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JPH09294584A - ヒト腫瘍壊死因子に対するモノクロナール抗体 - Google Patents

ヒト腫瘍壊死因子に対するモノクロナール抗体

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JPH09294584A
JPH09294584A JP8349507A JP34950796A JPH09294584A JP H09294584 A JPH09294584 A JP H09294584A JP 8349507 A JP8349507 A JP 8349507A JP 34950796 A JP34950796 A JP 34950796A JP H09294584 A JPH09294584 A JP H09294584A
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 新規ヒト腫瘍壊死因子に対するモノクロナー
ル抗体。 【解決手段】 ハイブリッドセルラインＥＣＡＣＣ８７
０５０８０１から生産され、かつその重鎖がサブタイプ
ＩｇＧγ−３を示すことを特徴とする、天然及び／又は
組換えヒト腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）と反応するモノクロ
ナール抗体の提供。 【効果】 敗血症用薬及びリューマチ性疾患用薬として
の使用。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ヒト腫瘍壊死因子
（ＴＮＦ）に対して特異性の高いモノクロナール抗体
（ｍＡｂ）を合成する雑種細胞系、ＴＮＦに対するモノ
クロナール抗体、この雑種細胞系及び抗体の製法、なら
びにこのモノクロナール抗体の使用に関する。
【０００２】
【従来の技術】マウス骨髄腫細胞と免疫されたマウスか
らの脾臓細胞との融合（コーラー及びミルシュタイン
著、ネイチャー第２５６巻１９５７年４９５〜４９７頁
参照）により、均質な（モノクロナール）抗体を産生す
る連続的な細胞系を得ることが可能であることが初めて
示された。それ以来、種々の雑種細胞（ハイブリドーマ
と呼ばれる）を製造するため、そしてそれが産生する抗
体を種々の科学的研究に使用するための多くの試みがな
された（カレント・トピックス・イン・マイクロバイオ
ロジイ・アンド・イムノロジイ第８巻：リンホサイト・
ハイブリドーマス、シュプリンガー出版社１９７８年参
照）。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】その生物学的性質のた
め、ＴＮＦは腫瘍性疾患の興味深くかつ有望な処置剤で
あることが明らかである。天然細胞中のＴＮＦの濃度が
きわめて低いため、初期には詳細な研究は失敗に終っ
た。ヒト蛋白質を下等生物中でクローニングできる可能
性を有する遺伝子操作が開発されるまでは、ＴＮＦを微
生物中で発現させることはできなかった。高度に精製さ
れた形で、この組換えＴＮＦ（ｒＴＮＦ）は天然ＴＮＦ
（ｎＴＮＦ）と同じ効果を有する。
【０００４】科学的研究ならびに治療上の使用は、ＴＮ
Ｆの活性ばかりでなく蛋白質ＴＮＦ自体を検出すること
を必要にした。生物学的活性の測定は常に面倒で費用が
かかる。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明は、組換えヒト腫
瘍壊死因子（ＴＮＦ）により免疫されたマウスの骨髄腫
細胞と脾臓細胞との細胞融合により得られたものであ
り、そして天然及び／又は組換えＴＮＦと反応するモノ
クロナール抗体を産生する雑種細胞系から得られる天然
及び／又は組換えＴＮＦと反応する新規なモノクロナー
ル抗体である。
【０００６】本発明はさらに、細胞融合により抗体を産
生する雑種細胞系を製造し、この細胞をサブクローニン
グし、そして細胞が生長したのち、抗ヒト腫瘍壊死因子
特異性を有するモノクロナール抗体を分離することを特
徴とする、このモノクロナール抗体の製法を記載する。
