KR101921555B1

KR101921555B1 - 골 보충재 함유 부직포

Info

Publication number: KR101921555B1
Application number: KR1020137025388A
Authority: KR
Inventors: 유스케 오키무라; 가즈요시 기타; 나오유키 하나키; 야스노리 네모토
Original assignee: 선스타 가부시키가이샤
Priority date: 2011-02-28
Filing date: 2012-02-28
Publication date: 2018-11-23
Also published as: WO2012118090A1; ES2691749T3; TWI539977B; US9737634B2; CN103402559A; TW201240682A; CA2828501C; BR112013022042A2; JPWO2012118090A1; JP5925185B2; KR20140009414A; MX2013009891A; CN108452382A; EP2682135B1; BR112013022042B1; US20130338790A1; MX348237B; EP2682135A1; CN108452382B; EP2682135A4

Abstract

본 발명은 골(특히, 치조골)의 재생에 적합한 골 재생용 재료를 제공하는 것을 과제로 한다. 본 발명에 의해 골 보충재를 함유하는 부직포로서, 골 보충재는 부직포를 구성하는 섬유 간에 포함되고, 부직포를 구성하는 섬유는 생체 적합성 섬유인 부직포가 제공된다. 해당 부직포는 골 재생용 재료(특히, 치과용의 골 재생용 재료)로서 적합하게 이용할 수 있다.

Description

골 보충재 함유 부직포{NON-WOVEN FABRIC CONTAINING BONE PROSTHETIC MATERIAL}

본 발명은 골 보충재를 함유하는 부직포에 관한 것이다.

최근, 노화나 치주병 등에 의해 치아를 결손한 경우에 인공 치근을 치조골에 매립하고, 그 위에 인공 치관 및 상부 구조를 장착하는 치료(이른바, “임플란트 치료”)가 널리 실시되게 되고 있다.

치아가 결손되면(즉, 이가 빠져 버리면), 그때까지 치아를 지지하고 있던 치조골은 급속히 흡수되어 감소한다. 따라서, 임플란트 치료에서는 인공 치근을 치조골에 매립하는 데는 치조골의 두께가 부족해 있다는 상황이 자주 일어난다. 치조골의 두께가 부족하면, 인공 치근을 매립해도 안정되지 않을 염려가 크다. 이와 같은 경우에는 골을 이식하거나, 또는 골을 재생시키는 등의 처치가 취해진다.

예를 들면, 치조골 재생을 위해 빈번히 이용되는 방법의 하나로서, GBR법(골 재생 유도법: guided bone regeneration)을 들 수 있다. 해당 방법은 구체적으로는, 치조골이 부족해 있는 부분(환부)에 분쇄한 자가골 또는 골 보충재를 놓고, 그 위에 멤브레인(차폐막, GBR막이라고 한다)을 놓아서(즉, 골 보충재를 보충한 환부를 포매(embedding)하여), 치육 조직의 혼입을 막으면서 치조골의 재생을 촉진시키는 방법이다. 그러나 현재 이용되고 있는 골 보충재는 세포의 부착성 및 증식성은 충분하지 않아서, 치조골 재생에 장시간을 요하고 있었다. 또, 치조골로의 접착성이나 환부로의 보존성도 양호하다고는 할 수 없어서, GBR막으로 포매했다고 해도 환부로부터 새어나오는 일도 있었다.

또, 골 시멘트가 이용되는 경우도 있는데, 골 시멘트에는 세포가 침윤할 수 없다는 결점이 있다.

상기와 같이, 현재 이용되는 골 재생 재료는 세포 부착성 및 증식성이 충분하지 않다는 문제가 있다.

이와 같은 상황을 개선하기 위해, 골(특히, 치조골)의 재생에 적합한 골 재생용 재료의 연구 개발이 계속되고 있다(예를 들면, 특허 문헌 1, 특허 문헌 2).

특허 문헌 1: WO2007／132186 특허 문헌 2: 일본국 특개2007―325543호 공보

본 발명은 골(특히, 치조골)의 재생에 적합한 골 재생용 재료를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명자들은 놀랍게도 골 보충재를 함유하는 부직포로서, 골 보충재는 부직포를 구성하는 섬유 간에 포함되고, 부직포를 구성하는 섬유는 생체 적합성 섬유인 부직포가 매우 세포(특히, 골아 세포)의 증식 효율이 높은(세포 증식능이 높은) 골 재생용 재료로 되는 것을 발견하고, 더욱 개량을 거듭하여 본 발명을 완성시키기에 이르렀다.

즉, 본 발명은 예를 들면, 이하의 항에 기재된 주제를 포함한다.

항 1.

골 보충재를 함유하는 부직포로서,

골 보충재는 부직포를 구성하는 섬유 간에 포함되고,

부직포를 구성하는 섬유는 생체 적합성 섬유인 부직포.

항 2.

생체 적합성 섬유가 생체 적합성 폴리머를 포함하여 이루어지는 섬유인 항 1에 기재된 부직포.

항 3.

생체 적합성 폴리머가 폴리유산, 폴리글리콜산, 폴리유산―폴리글리콜산 공중합체, 폴리카프로락톤, 키틴, 콜라겐, 폴리리신, 폴리아르기닌, 히알루론산, 세리신, 셀룰로오스, 덱스트란 및 풀루란으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종인 항 2에 기재된 부직포.

항 4.

골 보충재가 β-TCP(β―인산3칼슘), α-TCP(α―인산3칼슘), HA(하이드록시아파타이트), DCPD(제2인산칼슘), OCP(옥타칼슘포스페이트), 4CP(테트라칼슘포스페이트), 알루미나, 지르코니아, 칼슘알루미네이트(CaO-Al₂O₃), 알루미노실리케이트(Na₂O-Al₂O₃-SiO₂), 생체 활성화 유리, 석영 및 탄산칼슘으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종인 항 1∼3 중 어느 한 항에 기재된 부직포.

항 5.

골 보충재의 입경이 50∼5000㎛ 정도인 항 1∼4 중 어느 한 항에 기재된 부직포.

항 6.

부직포의 공극률이 78.5∼97％인 청구항 1∼5 중 어느 한 항에 기재된 부직포.

항 7.

부직포의 섬유 부분의 공극률이 80∼99.99％인 항 1∼6 중 어느 한 항에 기재된 부직포.

항 8.

부직포의 부피 밀도(g／㎤)가 0.1∼0.6인 항 1∼7 중 어느 한 항에 기재된 부직포.

항 9.

항 1∼8 중 어느 한 항에 기재된 부직포를 포함하는 골 재생용 재료.

항 10.

항 1∼8 중 어느 한 항에 기재된 부직포를 포함하는 골아 세포 배양 발판재.

항 A―1.

항 1∼8 중 어느 한 항에 기재된 부직포를, 골을 재생시켜야 할 부위에 적용하는 공정을 포함하는 골을 재생시키는 방법.

항 A―2.

골이 치조골인 항 A―1에 기재된 방법.

항 B―1.

골 재생에 있어서의 사용을 위한 항 1∼8 중 어느 한 항에 기재된 부직포.

항 B―2.

골이 치조골인 항 B―1에 기재된 부직포.

항 C―1.

골 재생용 제제의 제조에 있어서의 항 1∼8 중 어느 한 항에 기재된 부직포의 사용.

항 C―2.

골 재생용 제제가 치조골 재생용 제제인 항 C―1에 기재된 사용.

항 C―3.

in vitro에서의 세포 발판재(scaffold)로서의 항 1∼8 중 어느 한 항에 기재된 부직포의 사용.

본 발명의 골 보충재를 함유하는 부직포를 세포 배양의 발판으로서 이용한 경우, 매우 세포(특히, 골아 세포)의 증식 효율이 높아진다(즉, 세포의 증식능을 높일 수 있다). 또, 해당 부직포는 골 보충재를 포함하기 때문에 특히, 골아 세포의 배양의 발판으로서 이용한 경우, 골 재생 효율도 높일 수 있다. 이 때문에, 해당 부직포는 골 재생용 재료로서 적합하게 이용할 수 있다. 구체적으로는, 외적 요인(예를 들면, 사고)에 의해 골이 손상된 경우나 내적 요인(예를 들면, 골다공증, 치주병)에 의해 골이 적거나 또는 없어진 경우에, 본 발명의 부직포를 적용하는 것으로(구체적으로는, 환부에 메우거나 부착하는 것으로), 조기의 골의 재생을 달성할 수 있다.

도 1은 일렉트로스피닝법에 의한 부직포의 제조 방법의 간단한 개요를 나타낸다.
도 2는 본 발명의 부직포를 제조할 때에 이용하는 어스 전극의 일례를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 부직포(및 일렉트로스피닝법에 의해 제조한 통상의 부직포)의 단면도를 나타낸다.
도 4는 본 발명의 부직포의 단면도(주사형 전자 현미경에 의한)를 나타낸다.
도 5는 본 발명의 부직포의 예인 샘플 1∼3의 세포 증식능을 검토한 결과를 나타낸다.
도 6a는 블록상 골 보충재(오스페리온(OSferion)의 블록)를 쥐에 이식했을 때의 블록상 골 보충재로의 결합 조직 침윤의 정도를 나타내는 조직 절편 관찰 화상이다. 외측의 파선이 이식한 골 보충재의 윤곽을 나타내고, 내측의 점선이 해당 골 보충재에 침윤한 조직의 선단을 나타낸다.
도 6b는 본 발명의 부직포를 쥐에 이식했을 때의 부직포로의 결합 조직 침윤의 정도를 나타내는 조직 절편 관찰 화상이다. 외측의 파선이 이식한 부직포의 윤곽을 나타내고, 내측의 점선이 해당 부직포에 침윤한 조직의 선단을 나타낸다.
도 7은 각 부직포를 발판으로 하여 세포를 배양한 후, HE염색하여 얻은 화상 및 해당 화상으로부터 측정한 세포 침윤 거리를 나타낸다.
도 8은 각 부직포의 공극도 측정 결과 및 각 부직포를 발판으로 하여 세포를 배양해서 HE염색하여 얻은 화상을 나타낸다.
도 9는 부직포의 섬유끼리의 사이의 거리(섬유 간 거리)의 측정 방법의 개요를 나타낸다.
도 10은 각 부직포의 공극도 측정 결과 및 각 부직포를 발판으로 하여 세포를 배양해서 HE염색하여 얻은 화상 및 해당 화상으로부터 측정한 세포 침윤 거리를 나타낸다.

이하, 본 발명에 대하여 더욱 상세히 설명한다. 또한, “질량”은 “중량”으로 읽어도 좋다.

본 발명은 골 보충재를 함유하는 부직포에 관련된 것이다. 해당 부직포에 있어서, 골 보충재는 부직포를 구성하는 섬유 간에 포함된다. 또, 부직포를 구성하는 섬유는 생체 적합성 섬유이다.

부직포에 포함되는 골 보충재로서는, 공지의 것을 이용할 수 있다. 공지의 골 보충재로서는 예를 들면, β-TCP(β―인산3칼슘), α-TCP(α―인산3칼슘), HA(하이드록시아파타이트), DCPD(제2인산칼슘), OCP(옥타칼슘포스페이트), 4CP(테트라칼슘포스페이트), 알루미나, 지르코니아, 칼슘알루미네이트(CaO-Al₂O₃), 알루미노실리케이트(Na₂O-Al₂O₃-SiO₂), 생체 활성화 유리, 석영, 탄산칼슘 등이 예시된다. 구체적으로는, 이들의 성분을 포함하여 이루어지는 단편(바람직하게는 이들의 성분으로 이루어지는 단편)을 이용할 수 있다. 골 보충재는 1종 단독으로 또는 2종 이상을 조합하여 이용할 수 있다. 2종 이상을 조합하여 이용하는 경우, 골 보충재 1단편 중에 2종 이상이 조합되어 포함되는 것을 이용해도 좋고, 1성분만으로 이루어지는 단편을 2종 이상 조합하여 이용해도 좋다.

또, 골 보충재 1단편의 크기는 부직포 중에 매몰하여 함유되는 정도의 크기 이하이면 좋다. 또, 형상도 특별히 제한되지 않고, 예를 들면, 입자상, 블록상, 원통상 등일 수 있다.

골 보충재 1단편의 입경이 부직포의 두께보다 짧은 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 50∼5000㎛ 정도, 더욱 바람직하게는 75∼5000㎛ 정도, 더한층 바람직하게는 150∼3000㎛ 정도, 특히 바람직하게는 500∼1500㎛ 정도이다. 해당 입경은 건식 체법으로 구한 값이다. 구체적으로는, JIS Z8801에서 규정되는 체를 세트한 로탭 진탕기를 이용하여 얻어지는 값이다. 건식 체법에 의해 해당 입경의 골 보충재를 얻을 수 있다. 또, 건식 체법에 의해 입경 미지의 골 보충재의 입경의 정도를 측정할 수 있다. 또한, 여기에서의 “입경”이란, 골 보충재의 형상을 입상으로 한정하는 것을 의도하는 것은 아니고, 상기 방법으로 구해지는 값을 나타내는 데 불과하다. 입상은 아닌 형상(예를 들면, 블록상이나 원통상)의 골 보충재이어도 여기에서 말하는 “입경”의 값을 구할 수는 있다.

본 발명의 부직포에는 골 보충재로서 시판되고 있는 것을 구입하여 이용해도 좋다. 예를 들면, 오스페리온(올림퍼스 테루모 바이오마테리얼 주식회사), 본세람(올림퍼스 테루모 바이오마테리얼 주식회사), 네오본((주)엠ㆍ엠티), 오스테오그래프트―S(니혼 메디컬 마테리얼 주식회사), 아파세람(펜탁스 주식회사) 등이 예시된다.

본 발명의 부직포에서는 골 보충재는 부직포를 구성하는 복수(다수)의 섬유와 섬유의 사이에 존재한다. 즉, 골 보충재는 부직포를 구성하는 섬유 간에 포함된다. 1개의 섬유 내에 포함되는 것은 아니다. 부직포를 구성하는 섬유가 골 보충재를 얽도록 존재한다고도 할 수 있다. 본 발명의 부직포를 구성하는 섬유는 생체 적합성 섬유이다. 생체 적합성 섬유란, 생체 적합성 폴리머를 포함하여 이루어지는 섬유를 말한다. 생체 내에서 생분해성을 갖는 것이 바람직하다. 섬유 중의 생체 적합성 폴리머의 함유율은 통상 50질량％보다 크고, 75질량％ 이상이 바람직하고, 80질량％ 이상이 보다 바람직하고, 85질량％ 이상이 더욱 바람직하고, 90질량％ 이상이 더한층 바람직하고, 95질량％ 이상이 특히 바람직하고, 실질적으로 100％인 것이(즉, 생체 적합성 폴리머만으로 이루어지는 생체 적합성 섬유가) 가장 바람직하다.

생체 적합성 폴리머란, 생체에 접착시킨 경우 또는 매립한 경우에 이물 반응이 없거나 또는 작은(장기간에 걸쳐서 생체에 악영향도, 강한 자극도 주지 않고, 본래의 기능을 완수하면서 생체와 평화 공존할 수 있는) 폴리머를 말한다. 생체 흡수성 폴리머나 생체 분해성 폴리머를 예시할 수 있다.

보다 구체적으로는, 생체 적합성 폴리머로서는, 폴리유산, 폴리글리콜산, 폴리유산―폴리글리콜산 공중합체, 폴리카프로락톤, 폴리부틸렌석시네이트, 폴리에틸렌석시네이트, 폴리스티렌, 폴리카보네이트, 폴리헥사메틸렌카보네이트, 폴리아릴레이트, 폴리비닐이소시아네이트, 폴리부틸이소시아네이트, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리에틸메타크릴레이트, 폴리노르말프로필메타크릴레이트, 폴리노르말부틸메타크릴레이트, 폴리메틸아크릴레이트, 폴리에틸아크릴레이트, 폴리부틸아크릴레이트, 폴리아크릴로니트릴, 폴리비닐아세테이트, 폴리비닐메틸에테르, 폴리비닐에틸에테르, 폴리비닐노르말프로필에테르, 폴리비닐이소프로필에테르, 폴리비닐노르말부틸에테르, 폴리비닐이소부틸에테르, 폴리비닐텨셔리부틸에테르, 폴리비닐클로라이드, 폴리비닐리덴클로라이드, 폴리(N―비닐피롤리돈), 폴리(N―비닐카르바졸), 폴리(4―비닐피리딘), 폴리비닐메틸케톤, 폴리메틸이소프로페닐케톤, 폴리에틸렌옥사이드, 폴리프로필렌옥사이드, 폴리시클로펜텐옥사이드, 폴리스티렌설폰, 테플론(등록 상표)(폴리테트라플루오로에틸렌), 폴리시아노아크릴레이트, 폴리에테르에테르케톤, 폴리우레탄, 폴리이미드, 폴리염화비닐, 폴리에틸렌(초고분자량 폴리에틸렌을 포함한다), 폴리프로필렌, 폴리에틸렌테레프탈레이트, 폴리불화비닐리덴(폴리비닐리덴디플루오라이드), 폴리설폰, 폴리에테르설폰 및 이들의 공중합체 등의 합성 폴리머, 재생 셀룰로오스, 셀룰로오스디아세테이트, 셀룰로오스트리아세테이트, 메틸셀룰로오스, 프로필셀룰로오스, 벤질셀룰로오스, 피브로인, 천연 고무 등의 생체 고분자와 그 유도체가 예시된다. 또, 키틴, 젤라틴, 콜라겐, 폴라아미노산(폴리리신, 폴리아르기닌), 히알루론산, 세리신, 덱스트란, 풀루란 등도 예시된다.

