCl3/MeOH) 및 LC/MS (2.12 분 (ES+) m/z (상대 강도) 597 ([M + H]+., 100))에 의해 완료된 것으로 나타났다. 상기 반응 혼합물을, 진공 흡인에 의해 셀라이트를 포함하는 소결 깔때기를 통해 즉시 고온 여과하였다. 여과물을 진공에서 증발에 의해 용적을 감소시키고, 이때 생성된 무색 침전물을 여과에 의해 수집하고, 진공 데시케이터에서 건조하여 7 (31 g, 85%)을 제공하였다. [α]27D = +404°(c = 0.10, DMF); 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ10.2 (s, 2H, NH), 7.26 (s, 2H), 6.73 (s, 2H), 5.11 (d, 2H, J = 3.98 Hz, OH), 4.32-4.27 (m, 2H), 4.19-4.07 (m, 6H), 3.78 (s, 6H), 3.62 (dd, 2H, J = 12.1, 3.60 Hz), 3.43 (dd, 2H, J = 12.0, 4.72 Hz), 2.67-2.57 (m, 2H), 2.26 (p, 2H, J = 5.90 Hz), 1.99-1.89 (m, 2H); 13C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ169.1, 164.0, 149.9, 144.5, 129.8, 117.1, 111.3, 104.5, 54.8, 54.4, 53.1, 33.5, 27.5; IR (ATR, 순수) 3438, 1680, 1654, 1610, 1605, 1516, 1490, 1434, 1379, 1263, 1234, 1216, 1177, 1156, 1115, 1089, 1038, 1018, 952, 870 cm-1; MS (ES+) m/z (상대 강도) 619 ([M + Na]+., 10), 597 ([M + H]+., 52), 445 (12), 326 (11); HRMS [M + H]+. 이론치 C29H32N4O10 m/z 597.2191, 실측치 (ES+) m/z 597.2205.
방법 B: DMF (40 mL) 중의 10% Pd/C (7.5 g, 10% w/w)의 현탁액을 DMF (360 mL) 중의 니트로-에스테르 6 (75 g, 104 mmol)의 용액에 첨가하였다. 8 시간 이상 Parr 수소화 장치에서 상기 현탁액을 수소화시켰다. 수소 흡수가 중단된 후, 상기 반응의 진행정도를 LC/MS에 의해 모니터링하였다. 고체 Pd/C를 여과에 의해 제거하고, 진공 (10mbar 이하) 하의 40℃에서 여과물을 회전식 증발에 의해 농축시켜서, 미량의 DMF 및 잔류 숯을 포함하는 어두운 오일을 제공하였다. 40℃의 물 욕조 (회전식 증발 욕조)에서 잔류물을 EtOH (500 mL) 중에서 분해시키고, 생성된 현탁액을 셀라이트를 통하여 여과하고, 에탄올 (500 mL)로 세척하여, 맑은 여과물을 제공하였다. 히드라진 하이드레이트 (10 mL, 321 mmol)를 상기 용액에 첨가하고, 상기 반응 혼합물을 환류에서 가열하였다. 20 분 후 백색 침전물의 형성이 관찰되었고 및 추가의 30 분 동안 환류 유지하였다. 상기 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 침전물을 여과에 의해 재생시키고, 디에틸 에테르 (2:1 용적의 침전물)로 세척하고, 진공 데시케이터에서 건조시켜서, 7 (50 g, 81%)을 제공하였다. 방법 B의 분석 데이타: 방법 A와 동일 (광회전도, 1H NMR, LC/MS 및 TLC).
(f) 1,1'-[[(프로판-1,3-디일)디옥시]비스(11aS,2R)-2-(테르트-부틸디메틸실릴옥시)-7-메톡시-1,2,3,10,11,11a-헥사하이드로-5H-피롤로[2,1-c][1,4]-벤조디아제핀-5,11-디온] (8)
0℃ (얼음/아세톤)에서 TBSCl (27.6 g, 182.9 mmol) 및 이미다졸 (29.9 g, 438.8 mmol)을 무수 DMF (400 mL) 중의 테트라락탐 7 (21.8 g, 36.6 mmol)의 탁한 용액에 첨가하였다. 상기 혼합물을 질소 대기 하에 3 시간 동안 교반하고, 그후 LC/MS (3.90 분 (ES+) m/z (상대 강도) 825 ([M + H]+, 100)에 의해 반응이 완료된 것으로 나타났다. 상기 반응 혼합물을 얼음 (~ 1.75 L)에 붓고 및 교반하면서 실온으로 가온시켰다. 생성된 백색 침전물을 진공 여과에 의해 수집하고, H2O, 디에틸 에테르로 세척하고, 진공 데시케이터에서 건조하여, 순수 8 (30.1 g, 99%)을 제공하였다. [α]23D = +234°(c = 0.41, CHCl3); 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ8.65 (s, 2H, NH), 7.44 (s, 2H), 6.54 (s, 2H), 4.50 (p, 2H, J = 5.38 Hz), 4.21-4.10 (m, 6H), 3.87 (s, 6H), 3.73-3.63 (m, 4H), 2.85-2.79 (m, 2H), 2.36-2.29 (m, 2H), 2.07-1.99 (m, 2H), 0.86 (s, 18H), 0.08 (s, 12H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ170.4, 165.7, 151.4, 146.6, 129.7, 118.9, 112.8, 105.3, 69.2, 65.4, 56.3, 55.7, 54.2, 35.2, 28.7, 25.7, 18.0, -4.82 및 -4.86; IR (ATR, CHCl3) 3235, 2955, 2926, 2855, 1698, 1695, 1603, 1518, 1491, 1446, 1380, 1356, 1251, 1220, 1120, 1099, 1033 cm-1; MS (ES+) m/z (상대 강도) 825 ([M + H]+., 62), 721 (14), 440 (38); HRMS [M + H]+. 이론치 C41H60N4O10Si2 m/z 825.3921, 실측치 (ES+) m/z 825.3948.
(g) 1,1'-[[(프로판-1,3-디일)디옥시]비스(11aS,2R)-2-(테르트-부틸디메틸실릴옥시)-7-메톡시-10-((2-(트리메틸실릴)에톡시)메틸)-1,2,3,10,11,11a-헥사하이드로-5H-피롤로[2,1-c][1,4]-벤조디아제핀-5,11-디온] (9)
-30℃ (건조 얼음/에틸렌 글리콜) 질소 대기 하에서, n-BuLi (헥산 중 1.6 M 용액 68.3 mL, 109 mmol)의 용액을 무수 THF (600 mL) 중의 테트라락탐 8 (30.08 g, 36.4 mmol)의 교반 현탁액에 적가하였다. 상기 반응 혼합물을 이 온도에서 1 시간 동안 교반하고 (현재 밝은 오렌지색), 이때 무수 THF (120 mL) 중의 SEMCl (19.3 mL, 18.2 g, 109 mmol)의 용액을 적가하였다. 상기 반응 혼합물을 실온으로 서서히 가온시키고, 16 시간 동안 질소 대기 하에 교반하였다. TLC (EtOAc) 및 LC/MS (4.77 분 (ES+) m/z (상대 강도) 1085 ([M + H]+., 100)에 의해 반응이 완료된 것으로 나타났다. 진공에서 증발에 의해 THF를 제거하고, 생성된 잔류물을 EtOAc (750 mL)에 용해시키고, H2O (250 mL), 염수 (250 mL)로 세척하고, 건조하고 (MgSO4), 여과하고, 진공에서 증발시켜서, 오일 (maxm 39.5 g, 100%)로서 미정제 N10-SEM-보호 테트라락탐 9를 제공하였다. 생성물을 정제 과정 없이 다음 단계로 이동시켰다. [α]23D = +163°(c = 0.41, CHCl3); 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ7.33 (s, 2H), 7.22 (s, 2H), 5.47 (d, 2H, J = 9.98 Hz), 4.68 (d, 2H, J = 9.99 Hz), 4.57 (p, 2H, J = 5.77 Hz), 4.29-4.19 (m, 6H), 3.89 (s, 6H), 3.79-3.51 (m, 8H), 2.87-2.81 (m, 2H), 2.41 (p, 2H, J = 5.81 Hz), 2.03-1.90 (m, 2H), 1.02-0.81 (m, 22H), 0.09 (s, 12H), 0.01 (s, 18H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ170.0, 165.7, 151.2, 147.5, 133.8, 121.8, 111.6, 106.9, 78.1, 69.6, 67.1, 65.5, 56.6, 56.3, 53.7, 35.6, 30.0, 25.8, 18.4, 18.1, -1.24, -4.73; IR (ATR, CHCl3) 2951, 1685, 1640, 1606, 1517, 1462, 1433, 1360, 1247, 1127, 1065 cm-1; MS (ES+) m/z (상대 강도) 1113 ([M + Na]+., 48), 1085 ([M + H]+., 100), 1009 (5), 813 (6); HRMS [M + H]+. 이론치 C53H88N4O12Si4 m/z 1085.5548, 실측치 (ES+) m/z 1085.5542.
(h) 1,1'-[[(프로판-1,3-디일)디옥시]비스(11aS,2R)-2-히드록시-7-메톡시-10-((2-(트리메틸실릴)에톡시)메틸)-1,2,3,10,11,11a-헥사하이드로-5H-피롤로[2,1-c][1,4]-벤조디아제핀-5,11-디온] (10)
실온에서 TBAF (THF 중의 1.0 M 용액 150 mL, 150 mmol)의 용액을 THF (800 mL) 중의 미정제 비스-실릴 에테르 9 [84.0 g (maxm 56.8 g), 52.4 mmol]의 교반 용액에 첨가하였다. 1 시간 동안 교반 후, TLC (95:5 v/v CHCl3/MeOH)에 의한 상기 반응 혼합물의 분석은 반응의 완료를 나타내었다. 감압 하에 실온에서 증발에 의해 THF를 제거하고, 생성된 잔류물을 EtOAc (500 mL)에 용해시키고, NH4Cl (300 mL)로 세척하였다. 결합된 유기층을 염수 (60 mL)로 세척하고, 건조하고 (MgSO4), 여과하고, 감압 하에 증발시켜, 미정제 생성물을 제공하였다. 플래쉬 크로마토그래피 (구배 용리: 100% CHCl3 내지 96:4 v/v CHCl3/MeOH)에 의한 정제에 의해 백색 거품 (36.0 g, 79%)으로서 순수 테트라락탐 10을 제공하였다. LC/MS 3.33 분 (ES+) m/z (상대 강도) 879 ([M + Na]+., 100), 857 ([M + H]+., 40); [α]23D = +202°(c = 0.34, CHCl3); 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ7.28 (s, 2H), 7.20 (s, 2H), 5.44 (d, 2H, J = 10.0 Hz), 4.72 (d, 2H, J = 10.0 Hz), 4.61-4.58 (m, 2H), 4.25 (t, 4H, J = 5.83 Hz), 4.20-4.16 (m, 2H), 3.91-3.85 (m, 8H), 3.77-3.54 (m, 6H), 3.01 (br s, 2H, OH), 2.96-2.90 (m, 2H), 2.38 (p, 2H, J = 5.77 Hz), 2.11-2.05 (m, 2H), 1.00-0.91 (m, 4H), 0.00 (s, 18H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ169.5, 165.9, 151.3, 147.4, 133.7, 121.5, 111.6, 106.9, 79.4, 69.3, 67.2, 65.2, 56.5, 56.2, 54.1, 35.2, 29.1, 18.4, -1.23; IR (ATR, CHCl3) 2956, 1684, 1625, 1604, 1518, 1464, 1434, 1361, 1238, 1058, 1021 cm-1; MS (ES+) m/z (상대 강도) 885 ([M + 29]+., 70), 857 ([M + H]+., 100), 711 (8), 448 (17); HRMS [M + H]+. 이론치 C41H60N4O12Si2 m/z 857.3819, 실측치 (ES+) m/z 857.3826.
(i) 1,1'-[[(프로판-1,3-디일)디옥시]비스(11aS)-7-메톡시-2-옥소-10-((2-(트리메틸실릴)에톡시)메틸)-1,2,3,10,11,11a-헥사하이드로-5H-피롤로[2,1-c][1,4]-벤조디아제핀-5,11-디온] (11)
Ar 하에 디올 10 (25.6 g, 30 mmol, 1 eq.), NaOAc (6.9 g, 84 mmol, 2.8 eq.) 및 TEMPO (188 mg, 1.2 mmol, 0.04 eq.)을 DCM (326 mL)에 용해시켰다. 이것을 -8℃ (내부 온도)로 냉각하고, 15 분 이상 TCCA (9.7 g, 42 mmol, 1.4 eq.)를 한 방울씩 첨가하였다. 30 분 후의 TLC (EtOAc) 및 LC/MS [3.60 min. (ES+) m/z (상대 강도) 854.21 ([M + H]+., 40) (ES-) m/z (상대 강도) 887.07 ([M - H + Cl]-., 10)]는 반응이 완료되었음을 나타내었다. 냉각 DCM (200 mL)를 첨가하고, 상기 혼합물을 셀라이트 패드를 통해 여과하고, 포화 소듐 하이드로젠 카보네이트/ 소듐 티오술페이트 (1:1 v/v; 200 mL x 2)의 용액으로 세척하였다. 유기층을 MgSO4로 건조하고, 여과하고, 진공에서 용매를 제거하여, 노란색/오렌지색 스펀지 (25.4 g, 99%)를 수득하였다. LC/MS [3.60 min. (ES+) m/z (상대 강도) 854.21 ([M + H]+., 40); [α]20D = +291°(c = 0.26, CHCl3); 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ7.32 (s, 2H), 7.25 (s, 2H), 5.50 (d, 2H, J = 10.1 Hz), 4.75 (d, 2H, J = 10.1 Hz), 4.60 (dd, 2H, J = 9.85, 3.07 Hz), 4.31-4.18 (m, 6H), 3.89-3.84 (m, 8H), 3.78-3.62 (m, 4H), 3.55 (dd, 2H, J = 19.2, 2.85 Hz), 2.76 (dd, 2H, J = 19.2, 9.90 Hz), 2.42 (p, 2H, J = 5.77 Hz), 0.98-0.91 (m, 4H), 0.00 (s, 18H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ206.8, 168.8, 165.9, 151.8, 148.0, 133.9, 120.9, 111.6, 107.2, 78.2, 67.3, 65.6, 56.3, 54.9, 52.4, 37.4, 29.0, 18.4, -1.24; IR (ATR, CHCl3) 2957, 1763, 1685, 1644, 1606, 1516, 1457, 1434, 1360, 1247, 1209, 1098, 1066, 1023 cm-1; MS (ES+) m/z (상대 강도) 881 ([M + 29]+., 38), 853 ([M + H]+., 100), 707 (8), 542 (12); HRMS [M + H]+. 이론치 C41H56N4O12Si2 m/z 853.3506, 실측치 (ES+) m/z 853.3502.
(j) 1,1'-[[(프로판-1,3-디일)디옥시]비스(11aS)-7-메톡시-2-[[(트리fluoro메틸)술포닐]옥시]-10-((2-(트리메틸실릴)에톡시)메틸)-1,10,11,11a-테트라하이드로-5H-피롤로[2,1-c][1,4]-벤조디아제핀-5,11-디온] (12)
-45℃ (건조 얼음/아세토니트릴) 질소 대기 하에 무수 2,6-루티딘 (5.15 mL, 4.74 g, 44.2 mmol)을 건조 DCM (180 mL) 중의 비스-케톤 11 (6.08 g, 7.1 mmol)의 활발한 교반 용액의 한 부분에 주입하였다. 새로 개봉한 앰플에서 취한 무수 트리플릭 무수물 (7.2 mL, 12.08 g, 42.8 mmol)을 온도를 -40℃ 이하에서 유지하면서, 빠르게 적가 주입하였다. 상기 반응 혼합물을 -45℃에서 1 시간 동안 교반하고, 이때 TLC (50/50 v/v n-헥산/EtOAc)는 출발 물질의 완전 소모를 나타내었다. 상기 냉각 반응 혼합물을 즉시 DCM (200 mL)으로 희석하고, 활발하게 교반하면서, 물 (1 x 100 mL), 5% 시트르산 용액 (1 x 200 mL) 포화 NaHCO3 (200 mL), 염수 (100 mL)로 세척하고, 건조하였다 (MgSO4). 감압 하에 상기 용매의 여과 및 증발에 의해, 미정제 생성물을 제공하고, 플래쉬 칼럼 크로마토그래피 (구배 용리: 90:10 v/v n-헥산/EtOAc 내지 70:30 v/v n-헥산/EtOAc)에 의해 정제하여, 노란색 거품 (5.5 g, 70%)으로서, 비스-에놀 트리플레이트 12를 제공하였다. LC/MS 4.32 분 (ES+) m/z (상대 강도) 1139 ([M + Na]+., 20); [α]24D = +271°(c = 0.18, CHCl3); 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ7.33 (s, 2H), 7.26 (s, 2H), 7.14 (t, 2H, J = 1.97 Hz), 5.51 (d, 2H, J = 10.1 Hz), 4.76 (d, 2H, J = 10.1 Hz), 4.62 (dd, 2H, J = 11.0, 3.69 Hz), 4.32-4.23 (m, 4H), 3.94-3.90 (m, 8H), 3.81-3.64 (m, 4H), 3.16 (ddd, 2H, J = 16.3, 11.0, 2.36 Hz), 2.43 (p, 2H, J = 5.85 Hz), 1.23-0.92 (m, 4H), 0.02 (s, 18H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ167.1, 162.7, 151.9, 148.0, 138.4, 133.6, 120.2, 118.8, 111.9, 107.4, 78.6, 67.5, 65.6, 56.7, 56.3, 30.8, 29.0, 18.4, -1.25; IR (ATR, CHCl3) 2958, 1690, 1646, 1605, 1517, 1456, 1428, 1360, 1327, 1207, 1136, 1096, 1060, 1022, 938, 913 cm-1; MS (ES+) m/z (상대 강도) 1144 ([M + 28]+., 100), 1117 ([M + H]+., 48), 1041 (40), 578 (8); HRMS [M + H]+. 이론치 C43H54N4O16Si2S2F6 m/z 1117.2491, 실측치 (ES+) m/z 1117.2465.
실시예 1
Figure pct00146
(a) (S)-8-(3-(((S)-2-(4-아미노페닐)-7-메톡시-5,11-디옥소-10-((2-(트리메틸실릴)에톡시)메틸)-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-8-일)옥시)프로폭시)-7-메톡시-5,11-디옥소-10-((2-(트리메틸실릴)에톡시)메틸)-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-2-일 트리플루오로메탄설포네이트 (13)
Pd(PPh3)4 (116.9 mg, 0.101 mmol)를 비스-에놀 트리플레이트 12 (5.65 g, 5.06 mmol), 4-아미노페닐보론 산 피나콜 에스테르 (1 g, 4.56 mmol), Na2CO3 (2.46 g, 23.2 mmol), MeOH (37 mL), 톨루엔 (74 mL) 및 물 (37 mL)의 교반 혼합물에 첨가하였다. 30℃ 질소 대기 하에 24 시간 동안 상기 반응 혼합물을 교반하였고, 이때 모든 보론 에스테르가 소모되었다. 이어서, 상기 반응 혼합물을 증발 건조시키고, 잔류물을 EtOAc (150 mL)에서 취하고, H2O (2 x 100 mL), 염수 (150 mL)로 세척하고, 건조하고 (MgSO4), 여과하고, 감압 하에 증발시켜, 미정제 생성물을 제공하였다. 플래쉬 크로마토그래피 (구배 용리: 80:20 v/v 헥산/EtOAc 내지 60:40 v/v 헥산/EtOAc)에 의한 정제에 의해 노란색 거품 (2.4 g, 45%)으로서, 생성물 13을 제공하였다. LC/MS 4.02 분 (ES+) m/z (상대 강도) 1060.21 ([M + H]+., 100); 1H-NMR: (CDCl3, 400 MHz) δ7.40 (s, 1H), 7.33 (s, 1H), 7.27 (bs, 3H), 7.24 (d, 2H, J = 8.5 Hz), 7.15 (t, 1H, J = 2.0 Hz), 6.66 (d, 2H, J = 8.5 Hz), 5.52 (d, 2H, J = 10.0 Hz), 4.77 (d, 1H, J = 10.0 Hz), 4.76 (d, 1H, J = 10.0 Hz), 4.62 (dd, 1H, J = 3.7, 11.0 Hz), 4.58 (dd, 1H, J = 3.4, 10.6 Hz), 4.29 (t, 4H, J = 5.6 Hz), 4.00-3.85 (m, 8H), 3.80 - 3.60 (m, 4H), 3.16 (ddd, 1H, J = 2.4, 11.0, 16.3 Hz), 3.11 (ddd, 1H, J = 2.2, 10.5, 16.1 Hz), 2.43 (p, 2H, J = 5.9 Hz), 1.1-0.9 (m, 4H), 0.2 (s, 18H). 13C-NMR: (CDCl3, 100 MHz) δ169.8, 168.3, 164.0, 162.7, 153.3, 152.6, 149.28, 149.0, 147.6, 139.6, 134.8, 134.5, 127.9, 127.5, 125.1, 123.21, 121.5, 120.5, 120.1, 116.4, 113.2, 108.7, 79.8, 79.6, 68.7, 68.5, 67.0, 66.8, 58.8, 58.0, 57.6, 32.8, 32.0, 30.3, 19.7, 0.25.
(b) (S)-2-(4-아미노페닐)-8-(3-(((S)-2-시클로프로필-7-메톡시-5,11-디옥소-10-((2-(트리메틸실릴)에톡시)메틸)-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-8-일)옥시)프로폭시)-7-메톡시-10-((2-(트리메틸실릴)에톡시)메틸)-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-5,11(10H,11aH)-디온 (14)
아르곤 대기 하에서 트리페닐라신 (0.24 g, 0.8 mmol), 산화은 (I) (1.02 g, 4.4 mmol), 시클로프로필보론 산 (0.47 g, 5.5 mmol) 및 출발 물질 13 (1.15 g, 1.1 mmol)을 디옥산 (30 mL)에 용해시켰다. 포타슘 포스페이트 3 염기 (2.8 g, 13.2 mmol)를 막자 및 모르타르로 분쇄하고, 상기 반응 혼합물에 신속하게 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 진공처리시키고, 아르곤으로 3 회 플러싱하고, 71℃로 가열하였다. 팔라듐 (II) 비스 (벤조니트릴 클로라이드) (84 mg, 0.22 mmol)를 첨가하고,반응 용기를 진공처리시키고, 아르곤으로 3 회 플러싱하였다. 10 분 후 소량의 샘플을 TLC (80:20 v/v 에틸 아세테이트/헥산) 및 LC/MS에 의한 분석을 위해 취하였다. 30 분 후 상기 반응은 완료되었고 (LC/MS 분석은 출발 물질의 완전 소모를 나타내었음), 반응물을 셀라이트를 통하여 여과하고,필터 패드를 에틸 아세테이트 (400 mL)로 세척하였다. 여과물을 물 (2 x 200 mL) 및 염수 (2 x 200 mL)로 세척하였다. 유기층을 MgSO4로 건조하고, 여과하고, 용매를 진공에서 제거하였다. 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 (30:70 v/v 헥산/에틸 아세테이트)에 의한 정제에 의해 오렌지색/노란색 고체 (0.66 g, 63%)로서 생성물 14를 제공하였다. 방법 1, LC/MS (3.85 분 (ES+) m/z (상대 강도) 952.17 ([M + H]+., 100). 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ7.36 (d, 2H, J = 8.4 Hz), 7.30 (s, 1H), 7.25 - 7.19 (m, 4H), 6.68 (s, 1H), 6.62 (d, 2H, J = 8.4 Hz), 5.49 (dd, 2H, J = 5.6, 10.0 Hz), 4.73 (app. t, 2H, J = 10.8 Hz), 4.54 (dd, 1H, J = 3.2, 10.4 Hz), 4.40 (dd, 1H, J = 3.2, 10.4 Hz), 4.29 - 4.23 (m, 4H), 3.91 - 3.85 (m, 7H), 3.80 - 3.71 (m, 2H), 3.70 - 3.61 (m, 2H), 3.38 - 3.32 (m, 1H), 3.12 - 3.01 (m, 1H), 2.50 - 2.69 (m, 1H), 2.40 (Q, 2H, J = 5.6 Hz), 1.50 - 1.43 (m, 1H), 0.99 - 0.71 (m, 6H), 0.54 - 0.59 (m, 2H), 0.00 (s, 18H) ppm.
(c) (S)-2-(4-아미노페닐)-8-(3-(((S)-2-시클로프로필-7-메톡시-5-옥소-5,11a-디하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-8-일)옥시)프로폭시)-7-메톡시-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-5(11aH)-온 (15)
SEM 디락탐 14 (0.66 g, 0.69 mmol)을 THF (23 mL)에 용해시키고, -78℃ 아르곤 대기 하에서 냉각시켰다. Super-Hydride®용액 (1.7 mL, 1 M, THF)를 5 분 이상 온도를 모니터링하면서, 적가하였다. 20 분 후 소량의 샘플을 취하고, LC/MS 분석을 위해 물로 세척하였다. 물 (50 mL)을 첨가하고, 냉각 욕조를 제거하였다. 유기층을 추출하고, 염수 (60 mL)로 세척하였다. 결합된 수성 층을 CH2Cl2/MeOH (90/10 v/v) (2 x 50 mL)로 세척하였다. 결합된 유기층을 MgSO4로 건조하고, 여과하고, 용매를 진공에서 제거하였다. 상기 미정제 생성물을 MeOH (48 mL), CH2Cl2 (18 mL) 및 물 (6 mL)에 용해시키고, 충분한 실리카 겔을 첨가하여, 걸쭉한 현탁액을 제공하였다. 5 일 동안 교반한 후, 상기 현탁액을 소결 깔때기를 통해 여과하고, 생성이 중단되고 용리될 때까지, CH2Cl2/MeOH (9:1) (~ 200 mL)로 세척하였다. 유기층을 염수 (2 x 70 mL)로 세척하고, MgSO4로 건조하고, 여과하고, 용매를 진공에서 제거하였다. 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 (100% CHCl3 내지 96/4 v/v CHCl3/MeOH)에 의한 정제에 의해 노란색 고체로서 (302 mg, 66%) 생성물 15를 제공하였다. 방법 1, LC/MS (2.42 분 (ES+) m/z (상대 강도) 660.74 ([M + H]+., 30). 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ7.86 (d, 1H, J = 3.6 Hz), 7.78 (d, 1H, J = 3.6 Hz), 7.58 - 7.44 (m, 3H), 7.34 - 7.20 (m, 3H), 6.88 - 6.66 (m, 4H), 4.35 - 4.15 (m, 6H), 3.95 - 3.75 (m, 7H), 3.39 - 3.22 (m, 1H), 3.14 - 3.04 (m, 1H), 2.93 - 2.85 (m, 1H), 2.46 - 2.36 (m, 2H), 1.49 - 1.41 (m, 1H), 0.80 - 0.72 (m, 2H), 0.58 - 0.51 (app. s, 2H) ppm.
(d) 알릴 ((2S)-1-(((2S)-1-((4-(8-(3-((2-시클로프로필-7-메톡시-5-옥소-5,11a-디하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-8-일)옥시)프로폭시)-7-메톡시-5-옥소-5,11a-디하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-2-일)페닐)아미노)-1-옥소프로판-2-일)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄-2-일)카르바메이트 (16)
기체가 제거되고, 아르곤으로 충진된 둥근 바닥 플라스크에서, HO-Ala-Val-Alloc (149.6 mg, 0.549 mmol) 및 EEDQ (135.8 mg, 0.549 mmol)을 건조 CH2Cl2/MeOH (5 mL)의 9:1 혼합물에 용해시켰다. 상기 플라스크를 알루미늄 호일로 래핑하고, 상기 반응 혼합물을 실온에서 1 시간 동안 교반하고 출발 물질 15 (302 mg, 0.457 mmol)을 첨가하였다. 실온에서 상기 반응 혼합물을 추가의 40 시간 동안 교반하고, 휘발물질을 감압 하에 회전식 증발에 의해 제거하였다 (상기 반응을 LC/MS, RT 출발 물질 2.32 min (ES+ 660.29 ([M+H]+.,100)에 의해 추적함). 상기 미정제 생성물을 직접 실리카 겔 크로마토그래피 칼럼 (100% CHCl3 내지 90/10 v/v CHCl3/MeOH)에 의해 정제하여, 42% 수율 (174 mg)에서 순수 생성물 (16)을 제공하였다. 방법 2 LC/MS (2.70 분 (ES+) m/z (상대 강도) 914.73 ([M+H]+., 60), 660.43 (60), 184.31 (100)).