【０００７】モノクロナール抗体の製造は公知の方法
（モノクロナール・アンティボディズ、ケネットら著、
プレナム・プレス社発行、１９８０年３６３〜４１９頁
参照）に基づいて行われた。
【０００８】ＢＡＬＢ／ｃマウスを、大腸菌からの精製
組換えＴＮＦの少量を繰返し注射することにより免疫し
た。血清中に充分な抗体が検出されるとすぐに、この動
物の脾臓細胞を骨髄腫細胞と融合し、そして雑種を培養
した。
【０００９】個々の培養物は、ＴＮＦに対する特異的抗
体の濃度についてのスクリーニング試験にかけられた。
【００１０】適当なハイブリドーマの単一細胞から導か
れたコロニーを、制限希釈クローニング法により分離し
た。この方法により４種の雑種細胞系が得られ、これら
が異なる性質を有するモノクロナール抗体を分泌するこ
とにより区別された。すなわち雑種細胞系ＡＭ−１、Ａ
Ｍ−１１４、ＡＭ−１９５及びＡＭ−１９９である。こ
れらの細胞系は、英国ソリズパリイＳＰ４ ＯＪ６・ポ
ートン・ダウン所在の応用微生物学及び研究のためのＰ
ＨＬＳセンター、動物細胞培養物のヨーロッパ収集所
（ＥＣＡＣＣ）に、番号８７−０５０８０４、８７−０
５０８０３、８７−０５０８０１及び８７−０５０８０
２として寄託されている。
【００１１】これらの雑種細胞を、試験管内及び生体内
の両方の培養により生長させた。生体内での高い生長速
度はこの培養法を特に好適にした。プリスタン（Ｒ）に
より前処理された名称ＢＡＬＢ／ｃマウスに、各雑種株
の細胞を腹腔内注射により与えた。形成された腹水腫瘍
を８〜１０日後に採取した。
【００１２】ＴＮＦに対するモノクロナール抗体は、試
験管内細胞培養又は腹水液からの上澄液を精製処理する
ことにより分離された。精製はブルッフらの方法（Ｊ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ第５３巻１９８２年３
１３〜３１９頁参照）に基づいて行われた。
【００１３】モノクロナール抗体の分子の特性は下記の
ように決定された。
【００１４】精製された抗体の分子量は１５００００ダ
ルトンに等しいかそれより大きい（ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動により測定）。
【００１５】抗体ＡＭ−１、ＡＭ−１１４及びＡＭ−１
９９はＩｇＧ１型のもので、その重鎖はガンマ１であ
る。抗体ＡＭ−１９５はＩｇＧ３型のもので、その重鎖
はガンマ３である。軽鎖はすべての抗体においてカッパ
である（ＥＬＩＳＡにおけるサブタイプ特異的抗体によ
り測定）。
【００１６】モノクロナール抗体は、＞１０９ｌ／ｍｏ
ｌ程度の高い親和定数を有し、リンホトキシンと交叉反
応しない。
【００１７】ＴＮＦ分子上の個々の抗体のための結合部
位の相対的位置は、抗体の競合結合により調べられた。
【００１８】ＴＮＦをマイクロ滴定板上に固定した。１
種のビチオン標識抗体を、他の未標識抗体とともに保温
した。ＴＮＦ上の類似の部位に対し抗体の相互反応があ
る組合せを調べた。抗体ＡＭ−１９５が結合するエピト
ープは、ＡＭ−１及びＡＭ−１９９のためのそれと相違
する。ＡＭ−１１４についてわずかな競合が観察され
た。
【００１９】ＴＮＦ活性は普通の細胞毒検定法により測
定された。組換え及び天然ＴＮＦを過剰の抗体とともに
保温した。両ＴＮＦ標本の細胞毒活性は抗体ＡＭ−１９
５により中和された。ＡＭ−１１４による中和は１／１
０の強さであった。この知見は、抗原上の異なる領域が
種々の抗体と別様に反応すると仮定することにより説明
できる。ＡＭ−１９５モノクロナール抗体だけが、生物
学的活性に対して責任のある部位と反応する。
【００２０】抗体の結合及びＴＮＦの中和の結果は、Ｔ
ＮＦの少なくとも３種の異なるエピトープを認めること
ができ、そしてモノクロナール抗体の採取により定義し
うることを示すものである。
【００２１】抗体を用いて特定の抗原を検出するために
は、原則として二つの検定方法が可能である。両者にお
いて、抗原中に天然の標識がない場合には一方の成分を
標識する必要がある。抗原に、例えば放射活性標識同位
