JP2775445B2 - 抗フェニトインモノクローナル抗体及びそれを産生するハイブリドーマ - Google Patents
抗フェニトインモノクローナル抗体及びそれを産生するハイブリドーマInfo
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Description
【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ この発明は、抗てんかん薬であるフェニトイン（PH
T）に対し高い親和性及び特異性を有するモノクローナ
ル抗体及び該モノクローナル抗体を産生するハイブリド
ーマに関する。この発明のモノクローナル抗体はてんか
ん患者血液中のフェニトイン濃度を正確に測定するため
に用いることができる。
T）に対し高い親和性及び特異性を有するモノクローナ
ル抗体及び該モノクローナル抗体を産生するハイブリド
ーマに関する。この発明のモノクローナル抗体はてんか
ん患者血液中のフェニトイン濃度を正確に測定するため
に用いることができる。
［従来の技術］ 現在、抗てんかん薬としてはテオフィリンをはじめと
し、多数の薬剤が開発され治療に用いられている。しか
し、その治療に関しては薬剤の効果判定、服薬の確認、
中毒症状の責任薬剤の診断、薬物相互作用の診断等のた
めに血中薬物濃度測定が非常に重要な意義を持っている
ことは周知の事実である。
し、多数の薬剤が開発され治療に用いられている。しか
し、その治療に関しては薬剤の効果判定、服薬の確認、
中毒症状の責任薬剤の診断、薬物相互作用の診断等のた
めに血中薬物濃度測定が非常に重要な意義を持っている
ことは周知の事実である。
特に、難治性の部分発作型てんかんに有効であるとし
て使用されるフェニトインは十二指腸で吸収され、血中
に取り込まれ、肝臓で水酸化され、胆汁等通常の代謝経
路を経て尿中に排出される。90％前後が代謝産物とな
り、そのまま未代謝物として尿中に排出されるフェニト
インは５％以下に過ぎない。また、代謝過程で飽和現象
が現われること、すなわちフェニトイン投与量と定常状
態での血中濃度とは比較せず、服用量が飽和点に達する
とわずかなフェニトイン投与増により血中フェニトイン
濃度は急激に上昇することも知られている。従って、最
少有効量で中毒症状を引き起こさずに治療することが要
求される。しかし、フェニトインの剤形変更で血中濃度
等に差が出ること、さらに他の薬剤との併用で治療効果
の上昇をはかるつもりが薬効同志の相互作用によりフェ
ニトインの代謝経路が影響を受け、フェニトイン血中濃
度を上昇させ、中毒症状を起こすことがあることが知ら
れている。従って、投与にあたっては常に血中濃度の管
理が望まれる。
て使用されるフェニトインは十二指腸で吸収され、血中
に取り込まれ、肝臓で水酸化され、胆汁等通常の代謝経
路を経て尿中に排出される。90％前後が代謝産物とな
り、そのまま未代謝物として尿中に排出されるフェニト
インは５％以下に過ぎない。また、代謝過程で飽和現象
が現われること、すなわちフェニトイン投与量と定常状
態での血中濃度とは比較せず、服用量が飽和点に達する
とわずかなフェニトイン投与増により血中フェニトイン
濃度は急激に上昇することも知られている。従って、最
少有効量で中毒症状を引き起こさずに治療することが要
求される。しかし、フェニトインの剤形変更で血中濃度
等に差が出ること、さらに他の薬剤との併用で治療効果
の上昇をはかるつもりが薬効同志の相互作用によりフェ
ニトインの代謝経路が影響を受け、フェニトイン血中濃
度を上昇させ、中毒症状を起こすことがあることが知ら
れている。従って、投与にあたっては常に血中濃度の管
理が望まれる。
従来より、種々の測定系で使用されている抗フェニト
イン抗体の多くはウサギ、ヒツジ等を用いてつくられる
ポリクローナル抗体である。従来より用いられているポ
リクローナル抗体は一般に抗原に対する特異性が低く、
フェニトインの主たる代謝産物であるｐ−ヒドロキシジ
フェニルヒダントイン（ｐ−HPPH）及びｍ−ヒドロキシ
ジフェニルヒダントイン（ｍ−HPPH）並びに関連薬物で
あるエチルフェニルヒダントイン（EPH）及びフェノバ
ルビタール（PB）に対する交叉反応性が大きい。すなわ
ち、ｐ−HPPH、EPHに対し５〜10％交叉し、ｍ−HPPHに
対しては100％近い交叉反応性を示す。
イン抗体の多くはウサギ、ヒツジ等を用いてつくられる
ポリクローナル抗体である。従来より用いられているポ
リクローナル抗体は一般に抗原に対する特異性が低く、
フェニトインの主たる代謝産物であるｐ−ヒドロキシジ
フェニルヒダントイン（ｐ−HPPH）及びｍ−ヒドロキシ
ジフェニルヒダントイン（ｍ−HPPH）並びに関連薬物で
あるエチルフェニルヒダントイン（EPH）及びフェノバ
ルビタール（PB）に対する交叉反応性が大きい。すなわ
ち、ｐ−HPPH、EPHに対し５〜10％交叉し、ｍ−HPPHに
対しては100％近い交叉反応性を示す。
また、従来より抗フェニトインモノクローナル抗体も
市販されているが、フェニトインに対する親和性及び特
異性が未だ満足できるものではなく、後述の実施例にお
いて示すように、フェニトインに対する50％結合濃度が
