TWI782000B

TWI782000B - 抗ｇｐｒ２０抗體、其製造方法及其應用

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Publication number: TWI782000B
Application number: TW107110733A
Authority: TW
Inventors: 飯田謙二; 涉谷朋子; 中村健介; 天野正人
Original assignee: 日商第一三共股份有限公司
Priority date: 2017-03-30
Filing date: 2018-03-28
Publication date: 2022-11-01
Also published as: JPWO2018181656A1; EP3604518A4; KR20190135478A; US20200017583A1; JP7082112B2; EP3604518A1; CA3058357A1; AU2018244047A1; CN110573618A; US11261249B2; TW201840588A; WO2018181656A1

Abstract

本發明的課題為提供可用於檢測GPR20的抗GPR20抗體、包含該抗體而成的GPR20檢測用試劑、與GPR20的表現相關之疾病的診斷用試劑或檢查用組成物等。

提供與包含序列識別號1中胺基酸編號1至48所示之胺基酸序列而成的肽特異性結合之抗體或該抗體的抗原結合性片段、該抗體的嵌合化抗體、兔源化抗體等，並提供包含該抗體而成的組成物等。

Description

抗GPR20抗體、其製造方法及其應用

本發明係關於新穎的抗GPR20抗體、該抗體的功能片段、該抗體的修飾物、包含編碼該抗體所具有之胺基酸序列之鹼基序列的核苷酸、插入有該核苷酸的載體(vector)、導入有該核苷酸或載體的細胞、包含培養該細胞的步驟之該抗體的製造方法、醫藥組成物、診斷用或檢查用組成物等。

GPR20(G蛋白偶聯受體20，G Protein-coupled receptor 20)屬於G蛋白偶聯受體(GPCR)家族的A類(Class A)，為由358個胺基酸所構成的7次跨膜蛋白(transmembrane protein)，在細胞外具有N端側，在細胞內具有C端側。GPR20雖具有與辨識核苷酸或脂質之GPCR類似的胺基酸序列，但仍未鑑別其生理功能或活體內之配體。由使GPR20在HEK293細胞表現的實驗，而報告GPR20在無因配體所致之刺激的條件下，恆常地活化Gi型的三聚體G蛋白質(非專利文獻1)。

GPR20在心臟、腦、胎盤、肺、肝臟、骨骼肌、腎臟、胰臟、脾臟、胸腺、前列腺、精巢、卵巢、小腸、直腸、白血球確認到傳訊RNA(mRNA)的表現，尤其被報告在小腸為高表現(非專利文獻1)。在腦內，在視丘、殼核、尾狀核的表現已被報告(非專利文獻2)。又，GPR20被報告存在於胃腸道基質瘤(Gastrointestinal Stromal Tumor，GIST)(非專利文獻3)、消化道肌層內的神經叢等，且在涉及腸道蠕動運動之卡氏間質細胞(Interstitial Cells of Cajal，ICCs)的一部分中表現mRNA。ICCs被報告為GIST的起源細胞(origin cell)，且此等細胞係藉由GIST的主要轉錄控制因子之ets variant 1(ETV1)而調節GPR20的表現(非專利文獻4)。

GPR20缺損小鼠因顯示為以在開放空間測試(open field test)中總移動距離的增加為特徵之過動症的表現型，故暗示GPR20與中樞神經系統中之自發性活動性相關(專利文獻1)。

因此等狀況，提供可檢測GPR20的表現之方法係有用於檢查或診斷，該檢查或診斷係藉由將GIST等腫瘤細胞或存在於消化道的正常卡氏間質細胞、存在於腦內的細胞等檢測為GPR20陽性細胞而能進行的檢查或診斷。

以往，雖已知有被視為可檢測經福馬林固定之組織中的人類GPR20之多株抗體，但檢測感度、反應特異性不充分，在提供均一品質的抗體方面有問題。又，並未知曉對於GPR20的免疫組織化學染色為有用的單株抗體。

先前技術文獻 專利文獻

專利文獻1 公開專利公報US2003/0018989 A1

非專利文獻

非專利文獻1 Hase M., et al. J Biol Chem. (2008) 283, 12747-12755

非專利文獻2 O’Dowd B. F., Gene 187 (1997) 75-81

非專利文獻3 Allander S. V., et al. CANCER RESEARCH (2001) 61, 8624-8628

非專利文獻4 Chi P., et al. Nature. (2010) 467(7317)：849-853

發明概要

本發明的課題之一為提供與GPR20特異性結合的抗體。

本發明的另一課題為提供包含抗GPR20抗體而成的GPR20檢測用試劑。本發明的另一課題為提供包含抗GPR20抗體而成之與GPR20的表現相關之疾病的診斷用試劑或檢查用組成物等。

又，本發明的課題中，包含編碼該抗體所具有之胺基酸序列的核苷酸、插入有該核苷酸的載體、導入有該核苷酸或載體的細胞、包含培養該細胞的步驟之該抗體的製造方法等。

再者，本發明的另一課題為提供含有該抗GPR20抗體的醫藥組成物、以及使用該醫藥組成物之涉及GPR20的表現之疾病的治療方法。

發明人為了解決上述課題而專心致志地進行探討，創造出新穎的抗GPR20抗體，並發現使用該抗體可檢測GPR20，進而完成本發明。亦即，本發明包含以下發明。

(1)一種抗體或該抗體的抗原結合性片段，其係與包含序列識別號1中胺基酸編號1至48所示之胺基酸序列而成的肽特異性結合；(2)一種抗體或該抗體的抗原結合性片段，其對於對GPR20的結合，係與下列抗體具有競爭抑制活性：具有由序列識別號3的胺基酸編號20至466所示之胺基酸序列所構成的重鏈及由序列識別號11的胺基酸編號20至232所示之胺基酸序列所構成的輕鏈之抗體；(3)如(1)或(2)所記載之抗體或該抗體的功能性片段，其特徵在於與由LEVPLFHLFARLD(序列識別號31)所示之胺基酸序列所構成的表位(epitope)結合；(4)如(1)至(3)中任一項所記載之抗體或該抗體的抗原結合性片段，其中重鏈序列包含具有由序列識別號5或8所示之胺基酸序列所構成的CDRH1、由序列識別號6或9所示之胺基酸序列所構成的CDRH2、以及由序列識別號7所示之胺基酸序列所構成的CDRH3之可變區；輕鏈序列包含具有由序列識別號13所示之胺基酸序列所構成的CDRL1、由序列識別號14所示之胺基酸序列所構成的CDRL2、及由序列識別號15所示之胺基酸序列所構成的CDRL3之可變區； (5)如(1)至(4)中任一項所記載之抗體或該抗體的抗原結合性片段，其係包含下列重鏈可變區及輕鏈可變區而成：由序列識別號4所示之胺基酸序列所構成的重鏈可變區、及序列識別號12所示之輕鏈可變區；(6)如(1)至(5)中任一項所記載之抗體或該抗體的抗原結合性片段，其由重鏈及輕鏈所構成，該重鏈係包含序列識別號3的胺基酸編號20至466所示之胺基酸序列而成，該輕鏈係包含序列識別號11的胺基酸編號20至232所示之胺基酸序列而成；(7)如(1)至(5)中任一項所記載之抗體或該抗體的抗原結合性片段，其特徵在於為嵌合抗體；(8)如(7)所記載之嵌合抗體，其特徵在於恒定區係源自兔子抗體；(9)如(1)至(5)、(7)及(8)中任一項所記載之抗體或該抗體的抗原結合性片段，其包含由序列識別號19的胺基酸編號20至456所示之胺基酸序列所構成的重鏈及由序列識別號21的胺基酸編號21至232所示之胺基酸序列所構成的輕鏈；(10)如(1)至(5)中任一項所記載之抗體或該抗體的功能性片段，其特徵在於經兔源化；(11)如(1)至(5)中任一項所記載之抗體或該抗體的功能性片段，其特徵在於經人源化；(12)如(1)至(5)及(10)中任一項所記載之抗體或該抗體的抗原結合性片段，其包含以下(a)或(b)所記載之重鏈、及(c)所記載之輕鏈： (a)由序列識別號23中胺基酸編號20至456所記載之胺基酸序列所構成的重鏈、(b)由序列識別號25中胺基酸編號20至456所示之胺基酸序列所構成的重鏈、(c)由序列識別號27中胺基酸編號21至230所示之胺基酸序列所構成的輕鏈；(13)如(1)至(5)及(10)中任一項所記載之抗體或該抗體的抗原結合性片段，其由重鏈及輕鏈所構成，該重鏈係包含序列識別號23中胺基酸編號20至456所示之胺基酸序列而成，該輕鏈係包含序列識別號27中胺基酸編號21至230所示之胺基酸序列而成；(14)如(1)至(5)及(10)中任一項所記載之抗體或該抗體的抗原結合性片段，其由重鏈及輕鏈所構成，該重鏈係包含序列識別號25中胺基酸編號20至456所示之胺基酸序列而成，該輕鏈係包含序列識別號27中胺基酸編號21至230所示之胺基酸序列而成；(15)如(1)至(14)中任一項所記載之抗體的抗原結合性片段，其選自由Fab、F(ab’)2、Fab’及Fv所構成之群組；(16)如(1)至(14)中任一項所記載之抗體，其特徵在於為scFv；(17)一種組成物，其包含如(1)至(16)中任一項所記載之抗體或該抗體的抗原結合性片段；(18)如(17)所記載之組成物，其包含如(1)至(16)中任一項所記載之抗體或該抗體的抗原結合性片段，且被使用於在經石蠟包埋處理後經去石蠟處理的組織標本(以下僅稱作「標本」)中之GPR20的檢測或量測方法；(19)如(17)或(18)所記載之組成物，其被使用於包含使如(1)至(16)中任一項所記載之抗體或該抗體的抗原結合性片段與受檢標本接觸的步驟之標本中之GPR20的檢測或量測方法；(20)如(18)或(19)所記載之組成物，其中GPR20的檢測或量測方法包含以下步驟：在受檢標本中檢測或量測到GPR20、或者在受檢標本中之GPR20的表現程度或表現量係同等或高於事前所決定的基準時，判定該受檢標本為陽性；在受檢標本中未檢測或未量測到GPR20、或者在受檢標本中之GPR20的表現程度或表現量係同等或低於事前所決定的基準時，判定該受檢標本為陰性；(21)如(17)至(20)中任一項所記載之組成物，其被使用於GPR20陽性疾病的檢查或診斷方法；(22)如(17)至(21)中任一項所記載之組成物，其中GPR20陽性疾病的檢查或診斷方法包含：在GPR20的檢測或量測中，被判定為陽性之受檢標本的來源之受檢者，係被判定為適於包含投予與GPR20特異性結合之抗體或該抗體的抗原結合性片段的步驟之GPR20陽性疾病的治療或預防方法；被判定為陰性之受檢標本的來源之受檢者，係被判定為不適於包含投予與GPR20特異性結合之抗體或該抗體的抗原結合性片段的步驟之GPR20陽性疾病的治療或預防方法； (23)如(21)或(22)所記載之組成物，其中GPR20陽性疾病為GPR20陽性癌；(24)如(21)至(23)中任一項所記載之組成物，其中GPR20陽性疾病為胃腸道基質瘤(GIST)；(25)一種醫藥組成物，其包含與GPR20特異性結合之抗體或該抗體的抗原結合性片段，且投予至下述(a)至(c)中任一者所記載之受檢者：(a)使用如(17)至(19)及(21)中任一項所記載之組成物而檢測或量測到GPR20之受檢標本的來源之受檢者、(b)在使用如(20)所記載之組成物的GPR20的檢測或量測中被判定為陽性之受檢標本的來源之受檢者、(c)使用如(22)或(24)所記載之組成物，而被判定為適於包含投予與GPR20特異性結合之抗體或該抗體的抗原結合性片段的步驟之GPR20陽性疾病的治療或預防之受檢者；(26)一種GPR20陽性疾病的治療方法，其包含以下步驟(a)及(b)：(a)使用如(1)至(16)中任一項所記載之抗體或該抗體的抗原結合性片段、如(17)至(19)、(21)所記載之組成物而檢測或量測檢體之GPR20的步驟、(b)對在(a)中檢測或量測到GPR20的表現之檢體來源的受檢者投予抗GPR20抗體或該抗體的抗原結合性片段的步驟；(27)一種多核苷酸，其編碼如(1)至(16)中任一項所記載之抗體或該抗體的抗原結合性片段；(28)一種載體，其包含如(27)所記載之多核苷酸；(29)一種細胞，其包含如(27)所記載之多核苷酸或如(28)所記載之載體；(30)一種如(1)至(16)中任一項所記載之抗體或該抗體的抗原結合性片段之製造方法，其包含下述步驟(a)及(b)：(a)培養如(29)所記載之細胞的步驟、(b)從步驟(a)的培養物回收單株抗體或該抗體的抗原結合性片段的步驟。

圖1係顯示大鼠抗GPR20抗體04-093之重鏈的胺基酸序列(序列識別號3)及核苷酸序列(序列識別號2)。

圖2係顯示大鼠抗GPR20抗體04-093之輕鏈的胺基酸序列(序列識別號11)及核苷酸序列(序列識別號10)。

圖3係顯示大鼠抗GPR20抗體04-093之CDRH1~3(序列識別號5~9)、CDRL1~3的胺基酸序列(序列識別號13~15)。

圖4係顯示兔子嵌合化抗體重鏈OcHch的胺基酸序列(序列識別號19)。

圖5係顯示兔子嵌合化抗體輕鏈OcLch的胺基酸序列(序列識別號21)。

圖6係顯示兔源化抗體重鏈OcH01的胺基酸序列(序列識別號23)。

圖7係顯示兔源化抗體重鏈OcH02的胺基酸序列(序列識別號25)。

圖8係顯示兔源化抗體輕鏈OcL01的胺基酸序列(序列識別號27)。

圖9係顯示在使人類GPR20暫時性表現細胞株與產生抗人類GPR20抗體之融合瘤的培養上清液反應之際的流動式細胞測量術解析結果。縱軸顯示藉由流動式細胞測量術所量測之平均螢光強度(MFI)的相對值。