体により標識を行い、この場合は通常は競合置換検定法
例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）を用い、あるい
は抗体を標識する。この場合の好ましい検定法の型はイ
ムノラジオメトリックアッセイ（ＩＲＭＡ）、酵素免疫
測定法（ＥＬＩＳＡ）又は化学発光測定法である。これ
ら種々の測定法及びその変法の詳細は、この技術の専門
家に公知である。
【００２２】他の選択は、低分子量ハプテンの抗体との
カップリングであり、これは第二の反応により特異的に
検出できる。普通に用いられるものの例は、ストレプト
アビジンと反応するビオチンである。従って本発明のす
べての抗体は、長鎖ビオチンにより標識され、後続の段
階においてストレプトアビジン／セイヨウワサビパーオ
キシダーゼを用いて可視化された。
【００２３】本明細書に記載される検定法は、固相サン
ドイッチＥＬＩＳＡである。未標識の抗体（ＡＭ−１又
はＡＭ−１９９）を受身吸着又は共有結合により表面例
えばマイクロ滴定板に結合し、そしてこの表面を既知の
手段で非特異的結合に対してブロックした。ＴＮＦ含有
試料及びビオチンで標識した抗体（ＡＭ−１９５）を、
ピペットでウェル中に入れ、そして保温した。試料中の
ＴＮＦを１０ｐｇ／ｍｌの検出限界で検出できることが
示された。ｒＴＮＦはマウスＬ９２９の測定において
８．０×１０６Ｕ／ｍｇの比活性を有するので、このＥ
ＬＩＳＡ法により０．１ＵのＴＮＦ／ｍｌを検出するこ
とが可能である。ウエスタン・ブロッティング法は抗体
がヒト血清のどの成分とも交叉反応しないことを示し
た。従って本発明の抗体は、ＴＮＦにより処置された患
者の血清中のＴＮＦを測定するために用いることができ
る。これらの抗体は現行の診断の目的に、例えば血清及
び血漿中のＴＮＦレベルを検査するために用いることも
できる。
【００２４】本発明の抗体はＴＮＦを不活性化するので
（実施例６参照）、血中ＴＮＦ濃度が上昇する疾患、例
えば敗血症性ショックの処置のために使用できる。さら
に次の障害におけるＴＮＦ抗体での処置があげられる。
移植拒絶反応、アレルギー、自己免疫性疾患、リウマチ
性障害、肺ショック、炎症性骨疾患、凝固障害及び火
傷。この目的に適する抗体は、ＴＮＦの細胞毒活性を中
和するものである。
【００２５】ＴＮＦを含有する生物学的材料からＴＮＦ
を抽出するために、免疫アフィニティクロマトグラフィ
を用いることもできる。このためには抗体を既知の方法
によりゲルマトリックスに結合し、これにＴＮＦ含有溶
液を通過させる。
【００２６】
【実施例】下記の実施例により本発明をより詳細に説明
する。
【００２７】実施例１ モノクロナール抗体の製造 （ａ）ＢＡＬＢ／ｃマウスの免疫 雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスを、完全なフロインドのアジュ
バント０．５ｍｌ中のｒＴＮＦ３０μｇを用いて腹腔内
注射（ｉ．ｐ．）により免疫した。１４日後に動物に、
不完全なフロインドのアジュバント中の抗体３０μｇを
再び腹腔内注射により投与した。さらに２回の腹腔内注
射による免疫を、各３０μｇの抗体を用いて１４日の間
隔で行った。最後の抗体投与の３日後に、２匹の動物の
脾臓を摘出した。
【００２８】（ｂ）脾臓細胞懸濁液の製造 摘出された脾臓から、ステンレススチール製スクリーン
（目幅１００μｍ）にこの器官を強制的に通過させるこ
とにより、細胞懸濁液を製造した。ぶどう糖４．５ｇ／
ｌ、グルタミン１０ｍＭ、ペニシリン１０００単位／ｍ
ｌ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌ及び胎児牛血
清１５％が追加されたダルベッコの最小必須培地（ＤＭ
ＥＭ）中に細胞を移した。細胞をこの培地で３回洗浄し
たのち、同じ培地中に希望する濃度に再懸濁した。一般
に各脾臓から約５〜１０×１０７個の細胞が得られた。
【００２９】（ｃ）骨髄腫細胞の生長 骨髄腫細胞Ｓｐ２／Ｏ−Ａｇ１４（ＡＴＣＣ Ｎｏ．Ｃ
ＲＬ８２８７）を融合のために使用した。この細胞は２