１μg/ml程度であり、ｐ−HPPHに対して５％、ｍ−HPPH
に対しては100％の交叉反応性を示す。
市販されているが、フェニトインに対する親和性及び特
異性が未だ満足できるものではなく、後述の実施例にお
いて示すように、フェニトインに対する50％結合濃度が
１μg/ml程度であり、ｐ−HPPHに対して５％、ｍ−HPPH
に対しては100％の交叉反応性を示す。
［発明が解決しようとする問題点］ 従って、この発明の目的は、フェニトインに対して高
い親和性及び特異性を有する抗フェニトインモノクロー
ナル抗体及びそれを産生するハイブリドーマを提供する
ことである。
い親和性及び特異性を有する抗フェニトインモノクロー
ナル抗体及びそれを産生するハイブリドーマを提供する
ことである。
［問題点を解決するための手段］ 本願発明者らは、鋭意研究の結果、フェニトインに対
し従来のモノクローナル抗体に比較してはるかに高い親
和性及び特異性を有する新規な抗フェニトインモノクロ
ーナル抗体を産生するハイブリドーマを作製することに
成功し、この発明を完成した。
し従来のモノクローナル抗体に比較してはるかに高い親
和性及び特異性を有する新規な抗フェニトインモノクロ
ーナル抗体を産生するハイブリドーマを作製することに
成功し、この発明を完成した。
すなわち、この発明はフェニトインの50％結合濃度が
10-1μg/ml以下であり、ｐ−ヒドロキシジフェニルヒダ
ントインに対する交叉反応性が２％未満であり、ｍ−ヒ
ドロキシジフェニルヒダントインに対する交叉反応性が
10％未満であり、エチルフェニルヒダントインに対する
交叉反応性が１％未満であり、フェノバルビタールに対
する交叉反応性が１％未満であり、ハイブリドーマPHT1
6−17（FERM P−10389）により産生される。抗フェニト
インモノクローナル抗体を提供する。
10-1μg/ml以下であり、ｐ−ヒドロキシジフェニルヒダ
ントインに対する交叉反応性が２％未満であり、ｍ−ヒ
ドロキシジフェニルヒダントインに対する交叉反応性が
10％未満であり、エチルフェニルヒダントインに対する
交叉反応性が１％未満であり、フェノバルビタールに対
する交叉反応性が１％未満であり、ハイブリドーマPHT1
6−17（FERM P−10389）により産生される。抗フェニト
インモノクローナル抗体を提供する。
さらにまた、この発明は、上記本発明のモノクローナ
ル抗体を産生するハイブリドーマPHT16−17（FERM P−1
0389）を提供する。
ル抗体を産生するハイブリドーマPHT16−17（FERM P−1
0389）を提供する。
［発明の効果］ 本発明により、フェニトインに対して極めて高い親和
性及び特異性を有する新規な抗フェニトインモノクロー
ナル抗体及びそれを産生するハイブリドーマが提供され
た。本発明の抗フェニトイン抗体は、フェニトインに対
する親和性及び特異性が極めて高いので、ELISA法等の
免疫分析法を適用して検体中のフェニトインを、その代
謝産物や類似薬物の妨害を受けることなく極めて高い精
度で測定することが可能となる。また、その特異性が極
めて高いので、全血を用いた血液中のフェニトインの定
量に用いることができる。従って、この発明は、フェニ
トインを用いたてんかんの治療及び診断に大いに貢献す
る。
性及び特異性を有する新規な抗フェニトインモノクロー
ナル抗体及びそれを産生するハイブリドーマが提供され
た。本発明の抗フェニトイン抗体は、フェニトインに対
する親和性及び特異性が極めて高いので、ELISA法等の
免疫分析法を適用して検体中のフェニトインを、その代
謝産物や類似薬物の妨害を受けることなく極めて高い精
度で測定することが可能となる。また、その特異性が極
めて高いので、全血を用いた血液中のフェニトインの定
量に用いることができる。従って、この発明は、フェニ
トインを用いたてんかんの治療及び診断に大いに貢献す
る。
［発明の具体的説明］ 本発明の抗フェニトイン抗体は、フェニトインの50％
結合濃度（50％の抗体に結合するフェニトインの濃度、
この値が小さいほどフェニトインに対する親和性が高
い）が10-1μg/ml以下である。これは、従来より市販さ
れている抗フェニトインモノクローナル抗体と比較して
10倍以上の高い親和性である。また、フェニトインの代
謝産物であるｐ−HPPH及びｍ−HPPHに対する交叉反応性
かそれぞれ２％未満及び10％未満である。これらの値
も、従来の抗フェニトインモノクローナル抗体と比較し
て格段に低い（すなわち特異性が高い）。さらに、フェ
ニトインの関連薬物であるEPH及びPBに対する交叉反応
性がそれぞれ１％未満である。
結合濃度（50％の抗体に結合するフェニトインの濃度、
この値が小さいほどフェニトインに対する親和性が高
い）が10-1μg/ml以下である。これは、従来より市販さ
れている抗フェニトインモノクローナル抗体と比較して
10倍以上の高い親和性である。また、フェニトインの代
謝産物であるｐ−HPPH及びｍ−HPPHに対する交叉反応性
かそれぞれ２％未満及び10％未満である。これらの値
も、従来の抗フェニトインモノクローナル抗体と比較し
て格段に低い（すなわち特異性が高い）。さらに、フェ
