JP3841364B2 - 抗ヒトビトロネクチン・トロンビン・アンチトロンビンｉｉｉ 複合体モノクローナル抗体、ハイブリドーマ及び免疫学的測定方法 - Google Patents
抗ヒトビトロネクチン・トロンビン・アンチトロンビンｉｉｉ 複合体モノクローナル抗体、ハイブリドーマ及び免疫学的測定方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP3841364B2 JP3841364B2 JP27827894A JP27827894A JP3841364B2 JP 3841364 B2 JP3841364 B2 JP 3841364B2 JP 27827894 A JP27827894 A JP 27827894A JP 27827894 A JP27827894 A JP 27827894A JP 3841364 B2 JP3841364 B2 JP 3841364B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- human
- thrombin
- antithrombin iii
- vtat
- monoclonal antibody
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、抗ビトロネクチン・トロンビン・アンチトロンビンIII 複合体モノクローナル抗体、前記モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ及び前記モノクローナル抗体を用いるビトロネクチン・トロンビン・アンチトロンビンIII 複合体の免疫学的測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
臨床分野において、血中のトロンビンを測定することは、播種性血管内凝固や血栓症などの凝固亢進状態を知るうえで重要である。しかしながら、トロンビンそのものを測定することはできないので、代わりにトロンビンが血中のアンチトロンビンIII （以下ＡＴIII ともいう）と速やかに結合して生ずるトロンビン・アンチトロンビンIII 複合体（以下ＴＡＴともいう）を測定して、その量からトロンビンの量を推定して血液の凝固活性化の指標としている。しかしながら、ＴＡＴは血中のビトロネクチンと速やかに結合して、ビトロネクチン・トロンビン・アンチトロンビンIII 複合体（ＶＴＡＴ）を形成し、代謝される。従って、ＴＡＴを指標とすることが適切であるかどうかは、厳密な意味で不明である。また、ＶＴＡＴを指標とする方が、より適切であるとも考えられる。
【０００３】
実際に、従来法でも、ビトロネクチン・トロンビン・アンチトロンビンIII 複合体（ＶＴＡＴ）の測定が行われていた。その測定方法では抗アンチトロンビンIII モノクローナル抗体を固相に固定化し、ヒト血漿などの体液試料を接触させることにより得られる固相抗体と結合したＶＴＡＴ複合体に対し、酵素標識した抗ビトロネクチンモノクローナル抗体を作用させることによって実施されていた。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、この方法ではヒト血漿などの体液試料に共存しているＶＴＡＴに比べて大過剰（約１０万倍）のアンチトロンビンIII の干渉を免れることは不可能であり、実際上、ＶＴＡＴを測定することはできない（特開平２−６６４５８号公報）。また、ＴＡＴの測定もできない。
従って、本発明の目的は、新規なモノクローナル抗体を提供することにより、アンチトロンビンIII の干渉を受けずに正確にＶＴＡＴを測定する手段を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
すなわち、本発明は、ヒトビトロネクチン・ヒトトロンビン・ヒトアンチトロンビンIII複合体（ＶＴＡＴ）と特異的に反応するが、遊離ヒトトロンビン及び遊離ヒトアンチトロンビンIII（ＡＴIII）と反応せず、遊離ヒトビトロネクチンを感作したＥＬＩＳＡ用プレートを用いるＥＬＩＳＡ法において遊離ヒトビトロネクチンと反応せず、更にヒトトロンビン・ヒトアンチトロンビンIII複合体（ＴＡＴ）とも反応しないことを特徴とするモノクローナル抗体に関する。更に、本発明は、前記モノクローナル抗体を分泌することを特徴とするハイブリドーマ、及び、前記モノクローナル抗体を用いることを特徴とするビトロネクチン・トロンビン・アンチトロンビンIII複合体（ＶＴＡＴ）の免疫学的測定方法にも関する。更にまた、本発明は、前記モノクローナル抗体と共に、ヒトトロンビン・ヒトアンチトロンビンIII複合体（ＴＡＴ）と特異的に反応するが、遊離ヒトトロンビン及び遊離ヒトアンチトロンビンIIIと反応しないモノクローナル抗体を用いて、ビトロネクチン・トロンビン・アンチトロンビンIII複合体（ＶＴＡＴ）と共に、トロンビン・アンチトロンビンIII複合体（ＴＡＴ）を免疫学的に測定する方法にも関する。
【０００６】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の抗ＶＴＡＴモノクローナル抗体は、本発明による新規なハイブリドーマ（好ましくはマウス・ハイブリドーマ）を、それぞれ培地又は哺乳動物（特にはマウス）の腹腔内で培養することによって製造することができる。
本発明によるハイブリドーマは、一般的にはＶＴＡＴで免疫したマウスの脾臓細胞とマウス骨髄腫細胞とを、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｉｓｔｅｉｎの細胞融合の基本方法〔Ｎａｔｕｒｅ，第２５６巻，４９５頁（１９７５年）参照〕により製造することが可能である。詳細には、下記実施例で説明する。
【０００７】
また、上記のハイブリドーマを培養する培地としては、ハイブリドーマの培養に適した培地であればよく、好適にはダルベッコ氏変法イーグル氏最小必須培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅｅａｇｌｅ’ｓ ｍｉｎｉｍｕｍ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｅｄｉｕｍ 以下、ＤＭＥと記す）にウシ胎児血清、Ｌ−グルタミン、Ｌ−ピルビン酸及び抗生物質（ペニシリンＧとストレプトマイシン）を含む培地が用いられる。
【０００８】
このようにして製造された培養液又はマウスの腹水から、タンパク質の単離、精製に一般的に用いられる方法により前述の抗ＶＴＡＴモノクローナル抗体を分離、精製することが可能である。
そのような方法としては、硫安塩析、イオン交換セルロースを用いるイオン交換カラムクロマトグラフィー、分子ふるいゲルを用いる分子ふるいカラムクロマトグラフィー、プロテインＡ結合多糖類を用いる親和性カラムクロマトグラフィー、透析、凍結乾燥などがある。
【０００９】
このようにして得られた本発明の抗ＶＴＡＴモノクローナル抗体は、遊離のビトロネクチン、遊離のＡＴIII及び遊離のトロンビンとは結合せず、更にＴＡＴとも反応しないで、ＶＴＡＴとだけ結合する能力を有し、ＶＴＡＴの免疫定量用の試薬として有用である。本発明の抗ＶＴＡＴモノクローナル抗体（例えば後述の実施例で得られたＶＡＴ−１及びＶＡＴ−２）は、酵素免疫定量法（ＥＩＡ）あるいは発光免疫定量法（ＬＩＡ）における試薬として使用することができる。酵素免疫定量法の例としては、マイクロタイターあるいはプラスチックチューブを用いるワン・ステップ・サンドイッチ酵素免疫定量法を挙げることができる。この酵素免疫定量法の具体例は、下記実施例７に示す通りであるが、一般的には、ＶＴＡＴの互いに異なった抗原決定基を認識する２種類の抗ＶＴＡＴモノクローナル抗体を用いて行い、まずマイクロタイター・プレートの穴（ウエル）あるいはプラスチックチューブを前もって１種類の抗体（例えばＶＡＴ−１）で感作させておき、次に、この穴あるいはプラスチックチューブにＶＴＡＴを含む被検体及び酵素標識した別種の抗体（例えば、ＶＡＴ−２）の溶液を入れ、約３０分間静置後清浄し、酵素基質溶液を加えて３０分間程度酵素反応を行う。反応終了後、比色法などにより、被検体中のＶＴＡＴの量を定量することにより行うことが可能である。
