JP2840852B2 - Ｃ反応性蛋白質に対するモノクローナル坑体 - Google Patents
Ｃ反応性蛋白質に対するモノクローナル坑体Info
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- JP2840852B2 JP2840852B2 JP1103471A JP10347189A JP2840852B2 JP 2840852 B2 JP2840852 B2 JP 2840852B2 JP 1103471 A JP1103471 A JP 1103471A JP 10347189 A JP10347189 A JP 10347189A JP 2840852 B2 JP2840852 B2 JP 2840852B2
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
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- C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 この発明は、Ｃ反応性蛋白質と特異的に反応する新規
モノクローナル抗体、そのモノクローナル抗体を分泌す
るハイブリドーマ細胞、およびそのモノクローナル抗体
を用いる免疫定量法に関する。
モノクローナル抗体、そのモノクローナル抗体を分泌す
るハイブリドーマ細胞、およびそのモノクローナル抗体
を用いる免疫定量法に関する。
Ｃ反応性蛋白質（略称CRP）は急性期蛋白質の一種で
あって、組織破壊を伴うような炎症性疾患等の際には血
中濃度が急増するが、正常人血中には微量（１μg/ml以
下）しか認められないので、各種の化膿症やリウマチ性
疾患等の診断に広く利用されている。このCRPは、第１
図に示すように、５つの円盤状サブユニット（分子量約
21,000）からなる５量体であり、CRPに対するモノクロ
ーナル抗体としては既に２種類のものが作製されている
（The Journal of Immunology,vol 131,2411−2415）。
すなわち、円盤状サブユニットの円形上面（第１図のＡ
面：以下単にＡ面と称することがある）には特異的に反
応するが円盤状サブユニットの円形底面（第１図のＢ
面：以下単にＢ面と称することがある）には反応しない
モノクローナル抗体、及び円盤状サブユニットの円形底
面（Ｂ面）には特異的に反応するが円盤状サブユニット
の円形上面（Ａ面）とは反応しないモノクローナル抗体
である。しかしながら、前者のモノクローナル抗体又は
後者のモノクローナル抗体のいずれか一方を不溶性担持
体に結合させてからCRP含有試料と混合しても凝集反応
を起こさない。従って、上記の公知モノクローナル抗体
を用いてCRPを定量する場合には、両方のモノクローナ
ル抗体を利用したサンドイッチアッセイ等を用いること
が必要であった。
あって、組織破壊を伴うような炎症性疾患等の際には血
中濃度が急増するが、正常人血中には微量（１μg/ml以
下）しか認められないので、各種の化膿症やリウマチ性
疾患等の診断に広く利用されている。このCRPは、第１
図に示すように、５つの円盤状サブユニット（分子量約
21,000）からなる５量体であり、CRPに対するモノクロ
ーナル抗体としては既に２種類のものが作製されている
（The Journal of Immunology,vol 131,2411−2415）。
すなわち、円盤状サブユニットの円形上面（第１図のＡ
面：以下単にＡ面と称することがある）には特異的に反
応するが円盤状サブユニットの円形底面（第１図のＢ
面：以下単にＢ面と称することがある）には反応しない
モノクローナル抗体、及び円盤状サブユニットの円形底
面（Ｂ面）には特異的に反応するが円盤状サブユニット
の円形上面（Ａ面）とは反応しないモノクローナル抗体
である。しかしながら、前者のモノクローナル抗体又は
後者のモノクローナル抗体のいずれか一方を不溶性担持
体に結合させてからCRP含有試料と混合しても凝集反応
を起こさない。従って、上記の公知モノクローナル抗体
を用いてCRPを定量する場合には、両方のモノクローナ
ル抗体を利用したサンドイッチアッセイ等を用いること
が必要であった。
本発明者は、１種類のモノクローナル抗体だけを用い
てCRPと凝集反応を起こさせることを目標にして研究を
行ったところ、従来公知のモノクローナル抗体とは別異
の部分でCRPの円盤状サブユニットと特異的に反応する
新規モノクローナル抗体を見出し、このモノクローナル
抗体が前記の目的を達成することを見出した。従って、
本発明の目的は、前記の新規モノクローナル抗体、その
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞、及
びそのモノクローナル抗体を用いる免疫定量法を提供す
ることである。
てCRPと凝集反応を起こさせることを目標にして研究を
行ったところ、従来公知のモノクローナル抗体とは別異
の部分でCRPの円盤状サブユニットと特異的に反応する
新規モノクローナル抗体を見出し、このモノクローナル
抗体が前記の目的を達成することを見出した。従って、
本発明の目的は、前記の新規モノクローナル抗体、その
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞、及
びそのモノクローナル抗体を用いる免疫定量法を提供す
ることである。
前記の目的は、本発明により、Ｃ反応性蛋白質（CR
P）の側面に特異的に反応するモノクローナル抗体、す
なわち、Ｃ反応性蛋白質（CRP）において円盤状サブユ