ニトインの関連薬物であるEPH及びPBに対する交叉反応
性がそれぞれ１％未満である。
本発明のモノクローナル抗体は以下のようにして得る
ことができる。すなわち、先ず、フェニトインを例えば
マウスのような動物に免疫し、その脾細胞のような抗体
産生細胞と、ミエローマ細胞のような腫瘍細胞とを融合
してハイブリドーマを作製する。フェニトインは免疫原
性が小さいので、免疫原性を有する例えばKLH（keyhole
Limpet Hemocyanin）やBSAのようなキャリアタンパク
質と結合したものを免疫化に用いることが好ましい。次
いで、ハイブリドーマをHAT培地のような選択培地を用
いて選択し、限界希釈法のような適当な方法で単クロー
ン化して培養し、培養上清について、酵素免疫分析のよ
うな適当な免疫分析手段により抗フェニトイン抗体を産
生しているか否かをチェックする。これらの各工程は公
知の方法により行なうことができ、例えば、Kohler and
MilsteinのNature 256,495（1975）又はSecherらのNat
ure 285,446（1980）に記載された方法により行なうこ
とができる。さらに、ｐ−HPPH、ｍ−HPPH、EPH及びPB
に対する交叉反応性を調べ、本発明の範囲内に入る、交
叉反応性の低いものを選択する。次いで、培養上清か
ら、公知の方法、例えばアフィニティクロマトグラフィ
ーや電気泳動のような分離精製手段の組合わせにより目
的の抗フェニトイン抗体を単離する。
ことができる。すなわち、先ず、フェニトインを例えば
マウスのような動物に免疫し、その脾細胞のような抗体
産生細胞と、ミエローマ細胞のような腫瘍細胞とを融合
してハイブリドーマを作製する。フェニトインは免疫原
性が小さいので、免疫原性を有する例えばKLH（keyhole
Limpet Hemocyanin）やBSAのようなキャリアタンパク
質と結合したものを免疫化に用いることが好ましい。次
いで、ハイブリドーマをHAT培地のような選択培地を用
いて選択し、限界希釈法のような適当な方法で単クロー
ン化して培養し、培養上清について、酵素免疫分析のよ
うな適当な免疫分析手段により抗フェニトイン抗体を産
生しているか否かをチェックする。これらの各工程は公
知の方法により行なうことができ、例えば、Kohler and
MilsteinのNature 256,495（1975）又はSecherらのNat
ure 285,446（1980）に記載された方法により行なうこ
とができる。さらに、ｐ−HPPH、ｍ−HPPH、EPH及びPB
に対する交叉反応性を調べ、本発明の範囲内に入る、交
叉反応性の低いものを選択する。次いで、培養上清か
ら、公知の方法、例えばアフィニティクロマトグラフィ
ーや電気泳動のような分離精製手段の組合わせにより目
的の抗フェニトイン抗体を単離する。
本発明の抗フェニトインモノクローナル抗体は、フェ
ニトインの検出、定量のための試薬として用いることが
できる。特に、特開昭61−80049号に記載されているよ
うな、ホモジニアス酵素免疫分析（EIA）の試薬として
用いることができる。本発明の抗フェニトイン抗体は、
その親和性及び特異性が極めて高いので、このようなホ
モジニアスEIAにおいて、全血をそのまま、すなわち希
釈することなく検体として用いて血液中のフェニトイン
を定量することができる。
ニトインの検出、定量のための試薬として用いることが
できる。特に、特開昭61−80049号に記載されているよ
うな、ホモジニアス酵素免疫分析（EIA）の試薬として
用いることができる。本発明の抗フェニトイン抗体は、
その親和性及び特異性が極めて高いので、このようなホ
モジニアスEIAにおいて、全血をそのまま、すなわち希
釈することなく検体として用いて血液中のフェニトイン
を定量することができる。
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する
が、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
が、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
［実施例］ 1.ハイブリドーマの作製及びモノクローナル抗体の選択
方法 １−１免疫物質の調製 ハプテンとしてのフェニトインとキャリア分子として
のKLHより成る免疫物質複合体はCookらの方法（Researc
h Communication in Chemical Pathology and Pharmaco
logy.vol.25.767,1973）により調製した。
方法 １−１免疫物質の調製 ハプテンとしてのフェニトインとキャリア分子として
のKLHより成る免疫物質複合体はCookらの方法（Researc
h Communication in Chemical Pathology and Pharmaco
logy.vol.25.767,1973）により調製した。
１−２供血体であるマウスの免疫 免疫にはBalb/c株のマウスのみ用い、10匹のマウスの
群を免疫した。フェニトイン−KLHと完全フロイントア