【００１０】
発光免疫定量法（ＬＩＡ）を利用する場合には、本発明の抗ＶＴＡＴモノクローナル抗体の１種類（例えばＶＡＴ−２）をポリスチレンビーズなどの担体に感作させておき、次に、この担体にＶＴＡＴを含む被検体を接触させ、必要に応じて担体を洗浄した後、発光物質を標識した別種の抗体（例えばＶＡＴ−１）の溶液を入れて反応させ、洗浄後、発光物質が発光する条件に雰囲気を調整し、その発光量をルミホトメーターで測定することで被検体中のＶＴＡＴ量を定量することにより行うことが可能である。発光物質としてはルミノール又はアクリジニウム誘導体などを用いることができる。
【００１１】
本発明のモノクローナル抗体をラテックス凝集免疫法に使用する場合には、本発明のモノクローナル抗体を感作したラテックスと被検試料とを接触させ、それに伴う凝集の有無を測定することで、被検体中のＶＴＡＴを定量することができる。使用するラテックスは特に限定されるものではなく、例えば、ポリスチレンラテックス粒子を用いることができる。
【００１２】
本発明の前記モノクローナル抗体と、トロンビン・アンチトロンビンIII 複合体と特異的に反応するが、遊離トロンビン及び遊離アンチトロンビンIII と反応しないモノクローナル抗体とを併用して、ＶＴＡＴと共にＴＡＴを免疫学的に測定することもできる。前記の抗ＴＡＴモノクローナル抗体としては、例えば、特開昭６２−１３８１８７号公報記載のモノクローナル抗体、特には、ＡＴ−１を用いることができる。
【００１３】
ＶＴＡＴとＴＡＴとを同時に測定する場合にも、前記と同様に酵素免疫定量法、化学発光免疫定量法又はラテックス凝集免疫定量法を利用することができる。
例えばラテックス凝集法の場合には、本発明のＶＡＴ−１及び／又はＶＡＴ−２と前記のＡＴ−１をそれぞれ単独で別々にラテックス粒子に感作するか、あるいは前記モノクローナル抗体の混合物をラテックス粒子に感作したものを用いて、被検体中のＶＴＡＴと接触させ、それに伴う凝集の有無を測定すればよい。
また、酵素免疫定量法あるいは発光免疫定量法の場合には、プレートやビーズの担体に本発明のＴＡＴ−１及び／又はＶＡＴ−２と前記のＡＴ−１を固定化し、本発明の別種のモノクローナル抗体あるいは抗アンチトロンビンIII 抗体（ポリクローナル抗体）を酵素あるいは発光物質で標識したものを用いて前記と同様の操作を行えばよい。
本発明による前記の各種測定法において、被検試料としては ＶＴＡＴ及び場合によりＴＡＴを含む可能性のある試料であれば特に限定はされないが、例えば、生体試料、特には血液、血清、血漿などを挙げることができる。
【００１４】
【実施例】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
実施例１
ＶＴＡＴ複合体はＥ．Ｒ．ポダックらの方法〔ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ，第２６１巻，７３８７−７３９２頁（１９８６）〕により精製した。すなわち、ビトロネクチン８００μｇとトロンビン４００μｇとアンチトロンビンIII ８００μｇを塩化ナトリウム０．９％を含む０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）１ｍｌ中に加え、３７℃で３０分間反応させ、ＶＴＡＴ複合体を調製した。更に、セファアクリル Ｓ−３００（ファルマー社；スウェーデン）による分子ふるいクロマトグラフィーにより精製し、精製ＶＴＡＴ（Ａ２８０ｎｍ＝１．０のＶＴＡＴ）１ｍｌを得た。このようにして得た精製ＶＴＡＴは、以下の実施例において、免疫原として、また抗ＶＴＡＴ抗体産生性ハイブリドーマを選別するためのＥＬＩＳＡ用抗原として使用した。
【００１５】
実施例２
（ａ）免疫化した脾臓細胞の調製：
前記実施例１で調製したＶＴＡＴ免疫原溶液（Ａ２８０ｎｍ＝０．１）を等量のフロインド氏完全アジュバンドと乳化するまで混合し、その混合液２００μｌをマウス腹腔内に投与することにより免疫を行った（第１回免疫）。３０日経過後、該マウスに上記と同様の方法でマウス腹腔内に投与した（第２免疫）。第２回免疫から２１日経過後、ＶＴＡＴ免疫原溶液（Ａ２８０ｎｍ＝０．１）を等量の生理食塩水で希釈し、その希釈液２００μｌを、該マウスの静脈内に投与した（最終免疫）。最終免疫から３日経過後、脾臓細胞をマウスから取り出し、細胞融合に使用した。
【００１６】
（ｂ）細胞融合：
無菌的に摘出した上記の脾臓を、１０〜１５％ウシ胎児血清を含むＤＭＥ培地５ｍｌを入れたシャーレに入れた。次に、脾臓を、１０〜１５％ウシ胎児血清を含むＤＭＥ培地約１５ｍｌで還流して脾細胞を流出させた後、この脾細胞懸濁液をナイロンメッシュに通した。この脾細胞５０ｍｌを遠心チューブに集めて遠心（５００×ｇ，１０分間）した。こうして得たペレットにヘモライジング溶液（１５５ｍＭ−ＮＨ4 Ｃｌ，１０ｍＭ−ＫＨＣＯ3 ，１ｍＭ−Ｎａ2 ＥＤＴＡ，ｐＨ７．０）５ｍｌを加え、懸濁させた。０℃で、５〜１０分間放置すると懸濁液中の赤血球が破壊された。１０〜１５％ウシ胎児血清１５ｍｌを含むＤＭＥ培地を加えてから遠心分離した。こうして得られた細胞ペレットをＤＭＥ培地で遠心法によって洗浄し、生きている脾細胞数を測定した。
【００１７】
一方、予め培養しておいたマウス骨髄腫細胞（ミエローマ細胞）ＳＰ２／Ｏ−Ａｇ１４約２×１０7 個に上記脾細胞約１×１０8 個を加え、ＤＭＥ培地中でよく混合し、遠心分離を行った（５００×ｇ、１０分間）。その上清を吸引し、ペレットをよく解きほぐし、３８℃に保温しておいた４０％ポリエチレングリコール４０００溶液０．５ｍｌを滴下し、遠心チューブを、手で１分間穏やかに回転することによってポリエチレングリコール溶液と細胞ペレットを混合させた。次に、３８℃に保温しておいたＤＭＥ培地を、３０秒毎に１ｍｌ加えてチューブを穏やかに回転させた。この操作を１０回繰り返した後、１０〜１５％ウシ胎児血清を含むＤＭＥ培地２０ｍｌを加えて、遠心分離（５００×ｇ，１０分間）を行った。上清を除去した後、細胞ペレットを１０〜１５％ウシ胎児血清を含むＨＡＴ培地（ＤＭＥ培地にアミノプテリン４×１０-7Ｍ，チミジン１．６×１０-5Ｍ，ヒポキサンチン１×１０-4Ｍになるように添加したのも）で、遠心法によって２回洗浄後、上記ＨＡＴ培地４０ｍｌに懸濁した。この細胞懸濁液を９６ウエル細胞培養プレートの各ウエルに２００μｌずつ分注し、３７℃で、５％炭酸ガスを含む炭酸ガス培養器で培養を開始した。培養中、２〜３日間隔で各ウエルの培地を約１００μｌ除き、新たに上記のＨＡＴ培地を１００μｌ加えることによりＨＡＴ培地中で増殖するハイブリドーマを選択した。８日目頃から１０〜１５％ウシ胎児血清を含むＨＴ培地（ＤＭＥ培地にチミジン１．６×１０-5Ｍ，ヒポキサンチン１×１０-4Ｍになるように添加したもの）に交換し、ハイブリドーマの増殖を観察するとともに、約１０日目に、下述のＥＬＳＩＡ法により、抗ＶＴＡＴ抗体産生ハイブリドーマをスクリーニングした。
【００１８】
（ｃ）ハイブリドーマの樹立
ハイブリドーマ培養上清中の産生抗体の有無はＥＬＳＩＡ法により測定した。９６ウエルＥＬＳＩＡ用プレート（ＩｍｍｕｌｏｎII；日本ダイナテック株式会社）の各ウエルに、前述の精製ＶＴＡＴ溶液（Ａ２８０ｎｍ＝０．０５，生理食塩水で希釈したもの）を５０μｌずつ分注し、２５℃で２時間放置した。次に、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ＩＣＩ社の登録商標）−生理食塩水で３回洗浄した後、各ウエルに培養上清を５０μｌ加え、２５℃で１時間反応させた。
次に、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−生理食塩水で２００倍に希釈したペルオキシダーゼ結合抗マウス抗体（ダコ社；デンマーク）５０μｌを各ウエルに加えた。反応終了後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−生理食塩水で各ウエルを３回洗浄し、０．５ｍＭアミノアンチピリンと１０ｍＭフェノールと０．００５％過酸化水素水とを含む溶液２５０μｌを各ウエルに加え、２５℃で３０分間反応させ、各ウエルの４９０ｎｍにおける吸光度を測定した。その結果、１９２ウエル中、２３ウエルに抗体産生が認められた。
【００１９】
上記のＥＬＩＳＡ法によって認められた培養上清中の抗ＶＴＡＴ抗体が、ビトロネクチン、ＡＴIII 、トロンビン及びＴＡＴと反応するか否かを、ビトロネクチン、ＡＴIII 、トロンビン及びＴＡＴを感作した９６ウエルＥＬＩＳＡ用プレートを用いて上記と同様の方法で測定した。その結果、ＶＴＡＴと反応した１５ウエルの培養上清中、８ウエルの培養上清がＴＡＴとＡＴIII とも、５ウエルの培養上清がビトロネクチンとも、反応した。一方、トロンビンとは全く反応しなかった。
ビトロネクチン、ＡＴIII 、トロンビン及びＴＡＴとは反応しないで、ＶＴＡＴのみに特異的に反応する２ウエル中のハイブリドーマを２４ウエルプレートに移し、１０〜１５％ウシ胎児血清を含むＨＴ培地で４〜５日間培養した。その後、再度ＥＬＩＳＡ法によって「抗ＶＴＡＴ特異的抗体」（以下単に抗ＶＴＡＴ抗体という）の産生の有無を確認してから限界希釈法によりクローニングした。限界希釈法は、ＨＴ培地でハイブリドーマが５個／ｍｌとなるように希釈した細胞浮遊液を、予め正常ＢＡＬＢ／Ｃ系マウスの腹腔細胞がウエルあたり２×１０4 個分注してある９６ウエルプレートの各ウエルに１００μｌずつ分注した。約１０日後、ＥＬＩＳＡ法によって、抗ＶＴＡＴ抗体を産生するハイブリドーマのクローンをスクリーニングした。その結果、各ハイブリドーマにつき、２０〜４０個の抗体産生クローンが得られた。これらのクローンの中から、増殖性が良好で、抗体分泌能が高く、しかも安定なクローンを選び、前述と同様の方法で再クローン化を行い、「抗ＶＴＡＴ特異的抗体」産生ハイブリドーマＶＡＴ−１、及びＶＡＴ−２を樹立した。これらのハイブリドーマＶＡＴ−１及びＶＡＴ−２から分泌される抗体はビトロネクチン・トロンビン複合体（ＶＴ）とは反応しなかった。
【００２０】
実施例３：モノクローナル抗体の製造
（ａ）イン・ビトロ法
マウスハイブリドーマＶＡＴ−１及びＶＡＴ−２を各々１５％ウシ胎児血清を含むＤＭＥ培地中で３７℃にて、５％二酸化炭素雰囲気中で７２〜９６時間培養した。培養物を遠心分離（１００００×ｇ，１０分）した後、上清に固形の硫酸アンモニウムを５０％最終濃度となるように徐々に加えた。混合物を氷冷下３０分間撹拌した後、６０分間放置し、遠心分離（１００００×ｇ，１０分）した後、得られた沈渣を少量の１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解し、１０００倍量の１０ｍＭリン酸緩衝液に対して透析した。これを、１０ｍＭリン酸緩衝液で既に平衡化したＤＥＡＥ−セルロースのカラムに充填した。モノクローナル抗体の溶出は１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）と０．２Ｍ ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）の間で濃度勾配法により行った。溶出されたモノクローナル抗体を限外濾過法で濃縮し、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に対して透析した。ウシ血清ＩｇＧを除くために、透析物をヤギ抗ウシ血清ＩｇＧ−セファロース４Ｂのカラムに通した。次に通過液を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したプロテインＡ−セファロース４Ｂのカラムに充填した。カラムをｐＨ３．５の緩衝液で溶出して、精製した抗ＶＴＡＴ抗体ＶＡＴ−１の溶液を得た。同様にしてＶＡＴ−２の溶液も得た。
【００２１】
（ｂ）イン・ビボ法
プリスタン（２，６，１，１４−テトラメチルペンタデカン）０．５ｍｌを１０から１２週齢のＢＡＬＢ／Ｃ系マウスの腹腔内に投与した後、１４〜２０日目のマウス腹腔内にインビトロで増殖させたハイブリドーマＶＡＴ−１、又はＶＡＴ−２をマウス一匹あたり２×１０6 細胞となるように接種した。
各ハイブリドーマにつき一匹のマウスから約１０〜１５ｍｌの腹水が得られた。その抗体濃度は、２〜１０ｍｇ／ｍｌであった。腹水中のモノクローナル抗体の精製（但し、ヤギ抗ウシ血清ＩｇＧ−セファロース４Ｂのカラムを通す操作は除く）は、上記のインビトロ精製法と同様の方法で行った。
【００２２】
実施例４：モノクローナル抗体の免疫グロブリンクラス及び特異性の同定
抗ＶＴＡＴモノクローナル抗体ＶＡＴ−１及びＶＡＴ−２の免疫グロブリン・クラス、及び特異性の同定は、各々オクテロニー免疫拡散法、及びエンザイムイムノアッセイ法〔前記実施例２（ｃ）に記載のＥＬＩＳＡ法と同様の方法〕により行った。
結果を表１並びに図１（ＶＡＴ−１）及び図２（ＶＡＴ−２）に示す。図１及び図２において、Ｔはトロンビン、ＡはアンチトロンビンIII 、ＶＴはビトロネクチン・トロンビン複合体、ＴＡＴはトロンビン・アンチトロンビンIII 複合体、そしてＶＴＡＴはビトロネクチン・トロンビン・アンチトロンビンIII 複合体である。
【００２３】
【表１】
【００２４】
実施例５：ラテックススライド凝集免疫定量法
抗ＶＴＡＴモノクローナル抗体によるラテックス（日本合成ゴム社製，０．４９７μｍ）の感作は次のような操作で行った。
２種類のモノクローナル抗体ＶＡＴ−１及びＶＡＴ−２の各々の濃度が０．３ｍｇ／ｍｌの溶液１０ｍｌに、ラテックス濃度が１％（ｗ／ｖ）になるようにラテックスを加え、２５℃で１時間激しく撹拌した。次に、牛アルブミン溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）を０．２ｍｌ添加し、２５℃で３０分間激しく撹拌した後、遠心分離（２００００×ｇ，３０分間）を行った。沈渣を水５０ｍｌに懸濁し、抗ＶＴＡＴモノクローナル抗体感作ラテックスＶＴＡＴ・Ｌ−１として以下のラテックススライド凝集免疫定量に用いた。次に、モノクローナル抗体ＶＡＴ−１と特開平６２−１３８１８７号公報実施例３に記載のＴＡＴに特異的に反応するモノクローナル抗体ＡＴ−１との組み合わせを用いて上記と同様の方法で感作ラテックスを調製し、ＶＴＡＴ測定用ラテックスＶＴＡＴ・Ｌ−２として以下のラテックススライド凝集免疫定量に用いた。
【００２５】
スライド凝集板の各ウエルに感作ラテックス（０．２％）２５μｌを添加し、次に生理食塩水による２倍希釈列の被検体２５μｌを加えた。このスライド凝集板を６０回転／分で３分間回転させ、各ウエルの凝集の有無を測定した。被検体中のＶＴＡＴの量は、同時に測定した２倍希釈列の検量用複合体によるラテックス凝集反応の有無から求めた。結果を表２に示す。
【００２６】
【表２】
表２において、＋は凝集ありを、そして−は凝集なしを各々表している。
【００２７】
実施例６：ワン・ステップ・サンドイッチ酵素免疫定量法
抗ＶＴＡＴモノクローナル抗体ＶＡＴ−２を２０ｍＭ炭酸緩衝液中に１０μｇ／ｍｌの濃度で含む抗体液と、それとは別に抗ＶＴＡＴモノクローナル抗体ＶＡＴ−２及び実施例６で用いた抗ＴＡＴモノクローナル抗体ＡＴ−１を２０ｍＭ炭酸緩衝液中にそれぞれ５μｇ／ｍｌの濃度で含む抗体液を調製し、それぞれ９６ウエル平底型ポリスチレン製マイクロタイター・プレートに、１００μｌの量で入れて２５℃で３０分間静置した。そのプレートを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含む生理食塩水で３回洗浄した。こうして得た抗体感作プレートのウエルに、被検体５０μｌ、ペルオキシダーゼ標識抗ヒトアンチトロンビンIII 抗体（ラビット，ダコ社：デンマーク）、０．１５Ｍ−ＮａＣｌ、及び２％ウシアルブミンを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）１００μｌを加えた。２５℃で３０分間静置後、プレートを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含む生理食塩水で３回洗浄した。次いで、酵素基質液（１０ｍＭフェノール、２０ｍＭ−４−アミノアンチピリン、及び０．００５％過酸化水素を含む液）２００μｌずつをプレートのそれぞれのウエルに添加した。２５℃で３０分間反応させた後、各ウエルの４９０ｎｍにおける吸光度をＭＰ−５９０型マクロエライザ・ミニリーダー（ダイナテック社製）で測定した被検体中のＶＴＡＴの量は、同時に測定した検量用複合体の４９０ｎｍにおける吸光度から描いた検量線から求めた。結果を図３に示す。図３において、Ａは本発明のモノクローナル抗体ＶＡＴ−２と特開昭６２−１３８１８７号公報の実施例３に記載のＴＡＴに特異的なモノクローナル抗体ＡＴ−１の２種類を固定化した場合の結果であり、Ｂは本発明のモノクローナル抗体ＶＡＴ−２を固定化した場合の結果である。
【００２８】
【発明の効果】
本発明の抗ＶＴＡＴモノクローナル抗体を使用すると、前記のように、ＶＴＡＴを感度よく定量することができる。また、本発明の抗ＶＴＡＴモノクローナル抗体と、抗ＴＡＴモノクローナル抗体とを組み合わせることにより、検体中にビトロネクチンと結合していないＴＡＴが存在していた場合でも両者を測定することができ、統合的にトロンビンを把握できるという利点を有する。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明による抗ＶＴＡＴモノクローナル抗体ＶＡＴ−１のビトロネクチントロンビン、ＡＴIII 、ＶＴ、ＴＡＴ及びＶＴＡＴとの結合力を、９６ウエルマイクロタイター・プレートを用いてエンザイムイムノアッセイ法で測定した結果を表すグラフである。
【図２】本発明による抗ＶＴＡＴモノクローナル抗体ＶＡＴ−２のビトロネクチントロンビン、ＡＴIII 、ＶＴ、ＴＡＴ及びＶＴＡＴとの結合力を、９６ウエルマイクロタイター・プレートを用いてエンザイムイムノアッセイ法で測定した結果を表すグラフである。
【図３】ＶＴＡＴのサンドイッチＥＩＡ法による検量線を示したグラフである。
【産業上の利用分野】
本発明は、抗ビトロネクチン・トロンビン・アンチトロンビンIII 複合体モノクローナル抗体、前記モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ及び前記モノクローナル抗体を用いるビトロネクチン・トロンビン・アンチトロンビンIII 複合体の免疫学的測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
臨床分野において、血中のトロンビンを測定することは、播種性血管内凝固や血栓症などの凝固亢進状態を知るうえで重要である。しかしながら、トロンビンそのものを測定することはできないので、代わりにトロンビンが血中のアンチトロンビンIII （以下ＡＴIII ともいう）と速やかに結合して生ずるトロンビン・アンチトロンビンIII 複合体（以下ＴＡＴともいう）を測定して、その量からトロンビンの量を推定して血液の凝固活性化の指標としている。しかしながら、ＴＡＴは血中のビトロネクチンと速やかに結合して、ビトロネクチン・トロンビン・アンチトロンビンIII 複合体（ＶＴＡＴ）を形成し、代謝される。従って、ＴＡＴを指標とすることが適切であるかどうかは、厳密な意味で不明である。また、ＶＴＡＴを指標とする方が、より適切であるとも考えられる。
【０００３】
実際に、従来法でも、ビトロネクチン・トロンビン・アンチトロンビンIII 複合体（ＶＴＡＴ）の測定が行われていた。その測定方法では抗アンチトロンビンIII モノクローナル抗体を固相に固定化し、ヒト血漿などの体液試料を接触させることにより得られる固相抗体と結合したＶＴＡＴ複合体に対し、酵素標識した抗ビトロネクチンモノクローナル抗体を作用させることによって実施されていた。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、この方法ではヒト血漿などの体液試料に共存しているＶＴＡＴに比べて大過剰（約１０万倍）のアンチトロンビンIII の干渉を免れることは不可能であり、実際上、ＶＴＡＴを測定することはできない（特開平２−６６４５８号公報）。また、ＴＡＴの測定もできない。
従って、本発明の目的は、新規なモノクローナル抗体を提供することにより、アンチトロンビンIII の干渉を受けずに正確にＶＴＡＴを測定する手段を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
すなわち、本発明は、ヒトビトロネクチン・ヒトトロンビン・ヒトアンチトロンビンIII複合体（ＶＴＡＴ）と特異的に反応するが、遊離ヒトトロンビン及び遊離ヒトアンチトロンビンIII（ＡＴIII）と反応せず、遊離ヒトビトロネクチンを感作したＥＬＩＳＡ用プレートを用いるＥＬＩＳＡ法において遊離ヒトビトロネクチンと反応せず、更にヒトトロンビン・ヒトアンチトロンビンIII複合体（ＴＡＴ）とも反応しないことを特徴とするモノクローナル抗体に関する。更に、本発明は、前記モノクローナル抗体を分泌することを特徴とするハイブリドーマ、及び、前記モノクローナル抗体を用いることを特徴とするビトロネクチン・トロンビン・アンチトロンビンIII複合体（ＶＴＡＴ）の免疫学的測定方法にも関する。更にまた、本発明は、前記モノクローナル抗体と共に、ヒトトロンビン・ヒトアンチトロンビンIII複合体（ＴＡＴ）と特異的に反応するが、遊離ヒトトロンビン及び遊離ヒトアンチトロンビンIIIと反応しないモノクローナル抗体を用いて、ビトロネクチン・トロンビン・アンチトロンビンIII複合体（ＶＴＡＴ）と共に、トロンビン・アンチトロンビンIII複合体（ＴＡＴ）を免疫学的に測定する方法にも関する。
【０００６】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の抗ＶＴＡＴモノクローナル抗体は、本発明による新規なハイブリドーマ（好ましくはマウス・ハイブリドーマ）を、それぞれ培地又は哺乳動物（特にはマウス）の腹腔内で培養することによって製造することができる。
本発明によるハイブリドーマは、一般的にはＶＴＡＴで免疫したマウスの脾臓細胞とマウス骨髄腫細胞とを、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｉｓｔｅｉｎの細胞融合の基本方法〔Ｎａｔｕｒｅ，第２５６巻，４９５頁（１９７５年）参照〕により製造することが可能である。詳細には、下記実施例で説明する。
【０００７】
また、上記のハイブリドーマを培養する培地としては、ハイブリドーマの培養に適した培地であればよく、好適にはダルベッコ氏変法イーグル氏最小必須培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅｅａｇｌｅ’ｓ ｍｉｎｉｍｕｍ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｅｄｉｕｍ 以下、ＤＭＥと記す）にウシ胎児血清、Ｌ−グルタミン、Ｌ−ピルビン酸及び抗生物質（ペニシリンＧとストレプトマイシン）を含む培地が用いられる。
【０００８】
このようにして製造された培養液又はマウスの腹水から、タンパク質の単離、精製に一般的に用いられる方法により前述の抗ＶＴＡＴモノクローナル抗体を分離、精製することが可能である。
そのような方法としては、硫安塩析、イオン交換セルロースを用いるイオン交換カラムクロマトグラフィー、分子ふるいゲルを用いる分子ふるいカラムクロマトグラフィー、プロテインＡ結合多糖類を用いる親和性カラムクロマトグラフィー、透析、凍結乾燥などがある。
【０００９】
このようにして得られた本発明の抗ＶＴＡＴモノクローナル抗体は、遊離のビトロネクチン、遊離のＡＴIII及び遊離のトロンビンとは結合せず、更にＴＡＴとも反応しないで、ＶＴＡＴとだけ結合する能力を有し、ＶＴＡＴの免疫定量用の試薬として有用である。本発明の抗ＶＴＡＴモノクローナル抗体（例えば後述の実施例で得られたＶＡＴ−１及びＶＡＴ−２）は、酵素免疫定量法（ＥＩＡ）あるいは発光免疫定量法（ＬＩＡ）における試薬として使用することができる。酵素免疫定量法の例としては、マイクロタイターあるいはプラスチックチューブを用いるワン・ステップ・サンドイッチ酵素免疫定量法を挙げることができる。この酵素免疫定量法の具体例は、下記実施例７に示す通りであるが、一般的には、ＶＴＡＴの互いに異なった抗原決定基を認識する２種類の抗ＶＴＡＴモノクローナル抗体を用いて行い、まずマイクロタイター・プレートの穴（ウエル）あるいはプラスチックチューブを前もって１種類の抗体（例えばＶＡＴ−１）で感作させておき、次に、この穴あるいはプラスチックチューブにＶＴＡＴを含む被検体及び酵素標識した別種の抗体（例えば、ＶＡＴ−２）の溶液を入れ、約３０分間静置後清浄し、酵素基質溶液を加えて３０分間程度酵素反応を行う。反応終了後、比色法などにより、被検体中のＶＴＡＴの量を定量することにより行うことが可能である。
【００１０】
発光免疫定量法（ＬＩＡ）を利用する場合には、本発明の抗ＶＴＡＴモノクローナル抗体の１種類（例えばＶＡＴ−２）をポリスチレンビーズなどの担体に感作させておき、次に、この担体にＶＴＡＴを含む被検体を接触させ、必要に応じて担体を洗浄した後、発光物質を標識した別種の抗体（例えばＶＡＴ−１）の溶液を入れて反応させ、洗浄後、発光物質が発光する条件に雰囲気を調整し、その発光量をルミホトメーターで測定することで被検体中のＶＴＡＴ量を定量することにより行うことが可能である。発光物質としてはルミノール又はアクリジニウム誘導体などを用いることができる。
【００１１】
本発明のモノクローナル抗体をラテックス凝集免疫法に使用する場合には、本発明のモノクローナル抗体を感作したラテックスと被検試料とを接触させ、それに伴う凝集の有無を測定することで、被検体中のＶＴＡＴを定量することができる。使用するラテックスは特に限定されるものではなく、例えば、ポリスチレンラテックス粒子を用いることができる。
【００１２】
本発明の前記モノクローナル抗体と、トロンビン・アンチトロンビンIII 複合体と特異的に反応するが、遊離トロンビン及び遊離アンチトロンビンIII と反応しないモノクローナル抗体とを併用して、ＶＴＡＴと共にＴＡＴを免疫学的に測定することもできる。前記の抗ＴＡＴモノクローナル抗体としては、例えば、特開昭６２−１３８１８７号公報記載のモノクローナル抗体、特には、ＡＴ−１を用いることができる。
【００１３】
ＶＴＡＴとＴＡＴとを同時に測定する場合にも、前記と同様に酵素免疫定量法、化学発光免疫定量法又はラテックス凝集免疫定量法を利用することができる。
例えばラテックス凝集法の場合には、本発明のＶＡＴ−１及び／又はＶＡＴ−２と前記のＡＴ−１をそれぞれ単独で別々にラテックス粒子に感作するか、あるいは前記モノクローナル抗体の混合物をラテックス粒子に感作したものを用いて、被検体中のＶＴＡＴと接触させ、それに伴う凝集の有無を測定すればよい。
また、酵素免疫定量法あるいは発光免疫定量法の場合には、プレートやビーズの担体に本発明のＴＡＴ−１及び／又はＶＡＴ−２と前記のＡＴ−１を固定化し、本発明の別種のモノクローナル抗体あるいは抗アンチトロンビンIII 抗体（ポリクローナル抗体）を酵素あるいは発光物質で標識したものを用いて前記と同様の操作を行えばよい。
本発明による前記の各種測定法において、被検試料としては ＶＴＡＴ及び場合によりＴＡＴを含む可能性のある試料であれば特に限定はされないが、例えば、生体試料、特には血液、血清、血漿などを挙げることができる。
【００１４】
【実施例】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
実施例１
ＶＴＡＴ複合体はＥ．Ｒ．ポダックらの方法〔ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ，第２６１巻，７３８７−７３９２頁（１９８６）〕により精製した。すなわち、ビトロネクチン８００μｇとトロンビン４００μｇとアンチトロンビンIII ８００μｇを塩化ナトリウム０．９％を含む０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）１ｍｌ中に加え、３７℃で３０分間反応させ、ＶＴＡＴ複合体を調製した。更に、セファアクリル Ｓ−３００（ファルマー社；スウェーデン）による分子ふるいクロマトグラフィーにより精製し、精製ＶＴＡＴ（Ａ２８０ｎｍ＝１．０のＶＴＡＴ）１ｍｌを得た。このようにして得た精製ＶＴＡＴは、以下の実施例において、免疫原として、また抗ＶＴＡＴ抗体産生性ハイブリドーマを選別するためのＥＬＩＳＡ用抗原として使用した。
【００１５】
実施例２
（ａ）免疫化した脾臓細胞の調製：
前記実施例１で調製したＶＴＡＴ免疫原溶液（Ａ２８０ｎｍ＝０．１）を等量のフロインド氏完全アジュバンドと乳化するまで混合し、その混合液２００μｌをマウス腹腔内に投与することにより免疫を行った（第１回免疫）。３０日経過後、該マウスに上記と同様の方法でマウス腹腔内に投与した（第２免疫）。第２回免疫から２１日経過後、ＶＴＡＴ免疫原溶液（Ａ２８０ｎｍ＝０．１）を等量の生理食塩水で希釈し、その希釈液２００μｌを、該マウスの静脈内に投与した（最終免疫）。最終免疫から３日経過後、脾臓細胞をマウスから取り出し、細胞融合に使用した。
【００１６】
（ｂ）細胞融合：
無菌的に摘出した上記の脾臓を、１０〜１５％ウシ胎児血清を含むＤＭＥ培地５ｍｌを入れたシャーレに入れた。次に、脾臓を、１０〜１５％ウシ胎児血清を含むＤＭＥ培地約１５ｍｌで還流して脾細胞を流出させた後、この脾細胞懸濁液をナイロンメッシュに通した。この脾細胞５０ｍｌを遠心チューブに集めて遠心（５００×ｇ，１０分間）した。こうして得たペレットにヘモライジング溶液（１５５ｍＭ−ＮＨ4 Ｃｌ，１０ｍＭ−ＫＨＣＯ3 ，１ｍＭ−Ｎａ2 ＥＤＴＡ，ｐＨ７．０）５ｍｌを加え、懸濁させた。０℃で、５〜１０分間放置すると懸濁液中の赤血球が破壊された。１０〜１５％ウシ胎児血清１５ｍｌを含むＤＭＥ培地を加えてから遠心分離した。こうして得られた細胞ペレットをＤＭＥ培地で遠心法によって洗浄し、生きている脾細胞数を測定した。
【００１７】
一方、予め培養しておいたマウス骨髄腫細胞（ミエローマ細胞）ＳＰ２／Ｏ−Ａｇ１４約２×１０7 個に上記脾細胞約１×１０8 個を加え、ＤＭＥ培地中でよく混合し、遠心分離を行った（５００×ｇ、１０分間）。その上清を吸引し、ペレットをよく解きほぐし、３８℃に保温しておいた４０％ポリエチレングリコール４０００溶液０．５ｍｌを滴下し、遠心チューブを、手で１分間穏やかに回転することによってポリエチレングリコール溶液と細胞ペレットを混合させた。次に、３８℃に保温しておいたＤＭＥ培地を、３０秒毎に１ｍｌ加えてチューブを穏やかに回転させた。この操作を１０回繰り返した後、１０〜１５％ウシ胎児血清を含むＤＭＥ培地２０ｍｌを加えて、遠心分離（５００×ｇ，１０分間）を行った。上清を除去した後、細胞ペレットを１０〜１５％ウシ胎児血清を含むＨＡＴ培地（ＤＭＥ培地にアミノプテリン４×１０-7Ｍ，チミジン１．６×１０-5Ｍ，ヒポキサンチン１×１０-4Ｍになるように添加したのも）で、遠心法によって２回洗浄後、上記ＨＡＴ培地４０ｍｌに懸濁した。この細胞懸濁液を９６ウエル細胞培養プレートの各ウエルに２００μｌずつ分注し、３７℃で、５％炭酸ガスを含む炭酸ガス培養器で培養を開始した。培養中、２〜３日間隔で各ウエルの培地を約１００μｌ除き、新たに上記のＨＡＴ培地を１００μｌ加えることによりＨＡＴ培地中で増殖するハイブリドーマを選択した。８日目頃から１０〜１５％ウシ胎児血清を含むＨＴ培地（ＤＭＥ培地にチミジン１．６×１０-5Ｍ，ヒポキサンチン１×１０-4Ｍになるように添加したもの）に交換し、ハイブリドーマの増殖を観察するとともに、約１０日目に、下述のＥＬＳＩＡ法により、抗ＶＴＡＴ抗体産生ハイブリドーマをスクリーニングした。
【００１８】
（ｃ）ハイブリドーマの樹立
ハイブリドーマ培養上清中の産生抗体の有無はＥＬＳＩＡ法により測定した。９６ウエルＥＬＳＩＡ用プレート（ＩｍｍｕｌｏｎII；日本ダイナテック株式会社）の各ウエルに、前述の精製ＶＴＡＴ溶液（Ａ２８０ｎｍ＝０．０５，生理食塩水で希釈したもの）を５０μｌずつ分注し、２５℃で２時間放置した。次に、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ＩＣＩ社の登録商標）−生理食塩水で３回洗浄した後、各ウエルに培養上清を５０μｌ加え、２５℃で１時間反応させた。
次に、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−生理食塩水で２００倍に希釈したペルオキシダーゼ結合抗マウス抗体（ダコ社；デンマーク）５０μｌを各ウエルに加えた。反応終了後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−生理食塩水で各ウエルを３回洗浄し、０．５ｍＭアミノアンチピリンと１０ｍＭフェノールと０．００５％過酸化水素水とを含む溶液２５０μｌを各ウエルに加え、２５℃で３０分間反応させ、各ウエルの４９０ｎｍにおける吸光度を測定した。その結果、１９２ウエル中、２３ウエルに抗体産生が認められた。
【００１９】
上記のＥＬＩＳＡ法によって認められた培養上清中の抗ＶＴＡＴ抗体が、ビトロネクチン、ＡＴIII 、トロンビン及びＴＡＴと反応するか否かを、ビトロネクチン、ＡＴIII 、トロンビン及びＴＡＴを感作した９６ウエルＥＬＩＳＡ用プレートを用いて上記と同様の方法で測定した。その結果、ＶＴＡＴと反応した１５ウエルの培養上清中、８ウエルの培養上清がＴＡＴとＡＴIII とも、５ウエルの培養上清がビトロネクチンとも、反応した。一方、トロンビンとは全く反応しなかった。
ビトロネクチン、ＡＴIII 、トロンビン及びＴＡＴとは反応しないで、ＶＴＡＴのみに特異的に反応する２ウエル中のハイブリドーマを２４ウエルプレートに移し、１０〜１５％ウシ胎児血清を含むＨＴ培地で４〜５日間培養した。その後、再度ＥＬＩＳＡ法によって「抗ＶＴＡＴ特異的抗体」（以下単に抗ＶＴＡＴ抗体という）の産生の有無を確認してから限界希釈法によりクローニングした。限界希釈法は、ＨＴ培地でハイブリドーマが５個／ｍｌとなるように希釈した細胞浮遊液を、予め正常ＢＡＬＢ／Ｃ系マウスの腹腔細胞がウエルあたり２×１０4 個分注してある９６ウエルプレートの各ウエルに１００μｌずつ分注した。約１０日後、ＥＬＩＳＡ法によって、抗ＶＴＡＴ抗体を産生するハイブリドーマのクローンをスクリーニングした。その結果、各ハイブリドーマにつき、２０〜４０個の抗体産生クローンが得られた。これらのクローンの中から、増殖性が良好で、抗体分泌能が高く、しかも安定なクローンを選び、前述と同様の方法で再クローン化を行い、「抗ＶＴＡＴ特異的抗体」産生ハイブリドーマＶＡＴ−１、及びＶＡＴ−２を樹立した。これらのハイブリドーマＶＡＴ−１及びＶＡＴ−２から分泌される抗体はビトロネクチン・トロンビン複合体（ＶＴ）とは反応しなかった。
【００２０】
実施例３：モノクローナル抗体の製造
（ａ）イン・ビトロ法
マウスハイブリドーマＶＡＴ−１及びＶＡＴ−２を各々１５％ウシ胎児血清を含むＤＭＥ培地中で３７℃にて、５％二酸化炭素雰囲気中で７２〜９６時間培養した。培養物を遠心分離（１００００×ｇ，１０分）した後、上清に固形の硫酸アンモニウムを５０％最終濃度となるように徐々に加えた。混合物を氷冷下３０分間撹拌した後、６０分間放置し、遠心分離（１００００×ｇ，１０分）した後、得られた沈渣を少量の１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解し、１０００倍量の１０ｍＭリン酸緩衝液に対して透析した。これを、１０ｍＭリン酸緩衝液で既に平衡化したＤＥＡＥ−セルロースのカラムに充填した。モノクローナル抗体の溶出は１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）と０．２Ｍ ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）の間で濃度勾配法により行った。溶出されたモノクローナル抗体を限外濾過法で濃縮し、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に対して透析した。ウシ血清ＩｇＧを除くために、透析物をヤギ抗ウシ血清ＩｇＧ−セファロース４Ｂのカラムに通した。次に通過液を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したプロテインＡ−セファロース４Ｂのカラムに充填した。カラムをｐＨ３．５の緩衝液で溶出して、精製した抗ＶＴＡＴ抗体ＶＡＴ−１の溶液を得た。同様にしてＶＡＴ−２の溶液も得た。
【００２１】
（ｂ）イン・ビボ法
プリスタン（２，６，１，１４−テトラメチルペンタデカン）０．５ｍｌを１０から１２週齢のＢＡＬＢ／Ｃ系マウスの腹腔内に投与した後、１４〜２０日目のマウス腹腔内にインビトロで増殖させたハイブリドーマＶＡＴ−１、又はＶＡＴ−２をマウス一匹あたり２×１０6 細胞となるように接種した。
各ハイブリドーマにつき一匹のマウスから約１０〜１５ｍｌの腹水が得られた。その抗体濃度は、２〜１０ｍｇ／ｍｌであった。腹水中のモノクローナル抗体の精製（但し、ヤギ抗ウシ血清ＩｇＧ−セファロース４Ｂのカラムを通す操作は除く）は、上記のインビトロ精製法と同様の方法で行った。
【００２２】
実施例４：モノクローナル抗体の免疫グロブリンクラス及び特異性の同定
抗ＶＴＡＴモノクローナル抗体ＶＡＴ−１及びＶＡＴ−２の免疫グロブリン・クラス、及び特異性の同定は、各々オクテロニー免疫拡散法、及びエンザイムイムノアッセイ法〔前記実施例２（ｃ）に記載のＥＬＩＳＡ法と同様の方法〕により行った。
結果を表１並びに図１（ＶＡＴ−１）及び図２（ＶＡＴ−２）に示す。図１及び図２において、Ｔはトロンビン、ＡはアンチトロンビンIII 、ＶＴはビトロネクチン・トロンビン複合体、ＴＡＴはトロンビン・アンチトロンビンIII 複合体、そしてＶＴＡＴはビトロネクチン・トロンビン・アンチトロンビンIII 複合体である。
【００２３】
【表１】
実施例５：ラテックススライド凝集免疫定量法
抗ＶＴＡＴモノクローナル抗体によるラテックス（日本合成ゴム社製，０．４９７μｍ）の感作は次のような操作で行った。
２種類のモノクローナル抗体ＶＡＴ−１及びＶＡＴ−２の各々の濃度が０．３ｍｇ／ｍｌの溶液１０ｍｌに、ラテックス濃度が１％（ｗ／ｖ）になるようにラテックスを加え、２５℃で１時間激しく撹拌した。次に、牛アルブミン溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）を０．２ｍｌ添加し、２５℃で３０分間激しく撹拌した後、遠心分離（２００００×ｇ，３０分間）を行った。沈渣を水５０ｍｌに懸濁し、抗ＶＴＡＴモノクローナル抗体感作ラテックスＶＴＡＴ・Ｌ−１として以下のラテックススライド凝集免疫定量に用いた。次に、モノクローナル抗体ＶＡＴ−１と特開平６２−１３８１８７号公報実施例３に記載のＴＡＴに特異的に反応するモノクローナル抗体ＡＴ−１との組み合わせを用いて上記と同様の方法で感作ラテックスを調製し、ＶＴＡＴ測定用ラテックスＶＴＡＴ・Ｌ−２として以下のラテックススライド凝集免疫定量に用いた。
【００２５】
スライド凝集板の各ウエルに感作ラテックス（０．２％）２５μｌを添加し、次に生理食塩水による２倍希釈列の被検体２５μｌを加えた。このスライド凝集板を６０回転／分で３分間回転させ、各ウエルの凝集の有無を測定した。被検体中のＶＴＡＴの量は、同時に測定した２倍希釈列の検量用複合体によるラテックス凝集反応の有無から求めた。結果を表２に示す。