(e) (2S)-2-아미노-N-((2S)-1-((4-(8-(3-((2-시클로프로필-7-메톡시-5-옥소-5,11a-디하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-8-일)옥시)프로폭시)-7-메톡시-5-옥소-5,11a-디하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-2-일)페닐)아미노)-1-옥소프로판-2-일)-3-메틸부탄아미드 (17)
아르곤으로 충진된 둥근 바닥 플라스크에서, 출발 물질 16 (170 mg, 0.185 mmol)을 건조 CH2Cl2 (5 mL)에 용해시키고, 피롤리딘 (41 μL, 0.21 mmol)을 첨가하였다. 상기 플라스크를 아르곤으로 3 회 퍼징하고/리필하고 Pd(PPh3)4 (14 mg, 0.084 mmol)를 첨가하고, 플러싱 과정을 반복하였다. 1 시간 후, 출발 물질의 완전 소모가 관찰되었고 (상기 반응을 LC/MS에 의해 추적함), Et2O (50 mL)를 상기 반응 혼합물에 첨가하고 모든 생성물이 침전될 때까지 교반하였다. 고체를 소결 깔때기를 통해 여과하고, Et2O (2 x 25 mL)로 2 회 세척하였다. 수집 플라스크를 교체하고, 단리된 고체를 CHCl3 (100 mL 또는 모든 생성물이 소결 깔때기를 통해 통과될 때까지)에 용해시켰다. 이어서, 휘발물질을 감압 하에 회전식 증발에 의해 제거하여 미정제 생성물 17을 제공하여, 다음 단계에 직접 사용하였다 (168 mg). LC/MS 방법 2 (2.70 분 (ES+) m/z (상대 강도) 830.27 ([M+H]+., 50), 660.13 (80), 171.15 (100)).
(f) N-((R)-1-(((S)-1-((4-((S)-8-(3-(((S)-2-시클로프로필-7-메톡시-5-옥소-5,11a-디하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-8-일)옥시)프로폭시)-7-메톡시-5-옥소-5,11a-디하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-2-일)페닐)아미노)-1-옥소프로판-2-일)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄-2-일)-1-(3-(2,5-디옥소-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)프로판아미도)-3,6,9,12,15,18,21,24-옥타옥사헵타코산-27-아미드 (18)
퍼징하고, 아르곤으로 충진한 둥근 바닥 플라스크에서, 출발 물질 17 (154 mg, 0.185 mmol) 및 EDCI.HCl (110 mg, 0.185 mmol)을 건조 CH2Cl2 (5 mL) 중에 용해시켰다. 상기 혼합물을 실온에서 1 시간 동안 교반하고 PEG8-말레이미드 (35.6 mg, 0.185 mmol)를 첨가하고, 상기 반응 혼합물 추가의 16 시간 동안 (또는 LC/MS에 의한 모니터링에 의해, 반응이 안료될 때까지) 교반하였다. 상기 반응물을 CH2Cl2 (50 mL)로 희석하고,유기물을 H2O (50 mL) 및 염수 (50 mL)로 세척하고 MgSO4로 건조하고, 여과하고, 용매를 감압 하에 회전식 증발에 의해 제거하여, 미정제 생성물을 제공하였다. 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 (100% CHCl3 내지 85/15 v/v CHCl3/MeOH)에서의 정제에 의해, 목적 생성물 (135mg)을 제공하고, 그러나, 반응하지 않은 PEG8-말레이미드가 잔류된 것이 관찰되었다 (LC/MS에 의함, 2.21 min, 방법 2). 자동 역상 실리카 겔 크로마토그래피 (H2O/CH3CN) (조건에 대한 일반적인 정보 참조)에 의해 불순물을 성공적으로 제거하여, 순수한 최종 생성물 (18, 37mg의 순수 생성물, 110mg에서 출발, 33%)을 제공하였다. 전체 수율 = 17%. 방법 2 LC/MS (2.58 분 (ES+) m/z (상대 강도) 1404.03 ([M+H]+., 20), 702.63 (100)). 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ7.91 (t, J = 3.5 Hz, 1H), 7.80 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 7.75 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.69 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.54 - 7.50 (m, 2H), 7.45 (s, 1H), 7.39 - 7.31 (m, 2H), 6.87 (d, J = 10.5 Hz, 2H), 6.76 (s, 1H), 6.72 - 6.68 (m, 2H), 4.74 - 4.62 (m, 1H), 4.45 - 4.17 (m, 7H), 3.95 (s, 3H), 3.94 (s, 3H), 3.67 - 3.58 (m, 34H), 3.54 (m, 2H), 3.42 (dd, J = 10.2, 5.2 Hz, 2H), 3.16 - 3.07 (m, 1H), 2.92 (dd, J = 16.1, 4.1 Hz, 1H), 2.62 - 2.49 (m, 4H), 2.48 - 2.39 (m, 2H), 2.37 - 2.25 (m, 1H), 1.92 (s, 1H), 1.52 - 1.44 (m, 3H), 1.10 - 0.93 (m, 6H), 0.79 (dd, J = 9.2, 5.3 Hz, 2H), 0.57 (dd, J = 9.2, 5.3 Hz, 2H), NH는 관찰되지 않음.
실시예 2
Figure pct00147
(a) (R)-2-((R)-2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카르보닐)아미노)-3-메틸부탄아미도) 프로판산 (20b)
HO-Ala-Val-H 20a (350 mg, 1.86 mmol) 및 Na2CO3 (493 mg, 4.65 mmol)을 증류 H2O (15 mL)에 용해시키고, 상기 혼합물을 0℃로 냉각시키고 디옥산 (15 mL)을 첨가하였다 (아미노산 염의 부분적 침전 발생). 10 분 이상 활발하게 교반하면서, 디옥산 (15 mL) 중 Fmoc-Cl (504 mg, 1.95 mmol)의 용액을 적가하였다. 생성된 혼합물을 0℃에서 2 시간 동안 교반하고 얼음 욕조를 제거하고, 16 시간 동안 교반하였다. 용매를 감압 하에 회전식 증발에 의해 제거하고, 잔여물을 물 (150 mL)에 용해시켰다. pH를 1N HCl에 의해 9 내지 2로 조정하고, 이어서, 수성층을 EtOAc (3x100 mL)로 추출하였다. 결합된 유기물을 염수 (100 mL)로 세척하고, MgSO4로 건조하고, 여과하고, 휘발물질을 감압 하에 회전식 증발에 의해 제거하여 순수 HO-Ala-Val-Fmoc 20b (746 mg, 97% 수율)을 제공하였다. LC/MS 2.85 분 (ES+) m/z (상대 강도) 410.60 ; 1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ7.79 (d, J=7.77 Hz, 2H), 7.60(d, J=7.77 Hz, 2H), 7.43(d, J=7.5 Hz, 2H), 7.34 (d, J=7.5 Hz, 2H), 6.30 (bs, 1H), 5.30 (bs, 1H), 4.71-7.56 (m, 1H), 4.54-4.36 (m, 2H), 4.08-3.91 (m, 1H), 2.21-2.07 (m, 1H), 1.50 (d, J=7.1 Hz, 3H), 1.06-0.90 (m, 6H).
(b) (9H-플루오렌-9-일)메틸 ((S)-3-메틸-1-옥소-1-(((S)-1-옥소-1-((4-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사borolan-2-일)페닐)아미노)프로판-2-일)아미노)부탄-2-일)카르바메이트 (20)
아르곤으로 플러싱된 플라스크에서, 4-아미노페닐보론 산 피나콜 에스테르 (146.9 mg, 0.67 mmol)를 30 분 동안 실온에서 미리 교반된 건조 DCM (8 mL) 중의 HO-Ala-Val-Fmoc 20b (330mg, 0.8 mmol), DCC (166 mg, 0.8 mmol) 및 DMAP (5 mg, cat.)의 용액에 첨가하였다. 이어서, 상기 반응 혼합물을 실온에서 하룻밤 동안 교반하였다. 상기 반응을 LCMS 및 TLC에 의해 추적하였다. 상기 반응 혼합물을 CH2Cl2으로 희석하고, 유기물을 H2O 및 염수로 세척하고 MgSO4로 건조하고, 여과하고, 용매를 감압 하에 회전식 증발에 의해 제거하였다. 상기 미정제 생성물을 실리카겔 크로마토그래피 칼럼 (헥산/EtOAc, 6:4)에 건조 부하하고, 88% 수율 (360 mg)에서 백색 고체로서 순수 생성물 20을 단리하였다.
(c) 8-(3-((2-(4-((S)-2-((S)-2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카르보닐)아미노)-3-메틸부탄아미도)프로판아미도)페닐)-7-메톡시-5,11-디옥소-10-((2-(트리메틸실릴)에톡시)메틸)-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-8-일)옥시)프로폭시)-7-메톡시-5,11-디옥소-10-((2-(트리메틸실릴)에톡시)메틸)-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-2-일 트리플루오로메탄설포네이트 (21)
비스-트리플레이트 12 (2.03g, 1.81 mmol), 보론 피나콜 에스테르 (1g, 1.63 mmol) 및 Na2CO3 (881 mg, 8.31 mmol)을 톨루엔/MeOH/H2O, 2:1:1 (40 mL)의 혼합물에 용해시켰다. 반응 플라스크를 퍼징하고, 아르곤으로 3 회 충진하고 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐(0) (41 mg, 0.035 mmol)를 첨가하고, 하룻밤 동안 상기 반응 혼합물을 가열하였다. 용매를 감압 하에 제거하고, 잔류물을 H2O (100 mL) 중에 취하고, EtOAc (3 x 100 mL)로 추출하였다. 결합된 유기물을 염수 (100 mL)로 세척하고, MgSO4로 건조하고, 여과하고, 휘발물질을 감압 하에 회전식 증발에 의해 제거하였다. 상기 미정제 생성물을 실리카 겔 크로마토그래피 칼럼 (헥산/EtOAc, 8:2 내지 25:75)에 의해 정제하여, 33% 수율 (885 mg)에서 순수 21을 제공하였다. LC/MS 3.85 분 (ES+) m/z (상대 강도) 1452.90 ; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ7.78 - 7.16 (m, 17H), 7.13 (s, 1H), 6.51 - 6.24 (m, 1H), 5.51 (dd, J = 10.0, 5.1 Hz, 2H), 5.36 - 5.11 (m, 1H), 4.74 (dd, J = 10.1, 4.4 Hz, 2H), 4.70 - 4.53 (m, 2H), 4.47 (d, J = 6.4 Hz, 1H), 4.37 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 4.27 (m, 4H), 4.20 - 4.14 (m, 1H), 3.90 (s, 3H), 3.89 (s, 3H), 3.77 (ddd, J = 16.7, 9.0, 6.4 Hz, 3H), 3.71 - 3.61 (m, 2H), 3.24 - 2.91 (m, 3H), 2.55 - 2.33 (m, 2H), 2.22 - 2.07 (m, 1H), 1.52 - 1.37 (m, 3H), 1.04 - 0.86 (m, 10H), 0.00 (s, 18H).
(d) (9H-플루오렌-9-일)메틸((2S)-1-(((2S)-1-((4-(8-(3-((2-시클로프로필-7-메톡시-5,11-디옥소-10-((2-(트리메틸실릴)에톡시)메틸)-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-8-일)옥시)프로폭시)-7-메톡시-5,11-디옥소-10-((2-(트리메틸실릴)에톡시)메틸)-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-2-일)페닐)아미노)-1-옥소프로판-2-일)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄-2-일)카르바메이트 (22)
아르곤 대기 하에서 트리페닐라신 (42 mg, 0.137 mmol)를 건조 디옥산 (10 mL) 중의 PBD-트리플레이트 21 (250 mg, 0.172 mmol), 시클로프로필보론 산 (73.9 mg, 0.86 mmol), 산화 은 (159 mg, 0.688 mmol) 및 포타슘 포스페이트 3 염기 (438 mg, 2.06 mmol)의 혼합물에 첨가하였다. 상기 반응물을 아르곤으로 3 회 플러싱하고, 비스(벤조니트릴)팔라듐(II) 클로라이드 (13.2 mg, 0.034 mmol)를 첨가하였다. 상기 반응을 아르곤으로 3 회 이상 플러싱하고 75℃로 가온시키고, 10 분 동안 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 셀라이트 패드를 통해 여과하고 이어서, 에틸 아세테이트로 세정하였다. 용매를 감압 하에 회전식 증발에 의해 제거하였다. 생성된 잔류물을 플래쉬 칼럼 크로마토그래피 (실리카 겔; 1 % 메탄올/클로로포름)에 적용하였다. 순수 분획을 수집하고, 결합시키고, 과량의 용리액을 감압 하에 회전식 증발에 의해 제거하여 목적 생성물 22 (132 mg, 50 % 수율)을 제공하였다. LC/MS 3.83 분 (ES+) m/z (상대 강도) 1345.91 ; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ7.88 - 7.14 (m, 17H), 6.69 (s, 1H), 6.45 - 6.25 (m, 1H), 5.57 - 5.41 (m, 2H), 5.34 - 5.14 (m, 1H), 4.78 - 4.67 (m, 2H), 4.62 - 4.55 (m, 1H), 4.50 - 4.45 (m, 2H), 4.51 - 4.44 (m, 1H), 4.31 - 4.21 (m, 4H), 4.16 (m, 1H), 3.92 (s, 3H), 3.86 (s, 3H), 3.82 - 3.71 (m, 2H), 3.66 (m, 3H), 3.40 - 3.28 (m, 1H), 3.07 (m, 1H), 2.70 - 2.57 (m, 1H), 2.47 - 2.36 (m, 2H), 2.15 (m, 1H), 1.51 - 1.40 (m, 3H), 1.03 - 0.87 (m, 11H), 0.77 - 0.71 (m, 2H), 0.60 - 0.54 (m, 2H), 0.00 (t, J = 3.0 Hz, 18H).
(e) (9H-플루오렌-9-일)메틸((2S)-1-(((2S)-1-((4-(8-(3-((2-시클로프로필-7-메톡시-5-옥소-5,11a-디하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-8-일)옥시)프로폭시)-7-메톡시-5-옥소-5,11a-디하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-2-일)페닐)아미노)-1-옥소프로판-2-일)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄-2-일)카르바메이트 (23)
-78℃에서 아르곤 대기 하에서 Super-Hydride®(0.5 mL, 1M, THF)의 용액을 THF (10 mL) 중의 SEM 디락탐 22 (265 mg g, 0.19 mmol)의 용액에 적가하였다. 상기 반응 혼합물의 내부 온도를 일정하게 유지하기 위해, 상기 첨가 과정을 5 분 이상 완료하였다. 20 분 후, LC/MS 분석을 위해, 분취량을 물로 퀀칭하고 LC/MS 분석은 상기 반응이 완료되었음을 나타내었다. 물 (20 mL)를 상기 반응 혼합물에 첨가하고, 냉각 욕조를 제거하였다. 유기층을 EtOAc (3 x 30 mL)로 추출하고, 결합된 유기물을 염수 (50 mL)로 세척하고, MgSO4로 건조하고, 여과하고, 용매를 감압 하에 회전식 증발에 의해 제거하였다. 상기 미정제 생성물을 MeOH (12 mL), CH2Cl2 (6 mL), 물 (2 mL) 및 충분한 실리카 겔에 용해시켜서, 걸쭉한 교반 현탁액을 생성시켰다. 5 일 후, 상기 현탁액을 소결 깔때기를 통해 여과하고, 생성물의 용리가 완료될 때가지, CH2Cl2/MeOH (9:1) (200 mL)로 세척하였다. 유기층을 염수 (2 x 70 mL)로 세척하고, MgSO4로 건조하고, 여과하고, 용매를 감압 하에 회전식 증발에 의해 제거하였다. 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 (100% CHCl3 내지 96% CHCl3/ 4% MeOH)에 의한 정제에 의해 노란색 고체 (162 mg, 78%)로서 생성물 23을 제공하였다. LC/MS 3.02 분 (ES+) m/z (상대 강도) 1052.37.
(f) (2S)-2-아미노-N-((2S)-1-((4-(8-(3-((2-시클로프로필-7-메톡시-5-옥소-5,11a-디하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-8-일)옥시)프로폭시)-7-메톡시-5-옥소-5,11a-디하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-2-일)페닐)아미노)-1-옥소프로판-2-일)-3-메틸부탄아미드 (17)
과량의 피페리딘을 DMF (1 mL) 중의 SEM-디락탐 23 (76 mg, 0.073 mmol)의 용액에 첨가하였다 (0.2 mL, 2 mmol). 상기 혼합물을 실온에서 20 분 동안 교반하고, 이때 상기 반응은 완료되었다 (LC/MS에 의해 모니터링된 바에 의함). 상기 반응 혼합물을 CH2Cl2 (75 mL)로 희석하고, 피페리딘이 완전히 제거될 때까지, 유기 상을 H2O (3x75 mL)로 세척하였다. 유기 상을 MgSO4에서 건조하고, 여과하고, 과량의 용매를 감압 하에 회전식 증발에 의해 제거하여 미정제 생성물 17을 제공하여, 다음 단계에서 그대로 사용하였다. LC/MS 2.32 분 (ES+) m/z (상대 강도) 830.00.
(g) N-((2S)-1-(((2S)-1-((4-(8-(3-((2-시클로프로필-7-메톡시-5-옥소-5,11a-디하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-8-일)옥시)프로폭시)-7-메톡시-5-옥소-5,11a-디하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-2-일)페닐)아미노)-1-옥소프로판-2-일)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄-2-일)-1-(3-(2,5-디옥소-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)프로판아미도)-3,6,9,12,15,18,21,24-옥타옥사헵타코산-27-아미드 (18)
아르곤 대기 하에서 EDCI 염화수소산염 (14 mg, 0.0732 mmol)를 건조 CH2Cl2 (5 mL) 중의 말레이미드-PEG8-산 (43.4 mg, 0.0732 mmol)의 현탁액에 첨가하였다. 상기 혼합물을 1 시간 동안 실온에서 교반하고 PBD 17 (60.7 mg, 0.0732 mmol)를 첨가하였다. 상기 반응이 완료될 때까지 (보통 5 시간) 교반하였다. 상기 반응물을 CH2Cl2로 희석하고, 유기 상을 H2O 및 염수로 세척하고, MgSO4에서 건조하고, 여과하고, 과량의 용매를 감압 하에 회전식 증발에 의해 제거하였다. 생성물을 신중한 실리카 겔 크로마토그래피 (느린 용리 100% CHCl3 내지 9:1 CHCl3/MeOH) 후 역상 크로마토그래피에 의해 정제하여, 비반응 말레이미드-PEG8-산을 제거하였다. 생성물 18을 17.6% (21.8 mg)에서 단리하였다. LC/MS 2.57 분 (ES+) m/z (상대 강도) 1405.30 ; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ7.91 (t, J = 3.5 Hz, 1H), 7.80 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 7.75 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.69 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.54 - 7.50 (m, 2H), 7.45 (s, 1H), 7.39 - 7.31 (m, 2H), 6.87 (d, J = 10.5 Hz, 2H), 6.76 (s, 1H), 6.72 - 6.68 (m, 2H), 4.74 - 4.62 (m, 1H), 4.45 - 4.17 (m, 7H), 3.95 (s, 3H), 3.94 (s, 3H), 3.67 - 3.58 (m, 34H), 3.54 (m, 2H), 3.42 (dd, J = 10.2, 5.2 Hz, 2H), 3.16 - 3.07 (m, 1H), 2.92 (dd, J = 16.1, 4.1 Hz, 1H), 2.62 - 2.49 (m, 4H), 2.48 - 2.39 (m, 2H), 2.37 - 2.25 (m, 1H), 1.92 (s, 1H), 1.52 - 1.44 (m, 3H), 1.10 - 0.93 (m, 6H), 0.79 (dd, J = 9.2, 5.3 Hz, 2H), 0.57 (dd, J = 9.2, 5.3 Hz, 2H), NH는 관찰되지 않음.
실시예 3
Figure pct00148
(a) (S)-7-메톡시-8-(3-(((S)-7-메톡시-2-(4-(4-메틸피페라진-1-일)페닐)-5,11-디옥소-10-((2-(트리메틸실릴)에톡시)메틸)-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일)옥시)프로폭시)-5,11-디옥소-10-((2-(트리메틸실릴)에톡시)메틸)-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-2-일 트리플루오로메탄설포네이트 (24)
Pd(PPh3)4 (20.6 mg, 0.018 mmol)를 비스-에놀 트리플레이트 12 (500 mg, 0.44 mmol), N-메틸 피페라진 보론 에스테르 (100 mg, 0.4 mmol), Na2CO3 (218 mg, 2.05 mmol), MeOH (2.5 mL), 톨루엔 (5 mL) 및 물 (2.5 mL)의 교반 혼합물에 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 30℃ 질소 대기 하에 24 시간 동안 교반하고 이때, 모든 보론 에스테르가 소모되었다. 이어서, 상기 반응 혼합물을 증발 건조시키고 잔류물을 EtOAc (100 mL) 중에 취하고, H2O (2 x 50 mL), 염수 (50 mL)로 세척하고, 건조하고 (MgSO4), 여과하고, 감압 하에 증발시켜, 미정제 생성물을 제공하였다. 플래쉬 크로마토그래피 (구배 용리: 80:20 v/v 헥산/EtOAc 내지 60:40 v/v 헥산/EtOAc)에 의한 정제에 의해 노란색 거품 (122.6 mg, 25%)으로서 생성물 24를 제공하였다.
LC/MS 3.15 분 (ES+) m/z (상대 강도) 1144 ([M + H]+., 20%).
(b) (9H-플루오렌-9-일)메틸 ((S)-1-(((S)-1-((4-((S)-7-메톡시-8-(3-(((S)-7-메톡시-2-(4-(4-메틸피페라진-1-일)페닐)-5,11-디옥소-10-((2-(트리메틸실릴)에톡시)메틸)-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일)옥시)프로폭시)-5,11-디옥소-10-((2-(트리메틸실릴)에톡시)메틸)-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-2-일)페닐)아미노)-1-옥소프로판-2-일)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄-2-일)카르바메이트 (25)
PBD-트리플레이트 24 (359 mg, 0.314 mmol), 보론 피나콜 에스테르 20 (250 mg, 0.408 mmol) 및 트리에틸아민 (0.35 mL, 2.51 mmol)을 톨루엔/MeOH/H2O, 2:1:1 (3 mL)의 혼합물에 용해시켰다. 전자렌지 용기를 퍼징하고, 아르곤으로 3 회 충진하고 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐(0) (21.7 mg, 0.018 mmol)을 첨가하고, 상기 반응 혼합물 80℃에서 10 분 동안 전자렌지에 두었다. 이어서, CH2Cl2 (100 mL)를 첨가하고, 유기물을 물 (2 x 50 mL) 및 염수 (50 mL)로 세척하고 MgSO4로 건조하고, 여과하고, 휘발물질을 감압 하에 회전식 증발에 의해 제거하였다. 상기 미정제 생성물을 실리카 겔 크로마토그래피 칼럼 (CHCl3/MeOH, 100% 내지 9:1)에 의해 정제하여 순수 25 (200 mg, 43% 수율)를 제공하였다. LC/MS 3.27 분 (ES+) m/z (상대 강도) 1478 ([M + H]+., 100%).
(c) (9H-플루오렌-9-일)메틸 ((S)-1-(((S)-1-((4-((S)-7-메톡시-8-(3-(((S)-7-메톡시-2-(4-(4-메틸피페라진-1-일)페닐)-5-옥소-5,11a-디하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일)옥시)프로폭시)-5-옥소-5,11a-디하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-2-일)페닐)아미노)-1-옥소프로판-2-일)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄-2-일)카르바메이트 (26)
-78℃에서 아르곤 대기 하에서 Super-Hydride®(0.34 mL, 1M, THF 중)의 용액을 THF (5 mL) 중의 SEM-디락탐 25 (200 mg, 0.135 mmol)의 용액에 적가하였다. 상기 반응 혼합물의 내부 온도를 일정하게 유지하기 위해 상기 첨가 과정을 5 분 이상 완료하였다. 20 분 후, LC/MS 분석을 위해 분취량을 물로 퀀칭하였고, LC/MS 분석에 의해 상기 반응이 완료된 것으로 나타났다. 물 (20 mL)을 상기 반응 혼합물에 첨가하고, 냉각 욕조를 제거하였다. 유기층을 EtOAc (3 x 30 mL)로 추출하고, 결합된 유기물을 염수 (50 mL)로 세척하고, MgSO4로 건조하고, 여과하고, 용매를 감압 하에 회전식 증발에 의해 제거하였다. 상기 미정제 생성물을 MeOH (6 mL), CH2Cl2 (3 mL), 물 (1 mL) 및 충분한 실리카 겔에 용해시켜서, 걸쭉한 교반 현탁액을 생성시켰다. 5 일 후, 상기 현탁액을 소결 깔때기를 통해 여과하고, 생성물의 용리가 완료될 때까지, CH2Cl2/MeOH (9:1) (100 mL)로 세척하였다. 유기층을 염수 (2 x 50 mL)로 세척하고, MgSO4로 건조하고, 여과하고, 용매를 감압 하에 회전식 증발에 의해 제거하였다. 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 (100% CHCl3 내지 96% CHCl3/ 4% MeOH)에 의한 정제에 의해 노란색 고체 (100 mg, 63%)로서 생성물 26을 제공하였다. LC/MS 2.67 분 (ES+) m/z (상대 강도) 1186 ([M + H]+., 5%).
(d) (S)-2-아미노-N-((S)-1-((4-((R)-7-메톡시-8-(3-(((R)-7-메톡시-2-(4-(4-메틸피페라진-1-일)페닐)-5-옥소-5,11a-디하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일)옥시)프로폭시)-5-옥소-5,11a-디하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-2-일)페닐)아미노)-1-옥소프로판-2-일)-3-메틸부탄아미드 (27)
과량의 피페리딘 (0.1 mL, 1 mmol)을 DMF (0.9 mL) 중의 PBD 26 (36.4 mg, 0.03 mmol)의 용액에 첨가하였다. 상기 혼합물을 실온에서 20 분 동안 교반하였고, 이때 상기 반응이 완료되었다 (LC/MS에 의해 모니터링된 바에 의함). 상기 반응 혼합물을 CH2Cl2 (50 mL)로 희석하고, 피페리딘이 완전히 제거될 때까지, 유기 상을 H2O (3 x 50 mL)로 세척하였다. 유기 상을 MgSO4에서 건조하고, 여과하고, 과량의 용매를 감압 하에 회전식 증발에 의해 제거하여 미정제 생성물 27을 제공하여, 다음 단계에서 그대로 사용하였다. LC/MS 2.20 분 (ES+) m/z (상대 강도) 964 ([M + H]+., 5%).