ジュバント（CFA、ディフコ社製）1:1の比の乳濁液を各
マウスの腹腔内に投与した。投与量は、マウス１匹につ
き免疫原が20〜50μｇであった。
群を免疫した。フェニトイン−KLHと完全フロイントア
ジュバント（CFA、ディフコ社製）1:1の比の乳濁液を各
マウスの腹腔内に投与した。投与量は、マウス１匹につ
き免疫原が20〜50μｇであった。
４週間後に0.9％NaCl中のフェニトイン−KLHを20〜50
μｇ追加免疫した。
μｇ追加免疫した。
マウスの免疫反応を定期的に血液試料を採取して追跡
した。
した。
１−３マウスの癌細胞の培養 市販のマウスの骨髄腫細胞であるP3X63Ag8UP（P3U1）
大日本製薬社製）を融合に用いた。この細胞は凍結用培
地中で液体窒素で−196℃で保存してあった。融合の１
週間前に一部を取って解かし、RPMI−1640培地の入った
シャーレ（直径10cm）に入れ培養した。対数増殖期の細
胞を融合に用いた。
大日本製薬社製）を融合に用いた。この細胞は凍結用培
地中で液体窒素で−196℃で保存してあった。融合の１
週間前に一部を取って解かし、RPMI−1640培地の入った
シャーレ（直径10cm）に入れ培養した。対数増殖期の細
胞を融合に用いた。
１−４体細胞融合 最後の追加免疫をしてから３〜４日後に無菌条件下
で、免疫したマウスの脾臓を取り出した。ステンレス製
のメッシュ（孔の大きさ100μｍ）の上で注意深くすり
潰した後、脾細胞から結合組織を分離し、RPMI−1640培
地で２回洗浄した（100rpm、５分間で遠心分離）。次に
RPMI−1640に浮遊した。この混合液中で脾細胞と上記腫
瘍細胞とを2:1で混合した。ポリエチレングリコール−R
PMI−1640（PEG4000とRPMI−1640を1:1に混合した溶
液）を加えて、細胞融合を開始した。１分後にRPMI−16
40を加えてPEGを希釈した。PEGが完全になくなるまで細
胞を洗い、106細胞/mlの程度になるようにヒポキサンチ
ン／アミノプテリン／チミジン選択培地（リトルフィー
ルドのHAT培地）に浮遊した。この選択培地中では融合
した細胞のみ生存でき、浮遊液中の融合していない脾細
胞やセルライン細胞は生存できない。
で、免疫したマウスの脾臓を取り出した。ステンレス製
のメッシュ（孔の大きさ100μｍ）の上で注意深くすり
潰した後、脾細胞から結合組織を分離し、RPMI−1640培
地で２回洗浄した（100rpm、５分間で遠心分離）。次に
RPMI−1640に浮遊した。この混合液中で脾細胞と上記腫
瘍細胞とを2:1で混合した。ポリエチレングリコール−R
PMI−1640（PEG4000とRPMI−1640を1:1に混合した溶
液）を加えて、細胞融合を開始した。１分後にRPMI−16
40を加えてPEGを希釈した。PEGが完全になくなるまで細
胞を洗い、106細胞/mlの程度になるようにヒポキサンチ
ン／アミノプテリン／チミジン選択培地（リトルフィー
ルドのHAT培地）に浮遊した。この選択培地中では融合
した細胞のみ生存でき、浮遊液中の融合していない脾細
胞やセルライン細胞は生存できない。
１−５ハイブリドーマ細胞の培養 融合後の細胞浮遊液（HAT培地中）をピペットで200μ
ｌづつ取り、96穴カルチャープレートのウェルに分注し
た。37℃、相対湿度100％で、95％の空気と５％の二酸
化炭素の雰囲気中で７〜10日間インキュベートした。こ
の間に定期的に細胞の増殖を追跡した。
ｌづつ取り、96穴カルチャープレートのウェルに分注し
た。37℃、相対湿度100％で、95％の空気と５％の二酸
化炭素の雰囲気中で７〜10日間インキュベートした。こ
の間に定期的に細胞の増殖を追跡した。
２〜３週間後に、下記１−９に記載したスクリーニン
グ法を用いて、陽性の培養液（すなわち所期の特異性を
有する免疫グロブリンを産生している培養液）を同定し
た。同時に培養液をHAT培地からHT培地に、次いでRPMI
−1640培地に順次変えていった。
グ法を用いて、陽性の培養液（すなわち所期の特異性を
有する免疫グロブリンを産生している培養液）を同定し
た。同時に培養液をHAT培地からHT培地に、次いでRPMI
−1640培地に順次変えていった。
１−６ハイブリドーマ培養細胞のクローニング 陽性の増殖培養液を大容量の培養容器（コスター社
製、細胞培養プレートtype3524又は3506）中で増殖させ
た。以下のクローニングは限界希釈クローニング法によ
り実施した。この方法では陽性の培養液中の細胞を希釈
して新しく培養を始めた時移植された細胞数が統計的に
それぞれ１ウェルあたり１個程度になるようにした。８
〜12日後に単一の細胞から出発した大きなコロニーが既
に見えるようになった。モノクローナルの細胞が増殖し
ていることを確保するために、クローニング操作は少な
くとも２回行なった。
製、細胞培養プレートtype3524又は3506）中で増殖させ
た。以下のクローニングは限界希釈クローニング法によ
り実施した。この方法では陽性の培養液中の細胞を希釈
して新しく培養を始めた時移植された細胞数が統計的に
それぞれ１ウェルあたり１個程度になるようにした。８
〜12日後に単一の細胞から出発した大きなコロニーが既