０μｇ／ｍｌの８−アザグアニンに耐性であるが、ヒポ
キサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含有する培
地中（ＨＡＴ）ではもはや生長できない。この細胞を、
ぶどう糖４．５ｇ／ｌ、グルタミン１０ｍＭ、ペニシリ
ン１０００単位／ｍｌ、ストレプトマイシン１００μｇ
／ｍｌ及び胎児牛血清１５％が追加されたＤＭＥＭ（完
全培地）中で培養した。この細胞を、生長の対数増殖期
において融合に用いた。
【００３０】（ｄ）細胞融合 脾臓細胞懸濁液を骨髄腫細胞と５：１の割合で混合し、
血清不含のＤＭＥＭで洗浄した。洗浄された細胞を血清
不含のＤＭＥＭ３０ｍｌ中に再懸濁し、内容５０ｍｌの
ポリプロピレン製円錐管中で８００ｒｐｍで５分間遠心
分離した。上澄液を完全に吸引濾過した。分子量２００
０のポリエチレングリコール（ＰＥＧ、ベーリンガー
社）の５０％溶液０．５ｍｌを、きわめて注意深くペレ
ットに添加し、ペレットを軽くたたいてＰＥＧと混合
し、次いで混合物を１０００ｒｐｍで３分間遠心分離し
た。ＤＭＥＭ１０ｍｌを添加し、細胞ペレットを注意深
く懸濁し、次いで２０００ｒｐｍで３分間遠心分離し
た。細胞ペレットを２×１０６細胞／ｍｌの濃度でＨＡ
Ｔ培地中に再懸濁し、その０．２ｍｌをマイクロ滴定板
上に分散した。前日に、主としてマクロファージである
腹腔内単核細胞約５００００個を、供与者細胞としてウ
ェル中に入れた。
【００３１】（ｅ）ハイブリドーマの選択及び培養 細胞融合したのち、細胞をリトルフィールドＨＡＴ培地
（サイエンス第１４５巻１９６４年７０９〜７１２頁参
照）中で３７℃において、ＣＯ２を５％含有する湿った
雰囲気中で培養した。
【００３２】１週間に２回、培地の半分を新しいＨＡＴ
培地で置き換えることにより培養物を育てた。数週間の
のち、ハイブリドーマ細胞培養物からの上澄液を、抗ヒ
ト腫瘍壊死因子活性の存在について調べた。スクリーニ
ング試験において正の結果を示したハイブリドーマを、
クローニングのために選択した。このためにはハイブリ
ドーマを制限希釈法に付し、その際９６個のマイクロ滴
定ウェルのそれぞれに平均で０．５個の細胞／ウェルを
入れ、そして１０５個のマウス胸腺細胞を供与者細胞と
して添加した。このクローニング操作により選択された
抗体産生細胞を増殖し、凍結し、そして液体窒素中で胎
児牛血清１０％及びジメチルスルホキシド１０％を含有
する完全培地中に貯蔵した。
【００３３】（ｆ）特異的ＴＮＦ抗体のためのスクリー
ニング試験 ｒＴＮＦを、ＰＢＳ（燐酸塩緩衝塩水、ＮａＣｌ ０．
８％及び燐酸ナトリウム０．０２モルを含有し、ＨＣｌ
又はＮａＯＨでｐＨ７．４にしたもの）中に３μｇ／ｍ
ｌに希釈した。この溶液の各０．１ｍｌをマイクロタイ
ター（Ｒ）板のウェル中に入れた。室温で２時間のの
ち、上澄液を吸引濾過し、ウェルを１％牛血清アルブミ
ン溶液（シグマ社、ＲＩＡ等級）０．３ｍｌで３０分以
内に処理し、次いで上澄液を捨てた。生長しているハイ
ブリドーマ細胞系（約２０〜３０％集合）からの上澄液
又は免疫されたマウスからの血清の希釈液を、室温で２
時間以上保温した。ウェルをＰＢＳ ０．３ｍｌで数回
洗浄した。次いで適当な濃度の抗マウス免疫グロブリン
抗体（マイルズ社製）０．１ｍｌとともに室温で２時間
保温した。これらの抗体を酵素標識としてのパーオキシ
ダーゼとカップリングした。正のパーオキシダーゼ反応
を有するウェルは、抗原に特異的な抗体を示した。
【００３４】最初に用いた３６０個のウェルの８０％に
おいて、細胞の生長が観察された。これらのうち１２個
がＴＮＦスクリーニング試験において正の結果を示し
た。繰返し試験すると、そのうちの１１個が正であっ
た。４種の異なるモノクロナールハイブリドーマを本発
明のために追求した。それはＡＭ−１、ＡＭ−１９５、
ＡＭ−１１４及びＡＭ−１９９である。
【００３５】（ｇ）ハイブリドーマ細胞培養の展開 細胞培養における展開（試験管内）：約２×１０７個の
細胞を、１７５ｃｍ２の生長面積を有する細胞培養ビン
中に入れた。３日後に、細胞不含の上澄液は、細胞によ