圖10係顯示抗人類GPR20抗體對於由人類GPR20之N端48個胺基酸所構成的合成肽之結合性。

圖11-1係顯示抗GPR20抗體對於人類GPR20暫時性表現細胞之免疫染色影像。圖11-1顯示大鼠抗GPR20單株抗體的染色影像。

圖11-2係顯示抗GPR20抗體對於人類GPR20暫時性表現細胞之免疫染色影像。圖11-2顯示市售的兔子抗GPR20多株抗體的染色影像。

圖11-3係顯示抗GPR20抗體對於人類GPR20暫時性表現細胞之免疫染色影像。圖11-3顯示市售的兔子抗GPR20多株抗體的染色影像。

圖12-1係顯示胃腸道基質瘤GIST之利用大鼠抗人類GPR20抗體及市售的兔子抗GPR20抗體之染色影像。圖12-1顯示源自胃之GIST的染色影像。

圖12-2係顯示胃腸道基質瘤GIST之利用大鼠抗人類GPR20抗體及市售的兔子抗GPR20抗體之染色影像。圖12-2顯示源自小腸之GIST的染色影像。

圖12-3係顯示胃腸道基質瘤GIST之利用大鼠抗人類GPR20抗體及市售的兔子抗GPR20抗體之染色影像。圖12-3顯示源自大腸之GIST的染色影像。

圖13係顯示大鼠抗GPR20抗體04-093、兔子嵌合化抗GPR20抗體及兔源化抗GPR20抗體對於源自PC-3、GIST430、GIST430/654皮下移植小鼠模式的腫瘤組織之GPR20染色影像。

圖14-1係顯示胃腸道基質瘤GIST之利用大鼠抗GPR20抗體04-093、兔子嵌合化抗GPR20抗體及兔源化抗GPR20抗體之染色影像。圖14-1顯示源自胃之GIST的染色影像。

圖14-2係顯示胃腸道基質瘤GIST之利用大鼠抗GPR20抗體04-093、兔子嵌合化抗GPR20抗體及兔源化抗GPR20抗體之染色影像。圖14-2顯示源自小腸之GIST的染色影像。

圖14-3係顯示胃腸道基質瘤GIST之利用大鼠抗GPR20抗體04-093、兔子嵌合化抗GPR20抗體及兔源化抗GPR20抗體之染色影像。圖14-3顯示源自大腸之GIST的染色影像。

圖15係顯示大鼠抗GPR20單株抗體對於由人類GPR20之N端1至48胺基酸所構成的合成肽以及由30-48胺基酸所構成的合成肽之結合活性。橫軸顯示殖株(clone)編號，縱軸顯示利用化學發光量(CPS)之抗體結合量。

圖16係顯示04-093抗體的表位(序列識別號31：人類GPR20之第30至42個的胺基酸序列)。

圖17係顯示使用OcH1L1、OcH2L1、OcChimera、兔子IgG、anti-FLAG、anti-β肌動蛋白之利用西方印漬法之檢測結果的圖。

用於實施發明的形態 1.定義

本發明中，所謂「基因」，意指包含編碼蛋白質之胺基酸的鹼基序列之核苷酸或其互補股，例如，在「基因」的意義中包含：包含編碼蛋白質之胺基酸的鹼基序列之核苷酸或其互補股的多核苷酸、寡核苷酸、DNA、mRNA、cDNA、cRNA等。此種基因係單股、雙股或三股以上的核苷酸，DNA股與RNA股的締合體(association)、在單股核苷酸鏈上混合存在有核醣核苷酸(RNA)與去氧核醣核苷酸(DNA)者及包含該種核苷酸鏈的雙股或三股以上的核苷酸亦包含在「基因」的意義中。作為本發明之「GPR20基因」，可列舉例如包含編碼GPR20蛋白質的胺基酸序列之鹼基序列的DNA、mRNA、cDNA、cRNA等。

本發明中，「核苷酸」與「核酸」為同義，例如DNA、RNA、探針、寡核苷酸、多核苷酸、引子等亦包含在「核苷酸」的意義中。此種核苷酸為由單股、雙股或三股以上的鏈所構成的核苷酸，DNA鏈與RNA鏈的締合體、在單股核苷酸鏈上混合存在有核醣核苷酸 (RNA)與去氧核醣核苷酸(DNA)者及包含該種核苷酸鏈之雙股或三股以上的鏈之締合體亦包含在「核苷酸」的意義中。

本發明中，「多肽」、「肽」及「蛋白質」為同義。

本發明中，有將「抗原」用於「免疫原」之意義的情形。

本發明中，「細胞」中亦包含源自動物個體之各種細胞、繼代培養細胞、初代培養細胞、細胞株、重組細胞及微生物等。

本發明中，有將辨識GPR20之抗體分別標記為「抗GPR20抗體」的情形。在此種抗體中，包含多株抗體、單株抗體、嵌合化抗體、兔源化抗體、人源化抗體、人類抗體等。

本發明中所謂「抗體的功能片段」，意指發揮原本的抗體所發揮的功能之至少一部分的抗體片段。作為「抗體的功能片段」，可列舉例如Fab、F(ab’)2、scFv、Fab’、單鏈免疫球蛋白等，但不限於彼等。此種抗體的功能片段，除了藉由以木瓜酶、胃蛋白酶等酵素來處理抗體蛋白質的全長分子而得者之外，亦可為使用重組基因而在適當的宿主細胞中所產生的重組蛋白質。

本發明中，所謂抗體所結合之「部位」，亦即抗體所辨識之「部位」，意指抗體所結合或辨識之抗原上的部分肽或部分高次結構(higher order structure)。本發明中，亦將此種部位稱作表位、抗體的結合部位。作為本發明的抗GPR20抗體所結合或辨識之GPR20蛋白質上的部位，可例示GPR20蛋白質上的部分肽或部分高次結構等。

已知抗體分子的重鏈及輕鏈中分別有3處的互補決定區(CDR：Complementarity determining region)。互補決定區亦被稱作高度可變區(hypervariable domain)，位於抗體的重鏈及輕鏈之可變區內，為一級結構的變異性特別高的部位，在重鏈及輕鏈之多肽鏈的一級結構上，通常各自分離在三個地方。本發明中，關於抗體之互補決定區，將重鏈之互補決定區自重鏈胺基酸序列之胺基末端側起標記為CDRH1、CDRH2、CDRH3，將輕鏈之互補決定區自輕鏈胺基酸序列的胺基末端側起標記為CDRL1、CDRL2、CDRL3。此等部位在立體結構上為互相接近，且決定對於所結合之抗原的特異性。

本發明中，所謂「抗體變異體」，意指具有在原本的抗體所具有之胺基酸序列中進行胺基酸取代、缺失、加成及/或插入(以下，總稱為「變異」)而成之胺基酸序列，且與本發明之GPR20蛋白質結合的多肽。此種抗體變異體中之變異胺基酸的數量係1至2個、1至3個、1至4個、1至5個、1至6個、1至7個、1至8個、1至9個、1至10個、1至12個、1至15個、1至20個、1至25個、1至30個、1至40個或1至50個。此種抗體變異體亦包含在本發明之「抗體」中。

本發明中，所謂「1至數個」中之「數個」係指3至10個。

作為本發明之抗體所發揮之活性‧性質，可舉出例如生物的活性、物理化學的性質等，具體而言，可舉出各種生物活性、對於抗原或表位之結合活性、製造或保存時之穩定性、熱穩定性等。

本發明中，所謂「在嚴苛條件下進行雜交」，意指在以下條件或與其同等的條件下進行雜交：在包含5×SSC之溶液中以65℃進行雜交，接著在包含2×SSC-0.1%SDS之水溶液中以65℃清洗20分鐘，在包含0.5×SSC-0.1%SDS之水溶液中以65℃清洗20分鐘，以及在包含0.2×SSC-0.1%SDS之水溶液中以65℃清洗20分鐘。所謂SSC，係150mM NaCl-15mM檸檬酸鈉的水溶液，n×SSC意指n倍濃度的SSC。

本發明中所謂「細胞毒性」，係指以某些形式對細胞帶來病理性變化，不限於直接性外傷，亦意指DNA的剪切或鹼基之二聚體(dimer)的形成、染色體的剪切、有絲分裂構造(mitotic apparatus)的損傷、各種酵素活性的降低等所有細胞之結構、功能上的損傷。

本發明中所謂「細胞毒性活性」，意指引起上述細胞毒性。本發明中所謂「抗體依賴性細胞毒性活性」係指「antibody dependent cellular cytotoxicity(ADCC)活性」，意指NK細胞經由抗體而傷害腫瘤細胞等標的細胞之作用活性。

本說明書中，「癌」與「腫瘤」係以相同的意義使用。

本發明中所謂「免疫組織化學(immunohistochemistry：IHC)」，意指檢測組織標本中之抗原的組織學(組織化學)的手法，與「免疫抗體法」為同義，亦與「免疫染色(immunostaining)」用於相同意義。

本發明中所謂「改質型GPR20」，意指經福馬林固定之標本中的GPR20分子。在經福馬林固定後經石蠟處理及去石蠟處理之標本中的GPR20分子亦稱為「改質型GPR20」。

本發明中所謂「非改質型GPR20」，意指未經福馬林固定之樣本中的GPR20。未經福馬林固定之標本中的GPR20分子亦稱為「非改質型GPR20」。

2.GPR20

本發明所使用之GPR20，可由人類、人類以外的哺乳動物(例如，天竺鼠、大鼠、小鼠、兔子、豬、羊、牛、猴等)或雞之T細胞或肥大細胞直接精製而使用，或者製備上述細胞的細胞膜部分(fraction)而使用，又，可藉由在活體外合成GPR20、或者利用基因操作而使其在宿主細胞中產生而獲得。於基因操作，具體而言，在將GPR20 cDNA組入能表現的載體後，在包含轉錄與轉譯所必須之酵素、基質及能量物質的溶液中進行合成，或者藉由使其他原核生物或真核生物的宿主細胞轉形而使GPR20表現，藉此可獲得該蛋白質。

在GenBank中，人類GPR20之cDNA的核苷酸序列被登錄為登錄編號：NM_005293。又，在GenBank 中，人類GPR20的胺基酸序列被登錄為登錄編號：NP_005284。

GPR20的cDNA，可藉由例如將從表現GPR20的mRNA之臟器的cDNA庫或人類細胞所萃取之基因體DNA作為模板，並使用特異性增幅GPR20的cDNA之引子進行聚合酶連鎖反應(以下稱為「PCR」)(Saiki,R.K.,et al.,Science,(1988)239,487-49)，即所謂PCR法而取得。

此外，在GPR20的cDNA中亦包含在嚴苛的條件下與「由與編碼人類GPR20之核苷酸序列為互補的核苷酸序列所構成的多核苷酸」進行雜交，且編碼具有與GPR20同等生物活性之蛋白質的多核苷酸。再者，GPR20的cDNA中亦包含一種多核苷酸，其係由人類GPR20基因座所轉錄之剪接變異體或在嚴苛條件下與此進行雜交之多核苷酸，且其編碼具有與GPR20同等生物活性之蛋白質。

又，GPR20亦包含由人類GPR20的胺基酸序列中1個、2或3個或者4或5個的胺基酸經取代、缺失、或加成之胺基酸序列所構成，且具有與GPR20同等生物活性之蛋白質。再者，GPR20亦包含由在人類GPR20基因座所轉錄之剪接變異體所編碼之胺基酸序列或該胺基酸序列中1個、2或3個或者4或5個的胺基酸經取代、缺失、或加成之胺基酸序列所構成，且具有與GPR20同等生物活性之蛋白質。

本說明書所使用之人類GPR20的胺基酸序列係記載於序列表的序列識別號1。

3.抗GPR20抗體的製造

本發明的對於GPR20之抗體，可藉由使用通常方法，將選自GPR20或GPR20的胺基酸序列之任意的多肽對動物進行免疫，採取活體內所產生之抗體並進行精製而獲得。成為抗原之GPR20的生物種不限於人類，亦可將源自猴、小鼠、大鼠等人類以外的動物之GPR20對動物進行免疫。在此場合中，藉由對所取得之與異種GPR20結合的抗體與人類GPR20之交叉性進行，而可篩選出能適用於人類疾病的抗體。此外，藉由基因操作使宿主細胞產生GPR20基因，藉此可獲得成為抗原之GPR20。具體而言，只要製作能表現GPR20基因的載體，將其導入宿主細胞，使該基因表現，並精製所表現之GPR20即可。

本發明的對於抗GPR20之抗體，亦可使用DNA免疫法而獲得。所謂DNA免疫法，係將抗原表現質體對小鼠或大鼠等動物個體進行基因導入，使抗原在個體內表現，藉此誘導對於抗原之免疫的手法。在基因導入的手法中，存在有直接將質體注射至肌肉的方法、將微脂體或聚乙烯亞胺等導入試劑進行靜脈注射的方法、使用病毒載體的手法、藉由基因槍(Gene Gun)將附著有質體之金粒子射入的手法、將大量的質體溶液急速地進行靜脈注射的流體動力(Hydrodynamic)法等。關於利用表現質體的肌肉注射之基因導入法，作為使表現量提升的手法，已知在肌肉注射質體後，在同部位施加電穿孔之所謂活體內電穿孔(in vivo electroporation)的技術(Aihara H,Miyazaki J.Nat Biotechnol.1998 Sep；16(9)：867-70或Mir LM,Bureau MF,Gehl J,Rangara R,Rouy D,Caillaud JM,Delaere P,Branellec D,Schwartz B,Scherman D.Proc Natl Acad Sci U S A.1999 Apr 13；96(8)：4262-7.)。本手法係藉由在肌肉注射質體前，以玻尿酸酶處理肌肉，而更提升表現量(McMahon JM1,Signori E,Wells KE,Fazio VM,Wells DJ.Gene Ther.2001 Aug；8(16)：1264-70)。

又，亦可遵循眾所周知的方法(例如，Kohler and Milstein,Nature(1975)256,p.495-497、Kennet,R.ed.,Monoclonal Antibodies,p.365-367,Plenum Press,N.Y.(1980))，藉由使產生抗GPR20抗體之抗體產生細胞與骨髓瘤細胞進行融合而樹立融合瘤，並獲得單株抗體。此種方法的具體例係記載於國際公開第WO09/48072號小冊(2009年4月16日公開)及第WO10/117011號(2010年10月14日公開)小冊。

作為如此所樹立之大鼠抗人類GPR20抗體的實例，可舉出04-093抗體。04-093抗體重鏈的胺基酸序列顯示在序列表的序列識別號3，編碼其之核苷酸序列顯示在序列表的序列識別號2。04-093抗體輕鏈的胺基酸序列顯示在序列表的序列識別號11，編碼其之核苷酸序列顯示在序列表的序列識別號10。04-093抗體係與包含序列識別號1中胺基酸編號1至48所示之胺基酸序列而成的肽特異性結合。又，04-093抗體係與包含序列識別號1中胺基酸編號1至48所示之胺基酸序列而成的肽之中的由LEVPLFHLFARLD(序列識別號31)所示之胺基酸序列所構成的表位結合。