に見えるようになった。モノクローナルの細胞が増殖し
ていることを確保するために、クローニング操作は少な
くとも２回行なった。
１−７マウスの腹水の作製（in vivo） 腹水を調整するためにプリスタン（登録商標、ロス社
製）0.5mlをBalb/cマウスに腹腔内投与した。
製）0.5mlをBalb/cマウスに腹腔内投与した。
７〜60日内にこうして前処理したマウスの腹腔内に一
匹当り106ないし107個のハイブリドーマ細胞の浮遊液
（PBS中）を投与した。８〜10日後に腹腔に19G注射針を
差し込んで細胞を含有する腹水を集めた。
匹当り106ないし107個のハイブリドーマ細胞の浮遊液
（PBS中）を投与した。８〜10日後に腹腔に19G注射針を
差し込んで細胞を含有する腹水を集めた。
遠心分離（1000rpm、10分間）により腹水から細胞成
分を分離した。モノクローナル抗体を含有する上清画分
を（必要に応じて希釈）を分注しし、下記１−８に記載
する方法で精製した。
分を分離した。モノクローナル抗体を含有する上清画分
を（必要に応じて希釈）を分注しし、下記１−８に記載
する方法で精製した。
１−８腹水の精製 ブラックらの方法［J.Immunol.Math.53,313−319（19
82）］により精製した。
82）］により精製した。
１−８−１腹水の前処理 腹水を1000xgで５分間遠心分離して細胞成分を沈殿さ
せた。超遠心分離（100,000xg、30分間）により細胞断
片のフィブリン塊を分離除去した。次に上清画分を100
倍量のトリス塩酸緩衝液（0.02M/、pH7.2）で一夜透
析した。次いで10、000xgで15分間遠心分離した。
せた。超遠心分離（100,000xg、30分間）により細胞断
片のフィブリン塊を分離除去した。次に上清画分を100
倍量のトリス塩酸緩衝液（0.02M/、pH7.2）で一夜透
析した。次いで10、000xgで15分間遠心分離した。
１−８−２クロマトグラフィー 下記条件によりイオン交換クロマトグラフィー及びゲ
ルろ過クロマトグラフィーを行なった。イオン交換クロ
マトグラフィーは、出発緩衝液として0.01M Tris HCl p
H8.0を用い、０〜0.5M NaClでグラジエント溶出した。
担体はDEAE−セファロース（ファルマシア社製）、ゲル
ろ過はセファクリルＳ−200（ファルマシア社製）を用
いて行なった。緩衝液は0.01Mリン酸緩衝液pH7.4に0.15
MのNaClを含んだものを用いた。
ルろ過クロマトグラフィーを行なった。イオン交換クロ
マトグラフィーは、出発緩衝液として0.01M Tris HCl p
H8.0を用い、０〜0.5M NaClでグラジエント溶出した。
担体はDEAE−セファロース（ファルマシア社製）、ゲル
ろ過はセファクリルＳ−200（ファルマシア社製）を用
いて行なった。緩衝液は0.01Mリン酸緩衝液pH7.4に0.15
MのNaClを含んだものを用いた。
１−９抗体検出のためのスクリーニング試験 培養上清中のモノクローナル抗体のスクリーニングは
固相化抗原を用いたELISA法を用い、抗体の特異性は3H
−フェニトインを用いたRIA法により調べた。
固相化抗原を用いたELISA法を用い、抗体の特異性は3H
−フェニトインを用いたRIA法により調べた。
１−９−１固相免疫測定法（ELISA） ELISAプレートの調製 免疫で用いた抗原（フェニトイン−KLH）とはキャリ
ア部分の異なるフェニトイン−BSA結合物でELISA用96穴
プレートのウェルを被覆した（20μg/ml、50μｌ、４
℃、一夜）。反応液を除去後、0.05％ツィーン20入りPB
Sで洗浄し、調製した。
ア部分の異なるフェニトイン−BSA結合物でELISA用96穴
プレートのウェルを被覆した（20μg/ml、50μｌ、４
℃、一夜）。反応液を除去後、0.05％ツィーン20入りPB
Sで洗浄し、調製した。
ELISA法 抗原を被覆したプレートに各細胞培養上清画分を50μ
ｌづつ、マイクロピペットで入れた。37℃、60分間反応
させた後、ウェルの中の内容物を捨て、プレートをツィ
ーン20入りPBSで３回洗浄した。次にペルオキシダーゼ
で標識した第２抗体（DACO社製抗マウス免疫グロブリン
抗体）を各ウェルに入れ、さらに37℃、60分間反応し
た。３回洗浄後、基質ABTS（2,2′−アミノ−ビス（３
−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）、和光純
薬社製）を添加し、酵素反応を開始させた。陽性のウェ
ルに緑色の発色が見られた。
ｌづつ、マイクロピペットで入れた。37℃、60分間反応
させた後、ウェルの中の内容物を捨て、プレートをツィ
ーン20入りPBSで３回洗浄した。次にペルオキシダーゼ
で標識した第２抗体（DACO社製抗マウス免疫グロブリン
抗体）を各ウェルに入れ、さらに37℃、60分間反応し
た。３回洗浄後、基質ABTS（2,2′−アミノ−ビス（３
−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）、和光純
薬社製）を添加し、酵素反応を開始させた。陽性のウェ
ルに緑色の発色が見られた。