ニットの側面（第１図のＣ面：以下単にＣ面と称するこ
とがある）に特異的に反応するモノクローナル抗体によ
って達成される。
P）の側面に特異的に反応するモノクローナル抗体、す
なわち、Ｃ反応性蛋白質（CRP）において円盤状サブユ
ニットの側面（第１図のＣ面：以下単にＣ面と称するこ
とがある）に特異的に反応するモノクローナル抗体によ
って達成される。
更に前記の目的は、本発明により、不溶性担体に固定
させることにより、Ｃ反応性蛋白質（CRP）との間で抗
原抗体反応に基づく凝集反応を起すことのできるモノク
ローナル抗体によって達成することができる。CRPの側
面に特異的に反応する前記のモノクローナル抗体は、こ
れを不溶性担体に固定させるとCRPとの間で凝集反応を
起こすことができる。
させることにより、Ｃ反応性蛋白質（CRP）との間で抗
原抗体反応に基づく凝集反応を起すことのできるモノク
ローナル抗体によって達成することができる。CRPの側
面に特異的に反応する前記のモノクローナル抗体は、こ
れを不溶性担体に固定させるとCRPとの間で凝集反応を
起こすことができる。
更に本発明は、Ｃ反応性蛋白質（CRP）で免疫したマ
ウスの脾臓細胞とマウスのミエローマ細胞との融合によ
って形成され、Ｃ反応性蛋白質（CRP）の側面に特異性
に反応するモノクローナル抗体を分泌することを特徴と
する、ハイブリドーマ細胞にも関する。
ウスの脾臓細胞とマウスのミエローマ細胞との融合によ
って形成され、Ｃ反応性蛋白質（CRP）の側面に特異性
に反応するモノクローナル抗体を分泌することを特徴と
する、ハイブリドーマ細胞にも関する。
更に本発明はＣ反応性蛋白質（CRP）の側面に特異的
に反応するモノクローナル抗体を用いることを特徴とす
る、血漿中のＣ反応性蛋白質（CRP）の免疫定量法にも
関する。
に反応するモノクローナル抗体を用いることを特徴とす
る、血漿中のＣ反応性蛋白質（CRP）の免疫定量法にも
関する。
以下、本発明を詳細に説明する。
CRPに対するモノクローナル抗体である本発明による
抗CRPモノクローナル抗体は、新規なマウス・ハイブリ
ドーマ細胞をイン・ビトロ（例えば培地中）またはイン
・ビボ（例えばマウスの腹腔内）で培養することによっ
て製造することができる。
抗CRPモノクローナル抗体は、新規なマウス・ハイブリ
ドーマ細胞をイン・ビトロ（例えば培地中）またはイン
・ビボ（例えばマウスの腹腔内）で培養することによっ
て製造することができる。
ここで用いるマウス・ハイブリドーマ細胞は、一般的
にはCRPで免疫したマウスの脾臓細胞とマウスのミエロ
ーマ細胞（骨髄腫細胞）とを、KohlerおよびMilsteinの
方法〔Nature、第256巻495頁（1975年）参照〕により細
胞融合して製造することが可能である。
にはCRPで免疫したマウスの脾臓細胞とマウスのミエロ
ーマ細胞（骨髄腫細胞）とを、KohlerおよびMilsteinの
方法〔Nature、第256巻495頁（1975年）参照〕により細
胞融合して製造することが可能である。
また、上記のハイブリドーマ細胞を培養する培地とし
ては、ハイブリドーマ細胞の培養に適した任意の培地を
用いることができ、好適にはダルベッコ氏変法イーグル
氏培地（Dulbecco's modified Eeagle's medium:以下DM
Eと記す。）にウシ胎児血清、Ｌ−グルタミン、Ｌ−ピ
ルビン酸および抗生物質（ペニシリンＧとストレプトマ
イシン）を含む培地が用いられる。
ては、ハイブリドーマ細胞の培養に適した任意の培地を
用いることができ、好適にはダルベッコ氏変法イーグル
氏培地（Dulbecco's modified Eeagle's medium:以下DM
Eと記す。）にウシ胎児血清、Ｌ−グルタミン、Ｌ−ピ
ルビン酸および抗生物質（ペニシリンＧとストレプトマ
イシン）を含む培地が用いられる。
上記のハイブリドーマ細胞の培養は、イン・ビトロの
場合には例えば培地中で５％CO2濃度および37℃で約３
日間、またイン・ビボ例えばマウスの腹腔内で培養する
場合には約14日間実施する。
場合には例えば培地中で５％CO2濃度および37℃で約３
日間、またイン・ビボ例えばマウスの腹腔内で培養する
場合には約14日間実施する。
このようにして製造された培養液またはマウスの腹水
からモノクローナル抗体を分離、精製する場合には、蛋
白質の単離、精製に一般的に用いられる方法を用いるこ
とが可能である。そのような方法としては、硫安塩析、
イオン交換クロマトグラフィー、分子篩ゲルを用いる分
子篩カラムクロマトグラフィー、プロテインＡ結合多糖
類を用いる親和性カラムクロマトグラフィー、透析、凍
結乾燥の方法等がある。
からモノクローナル抗体を分離、精製する場合には、蛋
白質の単離、精製に一般的に用いられる方法を用いるこ
とが可能である。そのような方法としては、硫安塩析、
イオン交換クロマトグラフィー、分子篩ゲルを用いる分
子篩カラムクロマトグラフィー、プロテインＡ結合多糖
類を用いる親和性カラムクロマトグラフィー、透析、凍
結乾燥の方法等がある。
このようにして得られた抗CRPモノクローナル抗体
は、他の血漿蛋白とは反応しないで、CRPとだけ特異的
に結合する能力を有する。しかも、この発明による抗CR
Pモノクローナル抗体は円盤状サブユニットの円形上面
（Ａ面）又は円形底面（Ｂ面）とは反応せず、側面（Ｃ
面）とのみ特異的に反応する。更に、この抗CRPモノク
ローナル抗体は、これを不溶性担体に固定させると、CR
Pとの間で凝集反応を起こすことができるので、CRPの免
疫定量用試薬として有用である。例えば、凝集反応によ