本發明之抗體，只要為保持源自04-093抗體之6種全部的CDR序列且具有與GPR20結合之活性的抗體即可。亦即，本發明之抗體的重鏈可變區保有由序列識別號5或8所示之胺基酸序列所構成的CDRH1(GFTFNNYWMT(根據Abm的定義)或NYWMT(根據Kabat的定義))、由序列識別號6或9所示之胺基酸序列所構成的CDRH2(SITNIDGSSY(根據Abm的定義)或SITNIDGSSYYPDSVKG(根據Kabat的定義))、及由序列識別號7所示之胺基酸序列所構成的CDRH3(GSFDY)。又，前述之抗體的輕鏈可變區保有由序列識別號13所示之胺基酸序列所構成的CDRL1(KASQNVNKYLN)、由序列識別號14所示之胺基酸序列所構成的CDRL2(NTNNLQT)、及由序列識別號15所示之胺基酸序列所構成的CDRL3(FQHVSWLT)。此等CDR的胺基酸序列亦記載於圖3。

本發明之抗體係特異性地辨識GPR20蛋白質。換言之，本發明之較佳抗體係與GPR20蛋白質特異性結合。

在一態樣中，較佳抗體係與非改質型之人類GPR20、及經福馬林固定之標本中的改質型人類GPR20雙方特異性結合。又，更佳抗體可舉出與非改質型之人類GPR20、及經福馬林固定之標本中的改質型人類GPR20雙方特異性結合，且不與其他GPR家族特異性結合之抗體等，但不限於彼等。

本發明之抗體中，除了上述對於GPR20之單株抗體之外，亦包含將使異種抗原性降低等作為目的而經人為改變之基因重組型抗體，例如，嵌合(Chimeric)抗體、人源化(Humanized)抗體、或兔源化(Rabbit type，兔型)抗體、小鼠化抗體等。此等抗體可使用既知的方法製造。

作為嵌合抗體，可舉出抗體的可變區與恒定區互為異種之抗體，例如將源自小鼠或大鼠之抗體的可變區接合至源自人類的恒定區而成的嵌合抗體(參照Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,81,6851-6855,(1984))。又，作為其他例，可舉出將源自小鼠或大鼠之抗體的可變區接合至源自兔子的恒定區而成的嵌合抗體。

作為兔子嵌合化抗體之更具體的例，可舉出包含重鏈(OcHch)以及輕鏈(OcLch)而成的抗體，該重鏈係包含源自04-093抗體之重鏈可變區與兔子重鏈之恒定區而成，該輕鏈係包含源自04-093抗體之輕鏈可變區與兔子輕鏈之恒定區而成。OcHch的胺基酸序列顯示於序列表的序列識別號19的胺基酸編號20至456。OcLch的胺基酸序列顯示於序列表的序列識別號21的胺基酸編號21至232。

本發明之抗體中，包含改變前述人源化抗體或兔源化抗體之CDR的抗體。此等抗體可使用既知的方法製造。

作為人源化抗體，可舉出僅將互補決定區(CDR；complementarity determining region)組入源自人類之抗體的抗體(參照Nature(1986)321,p.522-525)；除了CDR的序列之外亦將一部分的框架(framework)的胺基酸殘基移植至人類抗體的抗體(國際公開第WO90/07861號小冊)。作為兔源化抗體，可舉出僅將互補決定區(CDR；complementarity determining region)組入源自兔子之抗體的抗體；除了CDR的序列之外亦將一部分的框架的胺基酸殘基移植至兔子抗體的抗體。CDR的胺基酸序列可藉由卡巴特(Kabat)的定義、喬西亞(Chothia)的定義、Abm的定義等眾所周知的方法而確定，本發明中之CDR可為藉由任一方法所定義者。

作為兔源化抗體之更具體的例，可舉出04-093抗體之兔源化抗體，作為更具體的例，可舉出包含重鏈(OcH01)或重鏈(OcH02)、以及輕鏈(OcL01)而成的兔源化抗體，該重鏈(OcH01)由序列表的序列識別號23的胺基酸編號20至456所示之胺基酸序列所構成，該重鏈(OcH02)由序列識別號25的胺基酸編號20至456所示之胺基酸序列所構成，該輕鏈(OcL01)由序列識別號27的胺基酸編號21至230所示之胺基酸序列所構成。

此外，已知以哺乳類培養細胞所生產之抗體的重鏈之羧基末端的離胺酸殘基缺失(Journal of Chromatography A,705：129-134(1995))，又，已知相同重鏈羧基末端的甘胺酸、離胺酸的2胺基酸殘基缺失，新位於羧基末端之脯胺酸殘基被醯胺化(Analytical Biochemistry,360：75-83(2007))。但是，此等重鏈序列之缺失及修飾並不影響抗體之抗原結合能力及效應子(effector)功能(補體的活化、抗體依賴型細胞毒性作用等)。因此，本發明亦包含受到該修飾之抗體，可舉出在重鏈羧基末端缺失1或2個胺基酸之缺失體、及經醯胺化之該缺失體(例如，羧基末端部位之脯胺酸殘基經醯胺化之重鏈)等。但是，只要保有抗原結合能力及效應子功能，則本發明之抗體的重鏈之羧基末端的缺失體不限於上述種類。構成本發明之抗體的二條重鏈，可為選自由完整長度及上述缺失體所構成之群組的重鏈之任一種，亦可為組合任二種者。各缺失體的量比可能受到產生本發明之抗體的哺乳類培養細胞的種類及培養條件影響，但作為本發明之抗體的主成分，可舉出在二條重鏈的兩者皆缺失羧基末端的一個胺基酸殘基之情形。

藉由以上方法所得之抗體，可評價對於抗原之結合性而挑選較佳的抗體。作為比較抗體性質時的其他指標之一例，可舉出抗體的穩定性。微差掃描熱量法(DSC)係可快速又正確地量測熱變性中點(Tm)之方法，此熱變性中點(Tm)為蛋白的相對性結構穩定性之優良指標。使用DSC量測Tm值，並比較其值，藉此可比較熱穩定性的差異。已知抗體的保存穩定性與抗體的熱穩定性顯示某程度的相關(Lori Burton,et.al.,Pharmaceutical Development and Technology(2007)12,p.265-273)，可將熱穩定性作為指標而挑選較佳的抗體。作為用於挑選抗體之其他指標，可舉出在適當宿主細胞中之產量高、及在水溶液中的凝集性低。例如，產量最高的抗體不一定顯示最高的熱穩定性，故必須基於以上所述之指標進行綜合判斷，而挑選最適合的抗體。

又，已知使用適當連接子(linker)將抗體之重鏈及輕鏈的全部長度序列進行連接，而取得單鏈免疫球蛋白(single chain immunoglobulin)的方法(Lee,H-S,et.al.,Molecular Immunology(1999)36,p.61-71；Shirrmann,T.et.al.,mAbs(2010),2,(1)p.1-4)。此種單鏈免疫球蛋白能藉由二聚體化而保持與原本為四量體之抗體類似的結構與活性。又，本發明之抗體亦可為具有單一的重鏈可變區且不具有輕鏈序列之抗體。此種抗體被稱作單域抗體(single domain antibody：sdAb)或奈米抗體(nanobody)，已有報告實際以駱駝或駱馬進行觀察，其保持抗原結合能力(Muyldemans S.et.al.,Protein Eng.(1994)7(9),1129-35、Hamers-Casterman C.et.al.,Nature(1993)363(6428)446-8)。上述抗體亦能解釋為本發明中之抗體的抗原結合性片段的一種。

在將抗體基因暫時分離後導入適當宿主而製作抗體時，可使用適當宿主與表現載體之組合。作為抗體基因的具體例，可舉出將編碼本說明書所記載之抗體的重鏈序列之基因及編碼輕鏈序列之基因組合而成者。在將宿主細胞進行轉形之際，重鏈序列基因與輕鏈序列基因能插入同一個表現載體，又亦能插入個別的表現載體。使用真核細胞作為宿主時，可使用動物細胞、植物細胞、真核微生物。作為動物細胞，可舉出(1)哺乳類細胞，例如，為猴細胞之COS細胞(Gluzman,Y.Cell(1981)23,p.175-182、ATCC CRL-1650)、小鼠纖維母細胞NIH3T3(ATCC No.CRL-1658)或中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞，ATCC CCL-61)之二氫葉酸還原酵素缺損株(Urlaub,G.and Chasin,L.A.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1980)77,p.4126-4220)。又，使用原核細胞時，可列舉例如大腸桿菌、枯草桿菌。藉由轉形而將作為目的之抗體基因導入此等細胞，在活體外培養經轉形的細胞，藉此可獲得抗體。在以上培養法中，有產量依抗體的序列而異之情形，能從具有同等結合活性之抗體中，以產量作為指標而篩選作為醫藥之生產為容易者。

沒有作為本發明之抗體的同型(isotype)之限制，可舉出例如IgG(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgM、IgA(IgA1、IgA2)、IgD或IgE等，但較佳可舉出IgG或IgM，再佳可舉出IgG1或IgG2。

又，本發明之抗體亦可為具有抗體的抗原結合部之抗體的抗原結合性片段或其修飾物。將抗體以木瓜酶、胃蛋白酶等蛋白質分解酵素進行處理，或者將抗體基因以基因工程的手法進行改變而使其在適當的培養細胞中表現，藉此可獲得該抗體的片段。在此種抗體片段之中，可將保持抗體全長分子所具有的全部或一部分功能之片段稱為抗體的抗原結合性片段。作為抗體的功能，一般而言可舉出抗原結合活性、中和抗原的活性之活性、增強抗原的活性之活性、抗體依賴性細胞毒性活性、補體依賴性細胞毒性(complement dependent cytotoxicity)活性及補體依賴性細胞性細胞毒性活性。本發明中之抗體的抗原結合性片段所保持之功能為對於GPR20之結合活性。

例如，作為抗體的片段，可舉出Fab、F(ab’)2、Fv、或以適當連接子來連接重鏈及輕鏈的Fv而成之單鏈Fv(scFv)、雙體(diabody、diabodies)、線狀抗體、及由抗體片段所形成之多特異性抗體等。又，抗體的片段亦包含在還原條件下處理F(ab’)2而成之抗體的可變區之一價的片段之Fab’。

再者，本發明之抗體亦可為對於至少二種類之不同抗原具有特異性之多特異性抗體。通常此種分子為與二種類的抗原結合者(亦即，雙特異性抗體(bispecific antibody))，但本發明中之「多特異性抗體」包含對於其以上(例如，3種類)的抗原具有特異性之抗體。

本發明之多特異性抗體亦可為由全部長度所構成的抗體或此種抗體的片段(例如，F(ab’)2雙特異性抗體)。雙特異性抗體亦可使二種類的抗體之重鏈與輕鏈(HL對)結合而製作，亦可藉由使產生不同單株抗體之融合瘤融合並製作雙特異性抗體產生融合細胞而製作(Millstein et al.,Nature(1983)305,p.537-539)。

本發明之抗體亦可為單鏈抗體(亦記載為scFv)。單鏈抗體可藉由以多肽之連接子來連接抗體之重鏈可變區與輕鏈可變區而獲得(Pluckthun,The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,113(Rosenberg及Moore編，Springer Verlag,New York,p.269-315(1994)、Nature Biotechnology(2005),23,p.1126-1136)。又，亦可將以多肽連接子使2個scFv結合所製作之BiscFv片段作為雙特異性抗體使用。

製作單鏈抗體之方法為本技術領域中所周知(例如，參照美國專利第4,946,778號、美國專利第5,260,203號、美國專利第5,091,513號、美國專利第5,455,030號等)。此scFv中，重鏈可變區與輕鏈可變區係經由不形成共軛的連接子而連接，較佳為經由多肽連接子而連接(Huston,J.S.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1988),85,p.5879-5883)。scFv中之重鏈可變區及輕鏈可變區可來自同個抗體，亦可來自不同個抗體。作為連接可變區之多肽連接子，可使用例如由12~19殘基所構成之任意的單鏈肽。

編碼scFv之DNA，可藉由以下方式而得：在編碼前述抗體之重鏈或重鏈可變區的DNA、及編碼輕鏈或輕鏈可變區的DNA之中，將該等序列之中編碼全部或所期望的胺基酸序列之DNA部分作為模板，並使用規定此兩端之引子對，藉由PCR法進行增幅，接下來進一步將編碼多肽連接子部分的DNA、及以其兩端分別與重鏈、輕鏈連接之方式而規定之引子對加以組合並進行增幅。

又，一旦製作編碼scFv之DNA，則可依據通常方法獲得含有彼等之表現載體、及藉由該表現載體所轉形之宿主，又，藉由使用該宿主，而可依據通常方法獲得scFv。此等抗體片段可與前述同樣地進行而取得基因且使其表現，並藉由宿主而使其產生。

本發明之抗體，可為進行多量化而提高對抗原之親和性者。作為多量化之抗體，可為一種類的抗體，亦可為辨識相同抗原的複數表位之複數的抗體。作為將抗體進行多量化的方法，可舉出IgG CH3域與二個scFv之結合、與鏈黴親和素(Streptavidin)之結合、螺旋-轉折-螺旋模體(helix-turn-helix motif)的導入等。

本發明之抗體可為胺基酸序列不同之複數種類的抗GPR20抗體之混合物，亦即多株抗體。作為多株抗體的一例，可舉出CDR不同之複數種類的抗體之混合物。作為該種多株抗體，可將產生不同抗體的細胞的混合物進行培養，而使用自該培養物精製之抗體(參照WO2004/061104號)。

作為抗體的修飾物，亦可使用與聚乙二醇(PEG)等各種分子結合之抗體。

本發明之抗體，進一步亦可為此等抗體與其他藥劑形成結合物者(Immunoconjugate)。作為此種抗體的例，可舉出該抗體與具有放射性物質或藥理作用的化合物結合者(Nature Biotechnology(2005)23,p.1137-1146)。