１−９−２親和性試験のためのRIA法 フェニトインに対する結合の親和性は3H−フェニトイ
ンを用いたRIA法により調べた。この操作は、Vincent
P.Butlerの方法（Method in Enzymology vol.84,558,19
82）に従って行なった。また、比較のため、同じ方法に
より市販の抗モノクローナル抗体であるエミットフェニ
トインキット（シバ社製）内のモノクローナル抗体及び
イムノリサーチ社製モノクローナル抗体とフェニトイン
の親和性をも調べた。
ンを用いたRIA法により調べた。この操作は、Vincent
P.Butlerの方法（Method in Enzymology vol.84,558,19
82）に従って行なった。また、比較のため、同じ方法に
より市販の抗モノクローナル抗体であるエミットフェニ
トインキット（シバ社製）内のモノクローナル抗体及び
イムノリサーチ社製モノクローナル抗体とフェニトイン
の親和性をも調べた。
１−９−３特異性試験のためのRIA法 フェニトインに対する抗体の存在が見られたウェル
は、Ｐ−HPPH、ｍ−HPPH、EPH及びPBとの交叉反応性を
調べるため、3H−フェニトインとモノクローナル抗体と
の反応を濃度を変えた上記各種交叉反応性物質で競争反
応を行なわせ、フリーと抗体結合フェニトインとをデキ
ストラン−チャコールにて分離した。この操作は具体的
には以下のように行なった。0.25％BSA/TBS0.5ml中に濃
度一定の3H−フェニトイン50μｌと、濃度を変えた抗フ
ェニトイン抗体50μｌを加え、25℃で２時間反応させ、
反応終了後、0.25mlのデキストランチャコールを加え遠
心し、フリーの3H−フェニトインと抗体結合3H−フェニ
トインを分離した。総3H−フェニトインの70％を結合す
る抗体濃度を用いて、この抗体と3H−フェニトイン、濃
度を変えた交叉反応物質を25℃で２時間反応させ、デキ
ストランチャコールでフリーの3H−フェニトインと結合
3H−フェニトインを分離した。交叉反応性物質のない状
態で抗体に結合した3H−フェニトインを100％とし、50
％阻害を示す交叉反応性物質の濃度を求め、フェニトイ
ンと比較して交叉反応％を算出した。また、比較のた
め、シバ社製の上記エミット及びイムノリサーチ社製の
モノクローナル抗体についても同様に試験を行なった。
は、Ｐ−HPPH、ｍ−HPPH、EPH及びPBとの交叉反応性を
調べるため、3H−フェニトインとモノクローナル抗体と
の反応を濃度を変えた上記各種交叉反応性物質で競争反
応を行なわせ、フリーと抗体結合フェニトインとをデキ
ストラン−チャコールにて分離した。この操作は具体的
には以下のように行なった。0.25％BSA/TBS0.5ml中に濃
度一定の3H−フェニトイン50μｌと、濃度を変えた抗フ
ェニトイン抗体50μｌを加え、25℃で２時間反応させ、
反応終了後、0.25mlのデキストランチャコールを加え遠
心し、フリーの3H−フェニトインと抗体結合3H−フェニ
トインを分離した。総3H−フェニトインの70％を結合す
る抗体濃度を用いて、この抗体と3H−フェニトイン、濃
度を変えた交叉反応物質を25℃で２時間反応させ、デキ
ストランチャコールでフリーの3H−フェニトインと結合
3H−フェニトインを分離した。交叉反応性物質のない状
態で抗体に結合した3H−フェニトインを100％とし、50
％阻害を示す交叉反応性物質の濃度を求め、フェニトイ
ンと比較して交叉反応％を算出した。また、比較のた
め、シバ社製の上記エミット及びイムノリサーチ社製の
モノクローナル抗体についても同様に試験を行なった。
１−10フェニトインのホモジニアスEIA 特開昭61−80049号に記載されたホモジニアスEIA系を
本発明のモノクローナル抗体を用いて確立し、感度、特
異性を調べた。すなわち、α−アミラーゼとモノクロー
ナル抗体を結合した酵素抗体結合物の溶液50μｌ、フェ
ニトインをウマフェリチンに結合した高分子化フェニト
インの溶液50μｌ及び既知量のフェニトインを溶解した
５％BSA/PBSの50μｌを混合し、37℃で20分間反応させ
た。反応液に基質懸濁液1.0mlを加えて37℃でさらに30
分間反応させ、0.5N NaOH0.5mlを加えて反応を停止させ
た。これを撹拌後、3000rpmで２分間遠心し、上清の620
nmにおける吸光度を測定してフェニトインに対する検量
線を得た。モノクローナル抗体の特異性を調べるため
に、酵素−抗体結合物溶液50μｌ、高分子化フェニトイ
ン溶液50μｌに一定濃度のフェニトインに交叉反応性物
質を種々の濃度で添加した溶液50μｌを加え、37℃で20
分間反応させた。その後の操作は検量線を求めた時と同
じ条件で行なった。交叉反応性物質を添加した溶液の測
定値を添加しなかった溶液の測定値と比較して交叉反応
％を算出した。
本発明のモノクローナル抗体を用いて確立し、感度、特
異性を調べた。すなわち、α−アミラーゼとモノクロー
ナル抗体を結合した酵素抗体結合物の溶液50μｌ、フェ
ニトインをウマフェリチンに結合した高分子化フェニト
インの溶液50μｌ及び既知量のフェニトインを溶解した
５％BSA/PBSの50μｌを混合し、37℃で20分間反応させ
