ES2568625T3

ES2568625T3 - Aislamiento de cinco genes novedosos que codifican nuevos melanomas de tipo receptor de Fc implicados en la patogénesis del linfoma/melanoma

Info

Publication number: ES2568625T3
Application number: ES00983778.2T
Authority: ES
Inventors: Riccardo Dalla-Favera
Original assignee: Columbia University in the City of New York
Current assignee: Columbia University in the City of New York
Priority date: 1999-11-29
Filing date: 2000-11-28
Publication date: 2016-05-03
Anticipated expiration: 2020-11-28
Also published as: EP2363403A2; EP1235847A4; HK1049843B; EP2363403A3; HK1049843A1; EP2363403B1; ES2581239T3; WO2001038490A3; JP2003532378A; EP2404927A2; ES2586850T3; HK1161723A1; EP2418212B1; HK1166009A1; CY1117761T1; DK1235847T3; EP2316843B1; WO2001038490A2; ES2591102T3; EP2316843A1

Abstract

Una molécula de ácido nucléico que codifica la proteína receptora de inmunoglobulina, Asociada a la Translocación de Receptores de la superfamilia de Inmunoglobulinas, IRTA2, que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en las Figuras 18B-1 a 18B-3.

Description

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

DESCRIPCION

Aislamiento de cinco genes novedosos que codifican nuevos melanomas de tipo receptor de Fc implicados en la patogenesis del linfoma/melanoma

La invencion descrita en la presente memoria se realizo en el curso del trabajo bajo la Concesion NCI Num. CA 44029 del Instituto Nacional del Cancer. En consecuencia, el Gobierno de Estados Unidos tiene ciertos derechos sobre esta invencion.

A lo largo de toda esta solicitud, las diversas referencias se mencionan entre parentesis.

Las citas bibliograficas completas para estas referencias se pueden encontrar al final de esta solicitud, antes de las reivindicaciones.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION

Las anomallas del cromosoma 1q21 son comunes en las neoplasias malignas de celulas B, incluyendo el linfoma de celulas B y el mieloma, pero los genes elegidos como diana por estas aberraciones son en gran parte desconocidos. Mediante la clonacion de los puntos de rotura de una translocacion cromosomica t(1;14)(q21;q32) en una llnea celular de mieloma, los autores de la presente invencion han identificado dos nuevos genes, IRTA1 e IRTA2, que codifican receptores de la superficie celular con homologlas con las familias de Receptores de Fc e Inhibidores. Ambos genes se expresan normalmente en las celulas B maduras, pero con diferentes distribuciones en los organos linfoides perifericos: IRTA1 se expresa en celulas B de la zona marginal, mientras IRTA2 tambien se expresa en centrocitos del centro germinal y en inmunoblastos. Como resultado de la translocacion t(1;14), el peptido senal IRTA1 se fusiona con el dominio Ca de la Inmunoglobulina para producir una protelna de fusion IRTA1/Ca quimerica. En las llneas celulares de mieloma multiple y de linfoma de Burkitt con anomallas en 1q21, la expresion de IRTA2 esta desregulada. Por lo tanto, IRTA1 e IRTA2 son inmunorreceptores novedosos con un papel potencialmente importante en el desarrollo de celulas B y la linfomagenesis.

El linfoma de celulas B no Hodgkin (LNH-B) y el mieloma multiple (MM) representan un grupo heterogeneo de neoplasias malignas derivadas de celulas B maduras con fenotipos correspondientes a celulas del pre-Centro Germinal (CG) (celulas del manto), GC (celulas grandes difusas, foliculares, de Burkitt), o post-CG (MM) (para la revision, Gaidano y Dalla-Favera, 1997; Kuppers et al., 1999). Se ha obtenido una informacion valiosa en torno a la patogenesis de estas neoplasias malignas mediante la identificacion de anomallas cromosomicas clonales recurrentes caracterlsticas para los subtipos especlficos de las enfermedades. La consecuencia comun de estas translocaciones es la desregulacion transcripcional de los protooncogenes por su yuxtaposicion a los elementos reguladores de la transcripcion heterologos localizados en el cromosoma companero (Gaidano y Dalla-Favera, 1997). Estos elementos reguladores de la transcription heterologos pueden derivar del locus de inmunoglobulina (IG) o de otros loci cromosomicos del companero. Los ejemplos incluyen MYC en t(8;14) (q24;q32) en el linfoma de Burkitt (LB) (Dalla-Favera et al, 1982; Taub et al., 1982), el gen CCND1 desregulado por la t(11;14) (q13;q32) en el linfoma de celulas del manto (LCM) (Rosenberg et al., 1991) y mieloma multiple (MM) (Ronchetti et al., 1999), BCL2 implicado en la t(14;18); (q32;q21) en el linfoma folicular (LF) (Bakhshi et al., 1985), BCL6 en t(3; 14) (q27;q32) en linfoma difuso de celulas B grandes (LDCG) (Ye et al., 1993), as! como FGFR3 en t(4; 14) (p16;q32). (Chesi et al., 1997), MAF en t(14;16) [q32;q23) (Chesi et al., 1998) y MUM1/IRF4 en t(6;14) (p25;q32) (Iida et al., 1997) en el mieloma multiple (MM). La identificacion de estos oncogenes ha ofrecido informacion valiosa sobre la patogenesis y el diagnostico de sus correspondientes neoplasias malignas.

Las anomallas cromosomicas que estan implicadas en la banda 1q21-q23 se encuentran entre las lesiones geneticas mas frecuentes tanto en LNH-B como en MM. Entre los subtipos de LNH, se ha informado sobre puntos de rotura en 1q21-q23, incluyendo translocaciones y duplicaciones, a menudo como la unica anomalla cromosomica, en 17-20% de los linfomas de celulas B grandes difusos y foliculares (LDCG), en 39% de los linfomas de celulas B de la zona marginal (Offit et al., 1991; Whang Peng et al., 1995; Cigudosa et al., 1999) y en de 27-38% de los linfomas de Burkitt, donde representan la segunda anomalla citogenetica mas comun despues de translocaciones que implican al proto-oncogen MYC (Berger y Bernheim, 1985; Kornblau et al., 1991). La hibridacion comparativa del genoma (HCG) tambien ha identificado 1q21-q23 como un sitio recurrente para la amplification de alto nivel en 10% de los casos de LDCG (Rao et al., 1998). En el MM, la trisomla de la region 1q21-q32 ha sido referida en 20-31% de los casos (Sawyer et al., 1995), la amplificacion de la region 1q12-qter en 80% de las llneas celulares y 40% de los tumores primarios (Avet-Loiseau et al., 1997), y las translocaciones de todo el brazo desequilibradas no aleatorias de 1q, asociadas con la multiduplication de la region adyacente 1q21-22, se encontraron en 23% de los pacientes con cariotipos anormales (Sawyer et al., 1998).

La alta frecuencia de implication de los reordenamientos estructurales 1q21 en las neoplasias malignas de celulas B sugiere que este locus puede albergar genes crlticos para la patogenesis de estas enfermedades. La clonacion de una t(1;14)(q21;q32) en una llnea celular de leucemia linfoblastica aguda pre-B identifico previamente un nuevo gen, BCL9 desregulado solamente en este caso (Willis et al., 1998), pero no implicado en otros casos. Un informe

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

reciente caracterizo la t(1;22) (q22;q11) en una ilnea celular de linfoma folicular (LF) y se encontro que el locus FCGR2B, que codifica el receptor Fc de IgG de baja afinidad FCGRIIb, era elegido como diana en esta llnea celular y en dos casos adicionales de FL (Callanan et al., 2000). Por ultimo, el locus MUC1 ha sido identificado en la proximidad del punto de rotura de una t(1;14)(q21;q32) en NHL (Dyomin et al., 2000; Gilles et al., 2000), y se han encontrado reordenamientos del locus MUC1 en 6% de los NHL con anomallas 1q21 (Dyomin et al., 2000). Estos resultados ponen de manifiesto la heterogeneidad de los puntos de rotura de 1q21 y la necesidad de identificar oncogenes candidatos adicionales situados en este locus, ya que la gran mayorla de estas alteraciones permanecen sin explicacion.

El documento EP-A2 0 330 191 describe un metodo para la clonacion de ADNc a partir de bibliotecas de expresion de mamlferos basadas en la expresion transitoria en celulas anfitrionas de mamlfero.

La Base de Datos EMBL, clon IMAGE: 1333716, Num. de Acceso de la Base de datos AA811806 describe una secuencia de acido ribonucleico mensajero (ARNm) humano de 475 pares de bases (AA811806.1), la Base de Datos EMBL, clon IMAGE: 2301418, Num. de Acceso de la Base de datos AI699363 (EST humano) describe una secuencia de acido ribonucleico mensajero (ARNm) humano de 429 pares de bases. La Base de Datos EMBL, clon IMAGE: 1327317. Num. de Acceso de la Base de datos AA724600 describe una secuencia de acido ribonucleico mensajero (ARNm) humano de 422 pares de bases.

El objetivo de este estudio fue explorar mas a fondo la arquitectura de los reordenamientos cromosomicos 1q21 en neoplasias malignas de las celulas B. Para ello, los autores de la presente invencion han empleado un enfoque de clonacion molecular de la t(1;14)(q21;q32) presente en la llnea celular de mieloma FR4. Los autores de la presente invencion han identificado dos nuevos genes que son elegidos como diana diferencialmente por anomallas de 1q21. Estos genes codifican cinco nuevos miembros de la familia de receptores de inmunoglobulina, IRTA1, IRTA2, IRTA3, IRTA4 y IRTA5 (Immunoglobulin superfamiliy Receptor Translocation Associated genes (Genes asociados a la translocacion de receptores de la superfamilia de inmunoglobulina) 1, 2, 3, 4, y 5), que pueden ser importantes para la funcion de los linfocitos normales y para las neoplasias malignas de celulas B.

COMPENDIO DE LA INVENCION

Esta invencion proporciona una molecula de acido nucleico aislada que codifica la protelna receptora de inmunoglobulina, Asociada a la Translocacion de Receptores de la superfamilia de Inmunoglobulinas, IRTA2.

Se describe un metodo para producir un polipeptido IRTA (protelna) que comprende: (a) introducir un vector que comprende un acido nucleico aislado que codifica una protelna receptora de inmunoglobulina, Asociada a la Translocacion de Receptores de la superfamilia de Inmunoglobulinas, IRTA, en una celula anfitriona adecuada; y (b) cultivar la celula resultante para producir el polipeptido.

Esta invencion proporciona una molecula de acido nucleico aislada que comprende al menos 15 nucleotidos contiguos capaz de hibridar especlficamente con una secuencia unica incluida dentro de la secuencia de la molecula de acido nucleico aislada que codifica la protelna IRTA2, o uno o varios fragmentos de la misma, que tiene la secuencia de aminoacidos expuesta en cualquiera de las Figuras 18B-1-18B-3.

Esta invencion proporciona un metodo para detectar una neoplasia maligna de celulas B o un tipo de neoplasia maligna de celulas B en una muestra de un sujeto en donde la neoplasia maligna de celulas B comprende una reordenacion cromosomica 1q21, que comprende:

a) poner en contacto el ARN de una muestra obtenida del sujeto con una molecula de acido nucleico de al menos 15 nucleotidos contiguos capaz de hibridar especlficamente con una secuencia unica incluida dentro de la secuencia de un ARN aislado que codifica la protelna IRTA2 humana en condiciones que permiten la hibridacion del ARN de la etapa (a) con la molecula de acido nucleico capaz de hibridar especlficamente con una secuencia unica incluida dentro de la secuencia de un ARN aislado que codifica una protelna IRTA2 humana, en donde la molecula de acido nucleico esta marcada con un marcador detectable; y b) detectar cualquier hibridacion en la etapa (a), en donde la deteccion de hibridacion indica la presencia de neoplasia maligna de celulas B o un tipo de neoplasia maligna de celulas B en la muestra.

Esta invencion proporciona un oligonucleotido antisentido que tiene una secuencia capaz de hibridar especlficamente con una molecula de ARNm que codifica una protelna IRTA2 humana con el fin de evitar la expresion en exceso de la molecula de ARNm.

Esta invencion proporciona una protelna IRTA2 purificada que comprende la secuencia de aminoacidos expuesta en las Figuras 18B-1-18B-3 (SEQ ID NO: 3).

Esta invencion proporciona uno o varios anticuerpos dirigidos a un epltopo de una protelna IRTA2 purificada, o uno o varios fragmentos de los mismos, que tienen la secuencia de aminoacidos expuesta en las Figuras 18B-1-18B-3.

Esta invencion proporciona un anticuerpo dirigido a una protelna IRTA2 purificada.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Esta invencion proporciona una composition farmaceutica que comprende una cantidad del anticuerpo dirigido a una protelna IRTA2 eficaz para unirse a las celulas cancerosas que expresan una protelna IRTA2 humana con el fin de evitar el crecimiento de las celulas cancerosas y un portador farmaceuticamente aceptable.

Esta invencion proporciona una composicion farmaceutica que comprende una cantidad de cualquiera de los oligonucleotidos de moleculas de acido nucleico que codifican las protelnas IRTA2 descritas en la presente memoria eficaz para prevenir la expresion en exceso de una protelna IRTA2 humana y un portador farmaceuticamente aceptable idoneo. Esta invencion proporciona un metodo de diagnostico de neoplasias malignas de celulas B que comprende una reordenacion cromosomica 1q21 en una muestra de un sujeto que comprende:

a) poner en contacto la muestra obtenida del sujeto con un anticuerpo dirigido a una protelna IRTA2 purificada capaz de unirse especlficamente con una protelna IRTA2 humana sobre la superficie celular de una celula cancerosa en condiciones que permiten la union del anticuerpo con la protelna IRTA2 humana sobre la superficie celular de la celula cancerosa, en donde el anticuerpo esta marcado con un marcador detectable; y

b) detectar cualquier union en la etapa (a), en donde la detection de la union indica un diagnostico de neoplasia maligna de celulas B en la muestra.

Se describe un metodo para detectar la protelna IRTA humana en una muestra que comprende: a) poner en contacto la muestra con cualquiera de los anticuerpos anti-IRTA descritos anteriormente bajo condiciones que permitan la formation de un complejo entre el anticuerpo y la IRTA en la muestra; y b) detectar el complejo formado en la etapa (a), detectando de ese modo la presencia de IRTA humana en la muestra.

Esta invencion proporciona el uso para el tratamiento de un sujeto que tiene un cancer de celulas B, que comprende administrar al sujeto una cantidad de anticuerpo anti-IRTA2 eficaz para unirse a las celulas cancerosas que expresan una protelna IRTA2 con el fin de evitar el crecimiento de las celulas cancerosas y un portador farmaceuticamente aceptable, tratando de este modo al sujeto.

Esta invencion proporciona un uso para el tratamiento de un sujeto que tiene un cancer de celulas B, que comprende administrar al sujeto una cantidad de un oligonucleotido antisentido que tiene una secuencia capaz de hibridar especlficamente con una molecula de ARNm que codifica una protelna IRTA2 humana con el fin de evitar la expresion en exceso de la protelna IRTA2 humana, con el fin de detener el crecimiento celular o inducir la muerte celular de las celulas cancerosas que expresan la protelna IRTA2 y un portador farmaceuticamente aceptable, tratando de este modo al sujeto.

La invencion tambien proporciona una composicion farmaceutica que comprende una cantidad eficaz de cualquiera de los oligonucleotidos descritos en la presente memoria y un portador farmaceuticamente aceptable.

La invencion tambien proporciona una composicion farmaceutica que comprende una cantidad eficaz de un anticuerpo dirigido contra un epltopo de la protelna IRTA2 descrita en la presente memoria y un portador farmaceuticamente aceptable.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS

Figuras 1A-1B.

donation molecular de la translocation t(1;14)(q21;q32) en la llnea celular de mieloma multiple FR4. Fig. 1A) Representation esquematica de los clones AFR4B-5 y AFR4S-a, que representan los puntos de rotura der(14) y der(1), y de la llnea germinal IgH y loci 1q21. Fig. 1B) Secuencia de nucleotidos de la union del punto de rotura y su alineamiento con las regiones correspondientes de la llnea germinal del cromosoma 14. Sa, region de cambio de IgA; LCR: region de control del locus 3' IgH; B, BamHI; H, Hindi!!; X, XhoI.

Figuras 2A-2B.

Mapa genomico del locus 1q21 en las proximidades del punto de rotura FR4. Fig. 2A) Mapa de endonucleasas de restriction y representacion esquematica de clones genomicos, es decir, bacteriofagos (1), cromosomas artificiales P1 (PAC) (2), y cromosoma artificial de levadura (YAC) (3), que abarca el locus de 1q21 de la llnea germinal en la region del punto de rotura de FR4 (punta de flecha). El nombre de cada clon se coloca directamente sobre la parte superior de su representacion. Los fragmentos finales derivados de los insertos de PAC y YAC se representan como clrculos, ya sea con una orientation del vector SP6/T7 (PAC), ya sea con una orientacion del vector del brazo izquierdo/derecho (YAC). El panel superior de la Fig. 1A representa la organization genomica de dos genes que rodean el punto de rotura de FR4. Los dos genes fueron identificados por la captura del exon de PAC 49A16. Estan estrechamente espaciados en el genoma, dentro de < 30 Kb uno de otro y se denominan MUM2 y MUM3 (mieloma multiple 2 y 3). En el esquema de sus loci genomicos, los recuadros de color negro indican los exones codificantes, mientras que los recuadros de color blanco y gris claro o medio indican exones no codificantes. Los intrones conectores son llneas. MUM3 (izquierda) da lugar a tres ARNm empalmados alternativamente, que comparten todos una region no traducida 5' comun (UTR), pero diversas UTR 3' (marcadas por diferentes tonos). Los numeros debajo de los

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

recuadros identifican el orden de los exones del ADNc. Los exones menores de 100 pb se representan como llneas verticales delgadas. La posicion y el tamano de cada exon se determinaron por medio de secuenciacion de clones genomicos de PAC y de fagos y por hibridacion de sondas de ADNc con ADN del clon digerido con endonucleasas. El mapeo de PAC y yAC se realizo por digestion parcial con enzimas de corte raro seguido de Electroforesis en Gel de Campo Pulsado e hibridacion con sondas internas y derivadas de los extremos. Las llneas discontinuas alinean las regiones de solapamiento. S, SacI; H, Hindlll; S, Swal; Pc, Pacl; P, Pmel; Fig. 2B) Mapa de conexiones geneticas Genethon de 1q21 en la region del locus MUM2/MUM3. Los sitios de secuencia expresada (STS) se ordenan a una distancia aproximada determinada previamente por Dib, C., et al., (1996) Nature, 380: 162-164. El STS Wl-5435 (en negrita) esta contenido dentro de YAC 23GC4 y PAC 49A16. Las llneas verticales paralelas representan segmentos interrumpidos, cuyo tamano aproximado se representa anteriormente en megabases (MB). El dimensionamiento se estimo por el tamano de los contigos de YAC no quimericos entre dos marcadores. El gen BCL9 en el centromero fue clonado a partir de un punto de rotura de t(1;14)(q21;q32) diferente por Willis T.G. et al., (1998) Blood 91, 6: 1873-1.881. El gen FcGRllA esta en el llmite de la banda cromosomica lq21-q22.

Figuras 3A-3C.

Estructura del ARNm y patron de expresion de MUM2. Fig. 3A) Representacion esquematica del ARNm de MUM2. Los recuadros grandes rellenos representan los dominios codificantes y los recuadros vaclos estrechos representan regiones no traducidas. SP, peptido senal; EC, dominio extracelular; TM, dominio transmembrana; ClT, dominio citoplasmico; A(n), cola poliA. La region extracelular se compone de cuatro dominios similares a inmunoglobulina tal como se representa. Las senales de poliadenilacion alternativas (flechas) generan tres especies de ARNm de MUM2 (a, b, c) cuya longitud (en Kb) oscila de 2,6 a 3,5. Fig. 3B) Analisis de transferencia Northern de la expresion del ARNm de MUM2 en tejidos humanos del sistema inmunitario. La sonda de ADNc utilizada para el analisis se muestra como una barra continua de color negro debajo del esquema del ARNm en la Fig. 3A). Cada calle contiene 2 pg de ARNm del tejido correspondiente. En el lado derecho de la transferencia, se representa la posicion de los marcadores de peso molecular de ARN. La posicion de los transcritos de ARNm de MUM2 y GAPDH se muestra por medio de flechas. (Se incluyo una sonda de GAPDH en la hibridacion como un control interno - sonda marcada 0,15 ng + no marcada 50 ng). Los resultados de este analisis muestran expresion debil de MUM2 en los ganglios linfaticos y el bazo. No se detecto expresion de MUM2 en una variedad de tejidos humanos distintos (datos no mostrados). Fig. 3C) Analisis de transferencia Northern de la expresion de MUM2 en ARN total de EREB, una llnea de celulas linfoblastoides B transformadas con EBV condicional. EREB lleva, el genoma de EBV con una protelna de fusion de EBNA2-receptor de estrogeno, activa solo en presencia de estrogeno. Para este experimento, las celulas fueron cultivadas en presencia de estrogeno (1 pg/ml), seguido de la retirada de estrogeno durante los momentos indicados. Tras la retirada de estrogeno, las celulas EREB se someten a la detencion G0/G1, determinada por la perdida de la expresion de c-myc. En la Fig. 3C, una transferencia Northern del ARN total de EREB [10 pg por calle) se hibrido con la sonda de ADNc de MUM2 mostrada en la Fig. 3A y la sonda de control interno de GAPDH, como en la Fig. 3B. Las flechas indican la posicion de los ARNm correspondientes en la transferencia de EREB. a, la banda C corresponde a la especie MUM2 en el panel de la Fig. 3A. A continuacion, la misma transferencia se elimino y se volvio a sondear con una sonda de ADNc de c-myc (exon 2) para verificar detencion en la G0/G1 celular. La cuantificacion del ARNm de MUM2 por medio del uso de un analisis densitometrico Phosphorimager demuestra un aumento de 10 veces en sus niveles en el plazo de 48 horas de la retirada de estrogeno, lo que sugiere que la expresion de MUM2 es elevada ya que las celulas entran en una fase de reposo.

Figuras 4A-4B.

Estructura de ARNm y patron de expresion de MUM3. Fig. 4A) Representacion esquematica del ARNm de MUM3. Los recuadros grandes rellenos representan dominios codificantes y los recuadros vaclos estrechos o de color gris representan regiones no traducidas. SP, peptido senal; EC, dominio extracelular; TM, dominio transmembrana; ClT, dominio citoplasmico; A(n), cola poliA. La region extracelular se compone de dominios de tipo inmunoglobulina, tal como se representa. El empalme alternativo genera cuatro especies de ARNm con diversa localizacion subcelular. Se secretan las protelnas MUM3-a y d, mientras que MUM3-b contiene un tramo hidrofobo de aminoacidos en su extremo C-terminal que puede servir como senal para la adicion de un anclaje de glicofosfatidil-inositol (ancla de GPl), como se muestra. MUM3-c se extiende por la membrana plasmatica. La identidad de secuencia entre las especies se indica mediante un relleno identico. Fig. 4B) Analisis de transferencia Northern de la expresion del ARNm de MUM3 en multiples tejidos humanos (izquierda) y en diversas llneas celulares linfoides y no linfoides (derecha). La sonda de ADNc utilizada se muestra como una barra continua debajo del esquema de ADNc en la Fig. 4A. Cada calle contiene 2 pg de ARNm del tejido o la llnea celular correspondiente. La posicion de los transcritos de ARNm de MUM3 y GAPDH se muestra por medio de flechas. (Se incluyo una sonda de GAPDH en la hibridacion como control interno como se describe en la Fig. 3). a, b, c y d corresponden a la especie de ARNm de MUM3 mostrada en la Fig. 4A. RD, NC42 y CB33, llneas de celulas B linfoblastoides transformadas con virus de Epstein-Barr; EREB, llnea celular linfoblastoide B transformada con EBV condicional; FR4, llnea de celulas de plasma; MOLT4 y HUT78, llneas de celulas T; HL60 y U937, llneas de celulas mielomonoclticas; K562, llnea de celulas eritroides. Los resultados sugieren que MUM3 se expresa exclusivamente en los tejidos del sistema inmunitario de la medula osea, la linfa y el bazo y en particular en las celulas B con un fenotipo linfoblastoide.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Figura 5.

Secuencias de nucleotidos y aminoacidos de MUM2 humano. La secuencia de aminoacidos deducida se muestra por encima de la secuencia de nucleotidos con el codigo de una letra y se numera a la derecha, con la posicion 1 ajustada al primer codon del peptido senal. El sitio de la peptidasa senal pronosticado se obtuvo por medio de un algoritmo informatico descrito por Nielsen et al., Protein Engineering 10, 1-6 (1997) y se marca por medio de una punta de flecha. La senal de poliadenilacion AATAAA esta subrayada. Los sitios potenciales para la N-glicosilacion estan subrayados tambien en la secuencia de aminoacidos. Un tramo hidrofobo de 16 aminoacidos que se pronostica que abarca la membrana plasmatica esta doblemente subrayado. Los sitios de union a SH2 consenso se destacan por medio de un subrayado ondulado.

Figura 6A.

Secuencia de nucleotidos y de aminoacidos de MUM3-a humana. La secuencia de aminoacidos deducida se muestra por encima de la secuencia de nucleotidos con el codigo de una letra y se numera a la derecha, con la posicion 1 ajustada al primer codon del peptido senal. El sitio pronosticado para la escision de la peptidasa senal se obtuvo como se ha indicado anteriormente y se marca por medio de una punta de flecha. La senal de poliadenilacion ATTAAA esta subrayada. Los sitios potenciales para la N-glicosilacion tambien estan subrayados en la secuencia de aminoacidos. La protelna carece de un dominio transmembrana y se preve que sea secretada.

Figura 6B.

Secuencia de nucleotidos y de aminoacidos MUM3-b humana. La secuencia de aminoacidos deducida se muestra por encima de la secuencia de nucleotidos con el codigo de una letra y se numera a la derecha, con la posicion 1 ajustada al primer codon del peptido senal. El sitio pronosticado para la escision de la peptidasa senal se obtuvo como se ha indicado anteriormente y se marca por medio de una punta de flecha. La senal de poliadenilacion AATAAA esta subrayada. Los sitios potenciales para la N-glicosilacion estan subrayados en la secuencia de aminoacidos.

Figura 6C-1-6C-2.

Secuencia de nucleotidos y de aminoacidos de MUM3-c humana. La secuencia de aminoacidos deducida se muestra por encima de la secuencia de nucleotidos con el codigo de una letra y es numera a la derecha, con la posicion 1 ajustada al primer codon del peptido senal. El sitio pronosticado para la escision de la peptidasa senal se obtuvo como se ha indicado anteriormente y se marca por medio de una punta de flecha. La senal de poliadenilacion AATAAA esta subrayada. Los sitios potenciales para la N-glicosilacion estan subrayados en la secuencia de aminoacidos. Un tramo hidrofobo de 23 aminoacidos que se pronostica que abarca la membrana plasmatica esta doblemente subrayado. Los sitios de union a SH2 consenso se destacan por medio de un subrayado ondulado.

Figuras 7A-7C.

t(1;14)(q21;32) en FR4 genera un transcrito de fusion MUM2/Ca. Fig. 7A) Representacion esquematica del clon genomico der(14) AFR4B-5 y del locus IgHA1 de la llnea germinal. El punto de rotura de FR4 esta marcado por medio de una flecha. Los recuadros rellenos y huecos representan los exones codificantes de MUM2 y Calfa y los no codificantes, respectivamente. La posicion de la sonda 1 para el exon de MUM2 utilizada para el analisis de transferencia Northern se muestra por medio de una barra. Fig. 7B) El analisis de transferencia Northern con una sonda para el exon 1 de MUM2 sobre FR4 y llneas celulares adicionales detecta un mensaje anormal de 0,8 Kb, selectivamente en FR4. Las puntas de flecha apuntan a la ubicacion de mensaje normal de MUM2 en el ARNm de EREB. JJN3 y U266, llneas celulares de mieloma; EREB, llnea celular linfoblastoide B transformada con EVB condicional. Se cargaron dos pg de ARN poliA+ por calle. Fig. 7C) Secuencia de nucleotidos y aminoacidos del ADNc de la fusion MUM2-Ca en FR4. El ADNc se amplifico por medio de RT-PCR a partir del ARN total de FR4 usando los cebadores mostrados en la Fig. 7A, y posteriormente se subclono y se secuencio. La secuencia de aminoacidos deducida se muestra por encima de la secuencia de nucleotidos con el codigo de una letra y se numera a la derecha con la posicion 1 ajustada al primer codon del peptido senal. El sitio pronosticado para la escision de la peptidasa senal se obtuvo como se ha indicado anteriormente y se marca por medio de una punta de flecha. La senal de poliadenilacion AATAAA esta subrayada. El dominio transmembrana Calfa esta subrayado. La porcion MUM2 del ADNc se muestra en cursiva. H, Hindlll; B, BamHI; X, Xhol; Sa, region de cambio de IgA; EC, region extracelular; TM, transmembrana; CIT, dominio citoplasmico.

Figuras 8A-8C.

Clonacion molecular de la translocacion t(1;14)(q21;q32) en la llnea celular de mieloma multiple FR4. Fig. 8A) Representacion esquematica de los clones de fagos que representan los puntos de rotura der(14) y der(1) y los loci IGH y 1q21 de la llnea germinal. Se indican 14 secuencias de cromosomas mediante una llnea continua de color negro representando los recuadros de color negro los exones Ca1. Las secuencias del cromosoma 1 se muestran como una llnea de color gris. Las sondas utilizadas para el mapeo cromosomico se indican debajo del mapa. Los codigos para las enzimas de restriction son: B, BamHI; H, HindIII; X, XhoI; S, SacI; E, EcoRI. Para las enzimas marcadas con un (*) solo se muestran los sitios que delinean las sondas.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Sa: region de cambio de IgA; LCR: region de control del locus 3'IgH. Fig. 8B) Secuencia de nucleotidos de las uniones de los puntos de rotura y su alineamiento con las correspondientes regiones de la linea germinal de los cromosomas 14 y 1. Fig. 8C) A la izquierda, analisis de hibridacion fluorescente in situ (FISH) sobre dispersiones de metafase humana normales abarcando el clon PAC 49A16 (Fig. 13) la region 1q21 de la linea germinal en el punto de rotura de FR4. Derecha, imagen tenida con DAPI de la misma dispersion de metafase.

Figuras 9A-9B.

Estructura de los ADNc de IRTA1 e IRTA2. Figs.9A, 9B) Representacion esquematica de los ADNc de IRTA1 (Fig. 9A) e IRTA2 (Fig. 9B) completos. Los recuadros rellenos, grandes representan dominios codificantes y los recuadros estrechos representan las regiones no traducidas (UTR). El sitio pronosticado para la escision de la peptidasa senal esta marcado por medio de una punta de flecha y se obtuvo de acuerdo con el servidor Red Informatica Mundial SignalIP en
http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalIP. El algoritmo de prediccion de dominios transmembrana es descrito por Tusnady et al., 1998. SP, peptido senal; EC, dominio extracelular; Ig, de tipo inmunoglobulina; TM, dominio transmembrana; CIT, dominio citoplasmico; A(n), cola poli A; GPI, glicofosfatidil inositol. En la (Fig. 9A), las flechas en la UTR 3' indican diferentes sitios de adicion de poliadenilacion utilizados en el ADNc de IRTA1. En la (Fig. 9B), se sombrean de manera diferente las regiones UTR 3' de las isoformas de IRTA2. Las barras debajo de las regiones UTR en la (Fig. 9A) y la (Fig. 9B) identifican las sondas utilizadas para el analisis de transferencia Northern en la Figura 12.

Figuras 10A-10B.

Comparacion de las secuencias de aminoacidos de IRTA1 e IRTA2 con miembros de la familia de receptores de Fc Fig. 10A) Alineamiento de secuencias multiples de los dos primeros (arriba) y el tercero (abajo) dominios extracelulares para Ig de IRTA1 e IRTA2 para los miembros de la familia de receptores de Fc. Las secuencias se compararon utilizando el programa ClustalW (Thompson et al., 1994). Los recuadros sombreados de color negro indican aminoacidos conservados entre todas las secuencias; los recuadros sombreadas de color gris oscuro indican aminoacidos conservados entre al menos la mitad de las secuencias; los recuadros sombreados en color claro indican las sustituciones conservativas. Fig. 10B) Alineamiento de los dominios de union a SH2 de IRTA1 e IRTA2 con los motivos de consenso ITAM e ITIM. Las posiciones de aminoacidos conservados estan en negrita. El simbolo X representa cualquier aminoacido.

Figuras 11A-11B-4.

Patron de expresion de IRTA1. Fig. 11A) Panel izquierdo. Analisis de transferencia Northern de la expresion del ARNm de IRTA1 en tejidos del sistema inmunitario humano. Cada calle contiene 2 mg de ARNm. La posicion de los marcadores de peso molecular de ARN se representa en el lado derecho de la transferencia. Las posiciones de los transcritos de ARNm de IRTA1 y GAPDH se muestran por medio de flechas. (Se incluyo una sonda de GAPDH en la hibridacion como un control interno - sonda marcada 0,15 ng + no marcada 50 ng). Panel derecho. Analisis de transferencia Northern de la expresion de IRTA1 en el ARN total de la linea celular ER/EB (10 mg por calle). Para este experimento, las celulas fueron cultivadas en presencia de estrogeno (1 mg/ml), seguido de la retirada de estrogeno durante los momentos indicados. Las flechas indican las posiciones de los ARNm correspondientes. a, b y c corresponden a especies poliadeniladas diferencialmente de IRTA1. La misma transferencia se elimino y se volvio a sondear con una sonda de ADNc MYC (exon 2) para verificar la detencion de Go/G1 celular. El analisis densitometrico de los niveles de ARNm de IRTA1 se representa en el grafico de columnas adyacente. La sonda de ADNc utilizada se muestra como una barra continua por debajo del esquema de ARNm de IRTA1 en la Figura 9A. Fig.11B-1-11B-4) Analisis de hibridacion in situ de la expresion de IRTA1 en secciones seriadas de amigdala humana. 1. Sonda IRTA1 efectora 2. Sonda IRTA1 antisentido 3. Tincion H & E 4. Senal IRTA1 antisentido superpuesta sobre una seccion tenida con H & E. GC, centro germinal, MargZ, zona marginal

Figura 12A-12B-4.

Patron de expresion de IRTA2. Fig. 12A) Analisis de transferencia Northern de la expresion de ARNm de IRTA2 en multiples tejidos humanos (panel izquierdo) y en diversas lineas celulares linfoides y no linfoides (panel derecho). Cada calle contiene 2 mg de ARNm. Las posiciones de los transcritos de IRTA2 y GAPDH se muestran por medio de flechas. a, b, c y d corresponden a isoformas de ARNm de IRTA2 de corte y empalme alternativo. RD, NC42 y CB33, lineas de celulas B linfoblastoides transformadas con virus de Epstein-Barr; EREB, linea celular linfoblastoide B transformada con EBV condicional; FR4, linea de celulas de plasma; MOLT4 y HUT78, lineas de celulas T; HL60 y U937, lineas de celulas mielomonociticas; K562, linea celular eritroide. La sonda de ADNc utilizada se muestra como una barra continua debajo del esquema del ARNm de IRTA2 en la Figura 9B. Figs.12B-1-12B-4) Analisis de hibridacion in situ de la expresion de IRTA2 en la amigdala humana. Fig. 12B-1. Sonda de ADNc de IRTA2 efectora, Fig. 12B-2. Sonda de ADNc de IRTA2 antisentido, Fig. 12B-3. Tincion H & E, Fig. 12B-4. Senal de la sonda de ADNc de IRTA2 antisentido superpuesta sobre la seccion tenida con H & E. GC, centro germinal, MargZ, zona marginal

Figura 13.

Mapa de la region 1q21 de la linea germinal que abarca el punto de rotura FR4 y la organizacion genomica de IRTA1 e IRTA2. Los cebadores utilizados para amplificar los exones de IRTA1 a partir de ADNc de bazo estan

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

marcados por medio de puntas de flecha en el panel superior. Los recuadros de color negro y claro indican exones codificantes y no codificantes respectivamente. Las flechas indican la posicion de BCL9, MUC1, familia IRTA y FCGRIIB. loci. S, SacI; H, Hindlll; S, Swal; Pc, PacI; P, Pmel; Mb, Megabases

Figuras 14A-14D.

t(1;14)(q21;q32) en FR4 genera un transcrito de fusion IRTA1/Ca. Fig. 14A) Representacion esquematica del clon genomico der(14) 1FR4B-5 y del locus IgCa1 de la llnea germinal. El punto de rotura FR4 esta marcado por una flecha. Los recuadros rellenos y vaclos representan los exones codificantes y no codificantes de IRTA1 y Ca1, respectivamente. Fig. 14B) El analisis de transferencia Northern con una sonda del exon 1 de IRTA1 (que se muestra por medio de una barra en la Fig. 14A) sobre FR4 y otras llneas celulares detecta un mensaje anormal en FR4. Las puntas de flecha apuntan a la ubicacion del mensaje de lRTA1 normal en el ARNm de ER/EB. JJN3 y U266, llneas celulares de mieloma. Se cargaron dos mg de ARN poliA+ por calle. Fig. 14C) Representacion esquematica del ADN de fusion IRTA1/Ca en FR4. El ADNc se amplifico por RT- PCR a partir de ARN total de FR4 utilizando los cebadores mostrados en la (Fig.14A), y se secuencio despues de la subclonacion. Fig. 14D) Analisis SDS/PAGE de los productos inmunoprecipitados obtenidos a partir de celulas 293-T' transfectadas con control de vector y transfectadas con constructos de expresion transitoria de IRTA1/ca (calles 1 y 2), o las siguientes llneas celulares: llnea de celulas linfoblastoides positiva para mlgA Dakiki (calle 3), FR4 (calle 4), llnea de celulas NHL positivas para mlgM Ramos (calle 5). H, Hindlll; B, BamHl; X, Xhol; Sa, region de cambio de lgA; EC, region extracelular; TM, transmembrana; ClT, citoplasmatica.

Figuras 15A-15B.

La expresion de IRTA2 esta desregulada en llneas celulares que portan anomallas 1q21. Figs. 15A, 15B) analisis de transferencia Northern de la expresion del ARNm de IRTA2 en llneas celulares de linfoma de Burkitt (Fig. 15A) y mieloma multiple (Fig. 15B). La sonda de ADNc utilizada es la misma que en la Fig. 12. Cada calle contiene 2 mg de ARNm. Las posiciones de los transcritos de ARNm de IRTA2 y GAPDH se muestran por medio de guiones y flechas, respectivamente. Los niveles relativos de expresion de ARNm de IRTA2 en el panel de la izquierda (Fig. 15A) se representaron en el panel de la derecha (Fig. 15A) despues de analisis densitometrico y la normalizacion frente a los niveles de GAPDH. El panel de la derecha (Fig. 15B) es un resumen de los resultados del analisis de transferencia Northern.

Figuras 16-1-16-4

Expresion de lRTA1 en tejido linfoide normal. Se tineron secciones incluidas en parafina de amlgdala humana normal con los anticuerpos siguientes: Fig. 16-1) Control negativo; Fig. 16-2) Anticuerpo monoclonal de raton anti-CD3 para detectar las celulas T; Fig. 16-3) anticuerpo monoclonal de raton anti-lRTA1 (mlRTA); Fig. 164) anticuerpo policlonal de conejo anti-lRTA1 (J92884K). Las celulas positivas para lRTA1 se encuentran en la region perifolicular e intraepitelial de la amlgdala, equivalente a la zona marginal en el bazo.

Figura 17

Expresion de lRTA1 en un linfoma de celulas B en Tejido Linfoide Asociado a Mucosa del estomago (MALT). Se tino una seccion incluida en parafina de un linfoma de celulas B MALT de estomago con el anticuerpo monoclonal de raton anti-lRTA1 (mlRTA) y se contratino con H & E. La mayorla de los linfomas MALT analizados eran positivos para lRTA1. Por tanto, este anticuerpo puede ser una herramienta eficaz en el diagnostico diferencial del linfoma MALT. Tambien se ha demostrado que el anticuerpo contra mlRTA1 es util en la terapia de este tumor de celulas B, de manera similar al uso del anticuerpo anti-CD20 (rituximab) en la terapia de los linfomas positivos para CD20 con recalda (Foon K., Cancer J. 6: pag. 273).

Figura 18A.

ADNc de lRTA1 y secuencia de aminoacidos de la protelna lRTA1codificada.

Figuras 18B-1-18B-3.

ADNc de lRTA2 y secuencia de aminoacidos de la protelna lRTA2 codificada.

Figuras 18C-1-18C-2.

ADNc de lRTA3 y secuencia de aminoacidos de la protelna lRTA3 codificada.

Figuras 18D-1-18D-2.

ADNc de lRTA4 y secuencia de aminoacidos de la protelna lRTA4 codificada.

Figuras 18E-1-18E-2.

ADNc de lRTA5 y secuencia de aminoacidos de la protelna lRTA5 codificada.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA invencion

Las siguientes abreviaturas convencionales se utilizan en toda la memoria para indicar nucleotidos especlficos: C = citosina; A = adenosina; T = timidina y G = guanosina.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Segun se utiliza en la presente memoria los genes "Asociados a la Translocacion de Receptores de Inmunoglobulinas", "IRTA" son moleculas de acido nucleico que codifican los receptores de la superficie celular novedosos de la superfamilia de inmunoglobulinas en las celulas B que son importantes en el desarrollo de celulas B, y cuya expresion anormal, p. ej., expresion desregulada, perturba las respuestas inmunologicas de las celulas B en la superficie celular y por lo tanto estan implicadas en las neoplasias malignas de las celulas B, incluyendo la linfomagenesis.

Las moleculas de acido nucleico que codifican protelnas denominadas protelnas "MUM-2" y "MUM-3" en la Primera Serie de Experimentos que ahora se denominan genes "IRTA-1" e "IRTA-2", es decir, moleculas de acido nucleico que codifican las protelnas IRTA-1 e IRTA-2, respectivamente. Las protelnas IRTA-3, 4 y 5 son miembros de la misma la superfamilia de genes de inmunoglobulina como son las protelnas IRTA-1 e IRTA-2.

En una realizacion de la molecula de acido nucleico aislada descrita anteriormente ,la protelna IRTA codificada es la protelna IRTA2 que comprende la secuencia de aminoacidos expuesta en las Figuras 18B-1-18B-3 (SEQ ID NO: 3).

En otra realizacion de cualquiera de las moleculas de acido nucleico aisladas descritas anteriormente, la molecula de acido nucleico es ADN. En realizaciones adicionales, el ADN es ADNc. En realizaciones adicionales, el ADN es ADN genomico. En otra realizacion, la molecula de acido nucleico es una molecula de ARN.

En realizaciones preferidas de la molecula de acido nucleico aislada, las moleculas de acido nucleico codifican la protelna IRTA2 humana.

En otra realizacion preferida, las moleculas aisladas de acido nucleico estan unidas operativamente a un promotor de la transcripcion de ADN. En otra realizacion preferida mas de la molecula de acido nucleico aislada, el promotor comprende un promotor bacteriano, de levadura, de insectos, de planta o de mamlfero.

Esta invencion proporciona un vector que comprende cualquiera de las moleculas de acido nucleico aisladas descritas anteriormente que codifican la protelna IRTA2, incluyendo pero no limitada a la protelna IRTA2 de mamlfero, de las cuales se prefieren la humana y la murina.

En una realizacion, el vector es un plasmido.

Esta invencion proporciona una celula anfitriona que comprende el vector descrito anteriormente que comprende cualquiera de las moleculas de acido nucleico aisladas descritas anteriormente que codifican la protelna IRTA2. Preferiblemente, las moleculas de acido nucleico aisladas en tales vectores estan unidas operativamente a un promotor de la transcripcion de ADN. En otra realizacion de la celula anfitriona, se selecciona la celula de un grupo que consiste en una celula bacteriana, una celula vegetal, y una celula de insecto y una celula de mamlfero.

Se describe un metodo para producir un polipeptido (protelna) IRTA que comprende: (a) introducir un vector que comprende un acido nucleico aislado que codifica una protelna receptora de inmunoglobulina, Asociada a la Translocacion de Receptores de la superfamilia de Inmunoglobulinas, IRTA, en una celula anfitriona adecuada; y (b) cultivar la celula resultante con el fin de producir el polipeptido.

La protelna IRTA producida por el metodo descrito anteriormente puede ser recuperada y en otra realizacion mas, puede ser purificada total o parcialmente. En una realizacion, la protelna IRTA es IRTA2.

En una realizacion adicional, las protelnas IRTA2; pueden ser una protelna de mamlfero. En otras realizaciones adicionales, la protelna de mamlfero puede ser una protelna IRTA2 humana o de raton.

Los genes IRTA (moleculas de acido nucleico que codifican protelnas IRTA IRTA1, IRTA2, IRTA3, IRTA4 e IRTA5) son utiles para la production de las protelnas IRTA codificadas de ese modo. Las protelnas IRTA son utiles para la production de anticuerpos; tales anticuerpos se utilizan como reactivos para el diagnostico diferencial de los subtipos de linfoma en hematopatologla. Los anticuerpos dirigidos contra las protelnas IRTA y que se unen especlficamente a las protelnas IRTA tambien tienen usos terapeuticos, es decir, para dirigirse especlficamente a las celulas tumorales, que pueden ser utilizados y administrados de manera similar a "Rituximab" (un anticuerpo anti- CD20), que es un anticuerpo aprobado por la FDA para el tratamiento de los linfomas positivos para CD20 con recalda (Foon K., Cancer J. 6 (5):273). Los anticuerpos anti-IRTA1, anti-IRTA2, anti-IRTA3, anti-IRTA4 y anti-IRTA5 tambien son marcadores utiles para el aislamiento de subconjuntos especlficos de celulas B en estudios de investigation de la biologla de celulas B normales y tumorales. Por otra parte, los anticuerpos anti-IRTA1, anti- IRTA2, anti-IRTA3, anti-IRTA4 y anti-IRTA5 son reactivos de investigacion utiles para estudiar experimentalmente la biologla de serialization en las celulas B normales y tumorales.

Los metodos para introducir moleculas de acido nucleico en celulas son bien conocidos para los expertos en la

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

tecnica. Tales metodos incluyen, por ejemplo, el uso de vectores virales y la co-precipitacion con fosfato de calcio. Por consiguiente, las moleculas de acido nucleico que codifican las protelnas IRTa IRTA1, IRTA2, IRTA3, IRTA4 e IRTA5 se pueden introducir en las celulas para la produccion de estas protelnas IRTA.

Se pueden emplear numerosos vectores para la expresion de las protelnas de la invencion IRTA2. Tales vectores, incluyendo los vectores plasmldicos, los vectores cosmidos, los vectores de bacteriofagos y otros virus, son bien conocidos en la tecnica. Por ejemplo, una clase de vectores utiliza elementos de ADN que derivan de virus animales tales como virus del papiloma bovino, virus de polioma, adenovirus, virus vaccinia, baculovirus, retrovirus (RSV, MMTV o MoMLV), virus del bosque Semliki o virus SV40. Adicionalmente, las celulas que han integrado de forma estable el ADN en sus cromosomas se pueden seleccionar introduciendo uno o mas marcadores que permiten la seleccion de celulas anfitrionas transfectadas. Los marcadores pueden proporcionar, por ejemplo, prototrofla a un anfitrion auxotrofo, resistencia a biocidas o resistencia a metales pesados tales como el cobre. El gen marcador seleccionable puede ser directamente ligado a las secuencias de ADN que se van a expresar, o puede ser introducido en la misma celula por medio de transformacion simultanea.

Los elementos reguladores requeridos para la expresion incluyen secuencias promotoras que se van a unir a ARN polimerasa y secuencias de inicio de la transcripcion para la union al ribosoma. Tambien se pueden necesitar elementos adicionales para la slntesis optima del ARNm. Estos elementos adicionales pueden incluir senales de empalme, as! como potenciadores y senales de terminacion. Por ejemplo, un vector de expresion bacteriano incluye un promotor tal como el promotor lac y para el inicio de la transcripcion la secuencia de Shine-Dalgarno y el codon de inicio AUG. De un modo similar, un vector de expresion eucariotico incluye un promotor heterologo u homologo para la ARN polimerasa II, una senal de poliadenilacion aguas abajo, el codon de inicio AUG, y un codon de terminacion para la separacion del ribosoma. Tales vectores se pueden obtener comercialmente o se pueden ensamblar a partir de las secuencias descritas por metodos bien conocidos en la tecnica, por ejemplo los metodos descritos anteriormente para construir vectores en general.

Estos vectores se pueden introducir en una celula anfitriona adecuada para formar un sistema vector anfitrion para producir las protelnas de la invencion. Los metodos de elaboracion de sistemas de vectores anfitriones son bien conocidos por los expertos en la tecnica.

Las celulas anfitrionas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, celulas bacterianas (incluyendo celulas Gram positivas), celulas de levadura, celulas fungicas, celulas de insecto y celulas animales. Las celulas animales adecuadas incluyen, pero no se limitan a celulas HeLa, celulas Cos, celulas CV1 y diversas celulas de mamlferos primarias. Se pueden utilizar numerosas celulas de mamlferos como anfitriones, incluyendo, pero no limitadas a, fibroblastos de raton, celulas NIH-3T3, celulas CHO, celulas HeLa, celulas Ltk y celulas COS. Las celulas de mamlferos pueden ser transfectadas por metodos bien conocidos en la tecnica tales como precipitacion con fosfato calcico, electroporacion y microinyeccion.

Esta invencion proporciona una molecula de acido nucleico aislada que comprende al menos 15 nucleotidos contiguos capaces de hibridar especlficamente con una secuencia unica incluida dentro de la secuencia de la molecula de acido nucleico aislada que codifica la protelna IRTA2, o uno o varios fragmentos de la misma, que tiene la secuencia de aminoacidos expuesta en la Figura 18A. En otras realizaciones, las moleculas de acido nucleico aisladas se marcan con un marcador detectable. En otras realizaciones adicionales de las moleculas de acido nucleico aisladas, el marcador detectable se selecciona del grupo que consiste en un isotopo radiactivo, enzima, colorante, biotina, una marca fluorescente o una marca quimioluminiscente.

Esta invencion proporciona un metodo para detectar una neoplasia maligna de las celulas B o un tipo de neoplasia maligna de las celulas B en una muestra de un sujeto en donde la neoplasia maligna de las celulas B comprende una reordenacion cromosomica 1q21, que comprende:

a) poner en contacto la muestra de ARN obtenida del sujeto con la molecula de acido nucleico de al menos 15 nucleotidos contiguos capaces de hibridar especlficamente con una secuencia unica incluida dentro de la secuencia de un ARN aislado que codifica la protelna IRTA2 humana en condiciones que permiten la hibridacion del ARN de la etapa (a) con la molecula de acido nucleico capaz de hibridar especlficamente con una secuencia unica incluida dentro de la secuencia de un ARN aislado que codifica la protelna IRTA2 humana, en donde la molecula de acido nucleico esta marcada con un marcador detectable; y b) detectar cualquier hibridacion en la etapa (a) en donde la deteccion de hibridacion indica la presencia de neoplasia maligna de las celulas B o un tipo de neoplasia maligna de las celulas B en la muestra.

La deteccion de la hibridacion de ARN que codifica las protelnas IRTA indicara que una neoplasia maligna es una neoplasia maligna de las celulas B. Mas especlficamente, la deteccion de hibridacion del ARN que codifica la protelna IRTA1 indica que la neoplasia maligna de celulas B es un linfoma de celulas B de Tejido Linfoide Asociado a la Mucosa (MALT). La deteccion de hibridacion de ARN que codifica las protelnas IRTA4 e IRTA5 indica que la neoplasia maligna de las celulas B es un linfoma de celulas del manto. En una realizacion del metodo descrito anteriormente, la neoplasia maligna de celulas B comprende una reordenacion cromosomica 1q21. Un experto utilizara el metodo descrito anteriormente como ayuda para el diagnostico junto con otros metodos convencionales

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

de deteccion/diagnostico de neoplasias malignas, p. ej., patologla de una muestra de tumor, que puede indicar linfoma y a continuacion el metodo descrito anteriormente, restringira la neoplasia maligna a un linfoma de celulas B o mas especlficamente a un linfoma de celulas B MALT) o un linfoma de celulas del manto como se ha discutido anteriormente.

Un experto en la tecnica esta familiarizado con los metodos conocidos de detection de hibridacion de moleculas de acido nucleico con oligonucleotidos de acido nucleico, es decir, sondas de acido nucleico que codifican una protelna de interes para metodos de diagnostico. Las moleculas de acido nucleico que codifican las protelnas IRTa de la presente invention son utiles para detectar neoplasias malignas de las celulas B. Un experto en la tecnica reconocera que las variaciones del metodo descrito anteriormente para la deteccion de una neoplasia maligna de las celulas B en una muestra incluyen, pero no se limitan a, digestion del acido nucleico de la muestra con enzimas de restriction y separation de los fragmentos de la molecula de acido nucleico as! obtenidos por medio de fraccionamiento por tamanos antes de la hibridacion.

En una realization del metodo descrito anteriormente para la deteccion de una neoplasia maligna de celulas B en una muestra de un sujeto, el marcador detectable es un isotopo radiactivo, una enzima, un colorante, biotina, una marca fluorescente o una marca quimioluminiscente. En una realizacion preferida, la neoplasia maligna de celulas B se selecciona del grupo que consiste en linfoma de celulas B, mieloma multiple, linfoma de Burkitt, linfoma de la zona marginal, linfoma difuso de celulas grandes y linfoma de las celulas foliculares. En una realizacion adicional, el linfoma de celulas B es linfoma de celulas B del Tejido Linfoide Asociado a la Mucosa (MALT). En otra realizacion preferida, el linfoma de celulas B es linfoma no Hodgkin.

En una realizacion preferida del oligonucleotido antisentido, la protelna IRTA es IRTA2 humana. En una realizacion adicional de cualquiera de los oligonucleotidos de moleculas de acido nucleico descritos anteriormente que codifican la protelna IRTA2, el acido nucleico puede ser ADN genomico o ADNc.

Un experto en la tecnica esta familiarizado con los mecanismos convencionales para la hibridacion de acido nucleico de oligonucleotidos, por ejemplo, Ausubel, F.M. et al. Current Protocols in Molecular Biology, (John Wiley & Sons, Nueva York, 1998), por ejemplo condiciones restrictivas de 65°C en presencia de una concentration de sal elevada. Tales condiciones se utilizan para la hibridacion de acido nucleico completamente complementario, mientras que las condiciones que no son restrictivas se utilizan para la hibridacion de acidos nucleicos que no son totalmente complementarios.

Segun se utiliza en la presente memoria, la frase "hibridar especlficamente" representa la capacidad de una molecula de acido nucleico para reconocer una secuencia de acido nucleico complementaria a ella misma y para formar segmentos de doble helice mediante enlaces de hidrogeno entre pares de bases complementarias. Segun se utiliza en la presente memoria, una "secuencia unica" es una secuencia especlfica solo para las moleculas de acido nucleico que codifican la protelna IRTA2. La tecnologla de sondas de acido nucleico es bien conocida para los expertos en la tecnica que apreciaran facilmente que tales sondas pueden variar mucho de longitud y pueden estar marcadas con una marca detectable, tal como un radioisotopo o colorante fluorescente, para facilitar la deteccion de la sonda. La deteccion de moleculas de acido nucleico que codifican la protelna IRTA2 es util como prueba de diagnostico para cualquier proceso de enfermedad en el que los niveles de expresion de la protelna IRTA2 correspondiente estan alterados. Las moleculas de sonda de ADN se producen mediante la insertion de una molecula de ADN que codifica la protelna IRTA2 de mamlfero o sus fragmentos en vectores adecuados, tales como plasmidos o bacteriofagos, seguido de la insercion en las celulas anfitrionas bacterianas adecuadas y la replication y la recoleccion de las sondas de ADN, todo ello utilizando bien los metodos conocidos en la tecnica. Por ejemplo, el ADN puede ser extraldo de un producto lisado celular utilizando fenol y etanol, digerido con las enzimas de restriccion correspondientes a los sitios de insercion del ADN en el vector (comentado en la presente memoria), sometido a electroforesis, y separado por corte del gel resultante. Las sondas de oligonucleotidos son utiles para la hibridacion 'in situ' o con el fin de localizar tejidos que expresan esta familia de genes IRTA, y para otros analisis de hibridacion para determinar la presencia de estos genes (moleculas de acido nucleico que codifican protelnas IRTA2) o su ARNm en diversos tejidos biologicos. Adicionalmente, los oligonucleotidos sintetizados (producidos por un sintetizador de ADN) complementarios a la secuencia de una molecula de ADN que codifica una protelna IRTA2 son utiles como sondas para estos genes, para su ARNm asociado, o para el aislamiento de genes relacionados por escrutinio de homologla de bibliotecas genomicas o de ADNc, o mediante el uso de tecnicas de amplification tales como la Reaction en Cadena de la Polimerasa.

Esta invencion proporciona una protelna IRTA2 purificada que comprende la secuencia de aminoacidos expuesta en las Figuras 18B-1-18B-3 (SEQ ID NO: 3). En una realizacion de la protelna IRTA2 purificada, la protelna IRTA2 es IRTA2 humana.

Con el fin de facilitar la comprension de la section de Detalles Experimentales siguiente, ciertos metodos y/o

11

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

terminos que aparecen con frecuencia se describen mejor en Sambrook, et al. (1989) y Harlow y Lane Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, Nueva York: 1988.

Esta invencion proporciona uno o varios anticuerpos dirigidos a un epltopo de protelna IRTA2 purificada, o uno o varios fragmentos de los mismos, que tienen la secuencia de aminoacidos expuesta en las Figuras 18B-1-18B-3.

Segun se utiliza en la presente memoria, el termino "anticuerpo" incluye, pero no se limita a, anticuerpos tanto de origen natural como de origen no natural. Especlficamente, el termino "anticuerpo" incluye anticuerpos policlonales y monoclonales, y fragmentos de union de los mismos. Ademas, el termino "anticuerpo" incluye anticuerpos quimericos y anticuerpos completamente sinteticos, y fragmentos de los mismos. Los anticuerpos policlonales y monoclonales pueden ser "purificados", lo que significa que los anticuerpos policlonales y monoclonales estan libres de cualquier otro anticuerpo. Segun se utiliza en la presente memoria, anticuerpo parcialmente purificado significa una composicion de anticuerpos que comprende anticuerpos que se unen especlficamente a la protelna IRTA de la invencion sujeto, y consta de menos impurezas de protelna que el suero del cual derivan los anticuerpos. Una impureza de protelna es una protelna distinta de los anticuerpos especlficos para la protelna IRTA de la presente invencion. Por ejemplo, los anticuerpos parcialmente purificados pueden ser una preparacion de IgG.

Los anticuerpos policlonales (anticuerpos anti-IRTA) se pueden producir mediante la inyeccion a un animal anfitrion tal como un conejo, rata, cabra, raton u otro animal del inmunogeno o los inmunogenos de esta invencion, por ejemplo, una IRTA1 humana purificada descrita mas abajo. Los sueros se extraen del animal anfitrion y se escrutan para obtener anticuerpos policlonales que son especlficos para el inmunogeno. Los metodos de escrutinio de anticuerpos policlonales son bien conocidos para los expertos normales en la tecnica tales como los descritos en Harlow y Lane Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, Nueva York: 1988)

Los anticuerpos monoclonales anti-IRTA de la presente invencion pueden ser producidos mediante la inmunizacion, por ejemplo, de ratones con un inmunogeno (los polipeptidos IRTa o fragmentos de los mismos descritos en la presente memoria). A los ratones se les inocula por via intraperitoneal una cantidad inmunogenica del inmunogeno descrito anteriormente y a continuacion se refuerza con cantidades similares de inmunogeno. Se recogen los bazos de los ratones inmunizados unos pocos dlas despues del refuerzo final y se prepara una suspension de celulas a partir de los bazos para su uso en la fusion.

Los hibridomas se pueden preparar a partir de los esplenocitos y un companero tumoral murino utilizando la tecnica de hibridacion de celulas somaticas general de Kohler, B. y Milstein, C., Nature (1975) 256: 495-497. Se pueden utilizar en la hibridacion las llneas de mieloma murino disponibles, tales como las de la Coleccion Americana de Cultivos Tipo (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, USA. Basicamente, la tecnica implica la fusion de las celulas tumorales y los esplenocitos utilizando un fusogeno tal como polietilenglicol. Despues de la fusion las celulas se separan del medio de fusion y se cultivan en un medio de crecimiento selectivo, tal como medio HAT, para eliminar celulas parentales no hibridadas. Los hibridomas se pueden expandir, si se desea, y los sobrenadantes se pueden analizar por procedimientos de inmunoanalisis convencionales, por ejemplo radioinmunoanalisis, utilizando el agente inmunizante como antlgeno. Los clones positivos se pueden caracterizar adicionalmente para determinar si satisfacen los criterios de los anticuerpos de la invencion.

Los hibridomas que producen tales anticuerpos se pueden hacer crecer in vitro o in vivo utilizando procedimientos conocidos. Los anticuerpos monoclonales se pueden aislar de los medios de cultivo o de los fluidos corporales, segun corresponda, por medio de procedimientos de purification de inmunoglobulinas convencionales tales como precipitation con sulfato de amonio, electroforesis en gel, dialisis, cromatografla y ultrafiltracion, si se desea.

En la practica de la presente invencion cualquiera de los anticuerpos descritos anteriormente se puede marcar con un marcador detectable. En una realization, el anticuerpo marcado es un anticuerpo marcado purificado. El termino "anticuerpo" incluye, a modo de ejemplo, anticuerpos tanto naturales como no naturales. Especlficamente, el termino "anticuerpo" incluye anticuerpos policlonales y monoclonales, y fragmentos de los mismos. Ademas, el termino "anticuerpo" incluye anticuerpos quimericos y anticuerpos completamente sinteticos, y fragmentos de los mismos. Los "radicales detectables" que funcionan como marcas detectables son bien conocidos para los expertos en la tecnica e incluyen, pero no se limitan a, una marca fluorescente, un atomo radiactivo, un ion paramagnetico, biotina, una marca quimioluminiscente o una marca que se puede detectar a traves de una etapa enzimatica secundaria o de union. La etapa enzimatica secundaria o de union puede comprender el uso de digoxigenina, fosfatasa alcalina, peroxidasa de rabano picante, 13-galactosidasa, fluorescelna o estreptavidina/biotina. Los metodos de marcaje de anticuerpos son bien conocidos en la tecnica.

Los metodos de recuperation de suero de un sujeto son bien conocidos por los expertos en la tecnica. Los metodos de purificacion parcial de anticuerpos tambien son bien conocidos por los expertos en la tecnica, e incluyen, a modo de ejemplo, filtration, cromatografla de intercambio ionico, y precipitacion.

Los anticuerpos policlonales y monoclonales de la invencion se pueden marcar con un marcador detectable. En una realizacion, el anticuerpo marcado es un anticuerpo marcado purificado. El marcador detectable puede ser, por

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

ejemplo, un marcador radiactivo o fluorescente. Los metodos de marcaje de anticuerpos son bien conocidos en la tecnica.

La determinacion de si los anticuerpos policlonales y monoclonales de la presente invencion se unen a las celulas, por ejemplo, celulas cancerosas, que expresan una protelna IRTA y forman un complejo con una o mas de las protelnas IRTA descritas en la presente memoria, o fragmentos de las mismas, en la superficie de dichas celulas, se puede llevar a cabo de acuerdo con metodos bien conocidos por los expertos en la tecnica. En la realization preferida, la determinacion se lleva a cabo de acuerdo con metodos de citometrla de flujo.

Los anticuerpos de la presente invencion pueden estar unidos a una matriz insoluble tal como la utilizada en la cromatografla de afinidad. Las celulas que forman un complejo, es decir, se unen, con el anticuerpo policlonal o monoclonal inmovilizado se pueden aislar por medio de metodos convencionales bien conocidos por los expertos en la tecnica. Por ejemplo, el aislamiento puede comprender cromatografla de afinidad utilizando el anticuerpo inmovilizado.

Alternativamente, el anticuerpo puede ser un anticuerpo libre. En este caso, el aislamiento puede comprender la clasificacion de celulas utilizando anticuerpos primarios o secundarios marcados. Tales metodos de clasificacion de celulas son convencionales y son bien conocidos para los expertos en la tecnica.

Esta invencion proporciona un anticuerpo dirigido a una protelna IRTA2 purificada. En una realizacion preferida del anticuerpo anti-lRTA, la protelna IRTA es una protelna IRTA humana. La protelna IRTA puede ser cualquier protelna IRTA de mamlfero, incluyendo una protelna IRTA murina. En una realizacion adicional de cualquiera de los anticuerpos descritos anteriormente, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. En otra realizacion, el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo monoclonal murino o un anticuerpo monoclonal humanizado. Segun se utiliza en la presente memoria, "humanizado" representa un anticuerpo que tiene caracterlsticas de un anticuerpo humano, siendo dicho anticuerpo de origen no natural, pero creado utilizando tecnicas de hibridoma en las que el anticuerpo es de origen humano, excepto para la portion determinante antigenica, que es murina. En otra realizacion mas, el anticuerpo es un anticuerpo policlonal.

En realizaciones preferidas, cualquiera de los anticuerpos de la presente invencion se puede conjugar con un agente terapeutico. En otras realizaciones preferidas, el agente terapeutico es un radioisotopo, una toxina, un toxoide o un agente quimioterapeutico. Los anticuerpos conjugados de la presente invencion se pueden administrar a un sujeto que tiene un cancer de celulas B mediante cualquiera de los metodos proporcionados a continuation.

Esta invencion proporciona una composition farmaceutica que comprende una cantidad del anticuerpo dirigido a una protelna IRTA2 eficaz para unirse a las celulas cancerosas que expresan una protelna IRTA2 seleccionada del grupo fomado por humanos con el fin de prevenir el crecimiento de las celulas cancerosas y un vehlculo farmaceuticamente aceptable. El anticuerpo anti-IRTA puede estar dirigido a un epltopo de una protelna IRTA2. Las protelnas pueden ser protelnas IRTA humanas o IRTA de raton.

En realizaciones preferidas de la composicion farmaceutica descrita anteriormente, las celulas cancerosas se seleccionan del grupo que consiste en celulas de linfoma de celulas B, de mieloma multiple, de linfoma de celulas del manto, de linfoma de Burkitt, de linfoma de la zona marginal, de linfoma difuso de celulas grandes y de linfoma folicular. En otra realizacion preferida de la composicion farmaceutica, las celulas de linfoma de celulas B son celulas de linfoma de celulas B de Tejido Linfoide Asociado a la Mucosa (MALT). En otra realizacion preferida de la composicion farmaceutica, las celulas de linfoma de celulas B son celulas de linfoma no Hodgkin. Esta invencion proporciona, tal como se define en las reivindicaciones, una composicion farmaceutica que comprende una cantidad de cualquiera de los oligonucleotidos descritos anteriormente eficaz para prevenir la expresion en exceso de una protelna IRTA humana y un portador farmaceuticamente aceptable idoneo. En realizaciones preferidas de la composicion farmaceutica el oligonucleotido es una molecula de acido nucleico que codifica una protelna IRTA2.

La protelna IRTA puede ser una protelna IRTA humana o de raton.

Segun se utiliza en la presente memoria, "neoplasia maligna" significa susceptible de metastatizar. Segun se utiliza en la presente memoria, "celulas tumorales" son las celulas que se originan a partir de un tumor, es decir, a partir de un nuevo crecimiento de tejido diferente o anormal. Las celulas tumorales y las celulas cancerosas pueden existir como parte de la masa tumoral, o pueden existir como celulas que flotan libremente, desprendidas de la masa tumoral a partir de la cual se originan.

Segun se utiliza en la presente memoria, las celulas malignas incluyen, pero no se limitan en modo alguno a, linfoma de celulas B, mieloma multiple, linfoma de Burkitt, linfoma de celulas del manto, linfoma de la zona marginal, linfoma difuso de celulas grandes y linfoma folicular. El linfoma de celulas B es linfoma de celulas B de Tejido Linfoide Asociado a la Mucosa (MALT) o es linfoma no Hodgkin.

Segun se utiliza en la presente memoria, "sujeto" es cualquier animal o animal modificado artificialmente. Los animales modificados artificialmente incluyen, pero no se limitan a, ratones SCID con sistemas inmunitarios

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

humanos. En una realizacion preferida, el sujeto es un ser humano.

Esta invention proporciona un metodo de diagnostico de neoplasia maligna de celulas B que comprende una reordenacion cromosomica 1q21 en una muestra de un sujeto que comprende:

a) poner en contacto la muestra obtenida del sujeto con un anticuerpo dirigido a una protelna IRTA2 purificada capaz de unirse especlficamente con una protelna IRTA2 humana sobre una superficie celular de una celula cancerosa en condiciones que permiten la union del anticuerpo con la protelna IRTA2 humana sobre la superficie celular de la celula cancerosa, en donde el anticuerpo esta marcado con un marcador detectable; y

b) detectar cualquier union en la etapa (a), en donde la detection de union indica un diagnostico de neoplasia maligna de celulas B en la muestra.

En una realizacion del metodo de diagnostico descrito anteriormente de neoplasia maligna de celulas B, la protelna IRTA es IRTA2.

En otra realizacion del metodo, la protelna IRTA es la protelna IRTA humana o de raton. En una realizacion adicional la protelna IRTA es purificada. En una realizacion preferida de este metodo, la neoplasia maligna de celulas B se selecciona entre el grupo que consiste en linfoma de celulas B, mieloma multiple, linfoma de Burkitt, linfoma de la zona marginal, linfoma difuso de celulas grandes y linfoma folicular. En otra realizacion mas de este metodo, el linfoma de celulas B es linfoma de celulas B de Tejido Linfoide Asociado a la Mucosa (MALT). En otra realizacion preferida de este metodo, el linfoma de celulas B es linfoma no Hodgkin.

Se describe un metodo para detectar la protelna IRTA humana en una muestra que comprende: a) poner en contacto la muestra con cualquiera de los anticuerpos anti-IRTA descritos anteriormente bajo condiciones que permitan la formation de un complejo entre el anticuerpo y la IRTA en la muestra; y b) detectar el complejo formado en la etapa (a), detectando de ese modo la presencia de IRTA humana en la muestra. En una realizacion la protelna IRTA detectada puede ser una protelna IRTA2, que tiene una secuencia de aminoacidos expuesta en las Figuras 18B-1-18B-3. Como se ha descrito anteriormente en este documento, la deteccion del complejo formado se puede conseguir mediante el uso de anticuerpos marcados con un marcador detectable y la determination de la presencia del complejo marcado.

La deteccion de la protelna IRTA humana en una muestra de un sujeto es otro metodo de diagnostico de neoplasia maligna de celulas B en un sujeto. En una realizacion de este metodo de diagnostico, la neoplasia maligna de celulas B se selecciona del grupo que consiste en linfoma de celulas B, mieloma multiple, linfoma de Burkitt, linfoma de la zona marginal, linfoma difuso de celulas grandes y linfoma folicular. En otra realizacion adicional de este metodo, el linfoma de celulas B es linfoma de celulas B de Tejido Linfoide Asociado a la Mucosa (MALT). En otra realizacion preferida de este metodo, el linfoma de celulas B es linfoma no Hodgkin.

Esta invencion proporciona la utilization de un tratamiento de un sujeto que tiene un cancer de celulas B, que comprende administrar al sujeto una cantidad de anticuerpo anti-IRTA eficaz para unirse a las celulas cancerosas que expresan una protelna IRTA con el fin de evitar el crecimiento de las celulas cancerosas y un portador farmaceuticamente aceptable, tratando de este modo al sujeto. El crecimiento y la proliferation de las celulas cancerosas es inhibido de ese modo y las celulas cancerosas mueren. En una realizacion de la utilizacion anteriormente descrita, la protelna IRTA es IRTA2 humana.

En una realizacion preferida de la utilizacion descrita anteriormente de tratamiento de un sujeto que tiene un cancer de celulas B, el anticuerpo anti-IRTA es un anticuerpo monoclonal. En otra realizacion del metodo, el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo monoclonal murino o un anticuerpo monoclonal humanizado. El anticuerpo puede ser un anticuerpo quimerico. En una realizacion adicional, el anticuerpo anti-IRTA es un anticuerpo policlonal. En una realizacion, el anticuerpo policlonal puede ser un anticuerpo policlonal murino o humano. En una realizacion preferida, el cancer de celulas B se selecciona del grupo que consiste en linfoma de celulas B, mieloma multiple, linfoma de Burkitt, linfoma de celulas del manto, linfoma de la zona marginal, linfoma difuso de celulas grandes y linfoma folicular. En otra realizacion preferida, el linfoma de celulas B es linfoma de celulas B de Tejido Linfoide Asociado a la Mucosa (MALT). En una realizacion preferida adicional, el linfoma de celulas B es linfoma no Hodgkin. En una realizacion preferida del metodo de tratamiento de un sujeto que tiene un cancer de celulas B descrito anteriormente, la administration de la cantidad de anticuerpo anti-IRTA eficaz para unirse a las celulas cancerosas que expresan una protelna IRTA es mediante liberation intravenosa, intraperitoneal, intratecal, intralinfatica, intramuscular, intralesional, parenteral, epidural, subcutanea; por infusion, por medio de liberacion mediada por liposomas, liberacion en aerosol; topica, oral, nasal, anal, ocular u otica. En otra realizacion preferida de los metodos descritos anteriormente, el anticuerpo anti-IRTA se puede conjugar con un agente terapeutico. En otras realizaciones preferidas, el agente terapeutico es un radioisotopo, una toxina, un toxoide o un agente quimioterapeutico.

Esta invencion proporciona una utilizacion para tratar a un sujeto que tiene un cancer de celulas B, que comprende administrar al sujeto una cantidad de un oligonucleotido antisentido que tiene una secuencia capaz de hibridar especlficamente con una molecula de ARNm que codifica una protelna IRTA2 humana con el fin de evitar la expresion en exceso de la protelna IRTA2 humana, con el fin de detener el crecimiento celular o de inducir la muerte

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

celular de las celulas cancerosas que expresan la protelna o las protelnas IRTA y un portador farmaceuticamente aceptable.

En una realizacion de la utilizacion descrita anteriormente para el tratamiento de un sujeto que tiene un cancer de celulas B, la protelna IRTA es la protelna IRTA2 humana. En una realizacion preferida, el cancer de celulas B se selecciona del grupo que consiste en linfoma de celulas B, mieloma multiple, linfoma de Burkitt, linfoma de la zona marginal, linfoma difuso de celulas grandes y linfoma folicular. En otra realizacion preferida, el linfoma de celulas B es linfoma de celulas B de Tejido Linfoide Asociado a la Mucosa (MALT). En otra realizacion preferida mas, el linfoma de celulas B es linfoma no Hodgkin. En realizaciones de cualquiera de los oligonucleotidos descritos anteriormente de moleculas de acido nucleico que codifican la protelna |RTA2, el acido nucleico puede ser ADN genomico o ADNc. En una realizacion adicional preferida del uso descrito anteriormente para tratar un sujeto que tiene un cancer de celulas B, la administracion de la cantidad de oligonucleotido eficaz para prevenir la expresion en exceso de la protelna IRTA humana mediante liberacion es intravenosa, intraperitoneal, intratecal, intralinfatica, intramuscular, intralesional, parenteral, epidural, subcutanea; por infusion, mediante liberacion mediada por liposomas, liberacion en aerosol; topica, oral, nasal, anal, ocular u otica. En una realizacion de los metodos descritos anteriormente, el oligonucleotido se puede conjugar con un agente terapeutico. En otras realizaciones preferidas, el agente terapeutico es un radioisotopo, una toxina, un toxoide o un agente quimioterapeutico.

La invencion tambien proporciona una composicion farmaceutica que comprende una cantidad eficaz de los oligonucleotidos o de los anticuerpos descritos anteriormente y un portador farmaceuticamente aceptable. En la invencion sujeto una "cantidad eficaz" es cualquier cantidad de un oligonucleotido o un anticuerpo que, cuando se administra a un sujeto que padece una enfermedad o anomalla contra las que el oligonucleotido o anticuerpo son eficaces, causa una reduccion, remision o regresion de la enfermedad o anomalla. En la practica de esta invencion, el "portador farmaceuticamente aceptable" es cualquier portador fisiologico conocido para los expertos normales en la tecnica util en la formulacion de composiciones farmaceuticas.

Los portadores farmaceuticamente aceptables son bien conocidos para los expertos en la tecnica e incluyen, pero no se limitan a tampon fosfato 0,01-0,1 M y preferiblemente 0,05 M o solucion salina al 0,8%. Adicionalmente, tales portadores farmaceuticamente aceptables pueden ser soluciones, suspensiones, y emulsiones acuosas o no acuosas. Los ejemplos de disolventes no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales tales como aceite de oliva, y esteres organicos inyectables tales como oleato de etilo. Los portadores acuosos incluyen agua, soluciones, emulsiones o suspensiones alcoholicas/acuosas, incluyendo solucion salina y medios tamponados. Los portadores parenterales incluyen solucion de cloruro sodico, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro sodico, solucion de Ringer con lactato anadido o aceites fijados. Los vehlculos intravenosos incluyen fluidos y reponedores de nutrientes, reponedores de electrolitos tales como los basados en dextrosa de Ringer, y similares. Tambien pueden estar presentes otros aditivos, tales como, por ejemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes, gases inertes y similares.

En una realizacion preferida, el portador farmaceutico puede ser un llquido y la composicion farmaceutica estarla en forma de una solucion. En otra realizacion igualmente preferida, el portador farmaceuticamente aceptable es un solido y la composicion esta en la forma de un polvo o un comprimido. En una realizacion adicional, el portador farmaceutico es un gel y la composicion esta en forma de un supositorio o una crema. En una realizacion adicional, el compuesto se puede formular como parte de un parche transdermico farmaceuticamente aceptable.

Un portador solido puede incluir una o mas sustancias que tambien pueden actuar como agentes aromatizantes, lubricantes, solubilizantes, agentes de suspension, cargas, antiapelmazantes, coadyuvantes de compresion, aglutinantes o agentes disgregantes de comprimidos; tambien puede ser un material encapsulante. En los polvos, el portador es un solido finamente dividido que esta mezclado con el ingrediente activo finamente dividido. En los comprimidos, el ingrediente activo se mezcla con un portador que tiene las propiedades de compresion necesarias en proporciones adecuadas y se compacta en la forma y el tamano deseados. Los polvos y los comprimidos contienen preferiblemente hasta 99% del ingrediente activo. Los portadores solidos adecuados incluyen, por ejemplo, fosfato de calcio, estearato de magnesio, talco, azucares, lactosa, dextrina, almidon, gelatina, celulosa, polivinilpirrolidina, ceras de bajo punto de fusion y resinas de intercambio ionico.

Los portadores llquidos se utilizan en la preparacion de soluciones, suspensiones, emulsiones, jarabes, elixires y composiciones presurizadas. El ingrediente activo se puede disolver o suspender en un portador llquido farmaceuticamente aceptable tal como agua, un disolvente organico, una mezcla de ambos o aceites o grasas farmaceuticamente aceptables. El portador llquido puede contener otros aditivos farmaceuticos adecuados tales como solubilizantes, emulsionantes, tampones, conservantes, edulcorantes, agentes aromatizantes, agentes de suspension, agentes espesantes, colorantes, reguladores de la viscosidad, estabilizantes u osmorreguladores. Los ejemplos adecuados de portadores llquidos para administracion oral y parenteral incluyen agua (que contiene parcialmente aditivos como los anteriores, p. ej., derivados de celulosa, preferentemente solucion de carboximetilcelulosa sodica), alcoholes (incluyendo alcoholes monohidroxilados y alcoholes polihidroxilados, p. ej. glicoles) y sus derivados, y aceites (p. ej., aceite de coco fraccionado y aceite de cacahuete). Para la administracion parenteral, el portador tambien puede ser un ester oleoso tal como oleato de etilo y miristato de isopropilo. Los portadores llquidos esteriles son utiles en composiciones esteriles en forma llquida para la administracion parenteral.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

El portador llquido para composiciones presurizadas puede ser un hidrocarburo halogenado u otro propelente farmaceuticamente aceptable.

Las composiciones farmaceuticas llquidas que son soluciones o suspensiones esteriles se pueden utilizar, por ejemplo, mediante inyeccion intramuscular, intratecal, epidural, intraperitoneal o subcutanea. Las soluciones esteriles tambien se pueden administrar por via intravenosa. Los compuestos se pueden preparar como una composition solida esteril que se puede disolver o suspender en el momento de la administration utilizando agua esteril, solution salina, u otro medio inyectable esteril apropiado. Se pretende que los portadores incluyan los aglutinantes, agentes de suspension, lubricantes, aromatizantes, edulcorantes, conservantes, colorantes, y recubrimientos necesarios e inertes.

La composicion farmaceutica que comprende el oligonucleotido o el anticuerpo se puede administrar oralmente en forma de una solucion o suspension esteril que contiene otros solutos o agentes de suspension, por ejemplo, suficiente solucion salina o glucosa para hacer la solucion isotonica, sales biliares, acacia, gelatina, monooleato de sorbitan, polisorbato 80 (esteres oleato de sorbitol y sus anhldridos copolimerizados con oxido de etileno) y similares.

La composicion farmaceutica que comprende el oligonucleotido o el anticuerpo tambien se puede administrar por via oral en forma de una composicion llquida o solida. Las composiciones adecuadas para administracion oral incluyen formas solidas, tales como plldoras, capsulas, granulos, comprimidos y polvos, y formas llquidas, tales como soluciones, jarabes, elixires, y suspensiones. Las formas utiles para la administracion parenteral incluyen soluciones, emulsiones, y suspensiones esteriles.

Las dosificaciones optimas que se van a administrar pueden ser determinadas por los expertos en la tecnica, y variaran con el inhibidor concreto en uso, la fuerza de la preparation, el modo de administracion, y el progreso del estado de enfermedad o anomalla. Otros factores que dependen del sujeto concreto a tratar daran como resultado la necesidad de ajustar las dosificaciones, incluyendo la edad del sujeto, el peso, el sexo, la dieta y el tiempo de administracion.

Esta invention se entendera mejor a partir de los Detalles Experimentales siguientes. Sin embargo, un experto en la tecnica apreciara facilmente que los metodos y resultados especlficos comentados son meramente ilustrativos de la invencion como se describe mas completamente en las reivindicaciones siguientes.

DETALLES EXPERIMENTALES

Primera serie de experimentos

El analisis molecular de las translocaciones cromosomicas asociadas con el mieloma multiple (MM) ha indicado que la patogenesis de esta neoplasia maligna puede ser heterogenea, estando asociada con varios oncogenes distintos incluyendo BCL-1, MUM-1 y FGFR3. Las anomallas estructurales del cromosoma 1q21, incluyendo las translocaciones con el cromosoma 14q32, representan aberraciones citogeneticas frecuentes asociadas con el mieloma multiple. Con el fin de identificar los genes implicados en estas translocaciones, se clonaron las regiones del punto de rotura correspondientes a ambos derivados de una t(1;14)(q21;q32) detectable en la llnea celular de plasmacitoma humano fR4. El analisis de las secuencias del punto de rotura mostro que implicaban una recombination reclproca entre el locus de la cadena pesada de inmunoglobulina (IgH) en 14q32 y secuencias desconocidas en 1q21. El locus normal correspondiente a la region 1q21 implicada en la translocation se clono y se identificaron los genes adyacentes a la region del punto de rotura por medio de una estrategia de captura del exon. Se encontraron dos genes, localizados a una distancia de 20 Kb entre si, en la region que abarcaba el punto de rotura en 1q21. El primer gen, denominado MUM-2 (mieloma multiple 2) se expresa como un transcrito de ARNm de 2,5 Kb detectable en el bazo y los ganglios linfaticos. La donation y secuenciacion del ADNc de MUM-2 completo pronostica una glicoprotelna de la superficie celular de 515 aminoacidos que contiene cuatro dominios de tipo Ig extracelulares, uno transmembrana y un dominio citoplasmatico y que comparten 37% de identidad (51% de homologla) con el receptor I gamma de Fc sobre sus tres primeros dominios extracelulares. En las celulas FR4, los puntos de rotura de la translocacion interrumpen el dominio codificante de MUM-2 y lo yuxtaponen al locus IgH en la misma orientation transcripcional. Como consecuencia, los transcritos MUM-2 especlficos de FR4 estructuralmente anormales (3,0, 5,2 y 6,0 Kb) en los ganglios linfaticos y el bazo codifican una protelna con un dominio extracelular que contiene seis dominios de tipo Ig homologos a los miembros de las familias de receptores Fc gamma y de adherencia de tipo Ig. La estructura de los genes MUM-2 y MUM-3 y su participation directa en una translocacion asociada a MM sugieren que estos genes codifican los receptores de la superficie celular novedosos importantes para la funcion de los linfocitos normales y las neoplasias malignas de las celulas B.

Segunda serie de experimentos

Procedimientos experimentales

Llneas celulares

Las llneas celulares de MM utilizadas en este estudio (FR4, U266, JJN3, EJM, SKMM1, RPMI-8226, XG1, XG2,

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

XG4, XG6, XG7) han sido referidas previamente (Tagawa et al., 1990), (Jernberg et al., 1987), (Hamilton et al., 1990; Jackson et al., 1989), (Eton et al., 1989), (Zhang et al., 1994). La linea celular FR4 se establecio en el laboratorio de uno de los autores (S.T.). Las lineas celulares U266, JJN3 y EJM fueron donaciones del Dr. K. Nilsson (Universidad de Uppsala, Uppsala, Suecia) y la linea celular SKMM-1 fue una donacion A.N. Houghton (Memorial Sloan Kettering Cancer Center, Nueva York, NY). Las cinco lineas de celulas XG se obtuvieron del Dr. Bernard Klein y se cultivaron en presencia de 1 ng/ml de IL-6 humana recombinante como se ha descrito previamente (Zhang et al., 1994). Las lineas celulares BL con anomalias 1q21 se han descrito previamente (Polito et al., 1995), (Magrath et al., 1980) y se cultivaron en RPMI, FCS al 10%.

Seleccion de la biblioteca genomica y de ADNc y analisis de la secuencia de ADN

Se construyeron dos bibliotecas genomicas a partir de ADN genomico de FR4 por medio de digestion completa con BamHI o por medio de digestion parcial con Sau3AI y posterior ligacion de las fracciones purificadas en gel en el vector de fago 1DASH-II (Stratagene). La biblioteca de BamHI se escruto con una sonda XhoI-BamHI de 4,2 kb derivada del locus de Ca y la biblioteca Sau3AI se escruto con una sonda 5'Sa descrita previamente (Bergsagel et al., 1996). Se escruto una biblioteca de ADN de placenta humana (Stratagene) con una sonda 1.0EH (Figuras 8A- 8C) para obtener el locus 1q21 de la linea germinal. El escrutinio de la biblioteca y el aislamiento de la placa se llevaron a cabo de acuerdo con los procedimientos establecidos (Sambrook et al., 1989). Los clones de ADNc de IRTA1 e IRTA2 se aislaron a partir de una biblioteca de ADNc oligo-dT/cebada al azar construida a partir de ARN de bazo humano normal (Clontech). La sonda de ADNc de IRTA1 utilizada para el escrutinio de la biblioteca se obtuvo a partir de la RT-PCR de ADNc de bazo humano utilizando los cebadores que flanquean los exones 1 y 3. La secuenciacion del ADN se llevo a cabo en un secuenciador automatizado ABI 373 (Applied Biosystems). Las busquedas de homologia de secuencia se llevaron a cabo a traves del servidor de correo electronico BLAST en el Centro Nacional de Informacion Biotecnologica, Bethesda, MD.

Aislamiento de PAC y YAC y captura de exones

Los clones de PAC humanos se obtuvieron mediante escrutinio de una biblioteca PAC humana aplicada sobre membranas de nailon (Research Genetics), con la sonda de 1,0 EH (Figuras 8A-8C). Se escruto la biblioteca de YAC humanos Zeneca (antes ICI) (Anand et al., 1990) obtenida del United Kingdom Human Genome Mapping Resource center (UK-HGMP) utilizando una estrategia de agrupamiento basada en la PCR. La captura de exones se realizo utilizando el sistema de captura de exones (Gibco BRL), de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Aislamiento de clones finales de PAC/YAC, electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE) y analisis de hi bridacion con fluorescencia en situ (FISH)

La extraccion de ADN de PAC se realizo de acuerdo con los metodos de lisis alcalina convencionales (Drakopoli N et al., 1996). Se utilizo un metodo de PCR vectorette para aislar sondas terminales de PAC y YAC (Riley et al., 1990), como se ha descrito previamente (Iida et al., 1996). El analisis de PFGE se realizo de acuerdo con protocolos convencionales (Drakopoli N et al., 1996) utilizando el sistema CHEF Mapper (BioRad, Hercules, CA). El marcaje con biotina del ADN de PAC, la preparacion de cromosomas y FISH se realizaron como se ha descrito previamente (Rao et al., 1993).

Analisis de transferencia Southern y Northern, RACE y RT-PCR

Los analisis de transferencia Southern y Northern se realizaron como se ha descrito previamente (Neri et al., 1991). Para los analisis de transferencia Northern se preparo el ARN total por el metodo del tiocianato de guanidinio y se selecciono el ARN poli(A) utilizando cuentas recubiertas con poli(T) (Kit Oligotex de Quigen). Para las transferencias Northern, se cargaron 2 mg de ARN poli(A) por calle. Se obtuvieron filtros Northern de multiples tejidos de Clontech. La RACE se realizo utilizando el kit de Amplificacion de ADNc Marathon (Clontech) y ADNc de bazo Marathon- Ready. La sintesis de la primera hebra de ADNc se realizo utilizando el sistema SuperScript RT-PCR (Gibco BRL).

Hibridacion in situ

Se transcribieron sondas de ARNc antisentido y efectoras que contenian digoxigenina con ARN polimerasa T3 y T7, respectivamente, a partir de plasmidos pBluescript KS+ linealizados que contenian la region codificante de los ADNc (nucleotidos 62-1681 de IRTA1 y 18 a 2996 de IRTA2.) Se congelo instantaneamente tejido tonsilar humano hiperplasico extirpado quirurgicamente de ninos del Babies Hospital, Columbia Presbyterian Medical Center en hielo seco en polvo. Las secciones del criostato se almacenaron durante varios dias a -80 grados C antes del procesamiento. La hibridacion no radiactiva in situ se realizo esencialmente como se ha descrito (Frank et al., 1999), excepto que el tiempo de fijacion en paraformaldehido al 4% se aumento a 20 minutos, y se omitio el tratamiento con proteinasa K. La rigurosidad de la hibridacion fue de 68 grados C, en 5X SSC, formamida al 50%. La tincion de los anticuerpos anti-digoxigenina conjugados con fosfatasa alcalina se desarrollo con el sustrato BCIP/NBT.

Transfeccion, inmunoprecipitacion y transferencia Western.

Se transfectaron de manera transitoria celulas 293 (ATCC), cultivadas en DMEM, FCS al 10%, de acuerdo con el metodo de fosfato de calcio convencional, con constructos de expresion transitoria pMT2T y pMT2T-IRTA1/Ca. Este ultimo fue generado utilizando el producto de la RT-PCR de IRTA1/Ca de FR4. Las celulas (2x106 de transfectantes y 2x107 de lineas celulares restantes) se solubilizaron en tampon de lisis Triton X-100 (NaCl 150 mM, Tris-HCl 10 mM [pH 7,4], TX-100 al 1%, BSA al 0,1%) en presencia de un coctel de inhibidores de proteasa (Roche Biochemicals). Los productos lisados se incubaron a 4°C durante 2 horas con 4 mg/ml del anticuerpo monoclonal

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Num. 117-332-1 (Yu et al., 1990) (Tanox Biosystems, Inc, Houston, Texas) que se originaron contra la porcion extracelular del peptido de membrana IgA. Los complejos inmunitarios se aislaron con protelna G-Sepharose (Pharmacia) antes de la electroforesis sobre geles en gradiente al 10-20% de Tris-HCl (BioRad) y de la inmunotransferencia, utilizando 15 mg/ml del anticuerpo Num. 117-332-1. Los resultados se visualizaron por medio de ECL (Amersham).

RESULTADOS

Clonacion Molecular de la t(1; 14)(q21 ;q32)

Las translocaciones cromosomicas que involucran al locus de la cadena pesada de Ig (IGH) se producen a menudo dentro o cerca de regiones de cambio de IgH como resultado de eventos de recombinacion de cambio "ilegltimos" (Dalla-Favera et al., 1983; Chesi et al., 1996; Chesi et al., 1998). Los puntos de rotura se pueden detectar mediante analisis de hibridacion por transferencia Southern como alelos reordenados en los que las secuencias de la region constante (Ch) de IGH han perdido su asociacion sintenica con las secuencias de la region de union (Jh) de IGH y de cambio 5' (s) (Dalla-Favera et al., 1983; Neri et al., 1988; Neri et al., 1991; Bergsagel et al., 1996). Este analisis ha llevado a la identificacion de varios companeros cromosomicos para el locus IgH en B-NHL y MM (Taub et al., 1982; Dalla-Favera et al., 1983; Neri et al., 1988; Neri et al., 1991; Ye et al., 1993; Chesi et al., 1996; Richelda et al., 1997; Iida et al., 1997; Dyomin et al., 1997; Dyomin et al., 2000). Los autores de la presente invencion emplearon la misma estrategia con el fin de clonar la region del punto de rotura de 1q21 en FR4, una llnea celular de mieloma que porta una t(1;14)(q21;q32), segun lo determinado por analisis citogenetico (Tagawa et al., 1990; Taniwaki M, resultados no publicados). Dos "fragmentos ilegltimamente reordenados se identificaron en el locus de la cadena pesada Ca en FR4 mediante analisis de transferencia Southern (datos no mostrados), y se clonaron a partir de bibliotecas de fagos construidas a partir de ADN genomico de FR4. El mapeo de restriccion, la hibridacion por transferencia Southern y la secuenciacion de nucleotidos parcial de dos fagos genomicos (clones lambda FR4B-5 y A FR4S-a, Figura 8A) demostraron que contenlan los puntos de rotura cromosomicos de una translocacion equilibrada reclproca entre el locus Cai en 14q32 y secuencias distintas de IGH. A continuacion se utilizo una sonda (1.0EH) que representaba estas secuencias distintas de IgH (Figura 8A) para clonar el correspondiente locus genomico normal a partir bibliotecas genomicas humanas del cromosoma artificial del fago P1 (PAC), y el cromosoma artificial de levadura (YAC). El analisis de hibridacion fluorescente in situ (FISH) de las propagaciones de la metafase humana normal utilizando el clon PAC no quimerico de 100 kb 49A16 que abarca la region del punto de rotura (vease mas abajo, Figura 13), identifico el locus cromosomico companero como derivado de la banda 1q21 (Figura 8C). El mapeo de un unico locus dentro del cromosoma 1 se confirmo por hibridacion de dos sondas no repetitivas a ADN de un panel de hlbridos de celulas somaticas representativo de cromosomas humanos individuales (datos no mostrados). Estos resultados fueron compatibles con la clonacion de secuencias que abarcan la t(1;14)(q21;q32) en FR4.

El analisis de secuencia de las regiones de punto de rotura en los cromosomas derivados y el alineamiento con los loci 14q32 y 1q21 de la llnea germinal revelaron que el punto de rotura se habla producido en el intron entre CH3 y el exon transmembrana de Ca1 en el cromosoma 14. Aunque la region del punto de rotura estaba desprovista de secuencias senal de recombinacion (RSS) o secuencias de senal de cambio (Kuppers et al., 1999), la secuencia CTTAAC (subrayada en la Figura 8B) estaba presente en ambos cromosomas 14 y 1 de la llnea germinal en la union del punto de rotura. Una copia de esta secuencia estaba presente en cada uno de los cromosomas derivados, con una ligera modificacion en la copia der(1) (mutacion puntual en el ultimo nucleotido: C a G). Los nucleotidos AT que preceden a CTTAAC en el cromosoma 1 tambien estaban presentes en ambos cromosomas derivados (Figura 8B). La translocacion no dio lugar a ninguna perdida de secuencias en el cromosoma 1. Por otro lado, en la porcion del cromosoma 14 de der(1) los autores de la presente invencion observaron dos deleciones aguas arriba de la union del punto de rotura: una delecion de 16 nucleotidos (GGCACCTCCCCTTAAC) y una delecion de 4 nucleotidos (TGCA) 6 nucleotidos aguas arriba (Figura 8B). Estas observaciones indican que la t(1;14)(q21;q32) en las celulas FR4 representa una translocacion reclproca equilibrada posiblemente facilitada por la presencia de secuencias homologas. (CTTAAC) en ambos cromosomas.

La region del punto de rotura de 1q21 contiene genes que codifican nuevos miembros de la superfamilia de receptores de inmunoglobulina

Los autores de la presente invencion investigaron a continuacion si la region del cromosoma 1q21 que abarca el punto de rotura de la translocacion en FR4 contiene una unidad transcripcional. El ADN de los clones de PAC parcialmente solapantes 49A16 y 210K22 (Figura 13) fueron clonados por medio de "pistola genica" en plasmidos, secuenciados y analizados para determinar la homologla con genes conocidos en bases de datos del genoma humano. Paralelamente, se buscaron los genes candidato en el PAC 49A16 por medio de una estrategia de captura de exones (Church et al., 1994).

El mapeo de los exones candidato sobre los clones genomicos de 1q21 revelo que el punto de rotura de FR4 se habla producido entre dos exones atrapados (vease mas abajo, Figura 13), que perteneclan al mismo transcrito, ya que podrlan estar conectados por RT-PCR utilizando ARN de bazo. A continuacion, se utilizo este producto de RT- PCR como sonda para escrutar una biblioteca de ADNc de bazo con el fin de aislar clones completos correspondientes a este transcrito. Se identificaron dos conjuntos de clones de ADNc, que perteneclan a dos transcritos distintos y que compartlan una identidad de secuencia de ARNm de 76% dentro de la region de la sonda de 443 pb. Los clones de ADNc completos para ambos transcritos se obtuvieron mediante amplificacion rapida de

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

extremos de ADNc (RACE) en ADNc de bazo humano que genero productos de extension 5' y 3'.

La estructura esquematica del ADNc que representa el primer transcrito se representa en la Figura 9A. El uso alternativo de los tres posibles sitios de poliadenilacion en su region no traducida 3' da lugar a tres especies de ARNm de 2,6, 2,7 y 3,5 kb, que codifican la misma supuesta protelna de 515-aminoacidos (Figura 9A). Las caracterlsticas pronosticadas de esta protelna incluyen un peptido senal, de acuerdo con la regla [-3, -1] (von Heijne, 1986), cuatro dominios extracelulares de tipo Ig que llevan tres sitios de glicosilacion potenciales unidos a (N) de asparragina (Figura 9A), uno transmembrana de 16 aminoacidos y un dominio citoplasmatico de 106 aminoacidos, con tres supuestos dominios de union de homologla 2 a Src (SH2) consenso (Unkeless y Jin, 1997) (Figura 10B). Estos dominios de union a (SH2) muestran caracterlsticas de motivos tanto ITAM (Motivo jnmunorreceptor basado en la Activacion de Tirosina D/EX7D/EX2YXXL/IX6-8YXXL/I; donde X indica los residuos no conservados) (Reth, 1989) como motivos ITIM (Motivo de Inhibicion de Inmunorreceptor basado en Tirosina - S/V/L/IYXXL/V, donde X indica residuos no conservados) (Unkeless y Jin, 1997). Como se muestra en la Figura 10B, los primeros dos dominios de union a SH2 estan espaciados por 8 aminoacidos, en consonancia con el motivo ITAM consenso. A diferencia del consenso, el residuo glutamato (E) se posiciona cuatro en lugar de dos aminoacidos antes de la primera tirosina (Y) (Figura 10B), y la posicion +3 con respecto a la tirosina (Y) esta ocupada por valina (V) en lugar de leucina (L) o isoleucina (I) (Cambier, 1995). Los tres dominios se ajustan al consenso ITIM y cada uno esta codificado por un exon separado, como es el caso de ITIM. Asl, su disposicion puede dar lugar a tres ITIM o posiblemente a un ITAM y un ITIM. La estructura general de esta protelna sugiere que representa un nuevo receptor transmembrana de la superfamilia de Ig y por lo tanto se denomino IRTA1 (gen 1 Asociado a la Translocacion del Receptor Inmunitario 1).

El segundo ADNc comparte homologla con IRTA1 (68% de identidad de nucleotidos para la longitud del mensaje de IRTA1 que codifica su dominio extracelular) y fue denominado IRTA2. El locus IRTA2 es mas complejo que IRTA1 y se transcribe en tres isoformas de ARNm principales (IRTA2a, IRTA2b, IRTA2c) de diferente peso molecular (2,8, 4,7 y 5,4 kb respectivamente), cada uno con un propia unica region no traducida 3' (Figura 9B). Adicionalmente, un transcrito de 0,6 kb (Figura 12A) surge del uso de una senal de poliadenilacion temprana en el nucleotido 536 de IRTA2. Las tres isoformas de la protelna IRTA2 pronosticadas codificadas por estos transcritos comparten una secuencia de aminoacidos comun hasta el residuo 560, que presenta un peptido senal comun y seis dominios de tipo Ig extracelulares (Figura 9B). IRTA2a codifica una glicoprotelna secretada de 759 aa con ocho dominios de tipo Ig seguido de 13 aminoacidos predominantemente polares unicos en su extremo C. IRTA2b diverge de IRTA2a en el residuo de aminoacido 560, y se extiende a lo largo de un corto tramo de 32 residuos adicionales, cuyo caracter hidrofobo es compatible con su acoplamiento a la membrana plasmatica a traves de un ancla de GPI (Ferguson y Williams, 1988). IRTA2c es la isoforma mas larga cuya secuencia se desvla de IRTA2a en el aminoacido 746. Codifica una glicoprotelna transmembrana de tipo I de 977 aa con nueve dominios de tipo Ig extracelulares, que alberga ocho sitios de glicosilacion unidos a N potenciales, uno transmembrana de 23 aminoacidos y un dominio citoplasmico de 104 aminoacidos con tres motivos de union a SH2 consenso (Figura 10B). Cada uno de los sitios de union a SH2 en IRTA2c coincide con el consenso ITIM (Figura 10B) y es codificado por un exon separado. Estos rasgos sugieren que IRTA2c es un receptor transmembrana novedoso de la superfamilia de Ig con isoformas secretadas y unidas a GPI.

Homologla entre las protelnas IRTA y los receptores de la superfamilia de inmunoglobulinas

El alineamiento de aminoacidos de la totalidad de los dominios extracelulares de las protelnas IRTA1 e IRTA2 entre si y con otros miembros de la superfamilia de Ig revelo una homologla notable entre ellos (identidad de 47% y similitud de 51%) y una homologla inferior, pero llamativa con la familia de protelnas receptoras de Fc gamma. Esta homologla era mas fuerte en las posiciones de aminoacidos conservados entre las diferentes clases de receptores de Fc. Entre los receptores de Fc, el receptor de IgG de la alta afinidad FCGRI (CD64) compartio los mas altos niveles de homologla con los tres primeros dominios Ig de IRTA1 e IRTA2 (identidad de 37% y similitud de 50%) a lo largo de toda su porcion extracelular (Figura 10A). Se observaron niveles inferiores de homologla entre las protelnas IRTA y los dominios extracelulares de otras moleculas de la superficie celular, incluyendo la molecula de adherencia endotelial de plaquetas humanas (PECAM1), la molecula de adherencia celular de linfocitos B (CD22) y la glicoprotelna biliar 1 (BGP1) (22-25% de identidad, 38-41% de homologla).

No existe homologla aparente entre las IRTA y los miembros de la familia de receptores de Fc en sus dominios citoplasmicos. En contraste, existe una homologla de aminoacidos significativa entre IRTA1 y PECAM1 (identidad de aminoacidos de 31% y homologla de 45%), IRTA2c y BGP1 (identidad de 30%, homologla de 35%) e IRTA2c y PECAM1 (28% de identidad, 50% de homologla) (Figura 10B). Estas homologlas sugieren el empleo de rutas de serialization aguas abajo similares por parte de estas protelnas diferentes.

IRTA1 e IRTA2 normalmente se expresan en subpoblaciones especlficas de celulas B

El patron de expresion normal de los ARNm de IRTA1 e IRTA2 se analizo primero por hibridacion de transferencia de Northern del ARN derivado de diferentes tejidos humanos normales y de las llneas celulares humanas que representan diferentes linajes hematopoyeticos y etapas de desarrollo de celulas B.

Se detecto la expresion de IRTA1 a un nivel muy bajo en ARN de bazo y ganglios linfaticos humanos (Figura 11A, panel izquierdo) y fue indetectable en todos los otros tejidos humanos analizados, incluyendo el hlgado fetal, medula

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

osea, pulmon, placenta, intestino delgado, rinon, hlgado, colon, musculo esqueletico, corazon y cerebro (datos no mostrados). Entre las llneas de celulas B, la expresion de IRTA1 estaba ausente en llneas de celulas que representan celulas pre-B y celulas B del centro germinal, celulas plasmaticas y celulas de origen eritroide, celulas T y mieloide (datos no mostrados, vease Materiales y Metodos). La expresion fue detectable a niveles muy bajos solamente en llneas celulares linfoblastoides (LCL) inmortalizadas con EBV, que representan una subpoblacion (inmunoblastos) situada aguas abajo de las celulas B del centro germinal en la diferenciacion de celulas B. Sin embargo, la expresion se indujo en celulas ER/EB privadas de estrogeno que, al estar inmortalizadas por un genoma de EBV recombinante en el que el gen EBNA2 se fusiona con el receptor de estrogeno, proliferan en presencia de estrogeno, mientras se detienen en la fase G0/G1 tras la privacion de estrogeno (Kempkes et al., 1995). La expresion de IRTA1 era apenas detectable en estas celulas en presencia de estrogeno, pero fue inducida (10 veces) despues de la detention G0/G1 tras la retirada de estrogenos (Figura 11A, panel derecho). Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que IRTA1 se expresa en una subpoblacion linfoide presente en el bazo y los ganglios linfaticos y, presumiblemente, representada por celulas B en reposo.

Para investigar mas el fenotipo y la distribucion en los tejidos de las celulas que expresan IRTA1, los autores de la presente invention realizaron la hibridacion in situ en tejido tonsilar humano utilizando una sonda de ADNc antisentido de IRTA1 (Figura 11B). Se procesaron las secciones seriadas para la hibridacion in situ con una sonda de ADNc efectora de control (Panel Num. 1 en la figura 11B), una sonda de ADNc antisentido (Panel Num. 2) y tincion con hematoxilina y eosina (H & E) (Panel Num. 3) para esbozar la arquitectura del tejido linfoide. La senal de hibridacion de IRTA1 fue excluida del centro germinal y la zona de manto de los follculos y se concentro caracterlsticamente en la zona perifolicular con infiltraciones en la region intraepitelial (Figuras 11B-2, 11B-4). En esta region, solo las celulas B fueron positivas tal como se documenta mediante la tincion con marcadores especlficos de celulas B (IGD, no mostrado), y mediante analisis immnunohistoqulmico con anticuerpos anti-IRTA1 y anti-B (CD20, PAX5), anti-T (CD3), y anti-monocitos (CD68) (no mostrados; G. Cattoretti et al., manuscrito en preparation.). Esta area perifolicular es la "zona marginal" equivalente a la amlgdala, lo que representa un compartimiento de celulas B funcionalmente distinta que contiene la mayorla de las celulas B de memoria y las celulas B monocitoides (de Wolf-Peeters et al., 1997). Junto con el analisis de transferencia Northern de tejidos normales y llneas celulares, estos resultados indican que IRTA1 se expresa en una subpoblacion de celulas B maduras en reposo topograficamente ubicada en la region perifolicular e intraepitelial, sitios ricos en celulas B de memoria.

En el caso de IRTA2, el analisis de transferencia Northern detecto todas las especies empalmadas alternativamente en ARNm de ganglio linfatico, bazo, medula osea e intestino delgado humanos, con una preponderancia relativa de la isoforma IRTA2a (Figura 12A, panel izquierdo). Entre las llneas de celulas hematopoyeticas de origen linfoide y no linfoide sometidas a ensayo, la expresion de IRTA2 se restringio a las llneas de celulas B con un fenotipo post-centro germinal inmunoblastico (Figura 12A, panel derecho). De manera similar a IRTA1, estaba ausente de las llneas celulares derivadas de celulas pre-B, centroblastos del centro germinal, celulas plasmaticas, celulas T, celulas eritroides y celulas mieloides (Figura 12A, panel derecho).

El analisis de hibridacion in situ de tejido tonsilar humano, utilizando el ADNc de IRTA2 como sonda, fue compatible con los resultados del analisis de transferencia Northern. El ARNm de IRTA2 fue excluido en gran parte de la zona del manto del centro germinal, con la exception de unas pocas celulas positivas (Figuras 12B-2, 12B4). Dentro del centro germinal, la zona oscura, representada por centroblastos, aparecio negativa para IRTA2, mientras que la zona clara, rica en centrocitos, fue fuertemente positiva (Figuras 12B-2, 12B-4). Finalmente, el ARNm de IRTA2 se detecto en la region equivalente de la "zona marginal" fuera de los follculos de los centros germinales y en las regiones intraepiteliales e interfoliculares de la amlgdala. Este patron es compatible con la especificidad de IRTA2 para los centrocitos y las celulas post-B del centro germinal. Comparando sus patrones de expresion, los autores de la presente invencion concluyen que ambos son especlficos para las celulas B maduras, pero IRTA2 tiene un patron mas amplio de expresion que incluye centrocitos y celulas B interfoliculares, mientras IRTA1 esta restringida a las celulas B de la zona marginal, muy probablemente celulas de memoria.

Organization genomica de los genes IRTA1 e IRTA2

Para entender las consecuencias de las anomallas 1q21 sobre la estructura y la expresion de los genes IRTA1 e IRTA2, los autores de la presente invencion determinaron primero la organizacion de sus loci genomicos. El gen IRTA1 contiene 11 exones con un tamano genomico total de 24,5 kb (Figura 13). Se encontro que el locus IRTA2 abarcaba una region genomica de aproximadamente 40 kb (Figura 13). Los tres productos empalmados alternativamente de IRTA2 comparten sus primeros 8 exones, en cuyo punto IRTA2b no utiliza el siguiente sitio de empalme, y termina introduciendo su region UTR 3'. Las isoformas IRTA2a y 2c se empalman en el exon 9, entrando IRTA2a en su UTR 3' despues del exon 11 y empalmando IRTA2c en el exon 12 y extendiendose hasta el exon 18 (Figura 13).

Basandose en los datos de secuenciacion, los autores de la presente invencion determinaron que los genes IRTA1 e IRTA2 se encuentran a 21 kb el uno del otro, yuxtapuestos en la misma orientation transcripcional (Figura 13) que se extiende desde el telomero (5') hacia el centromero (3'). En el locus 1q21, estan estrechamente conectados el uno al otro, as! como a tres genes adicionales que hablan clonado recientemente los autores de la presente invencion a traves de su homologla con las IRTA (I.M., manuscrito en preparacion). Los cinco genes son contiguos,

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

cubriendo una region de ~ 300 kb en 1q21. Esta region se encuentra en el intervalo entre los puntos de rotura de 1q21 referidos anteriormente. Basandose en la distancia entre clones genomicos que albergan los genes respectivos en el mapa Whitehead Institute Radiation Hybrid, se estima que el locus de IRTA1-2 se encuentra aproximadamente a 0,8 Mb de distancia del locus MUC1 hacia el telomero (N.P., datos no publicados; Dyomin et al., 2000; Gilles et al., 2000) y a menos de o igual a 7 Mb del locus FCGRIIB hacia el centromero (N.P., datos no publicados).

La translocacion t(1;14)(q21;q32) genera una protelna de fusion IRTA1/Ca1 en la llnea celular de mieloma FR4 El analisis comparativo de restriccion y de la secuencia de nucleotidos de la llnea germinal frente a las secuencias reordenadas de los loci Ca1 e IRTA1 mostro que la translocacion habla fusionado las secuencias en el intron 2 del gen IRTA1 a las secuencias intronicas entre CH3 y el exon transmembrana de Ca1 en la misma orientacion transcripcional (Figura 14A). Esto sugiere que, si las secuencias de IRTA1 se expresaban en el locus translocado, el sitio donante intacto en el llmite 3' del exon IRTA1 y el sitio aceptor intacto en el 5' de Ca1 podrlan ser utilizados para generar un ARNm de fusion IRTA1/Ca1, y posiblemente una protelna de fusion IRTA1/Ca1.

Con el fin de someter a ensayo esta prediccion, los autores de la presente invencion analizaron la expresion del ARNm de IRTA1 en FR4 por medio de analisis de transferencia Northern utilizando una sonda de ADNc de IRTA1 derivada del exon 1 (Figura 14A). Esta sonda detectaba un mensaje de 0,8 kb en FR4 que estaba ausente de otras llneas de celulas B, y era mas corto que el mensaje normal de 2,5 kb detectable en celulas ER/EB (Figura 14B). Los autores de la presente invencion clonaron este transcrito por medio de RT-PCR del ARNm de FR4 utilizando cebadores derivados de secuencias en el llmite 5' del exon 1 de IRTA1 y el llmite 3' del exon citoplasmico Ca (Figura 14A). Se obtuvo un producto de RT-PCR de FR4, pero no de la llnea celular DAKIKI que expresa la IgA de la superficie de tipo salvaje, u otras llneas celulares que carecen de una translocacion t(1;14) (datos no mostrados). El analisis de secuenciacion directa del producto de PCR indico que el empalme habla ligado de manera precisa IRTA1 y Ca1 en los sitios de empalme canonicos y determino que el transcrito de fusion tenia 820 pb de longitud.

El analisis del producto de protelna pronosticado indico que el empalme IRTA1/Ca1 habla dado lugar a una fusion entre el peptido senal IRTA1 y los dos primeros aminoacidos extracelulares, con el espaciador largo extracelular de 32 aminoacidos, el dominio transmembrana y la cola citoplasmatica del receptor de IgA1 de membrana (mIgA1) (Figura 14C). Para el analisis de la expresion de esta protelna de fusion en extractos de protelna FR4, los autores de la presente invencion utilizaron un anticuerpo dirigido contra residuos de aminoacidos extracelulares especlficos para la isoforma transmembrana de Ca1 (Yu et al., 1990) para la inmunoprecipitacion, seguido de transferencia Western. Los resultados de los autores de la presente invencion demuestran que las celulas FR4, pero no una llnea celular de control (DAKIKI) que expresa IgA de la superficie de tipo salvaje, expresan una protelna de 9,8 kDa acorde con el tamano pronosticado de la protelna de fusion IRTA1/Ca1 (Figura 14D). Estos resultados muestran que el alelo translocado codifica una protelna de fusion, compuesta por el peptido senal y los dos primeros residuos extracelulares de IRTA1 (17 aminoacidos) fusionado a los dominios transmembrana y citoplasmicos codificados por Ca1 (71 aminoacidos). En contraste con la expresion en exceso de IRTA1/Ca1 en der(14), no se detecto expresion en FR4 para el transcrito reclproco Ca1/IRTA1 o para el gen IRTA2 intacto en der(1).

Con la excepcion de FR4, no se detecto expresion de ARNm de IRTA1 en ninguna otra llnea celular de mieloma o linfoma, independientemente del estatus de su banda cromosomica 1q21 (datos no mostrados). Por lo tanto, la fusion IRTA1/Ca representa un evento raro en las aberraciones de 1q21.

Desregulacion frecuente de la expresion de IRTA2 en llneas celulares que portan anomallas de 1q21 Con el fin de establecer la relacion flsica entre otros puntos de rotura de 1q21 y el locus de IRTA1/2, los autores de la presente invencion realizaron un analisis FISH con el PAC 49A16 en el panel de llneas celulares BL y MM de los autores de la presente invencion. De diez llneas celulares BL analizadas, siete con dup(1) (q21q32) y tres con translocaciones 1q21 (AS283A, BL104, BL136), los autores de la presente invencion detectaron tres senales correspondientes al locus de IRTA1/IRTA2 en siete de las primeras y dos de las ultimas, en consonancia con dup(1) (q21q32) en el primer caso y dup(1) (q21q32) seguido de un punto de rotura de translocacion en 1q21 en el segundo (Tabla 1). El analisis FISH de AS283A y BL136, utilizando sondas que abarcan el locus de IRTA y con clones genomicos vecinos, situo el punto de rotura de los cromosomas derivados fuera del locus de IRTA en ambas llneas celulares, a una distancia de >800 kb hacia el centromero en AS283A y >800 kb hacia el telomero en BL136 (N.P., resultados no publicados). En consonancia con este hallazgo, el analisis de 30 casos de tumores primarios MM por medio de FISH de interfase con el YAC de 300 kb 23GC4 (Figura 13), mostro que 15 casos (50% del total analizado) tenlan mas de dos senales de FISH en interfase (datos no mostrados), mientras que el FISH de dos colores con dos clones de PAC que flanqueaban las fronteras centromericas y telomericas de YAC no detecto ninguna escision de estas dos sondas en ninguno de los casos. Estos resultados indican que, con la excepcion de FR4, los puntos de rotura de las aberraciones de 1q21 en BL o MM no estan dentro de o en estrecha proximidad con la region genomica definida por IRTA1 e IRTA2. Sin embargo, el resultado coherente de cualquiera dup(1) (q21q32) (vease la Tabla 1) o dup(1) (q21q32) seguido de translocaciones desequilibradas (AS283A, BL136, XG2, XG7 en la Tabla 1) es la trisomla o tetrasomla parcial de la region de 1q21 que contiene los genes de IRTA.

5

10

15

20

25

30

Tabla 1. Resumen de los datos del cariotipo y FISH en el locus IRTA1/IRTA2

Tipo de tumor: Citogenetica PAC 49A16 Numero de copias del locus IRTA por FISH Expresion de ARNm de IRTA2

Linfoma de Burkitt

AS283A: der(4) t(1;4) (q21; q35) der(4), normal 1 3 ++++++

MC116: duplq21 dup1q21 3 + + +

CA46: duplq21 duplq21 3 + + +

PA682: duplq21 duplq21 3 + +

BrgIgA: duplq21 dup1q21 3 + +

BL32: dup1q21 dup1q21 3 -

BL92: dup1q21 dup1q21 3 + +

BL103: invdup1q21 dup1q21 3 +

BL104: t(1; 3) (q21;p25) der(1) 2 +

BL136: der(1) (qpter1q21 :: q21) der(1) 3 + +

Mieloma multiple

XG2: der(1) t(1;?) (q21 ;?) der(1), normal 1 3 + + + +

der 19 t(1;19) (q12;?): der(19)

XG7: der(9) t(1; 9) (q12 ;?) der(9) 4 -

der(19) t(1;19) (q12;?): der(19)

der(1) t(1 ;?) (q21 ;?) x2: der(1) x2

A continuacion, los autores de la presente invencion investigaron si estas aberraciones tenlan un efecto sobre la expresion del ARNm de IRTA2. Con este fin, los autores de la presente invencion utilizaron una sonda de ADNc correspondiente a la region no traducida 5' de IRTA2 para escrutar una transferencia Northern con un panel de llneas celulares de B-NHL y MM carentes de o que mostraban anomallas cromosomicas en 1q21. Los resultados muestran que la mayorla (diez de doce) llneas BL con cromosomas 1q21 normales carecen esencialmente de expresion de IRTA2, coincidiendo con el hecho de que los BL derivan de centroblastos GC que normalmente carecen de expresion de IRTA2 (Figura 15A, panel izquierdo). Por el contrario, la mayorla de las llneas BL que portan anomallas en 1q21 (diez de doce) muestran claramente una regulacion al alza del ARNm de IRTA2 (Figura 15A, panel derecho), que oscilan de 2 a 50 veces sobre los niveles basales detectados en BL con 1q21 normal. Entre las llneas celulares de mieloma, IRTA2 era expresada en exceso en una de cada tres llneas que muestran anomallas en 1q21 (XG2), mientras que no se expresaba en ninguna de las siete con 1q21 normal (Figura 15B).

Estos resultados muestran una fuerte correlacion entre la presencia de aberraciones cromosomicas 1q21 y la desregulacion de la expresion de ARNm de IRTA2 en BL y sugieren que las trisomlas del locus IRTA2 pueden desregular su expresion en este subtipo de linfoma (vease la Discusion).

Discusion

Los esfuerzos descritos en la presente memoria para identificar genes implicados en las aberraciones cromosomicas que afectan a la banda 1q21 en el Mieloma Multiple y el linfoma de celulas B, condujeron al descubrimiento de que IRTA1 e IRTA2, dos miembros fundadores de una nueva subfamilia de receptores relacionados dentro de la familia de inmunorreceptores; las secuencias de acido nucleico completas que codifican las protelnas IRTA1 e IRTA2 son proporcionadas en la presente memoria, as! como las secuencias de aminoacidos de las protelnas IRTA1 e IRTA2 codificadas. Con posterioridad tres genes adicionales de los miembros de esta subfamilia de receptores relacionados fueron aislados, IRTA3, IRTA4, e IRTA5, cuyas secuencias de acido nucleico completas se proporcionan en la presente memoria, as! como las secuencias de aminoacidos de las protelnas IRTA3, IRTA4, e IRTA5 codificadas. Estos resultados tienen implicaciones para la biologla normal de las celulas B, as! como para el papel de las aberraciones de 1q21 en la linfomagenesis.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

IRTA1 e IRTA2 son miembros fundadores de una nueva subfamilia dentro de la superfamilia de Ig Varias caracterlsticas compartidas entre los dos genes de IRTA y sus protelnas codificadas sugieren que forman una nueva subfamilia dentro de la superfamilia de inmunorreceptores. En primer lugar, comparten un mayor grado de homologla entre si en sus dominios extracelulares que con otros miembros de la superfamilia tanto en su secuencia de ARNm (identidad de 68%) como de protelna (identidad de 47%). En segundo lugar, comparten homologla en sus dominios citoplasmicos, marcados por la presencia de motivos de senalizacion de tipo ITAM e ITIM en el contexto de las secuencias de aminoacidos homologas. En tercer lugar, IRTA1 e IRTA2 pertenecen a una subfamilia mas grande de cinco genes que muestra mayor homologla intrafamiliar y una estrecha agrupacion dentro de una region de ~ 300 kb en 1q21 (I.M. et al., Manuscrito en preparacion). Su organizacion genomica sugiere que un gen ancestral comun puede haber dado lugar a esta subfamilia, por medio de un proceso de duplicacion y divergencia de secuencia, similar al mecanismo propuesto para la familia de receptores de Fc (Qiu et al., 1990).

En su dominio extracelular, las protelnas IRTA estan estrechamente relacionadas con la subfamilia de receptores de Fc basandose en el alto grado de homologla de aminoacidos compartida especialmente con el receptor FCGRI de alta afinidad (37-45% de identidad de aminoacidos). Tambien sugiere un origen evolutivo comun con los receptores de Fc por la posicion del locus de la familia IRTA en el intervalo entre el locus FCGRI en 1q21 y los loci FCERI y FCGRII-III en 1q21-q23. Por ultimo, los genes IRTA y FCR comparten una organizacion exon/intron similar de la porcion del gen que codifica su peptido senal, en particular, los dos exones llder 5' con las secuencias que codifican el sitio de la peptidasa senal ubicado dentro del segundo exon de 21 pb.

Basandose en sus motivos de tipo ITIM citoplasmaticos, las protelnas IRTA se pueden considerar miembros de la Superfamilia de Receptores Inhibidores (IRS), un grupo de receptores que bloquean la activacion de muchos tipos de celulas en el sistema inmunitario (Lanier, 1998). Tales miembros incluyen FCGRIIB y CD22 en el ser humano (DeLisser et al., 1994) y PIR-B en el raton (Kubagawa et al., 1997). De un modo analogo a los miembros de IRS, los ITIM de IRTA1 e IRTA2 estan codificados por exones individuales. Una caracterlstica que comparten muchos miembros de IRS es la existencia de las correspondientes isoformas activadoras del receptor cuyos dominios citoplasmicos estan desprovistos de ITIM (revisado en Ravetch y Lanier, 1998). Es posible que la isoforma secretada de IRTA2, que carece de motivos de tipo ITIM, cumpla un papel analogo al contrarrestar el efecto de la isoforma transmembrana.

Las protelnas IRTA1 e IRTA2 y los miembros de la subfamilia las Moleculas de Adherencia Celular (CAM) PECAM1, CD22 y BGP1 comparten una homologla significativa en la secuencia y la organizacion general de su porcion extracelular. Ademas, la capacidad de IRTA2 para generar tres isoformas de la protelna con una localizacion subcelular distinta (una protelna transmembrana, una unida a GPI o una secretada) por corte y empalme diferencial es compartida por NCAM, otro miembro de la subfamilia de CAM (Dickson et al., 1987; Gower et al., 1988). Por lo tanto, la familia de IRTA tambien se relaciona con la familia de CAM, como se ha sugerido previamente para un miembro de la familia de receptores de Fc (FCGRII murino) debido a su homologla con PECAM1 (CAM, familia IRS) (Daeron, 1991; Newman et al., 1990; Stockinger et al., 1990).

En conclusion, la familia de IRTA puede representar una interseccion entre las familias de Fc, IRS y CAM, que combina las caracterlsticas de las tres. En consecuencia, las protelnas IRTA pueden tener un papel en la regulacion de la transduccion de senales durante una respuesta inmunitaria (como receptores de Fc), en la comunicacion intercelular (como miembros de las familias IRS y CAM) y en la migracion celular (como miembros de la familia CAM) (DeLisser et al., 1994; Ravetch y Lanier, 2000). Los experimentos iniciales indican que IRTA1 se puede unir debilmente a la IgA agregada por calor, mientras IRTA2c se puede unir especlficamente a la IgG de suero humano agregada por calor (con mayor afinidad para IgG1 e IgG2), pero no a IgG, IgA, IgM e IgE humanas monomericas (datos no mostrado). Estos datos iniciales apoyan una relacion funcional entre IRTA y las familias de receptores de Fc, pero no excluyen las funciones que dependen de otros ligandos para las protelnas IRTA.

Patron de expresion diferencial de los genes de IRTA en celulas B maduras

Los genes IRTA muestran un patron de expresion especlfico en diversos compartimentos de celulas B normales. IRTA1 esta topograficamente restringida a las celulas B dentro de la region perifolicular, que se denomino originalmente zona marginal en el bazo, pero tambien es detectable en la mayor parte de los organos linfoides (de Wolf-Peeters et al., 1997). Los datos de hibridacion in situ que aqul se presentan han sido confirmados por analisis inmunohistoqulmico utilizando anticuerpos anti-IRTA1 que muestran que la protelna IRTA1 se expresa selectivamente en celulas B de la zona marginal, y, entre los NHL, en el linfoma de la zona marginal, los tumores derivados de estas celulas (G. Cattoretti et al., manuscrito en preparacion). Por otra parte, IRTA2 tiene un patron de expresion mas amplio que incluye centrocitos GC, as! como un amplio espectro de celulas perifoliculares, que pueden incluir inmunoblastos y celulas de memoria. Los datos iniciales sugieren que el patron de expresion de IRTA3 es analogo al de IRTA2, mientras que IRTA4 e IRTA5 se expresan selectivamente en las celulas B de la zona del manto (I. Miller et al., manuscrito en preparacion), el compartimiento pre-GC de las celulas B maduras (MacLennan, I.C., 1994). Esta restriction topografica de la expresion genica de IRTA en los organos linfoides sugiere que las moleculas de IRTA pueden desempenar un papel en la migracion o actividad de diversas subpoblaciones de celulas B en compartimentos especlficos de celulas B funcionales. Ademas, la expresion de IRTA deberla ser util para el diagnostico diferencial de los subtipos de NHL que derivan de diversos compartimentos de celulas B, en particular IRTA1 en el diagnostico del linfoma de la zona marginal.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Locus de IRTA1 y anomallas de 1q21 en MM

En la llnea celular FR4, la consecuencia de la translocacion t(1;14) es la formation de un gen de fusion IRTA1/Ca1. A pesar del hecho de que este gen esta dirigido por la region promotora de IRTA1, que normalmente es silencioso en las celulas plasmaticas, su expresion es alta en FR4, presumiblemente debido a la influencia de LCR 3' de Ca1, que es retenido aguas abajo del locus Ca1. El gen de fusion codifica una protelna de fusion IRTA1/Ca1 que contiene solo el peptido senal y los primeros dos aminoacidos de IRTA1 unidos al receptor de IgA de la superficie. Este ultimo ha sido desprovisto casi completamente de su dominio extracelular, pero conserva todos sus dominios transmembrana e intracelulares. Esta estructura indica que la protelna de fusion IRTA1/Ca1, aunque probablemente incapaz de unirse a cualquier ligando, puede conservar el potencial para la dimerization y la serialization. En particular, la portion extracelular derivada de IgA de membrana (m) contiene un residuo de cistelna, que puede estar implicado en enlaces disulfuro entre dos cadenas a o entre cadenas a y protelnas asociadas, tales como el receptor de la superficie coadyuvante CD19 (Leduc et al., 1997). La protelna de fusion tambien porta el dominio citoplasmico mIgA de 14 aminoacidos intacto, que esta altamente conservado en evolution (Reth, 1992) y puede desempenar un papel esencial en la proliferation, la supervivencia y la diferenciacion de celulas B maduras, de forma analoga al papel de mIgG y mIgE (Kaisho et al., 1997). Por lo tanto, la aparicion de la protelna IRTA1/Ca1 en FR4 puede haber proporcionado a las celulas una ventaja proliferativa y de supervivencia durante el desarrollo del tumor a traves la activation independiente del ligando (antlgeno) de la ruta de BCR. Este evento de fusion sin embargo, parece ser poco frecuente en las neoplasias malignas de celulas B, ya que hasta ahora los autores de la presente invention han sido capaces de detectarlo solo en las celulas FR4.

Locus de IRTA2 y anomallas de 1q21 en MM y BL

La expresion anormal de IRTA2 es una consecuencia frecuente de las anomallas en 1q21. Aunque este gen no se expresa normalmente en centroblastos, las presuntas contrapartes normales de BL (Kuppers et al., 1999), ni en BL con 1q21 normal, sus niveles estan regulados al alza un promedio de 10 veces en llneas celulares de BL con anomallas en 1q21. Esta desregulacion parece ser especlfica para IRTA2 ya que todos los otros 4 genes de IRTA presentes dentro de 300 kb en 1q21, o bien no se expresan en BL (IRTA1), o bien su patron de expresion no se corresponde con la presencia de anomallas en 1q21 (IRTA3, 4, 5, no mostrado). El mecanismo por el cual se produce este desregulacion es diflcil de determinar en ausencia de lesiones estructurales dentro o adyacentes al gen de IRTA2. Dado que las aberraciones heterogeneas que afectan a 1q21 ocasionan todas un numero de copias en exceso del locus de IRTA, es posible que esto pueda conducir a trastornos de la regulation, como en el caso de un bajo nivel de amplification de BCL2 en FL que carece de translocaciones (14;18) (Monni et al., 1997), REL en linfoma difuso de celulas grandes (Houldsworth et al., 1996; Rao et al., 1998) y desregulacion de Ciclina D1 en algunos casos de MM con trisomla 11 (Pruneri et al., 2000). Por otra parte, las anomallas en 1q21, incluyendo translocaciones y duplicaciones, cambian el contexto genomico del locus de IRTA y pueden conducir a la desregulacion de IRTA2 por elementos de organization de la cromatina potenciadores que actuan en cis distantes que actuan sobre su promotor como es el caso MYC en BL endemico (Pelicci et al., 1986) y MM (Shou et al., 2000) y para CCND1 en el linfoma de celulas del manto (Bosch et al., 1994; Swerdlow et al., 1995) y MM (Pruneri et al., 2000).

Las consecuencias biologicas de una expresion desregulada de IRTA2 son diflciles de predecir en esta etapa. La observation de que IRTA2 tiene homologla con los receptores de adherencia CAM, junto con su distribucion especlfica en la zona clara del GC sugieren que su expresion ectopica en centroblastos puede causar una interruption en el desarrollo y la arquitectura del Gc. Por otro lado, las observaciones iniciales de los autores de la presente invencion de que IRTA2 se puede unir a complejos inmunitarios con IgG de una manera comparable a los receptores de Fc bona fide sugieren que su expresion inapropiada puede perturbar la dinamica de la regulacion de la superficie celular de las respuestas inmunologicas de celulas B, conduciendo posiblemente a la expansion clonal. Se ha propuesto que la expresion desregulada de FCGR2B como consecuencia de la t(1;14)(q21;q32) en el linfoma folicular contribuye a la linfomagenesis en este tipo de tumor (Callanan et al., 2000), por medio de un mecanismo que implica la huida por parte de las celulas tumorales de la vigilancia inmunitaria anti-tumoral a traves de su union a Fc y de la inactivation de la IgG especlfica del tumor. Se han observado mecanismos de evasion similares en las celulas infectadas por herpesvirus que codifican Fc (Dubin et al., 1991). Es necesario probar el papel de la desregulacion de IRTA2 en la "ganancia de funcion" de ratones transgenicos que expresan constitutivamente IRTA2 en el GC.

Referencias para la segunda serie de experimentos

Anand, R., Riley, J. H., Butler, R., Smith, J. C., y Markham, A. F. (1990). A 3.5 genome equivalent multi

access YAC library: construction, characterisation, screening and storage. Nucleic Acids Res 18, 1951-6.

Avet-Loiseau, H., Andree-Ashley, L. E., Moore, D., 2°, Mellerin, M. P., Feusner, J., Bataille, R., and Pallavicini,

M. G. (1997). Molecular cytogenetic abnormalities in multiple myeloma and plasma cell leukemia measured

using comparative genomic hybridization. Genes Chromosomes Cancer 19, 124-33.

Bakhshi, A., Jensen, J. P., Goldman, P., Wright, J. J., McBride, O. W., Epstein, A. L., y Korsmeyer, S. J.

(1985). Cloning the chromosomal breakpoint of t(14;18) human lymphomas: clustering around Jh on

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

chromosome 14 and near a transcriptional unit on 18. Cell 41, 899-906.

Berger, R., Bernheim, A. (1985). Cytogenetics of Burkitt's lymphoma-leukaemia: una revision. IARC Sci Publ 60, 65-80.

Bergsagel, P. L., Chesi, M., Nardini, E., Brents, L. A., Kirby, S. L., y Kuehl, W. M. (1996). Promiscuous translocations into immunoglobulin heavy chain switch regions in multiple myeloma. Proc Natl Acad Sci U S A 93, 13931-6.

Bosch, F., Jares, P., Campo, E., Lopez-Guillermo, A., Piris, M. A., Villamor, N., Tassies, D., Jaffe, E. S., Montserrat, E., Rozman, C.et al. (1994). PRAD-1/cyclin D1 gene overexpression in chronic lymphoproliferative disorders: a highly specific marker of mantle cell lymphoma. Blood 84, 2726-32.

Callanan, M. B., Le Baccon, P., Mossuz, P., Duley, S., Bastard, C., Hamoudi, R., Dyer, M. J., Klobeck, G., Rimokh, R., Sotto, J. J., y Leroux, D. (2000). The IgG Fc receptor, FcgammaRIIB, is a target for deregulation by chromosomal translocation in malignant lymphoma. Proc Natl Acad Sci U S A 97, 309-14.

Cambier, J. C. (1995). Antigen and Fc receptor signaling. The awesome power of the immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM). J Immunol 155, 3281-5.

Chesi, M., Bergsagel, P. L., Brents, L. A., Smith, C. M., Gerhard, D. S., y Kuehl, W. M. (1996). Dysregulation of cyclin D1 by translocation into an IgH gamma switch region in two multiple myeloma cell lines [see comments]. Blood 88, 674-81.

Chesi, M., Bergsagel, P. L., Shonukan, O. O., Martelli, M. L., Brents, L. A., Chen, T., Schrock, E., Ried, T., and Kuehl, W. M. (1998). Frequent dysregulation of the c-maf proto-oncogene at 16q23 by translocation to an Ig locus in multiple myeloma. Blood 91,4457-63.

Chesi, M., Nardini, E., Brents, L. A., Schrock, E., Ried, T., Kuehl, W. M., y Bergsagel, P. L. (1997). Frequent translocation t(4;14)(p16.3;q32.3) in multiple myeloma is associated with increased expression and activating mutations of fibroblast growth factor receptor 3. Nat Genet 16, 260-4.

Church, D. M., Stotler, C. J., Rutter, J. L., Murrell, J. R., Trofatter, J. A., y Buckler, A. J. (1994). Isolation of genes from complex sources of mammalian genomic ADN using exon amplification. Nat Genet 6, 98-105.

Cigudosa, J. C., Parsa, N. Z., Louie, D. C., Filippa, D. A., Jhanwar, S. C., Johansson, B., Mitelman, F., y Chaganti, R. S. (1999). Cytogenetic analysis of 363 consecutively ascertained diffuse large B- cell lymphomas. Genes Chromosomes Cancer 25, 123-33.

Daeron, M. (1991). Fc receptors, or the elective affinities of adhesion molecules. Immunol Lett 27, 175-81.

Dalla-Favera, R., Bregni, M., Erikson, J., Patterson, D., Gallo, R.C., y Croce, C.M.: The human c-myc onc- gene is located on the region of chromosome 8 which is translocated in Burkitt lymphoma cells. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 79:7824-7827, 1982.

Dalla-Favera, R., Martinotti, S., Gallo, R. C., Erikson, J., y Croce, C. M. (1983). Translocation and rearrangements of the c-myc oncogene locus in human undifferentiated B-cell lymphomas. Science 219, 9637.

de Wolf-Peeters, C., Pittaluga, S., Dierlamm, J., Wlodarska, I., y Van Den Berghe, H. (1997). Marginal zone B- cell lymphomas including mucosa-associated lymphoid tissue type lymphoma (MALT), monocytoid B-cell lymphoma and splenic marginal zone cell lymphoma and their relation to the reactive marginal zone. Leuk Lymphoma 26, 467-78.

DeLisser, H. M., Newman, P. J., y Albelda, S. M. (1994). Molecular and functional aspects of PECAM-1/CD31. Immunol Today 15, 490-5.

Dickson, G., Gower, H. J., Barton, C. H., Prentice, H. M., Elsom, V. L., Moore, S. E., Cox, R. D., Quinn, C., Putt, W., y Walsh, F. S. (1987). Human muscle neural cell adhesion molecule (N-CAM): identification of a muscle-specific sequence in the extracellular domain. Cell 50, 1119-30.

Dierlamm, J., Pittaluga, S., Wlodarska, I., Stul, M., Thomas, J., Boogaerts, M., Michaux, L., Driessen, A., Mecucci, C., Cassiman, J. J., y et al. (1996). Marginal zone B-cell lymphomas of different sites share similar cytogenetic and morphologic features [see comments]. Blood 87, 299-307.

Dracopoli, C. N., Haines, J. L., Korf, B. R., Morton, C. C., Seidman, C. E., Seidman, J.G., Smith, D. R. (1997).

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Current Protocols in Human Genetics (New York: Wiley & Sons)

Dubin, G., Socolof, E., Frank, I., Friedman, H. M. (1991). Herpes simplex virus type 1 Fc receptor protects infected cells from antibody-dependent cellular cytotoxicity. Journal of Virology 65, 7046-50.

Dyomin, V. G., Palanisamy, N., Lloyd, K. O., Dyomina, K., Jhanwar, S. C., Houldsworth, J., y Chaganti, R. S. (2000). MUC1 is activated in a B-cell lymphoma by the t(1;14)(q21;q32) translocation and is rearranged and amplified in B-cell lymphoma subsets. Blood 95, 2666-71.

Dyomin, V.G., Rao, P.H., Dalla-Favera, R., Chaganti, R.S.K. (1997). BCL8, a novel gene involved in translocations affecting band 15q11-13 in diffuse large-cell lymphoma. Proc Natl Acad Sci USA 94, 5728-32.

Eton, O., Scheinberg, D. A., and Houghton, A. N. (1989). Establishment and characterization of two human myeloma cell lines secreting kappa light chains. Leukemia 3, 729-35.

Ferguson, M. A., y Williams, A. F. (1988). Cell-surface anchoring of proteins via glycosyl-phosphatidylinositol structures. Annu Rev Biochem 57, 285-320.

Frank, D., Mendelsohn, C. L., Ciccone, E., Svensson, K., Ohlsson, R., y Tycko, B. (1999). A novel pleckstrin homology-related gene family defined by Ipl/Tssc3, TDAG51, and Tih1: tissue-specific expression, chromosomal location, and parental imprinting. Mamm Genome 10, 1150-1159.

Gaidano, G., y Dalla-Favera, R. (1997). Molecular Biology of Lymphomas. In: Principles and Practice of Oncology, Fifth Ed, DeVita, VT, Hellman, S., Rosenberg Sa (eds) JB Lippincott Co (publ.), 2131-2145.

Gilles, F., Goy, A., Remache, Y., Shue, P., y Zelenetz, A. D. (2000). MUC1 dysregulation as the consequence of a tt(1;14)(q21;q32) translocation in an extranodal lymphoma. Blood 95, 2930-2936.

Gower, H. J., Barton, C. H., Elsom, V. L., Thompson, J., Moore, S. E., Dickson, G., y Walsh, F. S. (1988). Alternative splicing generates a secreted form of N-CAM in muscle and brain. Cell 55, 955-64.

Hamilton, M. S., Ball, J., Bromidge, E., Lowe, J., y Franklin, I. M. (1990). Characterization of new IgG lambda myeloma plasma cell line (EJM): a further tool in the investigation of the biology of multiple myeloma. Br J Haematol 75, 378-84.

Houldsworth, J., Mathew, S., Rao, P. H., Dyomina, K., Louie, D. C., Parsa, N., Offit, K., Chaganti, R. S. (1996). REL proto-oncogene is frequently amplified in extranodal diffuse large cell lymphoma. Blood 87, 25-9.

Iida, S., Rao, P. H., Butler, M., Corradini, P., Boccadoro, M., Klein, B., Chaganti, R. S., y Dalla-Favera, R. (1997). Deregulation of MUM1/IRF4 by chromosomal translocation in multiple myeloma. Nat Genet 17, 22630.

Jackson, N., Lowe, J., Ball, J., Bromidge, E., Ling, N. R., Larkins, S., Griffith, M. J., y Franklin, I. M. (1989).

Two new IgA1-kappa plasma cell leukaemia cell lines (JJN-1 & JJN-2) which proliferate in response to B cell stimulatory factor 2. Clin Exp Immunol 75, 93-9.

Jernberg, H., Zech, L., y Nilsson, K. (1987). Cytogenetic studies on human myeloma cell lines. Int J Cancer 40, 811-7.

Juliusson, G., Oscier, D. G., Fitchett, M., Ross, F. M., Stockdill, G., Mackie, M. J., Parker, A. C. , Castoldi, G.

L., Guneo, A., Knuutila, S., y et al. (1990). Prognostic subgroups in B-cell chronic lymphocytic leukemia defined by specific chromosomal abnormalities. N Engl J Med 323, 720-4.

Kaisho, T., Schwenk, F., y Rajewsky, K. (1997). The roles of gamma 1 heavy chain membrane expression and cytoplasmic tail in IgG1 responses. Science 276, 412-5.

Kempkes, B., Spitkovsky, D., Jansen-Durr, P., Ellwart, J. W., Kremmer, E., Delecluss, H. J., Rottenberger, C., Bornkamm, G. W., y Hammerschmidt, W. (1995). B-cell proliferation and induction of early G1-regulating proteins by Epstein-Barr virus mutants conditional for EBNA2. Embo J 14, 88-96.

Kornblau, S. M., Goodacre, A., Cabanillas, F. (1991). Chromosomal abnormalities in adult non-endemic Burkitt's lymphoma and leukemia: 22 new reports and a review of 148 cases from the literature. Hematol Oncol 9, 63-78.

Kubagawa, H., Burrows, P. D., y Cooper, M. D. (1997). A novel pair of immunoglobulin-like receptors expressed by B cells and myeloid cells [see comments]. Proc Natl Acad Sci U S A 94, 5261-6.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Kuppers, R., Klein, U., Hansmann, M. L., y Rajewsky, K. (1999). Cellular origin of human B-cell lymphomas. N Engl J Med 341, 1520-9.

Lanier, L. L. (1998). NK cell receptors. Annu Rev Immunol 16, 359-93.

Leduc, I., Drouet, M., Bodinier, M. C., Helal, A., y Cogne, M. (1997). Membrane isoforms of human immunoglobulins of the A1 and A2 isotypes: structural and functional study. Immunology 90, 330-6. MacLennan, I. C. (1994). Germinal Centers. Annu Rev Immunol 12, 117-39.

Magrath, I. T., Pizzo, P. A., Whang-Peng, J., Douglass, E. C., Alabaster, O., Gerber, P., Freeman, C. B., y Novikovs, L. (1980). Characterization of lymphoma-derived cell lines: comparison of cell lines positive and negative for Epstein-Barr virus nuclear antigen. I. Physical, cytogenetic, and growth characteristics. J Natl Cancer Inst 64, 465-76.

Monni, O., Joensuu, H., Franssila, K., Klefstrom, J., Alitalo, K., y Knuutila, S. (1997). BCL2 overexpression associated with chromosomal amplification in diffuse large B-cell lymphoma. Blood 90, 1168-74.

Neri, A., Barriga, F., Knowles, D. M., Magrath, I. T., y Dalla-Favera, R. (1988). Different regions of the immunoglobulin heavy-chain locus are involved in chromosomal translocations in distinct pathogenetic forms of Burkitt lymphoma. Proc Natl Acad Sci U S A 85, 2748-52.

Neri, A., Chang, C. C., Lombardi, L., Salina, M., Corradini, P., Maiolo, A. T., Chaganti, R. S., y Dalla-Favera,

R. (1991). B cell lymphoma-associated chromosomal translocation involves candidate oncogene lyt-10, homologous to NF-kappa B p50. Cell 67, 1075-87.

Newman, P. J., Berndt, M. C., Gorski, J., White, G. C. d., Lyman, S., Paddock, C., y Muller, W. A. (1990). PECAM-1 (CD31) cloning and relation to adhesion molecules of the immunoglobulin gene superfamily. Science 247, 1219-22.

Offit, K., Louie, D. C., Parsa, N. Z., Roy, P., Leung, D., Lo Coco, F., Zelenetz, A., Dalla-Favera, R., Chaganti, R. S. (1995). BCL6 gene rearrangement and other cytogenetic abnormalities in diffuse large cell lymphoma. Leuk Lymphoma 20, 85-9.

Pelicci, P. G., Knowles, D. M. d., Magrath, I., y Dalla-Favera, R. (1986). Chromosomal breakpoints and structural alterations of the c-myc locus differ in endemic and sporadic forms of Burkitt lymphoma. Proc Natl Acad Sci U S A 83, 2984-8.

Polito, P., Cilia, A. M., Gloghini, A., Cozzi, M., Perin, T., De Paoli, P., Gaidano, G., y Carbone, A. (1995). High frequency of EBV association with non-random abnormalities of the chromosome region 1q21-25 in AIDS- related Burkitt's lymphoma-derived cell lines. Int J Cancer 61, 370-4.

Pruneri, G., Fabris, S., Baldini, L., Carboni, N., Zagano, S., Colombi, M. A., Ciceri, G., Lombardi, L., Rocchi, M., Buffa, R., Maiolo, A. T., Neri, A. (2000). Immunohistochemical analysis of cyclin D1 shows deregulated expression in multiple myeloma with the t(11 ;14). Am J Pathol 156, 1505-13.

Qiu, W. Q., de Bruin, D., Brownstein, B. H., Pearse, R., Ravetch, J. V. (1990). Organization of the human and mouse low-affinity Fc gamma R genes: duplication and recombination. Science 248, 732-5.

Rao, P. H., Houldsworth, J., Dyomina, K., Parsa, N. Z., Cigudosa, J. C., Louie, D. C., Popplewell, L., Offit, K., Jhanwar, S. C., y Chaganti, R. S. (1998). Chromosomal and gene amplification in diffuse large B-cell lymphoma. Blood 92, 234-40.

Rao, P. H., Murty, V. V., Gaidano, G., Hauptschein, R., Dalla-Favera, R., y Chaganti, R. S. (1993).

Subregional localization of 20 single-copy loci to chromosome 6 by fluorescence in situ hybridization. Genomics 16, 426-30.

Ravetch, J. V., y Lanier, L. L. (2000). Immune inhibitory receptors [In Process Citation]. Science 290, 84-9. Reth, M. (1989). Antigen receptor tail clue [letter]. Nature 338, 383-4.

Reth, M. (1992). Antigen receptors on B lymphocytes. Annu Rev Immunol 10, 97-121.

Richelda, R., Ronchetti, D., Baldini, L., Cro, L., Viggiano, L., Marzella, R., Rocchi, M., Otsuki, T., Lombardi, L.,

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Maiolo, A. T., Neri, A. (1997). A novel chromosomal translocation t(4; 14)(p16.3; q32) in multiple myeloma involves the fibroblast growth-factor receptor 3 gene [see comments]. Blood 90, 4062-70.

Riley, J., Butler, R., Ogilvie, D., Finniear, R., Jenner, D., Powell, S., Anand, R., Smith, J. C., y Markham, A. F. (1990). A novel, rapid method for the isolation of terminal sequences from yeast artificial chromosome (YAC) clones. Nucleic Acids Res 18, 2887-90.

Ronchetti, D., Finelli, P., Richelda, R., Baldini, L., Rocchi, M., Viggiano, L., Cuneo, A., Bogni, S., Fabris, S., Lombardi, L., Maiolo, A. T., y Neri, A. (1999). Molecular analysis of 11q13 breakpoints in multiple myeloma. Blood 93, 1330-7.

Rosenberg, C. L., Wong, E., Petty, E. M., Bale, A. E., Tsujimoto, Y., Harris, N. L., y Arnold, A. (1991). PRAD1, a candidate BCL1 oncogene: mapping and expression in centrocytic lymphoma. Proc Natl Acad Sci U S A 88, 9638-42.

Sawyer, J. R., Tricot, G., Mattox, S., Jagannath, S., y Barlogie, B. (1998). Jumping translocations of chromosome 1q in multiple myeloma: evidence for a mechanism involving decondensation of pericentromeric heterochromatin. Blood 91, 1732-41.

Sawyer, J. R., Waldron, J. A., Jagannath, S., Barlogie, B. (1995). Cytogenetic findings in 200 patients with multiple myeloma. Cancer Genet Cytogenet 82, 41-9.

Shou, Y., Martelli, M. L., Gabrea, A., Qi, Y., Brents, L. A., Roschke, A., Dewald, G., Kirsch, I. R., Bergsagel, P. L., y Kuehl, W. M. (2000). Diverse karyotypic abnormalities of the c-myc locus associated with c-myc dysregulation and tumor progression in multiple myeloma. Proc Natl Acad Sci U S A 97, 228-33.

Stockinger, H., Gadd, S. J., Eher, R., Majdic, O., Schreiber, W., Kasinrerk, W., Strass, B., Schnabl, E., y Knapp, W. (1990). Molecular characterization and functional analysis of the leukocyte surface protein CD31. J Immunol 145, 3889-97.

Swerdlow, S. H., Yang, W. I., Zukerberg, L. R., Harris, N. L., Arnold, A., Williams, M. E. (1995). Expression of cyclin D1 protein in centrocytic/mantle cell lymphomas with and without rearrangement of the BCL1/cyclin D1 gene. Hum Pathol 26, 999-1004.

Tagawa, S., Doi, S., Taniwaki, M., Abe, T., Kanayama, Y., Nojima, J., Matsubara, K., y Kitani, T. (1990). Amylase-producing plasmacytoma cell lines, AD3 and FR4, with der(14)t(8;14) and dic(8)t(1;8) established from ascites. Leukemia 4, 600-5.

Taub, R., Kirsch, I., Morton, C., Lenoir, G., Swan, D., Tronick, S., Aaronson, S., Leder, P. (1982).

Translocation of the c-myc gene into the immunoglobulin heavy chain locus in human Burkitt lymphoma and murine plasmacytoma cells. Proc Natl Acad Sci U S A 79, 7837-41.

Thompson, J. D., Higgins, D. G., Gibson, T. J. CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Res 22, 4673-80.

Tusnady, G. E., Simon, I. (1998). Principles governing amino acid composition of integral membrane proteins: application to topology prediction. J Mol Bio 283, 489-506.

Unkeless, J. C., y Jin, J. (1997). Inhibitory receptors, ITIM sequences and phosphatases. Curr Opin Immunol 9, 338-43.

von Heijne, G. (1986). A new method for predicting signal sequence cleavage sites. Nucleic Acids Res 14, 4683-90.

Whang-Peng, J., Knutsen, T., Jaffe, E. S., Steinberg, S. M., Raffeld, M., Zhao, W. P., Duffey, P., Condron, K., Yano, T., Longo, D. L. (1995). Sequential analysis of 43 patients with non-Hodgkin's lymphoma: clinical correlations with cytogenetic, histologic, immunophenotyping, and molecular studies. Blood 85, 203-16.

Willis, T. G., Zalcberg, I. R., Coignet, L. J., Wlodarska, I., Stul, M., Jadayel, D. M., Bastard, C., Treleaven, J.

G., Catovsky, D., Silva, M. L., y Dyer, M. J. (1998). Molecular cloning of translocation tt(1;14)(q21;q32) defines a novel gene (BCL9) at chromosome 1q21. Blood 91, 1873-81.

Ye, B. H., Lista, F., Lo Coco, F., Knowles, D. M., Offit, K., Chaganti, R. S., y Dalla-Favera, R. (1993). Alterations of a zinc finger-encoding gene, BCL-6, in diffuse large-cell lymphoma. Science 262, 747-50.

5

10

15

20

25

Yu, L. M., Peng, C., Starnes, S. M., Liou, R. S., y Chang, T. W. (1990). Two isoforms of human membrane- bound alpha Ig resulting from alternative mARN splicing in the membrane segment. J Immunol 145, 3932-6.

Zhang, X. G., Gaillard, J. P., Robillard, N., Lu, Z. Y., Gu, Z. J., Jourdan, M., Boiron, J. M., Bataille, R., y Klein,

B. (1994). Reproducible obtaining of human myeloma cell lines as a model for tumor stem cell study in human multiple myeloma. Blood 83, 3654-63.

Tercera Serie de Experimentos

El cromosoma 1q21 con frecuencia se ve alterado por translocaciones y duplicaciones en varios tipos de neoplasias malignas de celulas B, incluyendo mieloma multiple, linfoma de Burkitt, linfomas de la zona marginal, y linfoma folicular. Para identificar los genes implicados en estas aberraciones, se clono el punto de rotura cromosomica de una t(1;14)(q21;q32) en la llnea celular de mieloma FR4. Una region de 300 kb que abarca el punto de rotura contiene al menos cinco genes adyacentes altamente relacionados que codifican moleculas receptoras de la superficie que son miembros de la superfamilia de genes de inmunoglobulina, y por lo tanto denominados IRTA (Asociados a la Translocacion Receptores de Inmunoglobulina). Las diversas moleculas IRTA tienen de tres a nueve dominios extracelulares de la superfamilia de la inmunoglobulina y estan relacionados con los receptores de Fc gamma. Tienen dominios transmembrana y citoplasmicos que contienen motivos de senalizacion de tipo ITIM y de tipo ITAM (IRTA-1, IRTA-3, IRTA-4). Experimentos de hibridacion in situ muestran que todos los genes IRTA se expresan en el linaje de celulas B con distintos patrones especlficos de la etapa de desarrollo: IRTA-1 se expresa en un patron de celulas B marginales. IRTA-2 se expresa en centrocitos y celulas B mas maduras. Como resultado de la translocacion en FR4, IRTA-1 se rompe y produce un transcrito de fusion con el locus de inmunoglobulina. El gen IRTA-2, normalmente silencioso en centroblastos, se expresa en exceso en llneas celulares de mieloma multiple y linfoma de Burkitt que portan anomallas en 1q21. Aqul, los datos sugieren que los genes de IRTA son moleculas reguladoras de las celulas B novedosas que tambien pueden tener un papel en la linfomagenesis.

Claims

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

REIVINDICACIONES

1. Una molecula de acido nucleico que codifica la protelna receptora de inmunoglobulina, Asociada a la Translocacion de Receptores de la superfamilia de Inmunoglobulinas, IRTA2, que comprende la secuencia de aminoacidos expuesta en las Figuras 18B-1 a 18B-3.
2. Una molecula de acido nucleico de la reivindicacion 1, en la que la molecula de acido nucleico es ADN.
3. La molecula de ADN de la reivindicacion 1, en la que el ADN es ADNc.
4. La molecula de ADN de la reivindicacion 1, en la que el ADN es ADN genomico.
5. La molecula de acido nucleico de la reivindicacion 1, en la que la molecula de acido nucleico es una molecula de ARN.
6. La molecula de ADN de la reivindicacion 2, en la que la molecula de ADN es de ADNc que tiene la secuencia de nucleotidos expuesta en las Figuras 18B-1 a 18B-3.
7. La molecula de acido nucleico de la reivindicacion1, unido operativamente a un promotor de la transcripcion de ADN
8. La molecla de acido nucleico de la reivindicacion 7, en la que el promotor comprende un promotor bacteriano, de levadura, de insectos, de planta o de mamlfero.
9. Un vector que comprende la molecula de acido nucleico de la reivindicacion 7.
10. El vector de la reivindicacion 9, en el que el vector es un plasmido.
11. Una celula anfitriona que comprende el vector de la reivindicacion 10.
12. La celula anfitriona de la reivindicacion 11, en la que la celula es seleccionada del grupo que consiste en una celula bacteriana, una celula de plata, una celula de insecto y una celula de mamlfero.
13. Un metodo para detectar una neoplasia maligna de celulas B o un tipo de neoplasia maligna de celulas B en una muestra de un sujeto en donde la neoplasia maligna de celulas B comprende una reordenacion cromosomica 1q21, que comprende:

a) poner en contacto una muestra de ARN obtenida del sujeto con una molecula de acido nucleico de al menos 15 nucleotidos contiguos capaz de hibridar especlficamente con una secuencia unica incluida dentro de la secuencia de un ARN aislado que codifica la protelna IRTA2 humana en condiciones que permiten la hibridacion del ARN de la etapa (a) con la molecula de acido nucleico capaz de hibridar especlficamente con una secuencia unica incluida dentro de la secuencia de un ARN aislado que codifica una protelna IRTA2 humana, en donde la molecula de acido nucleico esta marcada con un marcador detectable; y

b) detectar cualquier hibridacion en la etapa (a), en donde la deteccion de hibridacion indica la presencia de neoplasia maligna de celulas B o un tipo de neoplasia maligna de celulas B en la muestra.

en el que la protelna IRTA2 humana comprende la secuencia de aminoacidos expuesta en las Figuras 18B-1 a 18B- 3.
14. El metodo de la reivindicacion 13, en el que el marcador detectable es un isotopo radiactivo, enzima, colorante, biotina, una marca fluorescente o una marca quimioluminiscente.
15. El metodo de la reivindicacion 13, en el que la neoplasia maligna de celulas B es seleccionada del grupo que consiste en linfoma de celulas B, mieloma multiple, linfoma de Burkitts, linfoma de zona marginal, linfoma de celulas grandes difusas y celulas de linfoma folicular.
16. El metodo de la reivindicacion 15, en el que el linfoma de celulas B es un linfoma de celulas B de Tejido Linfoide Asociado a la Mucosa (MALT).
17. El metodo de la reivindicacion 15 , en el que el linfoma de celulas B es un Linfoma no Hodgkin.
18. Un oligonucleotido antisentido que tiene una secuencia capaz de hibridar especlficamente con una molecula de ARNm que codifica una protelna IRTA2 humana con el fin de evitar la expresion en exceso de la molecula de ARNm, en donde la protelna IRTA2-b comprende la secuencia de aminoacidos expuesta en las Figuras 18B-1-18B-3.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65
19. Un anticuerpo dirigido a una protelna IRTA2 humana purificada, que comprende la secuencia de aminoacidos expuesta en las Figuras 18B-1 a 18B-3.
20. El anticuerpo de la reivindicacion 19, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal o un anticuerpo policlonal.
21. El anticuerpo de la reivindicacion 20, en el que el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo monoclonal murino o un anticuerpo monoclonal humanizado.
22. El anticuerpo de la reivindicacion 19, en el que el anticuerpo es conjugado con un agente terapeutico, en donde el agente terapeutico es seleccionado del grupo que consiste en un radioisotopo, una toxina, un toxoide o un agente quimioterapeutico.
23. Una composicion farmaceutica que comprende una cantidad del anticuertpo de la reivindicacion 19 efectiva para unirse a las celulas cancerosas que expresan una protelna IRTA2 con el fin de evitar el crecimiento de las celulas cancerosas y un portador farmaceuticamente aceptable.
24. La composicion farmaceutica de la reivindicacion 23, en el que las celulas cancerosas son seleccionadas del grupo que consiste en linfoma de celulas B, linfoma de celulas del manto, mieloma multiple, linfoma de Burkitts, linfoma de zona marginal, linfoma de celulas grandes difusas y celulas de linfoma folicular.
25. La composicion farmaceutica de la reivindicacion 24, en el que las celulas de linfoma de celulas B son celulas de linfoma de celulas B de Tejido Linfoide Asociado a la Mucosa (MALT).
26. La composicion farmaceutica de la reivindicacion 24, en el que las celulas de linfoma de celulas B son celulas de Linfoma no Hodgkin.
27. Una composicion farmaceutica que comprende una cantidad del oligonucleotido de la reivindicacion 18 efectiva para evitar la expresion en exceso de una protelna IRTA2 humana y un portador farmaceuticamente aceptable.
28. Un metodo de diagnostico de una neoplasia maligna de celulas B que comprende una reordenacion cromosomica 1q21 en una muestra de un sujeto que comprende:

a) poner en contacto una muestra obtenida del sujeto con el anticuerpo de la reivindicacion 19 capaz de unirse especlficamente con una protelna IRTA2 humana sobre la superficie celular de una celula cancerosa en condiciones que permiten la union del anticuerpo con la protelna IRTA2 humana sobre la superficie celular de la celula cancerosa, en donde el anticuerpo esta marcado con un marcador detectable; y

b) detectar cualquier union en la etapa (a), en donde la deteccion de la union indica un diagnostico de neoplasia maligna de celulas B en la muestra.
29. El metodo de la reivindicacion 28, en el que la neoplasia maligna de celulas B es seleccionada del grupo que consiste en linfoma de celulas B, mieloma multiple, linfoma de Burkitts, linfoma de celulas del manto, linfoma de zona marginal, linfoma de celulas grandes difusas y celulas de linfoma folicular.
30. El metodo de la reivindicacion 29, en el que el linfoma de celulas B es un linfoma de celulas B de Tejido Linfoide Asociado a la Mucosa (MALT).
31. El metodo de la reivindicacion 29 , en el que el linfoma de celulas B es un Linfoma no Hodgkin.
32. Uso de una cantidad de anticuerpo anti-IRTA2 eficaz para unirse a las celulas cancerosas que expresan una protelna IRTA2 humana con el fin de evitar el crecimiento de las celulas cancerosas para la preparacion de una composicion farmaceutica para tratar a un sujeto que tiene un cancer de celulas B, en donde la proteina IRTA2 humana comprende la secuencia de amino acido expuesta en las Figuras 18B-1 a 18B-3.
33. El uso de la reivindicacion 32, en el que el anticuerpo anti-IRTA2 es un anticuerpo monoclonal.
34. El uso de la reivindicacion 33, en el que el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo monoclonal murino o un anticuerpo monoclonal humanizado.
35. El uso de la reivindicacion 32, en el que el anticuerpo anti-IRTA2 es un anticuerpo policlonal.
36. El uso de la reividicacion 32, en el que el cancer de celulas B es seleccionado del grupo que consiste en linfoma de celulas B, mieloma multiple, linfoma de celulas del manto, linfoma de Burkitts, linfoma de zona marginal, linfoma de celulas grandes difusas y celulas de linfoma folicular.
37. El uso de la reivindicacion 36, en el que el linfoma de celulas B es un linfoma de celulas B de Tejido Linfoide Asociado a la Mucosa (MALT).

5 38. El uso de la reivindicacion 36, en el que el linfoma de celulas B es un Linfoma no Hodgkin.
39. Uso de una cantidad del oligonucleotido de la reivindicacion 18 efectiva para evitar la expresion en exceso de la protelna IRTA2 humana, as! como para detener el crecimiento celular o inducir la muerte celular de las celulas cancerosas que expresan la protelna o protelnas IRTA2 para la preparation de una composition farmaceutica para

10 tratar a un sujeto que tiene cancer de celulas B.
40. El uso de la reivindicacion 39, en el que el cancer de celulas B es seleccionado del grupo que consiste en linfoma de celulas B, linfoma de celulas del manto, mieloma multiple, linfoma de Burkitts, linfoma de zona marginal, linfoma de celulas grandes difusas y celulas de linfoma folicular.

15
41. El uso de la reivindicacion 40, en el que el linfoma de celulas B es un linfoma de celulas B de Tejido Linfoide Asociado a la Mucosa (MALT).
42. El metodo de la reivindicacion 40 , en el que el linfoma de celulas B es un Linfoma no Hodgkin.

20