DK174317B1 - Fremgangsmåder til fremstilling af et humaniseret immunoglobulin, polynucleotid kodende for et sådant, cellelinie transformeret med polynucleotidet samt anvendelse af et sådant humaniseret immunoglobulin til fremstilling af et lægemiddel - Google Patents

Description

i DK 174317 B1

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til fremstilling af et humaniseret immunoglobulin, hvor der er udført mindst en aminosyresubstitutuion udenfor de komplementaritetsbestemmende regioner (CDR'er) som defi-5 neret af Kabat et al. ("Sequences of Proteins of Immunological Interest", Kabat, E. et al., US Department of Health and Human Services (1983)) sammen med Cholthia et al. (Cholthia og Lesk, J.Mol.Biol., 196; 901-917 (1987)), eller udtrykt på anden måde ved fremstilling 10 af et humaniseret immunoglobulin ud fra humaniserede tunge og lette immunoglobulinkæder, hver med en rammeregion fra et humant acceptorimmunoglobulin og komplementaritetsbestemmende regioner (CDR'er) fra et donor immunoglobulin, der er i stand til at binde til et 15 antigen. Opfindelsen angår endvidere et polynucleotid, omfattende en første sekvens kodende for en humanagtig ikke CDR immunoglobulinrammeregion og en anden sekvens kodende for en eller flere CDR'er, en med polynucleoti-det transficeret cellelinie, en fremgangsmåde til frem-20 stilling af et humaniseret immunoglobulin ved dyrkning af cellelinien samt anvendelse af et sådant immunoglobulin eller et bindende fragment deraf til fremstilling af et lægemiddel.

Hos pattedyr medieres immunresponsen af to typer 25 af celler, der specifikt vekselvirker med fremmed materiale, dvs. antigener. En af disse celletyper, B-cel-ler, er ansvarlig for produktion af antistoffer. Den anden celleklasse, T-celler, inkluderer en lang række cellulære undergrupper, der kontrollerer in vivo funk-30 tionen af både B-celler og en lang række andre hæma-topoletiske celler, deriblandt T-celler.

Én måde, hvorpå T-celler udøver denne kontrol, er ved produktionen af et lymfokin kendt som interleu-kin-2 (IL-2), oprindelig betegnet τ-celle vækstfaktor.

35 Den vigtigste funktion hos IL-2 synes at være stimule- 2 DK 174317 B1 ring og opretholdelse af T-celler. Nogle immunologer mener ovenikøbet, at IL-2 ligger i centrum for hele immunresponses (se Farrar, J. et al., Immunol. Rev. 63: 129-166 (1982)) .

5 Til udøvelse af sine biologiske virkninger veksel virker IL-2 med en specifik højaffinitetsmembranrecep-tor (Greene, W. et al., Progress in Hematology XIV, E.

Brown ed., Grune and Statton, New York (1986), se side 283 ff.) . Den humane IL-2 receptor er et komplekst man-10 gekædet glycoprotein, hvori en kæde, der kendes som Tac peptidet, har en størrelse på ca. 55 kD (se Leonard, W. et al., J. Biol. Chem. 260: 1872 (1985)). Man har isoleret et gen, der koder for dette protein, og det forudsiger et peptid på 272 aminosyrer inkluderende et 21 15 mainosyre signalpeptid, (se Leonard, W. et al., Nature 311: 626 (1984)). De 219 NH2-terminale aminosyrer i p55 Tac proteinet omfatter tilsyneladende et ekstracellu-lært domæne (se Leonard, W. et al., Science 230: 633-639 (1985)).

O Λ

Meget af opklaringen af struktur og funktionen hos den humane IL-2 receptor skyldes udviklingen af specifikt reaktive monoklonale antistoffer.

Især har ét muse monoklonalt antistof, kendt som anti-

Tac (Uchiyama, et al., J. Immunol. 126:1393 (1981)) o c vist, at IL-2 receptorer kan påvises på T-celler, men også på celler af monocyt-makrofag-familien, Kupffer celler fra leveren, Langerhans' celler fra huden og naturligvis på aktiverede T-celler. Det er vigtigt, at hvilende T-celler, B-celler eller cirkulerende makrofa-30 ger typisk ikke opviser IL-2 receptoren (Herrmann, et al., J. Exp. Med. 162:1111 (1985)).

Man har også benyttet det anti-Tac monoklonale antistof til at definere lymfocytfunktioner, der kræver IL-2 vekselvirkning, og man har vist, at det inhiberer 35 forskellige T-celle funktioner, deriblandt dannelsen af / 3 DK 174317 B1 cytotoksiske og undertrykkende τ lymfocyter i cellekultur. Baseret på undersøgelser .med anti-Tac og andre antistoffer har man nu forbundet en række sygdomme med dårlig IL-2 receptor eksprimering af τ-celler, især 5 voksen T-celle leukæmi.

Man har i nyere tid vist, at IL-2 receptoren er et ideelt mål for nye forsøg på behandling af T-celle medierede sygdomme. Man har foreslået, at antistoffer, der er specifikke for IL-2 receptoren såsom det anti-10 Tac monoklonale antistof, enten kan benyttes alene eller som et immunkonjugat (eksempelvis med Ricin A, isotoper og lignende) til effektivt at fjerne celler, der bærer IL-2 receptoren. Disse midler kan f.eks. i teorien eliminere IL-2 receptoreksprimerende leukæmiske cells ler, visse B-celler eller aktiverede T-celler, der er involveret i en sygdomstilstand og alligevel tillade opretholdelse af modne normale τ-celler og forløbere derfor, så evnen til at sikre en normal T-celle immun-respons bevares. Almindeligvis kan de fleste andre T-20 celle specifikke midler i det væsentlige ødelægge alle perifere τ-celler, hvilket begrænser sådanne midlers terapeutiske effektivitet. Alt i alt kan anvendelse af passende monoklonale antistoffer, der er specifikke for IL-2 receptoren, være terapeutisk nyttige ved autoimmu-25 ne sygdomme, organtransplantation og eventuelle uønskede responser af aktiverede Τ-celler. Man har også påbegyndt kliniske forsøg under anvendelse af eksempelvis anti-Tac antistoffer (se Waldman, T. et al., Cancer Res. 45:625 (1985) og Waldman, T., Science 232:727-732 30 (1986 )1.

Desværre har anvendelse af anti-Tac og andre ikke humane monoklonale antistoffer visse ulemper, især ved gentagen terapi som forklaret nedenfor. Eksempelvis fikserer musemonoklonale antistoffer ikke humant kom-35 piement godt og mangler andre vigtige immunoglobulin- 4 DK 174317 B1 \ funktionelle karakteristika, når de benyttes på mennesker .

Det er måske mere vigtigt, at anti-Tac og andre ikke humane monoklonale antistoffer indeholder væsent-5 lige længder af aminosyresekvenser, der vil være immunogene, når de indsprøjtes i et menneske. Adskillige undersøgelser har vist, at immunresponsen efter indsprøjtning af et fremmed antistof, som en patient udøver mod et antistof kan være temmelig kraftig og i det 10 væsentlige eliminere antistoffets terapeutiske nytte efter en første behandling. Da man ydermere kan vente, at voksende antal af forskellige muse- eller andre antigene (for mennesker) monoklonale antistoffer vil blive udviklet til behandling af forskellige sygdomme, kan 15 behandlinger efter den første og anden behandling med et hvilken som helst andet ikke humant antistof selv for terapeutiske behandlinger, der ikke står i forbindelse hermed, være ineffektive og i visse tilfælde endog farlige.

20 Selv om produktionen af såkaldte "kimæriske an tistoffer" (eksempelvis musevariable regioner føjet til humane konstante regioner) har vist sig til dels succesfulde, er der et betydeligt problem med immunogeni-tet tilbage. Alment har produktionen af humane immuno-25 globuliner, der er reaktive med den humane IL-2 receptor, som med mange humane antigener, været overordentlig vanskelig, når man benytter typisk human monoklonal antistofproduktionsteknik. På lignende måde har benyttelse af rekombinant DNA teknologi til fremstilling af 20 såkaldte "humaniserede" antistoffer (se f.eks. EPO skrift nr. 0239400) givet usikre resultater, til dels på grund af uforudsigelige bindingsaffiniteter.

Der er således et behov for forbedrede former af humanagtige immunoglobuliner såsom sådanne, der er spe-35 cifikke for human IL-2 receptor, der i det væsentlige 5 DK 174317 B1 er ikke-immunogene overfor mennesker, men alligevel kan produceres let og økonomisk på en måde, så de er egnet til terapeutisk formulering og til andre anvendelser. Opfindelsen opfylder dette og andre behov.

5 Det har nu vist sig, at man kan tilvejebringe humanagtige immunoglobuliner ud fra på overraskende måde konstruerede humanagtige tunge og lette immuno-globul inkaeder, omfattende at man foretrukket først sammenligner rammeregions- eller variabel regions aminosy-10 resekvenser fra donorimmunoglobulinet med tilsvarende sekvenser i en samling af humane immunoglobulinkæder, og som det humane immunoglobuling udvælger en af de mere homologe sekvenser fra samlingen. Det humane immunoglobulin eller acceptorimmunoglobulinsekvensen udvælges 15 typisk fra en samling af mindst 10-20 immunoglobulin-kædesekvenser, og vil sædvanligvis have den højeste homolog! til donorimmunoglobulinsekvensen af alle sekvenserne i samlingen. Den humane immunoglobulinrammese-kvens vil typisk have ca. 65-70% homologi eller mere 20 til donorimmunoglobulinrammesekvenserne. Donorimmunoglobulinet kan enten være et let kæde eller tung kæde (eller begge) og den humane samling vil indeholde samme slags kæde. Man kan benytte en humaniseret let og tung kæde til at danne et fuldstændig humaniseret immunoglo-25 bulin eller antistof med to let/tunge kædepar med eller uden delvise eller fuldstændige humane konstante regioner og andre proteiner.