り分泌されたモノクロナール抗体を１０〜２０μｇ／ｍ
ｌの範囲で含有していた。
【００３６】マウス腹水における展開（生体内）：ＢＡ
ＬＢ／ｃマウスに、腹膜の条件付けのためにプリスタン
（Ｒ）０．５ｍｌを腹腔内注射により与えた。ＰＢＳ中
の５〜１０×１０６個のハイブリドーマの懸濁液を、前
処置された各動物に１〜２週間の期間にわたり投与し
た。８〜１０日ののち、腹膜を針で刺し、細胞を含有す
る腹水液を採取した。
【００３７】腹水液の試料の細胞成分を遠心分離（５０
００ｒｐｍ、５分）により除去した。モノクロナール抗
体を含有する上澄液を小分けして−７０℃で凍結する
か、あるいはクロマトグラフィにより少なくとも９０％
に精製した。純度はドデシル硫酸ナトリウム／ポリアク
リルアミドゲル電気泳動により評価された（西独特許出
願公開３３３０１６０号明細書参照）。
【００３８】（ｈ）モノクロナール抗体の型の決定 モノクロナール抗体を、ＥＬＩＳＡ系において特性決定
した。マイクロ滴定板のくぼみにｒＴＮＦ（５μｇ／ｍ
ｌ）を充填した。このように準備された板を、細胞培養
からの精製モノクロナール抗体とともに室温で２時間保
温したのち、第２の保温段階（室温で２時間）を、種々
のクラス及びサブクラスの抗マウス免疫グロブリンなら
びに種々のクラスの免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖（マ
イルズ社製）とともに行った。他の段階で、パーオキシ
ダーゼで標識したヤギ抗ウサギ免疫グロブリン（マイル
ズ社製）を添加した。１時間保温したのち、着色基質で
あるテトラメチルベンジジン（マイルズ社製）及び過酸
化水素を添加して酵素反応を開始した。その結果を第１
表にまとめて示す。
【００３９】 第 １ 表 抗 体 クラス 重 鎖 軽 鎖 ＡＭ−１ ＩｇＧ ガンマ１ カッパ （ＥＣＡＣＣ８７−０５０８０４） ＡＭ−１１４ ＩｇＧ ガンマ１ カッパ （ＥＣＡＣＣ８７−０５０８０３） ＡＭ−１９５ ＩｇＧ ガンマ３ カッパ （ＥＣＡＣＣ８７−０５０８０１） ＡＭ−１９９ ＩｇＧ ガンマ１ カッパ （ＥＣＡＣＣ８７−０５０８０２） （ｉ）モノクロナール抗体の標識 ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（ピアス社製）をＰＢＳに溶解
し、濃度を１ｍｇ／ｍｌにした。この溶液の０．１ｍｌ
を精製モノクロナール抗体（０．５ｍｇ／ｍｌＰＢＳ）
０．１ｍｌと混合し、この溶液を室温で２時間保温し
た。反応に続いて、溶液をＰＢＳで１ｍｌとなし、４℃
でＰＢＳに対して透析した。透析液すなわち透析管中の
溶液を、使用するまで４℃で貯蔵した。
【００４０】実施例２ ＴＮＦに対するモノクロナール抗体の親和性 親和性定数を、ＥＬＩＳＡからのデータを用いて測定し
た。このためには精製抗体を一定量のＴＮＦに対して滴
定し、そして抗体の結合を、パーオキシダーゼで標識し
たウサギ抗マウス免疫グロブリンの結合により検出し
た。特異性プログラムを用いて結合のデータを分析し
た。
【００４１】 第 ２ 表 モノクロナール抗体の親和性定数 抗 体 Ｋａ×１０９ｌ×ｍｏｌ−１ ＡＭ−１ １．５ ± ３０％ ＡＭ−１１４ １．４ ± ３０％ ＡＭ−１９５ ３．５ ± ３０％ ＡＭ−１９９ ２．０ ± ３０％ これらの会合定数Ｋａは、抗ＴＮＦ抗体の高い親和性を
示している。
【００４２】実施例３ ＴＮＦの細胞毒活性の中和 ＴＮＦの試験管内での生物学的活性を、アガーワルらに
より記載された方法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２６
０巻１９８５年２３４５〜２３５４頁参照）と同様にし
て、マウス細胞系Ｌ９２９（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＣＬ
１）の溶解により測定した。モノクロナール抗体による
ＴＮＦの細胞毒活性の中和の試験において、ＴＮＦ濃度
は少なくとも９０％の細胞が溶解する濃度であった。抗
体をマイクロ滴定板中で完全培地中に１：２で段階的に