た。反応液に基質懸濁液1.0mlを加えて37℃でさらに30
分間反応させ、0.5N NaOH0.5mlを加えて反応を停止させ
た。これを撹拌後、3000rpmで２分間遠心し、上清の620
nmにおける吸光度を測定してフェニトインに対する検量
線を得た。モノクローナル抗体の特異性を調べるため
に、酵素−抗体結合物溶液50μｌ、高分子化フェニトイ
ン溶液50μｌに一定濃度のフェニトインに交叉反応性物
質を種々の濃度で添加した溶液50μｌを加え、37℃で20
分間反応させた。その後の操作は検量線を求めた時と同
じ条件で行なった。交叉反応性物質を添加した溶液の測
定値を添加しなかった溶液の測定値と比較して交叉反応
％を算出した。
2.結果 ２−１ハイブリドーマ細胞株の確立 表１に、上記操作において得られた、コロニーが増殖
しているウェルの数、融合頻度（％）、抗フェニトイン
抗体産生ウェル数及びｍ−HPPHに10％以下の抗体を産生
しているウェルの数を示す。表１に示すように、融合
後、ほぼ100％の融合頻度（HAT選択培地で融合細胞のコ
ロニーが存在するウェルの比率）が規則的に得られた。
約20回の融合操作を行ない、7680個のウェルをスクリー
ニングした結果、抗フェニトイン抗体を産生し、かつｍ
−HPPHに対する交叉反応性が10％以下の抗体を産生して
いるハイブリドーマが１つだけ得られ、これをハイブリ
ドーマPHT16−17と命名し、そのモノクローナル抗体を
モノクローナル抗体PHT16−17と命名した。ハイブリド
ーマPHT16−17は工業技術院微生物工業技術研究所に寄
託されており、その受託番号は微工研菌寄第10389号で
ある。
しているウェルの数、融合頻度（％）、抗フェニトイン
抗体産生ウェル数及びｍ−HPPHに10％以下の抗体を産生
しているウェルの数を示す。表１に示すように、融合
後、ほぼ100％の融合頻度（HAT選択培地で融合細胞のコ
ロニーが存在するウェルの比率）が規則的に得られた。
約20回の融合操作を行ない、7680個のウェルをスクリー
ニングした結果、抗フェニトイン抗体を産生し、かつｍ
−HPPHに対する交叉反応性が10％以下の抗体を産生して
いるハイブリドーマが１つだけ得られ、これをハイブリ
ドーマPHT16−17と命名し、そのモノクローナル抗体を
モノクローナル抗体PHT16−17と命名した。ハイブリド
ーマPHT16−17は工業技術院微生物工業技術研究所に寄
託されており、その受託番号は微工研菌寄第10389号で
ある。
２−２フェニトインに対するモノクローナル抗体PHT16
−17の性質 ２−２−１免疫グロブリンサブクラス PHT16−17はIgG1免疫グロブリンでありＬ鎖はｋ型で
ある。
−17の性質 ２−２−１免疫グロブリンサブクラス PHT16−17はIgG1免疫グロブリンでありＬ鎖はｋ型で
ある。
２−２−２フェニトインに対する親和性 上記１−９−２の方法により調べたフェニトインに対
する親和性を図１に示す。図１には対照としての市販の
エミットモノクローナル抗体についての結果も示されて
いる。図１から明らかなように、PTH16−17は、フェニ
トインの50％結合濃度が約0.5x10-1μg/ml以下であり、
これは市販のエミットモノクローナル抗体の親和性の10
倍以上である。イムノリサーチ社製の市販の抗フェニト
インモノクローナル抗体についての結果もエミット抗体
とほぼ同じであった。
する親和性を図１に示す。図１には対照としての市販の
エミットモノクローナル抗体についての結果も示されて
いる。図１から明らかなように、PTH16−17は、フェニ
トインの50％結合濃度が約0.5x10-1μg/ml以下であり、
これは市販のエミットモノクローナル抗体の親和性の10
倍以上である。イムノリサーチ社製の市販の抗フェニト
インモノクローナル抗体についての結果もエミット抗体
とほぼ同じであった。
２−２−３特異性 上記１−９−３に記載した方法により調べた、PHT16
−17及びエミットモノクローナル抗体の各種物質に対す
る交叉反応性を表２に示す。表２に示されるように、本
発明のモノクローナル抗体であるPHT16−17の交叉反応
性は低く、すなわち、特異性が高く、特にｐ−HPPH及び
ｍ−HPPH、とりわけｍ−HPPHに対する交叉反応性が従来
の抗フェニトインモノクローナル抗体よりもはるかに小
さい。
−17及びエミットモノクローナル抗体の各種物質に対す
る交叉反応性を表２に示す。表２に示されるように、本
発明のモノクローナル抗体であるPHT16−17の交叉反応
性は低く、すなわち、特異性が高く、特にｐ−HPPH及び
ｍ−HPPH、とりわけｍ−HPPHに対する交叉反応性が従来
の抗フェニトインモノクローナル抗体よりもはるかに小
さい。
２−２−４ホモジニアスEIA １−10に記載したホモジニアスEIAの結果を表３並び
に図２及び図３に示す。図２にはPHT16−17を用いた検
量線が示されており、フェニトインの濃度に依存して吸
光度が変化しており、この方法により免疫分析が可能で
あることがわかる。また、表３に示す結果は表２に示す
RIA法の結果とほぼ同一である。また、図３にはエミッ
トフェニトインキットとこのホモジニアスEIA法との結