所得之抗體可精製至均勻為止。抗體之分離、精製只要使用通常蛋白質所使用之分離、精製方法即可。例如只要將管柱層析法、過濾器過濾、超過濾、鹽析、透析、製備用聚丙烯醯胺凝膠電泳、等電點電泳等適當選擇、組合，則可將抗體進行分離、精製(Strategies for Protein Purification and Characterization：A Laboratory Course Manual,Daniel R.Marshak et al.eds.,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1996)；Antibodies：A Laboratory Manual.Ed Harlow and David Lane,Cold Spring Harbor Laboratory(1988))，但並不限定於此等。

作為層析法，可舉出親和力層析法、離子交換層析法、疏水性層析法、凝膠過濾層析、逆相層析法、吸附層析法等。此等層析法可使用HPLC或FPLC等液相層析法而進行。作為親和力層析法所使用之管柱，可舉出蛋白質A(Protein A)管柱、蛋白質G(Protein G)管柱。例如，作為使用蛋白質A管柱之管柱，可舉出HypewD、POROS、Sepharose F.F.(Pharmacia)等。又，亦能使用將抗原固定化之撐體(support)，利用對抗原之結合性而將抗體進行精製。

4.醫藥組成物

本發明係提供包含抗GPR20抗體或其功能片段或其修飾物之醫藥組成物。

本發明之醫藥組成物有用於因GPR20或其配體之過度表現或者GPR20之變異或基因增幅所致之GPR20訊息異常或亢進、或者因GPR20的同功型(isoform)之轉換所引發之或惡化之各種疾病(以下稱為「GPR20相關疾病」)，特別有用於各種癌之治療或預防。

作為成為此種治療或預防的對象之癌的引發或惡化的原因，可例示GPR20基因內之單鹼基取代(SNP)、GPR20之高表現、恆常地活化GPR20之誤義突變、GPR20基因之增幅或過度表現、GPR20同功型之轉換等。

作為此種癌種類，可舉出例如胃腸道基質瘤(GIST)，較佳可舉出表現GPR20蛋白質之胃腸道基質瘤(GIST)。

本發明中，疾病的治療或預防包含：此種疾病的發病之預防、惡化或發展之抑制或阻礙，較佳為表現GPR20蛋白質的個體中之此種疾病的發病之預防、惡化或發展之抑制或阻礙；罹患此種疾病之個體所呈現之一個或二個以上的症狀之減輕、惡化或發展之抑制或緩解；續發性疾病的治療或預防等，但不限定於彼等。

本發明之醫藥組成物中，可含有對治療或預防為有效量的抗GPR20抗體或該抗體的功能片段與藥學上所容許之稀釋劑、載劑(carrier)、助溶劑、乳化劑、保存劑及/或補助劑。

所謂「對治療或預防為有效量」，意指依特定的疾病、投予形態及投予路徑而發揮治療或預防效果的量，與「藥理學上有效量」為同義。

本發明之醫藥組成物可包含用於使pH、滲透壓、黏度、透明度、顏色、等張性、無菌性、該組成物或其所含之抗體的穩定性、溶解性、持續釋放性、吸收性、滲透性、劑型、強度、特性、形狀等變化、維持或保持的物質(以下稱作「製劑用之物質」)。作為製劑用之物質，只要是藥理學上可容許的物質則無特別限定。例如，非毒性或低毒性係製劑用之物質所較佳具備之性質。

作為製劑用之物質，可舉出例如胺基酸類、抗菌劑、抗氧化劑、緩衝劑、填充劑、螫合劑、錯合劑、增量劑、單糖類、雙糖類、碳水化合物、著色劑、香味劑、稀釋劑、乳化劑、親水聚合物、防腐劑、溶劑、糖醇、懸浮劑、界面活性劑、穩定化增強劑、彈性增強劑、輸送劑、稀釋劑、賦形劑、及/或藥學上的補助劑等，相對於抗GPR20抗體或其功能片段或其修飾物之重量，該等物質之添加量為0.001至1000倍，較佳為0.01至100倍，更佳為0.1至10倍。

本發明之醫藥組成物亦包含以下醫藥組成物；含有在微脂體中包含抗GPR20抗體或其功能片段或其修飾物而成之免疫微脂體、抗體與微脂體結合而成之抗體修飾物(美國專利第6214388號等)之醫藥組成物。

賦形劑或載劑，通常為液體或固體，只要是注射用的水、生理食鹽水、人工腦脊髓液、其他之經口投予或非經口投予用之製劑所使用之物質則未特別限定。作為生理食鹽水，可舉出中性者、包含血清白蛋白者等。

作為緩衝劑，可例示以醫藥組成物之最終pH成為7.0至8.5之方式所製備的Tris緩衝液、同樣地以成為4.0至5.5之方式所製備之酢酸緩衝液、同樣地以成為5.0至8.0之方式所製備之檸檬酸緩衝液、同樣地以成為5.0至8.0所製備之組胺酸緩衝液等。

本發明之醫藥組成物係固體、液體、懸浮液等。可舉出冷凍乾燥製劑。為了將冷凍乾燥製劑進行成型，可使用蔗糖等賦形劑。

作為本發明之醫藥組成物的投予路徑，可為經腸投予、局部投予及非經口投予之任一者，可舉出例如靜脈內投予、動脈內投予、肌肉內投予、皮內投予、皮下投予、腹腔內投予、經皮投予、骨內投予、關節內投予等。

此種醫藥組成物之組成可因應投予方法、抗體之GPR20蛋白質結合親和性等而決定。本發明之抗GPR20抗體或其結合片段或其修飾物對GPR20蛋白質之親和性愈高(KD值越低)，則能以愈少的投予量發揮其藥效。

本發明之抗GPR20抗體的投予量，只要是藥理學上有效量則未限定，可因應個體的種類、疾病的種類、症狀、性別、年齡、宿疾、該抗體之GPR20蛋白質結合親和性或其生物活性、其他要素而適當決定，通常可將0.01至1000mg/kg，較佳為可將0.1至100mg/kg，於1至180日投予1次、或1日投予2次或3次以上。

作為醫藥組成物之形態，可例示注射劑(包含冷凍乾燥製劑、點滴劑)、栓劑、經鼻型吸收製劑、經皮型吸收製劑、舌下劑、膠囊、錠劑、軟膏劑、顆粒劑、氣霧劑、丸劑、散劑、懸浮劑、乳劑、點眼劑、活體植入型製劑等。

包含抗GPR20抗體或其功能片段或其修飾物作為有效成分之醫藥組成物，可與其他醫藥同時或分別進行投予。例如，可在投予其他醫藥後投予包含抗GPR20抗體或該抗體的功能片段作為有效成分之醫藥組成物；或可在投予此種醫藥組成物後投予其他醫藥；或者可同時投予該醫藥組成物與其他醫藥。作為其他醫藥，可舉出化學療法劑、放射線療法等各種抗癌劑等。將彼等統稱為本發明之抗體「與其他藥劑之併用」，本發明亦包含：除了本發明之抗體、其功能片段或其修飾物以外亦包含額外的藥劑之醫藥組成物。

本發明亦提供癌等GPR20相關疾病的治療方法或預防方法、用於製備該疾病的治療用或預防用醫藥組成物之本發明的抗體之用途、用於該疾病的治療或預防之本發明的抗體之用途。本發明亦包含含有本發明之抗體的治療用或預防用套組。

5.診斷用組成物

本發明亦提供包含抗GPR20抗體或其功能片段或其修飾物之檢查用或診斷用組成物(以下，統稱為「診斷用組成物」)。

本發明之診斷用組成物係有用於癌、胃腸道基質瘤(GIST)等GPR20相關疾病、GPR20表現之檢查或診斷。本發明中，檢查或診斷包含例如罹患風險之判定或量測、有無罹患之判定、發展或惡化程度之量測、利用抗GPR20抗體等醫藥組成物之藥物治療的效果之量測或判定、藥物治療以外之治療的效果之量測或判定、復發風險之量測、有無復發之判定等，但只要為檢查或診斷，則並不限定於彼等。

本發明之診斷用組成物係有用於鑑別投予抗GPR20抗體或其功能片段或其修飾物、包含彼等之組成物、包含彼等之醫藥組成物的個體。

在此種診斷用組成物中，可含有pH緩衝劑、滲透壓調節劑、鹽類、穩定化劑、防腐劑、顯影劑、敏化劑、抗凝集劑等。

本發明亦提供癌等GPR20相關疾病之檢查方法或診斷方法、本發明之抗體用於製備該疾病的診斷用組成物之用途、本發明之抗體用於該疾病的檢查或診斷之用途。包含本發明之抗體的檢查或診斷用套組亦包含在本發明中。

作為使用本發明之診斷用組成物的檢查或診斷方法，期望為三明治式酵素結合免疫吸附分析法(sandwich ELISA)，但能利用通常之ELISA法或RIA法、ELISPOT(Enzyme-Linked ImmunoSpot，酵素結合免疫斑點)法、點漬(dot blot)法、歐氏雙向擴散法、CIE(Counterimmunoelectrophoresis，對流免疫電泳)法、CLIA(Chemiluminescent immuno assay，化學發光免疫分析法)、FCM(Flow Cytometry，流動式細胞測量術)等利用抗體之檢測方法。作為抗體的標示法，除了生物素以外，亦可利用HRP、鹼性磷酸酶、FITC或ALEXA等螢光團、放射性同位元素等標示等能在生化學解析上實施之標示法。在利用酵素標示之檢測中，除了TMB(3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine，3,3,5,5-四甲基聯苯胺)、BCIP(5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate，5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯)、ρ-NPP(ρ-nitrophenyl phosphate，ρ-硝基苯磷酸酯)、OPD(o-Phenylenediamine，鄰苯二胺)、ABTS(3-Ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid，3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)、SuperSignal ELISA Pico Chemiluminescent Substrate(Thermo Fisher Scientific公司)等呈色基質(chromogenic substrate)或QuantaBlu(註冊商標)Fluorogenic Peroxidase Substrate(Thermo Fisher Scientific公司)螢光基質以外，亦可使用化學發光基質。對於本量測，除了源自人類或非人類動物的試料之外，亦可提供重組蛋白質等加以人工處理的試料。作為源自生物個體的受檢試料，可列舉例如血液、關節液、腹水、淋巴液、腦脊髓液、組織均質上清液、組織切片等，但不限於彼等。

包含本發明之抗體的檢查或診斷用之三明治式酵素結合免疫吸附分析法套組中，可包含對照(源自GPR20之肽的標準液)、呈色試劑、稀釋用緩衝液、固相用抗體、檢測用抗體、以及清洗液等。作為量測已與抗原結合之抗體量的方法，較佳適用吸光法、螢光法、發光法、RI(Radioisotope，放射性同位素)法等，在量測中，較佳使用吸光盤式分析儀(plate reader)、螢光盤式分析儀、發光盤式分析儀、RI液體閃爍計數器等。

不僅可用於前述免疫組織學試驗，亦可用於西方印漬法或點漬法，此西方印漬法或點漬法係依循通常方法自試料中的細胞、組織或臟器或者其一部分製備經增溶的蛋白，並使該增溶蛋白與標示化抗體反應，藉此確認增溶蛋白中是否存在GPR20。作為成為對象之受檢試料，包含從胞外體等所製備之增溶蛋白質，此胞外體係由包含血液等體液中所含之細胞、血中循環腫瘤細胞、癌細胞在內之各種細胞所分泌，但受檢試料不受限於彼等。

本發明提供在免疫組織化學(immunohistochemistry：IHC)的分析中為有用的抗體、其功能片段及其修飾物、以及包含彼等之組成物。此種組成物亦包含在本發明之「診斷用組成物」中。

免疫組織化學只要係使組織切片和會與抗原結合之抗體(一級抗體)反應而檢測與抗原結合之一級抗體的手法，則無特別限定。

組織切片較佳為在福馬林固定後進行石蠟包埋處理。石蠟包埋後，將已薄切之組織切片進行去石蠟處理後，進行抗原激活處理及非特異性反應抑制處理。作為抗原激活處理的方法，可例示加熱處理、利用蛋白酶等之酵素處理，較佳為加熱處理。作為加熱處理的條件，通常較佳為溫度90至110℃、pH8至10、處理時間20至60分鐘的範圍。pH的調整中，可使用Tris-EDTA緩衝液(例如，含有1mM之EDTA的10mM Tris緩衝液)等。作為非特異性反應抑制處理，通常利用將具有與呈色所使用之酵素同樣或類似的觸媒活性之內因性酵素進行去活化的方法。在藉由過氧化酶反應使其呈色之情形，較佳為預先將組織中所存在之內因性的過氧化酶以H₂O₂等阻礙。H₂O₂的溶劑可使用水、甲醇等，H₂O₂的濃度為0.1至3%，較佳為0.3至3%。H₂O₂溶液中可添加疊氮化鈉。又，亦可使用藉由血清或酪蛋白而進行阻斷(blocking)的方法來作為非特異性反應抑制處理。血清或酪蛋白可在一級抗體反應前處理組織，但亦可被含在稀釋一級抗體的溶劑中。

一級抗體的反應條件並未被特別限定，但溫度為4至50℃，較佳為20至37℃，更佳為24℃。反應時間為5分鐘至一晝夜，較佳為10分鐘至4小時，更佳為30分鐘至1小時。

一級抗體的檢測中，較佳可使用可進行可視化且與一級抗體結合之抗體(二級抗體)。亦有使用與二級抗體本身結合的抗體(三級抗體)進行3次以上的反應之情形。作為二級抗體或三級抗體之可視化法，可較佳地使用以下方法：使過氧化酶或鹼性磷酸酶等酵素與彼等抗體結合、或在彼等抗體上加成生物素等而使彼等與已與前述酵素結合之鏈黴親和素等結合，來使對應於彼等酵素之呈色基質進行反應的方法。作為使酵素與二級抗體或三級抗體結合之方法，可例示使用使糊精聚合物或胺基酸聚合物與前述酵素及二級抗體大量結合之試劑的方法(聚合物法)。於使生物素化二級抗體及經過氧化酶標示之鏈黴親和素反應的方法(LSAB法)，可使用DAB等作為呈色基質。又，亦可使用經螢光色素等所標示之二級抗體。以螢光標示二級抗體進行處理之情形，在處理後使用螢光顯微鏡檢測陽性細胞。

於抹片法，將摘出細胞塗布於玻璃或以離心分離機進行分離，分成細胞成分與液體性成分，並針對細胞成分進行免疫染色。亦即，可將細胞成分塗布於載玻片上，以乙醇溶液或10%福馬林液等進行固定後，進行與組織切片同樣的免疫染色。