希釈した。組換え又は天然ＴＮＦ（１．３ｎｇ／ｍｌ）
０．０５ｍｌを各抗体溶液（０．１ｍｌ）に添加し、混
合物を室温で２時間保温した。次いで培地０．０５ｍｌ
中のＬ９２９細胞５００００個を添加し、インキュベー
ター中で２０〜２４時間保温したのち、細胞を固定し、
クリスタルバイオレットで染色した。
【００４３】ＴＮＦの細胞毒効果は細胞の溶解に導き、
従って細胞は染色中に洗浄除去される。しかし充分な抗
体が存在する場合には、ＴＮＦの細胞毒効果は中和さ
れ、そして細胞は染色される。
【００４４】第 ３ 表 ＴＮＦの細胞毒活性の中和ｍＡＫ 中 和 ＡＭ−１ − ＡＭ−１１４ ＋ ＡＭ−１９５ ＋＋ ＡＭ−１９９ − 第３表から認められるように、中和試験において３種類
の抗体が見出された。ＴＮＦの中和は、ＡＭ−１９５で
は０．２μｇ／ｍｌ及びＡＭ−１１４では２μｇ／ｍｌ
のモノクロナール抗体濃度において認められたが、２０
μｇ／ｍｌのＡＭ−１及びＡＭ−１９９では中和は不完
全であった。
【００４５】実施例２における会合定数の測定は、各抗
体がほぼ同じ程度に結合することを示した。抗体を、強
く中和するもの、弱く中和するもの又は全く中和しない
ものに類別することは、ＴＮＦ分子上の種々のエピトー
プを区別できるようにする情報を提供する。抗体の結合
及びＴＮＦの中和についての結果は、ＴＮＦの少なくと
も３種の異なるエピトープを認識することができかつモ
ノクロナール抗体の収集により定義することができるこ
とを示す。
【００４６】実施例４ ＴＮＦの測定 （ａ）好適な１対のモノクロナール抗体の選択 ２種の抗体の同じエピトープへの競合的結合と、異なる
エピトープへの付加的結合とを区別するために、抗体だ
けを用いかつ可能なすべての対の組合せにおいて、固定
化されたＴＮＦへの結合を試験した。ＴＮＦは実施例１
に記載のように結合した。精製ＴＮＦを、２４０００ｎ
ｇ／ｍｌから出発して１：４段階に希釈した。次いでビ
オチン化された抗体ＡＭ−１９５を添加したのち、９０
分間保温した。ウェルをＰＢＳ／０．０５％ツイーン
（Ｒ）２０で洗浄し、ストレプトアビジン−パーオキシ
ダーゼ錯体（ＢＲＬ社）を添加し、混合物を３０分間保
温した。洗浄工程ののち、パーオキシダーゼ基質（実施
例４ｂ参照）０．１ｍｌを各ウェルに添加した。競合的
結合は、シグナルを消失させる結果となる。第４表から
明らかなように、モノクロナール抗体ＡＭ−１９５を結
合するＴＮＦエピトープは、ＡＭ−１又はＡＭ−１９９
のためのものと相違する。ＡＭ−１１４とのわずかな競
合が認められる。この理由から、固定化されたＡＭ−１
又はＡＭ−１９９抗体とビオチンで標識したＡＭ−１９
５を用いて、次の実験を行った。
【００４７】 第 ４ 表 ビオチンで標識したＡＭ−１９５のＴＮＦ への結合に対するｍＡＫの影響 ％ 結 合 μｇ ｍＡＫ／ｍｌ １９５ １１４ １９９ １ ２４０００ ３ ３３ １００ １００ ６０００ ４ ８５ １００ １００ １５００ １６ １００ １００ １００ ３７５ ６３ １００ １００ １００ ６２ ９５ １００ １００ １００ ０ １００ １００ １００ １００ （ｂ）酵素イムノアッセイの設計 抗体ＡＭ−１又はＡＭ−１９９を、受身吸着又は共有結
合により担体（小球、濾材、ポリスチレン又はポリ塩化
ビニル製マイクロ滴定板、濾紙又は他の材料）上に固定
した。モノクロナール抗体の特異性は、特異的な抗原
（この場合はＴＮＦ）だけが、この抗原上の単一分子結
合部位を介して結合することを可能にする。結合できる
ＴＮＦの量は溶液中の抗原の濃度及び量に比例する。抗
原は、抗体ＡＭ−１９５が他の分子結合部位に結合する
ことにより認識される。抗体ＡＭ−１９５は１個のシグ
ナルを有する。それ故、固定化されたシグナルの量は固
定化された抗原の量に、従って調べられる溶液中の抗原
の濃度にも直接比例する。
【００４８】アッセイの操作： （１）被覆 精製抗体ＡＭ−１又はＡＭ−１９９を粘着緩衝液（重炭
酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ９．５、４．２ｇ／ｌ＝０．