(e) 6-(2,5-디옥소-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)-N-((S)-1-(((S)-1-((4-((S)-7-메톡시-8-(3-(((S)-7-메톡시-2-(4-(4-메틸피페라진-1-일)페닐)-5-옥소-5,11a-디하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일)옥시)프로폭시)-5-옥소-5,11a-디하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-2-일)페닐)아미노)-1-옥소프로판-2-일)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄-2-일)헥사n아미드 (28)
아르곤 대기 하에서 EDCI 염화수소산염 (4.7 mg, 0.03 mmol)를 건조 CH2Cl2 (3 mL) 중의 6-말레이미도헥사노산 (6.5 mg, 0.03 mmol)의 현탁액에 첨가하였다. 상기 혼합물을 1 시간 동안 실온에서 교반하고 PBD 27 (34 mg, 미정제)을 첨가하였다. 상기 반응이 완료될 때까지 (6 시간) 교반하였다. 상기 반응물을 CH2Cl2로 희석하고, 유기 상을 H2O 및 염수로 세척하고 MgSO4에서 건조하고, 여과하고, 과량의 용매를 감압 하에 회전식 증발에 의해 제거하였다. 생성물을 신중한 실리카 겔 크로마토그래피 (느린 용리, 100% CHCl3 내지 9:1 CHCl3/MeOH) 후, 역상 크로마토그래피에 의해 정제하고 비반응 말레이미드-PEG8-산을 제거하였다. 생성물 28을 2 단계에서 41%로 단리하였다 (14.6 mg). LC/MS 2.40 분 (ES+) m/z (상대 강도) 1157 ([M + H]+., 5%)
실시예 4 - 화합물 25의 대안적 합성
Figure pct00149
PBD-트리플레이트 21 (469 mg, 0.323 mmol), 보론 피나콜 에스테르 (146.5 mg, 0.484 mmol) 및 Na2CO3 (157 mg, 1.48 mmol)을 톨루엔/MeOH/H2O, 2:1:1 (10 mL)의 혼합물에 용해시키고, 반응 플라스크를 아르곤으로 3 회 퍼징하고, 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐(0) (7.41 mg, 0.0064 mmol)을 첨가하고, 상기 반응 혼합물을 하룻밤 동안 30℃로 가열하였다. 용매를 감압 하에 제거하고 및 잔류물을 H2O (50 mL) 중에 취하고 및 EtOAc (3 x 50 mL)로 추출하고, 결합된 유기물을 염수 (100 mL)로 세척하고, MgSO4로 건조하고, 여과하고, 휘발물질을 감압 하에 회전식 증발에 의해 제거하였다. 상기 미정제 생성물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 (CHCl3 100% 내지 CHCl3/MeOH 95%:5%)에 의해 정제하여, 순수 25를 33% 수율에서 제공하였다 (885 mg). LC/MS 3.27 분 (ES+) m/z (상대 강도) 1478 ([M + H]+., 100%).
실시예 5
Figure pct00150
(a) (S)-2-(4-아미노페닐)-8-(3-(((S)-2-(벤조[d][1,3]디옥소l-5-일)-7-메톡시-5,11-디옥소-10-((2-(트리메틸실릴)에톡시)메틸)-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일)옥시)프로폭시)-7-메톡시-10-((2-(트리메틸실릴)에톡시)메틸)-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-5,11(10H,11aH)-디온 (29)
Ar 대기 하에서, 3, 4-(메틸렌디옥시)페닐 보론 산 (356 mg, 2.1 mmol, 1.3 equiv.), TEA (1.8 mL, 12.9 mmol, 8 equiv.) 및 트리플레이트/아닐린 13 (1.75 g, 1.7 mmol, 1 equiv.)을 에탄올 (7 mL), 톨루엔 (13 mL) 및 물 (2 mL)의 혼합물에 용해시키고, 상기 반응 혼합물을 진공처리시키고, Ar으로 3 회 플러싱하고, 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐(0) (114 mg, 0.1 mmol, 0.06 equiv.)을 첨가하였다. 상기 플라스크를 다시 진공처리시키고, Ar으로 3 회 플러싱하고 및 30 초 동안 사전 교반한 후, 8 분 동안 80℃의 마이크로파에서 가열하고, TLC (80:20 v/v 에틸 아세테이트/헥산)에 의한 분석은 출발 물질의 완전 소모를 나타내었다. 상기 반응 혼합물을 디클로로메탄 (50 mL)으로 희석하고 및 물 (50 mL)로 세척하였다. 유기층을 MgSO4로 건조하고, 여과하고, 용매를 진공에서 제거하였다. 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 (60:40 내지 20:80 v/v 헥산/ 에틸 아세테이트)에 의한 정제에 의해 노란색 고체 (1.21 g, 71%)로서 생성물 29를 제공하였다. LC/MS (3.92 분 (ES+) m/z (상대 강도) 1032.44 ([M + H]+., 100).
(b) (S)-2-(4-아미노페닐)-8-(3-(((S)-2-(벤조[d][1,3]디옥소l-5-일)-7-메톡시-5-옥소-5,11a-디하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일)옥시)프로폭시)-7-메톡시-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-5(11aH)-온 (30)
SEM 디락탐 29 (0.25 g, 0.24 mmol, 1 equiv.)를 THF (8 mL)에 용해시키고 Ar 대기 하에서, -78℃로 냉각시키고, 5 분 이상 온도를 모니터링하면서, Super-Hydride®(0.6 mL, 1 M, THF, 2.5 equiv.)를 적가하고 20 분 후 소량의 샘플을 취하고, LCMS 분석에 적용시켰다. 물 (50 mL)을 첨가하고, 냉각 욕조를 제거하고, 용액 에틸 아세테이트 (50 mL)로 세척하고, 유기층을 추출하고, 염수 (60 mL)로 세척하고, MgSO4로 건조하고, 여과하고, 용매를 진공에서 제거하였다. 상기 미정제 생성물을 EtOH (15 mL), CH2Cl2 (7.5 mL) 및 물 (2.5 mL)에 용해시키고 걸쭉한 현탁액이 될 때까지 충분한 실리카 겔을 첨가하고, 5 일 동안 교반한 후, 소결 깔때기를 통해 여과하고, 생성이 중단되고 용리될 때까지, CH2Cl2/MeOH (9:1) (100 mL)로 세척하였다. 유기층을 염수 (2 x 50 mL)로 세척하고, MgSO4로 건조하고, 여과하고, 용매를 진공에서 제거하였다. 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 (CHCl3 with 1% 내지 4% MeOH 구배)에 의한 정제에 의해 노란색 고체 (94 mg, 53%)로서 생성물 30을 제공하였다 . LC/MS (2.53 분 (ES+) m/z (상대 강도) 739.64 ([M ]+., 70).
(c) 알릴 ((S)-1-(((S)-1-((4-((S)-8-(3-(((S)-2-(벤조[d][1,3]디옥소l-5-일)-7-메톡시-5-옥소-5,11a-디하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일)옥시)프로폭시)-7-메톡시-5-옥소-5,11a-디하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-2-일)페닐)아미노)-1-옥소프로판-2-일)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄-2-일)카르바메이트 (31)
Ar 대기 하에서, 알라닌-발린-Alloc (180 mg, 0.66 mmol, 1.2 equiv.)를 무수 CH2Cl2 (21 mL) 및 메탄올 (1 mL) 중의 EEDQ (163 mg, 0.66 mmol, 1.2 equiv.)로 1 시간 동안 교반하고, PBD 30 (407 mg, 0.55 mmol, 1 equiv.)을 무수 CH2Cl2 (21 mL) 및 메탄올 (1 mL)에 용해시키고 상기 반응물에 첨가하고. 5 일 동안 실온에서 교반한 후, LC/MS는 대부분의 생성물이 생성되었음을 나타내었다. 용매를 진공에서 제거하고, 칼럼 크로마토그래피 (CH2Cl2 with 1% 내지 6% MeOH 구배)에 의한 정제에 의해 노란색 고체 (184 mg, 34%)로서 생성물 31을 수득하였다. LC/MS (2.95 분 (ES+) m/z (상대 강도) 994.95 ([M + H]+., 60).
(d) (S)-2-아미노-N-((S)-1-((4-((S)-8-(3-(((S)-2-(벤조[d][1,3]디옥소l-5-일)-7-메톡시-5-옥소-5,11a-디하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일)옥시)프로폭시)-7-메톡시-5-옥소-5,11a-디하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-2-일)페닐)아미노)-1-옥소프로판-2-일)-3-메틸부탄아미드 (32)
Ar 대기 하에서, 이민 31 (100 mg, 0.1 mmol, 1 equiv.)을 무수 DCM (10 mL)에 용해시켰다 (용해를 보조하기 위해 메탄올 한 방울을 적가함). 피롤리딘 (30 μL, 0.15 mmol, 1.5 equiv.)을 적가하고, 상기 플라스크를 진공처리시키고, Ar으로 3 회 플러싱하고, Pd(PPh3)4 (7 mg, 6 μmol, 0.06 equiv.)를 첨가하고, 플라스크를 진공처리시키고, Ar으로 3 회 플러싱하고, 1 시간 후 LC/MS 분석은 생성물 형성 및 출발 물질의 완전 손실을 나타내었다. Et2O (60 mL)를 상기 반응 혼합물에 첨가하고, 모든 생성물이 침전될 때까지 교반하고, 침전물을 소결 깔때기를 통해 여과하고, Et2O (2 x 20 mL)로 2 회 세척하고, 수집 플라스크를 교체하고 단리된 고체를 용해시키고, CHCl3 (100 mL)로 소결물을 통과시켜 세척하였다. 용매를 진공에서 제거하여, 노란색 고체로서 미정제 생성물 32를 제공하여, 다음 단계에 직접 사용하였다. LC/MS (1.14 분 (ES+) m/z (상대 강도) 910.40 ([M + H]+., 67).
(e) N-((S)-1-(((S)-1-((4-((S)-8-(3-(((S)-2-(벤조[d][1,3]디옥소l-5-일)-7-메톡시-5-옥소-5,11a-디하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일)옥시)프로폭시)-7-메톡시-5-옥소-5,11a-디하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-2-일)페닐)아미노)-1-옥소프로판-2-일)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄-2-일)-1-(3-(2,5-디옥소-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)프로판아미도)-3,6,9,12,15,18,21,24-옥타옥사헵타코산-27-아미드 (33)
용해를 보조하기 위해, 무수한 MeOH 방울을 적가하면서, 이민 32 (92 mg, 0.1 mmol, 1.1 equiv.)을 CHCl3 (6 mL)에 용해시키고, 말레이미드-PEG8-산 (53 mg, 0.09 mmol, 1 equiv.)를 첨가하고, EEDQ (33 mg, 0.14 mmol, 1.5 equiv.)를 첨가하였다. LC/MS 분석이 대부분의 생성물이 생성되었음을 나타낼 때까지, 이것을 아르곤 하에 4 일 동안 실온에서 활발하게 교반하고. 용매를 진공에서 제거하고 미정제 생성물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 (CHCl3 with 1% 내지 10% MeOH 구배)에 의해 부분적으로 정제하여, 33 (81mg)을 수득하였다. 상기 물질을 예비 HPLC에 의해 추가로 정제하여, 노란색 고체 (26.3 mg, 18%)로서 33을 제공하였다. Fast Formic run: LC/MS (1.39 분 (ES+) m/z (상대 강도) 1485.00 ([M + H]+., 64).
실시예 6
Figure pct00151
(a) 9H-플루오렌-9-일)메틸 ((S)-1-(((S)-1-((4-((S)-8-(3-(((S)-2-(벤조[d][1,3]디옥소l-5-일)-7-메톡시-5,11-디옥소-10-((2-(트리메틸실릴)에톡시)메틸)-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일)옥시)프로폭시)-7-메톡시-5,11-디옥소-10-((2-(트리메틸실릴)에톡시)메틸)-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-2-일)페닐)아미노)-1-옥소프로판-2-일)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄-2-일)카르바메이트 (34)
Ar 대기 하에서, 트리플레이트 21 (0.5 g, 0.35 mmol, 1 equiv.), 3, 4-(메틸렌디옥시)페닐 보론 산 (75 mg, 0.45 mmol, 1.3 equiv.) 및 Na2CO3 (0.17 g, 1.6 mmol, 4.5 equiv.)을 톨루엔 (11 mL), EtOH (5.5 mL) 및 물 (5.5 mL)에 용해시키고, 상기 플라스크를 진공처리시키고, Ar으로 3 회 플러싱하고, Pd(PPh3)4 (24 mg, 0.02 mmol, 0.06 equiv.)를 첨가하고, 다시 상기 플라스크를 진공처리시키고, Ar으로 3 회 플러싱하고. 이것을 30 ℃로 가열하고 및 하룻밤 동안 교반하였다. LC/MS에 의한 분석은 출발 물질의 완전 손실을 나타내었다. 용매를 진공에서 제거하고, 잔류물을 물 (60 mL)에 용해시키고, 에틸 아세테이트 (60 mL x 3)로 세척하였다. 결합된 유기층을 염수 (50 mL)로 세척하고, MgSO4로 건조하고, 여과하고, 용매를 진공에서 제거하였다. 칼럼 크로마토그래피 (50:50 내지 25:75 v/v 헥산/ 에틸 아세테이트)에 의한 정제에 의해, 노란색 고체 (310 mg, 64%)로서 생성물 34를 제공하였다. LC/MS (1.44 분 (ES-) m/z (상대 강도) 1423.35 ([M - H]-., 79).
(b) (9H-플루오렌-9-일)메틸 ((S)-1-(((S)-1-((4-((S)-8-(3-(((S)-2-(벤조[d][1,3]디옥소l-5-일)-7-메톡시-5-옥소-5,11a-디하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일)옥시)프로폭시)-7-메톡시-5-옥소-5,11a-디하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-2-일)페닐)아미노)-1-옥소프로판-2-일)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄-2-일)카르바메이트 (35)
SEM 디락탐 34 (0.31 g, 0.22 mmol, 1 equiv.)를 THF (10 mL)에 용해시키고 Ar 대기 하에서, -78℃로 냉각시키고, 5 분 이상 온도를 모니터링하면서, Super-Hydride®(0.5 mL, 1 M, THF, 2.5 equiv.)를 적가하고 30 분 후 소량의 샘플을 취하고, LC/MS 분석에 적용시켰다. 물 (50 mL)를 첨가하고, 냉각 욕조를 제거하고, 용액 에틸 아세테이트 (50 mL)로 세척하고, 유기층을 추출하고, 염수 (60 mL)로 세척하고, MgSO4로 건조하고, 여과하고, 용매를 진공에서 제거하였다. 상기 미정제 생성물을 EtOH (13.2 mL), CH2Cl2 (6.6 mL) 물 (2.2 mL)에 용해시키고 걸쭉한 현탁액이 될 때까지 충분한 실리카 겔을 첨가하고, 5 일 동안 교반한 후, 이것을 소결 깔때기를 통해 여과하고, 생성이 중단되고 용리될 때까지, CH2Cl2/MeOH (9:1) (100 mL)로 세척하고 유기층을 염수 (2 x 50 mL)로 세척하고, MgSO4로 건조하고, 여과하고, 용매를 진공에서 제거하였다. 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 (CHCl3 with 1% 내지 4% MeOH 구배)에 의한 정제에 의해 노란색 고체 (185 mg, 75%)로서 순수 생성물 35을 제공하였다. LC/MS (1.70 분 (ES+) m/z (상대 강도) 1132.85 ([M + H]+., 60).
(c) (S)-2-아미노-N-((S)-1-((4-((S)-8-(3-(((S)-2-(벤조[d][1,3]디옥소l-5-일)-7-메톡시-5-옥소-5,11a-디하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일)옥시)프로폭시)-7-메톡시-5-옥소-5,11a-디하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-2-일)페닐)아미노)-1-옥소프로판-2-일)-3-메틸부탄아미드 (32)
이민 35 (82 mg, 0.07 mmol, 1 equiv.)을 DMF (1 mL)에 용해시키고, 피페리딘 (0.2 mL, 2 mmol, 과량)를 서서히 첨가하였다. 실온에서 20 분 동안 LC/MS 분석이 출발 물질의 완전 소모를 나타낼 때까지, 이 용액을 교반하고, 상기 반응 혼합물을 CH2Cl2 (50 mL)로 희석하고, 물 (50 mL x 4)로 세척하고, MgSO4로 건조하고, 여과하고, 용매를 진공에서 제거하였다. 생성물 33을 추가의 정제 과정 없이 다음 단계에서 사용하였다. LC/MS (1.15 분 (ES+) m/z (상대 강도) 910.60 ([M + H]+., 58).
실시예 7
(i) ( S )-(2-아미노-5- 메톡시 -4-(( 트리이소프로필실릴 ) 옥시 ) 페닐 )(2-((( 테르트 - 부틸디메틸실릴 ) 옥시 ) 메틸 )-4- 메틸 -2,3- 디하이드로 -1H-피롤-1-일) 메탄온 ( 49 )
Figure pct00152
(a) 5-메톡시-2-니트로-4-((트리이소프로필실릴)옥시)벤즈알데하이드 ( 42 )
순수 트리이소프로필실릴클로라이드 (56.4 mL, 262 mmol)를 이미다졸 (48.7 g, 715.23 mmol) 및 4-히드록시-5-메톡시-2-니트로벤즈알데하이드 41 (47 g, 238 mmol) (함께 분쇄함)의 혼합물에 첨가하였다. 페놀 및 이미다졸이 녹아서 용액이 될 때까지 (100 ℃), 상기 혼합물을 가열하였다. 상기 반응 혼합물을 15 분 동안 교반한 다음 냉각시켰으며, 이때 플라스크 바닥에 고체가 형성된 것이 관찰되었다 (이미다졸 클로라이드). 상기 반응 혼합물을 5% EtOAc/ 헥산으로 희석하고 직접 실리카 겔에 부하하고, 상기 패드를 5% EtOAc/ 헥산으로 용리시킨 다음, 10% EtOAc/헥산으로 용리시켰다 (소량의 과량으로 인해, 극소량의 비반응 TIPSCl이 생성물 내에서 발견됨). 원하는 생성물을 헥산 중의 5 % 에틸 아세테이트로 용리시켰다. 과량의 용리액을 감압 하에 회전식 증발에 의해 제거하고, 고 진공 하에 건조하여, 결정질의 밝은 민감성 고체 (74.4 g, 88 %)를 제공하였다. LC/MS에 의한 충족 순도 (4.22 분 (ES+) m/z (상대 강도) 353.88 ([M + H]+., 100)); 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ10.43 (s, 1H), 7.60 (s, 1H), 7.40 (s, 1H), 3.96 (s, 3H), 1.35 - 1.24 (m, 3H), 1.10 (m, 18H).
(b) 5-메톡시-2-니트로-4-((트리이소프로필실릴)옥시)벤조산 ( 43 )
물 (800 mL) 중 아염소산 나트륨 (47.3 g, 523 mmol, 80 % 공업용) 및 소듐 디하이드로젠포스페이트 1염기 (35.2 g, 293 mmol) (NaH2PO4)의 용액을 실온에서 테트라하이드로푸란 (500 mL) 중의 화합물 2 (74 g, 209 mmol)의 용액에 첨가하였다. 과산화수소 (60 % w/w, 140 mL, 2.93 mol)를 활발하게 교반된 2 상 혼합물에 즉시 첨가하였다. 상기 반응 혼합물에서 기체 (산소)가 생성되었고, 출발 물질이 용해되고, 상기 반응 혼합물의 온도가 45℃로 상승하였다. 30 분 후 LC/MS는 반응이 완료되었음을 나타내었다. 상기 반응 혼합물을 얼음 욕조에서 냉각시키고, 염산 (1 M)를 첨가하여 pH를 3으로 낮추었다 (반응 종료시 pH가 이미 산성인 경우, 상기 단계는 많은 경우에 불필요함; 추출 전 pH 체크). 그후 상기 반응 혼합물을 에틸 아세테이트 (1 L)로 추출하고, 유기 상을 염수 (2 x 100 mL)로 세척하고, 황산 마그네슘에서 건조하였다. 유기 상을 여과하고, 과량의 용매를 감압 하에 회전식 증발에 의해 제거하여, 정량 수율에서 노란색 고체로서 생성물 43을 제공하였다. LC/MS (3.93 분 (ES-) m/z (상대 강도) 367.74 ([M - H]-., 100)); 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ7.36 (s, 1H), 7.24 (s, 1H), 3.93 (s, 3H), 1.34 - 1.22 (m, 3H), 1.10 (m, 18H).
(c) ((2S,4R)-2-(((tert-부틸디메틸실릴)옥시)메틸)-4-히드록시피롤리딘-1-일)(5-메톡시-2-니트로-4-((트리이소프로필실릴)옥시)페닐)메탄온 (45)
0 ℃에서, DCC (29.2 g, 141 mmol, 1.2 eq)를 디클로로메탄 (200 mL) 중의 산 3 (43.5 g, 117.8 mmol, 1eq), 및 히드록시벤조트리아졸 하이드레이트 (19.8 g, 129.6 mmol, 1.1 eq)의 용액에 첨가하였다. 냉각 욕조를 제거하고, 30 분 동안 실온에서 반응을 진행시키고, 이때, -10 ℃에서 아르곤 하에서 디클로로메탄 (100 mL) 중의 (2S,4R)-2-t-부틸디메틸실릴옥시메틸-4-히드록시피롤리딘 44 (30 g, 129.6 mmol, 1.1 eq) 및 트리에틸아민 (24.66 mL, 176 mmol, 1.5 eq)의 용액을 신속하게 첨가하였다 (대량인 경우, 반응 혼합물을 추가로 냉각시킴으로써 첨가 시간을 단축시킬 수 있음).상기 반응 혼합물을 실온에서 40 분 내지 1 시간 동안 교반하고, LC/MS 및 TLC (EtOAc)에 의해 모티터링하였다. 고체를 셀라이트에서 여과에 의해 제거하고, pH가 4 또는 5로 측정될 때까지, 유기 상을 냉각 수성 0.1 M HCl로 세척하였다. 그후 유기 상을 물로 세척한 다음, 포화 수성 중탄산 나트륨 및 염수로 세척하였다. 유기 층을 황산 마그네슘에서 건조하고, 여과하고, 과량의 용매를 감압 하에 회전식 증발에 의해 제거하였다. 잔류물을 칼럼 플래쉬 크로마토그래피 (실리카 겔; 구배 40/60 에틸 아세테이트/헥산 내지 80/20 에틸 아세테이트/ 헥산)에 적용하였다. 과량의 용매를 감압 하에 회전식 증발에 의해 제거하여, 순수 생성물 45을 제공하였다 (45.5 g의 순수 생성물 66%, 및 17 g의 소량의 불순물, 총 90%). LC/MS 4.43 분 (ES+) m/z (상대 강도) 582.92 ([M + H]+., 100); 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ7.66 (s, 1H), 6.74 (s, 1H), 4.54 (s, 1H), 4.40 (s, 1H), 4.13 (s, 1H), 3.86 (s, 3H), 3.77 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 3.36 (dd, J = 11.3, 4.5 Hz, 1H), 3.14 - 3.02 (m, 1H), 2.38 - 2.28 (m, 1H), 2.10 (ddd, J = 13.3, 8.4, 2.2 Hz, 1H), 1.36 - 1.19 (m, 3H), 1.15 - 1.05 (m, 18H), 0.91 (s, 9H), 0.17 - 0.05 (m, 6H) (회전 이성질체 존재).
(d) (S)-5-(((tert-부틸디메틸실릴)옥시)메틸)-1-(5-메톡시-2-니트로-4-((트리이소프로필실릴)옥시)벤조일)피롤리딘-3-온 (46)
0 ℃에서 TCCA (8.82 g, 40 mmol, 0.7 eq)를 건조 디클로로메탄 (250 mL) 중의 45 (31.7 g, 54 mmol, 1 eq) 및 TEMPO (0.85 g, 5.4 mmol, 0.1 eq)의 교반된 용액에 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 20 분 동안 활발하게 교반하고, 이때 TLC (50/50 에틸 아세테이트/헥산)는 출발 물질의 완전 소모를 나타내었다. 상기 반응 혼합물을 셀라이트를 통하여 여과하고, 여과물을 수성 포화 중탄산 나트륨 (100 mL), 소듐 티오술페이트 (9 g, 300 mL), 염수 (100 mL)로 세척하고, 황산 마그네슘에서 건조하였다. 감압 하의 회전식 증발에 의해 정량 수율에서 생성물 46을 제공하였다. LC/MS 4.52 분 (ES+) m/z (상대 강도) 581.08 ([M + H]+., 100);
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ7.78 - 7.60 (m, 1H), 6.85 - 6.62 (m, 1H), 4.94 (dd, J = 30.8, 7.8 Hz, 1H), 4.50 - 4.16 (m, 1H), 3.99 - 3.82 (m, 3H), 3.80 - 3.34 (m, 3H), 2.92 - 2.17 (m, 2H), 1.40 - 1.18 (m, 3H), 1.11 (t, J = 6.2 Hz, 18H), 0.97 - 0.75 (m, 9H), 0.15 - -0.06 (m, 6H) (회전 이성질체 존재).
(e) (S)-5-(((tert-부틸디메틸실릴)옥시)메틸)-1-(5-메톡시-2-니트로-4-((트리이소프로필실릴)옥시)벤조일)-4,5-디하이드로-1H-피롤-3-일 트리플루오로메탄설포네이트 ( 47 )
-50 ℃ (아세톤/건조 얼음 욕조)에서 2,6-루티딘 (25.6 mL, 23.5 g, 220 mmol, 4 eq, 체 (sieve)에서 건조)의 존재 하에, 무수 트리플산 (27.7 mL, 46.4 g, 165 mmol, 3 eq)을 활발한 교반 중의 건조 디클로로메탄 (900 mL) 중의 케톤 46 (31.9 g, 55 mmol, 1 eq)의 현탁액에 첨가하였다 (온도 제어). 상기 반응 혼합물을 1.5 시간 동안 교반하고, 이때 미니 워크-업 (물/디클로로메탄) 후 LC/MS는 반응이 완료되었음을 나타내었다. 물을 여전히 냉각 상태인 반응 혼합물에 첨가하고, 유기 층을 분리하고, 포화 중탄산 나트륨, 염수 및 황산 마그네슘로 세척하였다. 유기 상을 여과하고, 과량의 용매를 감압 하에 회전식 증발에 의해 제거하였다. 잔류물을 칼럼 플래쉬 크로마토그래피 (실리카 겔; 10/90 v/v 에틸 아세테이트/헥산)에 적용하고, 과량의 용리물의 제거에 의해, 생성물 47 (37.6 g, 96 %)을 제공하였다. LC/MS, 방법 2, 4.32 분 (ES+) m/z (상대 강도) 712.89 ([M + H]+., 100); 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ7.71 (s, 1H), 6.75 (s, 1H), 6.05 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 4.78 (dd, J = 9.8, 5.5 Hz, 1H), 4.15 - 3.75 (m, 5H), 3.17 (ddd, J = 16.2, 10.4, 2.3 Hz, 1H), 2.99 (ddd, J = 16.3, 4.0, 1.6 Hz, 1H), 1.45 - 1.19 (m, 3H), 1.15 - 1.08 (m, 18H), 1.05 (s, 6H), 0.95 - 0.87 (m, 9H), 0.15 - 0.08 (m, 6H).
(f) (S)-(2-(((tert-부틸디메틸실릴)옥시)메틸)-4-메틸-2,3-디하이드로-1H-피롤-1-일)(5-메톡시-2-니트로-4-((트리이소프로필실릴)옥시)페닐)메탄온 ( 48 )
아르곤 대기 하에서 트리페닐라신 (1.71 g, 5.60 mmol, 0.4 eq)을 건조 디옥산 (80 mL) 중의 트리플레이트 47 (10.00 g, 14 mmol, 1eq), 메틸보론 산 (2.94 g, 49.1 mmol, 3.5 eq), 산화 은 (13 g, 56 mmol, 4 eq) 및 포타슘 포스페이트 3 염기 (17.8 g, 84 mmol, 6 eq)의 혼합물에 첨가하였다. 상기 반응물을 아르곤으로 3 회 세척하고, 비스(벤조니트릴)팔라듐(II) 클로라이드 (540 mg, 1.40 mmol, 0.1 eq)를 첨가하였다. 상기 반응물을 110℃로의 순간적 가온 전에 아르곤을 사용하여 3 회 이상 세척하였다 (플라스크로의 첨가 전에, 상기 건조 가열 블록을 110℃로 미리 가온시켰음). 10 분 후, 상기 반응물을 실온으로 냉각시키고, 셀라이트 패드를 통해 여과하였다. 용매를 감압 하에 회전식 증발에 의해 제거하였다. 결과 잔류물을 칼럼 플래쉬 크로마토그래피 (실리카 겔; 10 % 에틸 아세테이트 / 헥산)에 적용하였다. 순수 분획을 수집하고, 결합시키고, 과량의 용리액을 감압 하에 회전식 증발에 의해 제거하고 생성물 48 (4.5 g, 55 %)을 제공하였다. LC/MS, 4.27 분 (ES+) m/z (상대 강도) 579.18 ([M + H]+., 100); 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ7.70 (s, 1H), 6.77 (s, 1H), 5.51 (d, J = 1.7 Hz, 1H), 4.77 - 4.59 (m, 1H), 3.89 (s, 3H), 2.92 - 2.65 (m, 1H), 2.55 (d, J = 14.8 Hz, 1H), 1.62 (d, J = 1.1 Hz, 3H), 1.40 - 1.18 (m, 3H), 1.11 (s, 9H), 1.10 (s, 9H), 0.90 (s, 9H), 0.11 (d, J = 2.3 Hz, 6H).
(g) (S)-(2-아미노-5-메톡시-4-((트리이소프로필실릴)옥시)페닐)(2-(((tert-부틸디메틸실릴)옥시)메틸)-4-메틸-2,3-디하이드로-1H-피롤-1-일)메탄온 ( 49 )
약 15℃에서, 아연 분말 (28 g, 430 mmol, 37 eq)를 에탄올 v/v (70 mL) 중 5% 포름산 중의 화합물 48 (6.7 g, 11.58 mmol)의 용액에 첨가하였다. 생성된 엑소덤 (exotherm)을 얼음 욕조를 사용하여, 상기 반응 혼합물의 온도가 30℃ 이하로 유지되도록 조절하였다. 30 분 후 상기 반응 혼합물을 셀라이트 패드를 통해 여과하였다. 여과물을 에틸 아세테이트로 희석하고, 유기 상을 물, 포화 수성 중탄산 나트륨 및 염수로 세척하였다. 유기 상을 황산 마그네슘에서 건조하고, 여과하고, 과량의 용매를 감압 하에 회전식 증발에 의해 제거하였다. 생성된 잔류물을 플래쉬 칼럼 크로마토그래피 (실리카 겔; 10 % 에틸 아세테이트, 헥산 중)에 적용하였다. 순수 분획을 수집하고, 결합시키고, 과량의 용매를 감압 하에 회전식 증발에 의해 제거하여 생성물 49 (5.1 g, 80 %)을 제공하였다. LC/MS, 4.23 분 (ES+) m/z (상대 강도) 550.21 ([M + H]+., 100); 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ7.28 (s, 1H), 6.67 (s, 1H), 6.19 (s, 1H), 4.64 - 4.53 (m, J = 4.1 Hz, 1H), 4.17 (s, 1H), 3.87 (s, 1H), 3.77 - 3.69 (m, 1H), 3.66 (s, 3H), 2.71 - 2.60 (m, 1H), 2.53 - 2.43 (m, 1H), 2.04 - 1.97 (m, J = 11.9 Hz, 1H), 1.62 (s, 3H), 1.26 - 1.13 (m, 3H), 1.08 - 0.99 (m, 18H), 0.82 (s, 9H), 0.03 - -0.03 (m, J = 6.2 Hz, 6H).
(ii) (11 S ,11a S )-알릴 11-(( tert -부틸디메틸실릴)옥시)-8-((5-요오도펜틸)옥시)-7-메톡시-2-메틸-5-옥소-11,11a-디하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-10(5H)-카르복실레이트
Figure pct00153
(a) (S)-알릴 (2-(2-(((tert-부틸디메틸실릴)옥시)메틸)-4-메틸-2,3-디하이드로-1H-피롤-1-카르보닐)-4-메톡시-5-((트리이소프로필실릴)옥시)페닐)카르바메이트 ( 50 )
-78℃ (아세톤/건조 얼음 욕조)에서, 알릴 클로로포르메이트 (0.30 mL, 3.00 mmol, 1.1 eq)를 건조 디클로로메탄 (20 mL) 중의 건조 피리딘 (0.48 mL, 6.00 mmol, 2.2 eq)의 존재 하에 아민 49 (1.5 g, 2.73 mmol)의 용액에 첨가하였다. 30 분 후, 욕조를 제거하고, 상기 반응 혼합물을 실온으로 가온시켰다. 상기 반응 혼합물을 디클로로메탄으로 희석하고, 포화 수성 황산 구리를 첨가하였다. 그후 유기 층을 포화 수성 중탄산 나트륨 및 염수로 순차적으로 세척하였다. 유기 상을 황산 마그네슘에서 건조하고, 여과하고, 과량의 용매를 감압 하에 회전식 증발에 의해 제거하여 생성물 50을 제공하고, 이것을 다음 반응에 직접 사용하였다. LC/MS, 4.45 분 (ES+) m/z (상대 강도) 632.91 ([M + H]+., 100)
(b) (S)-알릴 (2-(2-(히드록시메틸)-4-메틸-2,3-디하이드로-1H-피롤-1-카르보닐)-4-메톡시-5-((트리이소프로필실릴)옥시)페닐)카르바메이트 ( 51 )
미정제 50을 7:1:1:2 혼합물의 아세트산/메탄올/테트라하이드로푸란/물 (28:4:4:8 mL)에 용해시키고, 실온에서 교반하였다. 3 시간 후, LC/MS에 의해 출발 물질의 완전 소모가 관찰되었다. 상기 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석하고, 물 (2 x 500 mL), 포화 수성 중탄산 나트륨 (200 mL) 및 염수순차적으로 세척하였다. 유기 상을 황산 마그네슘에서 건조하고 여과하고, 과량의 에틸 아세테이트를 감압 하에 회전식 증발에 의해 제거하였다. 생성된 잔류물을 플래쉬 칼럼 크로마토그래피 (실리카 겔, 25% 에틸 아세테이트, 헥산 중)에 적용하였다. 순수 분획을 수집하고, 결합시키고, 과량의 용리액을 감압 하에 회전식 증발에 의해 제거하여 목적 생성물 51 (1 g, 71 %)을 제공하였다. LC/MS, 3.70 분 (ES+) m/z (상대 강도) 519.13 ([M + H]+., 95); 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ8.34 (s, 1H), 7.69 (s, 1H), 6.78 (s, 1H), 6.15 (s, 1H), 5.95 (ddt, J = 17.2, 10.5, 5.7 Hz, 1H), 5.33 (dq, J = 17.2, 1.5 Hz, 1H), 5.23 (ddd, J = 10.4, 2.6, 1.3 Hz, 1H), 4.73 (tt, J = 7.8, 4.8 Hz, 1H), 4.63 (dt, J = 5.7, 1.4 Hz, 2H), 4.54 (s, 1H), 3.89 - 3.70 (m, 5H), 2.87 (dd, J = 16.5, 10.5 Hz, 1H), 2.19 (dd, J = 16.8, 4.6 Hz, 1H), 1.70 (d, J = 1.3 Hz, 3H), 1.38 - 1.23 (m, 3H), 1.12 (s, 10H), 1.10 (s, 8H).
(c) (11S,11aS)-알릴 11-히드록시-7-메톡시-2-메틸-5-옥소-8-((트리이소프로필실릴)옥시)-11,11a-디하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-10(5H)-카르복실레이트 ( 52 )
-78℃ (건조 얼음 /아세톤 욕조)의 아르곤 대기 하에서 디메틸 술폭사이드 (0.35 mL, 4.83 mmol, 2.5 eq)를 건조 디클로로메탄 (10 mL) 중의 염화 옥살릴 (0.2 mL, 2.32 mmol, 1.2 eq)의 용액에 적가하였다. 10 분 후, 온도를 -78℃로 유지하면서, 건조 디클로로메탄 (8 mL) 중의 51 (1 g, 1.93 mmol)의 용액을 서서히 첨가하였다. 15 분 후 트리에틸아민 (1.35 mL, 4Å 분자 체에서 건조, 9.65 mmol, 5 eq)을 적가하고, 건조 얼음/아세톤 욕조를 제거하였다. 상기 반응 혼합물을 실온이 되도록 하고, 냉각 염산 (0.1 M), 포화 수성 중탄산 나트륨 및 염수로 추출하였다. 유기 상을 황산 마그네슘에서 건조하고, 여과하고, 과량의 디클로로메탄을 감압 하에 회전식 증발에 의해 제거하여 생성물 52 (658 mg, 66%)을 제공하였다. LC/MS, 3.52 min (ES+) m/z (상대적 강도) 517.14 ([M + H]+., 100); 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ7.20 (s, 1H), 6.75 - 6.63 (m, J = 8.8, 4.0 Hz, 2H), 5.89 - 5.64 (m, J = 9.6, 4.1 Hz, 2H), 5.23 - 5.03 (m, 2H), 4.68 - 4.38 (m, 2H), 3.84 (s, 3H), 3.83 - 3.77 (m, 1H), 3.40 (s, 1H), 3.05 - 2.83 (m, 1H), 2.59 (d, J = 17.1 Hz, 1H), 1.78 (d, J = 1.3 Hz, 3H), 1.33 - 1.16 (m, 3H), 1.09 (d, J = 2.2 Hz, 9H), 1.07 (d, J = 2.1 Hz, 9H).
(d) (11S,11aS)-알릴 11-((tert-부틸디메틸실릴)옥시)-7-메톡시-2-메틸-5-옥소-8-((트리이소프로필실릴)옥시)-11,11a-디하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-10(5H)-카르복실레이트 ( 53 )
0℃ 아르곤 하에서 Tert-부틸디메틸실릴트리플레이트 (0.70 mL, 3.00 mmol, 3 eq)를 건조 디클로로메탄 (40 mL) 중의 화합물 52 (520 mg, 1.00 mmol) 및 2,6-루티딘 (0.46 mL, 4.00 mmol, 4 eq)의 용액에 첨가하였다. 10 분 후, 냉각 욕조를 제거하고, 상기 반응 혼합물을 실온에서 1 시간 동안 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 물, 포화 수성 중탄산 나트륨 및 염수로 추출하였다. 유기 상을 황산 마그네슘에서 건조하고, 여과하고, 과량을 감압 하에 회전식 증발에 의해 제거하였다. 생성된 잔류물을 플래쉬 칼럼 크로마토그래피 (실리카 겔; 구배, 10 % 에틸 아세테이트, 헥산 중 내지 20 % 에틸 아세테이트 헥산 중)에 적용하였다. 순수 분획을 수집하고, 결합시키고, 과량의 용리액을 감압 하에 회전식 증발에 의해 제거하여 생성물 53 (540 mg, 85 %)을 제공하였다. LC/MS, 4.42 분 (ES+) m/z (상대 강도) 653.14 ([M + Na]+., 100); 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ7.20 (s, 1H), 6.71 - 6.64 (m, J = 5.5 Hz, 2H), 5.83 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 5.80 - 5.68 (m, J = 5.9 Hz, 1H), 5.14 - 5.06 (m, 2H), 4.58 (dd, J = 13.2, 5.2 Hz, 1H), 4.36 (dd, J = 13.3, 5.5 Hz, 1H), 3.84 (s, 3H), 3.71 (td, J = 10.1, 3.8 Hz, 1H), 2.91 (dd, J = 16.9, 10.3 Hz, 1H), 2.36 (d, J = 16.8 Hz, 1H), 1.75 (s, 3H), 1.31 - 1.16 (m, 3H), 1.12 - 1.01 (m, J = 7.4, 2.1 Hz, 18H), 0.89 - 0.81 (m, 9H), 0.25 (s, 3H), 0.19 (s, 3H).
(e) (11S,11aS)-알릴 11-((tert-부틸디메틸실릴)옥시)-8-히드록시-7-메톡시-2-메틸-5-옥소-11,11a-디하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-10(5H)-카르복실레이트 ( 54 )
리튬 아세테이트 (87 mg, 0.85 mmol)를 습윤한 디메틸포름아미드 (6 mL, 50:1 DMF/물) 중의 화합물 53 (540 mg, 0.85 mmol)의 용액에 첨가하였다. 4 시간 후, 상기 반응이 완료되었고, 상기 반응 혼합물을 에틸 아세테이트 (25 mL)로 희석하고, 수성 시트르산 용액 (pH ~ 3), 물 및 염수로 세척하였다. 유기 층을 황산 마그네슘에서 건조하고 여과하고, 과량의 에틸 아세테이트를 감압 하에 회전식 증발에 의해 제거하였다. 생성된 잔류물을 플래쉬 칼럼 크로마토그래피 (실리카 겔; 구배, 25% 내지 75% 에틸 아세테이트 헥산 중)에 적용하였다. 순수 분획을 수집하고, 결합시키고, 과량의 용리액을 감압 하에 회전식 증발에 의해 제거하여 생성물 54 (400 mg, 정량)을 제공하였다. LC/MS (3.33 분 (ES+) m/z (상대 강도) 475.26 ([M+H]+, 100).
(f) (11S,11aS)-알릴 11-((tert-부틸디메틸실릴)옥시)-8-((5-요오도펜틸)옥시)-7-메톡시-2-메틸-5-옥소-11,11a-디하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-10(5H)-카르복실레이트 ( 55 )
디요오도펜탄 (0.63 mL, 4.21 mmol, 5 eq) 및 탄산 칼륨 (116 mg, 0.84 mmol, 1 eq)을 아세톤 (4 mL, 분자 체에서 건조) 중의 페놀 54 (400 mg, 0.84 mmol)의 용액에 첨가하였다. 그후 상기 반응 혼합물을 60℃로 가온시키고, 6 시간 동안 교반하였다. 아세톤을 감압 하에 회전식 증발에 의해 제거하였다. 생성된 잔류물을 플래쉬 칼럼 크로마토그래피 (실리카 겔; 50/50, v/v, 헥산/에틸 아세테이트,)에 적용하였다. 순수 분획을 수집하고, 결합시키고, 과량의 용리액을 제거하여 90% 수율로 55를 제공하였다. LC/MS, 3.90 분 (ES+) m/z (상대 강도) 670.91 ([M]+, 100). 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ7.23 (s, 1H), 6.69 (s, 1H), 6.60 (s, 1H), 5.87 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 5.83 - 5.68 (m, J = 5.6 Hz, 1H), 5.15 - 5.01 (m, 2H), 4.67 - 4.58 (m, 1H), 4.45 - 4.35 (m, 1H), 4.04 - 3.93 (m, 2H), 3.91 (s, 3H), 3.73 (td, J = 10.0, 3.8 Hz, 1H), 3.25 - 3.14 (m, J = 8.5, 7.0 Hz, 2H), 2.92 (dd, J = 16.8, 10.3 Hz, 1H), 2.38 (d, J = 16.8 Hz, 1H), 1.95 - 1.81 (m, 4H), 1.77 (s, 3H), 1.64 - 1.49 (m, 2H), 0.88 (s, 9H), 0.25 (s, 3H), 0.23 (s, 3H).
(iii) (11 S ,11a S )-4-(2-(1-((1-(알릴옥시)-4-메틸-1,2-디옥소펜탄-3-일)아미노)-1-옥소프로판-2-일)히드라지닐)벤질 11-(( tert -부틸디메틸실릴)옥시)-8-히드록시-7-메톡시-2-메틸-5-옥소-11,11a-디하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-10(5H)-카르복실레이트 ( 70 )
Figure pct00154
(a) 알릴 3-(2-(2-(4-((((2-((S)-2-(((tert-부틸디메틸실릴)옥시)메틸)-4-메틸-2,3-디하이드로-1H-피롤-1-카르보닐)-4-메톡시-5-((트리이소프로필실릴)옥시)페닐)카르바모일)옥시)메틸)페닐)히드라지닐)프로판아미도)-4-메틸-2-옥소펜타노에이트 ( 56 )
5 ℃ (얼음 욕조)에서, 트리에틸아민 (2.23 mL, 18.04 mmol, 2.2 eq)를 건조 테트라하이드로푸란 (40 mL) 중의 아민 49 (4 g, 8.20 mmol) 및 트리포스젠 (778 mg, 2.95 mmol, 0.36 eq)의 용액에 첨가하고 교반하였다. 분취량을 주기적으로 반응 혼합물로부터 제거하고, 메탄올로 퀀칭하고, LC/MS 분석을 수행하여, 이소시아네이트 반응의 진행을 모니터링하였다. 이소시아네이트 형성이 완료되면, 건조 테트라하이드로푸란 (40 mL) 중의 Alloc-Val-Ala-PABOH (4.12 g, 12.30 mmol, 1.5 eq) 및 트리에틸아민 (1.52 mL, 12.30 mmol, 1.5 eq)의 용액을 신속하게, 새로 준비된 이소시아네이트에 주입함으로써 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 40 ℃에서 4 시간 동안 교반하였다. 과량의 용매를 감압 하에 회전식 증발에 의해 제거하였다. 생성된 잔류물을 플래쉬 칼럼 크로마토그래피 (실리카 겔; 구배, 1 % 메탄올 내지 5% 메탄올, 디클로로메탄 중)에 적용하였다. (EtOAc 및 헥산을 사용한 대안적 크로마토그래피 조건이 또한 성공적이었음). 순수 분획을 수집하고, 결합시키고, 과량의 용리액을 감압 하에 회전식 증발에 의해 제거하여 생성물 56 (3.9 g, 50%)을 제공하였다. LC/MS, 4.23 분 (ES+) m/z (상대 강도) 952.36 ([M + H]+., 100); 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ8.62 (br s, 1H), 8.46 (s, 1H), 7.77 (br s, 1H), 7.53 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.32 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 6.76 (s, 1H), 6.57 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 6.17 (s, 1H), 6.03 - 5.83 (m, 1H), 5.26 (dd, J = 33.8, 13.5 Hz, 3H), 5.10 (s, 2H), 4.70 - 4.60 (m, 2H), 4.58 (dd, J = 5.7, 1.3 Hz, 2H), 4.06 - 3.99 (m, 1H), 3.92 (s, 1H), 3.82 - 3.71 (m, 1H), 3.75 (s, 3H), 2.79 - 2.64 (m, 1H), 2.54 (d, J = 12.9 Hz, 1H), 2.16 (dq, J = 13.5, 6.7 Hz, 1H), 1.67 (s, 3H), 1.46 (d, J = 7.0 Hz, 3H), 1.35 - 1.24 (m, 3H), 1.12 (s, 9H), 1.10 (s, 9H), 0.97 (d, J = 6.8 Hz, 3H), 0.94 (d, J = 6.8 Hz, 3H), 0.87 (s, 9H), 0.07 - -0.02 (m, 6H).
(b) 알릴 3-(2-(2-(4-((((2-((S)-2-(히드록시메틸)-4-메틸-2,3-디하이드로-1H-피롤-1-카르보닐)-4-메톡시-5-((트리이소프로필실릴)옥시)페닐)카르바모일)옥시)메틸)페닐)히드라지닐)프로판아미도)-4-메틸-2-옥소펜타노에이트 ( 57 )
TBS 에테르 56 (1.32 g, 1.38 mmol)을 아세트산/메탄올/테트라하이드로푸란/물 (14:2:2:4 mL)의 7:1:1:2 혼합물에 용해시키고, 실온에서 교반하였다. 3 시간 후, LC/MS에 의해 출발 물질이 더이상 관찰되지 않았다. 상기 반응 혼합물을 에틸 아세테이트 (25 mL)로 희석하고, 물, 포화 수성 중탄산 나트륨 및 염수로 순차적으로 세척하였다. 유기 상을 황산 마그네슘에서 건조하고 여과하고, 과량의 에틸 아세테이트 감압 하에 회전식 증발에 의해 제거하였다. 생성된 잔류물을 플래쉬 칼럼 크로마토그래피 (실리카 겔, 2% 메탄올, 디클로로메탄 중)에 적용하였다. 순수 분획을 수집하고, 결합시키고, 과량의 용리액을 감압 하에 회전식 증발에 의해 제거하여 목적 생성물 57 (920 mg, 80%)을 제공하였다. LC/MS, 3.60 분 (ES+) m/z (상대 강도) 838.18 ([M+H]+., 100).1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ8.55 (s, 1H), 8.35 (s, 1H), 7.68 (s, 1H), 7.52 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.31 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 6.77 (s, 1H), 6.71 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 6.13 (s, 1H), 5.97 - 5.82 (m, J = 5.7 Hz, 1H), 5.41 - 5.15 (m, 3H), 5.10 (d, J = 3.5 Hz, 2H), 4.76 - 4.42 (m, 5H), 4.03 (t, J = 6.6 Hz, 1H), 3.77 (s, 5H), 2.84 (dd, J = 16.7, 10.4 Hz, 1H), 2.26 - 2.08 (m, 2H), 1.68 (s, 3H), 1.44 (d, J = 7.0 Hz, 3H), 1.30 (dt, J = 14.7, 7.4 Hz, 3H), 1.12 (s, 9H), 1.10 (s, 9H), 0.96 (d, J = 6.8 Hz, 3H), 0.93 (d, J = 6.8 Hz, 3H).
(c) (11S,11aS)-4-(2-(1-((1-(알릴옥시)-4-메틸-1,2-디옥소펜탄-3-일)아미노)-1-옥소프로판-2-일)히드라지닐)벤질 11-히드록시-7-메톡시-2-메틸-5-옥소-8-((트리이소프로필실릴)옥시)-11,11a-디하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-10(5H)-카르복실레이트 ( 58 )
-78℃ (건조 얼음 /아세톤 욕조) 아르곤 대기 하에서, 디메틸 술폭사이드 (0.2 mL, 2.75 mmol, 2.5 eq)를 건조 디클로로메탄 (7 mL) 중의 염화 옥살릴 (0.11 mL, 1.32 mmol, 1.2 eq)의 용액에 적가하였다. 10 분 후, 건조 디클로로메탄 (5 mL) 중 57 (920 mg, 1.10 mmol)의 용액을 서서히 첨가하고, 온도를 -78℃에서 유지하였다. 15 분 후 트리에틸아민 (0.77 mL, 4Å 분자 체에서 건조, 5.50 mmol, 5 eq)를 적가하고, 건조 얼음/아세톤 욕조를 제거하였다. 상기 반응 혼합물을 실온이 되도록 하고, 냉각 염산 (0.1 M), 포화 수성 중탄산 나트륨 및 염수로 추출하였다. 유기 상을 황산 마그네슘에서 건조하고, 여과하고, 과량의 디클로로메탄을 감압 하에 회전식 증발에 의해 제거하였다. 생성된 잔류물을 칼럼 플래쉬 크로마토그래피 (실리카 겔; 구배 2% 메탄올 내지 5 % 메탄올, 디클로로메탄 중)에 적용하였다. 순수 분획을 수집하고, 결합시키고, 감압 하의 회전식 증발에 의한 과량의 용리물의 제거에 의해 생성물 58 (550 mg, 60%)을 제공하였다. LC/MS, 3.43 분 (ES+) m/z (상대 강도) 836.01 ([M]+., 100). 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ8.39 (s, 1H), 7.52 - 7.40 (m, 2H), 7.21 - 7.08 (m, J = 11.5 Hz, 2H), 6.67 (s, 1H), 6.60 - 6.47 (m, J = 7.4 Hz, 1H), 5.97 - 5.83 (m, 1H), 5.79 - 5.66 (m, 1H), 5.38 - 4.90 (m, 6H), 4.68 - 4.52 (m, J = 18.4, 5.5 Hz, 4H), 4.04 - 3.94 (m, J = 6.5 Hz, 1H), 3.87 - 3.76 (m, 5H), 3.00 - 2.88 (m, 1H), 2.66 - 2.49 (m, 2H), 2.21 - 2.08 (m, 2H), 1.76 (s, 3H), 1.45 (d, J = 7.0 Hz, 3H), 1.09 - 0.98 (m, J = 8.9 Hz, 18H), 0.96 (d, J = 6.7 Hz, 3H), 0.93 (d, J = 6.9 Hz, 3H).
(d) (11S,11aS)-4-(2-(1-((1-(알릴옥시)-4-메틸-1,2-디옥소펜탄-3-일)아미노)-1-옥소프로판-2-일)히드라지닐)벤질 11-((tert-부틸디메틸실릴)옥시)-7-메톡시-2-메틸-5-옥소-8-((트리이소프로필실릴)옥시)-11,11a-디하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-10(5H)-카르복실레이트 ( 59 )
0℃ 아르곤 하에서 Tert-부틸디메틸실릴트리플레이트 (0.38 mL, 1.62 mmol, 3 eq)를 건조 디클로로메탄 (5 mL) 중의 화합물 58 (450 mg, 0.54 mmol) 및 2,6-루티딘 (0.25 mL, 2.16 mmol, 4 eq)의 용액에 첨가하였다. 10 분 후, 냉각 욕조를 제거하고, 상기 반응 혼합물을 실온에서 1 시간 동안 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 물, 포화 수성 중탄산 나트륨 및 염수로 추출하였다. 유기 상을 황산 마그네슘에서 건조하고, 여과하고, 과량의 용매를 감압 하에 회전식 증발에 의해 제거하였다. 생성된 잔류물을 칼럼 플래쉬 크로마토그래피 (실리카 겔; 50/50 v/v 헥산/에틸 아세테이트)에 적용하였다. 순수 분획을 수집하고, 결합시키고, 과량의 용리액을 감압 하에 회전식 증발에 의해 제거하여 생성물 59 (334 mg, 65%)을 제공하였다. LC/MS, 4.18 분 (ES+) m/z (상대 강도) 950.50 ([M]+., 100). 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ8.53 (s, 1H), 8.02 (s, 1H), 7.44 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 7.21 (s, 1H), 7.08 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 6.72 - 6.61 (m, J = 8.9 Hz, 2H), 6.16 (s, 1H), 5.97 - 5.79 (m, J = 24.4, 7.5 Hz, 2H), 5.41 - 5.08 (m, 5H), 4.86 (d, J = 12.5 Hz, 1H), 4.69 - 4.60 (m, 1H), 4.57 (s, 1H), 4.03 (t, J = 6.7 Hz, 1H), 3.87 (s, 3H), 3.74 (td, J = 9.6, 3.6 Hz, 1H), 2.43 - 2.09 (m, J = 34.8, 19.4, 11.7 Hz, 3H), 1.76 (s, 3H), 1.43 (d, J = 6.9 Hz, 3H), 1.30 - 1.21 (m, 3H), 0.97 (d, J = 6.7 Hz, 3H), 0.92 (t, J = 8.4 Hz, 3H), 0.84 (s, 9H), 0.23 (s, 3H), 0.12 (s, 3H).
(e) (11S,11aS)-4-(2-(1-((1-(알릴옥시)-4-메틸-1,2-디옥소펜탄-3-일)아미노)-1-옥소프로판-2-일)히드라지닐)벤질 11-((tert-부틸디메틸실릴)옥시)-8-히드록시-7-메톡시-2-메틸-5-옥소-11,11a-디하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-10(5H)-카르복실레이트 ( 60 )
리튬 아세테이트 (50 mg, 0.49 mmol)를 습윤한 디메틸포름아미드 (4 mL, 50:1 DMF/물) 중의 화합물 59 (470 mg, 0.49 mmol)의 용액에 첨가하였다. 4 시간 후, 상기 반응이 완료되었고, 상기 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석하고, 시트르산 (pH ~ 3), 물 및 염수로 세척하였다. 유기 층을 황산 마그네슘에서 건조하고 여과하고, 과량의 에틸 아세테이트를 감압 하에 회전식 증발에 의해 제거하였다. 생성된 잔류물을 칼럼 플래쉬 크로마토그래피 (실리카 겔; 구배, 50/50 내지 25/75 v/v 헥산/에틸 아세테이트)에 적용하였다. 순수 분획을 수집하고, 결합시키고, 과량의 용리액을 감압 하에 회전식 증발에 의해 제거하여 생성물 60 (400 mg, 정량)을 제공하였다. LC/MS, 3.32 분 (ES+) m/z (상대 강도) 794.18 ([M+H]+., 100). 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ8.53 (s, 1H), 8.02 (s, 1H), 7.44 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 7.21 (s, 1H), 7.08 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 6.72 - 6.61 (m, J = 8.9 Hz, 2H), 6.16 (s, 1H), 5.97 - 5.79 (m, J = 24.4, 7.5 Hz, 2H), 5.41 - 5.08 (m, 5H), 4.86 (d, J = 12.5 Hz, 1H), 4.69 - 4.60 (m, 1H), 4.57 (s, 1H), 4.03 (t, J = 6.7 Hz, 1H), 3.87 (s, 3H), 3.74 (td, J = 9.6, 3.6 Hz, 1H), 2.43 - 2.09 (m, J = 34.8, 19.4, 11.7 Hz, 3H), 1.76 (s, 3H), 1.43 (d, J = 6.9 Hz, 3H), 1.30 - 1.21 (m, 3H), 0.97 (d, J = 6.7 Hz, 3H), 0.92 (t, J = 8.4 Hz, 3H), 0.84 (s, 9H), 0.23 (s, 3H), 0.12 (s, 3H).
(iv) (11 S ,11a S )-4-((2 S ,5 S )-37-(2,5-디옥소-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)-5-이소프로필-2-메틸-4,7,35-트리옥소-10,13,16,19,22,25,28,31-옥타옥사-3,6,34-트리아자헵타트리아콘탄아미도)벤질 11-히드록시-7-메톡시-8-((5-((( S )-7-메톡시-2-메틸-5-옥소-5,11a-디하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-8-일)옥시)펜틸)옥시)-2-메틸-5-옥소-11,11a-디하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-10(5H)-카르복실레이트 ( 64 )
Figure pct00155
(a) (11S)-알릴 8-((5-(((11S)-10-(((4-(2-(1-((1-(알릴옥시)-4-메틸-1,2-디옥소펜탄-3-일)아미노)-1-옥소프로판-2-일)히드라지닐)벤질)옥시)카르보닐)-11-((tert-부틸디메틸실릴)옥시)-7-메톡시-2-메틸-5-옥소-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-8-일)옥시)펜틸)옥시)-11-((tert-부틸디메틸실릴)옥시)-7-메톡시-2-메틸-5-옥소-11,11a-디하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-10(5H)-카르복실레이트 ( 61 )
탄산 칼륨 (70 mg, 0.504 mmol, 1 eq)를 건조 아세톤 (25 mL) 중의 55 (370 mg, 0.552 mmol, 1.2 eq) 및 페놀 60 (400 mg, 0.504 mmol)의 용액에 첨가하였다. 상기 반응물을 8 시간 동안 70℃에서 교반하였다. LC/MS는 모든 출발 물질이 소모되지 않았다는 것을 나타내었고, 따라서 상기 반응물을 실온에서 하룻밤 동안 교반하고, 다음 날 추가로 2 시간 동안 교반하였다. 아세톤을 감압 하에 회전식 증발에 의해 제거하였다. 생성된 잔류물을 플래쉬 칼럼 크로마토그래피 (실리카 겔; 80% 에틸 아세테이트 헥산 중 내지 100% 에틸 아세테이트)에 적용하였다. 순수 분획을 수집하고, 결합시키고, 과량의 용리액을 감압 하에 회전식 증발에 의해 제거하여 생성물 61 (385 mg, 57%)을 제공하였다. LC/MS, 4.07 분 (ES+) m/z (상대 강도) 1336.55 ([M+H]+., 50).
(b) (11S)-알릴 8-((5-(((11S)-10-(((4-(2-(1-((1-(알릴옥시)-4-메틸-1,2-디옥소펜탄-3-일)아미노)-1-옥소프로판-2-일)히드라지닐)벤질)옥시)카르보닐)-11-히드록시-7-메톡시-2-메틸-5-옥소-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-8-일)옥시)펜틸)옥시)-11-히드록시-7-메톡시-2-메틸-5-옥소-11,11a-디하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-10(5H)-카르복실레이트 ( 62 )
테트라-n-부틸암모늄 플루오라이드 (1M, 0.34 mL, 0.34 mmol, 2 eq)를 건조 테트라하이드로푸란 (3 mL) 중의 61 (230 mg, 0.172 mmol)의 용액에 첨가하였다. 10 분 후, 출발 물질이 완전히 소모되었다. 상기 반응 혼합물을 에틸 아세테이트 (30 mL)로 희석하고, 물 및 염수로 순차적으로 세척하였다. 유기 상을 황산 마그네슘에서 건조하고 여과하고, 과량의 에틸 아세테이트 감압 하에 회전식 증발에 의해 제거하였다. 생성된 잔류물 62를 미정제 혼합물로서 다음 반응을 위해 사용하였다. LC/MS, 2.87 분 (ES+) m/z (상대 강도) 1108.11 ([M+H]+., 100).
(c) (11S)-4-(2-(1-((1-아미노-3-메틸-1-옥소부탄-2-일)아미노)-1-옥소프로판-2-일)히드라지닐)벤질 11-히드록시-7-메톡시-8-((5-((7-메톡시-2-메틸-5-옥소-5,11a-디하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-8-일)옥시)펜틸)옥시)-2-메틸-5-옥소-11,11a-디하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-10(5H)-카르복실레이트 (63)
테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐(0) (12 mg, 0.01 mmol, 0.06 eq)를 건조 디클로로메탄 (10 mL) 중의 미정제 62 (0.172 mmol) 및 피롤리딘 (36 μL, 0.43 mmol, 2.5 eq)의 용액에 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 20 분 동안 교반하고, 디클로로메탄으로 희석하고, 포화 수성 암모늄 클로라이드 및 염수로 순차적으로 세척하였다. 유기 상을 황산 마그네슘에서 건조하고 여과하고, 과량의 디클로로메탄을 감압 하에 회전식 증발에 의해 제거하였다. 생성된 잔류물 63을 미정제 혼합물로서 다음 반응을 위해 사용하였다. LC/MS, 2.38 분 (ES+) m/z (상대 강도) 922.16 ([M+H]+., 40).
(d) (11S,11aS)-4-((2S,5S)-37-(2,5-디옥소-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)-5-이소프로필-2-메틸-4,7,35-트리옥소-10,13,16,19,22,25,28,31-옥타옥사-3,6,34-트리아자헵타트리아콘탄아미도)벤질 11-히드록시-7-메톡시-8-((5-(((S)-7-메톡시-2-메틸-5-옥소-5,11a-디하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-8-일)옥시)펜틸)옥시)-2-메틸-5-옥소-11,11a-디하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-10(5H)-카르복실레이트 ( 64 )
1-에틸-3-(3'-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 (EDCI, 33 mg, 0.172 mmol)를 건조 디클로로메탄 (10 mL) 중의 미정제 63 (0.172 mmol) 및 Mal-(PEG)8-산 (100 mg, 0.172 mmol)의 용액에 첨가하였다. 상기 반응물을 2 시간 동안 교반하였고, LC/MS에 의해 출발 물질의 존재가 더 이상 관찰되지 않았다. 상기 반응물을 디클로로메탄로 희석하고, 물 및 염수로 순차적으로 세척하였다. 유기 상을 황산 마그네슘에서 건조하고 여과하고, 과량의 디클로로메탄을 감압 하에 회전식 증발에 의해 제거하였다. 생성된 잔류물을 플래쉬 칼럼 크로마토그래피 (실리카 겔; 100% 클로로포름 내지 10% 메탄올, 클로로포름 중)에 적용하였다. 순수 분획을 수집하고, 결합시키고, 과량의 용리액을 감압 하에 회전식 증발에 의해 제거하고 64 (E) (60 mg, 25% over 3 단계)를 제공하였다.
실시예 8
Figure pct00156
화합물 65는 WO 2011/130598의 화합물 79이다.
(11S)-4-(1-요오도-20-이소프로필-23-메틸-2,18,21-트리옥소-6,9,12,15-테트라옥사-3,19,22-트리아자테트라코산아미도)벤질 11-히드록시-7-메톡시-8-(3-((7-메톡시-5-옥소-2-((E)-프로프-1-엔-1-일)-5,11a-디하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-8-일)옥시)프로폭시)-5-옥소-2-((E)-프로프-1-엔-1-일)-11,11a-디하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-10(5H)-카르복실레이트 ( 66 )
N,N'-디이소프로필카르보디이미드 (DIC, 4.71 μL, 0.0304 mmol)를 건조 디클로로메탄 (0.8 mL) 중의 아민 65 (0.0276 mmol) 및 요오도-(PEG)4-산 (13.1 mg, 0.0304 mmol)의 용액에 첨가하였다. 상기 반응물을 3 시간 동안 교반하였고, LC/MS에 의해 출발 물질의 존재가 더이상 관찰되지 않았다. 상기 반응 혼합물을 박막 크로마토그래피 (TLC) 플레이트에 직접 부하하고, prep-TLC (10% 메탄올, 클로로포름 중)에 의해 정제하였다. 순수 밴드를 TLC 플레이트로부터 스크랩하고, 10% 메탄올, 클로로포름 중에 취하고, 여과하고, 과량의 용리물 감압 하에 회전식 증발에 의해 제거하여, 66 (D) (20.9 mg, 56%)를 제공하였다. LC/MS, 방법 2, 3.08 분 (ES+) m/z (상대 강도) 1361.16 ([M+H]+, 100).
실시예 9의 일반적 실험 방법
LCMS 데이타를 전기분무 이온화와 함께, Agilent 6110 사극자 MS가 구비된 Agilent 1200 시리즈 LC/MS를 사용하여 수득하였다.
이동 상 A - 0.1% 아세트산, 물 중. 이동 상 B - 0.1%, 아세토니트릴 중. 유속 1.00ml/min. 구배, 3 분 이상 5% B에서 95% B로 증가, 1 분 동안 95% B에서 유지 및 6 초 이상 5% B로 복귀. 총 구동 시간은 5 분이었다. 칼럼: Phenomenex Gemini-NX 3μm C18, 30 x 2.00mm. 254nm에서 UV 검출을 기반한 크로마토그램. 질량 스펙트럼은 양성 모드에서 MS를 사용하여 달성하였다. 양성자 NMR 화학적 이동 값은 Bruker AV400을 사용하여 400 MHz에서 델타 스케일 상 에서 측정하였다. 하기 약어가 사용되었다: s, 단일선; d, 이중선; t, 삼중선; q, 사중선; m, 다중선; br, 광범위. 커플링 상수는 Hz로 기록하였다. 달리 명시되지 않는 한, 칼럼 크로마토그래피 (플래쉬 과정)은 Merck Kieselgel 실리카 (Art. 9385)에서 수행하였다. 질량 분광분석 (MS) 데이타는 Waters 2795 HPLC 분리 모듈에 연결된 Waters Micromass LCT 장치를 사용하여 수집하였다. 박막 크로마토그래피 (TLC)는 실리카 겔 알루미늄 플레이트 (Merck 60, F254)에서 수행하였다. 기타 모든 화학 물질 및 용매는 Sigma-Aldrich 또는 Fisher Scientific에서 구입하였고, 추가 정제 과정 없이 공급된 대로 사용하였다.
광회전도는 ADP 220 편광계 (Bellingham Stanley Ltd.)에서 측정하였고, 농도 (c)는 g/100mL로 제공하였다. 융점은 디지털 융점 측정기 (Electrothermal)를 사용하여 측정하였다. IR 스펙트럼은 퍼킨-엘머 스펙트럼 (Perkin-Elmer Spectrum) 1000 FT IR 분광계 상에 기록하였다. 1H 및 13C NMR 스펙트럼은 각각 400 및 100 MHz에서 브루커 어밴스 (Bruker Avance) NMR 분광계를 사용하여 300 K에서 획득하였다. 화학적 이동은 TMS (δ = 0.0 ppm)에 대비하여 보고하며, 시그날은 헤르츠 (Hz)로 제공된 커플링 상수와 함께 s (단일선), d (이중선), t (삼중선), dt (이중 삼중선), dd (이중선의 이중선), ddd (이중선의 이중 이중선) 또는 m (다중선)으로 지정된다. 질량 분광학 (MS) 데이터는 워터스 (Waters) 2996 PDA를 갖는 워터스 (Waters) 2695 HPLC에 커플링된 워터스 마이크로매스 (Waters Micromass) ZQ 기구를 사용하여 수집하였다. 사용된 워터스 마이크로매스 ZQ 파라메터는 다음과 같았다: 모세관 (kV), 3.38; 콘 (Cone) (V), 35; 추출기 (Extractor) (V), 3.0; 공급 온도 (℃), 100; 탈용매화 (Desolvation) 온도 (℃), 200; 콘 유속 (L/h), 50; 탈용매화 유속 (L/h), 250. 고-분할 (High-resolution) 질량 분광학 (HRMS) 데이터는 샘플을 기구 내로 도입시키기 위한 금속-코팅된 보로실리케이트 유리 팁 (glass tip)을 사용하여 포지티브 W-모드로 워터스 마이크로매스 QTOF 글로발 (Waters Micromass QTOF Global) 상에 기록하였다.
박층 크로마토그래피 (TLC)는 실리카겔 알루미늄 플레이트 (Merck 60, F254) 상에서 수행되었으며, 섬광 (플래쉬) 크로마토그래피는 실리카겔 (Merck 60, 230-400 메쉬 ASTM)을 이용하였다. HOBt (NovaBiochem) 및 고체-지지된 시약 (아르곤aut)을 제외하고, 모든 다른 화학물질 및 용매는 Sigma-Aldrich로부터 구입하였으며, 더 정제하지 않고 공급된 채로 사용하였다. 무수 용매는 적절한 건조제의 존재 하에 건조 질소 대기 하에서 증류함으로써 제조하였으며, 4Å 분자체 또는 나트륨 와이어 상에 저장하였다. 석유 에테르는 40-60℃에서 비등하는 분획을 나타낸다. 일반적인 LC/MS 조건: HPLC (Waters Alliance 2695)는 물 (A) (포름산 0.1%) 및 아세토니트릴 (B) (포름산 0.1%)의 이동상을 사용하여 주행시켰다. 구배: 초기 조성은 1.0 분에 걸쳐서 5% B, 다음에는 3 분 이내에 5% B에서 95% B. 조성은 0.5 분 동안 95% B에서 유지시켰으며, 그 다음에는 0.3 분 이내에 5% B로 복귀시켰다. 총 구배 주행시간은 5 분에 해당한다. 유속은 3.0 ㎖/분이며, 400 ㎕를 제로 사적 티피스 (zero dead volume tee piece)를 경유하여 분할시켜 이것을 질량 분광계 내로 통과시킨다. 파장 검출 범위: 220 내지 400 ㎚. 기능 타입 (작동 유형): 다이오드 어레이 (535 스캔). 칼럼: 페노메넥스 (Phenomenex®) 오닉스 모놀리틱 (Onyx Monolithic) C18 50×4.60 ㎜
실시예 9
(i) 주요 중간체
(a)
Figure pct00157
(a-i) (S)-2-(알릴옥시카르보닐아미노)-3-메틸부탄산 ( 12 )
알릴 클로로포르메이트 (36.2 ml, 340.59 mmol, 1.2 eq)를 물 (650 mL) 및 THF (650 mL) 중의 L-발린 (I1)(33.25 g, 283.82 mmol, 1.0 eq) 및 탄산 칼륨 (59.27 g, 425.74 mmol, 1.5 eq)의 교반 용액에 적가하였다. 상기 반응 혼합물을 실온에서 18 시간 동안 교반한 다음, 용매를 감압 하에 농축하고, 잔류 용액 디에틸 에테르 (3 x 100 mL)로 추출하였다. 수성 부분을 농축 HCl에 의해 pH 2로 산성화시키고, DCM (3 x 100 mL)로 추출하였다. 결합된 유기물을 염수로 세척하고, MgSO4로 건조하고, 여과하고, 감압 하에 농축시켜서, 무색 오일 (57.1 g, 약 100% 수율)로서 생성물을 제공하였다. LC/MS (1.966 분 (ES+)), m/z: 202.1 [M+H]+. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ12.57 (br s, 1H), 7.43 (d, 1H, J = 8.6 Hz), 5.96 - 5.86 (m, 1H), 5.30 (ddd, 1H, J = 17.2, 3.4, 1.7 Hz), 5.18 (ddd, 1H, J = 10.4, 2.9, 1.6 Hz), 4.48 (dt, 2H, J = 5.3, 1.5 Hz), 3.85 (dd, 1H, J = 8.6, 6.0 Hz), 2.03 (oct, 1H, J = 6.6 Hz), 0.89 (d, 3H, J = 6.4 Hz), 0.87 (d, 3H, J = 6.5 Hz).
(a-ii) (S)-2,5-디옥소피롤리딘-1-일 2-(알릴옥시카르보닐아미노)-3-메틸부타노에이트 (13)
건조 THF (800 mL) 중의 보호 산 12 (60.6 g, 301.16 mmol, 1.0 eq) 및 N-히드록시숙신이미드 (34.66 g, 301.16 mmol, 1.0 eq)의 교반 용액에 디시클로헥실카르보디이미드 (62.14 g, 301.16 mmol, 1 eq)를 첨가하였다. 상기 반응물을 18 시간 동안 실온에서 교반하였다. 이어서, 상기 반응 혼합물을 여과하고, 고체를 THF로 세척하고 결합된 여과물을 감압 하에 농축시켰다. 잔류물을 DCM에 재용해시키고, 0℃에서 30 분 동안 방치하였다. 상기 현탁액을 여과하고, 냉각 DCM로 세척하였다. 여과물을 감압 하에 농축시켜, 점성 무색 오일 (84.7 g, 약 100% 수율)로서 생성물을 제공하고, 이것을 추가의 정제 과정 없이 다음 단계에서 사용하였다. LC/MS (2.194 분 (ES+)), m/z: 321.0 [M+Na]+. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ8.0 (d, 1H, J = 8.3 Hz), 5.97 - 5.87 (m, 1H), 5.30 (ddd, 1H, J = 17.2, 3.0, 1.7 Hz), 5.19 (ddd, 1H, J = 10.4, 2.7, 1.4 Hz), 4.52 (dt, 2H, J = 5.3, 1.4 Hz), 4.32 (dd, 1H, J = 8.3, 6.6 Hz), 2.81 (m, 4H), 2.18 (oct, 1H, J = 6.7 Hz), 1.00 (d, 6H, J = 6.8 Hz),
(a-iii) (S)-2-((S)-2-(알릴옥시카르보닐아미노)-3-메틸부탄아미도)프로판산 (14)
THF (50 mL) 중의 숙신이미드 에스테르 13(12.99 g, 43.55 mmol, 1.0 eq)의 용액을 THF (100 mL) 및 H2O (100 mL) 중의 L-알라닌 (4.07 g, 45.73 mmol, 1.05 eq) 및 NaHCO3 (4.02 g, 47.90 mmol, 1.1 eq)의 용액에 첨가하였다. 상기 혼합물을 실온에서 72 시간 동안 교반하고, THF를 감압 하에 제거하였다. pH를 시트르산에 의해 3-4로 조정하였고, 백색 검이 침전되었다. 에틸 아세테이트 (6 x 150 mL)에 의한 추출 후, 결합된 유기물을 H2O (200 mL)로 세척하고, MgSO4로 건조하고, 여과하고, 감압 하에 농축시켰다. 디에틸 에테르로 분쇄하여, 백색 분말로서 생성물을 제공하고, 여과에 의해 수집하고, 디에틸 에테르 (5.78 g, 49%)로 세척하였다.
LC/MS (1.925 분 (ES+)), m/z: 273.1 [M+H]+. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ12.47 (br s, 1H), 8.17 (d, 1H, J = 6.8 Hz), 7.16 (d, 1H, J = 9.0 Hz), 5.95 - 5.85 (m, 1H), 5.29 (dd, 1H, J = 17.2, 1.7 Hz), 5.17 (dd, 1H, J = 10.4, 1.5 Hz), 4.46 (m, 2H), 4.18 (quin, 1H, J = 7.2 Hz), 3.87 (dd, 1H, J = 9.0, 7.1 Hz), 1.95 (oct, 1H, J = 6.8 Hz), 1.26 (d, 3H, J = 7.3 Hz), 0.88 (d, 3H, J = 6.8 Hz), 0.83 (d, 3H, J = 6.8 Hz).
(a-iv) 알릴 (S)-1-((S)-1-(4-(히드록시메틸)페닐아미노)-1-옥소프로판-2-일아미노)-3-메틸-1-옥소부탄-2-일카르바메이트 (15)
EEDQ (5.51 g, 22.29 mmol, 1.05 eq)를 건조 THF (100 mL) 중의 p-아미노벤질 알코올 (2.74 g, 22.29 mmol, 1.05 eq) 및 산 14 (5.78 g, 21.23 mmol, 1 eq)의 용액에 첨가하고 실온에서 72 시간 동안 교반하였다. 이어서, 상기 반응 혼합물을 감압 하에 농축시키고 생성된 갈색 고체를 디에틸 에테르로 분말화하고 여과하고, 이어서 과량의 디에틸 에테르로 세척하여, 회색 고체 (7.1 g, 88 %)로서 생성물을 제공하였다. LC/MS (1.980 분 (ES+)), m/z: 378.0 [M+H]+. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ9.89 (br s, 1H), 8.13 (d, 1H, J = 7.0 Hz), 7.52 (d, 2H, J = 8.5 Hz), 7.26 (m, 1H), 7.23 (d, 2H, J = 8.5 Hz), 5.91 (m, 1H), 5.30 (m, 1H), 5.17 (m, 1H), 4.46 (m, 2H), 5.09 (t, 1H, J = 5.6 Hz), 4.48 (m, 2H), 4.42 (m, 3H), 3.89 (dd, 1H, J = 8.6, 6.8 Hz), 1.97 (m, 1H), 1.30 (d, 3H, J = 7.1 Hz), 0.88 (d, 3H, J = 6.8 Hz), 0.83 (d, 3H, J = 6.7 Hz).
(b)
Figure pct00158
1-요오도-2-옥소-6,9,12,15-테트라옥사-3-아자옥타데카-18-노 산 ( 17 )
건조 DCM (1 mL) 중의 요오도아세트산 무수물 (0.250 g, 0.706 mmol, 1.1 eq)의 용액을 DCM (1 mL) 중의 아미노-PEG(4)-산 16 (0.170 g, 0.642 mmol, 1.0 eq)에 첨가하였다. 상기 혼합물을 어두운 곳에서 실온에서 하룻밤 동안 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 0.1 M HCl, 물로 세척하고, MgSO4로 건조하고, 여과하고, 감압 하에 농축시켰다. 잔류물을 플래쉬 크로마토그래피 (실리카 겔, 3% MeOH 및 0.1% 포름산, 클로로포름 중 내지 10% MeOH 및 0.1% 포름산, 클로로포름 중)에 의해 정제하여, 오렌지색 오일 (0.118 g, 42%)로서 생성물을 제공하였다. LC/MS (1.623 분 (ES+)), m/z: 433..98 [M+H]+. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ8.069 (s, 1H), 7.22 (br s, 1H), 3.79 (t, 2H, J = 5.8 Hz), 3.74 (s, 2H), 3.72 - 3.58 (m, 14H), 3.50 - 3.46 (m, 2H), 2.62 (t, 2H, J = 5.8 Hz).
(ii) (11 S ,11a S )-알릴 11-( tert -부틸디메틸실릴옥시)-8-(3-요오도프로폭시)-7-메톡시-5-옥소-2-((E)-프로프-1-엔일)-11,11a-디하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-10(5H)-카르복실레이트 ( 74 )
Figure pct00159
(a) (S)-5-((tert-부틸디메틸실릴옥시)메틸)-1-(5-메톡시-2-니트로-4-(트리이소프로필실릴옥시)벤조일)-4,5-디하이드로-1H-피롤-3-일 트리플루오로메탄설포네이트 ( 47 )
-50℃에서, 트리플릭 무수물 (28.4 g, 100.0 mmol, 3.0 eq)를 2,6-루티딘 (14.4 g, 130.0 mmol, 4.0 eq)을 포함하는 DCM (550 mL) 중의 케톤 46 (19.5 g, 30.0 mmol, 1.0 eq)의 활발한 교반 용액에 25 분 이상 적가하였다. 상기 반응 혼합물을 1.5 시간 동안 교반하였고, 이때 LC/MS은 반응이 완료되었음을 나타내었다. 유기 상을 물 (100 mL), 포화 중탄산 나트륨 (150 mL), 염수 (50 mL)로 연속적으로 세척하고 유기 상을 MgSO4로 건조하고, 여과하고, 감압 하에 농축시켰다. 잔류물을 플래쉬 크로마토그래피 (실리카 겔, 90/10 v/v n-헥산/EtOAc)에 의해 정제하여, 연한 노란색 오일 (19.5 g, 82 %)로서 생성물을 제공하였다. LC/MS (4.391 분 (ES+)), m/z: 713.25 [M+H]+. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ7.68 (s, 1H), 6.72 (s, 1H), 6.02 (t, 1H, J = 1.9 Hz), 4.75 (m, 1H), 4.05 (m, 2H), 3.87 (s, 3H), 3.15 (ddd, 1H, J = 16.2, 10.3, 2.3 Hz), 2.96 (ddd, 1H, J = 16.2, 4.0, 1.6 Hz), 1.28 - 1.21 (m, 3H), 1.07 (d, 18H, J = 7.2 Hz), 0.88 (s, 9H), 0.09 (s, 3H), 0.08 (s, 3H).
(b) (S,E)-(2-((tert-부틸디메틸실릴옥시)메틸)-4-(프로프-1-엔일)-2,3-디하이드로-1H-피롤-1-일)(5-메톡시-2-니트로-4-(트리이소프로필실릴옥시)페닐)메탄온 (67)
질소 대기 하에 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐(0) (0.41 g, 0.35 mmol, 0.03 eq)를 건조 디옥산 (60 mL) 중의 트리플레이트 47 (8.4 g, 11.8 mmol, 1.0 eq), E-1-프로펜-1-일보론 산 (1.42 g, 16.5 mmol, 1.4 eq) 및 포타슘 포스페이트 (5.0 g, 23.6 mmol, 2.0 eq)의 혼합물에 첨가하였다. 상기 혼합물을 25℃에서 120 분 동안 교반하였고, 이때 LC/MS은 반응이 완료되었음을 나타내었다. 에틸 아세테이트 (120 mL) 및 물 (120 mL)을 첨가하고, 유기 상을 제거하고, 염수 (20 mL)로 세척하고, MgSO4로 건조하고, 여과하고, 감압 하에 농축시켰다. 잔류물을 플래쉬 크로마토그래피 (실리카 겔, 95/5 v/v n-헥산/EtOAc 내지 90/10 v/v n-헥산/EtOAc)에 의해 정제하여, 노란색 거품 (4.96 g, 70 %)으로서 생성물을 제공하였다. LC/MS (4.477 분 (ES+)), m/z: 605.0 [M+H]+. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ7.67 (s, 1H), 6.74 (s, 1H), 5.93 (d, 1H, J = 15.4 Hz), 5.67 (s, 1H), 4.65 (m, 1H), 4.04 (m, 2H), 3.86 (s, 3H), 2.85 (m, 1H), 2.71 (m, 1H), 1.72 (dd, 3H, J = 6.8, 1.0 Hz), 1.30 - 1.22 (m, 3H), 1.07 (d, 18H, J = 7.2 Hz), 0.87 (s, 9H), 0.08 (s, 3H), 0.07 (s, 3H).
(c) (S,E)-(2-아미노-5-메톡시-4-(트리이소프로필실릴옥시)페닐)(2-((tert-부틸디메틸실릴옥시)메틸)-4-(프로프-1-엔일)-2,3-디하이드로-1H-피롤-1-일)메탄온 (68)
온도를 25-30℃에서 유지하기 위해 얼음 욕조를 사용하여, 아연 더스트 (22.0 g, 0.33 mol, 37 eq)를 5% v/v 포름산 / 에탄올 (55 mL) 중의 프로펜일 중간체 67 (5.5 g, 9.1 mmol, 1.0 eq)의 용액에 20 분 이상 동안 부분으로 첨가하였다. 30 분 후, 상기 반응 혼합물을 셀라이트의 짧은 베드를 통하여 여과하였다. 셀라이트®를 에틸 아세테이트 (65 mL)로 세척하고 결합된 유기물을 물 (35 mL), 포화 중탄산 나트륨 (35 mL) 및 염수 (10 mL)로 연속적으로 세척하였다. 유기 상을 MgSO4로 건조하고, 여과하고, 감압 하에 농축시켰다. 잔류물을 플래쉬 크로마토그래피 (실리카 겔, 90/10 v/v n-헥산/EtOAc)에 의해 정제하여, 연한 노란색 오일 (3.6 g, 69.0 %)로서 생성물을 제공하였다. LC/MS (4.439 분 (ES+)), m/z: 575.2 [M+H]+. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ6.75 (m, 1H), 6.40 (br s, 1H), 6.28 (m, 1H), 6.11 (d, 1H, J = 15.4 Hz), 5.53 (m, 1H), 4.67 (m, 1H), 4.36 (m, 2H), 3.93 (br s, 1H), 3.84 (br s, 1H), 3.73 (s, 3H), 2.86 (dd, 1H, J = 15.7, 10.4 Hz), 2.73 (dd, 1H, J = 15.9, 4.5 Hz), 1.80 (dd, 3H, J = 6.8, 1.3 Hz), 1.35 - 1.23 (m, 3H), 1.12 (d, 18H, J = 7.3 Hz), 0.89 (s, 9H), 0.08 (s, 3H), 0.07 (s, 3H).
(d) (S,E)-알릴 2-(2-((tert-부틸디메틸실릴옥시)메틸)-4-(프로프-1-엔일)-2,3-디하이드로-1H-피롤-1-카르보닐)-4-메톡시-5-(트리이소프로필실릴옥시)페닐카르바메이트 (69)
-78℃에서 알릴 클로로포르메이트 (0.83 g, 6.88 mmol, 1.1 eq)를 건조 피리딘 (1.09 g, 13.77 mmol, 2.2 eq)을 포함하는 건조 DCM (80 mL) 중의 아민 68 (3.6 g, 6.26 mmol, 1.0 eq)의 용액에 첨가하였다. 건조 얼음를 제거하고, 상기 반응 혼합물 실온으로 가온시켰다. 추가의 15 분 동안 교반 후, LC/MS은 반응이 완료되었음을 나타내었다. 유기 상을 0.01N HCl (50 mL), 포화 중탄산 나트륨 (50 mL), 염수 (10 mL)로 연속적으로 세척하고, MgSO4로 건조하고, 여과하고, 감압 하에 농축시켜서 연한 노란색 오일을 제공하여, 이것을 추가의 정제 과정 없이 다음 단계에서 사용하였다(4.12g, 약 100% 수율). LC/MS (4.862 분 (ES+)), m/z: 659.2 [M+H]+.
(e)(S,E)-알릴 2-(2-(히드록시메틸)-4-(프로프-1-엔일)-2,3-디하이드로-1H-피롤-1-카르보닐)-4-메톡시-5-(트리이소프로필실릴옥시)페닐카르바메이트 ( 70 )
상기 미정제 중간체 69 (약 100% 수율, 4.12 g, 6.25 mmol, 1.0 eq)를 아세트산 (70 mL), 메탄올 (10 mL), THF (10 mL) 및 물 (20 mL)의 혼합물에 용해시키고 실온에서 교반하였다. 6 시간 후, 상기 반응 혼합물을 에틸 아세테이트 (500 mL)로 희석하고 물 (2 x 500 mL), 포화 중탄산 나트륨 (300 mL) 및 염수 (50 mL)로 연속적으로 세척하였다. 유기 상을 MgSO4로 건조하고, 여과하고, 감압 하에 농축시켰다. 잔류물을 플래쉬 크로마토그래피 (실리카 겔, 1/99 v/v 메탄올/DCM 내지 5/95 v/v 메탄올/DCM)에 의해 정제하여, 노란색 오일로서 생성물을 제공하고, 추가의 1 g의 비반응 출발 물질을 회수하였다. 이 물질을 상기와 동일한 반응 조건에 적용하고, 다만 16 시간 동안 교반 유지하였다. 작업 및 정제 후, 추가의 생성물이 단리되었다 (2.7 g, 79%, 2 단계) LC/MS (3.742 분 (ES+)), m/z: 545.2 [M+H]+. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ8.38 (m, 1H), 7.72 (m, 1H), 6.81 (s, 1H), 6.37 (m, 1H), 6.10 (d, 1H, J = 15.8 Hz), 5.97 (m, 1H), 5.53 (m, 1H), 5.36 (ddd, 1H, J = 17.2, 3.1, 1.5 Hz), 5.25 (ddd, 1H, J = 10.4, 2.5, 1.3 Hz), 4.78 (m, 1H), 4.65 (dt, 2H, J = 5.7, 1.3 Hz), 3.84 (m, 3H), 3.79 (s, 3H), 3.04 (dd, 1H, J = 16.7, 10.5 Hz), 2.40 (dd, 1H, J = 16.0, 4.5 Hz), 1.82 (dd, 3H, J = 6.8, 1.0 Hz), 1.36 - 1.26 (m, 3H), 1.14 (d, 18H, J = 7.3 Hz).
(f) (11S,11aS)-알릴 11-히드록시-7-메톡시-5-옥소-2-((E)-프로프-1-엔일)-8-(트리이소프로필실릴옥시)-11,11a-디하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-10(5H)-카르복실레이트 ( 71 )
-78℃에서 질소 대기 하에서 건조 디메틸 술폭사이드 (1.16 g, 14.87 mmol, 3.0 eq)를 DCM (25 mL) 중의 염화 옥살릴 (0.94 g, 7.43 mmol, 1.5 eq)의 용액에 적가하였다. 온도를 -78℃에서 유지하면서, 10 분 후 DCM (20 mL) 중의 일차 알코올 70 (2.7 g, 4.96 mmol, 1.0 eq)의 용액을 적가하였다. 추가의 15 분 후, 건조 트리에틸아민 (2.5g, 24.78 mmol, 5.0 eq)을 첨가하고, 상기 반응 혼합물 실온으로 가온시켰다. 상기 반응 혼합물을 냉각 0.1N HCl (50 mL), 포화 소듐 하이드로젠 카보네이트 (50 mL) 및 염수 (10 mL)로 연속적으로 세척하고 유기 층을 MgSO4으로 건조하고, 여과하고, 감압 하에 농축시켜서, 노란색 오일 (2.68g, 약 100% 수율)로서 생성물을 제공하여, 이것을 추가의 정제 과정 없이 다음 단계에서 사용하였다. LC/MS (3.548 분 (ES+)), m/z: 543.2 [M+H]+.
(g) (11S,11aS)-알릴 11-(tert-부틸디메틸실릴옥시)-7-메톡시-5-옥소-2-((E)-프로프-1-엔일)-8-(트리이소프로필실릴옥시)-11,11a-디하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-10(5H)-카르복실레이트 ( 72 )
0℃ 질소 대기 하에서, Tert-부틸디메틸실릴트리플루오로메탄 술포네이트 (3.93 g, 14.87 mmol, 3.0 eq)를 건조 DCM (40 mL) 중의 카르비놀아민 71 (약 100% 수율, 2.68 g, 4.96 mmol, 1.0 eq) 및 2,6-루티딘 (2.12 g, 19.83 mmol, 4.0 eq) 의 용액에 첨가하였다. 10 분 후, 상기 반응 혼합물을 실온으로 가온시키고, 추가의 60 분 동안 교반하였다. 유기 상을 물 (10 mL), 포화 중탄산 나트륨 (10 mL) 및 염수 (5 mL)로 연속적으로 세척하고, MgSO4으로 건조하고, 여과하고, 감압 하에 농축시켰다. 잔류물을 플래쉬 크로마토그래피 (실리카 겔, 클로로포름 내지 2/98 v/v 메탄올/클로로포름)에 의해 정제하여, 노란색 오일 (2.0g, 63%, 2 단계)로서 생성물을 제공하였다. LC/MS (4.748 분 (ES+)), m/z: 657.2 [M+H]+. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ7.19 (s, 1H), 6.86 (m, 1H), 6.66 (s, 1H), 6.22 (d, 1H, J = 15.4 Hz), 5.81 (d, 1H, J = 8.8 Hz), 5.78 (m, 1H), 5.48 (m, 1H), 5.11 (d, 1H, J = 5.0 Hz), 5.08 (m, 1H), 4.58 (dd, 1H, J = 13.4, 5.4 Hz), 4.35 (dd, 1H, J = 13.2, 5.7 Hz), 3.83 (s, 3H), 3.76 (s, 1H), 3.00 (dd, 1H, J = 15.6, 11.0 Hz), 2.53 (m, 1H), 1.81 (dd, 3H, J = 6.8, 0.9 Hz), 1.30 - 1.18 (m, 3H), 1.08 (d, 9H, J = 2.3 Hz), 1.06 (d, 9H, J = 2.3 Hz), 0.86 (s, 9H), 0.25 (s, 3H), 0.18 (s, 3H).
(h) (11S,11aS)-알릴 11-(tert-부틸디메틸실릴옥시)-8-히드록시-7-메톡시-5-옥소-2-((E)-프로프-1-엔일)-11,11a-디하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-10(5H)-카르복실레이트 ( 73 )
25℃에서 리튬 아세테이트 디하이드레이트 (0.31 g, 3.04 mmol, 1.0 eq)를 습윤한 DMF (20 mL) 중의 디아제핀 72 (2.0 g, 3.04 mmol, 1.0 eq)의 용액에 첨가하고 4 시간 동안 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 에틸 아세테이트 (200 mL)로 희석하고, 0.1M 시트르산 (50 mL, pH 3), 물 (50 mL) 및 염수 (10 mL)로 연속적으로 세척하고, MgSO4으로 건조하고, 여과하고, 감압 하에 농축시켰다. 잔류물을 플래쉬 크로마토그래피 (실리카 겔, 50/50 v/v n-헥산/EtOAc 내지 25/75 v/v n-헥산/EtOAc)에 의해 정제하여, 연한 노란색 고체 (0.68g, 45 %)로서 생성물을 제공하였다. LC/MS (3.352 분 (ES+)), m/z: 501.1 [M+H]+. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ7.02 (s, 1H), 6.66 (m, 1H), 6.53 (s, 1H), 6.03 (d, 1H, J = 15.5 Hz), 5.80 (s, 1H), 5.63 (d, 1H, J = 8.9 Hz), 5.55 (m, 1H), 5.29 (m, 1H), 4.87 (m, 2H), 4.39 (dd, 1H, J = 13.5, 4.2 Hz), 4.20 (dd, 1H, J = 13.2, 5.7 Hz), 3.73 (s, 3H), 3.59 (m, 1H), 2.81 (dd, 1H, J = 16.1, 10.5 Hz), 2.35 (d, 1H, J = 15.7 Hz), 1.61 (d, 3H, J = 6.4 Hz), 0.67 (s, 9H), 0.05 (s, 3H), 0.00 (s, 3H).
(i) (11S,11aS)-알릴 11-(tert-부틸디메틸실릴옥시)-8-(3-요오도프로폭시)-7-메톡시-5-옥소-2-((E)-프로프-1-엔일)-11,11a-디하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-10(5H)-카르복실레이트 ( 74 )
디요오도프로판 (0.295 g, 1.00 mmol, 5.0 eq) 및 탄산 칼륨 (0.028 g, 0.20 mmol, 1.0 eq)을 건조 아세톤 (5 mL) 중의 페놀 73 (0.100 g, 0.020 mmol, 1.0 eq)의 용액에 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 60℃ 6 시간 동안 가열하고, 이때 LC/MS는 반응이 완료되었음을 나타내었다. 상기 반응 혼합물을 감압 하에 건조물로 농축시키고 잔류물을 플래쉬 크로마토그래피 (실리카 겔, 75/25 v/v n-헥산/EtOAc 내지 50/50 v/v n-헥산/EtOAc)에 의해 정제하여, 무색 오일 (0.074 g, 56%)로서 생성물을 제공하였다. LC/MS (3.853 분 (ES+)), m/z: 669.0 [M+H]+. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ7.26 (s, 1H), 6.90 (s, 1H), 6.68 (s, 1H), 6.24 (d, 1H, J = 15.3 Hz), 5.87 (d, 1H, J = 8.9 Hz), 5.78 (m, 1H), 5.53 (m, 1H), 5.12 (m, 2H), 4.65 (m, 2H), 4.41 (m, 1H), 4.11 (m, 1H), 3.93 (s, 3H), 3.81 (m, 1H), 3.40 (t, 2H, J = 6.7 Hz), 3.05 (dd, 1H, J = 16.3, 10.1 Hz), 2.57 (m, 1H), 2.34 (m, 2H), 1.84 (d, 3H, J = 6.6 Hz), 0.92 (s, 9H), 0.28 (s, 3H), 0.26 (s, 3H).
(iii) (11 S ,11a S )-4-(( S )-2-(( S )-2-(알릴옥시카르보닐아미노)-3-메틸부탄아미도)프로판아미도)벤질 11-( tert -부틸디메틸실릴옥시)-8-히드록시-7-메톡시-5-옥소-2-(( E )-프로프-1-엔일)-11,11a-디하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-10(5H)-카르복실레이트 ( 79 )
Figure pct00160
(a) 알릴 ((S)-1-(((S)-1-((4-((((2-((S)-2-(((tert-부틸디메틸실릴)옥시)메틸)-4-((E)-프로프-1-엔-1-일)-2,3-디하이드로-1H-피롤-1-카르보닐)-4-메톡시-5-((트리이소프로필실릴)옥시)페닐)카르바모일)옥시)메틸)페닐)아미노)-1-옥소프로판-2-일)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄-2-일)카르바메이트 ( 75 )
5℃ (얼음 욕조)에서, 트리에틸아민 (0.256 mL, 1.84 mmol, 2.2 eq)를 건조 THF (15 mL) 중의 아민 68 (0.480 g, 0.835 mmol, 1.0 eq) 및 트리포스젠 (0.089 g, 0.301 mmol, 0.36 eq)의 교반 용액에 첨가하였다. 이소시아네이트 반응의 진행 과정을 상기 반응 혼합물의 분취량을 주기적으로 제거하고, 메탄올로 퀀칭하고, LCMS 분석을 수행함으로써 모니터링하였다. 이소시아네이트 반응이 완료되면, 건조 THF (10 mL) 중의 Alloc-Val-Ala-PABOH 15 (0.473 g, 1.25 mmol, 1.5 eq) 및 트리에틸아민 (0.174 mL, 1.25 mmol, 1.5 eq)의 용액을 새로 준비한 이소시아네이트에 주입함으로써 빠르게 첨가하였다. 상기 반응물을 40℃에서 4 시간 동안 교반하고 실온에서 하룻밤 동안 교반하였다. 상기 혼합물을 감압 하에 농축시키고, 플래쉬 크로마토그래피 (실리카 겔, 20/80 v/v n-헥산/EtOAc 내지 50/50 v/v n-헥산/EtOAc, 이어서 1/99 v/v DCM/MeOH 내지 5/95 v/v DCM/MeOH)에 의해 정제하여 노란색 고체 (0.579 g, 71%)로서 생성물을 제공하였다. LC/MS (4.468 분 (ES+)), m/z: 978.55 [M+H]+. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ8.63 (br s, 1H), 8.42 (s, 1H), 7.78 (br s, 1H), 7.53 (d, 2H, J = 8.1 Hz), 7.31 (d, 2H, J = 8.6 Hz), 6.76 (s, 1H), 6.59 (d, 1H, J = 7.6 Hz), 6.36 (br s, 1H), 6.04 (d, 1H, J = 15.9 Hz), 5.90 (m, 1H), 5.55 (m, 1H), 5.33 - 5.21 (m, 3H), 5.10 (s, 2H), 4.66 (m, 2H), 4.57 (dd, 2H, J = 5.6, 1.0 Hz), 3.98 (dd, 1H, J = 7.3, 6.8 Hz), 3.90 (m, 1H), 3.81 (m, 1H), 3.78 (s, 3H), 2.82 (dd, 1H, J = 15.4, 9.6 Hz), 2.72 (dd, 1H, J = 15.9, 3.5 Hz), 2.17 (m, 1H), 1.78 (dd, 3H, J = 6.5, 0.8 Hz), 1.46 (d, 3H, J = 7.1 Hz), 1.29 (m, 3H), 1.11 (d, 18H, J = 7.1 Hz), 0.97 (d, 3H, J = 6.8 Hz), 0.92 (d, 3H, J = 6.8 Hz), 0.83 (s, 9H), 0.04 (s, 3H), 0.01 (s, 3H).
(b) 알릴 ((S)-1-(((S)-1-((4-((((2-((S)-2-(히드록시메틸)-4-((E)-프로프-1-엔-1-일)-2,3-디하이드로-1H-피롤-1-카르보닐)-4-메톡시-5-((트리이소프로필실릴)옥시)페닐)카르바모일)옥시)메틸)페닐)아미노)-1-옥소프로판-2-일)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄-2-일)카르바메이트 ( 76 )
실릴 에테르 75 (1.49 g, 1.52 mmol, 1.0 eq)를 아세트산/ 메탄올/ 테트라하이드로푸란/ 물 (14:2:2:4 mL)의 7:1:1:2 혼합물에 용해시키고 실온에서 교반하였다. 2 시간 후, 상기 반응물을 EtOAc (100 mL)로 희석하고, 물, 수성 중탄산 나트륨, 이어서 염수로 순차적으로 세척하였다. 이어서, 유기 상을 MgSO4으로 건조하고, 여과하고, 감압 하에 농축시켰다. 잔류물을 플래쉬 크로마토그래피 (실리카 겔, 100/0 그후 99/1 내지 92/8 v/v DCM/ MeOH)에 의해 정제하여 오렌지색 고체 (1.2 g, 92%)로서 생성물을 제공하였다. LC/MS (3.649 분 (ES+)), m/z: 865.44 [M+H]+. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ8.44 (s, 1H), 8.35 (s, 1H), 7.69 (br s, 1H), 7.53 (d, 2H, J = 8.7 Hz), 7.32 (d, 2H, J = 8.3 Hz), 6.78 (s, 1H), 6.56 (m, 2H), 6.32 (br s, 1H), 6.05 (d, 1H, J = 14.9 Hz), 5.90 (m, 1H), 5.56 (m, 1H), 5.30 (m, 2H), 5.22 (m, 1H), 5.10 (d, 2H, J = 3.1 Hz), 4.73 (m, 1H), 4.64 (m, 1H), 4.57 (d, 2H, J = 5.8 Hz), 4.01 (m, 1H), 3.79 (m, 2H), 3.76 (s, 3H), 2.98 (dd, 1H, J = 16.3, 10.2 Hz), 2.38 (dd, 1H, J = 16.6, 4.1 Hz), 2.16 (m, 1H), 1.78 (dd, 3H, J = 6.8, 0.9 Hz), 1.46 (d, 3H, J = 7.1 Hz), 1.29 (m, 3H), 1.11 (d, 18H, J = 7.4 Hz), 0.97 (d, 3H, J = 6.7 Hz), 0.92 (d, 3H, J = 6.8 Hz).
(c) (11S,11aS)-4-((S)-2-((S)-2-(알릴옥시카르보닐아미노)-3-메틸부탄아미도)프로판아미도)벤질 11-히드록시-7-메톡시-5-옥소-2-((E)-프로프-1-엔일)-8-(트리이소프로필실릴옥시)-11,11a-디하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-10(5H)-카르복실레이트 ( 77 )
-78℃에서 질소 대기 하에서, 건조 디메틸 술폭사이드 (0.180 g, 2.3 mmol, 3.0 eq)를 DCM (10 mL) 중의 염화 옥살릴 (0.147 g, 1.1mmol, 1.5 eq)의 용액에 적가하였다. 온도를 -78℃에서 유지하고, 20 분 후, DCM (10 mL) 중의 일차 알코올 76 (0.666 g, 0.77 mmol, 1.0 eq)의 용액을 적가하였다. 추가의 15 분 후, 건조 트리에틸아민 (0.390 g, 3.85 mmol, 5.0 eq)을 첨가하고, 상기 반응 혼합물을 실온으로 가온시켰다. 상기 반응 혼합물을 냉각 0.1N HCl (10 mL), 포화 소듐 하이드로젠 카보네이트 (10 mL) 및 염수 (5 mL)로 연속적으로 세척하였다. 이어서 유기 층을 MgSO4으로 건조하고, 여과하고, 감압 하에 농축시켰다. 이어서 잔류물을 플래쉬 크로마토그래피 (실리카 겔, 50/50 v/v n-헥산/EtOAc 내지 25/75 v/v n-헥산/EtOAc)에 의해 정제하여 백색 고체 (0.356g, 54 %)로서 생성물을 제공하였다. LC/MS (3.487 분 (ES+)), m/z: 862.2 [M+H]+. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ8.34 (br s, 1H), 7.47 (d, 2H, J = 7.6 Hz), 7.17 (s, 1H), 7.14 (d, 2H, J = 7.5 Hz), 6.86 (br s, 1H), 6.65 (br s, 1H), 6.42 (d, 1H, J = 7.6 Hz), 6.22 (d, 1H, J = 14.4 Hz), 5.80 (m, 1H), 5.40 (m, 1H), 5.53 (m, 1H), 5.32 (m, 1H), 5.21 (d, 2H, J = 9.6 Hz), 5.06 (d, 1H, J = 12.3 Hz), 4.90 (m, 1H), 4.58 (m, 3H), 3.98 (m, 1H), 3.84 (m, 1H), 3.81 (s, 3H), 3.50 (m, 1H), 3.05 (dd, 1H, J = 16.0, 10.3 Hz), 2.76 (m, 1H), 2.15 (m, 1H), 1.80 (dd, 3H, J = 6.7, 0.8 Hz), 1.44 (d, 3H, J = 7.1 Hz), 1.16 (m, 3H), 1.01 (d, 18H, J = 6.6 Hz), 0.96 (d, 3H, J = 6.8 Hz), 0.92 (d, 3H, J = 6.8 Hz).
(d) (11S,11aS)-4-((S)-2-((S)-2-(알릴옥시카르보닐아미노)-3-메틸부탄아미도)프로판아미도)벤질 11-(tert-부틸디메틸실릴옥시)-7-메톡시-5-옥소-2-((E)-프로프-1-엔일)-8-(트리이소프로필실릴옥시)-11,11a-디하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-10(5H)-카르복실레이트 ( 78 )
0℃, 질소 대기 하에서, Tert-부틸디메틸실릴트리플루오로메탄 술포네이트 (0.46 g, 1.74mmol, 3.0 eq)를 건조 DCM (10 mL) 중의 이차 알코올 77 (0.5 g, 0.58 mmol, 1.0 eq) 및 2,6-루티딘 (0.25 g, 2.32 mmol, 4.0 eq)의 용액에 첨가하였다. 10 분 후, 상기 반응 혼합물을 실온으로 가온시키고, 추가의 120 분 동안 교반하였다. 이어서, 유기 상을 물 (10 mL), 포화 중탄산 나트륨 (10 mL) 및 염수 (5 mL)로 연속적으로 세척하고, MgSO4으로 건조하고, 여과하고, 감압 하에 농축시켰다. 잔류물을 플래쉬 크로마토그래피 (실리카 겔, 50/50 v/v n-헥산/EtOAc)에 의해 정제하여, 백색 고체 (0.320 g, 57 %)로서 생성물을 제공하였다. LC/MS (4.415 분 (ES+)), m/z: 976.52 [M+H]+. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ8.31 (br s, 1H), 7.48 (d, 2H, J = 8.0 Hz), 7.21 (s, 1H), 7.14 (d, 2H, J = 8.3 Hz), 6.89 (s, 1H), 6.65 (s, 1H), 6.38 (d, 1H, J = 7.3 Hz), 6.25 (d, 1H, J = 14.6 Hz), 5.93 (m, 1H), 5.85 (d, 1H, J = 8.8 Hz), 5.50 (m, 1H), 5.34 (m, 1H), 5.24 (m, 2H), 5.15 (d, 1H, J = 12.5 Hz), 4.86 (d, 1H, J = 12.2 Hz), 4.62 (m, 3H), 4.01 (m, 1H), 3.86 (s, 3H), 3.78 (m, 1H), 3.04 (m, 1H), 2.56 (m, 1H), 2.20 (m, 1H), 1.84 (dd, 3H, J = 6.6, 0.7 Hz), 1.48 (d, 3H, J = 6.8 Hz), 1.20 (m, 3H), 1.05 (d, 9H, J = 2.9 Hz), 1.03 (d, 9H, J = 2.9 Hz), 0.99 (d, 3H, J = 6.8 Hz), 0.95 (d, 3H, J = 6.8 Hz), 0.88 (s, 9H), 0.27 (s, 3H), 0.14 (s, 3H).
(e) (11S,11aS)-4-((S)-2-((S)-2-(알릴옥시카르보닐아미노)-3-메틸부탄아미도)프로판아미도)벤질 11-(tert-부틸디메틸실릴옥시)-8-히드록시-7-메톡시-5-옥소-2-((E)-프로프-1-엔일)-11,11a-디하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-10(5H)-카르복실레이트 ( 79 )
25℃에서 3 시간 동안 리튬 아세테이트 디하이드레이트 (0.010 g, 0.10 mmol, 1.0 eq)를 습윤한 DMF (2 mL) 중의 실릴 에테르 78 (0.100 g, 0.10 mmol, 1.0 eq)의 용액에 첨가하였다. 이어서, 상기 반응 혼합물을 에틸 아세테이트 (20 mL)로 희석하고, 0.1M 시트르산 (20 mL, pH 3), 물 (20 mL) 및 염수 (5 mL)로 연속적으로 세척하고, MgSO4으로 건조하고, 여과하고, 감압 하에 농축시켰다. 잔류물을 플래쉬 크로마토그래피 (실리카 겔, 5/95 v/v 메탄올/DCM)에 의해 정제하여 연한 노란색 오일 (0.070 g, 83 %)로서 생성물을 제공하였다. LC/MS (3.362 분 (ES+)), m/z: 820.2 [M+H]+. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ8.39 (s, 1H), 7.48 (d, 2H, J = 8.2 Hz), 7.25 (s, 1H), 7.12 (d, 2H, J = 8.1 Hz), 6.88 (s, 1H), 6.68 (s, 1H), 6.47 (d, 1H, J = 7.6 Hz), 6.24 (d, 1H, J = 15.2 Hz), 6.03 (s, 1H), 5.92 (m, 1H), 5.84 (d, 1H, J = 8.9 Hz), 5.50 (m, 1H), 5.34 (m, 1H), 5.26 (m, 2H), 5.18 (d, 1H, J = 12.3 Hz), 4.80 (d, 1H, J = 12.4 Hz), 4.66 - 4.60 (m, 3H), 4.02 (m, 1H), 3.95 (s, 3H), 3.81 (m, 1H), 3.03 (m, 1H), 2.57 (m, 1H), 2.19 (m, 1H), 1.84 (dd, 3H, J = 6.8, 0.8 Hz), 1.48 (d, 3H, J = 7.1 Hz), 1.00 (d, 3H, J = 6.8 Hz), 0.95 (d, 3H, J = 6.8 Hz), 0.87 (s, 9H), 0.26 (s, 3H), 0.12 (s, 3H).
(iv) (11S,11aS)-4-((20S,23S)-1-요오도-20-이소프로필-23-메틸-2,18,21-트리옥소-6,9,12,15-테트라옥사-3,19,22-트리아자테트라코산아미도)벤질 11-히드록시-7-메톡시-8-(3-((S)-7-메톡시-5-옥소-2-((E)-프로프-1-엔일)-5,11a-디하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-8-일옥시)프로폭시)-5-옥소-2-((E)-프로프-1-엔일)-11,11a-디하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-10(5H)-카르복실레이트 (66, D)
Figure pct00161
(a) (11S,11aS)-알릴 8-(3-((11S,11aS)-10-((4-((R)-2-((R)-2-(알릴옥시카르보닐아미노)-3-메틸부탄아미도)프로판아미도)벤질옥시)카르보닐)-11-(tert-부틸디메틸실릴옥시)-7-메톡시-5-옥소-2-((E)-프로프-1-엔일)-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-8-일옥시)프로폭시)-11-(tert-부틸디메틸실릴옥시)-7-메톡시-5-옥소-2-((E)-프로프-1-엔일)-11,11a-디하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-10(5H)-카르복실레이트 ( 80 )
탄산 칼륨 (0.030 g, 0.21 mmol, 1.0 eq)를 아세톤 (10 mL) 중의 페놀 79 (0.175 g, 0.21 mmol, 1.0 eq) 및 요오도 링커 74 (0.214 g, 0.32 mmol, 1.5 eq)의 용액에 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 질소 대기 하에 75℃의 밀봉된 플라스크에서 17 시간 동안 가열하였다. 상기 반응 혼합물을 감압 하에 건조물로 농축시키고 플래쉬 크로마토그래피 (실리카 겔, 2/98 v/v 메탄올/DCM 내지 5/95 v/v 메탄올/DCM)에 의해 정제하여, 연한 노란색 고체 (0.100 g, 35%)로서 생성물을 제공하였다. LC/MS (4.293 분 (ES+)), m/z: 1359.13 [M]+.
(b) (11S,11aS)-알릴 8-(3-((11S,11aS)-10-((4-((R)-2-((R)-2-(알릴옥시카르보닐아미노)-3-메틸부탄아미도)프로판아미도)벤질옥시)카르보닐)-11-히드록시-7-메톡시-5-옥소-2-((E)-프로프-1-엔일)-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-8-일옥시)프로폭시)-11-히드록시-7-메톡시-5-옥소-2-((E)-프로프-1-엔일)-11,11a-디하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-10(5H)-카르복실레이트 ( 81 )
테트라-n-부틸암모늄 플루오라이드 (1M, 0.22 mL, 0.22 mmol, 2.0 eq)를 건조 THF (2 mL) 중의 실릴 에테르 80 (0.150 g, 0.11 mmol, 1.0 eq)의 용액에 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 실온에서 20 분 동안 교반하고, 이때 LC/MS은 반응이 완료되었음을 나타내었다. 상기 반응 혼합물을 에틸 아세테이트 (10 mL)으로 희석하고, 물 (5 mL), 염수 (5 mL)로 순차적으로 세척하였다. 유기 상을 MgSO4으로 건조하고, 여과하고, 감압 하에 농축시키고 노란색 고체가 잔류하였다. 플래쉬 크로마토그래피 (실리카 겔, 6/94 v/v 메탄올/DCM 내지 10/90 v/v 메탄올/DCM)에 의한 정제에 의해 연한 노란색 고체 (0.090 g, 73%)로서 생성물을 제공하였다. LC/MS (2.947 분 (ES+)), m/z: 1154.0 [M+Na]+. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ8.39 (br s, 1H), 7.39 (d, 2H, J = 7.6 Hz), 7.18 (d, 2H, J = 10.6 Hz), 7.10 (m, 3H), 6.86 (d, 2H, J = 10.0 Hz), 6.74 (s, 1H), 6.55 (s, 1H), 6.22 (dd, 2H, J = 15.3, 6.6 Hz), 5.85 (m, 2H), 5.74 (m, 3H), 5.52 (m, 2H), 5.22 (m, 1H), 5.00 (m, 2H), 4.57 (m, 6H), 4.41 (m, 2H), 4.09 (m, 4H), 3.85 (m, 11H), 3.06 (m, 2H), 2.76 (m, 2H), 2.20 (m, 2H), 2.08 (m, 1H), 1.79 (d, 6H, J = 6.4 Hz), 1.40 (d, 3H, J = 6.1 Hz), 0.90 (m, 6H).
(c) (11S,11aS)-4-((R)-2-((R)-2-아미노-3-메틸부탄아미도)프로판아미도)벤질 11-히드록시-7-메톡시-8-(3-((S)-7-메톡시-5-옥소-2-((E)-프로프-1-엔일)-5,11a-디하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-8-일옥시)프로폭시)-5-옥소-2-((E)-프로프-1-엔일)-11,11a-디하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-10(5H)-카르복실레이트 ( 65 )
테트라키스(트리페닐포스펜)팔라듐(0) (0.005 g, 0.005 mmol, 0.06 eq)를 건조 DCM (5 mL) 중의 비스-카르비놀아민 81 (0.090 g, 0.08 mmol, 1.0 eq) 및 피롤리딘 (16 μL, 0.20 mmol, 2.5 eq)의 용액에 첨가하였다. 20 분 후, 상기 반응 혼합물을 DCM (10 mL)으로 희석하고 포화 암모늄 클로라이드 (5 mL) 및 염수 (5 mL)로 순차적으로 세척하고, MgSO4으로 건조하고, 여과하고, 용매를 감압 하에 제거하고, 연한 노란색 고체로서, 미정제 생성물이 잔류하였고, 이것을 추가의 정제 과정 없이 다음 단계에서 사용하였다 (0.075 g, 약 100% 수율). LC/MS (2.060 분 (ES+)), m/z: 947.2 [M+H]+.
(d) (11S,11aS)-4-((20S,23S)-1-요오도-20-이소프로필-23-메틸-2,18,21-트리옥소-6,9,12,15-테트라옥사-3,19,22-트리아자테트라코산아미도)벤질 11-히드록시-7-메톡시-8-(3-((S)-7-메톡시-5-옥소-2-((E)-프로프-1-엔일)-5,11a-디하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-8-일옥시)프로폭시)-5-옥소-2-((E)-프로프-1-엔일)-11,11a-디하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-10(5H)-카르복실레이트 ( 66, D )
EDCI (0.015 g, 0.08 mmol, 1.0 eq)를 건조 디클로로메탄 (5 mL) 중의 아민 65 (약 100% 수율 0.075 g, 0.08 mmol, 1.0 eq) 및 요오도아세트아미드-PEG4-산 17 (0.034 g, 0.08 mmol, 1.0 eq)의 용액에 첨가하고 어두운 곳에서 반응물을 교반하였다. 50 분 후, 추가 량의 요오도아세트아미드-PEG4-산 I7 (0.007 g, 0.016 mmol, 0.2 eq)를 첨가하고 추가 량의 EDCI (0.003 g, 0.016 mmol, 0.2 eq)를 첨가하였다. 총 2.5 시간 후, 상기 반응 혼합물을 디클로로메탄 (15 mL)으로 희석하고 물 (10 mL), 염수 (10 mL)로 순차적으로 세척하였다. 유기 상을 MgSO4으로 건조하고, 여과하고, 감압 하에 농축시켰다. 생성된 잔류물을 플래쉬 크로마토그래피 (실리카 겔, 클로로포름 100% 내지 90:10 v/v 클로로포름:메탄올)에 의해 정제하였다. 순수 분획을 결합시켜서, 생성물 (0.0254 g, 23%, 2 단계)을 제공하였다. 상기 미정제 분획을 수집하고, 예비 TLC (실리카 겔, 90:10 v/v 클로로포름:메탄올)에 의해 정제하여, 제2 배취의 생성물 (0.0036 g, 3%, 2 단계)을 제공하였다. LC/MS (2.689 분 (ES+)), m/z: 681.0 1/2[M+2H]+.
실시예 10: 방출 화합물의 활성
K562 분석
K562 인간 만성 골수성 백혈병 세포를 5% CO2를 포함하는 습윤한 대기에서 37℃에서 10 % 소태아 혈청 및 2 mM 글루타민으로 보충된 RPM1 1640 배지 중에 유지시키고, 37℃의 어두운 곳에서, 1 시간 또는 96 시간 동안 특정 용량의 약물로 인큐베이션시켰다. 인큐베이션을 원심 분리 (5 min, 300 g)에 의해 종료시키고, 세포를 약물-무함유 배지로 1 회 세척하였다. 적절한 약물 처리 후, 상기 세포를 96-웰 미세적정 플레이트 (104 세포/웰, 8 웰/샘플)로 옮겼다. 이어서, 플레이트를 5% CO2를 포함하는 습윤한 대기에서 37℃의 어두운 곳에 유지시켰다. 상기 분석은 노란색 용해성 테트라졸륨 염, 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐-2H-테트라졸륨 브로마이드 (MTT, Aldrich-Sigma)를 불용성 보라색 포르마잔 침전물로 환원시키는 생존 세포의 능력을 기반으로 한 것이다. 4 일 동안 상기 플레이트의 인큐베이션 후 (대조군 세포의 수를 대략 10배로 증가시키기 위해), 20 μL의 MTT 용액 (5 mg/mL, 포스페이트-완충 염수)를 각 웰에 첨가하고, 각 웰 및 플레이트를 5 시간 동안 추가로 인큐베이션시켰다. 이어서, 상기 플레이트를 300 g에서 5 분 동안 원심분리하고, 다량의 배지를 웰 당 10-20 μL만 남기고 세포 펠렛으로부터 피페팅하였다. DMSO (200 μL)를 각 웰에 첨가하고 및 샘플을 완전히 혼합될 때까지 교반하였다. 이어서, Titertek Multiscan ELISA 플레이트 판독기에서 550 nm의 파장에서 광학 밀도를 판독하고, 용량-반응 곡선을 작제하였다. 각 곡선에서, 최종 광학 밀도를 대조군 값의 50 %로 감소시키는데 요구되는 용량으로서 IC50 값을 결정하였다.
이 분석에서, 화합물 RelC는 0.1 pM 이하의 IC50을 갖는다.
이 분석에서, 화합물 RelE는 0.425 nM 이하의 IC50을 갖는다.
실시예 11: 컨주게이트의 생성
일반적 항체 컨주게이션 과정
항체를 환원 완충액 (예: 포스페이트 완충 염수 PBS, 히스티딘 완충액, 소듐 보레이트 완충액, 트리스 완충액)에서 1-5 mg/mL 로 희석하였다. 시스테인 이황화 가교를 선택적으로 환원시키기 위해, 새로 제조한 TCEP (트리스(2-카르복시에틸)포스핀 하이드로클로라이드)의 용액을 첨가하였다. TCEP의 양은 2 내지 8의 반응성 티올을 생성시키는 것으로서, 항체 당 1 내지 4의 몰당량에서, 목표 수준의 환원에 비례한다. 37℃에서 수 시간 동안 환원시킨 후, 상기 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 과량의 약물-링커 (A, B, C, D, E)를 희석된 DMSO 용액 (반응 혼합물의 최대 10% 용적/용적의 최종 DMSO 함량)으로서 첨가하였다. 상기 혼합물을 적당한 시간, 일반적으로 1 내지 3 시간 동안 및 화합물 4℃ 또는 실온에서 가볍게 흔들었다. 과량의 반응성 티올은 컨주게이션 말단에 N-에틸 말레이미드 (NEM)와 같은 "티올 캐핑 시약 (thiol capping reagent)"과 반응할 수 있다. 10 kDa 이상의 분자량 컷오프의 원심분리 회전-필터를 사용하여, 항체-약물 컨주게이트를 농축시킨 다음, TFF (tangential flow filtration) 또는 빠른 단백질 액체 크로마토그래피 (FPLC)에 의해 정제하였다. UV-시각화 (UV-Visible), 형광 또는 질량-분광분석 검출과 결합하여, 역상 크로마토그래피 (RP) 또는 소수성-상호작용 크로마토그래피 (HIC)를 사용하여 약물-항체 비율 (DAR)을 평가하기 위해, 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 또는 초고성능 액체 크로마토그래피 (UHPLC)에 의한 분석에 의해, 해당 항체-약물 컨주게이트를 결정할 수 있다; 응집 수준 및 단량체 순도는 UV-시각화 (UV-Visible), 형광 또는 질량-분광분석 검출과 결합하여, 크기-배제 크로마토그래피를 이용한 HPLC 또는 UHPLC에 의해 분석할 수 있다. 최종 컨주게이트 농도는 분광분석 (280, 214 및 330 nm의 흡광도) 및 생화학 분석 (BCA (bicinchonic acid assay; Smith, P.K., et al. (1985) Anal. Biochem. 150 (1): 76-85; 참조로서 알려진 농도를 IgG 항체 이용)의 조합에 의해 결정하였다. 항체-약물 컨주게이트는 일반적으로 무균 조건 하에서 0.2 ㎛ 필터를 사용하여 멸균 여과하고, +4℃, -20℃ 또는 -80℃에서 저장한다.
DAR 측정
항체 또는 ADC (ca. 35 μg, 35 μL 중)를 10 μL 보레이트 완충액 (100 mM, pH 8.4) 및 5 μL DTT (0.5 M, 물 중)의 첨가에 의해 환원시키고, 15 분 동안 37℃에서 가열하였다. 샘플을 1 부피의 아세토니트릴: 물: 포름산 (49%: 49%: 2% v/v)으로 희석하고, 80℃에서 1 ml/min의 유속으로, UPLC 시스템 (Shimadzu Nexera)에서 Widepore 3.6μXB-C18 150 x 2.1 mm (P/N 00F-4482-AN) 칼럼 (Phenomenex Aeris)에 주입하고, 75% 완충액 A (물, 트리플루오로아세트산 (0.1% v/v) (TFA), 25% 완충액 B (아세토니트릴: 물: TFA 90%: 10%: 0.1% v/v) 중에서 평형화시켰다. 10 분 동안 25% 내지 55% 완충액 B의 구배를 사용하여 결합 물질을 희석시켰다. 214 nm에서 UV 흡광도 피크를 통합하였다. 하기 피크를 각각의 ADC 또는 항체: 본래의 항체 경쇄 (L0), 본래의 항체 중쇄 (H0) 및 첨가된 약물-링커의 각 사슬 (1, 2 또는 3 부착 약물-링커의 중쇄의 경우, H1, H2, H3, 1 종의 약물의 경쇄의 경우, L1 표지)에 대해 확인하였다. 약물-링커를 포함하는 단편 (즉, L1, H1, H2, H3)의 확인을 위해, 330 nm에서의 UV 크로마토그램을 사용하였다.
PBD/단백질 몰비를 경쇄 및 중쇄 둘 모두에 대해 계산하였다:
Figure pct00162
최종 DAR을 하기와 같이 계산하였다:
Figure pct00163
약물-링커 흡광도의 방해를 최소화하기 위해, DAR 측정을 214 nm에서 수행하였다.
ADC 의 생성
항체 A (서열번호 7과 쌍을 이루는 서열번호 1의 가변 도메인 포함)는 약물 링커 A와 컨주게이팅되어, Conj A-A를 제공하였고, DAR은 2.35로 측정되었다.
항체 B (서열번호 8과 쌍을 이루는 서열번호 2의 가변 도메인 포함)는 약물 링커 A와 컨주게이팅되어, Conj B-A를 제공하였고, DAR은 2.2로 측정되었다 (하기 표 참조).
항체 C (서열번호 12와 쌍을 이루는 서열번호 6의 가변 도메인 포함)는 약물 링커 A와 컨주게이팅되어, Conj C-A를 제공하였고, DAR은 1.97로 측정되었다.
항체 D (서열번호 10과 쌍을 이루는 서열번호 4의 가변 도메인 포함)는 약물 링커 A와 컨주게이팅되어, Conj D-A를 제공하였고, DAR은 1.99로 측정되었다.
항체 E (서열번호 11과 쌍을 이루는 서열번호 5의 가변 도메인 포함)는 약물 링커 A와 컨주게이팅되어, Conj E-A를 제공하였고, DAR은 1.89로 측정되었다.
항체 B (서열번호 8과 쌍을 이루는 서열번호 2의 가변 도메인 포함)는 약물 링커 D와 컨주게이팅되어, Conj B-A를 제공하였고, DAR은 2.18로 측정되었다 (하기 표 참조).
항체 B (서열번호 8과 쌍을 이루는 서열번호 2의 가변 도메인 포함)는 약물 링커 E와 컨주게이팅되어, Conj B-E를 제공하였고, DAR은 1.93으로 측정되었다 (하기 표 참조).
RB4v1.2는 서열번호 2에 따른 서열을 갖는 VH 도메인 및 서열번호 8에 따른 서열을 갖는 VK 도메인을 포함하는 항-CD19 항체이다.
상기에서 개시되는 바와 같이, CD19에 표적화되는 ADC는 RB4v1.2 항체를 약물 링커 A, E, 또는 D에 컨주게이팅시킴으로써 제조하였다. 생성된 ADC는 측정된 DAR에 따라 하기 표에 제시하였다. B12 항-HIV gp120 항체를 대조군 비-CD19 표적화 ADC를 제조하는데 사용하였다.
Figure pct00164
실시예 12: ADC 의 시험관내 세포독성
세포 배양
WSU-DLCL2 및 SU-DHL-1 세포를 Microorganisms and Cell Cultures의 Leibniz Institute DSMZ-German Collection으로부터 제공받았다. Ramos 및 Daudi 세포를 American Type Culture Collection으로부터 제공받았다. 세포 배양 배지는 L-글루타민 및 10% FBS로 보충된 RPMI 1640이었다. 37℃, 5% CO2의 습윤한 인큐베이터에서 세포를 성장시켰다.
세포독성 분석
현탁 세포 배양 (최고 1 > 106/ml)의 농도 및 생존도를 트리판 블루에 의해 1:1 혼합하여 측정하고, 혈구계산기를 이용하여 무색 (생존)/블루 (사멸) 세포를 계수하였다. 세포 현탁액을 필요한 접종 밀도 (일반적으로 105/ml)로 희석하고, 96-웰 평 바닥 플레이트로 나누었다. 알라마 블루 어세이에서, 100 μL/웰을 블랙-웰 플레이트에 나누었다. MTS 어세이에서, 50 μL/웰을 투명한-웰 플레이트에 나누었다. 세포 배양 배지로 필터-멸균 ADC의 희석에 의해 ADC (20 μg/ml)의 스탁 용액 (1 ml)을 제조하였다. 900 μL의 세포 배양 배지 상에 100 μL을 순차적으로 옮겨서, 스탁 ADC의 8 x 10 배 희석 일 세트를 제조하였다. 각각의 ADC 희석액 (알라마 블루의 경우 100 μL/웰, MTS의 경우 50 μL/웰)을 세포 현탁액이 포함된 96-웰 플레이트의 복제된 4개의 웰로 옮겼다. 대조군 웰에도 동일한 용적의 배양 배지만을 제공하였다. 4 일 동안 인큐베이션 후, 세포 생존도를 알라마 블루 또는 MTS 어세이에 의해 측정하였다.
AlamarBlue®(Invitrogen, 카달로그 번호 DAL1025)를 각 웰에 나누고 (20 μL/웰), CO2-기체 인큐베이터에서 37℃에서 4 시간 동안 인큐베이션하였다. 웰 형광도를 여기 570 nm, 방출 585 nm에서 측정하였다. 4 개의 대조군 웰 (100%)의 평균 형광도와 비교하여, 4 ADC-처리 웰의 평균 형광도의 비율로부터 세포 생존도 (%)를 계산하였다.
MTS (Promega, 카달로그 번호 G5421)를 각 웰에 나누고 (20 μL/웰), CO2-기체 인큐베이터에서 37℃에서 4 시간 동안 인큐베이션하였다. 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 4 개의 대조군 웰 (100%)의 평균 형광도와 비교하여, 4 ADC-처리 웰의 평균 형광도의 비율로부터 세포 생존도 (%)를 계산하였다. 3개의 복제 실험의 평균 데이타로부터 투여량 반응 곡선을 생성하고, Prism (GraphPad, San Diego, CA)을 이용하여 다양한 기울기의 S자형 투여량-반응 곡선에 데이타를 적용하여 EC50을 측정하였다.
시험관내 세포독성
RB4v1.2-A의 효능을 CD19+ve 세포주, Daudi, Ramos 및 WSU-DLCL2에 대해 시험하였다. CD19-ve 대조군으로서, SU-DHL-1 세포를 사용하였다.
도 1은 RB4v1.2-A의 시험관 내 효능을 나타낸다. RB4v1.2-A의 일련의 10 배 희석액 (μg/mL)을 Daudi, Ramos, WSU-DLCL2 또는 SU-DHL-1 세포로 인큐베이션하였다. 인큐베이션 종료 시점에 알라마르 블루 어세이를 수행하고, 생존 세포를 계산하였다. 그래프는 3 중 실험의 평균을 나타낸다.
RB4v1.2-A는 Daudi 및 Ramos 세포에 대한 현저한 세포독성을 나타내었고, WSU-DLCL2 세포에 대해서는 다소 낮은 세포독성을 나타내었다 (도 1).
Figure pct00165
도 2는 RB4v1.2-E의 시험관 내 효능을 나타낸다. RB4v1.2-E의 일련의 10 배 희석액 (μg/mL)을 Daudi, Ramos, WSU-DLCL2 또는 SU-DHL-1 세포로 인큐베이션하였다. 인큐베이션 종료 시점에 알라마르 블루 어세이를 수행하고, 생존 세포를 계산하였다. 그래프는 3 중 실험의 평균을 나타낸다.
RB4v1.2-E는 Daudi 및 Ramos 세포에 대한 현저한 세포독성을 나타내었고, WSU-DLCL2 세포에 대해서는 다소 낮은 세포독성을 나타내었다 (도 2).
Figure pct00166
도 3은 RB4v1.2-D의 시험관 내 효능을 나타낸다. RB4v1.2-D의 일련의 10 배 희석액 (μg/mL)을 Daudi, Ramos, WSU-DLCL2 또는 SU-DHL-1 세포로 인큐베이션하였다. 인큐베이션 종료 시점에 알라마르 블루 어세이를 수행하고, 생존 세포를 계산하였다. 그래프는 3 중 실험의 평균을 나타낸다.
RB4v1.2-D는 Daudi 및 Ramos 세포에 대한 현저한 세포독성을 나타내었고, WSU-DLCL2 세포에 대해서는 다소 낮은 세포독성을 나타내었다 (도 3).
Figure pct00167

실시예 13 - ADC 의 시험관내 항-종양 활성
생체 내에서, RB4v1.2에 대한 가장 강력한 PBD 약물 링커를 결정하기 위해, CD19 +(ve) 인간 Burkitt의 림프종-유래 세포주 Ramos를 사용하였다. 상기에서 개시된 바와 같이, 항체를 A, E, 또는 D 약물 링커에 컨주게이션시키고, Ramos 이종이식 모델에서 시험하였다. 비-CD19-결합 대조군으로서, A 또는 E에 연결된 항-HIV gp120 항체, B12를 사용하였다. 동시에, PBD 탄두 없이 RB4v1.2로 관찰된 임의의 가능성 있는 항-종양 활성을 조사하기 위해, RB4v1.2를 튜불린 억제제로서 작용하는 마이탄시노이드 유도체 DM4에 생체 내 컨주게이션시켰다.
연구 설계
약물 및 처리:
Figure pct00168
과정
· 옆구리 피하에 0% 매트리겔 중의 1x1 LNCaP-SPN 종양 세포를 갖는 CR 암컷 NCr nu/nu 마우스를 수립한다.
· 세포 주입 용적은 0.1 mL/마우스이다.
· 개시일의 령: 8 내지 12 주령.
· 종양의 평균 크기가 100 - 150 mm3에 도달하는 경우, 페어 매치를 수행하고, 처리를 개시한다.
· 체중: 종료시까지 격주, 하루에 한번 x 5
· 캘리퍼 측정: 종료시까지 격주
· 임의의 부작용 또는 사멸의 경우 즉시 보고한다.
· >30% 체중 감소가 1회 관찰되거나 >25% 체중 감소가 연속하여 3회 측정되는 임의의 각 동물은 안락사시킨다.
· >20%의 평균 체중 감소 또는 > 10% 사망률이 2회 측정된 임의의 군은 투여를 중지한다. 상기 군은 안락사시키지 않고, 회복되도록 한다. >20% 중량 감소의 군에서, 체중 감소 한계점을 나타내는 각 동물은 안락사시킨다. 체중 감소와 관련된 치료 군이 원 중량의 10% 내로 회복되는 경우, 투여량을 감소시키거나 투여 계획 횟수를 줄여서, 투여를 재개할 수 있다. 비처리의 경우를 제외하고, 체중 % 회복율은 경우에 따라 기준으로 할 수 있다.
· 종료점 TGD. 동물들을 개별적으로 모니터링해야 한다. 종양 용적이 2000mm3이 되거나 또는 60일 경과 중 선행 시점에, 실험을 종료한다. 반응이 있는 경우, 더 오래 추적할 수 있다. 종료점에 도달하는 경우, 동물들을 안락사시킨다.
일반적인 방법론적 접근법
군 평균 종양 용적의 계산시, 하기 규칙을 적용하였다: 종양 용적으로 인해 연구에서 제외되는 동물의 경우, 상기 동물에서 기록된 최종 종양 용적을 추후 시점에 평균 용적 계산시 이용되는 데이타에 포함시킨다. 오차 막대는 평균의 표준 오차 (SEM)를 나타낸다. 연구에서, 한 군에 50% 미만의 동물이 남아 있는 경우, 군 평균 종양 용적 계산시, 종양 용적 값을 사용하지 않았다. Prism (GraphPad, San Diego, CA)을 그래프 제시 및 통계적 분석을 위해 사용하였다.
결과
도 4는 RB4v1.2-ADC에 대한 약물 링커 선택을 나타낸다. 실험 군 당 평균 종양 용적이 0.1 cm3에 도달하는 경우, 마우스에 투여하고, 꼬리 정맥 내로 0.3 및 1 mg/kg (ADC 결합) 및 1 mg/kg (ADC 비결합)의 ADC 단일 투여로 처리하였다. 데이타는 각 군에서 10 마리의 마우스의 평균 종양 값 (+/- SEM)을 나타낸다.
RB4v1.2-A, -E 및 -D 모두는 항-종양 활성을 나타내었고, RB4v1.2-E 및 -D는 RB4v1.2-A 보다 더욱 강하게 나타났다 (도 4 참조). 비결합 ADC 대조군 (B12-A 및 B12-E)은 현저한 항-종양 활성을 나타내지 않았다.