Mere specifikt er fremgangsmåden ifølge opfindelsen til fremstilling af et humaniseret immunoglobulin 3 0 ejendommelig ved, at mindst en aminosyre fra et ikke CDR variabelt område fra et ikke humant donor-immunoglobulin substitueres, og hvor i det humaniserede immunoglobulin aminosyresekvensen for andet end CDR'erne i den variable region omfatter mindst 70 aminosyrer iden-35 tiske med en variabel region aminosyresekvens fra et 6 DK 174317 B1 acceptor human immunoglobulin, og CDR'erne er fra den variable region i det nævnte ikke humane donor-immunoglobulin, idet dog den nævnte aminosyresubstitution er sket udenfor den hypervariable Cholthia-sløjfe Hl.

5 Udtrykt som en opfinderisk fremgangsmåde til fremstilling af et humaniseret immunoglobulin ud fra humaniserede tunge og lette immunoglobulinkæder, er denne ejendommelig ved, at man substituerer mindst en ikke CDR rammeregions-aminosyre fra acceptorimmunoglo-10 bulinet med en tilsvarende aminosyre fra donorimmuno-globulinet ved en position i immunoglobulinet, hvor: (a) aminosyren i den humane rammeregion fra acceptor-immunoglobulinet er sjælden i denne position, og den tilsvarende aminosyre fra donorimmunoglobu- 15 linet er almindelig for denne position i humane immunoglobulinsekvenser; eller (b) aminosyren er umiddelbart nabostillet til en af CDR'erne; eller (c) aminosyren forudsiges at besidde et sidekæde- 20 atom, der kan vekselvirke med antigenet eller med CDR'erne fra det humaniserede immunoglobulin; forudsat at den nævnte aminosyresubstitution er uden for den hypervariable Cholthia-sløjfe Hl, og at man benytter således humaniserede lette og tunge kæder til 25 at danne et fuldstændigt humaniseret immunoglobulin.

Den humaniserede immunoglobulinkæde vil typisk omfatte mindst ca. 3 aminosyrer fra donorimmunoglobuli-net ud over CDR'erne, hvoraf sædvanligvis mindst én er umiddelbart nabostillet til en CDR i donorimmunoglobu-30 linet. De tunge og lette kæder kan hver være konstruerede under anvendelse af et hvilket som helst eller alle tre af positionskriterierne.

Når de humaniserede lette og tunge kæder ifølge opfindelsen kombineres til et helt antistof, vil dette 35 i det væsentlige være ikke-immunogent for mennesker og 7 DK 174317 B1 i det væsentlige opretholde den samme affinitet som donorimmunoglobulinet til antigenet (såsom et protein eller anden forbindelse, der indeholder en epitop).

Disse affinitetsniveauer kan variere fra ca. ίο8 M-1 5 eller højere, og kan være indenfor ca. 4 gange donorim-munoglobulinets oprindelige affinitet til antigenet.

Idet de ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen tilgængelige humaniserede immunoglobuliner (og også bindende fragmenter deraf) let kan fremstilles ved en ræk-10 ke rekombinante DNA-teknikker, der slutter med ekspression i transficerede celler, især udødeliggjorte euka-ryotiske celler som myelomaceller eller hybridomacel-ler, er polynucleotidet ifølge opfindelsen ejendommeligt ved, at det ved eksprimering koder for et immuno-15 globulin, der kan tilvejebringes ved en fremgangsmåde ifølge opfindelsen som ovenfor anført, cellelinien ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at den er transficeret med et eller flere af sådanne polynucleo-tider, og den genteknologiske fremgangsmåde til frem-20 stilling af et sådant immunoglobulin er ejendommelig ved at man dyrker en sådan cellelinie og isolerer det humaniserede immunoglobulin fra cellekulturmediet. Et immunoglobulin fremstillet ifølge opfindelsen eller et bindende fragment deraf kan, også ifølge opfindelsen, 25 anvendes til fremstilling af et lægemiddel, der især er egnet til behandling af T-celle medierede afvigelser hos en menneskelig patient.

I øvrigt angives foretrukne udførelsesformer for fremgangsmåden ifølge opfindelsen i underkravene 2-6 og 30 8-10.

8 DK 174317 B1

KORT BESKRIVELSE AF TEGNINGEN

Figur 1. Sammenligninger af sekvenser fra anti-5 Tac tung kæde (øvre linier) og Eu tung kæde (nedre linier). Der benyttes 1-bogstavskode for aminosyrer.

Den første aminosyre på hver linie er nummereret til venstre. Identiske aminosyrer i de to sekvenser er forbundet med linier. De 3 CDR'er er understreget. Andre 10 aminosyrepositioner, for hvilke anti-Tac aminosyren snarere end Eu aminosyren blev benyttet i den humaniserede anti-Tac tunge kæde, er betegnet med en *.

Figur 2. Sammenligning af sekvenser fra anti-Tac 15 let kæde (øvre linier) og Eu let kæde (nedre linier).

Der benyttes l-bogstavskode for aminosyre. Den første aminosyre på hver linie er nummereret til venstre. Identiske aminosyrer i de to sekvenser er forbundet med linier. De 3 CDR'er er understregede. Andre aminosyre-20 positioner, for hvilke anti-Tac aminosyren snarere end Eu aminosyren blev benyttet i den humaniserede anti-Tac tunge kæde, er betegnet med en *.

Figur 3. Nucleotidsekvens for genet for det hu-25 maniserede anti-Tac tung kæde variabel region gen. Den translaterede aminsosyresekvens for den del af genet, der koder for protein, vises under nucleotidsekvensen. Nucleotiden TCTAGA ved begyndelsen og ved afslutning af genet er xba I steder. Den modne tunge kædesekvens be-30 gynder med aminosyre nr. 20 Q.

9 DK 174317 B1

Figur 4. Nucleotidsekvens for genet for den humaniserede anti-Tac let kæde variabel region gen. Den translaterede aminosyresekvens for den del af genet, der koder for protein, er vist under nucleotidsekven-5 sen. Nucleotiderne TCTAGA ved begyndelsen og ved slutningen af genet er Xba I steder. Den modne let kæde sekvens begynder med aminosyre nr. 21 D.

Figur 5. A. Sekvenser for de fire oligonucleoti-10 der, der er benyttet til at syntetisere det humaniserede anti-Tac tung kæde gen, trykt fra 51 til 3'. B. Relative positioner for oligonucleotiderne. Pilene peger i 3'-retningen for hvert oligonucleotid.

15 Figur 6. (A) Sekvenser, for de fire oligonucleo- tider, der benyttes til at syntetisere det humaniserede anti-Tac let kæde gen, trykt 5' til 3'. (B) Relative positioner for oligonucleotiderne. Pilene peger i 3'-retningen for hvert oligonucleotid. Der er vist posi-20 tionen for et Hind ill sted i overlappet for JFD2 og JFD3.

Figur 7. Skematisk diagram for plasmidet pHugTACl, der benyttes til at eksprimere den humanise-25 rede anti-Tac tunge kede. De relevante restriktionssteder er vist, og kodende regioner for den tunge kæde er vist som firkanter. Retningen for transkription fra immunoglobulin (Xg) promoteren er vist med en pil.

Eh = tung kæde forstærker, Hyg = hygromycinresistens-30 gen.

10 DK 174317 B1

Figur 8. Skematisk diagram for piesmid pHuLTAC, der benyttes til at eksprimere den humaniserede anti-Tac lette kæde. Relevante restriktionssteder er vist, og kodende regioner for den lette kæde er vist som 5 firkanter. Retningen for transkription fra Ig promote-ren er vist med en pil.

Figur 9. Fluorcytometri for HUT-102 og Jurkat celler farvet med anti-Tac antistof eller humaniseret 10 anti-Tac antistof fulgt henholdsvis af fluorescinkonju-geret gede anti-muse Ig antistof eller gede anti-human Ig antistof, som mærkede. I hver ramme viser den punkterede kurve resultaterne, når man udelod det første antistof, og den fuldt optrukne kurve resultaterne, når 15 man inkluderede første og anden (konjugerede) antistof som beskrevet.

Figur 10. (A) Fluorcytometri af HUT-102 celler farvet med 0-40 ng af anti-Tac som vist, derefter med 2o biotinyleret anti-Tac og derefter med phycoerythrinkon-jugeret avidin. (B) Fluorcytometri af HUT-102 celler farvet med det angivene antistof, derefter med biotinyleret anti-Tac og derefter med phycoerythrinkonjugeret avidin.

25

Man ved, at den grundlæggende strukturelle enhed i et antistof omfatter en tetramer. Hver tetramer er opbygget af to identiske par af polypeptidkæder, hvor hvert par har en "let" (ca. 25kD) og en "tung" kæde 30 (ca. 50-70kD). NH2-terminus for hver kæde påbegynder en variabel region på ca. 100-110 eller flere aminosyrer, der først og fremmest er ansvarlig for antigengenkendelse. COOH-terminus for hver kæde definerer en konstant region, der først og fremmest er an-35 svarlig for effektorfunktion.

11 DK 174317 B1

Lette kæder klassificeres som enten κ eller λ.

Tunge kæder klassificeres (og underklassificeres) som γ, y, α, δ eller ε, og definerer antistoffets isotype som henholdsvis IgG, IgM, IgA, IgD og IgE. Indenfor 5 lette og tunge kæder er de variable og konstante regioner forbundet med en "J" region på omtrent 12 eller flere aminosyrer, idet den tunge kæde også inkluderer en "D" region på omtrent 12 yderligere aminosyrer. (Se alment Fundamental Immunology, Paul, W., Ed., kapitel 10 7, side 131-166, Raven Press, N.Y. (1984)),

De variable regioner i hver par af let/tung kæde danner bindingsstedet i antistoffet. Kæderne opviser alle den samme generelle struktur med temmeligt bevarede rammeregioner forbundet med tre hypervariable regio-15 ner, også kaldet CDR/er (se definitionen i beskrivelsens indledning). CDR'erne fra de to kæder i hvert par er struktureret af rammeregionerne, hvilket tillader binding til en specifik epitop.