於冷凍包埋法，在將摘出組織以OCT化合物等包埋後，以液態氮等進行急速冷凍，並以冷凍切片機進行薄切，藉此製作玻片標本。可將此標本以10%福馬林或乙醇溶液等進行固定後，進行與組織切片同樣的免疫染色。

免疫組織化學之操作，可將反應液、反應條件、清洗次數等寫成程式輸入免疫裝置，而自動化進行。

影像診斷之情形，可在抗體上標示藥學上可容許的放射性核種或發光體，並將該抗體投予至受檢者，使用PET/CT等影像診斷技術獲取影像，判定或檢查GPR20的存在。

本發明的診斷用組成物所含之抗體、其功能片段或其修飾物，較佳為與GPR20結合之抗體，亦即為具有GPR20選擇性之抗體、其功能片段或其修飾物。

作為具有人類GPR20選擇性之抗體，可例示：包含含有大鼠04-093抗體之重鏈的CDRH1、CDRH2及CDRH3之重鏈、以及含有輕鏈的CDRL1、CDRL2及CDRL3之輕鏈而成的抗體；包含大鼠04-093抗體之重鏈可變區及輕鏈可變區而成的抗體；包含大鼠04-093抗體之重鏈及輕鏈而成的抗體等。作為此種抗體，可列舉大鼠04-093抗體、源自04-093抗體之嵌合抗體、源自04-093抗體之兔源化抗體、源自04-093抗體之人源化抗體等，但不限定於彼等。

在本發明之一較佳態樣中，診斷用組成物為GPR20檢測用或量測用。

本發明提供檢測或量測受檢樣本中之人類GPR20的方法。

在此等檢測或量測方法中，可使用本發明之診斷用組成物。此種量測方法及診斷用組成物亦作為人類GPR20陽性癌的診斷用或檢查用，較佳為作為胃腸道基質瘤的診斷用或檢查用而被包含在本發明中。

本發明中，亦包含鑑別投予以GPR20作為標的之醫藥組成物的個體(患者)之方法。在此種鑑別方法中，量測源自該個體之樣本中的人類GPR20，在該樣本中檢測到人類GPR20、或者與源自健康正常個體之樣本中所檢測到之人類GPR20的量比較而檢測到更多人類GPR20時，可判定該個體為陽性，而鑑別投予以GPR20作為標的之醫藥組成物的個體。

又，為了鑑別投予以GPR20作為標的之醫藥組成物的個體，除了在源自受檢者的樣本中確認到GPR20的表現之情形以外，亦可進一步將表現量或利用免疫染色之染色比例或染色強度作為指標。作為一例，可舉出對應於以抗GPR20抗體進行免疫染色之際的染色程度而設定表1所示之0至3的分數，並將分數1以上、2以上或3以上受檢者鑑別為投予以GPR20作為標的之醫藥組成物的患者之方法。

該方法中，可使用本發明之診斷用組成物。

又，在此種鑑別方法之一較佳態樣中，可用於判定該個體罹患癌或有其風險，較佳為罹患胃腸道基質瘤或有其風險。

再者，本發明之醫藥組成物在其一態樣中，能投予至在此種鑑別方法中被判定為陽性的個體。

6.試劑

本發明之抗體或其抗原結合性片段或其修飾物亦有用於作為試劑。此種試劑被使用在上述的檢查或診斷用、研究用及其他用途。

[實施例]

以下藉由實施例而具體地說明本發明，但本發明並不限定於此等。此外，在下述實施例中，有關基因操作之各操作只要未被特別明示，則依據「分子選殖(Molecular Cloning)」(Sambrook,J.,Fritsch,E.F.及Maniatis,T.著，由Cold Spring Harbor Laboratory Press 在1989年出版)所記載的方法而進行，或在使用市售的試劑或套組時遵循市售品的說明書而使用。又，本說明書中，未特別記載之試劑、溶劑及起始材料，能輕易地從市售的供給源取得。

實施例1：大鼠抗人類GPR20抗體的製作 1)-1 人類GPR20表現載體的構築

編碼人類GPR20蛋白質(NP_005284)之cDNA，係遵循本發明所屬技術領域中具有通常知識者眾所周知的方法，藉由將源自人類腦之cDNA作為模板之PCR法而進行增幅，藉由組入哺乳動物表現用載體而製作人類GPR20表現載體pcDNA3.1-hGPR20。將人類GPR20的胺基酸序列示於序列表的序列識別號1。使用EndoFree Plasmid Giga Kit(QIAGEN公司)進行pcDNA3.1-hGPR20質體DNA的大量製備。

1)-2 大鼠免疫

在免疫中，使用6週齡的WKY/Izm雌性大鼠(Japan SLC公司)。首先，以玻尿酸酶(SIGMA-ALDRICH公司)將大鼠雙腳下腿部進行前處理後，在同部位肌肉內注射人類GPR20表現載體pcDNA3.1-hGPR20。接下來，使用ECM830(BTX公司)，利用二針電極，在同部位實施活體內電穿孔。於二週重複一次同樣的活體內電穿孔後，在第79日採取大鼠的淋巴結，使用於融合瘤製作。

1)-3 融合瘤製作

使用Hybrimune Hybridoma Production System(Cyto Pulse Sciences公司)，將淋巴結細胞與小鼠骨髓瘤SP2/0-ag14細胞進行電細胞融合後，懸浮於ClonaCell-HY Selection Medium D(StemCell Technologies公司)，進行稀釋，在37℃、5% CO₂的條件下進行培養。出現之各個融合瘤群落係作為單株(monoclone)回收，懸浮於ClonaCell-HY Selection Medium E(StemCell Technologies公司)，在37℃、5% CO₂的條件下進行培養。細胞適度增殖後，製作各個融合瘤細胞的冷凍庫存(stock)，同時回收培養上清液，使用於產生抗GPR20抗體之融合瘤的篩選。

1)-4 利用Cell-ELISA法之抗體產生融合瘤的篩選 1)-4-1 Cell-ELISA用抗原基因表現細胞的製備

將293α細胞(表現整聯蛋白αv及整聯蛋白β3之源自HEK293的穩定表現細胞株)，在含有10% FBS之DMEM培養基中，以成為5x10⁵細胞/10mL之方式進行製備。遵循使用Lipofectamine 2000(Invitrogen公司)之轉染程序，對於此293α細胞，導入pcDNA3.1-hGPR20或者作為陰性對照之pcDNA3.1的DNA，在96孔盤(Corning公司)中分別注入各100μL後，在含有10%FBS之DMEM培養基中，在37℃、5% CO₂的條件下，培養24至27小時。將所得之轉染細胞以接著狀態直接使用於Cell-ELISA。

1)-4-2 Cell-ELISA

去除實施例1)-4-1所製備之表現載體導入293α細胞的培養上清液後，分別對於pcDNA3.1-hGPR20或pcDNA3.1導入293α細胞，添加融合瘤培養上清液，在4℃靜置1小時。將孔(well)中的細胞以含有5%FBS之PBS(+)清洗一次後，添加以含有5%FBS之PBS(+)稀釋500倍之於兔子中製備的抗大鼠IgG-過氧化酶抗體(Anti-Rat IgG-Peroxidase antibody produced in rabbit)(SIGMA公司)，在4℃靜置1小時。將孔中的細胞以含有5%FBS之PBS(+)清洗三次後，以100μL/孔來添加OPD呈色液(在OPD溶解液(0.05M檸檬酸三鈉、0.1M磷酸氫二鈉十二水合物pH4.5)中，分別以成為0.4mg/mL、0.6%(v/v)之方式，溶解鄰苯二胺二鹽酸鹽(和光純藥公司)、H₂O₂)。一邊不時攪拌一邊進行呈色反應，以100μL/孔來添加1M HCl而使呈色反應停止後，以盤式分析儀(ENVISION：PerkinElmer公司)量測490nm的吸光度。為了選擇產生與在細胞膜表面上表現之人類GPR20特異性結合的抗體之融合瘤，而選擇產生以下培養上清液之融合瘤作為抗人類GPR20抗體產生陽性：相較於對照之pcDNA3.1導入293α細胞，在pcDNA3.1-hGPR20表現載體導入293α細胞顯示更高吸光度之培養上清液。

1)-5 利用流動式細胞測量術之人類GPR20結合抗體的篩選 1)-5-1 流動式細胞測量術解析用抗原基因表現細胞的製備

以成為5×10⁴細胞/cm²之方式，將293T細胞接種至225cm²燒瓶(Sumitomo Bakelite公司製)，在含有10%FBS之DMEM培養基中，在37℃、5% CO₂的條件下培養一晚。隔天，使用Lipofectamine 2000，將pcDNA3.1-hGPR20及作為陰性對照之pcDNA3.1分別導入293T細胞，在37℃、5% CO₂的條件下，再培養一晚。隔天，以TrypLE Express(Life Technologies公司製)處理導入表現載體之293T細胞，以含有10%FBS之DMEM清洗細胞後，懸浮於含有5%FBS之PBS。將所得之細胞懸浮液使用於流動式細胞測量術解析。

1)-5-2 流動式細胞測量術解析

藉由流動式細胞測量術，進一步確認於實施例1)-4-2之Cell-ELISA判定為陽性之融合瘤所產生的抗體對於人類GPR20之結合特異性。將實施例1)-5-1所製備之暫時性表現293T細胞的懸濁液進行離心，去除上清液後，對各自添加融合瘤培養上清液，進行懸浮，在4℃靜置1小時。以含有5%FBS之PBS清洗二次後，添加以含有5%FBS之PBS稀釋500倍之抗大鼠IgG FITC結合物(Anti-Rat IgG FITC conjugate)(SIGMA公司製)並進行懸浮，在4℃靜置1小時。以含有5%FBS之PBS清洗二次後，在包含2μg/mL 7-胺基放線菌素D(Molecular Probes公司製)之含有5%FBS之PBS中進行再懸浮，以流式細胞儀(FC500：BeckmanCoulter公司製)進行偵測。以Flowjo(TreeStar公司製)進行資料分析。以閘(gate)去除7-胺基放線菌素D陽性的死細胞後，作成活細胞之FITC螢光強度的直方圖。相對於對照之pcDNA3.1導入293T細胞的螢光強度直方圖，將pcDNA3.1-hGPR20導入293T細胞的直方圖偏移至強螢光強度側之產生抗體的融合瘤，選擇178個殖株作為與人類GPR20結合之抗體產生融合瘤。圖9中，顯示作為與人類GPR20特異性結合之抗體的例之殖株編號04-093、13-001、13-006、13-010、13-040及13-046、以及未添加1級抗體之陰性對照(w/o 1st Ab)的結果。圖9之橫軸表示殖株編號，縱軸表示利用MFI(mean fluorescence intensity，平均螢光強度)之抗體結合量。

1)-6 利用肽-酵素結合免疫吸附分析法(peptide-ELISA)法之篩選

藉由肽-酵素結合免疫吸附分析法，評價對於人類GPR20的N端側48個胺基酸之結合性。以100μL/孔，在96孔Maxisorp盤(Nunc公司)中添加已以PBS稀釋成1μg/mL之NeutrAvidin(Pierce公司)，在4℃靜置1晚。去除溶液，以300μL/孔之含有0.05% Tween20的PBS(以下，PBST)清洗3次後，以100μL/孔，添加已以PBS將由C端經生物素化之人類GPR20的N端側1-48胺基酸(序列識別號29)所構成之合成肽1溶解成10nM的溶液，在室溫靜置1小時。作為陰性對照，準備添加有C端同樣地經生物素化之具有與GPR20的胺基酸序列不同序列之合成肽的盤，以下同樣地進行處理。從盤去除溶液，以PBST清洗3次後，以100μL/孔，添加含有1% BSA的PBS，在室溫靜置1晚。去除溶液，以PBST清洗3次後，以100μL/孔，添加已以含有1% BSA的PBS稀釋2倍之抗人類GPR20抗體產生融合瘤的培養上清液，在室溫靜置1小時。去除溶液，以PBST清洗3次後，以100μL/孔，添加已以PBS稀釋500倍之Anti-Rat IgG-Peroxidase antibody produced in rabbit(SIGMA公司)，在室溫靜置1小時。去除溶液，以PBST清洗3次後，以100μl/孔，添加SuperSignal ELISA Pico Chemiluminescent Substrate，在室溫靜置10分鐘後，以盤式分析儀(ARVO，PerkinElmer公司)量測化學發光。圖10中揭示對人類GPR20之N端側1-48胺基酸顯示特異性結合之6種抗體的典型反應例。圖10的橫軸顯示殖株編號，縱軸顯示利用化學發光量(CPS)之抗體結合量。

1)-7 大鼠單株抗體的亞型(subclass)、類型的決定

大鼠抗人類GPR20單株抗體之重鏈的亞型、輕鏈的類型係藉由RAT MONOCLONAL ANTIBODY ISOTYPING TEST KIT(DS Pharma Biomedical公司)而確定。其結果，確認04-093、13-001、13-006、13-010、13-040及13-046皆為IgG2b、κ鏈。又，藉由與實施例4所記載之方法同樣的方法解析鹼基序列的結果，推測13-001、13-006、13-010、13-040之各抗體的胺基酸序列具有顯示高同源性之序列，且辨識同一表位。

1)-8 大鼠抗人類GPR20抗體的製備

大鼠抗人類GPR20單株抗體04-093、13-001及13-046係由融合瘤培養上清液所精製。

首先，以ClonaCell-HY Selection Medium E，使各抗GPR20抗體產生融合瘤增殖至充分量後，培養基交換成已添加20%之Ultra Low IgG FBS(Life Technologies公司)的Hybridoma SFM(Life Technologies 公司)，培養4~5日。回收本培養上清液，通過0.8μm之過濾器後，再通過0.2μm之過濾器而去除不溶物。

由上述融合瘤上清液，以蛋白質G親和力層析法精製抗體。使蛋白質G管柱(GE Healthcare Bioscience公司)吸附抗體，以PBS清洗管柱後，以0.1M甘胺酸/鹽酸水溶液(pH2.7)洗提。在洗提液中添加1M Tris-HCl(pH9.0)調整成pH7.0~7.5後，以Centrifugal UF Filter Device VIVASPIN20(截留分子量(molecular weight cut off)UF30K，Sartorius公司)進行取代成HBSor(25mM組胺酸/5%山梨醇，pH6.0)之緩衝液取代，並同時進行抗體的濃縮，而將抗體濃度調製成0.7mg/mL以上。最後，以Minisart-Plus filter(Sartorius公司)進行過濾，作成精製樣本。

實施例2：大鼠抗人類GPR20抗體的IHC適性評價 2)-1 使用GPR20暫時性表現293T細胞之GPR20染色性評價 2)-1-1 細胞塊(cell block)的製作

293T細胞係使用Lipofectamine 2000(Life Technologies公司)並以pcDNA3.1-hGPR20或pcDNA3.1(空載體)轉染(GPR20表現293T細胞)。將此GPR20表現293T細胞的團塊(pellet)在福馬林固定後作成石蠟包埋塊。同樣地，針對已轉染pcDNA3.1.(空載體)之293T細胞(對照293T細胞)，亦在福馬林固定後作成石蠟包埋塊。

2)-1-2 GPR20暫時性表現293T細胞的免疫染色

比較1)-8所製備之大鼠單株抗人類GPR20抗體04-093、13-001及13-046與市售之兔子多株抗人類GPR20抗體的GPR20染色性。市售的抗體皆係將源自人類GPR20之合成肽作為抗原而製作，可使用LS Bio公司製之LS-A101(C端)、LS-A102(N端)、LS-A103(細胞質域)、LS-A104(C端)、LS-B7724(291~340胺基酸)、abcam公司製之ab75559、Novus Biologicals公司製之NLS101(C端)、Santa Cruz Biotechnology公司製之sc-87141(N端)。此外，括弧內顯示各兔子多株抗體製作時的免疫所使用之合成肽在GPR20內的部位。

去石蠟及抗原激活係使用Autostainer Link用前處理系統(PT Link：DAKO公司製)，抗原激活液(Target Retrieval Solution High pH：DAKO公司製)，在97℃實施20分鐘。其後的染色作業係使用自動染色裝置(Dako Autostainer Link48：DAKO公司製)在室溫實施。以EnVision FLEX WASH BUFFER(DAKO公司製)清洗1次後，添加Peroxidase Block 3% H2O2(DAKO公司製)培養(incubate)5分鐘，以EnVision FLEX WASH BUFFER清洗1次。添加Protein Block serum free(DAKO公司製)，培養15分鐘，藉由鼓風去除液體。以Signal stain Antibody diluent(Cell Signaling Technology公司製)，將抗GPR20抗體稀釋成表2-1及表2-2所記載之濃度，並使其反應30分鐘。以EnVision FLEX WASH BUFFER清洗3次後，對應一級抗體的種類，對大鼠抗體添加 Histofine simplestain mouse MAX PO(Rat)#414311(Nichirei Bioscience公司製)，對兔子抗體添加EnVision+System-HRP Labelled Polymer Anti-Rabbit #K4003(DAKO公司製)，培養30分鐘後，以EnVision FLEX WASH BUFFER清洗2次。

添加DAKO Liquid DAB+Substrate Chromogen System，培養共計10分鐘後，以EnVision FLEX WASH BUFFER清洗1次。添加EnVision FLEX Hematoxylin，培養5分鐘後，以EnVision FLEX WASH BUFFER及離子交換水清洗共計3次。

將各抗體的典型染色結果顯示於圖11-1、圖11-2、及圖11-3。又，表2-1及表2-2中顯示將圖11-1、圖11-2、及圖11-3中之各抗體的染色強度進行分數化之結果。在表中，+++表示強陽性、++表示陽性、+表示弱陽性、-表示陰性。與兔子多株抗GPR20抗體相比，大鼠單株抗GPR20抗體04-093、13-001、13-046對GPR20表現293T細胞(293-GPR20)顯示強染色性。另一方面，對於陰性對照293T細胞(293-EV)，大鼠單株抗GPR20抗體未顯示染色性，因此確認GPR20特異性染色性。

2)-2 臨床GIST組織切片的免疫染色 2)-2-1 GIST組織陣列的染色

使用GIST481，胃腸道基質瘤組織陣列(Gastrointestinal stromal tumor tissue array)，24盒/48芯(US Biomax公司製)探討臨床檢體中之抗GPR20抗體的染色性。

去石蠟及抗原激活係使用Autostainer Link用前處理系統(PT Link：DAKO公司製)，抗原激活液(Target Retrieval Solution High pH：DAKO公司製)，以97℃實施20分鐘。其後的染色作業係使用自動染色裝置(Dako Autostainer Link48：DAKO公司製)，在室溫實施。以EnVision FLEX WASH BUFFER(DAKO公司製)清洗1次後，添加Peroxidase Block 3% H2O2(DAKO公司製)培養5分鐘，以EnVision FLEX WASH BUFFER清洗1次。添加Protein Block serum free(DAKO公司製)，培養15分鐘，藉由鼓風去除液體。以Signal stain Antibody diluent(Cell Signaling Technology公司製)，將大鼠單株抗GPR20抗體或兔子多株抗GPR20抗體稀釋成10μg/mL或5μg/mL，使其反應30分鐘。以EnVision FLEX WASH BUFFER清洗3次後，添加Histofine simplestain mouse MAX PO(Rat)#414311(Nichirei Bioscience公司製)培養30分鐘後，以EnVision FLEX WASH BUFFER清洗2次。

添加DAKO Liquid DAB+Substrate Chromogen System，培養共計10分鐘後，以EnVision FLEX WASH BUFFER清洗1次。添加EnVision FLEX Hematoxylin培養5分鐘後，以EnVision FLEX WASH BUFFER及離子交換水清洗共計3次。

在圖12中，比較各抗體對於(圖12-1)胃GIST、(圖12-2)小腸GIST、(圖12-3)大腸GIST之GPR20染色性的結果，大鼠抗GPR20抗體04-093為最高感度。

實施例3：大鼠抗人類GPR20抗體04-093的序列解析 3)-1 來自04-093產生融合瘤之總RNA(total RNA)的製備

為了將04-093之編碼重鏈及輕鏈的訊息序列與可變區之cDNA進行增幅，而使用TRIzol Reagent(Ambion公司)，由04-093產生融合瘤製備總RNA。

3)-2 利用5’-RACE PCR之04-093之編碼重鏈的訊息序列與可變區之cDNA的增幅與核苷酸序列的確定

04-093之編碼重鏈的訊息序列與可變區之cDNA的增幅，係使用實施例3)-1所製備之總RNA的約1μg與SMARTer RACE cDNA Amplification Kit(Clontech公司)而實施。作為用於以PCR增幅04-093之編碼重鏈的訊息序列與可變區之cDNA的引子，使用UPM(Universal Primer A Mix：SMARTer RACE cDNA Amplification Kit所附)、以及由眾所周知的大鼠重鏈之恒定區的序列所設計之引子。

將5’-RACE PCR所增幅之編碼重鏈的訊息序列與可變區之cDNA選殖至質體，接著實施重鏈的訊息序列與可變區之cDNA的核苷酸序列之序列解析。

3)-3 利用5’-RACE PCR之04-093之編碼輕鏈的訊息序列與可變區之cDNA的增幅與核苷酸序列的確定

以與實施例3)-2同樣的方法進行實施。惟，作為用於以PCR增幅04-093之編碼輕鏈的訊息序列與可變區之cDNA的引子，使用UPM(Universal Primer A Mix：SMARTer RACE cDNA Amplification Kit所附)、以及由眾所周知的大鼠輕鏈之恒定區的序列所設計之引子。

04-093抗體之重鏈及輕鏈的全長序列，係藉由與眾所周知的恒定區連結而確定。大鼠的重鏈IgG2b之恒定區的鹼基序列與胺基酸序列係參照揭示於IMGT，the international ImMunoGeneTics information system(註冊商標)之AABR03048905(IGHG2B*01)的鹼基序列與胺基酸序列。又，大鼠的輕鏈IgK之恒定區的鹼基序列與胺基酸序列係參照揭示於同系統之V01241(IGKC*01)的鹼基序列與胺基酸序列。

04-093抗體的重鏈具有序列表的序列識別號3所示之胺基酸序列。序列表的序列識別號3所示之重鏈胺基酸序列中，由第1至19個的胺基酸殘基所構成之胺基酸序列為訊息序列，由第20至133個的胺基酸殘基所構成之胺基酸序列為可變區，由第134至466個的胺基酸殘基所構成之胺基酸序列為恒定區。該可變區，具有在序列表的序列識別號3中由第45至54個的胺基酸序列(GFTFNNYWMT)或第50至54個的胺基酸序列(NYWMT)所構成之CDRH1、由第69至78個的胺基酸序列(SITNIDGSSY)或第69至85個的胺基酸序列(SITNIDGSSYYPDSVKG)所構成之CDRH2、118至122所記載的胺基酸序列(GSFDY)所構成之CDRH3。04-093抗體的重鏈可變區具有序列表的序列識別號4所示之胺基酸序列。04-093抗體的CDRH1具有序列表的序列識別號5或8所示之胺基酸序列，CDRH2的胺基酸序列具有序列表的序列識別號6或9所示之胺基酸序列，CDRH3的胺基酸序列具有序列表的序列識別號7所示之胺基酸序列。又，04-093抗體的重鏈之胺基酸序列係記載於圖1。

04-093抗體的輕鏈具有序列表的序列識別號11所示之胺基酸序列。序列表的序列識別號11所示之輕鏈胺基酸序列中，由第1至19個的胺基酸殘基所構成之胺基酸序列為訊息序列，由第20至126個的胺基酸殘基所構成之胺基酸序列為可變區，由第127至232個的胺基酸殘基所構成之胺基酸序列為恒定區。該可變區，具有在序列表的序列識別號11中由43至53所記載的胺基酸序列所構成之CDRL1、由69至75所記載的胺基酸序列所構成之CDRL2、由108至115所記載的胺基酸序列所構成之CDRL3。04-093抗體的輕鏈可變區具有序列表的序列識別號12所示之胺基酸序列。04-093抗體的CDRL1具有序列表的序列識別號13所示之胺基酸序列(KASQNVNKYLN)，CDRL2的胺基酸序列具有序列表的序列識別號14所示之胺基酸序列(NTNNLQT)，CDRL3的胺基酸序列具有序列表的序列識別號15所示之胺基酸序列(FQHVSWLT)。又，04-093抗體的輕鏈之胺基酸序列係記載於圖2。

04-093抗體的重鏈胺基酸序列係藉由序列表的序列識別號2所示之核苷酸序列而編碼。序列表的序列識別號2所示之核苷酸序列中，由第1至57個的核苷酸所構成之核苷酸序列為訊息序列。序列表的序列識別號2所示之核苷酸序列中，由第58至399個的核苷酸所構成之核苷酸序列編碼04-093抗體的重鏈可變區，而且由第400至1398個的核苷酸所構成之核苷酸序列編碼04-093抗體的重鏈恒定區。編碼該可變區的核苷酸序列，具有在序列識別號2中由編碼CDRH1之核苷酸編號133至162或核苷酸編號118至162所記載之核苷酸序列所構成之多核苷酸、由編碼CDRH2之核苷酸編號205至234或205至183所記載之核苷酸序列所構成之多核苷酸、由編碼CDRH3之核苷酸編號352至366所記載之核苷酸序列所構成之多核苷酸。04-093抗體之重鏈的訊息序列與可變區之核苷酸序列亦示於序列表的序列識別號16。序列表的序列識別號16所示之核苷酸序列中，由第1至57個的核苷酸所構成之核苷酸序列顯示訊息序列，由第58至399個的核苷酸所構成之核苷酸序列編碼重鏈可變區。序列識別號2的序列亦記載於圖1。

04-093抗體的輕鏈胺基酸序列，係藉由序列表的序列識別號10所示之核苷酸序列而編碼。序列表的序列識別號10所示之核苷酸序列中，由第1至57個的核苷酸所構成之核苷酸序列為訊息序列。序列表的序列識別號10所示之核苷酸序列中，由第58至378個的核苷酸所構成之核苷酸序列編碼04-093抗體的輕鏈可變區，而且，由第379至696個的核苷酸所構成之核苷酸序列編碼04-093抗體的輕鏈恒定區。編碼該可變區之核苷酸序列，具有在序列識別號10中由編碼CDRL1之核苷酸編號127至159所記載之核苷酸序列所構成之多核苷酸、由編碼CDRL2之核苷酸編號205至225所記載之核苷酸序列所構成之多核苷酸、由編碼CDRL3之核苷酸編號322至345所記載之核苷酸序列所構成之多核苷酸。04-093抗體之輕鏈的訊息序列與可變區之核苷酸序列亦示於序列表的序列識別號17。序列表的序列識別號17所示之核苷酸序列中，由第1至57個的核苷酸所構成之核苷酸序列顯示訊息序列，由第58至378個的核苷酸所構成之核苷酸序列編碼輕鏈可變區。又，序列識別號10的序列係記載於圖2。

實施例4：兔子嵌合化抗GPR20抗體及兔源化抗GPR20抗體的製作 4)-1 抗GPR20抗體04-093之兔子嵌合化物的設計

兔子嵌合化序列係藉由參照IMGT(註冊商標)，the international ImMunoGeneTics information system(註冊商標)，將兔子的重鏈恒定區IGHG*02與兔子的輕鏈恒定區IGKC2*01連接殖株04-093的各可變區而設計。

將兔子嵌合化抗體重鏈命名為OcHch，將其胺基酸序列記載於序列識別號19。序列識別號19中，胺基酸編號第1至19個的胺基酸序列顯示訊息序列，第20至133個的胺基酸序列顯示重鏈可變區，第134至456個的胺基酸序列顯示重鏈恒定區的胺基酸序列。

將兔子嵌合化抗體輕鏈命名為OcLch，將其胺基酸序列記載於序列識別號21。序列識別號21中，胺基酸編號第1至20個的胺基酸序列顯示訊息序列，第21至127個的胺基酸序列顯示輕鏈可變區，第128至232個的胺基酸序列顯示輕鏈恒定區的胺基酸序列。

4)-2 抗GPR20抗體04-093之兔源化物的設計

兔源化抗體之可變區的胺基酸序列，係藉由CDR移植(CDR grafting)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,10029-10033(1989))而設計。基於可變區的胺基酸序列之一致性與兔子胚原序列(germline sequence)中之中庸性，重鏈接受者(acceptor)序列係選擇IGHV1S7*01與IGHJ3*01，輕鏈接受序列係選擇IGKV1S39*01與IGKJ1-2*01。以蛋白質立體結構解析程式BioLuminate(Schrodinger公司製)，分析所構築之殖株04-093的同源模式，參考藉由Queen et al.(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,10029-10033(1989))所給予的基準等，而選擇應移植至接受者上的供給者殘基。重鏈恒定區係選擇兔子的IGHG*02，輕鏈恒定區係選擇兔子的IGKC1*01。