약자
Ac 아세틸
Acm 아세트아미도메틸
Alloc 알릴옥시카르보닐
Boc 디-tert-부틸 디카르보네이트
t-Bu tert-부틸
Bzl 벤질 (Bzl-OMe는 메톡시벤질이고, Bzl-Me는 메틸벤젠임)
Cbz 또는 Z 벤질옥시-카르보닐 (여기서, z-Cl 및 Z-Br은 각각 클로로- 및 브로모벤질옥시 카르보닐임)
DMF N,N-디메틸포름아미드
Dnp 디니트로페닐
DTT 디티오트레이톨
Fmoc 9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐
imp N-10 이민 보호 기: 3-(2-메톡시에톡시)프로파노에이트-Val-Ala-PAB
MC-OSu 말레이미도카프로일-O-N-숙신이미드
Moc 메톡시카르보닐
MP 말레이미도프로판아미드
Mtr 4-메톡시-2,3,6-트리메틸벤젠술포닐
PAB 파라-아미노벤질옥시카르보닐
PEG 에틸렌옥시
PNZ p-니트로벤질 카르바메이트
Psec 2-(페닐술포닐)에톡시카르보닐
TBDMS tert-부틸디메틸실릴
TBDPS tert-부틸디페닐실릴
Teoc 2-(트리메틸실릴)에톡시카르보닐
Tos 토실
Troc 2,2,2-트리클로르에톡시카르보닐 클로라이드
Trt 트리틸
Xan 크산틸
서열
서열번호 1 (RB4v1.0 VH):
QVQLVQPGAEVVKPGASVKLSCKTSGYTFTSNWMHWVKQRPGQGLEWIGEIDPSDSYTNYNQNFKGKAKLTVDKSTSTAYMEVSSLRSDDTAVYYCARGSNPYYYAMDYWGQGTSVTVS
서열번호 2 (RB4v1.2 VH):
QVQLVQPGAEVVKPGASVKLSCKTSGYTFTSNWMHWVKQAPGQGLEWIGEIDPSDSYTNYNQNFQGKAKLTVDKSTSTAYMEVSSLRSDDTAVYYCARGSNPYYYAMDYWGQGTSVTVS
서열번호 3 (B43 VH):
QVQLLESGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIWPGDGDTNYNGKFKGKATLTADESSSTAYMQLSSLRSEDSAVYSCARRETTTVGRYYYAMDYWGQGTTVT
서열번호 4 (HD37 VH):
QVQLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIWPGDGDTNYNGKFKGKATLTADESSSTAYMQLSSLASEDSAVYFCARRETTTVGRYYYAMDYWGQGTSVTVS
서열번호 5 (4G7 VH):
EVQLQQSGPELIKPGASVKMSCKASGYTFTSYVMHWVKQKPGQGLEWIGYINPYNDGTKYNEKFKGKATLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCARGTYYYGSRVFDYWGQGTTLTVS
서열번호 6 (FMC63 VH):
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서열번호 7 (RB4v1.0 VK):
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서열번호 8 (RB4v1.2 VK):
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서열번호 9 (B43 VK):
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서열번호 10 (HD37 VK):
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서열번호 11 (4G7 VK):
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서열번호 12 (FMC63 VK):
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEIT
<110> ADC Therapeutics Sarl MEDIMMUNE LIMITED <120> Pyrrolobenzodiazepine - Antibody Conjugates <130> IPA150330-GB <150> US 61/712,924 <151> 2012-10-12 <150> US 61/712,928 <151> 2012-10-12 <150> US 61/784,421 <151> 2013-03-14 <150> US 61/784,362 <151> 2013-03-14 <150> US 61/784,383 <151> 2013-03-14 <160> 12 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: Antibody sequence RB4v1.0 VH of PCT/EP2013/071346 <400> 1 Gln Val Gln Leu Val Gln Pro Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Asn 20 25 30 Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Asn Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Val Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ser Asn Pro Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr 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Claims (114)

  1. DL이 하기 화학식 I 또는 II이의 것인, 화학식 L - (DL)p의 컨주게이트:
    Figure pct00169

    여기서,
    L은 CD19에 결합하는 항체 (Ab)이고, 상기 항체는 서열번호 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 중 임의의 하나에 따른 서열을 갖는 VH 도메인을 포함하고, 임의적으로, 서열번호 7, 8, 9, 10, 11 또는 12 중 임의의 하나에 따른 서열을 갖는 VL 도메인을 추가로 포함하며,
    C2' 및 C3' 사이에 이중 결합이 존재하는 경우, R12는 하기 군에서 선택되고:
    (ia) 할로, 니트로, 시아노, 에테르, 카르복시, 에스테르, C1-7 알킬, C3-7 헤테로시클릴 및 비스-옥시-C1-3 알킬렌을 포함하는 군에서 선택되는 하나 또는 그 이상의 치환기에 의해 임의 치환된, C5-10 아릴기;
    (ib) C1-5 포화 지방족 알킬;
    (ic) C3-6 포화 시클로알킬;
    (id)
    Figure pct00170
    (여기서 각각의 R21, R22 및 R23 는 독립적으로 H, C1-3 포화 알킬, C2 -3 알케닐, C2 -3 알키닐 및 시클로프로필에서 선택되며, R12 기에서 탄소 원자의 총 수는 5 이하임);
    (ie)
    Figure pct00171
    (여기서 R25a 및 R25b 중 하나는 H이고 다른 하나는 할로, 메틸, 메톡시에서 선택되는 기에 의해 임의 치환된 페닐; 피리딜; 및 티오페닐에서 선택됨); 및
    (if)
    Figure pct00172
    (여기서 R24가 H; C1 -3 포화 알킬; C2 -3 알케닐; C2 -3 알키닐; 시클로프로필; 할로, 메틸, 메톡시에서 선택되는 기에 의해 임의 치환된 페닐; 피리딜; 및 티오페닐에서 선택됨);
    C2' 및 C3' 사이에 단일 결합이 존재하는 경우, R12는
    Figure pct00173
    이고, 여기서 R26a 및 R26b 는 H, F, C1 -4 포화 알킬, C2 -3 알케닐에서 독립적으로 선택되거나(여기서 알킬 및 알케닐기는 C1 -4 알킬 아미도 및 C1 -4 알킬 에스테르에서 선택된 기에 의해 임의 치환됨), 또는 R26a 및 R26b 중 하나가 H인 경우, 다른 하나는 니트릴 및 C1-4 알킬 에스테르에서 선택되고;
    R6 및 R9는 독립적으로 H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR', 니트로, Me3Sn 및 할로에서 선택되고;
    여기서, R 및 R'는 독립적으로 임의로 치환된 C1 -12 알킬, C3 -20 헤테로시클릴 및 C5 -20 아릴기에서 선택되며;
    R7은 H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NHRR', 니트로, Me3Sn 및 할로에서 선택되고;
    R"는 사슬에 하나 이상의 헤테로 원자, 예를 들어 O, S, NRN2(여기서 RN2는 H 또는 C1 -4 알킬임) 및/또는 방향족 고리, 예를 들어 벤젠 또는 피리딘이 개재할 수 있는 C3 -12 알킬렌기이며;
    Y 및 Y'는 O, S 또는 NH에서 선택되며;
    R6', R7', R9'는 각각 R6, R7 및 R9와 동일한 기에서 선택되고,
    [화학식 I]
    RL1'은 항체 (Ab)와의 연결을 위한 링커이고;
    R11a는 OH, ORA (여기서, RA는 C1 -4 알킬임) 및 SOzM (여기서, z는 2 또는 3이고, M은 1가의 약학적으로 허용가능한 양이온임)에서 선택되고;
    R20 및 R21은 함께, 이들이 결합된 질소 원자와 탄소 원자 사이에 이중 결합을 형성하거나;
    R20은 H 및 RC (여기서, RC는 캡핑기임)에서 선택되고;
    R21은 OH, ORA 및 SOzM에서 선택되고;
    C2 및 C3 사이에 이중 결합이 존재하는 경우, R2는 하기로 이루어진 군에서 선택되고:
    (ia) 할로, 니트로, 시아노, 에테르, 카르복시, 에스테르, C1 -7 알킬, C3 -7 헤테로시클릴 및 비스-옥시-C1 -3 알킬렌을 포함하는 군에서 선택되는 하나 또는 그 이상의 치환기에 의해 임의 치환된 C5 -10 아릴 기;
    (ib) C1 -5 포화 지방족 알킬;
    (ic) C3 -6 포화 시클로알킬;
    (id)
    Figure pct00174
    (여기서, R11, R12 및 R13 각각은 독립적으로 H, C1 -3 포화 알킬, C2 -3 알케닐, C2 -3 알키닐 및 시클로프로필에서 선택되고, R2 기의 탄소 원자의 총 수는 5 이하임);
    (ie)
    Figure pct00175
    (여기서, R15a 및 R15b 중 하나는 H이고, 나머지 하나는 할로, 메틸, 메톡시에서 선택되는 기에 의해 임의 치환된 페닐; 피리딜; 및 티오페닐에서 선택됨);
    (if)
    Figure pct00176
    (여기서, R14는 H; C1 -3 포화 알킬; C2 -3 알케닐; C2 -3 알키닐; 시클로프로필; 할로, 메틸, 메톡시에서 선택되는 기에 의해 임의 치환된 페닐; 피리딜; 및 티오페닐에서 선택됨);
    C2 및 C3 사이에 단일 결합이 존재하는 경우,
    R2는
    Figure pct00177
    이고, 여기서, R16a 및 R16b는 독립적으로 H, F, C1 -4 포화 알킬, C2 -3 알케닐 (여기서, 알킬 및 알케닐 기는 C1 -4 알킬 아미도 및 C1 -4 알킬 에스테르에서 선택되는 기에 의해 임의 치환됨)에서 선택되거나; 또는 R16a 및 R16b 중 하나가 H인 경우, 나머지 하나는 니트릴 및 C1 -4 알킬 에스테르에서 선택되고;
    [화학식 II ]
    R22는 화학식 IIIa, 화학식 IIIb 또는 화학식 IIIc이고:
    (a)
    Figure pct00178

    (여기서, A는 C5 -7 아릴 기이고,
    (i) Q1은 단일 결합이고, Q2는 단일 결합 및 -Z-(CH2)n- (여기서, z는 단일 결합, O, S 및 NH에서 선택되고, n은 1 내지 3임)에서 선택되거나; 또는
    (ii) Q1은 -CH=CH-이고, Q2는 단일 결합임);
    (b)
    Figure pct00179

    (여기서, RC1, RC2 및 RC3 은 독립적으로 H 및 치환되지 않은 C1 -2 알킬에서 선택됨);
    (c)
    Figure pct00180

    (여기서, Q는 O-RL2', S-RL2', 및 NRN-RL2'에서 선택되고, RN은 H, 메틸 및 에틸에서 선택됨)
    X는 O-RL2', S-RL2', CO2-RL2', CO-RL2', NH-C(=O)-RL2', NHNH-RL2', CONHNH-RL2',
    Figure pct00181
    , NRNRL2' (여기서, RN은 H 및 C1 -4 알킬을 포함하는 군에서 선택됨) 포함하는 군에서 선택되고;
    RL2'은 항체 (Ab)와의 연결을 위한 링커이고;
    R10 및 R11은 함께, 이들이 결합된 질소 원자 및 탄소 원자 사이에서 이중 결합을 형성하거나;
    R10은 H이고, R11은 OH, ORA 및 SOzM에서 선택되고;
    R30 및 R31은 함께, 이들이 결합된 질소 원자 및 탄소 원자 사이에서 이중 결합을 형성하거나;
    R30은 H이고, R31은 OH, ORA 및 SOzM에서 선택된다.
  2. 제1항에 있어서, 컨주게이트가 ConjA, ConjB, ConjC, ConjD 또는 ConjE가 아닌 것인, 컨주게이트:
    ConjA
    Figure pct00182
    ;
    ConjB
    Figure pct00183
    ;
    ConjC
    Figure pct00184
    ;
    ConjD
    Figure pct00185
    ; 또는
    ConjE:
    Figure pct00186
    .
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, R7이 H, OH 및 OR에서 선택되는 것인, 컨주게이트.
  4. 제3항에 있어서, R7이 C1 -4 알킬옥시기인, 컨주게이트.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, Y가 O인, 컨주게이트.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, R"이 C3 -7 알킬렌인, 컨주게이트.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, R9가 H인, 컨주게이트.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, R6이 H 및 할로에서 선택되는 것인, 컨주게이트.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, C2' 및 C3' 사이에 이중결합이 존재하고, R12가 C5 -7 아릴 기인, 컨주게이트.
  10. 제9항에 있어서, R12가 페닐인, 컨주게이트.
  11. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, C2' 및 C3' 사이에 이중결합이 존재하고, R12가 C8 -10 아릴 기인, 컨주게이트.
  12. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, R12가 1 내지 3 개의 치환 기를 보유하는 것인, 컨주게이트.
  13. 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치환기가 메톡시, 에톡시, 플루오로, 클로로, 시아노, 비스-옥시-메틸렌, 메틸-피페라지닐, 모르폴리노 및 메틸-티오페닐에서 선택되는 것인, 컨주게이트.
  14. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, C2' 및 C3' 사이에 이중결합이 존재하고, R12가 C1 -5 포화 지방족 알킬 기인, 컨주게이트.
  15. 제16항에 있어서, R12가 메틸, 에틸 또는 프로필인, 컨주게이트.
  16. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, C2' 및 C3' 사이에 이중결합이 존재하고, R12가 C3 -6 포화 시클로알킬 기인, 컨주게이트.
  17. 제16항에 있어서, R12가 시클로프로필인, 컨주게이트.
  18. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, C2' 및 C3' 사이에 이중 결합이 존재하고, R12가 화학식
    Figure pct00187
    의 기인, 컨주게이트.
  19. 제18항에 있어서, R12 기의 탄소 원자의 총 수가 4 이하인, 컨주게이트.
  20. 제19항에 있어서, R12 기의 탄소 원자의 총 수가 3 이하인, 컨주게이트.
  21. 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, R21, R22 및 R23 중 하나가 H이고, 다른 두 개의 기가 H, C1 -3 포화 알킬, C2 -3 알케닐, C2 -3 알키닐 및 시클로프로필에서 선택되는 것인, 컨주게이트.
  22. 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, R21, R22 및 R23 중 두 개가 H이고, 다른 하나의 기가 H, C1 -3 포화 알킬, C2 -3 알케닐, C2 -3 알키닐 및 시클로프로필에서 선택되는 것인, 컨주게이트.
  23. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, C2' 및 C3' 사이에 이중 결합이 존재하고, R12가 하기 화학식의 기인, 컨주게이트:
    Figure pct00188
  24. 제23항에 있어서, R12가 하기 기인, 컨주게이트:
    Figure pct00189
  25. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, C2' 및 C3' 사이에 이중 결합이 존재하고, R12가 하기 화학식의 기인, 컨주게이트:
    Figure pct00190
  26. 제25항에 있어서, R24가 H, 메틸, 에틸, 에테닐 및 에티닐에서 선택되는 것인, 컨주게이트:
  27. 제26항에 있어서, R24가 H 및 메틸에서 선택되는 것인, 컨주게이트:
  28. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, C2' 및 C3' 사이에 단일 결합이 존재하고, R12가
    Figure pct00191
    이고, R26a 및 R26b가 둘 모두 H인, 컨주게이트.
  29. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, C2' 및 C3' 사이에 단일 결합이 존재하고, R12가
    Figure pct00192
    이고, R26a 및 R26b가 둘 모두 메틸인, 컨주게이트.
  30. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, C2' 및 C3' 사이에 단일 결합이 존재하고, R12가
    Figure pct00193
    이고, R26a 및 R26b 중 하나가 H이고, 다른 하나가, 알킬 및 알케닐기가 임의로 치환된, C1 -4 포화 알킬, C2 -3 알케닐에서 선택되는 것인, 컨주게이트.
    [화학식 I]
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, C2 및 C3 사이에 이중 결합이 존재하고, R2가 C5 -7 아릴기인, 컨주게이트.
  32. 제31항에 있어서, R2가 페닐인, 컨주게이트.
  33. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, C2 및 C3 사이에 이중 결합이 존재하고, R1이 C8 -10 아릴 기인, 컨주게이트.
  34. 제31항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, R2가 1 내지 3 개의 치환 기를 보유하는 것인, 컨주게이트.
  35. 제31항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치환기가 메톡시, 에톡시, 플루오로, 클로로, 시아노, 비스-옥시-메틸렌, 메틸-피페라지닐, 모르폴리노 및 메틸-티오페닐에서 선택되는 것인, 컨주게이트.
  36. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, C2 및 C3 사이에 이중 결합이 존재하고, R2가 C1 -5 포화 지방족 알킬 기인, 컨주게이트.
  37. 제36항에 있어서, R2가 메틸, 에틸 또는 프로필인, 컨주게이트.
  38. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, C2 및 C3 사이에 이중 결합이 존재하고, R2가 C3 -6 포화 시클로알킬 기인, 컨주게이트.
  39. 제38항에 있어서, R2가 시클로프로필인, 컨주게이트.
  40. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, C2 및 C3 사이에 이중 결합이 존재하고, R2가 하기 화학식의 기인, 컨주게이트.
    Figure pct00194
  41. 제40항에 있어서, R2기의 탄소 원자의 총 수가 4 이하인, 컨주게이트.
  42. 제41항에 있어서, R2기의 탄소 원자의 총 수가 3 이하인, 컨주게이트.
  43. 제40항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, R11, R12 및 R13 중 하나가 H이고, 다른 두 개의 기는 H, C1 -3 포화 알킬, C2 -3 알케닐, C2 -3 알키닐 및 시클로프로필에서 선택되는 것인, 컨주게이트.
  44. 제40항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, R11, R12 및 R13 중 두 개가 H이고, 다른 기는 H, C1 -3 포화 알킬, C2 -3 알케닐, C2 -3 알키닐 및 시클로프로필에서 선택되는 것인, 화합물
  45. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, C2 및 C3 사이에 이중 결합이 존재하고, R2가 하기 화학식의 기인, 화합물:
    Figure pct00195
  46. 제45항에 있어서, R2가 하기의 기인, 컨주게이트:
    Figure pct00196
  47. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, C2 및 C3 사이에 이중 결합이 존재하고, R12가 하기 화학식의 기인, 컨주게이트:
    Figure pct00197
  48. 제47항에 있어서, R14가 H, 메틸, 에틸, 에테닐 및 에티닐에서 선택되는 것인, 컨주게이트.
  49. 제48항에 있어서, R14가 H 및 메틸에서 선택되는 것인, 컨주게이트.
  50. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, C2 및 C3 사이에 단일 결합이 존재하고, R2가
    Figure pct00198
    이고, R16a 및 R16b가 둘 모두 H인, 컨주게이트.
  51. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, C2 및 C3 사이에 단일 결합이 존재하고, R2가
    Figure pct00199
    이고, R16a 및 R16b가 둘 모두 메틸인, 컨주게이트.
  52. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, C2 및 C3 사이에 단일 결합이 존재하고, R2가
    Figure pct00200
    이고, R16a 및 R16b 중 하나가 H이고, 나머지 하나가 C1 -4 포화 알킬, C2 -3 알케닐 (여기서, 알킬 및 알케닐 기는 임의로 치환됨)에서 선택되는 것인, 컨주게이트.
  53. 제1항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, R11a가 OH인, 컨주게이트.
  54. 제1항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, R21이 OH인, 컨주게이트.
  55. 제1항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, R21이 OMe인, 컨주게이트.
  56. 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, R20이 H인, 컨주게이트.
  57. 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, R20가 RC인, 컨주게이트.
  58. 제57항에 있어서, RC가 Alloc, Fmoc, Boc, Troc, Teoc, Psec, Cbz 및 PNZ로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 컨주게이트.
  59. 제56항에 있어서, RC가 하기 기인, 컨주게이트:
    Figure pct00201

    상기 식에서, 별표 (*)는 N10 위치에 대한 부착 지점을 나타내고, G2는 종결 기이고, L3은 공유 결합이거나, 절단가능한 링커 L1이고, L2는 공유 결합이거나 또는 OC(=O)와 함께 자가 희생 링커 (self-immolative linker)를 형성한다.
  60. 제59항에 있어서, R2가 Ac 또는 Moc이거나, Alloc, Fmoc, Boc, Troc, Teoc, Psec, Cbz 및 PNZ로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 컨주게이트.
  61. 제1항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, R20 및 R21이 함께, 이들이 결합된 질소 원자와 탄소 원자 사이에 이중 결합을 형성하는 것인, 컨주게이트.
    [화학식 II]
  62. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, R22가 화학식 IIIa의 것이고, A가 페닐인, 컨주게이트.
  63. 제1항 내지 제30항 및 제62항 중 어느 한 항에 있어서, R22가 화학식 IIa의 것이고, Q1이 단일 결합인, 컨주게이트.
  64. 제62항에 있어서, Q2가 단일 결합인, 컨주게이트.
  65. 제62항에 있어서, Q2가 -Z-(CH2)n-이고, Z가 O 또는 S이고, n이 1 또는 2인, 컨주게이트.
  66. 제1항 내지 제30항 및 제62항 중 어느 한 항에 있어서, R22가 화학식 IIIa의 것이고, Q1이 -CH=CH-인, 컨주게이트.
  67. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, R22가 화학식 IIIb의 것이고, RC1, RC2 및 RC3이 독립적으로 H 및 메틸에서 선택되는 것인, 컨주게이트.
  68. 제67항에 있어서, RC1, RC2 및 RC3이 둘 모두 H인, 컨주게이트.
  69. 제67항에 있어서, RC1, RC2 및 RC3이 둘 모두 메틸인, 컨주게이트.
  70. 제1항 내지 제30항 및 제62항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, R22가 화학식 IIIa 또는 화학식 IIIb의 것이고, X가 O-RL2', S-RL2', CO2-RL2', -N-C(=O)-RL2'및 NH-RL2'에서 선택되는 것인, 컨주게이트.
  71. 제70항에 있어서, X가 NH-RL2' 인, 컨주게이트.
  72. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, R22가 화학식 IIIc의 것이고, Q가 NH-RL2'인, 컨주게이트.
  73. 제72항에 있어서, RN이 H 또는 메틸인, 컨주게이트.
  74. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, R22가 화학식 IIIc의 것이고, Q가 O-RL2' 또는 S-RL2'인, 컨주게이트.
  75. 제1항 내지 제30항 및 제62항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, R11이 OH인, 컨주게이트.
  76. 제1항 내지 제30항 및 제62항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, R11이 OMe인, 컨주게이트.
  77. 제1항 내지 제30항 및 제62항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, R10이 H인, 컨주게이트.
  78. 제1항 내지 제30항 및 제62항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, R10 및 R11이 함께, 이들이 결합된 질소 원자와 탄소 원자 사이에 이중 결합을 형성하는 것인, 컨주게이트.
  79. 제1항 내지 제30항 및 제62항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, R31이 OH인, 컨주게이트.
  80. 제1항 내지 제30항 및 제62항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, R31이 OMe인, 컨주게이트.
  81. 제1항 내지 제30항 및 제62항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, R30이 H인, 컨주게이트.
  82. 제1항 내지 제30항 및 제62항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, R30 및 R31이 함께, 이들이 결합된 질소 원자와 탄소 원자 사이에 이중 결합을 형성하는 것인, 컨주게이트.
  83. 제1항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, R6', R7', R9' 및 Y'이 R6, R7, R9 및 Y와 동일한 것인, 컨주게이트.
  84. 제1항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, L-RL1'또는 L-RL2'이 하기 기인, 컨주게이트:
    Figure pct00202

    상기 식에서, 별표 (*)는 PBD에 대한 부착 지점을 나타내고, Ab가 항체이고, L1은 절단가능한 링커이고, A는 L1을 항체에 연결시키는 연결 기이고, L2는 공유 결합이거나 또는 OC(=O)와 함께 자가 희생 링커를 형성한다.
  85. 제84항에 있어서, L1이 효소절단가능한 것인, 컨주게이트.
  86. 제84항 또는 제85항에 있어서, L1이 아미노산의 인접 서열을 포함하는 것인, 컨주게이트.
  87. 제86항에 있어서, L1이 디펩티드를 포함하고, 디펩티드 내의 -X1-X2- 기, -NH-X1-X2-CO-가 하기로부터 선택되는 것인, 컨주게이트:
    -Phe-Lys-,
    -Val-Ala-,
    -Val-Lys-,
    -Ala-Lys-,
    -Val-Cit-,
    -Phe-Cit-,
    -Leu-Cit-,
    -Ile-Cit-,
    -Phe-Arg-,
    -Trp-Cit-.
  88. 제87항에 있어서, 디펩티드 내의 -X1-X2- 기, -NH-X1-X2-CO-가 하기로부터 선택되는 것인, 컨주게이트:
    -Phe-Lys-,
    -Val-Ala-,
    -Val-Lys-,
    -Ala-Lys-,
    -Val-Cit-,
  89. 제88항에 있어서, 디펩티드 내의 -X1-X2- 기, -NH-X1-X2-CO-가 -Phe-Lys-, -Val-Ala- 또는 -Val-Cit-인, 컨주게이트.
  90. 제87항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, X2-CO- 기가 L2에 연결되는 것인, 컨주게이트.
  91. 제87항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서, NH-X1- 기가 A에 연결되는 것인, 컨주게이트.
  92. 제87항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, L2가 OC(=O)와 함께 자가 희생 링커를 형성하는 것인, 컨주게이트.
  93. 제92항에 있어서, C(=O)O 및 L2가 하기 기를 형성하는 것인, 컨주게이트:
    Figure pct00203

    상기 식에서, 별표 (*)는 PBD에 대한 부착 지점을 나타내고, 물결선은 링커 L1에 대한 부착 지점을 나타내고, Y는 NH, O, C(=O)NH 또는 C(=O)O이고, n은 0 내지 3이다.
  94. 제93항에 있어서, Y가 NH인, 컨주게이트:
  95. 제93항 또는 제94항에 있어서, n이 0인, 컨주게이트:
  96. 제94항에 있어서, L1 및 L2가 -OC(=O)-와 함께 하기에서 선택되는 기를 포함하는 것인 컨주게이트:
    Figure pct00204

    또는
    Figure pct00205

    상기 식에서, 별표 (*)는 PBD에 대한 부착 지점을 나타내고, 물결선은 링커 L1의 나머지 부분에 대한 부착 지점 또는 A에 대한 부착 지점을 나타낸다.
  97. 제96항에 있어서, 상기 물결선이 A에 대한 부착 지점을 나타내는 것인, 컨주게이트.
  98. 제84항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서, A가 하기 i) 또는 ii)인 컨주게이트:
    (i)
    Figure pct00206

    (상기 식에서, 별표 (*)는 L1에 대한 부착 지점을 나타내고, 물결선은 항체에 대한 부착 지점을 나타내고, n은 0 내지 6임); 또는
    (ii)
    Figure pct00207

    (상기 식에서, 별표 (*)는 L1에 대한 부착 지점을 나타내고, 물결선은 항체에 대한 부착 지점을 나타내고, n은 0 또는 1이고, m은 0 내지 30임).
  99. 제1항에 있어서, 하기 화학식 ConjA, ConjB, ConjC, ConjD 또는 ConjE의 것인, 컨주게이트:
    ConjA
    Figure pct00208
    ;
    ConjB
    Figure pct00209
    ;
    ConjC
    Figure pct00210
    ;
    ConjD
    Figure pct00211
    ; 또는
    ConjE:
    Figure pct00212
    .
  100. 제1항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 VL 도메인과 쌍을 이루는 VH 도메인을 포함하고, VH 및 VL 도메인이 하기로 이루어진 군에서 선택되는 서열을 갖는 것인, 컨주게이트:
    서열번호 1은 서열번호 7, 8, 9, 10, 11 또는 12 중 어느 하나와 쌍을 이루고;
    서열번호 2는 서열번호 7, 8, 9, 10, 11 또는 12 중 어느 하나와 쌍을 이루고;
    서열번호 3은 서열번호 7, 8, 9, 10, 11 또는 12 중 어느 하나와 쌍을 이루고;
    서열번호 4는 서열번호 7, 8, 9, 10, 11 또는 12 중 어느 하나와 쌍을 이루고;
    서열번호 5는 서열번호 7, 8, 9, 10, 11 또는 12 중 어느 하나와 쌍을 이루고;
    서열번호 6은 서열번호 7, 8, 9, 10, 11 또는 12 중 어느 하나와 쌍을 이룬다.
  101. 제100항에 있어서, 쌍을 이루는 VH 및 VL 도메인이, 서열번호 7과 쌍을 이루는 서열번호 1, 서열번호 8과 쌍을 이루는 서열번호 2, 서열번호 9와 쌍을 이루는 서열번호 3, 서열번호 10과 쌍을 이루는 서열번호 4, 서열번호 11과 쌍을 이루는 서열번호 5 또는 서열번호 12와 쌍을 이루는 서열번호 6의 서열을 갖는 것인, 컨주게이트
  102. 제1항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 본래의 항체 (intact antibody)인, 컨주게이트.
  103. 제1항 내지 제102항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 인간화, 탈면역화 또는 재표면화되는 것인, 컨주게이트.
  104. 제1항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서, 약물 (D) 대 항체 (Ab)의 약물 부하 (p)가 1 내지 약 8의 정수인, 컨주게이트.
  105. 제104항에 있어서, p가 1, 2, 3, 또는 4인, 컨주게이트.
  106. 제104항에 있어서, 항체-약물 컨주게이트 화합물의 혼합물을 포함하는 컨주게이트로서, 항체-약물 컨주게이트 화합물의 혼합물에서 항체 당 평균 약물 부하가 약 2 내지 약 5인, 컨주게이트.
  107. 제1항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, 치료법에 사용하기 위한 것인, 컨주게이트.
  108. 제1항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체의 증식성 질환의 치료에 사용하기 위한 것인, 컨주게이트.
  109. 제108항에 있어서, 상기 질환이 암인, 컨주게이트.
  110. 제1항 내지 제106항 중 어느 한 항의 컨주게이트 및 약학적으로 허용가능한 희석제, 담체 또는 부형제를 포함하는 약학적 조성물.
  111. 제110항에 있어서, 화학요법제의 치료학적 유효량을 추가로 포함하는, 약학적 조성물.
  112. 대상체의 증식성 질환의 치료에 사용하기 위한 의약품의 제조에서, 제1항 내지 제106항 중 어느 한 항에 따른 컨주게이트의 용도.
  113. 제110항의 약학적 조성물을 환자에 투여하는 단계를 포함하는 암 치료 방법.
  114. 제113항에 있어서, 상기 환자에 상기 컨주게이트와 조합하여, 화학요법제를 투여하는 것인, 방법.





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