I denne forbindelse refererer betegnelsen 2o "immunoglobulin" til et protein, der består af ét eller flere polypeptider, der i det væsentlig kodes for af immunoglobulingener. De anerkendte immunoglobulingener inkluderer κ, λ, α, γ, δ, ε og μ konstant region gener, såvel som et utal af immunoglobulin variabel regionge-25 ner. Immunoglobulinerne kan eksistere i en række former ud over antistoffer; inkluderende f.eks. Fv, Fab og F(ab)2, såvel som i enkelte kæder (se f.eks. Huston, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 85:5879-5883 (1988) og Bird, et al., Science, 242:423-426 (1988) og al-30 ment Hood et al., "Immunology", Benjamin, N.Y., 2. udgave (1984) og Hunkapiller og Hood, Nature 323: 15-16 (1986)).

Kimæriske antistoffer er antistoffer, hvis let og tung kæde gener er konstruerede, typisk ved genetisk 35 manipulation, ud fra immunoglobulinsegmenter, der til- 12 DK 174317 B1 hører forskellige specier. F.eks. kan man forbinde de variable (V) segmenter fra generne fra et muse monoklo-! nalt antistof til humane konstante (C) segmenter, såsom

Yl °9 Y3· Et typisk terapeutisk kimærisk antistof er 1 5 således et hybridprotein, der består af det V eller an tigenbindende domæne fra et muse antistof eller effek-tordomænet fra et humant antistof (eksempelvis udskiller A.T.C.C. deponeringsnummer CRL 9688 et anti-Tac kimærisk antistof), selv om man kan benytte andre patte-10 dyrspecier.

I denne forbindelse refererer udtrykket "ramme-region" til sådanne dele af immunoglobulin let og tung kæde variable regioner, der er relativt bevarede (dvs. andre end CDR’er) blandt forskellige immunoglobuliner 15 hos en enkelt specie, som defineret af Kabat, et al., se ovenfor. I denne forbindelse er en "humanagtig rammeregion" en rammeregion, der i hver eksisterende kæde omfatter mindst ca. 70 eller flere aminosyrerester, typisk 75-85 eller flere rester, der er identiske med så-20 danne i et humant immunoglobulin.

I denne forbindelse refererer betegnelsen "humanagtigt immunoglobulin" til et immunoglobulin, der omfatter en humanagtig ramme, og hvori en hvilken som helst tilstedeværende konstant region i det væsentli-25 ge er homolog til en konstant region i et humant immunoglobulin, dvs. mindst ca. 85-90%, foretrukket omkring 95% identisk. Således er alle dele af et humanagtig immunoglobulin undtagen muligvis CDR'erne i det væsentlige homologe til tilsvarende dele af et eller flere na-30 tive humane immunoglobulinsekvenser. F.eks. vil et humanagtig immunoglobulin ikke omfatte en kimærisk muse variabel region/human konstant region antistof.

Ifølge et andet alment aspekt af opfindelsen inkluderes også kriterier, ifølge hvilke et begrænset an-35 tal aminosyrer i rammeområdet i et humanagtigt eller 13 DK 174317 B1 humaniseret immunoglobulinkæde udvælges til at være de samme som aminosyrer ved sådanne stillinger i donor Xg snarere end i acceptor Xg, for at forøge affiniteten for et antistof, der omfatter den humaniserede immuno-5 globulinkæde. Dette aspekt af opfindelsen er delvis baseret på den antagelse, at to årsager bidrager til tab af affinitet ved tidligere fremgangsmåder til fremstilling af humaniserede antistoffer (hvor man f.eks. benytter muse antistoffer som kilde for CDR'er): 10 (1) Når muse CDR'er kombineres med humant ramme område, bliver aminosyrerne i rammen, der er nær ved CDR'erne, humane i stedet for museagtige. Idet vi ikke føler os bundet af teorien, mener vi, at disse ændrede aminosyrer til en vis grad kan forstyrre CDR'erne, da 15 de skaber andre elektrostatiske eller hydrofobe kræfter end i donormusens antistof, og at de forstyrrede CDR'er ikke foretager en så effektiv kontakt med antigenet, som CDR'erne gjorde i donorantistoffet; (2) Endvidere kan aminosyrer 1 det oprindelige 20 muse antistof, der er nær ved, men ikke er en del af CDR’erne (dvs. stadig del af rammeområdet) foretage kontakter, der fører til affinitet med antigenet. Disse aminosyrer tabes, når antistoffet bliver humaniseret, idet alle rammeaminosyrer gøres humane.

25 Til undgåelse af sådanne problemer og til frem bringelse af humaniserede antistoffer, der har en meget kraftig affinitet for det ønskede antigen, benytter opfindelsen følgende fire kriterier til konstruktion af humaniserede immunoglobuliner. Disse kriterier kan be-30 nyttes enkeltvis eller efter behov i kombination til opnåelse af den ønskede affinitet eller andre karakteristika.

14 DK 174317 B1

Kriterium I: Benyt som acceptor et rammeområde fra et bestemt humant immunoglobulin, der er usædvanlig homologt til det donorimmunoglobulin, der skal humaniseres, eller benyt et consensusrammeområde fra mange 5 humane antistoffer. F.eks. viser sammenligning af sekvensen for en muse tung (eller let) kæde variabel region mod human tung (eller let) variable regioner i en I databank (f.eks. the National Biomedical Research Foun dation Protein Identification Resource), at graden af 10 homologi til forskellige humane regioner varierer meget, typisk fra ca. 40% til ca. 60-70%. Hvis man som acceptorimmunoglobulin vælger en af de humane tunge (henholdsvis lette) kæde variable regioner, der er mest homolog til den tunge (henholdsvis lette) kæde variab-15 le region for donorimmunoglobulinet, vil færre aminosyrer blive ændret, når man går fra donorimmunoglobulinet til det humaniserede immunoglobulin. Således menes det, igen uden binding til teorien, at der er en mindre risiko for at ændre en aminosyre nær ved CDR'erne, der 20 forskyder deres konformation. Derudover kan den nøjagtige totale form for et humaniseret antistof, der omfatter den humaniserede immunoglobulinkæde, tættere ligne formen for donorantistoffet, hvilket også reducerer risikoen for at forstyrre CDR'erne.

25 Typisk vil man udvælge én ud af de 3-5 mest ho mologe tung kæde variable region sekvenser i et repræsentativt udvlag på mindst ca. 10-20 distinkte humane tunge kæder som acceptor til opnåelse af det tung kædede rammeområde og på tilsvarende måde for den lette 30 kæde. Man vil foretrukket benytte én ud af de 1-3 mest homologe variable regioner. Den udvalgte ecceptorimmu-noglobulinkæde vil mest foretrukket have mindst ca. 65% homologi i rammeregionen til donorimmunoglobulinet.

Uafhængig af, hvordan acceptorimmunoglobulinet 35 bliver udvalgt, kan man opnå en højere affinitet ved at 15 DK 174317 B1 udvælge et lille antal aminosyrer i rammeområdet fra den humaniserede immunoglobulinkæde til at være de samme som aminosyrerne ved sådanne positioner i donoren snarere end i acceptoren. De folgende kriterier define-5 rer, hvilke aminosyrer, der kan udvælges på en sådan måde. Man vil foretrække en donoraminosyre, hvor hovedparten eller alle aminosyrepositioner tilfredsstiller ét af disse kriterier.

10 Kriterium II: Hvis en aminosyre i rammeområdet på det humane acceptorimmunoglobulin er usædvanlig (dvs. "sjælden", hvilket i denne forbindelse betegner en aminosyre, der forekommer på dette sted i ikke mere end ca. 10% af humane tunge (henholdsvis lette) kæde V re-15 gion sekvenser i en repræsentativ databank), og hvis donoraminosyren på dennes position er typisk for humane sekvenser (dvs. "almindelig", hvilket i denne forbindelse betegner en aminosyre, der forekommer i det mindste ca. 25% af sekvenserne i en repræsentativ 20 databank), så kan man udvælge donoraminosyren snarere end den fra acceptoren. Dette kriterium hjælper til at sikre, at en atypisk aminosyre i det humane rammeområde ikke forstyrrer antistofstrukturen. Hvis man erstatter en usædvanlig aminosyre med en aminosyre fra donoranti-25 stoffet, der tilfældigvis er typisk for humane antistoffer, kan man ydermere gøre det humaniserede antistof mindre immunogent.

Kriterium III: I de positioner, der er umiddelbart na-30 bostillet til de 3 CDR'er i den humaniserede immunoglo-bulinkæde, kan man vælge donoraminosyren snarere end acceptoraminosyren. Sådanne aminosyrer har især stor sandsynlighed for at vekselvirke med aminosyrerne i CDR'erne og vil, hvis de vælges fra acceptoren, for-35 styrre donor CDR'erne og reducere affiniteten. Derudo- 16 DK 174317 B1 ver kan de nabostillede aminosyrer direkte vekselvirke med antigenet (Amit et al., Science 233: 747-753 (1986)), og det kan være ønskværdigt at udvælge disse aminosyrer fra donoren for at beholde alle de antigen-5 kontakter, der giver affinitet i det oprindelige antistof.

Kriterium IV: En 3-dimensionel model, typisk for det oprindelige donorantistof, viser at visse aminosyrer udenfor CDR'erne nær ved CDR'erne har en god sand-10 synlighed for at vekselvirke med aminosyrer i CDR'erne ved hydrogenbinding, van der Waalske kræfter, hydrofo-biske vekselvirkninger etc. Ved sådanne aminosyreposi-tioner kan man udvælge donoraminosyrer snarere end aminosyrer fra acceptorimmunoglobulinet. Aminosyrer ifølge 15 dette kriterium vil almindeligvis have et sidekædeatom indenfor ca. 3 Å enheder fra en eller anden position i CDR'erne og skal indeholde atomer, der vil kunne vekselvirke med CDR atomer ifølge anerkendte kemiske kræfter såsom sådanne opregnet ovenfor. Computerprogrammer 20 til opstilling af modeller for proteiner såsom antistoffer er alment tilgængelige og velkendt af fagmanden (se Loew et al., Int. J. Quant. Chem., Quant. Biol.

Symp., 15:55-66 (1988); Bruccoleri et al., Nature, 335, 564-568 (1988); Chothia et al., Science, 233:755-758 25 (1986),

Disse udgor ikke en del af opfindelsen. Da alle antistoffer har lignende strukturer, vil kendte antistofstrukturer, der er tilgængelige fra Brookhaven Protein Data Bank kunne benyttes efter behov som grove modeller 30 for andre antistoffer. Man kan benytte kommercielt tilgængelige computerprogrammer til at vise sådanne modeller på en computerskærm til at beregne afstanden mellem atomer og til at vurdere sandsynligheden for, at forskellige aminosyrer vekselvirker (se Ferrln et al., J.

35 Mol. Graphics, 6:13-27 (1988)).

17 DK 174317 B1

Humaniserede eller humanagtige antistoffer har alment mindst tre indbyggede fordele over muse, eller i visse tilfælde kimæriske antistoffer, hvad angår anvendelse i human terapi: 5 1) Da effektordelen er human, kan den bedre vek selvirke med andre dele af det humane immunsystem (dvs. ødelægge målcellerne mere effektivt ved komplementaf-haengig cytotoksicitet (CDC) eller antistofafhængig cellulær cytotoksicitet (ADCC)).

10 2) Det humane immunsystem bør ikke genkende ram meområdet eller den konstante region af det humaniserede antistof som fremmed, og derfor bør antistofresponsen mod et sådant indsprøjtet antistof være mindre end mod et helt fremmed muse antistof eller delvis fremmed 15 kimærisk antistof.

3) Det er blevet meddelt, at indsprøjtede museantistoffer i det humane kredsløb har en halveringstid, der er meget kortere end halveringstiden for normale antistoffer (D. Shaw et al., J. Immunol., 138:4534-4538 20 (1987)). Indsprøjtede humaniserede antistoffer vil an tagelig have en halveringstid, der minder mere om hvad man finder hos naturligt forekommende humane antistoffer, hvilket tillader, at man indgiver mindre doser mindre ofte.

25 De ifølge opfindelsen fremstillede forbedrede hu maniserede immunoglobuliner (eksempelvis sådanne, der er i stand til at binde til den humane IL-2 receptor) i forhold til sådanne, der er beskrevet i EP patentskrift nr. 0239400. Denne ansøgning, hvis opfinderiske indhold 30 udelukkes fra dækning i denne forbindelse, beskriver for visse immunoglobuliner substituerede CDR regioner i de let kæde eller tung kæde variable domæner hos et ac-ceptorantistof med analoge dele af CDR'er (typisk solvent tilgængelige) fra et antistof med en anden 35 specificitet. Endvidere diskuterer denne ansøgning for 18 DK 174317 B1 visse immunoglobuliner muligheden for kun at overfore J rester, der er (opløsningsmiddel) tilgængelige fra an tigenbindingsstedet, hvilke rester tilsyneladende kan inkludere visse rammeregioner (mere specifikt rester, 5 der vides at være involveret i antigenbinding som beskrevet hos Amit et al,, Science 233: 747-753 ( 1985 ) eller måske rester, der er essentielle for vekselvirkning mellem kæder, idet dog udvælgelse af sådanne ikke beskrives særlig tydeligt i denne ansøgning). Således 10 angår en foretrukket udførelsesform af denne opfindelse at substituere hele CDR'er og rammeaminosyrer, der er umiddelbart nabostillet til en (eller foretrukket alle) af CDR'erne. Alment er en hvilken som helst rammeområderest, der også foretager kontakt mellem 15 CDR'erne for eksempelvis at opretholde deres konforma-tion (og sædvanligvis deres bindingsspecificitet for antigener), specifikt inkluderet i foretrukne udførelsesformer af opfindelsen som beskrevet detaljeret ovenfor.

20 I et aspekt af opfindelsen med humaniseret immuno globulin opnået fra let/tung-kæderne ønskes rekombinan-te DNA segmenter, der koder for tung og/eller let kæde CDR'er (typisk med andre aminosyrerester som ovenfor beskrevet) fra et immunoglobulin, der er i stand til at 25 binde til en ønskelig epitop, såsom på den humane IL-2-receptor (eksempelvis det anti-Tac monoklonale antistof). DNA segmenter, der koder for disse regioner, vil typisk være forbundet med DNA segmenter, der koder for passende humanagtige rammeregioner. F.eks. vises de 30 foretrukne DNA sekvenser, der under eksprimering koder for polypeptidkæder omfattende anti-Tac tung og let kæde hypervariable regioner (med humanagtige rammeregioner) på figur 3 og 4, henholdsvis. På grund af kodonde-generering og ikke-kritisk aminosyresubstitution kan 35 andre DNA sekvenser nemt substitueres for sådanne sekvenser som nedenfor beskrevet mere detaljeret.

19 DK 174317 B1 DNA segmenterne vil typisk yderligere inkludere en ekspressionskontrol DNA sekvens, der er operativt forbundet til de humanagtige antistofkodende sekvenser, deriblandt naturligt associerede eller heterologe 5 promoterregioner. Ekspressionskontrolsekvenserne vil foretrukket være eukaryotiske promotersystemer i vektorer, der er i stand til at transformere eller transfi-cere eukaryotiske værsceller, men kontrolsekvenser for prokaryotiske værter kan også anvendes. Når først vek-toren er blevet inkorporeret i en passende vært, holdes værten under betingelser, der er egnede for ekspression på højt niveau af nucleotidsekvenserne, og hvis det ønskes kan derpå følge indsamling og oprensing af lette kæder, tunge kæder, let/tung kæde dimere eller hele an-15 tistoffer, bindende fragmenter eller andre immunoglo-bulinformer.

Humane konstant region DNA sekvenser kan isoleres ved velkendte fremgangsmåder fra en række humane celler, men foretrukket udødeliggjorte B-celler (se Ka-20 bat ovenfor og WP87/02671). F.eks. beskrives de humane k immunoglobulin konstant region og J region gener og sekvenser i Heiter et al., Cell 22:197-207 (1980) og nucleotidsekvensen for et human immunoglobulin cyi gen beskrives af Ellison et al., Nucl. Acid. Res. 10:4071 25 (1992))4 På lignende måde vil CDR'erne til produktion af immuno-globuliner ifølge opfindelsen være afledt af monoklona-le antistoffer, der er i stand til at binde til det ønskede antigen (eksempelvis den humane IL-2 receptor) og 30 som er produceret i en hvilken som helst passende pattedyrskilde, deriblandt mus, rotter, kaniner eller andre hvirveldyr, der er i stand til at producere antistoffer ved kendt teknik. Egnede kildeceller for DNA sekvenserne og værtsceller for immunoglobulin ekspres-35 sion og udskillelse kan opnås fra en række kilder, så- 20 DK 174317 B1 l ledes som American Type Culture Collection ("Catalogue i of Cell Lines and Hybridomas," 5. udgave (1985) Rock ville, Maryland, U.S.A.

Ud over de humanagtige immunoglobuliner, der 5 specifikt beskrives her, kan andre "i det væsentlige homologe" modificerede immunoglobuliner uden videre konstrueres og fremstilles under anvendelse af forskellige former for rekombinant DNA teknik, der er velkendt af fagmanden. F.eks. kan for IL-2 receptor immunoglobu-10 linerne rammeregionerne variere fra sekvenserne i figur 3 og 4 ved primærstrukturniveauet med adskillige ami-nosyresubstitutioner, terminale og mellemliggende additioner og sletninger og lignende. Derudover kan en række forskellige menneskelige rammeregioner blive benyt-15 tet enkelt eller kombineret som en basis for de humanagtige Immunoglobuliner ifølge opfindelsen. Alment kan man uden videre modificere generne ved en række velkendte fremgangsmåder såsom positionsrettet muta-genese (se Gillman og Smith, Gene 8:81-97 (1979) og Ro-20 berts, S. et al., Nature 328:731-734 (1987)).

Alternativt kan der produceres polypeptidfrag-menter, der kun omfatter en del af den primære antistofstruktur, idet disse fragmenter besidder én eller flere immunoglobulinaktiviteter (f.eks. komplementfik-25 seringsaktivitet). Da de immunoglobulinrelaterede gener ligesom mange andre gener indeholder adskilte funktionelle regioner, hver med én eller flere adskilte biologiske aktiviteter, kan generne sammenføjes med funktionelle regioner fra andre gener (f.eks. enzymer, se commonly assigned U.S.S.N. nr. 132.387, indleveret 15. december 1987 til opnåelse af fusionsproteiner (f.eks. immunotoksi-ner) med nye egenskaber.