兔源化抗體重鏈設計OcH01及OcH02之二種類，將各自的胺基酸序列記載於序列識別號23及25。在序列識別號23及25中，第1至19個的胺基酸序列顯示訊息序列，第20至133個的胺基酸序列顯示可變區，第134至456個的胺基酸序列顯示恒定區。

兔源化抗體輕鏈設計OcL01之一種類，將其胺基酸序列記載於序列識別號27。在序列識別號27中，第1至20個的胺基酸序列顯示訊息序列，第21至127個的胺基酸序列顯示可變區，第128至230個的胺基酸序列顯示恒定區。

4)-2 重組抗體的製作 4)-2-1 兔子嵌合化抗GPR20抗體之重鏈表現載體的構築 4)-2-1-1 抗體表現載體pCMA-LK的構築

使用In-Fusion Advantage PCR選殖套組(CLONTECH公司)，將以限制酵素XbaI及PmeI消化質體pcDNA3.3-TOPO/LacZ(Invitrogen公司)所得之約5.4kb的片段、與序列識別號28所示之包含編碼人類輕鏈訊息序列及人類κ鏈恒定區的胺基酸序列之DNA序列的DNA片段加以結合，而製作pcDNA3.3/LK。

藉由從pcDNA3.3/LK去除新黴素表現單元，而構築pCMA-LK。

4)-2-1-2 兔子嵌合化抗體重鏈OcHch表現載體的構築

合成序列識別號18所示之DNA片段(GENEART公司)，此DNA片段包含編碼兔子嵌合化抗體重鏈OcHch的胺基酸序列之DNA序列。序列表的序列識別號18所示之核苷酸序列中，由第26至82個的核苷酸所構成之核苷酸序列顯示訊息序列，由第83至424個的核苷酸所構成之核苷酸序列編碼重鏈可變區，由第 425至1393個的核苷酸所構成之核苷酸序列編碼恒定區。

使用In-Fusion HD PCR選殖套組(CLONTECH公司)，將所合成之DNA片段、與將pCMA-LK以XbaI及PmeI消化而去除輕鏈訊息序列及人類κ鏈恒定區之DNA片段加以結合，藉此構築兔子嵌合化抗體重鏈OcHch表現載體。

4)-2-2 兔子嵌合化抗GPR20抗體之輕鏈表現載體的構築 4)-2-2-1 兔子嵌合化抗體輕鏈OcLch表現載體的構築

合成序列識別號20所示之DNA片段(GENEART公司)，此DNA片段包含編碼兔子嵌合化抗體輕鏈OcLch的胺基酸序列之DNA序列。序列表的序列識別號20所示之核苷酸序列中，由第26至85個的核苷酸所構成之核苷酸序列顯示訊息序列，由第86至406個的核苷酸所構成之核苷酸序列編碼輕鏈可變區，由第407至721個的核苷酸所構成之核苷酸序列編碼恒定區。以與實施例4)-2-1-2同樣的方法，構築兔子嵌合化抗體輕鏈OcLch的表現載體。

4)-2-3 兔源化抗GPR20抗體之重鏈表現載體的構築 4)-2-3-1 兔源化抗體重鏈OcH01之表現載體的構築

合成序列識別號22所示之DNA片段(GENEART公司)，此DNA片段包含編碼兔源化抗體重鏈OcH01的胺基酸序列之DNA序列。序列表的序列識別號22所示之核苷酸序列中，由第26至82個的核苷酸所構成之核苷酸序列顯示訊息序列，由第83至424個的核苷酸所構成之核苷酸序列編碼重鏈可變區，由第425至1393個的核苷酸所構成之核苷酸序列編碼恒定區。以與實施例4)-2-1-2同樣的方法，構築兔源化抗體重鏈OcH01表現載體。

4)-2-3-2 兔源化抗體重鏈OcH02之表現載體的構築

合成序列識別號24所示之DNA片段(GENEART公司)，此DNA片段包含編碼兔源化抗體重鏈OcH02的胺基酸之DNA序列。序列表的序列識別號24所示之核苷酸序列中，由第26至82個的核苷酸所構成之核苷酸序列顯示訊息序列，由第83至424個的核苷酸所構成之核苷酸序列編碼重鏈可變區，由第425至1393個的核苷酸所構成之核苷酸序列編碼恒定區。以與實施例4)-2-1-2同樣的方法，構築兔源化抗體重鏈OcH02表現載體。

4)-2-4 兔源化抗GPR20抗體之輕鏈表現載體的構築 4)-2-4-1 兔源化抗體輕鏈OcL01之表現載體的構築

合成序列識別號26所示之DNA片段(GENEART公司)，此DNA片段包含編碼兔源化抗體輕鏈OcL01的胺基酸之DNA序列。序列表的序列識別號26所示之核苷酸序列中，由第26至85個之核苷酸所構成的核苷酸序列顯示訊息序列，由第86至406個的核苷酸所構成之核苷酸序列編碼重鏈可變區，由第407至721個的核苷酸所構成之核苷酸序列編碼恒定區。以與實施例5)-2-1-2同樣的方法，構築兔源化抗體輕鏈OcL01表現載體。

4)-2-5 重組抗體的製備 4)-2-5-1 重組抗體的生產

FreeStyle 293F細胞(Invitrogen公司)係依據手冊而進行繼代、培養。將對數增殖期之1.2×10⁹個的FreeStyle 293F細胞(Invitrogen公司)接種於3L Fernbach Erlenmeyer Flask(CORNING公司)，以FreeStyle293 expression medium(Invitrogen公司)進行稀釋而調製成2.0×10⁶細胞/mL。在40mL之Opti-Pro SFM培養基(Invitrogen公司)中，添加0.24mg之重鏈表現載體、0.36mg之輕鏈表現載體、以及1.8mg之聚乙烯亞胺(Polyscience #24765)，並溫和地攪拌，在進一步放置5分鐘後，添加至FreeStyle 293F細胞。在37℃、8% CO₂培養箱(incubator)進行4小時、90rpm之振盪培養後，添加600mL之EX-CELL VPRO培養基(SAFC Biosciences公司)、18mL之GlutaMAX I(GIBCO公司)、及30mL之Yeastolate Ultrafiltrate(GIBCO公司)，以Disposable Capsule Filter(Advantec #CCS-045-E1H)，將在37℃、8% CO₂培養箱中進行7天、90rpm之振盪培養所得之培養上清液進行過濾。

在重組抗體的表現中，藉由組合OcHch與OcLch的表現載體而生產OcChimera抗體，藉由組合OcH01與OcL01的表現載體而生產OcH1L1抗體，藉由組合OcH02與OcL01的表現載體而生產OcH2L1抗體。

4)-2-5-2 重組抗體的精製

以rProtein A親和力層析法的1階段步驟，精製實施例4)-2-5-1所得之培養上清液。將培養上清液供應至填充有已以PBS進行平衡化之MabSelectSuRe的管柱(GE Healthcare Bioscience公司製)後，以管柱容量的2倍以上之PBS清洗管柱。接著，以2M精胺酸鹽酸鹽溶液(pH4.0)進行洗提，收集包含抗體的部分。藉由透析(Thermo Scientific公司，Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette)，將該部分進行取代成PBS之緩衝液取代。以Centrifugal UF Filter Device VIVASPIN20(截留分子量UF10K，Sartorius公司)濃縮抗體，將IgG濃度調製成2mg/mL。最後，以Minisart-Plus filter(Sartorius公司)進行過濾，作成精製樣本。

實施例5：使用兔子嵌合化抗GPR20抗體及兔源化抗GPR20抗體之免疫染色 5)-1 GIST細胞株的免疫染色

使用GIST細胞株(GIST430、GIST430/654)及作為陰性對照之前列腺癌細胞株(PC-3)的石蠟包埋標本，探討實施例4)-2-5所製作隻兔子嵌合化抗GPR20抗體及兔源化抗GPR20抗體的染色性。去石蠟及抗原激活係使用Autostainer Link用前處理系統(PT Link：DAKO公司製)，抗原激活液(Target Retrieval Solution High pH：DAKO公司製)，以97℃實施40分鐘。之後的染色作業係使用自動染色裝置(Dako Autostainer Link48： DAKO公司製)，在室溫實施。以EnVision FLEX WASH BUFFER(DAKO公司製)清洗1次後，添加Peroxidase Block 3% H2O2(DAKO公司製)，培養5分鐘，以EnVision FLEX WASH BUFFER清洗1次。添加Protein Block serum free(DAKO公司製)，培養30分鐘，藉由鼓風去除液體。以REAL Antibody Diluent(DAKO公司製)，將大鼠單株抗GPR20抗體或兔子嵌合化抗GPR20抗體及兔源化抗GPR20抗體稀釋成1.0μg/mL~10μg/mL，並使其反應30分鐘。以EnVision FLEX WASH BUFFER清洗3次後，對於大鼠抗體添加Histofine simplestain mouse MAX PO(Rat)#414311(Nichirei Bioscience公司製)，對於兔子抗體添加EnVision+ System-HRP Labelled Polymer Anti-Rabbit #K4003(DAKO公司製)，皆培養30分鐘後，以EnVision FLEX WASH BUFFER清洗2次。

圖13中顯示典型的染色影像。對於GIST細胞株，兔子嵌合化抗體OcChimera及兔源化抗體OcH1L1、OcH2L1顯示較大鼠抗體04-093更高感度的染色性。對於不表現GPR20之前列腺癌細胞株，未顯示染色性。

5)-2 臨床GIST的免疫染色

使用GIST801，胃腸道基質瘤組織陣列，80盒/80芯(US Biomax公司製)，探討臨床檢體中之兔子嵌合化抗GPR20抗體及兔源化抗GPR20抗體的染色性。染色係以與實施例5)-1同樣的方法實施。

圖14中，比較各抗體對於(圖14-1)胃GIST、(圖14-2)小腸GIST、(圖14-3)大腸GIST之GPR20染色性的結果，兔子嵌合化抗GPR20抗體及兔源化抗GPR20抗體皆較大鼠抗GPR20抗體04-093更高感度。

實施例6：表位的鑑別 6)-1 利用肽-酵素結合免疫吸附分析法之結合能力評價

藉由肽-酵素結合免疫吸附分析法，評價大鼠抗人類GPR20抗體04-093對於以下合成肽之結合。在96-孔Maxisorp盤(Nunc公司)中，以100μL/孔，添加已以PBS稀釋成1μg/mL之NeutrAvidin(Pierce公司)，在4℃靜置1晚。去除溶液，以300μL/孔之含有0.05% Tween20的PBS(以下，PBST)清洗3次後，以100μL/孔，添加將C端經生物素化之由人類GPR20的胺基酸編號第1至48個(序列識別號29)所構成的合成肽1、由人類GPR20的胺基酸編號第30至48個(序列識別號30)所構成的合成肽2、具有與GPR20的胺基酸序列不同的序列之陰性對照的合成肽分別以PBS溶解成10nM的溶液，在室溫靜置1小時。從盤去除溶液，以PBST清洗3次後，以100μL/孔來添加Blocker Casein in PBS(Thermo Fisher Scientific公司)，在室溫靜置1晚。去除溶液，以PBST清洗3次後，以100μL/孔，添加已以Blocker Casein in PBS稀釋成1μg/mL之04-093抗體，在室溫靜置1小時。去除溶液，以PBST清洗3次後，以100μL/孔，添加已以PBS稀釋500倍之Anti-Rat IgG-Peroxidase antibody produced in rabbit(Jackson ImmunoResearch Laboratories公司)，在室溫靜置1小時。去除溶液，以PBST清洗3次後，以100μl/孔，添加SuperSignal ELISA Pico Chemiluminescent Substrate，在室溫靜置10分鐘後，以盤式分析儀(SpectraMax M3，Molecular Devices公司)量測化學發光。圖15中顯示各種抗體的反應例。圖15的橫軸顯示殖株編號，縱軸顯示利用化學發光量(CPS)之抗體結合量。04-093抗體對於合成肽1及合成肽2顯示同等的結合活性。另一方面，其他抗GPR20抗體對於合成肽2未顯示結合性。由本結果顯示，04-093抗體係與由GPR20的胺基酸編號第30至48個所構成的胺基酸序列(序列識別號30：LEVPLFHLFARLDEELHGT)結合。

6)-2 使用GPR20片段肽之結合能力評價

為了詳細地解析表位，作為GPR20片段肽庫而製作：合成由GPR20的胺基酸編號第29至48個所構成的肽、以及將本肽之末端的胺基酸以一殘基一殘基地連續縮短而成的肽，並將N-端進行生物素化，將C-末端進行醯胺化者(Sigma-Aldrich Japan公司)。所製作之GPR20片段肽與04-093抗體的解離常數係使用Octet RED384系統(Pall ForteBio公司製)，將GPR20片段肽作為配體而捕捉至感測晶片，並將04-093抗體作為分析物，藉此進行量測。使用PBS-T作為緩衝液，使用鏈黴親和素感測晶片(Pall ForteBio公司製)作為感測晶片。針對各GPR20片段肽，將感測晶片浸在1μg/mL之肽溶液中300秒鐘後，浸在04-093抗體之稀釋系列溶液(0.247~20nM之3倍稀釋系列，5濃度)90秒鐘，監測結合相，接著浸在緩衝液中，監測270秒鐘的解離相。在量測各濃度之04-093抗體後，為了將感測晶片再生，而浸在檸檬酸緩衝液pH 2.220秒鐘，為了更加平衡化，而浸在緩衝液中20秒鐘。在資料分析中，使用1：1結合模式，算出結合速度常數ka、解離速度常數kd及解離常數(KD；KD=kd/ka)。

將結果顯示於表3。

GPR20片段肽(GLEVPLFHLFARLD：序列識別號29的胺基酸編號29至42)對04-093抗體顯示強結合，但於(GLEVPLFHLFARL：序列識別號29的胺基酸編號29至41)則確認到結合的降低。又，GPR20片段肽(LEVPLFHLFARLDEEL：序列識別號29的胺基酸編號30至45)對04-093抗體顯示強結合，但於(EVPLFHLFARLDEEL：序列識別號29的胺基酸編號31至45)則確認到結合的降低。由此等結果，將序列識別號29的胺基酸編號30至42(LEVPLFHLFARLD：序列識別號31)鑑別為04-093抗體的表位。

實施例7：利用西方印漬(Western blotting)法之GPR20蛋白質的檢測

藉由西方印漬法，檢測在293T細胞中暫時性表現的GPR20蛋白質。使用Lipofectamine 2000(Life Technologies公司)，在293T細胞中分別導入人類GPR20表現載體pcDNA3.1-hGPR20、已在N端加成FLAG標籤之人類GPR20的表現載體pFLAG-GPR20以及pcDNA3.1(空載體)。使用Mem-PER Plus Membrane Protein Extraction Kit(ThermoFisher Scientific公司)，由各細胞製備膜部分的蛋白質溶解液，並使用BCA protein assay(ThermoFisher Scientific公司)量測蛋白質濃度。在已進行濃度調整之蛋白質溶液中，以成為1X濃度之方式，添加NuPAGE^TM LDS Sample Buffer(4X)、NuPAGE^TM Sample Reducing Agent(10X)(Thermo Fisher Scientific公司)，在70℃加熱10分鐘後，依循通常方法，以使用 Tris/Glysin/SDS buffer之SDS-PAGE，將20μg/電泳道(lane)之蛋白質進行電泳。由電泳後的凝膠將蛋白質轉印至Immobilon-FL膜(Millipore公司)。將此Immobilon-FL膜以Odyssey Blocking Buffer(LI-COR公司)阻斷1小時後，在已以0.1% Tween20/Odyssey Blocking Buffer稀釋之兔子嵌合化抗GPR20抗體或兔源化抗GPR20抗體的一級抗體反應液中，以4℃振盪一晚。又，作為對照，同樣地將兔子IgG及小鼠抗FLAG抗體、小鼠抗β肌動蛋白抗體作為一級抗體反應液使用。在使用SNAP i.d.系統(Millipore公司)並以TBS-0.1% Tween20緩衝液清洗3次後，在藉由已以0.1% Tween20/Odyssey Blocking Buffer稀釋之二級抗體液(一級抗體為兔子抗體之情形使用IRDye 680CW Goat anti-rabbit IgG，一級抗體為小鼠抗體之情形使用IRDye 800CW Goat anti-mouse IgG)進行反應後，以TBS-0.1% Tween20緩衝液清洗2次，以TBS清洗1次。在螢光的檢測中，使用Odyssey Infrared Imaging System(LI-COR公司)。在圖17中，兔源化抗GPR20抗體OcH1L1、OcH2L1、兔子嵌合化抗GPR20抗體OcChimera對於表現人類GPR20之293T-pcDNA3.1-GPR20細胞或N端已加成FLAG標籤之表現人類GPR20之293T-pFLAG-GPR20細胞顯示反應性，並檢測到複數的帶(band)。另一方面，於陰性對照之293T-pcDNA3.1細胞，未檢測到帶。又，小鼠抗FLAG抗體僅對於293T-pFLAG-GPR20顯示反應性，並檢測到複數的帶。由以上結果顯示，兔子嵌合化抗GPR20抗體及兔源化抗GPR20抗體係有用於利用西方印漬之GPR20的檢測。

產業上的可利用性

藉由使用本發明所提供之抗GPR20抗體而能檢查或診斷表現PR20之各種癌，且可提供包含本發明的抗GPR20抗體之表現GPR20的各種癌之檢查或診斷用套組等。又，可提供包含本發明之抗GPR20抗體作為有效成分的醫藥組成物等。

[序列表非關鍵詞文字]

序列識別號18：包含編碼兔子嵌合化抗體重鏈OcHch的胺基酸序列之序列的DNA片段之核苷酸序列

序列識別號19：兔子嵌合化抗體重鏈OcHch的胺基酸序列

序列識別號20：包含編碼兔子嵌合化抗體輕鏈OcLch的胺基酸序列之序列的DNA片段之核苷酸序列

序列識別號21：兔子嵌合化抗體輕鏈OcLch的胺基酸序列

序列識別號22：包含編碼兔源化抗體重鏈OcH01的胺基酸序列之序列的DNA片段之核苷酸序列

序列識別號23：兔源化抗體重鏈OcH01的胺基酸序列

序列識別號24：包含編碼兔源化抗體重鏈OcH02的胺基酸序列之序列的DNA片段之核苷酸序列

序列識別號25：兔源化抗體重鏈H02的胺基酸序列

序列識別號26：包含編碼兔源化抗體輕鏈OcL01的胺基酸序列之序列的DNA片段之核苷酸序列

序列識別號27：兔源化抗體輕鏈OcL01的胺基酸序列

序列識別號28：包含編碼人類輕鏈訊息序列及人類κ鏈恒定區的胺基酸序列之DNA序列的DNA片段

序列識別號29：合成肽1人類GPR20的第1至48個的胺基酸序列

<110> 第一三共股份有限公司(Daiichi Sankyo Company,Limited)

<120> 抗GPR20抗體

<130> FP1813

<150> JP2017-067164

<151> 2017-03-30

<160> 31

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 358

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 1

<210> 2

<211> 1398

<212> DNA

<213> 大鼠

<220>

<221> 訊息肽編碼序列

<222> (1)..(57)

<400> 2

<210> 3

<211> 466

<212> PRT

<213> 大鼠

<220>

<221> 訊息序列的範圍

<222> (1)..(19)

<400> 3

<210> 4

<211> 114

<212> PRT

<213> 大鼠

<400> 4

<210> 5

<211> 10

<212> PRT

<213> 大鼠

<400> 5

<210> 6

<211> 10

<212> PRT

<213> 大鼠

<400> 6

<210> 7

<211> 5

<212> PRT

<213> 大鼠

<400> 7

<210> 8

<211> 5

<212> PRT

<213> 大鼠

<400> 8

<210> 9

<211> 17

<212> PRT

<213> 大鼠

<400> 9

<210> 10

<211> 696

<212> DNA

<213> 大鼠

<220>

<221> 訊息肽編碼序列

<222> (1)..(57)

<400> 10

<210> 11

<211> 232

<212> PRT

<213> 大鼠

<220>

<221> 訊息序列的範圍

<222> (1)..(19)

<400> 11

<210> 12

<211> 107

<212> PRT

<213> 大鼠

<400> 12

<210> 13

<211> 11

<212> PRT

<213> 大鼠

<400> 13

<210> 14

<211> 7

<212> PRT

<213> 大鼠

<400> 14

<210> 15

<211> 8

<212> PRT

<213> 大鼠

<400> 15

<210> 16

<211> 399

<212> DNA

<213> 大鼠

<220>

<221> 訊息肽編碼序列

<222> (1)..(57)

<400> 16

<210> 17

<211> 381

<212> DNA

<213> 大鼠

<220>

<221> 訊息肽編碼序列

<222> (1)..(57)

<400> 17

<210> 18

<211> 1418

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 嵌合兔子抗體重鏈OcHch的核苷酸序列

<220>

<221> 訊息肽編碼序列

<222> (26)..(82)

<400> 18

<210> 19

<211> 456

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 嵌合兔子抗體重鏈OcHch的胺基酸序列

<220>

<221> 訊息序列的範圍

<222> (1)..(19)

<400> 19

<210> 20

<211> 746

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 嵌合兔子抗體輕鏈OcLch的核苷酸序列

<220>

<221> 訊息肽編碼序列

<222> (26)..(85)

<400> 20

<210> 21

<211> 232

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 嵌合兔子抗體輕鏈OcLch的胺基酸序列

<220>

<221> 訊息序列的範圍

<222> (1)..(20)

<400> 21

<210> 22

<211> 1418

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 兔型(rabbit type)抗體重鏈OcH01的核苷酸序列

<220>

<221> 訊息肽編碼序列

<222> (26)..(82)

<400> 22

<210> 23

<211> 456

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 兔型抗體重鏈OcH01的胺基酸序列

<220>

<221> 訊息序列的範圍

<222> (1)..(19)

<400> 23

<210> 24

<211> 1418

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 兔型抗體重鏈OcH02的核苷酸序列

<220>

<221> 訊息肽編碼序列

<222> (26)..(82)

<400> 24

<210> 25

<211> 456

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 兔型抗體重鏈OcH02的胺基酸序列

<220>

<221> 訊息序列的範圍

<222> (1)..(19)

<400> 25

<210> 26

<211> 740

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 兔型抗體輕鏈OcL01的核苷酸序列

<220>

<221> 訊息肽編碼序列

<222> (26)..(85)

<400> 26

<210> 27

<211> 230

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 兔型抗體輕鏈OcL01的胺基酸序列

<220>

<221> 訊息序列的範圍

<222> (1)..(20)

<400> 27

<210> 28

<211> 449

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 包含人類輕鏈訊息序列及人類κ鏈(kappa chain)恒定區的DNA片段

<400> 28

<210> 29

<211> 48

<212> PRT

<213> 智人

<400> 29

<210> 30

<211> 19

<212> PRT

<213> 智人

<400> 30

<210> 31

<211> 13

<212> PRT

<213> 智人

<400> 31

Claims

一種抗體或該抗體的抗原結合性片段，其係與包含序列識別號1中胺基酸編號1至48所示之胺基酸序列而成的肽特異性結合，其中該抗體之重鏈序列包含具有由序列識別號5或8所示之胺基酸序列所構成的CDRH1、由序列識別號6或9所示之胺基酸序列所構成的CDRH2、以及由序列識別號7所示之胺基酸序列所構成的CDRH3之可變區；輕鏈序列包含具有由序列識別號13所示之胺基酸序列所構成的CDRL1、由序列識別號14所示之胺基酸序列所構成的CDRL2、及由序列識別號15所示之胺基酸序列所構成的CDRL3之可變區。
如請求項1之抗體或該抗體的抗原結合性片段，其與由LEVPLFHLFARLD(序列識別號31)所示之胺基酸序列所構成的表位(epitope)結合。
如請求項1之抗體或該抗體的抗原結合性片段，其係包含下列重鏈可變區及輕鏈可變區而成：由序列識別號4所示之胺基酸序列所構成之重鏈可變區、及序列識別號12所示之輕鏈可變區。
如請求項1之抗體或該抗體的抗原結合性片段，其由重鏈及輕鏈所構成，該重鏈係包含序列識別號3的胺基酸編號20至466所示之胺基酸序列而成，該輕鏈係包含序列識別號11的胺基酸編號20至232所示之胺基酸序列而成。
如請求項1之抗體或該抗體的抗原結合性片段，其為嵌合抗體。
如請求項5之抗體或該抗體的抗原結合性片段，其中嵌合抗體的恒定區係源自兔子抗體。
如請求項1之抗體或該抗體的抗原結合性片段，其包含由序列識別號19的胺基酸編號20至456所示之胺基酸序列所構成的重鏈、及由序列識別號21的胺基酸編號21至232所示之胺基酸序列所構成的輕鏈。
如請求項1之抗體或該抗體的抗原結合性片段，其係經兔源化。
如請求項1之抗體或該抗體的抗原結合性片段，其係經人源化。
如請求項1之抗體或該抗體的抗原結合性片段，其包含以下(a)或(b)所記載之重鏈、及(c)所記載之輕鏈：(a)由序列識別號23中胺基酸編號20至456所記載之胺基酸序列所構成的重鏈；(b)由序列識別號25中胺基酸編號20至456所示之胺基酸序列所構成的重鏈；(c)由序列識別號27中胺基酸編號21至230所示之胺基酸序列所構成的輕鏈。
如請求項1之抗體或該抗體的抗原結合性片段，其由重鏈及輕鏈所構成，該重鏈係包含序列識別號23中胺基酸編號20至456所示之胺基酸序列而成，該輕鏈係包含序列識別號27中胺基酸編號21至230所示之胺基酸序列而成。
如請求項1之抗體或該抗體的抗原結合性片段，其由重鏈及輕鏈所構成，該重鏈係包含序列識別號25中胺基酸編號20至456所示之胺基酸序列而成，該輕鏈係包含序列識別號27中胺基酸編號21至230所示之胺基酸序列而成。
如請求項1之抗體或該抗體的抗原結合性片段，其選自由Fab、F(ab’)2、Fab’及Fv所構成之群組。
如請求項1之抗體或該抗體的抗原結合性片段，其為scFv。
一種組成物，其包含如請求項1至14中任一項之抗體或該抗體的抗原結合性片段。
如請求項15之組成物，其包含如請求項1至14中任一項之抗體或該抗體的抗原結合性片段，且被使用於在經石蠟包埋處理後經去石蠟處理的組織標本中之GPR20的檢測或量測方法。
如請求項16之組成物，其被使用於包含使如請求項1至14中任一項之抗體或該抗體的抗原結合性片段與組織標本接觸的步驟之標本中之GPR20的檢測或量測方法。
如請求項17之組成物，其中GPR20的檢測或量測方法包含以下步驟：在組織標本中檢測或量測到GPR20、或者在組織標本中之GPR20的表現程度或表現量係同等或高於事前所決定的基準時，判定該組織標本為陽性；在組織標本中未檢測或未量測到GPR20、或者在組織標本中之GPR20的表現程度或表現量係同等或低於事前所決定的基準時，判定該組織標本為陰性。
如請求項18之組成物，其被使用於GPR20陽性疾病的檢查或診斷方法。
如請求項19之組成物，其中GPR20陽性疾病的檢查或診斷方法包含：在GPR20的檢測或量測中，被判定為陽性之組織標本的來源之受檢者，係被判定為適於包含投予與GPR20特異性結合之抗體或該抗體的抗原結合性片段的步驟之GPR20陽性疾病的治療或預防方法；被判定為陰性之組織標本的來源之受檢者，係被判定為不適於包含投予與GPR20特異性結合之抗體或該抗體的抗原結合性片段的步驟之GPR20陽性疾病的治療或預防方法。
如請求項20之組成物，其中GPR20陽性疾病為GPR20陽性癌。
如請求項19至21中任一項之組成物，其中GPR20陽性疾病為胃腸道基質瘤(Gastrointestinal Stromal Tumor，GIST)。
一種GPR20陽性疾病的檢查方法，其包含以下步驟：使如請求項1至14中任一項之抗體或該抗體的抗原結合性片段與組織標本接觸之步驟。
一種多核苷酸，其編碼如請求項1至14中任一項之抗體或該抗體的抗原結合性片段。
一種載體(vector)，其包含如請求項24之多核苷酸。
一種細胞，其包含如請求項24之多核苷酸或如請求項25之載體。
一種如請求項1至14中任一項之抗體或該抗體的抗原結合性片段之製造方法，其包含下述步驟(a)及(b)：(a)培養如請求項26之細胞的步驟；(b)從步驟(a)的培養物回收單株抗體或該抗體的抗原結合性片段的步驟。