果の相関図が示されており、ほぼ1:1に対応している。
これらのことから、PHT16−17を用いたホモジニアスEIA
法により、精度良くフェニトインを免疫分析できること
がわかる。
に図２及び図３に示す。図２にはPHT16−17を用いた検
量線が示されており、フェニトインの濃度に依存して吸
光度が変化しており、この方法により免疫分析が可能で
あることがわかる。また、表３に示す結果は表２に示す
RIA法の結果とほぼ同一である。また、図３にはエミッ
トフェニトインキットとこのホモジニアスEIA法との結
果の相関図が示されており、ほぼ1:1に対応している。
これらのことから、PHT16−17を用いたホモジニアスEIA
法により、精度良くフェニトインを免疫分析できること
がわかる。
図１は本発明のモノクローナル抗体及び従来の市販のモ
ノクローナル抗体のフェニトインに対する親和性を示す
図、 図２は本発明のモノクローナル抗体を用いたホモジニア
スEIAの検量線を示す図、及び 図３は本発明のモノクローナル抗体を用いたホモジニア
スEIAの結果と従来の抗フェニトインモノクローナル抗
体キットを用いたEIAの結果の相関図を示す。
ノクローナル抗体のフェニトインに対する親和性を示す
図、 図２は本発明のモノクローナル抗体を用いたホモジニア
スEIAの検量線を示す図、及び 図３は本発明のモノクローナル抗体を用いたホモジニア
スEIAの結果と従来の抗フェニトインモノクローナル抗
体キットを用いたEIAの結果の相関図を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｂ 33/577 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (56)参考文献 ＦＥＤ．ＰＲＯＣ．46［３］ （1987） Ｐ．709 Ｉｎｔ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍ ａｃ．９［３］ （1987） Ｐ．391− 399 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (2)
- 【請求項１】フェニトインの50％結合濃度が10-1μg/ml
以下であり、ｐ−ヒドロキシジフェニルヒダントインに
対する交叉反応性が２％未満であり、ｍ−ヒドロキシジ
フェニルヒダントインに対する交叉反応性が10％未満で
あり、エチルフェニルヒダントインに対する交叉反応性
が１％未満であり、フェノバルビタールに対する交叉反
応性が１％未満であり、ハイブリドーマPHT16−17（FER
M P−10389）により産生される抗フェニトインモノクロ
ーナル抗体。 - 【請求項２】請求項１記載のモノクローナル抗体を産生
するハイブリドーマPHT16−17（FERM P−10389）。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63291632A JP2775445B2 (ja) | 1988-11-18 | 1988-11-18 | 抗フェニトインモノクローナル抗体及びそれを産生するハイブリドーマ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63291632A JP2775445B2 (ja) | 1988-11-18 | 1988-11-18 | 抗フェニトインモノクローナル抗体及びそれを産生するハイブリドーマ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02138992A JPH02138992A (ja) | 1990-05-28 |
| JP2775445B2 true JP2775445B2 (ja) | 1998-07-16 |
Family
ID=17771469
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63291632A Expired - Fee Related JP2775445B2 (ja) | 1988-11-18 | 1988-11-18 | 抗フェニトインモノクローナル抗体及びそれを産生するハイブリドーマ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2775445B2 (ja) |
-
1988
- 1988-11-18 JP JP63291632A patent/JP2775445B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| ＦＥＤ．ＰＲＯＣ．４６［３］ （１９８７） Ｐ．７０９ |
| Ｉｎｔ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃ．９［３］ （１９８７） Ｐ．３９１−３９９ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH02138992A (ja) | 1990-05-28 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |