JP3291525B2

JP3291525B2 - ヒトプラスミン−α▲下２▼−プラスミンインヒビター複合体の免疫学的測定方法

Info

Publication number: JP3291525B2
Application number: JP50147592A
Authority: JP
Inventors: 吉夫徐; 功河野; 眞美椎葉
Original assignee: 株式会社ヤトロン
Priority date: 1990-12-20
Filing date: 1991-12-19
Publication date: 2002-06-10
Anticipated expiration: 2017-06-10
Also published as: DE69129582T2; KR100207351B1; DE69129582D1; ES2118807T3; KR927003838A; EP0516863A4; CA2075937C; EP0516863B1; AU9100191A; EP0516863A1; AU657504B2; US5888749A; WO1992011384A1; CA2075937A1

Description

【発明の詳細な説明】技術分野本発明は、ヒトプラスミン−α_２−プラスミンインヒ
ビター複合体（Plasmin−α_２−Plasmin inhibitor Com
plex:以下PICの略称を用いることがある）に対して反応
性を有する各種のモノクローナル抗体群を用いたヒトプ
ラスミン−α_２−プラスミンインヒビター複合体の免疫
学的定量方法に関する。

背景技術汎発性血管内凝固症候群（DIC:Disseminated intrava
scular coagulation）患者の血漿中や、ウロキナーゼ又
はティシュープラスミノーゲンアクチベータ（ｔ−PA）
を用いた血栓溶解療法実施中の患者血漿中では、プラス
ミノーゲンが活性化されてプラスミンが生成される。生
成されたプラスミンは、流血中では瞬時にα_２プラスミ
ンインヒビター（α₂PI:青木ら、J.Biol.Chem.,251,595
6−5965,1976）と1:1の複合体、即ち前記のPICを形成す
る。従って、PICを測定することにより、プラスミンの
生成、即ち、線溶系活性化の事象を把握することができ
る。最近、血漿中のPICはDICの診断及び血栓溶解療法の
モニター等の分子マーカーとして重要視されている。そ
のため、血液あるいは血漿中のPICの量を正確かつ簡単
に測定する必要がある。

従来から知られているPICの測定法としては、以下の
５つの方法を挙げることができる。第１の方法は、二次
元交叉免疫電気泳動法を用いる方法である。第２の方法
は、PICのネオアンチゲンを認識するポリクローナル抗
体を用いたラテックス凝集法である。第３の方法は、プ
ラスミノーゲンに対するポリクローナル抗体とα_２−プ
ラスミンインヒビターに対するポリクローナル抗体の両
者を用い、その一方を固定化抗体とし、他方を酵素標識
抗体とした。酵素免疫測定法である。第４の方法は、α
_２−プラスミンインヒビターに存在するプラスミンの繊
維素溶解作用を阻止する部位を特異的に認識するモノク
ローナル抗体とプラスミンポリクローナル抗体の両者を
用い、その一方を固定化抗体とし、他方を酵素標識抗体
とし、血漿検体を1200倍に希釈して測定して測定する酵
素免疫測定法である。第５の方法は、PICのネオアンチ
ゲンを認識するモノクローナル抗体２種又は３種を用い
るラテックス凝集法である。

しかしながら、第１の方法には、感度が低く定量性に
欠けるという欠点があった。第２の方法には、PICを特
異的に測定できないという欠点があった。第３の方法
は、感度は良好であるが、抗血清の安定な確保が困難で
あり、免疫反応が２工程であるので操作が煩雑で、測定
に長時間を要するという欠点があった。第４の方法は、
α_２−プラスミンインヒビターに対するモノクローナル
抗体を使用する点及び免疫反応を１工程で操作する点で
前記の第３の方法が改良されているが、酵素免疫反応が
有する欠点、即ち、操作が煩雑で測定に長時間を要する
という問題点を解消するものではなかった。更に、第４
の方法には、１工程の免疫反応を導入するために、検体
を1200倍に希釈する工程が必要になるという欠点もあっ
た。第５の方法は、ポリクローナル抗体を用いた第２の
方法と比較して、特異性や測定感度において差異はな
く、PICを特異的に測定できないという問題点を解決す
るものではなかった。

本発明者は、PICを簡便に、正確にそして再現性よく
測定する方法を開発するべく鋭意研究をした結果、PIC
及びプラスミノーゲンの両者に反応性を示す第１のモノ
クローナル抗体（PIC−１）、PIC及びα_２−プラスミン
インヒビターの両者に反応性を示す第２のモノクローナ
ル抗体（PIC−２）、そしてPICに特異的反応性を示す
が、PICの構成タンパク質であるプラスミノーゲン及び
α_２−プラスミンインヒビターには反応性を示さない第
３のモノクローナル抗体（PIC−３）の、３種のモノク
ローナル抗体を見出し、これらのモノクローナル抗体の
２種以上の組み合わせを用いると、血漿中のPICを、血
漿検体の希釈工程を必要とせず、迅速かつ正確に、しか
も検体中に遊離の状態で存在するプラスミノーゲン及び
α_２−プラスミンインヒビターの妨害を受けずに、特異
的に測定することができることを見出した。従って、本
発明の目的は、前記の各モノクローナル抗体を用いる新
規の免疫学的定量方法を提供することにある。

発明の開示従って、本発明は、不溶性担体に固定化された、
（１）ヒトプラスミン−α_２−プラスミンインヒビター
複合体及びヒトプラスミノーゲンと特異的に反応し、ヒ
トα_２−プラスミンインヒビターとは反応しないモノク
ローナル抗体、（２）ヒトプラスミン−α_２−プラスミ
ンインヒビター複合体及びヒトα_２−プラスミンインヒ
ビターと特異的に反応するモノクローナル抗体、及び
（３）ヒトプラスミン−α_２−プラスミンインヒビター
複合体と特異的に反応し、ヒトプラスミノーゲン及びヒ
トα_２−プラスミンインヒビターとは反応しないモノク
ローナル抗体少なくとも２種と、被検試料とを接触さ
せ、被検試料における凝集反応を観察することを特徴と
する、ヒトプラスミン−α_２−プラスミンインヒビター
複合体の測定方法に関する。

図面の簡単な説明第１図は、本発明のモノクローナル抗体ラテックス複
合体を用いて、健常人血漿（12検体）及びDIC患者血漿
（15検体）中のPIC量を測定した結果を示す説明図であ
る。

発明を実施するための最良の形態以下、本発明を、モノクローナル抗体、ハイブリドー
マ及び免疫学的測定方法の順に説明する。

免疫原として用いるヒトPICは、例えば、Plowらの方
法（J.Lab.Clin.Med.93,199−209,1979）に従って調製
することができる。即ち、ヒト（健常人）の血漿からプ
ラスミノーゲンを除去し、プラスミノーゲン不含のこの
血漿に、プラスミンを徐々に加えることによりPICを生
成させ、生成したPICを適当な親和性ゲルに吸着させ
る。この吸着PICを適当な緩衝液で溶出させ、更に、イ
オン交換クロマトグラフィーや分子ふるいクロマトグラ
フィー等による精製操作で処理し、純化ヒトPICを得
る。こうして得られたヒトPICは、SDS−PAGE（SDS−Pol
yacrylamidegel elctrophoresis）で単一のバンドを示
す。

次に、精製したPIC免疫原溶液を用いて哺乳動物（例
えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ又はウマ）をイン
・ビボ免疫法により免疫する。

具体的には、例えば、精製したヒトPIC免疫原溶液を
等量のフロインド氏完全アジュバント又は不完全アジュ
バントと乳化するまで混合する。この混合液を、例えば
マウスの皮下に投与する（第１回免疫）。以後、２〜４
週間の間隔で同様の操作を行い、数回免疫する。最終免
疫から数日後に脾臓を無菌的に取り出し、ステンレスメ
ッシュなどで押しつぶして脾臓細胞を調製し、細胞融合
工程に用いる。

細胞融合に用いるもう一方の親細胞であるミエローマ
細胞（骨髄腫細胞）としては、各種の公知の細胞株、例
えば、p3（p3/×63−Ag8）〔Nature,256,495−497（197
5）〕、p3−U1〔CurrentTopics in Microbiology and I
mmunology,81;1−７（1978）〕、NS−１〔Eur.J.Immuno
l.,6;511−519（1976）〕、MPC−11〔Cell,8;405−415
（1976）〕、SP2/0〔Nature,276;269−270（1978）〕、
FO〔J.Immunol.Meth.,35;1−21（1980）〕、×63.6.55.
3〔J.Immunol.,123;1548−1550（1979）〕、S194〔J.Ex
p.Med,148;313−323（1978）〕、又はラットにおけるR2
10〔Nature,277;131−133（1979）〕などを使用するこ
とができる。

免疫脾臓細胞とミエローマ細胞との細胞融合は通常の
方法で行うことができ、例えば、公知の融合促進剤（ポ
リエチレングリコール又はセンダイウイルスなど）を用
い、場合により補助剤（ジメチルスルホキシドなど）を
用いることもできる。免疫脾臓細胞とミエローマ細胞と
の使用比率も常法と同様でよく、例えば、エミローマ細
胞に対して脾臓細胞を約１〜10倍程度の量で用いる。融
合用培地としては、例えば、40％（w/v）ポリエチレン
グリコールを含むダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）
を用いることができる。融合は、前記の培地内で免疫脾
臓細胞とミエローマ細胞とをよく混合することによって
行う。続いて、選別用培地（例えば、HAT培地）を用い
てハイブリドーマ以外の細胞を除去し、ハイブリドーマ
培養上清の抗体産生の有無を、例えばELISA法によって
測定し、目的とするハイブリドーマを分離する。

こうして得られた、モノクローナル抗体PIC−１、PIC
−２又はPIC−３を分泌するハイブリドーマPIC−１、PI
C−２又はPIC−３は、通常の培地で継代培養することが
でき、また液体窒素等の中で容易に長期間保存すること
ができる。

また、前記のハイブリドーマを培養する培地として
は、ハイブリドーマの培養に適した任意の培地を用いる
ことができ、好適にはDMEMにウシ胎児血清、Ｌ−グルタ
ミン、Ｌ−ピルビン酸及び抗生物質（ペニシリンＧとス
トレプトマイシン）を含む培地が用いられる。

前記のハイブリドーマの培養は、イン・ビトロの場合
には例えば培地中で５％CO₂濃度及び37℃で約３日間、
またイン・ビボ例えばマウスの腹腔中で培養する場合に
は約14日間実施するのが好ましい。

前記のハイブリドーマPIC−１、PIC−２又はPIC−３
を常法によって培養した培養液から、あるいは前記３種
のいずれかのハイブリドーマを投与した適当な哺乳動物
（例えばマウス又はラット）の腹水から、目的とするモ
ノクローナルを分離し、精製することが可能である。

このようにして製造された培養液又はマウスの腹水か
らモノクローナル抗体を分離、精製する場合にはタンパ
ク質の単離、精製に一般的に用いられる方法を用いるこ
とが可能である。そのような方法としては硫安塩析、イ
オン交換クロマトグラフィー、分子篩ゲルを用いる分子
篩カラムクロマトグラフィー、プロテインＡ結合多糖類
を用いる親和性カラムクロマトグラフィー、透析、凍結
乾燥の方法等がある。

こうして得られた抗PICモノクローナル抗体は、その
反応性によって以下の３種に分類することができる。

（１）PIC及びプラスミノーゲンとは反応するが、α_２
−プラスミンインヒビターとは反応しない第１のモノク
ローナル抗体（PIC−１）。

（２）PIC及びα_２−プラスミンインヒビターとは反応
するが、プラスミノーゲンとは反応しない第２のモノク
ローナル抗体（PIC−２）。

（３）PICとは反応するが、プラスミノーゲン及びα_２
−プラスミンインヒビターとは反応しない第３のモノク
ローナル抗体（PIC−３）。

前記の第１のモノクローナル抗体（PIC−１）は、好
ましくはヒトプラスミノーゲンのクリングル２及びクリ
ングル３を含む領域を認識する。

前記の第１〜第３の抗PICモノクローナル抗体を不溶
性担体に固定化させ、それらの少なくとも２種を被検試
料と接触させると、被検試料中の遊離のプラスミノーゲ
ン及びα_２−プラスミンインヒビターとは凝集反応を起
こさず、PICとの間でのみ凝集反応を起こさせることが
できるので、PICの免疫学的定量方法に用いることがで
き、そして免疫学的定量用試薬としても有用である。