るCRP定量法はこの発明による抗CRPモノクローナル抗体
１種類のみを用い、これを公知の化学結合法（架橋剤と
してカルボジイミド、グルタルアルデヒド等を用いる）
又は物理吸着法によって、通常用いる不溶性担体〔例え
ばラテックス（例えばポリスチレンラテックス粒子）〕
に結合させて複合体を形成する。この抗CRPモノクロー
ナル抗体結合不溶性担体複合体の既知一定量と未知量の
CRPを含有する水性試料（例えば血清、血漿、尿）の一
定量とを、適当な反応容器例えばスライド板上あるいは
反応セル中で接触させる。こうして形成される凝集の程
度からCRP濃度の定量を行うことができる。例えばスラ
イド板の場合には目視的に、反応セルの場合は特定の波
長を用いて分光学的に凝集反応を測定し、被検試料中の
CRP濃度を定量することができる。
は、他の血漿蛋白とは反応しないで、CRPとだけ特異的
に結合する能力を有する。しかも、この発明による抗CR
Pモノクローナル抗体は円盤状サブユニットの円形上面
（Ａ面）又は円形底面（Ｂ面）とは反応せず、側面（Ｃ
面）とのみ特異的に反応する。更に、この抗CRPモノク
ローナル抗体は、これを不溶性担体に固定させると、CR
Pとの間で凝集反応を起こすことができるので、CRPの免
疫定量用試薬として有用である。例えば、凝集反応によ
るCRP定量法はこの発明による抗CRPモノクローナル抗体
１種類のみを用い、これを公知の化学結合法（架橋剤と
してカルボジイミド、グルタルアルデヒド等を用いる）
又は物理吸着法によって、通常用いる不溶性担体〔例え
ばラテックス（例えばポリスチレンラテックス粒子）〕
に結合させて複合体を形成する。この抗CRPモノクロー
ナル抗体結合不溶性担体複合体の既知一定量と未知量の
CRPを含有する水性試料（例えば血清、血漿、尿）の一
定量とを、適当な反応容器例えばスライド板上あるいは
反応セル中で接触させる。こうして形成される凝集の程
度からCRP濃度の定量を行うことができる。例えばスラ
イド板の場合には目視的に、反応セルの場合は特定の波
長を用いて分光学的に凝集反応を測定し、被検試料中の
CRP濃度を定量することができる。
また、この発明の抗CRPモノクローナル抗体と別異の
抗CRPモノクローナル抗体（例えば円盤上サブユニット
の円形上面又は円形底面と特異的に反応するモノクロー
ナル抗体）とを用いて各種のCRP含有水性試料の免疫定
量法を実施することができる。
抗CRPモノクローナル抗体（例えば円盤上サブユニット
の円形上面又は円形底面と特異的に反応するモノクロー
ナル抗体）とを用いて各種のCRP含有水性試料の免疫定
量法を実施することができる。
次に、この発明を実施例により更に詳細に説明する
が、この発明は以下の実施例によって限定されるもので
はない。
が、この発明は以下の実施例によって限定されるもので
はない。
実施例１ （ａ）免疫化した脾臓細胞の調製： CRP免疫原溶液〔ペルフリーズ社（米国）〕（A280nm
＝0.1）を等量のフロインド氏完全アジュバントと乳化
するまで混合し、その混合液200μをマウス腹腔内に
投与することにより免疫を行なった（第１回免疫）。30
日経過後、該マウスに上記と同様の混合液200μをマ
ウス腹腔内に投与した（第２回免疫）。第２回免疫から
21日経過後、CRP免疫原溶液（A280nm＝0.1）を等量の生
理食塩水で希釈し、その希釈液200μを、該マウスの
静脈内に投与した（最終免疫）。最終免疫から３日経過
後、脾臓を無菌的にマウスから取り出し、次の細胞融合
工程に使用した。
＝0.1）を等量のフロインド氏完全アジュバントと乳化
するまで混合し、その混合液200μをマウス腹腔内に
投与することにより免疫を行なった（第１回免疫）。30
日経過後、該マウスに上記と同様の混合液200μをマ
ウス腹腔内に投与した（第２回免疫）。第２回免疫から
21日経過後、CRP免疫原溶液（A280nm＝0.1）を等量の生
理食塩水で希釈し、その希釈液200μを、該マウスの
静脈内に投与した（最終免疫）。最終免疫から３日経過
後、脾臓を無菌的にマウスから取り出し、次の細胞融合
工程に使用した。
（ｂ）細胞融合： 無菌的に摘出した上記の脾臓を、15％ウシ胎児血清を
含むDME培地5mlを入れたシャーレに入れた。次に、脾臓
を15％ウシ胎児血清を含むDME培地約15mlで還流して脾
臓細胞を流出させた後、この脾臓細胞懸濁液をナイロン
メッシュに通した。この脾臓細胞を50ml遠心チューブに
集め、500×ｇで10分間遠心した。こうして得たペレッ
トにヘモライジング溶液（155mM NH4Cl,10mMKHCO3,1mM
Na2EDTA pH 7.0）4mlを加え、懸濁させた。０℃で５分
間放置して懸濁液中の赤血球を破壊させた。15％ウシ胎
児血清10mlを含むDME培地を加えてから遠心分離した。
こうして得た細胞ペレットをDME培地で遠心法によって
洗浄し、生きている脾臓細胞数を測定した。
含むDME培地5mlを入れたシャーレに入れた。次に、脾臓
を15％ウシ胎児血清を含むDME培地約15mlで還流して脾
臓細胞を流出させた後、この脾臓細胞懸濁液をナイロン
メッシュに通した。この脾臓細胞を50ml遠心チューブに
集め、500×ｇで10分間遠心した。こうして得たペレッ
トにヘモライジング溶液（155mM NH4Cl,10mMKHCO3,1mM
Na2EDTA pH 7.0）4mlを加え、懸濁させた。０℃で５分
間放置して懸濁液中の赤血球を破壊させた。15％ウシ胎
児血清10mlを含むDME培地を加えてから遠心分離した。
こうして得た細胞ペレットをDME培地で遠心法によって
洗浄し、生きている脾臓細胞数を測定した。
