Nothing Special   »   [go: up one dir, main page]

KR101397290B1 - 감소한 면역원성을 가지는 항-ｃｄ19 항체 - Google Patents

감소한 면역원성을 가지는 항-ｃｄ19 항체 Download PDF

Info

Publication number
KR101397290B1
KR101397290B1 KR1020087018761A KR20087018761A KR101397290B1 KR 101397290 B1 KR101397290 B1 KR 101397290B1 KR 1020087018761 A KR1020087018761 A KR 1020087018761A KR 20087018761 A KR20087018761 A KR 20087018761A KR 101397290 B1 KR101397290 B1 KR 101397290B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
antibody
ser
seq
amino acid
ala
Prior art date
Application number
KR1020087018761A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20080090485A (ko
Inventor
마이클 슈퍼
조나단 에이치 데이비스
파스칼 안드레 스테인
Original Assignee
메르크 파텐트 게엠베하
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 메르크 파텐트 게엠베하 filed Critical 메르크 파텐트 게엠베하
Publication of KR20080090485A publication Critical patent/KR20080090485A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101397290B1 publication Critical patent/KR101397290B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)

Abstract

개질된 가변부를 가지는 항-CD19 B4 항체가 개시된다. 개질된 항-CD19 가변부 폴리펩티드는 중쇄 가변부 또는 경쇄 가변부의 하나 이상의 골격부 또는 상보성 결정부에 대한 변경을 가져, 그로 인해 T-세포 반응을 감소시킨다.
항-CD19 B4 항체, 중쇄 가변부, 경쇄 가변부

Description

감소한 면역원성을 가지는 항-ＣＤ19 항체 {ANTI-CD19 ANTIBODIES WITH REDUCED IMMUNOGENICITY}
본 발명은 일반적으로 면역원성이 감소하도록 개질된 항-CD19 쥐과 단일 항체 B4 경쇄 및 중쇄의 가변부에 대한 것이다.
CD19는 B 세포 및 B 세포 유래 특정 암 세포, 예컨대 많은 B 세포 림프종에서 발견되는 표면 단백질이다. 항-CD19 단일 항체는 마우스에서 생성되고, B 세포-유래 암의 전임상적 동물 모델에서 얼마간의 가능성을 나타낸다. 그러나, 마우스 유래 항체는 일반적으로 인간 내에서 면역원성을 가진다. 마우스 유래 항체를 변형시켜 인간 내에서의 이들의 면역원성을 최소화하기 위한 많은 전략이 개발되어왔다. 이러한 하나의 전략인 키메라화(chimerization)는, 마우스 가변부를 인간 불변부에 융합시키는 것을 포함한다. 그러나, 키메라화 후 남아있는 마우스 유래 가변부 서열은 종종 면역원성일 것이다. 이러한 또 다른 전략인 인간화는, 결합 활성을 유지하기 위해 특정 아미노산을 상응하는 마우스 아미노산으로 되돌리도록 임의 역전시키는 것과 함께 가변부 중의 마우스 유래 골격부(FR)를 가장 가깝게 관련된 인간 유래 서열로 교체하는 것을 포함한다. 그러나, 심지어 인간화된 항체조차도 면역원성일 수 있는데, 이는 항체 상보성 결정부(CDR)가 일반적으로 이물질인 B 세포 에피토프 및 T 세포 에피토프를 함유하기 때문이다. 실제로, 심지어 인간 항체는 전부 면역원성이다; 이는 면역 반응 과정 동안 항유전형 항체 형성에 대한 근거이다. 상기 모든 문제는, 임의 다른 유형의 항체에 대해서와 마찬가지로 마우스 유래 항-CD19 항체에도 해당될 수 있다. 따라서, 감소한 면역원성을 가지는 항-CD19 항체가 필요하다.
발명의 요약
본 발명은 야생형 B4 항체와 비교하여 면역원성이 감소하도록 개질된 항-CD19 쥐과 단일클론 B4 항체에 대한 것이다. 보다 명확히, 잠재적 T-세포 에피토프를 제거하여 본 발명의 B4 항체의 가변부를 개질시켰다. 그 결과로서, 야생형 B4 항체와 비교하여 본 발명의 B4 항체는 개선된 생물학적 특성을 가진다.
따라서, 한 가지 측면에서 본 발명은, SEQ ID NO:22의 아미노산 잔기 1 ~ 30을 포함하는 개질된 면역 글로불린 중쇄 골격부를 특징으로 하는 아미노산 서열을 특징으로 하는데, 여기서 X5, X12, X19, X20, X23 및 X24 위치에서의 아미노산 잔기 중 하나 이상은 하기와 같다: X5는 Q 또는 E, X12는 V 또는 K, X19는 R 또는 K, X20은 L 또는 V, X23은 K, E 또는 D, 또는 X24는 T 또는 A이다. 본 발명의 상기 측면에 따르면, X5, X12, X19, X20, X23 또는 X24 위치에서의 아미노산 잔기 중 하나 이상은, SEQ ID NO:13의 아미노산 잔기 1 ~ 30에서 설명되는 것으로서 비개질된 면역 글로불린 중쇄 골격부에서의 상응하는 위치에서의 아미노산으로서인 아미노산 잔기와 동일하지 않다. 한 구현예에서, X23은 E 또는 D이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 SEQ ID NO:23의 아미노산 잔기 1 ~ 14를 포함 하는 개질된 면역 글로불린 중쇄 골격부를 특징으로 하는 아미노산 서열을 특징으로 하는데, 여기서 X3, X5, X7 및 X8 위치에서의 아미노산 잔기 중 하나 이상은 하기와 같다: X3는 K 또는 R, X5는 R, T 또는 A, X7은 G, D 또는 E, 또는 X8은 Q 또는 K이다. 본 발명의 상기 측면에 따르면, X3, X5, X7 또는 X8 위치에서의 아미노산 잔기 중 하나 이상은, SEQ ID NO:13의 아미노산 잔기 36 ~ 49에서 설명되는 것으로서 비개질된 면역 글로불린 중쇄 골격부에서의 상응하는 위치에서의 아미노산과 동일하지 않다. 한 구현예에서, X7은 E 또는 D이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 SEQ ID NO:24의 아미노산 잔기 1 ~ 39를 포함하는 개질된 면역 글로불린 중쇄 골격부를 특징으로 하는 아미노산 서열을 특징으로 하는데, 여기서 X6, X10, X26, X29 및 X34 위치에서의 아미노산 잔기 중 하나 이상은 하기와 같다: X6은 K, D 또는 E, X10은 K, E 또는 D, X26은 S, D 또는 E, X29는 S 또는 A, 또는 X34는 V 또는 T이다. 본 발명의 상기 측면에 따르면, X6, X10, X26, X29 또는 X34 위치에서의 아미노산 잔기 중 하나 이상은, SEQ ID NO:13의 아미노산 잔기 60 ~ 98에서 설명되는 것으로서 비개질된 면역 글로불린 중쇄 골격부에서의 상응하는 위치에서의 아미노산과 동일하지 않다. 한 구현예에서, X10은 E 또는 D이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 SEQ ID NO:32의 아미노산 잔기 1 ~ 23을 포함하는 개질된 면역 글로불린 경쇄 골격부를 특징으로 하는 아미노산 서열을 특징으로 하는데, 여기서 X1, X3, X7, X10, X11 및 X19 위치에서의 아미노산 잔기 중 하나 이상은 하기와 같다: X1은 Q 또는 D, X3은 V 또는 A, X7은 S 또는 E, X10은 I 또는 T, X11은 M 또는 L, 또는 X19는 V 또는 A이다. 본 발명의 상기 측면에 따르면, X1, X3, X7, X10, X11 또는 X19 위치에서의 아미노산 잔기 중 하나 이상은, SEQ ID NO:25의 아미노산 잔기 1 ~ 23에서 설명되는 것으로서 비개질된 면역 글로불린 경쇄 골격부에서의 상응하는 위치에서의 아미노산과 동일하지 않다. 한 구현예에서, X3은 A이고 X7은 E이다. 또 다른 구현예에서, X1은 D, X10은 I이고, X11은 L이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 SEQ ID NO:28의 아미노산 잔기 24 ~ 33을 포함하는 개질된 면역 글로불린 경쇄 상보성 결정부를 특징으로 하는 아미노산 서열을 특징으로 한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 SEQ ID NO:28의 아미노산 잔기 56 ~ 87을 포함하는 개질된 면역 글로불린 경쇄 골격부를 특징으로 하는 아미노산 서열을 특징으로 한다.
또 다른 측면에 따라, 본 발명은 SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30 또는 SEQ ID NO:31로 이루어지는 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 항체 가변부를 특징으로 하는데, 여기서 항체 가변부는 CD19에 특이적으로 결합한다.
또 다른 측면에 따라, 본 발명은 B4 항체 중쇄 가변부와 90% 이상 또는 95% 이상 동일한 폴리펩티드를 특징으로 하는데, 상기 폴리펩티드는 Val12, Leu20, Lys23, Thr24, Lys38, Gly42, Gln43, Lys65, Lys69, Ser85, Ser88 또는 Val93에 상 응하는 하나 이상의 잔기에서의 아미노산 치환을 포함한다. 한 구현예에서, 폴리펩티드는 Gln5Glu, Val12Lys, Arg19Lys, Leu20Val, Lys23Glu, Lys23Asp, Thr24Ala, Lys38Arg, Arg40Thr, Gly42Asp, Gly42Glu, Gln43Lys, Lys65Asp, Lys65Glu, Lys69Glu, Lys69Asp, Ser85Asp, Ser85Glu, Ser88Ala 또는 Val93Thr 치환 중 하나 이상을 포함한다.
또 다른 측면에 따라, 본 발명은 B4 항체 경쇄 가변부와 90% 이상 또는 95% 이상 동일한 폴리펩티드를 특징으로 하는데, 상기 폴리펩티드는 Val3, Ser7, Ile10, Met11, Val19, Val29, Ser51, Leu53, Ala54 또는 Ser75에 상응하는 하나 이상의 잔기에서의 아미노산 치환을 포함한다. 한 구현예에서, 폴리펩티드는 Gln1Asp, Val3Ala, Ser7Glu, Ile10Thr, Met11Leu, Val19Ala, Val29Ala, Ser51Asp, Leu53Thr, Ala54Asp 또는 Ser75Glu 치환 중 하나 이상을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 발명의 구현예 중 임의의 한 구현예에 따른 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 특징으로 한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 발명의 구현예 중 임의의 한 구현예에 따른 폴리펩티드의 치료적 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 환자의 치료 방법을 특징으로 한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 표면에 CD19를 가지는 세포를 타겟팅하는 방법을 특징으로 하는데, 상기 방법은 본 발명의 구현예 중 임의의 한 구현예에 따른 항체 가변부를 투여하는 단계를 포함한다. 본 방법의 한 구현예에서, 세포는 종양 세포이다.
요약하면, 본 발명은 하기에 대한 것이다:
ㆍ 인간에게 투여하는 경우 비개질된 B4 항체보다 덜 면역원성이지만, CD19에 특이적으로 결합하고 CD19를 발현하는 세포를 타겟팅하기에는 여전히 충분한 개질된 B4 항체로서, 하기의 면역 글로불린 중쇄 골격부 중 하나 이상을 포함하는 개질된 항체:
(i) QVQLX5QPGAEVX12KPGASVX19X20SCX23X24SGYTFT (SEQ ID NO:22)
[식 중,
X5는 Q 또는 E, X12는 V 또는 K, X19는 R 또는 K, X20은 L 또는 V, X23은 K, E 또는 D이고, X24는 T 또는 A임, 단 상기 위치에서의 아미노산 잔기 중 하나 이상은 SEQ ID NO:13의 아미노산 잔기 1 ~ 30 에서의 상응하는 위치에서의 아미노산과 동일하지 않음].
(ii) WVX3QX5PX7X8GLEWIG (SEQ ID NO:23)
[식 중,
X3은 K, X5는 R, A 또는 T, X7은 G이고, X8은 Q 또는 K임, 단 X5 또는 X8 위치에서의 아미노산 잔기 중 하나는 SEQ ID NO:13의 아미노산 잔기 36 ~ 49 에서의 상응하는 위치에서의 아미노산과 동일하지 않음].
(iii) YNQKFX6GKAX10LTVDKSSSTAYMEVSX26LTX29EDSAX34YYCAR (SEQ ID NO:24)
[식 중,
X6은 K, D 또는 E, X10은 K, E 또는 D, X26은 S, D 또는 E, X29는 S 또는 A이고, X34는 V 또는 T임, 단 상기 위치에서의 아미노산 잔기 중 하나 이상은 SEQ ID NO:13의 아미노산 잔기 60 ~ 98 에서의 상응하는 위치에서의 아미노산과 동일하지 않음].
ㆍ 중쇄 골격부 (i), (ii) 및 (iii)를 포함하는 상응하는 개질된 항체.
ㆍ 인간에게 투여하는 경우 비개질된 B4 항체보다 덜 면역원성이지만, CD19에 특이적으로 결합하고 CD19를 발현하는 세포를 타겟팅하기에는 여전히 충분한 상응하는 개질된 B4 항체로서, 하기의 면역 글로불린 경쇄 골격부를 포함하는 개질된 항체:
(iv) X1IX3LTQX7PAX10X11SASPGEKX19TMTC (SEQ ID NO:32)
[식 중,
X1은 Q 또는 D, X3은 V 또는 A, X7은 S 또는 E, X10은 I 또는 T, X11은 M 또는 L이고, X19는 V 또는 A임, 단 상기 위치에서의 아미노산 잔기 중 하나 이상은 SEQ ID NO:25의 아미노산 잔기 1 ~ 23 에서의 상응하는 위치에서의 아미노산과 동일하지 않음].
ㆍ X3은 A이고 X7은 E인, 상응하는 개질된 B4 항체;
ㆍ X1은 D, X10은 I이고, X11은 L인, 상응하는 개질된 B4 항체.
ㆍ 중쇄 골격부 (i), (ii) 및 (iii)과 경쇄 골격부 (iv)를 포함하는, 상응하는 개질된 B4 항체.
ㆍ 다음의 면역 글로불린 경쇄 상보성 결정부(CDR): SASSGANYMH (SEQ ID NO:28의 아미노산 잔기 24 ~ 33)를 포함하는, 상응하는 개질된 B4 항체.
ㆍ 인간에게 투여하는 경우 비개질된 B4 항체보다 덜 면역원성이지만, CD19에 특이적으로 결합하고 CD19를 발현하는 세포를 타겟팅하기에는 여전히 충분한 개질된 B4 항체로서, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21로 이루어지는 군에서 선택되는 하기의 중쇄 가변부 아미노산 서열 중 하나 이상을 포함하는 개질된 항체.
ㆍ 인간에게 투여하는 경우 비개질된 B4 항체보다 덜 면역원성이지만, CD19에 특이적으로 결합하고 CD19를 발현하는 세포를 타겟팅하기에는 여전히 충분한 개질된 B4 항체로서, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30 및 SEQ ID NO:31로 이루어지는 군에서 선택되는 하기의 경쇄 가변부 아미노산 서열 중 하나 이상을 포함하는 개질된 항체.
ㆍ 중쇄 가변부 아미노산 서열 SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21로 이루어지는 군에서 선택되는 서열 중 하나 이상을 포함하고, 경쇄 가변부 아미노산 서열 SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30 및 SEQ ID NO:31로 이루어지는 군에서 선택되는 서열 중 하나 이상을 포함하는, 상응하는 개질된 B4 항체.
ㆍ 하기 군에서 선택되는 중쇄 및 경쇄를 포함하는 상응하는 개질된 B4 항체:
(i) SEQ ID NO:14의 중쇄 가변부 및 SEQ ID NO:26의 경쇄 가변부;
(ii) SEQ ID NO:15의 중쇄 가변부 및 SEQ ID NO:27의 경쇄 가변부;
(iii) SEQ ID NO:16의 중쇄 가변부 및 SEQ ID NO:28의 경쇄 가변부;
(iv) 바람직하게는 SEQ ID NO:17의 중쇄 가변부 및 SEQ ID NO:29의 경쇄 가변부;
(v) 바람직하게는 SEQ ID NO:18의 중쇄 가변부 및 SEQ ID NO:29의 경쇄 가변부;
(vi) SEQ ID NO:20의 중쇄 가변부 및 SEQ ID NO:30의 경쇄 가변부; 및
(vii) SEQ ID NO:21의 중쇄 가변부 및 SEQ ID NO:31의 경쇄 가변부.
ㆍ 다음의 면역 글로불린 경쇄 상보성 결정부(CDR): SASSGANYMH (SEQ ID NO:28의 아미노산 잔기 24 ~ 33)를 포함하는, 상응하는 개질된 B4 항체.
ㆍ 인간에게 투여하는 경우 비개질된 B4 항체보다 덜 면역원성이지만 CD19에 특이적으로 결합하고 CD19를 발현하는 세포를 타겟팅하기에는 여전히 충분한, B4 항체의 중쇄 가변부와 90% 이상 동일한 폴리펩티드로서, Val12, Leu20, Lys23, Thr24, Gly42, Lys38, Lys65, Lys69, Ser85 또는 Val93에 상응하는 하나 이상의 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하는 폴리펩티드.
ㆍ B4 항체 중쇄 가변부와 95% 이상 동일한, 상응하는 폴리펩티드.?
ㆍ Gln5Glu, Val12Lys, Arg19Lys, Leu20Val, Lys23Glu, Lys23Asp, Thr24Ala, Lys38Arg, Gly42Asp, Gly42Glu, Lys65Asp, Lys65Glu, Lys69Glu, Lys69Asp, Ser85Asp, Ser85Glu 또는 Val93Thr 치환 중 하나 이상을 포함하는, 상응하는 폴리펩티드.
ㆍ 인간에게 투여하는 경우 비개질된 B4 항체보다 덜 면역원성이지만 CD19에 특이적으로 결합하고 CD19를 발현하는 세포를 타겟팅하기에는 여전히 충분한, B4 항체의 경쇄 가변부와 90% 이상 동일한, 상응하는 폴리펩티드로서, Val3, Ser7, Ile10, Met11, Val19, Val29, Ser51, Leu53, Ala54 또는 Ser75에 상응하는 하나 이상의 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하는 폴리펩티드.
ㆍ B4 항체 경쇄 가변부와 95% 이상 동일한, 상응하는 폴리펩티드.
ㆍ Gln1Asp, Val3Ala, Ser7Glu, Ile10Thr, Met11Leu, Val19Ala, Val29Ala, Ser51Asp, Leu53Thr, Ala54Asp 또는 Ser75Glu 치환 중 하나 이상을 포함하는, 상응하는 폴리펩티드.
ㆍ Gln5Glu, Val12Lys, Arg19Lys, Leu20Val, Lys23Glu, Lys23Asp, Thr24Ala, Lys38Arg, Gly42Asp, Gly42Glu, Lys65Asp, Lys65Glu, Lys69Glu, Lys69Asp, Ser85Asp, Ser85Glu 또는 Val93Thr 아미노산 치환을 포함하는 중쇄 폴리펩티드, 및 Gln1Asp, Val3Ala, Ser7Glu, Ile10Thr, Met11Leu, Val19Ala, Val29Ala, Ser51Asp, Leu53Thr, Ala54Asp 또는 Ser75Glu 아미노산 치환을 포함하는 경쇄 폴리펩티드를 포함하는 개질된 B4 항체.
ㆍ 상기 및 하기에 상술한 것과 같은 개질된 B4 항체 또는 상응하는 폴리펩티드를 인코딩하는 DNA 분자.?
ㆍ 상응하는 DNA 분자를 포함하는 발현 벡터.
ㆍ 상술한 것과 같은 개질된 B4 항체 또는 상응하는 폴리펩티드를 발현시키는 숙주 세포.
ㆍ 상기 및 하기에 상술한 것과 같은 항체 또는 폴리펩티드를 임의로는 약학적으로 허용 가능한 희석제, 담체 또는 부형제와 함께 약학적 유효량으로 포함하는, 암 및 자가면역 질환의 치료에 적합한 약학 조성물.
ㆍ 자가면역 질환 또는 암 치료용 약제 제조를 위한 상응하는 약학 조성물의 용도.
도면의 간략한 기술
도 1은 B4 항체 중쇄 가변부(B4 VH0)를 인코딩하는 핵산 서열(SEQ ID NO:1)을 나타낸다.
도 2는 돌연변이 K23E, G42D, K69E 및 S85D를 위한 코돈을 삽입한 바람직한 B4 항체 중쇄 가변부(B4 VHv1)를 인코딩하는 핵산 서열(SEQ ID NO:2)을 나타낸다.
도 3은 돌연변이 K69E 및 S85D를 위한 코돈을 삽입한 바람직한 B4 항체 중쇄 가변부(B4 VHv2)를 인코딩하는 핵산 서열(SEQ ID NO:3)을 나타낸다.
도 4는 돌연변이 Q5E, V12K, R19K, L20V, T24A, S85D 및 S88A를 위한 코돈을 삽입한 바람직한 B4 항체 중쇄 가변부(B4 VHv3)를 인코딩하는 핵산 서열(SEQ ID NO:4)을 나타낸다.
도 5는 돌연변이 Q5E, R19K, L20V, R40T, Q43K, K65D, S85D, S88A 및 V93T 를 위한 코돈을 삽입한 바람직한 B4 항체 중쇄 가변부(B4 VHv4)를 인코딩하는 핵산 서열(SEQ ID NO:5)을 나타낸다.
도 6은 돌연변이 Q5E, V12K, R19K, L20V, T24A, K38R, R40A, Q43K, K65D, S85D 및 V93T를 위한 코돈을 삽입한 바람직한 B4 항체 중쇄 가변부(B4 VHv5)를 인코딩하는 핵산 서열(SEQ ID NO:6)을 나타낸다.
도 7은 돌연변이 Q5E, R19K, L20V, K65D, S85D 및 V93T를 위한 코돈을 삽입한 바람직한 B4 항체 중쇄 가변부(B4 VHv6)를 인코딩하는 핵산 서열(SEQ ID NO:7)을 나타낸다.
도 8은 B4 항체 경쇄 가변부(B4 VK0)를 인코딩하는 핵산 서열(SEQ ID NO:8)을 나타낸다.
도 9는 돌연변이 V3A, S7E 및 A54D를 위한 코돈을 삽입한 바람직한 B4 항체 경쇄 가변부(B4 VKv1)를 인코딩하는 핵산 서열(SEQ ID NO:9)을 나타낸다.
도 10은 돌연변이 Q1D, I10T, M11L 및 A54D를 위한 코돈을 삽입한 바람직한 B4 항체 경쇄 가변부(B4 VKv2)를 인코딩하는 핵산 서열(SEQ ID NO:10)을 나타낸다.
도 11은 돌연변이 I10T, M11L, V19A, V29A 및 S75E를 위한 코돈을 삽입한 바람직한 B4 항체 경쇄 가변부(B4 VKv3)를 인코딩하는 핵산 서열(SEQ ID NO:11)을 나타낸다.
도 12는 돌연변이 I10T, M11L, V19A, S51D 및 L53T를 위한 코돈을 삽입한 바람직한 B4 항체 경쇄 가변부(B4 VKv4)를 인코딩하는 핵산 서열(SEQ ID NO:12)을 나타낸다.
도 13은 B4 항체 중쇄 가변부(B4 VH0)의 아미노산 서열(SEQ ID NO:13)을 나 타낸다.
도 14는 돌연변이 K23E, G42D, K69E 및 S85D를 위한 바람직한 B4 항체 중쇄 가변부(B4 VHv1)의 아미노산 서열(SEQ ID NO:14)을 나타낸다.
도 15는 돌연변이 K69E 및 S85D를 가지는 바람직한 B4 항체 중쇄 가변부(B4 VHv2)의 아미노산 서열(SEQ ID NO:15)을 나타낸다.
도 16은 돌연변이 Q5E, V12K, R19K, L20V, T24A, S85D 및 S88A를 가지는 바람직한 B4 항체 중쇄 가변부(B4 VHv3)의 아미노산 서열(SEQ ID NO:16)을 나타낸다.
도 17은 돌연변이 Q5E, R19K, L20V, R40T, Q43K, K65D, S85D, S88A 및 V93T를 가지는 바람직한 B4 항체 중쇄 가변부(B4 VHv4)의 아미노산 서열(SEQ ID NO:17)을 가진다.
도 18은 돌연변이 Q5E, V12K, R19K, L20V, T24A, K38R, R40A, Q43K, K65D, S85D 및 V93T를 가지는 바람직한 B4 항체 중쇄 가변부(B4 VHv5)의 아미노산 서열(SEQ ID NO:18)을 나타낸다.
도 19는 돌연변이 Q5E, R19K, L20V, K65D, S85D 및 V93T를 가지는 바람직한 B4 항체 중쇄 가변부(B4 VHv6)의 아미노산 서열(SEQ ID NO:19)을 나타낸다.
도 20은 돌연변이 V12K, K23E, G42D, K65D, K69E 및 S85D를 가지는 바람직한 B4 항체 중쇄 가변부(B4 VHv11)의 아미노산 서열(SEQ ID NO:20)을 나타낸다.
도 21은 돌연변이 Q5E, V12K, R19K, L20V, T24A, R40T, Q43K, K65D, S85D, S88A 및 V93T를 가지는 바람직한 B4 항체 중쇄 가변부(B4 VHv34)의 아미노산 서 열(SEQ ID NO:21)을 나타낸다.
도 22는 미정의된 아미노산 잔기 X5, X12, X19, X20, X23 및 X24를 가지는 바람직한 B4 항체 중쇄 골격부(B4 VHfr1)의 아미노산 서열(SEQ ID NO:22)을 나타낸다.
도 23은 미정의된 아미노산 잔기 X3, X5, X7 및 X8을 가지는 바람직한 B4 항체 중쇄 골격부 2(B4 VHfr2)의 아미노산 서열(SEQ ID NO:23)을 나타낸다.
도 24는 미정의된 아미노산 잔기 X6, X10, X26, X29 및 X34를 가지는 바람직한 B4 항체 중쇄 골격부 3(B4 VHfr3)의 아미노산 서열(SEQ ID NO:24)을 나타낸다.
도 25는 B4 항체 경쇄 가변부(B4 VK0)의 아미노산 서열(SEQ ID NO:25)을 나타낸다.
도 26은 돌연변이 V3A, S7E 및 A54D를 가지는 바람직한 B4 항체 경쇄 가변부(B4 VKv1)의 아미노산 서열(SEQ ID NO:26)을 나타낸다.
도 27은 돌연변이 Q1D, I10T, M11L 및 A54D를 가지는 바람직한 B4 항체 경쇄 가변부(B4 VKv2)의 아미노산 서열(SEQ ID NO:27)을 나타낸다.
도 28은 돌연변이 I10T, M11L, V19A, V29A 및 S75E를 가지는 바람직한 B4 항체 경쇄 가변부(B4 VKv3)의 아미노산 서열(SEQ ID NO:28)을 나타낸다.
도 29는 돌연변이 I10T, M11L, V19A, S51D 및 L53T를 가지는 바람직한 B4 항체 경쇄 가변부(B4 VKv4)의 아미노산 서열(SEQ ID NO:29)을 나타낸다.
도 30은 돌연변이 V3A, S7E, V19A, A54D 및 S75E를 가지는 바람직한 B4 항체 경쇄 가변부(B4 VKv11)의 아미노산 서열(SEQ ID NO:30)을 나타낸다.
도 31은 돌연변이 I10T, M11L, V19A, V29A, S51D, L53T 및 S75E를 가지는 바람직한 B4 항체 경쇄 가변부(B4 VKv34)의 아미노산 서열(SEQ ID NO:31)을 나타낸다.
도 32는 미정의된 아미노산 잔기 X1, X3, X7, X10, X11 및 X19를 가지는 바람직한 B4 항체 경쇄 골격부(B4 VKfr1)의 아미노산 서열(SEQ ID NO:32)을 나타낸다.
도 33은 미정의된 아미노산 잔기 X3, X5 및 X6을 가지는 바람직한 B4 항체 경쇄 상보성 결정부(B4 VKcdr2)의 아미노산 서열(SEQ ID NO:33)을 나타낸다.
도 34는 B4 항체 중쇄 가변부의 아미노산 서열을 나타낸다. 상보성 결정부에 밑줄을 그었다. 개질 가능한 아미노산 잔기를 굵은 글씨로 나타내었다.
도 35는 B4 항체 경쇄 가변부의 아미노산 서열을 나타낸다. 상보성 결정부에 밑줄을 그었다. 개질 가능한 아미노산 잔기를 굵은 글씨로 나타내었다.
도 36은 B4 항체 중쇄 가변부 VH0(SEQ ID NO:13), VHv1(SEQ ID NO:14), VHv2(SEQ ID NO:15), VHv3(SEQ ID NO:16), VHv4(SEQ ID NO:17), VHv5(SEQ ID NO:18), VHv11(SEQ ID NO:20) 및 VHv34(SEQ ID NO:21)의 아미노산 서열 배열이다.
도 37은 B4 항체 경쇄 가변부 VK0(SEQ ID NO:25), VKv1(SEQ ID NO:26), VKv2(SEQ ID NO:27), VKv3(SEQ ID NO:28), VKv4(SEQ ID NO:29), VKv11(SEQ ID NO:30) 및 VKv34(SEQ ID NO:31)의 아미노산 서열 배열이다.
도 38은 실시예 4에 기재된 것과 같이 HEK 293T 세포(빈 삼각형) 또는 YB2/0 세포(채워진 삼각형)로부터 발현되는 B4 VHv4/VKv4 항체, 및 NS/0 세포주(빈 원) 또는 YB2/0 세포(채워진 원)로부터 발현되는 B4 VHv5/VKv4 항체로 실행한 다우디 버킷 림프종(Daudi Burkitt's lymphoma) 세포에 대한 ADCC 분석법 결과를 나타낸다.
도 39는 실시예 5에 기재된 것과 같이 본 발명의 B4 VHv4/VKv4 항체(줄무늬 막대), Leu 16 항체(흰 막대) 또는 PBS(검은 막대)로 치료한, 인간 PBMC가 이식된 마우스의 치료 결과를 나타낸다.
도 40은 실시예 6에 기재된 것과 같이 본 발명의 B4 VHv4/VKv4 항체(빈 원) 또는 PBS(별)로 치료한, 나말와 림프종(Namalwa lymphoma) 세포를 가지는 마우스의 치료 결과를 나타낸다.
도 41은 실시예 7에 기재된 것과 같이 본 발명의 B4 VHv4/VKv4 항체(빈 삼각형), 시클로포스파미드(빈 사각형), B4 VHv4/VKv4 항체 및 시클로포스파미드의 배합물(빈 원) 또는 PBS(별)로 치료한, 다우디 버킷 림프종 세포를 가지는 마우스의 치료 결과를 나타낸다.
도 42는 실시예 8에 기재된 것과 같이 다양한 화학요법제와 병용한 본 발명의 항체로 치료한 나말와 림프종 세포를 가지는 마우스의 치료 결과를 나타낸다. 도 42(a)에서 치료법은 시클로포스파미드(빈 사각형), B4 VHv4/VKv4 항체(X), B4 VHv4/VKv4 항체 및 시클로포스파미드의 배합물(채워진 사각형) 또는 PBS(별)이다. 도 42(b)에서 치료법은 빈크리스틴(빈 삼각형), B4 VHv4/VKv4 항체(X), B4 VHv4/VKv4 항체 및 빈크리스틴의 배합물(채워진 삼각형) 또는 PBS(별)이다. 도 42(c)에서 치료법은 독소루비신(빈 원), B4 VHv4/VKv4 항체(X), B4 VHv4/VKv4 항체 및 독소루비신의 배합물(채워진 원) 또는 PBS(별)이다.
본 발명은 야생형 B4와 비교하여 감소된 면역원성을 가지는 B4 단백질에 대한 것뿐만 아니라, 이러한 단백질을 제조하고 사용하는 방법에 대한 것이다. 보다 자세하게는, 본 발명은 면역 반응을 자극할 수 있는 B4 내부의 T-세포 에피토프를 우선적으로 제거함으로써 B4 항체 자체의 면역원성을 감소시키는 효과를 가지는 B4 항체 내부의 돌연변이를 제공한다.
본 발명은 항-CD19 쥐과 항체 B4의 개질된 항체 중쇄(VH) 및 경쇄(VK) 가변부 집단[Nadler 등, (1983) J. Immunol. 130:2947 ~ 2951; Roguska 등, (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:969 ~ 973]에 대한 것인데, 본원에서는 각각 특유하게 "B4 VHvx" 및 "B4 VKvy"로 부른다. 참고로, CDR이 밑줄 쳐진 원형 쥐과 B4 항체의 중쇄 가변부(B4 VH0) 서열 및 원형 쥐과 B4 항체의 경쇄 가변부(B4 VK0) 서열을 각각 도 34 및 도 35에 제공한다.
원형 B4 VH0 및 B4 VK0 폴리펩티드와 비교하여, B4 VHvx 및 B4 VKvy 폴리펩티드는 감소된 면역원성을 가진다. 보다 자세하게는, 본 발명은 면역 반응을 자극할 수 있는 T-세포 에피토프를 상기 폴리펩티드 내부에서 우선적으로 제거함으로써 B4 가변부 폴리펩티드의 면역원성을 감소시키는 효과를 가지는 B4 VH 및/또는 B4 VK 내부의 돌연변이를 제공한다. 본 발명에 따라서, 인간에게 투여하는 경우 개질된 형태의 B4 가변부를 함유하는 단백질 조성물은 덜 면역원성이지만, CD19에 특이적으로 결합하고 CD19를 발현하는 세포를 타겟팅하기에는 여전히 충분하다.
본원에서 사용한 것처럼, "상보성 결정부" 및 "CDR"이라는 용어는 항원과 우선적으로 반응하는 면역 글로불린 가변부의 과가변부 또는 루프를 의미하는 것으로 이해된다. 도 34 및 도 35에 각각 나타낸 것과 같이, 면역 글로불린 중쇄 가변부(VH) 및 면역 글로불린 경쇄 가변부(VK) 둘 모두는 골격부 사이에 끼워진 세 개의 CDR을 함유한다. 예를 들어, 도 34에서 나타낸 것과 같은 B4 항체의 면역 글로불린 중쇄 가변부를 정의하는 아미노산 서열(SEQ ID NO:13)에 관하여, Ser31 내지 His35(CDR1), Glu50 내지 Asn59(CDR2) 및 Gly99 내지 Tyr109 (CDR3)의 아미노산 서열로써 CDR을 정의한다. 도 35에서 나타낸 것과 같은 B4 항체의 면역 글로불린 경쇄 가변부를 정의하는 아미노산 서열(SEQ ID NO:25)에 관하여, Ser24 내지 His33(CDR1), Asp49 내지 Ser55(CDR2) 및 His88 내지 Thr94(CDR3)의 아미노산 서열로써 CDR을 정의한다.
본원에 사용한 것처럼, "골격부" 및 "FR"이라는 용어는 상보성 결정부에 인접한 면역 글로불린 가변부 부위를 의미하는 것으로 이해된다. 도 34 및 도 35에 나타낸 것과 같이, 면역 글로불린 중쇄 가변부(VH) 및 면역 글로불린 경쇄 가변부(VK)는 각각 네 개의 FR을 함유한다. 예를 들어, 도 34에 나타낸 것과 같은 B4 항체의 면역 글로불린 중쇄 가변부를 정의하는 아미노산 서열(SEQ ID NO:13)에 관하여, Gln1 내지 Thr30(FR1), Trp36 내지 Gly49(FR2), Tyr60 내지 Arg98(FR3) 및 Trp110 내지 Ser120(FR4)의 아미노산 서열로써 FR을 정의한다. 도 35에 나타낸 것과 같은 B4 항체의 면역 글로불린 경쇄 가변부를 정의하는 아미노산 서열(SEQ ID NO:25)에 관하여, Gln1 내지 Cys23(FR1)으로부터, Trp34 내지 Tyr48(FR2), Gly56 내지 Cys87(FR3) 및 Phe95 내지 Lys104(FR4)의 아미노산 서열로써 FR을 정의한다. 또한, 도 34 및 도 35에서 굵은 글씨로 표현한 아미노산 잔기는 본 발명의 다양한 구현예에 따라 돌연변이될 수 있는 아미노산 잔기이다.
구조 기준 컴퓨터 모델링을 기반으로 한 예측을 포함하는 컴퓨터 및 비컴퓨터 방법의 다양성으로써, 또는 펩티드 합성 및 특이 MHC 클래스 II 분자 결합 시험 또는 면역원성 검정법으로써 T-세포 에피토프를 확인할 수 있다. 본 발명에 따라서 잠재적 T-세포 에피토프는, 분리된 펩티드로서 고려하는 경우 MHC 클래스 II 분자 또는 비-인간 종에서의 동등물에 결합할 것으로 예측되는 서열이다. 항원 가공의 다른 측면, 예컨대 항원 제시 세포로의 단백질의 흡수 효율, MHC 클래스 II로 결합할 수 있는 펩티드를 생성하는 온전한 단백질에서의 부위에서의 절단 효율 등을 고려하지 않고 잠재적 T-세포 에피토프를 정의한다. 따라서, 동물에 단백질을 투여한 후 MHC 클래스 II 상에 실제로 제시된 T-세포 에피토프의 집단은 잠재적 T-세포 에피토프의 아집단이다. 본 발명에 따라서, T-세포 에피토프는 MHC 클래스 II 분자와 반응하는 단백질 상의 에피토프이다. 이론에 속박됨 없이, T-세포 에피토프는 T-세포 발생 동안 음성 T-세포 선택 방법을 거치는 데 실패한 단백질의 아미노산 서열로 이해되고, 따라서 MHC 클래스 II 분자에 의해 제시되고 T-세포 수용체에 의해 인식될 것으로 기대될 것이다.
한 구현예에 따라, 본 발명은 B4 VH 및 B4 VK 부위의 면역원성을 감소시키는데 관한 방법을 제공한다. 본 발명의 한 구현예에 따라, B4 VH 또는 B4 VK의 서열에서 잠재적 비자기 T-세포 에피토프를 확인한다. 예를 들어, MHC 클래스 II 분자에 결합하는 펩티드를 모델링하는 것을 기반으로 하는 컴퓨터적 방법에 의해 잠재적 비자기 T-세포 에피토프를 확인한다. 이후 특정 아미노산 잔기로의 치환이 이루어져 잠재적 T-세포 에피토프 함유 펩티드의 MHC 클래스 II에 결합하는 능력이 감소하거나 또는 사라진다.
본 발명의 가변부의 개질된 단백질 서열.
한 구현예에 따라, 구조-기준 컴퓨터 모델링을 기반으로 특정 아미노산 돌연변이 또는 돌연변이들의 효과를 예측한다. 예를 들어, ProPred [http://www.imtech.res.in/raghava/propred; Singh 및 Raghava(2001) Bioinformatics 17:1236~1237]는 HLA-DR 대립형질에 결합하는 펩티드의 예측에 사용할 수 있는 공개적으로 활용가능한 웹 기반 도구이다. ProPred는 50개의 HLA-DR 대립형질 집단을 위해 Sturniolo에 의해 기재된 매트릭스 예측 알고리즘(Sturniolo 등, 1999, Nature Biotechnol. 17:555 ~ 561)을 기반으로 한다. 이러한 알고리즘을 사용하여, 멀티플 MHC 클래스 II에 결합할 것으로 예측되며 따라서 면역원성일 것으로 보이는, B4 VH 및 B4 VK 안에서의 다양한 펩티드 서열을 발견하였다. 상기 펩티드 서열 및 HLA-DR 대립형질에 대한 이의 예측되는 결합 빈도를 표 1에 나타내었다.
표 1에 관하여, 5 이상의 HLA-DR 대립형질에 결합하는 각 9-mer 펩티드의 서열을 B4 VH 부위(왼쪽 열) 또는 B4 부위(오른쪽 열) 중의 위치(#)에 따라 표시하였다. "결합 빈도"는, 가능한 한 50 대립형질 초과이고 펩티드가 임의의 결합 역치 초과, 상기 경우 20%로 결합하는 대립형질의 수이다. 결합 빈도의 "+"는 5 ~ 9 대립형질에 결합하는 펩티드를 나타내고, "++"는 10 ~19 대립형질에 결합하는 펩티드를 나타내며, "+++"는 20 ~ 50 대립형질에 결합하는 펩티드를 나타낸다. 20% 결합 역치는 Sturniolo 등에 의해 기재된 알고리즘으로써 계산한 이론적 최대 결합 점수에 대한 것이다.
표 1. 인간 HLA-DR 대립형질에 결합하는 것으로 예측되는 B4 V 부위의 선택된 펩티드.
VH T 세포 에피토프 (시작 위치) 결합 빈도 VK T 세포 에피토프 (시작 위치) 결합 빈도
(2) VQLQQPGAE
(12) VKPGASVRL
(18) VRLSCKTSG
(36) WVKQRPGQG
(60) YNQKFKGKA
(64) FKGKAKLTV
(80) YMEVSSLTS
(93) VYYCARGSN		 +
+
+++
+
+
+++
++
+		 (2) IVLTQSPAI
(3) VLTQSPAIM
(19) VTMTCSASS
(29) VNYMHWYQQ
(46) WIYDTSKLA
(47) IYDTSKLAS		 +++
++
+
+
++
+
B4 VH 및 B4 VK 폴리펩티드 중의 이러한 잠재적으로 면역원성인 서열은, 특정 펩티드의 인간 HLA-DR 대립형질에 대한 결합을 감소시키거나 또는 제거하는 특정 돌연변이를 도입시킴으로써 덜 면역원성이 될 수 있다(예를 들어 WO98/52976 및 WO00/34317 참조). 대안적으로는, 비인간 T-세포 에피토프가 돌연변이를 일으켜 인간 생식선 항체에 존재하는 인간 자기 에피토프에 상응한다(예를 들어 US 5,712,120 참조).
항체 가변부의 3차 및 4차 구조를 참고함으로써 적합한 돌연변이를 선택하기 위한 안내를 수득할 수 있다. 항체 가변 영역의 결정 구조는 당업계에 공지되어 있으며, FR의 구조가 일반적으로 서로 매우 유사한 것이 발견되었다. 구조가 측정되고, 1차 구조 배열로써 확인할 수 있는, 가장 가깝게 연관된 항체 중쇄 및 항체 경쇄 가변부로부터 항-CD19 항체 B4 VH0/VK0의 항체 가변부의 이론적 모델을 구축할 수 있다(Altschul 등, 1990, J. Mol. Biol. 215:403~415). B4 경쇄 및 중쇄를 해석된 구조에 대해 모델링하는 것에 스레딩 알고리즘(threading algorithm)을 사용하고(Marti-Renom 등, 2000, Annu Rev Biophys Biomol Struct 29:291~325), 또한 스레딩 구조를 추가로 다듬어 입체화학적으로 유리한 에너지를 수득할 수 있다(Weiner 등, 1984, J Am Chem Soc 106:765~784). PDB 데이터베이스 접근 코드 1FBI(단일클론 항체 F9.13.7의 Fab 조각) 및 1MIM(항-CD25 키메릭 항체 Sdz Chi621의 Fab 조각)에 의해 각각 명시된 해석된 중쇄 및 경쇄 구조가 상기 목적에 유용한 참고 구조임을 발견하였다.
바람직한 돌연변이는 단백질 발현, 접힘 또는 활성을 과도하게 억제하지는 않는다. 본 발명에 따라서, B4 VH 중의 Q5, V12, R19, L20, K23, T24, K38, R40, G42, Q43, K65, K69, S85, S88 또는 V93 위치에서의 아미노산 및 B4 VK 중의 Q1, V3, S7, I10, M11, V19, V29, S51, L53, A54 또는 S75 위치에서의 아미노산은, 발현될 항체의 능력을 여전히 유지하고 비개질된 형태의 B4와 필적할만한 수준에서 CD19에 결합하면서 돌연변이가 될 수 있다. 따라서 본 발명은 Q5, V12, R19, L20, K23, T24, K38, R40, G42, Q43, K65, K69, S85, S88 및 V93으로 이루어지는 아미노산 위치의 군에서 선택되는 VH 서열 중 하나 이상의 개질 및/또는 Q1, V3, S7, I10, M11, V19, V29, S51, L53, A54 및 S75로 이루어지는 아미노산 위치의 군에서 선택되는 VK 서열 중 하나 이상의 개질을 가지는 B4 항체를 포함한다.
본 발명에 따라 아미노산 치환을 가능하게 하는 것으로 발견된 특정 위치의 부분적 열거 목록을 상기 위치에서의 바람직한 치환과 함께 표 2에 나타내었다.
표 2. B4 V 부위에서의 치환.
B4 VH에서의 위치 치환 B4 VK에서의 위치 치환
Gln5
Val12
Arg19
Leu20
Lys23		 Glu
Lys
Lys
Val
Glu, Asp		 Gln1
Val3
Ser7
Ile10
Met11		 Asp
Ala
Glu
Thr
Leu
Thr24
Lys38
Arg40
Gly42
Gln43
 Ala
Arg
Ala, Thr
Asp, Glu
Lys
 Val19
Val29
Ser51
Leu53
Ala54		 Ala
Ala
Asp
Thr
Asp
Lys65
Lys69
Ser85
Ser88
Val93		 Asp, Glu
Glu, Asp
Asp, Glu
Ala
Thr		 Ser75 Glu
구현예 중 한 집단은 Q5E, V12K, R19K, L20V, K23E, T24A, K38R, R40T, G42D, Q43K, K65D, K69E, S85D, S88A 및 V93T에서 선택된 B4 VH 폴리펩티드 중의 아미노산 치환을 포함한다. 추가로 숙고한 치환은 K23D, G42E, K65E 및 K69D이다. 돌연변이의 특정 배합이 또한 유용한 것으로 발견된다. 예를 들어, 한 특정 구현예에서는 치환 K23E 및 K69E를 포함한다. 또 다른 구현예에서는, 예를 들어 B4 VHv1(SEQ ID NO:14)에서 나타낸 것과 같이 치환 G42D 및 S88A를 추가로 포함한다. 또 다른 특정 구현예에서는, VHv1이 치환 V12K 및 K65D를 추가로 포함한다(B4 VHv11)(SEQ ID NO:20). 추가적인 특정 구현예에서는, B4 VHv3(SEQ ID NO:16)로써 예시한 것과 같이 치환 Q5E, V12K, R19K, L20V, S85D 및 S88A를 포함한다. 더 추가적인 특정 구현예에서는, B4 VHv4(SEQ ID NO:17)로써 예시한 것과 같이 치환 Q5E, R19K, L20V, R40T, Q43K, K65D, S85D, S88A 및 V93T를 포함한다. 더 추가적인 특정 구현예에서는, B4 VHv5 (SEQ ID NO:18)로써 예시한 것과 같이 치환 Q5E, R19K, L20V, K38R, R40A, Q43K, K65D, S85D 및 V93T를 포함한다. 또 다른 특정 구현예에서는, B4 VHv34(SEQ ID NO:21)의 서열에 나타낸 것과 같이 B4 VHv3 및 B4 VHv4의 치환을 조합한다.
또 다른 구현예의 집단은 Q1D, V3A, S7E, I10T, M11L, V19A, V29A, S51D, L53T, A54D 및 S75E로부터 선택되는 B4 VK 폴리펩티드 중의 아미노산 치환을 포함한다. 한 특정 구현예에서는 치환 A54D를 포함한다. 돌연변이의 특정 조합물이 또한 유용한 것으로 발견된다. 예를 들어, 보다 특정한 구현예에서는, B4 VKv1(SEQ ID NO:26)으로써 예시한 것과 같이 치환 V3A 및 S7E를 추가로 포함하거나, 또는 B4 VKv2(SEQ ID NO:27)로써 예시한 것과 같이 치환 Q1D, I10T 및 M11L을 추가로 포함한다. 추가적인 구현예에서, B4 VKv11(SEQ ID NO:30)에 예시한 것과 같이 B4 VK1은 치환 V19A 및 S75E를 추가로 포함한다. 또 다른 구현예에서는, B4 VKv3(SEQ ID NO:28)로써 예시한 것과 같이 치환 I10T, M11L, V19A, V29A 및 S75E를 포함한다. 더 추가적인 특정 구현예에서는, B4 VKv4(SEQ ID NO:29)로써 예시한 것과 같이 치환 I10T, M11L, V19A, S51D 및 L53T를 포함한다. 또 다른 특정 구현예에서는, B4 VKv34(SEQ ID NO:31)의 서열에서 나타낸 것과 같이 B4 VKv3 및 B4 VKv4의 치환을 배합한다.
상기 언급한 본 발명의 B4 VHvx 및 B4 VKvx의 일부 바람직한 서열의 1차 구조 배열을 각각 도 36 및 도 37에 나타내었다. 굵은 글씨로 표시된 아미노산은 VH0 및 VK0의 위치에 있으며 본 발명에 따라 돌연변이가 될 수 있고, 밑줄 친 아미노산은 CDR을 나타낸다. VHv1-VHv34 및 VKv1-VKv34는 면역원성을 감소시키는 특정 아미노산 치환을 가지는 각각의 대표적인 중쇄 및 경쇄이다.
본 발명의 가변부 조성물은 본 발명의 하나 이상의 중쇄 또는 경쇄를 포함한다. 예를 들어, 한 구현예에서, 가변부는 B4 VHv1(SEQ ID NO:14) 및 B4 VK0(SEQ ID NO:25)을 함유한다. 또 다른 구현예에서, 가변부는 B4 VHv1(SEQ ID NO:14) 및 B4 VKv1(SEQ ID NO:26)을 함유한다. 또 다른 구현예에서, 가변부는 B4 VHv4(SEQ ID NO:17) 및 B4 VKv4(SEQ ID NO:29)를 함유한다. 또 다른 구현예에서, 가변부는 B4 VHv5(SEQ ID NO:23) 및 B4 VKv4(SEQ ID NO:29)를 함유한다. 본 발명에서 숙고한 완전한 집단의 B4 VHvx 및 B4 VKvy 폴리펩티드를 결합적으로 매치시킴으로써 본 발명의 다른 구현예를 용이하게 수득함이 인정된다. 하기에 보다 자세히 기재된 것처럼, 발현성 및 CD-19 결합 활성 뿐 아니라 감소된 면역원성을 위해, 이러한 배합물 예컨대 B4 VHvx/VKvy 항체를 함유하는 단백질 조성물을 분석함으로써, 유용한 배합물을 또한 실험적으로 결정한다.
본 발명의 가변부의 감소한 면역원성의 확인.
본 발명의 돌연변이가 실제로 감소한 면역원성을 가지는지 확인하기 위해 당업계에 잘 공지된 표준 실험적 시험을 사용할 수 있다. 예를 들어, T-세포 자극 분석법(예를 들어, Jones 등, 2004, J. Interferon Cytokine Res ., 24:560)을 사용할 수 있다. 이러한 분석법에서, 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 수득하여 표준 조건에 따라 배양한다. 임의적인 예비자극 후, 잠재적 MHC 클래스 II 에피토프에 상응하는 펩티드를 PBMC의 배양액에 첨가한다; PBMC를 추가로 인큐베이션하고, 이후 삼중수소 티미딘을 첨가한다. 펩티드는 최소 9-mer일 수 있거나, 또는 약 10 내지 15, 또는 15 초과의 아미노산을 가질 수 있다. 세포의 추가적인 인큐베이션 후, 삼중수소 티미딘을 DNA로 혼입시킨 후 표준 기술로 측정한다.
T-세포 자극 분석법은 하기의 메카니즘으로 작용하는 것으로 생각된다. 첫 번째로, 펩티드를 자극제로서 사용한다면, 펩티드는 PBMC 중 세포 상에 제시된 MHC 클래스 II 분자에 먼저 결합해야 한다. 두 번째로, MHC 클래스 II/펩티드 복합체는 CD4+ T-세포 상의 T-세포 수용체와 생산적으로 결합해야 한다. 만약 시험 펩티드가 MHC 클래스 II 분자와 충분히 단단하게 결합할 수 없다면, 신호가 생기지 않을 것이다. 만약 펩티드가 MHC 클래스 II 분자에 결합할 수 있다면, 특정 MHC 클래스 II/펩티드 복합체를 인지할 수 있는 적절히 재배열된 T-세포 수용체를 발현시키는 T-세포가 있다면, 신호가 생긴다. 그러나, 만약 이러한 T-세포가 음성 선별 방법의 결과로서 삭제되었다면, 신호는 생기지 않을 것이다. 상기 메카니즘은, 수득한 펩티드에 의한 자극 또는 자극 결핍에서부터 추측한 것과 같이, 단백질 서열의 면역원성에 관련된 것으로 고려된다.
적합한 T-세포 수용체의 발생 실패 또는 기타 비관련 T-세포의 증식(이후, T-세포군의 항상성이 유지됨)에 관련한 통계적 이유로 인하여, 인지하는 T-세포가 PBMC 군 중 매우 낮은 수로 존재한다면, 신호가 예측됨에도 불구하고 신호가 없을 수도 있다. 따라서, 위음성 결과가 일어날 수 있다. 이러한 고려 사항을 기반으로, 많은 수의 상이한 PBMC 공급원을 사용하고, 이들 시료를 독립적으로 시험하는 것이 중요하다. 또한, 인종적으로 다양한 집단의 인간으로부터 PBMC를 시험하고, 각 PBMC 군에 존재하는 MHC 클래스 II 대립형질을 측정하는 것이 일반적으로 유용하다.
표준 T-세포 분석법은, 트리튬 혼입 신호가 종종 배경 혼입보다 단지 2배 초과한다는 점에서 불리하다. 개질된 T-세포 분석법으로 본 발명의 단백질 및 펩티드를 또한 시험할 수 있는데, 예를 들어 정제한 CD4+ T-세포 및 정제한 수상돌기 세포를 시험 펩티드의 존재 하에 공배양한 후, 삼중수소 티미딘에 노출시킨 후 삼중수소 티미딘 혼입에 대해 분석한다. 상기 두 번째 분석법은 삼중수소 티미딘을 관련이 없는 세포 예컨대 CD8+ T-세포에 혼입시키는 장점을 가지는데, 본질적으로 제거되어, 따라서 배경이 감소한다.
세 번째 분석법은 감소한 면역원성을 가지는 후보 단백질을 영장류와 같은 동물에서 시험하는 것을 포함한다. 이러한 분석법은 일반적으로 B4 VHvx/VKvy 단백질 조성물 예컨대 항체의 시험을 포함하는데, 상기 기재된 것과 같은 세포계 분석법에서 잠재적 면역원성을 위해 개별적 성분 펩티드를 시험함으로써 설계하였다. 이러한 후보 B4 VHvx/VKvy 단백질 조성물을 설계하고 발현시키면, 상기 단백질을 동물에 주사함으로써 면역원성을 시험한다.
B4 VHvx/VKvy 단백질 조성물의 주사는 일반적으로 인간에서의 치료 용도 동안 예상되는 전달 경로와 동일한 방식으로 수행된다. 예를 들어, 피부층, 피하, 근육 내, 복강 내 주사 또는 정맥 주사를 사용할 수 있다. 하나 초과의 투여를 사용하는 경우, 투여는 상이한 경로에 의한 것일 수 있다.
면역원성 시험 목적으로, 보조제를 공동투여하여, 신호를 증가시키고, 사용하는데 필요한 동물의 수를 최소화하는 것이 유용할 수 있다. 보조제를 사용한다면, 보조제 결핍 단백질 성분 예컨대 메틸화되지 않은 CpG 디뉴클레오티드를 가지는 DNA, 박테리아성 지질 A, N-포르밀 메티오닌 또는 다른 박테리아성 비단백질 성분을 사용하는 것이 가능하다. 이론에 속박됨 없이, 단백질 함유 보조제를 피하기 위한 이론적 설명은 기타 단백질이 후보 단백질에 대한 항체 반응에 궁극적으로 기여할 T-세포 에피토프를 제공할 수 있다는 것이다.
후보 B4 VHvx/VKvy 단백질 조성물의 1회 이상의 투여 후, ELISA 방법과 같은 표준 기술로 항-유전형 항체의 존재를 시험한다. 본 발명의 B4 VHvx/VKvy 단백질 조성물이 본래의 B4 VH/VK 서열을 함유하는 상응 분자보다 덜 자주, 및 더 작은 정도까지 항체 형성을 유도함이 발견된다.
본 발명의 가변부의 다른 구성.
노출된 항체에서 본 발명의 V 부위의 용도에 추가하여, 본 발명의 V 부위를 항체 융합 단백질(독소, 면역 자극제 및 다른 단백질을 타겟팅하는 항체 융합 단백질 뿐 아니라 Fab, 단일쇄 Fv, 양특이적 항체 및 항체 공학의 당업계에 공지된 다른 구성에서의 항체 융합 단백질)로 형성시키는 것이 또한 가능하다.
본 발명의 특정한 구현예에서, 경쇄 가변부 및 중쇄 가변부를 각각 면역 글로불린의 경쇄 불변부 및 중쇄 불변부에 결합시킬 수 있다. 면역 글로불린 경쇄는 카파 또는 람다 사슬로서 지정된 불변부를 가진다. 본 발명의 특정 구현예에서, 경쇄 불변부는 카파 사슬이다. 중쇄 불변부, 및 이의 다양한 개질 및 조합을 하기에서 보다 자세히 토의한다.
Fc 부분
본 발명의 항체 가변 영역은 Fc 부분에 임의로 융합된다. 본원에서 사용한 것처럼, Fc 부분은 면역 글로불린, 바람직하게는 인간 면역 글로불린의 중쇄 불변부 유래 영역(조각, 유사체, 변이체, 돌연변이 또는 불변부 유도체를 포함)을 포함한다. 면역 글로불린 중쇄의 불변부는 자연적으로 발생하거나 또는 CH1, 힌지(hinge), CH2, CH3 및, 일부 중쇄 클래스용으로는 CH4 영역을 포함하는, 중쇄의 C-말단 부위의 적어도 일부분과 상동하는, 합성 제조된 폴리펩티드로서 정의된다. "힌지" 부위는 CH1 영역을 Fc 부분의 CH2-CH3 부위에 연결시킨다. 모든 포유류 면역 글로불린의 중쇄의 불변부는 광범위한 아미노산 서열 유사성을 보인다. 이러한 면역 글로불린 부분을 위한 DNA 서열은 당업계에 잘 공지되어 있다(예를 들어, Gillies 등, 1989, J. Immunol. Meth. 125:191 참조).
본 발명에서는, Fc 부분은 전형적으로 적어도 CH2 영역을 포함한다. 예를 들어, Fc 부분은 전체 면역 글로불린 중쇄 불변부(CH1-힌지-CH2-CH3)를 포함할 수 있다. 대안적으로, Fc 부분은 힌지 부분, CH2 영역 및 CH3 영역의 전체 또는 일부를 포함할 수 있다. 면역 글로불린의 불변부는 Fc 수용체(FcR) 결합 및 보체 결합으로 조정되는 것을 포함하는 많은 중요한 항체 효과기 기능에 책임을 가진다. 5개 주요 클래스의 중쇄 불변부가 있는데, IgA, IgG, IgD, IgE 및 IgM으로서 분류되고, 각각의 특유한 효과기 기능은 이소타입에 의해 지정된다.
예를 들어 IgG는 γ1, γ2, γ3 및 γ4의 4개의 γ 이소타입으로 분리되는데, 이는 각각 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4으로서도 또한 공지된다. IgG 분자는 항체의 IgG 클래스에 특이적인 3개 클래스의 Fcγ 수용체(FcγR, 즉 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII)를 포함하는 세포질 수용체의 다수 클래스와 반응할 수 있다. IgG가 FcγR 수용체에 결합하는 데에 중요한 서열은 CH2 및 CH3 영역 중에 있는 것으로 보고되었다.
항체, 특히 IgG 클래스의 널리 인지된 효과기 기능은 보체-의존 세포독성(CDC) 및 항체-의존 세포질 세포독성(ADCC)을 포함한다. 모든 IgG 하위클래스(IgG1, IgG2, IgG3, IgG4)는, 둘 모두의 활성에 가장 강력한 IgG1 및 IgG3으로 CDC 및 ADCC를 일정 정도까지 조정한다(Paul, Essential Immunology 4.sup.th Ed., p.62의 제 3장, 표 3). CDC는 다수의 메카니즘에 의해 일어나는 것으로 믿어진다; 한 메카니즘은 항체가 세포 표면 상의 항원에 결합하는 경우 개시된다. 항원-항체 복합체가 형성되고 나면, C1q 분자가 항원-항체 복합체에 결합하는 것으로 믿어진다. 이후 C1q는 자체적으로 절단되어 효소적 활성의 케스케이드 및 다른 보체 단백질(이는 목적하는 세포 표면에 결합하여, 예를 들어 세포 용해 및/또는 대식세포에 의한 소화를 통해 이의 사멸을 촉진함)의 절단을 개시한다. ADCC는 세포독성 세포(예컨대 자연 살해(NK) 세포, 대식세포 및 호중구) 상의 Fc 수용체가 세포 표면 상의 항원에 결합된 항체의 Fc 수용체에 결합하는 경우, 발생하는 것으로 믿어진다. Fc 수용체 결합 신호는 세포독성 세포가 표적 세포를 사멸시키도록 한다. 특징적으로, NK 세포는 오직 FcγRIIIa만 발현시키는 ADCC의 1차 조정자인 것으로 믿어진다.
이는 항체의 효과기 기능을 바꾸는 데 종종 유용하다. 예를 들어, 악성 B 세포와 관련된 암을 치료하거나 또는 B 세포 요소를 갖는 자가면역 질병을 치료하는 데 유용하여, 항체의 ADCC 활성을 강화시킨다. 이는 CD19에 대한 것에서처럼, 상대적으로 낮은 밀도로 존재하는 B 세포 표면 항원에 대한 항체의 ADCC 활성을 강화시키는 데 특히 유용할 수 있다(Niwa 등, 2005, Clin. Cancer Res. 11:2327 ~ 2336). B 세포 표면 상의 CD20에 대한 CD19의 항원 밀도가 대략 10배 낮은 것으로 생각된다. 모체 항체에 대한 항체의 ADCC 활성을 증가시키는 항체의 변형이 당업계에 공지되어 있고, 일반적으로 FcγRIII에 대한 변이체 항체의 결합 친화성을 증가시키는 개질과 상호 관련되어 있다(예를 들어 US Pat. No. 6,737,056 참조). 예를 들어, 돌연변이는 256, 290, 298, 312, 326, 330, 333, 334, 339, 360, 378 및 430에서 선택되는 하나 이상의 위치(IgGγ1에서의 위치를 참고하여)에서 Fc 부위로 도입된다(Kabat 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest , 1991 에 따른 수). 바람직한 돌연변이는 298, 333 및 334에서 선택되는 하나 이상의 위치에 있다. 예를 들어, 알라닌 치환이 도입될 수 있다.
항체의 ADCC 활성은 또한 항체를 제조하는 데 사용한 특정 세포주에 의해 영향 받는다. 예를 들어, 마우스 골수종 NS/0 세포(또는 SP2/0 세포)에서 제조한 항체는 일반적으로 낮은 ADCC를 가지고, 랫트 골수종 YO 세포(또는 YB2/0)에서 제조한 항체는 높은 ADCC를 가진다(Lifely 등, 1995, Glycobiology 5:813 ~ 822). 항체 발현에 사용한 세포주의 유형이, IgGγ1의 N297 에 상응하는 위치에서의 항체의 Fc 부위에 붙은 N-연결된 글리코실 사슬의 탄수화물 구조에 영향을 준다는 것이 당업계에 공지되어 있다. CHO 세포에서 제조한 항체의 탄수화물 구조는 푸코실화되는데, 반면 YB2/0에서 제조한 항체의 탄수화물 사슬은 푸코스가 크게 결핍되어 있다(Shinkawa 등, 2003, JBC 278:3466 ~ 3473). 탄수화물 구조 상의 푸코스 결핍 항체는 높은 친화성으로 인간 FcγRIIIa에 결합한다(Shields 등, 2002, JBC 277:26733~26740). 특정 구현예에서, 본 발명의 가변부를 가지는 항-CD19 항체는 항체의 Fc 부분의 N-연결된 글리코실 사슬 상에서 감소한 푸코실화를 가지는 것을 특징으로 한다.
또한, 이는 항체의 혈청 반감기를 바꾸는 데 종종 유용하다. 면역 글로불린 융합 단백질로서의 항체의 혈청 반감기는 Fc 수용체(FcR)에 결합하는 항체의 능력에 의해 영향 받는다(Gillies 등, Cancer Research, 1999, 59:2159~2166). IgG2 및 IgG4의 CH2 및 CH3 영역은, IgG1의 CH2 및 CH3 영역과 비교하여, 검출할 수 없거나 또는 감소한 Fc 수용체 결합 친화성을 가진다. 따라서, IgG2 또는 IgG4 이소타입으로부터 CH2 및/또는 CH3 영역을 사용함으로써 상기 특성을 가지는 항체의 혈청 반감기를 증가시킬 수 있다. 대안적으로, 항체는 이러한 영역 중 하나 이상의 아미노산의 개질된 IgG1 또는 IgG3로부터의 CH2 및/또는 CH3 영역을 포함하여, Fc 수용체에 대한 결합 친화성을 감소시킬 수 있다(예를 들어 U.S. 특허 출원 공보 2003-0105294로서 공개된 U.S. 특허 출원 일련 번호 09/256,156 참조).
Fc 부분의 힌지 부위는 보통 중쇄 불변부의 CH1 영역의 C-말단에 인접해 있다. 본 발명의 단백질에 포함되는 경우, 힌지는 자연적으로 발생하는 면역 글로불린 부위와 상동이고, 전형적으로 자연적 면역 글로불린에서의 디설파이드 결합을 통해 두 개의 중쇄를 연결하는 시스테인 잔기를 포함한다. 인간 및 마우스 면역 글로불린을 위한 힌지 부위의 대표적인 서열은 "항체 공학, 실질적인 안내"("ANTIBODY ENGINEERING, a PRACTICAL GUIDE", Borrebaeck, ed., W. H. Freeman and Co., 1992)에서 발견할 수 있다.
본 발명을 위한 적합한 힌지 부위는 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 및 다른 면역 글로불린 이소타입 유래일 수 있다. IgG1 이소타입은 힌지 부위에 두 개의 디설파이드 결합을 가지는데, 효율적이고 일정한 디설파이드 결합 형성을 가능하게 한다. 따라서, 본 발명의 바람직한 힌지 부위는 IgG1 유래이다. 임의로는, 첫째로, IgG1 힌지의 최대 N-말단 시스테인이 돌연변이가 되어 본 발명의 항체 또는 항체 융합 단백질의 조립 및 발현을 강화시킨다(예를 들어 U.S. 특허 출원 공보 2003-0044423으로서 공개된 U.S. 특허 출원 일련 번호 10/093,958 참조).
IgG1과는 반대로, IgG4의 힌지 부위는 사슬간 디설파이드 결합을 불충분하게 형성하는 것으로 알려져 있다(Angal 등, 1993, Mol. Immunol. 30:105 ~ 108). 또한, IgG2 힌지 부위는 4개의 디설파이드 결합을 가지는데, 재조합계 중의 분비 동안 혹여 옳지 않은 디설파이드 결합 및 올리고머화를 촉진하는 경향이 있다. 본 발명의 한 적합한 힌지 부위는 IgG4 힌지 부위 유래일 수 있고, 바람직하게는 중쇄 유래 부분 사이의 디설파이드 결합의 올바른 형성을 강화시키는 돌연변이를 함유한다(Angal 등, 1993, Mol. Immunol. 30(1):105~108). 또 다른 바람직한 힌지 부위는 IgG2 힌지 유래이고, 여기서 첫 번째 두 시스테인은 각각 또 다른 아미노산 예컨대 일반적인 선택 순으로 세린, 알라닌, 트레오닌, 프롤린, 글루타민산, 글루타민, 리신, 히스티딘, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 글리신, 메티오닌, 발린, 이소류신, 류신, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판 또는 셀리노시스테인으로 돌연변이 된다(예를 들어 U.S. 특허 출원 공보 2003-0044423 참조).
본 발명의 항체 가변부에 융합한 Fc 부분은 상이한 항체 이소타입에서 유래한 CH2 및/또는 CH3 영역 및 힌지 부위를 함유할 수 있다. 예를 들어, Fc 부분은 IgG2 또는 IgG4의 CH2 및/또는 CH3 영역 및 IgG1의 힌지 부위를 함유할 수 있다. 이러한 하이브리드 Fc 부분의 조립은 U.S. 특허 출원 공보 2003-0044423에 기재되었다.
본 발명의 항체 가변부가 융합한 경우, Fc 부분은 하나 이상의 아미노산 개질을 함유할 수 있어 일반적으로 Fc 융합 단백질의 혈청 반감기를 연장시킨다. 이러한 아미노산 개질은 Fc 수용체 결합 또는 보체 결합 활성을 실제적으로 감소시키거나 제거시키는 돌연변이를 포함한다. 예를 들어, 이러한 돌연변이의 한 유형은 면역 글로불린 중쇄의 Fc 부분의 글리코실화 부위를 제거한다. IgG1에서는, 글리코실화 부위는 Asn297(예를 들어 U.S. 특허 출원 공보 2003-0166163으로서 공개된 U.S. 특허 출원 일련 번호 10/310,719 참조)이다.
본 발명의 항체 가변부는 진단 및/또는 치료제에 결합할 수 있다. 작용제가 항체와 융합하여 융합 단백질이 제조될 수 있다. 대안적으로, 상기 작용제가 항체와 화학적으로 결합하여 면역 접합체가 제조될 수 있다. 상기 작용제는, 예를 들어 독소, 식별용 동위원소, 화상화제, 면역증강성 부분 등일 수 있다.
본 발명의 항체 가변부는 사이토카인에 결합할 수 있다. 바람직한 사이토카인은 인터루킨 예컨대 인터루킨-2(IL-2), IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-18, IL-21 및 IL-23, 조혈 인자 예컨대 과립구-대식세포 집락 자극 인자(GM-CSF), 과립구 집락 자극 인자(G-CSF) 및 에리스로포에틴(erythropoeitin), 종양 괴사 인자(TNF) 예컨대 TNFα, 림포카인 예컨대 림포톡신, 대사 과정 조절자 예컨대 렙틴, 인터페론 예컨대 인터페론 α, 인터페론 β 및 인터페론 γ, 및 케모카인을 포함한다. 바람직하게는, 항체-사이토카인 융합 단백질 또는 면역접합체는 사이토카인 생물학적 활성을 나타낸다. 한 구현예에서는, 항체 가변부가 IL-2에 융합한다. 바람직하게는, U.S. 특허 출원 공보 2003-0166163에 기재된 것 처럼 IL-2 부분 중의 몇몇 아미노산에 돌연변이가 일어나 독성이 감소한다.
임의로는, 단백질 복합체는 2차 작용제 예컨대 2차 사이토카인을 추가로 포함할 수 있다. 한 구현예에서, B4 VHvx/VKvy 항체 융합 단백질은 IL-12 및 IL-2를 포함한다. 면역 글로불린 영역 및 두 개의 상이한 사이토카인을 포함하는 단백질 복합체의 구성이 U.S. Pat. No. 6,617,135에 자세히 기재된다.
항체 제조
본 발명의 항체 뿐 아니라, 본 발명의 다른 가변부 함유 단백질을 단백질 공학의 당업계에 잘 공지된 방법으로 제조한다. 본 발명의 서열을 포함하는, 중쇄 및 경쇄를 발현할 수 있는 핵산 벡터를 적합한 세포로 도입시켜 재조합 단백질 생성물을 발현시키고 정제한다. 예를 들어, 본 발명의 항체를 유전자 조작한 포유류 세포주 예컨대 NS/0 세포, CHO 세포, SP2/0 세포(SP2/0-Ag14; ATCC-CRL 1581), YB2/0 세포(YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20; ATCC CRL-1662) 또는 항체 제조의 당업계에 잘 공지된 다른 포유류 세포에서 제조할 수 있다. 한 구현예에서, B4 VHvx/VKvy 항체를 NS/0 세포에서 제조한다. 또 다른 구현예에서, B4 VHvx/VKvy 항체를 YB2/0 세포에서 제조한다. 대안적으로는, 효모, 식물, 곤충 세포 또는 박테리아를 사용하여 본 발명의 가변부를 함유하는 단백질을 제조할 수 있다.
투여
본 발명의 항체는 바람직하게는 B 세포 장애 예컨대 B 세포 림프종 또는 B 세포 성분을 가지는 자가면역 장애 예컨대 류머티스성 관절염, 중증 근무력증, 다발성 경화증, 전신 홍반성 루푸스 등을 가지는 환자를 치료하는 데 사용한다. B 세포 림프종을 위해서는, 의사의 판단에 따라, 다른 치료 요법이 실패한 환자를 치료하는 데 유용할 수 있다. 예를 들어, 리툭산TM(RituxanTM)으로 치료한 일부 환자는 초기에 반응을 보일 수 있으나, 리툭산TM 내성 암 세포가 발생할 수 있다. 이러한 환자는 일반적으로 본 발명의 항체에 여전히 반응을 보일 것이다.
CD19에 대항하는 항체의 경우, 신체로부터 정상 B 세포를 배제시키는 것이 때때로 유용한데, 이러한 세포들이 본 발명의 항체를 적정하기 쉽기 때문이다. 리툭산TM은 표준 절차에 따라 상기 목적으로 사용할 수 있다. 대안적으로, 예를 들어, 실시예 5 및 실시예 9에 기재된 것처럼 본 발명의 항-CD 19 항체를 사용하여 신체로부터 정상 B 세포를 배제시킬 수 있다.
주입은 바람직한 투여법이다. 투여의 다른 방법은 주사 경로 예컨대 피하, 진피 내, 근육 내, 복강 내 또는 정맥 내(일시) 투여를 포함한다. 흡입 및 경구 투여 또한 가능한 투여법이다.
70 킬로그램 인간을 위한 전형적인 복용량은 약 50 밀리그램 내지 2 그램의 범위이고, 바람직한 복용량은 약 400 ~ 600 밀리그램 범위이다. 복용은 예를 들어 정상 B 세포 및 종양 세포를 모니터링 하는 동안, 매 3주 내지 6주마다 약 한번씩 반복할 수 있다.
본 발명의 융합 단백질은 인간 질병 예컨대 암의 치료에 유용하다. 암을 치료하는 경우, 예를 들어 0.1 내지 100 밀리그램/미터2/환자의 복용량으로 주입 또는 피하 주사함으로써 본 발명의 가변부를 포함하는 항체-IL-2 융합 단백질을 투여하는 것이 유용하다. 바람직한 구현예에서, 1 내지 10 밀리그램/미터2/환자(보다 바람직하게는 약 3 내지 6 밀리그램/미터2/환자)의 복용량으로 주입 또는 피하 주사함으로써 본 발명의 가변부를 포함하는 항체-IL-2 융합 단백질을 투여하는 것이 유용하다.
본 발명의 약학 조성물은 고체, 반고체 또는 액체 투약 형태 예컨대, 예를 들어 정제, 캡슐, 가루, 액체, 현탁액 등의 형태로, 바람직하게는 정확한 용량의 투여에 적합한 단위 제형의 형태로 사용할 수 있다. 조성물은 통상적인 약학 담체 또는 부형제를 포함하고, 추가로 다른 의학제, 약학제, 담체, 보조제 등을 포함할 수 있다. 이러한 부형제는 다른 단백질 예컨대, 예를 들어 인간 혈청 알부민 또는 플라즈마 단백질을 포함할 수 있다. 이러한 투약 형태를 제조하는 실제적인 방법은 당업자에게 공지되어 있거나 또는 명백한 것이다. 투여할 조성물 또는 제형은 임의 경우에, 치료하는 대상에서 원하는 효과를 얻기에 효과적인 양으로 활성 성분을 함유한다.
이의 조성물의 투여는 이러한 활성을 나타내는 작용제를 위한 임의의 허용되는 방식의 투여를 통할 수 있다. 이러한 방법은 국소 투여 또는 전신 투여이다. 약학적으로 허용 가능한 담체로의 정맥 주사가 바람직한 투여법이다. 투여한 활성 화합물의 양은, 물론 치료하는 대상, 고통의 중증도, 투여 방법 및 처방하는 의사의 판단에 의존할 것이다.
본 발명을 하기의 비제한적 실시예를 통해 추가로 설명한다.
실시예 1. 본 발명의 가변부 중쇄 및 경쇄를 함유하는 항- CD19 항체의 구성.
표준 유전 공학 기술을 사용하여 본 발명의 중쇄 및 경쇄 부위를 인코딩하는 핵산 서열을 적합한 포유류 발현 벡터로 도입시켰다. 바람직한 클로닝 기법을 하기에 기재하였다. 발현 벡터 pdHL12는 중쇄 및 경쇄 가변부를 인코딩하는 핵산 카세트의 삽입을 위한 고유한 제한 부위를 함유하도록 설계된 후세대 pdHL 발현 벡터이다. Nhe I / Hind III 조각으로서 중쇄 가변부를 인코딩하는 핵산, 및 Afl II / Bam HI 조각으로서 경쇄 가변부를 인코딩하는 핵산을 수용하고, 온전한 항체 중쇄 및 경쇄를 공발현하도록 pdHL12를 설계하였다(예를 들어 US 특허 출원 2003/0157054 참조).
엔도뉴클레아제 제한 인지 서열 5'-CTTAAGC-3(상류, Nhe I 부위 함유) 및 5'-CGTAAGTGGATCC-3'(하류, Hind III 부위 함유)을 가지는 서열에 의해 측면 배치된 본 발명의 중쇄 가변부의 핵산 서열을 새로(de novo) 합성하여 pUC 벡터-유래 담체 플라스미드(Blue Heron Biotechnology, Bothell, WA)로 삽입하였다. 핵산을 담체 플라스미드로부터 Nhe I / Hind III 조각으로서 잘라내어 마찬가지로 잘라 낸 pdHL12 플라스미드의 적합한 벡터 조각과 연결시켰다. B4 VH0(SEQ ID NO:1), B4 VHv1(SEQ ID NO:2), B4 VHv2(SEQ ID NO:3), B4 VHv3(SEQ ID NO:4), B4 VHv4(SEQ ID NO:5), B4 VHv5(SEQ ID NO:6) 및 B4 VHv6(SEQ ID NO:7)을 위한 핵산 서열을 나타내었다.
유사하게, 엔도뉴클레아제 제한 인지 서열 5'-GCTAGCTCCAGC-3(상류, Afl II 부위 함유) 및 5'-GGTAAGCTT-3'(하류, Bam HI 부위 함유)을 가지는 서열에 의해 측면 배치된 본 발명의 경쇄 가변부의 핵산을 새로 합성하여 pUC 벡터-유래 담체 플라스미드(Blue Heron Biotechnology, Bothell, WA)로 삽입하였다. 핵산을 담체 플라스미드로부터 Afl II / Bam HI 조각으로서 잘라내어 마찬가지로 잘라낸 pdHL12 플라스미드의 적합한 벡터 조각과 연결시켰다. B4 VK0(SEQ ID NO:8), B4 VKv1(SEQ ID NO:9), B4 VKv2(SEQ ID NO:10), B4 VKv3(SEQ ID NO:11) 및 B4 VKv4(SEQ ID NO:12)를 인코딩하는 핵산 서열을 나타내었다.
상이한 중쇄 및 경쇄 가변부를 인코딩하는 핵산 서열을 결합적으로 pdHL12에 삽입함으로써, 본 발명의 B4 항체, B4 VHvx/VKvy를 인코딩하는 플라스미드 패널이 생성되었다.
실시예 2. 본 발명의 항체의 발현 및 정제.
하기의 일반적인 기술을 이후의 실시예에 사용하였다.
1A. 세포 배양 및 트랜스펙션
포유류 세포로부터 항체를 일시적으로 발현시키기 위해, 인산칼슘으로 플라스미드 DNA를 공침시킴으로써 플라스미드 DNA를 인간 배아 신장 293 세포, 또는 베이비 햄스터 신장(BHK) 세포로 도입시키고, 세포는 플라스미드 유지를 위한 선별 없이 생장시켰다[Sambrook 등, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y.].
여러 표준 방법 중 하나, 예를 들어 전기천공법 또는 뉴클레오펙션에 의해 안정적으로 트랜스펙션된 클론을 수득하였다. 마우스 골수종 NS/0 세포로의 DNA 전기천공을 하기와 같이 수행하였다. NS/0 세포를 10% 소 태아 혈청, 2mM 글루타민, 1mM 소듐 피루베이트 및 1x 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 둘베코의 개질된 이글 배지(DMEM, Life Technologies 사제)에서 생장시켰다. 약 5x106 세포를 PBS로 한번 세척하고 0.5ml 인산염 버퍼 용액(PBS)로 재현탁시켰다. 그 후 10 마이크로그램의 선형 플라스미드 DNA를 세포와 함께 유전자 펄서 큐벳(Gene Pulser Cuvette, 0.4 cm 전극 격차, BioRad 사제)에서 얼음 상에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 0.25V 및 μF 설정으로 유전자 펄서(BioRad 사제)를 사용하여 전기천공을 수행하였다. 얼음 상에서 10분 동안 세포가 회수되도록 둔 후, 생장 배지에 재현탁한 후 2 개의 96-웰 플레이트에 플레이팅하였다. 트랜스펙션 2일 후 도입된 100nM 메토트렉세이트(MTX)의 존재 하 생장에 의해, 안정적으로 트랜스펙션된 클론을 선택하였다. 상기 세포에 매 3일 동안 2번 내지 3번 이상 영양을 공급하였고, MTX-내성 클론은 일반적으로 2주 내지 3주 안에 나타났다. 항-인간 Fc ELISA로써 클론으로부터의 상층액을 분석하여 높은 생산자를 확인하였다[Gillies 등, 1989, J. Immunol. Methods 125:191]. 고생산 클론을 분리하여 100nM MTX 함유 생장 배지에 증식시켰다.
유사하게, 다른 세포주 예컨대 CHO 세포, BHK 세포, SP2/0 세포 및 YB2/0 세포를 사용하여 본질적으로 동일한 방법에 의해 안정적으로 트랜스펙션된 클론을 수득할 수 있다. YB2/0 세포를 사용한 경우, 일반적으로 50 nM MTX의 존재 하 생장으로써 안정적으로 트랜스펙션된 클론을 선택하였다.
예를 들어 랫트 골수종 YB2/0 세포의 안정적으로 트랜스펙션된 클론을 또한 뉴클레오펙션에 의해 수득하였다. 열 불활성화된 10% 소 태아 혈청, 2mM 글루타민, 1mM 소듐 피루베이트 및 1x 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 둘베코의 개질된 이글 배지에서 자란 약 2x106 YB2/0 세포를 90xg에서 실온에서 10분 동안 원심분리하고 100㎕의 보충된 뉴클레오펙터 용액 V에서 재현탁시켰다. 100㎕의 세포 현탁액을 2㎍의 선형 플라스미드 DNA(β-락타마제 서열 중의 Fsp I 부위에서 선형화된)와 혼합하여, 큐벳(Amaxa 사제)에 옮기고, 적합한 뉴클레오펙터(Amaxa 사제) 프로그램, Q-20을 사용하여 뉴클레오펙션을 수행하였다. 500㎕ 의 미리 가온한 배양 배지를 첨가하고 시료를 12-웰 플레이트의 웰로 옮겼다. 트랜스펙션 1일 후, 세포를 생장 배지에 재현탁시키고 약 10 세포/웰 내지 약 600 세포/웰 범위의 세포 밀도로 96 웰 플레이트에서 플레이팅하였다. 트랜스펙션 2일 후 도입된 50nM 메토트렉세이트(MTX)의 존재 하 생장시킴으로써, 안정적으로 트랜스펙션된 클론을 선택하였다. 상기 세포에 매 2일 또는 3일 동안 2번 이상 영양을 공급하였고, MTX-내성 클론은 일반적으로 2주 내지 3주 안에 나타났다. 항-인간 Fc ELISA로써 클론으로부터의 상층액을 분석하여 높은 생산자를 확인하였다[Gillies 등, 1989, J. Immunol. Methods 125:191]. 고생산 클론을 분리하여 50nM MTX 함유 생장 배지에 증식시켰다.
상기 세포는 당업계에 공지된 대안적인 배지 예컨대 2.5% 소 태아 혈청 및 100nM 메토트렉세이트가 보충된 HSFM 또는 단백질이 없는 배지 예컨대 CD 배지에서 생장할 수 있다.
1B. ELISA
상이한 ELISA를 사용하여 MTX 내성 클론 및 다른 시험 시료의 상층액에서의 단백질 생성물 농도를 측정하였다. 예를 들어, 항-huFc ELISA를 사용하여 인간 Fc-함유 단백질, 즉 키메릭 항체의 양을 측정하고, 항-hu 카파 ELISA를 사용하여 카파 경쇄(키메릭의 또는 인간 면역 글로불린의)의 양을 측정하였다.
항-huFc ELISA를 하기에 자세히 기재하였다.
A. 플레이트 코팅
PBS 중 5 마이크로그램/ml의 AffiniPure 염소 항-인간 IgG (H+L) (Jackson Immuno Research 사제)를 96-웰 플레이트(Nunc-Immuno plate Maxisorp 사제)에 웰 당 100㎕씩으로 하여 ELISA 플레이트를 코팅하였다. 코팅한 플레이트를 덮고 4℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션하였다. 그 후 PBS 중의 0.05% 트윈(트윈 20)으로 플레이트를 4번 세척하고, PBS 중의 1% BSA/1% 염소 혈청을 웰 당 200 마이크로리터씩으로 하여 블로킹하였다. 37℃에서 2시간 동안 블로킹 버퍼로 인큐베이션한 후, PBS 중의 0.05% 트윈으로 상기 플레이트를 4번 세척하고 종이 수건에 가볍게 두드려서 건조시켰다.
B. 시험 시료 및 2차 항체 인큐베이션
PBS 중의 1% BSA/1% 염소 혈청/0.05% 트윈을 함유하는 시료 버퍼로 시료를 적절한 농도로 희석하였다. 농도가 알려진 키메릭 항체(인간 Fc를 가지는)로 표준 곡선을 준비하였다. 표준 곡선을 준비하기 위해, 시료 버퍼로 연속 희석물을 제조하여 125ng/ml 내지 3.9ng/ml 범위의 표준 곡선을 수득하였다. 희석한 시료 및 표준을 플레이트에 100 마이크로리터/웰로 첨가하고, 플레이트를 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다.
인큐베이션 후, 플레이트를 PBS 중의 0.05% 트윈으로 8번 세척하였다. 그 후 각각의 웰에 100 마이크로리터의 2차 항체, 서양고추냉이 과산화효소(HRP)-결합 항-인간 IgG(Jackson Immuno Research 사제)를 추가하여 시료 버퍼에서 약 1:120,000 으로 희석하였다. 각 로트(lot)의 HRP-결합 항-인간 IgG에 대한 2차 항체의 정확한 희석을 결정해야 한다. 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션 후, PBS 중의 0.05% 트윈으로 플레이트를 8번 세척하였다.
C. 현상
웰 당 100㎕씩으로 하여 기질 용액을 플레이트에 첨가하였다. 30mg의 o-페닐렌디아민 디하이드로클로라이드(OPD) (1 정제)를 pH 5이고 0.03%의 새로이 첨가한 H2O2를 함유하는 15ml의 0.025M 시트르산/0.05M Na2HPO4 버퍼에 용해시켜 기질 용액을 제조하였다. 어둠 속에서 실온에서 30분 동안 발색하여 현상하였다. 현상 시간은 코팅된 플레이트, 2차 항체 등의 로트 대 로트 다양성에 따라 다르게 하였다. 표준 곡선에서의 발색 현상을 관찰하여 반응을 종료시킬 때를 결정하였다. 웰 당 100㎕씩으로 하여 4N H2SO4를 첨가하여 반응을 종료시켰다. 490nm 및 650nm 둘 모두로 설정되고 490nm에서의 OD로부터 650nm에서의 배경 OD를 빼도록 프로그램된 플레이트 리더(plate reader)로 플레이트를 읽었다.
사용한 2차 항체가 1:4000 희석으로 사용한 서양고추냉이 과산화효소-결합 염소 항-hu 카파(Southern Biotechnology Assoc. Inc. 사제, Birmingham, Ala.)라는 것을 제외하고는, 항-hu 카파 ELISA는 상기 기재한 것과 동일한 절차를 따랐다.
정제
표준 항체 정제 절차는 하기를 따랐다. 전형적으로, 단백질 A에 대한 Fc 부분의 친화성을 기반으로 한 단백질 A 크로마토그래피를 통해 세포 배양 상층액으로부터 본 발명의 B4 VHvx/VKvy 항체 조성물을 정제하였다. B4 VHvx/VKvy 항체 조성물을 발현하는 세포로부터의 조절된 상층액을 예비 평형화시킨 빠른 흐름(Fast-Flow) 단백질 A 세파로즈 컬럼에 채웠다. 상기 컬럼을 인산 나트륨 버퍼(50mM 인산 나트륨, 중성 pH에서의 150mM NaCl)로 광범위하게 세척하였다. 결합한 단백질을 낮은 pH(pH 2.5 ~ 3)의 인산 나트륨 버퍼(조성은 상기와 동일)로 용출하고, 용출한 분획을 즉시 1M 트리스 염기로 약 pH 6.5로 중성화시켰다. 트윈 80을 0.01%로 보충한, pH 6.5의 50mM 인산 나트륨, 150mM NaCl에 조성물을 보관하였다.
생성물의 순도 및 온전함은 HPLC 크기 배제 크로마토그래피 및 SDS-PAGE로 주기적으로 평가하였다. 결과는 본 발명의 B4 VHvx/VKvy 항체가 분해 생성물이 거의 없이 전형적으로 90% 이상 비응집하고 온전하다는 것을 나타냈다.
실시예 3. 본 발명의 B4 항체의 CD -19 제시 세포에 대한 상대적 결합 친화성의 측정.
본 발명의 항체의 CD19로의 결합이 유지된다는 것을 확인하기 위해 경쟁법을 사용하였는데, 여기서 표지한 어버이 B4 항체(B4 VH0/VK0)의 다우디(Daudi) 림프종 세포(CD19 항원을 가짐)에 대한 결합을 억제하는 상기 항체의 강도를 측정하였다.
제공된 프로토콜에 따라, EZ-링크 설포-NHS-LC-바이오틴화 키트(Pierce 사 제, #21430)를 사용하여 바이오틴 표지한 B4 VH0/VK0 항체를 제조하였다. 생성물을 슬라이드-a-라이저(Slide-a-lyzer, Pierce 사제, #66425)로 투석하고, HPLC 크기 배제 크로마토그래피로 분석하였다.
간단히, PBS/2% 혈청 버퍼 중 800ng/ml, 400ng/ml, 200ng/ml, 100ng/ml 및 50ng/ml에서의 표지하지 않은, 실험적 B4 VHvx/VKvy 항체 중 하나와 바이오틴 표지한 B4 VH0/VK0 항체를 100ng/ml의 최종 농도로 예비 혼합한 적정 연속물을 제조하였다. 대조군으로서, 상기와 동일한 농도로 바이오틴 표지한 항체를 표지하지 않은 B4 VH0/VK0 항체와 예비 혼합하거나(억제 대조군) 또는 오직 버퍼와 예비 혼합하였다(양성 결합 대조군). 배합한 항체를 30분 동안 4℃에서 다우디 세포에 첨가하였다. FITC 표지한 스트렙타비딘(streptavidin)의 1:200 희석물을 세포에 첨가하고 시료를 추가로 30분 동안 4℃에서 인큐베이션하였다. 표지한 B4 VH0/VK0 항체의 결합량을 FACS 분석으로 정량하고, 결과를 양성 결합 대조군에 대한 "억제 백분율"로 표현하였다. 시험한 항체는 B4 VH0/VK0 (C), B4 VHv1/VKv1 (1), B4 VHv2/VKv1 (2), B4 VHv1/VKv2 (3), B4 VHv2/VKv2 (4), B4 VHv3/VKv3 (5), B4 VHv4/VKv3 (6), B4 VHv3/VKv4 (7), B4 VHv4/VKv4 (8), B4 VHv5/VKv4 (9) 및 B4 VHv6/VKv4 (10)이었다. 두 실험의 대표적 결과를 표 3 및 표 4에 나타내었다.
표 3: 본 발명의 항체에 의한, 바이오틴-B4 VH0/VK0의 다우디 세포에 대한 결합의 억제.
비율
(미표지/표지)		 항체
(표지한 B4 결합의 억제 %)
C 1 2 3 4 5 6 7 8
8x 68 56 56 56 56 60 56 60 60
4x 56 44 40 44 44 40 44 52 48
2x 44 28 28 32 32 36 32 36 32
1x 28 16 16 20 16 20 16 20 16
0.5x 16 12 8 12 8 12 12 12 12
표 4: 본 발명의 항체에 의한, 바이오틴-B4 VH0/VK0의 다우디 세포에 대한 결합의 억제.
비율
(미표지/표지)		 항체
(표지한 B4 결합의 억제 %)
C 9 10
8x 93 90 87
4x 90 87 80
2x 83 70 70
1x 67 57 60
0.5x 50 47 53
표 3 및 표 4에 나타낸 것처럼 B4 VHvx/VKvy 항체가, 미표지한 B4 VH0/VK0 항체와 유사한 정도로, 표지한 B4 항체의 다우디 세포에 대한 결합을 억제한다는 것을 발견하였으며, 이는 B4 VHvx/VKvy 항체 및 B4 VH0/VK0 항체의 친화성이 유사하다는 것을 나타낸다.
실시예 4. 본 발명의 항체의 ADCC 활성
다양한 세포주에서 제조한 본 발명의 항체에 의해 조정되는 ADCC 활성을 평가하였다. 당업계에서 실행하는 표준 51Cr 유리법으로 ADCC를 측정하였다. 항체의 연속 희석물(100ng/ml 내지 0.025ng/ml의 범위에서 4배 희석)을 제조하고, 총 세포성 51Cr(연속적으로 유리된 51Cr에 맞게 조정한)에 대한 특이적 51Cr 유리에 의해, 항체의 존재 하에서의 정제한 인간 PBMC(효과기 세포)의 51Cr 표지한 다우디 세포(목표; E:T가 100:1)에 의한 용해를 측정하였다. 인간 배아 신장 293T 세포 또는 YB2/0 세포로부터 제조한 B4 VHv4/VKv4 항체 및, NS/0 세포주 또는 YB2/0 세포로부터 제조한 B4 VHv5/VKv4 항체를 시험하였다.
도 38은 이러한 실험 결과를 나타낸다. YB2/0 세포 발현으로부터 수득한 두 항체는 ADCC를 조정하는 데 있어서 동등하게 활성이고, NS/0 세포주 또는 293T 세포로부터의 발현에 의해 수득한 상응하는 항체보다 50배 이상 더 활성이었다. 293T 세포로부터 제조한 B4 VHv4/VKv4이 NS/0 세포주로부터 제조한 B4 VHv5/VKv4 보다 더 활성이었다.
실시예 5. 본 발명의 항체에 의한, SCID 마우스로 이식한 인간 B 세포의 고갈
B 세포의 고갈은 많은 치료적 맥락에서 유용하다. 예를 들어, 항체-유도 자가면역 및 염증 장애를 본 발명의 항체로 치료하여 B 세포를 감소시키거나 또는 본질적으로 제거할 수 있다. 대안적으로, 종양-표적제제 예컨대 제발린TM(ZevalinTM) 또는 벡사르TM(BexxarTM) 또는 Leu16-IL2 융합 단백질(WO2005/016969)로 치료하는 경우, 우선 정상 B 세포를 제거하는 것이 유용하다.
본 발명의 항체를 인간 B 세포를 고갈시키는 데 사용할 수 있는지 검토하기 위해, 하기의 실험을 수행하였다. 0일째, 정제한 인간 PBMC를 0.2ml의 PBS 중 약 4.5 x 107 세포로 수컷 SCID CB17 마우스(n = 3) 복강 내로 주사하고, 인간 비장 세포의 이동에 대해 기재한 프로토콜(Yacoub-Youssef 등, Transpl. Immunol., 2005, 15:157~164)에 본질적으로 따라서 이식한다. 3일째, 마우스에 PBS 또는 50 마이크로그램의 항-CD20 항체 Leu16, 또는 K4H4 항-CD19 항체를 복강 내로 주사하였다. 7일, 14일 및 21일째, 인간 IgM의 수준을 인간 IgM ELISA 정량 키트(Bethyl Laboratories 사제; Cat #E80-100)로 측정하였다.
도 39는 전형적인 결과를 나타낸다. PBS 처리한 대조군에서, 인간 IgM의 역가는 꾸준히 상승하여 42일째 약 800 마이크로그램/ml에 도달하였다. Leu16 또는 B4 VHv5/VKv4 항체로 치료한 마우스에서, 인간 IgM 역가는 본질적으로 없었고, 이는 항체 치료에 의해 인간 B 세포가 고갈되었다는 것을 나타낸다.
실시예 6. 본 발명의 항체에 의한, 림프종을 가지는 포유류의 치료.
본 발명의 항체가 세포 내(in vivo)에서 기능했는지 검토하기 위해, YB2/0 세포에서 발현된 B4 VHv4/VKv4 항체를 인간 림프종의 동물 모델에서 시험하였다. 0일째 약 1 x 106 생장가능한 '나말와(Namalwa)' Nalm-6-UM-1 세포를 8주 된 SCID CB17 마우스(n = 6)에 정맥 주사하였다. 1일, 3일 및 5일째, 복강 내 500 마이크로그램의 항체 또는 PBS로 마우스를 치료하였다. 1주당 약 1번 내지 2번 마우스를 시험하여, 어떤 마우스가 안락사를 필요로 하기에 충분한 만큼 질병이 생기는지 보았다.
도 40은 이러한 실험의 전형적인 결과를 나타낸다. PBS로 치료한 마우스는 모두 종양 세포를 주사하고 10주 안에 질병이 생긴 반면, B4 VHv4/VKv4 항체로 치료한 마우스는 그 후에 질병이 생겼고, 상기 군에서 6마리 중 3마리는 실험 과정 의 30주 동안 건강하게 남아있었다.
실시예 7. 본 발명의 항체와 화학요법의 병용에 의한, 버킷의 림프종을 가지는 포유류의 치료.
본 발명의 항체를 생체 내에서 화학요법과 병용하여 사용할 수 있는지 검토하기 위해, 이전의 실시예에서보다 유력한, 림프종의 형태를 치료하기에 보다 진보되거나 또는 보다 어려운 것에 상응하는, 인간 림프종의 동물 모델에서 B4 VHv4/VKv4 항체를 시험하였다. 한 대표적 실험에서, 버킷의 림프종 세포주인 다우디 세포주를 YB2/0 세포에서 발현시킨 B4 VHv4/VKv4 항체로, 시클로포스파마이드(CPA)와 함께 또는 CPA 없이 치료하였다. 8주 된 SCID CB17 마우스(n = 6)에 0일째 약 5 x 106의 생존가능한 다우디 세포를 정맥 주사하였다. 8일 및 12일째, 100 마이크로그램의 항체 또는 PBS로 마우스를 치료하였다. 7일째, PBS 또는 체중 1킬로그램 당 75 마이크로그램의 CPA로 마우스를 치료하였다. 0.2ml 에서 복강 내 투여하여 치료하였다. 1주당 약 1번 내지 2번 마우스를 시험하여, 어떤 마우스가 안락사를 필요로 하기에 충분한 만큼 질병이 생기는지 보았다.
도 41은 전형적인 실험 결과를 나타낸다. 항체 또는 CPA로 치료하지 않은 대조군에서는, 모든 마우스가 림프종 세포를 주사하고 4주 안에 질병이 생겼다. B4 VHv4/VKv4 항체 또는 CPA 단독으로 치료한 마우스 군에서, 6마리 중 5마리는 5주 이상 건강했으나 약 6주 안에 질병이 생겼다. B4 VHv4/VKv4 항체 및 CPA로 치료한 마우스 군에서는, 모든 마우스가 8주 이상 건강하게 남아있었다.
실시예 8. 화학요법과 병용한 본 발명의 항체에 의한, 림프종이 전파된 질병의 치료.
또 다른 실험군에서, 1 x 106 세포 대신 2 x 106 세포를 사용하였다는 것을 제외하고는, 이전의 실시예에 기재된 것과 동일하게 나말와 세포를 마우스에 정맥 주사하였다. 상기 증가한 수의 세포는, 3주 안에 모두 질병이 생겼던 도 42에서 PBS 치료한 마우스의 비교에 의해 나타낸 것처럼(5주 내지 10주 안에 질병이 생겼던, 도 40에서 PBS 치료한 마우스와 반대로), 보다 공격적인 질병 과정을 유발한다. 3일, 7일 및 11일째, 복강 내 500 마이크로그램의 항체 또는 PBS로 마우스(n=5)를 치료하였다. 3일, 7일 및 11일째, 시클로포스파마이드(75mg/kg, i.p.) 또는 빈크리스틴(0.4mg/kg, i.v.) 또는 독소루비신(3mg/kg, i.v.) 또는 PBS(i.v.)로 또한 마우스를 치료하였다. 결과를 도 42(a~c)에 나타내었다. 상기 결과는 각 3개의 화학요법제를 본 발명의 항체와 병용할 수 있음을 나타내었다.
실시예 9. 본 발명의 방법 및 항체에 의한, 환자의 치료.
본 발명의 항-CD19 항체를 사용하여 인간 질병 및 장애를 하기와 같이 치료하였다. 일반적으로, 피하 주사, 흡입, 경구 투여 및 다른 방법 또한 가능하지만, 바람직한 투여법은 정맥 주입 또는 정맥 주사이다. 투여 횟수가 환자의 필요에 따라 다양할 수 있으나, 매 2주, 3주 또는 4주에 약 한 번의 투여를 사용하였다. 전형적인 복용량은 성인에 대해 약 100 내지 800mg이다. 면역억제로 인한 것일 수 있는 감염의 징후에 대해 치료한 환자를 모니터링하였다.
예를 들어, 본 발명의 항-CD19 B4 VHv4/VKv4 항체로, 매 2주에 약 한번 약 8mg/kg의 복용량으로, 약 1시간 동안 점적 주입에 의한 투여로 캐슬만씨 병 환자를 치료하였다.
항-CD19 B4 VHv4/VKv4 항체로, 매 4주에 약 한번 약 8mg/kg의 복용량으로, 약 1시간 동안 점적 주입에 의한 투여로 류마티스성 관절염 환자를 치료하였다. 질병-개질 항-류마티즘 약과 비교하여, 관절 파손의 진행이 단일요법에 의해 상당히 억제되는 것을 발견하였다.
항-CD19 B4 VHv4/VKv4 항체로, 매 4주에 약 한번 약 8mg/kg의 복용량으로, 약 1시간 동안 점적 주입에 의한 투여로 크론씨병 환자를 치료하였다.
항-CD19 B4 VHv4/VKv4 항체로, 매 3주에 약 한번 약 8mg/kg의 복용량으로, 약 1시간 동안 점적 주입에 의한 투여로 다발성 골수종 환자를 치료하였다. 환자에 적합한 것으로서 의사에 의해 결정된 다발성 골수종의 진료 표준 치료와, 항-CD19 B4 VHv4/VKv4로의 치료를 병용하였다.
항-CD19 B4 VHv4/VKv4 항체로, 매 3주에 약 한번 약 8mg/kg의 복용량으로, 약 1시간 동안 점적 주입에 의한 투여로, 임의로는 리툭산TM과 같은 항체를 체표면적 제곱미터 당 약 375 밀리그램에서 매 주 투여하거나, 항-CD22 항체 에프라투주맙과 함께 병용하여 B 세포 림프종 환자를 치료하였다. 대안적으로, 난치성 림프종 환자의 경우, 항-CD19 B4 VHv4/VKv4 항체에 의한 치료와 방사성면역결합제 예 컨대 벡사르TM 또는 제발린TM을 병용하였다.
보다 명확하게는, 항-CD19 B4 VHv4/VKv4 항체로, 매 3주에 약 한번 약 8mg/kg의 복용량으로, 약 1시간 동안 점적 주입에 의한 투여로, 임의로는 화학요법 예컨대 시클로포스파마이드에 빈크리스틴, 독소루비신, 프레드니솔론을 합하거나("CHOP"), 또는 CHOP에 블레오마이신을 합하거나, 또는 CHOP에 에토포시드를 합하거나, 또는 미톡산트론에 빈크리스틴, 티오테파를 합하거나, 또는 에토포시드에 프레드니솔론, 시타라빈, 시스플라틴을 합하거나, 또는 메스나에 이포스파미드, 미톡산트론, 에토포시드를 합하거나, 또는 벤다무스틴 또는 플루다리빈 및 2-CdA와 병용하여 B 세포 림프종 환자를 치료하였다.
대안적인 치료 요법으로, 항-CD19 B4 VHv4/VKv4 항체로, 약 8mg/kg의 복용량으로 B 세포 림프종 환자를 초기 치료한 후, 이후 예컨대 WO2005/016969에 기재된 것과 같은 항-CD20-IL2 융합 단백질로 치료하였다. 예를 들어, 1일째 약 1시간 동안 점적 주입에 의한 투여로 항-CD19 B4 VHv4/VKv4 항체로 환자를 치료한 후, 2일째 및 4일째 항-CD20-IL2 융합 단백질로, kg 당 약 150 마이크로그램의 복용량으로 약 4시간 동안 점적 주입에 의한 투여로 치료하고, 상기 순환을 약 3주마다 반복하였다. 이론에 속박됨 없이, 상기 항-CD19 B4 VHv4/VKv4 항체는 환자로부터 대부분의 정상 B 세포를 제거하는 효과를 가지는데, 항-CD20-IL2 융합 단백질이 남아있는 종양 세포에 결합함으로써 상기 효과를 발휘하였다.
SEQUENCE LISTING <110> Super, Michael Davis, Jonathan Stein, Pascal Andre <120> Anti-CD19 Antibodies with Reduced Immunogenicity <130> P05/226-bz/bs (LEX-040) <150> PCT/EP2006/012365 <151> 2006-12-21 <160> 33 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 360 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 caggtgcaac tgcagcagcc tggggctgaa gtggtgaagc ctggggcttc agtgagactg 60 tcctgcaaga cttctggcta caccttcacc agcaactgga tgcactgggt gaagcagagg 120 cctggacaag gccttgagtg gatcggagag attgatcctt ctgatagtta tactaactac 180 aatcaaaagt tcaagggcaa ggccaagttg actgtagaca aatcctccag cacagcctac 240 atggaagtca gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct attactgtgc aagaggtagc 300 aacccttact actatgctat ggactactgg ggtcaaggaa cctcagtcac cgtctcctca 360 <210> 2 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence encoding B4 antibody heavy chain variable region with codons for amino acid substitutions K23E, G42D, K69E, and S85D (B4 VHv1) <400> 2 caggtgcaac tgcagcagcc tggggctgaa gtggtgaagc ctggggcttc agtgagactg 60 tcctgcgaga cttctggcta caccttcacc agcaactgga tgcactgggt gaagcagagg 120 cctgaccaag gacttgagtg gatcggagag attgatcctt ctgatagtta tactaactac 180 aatcaaaagt tcaagggcaa ggccgaattg actgtagaca aatcctccag cacagcctac 240 atggaagtca gcgacctgac atctgaggac tctgcggtct attactgtgc aagaggtagc 300 aacccttact actatgctat ggactactgg ggtcaaggaa cctcagtcac cgtctcctca 360 <210> 3 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence encoding B4 antibody heavy chain variable region with codons for amino acid substitutions K69E, and S85D (B4 VHv2) <400> 3 caggtgcaac tgcagcagcc tggggctgaa gtggtgaagc ctggggcttc agtgagactg 60 tcctgcaaga cttctggcta caccttcacc agcaactgga tgcactgggt gaagcagaga 120 cctggacaag gacttgagtg gatcggagag attgatcctt ctgatagtta tactaactac 180 aatcaaaagt tcaagggcaa ggccgaattg actgtagaca aatcctccag cacagcctac 240 atggaagtca gcgacctgac atctgaggac tctgcggtct attactgtgc aagaggtagc 300 aacccttact actatgctat ggactactgg ggtcaaggaa cctcagtcac cgtctcctca 360 <210> 4 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence encoding B4 antibody heavy chain variable region with codons for amino acid substitutions Q5E, V12K, R19K, L20V, T24A, S85D, and S88A (B4 VHv3) <400> 4 caggtgcaac tggagcagcc tggggctgaa gtgaagaagc ctggggcttc agtgaaggtg 60 tcctgcaagg cttctggcta caccttcacc agcaactgga tgcactgggt gaagcagagg 120 cctggacaag gacttgagtg gatcggagag attgatcctt ctgatagtta tactaactac 180 aatcaaaagt tcaagggcaa ggccaagttg actgtagaca aatcctccag cacagcctac 240 atggaagtca gcgacctgac agctgaggac tctgcggtct attactgtgc aagaggtagc 300 aacccttact actatgctat ggactactgg ggtcaaggaa cctcagtcac cgtctcctca 360 <210> 5 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence encoding B4 antibody heavy chain variable region with codons for amino acid substitutions Q5E, R19K, L20V, R40T, Q43K, K65D, S85D, S88A, and V93T (B4 VHv4) <400> 5 caggtgcaac tggagcagcc tggggctgaa gtggtgaagc ctggggcttc agtgaaggtg 60 tcctgcaaga cttctggcta caccttcacc agcaactgga tgcactgggt gaagcagacg 120 cctggaaaag gacttgagtg gatcggagag attgatcctt ctgatagtta tactaactac 180 aatcaaaagt tcgatggcaa ggccaagttg actgtagaca aatcctccag cacagcctac 240 atggaagtca gcgacctgac agctgaggac tctgcgacct attactgtgc aagaggtagc 300 aacccttact actatgctat ggactactgg ggtcaaggaa cctcagtcac cgtctcctca 360 <210> 6 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence encoding B4 antibody heavy chain variable region with codons for amino acid substitutions Q5E, V12K, R19K, L20V, T24A, K38R, R40A, Q43K, K65D, S85D, and V93T (B4 VHv5) <400> 6 caggtgcaac tggagcagcc tggggctgaa gtgaagaagc ctggggcttc agtgaaggtg 60 tcctgcaagg cttctggcta caccttcacc agcaactgga tgcactgggt gagacaggca 120 cctggaaaag gacttgagtg gatcggagag attgatcctt ctgatagtta tactaactac 180 aatcaaaagt tcgatggcaa ggccaagttg actgtagaca aatcctccag cacagcctac 240 atggaagtca gcgacctgac atctgaggac tctgcgacct attactgtgc aagaggtagc 300 aacccttact actatgctat ggactactgg ggtcaaggaa cctcagtcac cgtctcctca 360 <210> 7 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence encoding B4 antibody heavy chain variable region with codons for amino acid substitutions Q5E, R19K, L20V, K65D, S85D, and V93T (B4 VHv6) <400> 7 caggtgcaac tggagcagcc tggggctgaa gtggtgaagc ctggggcttc agtgaaggtg 60 tcctgcaaga cttctggcta caccttcacc agcaactgga tgcactgggt gaagcagagg 120 cctggacaag gacttgagtg gatcggagag attgatcctt ctgatagtta tactaactac 180 aatcaaaagt tcgatggcaa ggccaagttg actgtagaca aatcctccag cacagcctac 240 atggaagtca gcgacctgac atctgaggac tctgcgacct attactgtgc aagaggtagc 300 aacccttact actatgctat ggactactgg ggtcaaggaa cctcagtcac cgtctcctca 360 <210> 8 <211> 312 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 8 caaattgttc tcacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctccagggga gaaggtcacc 60 atgacctgca gtgccagctc aggtgtcaac tacatgcact ggtaccagca gaagccaggc 120 acctccccca aaagatggat ttatgacaca tccaaactgg cttctggagt ccctgctcgc 180 ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttat tctctcacaa tcagcagcat ggaggctgaa 240 gatgctgcca cttattactg ccatcagcga ggtagttaca cgttcggagg ggggaccaag 300 ctggaaataa aa 312 <210> 9 <211> 312 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence encoding B4 antibody light chain variable region with codons for amino acid substitutions V3A, S7E, and A54D (B4 VKv1) <400> 9 caaattgctc tcacccagga gccagcaatc atgtctgcat ctccagggga gaaggtcacc 60 atgacctgca gtgccagctc aggtgtcaac tacatgcact ggtatcagca gaagccaggc 120 acctccccca aaagatggat ttatgacaca tccaaactgg attctggagt ccctgctcgc 180 ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttat tctctcacaa tcagcagcat ggaggctgaa 240 gatgctgcca cttattactg ccatcagcga ggtagttaca cgttcggagg ggggaccaag 300 ctggaaataa aa 312 <210> 10 <211> 312 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence encoding B4 antibody light chain variable region with codons for amino acid substitutions Q1D, I10T, M11L, and A54D (B4 VKv2) <400> 10 gacattgttc tcacccagtc tccagcaact ttgtctgcat ctccagggga gaaggtcacc 60 atgacctgta gtgccagctc aggtgtcaac tacatgcact ggtatcagca gaagccaggc 120 acctccccca aaagatggat ttatgacaca tccaaactgg attctggagt ccctgctcgc 180 ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttat tctctcacaa tcagcagcat ggaggctgaa 240 gatgctgcca cttattactg ccatcagcga ggtagttaca cgttcggagg ggggaccaag 300 ctggaaataa aa 312 <210> 11 <211> 312 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence encoding B4 antibody light chain variable region with codons for amino acid substitutions I10T, M11L, V19A, V29A, and S75E (B4 VKv3) <400> 11 caaattgttc tcacccagtc tccagcaact ttgtctgcat ctccagggga gaaggctacc 60 atgacctgca gtgccagctc aggtgctaac tacatgcact ggtaccagca gaagccaggc 120 acctccccca aaagatggat ttatgacaca tccaaactgg cttctggagt ccctgctcgc 180 ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttat tctctcacaa tcgagagcat ggaggctgaa 240 gatgctgcca cttattactg ccatcagcga ggtagttaca cgttcggagg ggggaccaag 300 ctggaaataa aa 312 <210> 12 <211> 312 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence encoding B4 antibody light chain variable region with codons for amino acid substitutions I10T, M11L, V19A, S51D, and L53T (B4 VKv4) <400> 12 caaattgttc tcacccagtc tccagcaact ttgtctgcat ctccagggga gaaggctacc 60 atgacctgta gtgccagctc aggtgtcaac tacatgcact ggtaccagca gaagccaggc 120 acctccccca aaagatggat ttatgacaca gacaaaacgg cttctggagt ccctgctcgc 180 ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttat tctctcacaa tcagcagcat ggaggctgaa 240 gatgctgcca cttattactg ccatcagcga ggtagttaca cgttcggagg ggggaccaag 300 ctggaaataa aa 312 <210> 13 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Arg Leu Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Asn 20 25 30 Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Val Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ser Asn Pro Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 14 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of B4 antibody heavy chain variable region with codons for amino acid substitutions K23E, G42D, K69E, and S85D (B4 VHv1) <400> 14 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Arg Leu Ser Cys Glu Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Asn 20 25 30 Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Asp Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Glu Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Val Ser Asp Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ser Asn Pro Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 15 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of B4 antibody heavy chain variable region with codons for amino acid substitutions K69E, and S85D (B4 VHv2) <400> 15 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Arg Leu Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Asn 20 25 30 Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Glu Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Val Ser Asp Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ser Asn Pro Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 16 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of B4 antibody heavy chain variable region with codons for amino acid substitutions Q5E, V12K, R19K, L20V, T24A, S85D, and S88A (B4 VHv3) <400> 16 Gln Val Gln Leu Glu Gln Pro Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Asn 20 25 30 Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Val Ser Asp Leu Thr Ala Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ser Asn Pro Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 17 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of B4 antibody heavy chain variable region with codons for amino acid substitutions Q5E, R19K, L20V, R40T, Q43K, K65D, S85D, S88A, and V93T (B4 VHv4) <400> 17 Gln Val Gln Leu Glu Gln Pro Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Asn 20 25 30 Trp Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Asp Gly Lys Ala Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Val Ser Asp Leu Thr Ala Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ser Asn Pro Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 18 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of B4 antibody heavy chain variable region with codons for amino acid substitutions Q5E, V12K, R19K, L20V, T24A, K38R, R40A, Q43K, K65D, S85D, and V93T (B4 VHv5) <400> 18 Gln Val Gln Leu Glu Gln Pro Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Asn 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Asp Gly Lys Ala Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Val Ser Asp Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ser Asn Pro Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 19 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of B4 antibody heavy chain variable region with codons for amino acid substitutions Q5E, R19K, L20V, K65D, S85D, and V93T (B4 VHv6) <400> 19 Gln Val Gln Leu Glu Gln Pro Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Asn 20 25 30 Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Asp Gly Lys Ala Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Val Ser Asp Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ser Asn Pro Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 20 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of B4 antibody heavy chain variable region with codons for amino acid substitutions V12K, K23E, G42D, K65D, K69E, and S85D (B4 VHv11) <400> 20 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Arg Leu Ser Cys Glu Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Asn 20 25 30 Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Asp Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Asp Gly Lys Ala Glu Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Val Ser Asp Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ser Asn Pro Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 21 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of B4 antibody heavy chain variable region with codons for amino acid substitutions Q5E, V12K, R19K, L20V, T24A, R40T, Q43K, K65D, S85D, S88A, and V93T (B4 VHv34) <400> 21 Gln Val Gln Leu Glu Gln Pro Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Asn 20 25 30 Trp Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Asp Gly Lys Ala Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Val Ser Asp Leu Thr Ala Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ser Asn Pro Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 22 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of B4 antibody heavy chain framework region 1 with variable amino acid residues X5, X12, X19, X20, X23, and X24 (B4 VHfr1) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa is Gln or Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Xaa is Val or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (19)..(19) <223> Xaa is Arg or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Xaa is Leu or Val <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(23) <223> Xaa is Lys, Glu, or Asp <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(24) <223> Xaa is Thr or Ala <400> 22 Gln Val Gln Leu Xaa Gln Pro Gly Ala Glu Val Xaa Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Xaa Xaa Ser Cys Xaa Xaa Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 20 25 30 <210> 23 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of B4 antibody heavy chain framework region 2 with variable amino acid residues X3, X5, X7, and X8 (B4 VHfr2) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa is Lys or Arg <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa is Arg, Thr, or Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa is Gly, Asp, or Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa is Gln or Lys <400> 23 Trp Val Xaa Gln Xaa Pro Xaa Xaa Gly Leu Glu Trp Ile Gly 1 5 10 <210> 24 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of B4 antibody heavy chain framework region 3 with variable amino acid residues X6, X10, X26, X29, and X34 (B4 VHfr3) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa is Lys, Asp, or Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Xaa is Lys, Glu, or Asp <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(26) <223> Xaa is Ser, Asp, or Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (29)..(29) <223> Xaa is Ser or Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (34)..(34) <223> Xaa is Val or Thr <400> 24 Tyr Asn Gln Lys Phe Xaa Gly Lys Ala Xaa Leu Thr Val Asp Lys Ser 1 5 10 15 Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Val Ser Xaa Leu Thr Xaa Glu Asp Ser 20 25 30 Ala Xaa Tyr Tyr Cys Ala Arg 35 <210> 25 <211> 104 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Gly Val Asn Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Arg Gly Ser Tyr Thr Phe Gly 85 90 95 Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 <210> 26 <211> 104 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of B4 antibody light chain variable region with codons for amino acid substitutions V3A, S7E, and A54D (B4 VKv1) <400> 26 Gln Ile Ala Leu Thr Gln Glu Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Gly Val Asn Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Arg Gly Ser Tyr Thr Phe Gly 85 90 95 Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 <210> 27 <211> 104 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of B4 antibody light chain variable region with codons for amino acid substitutions Q1D, I10T, M11L, and A54D (B4 VKv2) <400> 27 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Gly Val Asn Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Arg Gly Ser Tyr Thr Phe Gly 85 90 95 Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 <210> 28 <211> 104 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of B4 antibody light chain variable region with codons for amino acid substitutions I10T, M11L, V19A, V29A, and S75E (B4 VKv3) <400> 28 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Ala Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Gly Ala Asn Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Glu Ser Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Arg Gly Ser Tyr Thr Phe Gly 85 90 95 Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 <210> 29 <211> 104 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of B4 antibody light chain variable region with codons for amino acid substitutions I10T, M11L, V19A, S51D, and L53T (B4 VKv4) <400> 29 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Ala Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Gly Val Asn Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Asp Lys Thr Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Arg Gly Ser Tyr Thr Phe Gly 85 90 95 Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 <210> 30 <211> 104 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of B4 antibody light chain variable region with codons for amino acid substitutions V3A, S7E, V19A, A54D, and S75E (B4 VKv11) <400> 30 Gln Ile Ala Leu Thr Gln Glu Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Ala Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Gly Val Asn Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Glu Ser Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Arg Gly Ser Tyr Thr Phe Gly 85 90 95 Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 <210> 31 <211> 104 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of B4 antibody light chain variable region with codons for amino acid substitutions I10T, M11L, V19A, V29A, S51D, L53T, and S75E (B4 VKv34) <400> 31 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Ala Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Gly Ala Asn Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Asp Lys Thr Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Glu Ser Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Arg Gly Ser Tyr Thr Phe Gly 85 90 95 Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 <210> 32 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of B4 antibody light chain framework region 1 with variable amino acid residues X1, X3, X7, X10, X11 and X19 (B4 VKfr1) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa is Gln or Asp <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa is Val or Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa is Ser or Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Xaa is Ile or Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Xaa is Met or Leu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (19)..(19) <223> Xaa is Val or Ala <400> 32 Xaa Ile Xaa Leu Thr Gln Xaa Pro Ala Xaa Xaa Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Xaa Thr Met Thr Cys 20 <210> 33 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of B4 antibody light chain complementarity determining region 2 with variable amino acid residues X3, X5, and X6 (B4 VKcdr2) <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (5)..(6) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 33 Asp Thr Xaa Lys Xaa Xaa Ser 1 5

Claims (25)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. SEQ ID NO:13 인 중쇄 가변부와 SEQ ID NO:25 인 경쇄 가변부로 특정되는 쥐과 항-CD19 B4 모체 항체로부터 유래한, 변형된 항-CD19 항체를 포함하는, 인간의 암 또는 자가면역 질환 치료용 약학 조성물로서,
    상기 질환은 류마티스성 관절염, 크론씨병, 캐슬만씨 병, 다발성 골수종 및 B 세포 림프종에서 선택되고,
    상기 변형된 항-CD19 항체는 (i) SEQ ID NO:17 인 중쇄 가변부와 SEQ ID NO:29 인 경쇄 가변부를 포함하고, (ii) YB2/0 세포에서 발현되어 수득되고, (iii) 가변부가 SEQ ID NO:17 및 SEQ ID NO:29 로 변형됨으로 인해, 인간에게 투여하는 경우, 쥐과 항-CD19 B4 모체 항체보다 면역원성이 낮지만, CD19 에 특이적으로 결합하고, CD19 를 발현하는 세포를 타겟팅하며, (iv) 항체-의존 세포질 세포독성(ADCC)을 증가시키는,
    약학 조성물.
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 삭제
  18. 삭제
  19. 삭제
  20. 삭제
  21. 삭제
  22. 삭제
  23. 삭제
  24. 삭제
  25. 삭제
KR1020087018761A 2005-12-30 2006-12-21 감소한 면역원성을 가지는 항-ｃｄ19 항체 KR101397290B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US75560905P 2005-12-30 2005-12-30
US60/755,609 2005-12-30
PCT/EP2006/012365 WO2007076950A1 (en) 2005-12-30 2006-12-21 Anti-cd19 antibodies with reduced immunogenicity

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20080090485A KR20080090485A (ko) 2008-10-08
KR101397290B1 true KR101397290B1 (ko) 2014-05-21

Family

ID=37865674

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020087018761A KR101397290B1 (ko) 2005-12-30 2006-12-21 감소한 면역원성을 가지는 항-ｃｄ19 항체

Country Status (15)

Country Link
US (4) US8691952B2 (ko)
EP (2) EP2270050B1 (ko)
JP (2) JP2009521912A (ko)
KR (1) KR101397290B1 (ko)
CN (1) CN101351477B (ko)
AT (1) ATE509954T1 (ko)
AU (1) AU2006332155B2 (ko)
BR (1) BRPI0620795A2 (ko)
CA (1) CA2635623C (ko)
DK (2) DK2270050T3 (ko)
EA (1) EA016429B1 (ko)
ES (2) ES2365046T3 (ko)
PT (2) PT2270050E (ko)
WO (1) WO2007076950A1 (ko)
ZA (1) ZA200806609B (ko)

Families Citing this family (50)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030105294A1 (en) * 1998-02-25 2003-06-05 Stephen Gillies Enhancing the circulating half life of antibody-based fusion proteins
DK1252192T3 (da) 2000-02-11 2006-11-20 Merck Patent Gmbh Forbedring af antistofbaserede fusionsproteiners serumhalveringstid
MXPA03008031A (es) 2001-03-07 2003-12-04 Merck Patent Gmbh Tecnologia de expresion para proteinas que contienen porcion de anticuerpo isotipo hibrida.
WO2002079415A2 (en) 2001-03-30 2002-10-10 Lexigen Pharmaceuticals Corp. Reducing the immunogenicity of fusion proteins
PT1383785E (pt) 2001-05-03 2011-06-28 Merck Patent Gmbh Anticorpo recombinante específico de tumores e utilização deste
MXPA04005266A (es) * 2001-12-04 2004-10-11 Merck Patent Gmbh Inmunocitocinas con selectividad modulada.
CA2551915C (en) * 2003-12-30 2015-06-23 Merck Patent Gesellschaft Mit Beschraenkter Haftung Il-7 fusion proteins
KR20060124656A (ko) * 2003-12-31 2006-12-05 메르크 파텐트 게엠베하 개선된 약물동태를 가지는 Ｆｃ-에리스로포이에틴 융합단백질
US7670595B2 (en) * 2004-06-28 2010-03-02 Merck Patent Gmbh Fc-interferon-beta fusion proteins
US8444973B2 (en) * 2005-02-15 2013-05-21 Duke University Anti-CD19 antibodies and uses in B cell disorders
US20070104689A1 (en) * 2005-09-27 2007-05-10 Merck Patent Gmbh Compositions and methods for treating tumors presenting survivin antigens
KR101397290B1 (ko) 2005-12-30 2014-05-21 메르크 파텐트 게엠베하 감소한 면역원성을 가지는 항-ｃｄ19 항체
US20070166306A1 (en) * 2006-01-17 2007-07-19 Fey Georg H M Anti-CD19 antibody composition and method
DK2059536T3 (da) 2006-08-14 2014-04-14 Xencor Inc Optimerede antistoffer, der er rettet mod cd19
CN103694349A (zh) 2006-09-08 2014-04-02 米迪缪尼有限公司 人源化抗cd19抗体及其在治疗癌症、移植病和自身免疫病中的应用
EP2167128B1 (en) * 2007-07-17 2012-10-24 Merck Patent GmbH Engineered anti-alpha v- integrin hybrid antibodies
DK2211904T3 (en) 2007-10-19 2016-10-24 Seattle Genetics Inc Cd19-binding agents and uses thereof
US10350243B2 (en) 2008-01-30 2019-07-16 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Methods for off-the-shelf-tumor immunotherapy using allogeneic T-cell precursors
US10059923B2 (en) * 2008-01-30 2018-08-28 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Methods for off-the-shelf tumor immunotherapy using allogeneic T-cell precursors
JP2011519276A (ja) * 2008-04-25 2011-07-07 メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング 人工タンパク質スキャフォールド
BRPI1016204A2 (pt) * 2009-04-22 2016-04-19 Merck Patent Gmbh proteínas de fusão de anticorpos com sítios de ligação fcrn modificados
EP2409993A1 (en) 2010-07-19 2012-01-25 International-Drug-Development-Biotech Anti-CD19 antibody having ADCC function with improved glycosylation profile
EP2409712A1 (en) 2010-07-19 2012-01-25 International-Drug-Development-Biotech Anti-CD19 antibody having ADCC and CDC functions and improved glycosylation profile
PL2672994T3 (pl) 2011-02-11 2018-11-30 Merck Patent Gmbh Przeciwciało przeciwko integrynie alfa-v do leczenia raka prostaty
MX353589B (es) 2011-08-16 2018-01-19 Morphosys Ag Terapia de combinacion con un anticuerpo anti-cd19 y un analogo de purina.
AU2012296907B2 (en) 2011-08-16 2017-01-05 Incyte Corporation Combination therapy with an anti - CD19 antibody and a nitrogen mustard
CA2887895C (en) * 2012-10-12 2019-10-29 Adc Therapeutics Sarl Pyrrolobenzodiazepine-anti-cd19 antibody conjugates
RS57104B1 (sr) 2012-10-12 2018-06-29 Adc Therapeutics Sa Konjugati pirolobenzodiazepin-antitela
KR20180004286A (ko) 2015-05-26 2018-01-10 모르포시스 아게 항-cd19 항체 및 브루톤 타이로신 키나제 억제제의 조합 및 이의 용도
BR112018003263A2 (pt) 2015-08-21 2018-09-25 Morphosys Ag combinação sinérgica
MD3465214T2 (ro) 2016-05-30 2021-09-30 Morphosys Ag Metode de predicție a beneficiului terapeutic al terapiei anti-CD19 la pacienți
MX2018016362A (es) 2016-06-27 2019-04-22 Morphosys Ag Formulaciones de anticuerpo anti-cd19.
HUE054496T2 (hu) 2016-10-28 2021-09-28 Morphosys Ag CD19 elleni ellenanyag kombinálása BCL-2-gátlóval és alkalmazásuk
US11129906B1 (en) 2016-12-07 2021-09-28 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
CN108690138A (zh) * 2017-04-12 2018-10-23 鸿运华宁（杭州）生物医药有限公司 一种能与人cd19或cd20和人cd3结合的双特异性抗体及其应用
MA48751B1 (fr) 2017-05-31 2023-11-30 Morphosys Ag Paradigme de traitement d'anticorps anti-cd19 et traitement de combinaison venetoclax
KR102413686B1 (ko) * 2017-07-07 2022-06-28 한미약품 주식회사 신규 치료학적 효소 융합단백질 및 이의 용도
EP3652206A1 (en) 2017-07-10 2020-05-20 International-Drug-Development-Biotech Treatment of b cell malignancies using afucosylated pro-apoptotic anti-cd19 antibodies in combination with anti cd20 antibodies or chemotherapeutics
KR102588611B1 (ko) * 2017-12-22 2023-10-16 한미약품 주식회사 신규한 구조를 갖는 치료학적 효소 융합단백질 및 이의 용도
AU2020267823A1 (en) 2019-05-03 2021-11-11 Incyte Corporation Anti-CD19 therapy in patients having a limited number of NK cells
JP2022550435A (ja) 2019-10-04 2022-12-01 ウルトラジェニックス ファーマシューティカル インコーポレイテッド 組換えａａｖの改善された治療的使用のための方法
JP2022554324A (ja) 2019-10-31 2022-12-28 モルフォシス・アーゲー 抗ｃｄ１９抗体及びガンマデルタｔ細胞を含む抗腫瘍併用療法
CN114641312A (zh) 2019-10-31 2022-06-17 莫佛塞斯公司 抗cd19疗法与来那度胺组合用于治疗白血病或淋巴瘤
CN111018988B (zh) * 2019-11-26 2021-09-21 山东立菲生物产业有限公司 一种抗cd19的抗体、制备方法及其应用
AR121370A1 (es) * 2020-02-28 2022-06-01 Lilly Co Eli Anticuerpos anti-cd19 humano
JP2023530499A (ja) 2020-06-22 2023-07-18 モルフォシス・アーゲー 抗ＣＤ１９抗体及びＳＩＲＰα－ＣＤ４７自然免疫チェックポイントを遮断するポリペプチドを含む抗腫瘍組み合わせ療法
JP2023544200A (ja) 2020-10-06 2023-10-20 ゼンコー・インコーポレイテッド 全身性エリテマトーデス（ｓｌｅ）を含む自己免疫疾患を治療するためのバイオマーカー、方法、及び組成物
AU2021391623A1 (en) 2020-12-04 2023-06-29 Incyte Corporation Anti-cd19 combination therapy
WO2023073645A1 (en) 2021-10-29 2023-05-04 Takeda Pharmaceutical Company Limited Therapy comprising anti-cd19 antibody and sumo-activating enzyme inhibitor
WO2024038115A1 (en) 2022-08-17 2024-02-22 Morphosys Ag Therapy comprising anti-cd19 antibody and ezh2 modulators

Family Cites Families (112)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4196265A (en) 1977-06-15 1980-04-01 The Wistar Institute Method of producing antibodies
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US5082658A (en) 1984-01-16 1992-01-21 Genentech, Inc. Gamma interferon-interleukin-2 synergism
US5807715A (en) 1984-08-27 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and transformed mammalian lymphocyte cells for producing functional antigen-binding protein including chimeric immunoglobulin
US5679543A (en) 1985-08-29 1997-10-21 Genencor International, Inc. DNA sequences, vectors and fusion polypeptides to increase secretion of desired polypeptides from filamentous fungi
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US4935233A (en) 1985-12-02 1990-06-19 G. D. Searle And Company Covalently linked polypeptide cell modulators
US5359035A (en) 1985-12-21 1994-10-25 Hoechst Aktiengesellschaft Bifunctional proteins including interleukin-2 (IL-2) and granuloctyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF)
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
EP0307434B2 (en) 1987-03-18 1998-07-29 Scotgen Biopharmaceuticals, Inc. Altered antibodies
US5258498A (en) 1987-05-21 1993-11-02 Creative Biomolecules, Inc. Polypeptide linkers for production of biosynthetic proteins
DE3856559T2 (de) 1987-05-21 2004-04-29 Micromet Ag Multifunktionelle Proteine mit vorbestimmter Zielsetzung
US5091513A (en) 1987-05-21 1992-02-25 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
EP0294703B1 (en) 1987-06-10 1995-05-10 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Bifunctional antibody constructs and method for selectively destroying cell populations
US5064646A (en) 1988-08-02 1991-11-12 The University Of Maryland Novel infectious bursal disease virus
PH26813A (en) 1987-09-02 1992-11-05 Ciba Geigy Ag Conjugates of cytokines with immunoglobulins
US5677425A (en) 1987-09-04 1997-10-14 Celltech Therapeutics Limited Recombinant antibody
ATE108068T1 (de) 1987-09-23 1994-07-15 Bristol Myers Squibb Co Antikörper-heterokonjugate zur töting von hiv- infizierten zellen.
PT88641B (pt) 1987-10-02 1993-04-30 Genentech Inc Metodo para a preparacao de uma variante de adesao
JP3040121B2 (ja) 1988-01-12 2000-05-08 ジェネンテク，インコーポレイテッド 増殖因子レセプターの機能を阻害することにより腫瘍細胞を処置する方法
CA1341588C (en) 1988-01-26 2009-01-06 Michel Revel Human ifn-beta2/i1-6, its purification and use
DE3812605A1 (de) 1988-04-15 1990-06-07 Leskovar Peter Dipl Ing Dr Hab Immunregulative stoffe und stoffgemische zur aktiven beeinflussung des krankheitsverlaufes
US4975369A (en) 1988-04-21 1990-12-04 Eli Lilly And Company Recombinant and chimeric KS1/4 antibodies directed against a human adenocarcinoma antigen
IT1217724B (it) 1988-05-26 1990-03-30 Ist Naz Ric Sul Cancro Anticorpo monoclonale specifico per una sequenza di fibronettina espressa in cellule trasformate ibridoma secernente tale anticorpo e impiego dell'anticorpo monoclonale per la diagnosi di tumori
US5601819A (en) 1988-08-11 1997-02-11 The General Hospital Corporation Bispecific antibodies for selective immune regulation and for selective immune cell binding
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5116964A (en) 1989-02-23 1992-05-26 Genentech, Inc. Hybrid immunoglobulins
US5225538A (en) 1989-02-23 1993-07-06 Genentech, Inc. Lymphocyte homing receptor/immunoglobulin fusion proteins
US6291158B1 (en) 1989-05-16 2001-09-18 Scripps Research Institute Method for tapping the immunological repertoire
US5399346A (en) 1989-06-14 1995-03-21 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Gene therapy
US5196320A (en) 1989-09-20 1993-03-23 Abbott Biotech, Inc. Method of producing engineered binding proteins
AU633357B2 (en) 1989-09-20 1993-01-28 Abbott Laboratories Method of producing fusion proteins
US5314995A (en) 1990-01-22 1994-05-24 Oncogen Therapeutic interleukin-2-antibody based fusion proteins
JPH07507440A (ja) 1990-03-02 1995-08-24 レプリゲン・コーポレーション 結合親和性を高めた抗体構築物
HUT60768A (en) * 1990-03-16 1992-10-28 Sandoz Ag Process for producing cd25 fixing molecules
JPH06504262A (ja) 1990-07-27 1994-05-19 レブリゲン　コーポレーション 脈管形成性の病気の処置用の新規な方法と組成物
US5650150A (en) 1990-11-09 1997-07-22 Gillies; Stephen D. Recombinant antibody cytokine fusion proteins
WO1992008495A1 (en) 1990-11-09 1992-05-29 Abbott Biotech, Inc. Cytokine immunoconjugates
WO1992008801A1 (en) 1990-11-09 1992-05-29 Abbott Laboratories Bridging antibody fusion constructs
KR100237968B1 (ko) 1990-12-05 2000-01-15 한센 핀 베네드 변화된 에피토프를 지닌 단백질 및 그 제조방법
GB9105245D0 (en) 1991-03-12 1991-04-24 Lynxvale Ltd Binding molecules
US6072039A (en) 1991-04-19 2000-06-06 Rohm And Haas Company Hybrid polypeptide comparing a biotinylated avidin binding polypeptide fused to a polypeptide of interest
EP0519596B1 (en) 1991-05-17 2005-02-23 Merck & Co. Inc. A method for reducing the immunogenicity of antibody variable domains
US6797492B2 (en) 1991-05-17 2004-09-28 Merck & Co., Inc. Method for reducing the immunogenicity of antibody variable domains
WO1993003157A1 (en) 1991-07-29 1993-02-18 Dana Farber Cancer Institute Plasmids for the rapid preparation of modified proteins
EP0601043B1 (en) 1991-08-30 1998-11-25 Fred Hutchinson Cancer Research Center Hybrid cytokines
US20020037558A1 (en) 1991-10-23 2002-03-28 Kin-Ming Lo E.coli produced immunoglobulin constructs
US6627615B1 (en) 1991-12-17 2003-09-30 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for in vivo gene therapy
GB9206422D0 (en) 1992-03-24 1992-05-06 Bolt Sarah L Antibody preparation
IL105914A0 (en) 1992-06-04 1993-10-20 Univ California Methods and compositions for in vivo gene therapy
DE69332485T2 (de) 1992-08-11 2003-11-13 The President And Fellows Of Harvard College, Cambridge Immunmodulierende peptide
DE4228839A1 (de) 1992-08-29 1994-03-03 Behringwerke Ag Verfahren zum Nachweis und zur Bestimmung von Mediatoren
US5639641A (en) * 1992-09-09 1997-06-17 Immunogen Inc. Resurfacing of rodent antibodies
EP0627932B1 (en) 1992-11-04 2002-05-08 City Of Hope Antibody construct
AU6776194A (en) 1993-04-28 1994-11-21 Hybritech Incorporated Method for creating optimized regulatory regions affecting protein expression and protein trafficking
US5554512A (en) 1993-05-24 1996-09-10 Immunex Corporation Ligands for flt3 receptors
GB9316989D0 (en) 1993-08-16 1993-09-29 Lynxvale Ltd Binding molecules
ES2166368T3 (es) 1993-12-24 2002-04-16 Merck Patent Gmbh Inmunoconjugados.
CU22615A1 (es) 1994-06-30 2000-02-10 Centro Inmunologia Molecular Procedimiento de obtención de anticuerpos monoclonales murinos menos inmunogénicos. anticuerpos monoclonales obtenidos
US5888773A (en) 1994-08-17 1999-03-30 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Method of producing single-chain Fv molecules
US5541087A (en) 1994-09-14 1996-07-30 Fuji Immunopharmaceuticals Corporation Expression and export technology of proteins as immunofusins
US6309636B1 (en) 1995-09-14 2001-10-30 Cancer Research Institute Of Contra Costa Recombinant peptides derived from the Mc3 anti-BA46 antibody, methods of use thereof, and methods of humanizing antibody peptides
WO1997000317A1 (en) 1995-06-07 1997-01-03 Osteosa Inc. Osteoclast growth regulatory factor
US5723125A (en) 1995-12-28 1998-03-03 Tanox Biosystems, Inc. Hybrid with interferon-alpha and an immunoglobulin Fc linked through a non-immunogenic peptide
AU1952497A (en) 1996-02-13 1997-09-02 Regents Of The University Of California, The Novel antibody-cytokine fusion protein, and methods of making and using the same
US6100387A (en) 1997-02-28 2000-08-08 Genetics Institute, Inc. Chimeric polypeptides containing chemokine domains
GB2339430A (en) 1997-05-21 2000-01-26 Biovation Ltd Method for the production of non-immunogenic proteins
GB9712892D0 (en) 1997-06-20 1997-08-20 Eclagen Ltd Identification of mhc binding peptides
US6608183B1 (en) 1997-07-14 2003-08-19 Bolder Biotechnology, Inc. Derivatives of growth hormone and related proteins
DK1037927T3 (da) 1997-12-08 2004-09-06 Emd Lexigen Res Ct Corp Heterodimere fusionsproteiner, der er nyttige til målrettet immunterapi og generel immunstimulering
US20030105294A1 (en) 1998-02-25 2003-06-05 Stephen Gillies Enhancing the circulating half life of antibody-based fusion proteins
EP1071468B1 (en) 1998-04-15 2006-06-14 Lexigen Pharmaceuticals Corp. Enhancement of antibody-cytokine fusion protein mediated immune responses by co-administration with angiogenesis inhibitor
PL343486A1 (en) 1998-04-17 2001-08-27 Lexigen Pharm Corp Enhancement of antibody-cytokine fusion protein mediated immune responses by co-administration with prostaglandin inhibitor
EP1088888A4 (en) 1998-05-14 2005-03-16 Merck Patent Gmbh MERGED PROTEIN
GB9814383D0 (en) 1998-07-02 1998-09-02 Cambridge Antibody Tech Improvements relating to antibodies
WO2000011033A2 (en) 1998-08-25 2000-03-02 Lexigen Pharmaceuticals Corp. Expression and export of angiostatin and endostatin as immunofusins
US6646113B1 (en) 1998-09-17 2003-11-11 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Nucleic acid molecule encoding human survival of motor neuron-interacting protein 1 (SIP1) deletion mutants
US6335176B1 (en) 1998-10-16 2002-01-01 Pharmacopeia, Inc. Incorporation of phosphorylation sites
WO2000034317A2 (en) 1998-12-08 2000-06-15 Biovation Limited Method for reducing immunogenicity of proteins
EP1141013A2 (en) 1999-01-07 2001-10-10 Lexigen Pharmaceuticals Corp. EXPRESSION AND EXPORT OF ANTI-OBESITY PROTEINS AS Fc FUSION PROTEINS
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
DK2270147T4 (da) 1999-04-09 2020-08-31 Kyowa Kirin Co Ltd Fremgangsmåde til at kontrollere aktiviteten af immunologisk funktionelt molekyle
HUP0201474A3 (en) 1999-05-19 2002-11-28 Lexigen Pharmaceuticals Corp L Expression and export of interferon-alpha proteins as fc fusion proteins
US7067110B1 (en) 1999-07-21 2006-06-27 Emd Lexigen Research Center Corp. Fc fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens
SK782002A3 (en) 1999-07-21 2003-08-05 Lexigen Pharm Corp FC fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens
EP1200479B1 (en) 1999-08-09 2006-02-01 Lexigen Pharmaceuticals Corp. Multiple cytokine-antibody complexes
US20050202538A1 (en) 1999-11-12 2005-09-15 Merck Patent Gmbh Fc-erythropoietin fusion protein with improved pharmacokinetics
DK1252192T3 (da) 2000-02-11 2006-11-20 Merck Patent Gmbh Forbedring af antistofbaserede fusionsproteiners serumhalveringstid
US7517526B2 (en) 2000-06-29 2009-04-14 Merck Patent Gmbh Enhancement of antibody-cytokine fusion protein mediated immune responses by combined treatment with immunocytokine uptake enhancing agents
US6475707B2 (en) * 2000-12-22 2002-11-05 United Microelectronics Corp. Method of reworking photoresist layer
US20030133939A1 (en) 2001-01-17 2003-07-17 Genecraft, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
JP2004525620A (ja) 2001-01-17 2004-08-26 トルビオン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 結合ドメイン−免疫グロブリン融合タンパク質
HUP0401300A3 (en) 2001-01-18 2005-06-28 Merck Patent Gmbh Bifunctional fusion proteins with glucocerebrosidase activity
KR100899970B1 (ko) 2001-02-19 2009-05-28 메르크 파텐트 게엠베하 Ｔ-세포 에피토프의 동정 방법 및 감소된 면역원성을 갖는분자의 제조를 위한 용도
PL362324A1 (en) 2001-02-19 2004-10-18 Merck Patent Gmbh Artificial fusion proteins with reduced immunogenicity
MXPA03008031A (es) 2001-03-07 2003-12-04 Merck Patent Gmbh Tecnologia de expresion para proteinas que contienen porcion de anticuerpo isotipo hibrida.
WO2002079415A2 (en) 2001-03-30 2002-10-10 Lexigen Pharmaceuticals Corp. Reducing the immunogenicity of fusion proteins
PT1383785E (pt) 2001-05-03 2011-06-28 Merck Patent Gmbh Anticorpo recombinante específico de tumores e utilização deste
MXPA04005266A (es) 2001-12-04 2004-10-11 Merck Patent Gmbh Inmunocitocinas con selectividad modulada.
US6736056B1 (en) 2002-11-15 2004-05-18 A Marek Ken Company Manual ink applicator
PL211180B1 (pl) 2002-12-17 2012-04-30 Merck Patent Gmbh Białko fuzyjne typu przeciwciało-IL2, wektor zawierający sekwencję kwasów nukleinowych kodujących takie białko, kompozycja farmaceutyczna zawierająca takie białko fuzyjne oraz jego zastosowania do wytwarzania leków
US8147832B2 (en) 2003-08-14 2012-04-03 Merck Patent Gmbh CD20-binding polypeptide compositions and methods
US20050069521A1 (en) 2003-08-28 2005-03-31 Emd Lexigen Research Center Corp. Enhancing the circulating half-life of interleukin-2 proteins
CA2551915C (en) 2003-12-30 2015-06-23 Merck Patent Gesellschaft Mit Beschraenkter Haftung Il-7 fusion proteins
KR20060124656A (ko) 2003-12-31 2006-12-05 메르크 파텐트 게엠베하 개선된 약물동태를 가지는 Ｆｃ-에리스로포이에틴 융합단백질
AU2005206277B2 (en) 2004-01-22 2011-06-23 Merck Patent Gmbh Anti-cancer antibodies with reduced complement fixation
US7670595B2 (en) 2004-06-28 2010-03-02 Merck Patent Gmbh Fc-interferon-beta fusion proteins
AU2005313492B2 (en) 2004-12-09 2011-12-15 Merck Patent Gmbh IL-7 variants with reduced immunogenicity
US20060280738A1 (en) 2005-06-08 2006-12-14 Tedder Thomas F Anti-CD19 antibody therapy for transplantation
KR101397290B1 (ko) 2005-12-30 2014-05-21 메르크 파텐트 게엠베하 감소한 면역원성을 가지는 항-ｃｄ19 항체

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JBC, Vol. 278, No. 5, Pages 3466-3473(2003. 1. 31.). *
JBC, Vol. 278, No. 5, Pages 3466-3473(2003. 1. 31.).*
PNAS Vol. 102, No. 42, Pages 15178-15183(2005. 10. 18.). *
PNAS Vol. 102, No. 42, Pages 15178-15183(2005. 10. 18.).*
Protein Engineering Vol. 9, No. 10, Pages 895-904(공개일: 1996.10.) *
Protein Engineering Vol. 9, No. 10, Pages 895-904(공개일: 1996.10.)*

Also Published As

Publication number Publication date
US11208496B2 (en) 2021-12-28
EP2270050B1 (en) 2013-06-05
DK1966245T3 (da) 2011-07-18
US10072092B2 (en) 2018-09-11
CN101351477A (zh) 2009-01-21
EA016429B1 (ru) 2012-04-30
JP2016014039A (ja) 2016-01-28
EP2270050A1 (en) 2011-01-05
ES2426468T3 (es) 2013-10-23
AU2006332155A1 (en) 2007-07-12
WO2007076950A1 (en) 2007-07-12
KR20080090485A (ko) 2008-10-08
PT1966245E (pt) 2011-08-31
CA2635623A1 (en) 2007-07-12
US20190241671A1 (en) 2019-08-08
US20140288288A1 (en) 2014-09-25
US8957195B2 (en) 2015-02-17
BRPI0620795A2 (pt) 2011-11-22
ATE509954T1 (de) 2011-06-15
US20150322159A1 (en) 2015-11-12
JP2009521912A (ja) 2009-06-11
EP1966245A1 (en) 2008-09-10
CA2635623C (en) 2015-02-17
JP6104332B2 (ja) 2017-03-29
US20070154473A1 (en) 2007-07-05
AU2006332155B2 (en) 2013-01-10
CN101351477B (zh) 2011-11-16
EA200870132A1 (ru) 2008-12-30
ZA200806609B (en) 2009-11-25
EP1966245B1 (en) 2011-05-18
ES2365046T3 (es) 2011-09-21
US8691952B2 (en) 2014-04-08
PT2270050E (pt) 2013-09-12
DK2270050T3 (da) 2013-08-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101397290B1 (ko) 감소한 면역원성을 가지는 항-ｃｄ19 항체
JP6927639B2 (ja) ヒトクローディン−１８．２を結合する抗体およびその使用
TWI445716B (zh) Ｐｃｓｋ９拮抗劑類
JP2008533985A (ja) ＭＣＳＰを対象とし、且つ、Ｆｃ受容体結合親和性とエフェクター機能を増強した抗原結合分子
JP7505148B2 (ja) Ｌａｇ３に結合する抗体およびその使用
US20230112085A1 (en) Anti-b7-h4 constructs and uses thereof
KR20200118458A (ko) 개선된 면역치료 효과를 갖지만 약화된 부작용을 갖는 돌연변이 항-ctla-4 항체
CN112566937A (zh) 对cd3特异性的抗体及其用途
CN115812081A (zh) 抗ctla-4抗体及其用途
CA3114955A1 (en) Combination therapy for cancer
KR20230156691A (ko) Pd-l1 결합 항체 및 그의 용도
EP4180457A1 (en) Anti-cldn-18.2 antibody and use thereof
MX2008008256A (en) Anti-cd19 antibodies with reduced immunogenicity

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E90F Notification of reason for final refusal
E902 Notification of reason for refusal
E90F Notification of reason for final refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20170421

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20180502

Year of fee payment: 5

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20200213

Year of fee payment: 6

R401 Registration of restoration