【００２６】
【表２】
【００２７】
実施例６：ワン・ステップ・サンドイッチ酵素免疫定量法
抗ＶＴＡＴモノクローナル抗体ＶＡＴ−２を２０ｍＭ炭酸緩衝液中に１０μｇ／ｍｌの濃度で含む抗体液と、それとは別に抗ＶＴＡＴモノクローナル抗体ＶＡＴ−２及び実施例６で用いた抗ＴＡＴモノクローナル抗体ＡＴ−１を２０ｍＭ炭酸緩衝液中にそれぞれ５μｇ／ｍｌの濃度で含む抗体液を調製し、それぞれ９６ウエル平底型ポリスチレン製マイクロタイター・プレートに、１００μｌの量で入れて２５℃で３０分間静置した。そのプレートを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含む生理食塩水で３回洗浄した。こうして得た抗体感作プレートのウエルに、被検体５０μｌ、ペルオキシダーゼ標識抗ヒトアンチトロンビンIII 抗体（ラビット，ダコ社：デンマーク）、０．１５Ｍ−ＮａＣｌ、及び２％ウシアルブミンを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）１００μｌを加えた。２５℃で３０分間静置後、プレートを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含む生理食塩水で３回洗浄した。次いで、酵素基質液（１０ｍＭフェノール、２０ｍＭ−４−アミノアンチピリン、及び０．００５％過酸化水素を含む液）２００μｌずつをプレートのそれぞれのウエルに添加した。２５℃で３０分間反応させた後、各ウエルの４９０ｎｍにおける吸光度をＭＰ−５９０型マクロエライザ・ミニリーダー（ダイナテック社製）で測定した被検体中のＶＴＡＴの量は、同時に測定した検量用複合体の４９０ｎｍにおける吸光度から描いた検量線から求めた。結果を図３に示す。図３において、Ａは本発明のモノクローナル抗体ＶＡＴ−２と特開昭６２−１３８１８７号公報の実施例３に記載のＴＡＴに特異的なモノクローナル抗体ＡＴ−１の２種類を固定化した場合の結果であり、Ｂは本発明のモノクローナル抗体ＶＡＴ−２を固定化した場合の結果である。
【００２８】
【発明の効果】
本発明の抗ＶＴＡＴモノクローナル抗体を使用すると、前記のように、ＶＴＡＴを感度よく定量することができる。また、本発明の抗ＶＴＡＴモノクローナル抗体と、抗ＴＡＴモノクローナル抗体とを組み合わせることにより、検体中にビトロネクチンと結合していないＴＡＴが存在していた場合でも両者を測定することができ、統合的にトロンビンを把握できるという利点を有する。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明による抗ＶＴＡＴモノクローナル抗体ＶＡＴ−１のビトロネクチントロンビン、ＡＴIII 、ＶＴ、ＴＡＴ及びＶＴＡＴとの結合力を、９６ウエルマイクロタイター・プレートを用いてエンザイムイムノアッセイ法で測定した結果を表すグラフである。
【図２】本発明による抗ＶＴＡＴモノクローナル抗体ＶＡＴ−２のビトロネクチントロンビン、ＡＴIII 、ＶＴ、ＴＡＴ及びＶＴＡＴとの結合力を、９６ウエルマイクロタイター・プレートを用いてエンザイムイムノアッセイ法で測定した結果を表すグラフである。
【図３】ＶＴＡＴのサンドイッチＥＩＡ法による検量線を示したグラフである。
Claims (5)
- ヒトビトロネクチン・ヒトトロンビン・ヒトアンチトロンビンIII複合体と特異的に反応するが、遊離ヒトトロンビン、遊離ヒトアンチトロンビンIII、及びヒトトロンビン・ヒトアンチトロンビンIII複合体と反応せず、遊離ヒトビトロネクチンを感作したＥＬＩＳＡ用プレートを用いるＥＬＩＳＡ法において遊離ヒトビトロネクチンと反応しないことを特徴とするモノクローナル抗体。
- ヒトビトロネクチン・ヒトトロンビン・ヒトアンチトロンビンIII複合体と特異的に反応するが、遊離ヒトトロンビン、遊離ヒトアンチトロンビンIII、及びヒトトロンビン・ヒトアンチトロンビンIII複合体と反応せず、遊離ヒトビトロネクチンを感作したＥＬＩＳＡ用プレートを用いるＥＬＩＳＡ法において遊離ヒトビトロネクチンと反応しないモノクローナル抗体を分泌することを特徴とするハイブリドーマ。
- ヒトビトロネクチン・ヒトトロンビン・ヒトアンチトロンビンIII複合体と特異的に反応するが、遊離ヒトトロンビン、遊離ヒトアンチトロンビンIII、及びヒトトロンビン・ヒトアンチトロンビンIII複合体と反応せず、遊離ヒトビトロネクチンを感作したＥＬＩＳＡ用プレートを用いるＥＬＩＳＡ法において遊離ヒトビトロネクチンと反応しないモノクローナル抗体を使用することを特徴とするビトロネクチン・トロンビン・アンチトロンビンIII複合体の免疫学的測定方法。
- ヒトトロンビン・ヒトアンチトロンビンIII複合体と特異的に反応するが、遊離ヒトトロンビン及び遊離ヒトアンチトロンビンIIIと反応しないモノクローナル抗体を併用して、トロンビン・アンチトロンビンIII複合体を同時に定量する請求項３に記載の方法。
- 免疫定量法が、酵素免疫定量法、化学発光免疫定量法又はラテックス凝集免疫定量法である請求項３又は４に記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP27827894A JP3841364B2 (ja) | 1994-10-18 | 1994-10-18 | 抗ヒトビトロネクチン・トロンビン・アンチトロンビンｉｉｉ 複合体モノクローナル抗体、ハイブリドーマ及び免疫学的測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP27827894A JP3841364B2 (ja) | 1994-10-18 | 1994-10-18 | 抗ヒトビトロネクチン・トロンビン・アンチトロンビンｉｉｉ 複合体モノクローナル抗体、ハイブリドーマ及び免疫学的測定方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08120000A JPH08120000A (ja) | 1996-05-14 |
| JP3841364B2 true JP3841364B2 (ja) | 2006-11-01 |
Family
ID=17595126
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP27827894A Expired - Fee Related JP3841364B2 (ja) | 1994-10-18 | 1994-10-18 | 抗ヒトビトロネクチン・トロンビン・アンチトロンビンｉｉｉ 複合体モノクローナル抗体、ハイブリドーマ及び免疫学的測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3841364B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9593166B2 (en) | 2013-03-14 | 2017-03-14 | Bayer Healthcare Llc | Monoclonal antibodies against antithrombin β |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002316999A (ja) * | 2001-04-17 | 2002-10-31 | Dai Ichi Pure Chem Co Ltd | モノクローナル抗体 |
-
1994
- 1994-10-18 JP JP27827894A patent/JP3841364B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9593166B2 (en) | 2013-03-14 | 2017-03-14 | Bayer Healthcare Llc | Monoclonal antibodies against antithrombin β |