21 DK 174317 B1

Nucleinsyresekvenserne ifølge opfindelsen, der til slut er i stand til at eksprimere de ønskede human-agtige antistoffer, kan dannes af en række forskellige polynucleotider (genomisk eller cDNA, RNA, syntetiske 5 oligonucleotider, etc.) og komponenter (f.eks. V, J, D og C regioner), såvel som ved en række forskellige fremgangsmåder. Den almindeligste produktionsmåde er i øjeblikket at sammenføje egnede genomiske sekvenser, men man kan også benytte cDNA sekvenser (se EP patent-10 skrift nr. 0239400 og Reichmann, L., et al., Nature 332:323-327 (1988)),

Som tidligere fastslået vil DNA sekvenserne blive eksprimeret i værter efter at sekvenserne er blevet operativt forbundet til (dvs. anbragt, så man sikrer 15 funktionen af) en ekspressionskontrolsekvens. Disse ekspressionsvektorer er typisk replicerbare i værtsorganismerne, enten som episomer eller som en indgående del af værtens kromosomale DNA. Ekspressionsvektorer vil normalt indeholde udvælgelsesmarkører, f.eks. te-20 tracyklin eller neomycin, for at tillade påvisning af sådanne celler, der er transformeret med de ønskede DNA sekvenser (se f.eks. US patent nr. 4,704,362).

E. coli er en prokaryotisk vært, der er særlig nyttig til kloning af DNA sekvenserne ifølge opfindel-25 sen. Andre egnede værter til dette brug inkluderer bacilli, såsom Bacillus subtilis, og andre enterobacte-riaceae, såsom Salmonella, Serratla, og forskellige Pseudomonas species. I disse prokaryotiske værter kan man også frembringe ekspressionsvektorer, der typisk 30 vil indeholde ekspressionskontrolsekvenser, der er forligelige med værtscellen (f.eks. et replikationsori-gln). Derudover vil et hvilket som helst antal af en række velkendte promotere være til stede såsom lactose promotersystemet, et tryptophan (trp) promotersystem, 35 et β-lactamase promotersystem, eller et promotersystem 22 DK 174317 B1 fra phag λ. Promoterne vil typisk kontrollere ekspressionen, eventuelt med en operatorsekvens og have ribo-j sombindingsstedssekvenser og lignende til initiering og fuldstændiggørelse af transkription og translation.

5 Andre mikrober, såsom gærarter, kan også benyt tes til ekspressionen, saccharomyces er en foretrukket vært med egnede vektorer med ekspressionskontrolsekvenser, såsom promotere, deriblandt 3-phosphoglyceratki-nase eller andre glycolytiske enzymer og replikations-10 origin, termineringssekvenser og lignende efter ønske.

Ud over mikroorganismer kan vævscellekulturer fra pattedyr også benyttes til at eksprimere og producere polypeptiderne ifølge opfindelsen (se Winnacker, "From Genes to dones," VCH Publishers, N.Y., N.Y.

15 (1987). I øjeblikket foretrækkes eukaryotiske celler, idet en række egnede værtscellelinier, der er i stand til at udskille intakte immunoglobuliner, er blevet udviklet, og disse inkluderer CHO cellelinier, forskellige COS cellelinier, HeLa celler, myelomacellelinier, 20 etc., men foretrukket transformerede B-celler eller hy-bridomaer. Ekspressionsvektorer for sådanne celler kan inkludere ekspressionskontrolsekvenser, såsom et repli-kationsorigo, en promoter, en forstærker (Queen, C. et al., Immunol. Rev. 89: 49-68 (1986)), og nødvendige 25 procesinformationssteder, såsom ribosombindingssteder, RNA sammensplejsningssteder, polyadenyleringssteder og transkriptionsafslutningssekvenser. Ekspressionskon trolsekvenserne er foretrukket promotere afledt af SV40 med forstærker (se Mulligan og Berg; Science 209: 1522-30 1427 (1980)), et immunoglobul ingen, adenovirus, bovint' papillomavirus og lignende.

Vektorerne, der indeholder de interessante DNA segmenter (eksempelvis sekvenser, der koder for den tunge og lette kæde og ekspressionskontrolsekvenser), 35 kan overføres til værtscellerne ved kendt teknik, der 23 DK 174317 B1 varierer afhængig af typen af værtscellen. F.eks. benytter man sædvanligvis calciumchloridtransficering for prokaryotiske celler, hvorimod man kan benytte calcium-phosphatbehandling eller elektroporering for andre 5 celleværter. (Se alment Maniatis, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, (1982)1 Når de først er eksprimeret, kan de fuldstændige antistoffer, deres dimere, enkelte lette og tunge kæder 10 eller andre immunoglobulinformer ifølge opfindelsen renses ifølge kendt teknik, deriblandt ammoniumsulfat-udfældning,' affinitetskolonner, søjlechromatografi, gelelektroforese og lignende (se alment Scopes, R.,

Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y. (1982)). X det væsentlige rene immunoglobuliner med mindst ca.

90-95% homogenitet foretrækkes, idet 98-99% homogenitet eller bedre er mest foretrukket, til farmaceutiske anvendelser. Når polypeptiderne først er renset, delvis eller til homogenitet efter ønske, kan de derefter be-20 nyttes terapeutisk (også ekstrakorporalt) eller til udvikling eller udførelse af assayfremgangsmåder, immun-fluorescensfarvninger og lignende. (Se alment Immunological Methods, bind I og II, Lefkovits og Pernis, eds., Academic Press, New York, N.Y. (1979 og 1981)).

25 De IL-2 receptorspecifikke antistoffer, der gi ves eksempler på i opfindelsen, vil typisk individuelt finde anvendelse ved behandling af en T-celle medieret sygdomstilstand. Når man har identificeret cellen i forbindelse med en sygdom som en sådan, der bærer en 30 iL-receptor, vil man alment finde humanagtige antistoffer, der er i stand til at blokere bindingen af IL-2 til den humane IL-2 receptor, som egnet (se U.S.S.N. 085.707, med betegnelsen "Treating Human Malignancies and Disorders,"), 35 For eksempel er typiske sygdomstilstande, der er egnet 24 DK 174317 B1 til behandling/transplantation versus vært sygdomme og udstødelse af transplantationer i patienter, der får et organ transplanteret såsom hjerte, lunger, nyrer, lever etc. Andre sygdomme inkluderer autoimmune sygdomme så-5 som Type I diabetes, multipel sclerose, rheumatoid arthritis, systemisk lupus erythematosus og myasthenia gravis.

De humanagtige antistoffer ifølge opfindelsen kan også benyttes i kombination med andre antistoffer, 10 især humane monoklonale antistoffer, der er reaktive med andre markører på celler, der er ansvarlige for sygdommen. F.eks. kan passende τ-cellemarkører inkludere sådanne, der er grupperet i den såkaldte "Clusters of Differentiation", idet dette navn er givet af First 15 International Leukocyte Differentiation workshop, Leukocyte Typing, Bernard, et al., Eds., Springer-Verlag, N.Y. (1984),

Antistofferne kan også benyttes som præparater til adskilt indgivelse i forbindelse med kemoterapeu-20 tiske eller immunundertrykkende midler. Midlerne vil typisk inkludere cyclosporin A eller en purinanalog (eksempelvis methotrexat, 6-mercaptopurin eller lignende), men adskillige yderligere midler (f.eks. cy~ clophosphamid, prednison etc.), der er velkendt af fag-25 manden, kan også benyttes.

Et foretrukket farmaceutisk præparat ifølge opfindelsen omfatter anvendelse af de omhandlede antistoffer i immunotoksiner. Immunotoksiner er karakteriseret ved to komponenter og er særlige nyttige til at 30 dræbe udvalgte celler in vitro eller in vivo. En komponent er et cytotoksisk middel, der sædvanligvis er dø-deligt for en celle, når det bliver tilfæstet eller absorberet. Den anden komponent, der kendes som "overførselsbæreren" giver et middel til at overføre 35 det toksiske middel til en bestemt celletype såsom cel- 25 DK 174317 B1 ler, der omfatter en carcinoma. De to komponenter er sædvanligvis bundet kemisk sammen ved en hvilken som helst af en lang række velkendte kemiske procedurer.

Når det cytotoksiske middel f.eks. er et protein og den 5 anden komponent er et intakt immunoglobulin, kan sammenbindingen foregå ved heterobifunktionelle tværbindere, eksempelvis SPDP, carbodiimid, glutaraldehyd eller lignende. Produktion af forskellige immunotoksiner er velkendt, og man kan f.eks. finde den i "Monoclonal 10 Antibody-Toxin Conjugates: Aiming the Magic Bullet",

Thorpe et al., Monoclonal Antibodies in Clinical Medicine, Academic Press, side 168-190 (1982),

En række cytotoksiske midler er egnet til brug i immunotoksiner. Cytotoksiske midler kan inkludere 15 radionuclider, såsom Iod-131, Yttrium-90, Rhenium-188 og Bismuth-212; et antal kemoterapeutiske medikamenter, såsom vindesin, methotrexat, adriamycin og cisplatin; og cytotoksiske proteiner såsom ribosomal inhiberende proteiner som kermesbær antiviral protein, Pseudomonas 20 exotoxin A, ricin, diphtheriatoksin, ricin A kæde etc., eller et middel, der er aktiv ved celleoverfladen, såsom phospholipaseenzymer (eksempelvis phospholipase C).

(Se alment commonly assigned U.S.S.N. 07/290.968, indleveret 28. december 1988, "Chimeric Toxins", Olsnes 25 og Phil, Pharmac. Ther., 25:355-381 (1982), og "Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy", eds. Baldwin og Byers, side 159-179, 224-266, Academic Press (1985),

Indgivelseskomponenten af immunotoksinet vil in-30 kludere de humanagtige immunoglobuliner ifølge opfindelsen. Hele immunoglobuliner eller deres bindende fragmenter, såsom Pab, benyttes foretrukket. Antistofferne i immunotoksinerne vil typisk være af human IgM eller IgG isotype, men andre pattedyrs konstante regio-35 ner kan benyttes efter ønske.