０５Ｍ）中に０．５μｇ／ｍｌに希釈した。マイクロ滴
定板のウェルにこの溶液０．１ｍｌを入れ、４℃で１６
〜２０時間保温した。
【００４９】（２）遮断 （１）により得られた溶液を吸引濾過し、ウェルをＰＢ
Ｓ（ＮａＣｌ ２ｇ／ｌ、ＫＣｌ ０．２ｇ／ｌ、Ｎａ
２ＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏ １．４４ｇ／ｌ、ＫＨ２ＰＯ４
０．２ｇ／ｌ、ｐＨ７．０）で２回洗浄し、次いで１
％牛血清アルブミン（シグマ社、ＲＩＡ等級）により室
温で３０分間遮断した。
【００５０】（３）系列希釈及びＴＮＦ試料 （２）からの溶液を吸引濾過し、ウェルをＰＢＳで２回
洗浄した。ｒＴＮＦを緩衝液Ｉ［牛血清アルブミン（シ
グマ社、ＲＩＡ等級）１ｇをＰＢＳ １ｌに添加したも
の］により２．５ｎｇ／ｍｌとなし、１：２段階に希釈
した。試料各０．１ｍｌをピペットにより各ウェル中に
入れ、室温で２〜４時間保温した。緩衝液（洗浄用緩衝
液：ＰＢＳ＋０．１％ツイーン（Ｒ）２０）により３回
洗浄したのち、ビオチンで標識した抗体ＡＭ−１９５を
０．１ｍｌ添加した。実施例１（ｈ）の方法により製造
した接合物を緩衝液Ｉにより１：４００に希釈し、室温
で２時間又は４〜１０℃で１６〜２０時間保温した。
【００５１】（４）増幅系 ウェルを洗浄用緩衝液により３回洗浄したのち、ストレ
プトアビジン−パーオキシダーゼ錯体（ＢＲＬ社、ＰＢ
Ｓ／ＢＳＡ緩衝液中に１：２０００に希釈したもの）
０．１ｍｌとともに室温で３０分間保温した。
【００５２】（５）展開 ウェルを洗浄用緩衝液により３回洗浄し、パーオキシダ
ーゼ基質０．１ｍｌをピペットにより各ウェル中に入
れ、室温で３０分間保温した。２Ｍ−Ｈ２ＳＯ４０．１
ｍｌ／ウェルにより反応を停止した。マイクロ滴定板に
おける吸光を、４５０ｎｍの波長において１時間以内に
記録した。特性を示す検量線を図１に曲線○−○−○と
して示す。ＴＮＦの検出限界は１０ｐｇ／ｍｌである。
【００５３】パーオキシダーゼ基質 ＴＭＢ溶液：ＤＭＳＯ中の４２ｍＭ−ＴＭＢ（３，
３′，５，５′−テトラメチルベンジジン、マイル
ズ）。
【００５４】基質用緩衝液：水１ｌに加えた酢酸ナトリ
ウム５０ｇ、くえん酸１ｇによりｐＨ４．９に調整。
【００５５】ＴＭＢ溶液０．１ｍｌを基質用緩衝液１０
ｍｌに振動しながら徐々に添加し、次いで３０％Ｈ２Ｏ
２超純粋、メルク社）１．４７μｌを添加した。
【００５６】（ｃ）ヒト血清中のＴＮＦの測定 組換え及び／又は天然ＴＮＦを緩衝液Ｉ（実施例４ｂ参
照）又はヒト血清中に２．５ｎｇ／ｍｌとなし、同じ条
件下で１：２で段階的に希釈した。その０．１ｍｌをピ
ペットにより、実施例４（ｂ）に記載のようにして抗体
ＡＭ−１９９又はＡＭ−１によりあらかじめ被覆された
各ウェル中に加えた。後続の操作を実施例（ｂ）と同様
に行った。その結果を図１に曲線●−●−●として示
す。
【００５７】図１から明らかなように、ヒト血清のどの
成分も、モノクロナール抗体を用いるＴＮＦの測定を妨
害しない。
【００５８】（ｄ）抗体とリンホトキシンとの交叉反応 抗体とリンホトキシンとの可能な交叉反応を、実施例１
（ｅ）に記載のようにして試験した。その際マイクロ滴
定板のウェルを精製された組換えリンホトキシンにより
被覆した。抗体ＡＭ−１、ＡＭ−１１４、ＡＭ−１９５
又はＡＭ−１９９のリンホトキシンとの結合は認められ
なかった。
【００５９】実施例５ ウエスタン・ブロッティング法によるモノクロナール抗
体を用いる血清中のＴＮＦの検出 種々の量のＴＮＦが添加されたヒト血清を、ゲル電気泳
動により１２．５％ゲル中でレムリの方法（Ｊ．Ｍｏ
ｌ．Ｂｉｏｌ．第８０巻１９７３年５７５〜５９９頁参
照）により分別した。ウエスタン・ブロッティング法
は、バーネット（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．第１１２
巻１９８１年１９５〜２０３頁参照）及びライネスら
（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２６０巻１９８５年１１