이들 중, 폴리유산, 폴리글리콜산, 폴리유산―폴리글리콜산 공중합체, 폴리히드록시부티르산, 폴리카프로락톤, 폴리에틸렌아디페이트, 폴리부틸렌석시네이트, 폴리에틸렌석시네이트 및 폴리시아노아크릴레이트 및 이들의 공중합체 등의 지방족 폴리에스테르, 폴리부틸렌카보네이트, 폴리에틸렌카보네이트 등의 지방족 폴리카보네이트를 바람직한 예로서 들 수 있고, 더욱 바람직하게는 폴리유산, 폴리글리콜산, 폴리유산―폴리글리콜산 공중합체, 폴리카프로락톤을 들 수 있다. 그 중에서도 폴리유산이 특히 바람직하다. 생체 적합성 폴리머는 1종 단독으로 또는 2종 이상을 조합하여 이용할 수 있다.

또한, 본 발명의 효과를 손상하지 않는 범위에서 다른 폴리머나 화합물을 병용(예를 들면, 폴리머 공중합체 폴리머 블랜드, 인지질, 그 외 화합물 등 및 이들의 혼합물)해도 좋다.

부직포를 구성하는 섬유의 평균 섬유 지름은 바람직하게는 0.05∼20㎛ 정도, 보다 바람직하게는 0.1∼5㎛ 정도, 더욱 바람직하게는 0.1∼3㎛ 정도이다. 해당 평균 섬유 지름이면, 특히 골아 세포가 접착하기 쉬워서, 골 재생 효율이 향상되기 때문에 유리하다. 또한, 여기에서의 섬유 지름은 섬유의 직경을 말한다. 또, 해당 평균 섬유 지름은 해당 부직포의 전자 현미경 촬영 영상으로부터 각 섬유의 직경을 측정하고, 무작위로 선택한 50개의 섬유 지름으로부터 산출한 평균값을 말한다.

부직포의 두께는 부직포가 적용되는 환부(골 결손 부위)의 크기에 맞추어서 적절히 설정할 수 있다. 바람직하게는 0.1∼5㎝ 정도, 보다 바람직하게는 0.1∼1㎝ 정도, 더욱 바람직하게는 0.1∼0.5㎝ 정도이다. 또한, 여기에서의 부직포의 “두께”는 해당 부직포의 두께 방향으로 압력을 가하지 않고 측정한 두께를 말한다. 측정에는 두께계(Digital thickness gauge, 오자키 제작소, DG―205M) 등을 이용할 수 있다.

본 발명의 부직포의 부피 밀도((g／㎤), 즉, {부직포 중량(g)／부직포 체적(㎤)})는 0.1∼0.6 정도가 바람직하고, 0.1∼0.5 정도가 보다 바람직하고, 0.1∼0.4 정도가 더욱 바람직하고, 0.1∼0.3 정도가 더한층 바람직하고, 0.15∼0.25 정도가 또한 바람직하고, 0.15∼0.2 정도가 특히 바람직하다. 함유되는 골 보충재가 β-TCP 또는 α-TCP인 경우, 특히, 부피 밀도가 해당 범위인 것이 바람직하다. 또한, 여기에서의 부직포 체적은 부직포를 직사각형으로 절단(약 4㎠ 정도)하고, 세로, 가로 및 두께의 길이를 상기의 두께계로 측정하여, 세로, 가로, 두께의 길이를 곱해서 구한 체적(㎤)이다.

본 발명의 부직포의 공극률은 78.5∼97％ 정도가 바람직하고, 80∼97％ 정도, 85∼97％ 정도, 90∼97％ 정도, 90∼95％ 정도, 91∼95％ 정도, 91.5∼95％ 정도, 92∼95％ 정도가 이 순서로 바람직하다. 또한, 공극률(％)은 부직포를 구성하는 섬유 및 골 보충재 그 자체의 밀도(진밀도)로부터 구할 수 있다. 즉, 본 발명의 부직포 1㎤당에 포함되는 섬유의 중량 및 골 보충재의 중량을 각각의 진밀도로 나눔으로써 해당 섬유 및 해당 골 보충재의 각각이 차지하는 체적을 구할 수 있기 때문에 이들의 체적(㎤)의 합계값을 1(㎤)에서 빼고, 이것에 100을 곱하는 것으로 해당 부직포의 공극률(％)을 구할 수 있다. 식으로 나타내면 다음과 같다.

[수학식 1]

부직포의 공극률(％)＝[1－{(섬유 중량／섬유 진밀도)＋(골 보충재 중량／골 보충재 진밀도)}]]×100

또, 상기 섬유가 차지하는 체적(㎤)을, 상기 골 보충재가 차지하는 체적(㎤)을 1(㎤)에서 뺀 값으로 나누고, 이것에 100을 곱함으로써 부직포의 섬유 부분의 공극률(％)을 구할 수도 있다. 식으로 나타내면, 다음과 같다.

[수학식 2]

부직포의 공극률(％)＝[1－{(섬유 중량／섬유 진밀도)／{1－(골 보충재 중량／골 보충재 진밀도)}]]×100

부직포의 섬유 부분의 공극률은 85∼99.99％ 정도가 바람직하고, 90∼99.99％ 정도가 보다 바람직하고, 97.5∼99.99％ 정도가 더욱 바람직하고, 98∼99.8％ 정도가 더한층 바람직하다.

또한, 본 명세서에 있어서, 진밀도는 정용적 팽창법으로 구한 값이다. 진밀도의 측정에는 예를 들면, 건습 자동 밀도계(아큐픽1330; 시마즈 제작소)를 이용할 수 있다.

부직포의 공극률, 부직포의 섬유 부분의 공극률이 상기의 범위이면, 특히, 세포가 침윤하기 쉽고, 또, 체액ㆍ혈액 등의 통액성도 높으며, 섬유 재생 시에 있어서 신생 혈관이 침입하기 쉬운 점에서 유리하다. 또한, 본 발명의 부직포의 섬유 부분의 공극률은 통상의 부직포와 비교하여 높은 공극률로 되어 있다. 한정적인 해석을 원하는 셈은 아니지만, 골 보충재를 섬유 간에 포함함으로써 높은 공극률이 발생하는 것이라고 생각된다. 이 높은 섬유 부분의 공극률에도 불구하고, 본 발명의 부직포는 압력을 가해도 해당 압력을 없애면(예를 들면, 손으로 눌러도 그 후 손을 떼면) 두께가 어느 정도 회복된다. 이것도 골 보충재를 섬유 간에 포함하기 때문에 이루어지는 효과라고 생각된다.

본 발명의 부직포의 포어 크기는 0.5∼500㎛ 정도가 바람직하고, 1∼100㎛ 정도가 보다 바람직하고, 2∼50㎛ 정도가 더욱 바람직하고, 3∼30㎛ 정도가 더한층 바람직하고, 6∼20㎛ 정도가 특히 바람직하다.

또한, 여기에서의 부직포의 포어 크기란, 측정용 샘플로서 본 발명의 부직포의 표층을 벗겨낸 것을 이용하고, 퍼플루오로폴리에스테르를 이용한 하프 드라이법(ASTM E1294―89)에 의해 구해지는 최빈값(계급폭 1㎛)을 말한다. 해당 포어 크기 측정에는 capillary flow porometer(CFP-1200-AEL, Porous Materials Inc)를 이용할 수 있다.

또, 본 발명의 부직포에서는 부분에 따라서는 섬유가 조악하거나 조밀하다(즉, 섬유 분포의 소밀(소밀(疏密) 구조가 존재한다). 섬유가 조밀하게 존재하는 부분의 섬유 간 거리는 5∼40㎛ 정도가 바람직하고, 10∼30㎛ 정도가 보다 바람직하고, 15∼25㎛ 정도가 더욱 바람직하다. 또, 섬유가 조악하게 존재하는 부분의 섬유 간 거리는 약 50∼100㎛ 정도이다. 여기에서의 부직포의 섬유 간 거리는 부직포의 동결 블록 절편을 현미경으로 관찰하여 얻은 화상으로부터 섬유를 검출하고, 검출한 섬유의 데이터로부터 중심 간 거리법에 의해 구해지는 값이다.

본 발명의 부직포의 골 보충재 비율은 10∼98％ 정도가 바람직하고, 50∼98％ 정도가 보다 바람직하고, 80∼98％ 정도가 더욱 바람직하다.