26 DK 174317 B1

De humanagtige antistoffer og farmaceutiske præparater dermed ifølge opfindelsen er særlig nyttige til parenteral indgivelse, dvs. subcutant, intramusku-lært eller intravenøs indgivelse. Præparaterne til par-5 enteral indgivelse vil alment omfatte en opløsning af antistoffet eller en cocktail deraf opløst i en acceptabel bærer foretrukket en vandig bærer. Man kan benytte en række vandige bærere, eksempelvis vand, pufret vand, 0,4% saltvand, 0,3% glycin og lignende. Disse op-10 løsninger er sterile og almindeligvis frie for partikler. Sådanne præparater kan steriliseres ved konventionel velkendt sterilisationsteknik. Præparaterne kan indeholde farmaceutisk acceptable hjælpestoffer efter behov, så man tilnærmer de fysiologiske betingel-15 ser, såsom pH tilpassende og pufrende midler, toksicitettilpassende midler og lignende, f.eks. natriumacetat, natriumchlorid, kaliumchlorid, calciumchlorid, na-triumlactat, etc. Koncentrationen af antistof i sådanne præparater kan variere bredt, dvs. fra mindre end ca.

20 0,5%, sædvanligvis fra eller mindst fra ca. 1% til så højt som 15 eller 20 vægt% og udvælges først og fremmest på basis af væskerumfang, viskositet etc., afhængig af den valgte indgivelsesmåde.

Således kunne man fremstille en typisk farmaceu-25 tisk præparat til intramuskulær injection, der indeholdt 1 ml steril pufret vand og 50 mg antistof. Et typisk præparat til intravenøs infusion kunne fremstilles til at indeholde 50 ml steril Ringer's opløsning og 150 mg antistof. Konkrete fremgangsmåder til fremstil-30 ling af parenteral indgivelig præparater kendes eller er nærliggende for fagmanden og beskrives f.eks. mere detaljeret i Remington's Pharmaceutical Science, 15. udgave, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania (1980), 35 27 DK 174317 B1

Antistofferne ifolge opfindelsen, kan frysetorres med henblik på lagring og genoprettes i en passende bærer for Anvendelse. Denne teknik har vist sig at være effektiv med konventionelle immunoglobuliner, og man 5 kan benytte standard frysetørring og genoprettelsesteknikker. Fagmanden vil kunne se, at frysetørring og genoprettelse kan fore til forskellige grader af tab af aktivitet hos antistoffet (eksempelvis har ved konventionelle immunoglobuliner IgM antistoffer et storre ak-10 tivitetstab end IgG antistoffer), og at man eventuelt må kompensere derfor, når man fremstiller præparaterne.

Præparaterne indeholdende de omhandlede humanag-tige antistoffer eller en cocktail deraf kan indgives 15 til profylaktisk og/eller terapeutisk behandling. Ved terapeutiske anvendelser indgiver man præparaterne til en patient, der allerede lider af en sygdom, i en mængde, der er tilstrækkelig til at kurere eller i det mindste delvis sinke sygdommen og dens komplikationer.

20 En mængde, der er tilstrækkelig til at opnå dette, defineres som en "terapeutisk effektiv dosis". Effektive mængder til denne anvendelse vil afhænge af alvoren af infektionen og patientens eget immunsystems almene tilstand, men ligger almindeligvis fra ca. 1-200 mg anti-25 stof pr. dosis, idet doser på 5-25 mg pr. patient er mere almindelige til anvendelse. Det bør huskes, at materialerne ifølge denne opfindelse alment kan anvendes ved alvorlige sygdomstilstande, der er livstruende, eller kan blive livstruende. I sådanne tilfælde er det 30 muligt og, idet udefra kommende substanser bliver mini-mlseret og der er en mindre sandsynlighed for afvisning af "fremmed stof" med de omhandlede humanagtige antistoffer, at indgive et betydeligt overskud af antistofferne, hvis lægen finder det nødvendigt.

35 28 DK 174317 B1

Ved profylaktiske' anvendelser indgiver man præparater indeholdende de omhandlede antistoffer, eller en cocktail deraf til en patient, der ikke allerede er i en sygdomstilstand, for at foroge patientens 5 modstandskraft. En sådan mængde defineres som en "profylaktisk effektiv dosis". Ved en sådan anvendelse afhænger de nøjagtige mængder igen af patientens helbredstilstand og almene immuntilstand, men de ligger sædvanligvis fra 0,1-25 mg pr. dosis, især 0,5-2,5 mg 10 pr. patient. En foretrukket profylaktisk anvendelse er til forhindring af udstødning af en transplanteret nyre.

Man kan udføre enkelte eller mange indgivelser af præparaterne, idet dosisniveauer og dosismønster be-15 stemmes af den behandlende læge. I alle tilfælde skal de farmaceutiske præparater tilvejebringe en mængde af antistof eller antistoffer ifølge opfindelsen, der er tilstrækkelig til en effektiv behandling af patienten.

Humanagtige antistoffer ifølge opfindelsen kan 20 yderligere finde en bred anvendelse in vitro. Eksempelvis kan sådanne antistoffer benytts til typebestemmelse af T-celler, til isolering af specifikke IL-2 receptorbærende celler eller celler, der bærer fragmenter af receptoren, til fremstilling af vacciner eller lignen-25 de.

Til diagnostiske formål kan antistofferne enten være mærkede eller umærkede. Umærkede antistoffer kan benyttes i kombination med andre mærkede antistoffer (andet antistof), der er reaktive med det humanagtige 30 antistof, såsom antistoffer, der er specifikke for human immunoglobulin konstante regioner. Alternativt kan antistofferne være direkte mærkede. Der kan anvendes en bred række mærkninger såsom radionuclider, fluorer, enzymer, enzymsubstrater, enzymccfaktorer, enzyminhibito-35 rer, ligander (især haptener), etc. Mange typer immun-assays er tilgængelige og kendes af fagmanden.

29 DK 174317 B1

Der kan også tilvejebringes sæt til anvendelse med de omhandlede antistoffer ved beskyttelse mod eller påvisning af en cellulær aktivitet eller af tilstedeværelse af et udvalgt antigen. Således kan man tilveje-5 bringe et omhandlet antistofpræparat ifølge opfindelsen, sædvanligvis på frysetørret form i en beholder, enten alene eller sammen med yderligere antistoffer, der er specifikke for den ønskede celletype. Antistofferne, der kan være konjugeret til en markør eller et 10 toksin eller være ukonjugerede, findes i sættet sammen med puffere, såsom Tris, phosphat, carbonat, etc., stabilisatorer, biocide midler, inerte proteiner, eksempelvis serumalbumin eller lignende og et sæt instruktioner for anvendelse. Disse materialer vil alment være 15 til stede i en mængde på under 5 vægt% i forhold til mængden af aktivt antistof og sædvanligvis til stede i en total mængde på mindst ca. 0,001 vægt%, igen baseret på antistofkoncentrationen. Det vil ofte være ønskværdigt at inkludere et inert strækningsmiddel eller ex-20 cipient for at fortynde de aktive ingredienser, idet excipienten kan være til stede fra ca. 1-99 vægt% af det totale præparat. Når der benyttes et andet antistof, der er i stand til at binde til det kimæriske antistof i et assay, vil dette sædvanligvis findes i en 25 beholder for sig. Det andet antistof er typisk konjugeret til en markør og formuleret på en lignende måde som antistofformuleringerne beskrevet ovenfor.

De følgende eksempler skal opfattes som illustrerende 30 30 DK 174317 B1

EKSPERIMENTAL DEL

Konstruktion af gener for humanagtige lette og tunge kæder 5 Man benyttede sekvensen for det humane antistof

Eu (Sequences of Proteins of Immunological Interest,

Kabat, E., et al., U.S. Dept, of Health og Kuman Services, 1983) til at tilvejebringe rammeområdet for det humaniserede antistof, idet aminosyresekvensen for den 10 tunge kæde fra anti-Tac er mere homolog til den tunge kæde fra dette antistof end til nogen anden tung kædesekvens i National Biomedical Foundation Protein Identification Resource.

Til udvælgelse af sekvensen for den humaniserede 15 tunge kæde bragte man sekvensen for anti-Tac tung kæde (se commonly assigned U.S.S.N. nr. 186.862 og 223.037, der inkorporeres heri under reference) på linie med sekvensen fra den Eu tunge kæde (figur 1). For hver position valgte man Eu aminosyren fra en humaniseret sek-20 vens, medmindre denne position faldt indenfor nogen som helst af følgende kategorier, i hvilket tilfælde man udvalgte anti-Tac aminosyren.

(1) Positionen faldt indenfor en komplementaritets- 25 bestemmende region {CDR), som defineret af Ka bat, et al., se ovenfor (aminosyrer 31-35, 50-66, 99-106); (2) Eu aminosyren var usædvanlig for humane tunge 30 kæder ved denne position, hvorimod anti-Tac ami nosyren var typisk for humane tunge kæder på denne position (aminosyrer 27, 93, 95, 98, 107-109, 111); 35 31 DK 174317 B1 (3) Positionen var umiddelbart nabostillet til en CDR i aminosyresekvensen for den anti-Tac tunge kæde (aminosyrer 30 og 67); 5 (4) En 3-dimensionel model af anti-Tac antistoffet tydede på, at aminosyren var fysisk nær ved den antigenbindende region (aminosyrer 48 og 68).

Visse aminosyrer faldt i mere end én af disse 10 kategorier, men er kun opregnet under én af disse.

Til udvælgelse af sekvensen for den humaniserede lette kæde bragte man den anti-Tac lette kædesekvens på linie med sekvensen for den Eu lette kæde (figur 2).

Man udvalgte Eu aminosyren ved hver position, med min-15 dre positionen faldt i én af kategorierne (1)-(4), (idet let kæde erstatter tung kæde i definitionen for kategorierne): (1) CDR'er (aminosyrer 24-34, 50-56, 89-97); 20 (2) Anti-Tac aminosyre mere typisk end Eu (aminosyrer 48 og 63); (3) Nabostillet til CDR'er (ingen aminosyrer; Eu og anti-Tac var allerede ens på alle disse positioner); 25 (4) Mulig 3-dimentionel nærhed til bindingsregion (aminosyre 60).

Den virkelige nucleotidsekvens for den tunge (figur 3) og lette kæde (figur 4) gener blev udvalgt på 30 følgende måde: (1) Nucleotidsekvenserne koder for aminosyresekven-serne, der er udvalgt som ovenfor beskrevet; (2) 5'-stillet for disse kodende sekvenser koder nu- 35 cleotidsekvenserne for en leader(signal)sekvens, nemlig leaderen for den lette kæde fra antistof- 32 DK 174317 B1 fet MOPC 6 3 og leaderen for den tunge kæde fra antistoffet PCH 108A (Kabat et al., se ovenfor).

Disse leadersekvenser blev udvalgt som typiske for antistoffer; 5 (3) 3'-stillet for de kodende sekvenser er nucleo- tidsekvenserne de sekvenser, der folger det muse let kæde J5 segment og det muse tung kæde J2 segment, der er del af anti-Tac sekvenserne.

Disse sekvenser inkluderes, da de indeholder 10 splejsningsdonorsignaler; (4) Ved hver ende af sekvenserne findes et Xba I sted til opnåelse af mulighed for gennemskæring ved Xba I steder og kloning i Xba I stederne på en vektor.

15

Konstruktion af humaniseret let og tung kæde gener

Til frembringelse af den tunge kæde syntetiserede man fire oligonucleotider HES12, HES13, HES14, HES15 (figur 5A) under anvendelse af en Applied Biosystems 20 380B DNA synthesizer. To af oligonucleotiderne er del af hver streng fra den tunge kæde, og hvert oligonu-cleotid overlapper den næste med omtrent 20 nucleotider for at tillade anellering (figur 5B). Sammen dækker oligonucleotiderne hele den humaniserede tunge kæde 25 (figur 3) med nogle få ekstra nucleotider ved hver ende for at tillade gennemskæring ved Xba I stederne. Disse oligonucleotider blev oprenset fra polyacrylamidgeler.

Hvert oligonucleotid blev phosphoryleret under anvendelse af ATP og T4 polynucelotidkinase ved stan-30 dardteknik (se Maniatis, se ovenfor). Til anellering af de phosphorylerede oligonucleotider blev de sammen suspenderet i 40 μΐ TA (33 mM Tris-acetat, pH 7,9, 66 mM kaliumacetat, 10 mM magnesiumacetat) ved en koncentration på ca. 3,75 μΜ af hver, opvarmet til 95°C i 4 mi-35 nutter og afkølet langsomt til 4 C. Til opnåelse af syntese af det komplette gen fra oligonucleotiderne ved 33 DK 174317 B1 at syntetisere den omvendte streng fra hver oligonu-cleotid (figur 5B) tilsatte man følgende komponenter i et slutvolumen på 100 yl: 5 10 μ annellerede oligonucleotider

0,16 mM af hvert desoxyribonucleotid 0,5 mM ATP

0,5 mM DTT

100 yg/ml BSA

10 3,5 yg/ml T4 g43 protein (DNA polymerase) 25 yg/ml T4 g44/62 protein (polymerase accessorisk protein) 24 yg/ml 45 protein (polymerase acces sorisk protein) 15

Blandingen blev inkuberet ved 37 C i 30 minutter. Derefter tilsatte man 10 enheder T4 DNA ligase og fortsatte inkuberingen ved 37°C i 30 minutter. Polymerasen og ligasen blev inaktiveret ved inkubation af re-0 20 aktionen ved 70 C i 15 minutter. Til fordøjelse af genet med Xba I satte man til reaktionsblandingen 50 yl af 2 x TA med indhold af BSA med 200 yg/ml og DTT med 1 mM, 43 yl vand og 50 enheder Xba I i 5 yl. Reaktionen 0 blev inkuberet i 3 timer ved 37 C og kørt på en gel.

25 Man oprensede det 431 bp Xba I fragment fra gelen og klonede den i Xba I stedet på plasmidet pUC19 ved standardteknik. Man rensede fire plasmidisolater og se-kvensopdelte disse under anvendelse af didesoxy fremgangsmåden, Et af disse havde den korrekte sekvens 30 (figur 3). Til frembringelse af den lette kæde syntetiserede man fire oligonucleotider JFDl, JFD2, JFD3, JFD4 (figur 6A). To af oligonucleotiderne er en del af hver streng af den lette kæde, og hvert oligonucleotid overlapper den næste med omtrent 20 nucleotider for at til- 35 lade annellering (figur 6B). Sammen dækker oligonucleotiderne hele den humaniserede lette kæde (figur 4) med 34 DK 174317 B1 nogle få ekstra nucleotider i hver ende for at tillade gennemskæring ved Xba I stederne. Oligonucleotiderne blev oprenset fra polyacrylamidgeler.

Genet for den lette kæde blev syntetiseret fra 5 disse oligonucleotider i to dele. Man kombinerede 0,5 yg af hver af JFDl og JFD2 i 20 yl sekvenasepuffer (40

mM Tris-HCl, pH 7,5, 20 mM magnesiumchlorid, 50 mM

0 natriumchlorid), opvarmede til 70 C i 3 minutter og af- 0 kølede langsomt til 23 C til opnåelse af annellering af 10 oligonucleotiderne. JFD3 og JFD4 blev behandlet på samme måde. Hver reaktionsblanding blev gjort 10 mM i DTT og 0,5 mM i hvert desoxyribonucleotid og man tilsatte 6,5 enheder sekvenase (US Biochemicals) til et slutrum-fang på 24 yl og inkuberede i 1 time ved 37°C for at 15 syntetisere den modsatte streng af oligonucleotiderne.

Man satte Xba I og Hind III til hver reaktionsblanding for at fordøje DNA (der er et Hind III sted i den region, hvor JFD2 og JFD3 overlapper og således i hver af de syntetiserede DNA'er; figur 6B). Reaktionerne blev 20 kørt på polyacrylamidgeler, og man oprensede Xba I -Hind III fragmenterne og klonede disse i pUC18 ved standardteknik. Man sekvensopdelte adskillige plasmi-disolater fra hver fragment ved didesoxyfremgangsmåden og udvalgte de korrekte.

25

Konstruktion af plasmider til eksprlmering af humaniseret lette og tunge kæder

Man isolerede det tung kæde Xba I fragment fra pUC19 plasmidet, hvori det var indsat, og indsatte det 30 derefter i xba I stedet på vektoren pVyl (se commonly assigned U.S.S.N. nr. 223.037) i korrekt orientering ved standardteknik til opnåelse af plasmidet pHuGTACl (figur 7). Dette plasmid vil eksprimere høje niveauer af en fuldstændig tung kæde, når det transficeres i en 35 passende værtcelle.

De to let kæde Xba I - Hind III fragmenter blev isoleret fra pUC18 plasmiderne, hvori de var indsat.

35 DK 174317 B1

Vektorplasmidet pVxl (se commonly assigned U.S.S.N. nr. 223.037) blev gennemskåret med Xba I, dephosphoryleret og ligeret med de to fragmenter ved standardteknik. Det ønskede reaktionsprodukt havde følgende cirkulære form: 5 vektor - Xba I - fragment l - Hind m - fragment 2 -Xba I - vektor. Man analyserede adskillige plasmidiso-later ved restriktionskortlægning og sekvensopdeling og valgte ét med denne form. Dette plasmid, pHuLTAC (figur 8) indeholder derfor den fuldstændige humaniserede let-10 te kæde (figur 4) og vil eksprimere hoje niveauer af den lette kæde, når den transficeres i en passende værtscelle.

Syntese og affinitet af humaniseret antistof 15 Plasmiderne pHuGTACl og pHuLTAC blev transfice- ret i muse Sp2/0 celler, og celler, der integrerede plasmiderne blev udvalgt på basis af resistens til my-cophenolsyre og/eller hygromycin B overført af gpt og hyg generne på plasmiderne (figur 7, 8) ved standard-20 fremgangsmåder. Til bekræftelse af, at disse celler udskilte antistof, der kunne binde til IL-2 receptoren, inkuberede man supernatant fra cellerne med HUT-102 celler, der vides at eksprimere i IL-2 receptoren. Efter vask inkuberede man cellerne med fluoresceinkonju-25 geret gede anti-humant antistof, vaskede og analyserede for fluorescens på et FACSCAN cytofluormeter. Resultaterne (figur 9A) viser tydeligt, at det humaniserede antistof binder til disse celler, men ikke til Jurkat T-celler, der ikke eksprimerer IL-2 receptoren 30 (figur 9D). Som kontrol benyttede man også det oprindelige muse anti-Tac antistof til at farve disse celler (figur 9B,C), med lignende resultater.

Til yderligere eksperimenter indsprøjtede man celler, der producerede det humaniserede antistof, i 35 mus og indsamlede den opnåede ascites. Man oprensede humaniseret antistof til i det væsentlige homogenitet 36 DK 174317 B1 fra ascites ved passage gennem en affinitetskolonne med gede anti-humant immunoglobulin antistof, præpareret på en Affigel-10 bærer (Bio-Rad Laboratories, Inc., Richmond, CA), ved standardteknik. Til bestemmelse af affi-5 niteten af det humaniserede antistof i forhold til det oprindelige anti-Tac antistof udførte man et konkurrerende bindingseksperiment. Man inkuberede omtrent 5 x 105 HUT-102 celler med kendte mængder (10-40 ng) af anti-Tac antistoffet og det humaniserede anti-Tac anti-10 stof i 10 minutter ved 4°C. Derefter satte man 100 ng biotinyleret anti-Tac til cellerne og inkuberede i 30 0 minutter ved 4 C. Man har tidligere bestemt, at en sådan mængde anti-Tac er tilstrækkelig til at mætte bindingsstederne på cellerne, men ikke at være et stort 15 overskud. Derefter vaskede man cellerne 2 gange med 2 ml phosphatpufret saltvand (PBS) med indhold af 0,1% natriumazid, Cellerne blev nu inkuberet i 30 minutter 0 ved 4 C med 250 ng phycoerythrinkonjugeret avidin, der binder til det biotinylerede anti-Tac, der allerede er 20 bundet til cellerne. Cellerne blev igen vasket som ovenfor, fikseret i PBS med indhold af 1% paraformalde-hyd og analyseret for fluorescens på et FACSCAN cyto-fluormeter.

Anvendelse af voksende mængder (10-40 ng) af 25 anti-Tac antistoffet som konkurrent i det første trin formindskede den mængde af biotinyleret anti-Tac, der kunne binde til cellerne i andet trin og således den mængde af phycoerythrinkonjugeret avidin, der blev bundet i sidste trin, hvorfor fluorescensen faldt (figur 30 10A). Ækvivalente mængder (20 ng) af anti-Tac og humaniseret anti-Tac, der blev benyttet som konkurrent, formindskede fluorescensen i omtrent samme grad (figur 10B). Dette viser, at disse antistoffer har omtrent samme affinitet (indenfor en faktor 3-4), idet, hvis ét 35 af dem havde meget større affinitet, ville det mere effektivt havde konkurreret med det biotinylerede anti- 37 DK 174317 B1

Tac, og således fået fluorescensen til at falde endnu mere.

Biologiske egenskaber af det humaniserede antistof 5 Til optimal anvendelse ved behandling af sygdom me hos mennesker bør det humaniserede antistof være i stand til at ødelæge T-celler i legemet, der eksprime-rer IL-2 receptoren. En mekanisme, ved hvilken antistoffer kan ødelægge målceller, er antistofafhængig 10 cellemedieret cytotoksicitet, forkortet ADCC (Fundamental Immunology, Paul, V., Ed., Raven Press, New York (1984), side 681), hvori antistoffet danner en bro mellem målcellen og en effektorcelle såsom en makrofag, der kan lysere målet. Til bestemmelse af, om det huma-15 niserede antistof og det oprindelige muse anti-Tac antistof kan mediere ADCC, udførte man et chromfrigivel-sesassay ved standardteknik. Mere detaljeret inkuberede man humane leukæmi HUT-102 celler, der eksprimerer IL-2 receptoren, med 51Cr for at lade dem absorbere dette 20 radionuclid. Disse HUT-102 celler blev derefter inkuberet med et overskud af enten anti-Tac eller humaniseret anti-Tac antistof. HUT-102 cellerne blev derefter inkuberet i 4 timer med enten et 30:1 eller 100:1 forhold af effektorceller, der på normal måde var oprenset fra 25 mononucleære celler fra humant renset perifert blod, der var blevet aktiveret ved inkubation i omtrent 20 timer ved humant rekombinant IL-2. Frigivelse af ^*Cr, der var et tegn på lysering af mål HUT-102 cellerne, blev målt, og man trak baggrunden fra (Tabel l). Resul-30 taterne viser, at ved begge forhold for effektorceller lyserede anti-Tac ikke et synderligt stort antal af målcellerne (mindre end 5%), hvorimod det humaniserede antistof gjorde (mere end 20%). Således er det humaniserede antistof sandsynligvis mere effektivt end det 35 oprindelige muse antistof ved behandling af T-celle leukæmi eller andre T-celle medierede sygdomme.

38 DK 174317 B1 TABEL 1

Procentisk *^Cr frigivelse efter ADCC

5 Effektor; Målforhold 30:1 100:1

Antistof

Anti-Tac 4% < 1% 10 Humaniseret anti-Tac 24% 23%

Det fremgår af det ovenstående, at de humanagti-ge immunoglobuliner ifølge opfindelsen har adskillige fordele i forhold til andre antistoffer, f.eks. kan de 15 omhandlede humanagtige IL-2 receptorimmunoglobuliner sammenlignet med anti-Tac muse monoklonale antistoffer produceres mere økonomisk og indeholde en betydelig 1 mindre mængde fremmede aminosyresekvenser. Denne redu cerede sandsynlighed for antigenicitet efter indsprøjt-20 ning i en human patient er en betydelig terapeutisk forbedring, hvad angår immunoglobuliner, der er konstrueret i overensstemmelse med de ovenfor givne kriterier.

Selv om denne opfindelse er blevet beskrevet til 25 en vis grad detaljeret ved hjælp af illustrationer og eksempler med henblik på klarhed og forståelse, bør man bemærke, at visse ændringer og modifikationer kan udføres indenfor området af følgende krav.

Claims (15)

1. Fremgangsmåde til fremstilling af et humaniseret immunoglobulin, hvor der er udført mindst en amino-syresubstitutuion udenfor de komplementaritetsbestem-5 mende regioner (CDR'er) som defineret af Kabat et al. ("Sequences of Proteins of Immunological Interest", Kabat, E. et al., US Department of Health and Human Services (1983)) sammen med Cholthia et al. (Cholthia og Lesk, J.Mol.Biol., 196; 901-917 (1987)), kende-10 tegnet ved, at mindst en aminosyre fra et ikke CDR variabelt område fra et ikke humant donor-immunoglobulin substitueres, og hvor i det humaniserede immunoglobulin aminosyresekvensen for andet end CDR"erne i den variable region omfatter mindst 70 aminosyrer iden-15 tiske med en variabel region aminosyresekvens fra et acceptor human immunoglobulin, og CDR "erne er fra den variable region i det nævnte ikke humane donor-immunoglobulin, idet dog den nævnte aminosyresubstitution er sket udenfor den hypervariable Cholthia-sløjfe Hl.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendeteg net ved, at det nævnte humaniserede immunoglobulin er specifikt reaktivt med p55 Tac protein, er i stand til at inhibere binding af humant interleukin (IL-2) til en human IL-2 receptor eller er i stand til at bin-25 de til en human IL-2 receptor.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegne t ved, at det humaniserede immunoglobulin opviser en bindingsaffinitet til en human IL-2 receptor på omtrent 10® M eller kraftigere.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 2 eller 3, ken detegnet ved, at proteinsekvenserne i den modne lette og tunge variable region fra det humaniserede immunoglobulin er homologe til de modne proteinsekvenser på Figur 3 og 4. 35 DK 174317 B1 40

5. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 4, kendetegnet ved, at det humaniserede immunoglobulin er en IgG^^ immunoglobulin isotype.

6. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 5, kendetegnet ved, at substitutionen er umiddelbart nabostillet til en CDR.

7. Fremgangsmåde til fremstilling af et humaniseret immunoglobulin ud fra humaniserede tunge og lette 10 immunoglobulinkæder, hver med en rammeregion fra et humant acceptorimmunoglobulin og komplementaritetsbestemmende regioner (CDR'er) fra et donorimmunoglobulin, der er i stand til at binde til et antigen, kendetegnet ved, at man substituerer mindst en ikke 15 CDR rammeregions-aminosyre fra acceptorimmunoglobulinet med en tilsvarende aminosyre fra donorimmunoglobulinet ved en position i immunoglobulinet, hvor: (a) aminosyren i den humane rammeregion fra acceptorimmunoglobulinet er sjælden i denne position, og 20 den tilsvarende aminosyre fra donorimmunoglobu linet er almindelig for denne position i humane immunoglobulinsekvenser,- eller (b) aminosyren er umiddelbart nabostillet til en af CDR'erne; eller 25 (c) aminosyren forudsiges at besidde et sidekæde- atom, der kan vekselvirke med antigenet eller med CDR'erne fra det humaniserede immunoglobulin; forudsat at den nævnte aminosyresubstitution er uden for den hypervariable Cholthia-sløjfe Hl, og at man 30 benytter således humaniserede lette og tunge kæder til at danne et fuldstændigt humaniseret immunoglobulin. 35 41 DK 174317 B1

8. Fremgangsmåde ifølge krav 7, kendeteg net ved, at mindst tre af sådanne ikke CDR rammere-gions-aminosyrer bliver substitueret med ved hjælp af kriterierne (a), (b) eller (c) udvalgte aminosyrer fra 5 donorimmunoglobulinet.

9. Fremgangsmåde ifølge krav 8, kendetegnet ved, at mindst en af aminosyrerne substitueret fra donoren er umiddelbart nabostillet til en CDR.

10. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af 10 kravene 7 til 9, kendetegnet ved, at proteinsekvenserne i den modne lette og tunge variable region fra det humaniserede immunoglobulin er homologe til de modne proteinsekvenser på Figur 3 og 4.

11. Polynucleotid, omfattende en første sekvens 15 kodende for en humanagtig ikke CDR immunoglobulinramme- region og en anden sekvens kodende for en eller flere CDR'er, kendetegnet ved, at polynucleotidet ved eksprimering koder for et immunoglobulin, der kan opnås ved en fremgangsmåde ifølge et vilkårligt af kra-20 vene 1 til 6 eller ved en sådan ifølge krav 7 til 10.

12. Cellelinie, kendetegnet ved, at den er transficeret med et eller flere polynucleotider ifølge krav 11.

13. Fremgangsmåde til fremstilling af et humanise-25 ret immunoglobulin som defineret i krav li, kende - tegnet ved, at man dyrker en cellelinie ifølge krav 12 og isolerer det humaniserede immunoglobulin fra cellekulturmediet.

14. Anvendelse af et immunoglobulin ifølge krav 13 30 eller et bindende fragment deraf til fremstilling af et lægemiddel.

15. Anvendelse ifølge krav 14, kendetegnet ved, at lægemidlet er egnet til behandling af T-celle medierede afvigelser hos en menneskelig patient.