本発明の免疫学的定量方法に用いる被検試料は、PIC
を含有する可能性のある試料であれば特に制限されるも
のではないが、例えば、生体試料、特には血液、血清、
血漿又は尿、好ましくは血漿である。本発明の免疫学的
定量方法においては、被検試料を希釈せずに、そのまま
使用しても、被検試料中に遊離の状態で存在するプラス
ミノーゲン及びα_２−プラスミンインヒビターの妨害を
避けることができる。即ち、本発明方法によれば、被検
試料中に存在するプラスミノーゲン及びα_２−プラスミ
ンインヒビターの干渉を受けずに、ヒトプラスミン−α
_２−プラスミンインヒビター複合体の測定を行うことが
できる。

不溶性担体としては、高原抗体の凝集反応を利用する
免疫学的測定方法において一般的に用いられる任意の不
溶性担体を用いることができ、例えば、ラテックス粒子
（特には、ポリスチレンラテックス粒子）を挙げること
ができる。

モノクローナル抗体を不溶性担体に固定化させるに
は、公知の方法、例えば、化学結合法（架橋剤としてカ
ルボジイミド、グルタルアルデヒド等を用いる）又は物
理吸着法を用いることができる。こうして、モノクロー
ナル抗体と不溶性担体との複合体を形成し、これを本発
明の免疫学的定量方法に用いることができる。

本発明の免疫学的定量方法においては、前記の不溶性
担体に固定化した少なくとも２種のモノクローナル抗体
を使用するが、或る１種のモノクローナル抗体を不溶性
担体に固定化して調製した複合体を２種又は３種用いる
か、あるいは、２種又は３種のモノクローナル抗体を或
る１種の不溶性担体に固定化して調製した複合体を用い
ることができる。更に、或る１種のモノクローナル抗体
を不溶性担体に固定化して調製した複合体１種と、２種
のモノクローナル抗体を或る１種の不溶性担体に固定化
して調製した複合体１種との組み合わせを用いることも
できる。

モノクローナル抗体２種の組み合わせは任意でよい
が、前記の第１のモノクローナル抗体（PIC−１）と第
２のモノクローナル抗体（PIC−２）との組み合わせを
用いるのが好ましい。

本発明の測定方法においては、前記のモノクローナル
抗体固定化不溶性担体複合体の既知一定量と未知量のPI
Cを含有する水性被検試料の一定量とを適当な反応容器
（例えば、スライド板上あるいは反応セル）中で接触さ
せる。例えば血漿試料の場合には、血漿試料（非希釈
液）１容量部に対して前記の複合体懸濁水（１％以上の
濃度）を１容量部又は１容量部以上加えて接触させる。
また、凝集像をより鮮明にするために、試料と複合体懸
濁水に更に緩衝液（例えば、トリス塩酸緩衝液）を加え
て接触させてもよい。こうして形成される凝集の程度か
らPIC濃度の定量を行うことができる。この凝集反応
は、血漿試料中に存在する遊離のプラスミノーゲン及び
α_２−プラスミンインヒビターの妨害を受けない。例え
ば、スライド板の場合には目視的に、反応セルの場合は
特定の波長を用いて分光学的に凝集反応を測定し、非検
試料中のPIC濃度を定量することができる。

実施例次に、本発明を実施例により更に詳細に説明するが、
本発明は以下の実施例によって限定されるものではな
い。

実施例1:PICの精製（ａ）ヒトプラスミン−α_２−プラスミンインヒビター
複合体（PIC）の精製はPlowらの方法（J.Lab.Clin.Med.
93,199−209,1979）に従って行った。簡単に説明する
と、ヒト（健常人）血漿100mlをリジン−セファロース
カラム（ベッド容量、100ml）に通過させ、プラスミノ
ーゲンを除去た。プラスミノーゲン不含のこの血漿に、
プラスミン水溶液（60μg/ml）100mlを徐々に加えた
後、37℃で10分間保温した。反応後の水溶液をリジン−
セファロースカラム（ベッド容量、200ml）に通し、PIC
を吸着させた。PIC吸着カラムを0.1Mリン酸緩衝生理食
塩水（PBS）洗浄した後、50mMε−アミノカプロン酸を
含むPBSでPICを溶出させた。

更に、得られたPICをウルトロゲルACA44による分子篩
クロマトグラフィーによって精製した。この精製PICを
免疫原及び抗PICモノクローナル抗体のスクリーニング
に使用した。

（ｂ）免疫化脾臓細胞の調製： PIC免疫原溶液（A280nm＝0.1）を等量のフロインド氏
完全アジュバンドと乳化するまで混合し、その混合液20
0μｌをBALB/c系マウスの腹腔内に投与することにより
免疫を行った（第１回免疫）。30日経過後、前記と同様
の混合液200μｌを前記マウスの腹腔内に投与した（第
２回免疫）。第２回免疫から21日経過後、PIC免疫原溶
液（A280nm＝0.1）を等量の生理食塩水で希釈して調製
したPIC希釈液200μｌを、前記マウスの静脈内に投与し
た（最終免疫）。最終免疫から３日経過後、脾臓を無菌
的にマウスから取り出し、次の細胞融合工程に使用し
た。

（ｃ）細胞融合 15％ウシ胎児血清を含むDME培地5mlを入れたシャーレ
に、無菌的に抽出した前記の脾臓を入れた。次に、15％
ウシ胎児血清を含むDME培地約15mlで前記脾臓を還流し
て脾臓細胞を流出させた後、この脾臓細胞懸濁液をナイ
ロンメッシュに通した。この脾臓細胞を50ml遠心チュー
ブに集め、500×ｇで10分間遠心した。こうして得たペ
レットにヘモライジング溶液（155mM−NH₄Cl、10mM−KH
CO₃、1mM−Na₂EDTA:pH7.0）4mlを加え、懸濁させた。０
℃で５分間放置して懸濁液中の赤血球を破壊させた。15
％ウシ胎児血清10mlを含むDME培地を加えてから遠心分
離した。こうして得たペレットをDME培地で遠心法によ
り洗浄し、生きている脾臓細胞数を測定した。

一方、予め培養しておいたマウスエミローマ細胞（骨
髄腫細胞）SP2/0−Ag14（理化学研究所ジーンバンク細
胞銀行）約２×10⁷個に前記脾臓細胞１×10⁸個を加え、
DME培地中でよく混合し、遠心分離を行った（500×ｇ、
10分間）。その上清を吸引し、ペレットをよく解きほぐ
し、40％ポリエチレングリコール4000溶液（38℃に保
温）0.5mlを滴下し、遠心チューブを手で１分間穏やか
に回転することによってポリエチレングリコール溶液と
細胞ペレットとを混合させた。次に、38℃に保温してお
いたDME培地を30秒毎に1mlずつ加えて、チューブを穏や
かに回転させた。この操作を10回繰り返した後、15％ウ
シ胎児血清20mlを含むDME培地を加えて、遠心分離（500
×ｇ、10分間）を行った。上清を除去した後、15％ウシ
胎児血清を含むHAT培地（DME培地にアミノプテリン４×
10^-7、チミジン1.6×10^-5M,ヒポキサンチン１×10^-4Mに
なるように添加したもの）で細胞ペレットを遠心法によ
って２回洗浄した後、前記HAT培地40mlに懸濁した。こ
の細胞懸濁液を96ウエル細胞培養プレートの各ウエルニ
200μｌずつ分注し、５％炭酸ガスを含む炭酸ガス培養
器で37℃にて培養を開始した。培養中、２〜３日間隔で
各ウエルの培地を約100μｌ除き、新たに前記のHAT培地
100μｌを加えることによりHAT培地中で増殖するハイブ
リドーマを選択した。８日目から15％ウシ胎児血清を含
むHT培地（DME培地にチミジン1.6×10^-5M、ヒポキサン
チン１×10^-4Mになるように添加したもの）に交換し、
ハイブリドーマを観察するとともに、10日目に、後記の
ELISA法により、PIC抗体産生ハイブリドーマをスクリー
ニングした。

（ｄ）ハイブリドーマの樹立ハイブリドーマ培養液の上清における産生抗体の有無
はELISA法により測定した。96ウエルELISA用プレート
（Immulon II、日本ダイナテック株式会社）の各ウエル
に前記のPIC免疫原溶液（A280nm＝0.05、生理食塩水で
希釈した）50μｌずつを分注し、25℃で２時間放置し
た。次に、0.05％Tween20−生理食塩水で３回洗浄した
後、各ウエルに培養液上清50μｌを加え、25℃で１時間
反応させた。

次に、Tween20−生理食塩水で200倍に希釈したペルオ
キシターゼ結合抗マウス抗体（ダコ社、デンマーク）50
μｌを各ウエルに加えた。反応終了後、0.05％Tween20
−生理食塩水で各ウエルを３回洗浄し、0.5mMアミノア
ンチピリン、10mMフェノール及び0.005％過酸化水素水
を含む溶液250μｌを各ウエルに加え、25℃で30分間反
応させ、各ウエルの490nmにおける吸光度を測定した。
その結果、192ウエル中、３ウエルに抗体産生が認めら
れた。その３ウエル中のハイブリドーマを24ウエルプレ
ートに移し、15％ウシ胎児血清を含むHT培地で４〜５日
間培養した。その後、再度ELISA法によって抗PIC抗体の
産生の有無を確認してから限界希釈法によりクローニン
グした。限界希釈法は、HT培地でハイブリドーマが５個
/mlとなるように希釈した細胞浮遊液を、予め正常BALB/
C系マウスの腹腔細胞がウエル当たり２×10⁴個分注して
ある96ウエルプレートの各ウエルに100μｌずつ分注し
た。10日後、ELISA法によって抗PIC特異的抗体を産生す
るハイブリドーマのクローンをスクリーニングした。

その結果、各ハイブリドーマにつき、20〜40個の抗体
産生クローンが得られた。これらのクローンの中から、
増殖力が強く、抗体分泌能が高く、しかも安定なクロー
ンを選び、前記と同様の方法で再クローン化を行い、３
種の抗PIC抗体産生ハイブリドーマPIC−１、PIC−２及
びPIC−３を樹立した。これら３種のハイブリドーマか
ら分泌される３種のモノクローナル抗体PIC−１、PIC−
２及びPIC−３とヒトプラスミノーゲン（アテンズ・リ
サーチ社、アメルカ）あるいはヒトα_２−プラスミンイ
ンヒビター（アテンズ・リサーチ社、アメリカ）との反
応性を、96ウエルELISA用プレートにヒトプラスミノー
ゲンあるいはヒトα_２−プラスミンインヒビターを被覆
し、前記のELISA法と同様の方法により調べた。モノク
ローナル抗体PIC−１はヒトプラスミノーゲンと反応し
たが、ヒトα_２−プラスミンインヒビターとは反応しな
かった。モノクローナル抗体PIC−２はα_２−プラスミ
ンインヒビターと反応したが、ヒトプラスミノーゲンと
は反応しなかった。一方、モノクローナル抗体PIC−３
はヒトプラスミノーゲンにも、ヒトα_２−プラスミンイ
ンヒビターにも反応しなかった。

前記の各ハイブリドーマは通商産業省工業技術院微生
物工業技術研究所（あて名：〒305日本国茨城県つくば
市東１丁目１番３号）に1990年12月４日から国内寄託さ
れ、1991年12月16日から国際寄託に移管されている。国
際寄託番号（国際寄託番号につづく［］内は国内寄託番
号）は、ハイブリドーマPIC−１が微工研条寄第3681号
（FERM BP−3681）［微工研菌寄第11888号（FERM Ｐ
−11888）］、ハイブリドーマPIC−２が微工研条寄第36
82号（FERM BP−3682）［微工研菌寄第11889号（FERM
Ｐ−211889）］そしてハイブリドーマPIC−３が微工
研条寄第3683号（FERM BP−3683）［備工研菌寄第1189
0号（FERM Ｐ−11890）］である。

実施例2:モノクローナル抗体の製造（ａ）イン・ビトロ法マウスハイブリドーマPIC−１、PIC−２及びPIC−３
を、それぞれ15％ウシ胎児血清を含むDME培地で、37℃
で５％二酸化炭素雰囲気中において72〜96時間培養し
た。培養物を遠心分離（10000×ｇ、10分間）後、上清
に固形の硫酸アンモニウムを50％最終濃度となるように
徐々に加えた。混合物を氷冷下で30分間攪拌した後、60
分間放置してから遠心分離（10000×ｇ、10分間）処理
し、得られた沈渣を少量の10mMリン酸緩衝液（pH8.0）
に溶解し、1000倍量の10mMリン酸緩衝液ですでに平衡化
したDEAE−セルロースのカラムに充填した。モノクロー
ナル抗体の溶出は10mMリン酸緩衝液（pH8.0）と0.2M−N
aClを含む10mMリン酸緩衝液（pH8.0）の間で濃度勾配法
により行った。溶出されたモノクローナル抗体を限外
過法で濃縮し、0.1Mリン酸緩衝液（pH8.0）に対して透
析した。ウシ血清IgGを除くために、透析物をヨギ抗ウ
シ血清IgG−セファロース4Bカラムに通した。次に、通
過液を0.1Mリン酸緩衝液（pH8.0）で平衡化したプロテ
インＡ−セファロース4Bカラムに充填した。カラムをpH
3.5の緩衝液で溶出して、精製した抗PIC特異モノクロー
ナル抗体PIC−１、同様にモノクローナル抗体PIC−２、
及びモノクローナル抗体PIC−３の溶液を得た。

（ｂ）イン・ビボ法プリスタン（2,6,10,14−テトラメチルペンタデカ
ン）0.5mlを10〜12週齢のBALB/c系マウスの腹腔内に投
与し、それから14〜20日目のマウスの腹腔内にインビト
ロで増殖されたハイブリドーマPIC−１、PIC−２、又は
PIC−３をマウス一匹あたり２×10⁶個となるように接種
した。各ハイブリドーマにつき一匹のマウスから約10〜
15mlの腹水が得られた。その抗体濃度は、２〜10mg/ml
であった。腹水中のモノクローナル抗体の精製は、前記
のイン・ビトロ精製と同様の方法（但し、ヤギ抗ウシ血
清IgG−セファロース4Bのカラムを通す操作を除く）で
行なった。

実施例3:モノクローナル抗体の免疫グロブリンクラス及
び特異性の同定抗PIC特異モノクローナル抗体PIC−１、PIC−２及びP
IC−３の免疫グロブリンクラス及び特異性の同定はそれ
ぞれオクテロニー免疫拡散法、エンザイムイムノアッセ
イ法及びイムノブロット法により行った。結果は表１に
示す通りである。

表１において、「＋」はELISA法で反応を示すこと
を、そして「−」はELISA法で反応を示さないことを意
味する。更に、「有」はイムノブロット法で反応を示す
ことを、そして「無」はイムノブロット法で反応を示さ
ないことを意味する。

実施例4:抗体と不溶性担体（ラテックス）との結合モノクローナル抗体PIC−１（2.0mg/ml）を含有する
水溶液2mlと、ラテックス溶液（２％、Dow Chemical
社：粒径0.482μｍ）2mlとを混合し、約１時間攪拌し
た。遠心（20,000×ｇ、10分間）した後、沈澱を0.1％B
SA溶液に懸濁し、約１時間攪拌した。再び遠心（20,000
×ｇ、10分間）した後、沈澱を水に懸濁し、約２時間攪
拌した。こうして、モノクローナル抗体PIC−1/ラテッ
クス複合体含有液を得た。同様にしてモノクローナル抗
体PIC−２又はモノクローナル抗体PIC−３を用いて、単
独の各モノクローナル抗体とラテックスとの複合体の含
有液を調製した。

抗体混合物とラテックスとの複合体は以下のように調
製した。モノクローナル抗体PIC−１、モノクローナル
抗体PIC−２及びモノクローナル抗体PIC−３をそれぞれ
0.66mg/mlずつ含有する水溶液2mlと、ラテックス溶液
（２％、Dow Chemical社：粒径0.482μｍ）2mlとを混合
し、約１時間攪拌した。以下、前記と同様に処理して、
モノクローナル抗体PIC−1/モノクローナル抗体PIC−2/
モノクローナル抗体PIC−3/ラテックス複合体を調製し
た。

モノクローナル抗体PIC−１及びモノクローナル抗体P
IC−２をそれぞれ1mg/mlずつ含有する水溶液とラテック
ス溶液とを等量混合すること以外は前記と同様にして、
モノクローナル抗体PIC−1/モノクローナル抗体PIC−2/
ラテックス複合体を調製した。

実施例５スライド凝集反応による定量実施例４で調製した抗体ラテックス複合体含有液40μ
ｌと種々な濃度のPICを含有する水溶液40mlとをスライ
ドガラス上で混合し、揺動して３分後に凝集像を目視的
に判定した。結果を以下の表２に示す。

表２において、「＋」は凝集ありを、そして「−」は
凝集なしを各々意味する。また、表２の抵抗／ラテック
ス複合体の欄において、複合体の種類をその複合体に結
合するモノクローナル抗体によって示す。従って、例え
ばPIC−１はモノクローナル抗体PIC−1/ラテックス複合
体を意味し、PIC−１＋PIC−２はモノクローナル抗体PI
C−1/ラテックス複合体とモノクローナル抗体PIC−2/ラ
テックス複合体との等量混合液を意味する。更に、PIC
−1/PIC−２はモノクローナル抗体PIC−1/モノクローナ
ル抗体PIC−2/ラテックス複合体を意味する。

実施例6:精製PICの添加回収試験５種の検体（健常人Ａ、健常人Ｂ、DIC患者Ｃ、DIC患
者Ｄ及びDIC患者Ｅから採取した血漿）中のPIC濃度を、
実施例５のモノクローナル抗体PIC−1/モノクローナル
抗体PIC−2/ラテックス複合体溶液を用いて測定した。
次いで、それぞれの検体に精製PIC2μg/ml、４μg/ml及
び８μg/mlを添加し、添加回収試験を行った。測定値は
検体を倍々希釈して凝集の消失する希釈倍数から半定量
的に測定した。結果は表３に示すように、良好な回収が
得られた。

実施例7:健常人とDIC患者群のPIC値実施例６で使用したモノクローナル抗体PIC−1/モノ
クローナル抗体PIC−2/ラテックス複合体溶液を用い
て、健常人血漿12検体、DIC患者血漿15検体のPIC量を測
定した。結果を図１に示す。健常人群のPIC量は全例１
μg/ml未満であった。それに対してDIC患者群は全例２
μg/ml以上であった。

産業上の利用可能性以上詳細に説明したとおり、本発明によれば、血漿試
料の希釈操作を行わなくても、血漿中の遊離プラスミノ
ーゲン及び遊離α_２−プラスミンインヒビターの干渉を
受けることなく、患者血漿中のPIC量を特異的に、簡便
かつ迅速に、凝集法により測定することができる。これ
は、本発明によって初めて可能になったものである。従
って、本発明はDIC等の診断及び病理研究に有用な手段
を提供するものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) G01N 33/577 C07K 16/36 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】不溶性担体に固定化された、（１）ヒトプ
ラスミン−α_２−プラスミンインヒビター複合体及びヒ
トプラスミノーゲンと特異的に反応し、ヒトα_２−プラ
スミンインヒビターとは反応しないモノクローナル抗
体、（２）ヒトプラスミン−α_２−プラスミンインヒビ
ター複合体及びヒトα_２−プラスミンインヒビターと特
異的に反応するモノクローナル抗体、及び（３）ヒトプ
ラスミン−α_２−プラスミンインヒビター複合体と特異
的に反応し、ヒトプラスミノーゲン及びヒトα_２−プラ
スミンインヒビターとは反応しないモノクローナル抗体
少なくとも２種と、被検試料とを接触させ、被検試料に
おける凝集反応を観察することを特徴とする、ヒトプラ
スミン−α_２−プラスミンインヒビター複合体の測定方
法。