一方、予め培養しておいたマウスミエローマ細胞（骨
髄腫細胞）SP 2/0−Ag14（理化学研究所ジーンバンク細
胞銀行）約２×177個に上記脾臓細胞１×108個を加え、
DME培地中でよく混合し、遠心分離を行なった（500×
ｇ、10分間）。その上清を吸引し、ペレットをよく解き
ほぐし、40％ポリエチレングリコール4000溶液（38℃に
保温）0.5mlを滴下し、遠心チューブを手で１分間穏や
かに回転することによってポリエチレングリコール溶液
と細胞ペレットを混合させた。次に38℃に保温しておい
たDME培地を30秒毎に1ml加えて、チューブを穏やかに回
転させた。この操作を10回繰返した後、15％ウシ胎児血
清20mlを含むDME培地を加えて、遠心分離（500×ｇ、10
分間）を行なった。上清を除去した後、細胞ペレットを
15％ウシ胎児血清を含むHAT培地（DME培地にアミノプテ
リン４×10-7M、チミジン1.6×10-5M、ヒポキサンチン
１×10-4Mになるように添加したもの）で、遠心法によ
って２回洗浄後、40mlの上記HAT培地に懸濁した。この
細胞懸濁液を96ウエル細胞培養プレートの各ウエルに20
0μずつ分注し、37℃、５％炭酸ガスを含む炭酸ガス
培養器で培養を開始した。培養中、２〜３日間隔で各ウ
エルの培地を約100μ除き、新たに上記のHAT培地100
μを加えることによりHAT培地中で増殖するハイブリ
ドーマを選択した。８日目から15％ウシ胎児血清を含む
HAT培地（DME培地にチミジン1.6×10-5M、ヒポキサンチ
ン１×10-4Mになるように添加したもの）に交換し、ハ
イブリドーマの増殖を観察するとともに、10日目に、下
述のELISA法により、CRP抗体産生ハイブリドーマをスク
リーニングした。
髄腫細胞）SP 2/0−Ag14（理化学研究所ジーンバンク細
胞銀行）約２×177個に上記脾臓細胞１×108個を加え、
DME培地中でよく混合し、遠心分離を行なった（500×
ｇ、10分間）。その上清を吸引し、ペレットをよく解き
ほぐし、40％ポリエチレングリコール4000溶液（38℃に
保温）0.5mlを滴下し、遠心チューブを手で１分間穏や
かに回転することによってポリエチレングリコール溶液
と細胞ペレットを混合させた。次に38℃に保温しておい
たDME培地を30秒毎に1ml加えて、チューブを穏やかに回
転させた。この操作を10回繰返した後、15％ウシ胎児血
清20mlを含むDME培地を加えて、遠心分離（500×ｇ、10
分間）を行なった。上清を除去した後、細胞ペレットを
15％ウシ胎児血清を含むHAT培地（DME培地にアミノプテ
リン４×10-7M、チミジン1.6×10-5M、ヒポキサンチン
１×10-4Mになるように添加したもの）で、遠心法によ
って２回洗浄後、40mlの上記HAT培地に懸濁した。この
細胞懸濁液を96ウエル細胞培養プレートの各ウエルに20
0μずつ分注し、37℃、５％炭酸ガスを含む炭酸ガス
培養器で培養を開始した。培養中、２〜３日間隔で各ウ
エルの培地を約100μ除き、新たに上記のHAT培地100
μを加えることによりHAT培地中で増殖するハイブリ
ドーマを選択した。８日目から15％ウシ胎児血清を含む
HAT培地（DME培地にチミジン1.6×10-5M、ヒポキサンチ
ン１×10-4Mになるように添加したもの）に交換し、ハ
イブリドーマの増殖を観察するとともに、10日目に、下
述のELISA法により、CRP抗体産生ハイブリドーマをスク
リーニングした。
（ｃ）ハイブリドーマの樹立 ハイブリドーマ培養上清中の生産抗体の有無はELISA
法により測定した。96ウエルELISA用プレート（Immulon
II、日本ダイナテック株式会社）の各ウエルに、前述の
CRP免疫原溶液（A280nm＝0.05、生理食塩水で希釈し
た）50μずつを分注し、25℃で２時間放置した。次
に、0.05％Tween20−生理食水で３回洗浄した後、各ウ
エルに培養上清50μを加え、25℃で１時間反応させ
た。
法により測定した。96ウエルELISA用プレート（Immulon
II、日本ダイナテック株式会社）の各ウエルに、前述の
CRP免疫原溶液（A280nm＝0.05、生理食塩水で希釈し
た）50μずつを分注し、25℃で２時間放置した。次
に、0.05％Tween20−生理食水で３回洗浄した後、各ウ
エルに培養上清50μを加え、25℃で１時間反応させ
た。
次に、Tween20−生理食塩水で200培希釈したペルオキ
シターゼ結合抗マウス抗体（ダコ社、デンマーク）50μ
を各ウエルに加えた。反応終了後、0.05％Tween20−
生理食塩水で各ウエルを３回洗浄し、0.5mMアミノアン
チピリン、10mMフェルール及び0.005％過酸化水素水を
含む溶液250μを各ウエルに加え、25℃で30分間反応
させ、各ウエルの490nmにおける吸光度を測定した。そ
の結果、192ウエル中４ウエルに抗体産生が認められ
た。その４ウエルの中の各ハイブリドーマを24ウエルプ
レートに写し、15％ウシ胎児血清を含むHT培地で４〜５
日間培養した。その後、再度ELISA法によって抗CPR抗体
の産生の有無を確認してから限界希釈法によりクローニ
ングした。限界希釈法は、HT培地でハイブリドーマが５
個/mlとなるように希釈した細胞浮遊液を、予め正常BAL
B/C系マウスの腹腔細胞がウエルあたり２×104個分注し
てある96ウエルプレートの各ウエルに100μずつ分注
した。10日後、ELISA法によって抗CRP特異的抗体を産生
するハイブリドーマのクローンをスクリーニングした。
その結果、各ハイブリドーマにつき、20〜40個の抗体産
生クローンが得られた。これらのクローンの中から、増
殖のよい、抗体分泌能の高い、しかも安定なクローンを
選び、前述と同様の方法で再クローン化を行い、抗CRP
特異的抗体産生ハイブリドマーCRP−1,CRP−2,CRP−３
及びCRP−４を樹立した。これらのハイブリドーマは198
9年４月13日から工業技術院微生物工業技術院に寄託さ
れている。寄託番号は以下のとおりである。
シターゼ結合抗マウス抗体（ダコ社、デンマーク）50μ
を各ウエルに加えた。反応終了後、0.05％Tween20−
生理食塩水で各ウエルを３回洗浄し、0.5mMアミノアン
チピリン、10mMフェルール及び0.005％過酸化水素水を
含む溶液250μを各ウエルに加え、25℃で30分間反応
させ、各ウエルの490nmにおける吸光度を測定した。そ
の結果、192ウエル中４ウエルに抗体産生が認められ
た。その４ウエルの中の各ハイブリドーマを24ウエルプ
レートに写し、15％ウシ胎児血清を含むHT培地で４〜５
日間培養した。その後、再度ELISA法によって抗CPR抗体
の産生の有無を確認してから限界希釈法によりクローニ
ングした。限界希釈法は、HT培地でハイブリドーマが５
個/mlとなるように希釈した細胞浮遊液を、予め正常BAL
B/C系マウスの腹腔細胞がウエルあたり２×104個分注し
てある96ウエルプレートの各ウエルに100μずつ分注
した。10日後、ELISA法によって抗CRP特異的抗体を産生
するハイブリドーマのクローンをスクリーニングした。
その結果、各ハイブリドーマにつき、20〜40個の抗体産
生クローンが得られた。これらのクローンの中から、増
殖のよい、抗体分泌能の高い、しかも安定なクローンを
選び、前述と同様の方法で再クローン化を行い、抗CRP
特異的抗体産生ハイブリドマーCRP−1,CRP−2,CRP−３
及びCRP−４を樹立した。これらのハイブリドーマは198
9年４月13日から工業技術院微生物工業技術院に寄託さ
れている。寄託番号は以下のとおりである。
ハイブリドーマ 寄 託 番 号 CRP−１ 微工研菌寄第10661号(FERM P−10661) CRP−２ 微工研菌寄第10662号(FERM P−10662) CRP−３ 微工研菌寄第10663号(FERM P−10663) CRP−４ 微工研菌寄第10664号(FERM P−10664) 実施例2:モノクローナル抗体の製造 （ａ）イン・ビトロ法 マウスハイブリドーマCRP−1,CRP−2,CRP−３及びCRP
−４を、それぞれ15％ウシ胎児血清を含むDME培地中で3
7℃、５％二酸化炭素雰囲気中において72時間〜96時間
培養した。培養物を遠心分離（1000×ｇ、10分）後、上
清に固形の硫酸アンモニウムを50％最終濃度となるよう
に徐々に加えた。混合物を氷冷下で30分間撹拌した後、
60分間放置し、遠心分離（1000×ｇ、10分）後、得られ
た沈渣を小量の10mMリン酸緩衝液（pH8.0）に溶解し、1
000培量の10mMリン酸緩衝液に対して透析した。これ
を、10mMリン酸緩衝液ですでに平衡化したDEAE−セルロ
ースのカラムに充填した。モノクローナル抗体の溶出は
10mMリン酸緩衝液（pH8.0）と0.2M NaClを含む10mMリン
酸緩衝液（pH8.0）の間で濃度勾配法により行なった。
溶出されたモノクローナル抗体を限外濾過法で濃縮し、
0.1Mリン酸緩衝液（pH8.0）に対して透析した。ウシ血
清IgGを除くために、透析物をやぎ抗ウシ血清IgG−セフ
ァロース4Bのカラムに通した。次に通過液を0.1Mリン酸
緩衝液（pH8.0）で平衡化したプロテインＡ−セファロ
ース4Bのカラムに充填した。カラムをpH3.5の緩衝液で
溶出して、精製した抗CRP特異抗体CRP−１（同様にして
CRP−2,CRP−3,及びCRP−４）の溶液を得た。
−４を、それぞれ15％ウシ胎児血清を含むDME培地中で3
7℃、５％二酸化炭素雰囲気中において72時間〜96時間
培養した。培養物を遠心分離（1000×ｇ、10分）後、上
清に固形の硫酸アンモニウムを50％最終濃度となるよう
に徐々に加えた。混合物を氷冷下で30分間撹拌した後、
60分間放置し、遠心分離（1000×ｇ、10分）後、得られ
た沈渣を小量の10mMリン酸緩衝液（pH8.0）に溶解し、1
000培量の10mMリン酸緩衝液に対して透析した。これ
を、10mMリン酸緩衝液ですでに平衡化したDEAE−セルロ
ースのカラムに充填した。モノクローナル抗体の溶出は
10mMリン酸緩衝液（pH8.0）と0.2M NaClを含む10mMリン
酸緩衝液（pH8.0）の間で濃度勾配法により行なった。
溶出されたモノクローナル抗体を限外濾過法で濃縮し、
0.1Mリン酸緩衝液（pH8.0）に対して透析した。ウシ血
清IgGを除くために、透析物をやぎ抗ウシ血清IgG−セフ
ァロース4Bのカラムに通した。次に通過液を0.1Mリン酸
緩衝液（pH8.0）で平衡化したプロテインＡ−セファロ
ース4Bのカラムに充填した。カラムをpH3.5の緩衝液で
溶出して、精製した抗CRP特異抗体CRP−１（同様にして
CRP−2,CRP−3,及びCRP−４）の溶液を得た。
（ｂ）イン・ビボ法 プリスタン（2,6,10,14−テトラメチルペンタデカ
ン）0.5mlを10〜12週齢のBALB/C系マウスの腹腔内に投
与後14〜20日目のマウス腹腔内にインビトロで増殖させ
たハイブリドーマCRP−1,CRP−2,CRP−３又はCRP−４を
マウス一匹あたり２×106細胞となるように接種した。
ン）0.5mlを10〜12週齢のBALB/C系マウスの腹腔内に投
与後14〜20日目のマウス腹腔内にインビトロで増殖させ
たハイブリドーマCRP−1,CRP−2,CRP−３又はCRP−４を
マウス一匹あたり２×106細胞となるように接種した。
各ハイブリドーマにつき一匹のマウスから約10〜15ml
の腹水が得られた。その抗体濃度は、２〜10mg/mlであ
った。覆腹中のモノクローナル抗体の精製は、上記のイ
ンビトロ精製法と同様の方法（但し、ヤギ抗ウシ血清Ig
G−セファロース4Bのカラムを通す操作を除く）で行な
った。
の腹水が得られた。その抗体濃度は、２〜10mg/mlであ
った。覆腹中のモノクローナル抗体の精製は、上記のイ
ンビトロ精製法と同様の方法（但し、ヤギ抗ウシ血清Ig
G−セファロース4Bのカラムを通す操作を除く）で行な
った。
実施例3:モノクローナル抗体の免疫グロブリンクラス及
び特異性の同定 抗CRP特異モノクローナル抗体CRP−1,CRP−2,CRP−３
及びCRP−４の免疫グロブリン・クラス及び特異性の同
定はそれぞれオクテロニー免疫拡散法及びエンザイムノ
アッセイ法により行った。結果は表１に示す通りであ
る。
び特異性の同定 抗CRP特異モノクローナル抗体CRP−1,CRP−2,CRP−３
及びCRP−４の免疫グロブリン・クラス及び特異性の同
定はそれぞれオクテロニー免疫拡散法及びエンザイムノ
アッセイ法により行った。結果は表１に示す通りであ
る。
実施例4:抗体と不溶性担体（ラテックス）との結合及び
反応部位の確認 ラテックス溶液（２％、Dow Chemical社：粒径0.482
μｍ）2mlと、CRP−１抗体2.0mg/mlを含有する水溶液2m
lとを混合し、約１時間撹拌した。遠心後（20,000g、10
分間）、沈殿を0.1％BSA溶液に懸濁し、約１時間撹拌し
た。再び遠心（20,000g、10分間）した後、沈殿を水に
懸濁し、約２時間撹拌した。こうして、CRP−１抗体−
ラテックス複合体含有液を得た。同様にしてCRP−２抗
体、CRP−３抗体及びCRP−４抗体を用いて複合体含有液
を調製した。
反応部位の確認 ラテックス溶液（２％、Dow Chemical社：粒径0.482
μｍ）2mlと、CRP−１抗体2.0mg/mlを含有する水溶液2m
lとを混合し、約１時間撹拌した。遠心後（20,000g、10
分間）、沈殿を0.1％BSA溶液に懸濁し、約１時間撹拌し
た。再び遠心（20,000g、10分間）した後、沈殿を水に
懸濁し、約２時間撹拌した。こうして、CRP−１抗体−
ラテックス複合体含有液を得た。同様にしてCRP−２抗
体、CRP−３抗体及びCRP−４抗体を用いて複合体含有液
を調製した。
それとは別に、前述のThe Journal of Immunology（V
ol 131,2411−2415）に準じて、CRPのＡ面に特異的に反
応し、Ｂ面とは反応しないモノクローナル抗体（Ａ抗
体）及びCRPのＢ面に特異的に反応し、Ａ面とは反応し
ないモノクローナル抗体（Ｂ抗体）を調製し、上記操作
と同様にして複合体含有液を得た。
ol 131,2411−2415）に準じて、CRPのＡ面に特異的に反
応し、Ｂ面とは反応しないモノクローナル抗体（Ａ抗
体）及びCRPのＢ面に特異的に反応し、Ａ面とは反応し
ないモノクローナル抗体（Ｂ抗体）を調製し、上記操作
と同様にして複合体含有液を得た。
これら複合体含有液30μと、20μg/mlのCRP含有量3
0μとをスライドガラス上で混合し、凝集像を目視的
に観察した。その結果、Ａ抗体及びＢ抗体においては凝
集は認められず、それに対して本発明のCRP−1,2,3及び
４の各抗体においては凝集が確認された。本発明のCRP
−1,2,3及び４抗体は、従来のＡ面にのみ特異的な抗体
及びＢ面にのみ特異的な抗体とは、明らかに異る性質で
あることがわかる。
0μとをスライドガラス上で混合し、凝集像を目視的
に観察した。その結果、Ａ抗体及びＢ抗体においては凝
集は認められず、それに対して本発明のCRP−1,2,3及び
４の各抗体においては凝集が確認された。本発明のCRP
−1,2,3及び４抗体は、従来のＡ面にのみ特異的な抗体
及びＢ面にのみ特異的な抗体とは、明らかに異る性質で
あることがわかる。
そこでCRPのＡ面を対応する抗体でマスキングしたCRP
20μg/ml含有液、及びCRPのＢ面を対応する抗体でマス
キングしたCRP20μg/ml含有液を調製し、これらの液30
μに、上記の抗体複合体含有液30μを加え、スライ
ドガラス上で混合したところ、本発明によるCRP−1,2,3
及び４各抗体において、凝集が確認された。このこと
は、本発明の各抗体の特異的反応部位が、CRPのＡ面、
及びＢ面とは異なる部位であること、又、本発明の各抗
体複合体において、CRPとの反応により凝集を示すこと
から、本抗体は、CRPの側面部位に特異的に反応してい
ることを示唆するものである。
20μg/ml含有液、及びCRPのＢ面を対応する抗体でマス
キングしたCRP20μg/ml含有液を調製し、これらの液30
μに、上記の抗体複合体含有液30μを加え、スライ
ドガラス上で混合したところ、本発明によるCRP−1,2,3
及び４各抗体において、凝集が確認された。このこと
は、本発明の各抗体の特異的反応部位が、CRPのＡ面、
及びＢ面とは異なる部位であること、又、本発明の各抗
体複合体において、CRPとの反応により凝集を示すこと
から、本抗体は、CRPの側面部位に特異的に反応してい
ることを示唆するものである。
実施例5:スライド凝集反応による定量 実施例４で調製した抗体−ラテックス複合体含有液30
μと種々な濃度のCRPを含有する水溶液30μとをス
ライドガラス上で混合し、揺動して３分後に凝集像を目
視的に判定した。結果を以下の表２に示す。
μと種々な濃度のCRPを含有する水溶液30μとをス
ライドガラス上で混合し、揺動して３分後に凝集像を目
視的に判定した。結果を以下の表２に示す。
表２においては＋は凝集ありを、そして−は凝集なし
を各々意味する。
を各々意味する。
実施例6:分光学的方法による測定 実施例４で調製したモノクローナル抗体CRP−1,CRP−
2,CRP−３及びCRP−４で感作したラテックス（粒径0.48
2μｍ、ダウ社、ドイツ）を用い、自動分析機（注：一
般名）（LPIA L−1:三菱化成社）によって凝集反応速度
のヒトCRP濃度依存性を調べた。ヒトCRPとしてはペルフ
リーズ社（アメリカ）から市販のものを用い、濃度0.04
μg/ml〜80μg/mlのヒトCRPを含有する12種の水溶液を
調製した。結果を第２図に示す。第２図から明らかなよ
うに、４種類のラテックスの各々は、CRP濃度に依存し
た凝集反応速度（Ｖ値：単位時間当りの透過度変化）を
示した。
2,CRP−３及びCRP−４で感作したラテックス（粒径0.48
2μｍ、ダウ社、ドイツ）を用い、自動分析機（注：一
般名）（LPIA L−1:三菱化成社）によって凝集反応速度
のヒトCRP濃度依存性を調べた。ヒトCRPとしてはペルフ
リーズ社（アメリカ）から市販のものを用い、濃度0.04
μg/ml〜80μg/mlのヒトCRPを含有する12種の水溶液を
調製した。結果を第２図に示す。第２図から明らかなよ
うに、４種類のラテックスの各々は、CRP濃度に依存し
た凝集反応速度（Ｖ値：単位時間当りの透過度変化）を
示した。
第１図はＣ反応性蛋白質（CRP）の構造を模式的に示す
説明図であり、第２図は凝集反応速度とCRP濃度との関
係を示すグラフである。
説明図であり、第２図は凝集反応速度とCRP濃度との関
係を示すグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (4)
- 【請求項１】Ｃ反応性蛋白質の側面に特異的に反応する
モノクローナル抗体。 - 【請求項２】不溶性担体に固定させることにより、Ｃ反
応性蛋白質との間で抗原抗体反応に基づく凝集反応を起
すことのできるモノクローナル抗体。 - 【請求項３】Ｃ反応性蛋白質で免疫したマウスの脾臓細
胞とマウスのミエローマ細胞との融合によって形成さ
れ、Ｃ反応性蛋白質の側面に特異的に反応するモノクロ
ーナル抗体を分泌することを特徴とする、ハイブリドー
マ細胞。 - 【請求項４】Ｃ反応性蛋白質の側面に特異的に反応する
モノクローナル抗体を用いることを特徴とする、血漿中
のＣ反応性蛋白質の免疫定量法。
Priority Applications (8)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1103471A JP2840852B2 (ja) | 1989-04-25 | 1989-04-25 | Ｃ反応性蛋白質に対するモノクローナル坑体 |
| CA002031504A CA2031504C (en) | 1989-04-25 | 1990-04-25 | Monoclonal antibodies to c-reactive protein |
| ES90906370T ES2073569T3 (es) | 1989-04-25 | 1990-04-25 | Anticuerpo monoclonal contra la proteina c reactiva. |
| AU54493/90A AU631192B2 (en) | 1989-04-25 | 1990-04-25 | Monoclonal antibody against c-reactive protein |
| DE69020315T DE69020315T2 (de) | 1989-04-25 | 1990-04-25 | Monoklonaler antikörper gegen c-reaktives protein. |
| PCT/JP1990/000538 WO1990012884A1 (fr) | 1989-04-25 | 1990-04-25 | Anticorps monoclonal inhibiteur de proteines c-reactives |
| EP90906370A EP0431171B1 (en) | 1989-04-25 | 1990-04-25 | Monoclonal antibody against c-reactive protein |
| US08/357,540 US5500345A (en) | 1989-04-25 | 1994-12-16 | Hybridomas producing monoclonal antibodies specific for C-reactive protein and methods for detection of C-reactive protein |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1103471A JP2840852B2 (ja) | 1989-04-25 | 1989-04-25 | Ｃ反応性蛋白質に対するモノクローナル坑体 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02283293A JPH02283293A (ja) | 1990-11-20 |
| JP2840852B2 true JP2840852B2 (ja) | 1998-12-24 |
Family
ID=14354924
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1103471A Expired - Lifetime JP2840852B2 (ja) | 1989-04-25 | 1989-04-25 | Ｃ反応性蛋白質に対するモノクローナル坑体 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0431171B1 (ja) |
| JP (1) | JP2840852B2 (ja) |
| AU (1) | AU631192B2 (ja) |
| CA (1) | CA2031504C (ja) |
| DE (1) | DE69020315T2 (ja) |
| ES (1) | ES2073569T3 (ja) |
| WO (1) | WO1990012884A1 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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| US8685009B2 (en) | 2011-05-16 | 2014-04-01 | Covidien Lp | Thread-like knife for tissue cutting |
| CN112574304B (zh) * | 2019-09-30 | 2022-11-04 | 东莞市朋志生物科技有限公司 | 一种抗c反应蛋白的抗体 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6236399A (ja) * | 1985-08-09 | 1987-02-17 | Nippon Baiotesuto Kenkyusho:Kk | ヒトｃｒｐの回収、精製法 |
| JPS62210984A (ja) * | 1986-03-12 | 1987-09-17 | Zenkoku Nogyo Kyodo Kumiai Rengokai | 犬のｃ−反応性蛋白に対するモノクロ−ナル抗体産生ハイブリド−マとその抗体を用いた犬ｃ−反応性蛋白の分離精製法 |
| JPS62210985A (ja) * | 1986-03-12 | 1987-09-17 | Zenkoku Nogyo Kyodo Kumiai Rengokai | 牛のｃ−反応性蛋白に対するモノクロ−ナル抗体産生ハイブリド−マとその抗体を用いた牛ｃ−反応性蛋白の分離精製法 |
| GB2218100A (en) * | 1988-03-02 | 1989-11-08 | Erling Sundrehagen | Conjugates for the detection and/or quantification of antigenic substances in body fluids |
| JPH06236399A (ja) * | 1993-02-10 | 1994-08-23 | Nec Corp | 翻訳機能付きワードプロセッサ |
-
1989
- 1989-04-25 JP JP1103471A patent/JP2840852B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1990
- 1990-04-25 ES ES90906370T patent/ES2073569T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-04-25 DE DE69020315T patent/DE69020315T2/de not_active Revoked
- 1990-04-25 EP EP90906370A patent/EP0431171B1/en not_active Revoked
- 1990-04-25 WO PCT/JP1990/000538 patent/WO1990012884A1/ja not_active Application Discontinuation
- 1990-04-25 AU AU54493/90A patent/AU631192B2/en not_active Expired
- 1990-04-25 CA CA002031504A patent/CA2031504C/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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| EP0431171B1 (en) | 1995-06-21 |
| JPH02283293A (ja) | 1990-11-20 |
| WO1990012884A1 (fr) | 1990-11-01 |
| CA2031504A1 (en) | 1990-10-26 |
| ES2073569T3 (es) | 1995-08-16 |
| CA2031504C (en) | 2000-01-25 |
| AU631192B2 (en) | 1992-11-19 |
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| AU5449390A (en) | 1990-11-16 |
| DE69020315D1 (de) | 1995-07-27 |
| EP0431171A1 (en) | 1991-06-12 |
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