또한, 여기에서의 골 보충재 비율이란,

{부직포에 포함되는 골 보충재(g)／부직포(g)}×100(％)

로 구해지는 값을 말한다. 부직포에 포함되는 골 보충재(g)는 본 발명의 부직포 중의 폴리유산을 디클로로메탄에 의해 용해한 후(즉, 부직포의 섬유 부분을 용해한 후)의 잔사의 중량을 측정하여 구한 값이다.

본 발명의 부직포는 일렉트로스피닝법에 의해 제조할 수 있다. 일렉트로스피닝법은 부직포를 제조하는 수법의 하나로서 주지의 방법이다. 구체적으로는, 폴리머(및 필요에 따라서 분산 보조제)를 휘발성 용매(예를 들면, 클로로포름, 디클로로메탄, 헥사플루오로이소프로필알코올, 또는 이들의 혼합 용액 등)에 용해한 용액을 전극 간에서 형성된 정전장 중에 토출하고, 용액을 전극(어스 전극)을 향하여 예사(forming threads)함으로써 섬유상 물질을 제조하는 방법이다. 일렉트로스피닝법의 극히 간단한 개요를 도 1에 나타낸다. 또한, 도 1은 예시이다. 공지의 일렉트로스피닝법이고, 본 발명의 부직포를 제조할 수 있는 방법이면, 본 발명의 부직포의 제조에 이용할 수 있다. 도 1을 간단히 설명한다. 고전압을 시린지(선단에 노즐 장착) 중의 폴리머 용해 용액에 부가하면, 폴리머 용액의 드롭이 날카로운 원추로 된다. 그리고 더욱 전압이 늘면, 용액은 어스 전극(예를 들면, 동, 알루미늄 등)을 향하여 분출되게(분무되게) 되고, 어스 전극 상에서 얇은 섬유의 막(즉, 부직포)을 형성한다. 즉, 도 1에서는 어스 전극이 콜렉터를 겸한다.

본 발명에 있어서, 일렉트로스피닝법에 사용하는 생체 적합성 폴리머 용해 용액 중의 생체 적합성 폴리머의 농도는 적절히 설정할 수 있지만, 통상, 1∼30질량％ 정도, 바람직하게는 2∼25질량％ 정도, 보다 바람직하게는 3∼20질량％ 정도이다.

또, 전극 간의 거리(도 1에서는 시린지와 어스 전극 간의 거리)는 대전량, 노즐 치수, 방사액 유량, 방사액 농도 등에 의존하고 있으며, 적절히 설정할 수 있다. 예를 들면, 인가 전압이 10kV 정도인 때에는 5∼50㎝ 정도가 바람직하고, 10∼30㎝ 정도가 보다 바람직하다. 또, 인가되는 정전기 전위는 통상, 3∼100kV 정도, 바람직하게는 5∼50kV 정도, 더욱 바람직하게는 5∼30kV 정도이다.

본 발명의 부직포 제조 공정에서는 일렉트로스피닝법에 의해 부직포를 제조하는 도중에 골 보충재가 공급된다. 구체적으로는 예를 들면, 일렉트로스피닝법에 의해 생체 적합성 폴리머 용해 용액을 소량 분무하여 부직포를 제조하고, 적당량의 골 보충재를 해당 부직포 상으로 분산시킨 후, 더욱 생체 적합성 폴리머 용해 용액을 분무한다는 공정에 의해 본 발명의 부직포를 제조할 수 있다. 바람직하게는, 해당 공정을 수회∼수십회(구체적으로는 2∼50회 정도, 바람직하게는 5∼10회 정도) 반복하여 본 발명의 부직포는 제조된다. 바꾸어 말하면, 본 발명의 부직포의 제조 방법은 해당 공정을 포함하고, 바람직하게는 수회∼수십회의 해당 공정의 반복을 포함한다. 바람직한 제조 방법의 일양태로서, 생체 적합성 폴리머 용해 용액을 0.5∼1.5μL／sec의 비율로 분무하고, 15분 간격으로 0.1∼0.2g의 골 보충재를 첨가한다는 방법을 예시할 수 있다. 해당 예시 방법에 있어서는, 골 보충재는 합계 첨가량이 1∼2g 정도가 되기까지 첨가된다.

또한, 일렉트로스피닝법에서는 제조되는 부직포의 두께가 두꺼워짐에 따라 해당 부직포가 존재하기 때문에 어스 전극이 마이너스로 대전하기 어려워지고, 따라서, 생체 적합성 폴리머 용해 용액이 분무되기 어려워진다. 이 때문에, 종래 일렉트로스피닝법에 의해 비교적 두꺼운 부직포를 얻는 것은 곤란했다. 본 발명에서는 비교적 두꺼운 부직포를 제조하기 위해, 어스 전극에 다음과 같은 연구를 실시하는 것이 바람직하다. 즉, 어스 전극으로서 금속판(예를 들면, 알루미늄이나 동의 판)을 이용할 뿐만 아니라, 해당 판상에 돌기(바람직하게는 원주상 또는 원추상)가 구비되어 있는 것이 바람직하다. 또한, 해당 돌기는 상하로 가동하는 것이 바람직하다. 이와 같은 돌기를 구비한 어스 전극이면, 부직포의 두께가 두꺼워져서, 어스 전극이 마이너스로 대전하기 어려워진 경우에, 해당 돌기를 상승시킴으로써 어스 전극을 다시 마이너스로 대전시키는 것이 가능하게 된다. 해당 돌기는 금속판 상에 예를 들면, 1∼3㎝ 정도의 간격으로 격자상으로 구비되는 것이 바람직하다. 또, 해당 돌기의 단면적은 0.001∼0.5㎠ 정도가 바람직하고, 0.01∼0.1㎠ 정도가 보다 바람직하다. 본 발명은 이와 같은 구성을 구비한 일렉트로스피닝용 어스 전극도 포함한다. 또한, 후술하는 바와 같이, 도 2는 이와 같은 구성을 구비한 일렉트로스피닝용 어스 전극의 일양태를 나타낸다.

본 발명의 부직포는 세포 배양의 발판으로서 이용한 경우, 매우 세포(특히, 골아 세포)의 증식 효율을 높이기(세포 증식능을 높이기) 때문에 세포 배양 발판재로서, 나아가서는 골 재생용 재료로서 적합하게 이용할 수 있다. 구체적으로는, 외적 요인(예를 들면, 사고)에 의해 골이 손상된 경우나 내적 요인(예를 들면, 골다공증, 치주병)에 의해 골이 적거나 또는 없어진 경우에, 본 발명의 부직포를 적용하는 것으로(구체적으로는, 환부에 메우거나 부착하는 것으로), 조기의 골의 재생을 달성할 수 있다. 특히, 본 발명의 부직포는 종래의 부직포에서는 불가능했던 정도의 두께를 구비할 수 있기 때문에 종래의 골 보충재와 마찬가지로, 골 재생을해야 할 부위(환부)에 매립함으로써 골 재생을 촉진시킨다는 이용 방식이 가능하다.

특히, 본 발명의 부직포에서는 부직포의 섬유에 골 보충재를 얽어서 지지시킨 것으로 골 보충재의 보존성이 높고, 또, 적당한 인성(靭性)을 갖기 때문에 환부가 복잡한 형상이어도 용이하게 적용할(매립할) 수 있다. 또, 세포 통과성 및 통액성에도 뛰어나다.

제한되지는 않지만, 본 발명의 부직포는 특히, 임플란트 치료에 있어서의 치조골의 재생을 위해 바람직하게 이용할 수 있다.

종래, GBR법(Guided Bone Regeneration: 골 재생 유도 요법)에서는 치조골을 재생시키는 영역에 골 보충재를 충전한 후, 골 조직 재생을 방해하는 치육 조직이나 상피 조직이 해당 영역 내에 침윤하는 것을 억제하기 위해, 차폐막을 적용하지 않으면 안되었다(즉, 골 보충재와 차폐막을 “순차” 적용하여 병용 설치하지 않으면 안되었다). 이 때문에, 해당 영역에 우선 골 보충재를 충전하고, 다음으로 차폐막을 적용하게 되기 때문에 시술자의 수고가 많고, 또, 시술자에게는 고도한 기술이 요구되고 있었다. 한편, 본 발명의 부직포를 골 보충재 대신에 이용하는 경우에는 차폐막과 함께 “한 번에” 적용할 수 있기 때문에 시술자의 수고가 경감되고, 또, 종래에 비하여 기술적으로도 간단히 적용할 수 있다. 특히, 종래 골 보충재가 적용 부위로부터 새어나오는 경우도 종종 있었지만, 본 발명의 부직포를 골 보충재 대신에 이용하면, 이와 같은 문제는 일어나지 않는다. 또, 본 발명의 부직포는 유연성에 뛰어나기 때문에 환부의 형상에 맞추어서 변형시키고나서 적용할 수도 있고, 또는, 환부의 형상에 맞추어서 절단하고나서 적용할 수도 있다.

또한, 본 발명의 부직포에 있어서, 내부에 포함되는 골 보충재로부터 외측까지의 길이를 길게 하는 것으로(즉, 본 발명의 부직포의 치육 조직이나 상피 조직에 접하는 면의 섬유층을 두껍게 하는 것으로), 치육 조직이나 상피 조직의 재생 영역으로의 침윤을 억제할(즉, 차폐막의 기능을 부가할) 수도 있다. 이 경우, 본 발명의 부직포만을 차폐막 및 골 보충재 대신으로서 이용할 수 있다.

또, 상기와 같이, 본 발명의 부직포는 일렉트로스피닝법에 의해 “생체 적합성 폴리머―용해 용액을 소량 분무하여 부직포를 제조하고, 적당량의 골 보충재를 해당 부직포 상으로 분산시킨 후, 다시 생체 적합 폴리머 용해 용액을 분무한다”는 공정을 반복함으로써 제조할 수 있는데, 이 제조 과정을 조금 변경함으로써 여러 가지 형태의 유용한 부직포를 제조할 수도 있다. 예를 들면, 최초에 생체 적합성 폴리머 용해 용액을 대량 분무하여 넓고 두꺼운 부직포를 제조하고, 그 위의 비교적 좁은 일부분에만 골 보충재를 추가하여 생체 적합성 폴리머 용해 용액을 분무한다는 조작을 반복하면, 넓고 두꺼운 부직포를 토대로 하여, 그 일부에 골 보충재를 포함하는 부직포가 솟아올라서 이루어지는 실크 햇상의 부직포가 얻어진다. 실크 햇으로 판단한 경우, 차양 부분이 넓고 두꺼운 토대의 부직포이고, 크라운의 부분이 골 보충재를 포함하는 부직포이다. 이 실크 햇상의 부직포에서는 크라운 부분을, 치조골을 재생시켜야 할 영역에 매립하고, 또한, 차양 부분에서 치육 조직이나 상피 조직이 해당 영역 내로 침윤하는 것을 억제할 수 있다. 즉, 해당 실크 햇상의 부직포는 차폐막 및 골 보충재의 양쪽의 기능을 갖는다.

이와 같이, 본 발명의 부직포는 골 재생용 재료로서 이용할 수 있다. 또한, 본 발명의 부직포에 골아 세포 등을 부착시킨 것 또는 첨가한 것도 본 발명에 포함된다. 즉, 본 발명은 상기 부직포를 포함하는 골 재생용 재료를 포함하고, 해당 골 재생용 재료는 상기 부직포로 이루어지는 것이어도 좋고, 골아 세포를 더 포함하는 상기 부직포이어도 좋다. 또한, 골아 세포를 포함시키는 데는, 예를 들면, 해당 부직포를 발판으로 하여 세포를 배양하면 좋다.

또, 본 발명의 부직포는 골아 세포 배양 발판재로서 이용할 수 있다. 이 경우에 있어서, 상기의 골 재생 재료와 동일한 구성을 갖는 부직포를 골아 세포 배양 발판재로서 이용할 수 있다.

또한, 본 발명의 부직포는 골 재생용 재료로서 이용할 수 있는 것에서, 예를 들면, 이하에 기재하는 치료, 수술 또는 용도에 이용할 수 있다.

＜치주 조직 재생, 구강 외과 영역＞

골연하 결손, 클래스Ⅱ근분지부 병변, 퇴축형 결손, 열개형 결손에 있어서의 조직 재생 유도법; 악제의 골 조성술, 치조제 증대술, 임플란트 주위의 골 조성술에 있어서의 골 재생 유도법; 악제 형성술; 상악동저 거상술에 있어서의 사이너스 리프트법; 발치와의 보존에 있어서의 소켓 프리저베이션법; 비강저 거상술; 골 연장 수술, 골 괴사 부분의 소파 후의 골 충전, 골 조직의 암병소 소파 후의 골 충전, 외상에 의한 골절의 치료를 위한 골 충전에 있어서의 골 재건술; 브리지 하의 치육 증대, 치육 퇴축으로의 근면피복, 치간 유두 재건, 그 외, 치육 증대 등 심미 목적에서의 시술 등

＜정형 외과 영역＞

골 연장 수술; 골 괴사 부분의 소파 후, 골 조직의 암병소 소파 후, 외상에 의한 골절의 치료, 척추 압박 골절, 위관절 치료에 있어서의 골 재건술; 골 연장 수술: 골다공증의 치료에 있어서의 약효 성분의 캐리어재로서의 사용 등

또한, 본 발명은 상기 본 발명의 부직포를, 골(바람직하게는 치조골)을 재생시켜야 할 부위에 적용하여 골을 재생시키는 방법도 포함한다. 해당 방법은 예를 들면, 상기 치료, 수술에 이용할 수 있다.

(실시예)

이하, 본 발명을 구체적으로 설명하는데, 본 발명은 하기의 예에 한정되는 것은 아니다. 또한, 실험 시에 해당 기술 분야의 교과서 등(예를 들면, Molecular Cloning: A Laboratory Manual(3 Vol. Set);Cold Spring Harbor Laboratory Press)을 적절히 참조해도 좋다.

부직포의 제조 1

폴리유산(미츠이 화학, LACEA, H―400) 7g에 헥사플루오로이소프로필알코올:디클로로메탄＝8:2(질량비)의 혼합 용액 43g을 첨가하여 용해시키고, 폴리유산 용액을 얻었다(14w／w％). 해당 폴리유산 용액을 시린지(Henke SASS WOLF, 5mL)에 충전하고, 바늘(테루모, 난베벨(non-bevel) 바늘 21G1.1／2)을 시린지에 장착하여 일렉트로스피닝 장치에 세트했다. 시린지로부터 타겟으로 되는 어스와의 거리를 8㎝로 하고, 인가 전압 10kV에서 표 1에 나타내는 조건으로 분무량이나 분무 시간을 각각 변화시켜서 분무했다. 분무 동안, 15분 간격으로 골 보충재(오스페리온／올림퍼스 테루모 바이오마테리얼 주식회사)를 가능한 한 골고루 첨가했다. 해당 첨가는 합계 첨가량이 2g이 되기까지 실시했다. 또한, 이용한 골 보충재(오스페리온)의 입경은 0.5∼1.5㎜(규격값)이다. 골 보충재 전량을 첨가 종료 후, 다시 15분간 폴리유산 용액을 분무했다. 이와 같이 하여 표 1에 나타내는 4종의 부직포를 제조했다.

또한, 제조에 있어서는, 어스 전극(콜렉터를 겸한다)으로서, 상하 가동의 동제의 돌기를 구비한 알루미늄판을 이용했다. 해당 어스 전극의 개요를 도 2에 나타낸다. 상기의 분무 동안, 15분 간격으로 해당 동제 돌기를 0.5㎜씩 상승시켰다.

일렉트로스피닝법에 의해 작성한 샘플

제조한 부직포	분무량	분무 시간	1회의 골 보충재 첨가량	골 보충재 첨가 간격	골 보충재 전체 첨가량
골 보충재 없는 부직포(샘플 0)	0.6μL／sec	120min	―	―	―
입체 부직포(샘플 1)	0.6μL／sec	165min	0.2g	15min	2g
입체 부직포(샘플 2)	1.2μL／sec	165min	0.2g	15min	2g
입체 부직포(샘플 3)	1.2μL／sec	315min	0.1g	15min	2g

부직포의 물성 평가 1

이하의 순서에 의해 상기 4종의 부직포(샘플 0, 1, 2, 3)의 두께, 부피 밀도, 골 보충재 비율 및 부직포를 구성하는 섬유의 섬유 지름을 측정했다.

샘플을 각각 직사각형으로 절단(약 4㎠ 정도)하고, 중량을 측정했다. 측정 샘플의 세로, 가로 및 두께의 길이를 두께계(Digital thickness gauge, 오자키 제작소, DG―205M)로 측정하고, 세로, 가로, 두께의 길이를 곱하여 체적(㎤)을 구했다. 또한, 두께는 20군데의 측정값의 평균값으로 했다.

샘플 중량과 체적으로부터 부피 밀도를 다음 식에 의해 구했다.

부피 밀도(g／㎤)＝샘플 중량(g)／샘플 체적(㎤)

또한, 컷한 각 샘플을 각각 코니컬 튜브에 넣고, 50mL의 디클로로메탄을 첨가하여 샘플 중의 폴리유산을 용해했다. 다음으로, 코니컬 튜브에 침전을 남기고, 상청을 제거했다. 해당 침전의 디클로로메탄을 증발시키서 남은 침전의 중량을 측정하고, 골 보충재의 중량으로 했다. 그리고 골 보충재 비율을 다음 식에 의해 구했다.

골 보충재 비율(％)＝(디클로로메탄 불용해물(침전)／이용한 샘플 중량)×100

또, 주사형 전자 현미경(주식회사 히타치 하이테크놀로지, S―3400N)을 이용하여 각 샘플 단면을 촬영하고, 500배의 전자 현미경 촬영 영상으로부터 1mage J(ver. 1.43u)(NIH개발의 화상 처리 소프트웨어)에 의해 섬유 지름을 측정했다. 섬유 50개의 섬유 지름의 평균값을 각 샘플의 섬유 지름으로 했다.

또한, 각 샘플의 단면 사진을 도 3에 나타낸다. 도 3에서는 A가 샘플 0을, B가 샘플 1을, C가 샘플 2를, D가 샘플 3을 각각 나타낸다. 도 3으로부터 샘플 0에 비해 샘플 1∼3이 골 보충재를 넣는 것으로 두께가 있는 부직포로 되어 있는 것을 확인할 수 있었다. 또, 주사형 전자 현미경에 의한 샘플 3의 단면의 촬영도를 도 4에 나타낸다. 도 4에는 아울러서 모식도도 나타낸다.

이상의 물성 평가의 결과를 표 2에 나타낸다.

부직포의 물성 평가 결과

샘플	골 보충재 비율	두께	섬유 지름	부피 밀도
골 보충재 없는 부직포(샘플 0)	0％	0.163㎜±0.044	2.685㎛±0.322	―
입체 부직포(샘플 1)	97.4％	2.415㎜±0.430	3.435㎛±0.741	0.179g/㎤
입체 부직포(샘플 2)	91.6％	2.733㎜±0.427	3.170㎛±0.997	0.194g/㎤
입체 부직포(샘플 3)	89.0％	2.500㎜±0.529	2.630㎛±0.473	0.216g/㎤

또한, 샘플 1∼3에 대하여, 부직포의 공극률(％) 및 부직포의 섬유 부분의 공극률(％)을 산출했다. 계산에는 폴리유산의 진밀도로서 1.26g／㎤, 골 보충재(오스페린)의 진밀도로서 3.17g／㎤의 각 값을 이용했다. 결과를 표 3에 나타낸다. 또한, 해당 진밀도값은 건습 자동 밀도계(아큐픽1330; 시마즈 제작소)에 의해 구한 값이다.

골 보충재를 포함하지 않는 폴리유산의 부직포(샘플 0)는 두께가 0.163㎜로 얇고, 특히, 환부(골 결손부)에 충전하여 이용하는 골 재생용 재료로서는 충분한 두께라고는 하기 어려운 것이었지만, 골 보충재를 첨가한 폴리유산 부직포(샘플 1∼3)는 두께 2∼3㎜의 비교적 두꺼운 부직포로서, 손으로 눌러도 손을 떼면 두께가 회복되는 것이고, 골 재생용 재료로서도 적합한 것으로 생각되었다.

부직포의 세포 증식능 평가

이하의 순서에 의해 각 부직포(샘플 1∼3)의 세포 증식능을 검토했다. 구체적으로는, 각 샘플에 의해 증식한 세포의 DNA량을 측정하여 세포 증식능을 검토했다.

＜세포 배양＞

각 부직포 샘플(샘플 1∼3)을 48홈 플레이트(스미토모 베이크라이트(주), SUMILON, MS―80480)의 저면과 같은 크기로 컷하고, 48홈 플레이트의 바닥에 놓았다. 이들에는 약 50㎎분의 골 보충재가 포함된다. 또, 컨트롤 샘플로서, 골 보충재(오스페리온) 약 50㎎을 그대로 48홈 플레이트의 바닥에 놓았다.

각 평가 샘플의 위에 스테인레스관(페니실린 컵)을 놓고, 또한, 10％FBS／MEM배지(항생 물질과 글루타민산을 첨가한 10％FBS／MEM배지: 이하의 “10％FBS／MEM배지”도 동일)를 500μL 첨가했다. 플레이트 원심기에서 5min 원심하고(2500rpm, 실온), 감압 탈기하여 다시 5min 원심했다(2500rpm, 실온). 그리고 200μL의 10％FBS／MEM배지를 첨가하고, 37℃, 5％CO₂ 인큐베이터 내에서 1hr 이상 인큐베이트했다. 배지를 500μL 흡수하여 제거하고, 인간 골육종 유래 세포 MG―63를 1.6×10⁵cells／mL로 되도록 10％FBS／MEM배지에 현탁하고, 이것을 100μL씩 각 well에 파종했다(1.6×10⁴cells／well). 5시간 인큐베이트하고, 세포를 평가 샘플에 부착시킨 후, 200μL의 10％FBS／MEM배지를 첨가하고, 배양했다. 배양 1일, 3일, 8일 후의 샘플을 세포 증식능 평가에 사용했다.

＜세포 증식능의 측정＞

배양 후, 세포가 부착한 각 평가 샘플(부직포)을 꺼내고, 각각 PBS(인산 완충 생리 식염수)가 들어간 플레이트에 추가했다. PBS를 포함한 상태의 중량을 측정하고, 건조 중량과 PBS를 포함한 상태의 평가 샘플 중량으로부터 흡수량(PBS를 포함한 상태의 평가 샘플 중량으로부터 평가 샘플의 실험에 제공되기 전의 건조 중량(플레이트 저면과 같은 크기로 컷한 시점에서 측정)을 뺀 양)을 구했다.

샘플의 흡수량과 TE완충액(Tris/Tris-HCl 10mM, EDTA 1mM)을 합친 용액량이 1200μL로 되도록 TE완충액을 각 플레이트에 추가했다. 2회 동결 융해(－80℃에서 동결시키고, 실온에서 융해시키는 조작을 2회 반복했다)를 실시하고, 그 후, 초음파 처리를 30분 실시하여 세포를 파쇄했다. TE완충액 중에 DNA를 용출시킨 100μL의 세포 용해액(동결 융해 및 초음파 처리를 실시하여 얻은 세포 파쇄액)을 96홈 형광 측정용 플레이트(Nunc black microwell, cat. 137101)에 추가하여 측정 샘플로 했다.

피코그린(인비트로젠)을 TE완충액으로 희석(100μL을 20mL로 희석)하고, 측정 샘플에 100μL 첨가하고, 5분간 실온에서 인큐베이트했다. 형광 플레이트 리더(Molecular devices spectra Max gemin XPS)를 이용하여 여기광 480㎚ㆍ측정 파장 520㎚로 형광 강도를 측정했다. 피코그린은 2개쇄 DNA 특이적 염색제이기 때문에 얻어진 형광 강도는 DNA량(나아가서는 세포수)을 반영한다. 결과를 도 5에 나타낸다. 골 보충재만(컨트롤)을 이용한 경우에 비하여 골 보충재를 포함하는 두꺼운 폴리유산 부직포(샘플 1∼3)에는 다수의 세포가 부착하여 증식하는 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 이들의 부직포는 골 재생 재료로서 우수한 것을 알 수 있었다.

부직포의 포어 크기 측정

부직포의 포어 크기(최빈값)는 퍼플루오로폴리에스테르를 이용한 하프 드라이법(ASTM E1294―89)에 의해 측정(직경 7㎜의 원형 측정 어댑터를 사용)했다. 또한, 측정 기기는 capillary flow porometer(CFP-1200-AEL, Porous Materials Inc)를 이용했다. 또, 최빈값을 구할 때의 계급폭은 1㎛로 했다.

부직포의 제조 2

폴리유산(에보닉 데구사 재팬 주식회사, RESOMER(등록 상표), L206S) 5g에 헥사플루오로이소프로필알코올:디클로로메탄＝8:2(질량비)의 혼합 용액 45g을 첨가하여 용해시키고, 폴리유산 용액을 얻었다(10중량％). 해당 폴리유산 용액을 시린지(Henke SASS WOLF, 5mL)에 충전하고, 일렉트로스피닝 장치(주식회사 메크, NF-103A)에 세트했다. 시린지로부터 타겟으로 되는 어스 전극(4×4㎝의 알루미늄 블록: 도 2에 나타내는 것과 동일 기구)의 거리를 22㎝로 하고, 인가 전압 15kV로 분무량 1ml/hour, 분무 합계 시간 90min의 조건으로 분무했다. 분무 동안, 3분 간격으로 0.033g의 골 보충재(올림퍼스 테루모 바이오마테리얼 주식회사, 오스페리온G1) 및 그 골 보충재를 보다 가늘게 파쇄하고, 체로 입경을 조절한 것을 골고루 첨가했다. 해당 첨가는 30회, 합계 첨가량이 약 1g이 되기까지 실시했다. 이와 같이 하여 표 4에 나타내는 5종의 부직포(A, B, C, D 및 E)를 제작했다.

또, 블록상(20㎜×10㎜×3.5㎜의 직방체상)의 오스페리온(오스페리온A1)을 골 보충재로서 이용하여 동일하게 부직포를 제작했다. 해당 부직포를 부직포 F로 한다(표 4).

부직포의 물성 평가 2

이하의 순서에 의해 부직포 A∼F의 두께, 부피 밀도, 골 보충재 비율 및 부직포를 구성하는 섬유의 섬유 지름을 측정 및 산출했다.

각 샘플을 각각 4×4㎝의 정사각형으로 잘라내고, 중량을 측정했다. 샘플의 두께를 디지마틱(digimatic) 마이크로미터(주식회사 미츠토요, CLM1-15QM)로 측정했다. 두께는 20군데의 측정값의 평균값으로 했다.

다음으로, 상기 “부직포의 물성 평가 1”과 동일하게 하여 부직포 A∼F의 부피 밀도, 골 보충재 비율 및 부직포를 구성하는 섬유의 섬유 지름을 측정 및 산출했다. 다만, 섬유 지름에 대해서는, 500배는 아니고, 2000배의 전자 현미경 촬영 영상을 이용하여 구했다.

이상의 물성 평가의 결과를 표 5에 나타낸다. 또한, 부직포 F는 블록상의 골 보충재를 이용하여 제조했기 때문에 다른 부직포에 비하여 부피 밀도가 크다.

샘플	골 보충재 비율 (％)	두께 (㎜)	섬유 지름 (㎛)	부피 밀도 (g/㎤)
골 보충재 없음(부직포 A)	0	0.24±0.02	2.52±0.20	0.273
입체 부직포 B	75.0	1.70±0.18	1.99±0.26	0.379
입체 부직포 C	92.43	2.96±0.17	2.43±0.23	0.214
입체 부직포 D	94.0	3.59±0.39	2.20±0.33	0.152
입체 부직포 E	92.1	4.68±1.09	2.08±0.15	0.145
입체 부직포 F	90.9	1.16±1.34	2.25±0.31	0.595

또한, 각 부직포의 공극률(％) 및 각 부직포의 섬유 부분의 공극률(％)을 산출했다. 구체적으로는, 계산에는 폴리유산의 진밀도로서 1.26g／㎤, 골 보충재(오스페리온)의 진밀도로서 3.17g／㎤를 이용하고, 상기 “부직포의 물성 평가 1”과 동일하게 하여 산출했다. 다만, 부직포 F는 블록상의 골 보충재 자체가 많이 공극을 포함하기 때문에 부직포 F의 섬유 부분의 공극률을 산출할 때만 골 보충재의 진밀도로서 0.7065g／㎤를 이용했다. 결과를 표 6에 나타낸다.

부직포 F는 블록상의 골 보충재를 이용하여 제조했기 때문에 다른 부직포에 비하여 부직포의 섬유 부분의 공극률이 낮다. 이 때문에, 다른 부직포에 비하면 약간 단단한 부직포이었다.

샘플	부직포의 공극률(％)	부직포의 섬유 부분의 공극률(％)
골 보충재 없음 (부직포 A)	78.3	78.3
입체 부직포 B	83.5	91.7
입체 부직포 C	92.5	98.6
입체 부직포 D	94.8	99.2
입체 부직포 E	94.9	99.1
입체 부직포 F	78.6	81.6

부직포의 제조 3

사용 폴리유산 용액 농도를 5중량％로 하고, 일렉트로스피닝 장치로부터의 분무 조건을 분무량 1mL／hour, 분무 합계 시간 195min으로 하고, 처음에 15min 분무한 후, 6min 간격으로 0.03g의 골 보충재를 합계 첨가량이 약 1g이 되기까지 첨가한 이외는, 상기 “부직포의 제조 2”와 동일하게 하여 부직포 α를 제조했다.

부직포의 물성 평가 3

상기 “부직포의 물성 평가 2”와 동일하게 하여 부직포 α의 두께, 부피 밀도, 골 보충재 비율 및 입체 부직포를 구성하는 섬유의 섬유 지름을 측정 및 산출하고, 또한, 입체 부직포의 공극률(％) 및 입체 부직포의 섬유 부분의 공극률(％)을 산출했다. 결과를 표 7 및 표 8에 나타낸다.

샘플	골 보충재 비율 (％)	두께 (㎜)	섬유 지름 (㎛)	부피 밀도 (g／㎤)
입체 부직포 α	95.0	3.91	0.35±0.17	0.156

샘플	부직포의 공극률(％)	부직포의 섬유 부분의 공극률(％)
입체 부직포 α	94.7	99.3

부직포의 제조 4

어스 전극을 6×25㎝의 알루미늄 블록으로 하여 분무 조건을 폭 16㎝, 분무량 1mL／hour, 분무 합계 시간 360min으로 하고, 분무 동안, 6min 간격으로 0.135g의 골 보충재(오스페리온)를 59회 합계 첨가량이 약 8g이 되기까지 4×16㎝로 골고루 첨가한 이외는, 상기 “부직포의 제조 2”와 동일하게 하여 부직포 β를 제조했다.

부직포의 물성 평가 4

상기 “부직포의 물성 평가 2”와 동일하게 하여 부직포 β의 두께, 부피 밀도, 골 보충재 비율 및 입체 부직포를 구성하는 섬유의 섬유 지름을 측정 및 산출하고, 또한, 입체 부직포의 공극률(％) 및 입체 부직포의 섬유 부분의 공극률(％)을 산출했다. 결과를 표 9 및 표 10에 나타낸다.

샘플	골 보충재 비율 (％)	두께 (㎜)	섬유 지름 (㎛)	부피 밀도 (g／㎤)
입체 부직포 β	89.0±1.1	6. 34±0.18	2.11±0.24	0.155

샘플	부직포의 공극률(％)	부직포의 섬유 부분의 공극률(％)
입체 부직포 β	94.3	98.6

부직포의 이식

부직포 β를 이하와 같이 하여 쥐에 이식하고, 결합 조직의 침윤의 정도를 검토했다. 또한, 블록상 골 보충재 그 자체(오스페리온 A1)도 동일하게 쥐에 이식하고, 대조로 했다.

SD계 숫성 쥐(8주령, 약 200g)를 구입하여, 실험 동물로 했다. 해당 쥐에 2.5％ 이소풀루란 흡입 마취를 실시하고, 목표 부위인 등부의 털을 깎고, 또한, 이소딘 및 소독용 알코올로 소독했다. 등부의 피부를 절개하여 소성 결합 조직 내에 공극을 제작했다. 이 공극에 부직포 β 또는 골 보충재의 블록(10×10×5㎜, 올림퍼스 테루모 바이오마테리얼사, 오스페리온 A1으로부터 잘라냄)을 매식하고, 봉합사로 닫았다. 매식으로부터 2주 후, 2.5％ 이소풀루란의 흡입 마취 하에서 복부 대동맥으로부터 방혈을 실시하고, 이식을 실시한 쥐를 안락사시켰다. 해당 쥐의 치사 확인 후, 매식한 검체를 주변부도 포함시켜서 채취했다. 채취한 샘플을 10％ 중성 완충 포르말린액(마일드포름(등록 상표), 와코 쥰야쿠 공업 주식회사제)에 침지하여 고정했다. 그 후, 해당 샘플로부터 동결 비탈회 조직 절편을 제작하고, 헤마톡시린―에오신 염색을 실시했다. 얻어진 조직 절편 표본을 광학 현미경으로 관찰했다. 결과를 도 6a 및 도 6b에 나타낸다. 부직포 β로의 결합 조직 침윤은 대조인 블록상 골 보충재의 것보다도 양호했다.

세포 침윤성의 검토 1

＜세포 배양＞

부직포 A∼D를 직경 약 1㎝의 크기로 컷하고, 24홈 플레이트(스미토모 베이크라이트(주), SUMILON, MS―80480)의 바닥에 설치했다. 평가 샘플을 페니실린 컵(스테인레스관)으로 누르고, 항생 물질과 글루타민산을 첨가한 10％FBS／MEM배지(이하, 특별히 규정되지 않는 한, 단순히 “10％FBS／MEB배지”로 표기한 경우에도 항생 물질과 글루타민산을 포함한다)를 10000μL 첨가하여 적시고, 감압 탈기했다. 37℃, 5％CO₂인큐베이터 내에서 1hr 이상 인큐베이트했다. 사전에 배양한 MG―63(유래: 인간 골육종, 휴먼 사이언스 연구 자원 뱅크, Lot. 05262004)을 3.2×10⁵cells／mL로 되도록 10％FBS／MEM배지에 현탁하고, 100μL씩 각 well에 파종했다(3.2×10⁴cells／well). 하룻밤 배양한 세포를 평가 샘플로서 이용했다.

＜세포 침윤성 평가＞

세포를 4％파라포름알데히드 용액으로 1hr 고정하고, PBS로 세정을 했다. 그 후, 샘플을 드라이아이스 냉각 하의 헥산으로 동결하고, 4％CMC에 동결 포매했다. 동결 샘플을 두께 30μL로 얇게 자르고, 헤마톡시린ㆍ에오신 염색(HE영색)을 실시했다. 얇게 자른 샘플을 정립 현미경(올림퍼스 주식회사, BH―2)으로 관찰했다. 또, Image J ver 1.44를 이용하여 최대의 세포 침윤 거리를 측정했다. 결과를 도 7에 나타낸다. 공극률, 섬유 부분의 공극률의 상승과 함께, 세포의 침윤성이 높아지는 것을 확인할 수 있었다.

부직포의 제조 5

분무 합계 시간 120min으로 하고, 분무 동안, 3min 간격으로 0.135g의 골 보충재(오스페리온 G1)를 39회, 합계 첨가량이 약 5.3g으로 되기까지 4×16㎝로 골고루 첨가한 이외는, 상기 “부직포의 제조 4”와 동일하게 하여 부직포 γ를 제조했다.

세포 침윤성의 검토 2

부직포 β 및 부직포 γ의 세포 침윤성을 검토했다. 부직포 β 및 γ에 대하여, 다음과 같이 하여 세포 배양을 실시했다. 즉, 직경 약 1㎝의 크기로 컷하고, 10％FBS／MEM배지 중에서 감압 탈기하여 완전히 적셨다. 그리고 37℃, 5％CO₂인큐베이터 내에서 1hr 이상 인큐베이트했다. 사전에 배양한 MG―63(유래: 인간 골육종, 휴먼 사이언스 연구 자원 뱅크, Lot. 05262004)을 1.6×10⁵cells／mL로 되도록 10％FBS／MEM배지에 현탁하고, 각 평가 샘플을 세포 용액 10mL에 60분 적셨다. 샘플은 15분마다 용액 내에서 조용히 교반했다. 세포액으로부터 샘플을 꺼내고, 24홈 플레이트(스미토모 베이크라이트(주), SUMILON, MS―80240)의 바닥에 설치했다. 배지를 1mL 첨가하고, 페니실린 컵(스테인레스관)으로 샘플을 누르고, 하룻밤 배양했다. 이 세포를 배양한 부직포를 샘플로 하여, 세포를 4％파라포름알데히드 용액으로 1hr 고정하고, PBS에서 세정을 했다. 그 후, 샘플을 드라이아이스 냉각 하의 헥산으로 동결하고, 4％CMC로 동결 포매했다. 동결 샘플을 두께 30μL로 얇게 자르고, HE염색을 실시했다. 얇게 자른 샘플을 현미경(올림퍼스 주식회사, BH―2)으로 관찰하고, 세포 침윤성을 평가했다.

또, 상기 “부직포의 포어 크기 측정”과 동일하게 하여 각 부직포의 포어 크기를 측정했다. 다만, 부직포 β 및 γ의 포어 크기를 측정할 때에는 부직포의 표층을 벗겨내고, 이것을 측정에 이용했다.

이상의 결과를 도 8에 나타낸다. 도 8의 포어 크기는 최빈값을 나타낸다.

또한, 각 부직포의 섬유끼리의 사이의 거리(섬유 간 거리)를 다음과 같이 하여 측정했다. 즉, 측정하는 샘플(부직포)을 PBS에 침지하고, 감압 탈포한다. PBS가 침윤한 샘플을 4％CMC(카르복시메틸 셀룰로오스) 겔에 가라앉히고, 동결 블록을 작성했다. 작성한 블록으로부터 두께 2㎛의 샘플을 작성하고, 슬라이드 유리와 커버 유리의 사이에 수지로 봉입했다. 얇게 자른 샘플을 위상차 현미경으로 촬영했다. 촬영한 화상으로부터 섬유의 단면을 검출하고, 그 섬유 간 거리를 중심 간 거리법으로 측정을 실시했다. 중심 간 거리법의 해석은 “A조군(A-ZO KUN)”(아사히 가세이 엔지니어링, ver 2.20)을 이용하여 실시했다. 해당 해석의 개요를 도 9에 나타낸다. 또한, 이와 같이 하여 측정한 섬유 간 거리는 부직포 β에서는 18.4㎛, 부직포 γ에서는 27.2㎛, 부직포 샘플 2에서는 33.3㎛이었다.

세포 침윤성의 검토 3(참고예)

세포 침윤성과 부직포의 포어 크기의 관계를 해석하기 위해, 통상의 부직포(평면 부직포(ⅰ)∼(ⅲ): 표 11)를 제조하고, 세포 침윤성을 검토했다.

제작한 부직포	분무량 (mL／hour)	분무 시간 (min)
부직포(ⅰ)	1.0	60
부직포(ⅱ)		180
부직포(ⅲ)		180

구체적으로는, 폴리유산(에보닉 데구사 재팬 주식회사, RESOMER(등록 상표), L 206S) 5g에 헥사플루오로이소프로필알코올:디클로로메탄＝8:2(질량비)의 혼합 용액 45g을 첨가하여 용해시키고, 폴리유산 용액을 얻었다(10중량％). 해당 폴리유산 용액을 시린지(Henke SASS WOLF, 5mL)에 충전하고, 일렉트로스피닝 장치(주식회사 메크, NF―103A)에 세트했다. 시린지으로부터 타겟(3×3㎝의 알루미늄 블록)으로 되는 어스와의 거리를 25㎝로 하여, 인가 전압 15kV로 분무량 1mL／hour, 분무 합계 시간 60min의 조건으로 분무하고, 부직포(ⅰ)을 제작했다. 또, 부직포(ⅱ)(ⅲ)은 각각 다른 종류의 회전식의 드럼을 어스에 이용한 점 이외는, 부직포(ⅰ)과 동일하게 하여 제작했다.

부직포(ⅰ)∼(ⅲ)에 대하여, 상기 “세포 침윤성의 검토 2”와 동일하게 하여 세포 침윤성을 검토했다. 다만, 부직포(ⅰ)의 포어 크기 측정에 있어서만 최빈값을 구할 때의 계급폭은 0.1㎛로 했다. 결과를 도 10에 나타낸다. 도 10의 포어 크기는 최빈값을 나타낸다. 또한, 도 10의 “최대 침윤 거리”는 HE염색 조직 절편의 관찰 화상으로부터 구했다. 또, 각각의 부직포의 섬유 간 거리는 부직포(ⅰ)에서는 7.3㎛, 부직포(ⅱ)에서는 13.4㎛, 부직포(ⅲ)에서는 15.8㎛이었다.

Claims

골 보충재를 함유하는 부직포로서,
골 보충재는 부직포를 구성하는 섬유 간에 포함되고,
부직포를 구성하는 섬유는 생체 적합성 섬유이고,
골 보충재의 입경이 50∼5000㎛이고,
부직포의 공극률이 78.5∼97％인
부직포.
제1항에 있어서,
생체 적합성 섬유가 생체 적합성 폴리머를 포함하여 이루어지는 섬유인
부직포.
제2항에 있어서,
생체 적합성 폴리머가 폴리유산, 폴리글리콜산, 폴리유산―폴리글리콜산 공중합체, 폴리카프로락톤, 키틴, 콜라겐, 폴리리신, 폴리아르기닌, 히알루론산, 세리신, 셀룰로오스, 덱스트란 및 풀루란으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종인
부직포.
제1항 또는 제2항에 있어서,
골 보충재가 β-TCP(β―인산3칼슘), α-TCP(α―인산3칼슘), HA(하이드록시아파타이트), DCPD(제2인산칼슘), OCP(옥타칼슘포스페이트), 4CP(테트라칼슘포스페이트), 알루미나, 지르코니아, 칼슘알루미네이트(CaO-Al₂O₃), 알루미노실리케이트(Na₂O-Al₂O₃-SiO₂), 생체 활성화 유리, 석영 및 탄산칼슘으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종인
부직포.
제1항 또는 제2항에 있어서,
부직포의 섬유 부분의 공극률이 80∼99.99％인
부직포.
제1항 또는 제2항에 있어서,
부직포의 부피 밀도(g／㎤)가 0.1∼0.6인
부직포.
제1항 또는 제2항에 기재된 부직포를 포함하는
골 재생용 재료.
제1항 또는 제2항에 기재된 부직포를 포함하는
골아 세포 배양 발판재.
제4항에 있어서,
부직포의 섬유 부분의 공극률이 80∼99.99％인
부직포.
제4항에 있어서,
부직포의 부피 밀도(g／㎤)가 0.1∼0.6인
부직포.
제4항에 기재된 부직포를 포함하는
골 재생용 재료.
제4항에 기재된 부직포를 포함하는
골아 세포 배양 발판재.