３３〜１１３９頁参照）により報告された方法である。
ゲル上の蛋白質をニトロセルロース膜（シュライヘル及
びシュル）上に１夜ブロットした。このニトロセルロー
ス膜を１％ゼラチン溶液（バイオーラド社、ゼラチン１
０ｇをＰＢＳ１ｌに加えたもの）とともに室温で３時間
保温した。次いでニトロセルロース膜を、緩衝液（ＰＢ
Ｓ中の１％ゼラチン）中に１μｇ／ｍｌに希釈された抗
体溶液２０ｍｌとともに室温で２時間保温した。上澄液
を傾斜により除去し、膜を数回洗浄した。パーオキシダ
ーゼで標識した抗マウス免疫グロブリンを用いて、ＴＮ
Ｆをニトロセルロース膜上で見えるようにした。検出限
界はＴＮＦ３０ｎｇである。
【００６０】図２に、ＴＮＦを種々の量で添加されたヒ
ト血清のゲル電気泳動による分画（Ａ）及びこのゲル電
気泳動分画についてモノクロナール抗体ＡＭ−１９５を
用いて行ったウエスタン・ブロッティングの結果（Ｂ）
を示す。図２から明らかなように、ＡＭ−１９５はヒト
血清中の成分と反応せず、したがってＴＮＦに対して特
異的であると認められた。抗体ＡＭ−１、ＡＭ−１１４
及びＡＭ−１９９についても同じ結果が得られた。
【００６１】実施例６ ＴＮＦの中和 ＴＮＦに対するｍＡＫの保護作用を、生体内条件下で雌
性のＢＡＬＢ／ｃマウス（試験１、２及び４）及びＣ３
Ｈ／ＨｅＮマウス（試験３）において調べた。４〜６週
令のマウスを無作為に１群３匹又は５匹に分けた。被験
物質を静脈内注射により外側尾静脈内に投与した（投与
量１０ｍｌ／ｋｇ）。注射の前に、ＴＮＦを緩衝液Ａ
［１５０ｍＭ−ＮａＣｌ及び０．１８％牛血清アルブミ
ン（シグマ社、ＲＩＡ等級）］に溶解し、４〜１０℃で
６時間貯蔵した。ＴＮＦの毒性はこの時間後に最高であ
った。最初にＴＮＦを、次いで１５〜３０分後にｍＡＫ
を添加した。２４時間後に死亡率を測定した。第５表に
その結果を示す（この表中、例えば３／５は動物５匹の
うち３匹が死んだことを意味する）。
【００６２】 第 ５ 表 試 験 番 号 投与した物質（ｍｇ／ｋｇ） １ ２ ３ ４ 緩衝液Ａ ０／３ ０／５ ０／５ ０／５ ｍＡＫ１０ ０／３ ０／５ ０／５ ０／５ ｍＡＫ５ ０／３ ０／５ ０／５ ０／５ ＴＮＦ１ ３／３ ０／５ ４／５ ４／５ ＴＮＦ１＋ｍＡＫ１ １／３ ２／５ １／５ ３／５ ＴＮＦ１＋ｍＡＫ５ ０／３ ０／５ ０／５ ０／５ ＴＮＦ２ ３／３ ５／５ １／５ ４／５ ＴＮＦ２＋ｍＡＫ２ ３／３ ４／５ ２／５ ５／５ ＴＮＦ２＋ｍＡＫ１０ ０／３ ０／０ ０／５ ０／５ 第５表から明らかなように、中和性の抗体ＡＭ−１９５
はマウスにおいて致死量のＴＮＦを中和することができ
る。動物の生存率は抗体及びＴＮＦの重量比に依存す
る。ＴＮＦの毒性の完全阻止は５：１の比率において認
められた。ＴＮＦが三量体であると考えると（ＦＥＢＳ
Ｌｅｔｔ．第２１１巻１９８７年１７９頁参照）、こ
れは１．６：１の抗体：ＴＮＦのモル比に相当する。
【００６３】マウスにおいてＴＮＦを非中和性抗体によ
り中和することはできない。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のモノクロナール抗体を用いてＴＮＦを
測定するための検量線を示すグラフ図。
【図２】ＴＮＦを種々の量で添加したヒト血清のゲル電
気泳動による結果を示す、図面に代わる写真である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｂ // Ａ６１Ｋ 39/395 ＡＢＧ Ａ６１Ｋ 39/395 ＡＢＧ ＡＤＺ ＡＤＺＴ Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ハイブリッドセルラインＥＣＡＣＣ８７
    ０５０８０１から生産され、かつその重鎖がサブタイプ
    ＩｇＧγ−３を示すことを特徴とする、天然及び／又は
    組換えヒト腫瘍壊死因子(ＴＮＦ)と反応するモノクロナ
    ール抗体。
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