| US9908942B2 (en) | 2013-03-14 | 2018-03-06 | Bayer Healthcare, Llc | Monoclonal antibodies against antithrombin β |
| US10144784B2 (en) | 2013-03-14 | 2018-12-04 | Bayer Healthcare Llc | Monoclonal antibodies against antithrombin beta |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH08120000A (ja) | 1996-05-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5500345A (en) | Hybridomas producing monoclonal antibodies specific for C-reactive protein and methods for detection of C-reactive protein | |
| JPH06104071B2 (ja) | 第▲ｉｘ▼因子コンホメ−シヨン特異性モノクロ−ナル抗体 | |
| JP3517754B2 (ja) | 抗ヒト可溶性フィブリン抗体，ハイブリドーマ及び免疫学的測定法 | |
| JP5903381B2 (ja) | 抗ｆｄｐモノクローナル抗体、それを用いたｆｄｐ測定用試薬及び試薬キット、並びにｆｄｐ測定方法 | |
| JP3681206B2 (ja) | 抗ファクターＸａ・ティシュファクターパスウェイインヒビター複合体モノクローナル抗体及びその使用 | |
| JP3889084B2 (ja) | 新規なモノクローナル抗体並びにｅ−Ｄダイマー及びｅ−ＤＤ／Ｅ複合体の免疫学的測定法 | |
| JP3307422B2 (ja) | ヒトｐｉｖｋａ−ｉｉの免疫学的測定方法 | |
| JPH0746104B2 (ja) | Ｆｄｐの測定法 | |
| JP3857468B2 (ja) | Ｄダイマー及びｄｄ／ｅ複合体の免疫学的分析方法及び分析用キット | |
| JP3841364B2 (ja) | 抗ヒトビトロネクチン・トロンビン・アンチトロンビンｉｉｉ 複合体モノクローナル抗体、ハイブリドーマ及び免疫学的測定方法 | |
| JPH0644876B2 (ja) | 抗トロンビン・アンチトロンビン３複合体モノクローナル抗体、及びその製造方法、並びにそれを用いるトロンビン・アンチトロンビン３複合体の免疫定量法、及びそれを用いるトロンビン・アンチトロンビン３複合体の精製方法 | |
| EP0516863B1 (en) | Antibody against human plasmin-alpha 2-plasmin inhibitor complex, hybridoma and immunoassay | |
| US5358850A (en) | Sandwich immunoassay of β-n-acetylglucosaminidase and monoclonal antibody used therein | |
| JP2609858B2 (ja) | コラゲナーゼインヒビターの酵素免疫学的定量法 | |
| EP0315447A2 (en) | Method of immunological measurement of human protein S and reagent and kit therefor | |
| JP2840852B2 (ja) | Ｃ反応性蛋白質に対するモノクローナル坑体 | |
| JP2837030B2 (ja) | 抗ヒトプラスミン−α▲下２▼−プラスミンインヒビター複合体特異抗体及び免疫学的測定方法 | |
| RU1776691C (ru) | Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS L, - продуцент моноклональных антител против J @ Е человека | |
| JPH01231893A (ja) | 抗ヒトプロテインｓモノクローナル抗体およびその利用 | |
| JPH03183953A (ja) | ヒト膵臓α―アミラーゼの測定方法 | |
| JPH0327296A (ja) | ヒトラミニンのモノクローナル抗体、その製法および利用 | |
| JPH021555A (ja) | ヒトプロティンｓの免疫学的測定方法、それに用いる測定試薬及びキット | |
| JPS63141595A (ja) | 抗ヒトフエリチンｈ型サブユニツト単クロ−ン性抗体及びこれを産生するハイブリド−マ並びにこれを利用するヒトフエリチンｈ型サブユニツト量の測定法 | |
| JPS6358262A (ja) | 特異モノクロ−ナル抗体を用いた生体成分の分析方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20040622 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20040823 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20050830 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20051018 |
|
| A911 | Transfer of reconsideration by examiner before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20051202 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20060228 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20060801 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20060807 |
|
| R150 | Certificate of patent (=grant) or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100818 Year of fee payment: 4 |
|
| S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313111 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100818 Year of fee payment: 4 |
|
| R371 | Transfer withdrawn |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R371 |
|
| S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313111 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100818 Year of fee payment: 4 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110818 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120818 Year of fee payment: 6 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130818 Year of fee payment: 7 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |