BR112013000796B1

BR112013000796B1 - Anticorpo isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno, composição farmacêutica, métodos para inibir a montagem de ligantes difusíveis derivados de ß-amiloide, para inibir a fosforilação de proteína tau em ser202/thr205, para identificar um suposto agente terapêutico, para detectar ligantes difusíveis derivados de ß-amiloide e para diagnosticar uma doença associada aos ligantes difusíveis derivados de ß-amiloide, e, kit para detectar ligantes difusíveis derivados de ß-amiloide

Info

Publication number: BR112013000796B1
Application number: BR112013000796-6A
Authority: BR
Inventors: Renee C. Gaspar; Paul J. Shughrue; Fubao Wang; Weirong Wang; Ningyan Zhang; Wei-Qin Zhao; Alexander McCampbell; Min Xu
Original assignee: Merck Sharp & Dohme Corp
Priority date: 2010-07-14
Filing date: 2011-07-13
Publication date: 2021-08-31
Also published as: KR20130135831A; RU2567808C2; CN103140500A; EP2593475A4; MX338640B; US9309309B2; AU2011279221A1; US20130115227A1; CA2805414C; MX2013000490A; AU2011279221B2; WO2012009442A3; KR101842301B1; RU2013106270A; EP2593475B1; EP2593475A2; ES2573135T3; CN103140500B; BR112013000796A2; DK2593475T3

Abstract

ANTICORPO ISOLADO OU UM FRAGMENTO DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, USO DE ANTICORPO OU FRAGMENTO DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO, MÉTODO PARA INIBIR A MONTAGEM DE LIGANTES DIFUSÍVEIS DERIVADOS DE B-AMILOIDE, PARA INIBIR A FOSFORILAÇÃO DE PROTEÍNA TAU EM SER202/THR205, PARA IDENTIFICAR UM SUPOSTO AGENTE TERAPÊUTICO, PARA DETECTAR LIGANTES DIFUSÍVEIS DERIVADOS DE B- AMILOIDE E PARA DIAGNOSTICAR UMA DOENÇA ASSOCIADA AOS LIGANTES DIFUSÍVEIS DERIVADOS DE B-AMILOIDE, USO DA COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA,E, KIT PARA DETECTAR LIGANTES DIFUSÍVEIS DERIVADOS DE B-AMILOIDE. São revelados os anticorpos que se ligam aos ligantes difusíveis derivados de beta amiloide, também conhecido como ADDLs. Os anticorpos que são seletivos para ADDLs podem penetrar no cérebro e são usados em métodos de detectar ADDLs e diagnosticar doença de Alzheimer. Os anticorpos também bloqueiam a ligação de ADDLs aos neurônios, montagem de ADDLS, e fosforilação da Tau e são usados em métodos para prevenir e tratar doenças associadas à ADDLs.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA COM OS PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Este pedido reivindica a prioridade de 35 USC § 119 no pedido provisório U.S. No. 61/364,210, depositado em 14 de julho de 2011.

CAMPO DA INVENÇÃO

[002] A presente invenção diz respeito aos anticorpos monoclonais para uso no tratamento de doença de Alzheimer. A invenção também fornece composições que compreendem anticorpos monoclonais e métodos de usar as composições como biomarcadores, ou para diagnosticar e tratar doenças associadas a beta amiloide (Aβ) e ligantes difusíveis derivados de Aβ (ADDLs).

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[003] A doença de Alzheimer (AD) é caracterizada pela perda progressiva da função cognitiva e pelo acúmulo de placas de beta amiloide (Aβ) em regiões associadas com aprendizado e memória. Embora as placas de Aβ sejam conhecidas por desempenhar um papel central na patogênese de AD, uma evidência cada vez maior sugere que os ligantes difusíveis derivados de Aβ (ADDLs) possam ser responsáveis pela disfunção neuronal associada à doença e pela diminuição cognitiva (Walsh and Selkoe, 2004, Protein Pept. Lett., 11: 2,13-228). ADDLs são oligômeros solúveis pequenos de Aβ, que são abundantes em AD, mas não em cérebros normais (McLean et al., 1999, Ann. Neurol., 46: 860-866; Gong et al., 2003, Proc, Natl. Acad. Sci. USA, 100: 10417-10422). Estudos in vitro mostraram que os ADDLs, isolados do cérebro com AD ou preparações sintéticas, se ligam a uma subpopulação de neurônios corticais e hipocampais (Gong et al., 2003; Klein et al., 2004, Neurobiol. Aging, 25: 569-580; Lacor et al., 2004, J. Neurosci., 24: 10191-10200; Shughrue et al., 2010, Neurobiol. Aging, 31: 189-202), enquanto pouca, ou nenhuma, ligação foi detectada com preparações Aβ fibrilar ou de monômero (Lacor et al., 2004; Hepler et al., 2006, Biochemistry, 45: 15157-15167). Além do mais, ADDL que se liga aos neurônios pode ser atenuado tanto com anticorpos policlonais (Gong et al., 2003) quanto monoclonais (Lee et al., 2006, J. Biol. Chem., 281: 4292-4299; De Felice et al., 2007, Neurobiol. Aging 29: 1334-1347; Shughrue et al., 2010) gerados contra ADDLs.

[004] Em modelos de reodor, a administração central de ADDLs induz déficits na potenciação de longo prazo (LTP) e formação da memória em roedores (Walsh et al., 2002, Nature, 416: 535-539; Cleary et al., 2004, Nat. Neurosci., 8: 79-84; Klyubin et al., 2005, Nat. Med., 11: 556-561). O efeito de oligômeros em LTP foi atenuado quando ADDLs foram coadministrados com um anticorpo anti-Aβ, ou administrados em animais que foram vacinados com o peptídeo Aβ (Rowan et al., 2004, Exp, Gerontol,, 39: 1661-1667). Em um modelo transgênico de AD, tal como camundongos transgênicos que produzem proteína precursora amiloide humana (hAPP), os déficits cognitivos associados à idade foram observados com níveis elevados de ADDL (Westerman et al., 2002, J. Neurosci,, 22: 1858-1867; Ashe, 2005, Biochem, Soc. Trans., 33: 591-594; Lee et al., 2006; Lesne et al., 2006, Nature, 440: 352-357). Quando os camundongos com hAPP foram tratados com um anticorpo anti-ADDL, uma melhoria significativa no desempenho cognitivo foi observada sem uma diminuição concomitante na carga de placa Aβ (Lee et al., 2006). Juntos, estes achados sugerem que ADDLs, e não as placas Aβ, são os principais responsáveis por deficiência cognitiva e que o uso de anticorpos anti-ADDL podem demonstrar eficiência no tratamento de AD. Ver também, U.S.2006/0228349; U.S. 7.731.962, WO2007/050359; U.S.2007/0218499, WO2006/014478; U.S. 7.700.099; U.S. 2008/01758835, WO2006/055178.

[005] Dessa maneira, existe uma necessidade de anticorpos terapêuticos seletivos com relação à ADDL para a prevenção e tratamento de AD. A presente invenção atende esta necessidade.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[006] A presente invenção diz respeito a um anticorpo isolado, ou fragmento deste, capaz de reconhecer de maneira diferencial uma conformação multidimensional de um ou mais ligantes difusíveis derivados de β-amiloide (ADDLs) para o tratamento de doenças associadas à ADDLs, tal como doença de Alzheimer (AD). A presente invenção também fornece composições farmacêuticas que compreendem o anticorpo isolado da invenção, tanto sozinho quanto em combinação, com um ou mais agentes, carreadores, ou diluentes terapeuticamente ativos.

[007] A presente invenção também diz respeito aos métodos de uso do anticorpo isolado, tais como métodos para detectar ADDLs em uma amostra, para inibir a montagem de ADDLs, para identificar agentes terapêuticos que previnem a ligação de ADDLs aos neurônios, e para atenuar os sintomas de uma doença associada à ADDLs, e como um biomarcador para uso no diagnóstico de uma doença associada à ADDLs ou para a detecção de ADDLs em uma amostra.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[008] A figura 1 é uma representação gráfica da ligação por ELISA de um painel de anticorpos humanizados (h3B3) e anti-ADDL com afinidade maturada (14.2, 7.2, 11.4, 9.2, 13.1, 17.1, e 19.3), e três anticorpos de comparação (Comp 1, 2, e 3) para o monômero Aβ, ADDLs e Aβ fibrilar. O fundamento deste ensaio foi determinado removendo o anticorpo de captura a partir de ELISA (sem mAb). As barras de erro representam o erro padrão da média.

[009] A figura 2 é uma representação gráfica da ligação por ELISA de anticorpo anti-ADDL 19.3 e anticorpo 3B3 aos ADDLs ou monômero Aβ (Aβ1-40), avaliada com uma curva de titulação de 11 pontos.

[0010] A figura 3 é uma representação gráfica da capacidade do anticorpo anti-ADDL 19.3 e 3B3 bloquear a ligação de ADDL às células neuronais hipocampais primárias após a pré-incubação com concentração crescente do anticorpo. A capacidade do anticorpo anti-ADDL 19.3 bloquear a ligação de ADDL aos neurônios foi atenuada após desnaturação térmica do anticorpo. As barras de erro representam o erro padrão da média.

[0011] As figuras 4A-4C são representações gráficas da ligação por ELISA aos ADDLs do anticorpo anti-ADDL 19.3 (determinado como WT na figura 4A) e dois anticorpos anti-ADDL derivados de 19.3 (Figuras 4B e 4C), após incubação de até um mês em temperaturas variadas para avaliar a estabilidade do anticorpo. Os anticorpos anti-ADDL derivados de 19.3 sendo compreendidos uma substituição única de aminoácido de Asn33 na cadeia leve CDR1 tanto em Ser33 (19.3S33) quanto Thr33 (19.3T33) (SEQ ID NOS: 55 e 56, respectivamente). A substituição de Asn33 tanto com S33 (Figura 4B) quanto T33 (Figura 4C) resultou em melhor estabilidade do anticorpo versus o anticorpo parental 19.3.

[0012] A figura 5 é uma representação gráfica da ligação e dissociação de anticorpos anti-ADDL com o FcRn imobilizado humano durante a avaliação com Biacore™ (GE Healthcare, Piscataway, NJ). O sensorgrama ajustado mostra a ligação inicial em pH 6,0, e a seguir a dissociação de anticorpos em pH 7,3 a partir de 180 segundos. Um ponto de controle (estabilidade) foi inserido em 5 segundos após o final da ligação com pH 6,0 e o “% ligado” foi calculado como % de RUestabilidade RUligação.

[0013] A figura 6A mostra o alinhamento das regiões variáveis de cadeia pesada e leve para o anticorpo anti-ADDL 19.3, com uma linhagem germinativa humana com as regiões de determinação complementar (CDRs) indicadas em negrito. A figura 6B é um modelo tridimensional das regiões variáveis de cadeia pesada e leve do anticorpo 19.3 que mostra a localização das CDRs.

[0014] A figura 7 é uma representação gráfica do perfil farmacocinético (PK) de anticorpos anti-ADDL, 19.3 e 3B3, avaliado em camundongos com FcRn de humano 276 heterozigoto (Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) após uma administração intravenosa (IV) única de 10 mg/kg. A concentração de anticorpo foi medida em vários intervalos de tempo para determinar a meia vida (t/) de anticorpo livre (19.3: 77 ± 6 horas; 3B3, respectivamente: 29 + 9 horas).

[0015] A figura 8 é uma representação gráfica do PK de anticorpo anti-ADDL 19.3 (no soro), avaliada em seis macacos reso após a administração de uma dose em bolo intravenosa (IV) ou subcutânea (SC) de 5 mg/kg. Uma meia vida (t/) de 254 + 28 (274 ± 9) horas foi determinada após a administração IV e 204 + 49 (219 + 52) horas após a dosagem SC.

[0016] A figura 9 é uma representação gráfica do PK de anticorpo anti-ADDL 19.3 avaliada no fluido cérebro-espinhal (CSF) de primata (três macacos reso machos) usando um modelo de cisterna magna conduzido em macacos reso após a administração de uma dose em bolo IV de 5 mg/kg. Em cerca de 48 horas após a dose, o anticorpo anti-ADDL 19.3 estava presente no CSF em 0,1 % da concentração no soro.

[0017] As figuras 10A-10D são representações da capacidade de anticorpo anti-ADDL 19.3, versus dois anticorpos de comparação (Comp 1 e Comp2), para atravessar a barreira hemato-encefálica em um modelo de camundongo transgênico que superexpressa a proteína precursora amiloide humana (hAPP). Os camundongos foram injetados intravenosamente (IV) com anticorpo anti-ADDL 19.3 marcado com 125I, ou um anticorpo de comparação, e as amostras de sangue, CSF e cérebro foram coletadas duas horas após a dose. Mediante a avaliação da distribuição da radioatividade, 0,02 % de anticorpo anti-ADDL 19.3 estava presente no CSF (Figura 10A), enquanto 0,19 % foi observado no cérebro (Figura 10B). Níveis similares foram observados com os dois anticorpos de comparação. A análise de imunocitoquímica demonstrou a localização de anticorpo anti-ADDL 19.3 (Figura 10 C, setas) e uma concentração de anticorpo anti-ADDL 19.3 estava visível nas placas (Figura 10D). O anticorpo anti-ADDL 19.3 foi capaz de penetrar no cérebro e se ligar aos ADDLs.

[0018] As figuras 11A-11C são representações da capacidade do anticorpo anti-ADDL 19.3 bloquear a deposição de ADDLs em placas de crescimento em um modelo de camundongo transgênico que superexpressa hAPP. Os ADDLs biotinilados (bADDLs) infundidos no hipocampo de camundongos de 12 meses por quatro semanas (uma injeção por semana) (Figura 11 A) marcaram as placas existentes (apenas veículo: Figura 11B; anticorpo 19.3: Figura 11C, anel). A análise imunocitoquímica foi usada para avaliar a deposição de novo material (ADDLs) (Figuras 1 IB e 11C).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0019] A presente invenção diz respeito aos anticorpos, ou um fragmento de ligação ao antígeno, que se ligam a ligantes difusíveis derivados de β-amiloide (Aβ) (ADDLs), isto é, anticorpos anti-ADDL, e atenuam a ligação de ADDL aos neurônios. Os resultados de um ensaio quantitativo a base de célula revelaram que os anticorpos anti-ADDL se ligaram preferivelmente aos ADDLs, reduziram a ligação de ADDLs to neurônios hipocampais, atravessaram a barreira hemato-encefálica, e apresentam um melhor perfil farmacocinético (PK).

[0020] Em uma modalidade a presente invenção diz respeito a um anticorpo isolado, ou um fragmento de ligação ao antígeno deste, que se liga a ligantes difusíveis derivados de β-amiloide (ADDLs) que compreendem: (a) uma região variável de cadeia leve que compreende, (i) uma CDR1 com a sequência Arg-Ser-Ser-Gln-Ser-Ile-Val- His-Ser-Asn-Gly-Asn-Thr-Tyr-Leu-Glu (SEQ ID NO: 1), (ii) uma CDR2 com a sequência Lys-Ala-Ser-Asn-Arg-Phe- Ser (SEQ ID NO: 2), e (iii) uma CDR3 com a sequência Phe-Gln-Gly-Ser-Xaa1- Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5 (SEQ ID NO: 3), em que Xaa1 é Arg, Lys ou Tyr, Xaa2 é Val, Ala, ou Leu, Xaa3 é Pro, His, ou Gly, Xaa4 é Ala, Pro, ou Val, e Xaa5 é Ser, Gly, ou Phe; e (b) uma região variável de cadeia pesada que compreende, (i) uma CDR1 com a sequência Gly-Phe-Thr-Phe-Ser-Ser-Phe- Gly-Met-His (SEQ ID NO: 4), (ii) uma CDR2 com a sequência Tyr-Ile-Ser-Arg-Gly-Ser-Ser- Tlir-Ile-Tyr-Tyr-Ala-Asp-Thr-Val-Lys-Gly (SEQ ID NO: 5), e (iii) uma CDR3 com a sequência Gly-Ile-Thr-Thr- Ala-Leu- Asp-Tyr (SEQ ID NO:6).

[0021] Em uma outra modalidade, a presente invenção diz respeito a um anticorpo isolado, ou um fragmento de ligação ao antígeno deste, que se liga a ligantes difusíveis derivados de β-amiloide (ADDLs) que compreendem: (a) uma região variável de cadeia leve que compreende, (i) uma CDR1 com a sequência Arg-Ser-Ser-Gln-Ser-Ile-Val- His-Ser-Xaa1-Gly-Xaa2-Thr-Tyr-Leu-Glu (SEQ ID NO: 53), em que Xaa1 é Asn, Ser, Thr, Ala, Asp ou GIu e Xaa2 é Asn, His, Gin, Ser, Thr, Ala, ou Asp; (ii) uma CDR2 com a sequência Lys-Ala-Ser-Xaa1-Arg-Phe- Ser (SEQ ID NO:54), em que Xaa1 é Asn, Gin, Ser, Thr, ou Ala, e (iii) uma CDR3 com a sequência Phe-Gln-Gly-Ser-Arg-Leu- Gly-Pro-Ser (SEQ ID NO: 10); e (b) uma região variável de cadeia pesada que compreende, (i) uma CDR1 com a sequência Gly-Phe-Thr-Phe-Ser-Ser-Phe- Gly-Met-His (SEQ ID NO: 4), (ii) uma CDR2 com a sequência Tyr-Ile-Ser-Arg-Gly-Ser-Ser- Thr-Ile-Tyr-Tyr-Ala-Asp-Thr-Val-Lys-Gly (SEQ ID NO: 5), e (iii) uma CDR3 com a sequência Gly-Ile-Thr-Thr-Ala-Leu- Asp-Tyr (SEQ ID NO:6).

[0022] Em uma outra modalidade a presente invenção é um anticorpo isolado que se liga aos ADDLs, isto é, um anticorpo anti-ADDL, ou um fragmento de ligação ao antígeno deste, com uma região variável de cadeia leve CDR3 que é selecionada do grupo que consiste em 17.1, com a sequência Phe-Gln-Gly-Ser-Arg-Val-Pro-Ala-Ser (SEQ ID NO: 7), 14.2, com a sequência Phe-Gln-Gly-Ser-Arg-Val-Pro-Pro-Gly (SEQ ID NO: 8), 13.1, com a sequência Phe-Gln-Gly-Ser-Lys-Ala-His-Pro-Ser (SEQ ID NO: 9), 19.3, com a sequência Phe-Gln-Gly-Ser-Arg-Leu-Gly-Pro-Ser (SEQ ID NO: 10), 7.2, com a sequência Phe-Gln-Gly-Ser-Tyr-Ala-Pro-Pro-Gly (SEQ ID NO: 1 1), 9.2, com a sequência Phe-Gln-Gly-Ser-Arg-Ala-Pro-Pro-Phe (SEQ ID NO: 12), e 11.4, com a sequência Phe-Gln-Gly-Ser-Arg-Val-Pro-Val-Arg (SEQ ID NO: 13). Em uma submodalidade, a região variável de cadeia leve CDR3 é SEQ ID NO: 10.

[0023] Ainda em uma outra modalidade da presente invenção, o anticorpo isolado anti-ADDL compreende adicionalmente uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 15 e uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 17.

[0024] Ainda em uma outra modalidade da presente invenção, o anticorpo isolado anti-ADDL compreende adicionalmente uma região constante de cadeia pesada de SEQ ID NO: 21.

[0025] Em uma outra modalidade da presente invenção, o anticorpo isolado anti-ADDL é um anticorpo monoclonal.

[0026] Uma outra modalidade da presente invenção é uma composição farmacêutica que compreende um anticorpo isolado anti-ADDL, ou um fragmento de ligação ao antígeno deste, em mistura com um carreador farmaceuticamente aceitável.

[0027] Uma outra modalidade da presente invenção é um método para atenuar a ligação de ADDLs a um neurônio, compreendendo colocar o neurônio em contato com um anticorpo isolado anti-ADDL, ou um fragmento de ligação ao antígeno deste, de maneira tal que a ligação de ligantes difusíveis derivados de Aβ ao neurônio seja atenuada.

[0028] Uma outra modalidade da presente invenção é um método para inibir a montagem de ADDLs, que compreende colocar uma amostra contendo peptídeos β amiloide 1-42 em contato com um anticorpo isolado anti-ADDL, ou fragmento de ligação ao antígeno deste, inibindo por meio disso a montagem de ADDLs.

[0029] Uma outra modalidade da presente invenção é um método para inibir o fosforilação de proteína Tau em Ser202/Thr205, compreendendo colocar uma amostra contendo uma proteína Tau em contato com um anticorpo isolado anti-ADDL, ou um fragmento de ligação ao antígeno deste, inibindo por meio disso a fosforilação de proteína Tau em Ser202/Thr205.

[0030] Uma outra modalidade da presente invenção é um método para atenuar os sintomas de uma doença associada aos ADDLs, compreendendo administrar uma quantidade eficiente a um paciente que necessita desta composição farmacêutica, que compreende um anticorpo isolado anti-ADDL, ou um fragmento de ligação ao antígeno deste.

[0031] Uma outra modalidade da presente invenção é um método para identificar um suposto agente terapêutico que atenua a ligação de ligantes difusíveis derivados de β-amiloide (ADDLs) aos neurônios, compreendendo: (a) colocar uma composição que compreende um neurônio em contato com ADDLs na presença de um agente; (b) colocar a composição em contato com o anticorpo isolado anti-ADDL, ou um fragmento de ligação ao antígeno deste; e (c) detectar a quantidade de anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno ligado na presença do agente, em que uma diminuição na quantidade de anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno, ligado na presença do agente comparada à quantidade de anticorpo ligado na ausência do agente indica que o agente é um suposto agente terapêutico para atenuar a ligação de ADDLs aos neurônios.

[0032] Uma outra modalidade da presente invenção é um método para detectar ADDLs em uma amostra que compreende colocar uma amostra em contato com um anticorpo isolado anti-ADDL, ou um fragmento de ligação ao antígeno deste, e determinar a presença de um complexo que compreende os ADDLs e o dito anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno.

[0033] Uma outra modalidade da presente invenção é um método para diagnosticar uma doença associada aos ADDLs, compreendendo colocar uma amostra em contato com um anticorpo isolado anti-ADDL, ou um fragmento de ligação ao antígeno deste, e determinar a presença de um complexo que compreende os ADDLs. e o dito anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno, em que a presença do dito complexo é diagnóstico de uma doença associada aos ADDLs.

[0034] Ainda uma outra modalidade da presente invenção é um kit para detectar ADDLs, compreendendo um anticorpo isolado anti-ADDL, ou um fragmento de ligação ao antígeno deste, que se liga aos ADDLs.

[0035] Os anticorpos monoclonais, que reconhecem de maneira diferente as conformações multidimensionais de ligantes difusíveis derivados de Aβ (ADDLs), são conhecidos na técnica (ver, patente U.S. 7.780.963, patente U.S. 7.731.962, e patente U.S. 7.811.563, todas as quais são aqui incorporadas pela referência na sua íntegra), e mostraram reduzir a ligação de ADDL aos neurônios em ensaios à base de célula. Os anticorpos anti-ADDL pode distinguir entre extratos cerebrais humanos de doença de Alzheimer (AD) e controle, podem identificar oligômeros endógenos em fragmentos cerebrais com AD e em células hipocampais, e podem neutralizar ADDLs endógenos e sintéticos em solução. Os anticorpos anti-ADDL se ligam especificamente a uma ou mais conformações multidimensionais de ADDLs, se ligam aos ADDLs particulares derivados da oligomerização de Aβ42, embora com afinidade reduzida para outros peptídeos Aβ, incluindo Aβ1-40.

[0036] A presente invenção diz respeito aos anticorpos anti-ADDL, especificamente anticorpos 17.1, 14.2, 13.1, 19.3, 19.3T33, 19.3S33, 7.2, 9.2, e 11.4, que se ligam preferivelmente a ADDLs e que foram caracterizados por sua especificidade e seletividade por ADDLs. DE maneira importante, a especificidade e seletividade destes anticorpos anti-ADDL da presente invenção não são previsíveis a partir do epítopo linear de Aβ nos quais eles são ligados, nem a sua atividade foi previsível a partir da sua capacidade de detectar ADDLs por Western blot, ou de sua capacidade de detectar ADDLs imunocorados ligados aos neurônios. Além do mais, a capacidade diferencial dos anticorpos anti-ADDL da presente invenção em neutralizar os ADDLs e bloquear a ligação aos neurônios hipocampais principais sustenta a opinião de que os anticorpos anti-ADDL agem por meio da ligação a um epítopo conformacional mais relevante, que previne ADDL de se ligar aos neurônios. Em uma modalidade da presente invenção, o anticorpo anti-ADDL 19.3 não apenas bloqueou a ligação de ADDLs aos neurônios principais, mas também reduziu as mudanças induzidas por ADDL na morfologia espinhal hipocampal, uma indicação de que o obstáculo da ligação ADDL-neural apresenta ramificações fisiológicas significativas, por exemplo, sobrevivência neuronal, conectividade neuronal e transdução de sinal. O anticorpo anti- ADDL 19.3 também apresentou um melhor perfil farmacocinético (PK), da maneira comparada com um anticorpo anti-ADDL previamente conhecido, 3B3, quando avaliado tanto em modelos in vitro quanto in vivo. Além disso, quando administrados aos camundongos transgênicos que superexpressam uma forma humana de proteína precursora amiloide (hAPP), o anticorpo anti- ADDL 19.3 foi conhecido por penetrar a barreira hemato-encefálica e se concentrar no cérebro. Uma vez que os ADDLs são localizados no cérebro e agem afetando de maneira adversa na função neuronal, os versados na técnica saberão e entenderão que a penetração e a concentração de anticorpo no cérebro pode ser benéfica para imunoterapia. Obtidos juntos, estes dados demonstram que os anticorpos anti-ADDL seletivos, tal como anticorpo 19.3, podem bloquear a ligação de ADDLs aos neurônios hipocampais, que estão envolvidos de maneira importante no aprendizado e na memória.

[0037] A utilidade dos anticorpos anti-ADDL para o tratamento de AD baseia-se em aumento crescente de evidência que sugere que os ADDLs, e não as placas amiloide per se, desempenham um papel fundamental na diminuição cognitiva associada a esta doença (Walsh e Selkoe, 2004, Protein Pept. Lett., 11: 213-228). Os ADDLs são elevados no cérebro de AD e induzem déficits nas finalizações comportamentais e eletrofisiológicas quando administrado de maneira central aos roedores (Walsh, et al., 2002, Nature, 416: 535-539; Cleary, et al., 2004, Nat. Neurosci., 8: 79-84; Klyubin, et al., 2005, Nat. Med.. 11: 556-561; Balducci, et al., 2010, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 107: 2295-2300). Os déficits no aprendizado e memória também foram observados em um modelo de camundongo que expressa liAPP, com o início dos prejuízos associados aos níveis elevados de ADDL (Westerman, et al., 2002, J. Neurosci., 22: 1858-1867; Ashe, 2005, Biochem. Soc. Trans., 33: 591-594; Lee, et al., 2005, J. Biol. Chem.. 281: 4292-4299; Lesne, et al., 2006, Nature, 440: 352-357). Embora os eventos celular e subcelular que medeiam estes efeitos na cognição não sejam completamente entendidos, é óbvio que os ADDLs se ligam aos terminais sinápticos localizados nos processos dendríticos de neurônios hipocampais (Lacore, et al., 2004, J. Neurosci., 24: 10191-1022), e alteram a morfologia e número de espinhas dendríticas (Lacor et al., 2007, J. Neurosci., 27: 796-807; Shankar, et al., 2007, J. Neurosci., 27: 2866-2875; Shughrue, et al., 2010, Neurobiol. Aging. 31: 1 9-202). Os achados de que os ADDLs se ligam tanto aos neurônios GABAergic quanto glutamato no hipocampo (Shughrue, et al., 2010), neurônios envolvidos de maneira importante no aprendizado e memória, que resultam na internalização de receptores AMPA (Zhao, et al., 2010, J. Biol. Chem., 285: 7619-7632), sustentam adicionalmente a opinião de que os ADDLs modulam direta ou indiretamente estes sistemas neurotransmissores (ver, por exemplo, Venkitaramani, et al., 2007, J. Neurosci., 27: 1183211837).

[0038] Na presente invenção, um painel de anticorpos anti-ADDL derivados do anticorpo anti-ADDL, 3B3 (patente U.S. 7.780.963 e patente U.S. 7.811.563, que são aqui incorporadas pela referência na sua íntegra), foi avaliado com relação à sua capacidade de bloquear ADDL que se liga aos neurônios hipocampais primários. Os anticorpos monoclonais selecionados foram então humanizados e tiveram sua afinidade maturada para caracterização adicional. Os anticorpos sonda, selecionados por sua capacidade de se ligarem aos ADDLs, foram avaliados adicionalmente em uma concentração simples, usando um ELISA de três pontos, para determinar a ligação do anticorpo ao monômero Aβ, ADDLs e Aβ fibrilar. Da maneira mostrada na figura 1, seis dos sete anticorpos com afinidade maturada anti- ADDL, especificamente os anticorpos 14.2, 7.2, 1 1.4, 13.1, 17.1, e 19.3 eram preferivelmente ADDL, quando comparados ao monômero Aβ e Aβ fibrilar. Subsequentemente uma curva de titulação de onze pontos e ELISA foram usados para verificar a afinidade de ligação dos anticorpos anti-ADDL em ADDLs e monômero Aβ (Aβ1-40) em uma ampla faixa de concentrações. Da maneira mostrada na figura 2, os anticorpos anti-ADDL 3B3 e 19.3 foram muito seletivos para ADDL. Além disso, os anticorpos foram comparados em um ensaio de ligação a base de célula para determinar a capacidade de anticorpos em bloquear a ligação de ADDL aos neurônios. Da maneira mostrada na figura 3, ADDLs, pré-incubados com concentrações crescentes de anticorpos anti-ADDL, 3B3 e 19.3, foram adicionados aos neurônios hipocampais principais, e uma curva de titulação foi usada para mostrar quantitativamente a capacidade do anticorpo em bloquear a ligação de ADDL aos neurônios. Obtidos juntos, estes resultados mostram que os anticorpos anti-ADDL diminuem muito a ligação neuronal em um formato a base de células.

[0039] Uma avaliação da sequência de aminoácidos foi conduzida para identificar sítios potenciais de desamidação. Os resíduos de asparagina e ácido aspártico presentes nas CDRs de anticorpos terapêuticos são conhecidos por se submeterem à desamidação e formação de isoaspartato (Valsak e Ionescu, 2008, Curr.Pharm.Biotech., 9:468-481; Aswad et al., 2000, J. Pharm.Biomed.Anal. 21:1129-1136), cuja formação pode alterar a eficiência de ligação de um anticorpo e, por sua vez, reduzir a efetividade do anticorpo para uso como um terapêutico. Assim, os versados na técnica podem entender e saber que a presença de uma asparagina ou um ácido aspártico nas CDRs para o anticorpo 19.3 pode não ser desejável. Dessa maneira, os requerentes alteraram o resíduo de asparagina na posição 33 da CDR1 de cadeia leve para otimizar a estabilidade do anticorpo anti-ADDL 19.3 (tabela 4B). Os derivados do anticorpo 19.3 foram produzidos com a substituição de serina (SEQ ID NO: 55), treonina (SEQ ID NO: 56), ou ácido glutâmico (SEQ ID NO: 67) pela asparagina na posição 33 (SEQ ID NO: 1) em CDR1. A substituição de ácido aspártico (SEQ ID NO: 68) pela asparagina na posição 33 também foi gerada como um controle. Estas mudanças removerão a possibilidade de desamidação de asparagina na posição 33 em CDR1. Os derivados de 19.3 foram gerados da maneira descrita no exemplo 3 e caracterizados da maneira descrita no exemplo 4 como os derivados das substituições de serina (SEQ ID NO: 55), treonina (SEQ ID NO: 56), ácido glutâmico (SEQ ID NO: 67), e ácido aspártico (SEQ ID NO: 68) para avaliar a estabilidade dos novos construtos. Da maneira mostrada nas figuras 4B e 4C, respectivamente, dois derivados representativos, 19.3S33 (SEQ ID NO: 55) e 19.3T33 (SEQ ID NO: 56), apresentaram melhor estabilidade de ligação após uma incubação de um mês em várias temperaturas. Outras substituições de aminoácido na CDR1 de cadeia leve pela asparagina nas posições 33 e 35 (SEQ ID NO: 53), e na CDR2 de cadeia leve pela asparagina na posição 58 (SEQ ID NO: 54) são propostas nas tabelas 4B e 4C para avaliação adicional.

[0040] Para determinar a farmacocinética dos anticorpos anti-ADDL com afinidade maturada da presente invenção, uma série de estudos in vitro e in vivo foram realizados. A ligação dos anticorpos ao receptor FcRn em pH 6,0 mostrou ser previsível na meia vida do anticorpo em humanos (Zalevsky, et al., 2010, Nat. Biotech.. 28(2): 157-159) e em pH 7.3 (USSN 61/307.182). A ligação e dissociação dos anticorpos anti-ADDL da presente invenção ao FcRn humano imobilizado foram avaliadas com uma análise de interação sem marca, tal como aquela oferecida por Biacore™ Life Sciences, Biacore™ T- 100 (GE Healthcare, Piscataway, NJ). Um sensorgrama ajustado é usado para mostrar a ligação inicial em pH 6,0, e a seguir a dissociação de anticorpos em pH 7,3 de 180 segundos. Um ponto de controle (estabilidade) foi inserido em 5 segundos após o final da ligação em pH 6,0 e o “% ligado” foi calculado como RUestabilidade/RULigação (%). Da maneira mostrada na figura 5, a taxa de dissociação para 3B3 humanizado foi muito mais lenta que os sete anticorpos anti-ADDL da presente invenção, os quais incluíram o anticorpo 19.3 e três anticorpos de comparação. Neste caso, em que sabe-se que uma taxa de dissociação lenta é um indicador de PK pobre in vivo, um estudo adicional in vivo foi realizado em FcRn de camundongos transgênicos (FcRn de camundongos 276 humanos heterozigotos, Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME). Quando o FcRn de camundongos transgênicos foi fornecido em 10 mg/kg intravenosamente (IV) tanto de anticorpo anti-ADDL 3B3 quanto 1.3, uma diferença significativa na farmacocinética foi determinada. Da maneira mostrada na figura 7, a meia vida (t/) de anticorpo anti-ADDL 3B3 foi relativamente curta (29 ± 9 horas), o que foi consistente com a previsão dos dados de Biacore™, embora a meia vida para o anticorpo anti-ADDL 19.3 tenha sido significativamente maior (77 ± 6 horas). Em geral, o PK pobre, da maneira observada com o anticorpo 3B3, pode excluir o desenvolvimento adicional de um anticorpo para uso como um terapêutico, em virtude de sua pouca biodisponibilidade.

[0041] Para confirmar a meia vida prevista de anticorpo anti-ADDL 19.3 em primatas, um estudo de farmacocinética em primatas foi realizado com o anticorpo em um coorte de cisterna magna conduzido em macacos reso. Os animais foram dosados com uma injeção em bolo intravenosa única (IV) ou subcutânea (SC) de anticorpo anti-ADDL 19.3 (5 mg/kg), e as amostras de sangue foram coletadas após a administração do anticorpo. Ao mesmo tempo, as amostras CSF foram coletadas a partir da entrada da cisterna magna em intervalos de tempo, e a concentração de anticorpo anti- ADDL 19.3 no soro e CSF foi determinada com um ensaio de ELISA com IgG anti-humana. Quando os animais foram administrados com anticorpo anti-ADDL 19.3 por uma injeção em bolo IV única, uma t/ de 254 ± 28 horas (Figura 8) foi observada, embora uma t/ de 204 ± 49 horas tenha sido observada para a administração subcutânea. Além disso, os requerentes observaram que o anticorpo anti-ADDL 19.3 foi capaz de atravessar CSF de primata, onde aumentou em concentração durante as primeiras 48 horas e atingiu o pico em cerca de 0,1 % do anticorpo dosado (Figura 9).

[0042] Em uma tentativa de verificar a quantidade de anticorpo que penetra a barreira hemato-encefálica e entra no CSF e cérebro, o anticorpo anti-ADDL 19.3 e dois anticorpos de comparação (Comp 1 e Comp 2) foram marcados com 125I e administrados aos camundongos velhos (doze meses) que superexpressam hAPP, um modelo de roedor para AD. Duas horas após a IV dosagem, cerca de 0,02 % de anticorpo 19.3 foi observada no CSF (Figura 10A), enquanto cerca de 0,19 % de anticorpo 19.3 foi observado no cérebro (Figura 10B). Níveis similares foram observados para os dois anticorpos de comparação (Figura 10A e 10B). Quando a análise imunocitoquímica foi realizada nas seções cerebrais dos camundongos dosados e a localização de anticorpo anti-ADDL 19.3 foi determinada (seta na figura 10C), uma concentração do anticorpo associada com a deposição de Aβ em placas foi observada (Figura 10D). Isto demonstrou que o anticorpo anti-ADDL 19.3 penetrou no CSF e foi concentrado no cérebro. Recentemente, observou-se que ADDLs exógenos foram depositados em placas quando administrados a camundongos que superexpressam hAPP (Caspar, et al., 2010, Exp. Neurol., 223: 394-400). Assim, os achados aqui confirmam que o anticorpo anti- ADDL 19.3 localizado e ligado aos ADDLs circulantes se associaram às placas.

[0043] Para avaliar adicionalmente a eficiência in vivo de anticorpos anti-ADDL, a capacidade do anticorpo 19.3 em bloquear a deposição de ADDLS nas placas em crescimento foi avaliada em hAPP de camundongos transgênicos após quatro infusões semanais de ADDLs biotinilados (bADDLs) no hipocampo de camundongos de 12 meses para marcar as placas existentes (Figura 11A). Os animais receberam então quatro infusões intravenosas semanais de anticorpo 19.3 (Figura 11A). A deposição de material novo (ADDLs) em placas de crescimento foi avaliada por análise imunocitoquímica. Da maneira observada nas figuras 11B e 11C, o anticorpo anti-ADDL 19.3 reduziu significativamente a deposição de ADDLs na periferia de placas existentes (Figura 11C), comparado aos camundongos tratados apenas com veículo (Figura 11B). Obtidos juntos, estes resultados demonstraram que um anticorpo anti-ADDL, especificamente o anticorpo 19.3, foi capaz de atravessar a barreira hemato-encefálica, se ligar aos ADDLs, e bloquear a deposição de novo material nas placas em crescimento.

[0044] A ligação ao ADDL também pode apresentar efeitos a longo prazo nos neurônios. Estudos recentes mostram que a ligação ao ADDL nos neurônios hipocampais pode iniciar uma cascata de sinalização que resulta na fosforilação de Tau (De Felice, et al., 2006, Neurobiol. Aging, 29: 394-400). Um componente desta cascata de sinalização, GSK-3β, também mostrou ser modulado pela ligação ao ADDL in vivo e in vitro (Ma, et al., 2006, J. Neurosci. Res., 83: 374-384). Ma, et al., 2006, observaram que a imunização passiva de hAPP de camundongos com um anticorpo que reduziu os ADDLs também reduziu os níveis de GSK-3β e a fosforilação de Tau no córtex. Estes achados sustentam uma ligação entre Aβ e a Tau fosforilada e sugerem que a ligação ao ADDL pode ativar eventos que levam à agregação intracelular de Tau. Adicionalmente, os dados sugerem que os anticorpos que previnem a ligação de ADDLs aos neurônios e a perda associada de espinhas sinápticas, tais como os anticorpos da presente invenção, podem melhorar os efeitos cognitivos e/ou patológicos associados à doença de Alzheimer e doenças relacionadas.

[0045] Os anticorpos monoclonais, que reconhecem de maneira diferente as conformações multidimensionais de ligantes difusíveis derivados de Aβ, isto é, ADDLs, foram agora gerados. Estes anticorpos foram humanizados e, em algumas modalidades, tiveram a afinidade maturada. Os anticorpos distinguem vantajosamente entre os extratos cerebrais humanos de doença de Alzheimer e controle, e identificam oligômeros endógenos em fragmentos cerebrais com doença de Alzheimer e em células hipocampais cultivadas. Adicionalmente, os anticorpos da presente invenção neutralizam ADDLs endógenos e sintéticos em solução. Os assim denominados ADDLs “sintéticos” são produzidos in vitro misturando Aβ1-42 purificado em condições que geram ADDLs. Ver a patente U.S. 6.218.506. Os anticorpos aqui revelados exibem um grau elevado de seletividade para ADDLs, com detecção mínima das espécies de monômero Aβ. Além do mais, estes anticorpos bloqueiam diferencialmente a capacidade de preparações contendo ADDL de se ligarem às culturas primárias de neurônios hipocampais de rato e linhagens celulares imortalizadas de neuroblastoma, e também bloqueiam a montagem de ADDL. Estes achados demonstram que estes anticorpos possuem uma capacidade diferencial de reconhecer uma conformação multidimensional de ADDLs, apesar do reconhecimento e afinidades da sequência linear similar. Uma vez que ADDLs são conhecidos por se associar a um subconjunto de neurônios e interromper a função neuronal normal, os anticorpos desta invenção encontram uso na prevenção da ligação de ADDL aos neurônios e na montagem de ADDLs e, por sua vez, podem ser usados para o tratamento de doenças relacionadas ao ADDL, incluindo a doença de Alzheimer.

[0046] Dessa maneira, uma modalidade da presente invenção é um anticorpo isolado que reconhece de maneira diferencial uma ou mais conformações multidimensionais de ADDLs. Um anticorpo “isolado” da presente invenção refere-se a um anticorpo que é substancialmente livre de outros anticorpos. Entretanto, a molécula pode incluir alguns agentes adicionais ou frações que não afetam de maneira prejudicial nas características básicas do anticorpo (por exemplo, especificidade de ligação, atividade de neutralização, etc.).

[0047] Um anticorpo que é capaz de se ligar especificamente a uma ou mais conformações multidimensionais de ADDLs, se liga aos ADDLs particulares derivados da oligomerização de Aβ1-42, mas não reagem de maneira cruzada com outros peptídeos Aβ, denominados Aβ 1-12, Aβ 1-28, Aβ 1-40 e Aβ 12-28, determinado por análises Western blot da maneira aqui revelada, e preferivelmente se ligam aos ADDLs em solução. A ligação específica entre duas entidades refere-se em geral a uma afinidade de pelo menos 106, 107, 108, 109 ou 1010 M-1. As afinidades maiores que 108 M-1 são desejadas para atingir a ligação específica.

[0048] Em modalidades particulares, um anticorpo que é capaz de se ligar especificamente a uma conformação multidimensional de um ou mais ADDLs também é mais eficiente contra, isto é, um animal é imunizado com, as conformações multidimensionais de ADDLs. Em outras modalidades, um anticorpo que é capaz de se ligar especificamente a uma conformação multidimensional de um ou mais ADDLs é mais eficiente contra um peptídeo com pouca formação de n-mer, tal como Aβ1-42[Nle35-Dpro37].

[0049] O termo “epítopo” refere-se a um sítio em um antígeno no qual as células B e/ou T respondem, ou a um sítio em uma molécula contra a qual um anticorpo será produzido e/ou na qual um anticorpo se ligará. Por exemplo, um epítopo pode ser reconhecido por um anticorpo que define o epítopo.

[0050] Um epítopo linear é um epítopo em que uma sequência primária de aminoácido compreende o epítopo reconhecido. Um epítopo linear inclui tipicamente pelo menos 3, e mais em geral pelo menos 5, por exemplo, cerca de 6 a cerca de 10 aminoácidos em uma sequência exclusiva.

[0051] Um epítopo conformacional, ao contrário de um epítopo linear, é um epítopo em que a sequência primária dos aminoácidos que compreende o epítopo não é a única que define o componente do epítopo reconhecido (por exemplo, um epítopo em que a sequência primária de aminoácidos não é necessariamente reconhecida pelo anticorpo que define o epítopo). Tipicamente, um epítopo conformacional inclui um maior número de aminoácidos com relação a um epítopo linear. Com relação ao reconhecimento de epítopos conformacionais, o anticorpo reconhece uma estrutura tridimensional do peptídeo ou proteína. Por exemplo, quando uma molécula de proteína se dobra para formar uma estrutura tridimensional, certos aminoácidos e/ou a parte principal do polipeptídeo que forma o epítopo conformacional se tornam justapostas, possibilitando que o anticorpo reconheça o epítopo.

[0052] Os métodos de determinar a conformação de epítopos incluem, mas sem limitação, por exemplo, cristalografia de raios-X, espectroscopia magnética nuclear bidimensional e espectroscopia de marcação rotatória sítio- dirigida e de ressonância paramagnética eletrônica. Ver, por exemplo, Epitope Mapping Protocols em Methods in Molecular Biology (1996) Vol. 66, Morris (Ed.).

[0053] Os ligantes difusíveis derivados de β-amiloide, ou ADDLs, referem-se aos oligômeros solúveis de Aβ1-42 que são compostos desejavelmente de agregados menores que oito ou nove peptídeos Aβ1-42, e são encontrados associados com a doença de Alzheimer. Isto é, ao contrário dos intermediários de agregação de alto peso molecular, o que forma cadeias de micelas, levando à formação de fibrila.

[0054] Da maneira aqui exemplificada, os anticorpos da presente invenção se ligam ou reconhecem pelo menos uma conformação multidimensional de um ADDL. Em modalidades particulares, os anticorpos se ligam em pelo menos duas, pelo menos três, ou pelo menos quatro conformações multidimensionais de um ADDL. Pretende-se que as conformações multidimensionais de ADDLs incluam dímeros, trímeros, tetrâmeros, pentâmeros, hexâmeros, heptâmeros, octâmeros, nonâmeros, decâmeros, etc., da maneira definida por análise por meio de SDS-PAGE. Em decorrência do trímero, tetrâmero, etc., as designações podem variar com o método de ensaio empregado (ver, por exemplo, Bitan, et al., 2005, Amyloid, 12:88-95), a definição de trímero, tetrâmero e similares, da maneira aqui usada, está de acordo com a análise SDS-PAGE. Para ilustrar aqui as capacidades de ligação diferencial dos anticorpos, observa-se que certos anticorpos reconhecerão uma conformação multidimensional, por exemplo, tetrâmeros de ADDLs (patente U.S. 7.780.963, anticorpos murinos 2D6 e 4E2), enquanto outros anticorpos reconhecem várias conformações multidimensionais, por exemplo, trímeros e tetrâmeros de ADDLs (patente U.S. 7.780.963, anticorpos murinos 2A10, 2B4, 5F10 e 20C2 e anticorpo humanizado 20C2). Como tal, o anticorpo da presente invenção apresenta características específicas de oligômero. Em modalidades particulares, uma conformação multidimensional de um ADDL está associada com uma estrutura específica de polipeptídeo que resulta em um epítopo conformacional, que é reconhecido por um anticorpo da presente invenção. Em outras modalidades, um anticorpo da invenção se liga especificamente a uma conformação multidimensional ADDL com uma faixa de tamanho de aproximadamente um trímero ou tetrâmero, que apresentam pesos moleculares em excesso de >50 kDa.

[0055] Enquanto os anticorpos da presente invenção podem apresentar epítopos lineares similares, tais epítopos lineares não são completamente indicativos das características de ligação destes anticorpos, isto é, a capacidade de bloquear a ligação de ADDL aos neurônios, prevenir a fosforilação da Tau e inibir a montagem de ADDL, em decorrência do epítopo linear corresponder a apenas uma porção do epítopo do antígeno, como é bem conhecido pelos versados na técnica (ver, por exemplo, Breitling e Diibel, 1999, Recombinant Antibodies, John Wiley & Sons, Inc., NY, pg. 115). Os anticorpos da presente invenção podem ser distinguidos daqueles da técnica como sendo capazes de reconhecer de maneira diferencial os ADDLs multidimensionais e, dessa maneira, bloquear de maneira diferencial a ligação de ADDL aos neurônios, prevenir de maneira diferencial a fosforilação da Tau e inibir de maneira diferencial a montagem de ADDL.

[0056] Um anticorpo usado de acordo com a presente invenção inclui, mas sem limitação, anticorpos policlonais ou monoclonais, e anticorpos quiméricos, humanos (por exemplo, isolados de células B), humanizados, neutralizantes, biespecíficos ou de cadeia simples destes. Em uma modalidade, um anticorpo da presente invenção é monoclonal. Para a produção de anticorpos, vários hospedeiros, incluindo cabras, coelhos, galinhas, ratos, camundongos, humanos e outros, podem ser imunizados por injeção com ADDLs sintéticos ou naturais. Os métodos para produzir anticorpos são bem conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Kohler e Milstein, 1975, Nature, 256:495-497: Harlow e Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, synthetic ou natural, Nova Iorque, 1988.

[0057] Dependendo da espécie do hospedeiro, vários adjuvantes podem ser usados para aumentar a reposta imunológica. Os adjuvantes usados de acordo com a presente invenção aumentam desejavelmente a resposta intrínseca aos ADDLs sem causar mudanças conformacionais no imunógeno que afetam a forma qualitativa da resposta. Particularmente, os adjuvantes adequados incluem lipídeo A de monofosforila 3 De-O-acilado (MPL™; RIBI ImmunoChem Research Inc., Hamilton, MT; ver GB 2220211) e emulsões óleo em água, tal como esqualeno ou óleo de amendoim, opcionalmente em combinação com estimulantes imunes, tais como lipídeo A de monofosforila (ver, Stoute, et al., 1997, N. Engl. J. Med., 336:86-91), peptídeos de muramila (por exemplo, N-acetilmuramil-L-treonil-D- isoglutamina (thr-MDP), N-acetil-normuramil-L-alanil-D-isoglutamina (nor- MDP), N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2-(1’- 2’dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina (E-PE), N- acetilglucsaminil-N-acetilmuramil-L-A1-D-isoglu-L-Ala-dipalmitoxi propilamida (DTP-DPP)), ou outros componentes da parede celular bacteriana. Os exemplos específicos de emulsões óleo em água incluem MF59 (WO 90/14837), contendo 5 % de esqualeno, 0,5 % de TWEEN™ 80, e 0,5 % de SPAN 85 (opcionalmente contendo várias quantidades de MTP- PE), formulada em partículas submícron usando um microfluidizador, tal como o microfluidizador modelo 110Y (Microfluidics, Newton, MA); SAF contendo 10 % de esqualeno, 0,4 % de TWEEN™ 80, 5 % de PLURONIC®- polímero bloqueado L121, e thr-MDP, tanto microfiuidizada em uma emulsão submícron quanto vortexada para gerar uma emulsão de tamanho maior de partícula; e sistema de adjuvante RIBI™ (RAS) (Ribi ImmunoChem, Hamilton, MT) contendo 2 % de esqualeno, 0,2 % de TWEEN™ 80, e um ou mais componentes de parede celular bacteriana, tais como lipídeo A de monofosforila, dimicolato de trealose (TDM) e esqueleto de parede celular (CWS).

[0058] Uma outra classe de adjuvantes são os adjuvantes de saponina, tal como STIMULON™ (QS-21, Aquila, Framingham, MA) ou partículas geradas a partir destas, tais como ISCOMs (complexos imunoestimulantes) e ISCOMATRDv® (CSL Ltd., Parkville, Austrália). Outros adjuvantes adequados incluem adjuvante completo de Freund (CFA), adjuvante incompleto de Freund (IFA), géis minerais tal como hidróxido de alumínio, e substâncias ativas na superfície tais como lisolecitina, PLURONIC® polióis, poliânions, peptídeos, CpG (WO 98/40100), hemocianina de lapa californiana, dinitrofenol, e citocinas tais como interleucinas (IL-1, IL-2, e IL- 12), fator estimulador de colônia e macrófago (M-CSF) e fator de necrose tumoral (TNF). Entre os adjuvantes usados em humanos, BCG (bacilo de Calmette-Guerin) e Corynebacterium parvum são particularmente adequados.

[0059] Um anticorpo com uma conformação multidimensional ADDL é gerado imunizando um animal com ADDLs. Em geral, os ADDLs podem ser gerados sinteticamente ou por expressão e purificação de fragmento recombinante. Os ADDLs sintéticos podem ser preparados da maneira aqui revelada, ou de acordo com os métodos revelados nas patentes U.S. 6.218.506 e 7.811.563, ou nos pedidos copendentes U.S. 2007/0218499, U.S. 2010/0143396, e U.S. 2010/0240868, todos os quais são aqui incorporados pela referência na sua íntegra. Adicionalmente, os ADDLs podem ser fundidos com uma outra proteína, tal como hemocianina de lapa californiana, para gerar um anticorpo contra a molécula quimérica. Os ADDLs podem ser constritos conformacionalmente para formar um epítopo usado da maneira aqui descrita e, além do mais, pode ser associado com uma superfície, por exemplo, fisicamente anexado ou quimicamente ligado a uma superfície, de uma maneira tal que permita a produção de uma conformação que é reconhecida pelos anticorpos da presente invenção.

[0060] Os anticorpos monoclonais com conformações multidimensionais de ADDLs podem ser preparados usando qualquer técnica que fornece a produção de moléculas de anticorpo por linhagens celulares contínuas em cultivo. Estas incluem, mas sem limitação, a técnica do hibridoma, a técnica do hibridoma de célula B humana, e a técnica de EBV- hibridoma (Kohler, et al.,1975, Nature 256:495-497; Kozbor, et at, 1985, J. Immunol. Methods 81:31-42; Cote, et al., 1983, Proc.Natl.Acad.Sci. 80:20262030; Cole, et al., 1984, MoL Cell Biol. 62:109-120).

[0061] Em modalidades particulares, os anticorpos da presente invenção são humanizados. Os anticorpos humanizados ou quiméricos podem ser produzidos pela união de genes de anticorpo de camundongo com os genes de anticorpo humano para obter uma molécula com especificidade de antígeno e atividade biológica apropriados (ver, Morrison, et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. 81, 6851-6855; Neuberger, et al., 1984, Nature 312:604-608; Takeda, et al., 1985, Nature 314:452-454; Queen, et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:10029-10033; WO 90/07861). Por exemplo, um anticorpo de camundongo é expresso como o fragmento Fv ou Fab em um vetor de seleção de fago. O gene para a cadeia leve (e, em um experimento em paralelo, o gene para a cadeia pesada) é trocado por uma biblioteca de genes de anticorpo humano. Os anticorpos de fago, que ainda se ligam ao antígeno, são então identificados. Este método, comumente conhecido como seleção de cadeia, forneceu anticorpos humanizados que podem se ligar ao mesmo epítopo, assim como o anticorpo de camundongo a partir do qual ele descende (Jespers, et al., 1994, Biotechnology NY 12:899-903). Como uma alternativa, a seleção de cadeia pode ser realizada no nível proteico (ver, Figini, et al., 1994, J. Mol. Biol. 239:68-78).

[0062] Os anticorpos humanos também podem ser obtidos usando métodos de exibição de fagos. Ver, por exemplo, WO 91/17271 e WO 92/01047. Nestes métodos, as bibliotecas de fago são produzidas, nas quais os elementos exibem diferentes anticorpos em suas superfícies externas. Os anticorpos são exibidos em geral como fragmentos Fv ou Fab. Os anticorpos de exibição de fago com uma especificidade desejada são selecionados por enriquecimento por afinidade com os ADDLs. Os anticorpos humanos contra ADDLs também podem ser produzidos a partir de mamíferos transgênicos não humanos com transgenes que codificam pelo menos um segmento do lócus de imunoglobulina humana, e um lócus de imunoglobulina endógena ativada. Ver, por exemplo, WO 93/12227 e WO 91/10741. Os anticorpos humanos podem ser selecionados por experimentos de ligação competitiva, ou ao contrário, por apresentar a mesma especificidade de epítopo como um anticorpo particular de camundongo. Tais anticorpos mantêm em geral as propriedades funcionais utilizáveis dos anticorpos de camundongo. Os anticorpos policlonais humanos também podem ser fornecidos na forma de soro, a partir de humanos imunizados com um agente imunogênico. Opcionalmente, tais anticorpos policlonais podem ser concentrados por purificação por afinidade, usando ADDLs como um reagente de afinidade.

[0063] Da maneira aqui exemplificada, os anticorpos humanizados também podem ser produzidos revestindo ou recompondo a superfície de anticorpos murinos. O revestimento envolve substituir apenas os aminoácidos de região fixa na superfície, das regiões variáveis pesadas e leves de camundongo, por aqueles de uma sequência homóloga de anticorpo humano. Substituir a superfície de aminoácidos de camundongo por resíduos humanos na mesma posição de uma sequência humana homóloga mostrou reduzir a imunogenicidade do anticorpo de camundongo, preservando ao mesmo tempo sua ligação ao ligante. A substituição de resíduos externos apresenta em geral pouco, ou nenhum, efeito nos domínios interiores, ou nos contatos interdomínios. Ver, por exemplo, patente U.S. 6.797.492.

[0064] Os anticorpos humanos ou humanizados podem ser determinados para apresentar regiões constantes de IgG, IgD, IgA, IgM ou IgE, e qualquer isotipo, incluindo IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Em modalidades particulares, um anticorpo da invenção é IgG ou IgM, ou uma combinação destes. Em uma modalidade específica, os anticorpos da presente invenção são IgG2. Os versados na técnica podem entender que outras isoformas podem ser utilizadas aqui. As sequências exemplares para estas isoformas são fornecidas em SEQ ID NOS: 43-45. Outras modalidades da presente invenção incluem uma região constante formada por incorporação seletiva de sequências de IgG4 humana em uma região constante de IgG2 humana padrão. Uma Fc de IgG2 mutante exemplar é IgG2m4, aqui apresentada como SEQ ID NO: 46. Os anticorpos podem ser expressos como tetrâmeros contendo duas cadeias leves e duas pesadas, como cadeia pesadas e cadeia leves separadas ou como anticorpos de cadeia única, em que os domínios variáveis de cadeia pesada e leve são ligados por meio de um espaçador. As técnicas para a produção de anticorpos de cadeia única são cem conhecidas na tecnologia.

[0065] Os anticorpos humanizados exemplares produzidos por enxertia e revestimento de CDR são revelados nas patentes U.S. 7.780.963, 7.731.962 e 7.811.563.

[0066] Os diacorpos também são contemplados. Um diacorpo refere- se a um construto de anticorpo geneticamente modificado, preparado isolando os domínios de ligação (tanto de cadeia pesada quanto leve) de um anticorpo de ligação, e fornecendo uma fração de ligação que une ou liga funcionalmente as cadeias pesadas e leves na mesma cadeia de polipeptídeo, conservando por meio disso a função de ligação (ver, Holiiger, et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444: Poliak, 1994. Structure 2:1121-1123). Isto forma, em essência, um anticorpo abreviado radicalmente, com apenas o domínio variável necessário para ligar o antígeno. Usando um ligador que é muito pequeno para permitir o pareamento entre os dois domínios na mesma cadeia, os domínios são forçados a parear com os domínios complementares de uma outra cadeia e criar dois sítios de ligação de antígeno. Estes fragmentos diméricos de anticorpo, ou diacorpos, são bivalentes e biespecíficos. Os versados na técnica entenderão que qualquer método para gerar os diacorpos pode ser usado. Os métodos adequados são descritos por Holiiger, et al., 1993, supra; Poljak, 1994, supra; Zhu, et al., 1996, Biotechnology 14:192-196, e na patente U.S. 6.492.123, que são aqui incorporados pela referência na sua íntegra.

[0067] Os fragmentos de um anticorpo isolado da invenção são também incluídos expressamente pela presente invenção. Pretende-se que os fragmentos incluam fragmentos Fab, fragmentos F(ab’)2, fragmentos F(ab’), fragmentos Fvsc biespecíficos, fragmentos Fv e fragmentos produzidos por uma biblioteca de expressão de Fab, bem como aptâmeros de peptídeo. Por exemplo, os fragmentos de F(ab’)2 são produzidos por digestão de pepsina da molécula de anticorpo da invenção, ao passo que os fragmentos de Fab são gerados reduzindo as pontes de dissulfeto dos fragmentos F(ab’)2. Alternativamente, as bibliotecas de expressão de Fab podem ser construídas para permitir a identificação rápida e fácil de fragmentos Fab monoclonais com a especificidade desejada (ver, Huse, et al., 1989, Science, 254: 12751281). Em modalidades particulares, os fragmentos de anticorpo da presente invenção são fragmentos de anticorpos neutralizantes que mantêm o sítio de ligação da região variável destes, isto é, fragmento de ligação ao antígeno. Os exemplos são fragmentos F(ab’)2, fragmentos F(ab’) e fragmentos Fab. Ver, em geral, Immunology: Basic Processes, 1985, 2a edição, J. Bellanti (Ed.) pp. 95-97.

[0068] Os aptâmeros peptídicos que reconhecem de maneira diferente as conformações multidimensionais de ADDLs podem ser determinados racionalmente ou selecionados em uma biblioteca de aptâmeros (por exemplo, fornecida por Aptanomics SA, Lyon, França). Em geral, os aptâmeros peptídicos são moléculas de reconhecimento sintético cujo desenho baseia-se na estrutura de anticorpos. Os aptâmeros peptídicos consistem em uma alça de peptídeo variável, anexada a ambas as extremidades em um andaime de proteína. Esta restrição estrutural dupla aumenta muito a afinidade de ligação do aptâmero peptídico em níveis comparáveis àqueles de um anticorpo (faixa nanomolar).

[0069] As sequências de ácido nucleico exemplares que codificam as regiões variáveis de cadeia pesada e leve para uso na produção de anticorpo e fragmentos de anticorpo da presente invenção são aqui reveladas em SEQ ID NOS: 14 e 16. Da maneira a ser entendida pelos versados na técnica, as regiões variáveis de cadeia pesada aqui reveladas, tais como aquelas mostradas em SEQ ID NO: 16, podem ser usadas em combinação com qualquer uma das regiões variáveis de cadeia leve aqui reveladas para gerar anticorpos com afinidades modificadas, dissociação, epítopos e similares.

[0070] Anticorpos ou fragmentos de anticorpo da presente invenção podem apresentar frações adicionais anexadas a estes. Por exemplo, uma microesfera ou micropartícula pode ser anexada ao anticorpo ou fragmento de anticorpo, da maneira descrita na patente U.S. 4.493.825, cuja revelação é aqui incorporada pela referência na sua íntegra.

[0071] Além do mais, a modalidade particular inclui anticorpo ou fragmentos de anticorpo que são mutados e selecionados para melhor afinidade de antígeno, atividade de neutralização (isto é, a capacidade de bloquear a ligação de ADDLs às células neuronais, ou a capacidade de bloquear a montagem de ADDL), ou uma constante de dissociação modificada. As cepas mutantes de E. coli (Low, et al., 1996, J. Mol. Biol, 260:359-368), seleção de cadeia (Figini, et al., 1994, supra), e mutagênese por PCR são métodos estabelecidos para mutar as moléculas de ácido nucleico que codificam os anticorpos. A título de ilustração, a melhor afinidade pode ser selecionada colocando um grande número de anticorpos de fago em contato com uma pequena quantidade de antígeno biotinilado, de maneira tal que os anticorpos possam competir por ligação. Neste caso, o número de moléculas de antígeno pode exceder o número de fago anticorpos, mas a concentração de antígeno pode estar um pouco abaixo da constante de dissociação. Assim, os anticorpos de fago predominantemente mutados com melhor afinidade se ligam ao antígeno biotinilado, enquanto a maior parte dos anticorpos de fago com afinidade mais fraca permanece não ligada. A estreptavidina pode auxiliar então no enriquecimento dos anticorpos mutados de fago e com melhor afinidade a partir da mistura (Schier, et al., 1996, J. Mol. Biol. 255:28-43). As sequências de aminoácidos de CDR3 de cadeia leve com afinidade maturada exemplares são aqui reveladas (ver tabela 4), com modalidades particulares incluindo uma sequência de aminoácidos CDR3 de cadeia leve de SEQ ID NO: 3 e as modalidades específicas de SEQ ID NOS: 7-13. A presente invenção também inclui variações alternativas para CDR1 (SEQ ID NO: 53) e CDR2 (SEQ ID NO: 54) de cadeia leve.

[0072] Para algumas aplicações terapêuticas, pode ser desejável reduzir a dissociação do anticorpo a partir do antígeno. Para atingir isto, os anticorpos de fago são ligados ao antígeno biotinilado e um excesso de antígeno não biotinilado é adicionado. Após um período de tempo, predominantemente, os anticorpos de fago com a menor constante de dissociação podem ser coletados com estreptavidina (Hawkins, et al., 1992, J. Mol. Biol 226:889-96).

[0073] Vários imunoensaios, incluindo aqueles aqui revelados, podem ser usados na seleção para identificar anticorpos, ou fragmentos destes, com a especificidade desejada para as conformações multidimensionais de ADDLs. Vários protocolos para ligação competitiva (por exemplo, ELISA), ensaios de aglutinação do látex, ensaio imunorradiométrico, cinética (por exemplo, análise Biacore™) que usa tanto anticorpos policlonais quanto monoclonais, ou fragmentos destes, são bem conhecidos na técnica. Tais imunoensaios envolvem tipicamente a medição da formação de complexo entre um anticorpo específico e seu antígeno cognato. Um imunoensaio com base monoclonal e dois sítios, que utiliza anticorpos monoclonais reativos para dois epítopos não interferentes, é adequado, mas um ensaio de ligação competitiva também pode ser empregado. Tais ensaios também podem ser usados na detecção de conformações multidimensionais de ADDLs em uma amostra.

[0074] Um anticorpo ou fragmento de anticorpo também pode ser submetido a outros ensaios de atividade biológica, por exemplo, deslocamento da ligação de ADDL aos neurônios ou às células hipocampais cultivadas, ou o bloqueio da montagem de ADDL, a fim de avaliar a atividade de neutralização ou farmacológica e a eficiência potencial como um agente profilático ou terapêutico. Tais ensaios são aqui descritos e são bem conhecidos na técnica.

[0075] Os anticorpos e fragmentos de anticorpos podem ser produzidos e mantidos como hibridomas ou, alternativamente, produzidos de maneira recombinante em qualquer sistema de expressão bem estabelecido incluindo, mas sem limitação, E. coli, levedura (por exemplo, Saccharomyces spp. e Pichia spp.), baculovírus, células de mamífero (por exemplo, mieloma, CHO, COS), plantas, ou animais transgênicos (Breitling e Dilbel, 1999, Recombinant Antibodies, John Wiley & Sons, Inc., NY, pp. 119-132). Os anticorpos e fragmentos de anticorpos podem ser isolados usando qualquer dos métodos apropriados incluindo, mas sem limitação, cromatografia por afinidade, moléculas de ligação de imunoglobulinas (por exemplo, proteínas A, L, G ou H), etiquetas funcionalmente ligadas ao anticorpo ou fragmento de anticorpo (por exemplo, etiqueta His, etiqueta FLAG®-3, etiqueta Strep, etiqueta c-myc) e similares. Ver, Breitling e Diibel, 1999 supra.

[0076] Os anticorpos e fragmentos de anticorpo da presente invenção apresentam uma variedade de usos, incluindo o diagnóstico de doenças associadas ao acúmulo de ADDLs, bloqueio ou inibição da ligação de ADDLs às células neuronais, bloqueio da montagem de ADDL, tratamento profilático ou terapêutico de uma doença associada aos ADDLs, identificação de agentes terapêuticos que previnem a ligação de ADDLs aos neurônios, e prevenção da fosforilação de proteína Tau em Ser202/Thr205.

[0077] O anticorpo e os fragmentos de anticorpo da presente invenção são usados em um método para bloquear ou inibir a ligação de ADDLs às células neuronais. Este método da invenção é realizado colocando um neurônio, in vitro ou in vivo, em contato com um anticorpo ou fragmento de anticorpo da presente invenção, de maneira tal que a ligação de ADDLs ao neurônio seja bloqueada. Em modalidades particulares, um anticorpo ou fragmento de anticorpo da presente invenção atinge pelo menos uma diminuição de 15 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, ou 97 % na ligação de ADDLs, comparada à ligação de ADDLs na ausência do anticorpo ou fragmento de anticorpo. O grau no qual um anticorpo pode bloquear a ligação de ADDLs a um neurônio pode ser determinado de acordo com os métodos aqui revelados, isto é, imunocitoquímica, ou ensaio de fosfatase alcalina a base de célula, ou qualquer outro ensaio adequado. Os anticorpos particularmente usados para diminuir a ligação de ADDLs às células neuronais incluem os anticorpos anti- ADDL exemplares mostrados nas patetes U.S. 7.731.962, 7.780.963 e 7.811.563, bem como derivados e fragmentos destes.

[0078] O anticorpo e os fragmentos de anticorpo da presente invenção são usados adicionalmente em um método para bloquear ou inibir a montagem de ADDLs. Este método envolve colocar uma amostra contendo peptídeos β amiloide 1-42 em contato com um anticorpo ou fragmento de anticorpo da presente invenção, de maneira tal que a montagem de ADDL seja inibida. O grau no qual um anticorpo pode bloquear a montagem de ADDLs pode ser determinado de acordo com os métodos aqui revelados, isto é, FRET ou polarização por fluorescência ou qualquer outro ensaio adequado. Os anticorpos particularmente usados para bloquear a montagem de ADDLs incluem anticorpos anti-ADDL com uma sequência de aminoácidos CDR3 apresentada em SEQ ID NO: 10, bem como derivados e fragmentos destes.

[0079] Os anticorpos aqui revelados também são usados em métodos para prevenir a fosforilação de proteína Tau em Ser202/Thr205. Este método envolve colocar uma amostra contendo proteína Tau em contato com um anticorpo ou fragmento de anticorpo da presente invenção, de maneira tal que ligação de ADDLs aos neurônios seja bloqueada, prevenindo por meio disso a fosforilação de proteína Tau. O grau no qual um anticorpo pode prevenir a fosforilação de proteína Tau em Ser202/Thr205 pode ser determinado de acordo com os métodos aqui revelados ou qualquer outro ensaio adequado.

[0080] Bloquear ou diminuir a ligação de ADDLs aos neurônios, inibir a montagem de ADDLs, e prevenir a fosforilação de proteína Tau em Ser202/Thr205 são todos observados nas aplicações em métodos de tratar profilaticamente ou terapeuticamente uma doença associada ao acúmulo de ADDLs. Dessa maneira, a presente invenção também inclui o uso de um anticorpo ou fragmento de anticorpo aqui para prevenir ou tratar uma doença associada ao acúmulo de ADDLs (por exemplo, doença de Alzheimer ou distúrbios similares relacionados à memória). A evidência na técnica indica que os níveis elevados de Aβ, mas não necessariamente as placas agregadas, causam demência associada à doença de Alzheimer e subsequente anormalidades na Tau. Os ligantes difusíveis derivados de Aβ são implicados diretamente na neurotoxicidade associada à doença de Alzheimer. A técnica indica que os ADDLs são elevados em camundongos transgênicos e pacientes com doença de Alzheimer, e modulam a atividade funcional associada aos processos mnemônicos em modelos animais. Assim, remover esta forma de Aβ pode fornecer auxílio com a neurotoxicidade associada à doença de Alzheimer. Como tal, o tratamento com um anticorpo da presente invenção que reduz a carga de ADDL no sistema nervoso central pode comprovar eficiência no tratamento de doença de Alzheimer. Os pacientes receptivos ao tratamento incluem indivíduos em risco de doença, mas que não exibem sintomas, bem como pacientes que exibem atualmente os sintomas. No caso de doença de Alzheimer, quase todos apresentam risco de sofrer da doença de Alzheimer se ele ou ela viverem tempo suficiente. Portanto, o anticorpo ou fragmentos de anticorpo da presente invenção podem ser administrados profilaticamente à população geral, sem a necessidade de qualquer avaliação de risco do paciente em questão. Os presentes métodos são usados especialmente para individuas que apresentam um risco genético conhecido de doença de Alzheimer. Tais indivíduos incluem aqueles com parentes que foram diagnosticados com a doença, e aqueles cujo risco é determinado por análise de marcadores genéticos ou bioquímicos. Os marcadores genéticos de risco para a doença de Alzheimer incluem as mutações no gene APP, particularmente as mutações na posição 717 e posições 670 e 671, referidas como as mutações Hardy e Swedish respectivamente. Outros marcadores de risco são as mutações nos genes de presenilina, PS1 e PS2, e ApoE4, histórico familiar de doença de Alzheimer, hipercolesterolemia ou aterosclerose. Os indivíduos que sofrem atualmente de doença de Alzheimer podem ser reconhecidos a partir das características de demência, bem como a presença de fatores de descritos anteriormente. Além disso, inúmeros testes de diagnóstico são disponíveis para identificar indivíduos que apresentam a doença de Alzheimer. Estes incluem medição dos níveis de CSF tau e Aβ1- 42. Os indivíduos que sofrem de doença de Alzheimer também podem ser diagnosticados pelos critérios ADRDA ou pelo método aqui revelado.

[0081] Em pacientes assintomáticos, tratamento pode começar em qualquer idade (por exemplo, 10, 20, 30 anos de idade). Entretanto, em geral não é necessário começar o tratamento até que um paciente atinja 40, 50, 60 ou 70 anos de idade. O tratamento inclui tipicamente dosagens múltiplas por um período de tempo. O tratamento pode ser monitorado ensaiando a presença de ADDLs com o tempo.

[0082] Nas aplicações terapêuticas, uma composição farmacêutica, ou medicamento contendo um anticorpo ou fragmento de anticorpo da invenção, é administrado ao um paciente suspeito, ou que já sofre, de uma doença como esta associada ao acúmulo de ADDLs em uma quantidade suficiente para curar, ou pelo menos diminuir parcialmente, os sintomas da doença (bioquímicos, histológicos e/ou comportamentais), incluindo suas complicações e fenótipos patológicos intermediários no desenvolvimento da doença. Em aplicações profiláticas, uma composição de produto farmacêutico, ou medicamento contendo um anticorpo ou fragmento de anticorpo da invenção, é administrada a um paciente susceptível a, ou de outra forma em risco de, uma doença associada ao acúmulo de ADDLs em uma quantidade suficiente para atingir a imunidade passiva no paciente, eliminando ou reduzindo por meio disso o risco, diminuindo a gravidade, ou retardando o início da doença, incluindo os sintomas bioquímicos, histológicos e/ou comportamentais da doença, suas complicações e fenótipos patológicos intermediários presentes durante o desenvolvimento da doença. Em alguns métodos, a administração de agente reduz ou elimina a deficiência miocognitiva em pacientes que ainda não desenvolveram as características da patologia de Alzheimer. Em modalidades particulares, uma quantidade eficiente de um anticorpo ou fragmento de anticorpo da invenção é uma quantidade que atinge pelo menos uma diminuição de 15 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, ou 97 % na ligação de ADDLs aos neurônios no paciente, comparado à ligação de ADDLs na ausência de tratamento. Como tal, o dano na potenciação de longo prazo/formação da memória é menor.

[0083] As doses eficientes das composições da presente invenção, para o tratamento das condições descritas anteriormente, podem variar dependendo de muitos fatores diferentes, incluindo meios de administração, estado fisiológico do paciente, quer o paciente seja humano ou um animal, outras medicações administradas, e quer o tratamento seja profilático ou terapêutico. Em geral, o paciente é um humano, mas os mamíferos não humanos, tais como cachorros ou mamíferos transgênicos, também podem ser tratados.

[0084] As dosagens de tratamento são tituladas em geral para otimizar a segurança e eficiência. Para a imunização passiva com um anticorpo ou fragmento de anticorpo, as dosagens que variam de cerca de 0,0001 a 100 mg/kg, e mais em geral de 0,01 a 5 mg/kg, do peso corporal do hospedeiro são adequadas. Por exemplo, as dosagens podem ser 1 mg/kg de peso corporal ou 10 mg/kg de peso corporal, ou estar na faixa de 1-10 mg/kg. Em alguns métodos, dois ou mais anticorpos da invenção com diferentes especificidades de ligação são administrados simultaneamente, em que no caso a dosagem de cada anticorpo administrado está nas faixas indicadas. Os anticorpos são administrados em geral em ocasiões múltiplas, em que os intervalos entre as dosagens únicas podem ser semanais, mensais ou anuais. Um regime de tratamento exemplar inclui a dosagem subcutânea, uma vez a duas semanas ou mensalmente. Os intervalos também podem ser irregulares, da maneira indicada medindo os níveis sanguíneos de anticorpo para ADDLs no paciente. Em alguns métodos, a dosagem é ajustada para atingir uma concentração de anticorpo no plasma de 1-1.000 μg/mL e em alguns métodos de 25-300 μg/mL. Alternativamente, o anticorpo ou fragmento de anticorpo pode ser administrado como uma formulação de liberação contínua, em que no caso a administração menos frequente é exigida. A dosagem e frequência variam dependendo da meia vida do anticorpo no paciente. Em geral, os anticorpos humanos e humanizados apresentam meias vidas mais longas do que os anticorpos quiméricos e os anticorpos não humanos. Da maneira indicada anteriormente, a dosagem e frequência de administração podem variar dependendo se o tratamento é profilático ou terapêutico. Em aplicações profiláticas, uma dosagem relativamente baixa é administrada em intervalos relativamente infrequentes por um período de tempo longo. Alguns pacientes continuam a receber tratamento pelo resto de suas vidas. Em aplicações terapêuticas, uma dosagem relativamente alta em intervalos relativamente curtos é exigida, algumas vezes, até que a progressão da doença seja reduzida ou finalizada e, preferivelmente, até que o paciente mostre melhora parcial ou completa dos sintomas da doença. A seguir, um regime profilático pode ser administrado ao paciente.

[0085] O anticorpo e os fragmentos de anticorpo da presente invenção podem ser administrados como um componente de uma composição farmacêutica ou medicamento. As composições farmacêuticas ou medicamentos contêm, em geral, o agente terapêutico ativo e uma variedade de outros componentes farmaceuticamente aceitáveis. Ver, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Alfonso R. Gennaro, editor, 20a ed. Lippincott Williams & Wilkins: Filadélfia, PA, 2000. A forma preferida depende do modo de administração e aplicação terapêutica pretendidos. As composições farmacêuticas podem conter, dependendo da formulação desejada, carreadores ou diluentes não tóxicos farmaceuticamente aceitáveis, que são definidos como veículos comumente usados para formular composições farmacêuticas para a administração animal ou humana. Os diluentes são selecionados de maneira a não afetar a atividade biológica da combinação. Exemplos de tais diluentes são água destilada, salina fisiológica tamponada com fosfato, soluções de Ringer, solução de dextrose e solução de Hank.

[0086] As composições do produto farmacêutico também podem conter macromoléculas grandes e que são metabolizadas lentamente, tais como proteínas, polissacarídeos tais como quitosana, ácidos poliláticos, ácidos poliglicólicos e copolímeros (tais como SEPHAROSE™ funcionalizado com látex, agarose, celulose e similares), aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácido e agregados de lipídeo (tais como gotas de óleo ou lipossomos).

[0087] A administração de uma composição farmacêutica ou medicamento da invenção pode ser realizada em uma variedade de vias incluindo, mas sem limitação, oral, tópica, pulmonar, retal, subcutânea, intradérmica, intranasal, intracraniana, intramuscular, intraocular, ou injeção intratecal ou intra-articular e similares. A via de administração mais comum é a intravenosa seguida por subcutânea, embora outras vias possam ser igualmente eficientes. A injeção intramuscular também pode ser realizada nos músculos do braço ou perna. Em alguns métodos, os agentes são injetados diretamente em um tecido particular onde os depósitos se acumulam, por exemplo, injeção intracraniana ou intratecal. Em algumas modalidades, um anticorpo ou fragmento de anticorpo é injetado diretamente no crânio ou CSF. Em outras modalidades, o anticorpo ou fragmento de anticorpo é administrado como uma composição ou dispositivo de liberação contínua, tal como um dispositivo MEDIPAD™.

[0088] Para a administração parenteral, o anticorpo ou fragmentos de anticorpo da invenção podem ser administrados como dosagens injetáveis de uma solução ou suspensão da substância, em um diluente fisiologicamente aceitável com um carreador farmacêutico que pode ser um líquido estéril tal como água, óleos, salina, glicerol ou etanol. Adicionalmente, as substâncias auxiliares, tais como agentes de umectação ou emulsificantes, agentes tensoativos, substâncias de tamponamento de pH e similares, podem estar presentes nas composições. Outros componentes de composições farmacêuticas são aqueles de origem de petróleo, animal, vegetal ou sintéticos, por exemplo, óleo de amendoim, óleo de soja e óleo mineral. Em geral, os glicóis tal como propileno glicol ou polietileno glicol são carreadores líquidos adequados, particularmente para as soluções injetáveis. Os anticorpos podem ser administrados na forma de uma injeção de depósito ou preparação de implante, que pode ser formulada de uma maneira tal que permita uma liberação contínua do ingrediente ativo.

[0089] Uma composição exemplar contém um anticorpo isolado, ou fragmento de anticorpo deste, da presente invenção formulada como um líquido claro e estéril, em uma concentração de pelo menos 10 mg/mL em salina isotônica tamponada (histidina 10 mM, cloreto de sódio 150 mM, 0,01 % (p/v) de POLISORBATO 80, pH 6,0). Uma formulação de anticorpo exemplar é preenchida como uma dose única, em frascos de vidro com 0,6 mL, preenchidos com 3,3 mL de solução por frasco. Cada frasco é tampado com uma rolha revestida de TEFLON e selado com uma tampa de alumínio.

[0090] De maneira típica, as composições são preparadas como injetáveis, tanto como soluções ou suspensões líquidas; as formas sólidas adequadas para solução, ou suspensão, em veículos líquidos antes da injeção também podem ser preparadas. A preparação também pode ser emulsificada ou encapsulada em lipossomos ou micropartículas, tais como polilactida, poliglicolida ou copolímero, para melhor distribuição.

[0091] Com relação aos supositórios, aglutinantes e carreadores, são incluídos, por exemplo, polialquileno glicóis ou triglicerídeos, tais supositórios podem ser formados a partir de misturas contendo o ingrediente ativo na faixa de 0,5 % a 10 %, ou mais desejavelmente l %-2 %.

[0092] As formulações orais incluem excipientes, tais como graus de farmacêuticos de manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina sódica, celulose e carbonato de magnésio. Estas composições obtêm a forma de soluções, suspensões, comprimidos, pílulas, cápsulas, formulações de liberação contínua ou pós, e contêm 10 %-95 % de ingrediente ativo, ou mais adequadamente 25 %-70 %.

[0093] A aplicação tópica pode resultar em distribuição transdérmica ou intradérmica. A administração tópica pode ser facilitada por coadministração do agente com toxina colérica ou derivados ou subunidades desintoxicados destes, ou outras toxinas bacterianas similares (ver Glenn, et al. (1998) Nature 391:851). A coadministração pode ser atingida usando os componentes como uma mistura ou como moléculas ligadas, obtidas por reticulação química ou expressão como uma proteína de fusão.

[0094] Alternativamente, a distribuição transdérmica pode ser atingida usando um adesivo de pele ou usando transferossomas (Paul, et al., 1995, Eur. J. Immunol. 25:3521-3524; Cevc, et al., 1998, Biochem. Biophvs. Acta 1368:201-215).

[0095] Um anticorpo ou fragmento de anticorpo da invenção pode ser opcionalmente administrado em combinação com outros agentes que são pelo menos parcialmente eficientes no tratamento da doença amiloidogênica. Por exemplo, o presente anticorpo pode ser administrado com tratamentos paliativos existentes para a doença de Alzheimer, tal como inibidores de acetilcolinesterase tais como ARICEPT™, EXELON™ e REMI YL™, e o antagonista de NMDA, NAMENDA™. Além destes tratamentos aprovados, o presente anticorpo pode ser usado para fornecer benefícios sinergísticos/aditivos para qualquer das várias abordagens atualmente em desenvolvimento para o tratamento de doença de Alzheimer, que incluem sem limitação, inibidores da produção e agregação de Aβ.

[0096] O anticorpo e os fragmentos de anticorpo da presente invenção também podem ser aplicados na identificação de agentes terapêuticos que previnem a ligação de ADDLs aos neurônios (por exemplo, uma célula hipocampal), prevenindo por meio disso os eventos à jusante atribuídos aos ADDLs. Um ensaio como este é realizado colocando um neurônio em contato com os ADDLs na presença de um agente, e usando um anticorpo do fragmento de anticorpo da invenção para determinar a ligação dos ADDLs ao neurônio na presença do agente. De maneira a ser entendida pelos versados na técnica, um agente que bloqueia a ligação de ADDLs a um neurônio diminuirá a quantidade de ADDLs ligados ao neurônio, comparado a um neurônio que não foi colocado em contato com o agente, em uma quantidade que é detectável em um imunoensaio que emprega um anticorpo ou fragmento de anticorpo da presente invenção. Os imunoensaios adequados para detectar ADDLs ligados às células neuronais são aqui revelados.

[0097] Os agentes que podem ser selecionados usando o método aqui fornecido incluem várias classes químicas, embora sejam tipicamente moléculas orgânicas, preferivelmente compostos orgânicos pequenos com um peso molecular de mais de 100 e menos de cerca de 2.500 daltons. Os agentes incluem grupos funcionais necessários para a interação estrutural com proteínas, particularmente ligação de hidrogênio, e incluem tipicamente pelo menos um grupo amina, carbonila, hidroxila ou carboxila, preferivelmente pelo menos dois dos grupos químicos funcionais. Os agentes contêm frequentemente estruturas de carbono cíclico ou heterocíclico, e/ou estruturas aromáticas ou poliaromáticas substituídas por um ou mais dos grupos funcionais anteriores. Os agentes também podem ser encontrados entre as biomoléculas, incluindo peptídeos, anticorpos, sacarídeos, ácidos graxos, esteroides, purinas, pirimidinas, derivados, análogos estruturais ou combinações destes. Os agentes são obtidos de uma ampla variedade de fontes, incluindo bibliotecas de compostos naturais ou sintéticos.

[0098] Uma variedade de outros reagentes, tais como sais e proteínas neutras pode ser incluída nos ensaios de seleção. Igualmente, os reagentes que melhoram de outra forma a eficácia do ensaio, tais como inibidores de protease, inibidores de nuclease, agentes antimicrobianos e similares, podem ser usados. A mistura de componentes pode ser adicionada em qualquer ordem que forneça a ligação exigida.

[0099] Os agentes identificados pelo ensaio de seleção da presente invenção serão benéficos para o tratamento de doenças amiloidogênicas e/ou tauopatias. Além disso, contempla-se que os sistemas experimentais usados para exemplificar estes conceitos representam ferramentas de pesquisa para a avaliação, identificação e seleção de alvos de medicamento inédito, associado com a indução de beta amiloide indução na fosforilação da Tau.

[00100] A presente invenção também fornece métodos para detectar ADDLs e diagnosticar uma doença associada ao acúmulo de ADDLs, usando aqui um anticorpo ou fragmento de anticorpo. Pretende-se que uma doença associada ao acúmulo de ADDLs inclua qualquer doença na qual o acúmulo de ADDLs resulte em dano fisiológico da potenciação de longo prazo/formação da memória. As doenças deste tipo incluem, mas sem limitação, doença de Alzheimer e distúrbios similares relacionados à memória.

[00101] De acordo com estes métodos, uma amostra de um paciente é colocada em contato com um anticorpo ou fragmento de anticorpo da invenção, e a ligação do anticorpo ou fragmento de anticorpo na amostra é indicativo da presença de ADDLs na amostra. Da maneira usada no contexto da presente invenção, pretende-se que uma amostra signifique qualquer fluido ou tecido que é propensa a análise usando imunoensaios. As amostras adequadas que podem ser analisadas de acordo com os métodos da invenção incluem, mas sem limitação, amostras de biópsia e amostras de fluido do cérebro de um paciente (por exemplo, um mamífero tal como um humano). Com propósitos in vitro (por exemplo, em ensaios que monitoram a formação de oligômero), uma amostra pode ser uma linhagem celular neural ou amostra tecidual. Com propósitos de diagnósticos, contempla-se que a amostra pode ser de um indivíduo suspeito de apresentar uma doença associada ao acúmulo de ADDLs ou de um indivíduo em risco de apresentar uma doença associada ao acúmulo de ADDLs, por exemplo, um indivíduo com um histórico familiar que predispõe o indivíduo a uma doença associada ao acúmulo de ADDLs.

[00102] A detecção de ligação do anticorpo ou fragmento de anticorpo aos ADDLs na amostra pode ser realizada usando qualquer imunoensaio padrão (por exemplo, da maneira aqui revelada), ou alternativamente quando o fragmento de anticorpo é, por exemplo, um aptâmero peptídico, a ligação pode ser detectada diretamente, por exemplo, por um marcador proteico detectável (por exemplo, β-galactosidase, GFP ou luciferase) fundido ao aptâmero. Subsequentemente, a presença ou ausência do complexo ADDL- anticorpo está correlacionada à presença ou ausência, respectivamente, de ADDLs na amostra e, portanto, à presença ou ausência, respectivamente, de uma doença associada ao acúmulo de ADDLs. Contempla-se que um ou mais anticorpos ou fragmentos de anticorpo da presente invenção podem ser usados junto com técnicas de formação de imagem, baseadas em imuno não invasivas atuais, para melhorar muito a detecção e o diagnóstico precoce de uma doença associada ao acúmulo de ADDLs.

[00103] Para facilitar o diagnóstico, a presente invenção também diz respeito aqui a um kit contendo um anticorpo ou fragmento de anticorpo. O kit inclui um recipiente que contém um ou mais anticorpos ou fragmentos de anticorpo, que reconhecem a conformação multidimensional de ADDLs, e instruções para usar o anticorpo, com o propósito de ligação aos ADDLs para formar um complexo anticorpo-antígeno e detectar a formação do complexo anticorpo-antígeno, de maneira tal que a presença ou ausência do complexo anticorpo-antígeno correlaciona-se com a presença ou ausência de ADDLs na amostra. Os exemplos de recipientes incluem placas multipoços que permitem a detecção simultânea de ADDLs em amostras múltiplas.

[00104] Todas as referências aqui citadas são aqui incorporadas pela referência na sua íntegra.

[00105] A invenção é descrita em maiores detalhes pelos exemplos não limitantes a seguir. EXEMPLOS

[00106] As seguintes abreviações são aqui usadas: Ab: anticorpo; Aβ: proteína beta amiloide; AD: doença de Alzheimer; ADDL: ligante difusível derivado de β-amiloide (Aβ); Ag: antígeno; APP: proteína precursora de amiloide; bADDLs: ADDLs biotinilados; CSF: fluido cerebroespinhal; DMSO: dimetil sulfóxido; hAPP: proteína precursora amiloide humana; meio HAT: meio de hipoxantina-aminopterina-timidina; HFIP: hexafluor-2- propanol; IV: intravenoso; ágar LB: ágar de caldo lisogênico; SC: subcutâneo; PBS: salina tamponada com fosfato; TEA: trietilamina. Exemplo 1 Materiais e métodos gerais A. Geração de anticorpos monoclonais ADDL

[00107] Os oligômeros Aβ solúveis, uma espécie que é referida aqui como ADDLs “sintéticos”, foram misturados 1:1 com adjuvante completo de Freund (primeira e segunda vacinação) ou adjuvante incompleto de Freund (todas as vacinações subsequentes), e foram fornecidos por injeção subcutânea (primeiras duas vacinações) ou intraperitoneal em três camundongos, em um volume total de 1 mL/camundongo. Cada injeção consistiu em ADDLs purificados, equivalente a 194 ± 25 μg de proteína total. Os camundongos foram injetados aproximadamente a cada três semanas. Após seis injeções, um camundongo morreu e seu baço foi congelado. O baço do camundongo com a titulação sérica mais elevada foi então fundido com células de mieloma SP2/0 na presença de polietileno glicol e plaqueado em placas de 96 poços. As células foram cultivadas a 37°C com 5 % de CO2 por 10 dias, em 200 μL de meio de seleção de hipoxantina-aminopterina- timidinae (HAT), que é composto de um meio sintético enriquecido, tal como meio de Dulbecco modificado por Iscove (IMDM) (Sigma- Aldrich, St. Louis, MO) suplementado com 10 % de soro bovino fetal (FBS), 1 μg mL de HYBRI-MAX® (azaserina-hipoxantina; Sigma-Aldrich, MO), e 30 % de meio condicionado coletado a partir de cultura de célula SP2/0. As culturas foram alimentadas uma vez com IMDM (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) suplementado com 10 % de FBS no dia 10, e o sobrenadante das culturas foi removido no dia 14 para selecionar poços positivos em ELISA. As culturas positivas foram clonadas adicionalmente limitando as diluições com a probabilidade de 0,3 células por poço. Os clones positivos foram confirmados em ELISA e expandidos adicionalmente. Os anticorpos monoclonais foram então produzidos e purificados para uso (QED Bioscience, San Diego, CA). B. Preparação de ADDLs e bADDLs

[00108] Os ADDLs foram preparados usando métodos previamente descritos (Hepler, et al., 2006, Biochemistry, 45: 15157-15167; Shughrue, et al.. 2010, Neurobiol. Aging, 31: 189-202). Resumidamente, o peptídeo sintético Aβ1-42 (American Peptide, Sunnyvale, CA) foi dissolvido em hexafluoro-2-propanol (HFIP) em uma concentração de 10 mg/mL, e incubado em temperatura ambiente (T) por uma hora. A solução de peptídeo foi dispensada em alíquotas de 50 μL em tubos para microcentrífuga de polipropileno de 1,5 mL. O HFIP foi removido usando um SpeedVac® (Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA), e os filmes de peptídeo resultante foram armazenados e dissecados a -70°C até a utilização. Um filme de 0,5 mg de HFIP seco foi dissolvido em 22 μL de dimetil sulfóxido anidro (DMSO) com agitação, por 10 minutos, em um misturador do tipo vórtex. Subsequentemente, 1 mL de meio Ham’s F12 gelado sem vermelho fenol (United Biosource, San Francisco, CA) foi adicionado rapidamente à mistura DMSO/peptídeo. O tubo foi tampado, invertido para garantir a mistura completa e incubado por toda a noite a 4°C. Na manhã seguinte, as amostras foram centrifugadas por dez minutos a 12.000 x g em uma microcentrífuga Beckman (Beckman Coulter, Brea, CA) operada a 2-8°C. O sobrenadante foi coletado e filtrado por meio de filtro para centrífuga ym 50 (corte molecular de 50.000 kDa) Centricon® (Millipore, Billerica, MA) para enriquecer a espécie oligomérica. Os ADDLs biotinilados (bADDLs) foram preparados usando os mesmos métodos, mas iniciando com peptídeo Aβ 1-42 biotinilado N-terminal (American Peptide, Sunnyvale, CA). C. Preparações de monômero e fibrila

[00109] Para gerar as preparações de monômero, RT Aβ1-40 ou o filme de peptídeo Aβ1-42 foi dissolvido em 2 mL de tampão borato 25 nM (pH 8,5) por mg de peptídeo, dividido em alíquotas, e congelado a -70°C até ser utilizado. As preparações de fibrila foram realizadas adicionando 2 mL de ácido clorídrico 10 mM por mg de filme de peptídeo Aβ1-42. A solução foi misturada em um misturador do tipo vórtex na menor velocidade possível por cinco a dez minutos, e a preparação resultante foi armazenada a 37°C por 18 a 24 horas antes do uso. D. Neurônios primários

[00110] As culturas neuronais primárias foram preparadas a partir de tecidos hipocampais e/ou corticais de rato, obtidos da BrainBits (Springfield, IL). Após a dissociação, as células foram plaqueadas em uma placa de 96 poços com 35.000 células/poço, pré-revestida com laminina e poli-D-lisina (Corning Life Sciences, Lowell, MA). As células foram mantidas a 37°C com 5 % de CO2 em meio (Neurobasal suplementado com 2 % de B27, 1 % de L- glutamina, e 1 % de pen/estrep; Invitrogen, Carlsbad, CA) por duas a três semanas, e então usadas para estudos de ligação. E. Ensaio de ligação de ADDL a base de célula

[00111] Para medir o efeito de anticorpos anti-ADDL no bloqueio de ligação de ADDL, os anticorpos anti-ADDL foram misturados com bADDLs 500nM, com as concentrações finais de anticorpo variando de 1,8 nM a 450 nM. Como um controle, a mesma concentração de anticorpo desnaturado pelo calor (98°C por 30 minutos) foi misturada com bADDLs. As misturas de anticorpo-bADDL foram incubadas em tubos de microcentrífuga siliconizados (Fischer Scientific, Pittsburgh, PA) a 37°C por uma hora com rotação constante final a final em uma velocidade baixa. As misturas foram então aplicadas às culturas hipocampais e/ou corticais primárias e incubadas a 37°C por uma hora. A incubação foi finalizada removendo o meio de cultura. As células foram então submetidas aos tratamentos de fixação e pós-fixação da maneira descrita anteriormente. As células foram então incubadas com estreptavidina conjugada com fosfato alcalino (AP) a 4°C por toda a noite, lavadas cinco vezes com PBS e reagidas com o substrato quimioluminescente Tropix® CDP®-Star (Life Technologies™, Carlsbad, CA) em temperatura ambiente por 30 minutos. A intensidade de ligação bADDL foi medida e registrada com um leitor de microplacas EnVision® (PerkinElmer, Waltham, MA). F. ELISA

[00112] Os ADDLs biotinilados (bADDLs), ou monômero Aβ1-40, ou Aβ1-42, foram adicionados a uma placa revestida de estreptavidina com capacidade elevada (Sigma- Aldrich, St. Louis, MO) com 100 μL, por poço, de reagente de revestimento em PBS 1 μM, e incubados por duas horas em temperatura ambiente. As placas foram lavadas em PBS com 0,05 % de Tween (seis vezes) e a seguir PBS sozinho (três vezes) antes de bloquear os poços com 5 % de leite em pó desnatado em PBS por uma hora em temperatura ambiente. Os poços foram então lavados e uma diluição seriada de amostras de anticorpo foi adicionada às placas, na qual ligou naturalmente por duas horas em temperatura ambiente. Após a incubação e lavagem, a ligação de anticorpo foi detectada com um anticorpo secundário IgG-Fc de cabra anti-humano conjugado com peroxidase de rábano silvestre (HRP) (1:1.000; uma hora em temperatura ambiente). A marca de HRP foi visualizada com tetrametil benzidina (Virolabs, Chantilly, VA) como um substrato e lida a 450 nm em um leitor de microplacas. Exemplo 2 Seleção de anticorpos anti-ADDL A. Biblioteca de anticorpo humanizado por aderência celular a uma superfície sólida

[00113] Uma biblioteca com afinidade madura de um anticorpo anti- ADDL humanizado, h3B3, (Ver, U.S. 2006/0228349 e U.S. 2008/0175835) foi construída, na qual parte das sequências de aminoácidos de CDR3 de cadeia leve foi submetida à mutagênese aleatória. Para atingir toda a região CDR3, duas sub-bibliotecas foram construídas. Uma biblioteca foi composta da região variável parental de cadeia pesada e aminoácidos mutados na metade esquerda da CDR3 de cadeia leve, e a outra na metade direita da CDR3 de cadeia leve. Uma estratégia similar foi usada para a mutagênese aleatória de CDRs de cadeia pesada com três sub-bibliotecas.

[00114] O 3B3 humanizado (h3B3) foi submetido à maturação da afinidade usando métodos conhecidos na técnica. As regiões variáveis de h3B3 foram clonadas em um vetor de exibição de Fab (pFab3D). Neste vetor, as regiões variáveis para cadeias pesadas e leves foram inseridas em alinhamento para combinar o domínio CHI da região constante e a região constante kappa, respectivamente. Em Fab3D, o epítopo myc e seis aminoácidos consecutivos de histidina acompanharam a sequência CHI, que é então ligada à proteína pill do fago para exibição. Todas as posições nas CDR3s de cadeia pesada e leve foram mutagenizadas aleatoriamente usando as sequências degeneradas de oligonucleotídeo construídas nos oligonucleotídeos iniciadores de PCR. Para adaptar o tamanho físico, as sub- bibliotecas foram construídas com cada uma focando em 5-6 aminoácidos. O vetor do DNA de humano 3B3 (H3B3) foi usado como DNA molde para amplificar tanto as cadeias pesadas quanto leves com os oligonucleotídeos iniciadores mutados de PCR (Tabela 1). Após a amplificação por PCR, os fragmentos de DNA sintetizados foram corridos em um gel de agarose a 1,3 %, os oligonucleotídeos iniciadores foram removidos e os fragmentos variáveis foram digeridos com enzimas de restrição: BsiWI e Xbal nos sítios de clonagem para clonagem variável de cadeia leve, Xhol e Apal para clonagem variável de cadeia pesada.

[00115] Para construir uma biblioteca de maturação da afinidade no vetor de exibição de fago pFab3D, o DNA pFab3D-3B3 foi digerido com o mesmo par de enzimas de restrição, purificado e os fragmentos de PCR para os variáveis de cadeia pesada e leve foram ligados com T4 ligase (Invitrogen) por toda a noite a 16°C. Os produtos de ligação foram então transfectados em células competentes para eletroporação de E. coli TG1 (Stratagene, Agilent Technologies, Santa Clara, CA), e as alíquotas da cultura bacteriana foi plaqueada em placas de ágar LB-carbenicilina (50 μg/mL) para titular o tamanho da biblioteca. As culturas restantes foram então plaqueadas em uma placa grande com carbenicilina e incubadas a 30°C por toda a noite para estoque de biblioteca de E. coli, ou infectadas com o fago auxiliar M13K07 (Invitrogen, Carlsbad, CA, 1011 pfu/mL) incubando em temperatura ambiente e a 37°C por dez minutos. A seguir, o meio 2YT com carbenicilina (50 g mL) foi adicionado e incubado a 37°C por uma hora com agitação. A canamicina (70 g mL) foi então adicionada e as culturas foram crescidas por toda a noite a 30°C com agitação. O sobrenadante da cultura de fago foi titulado e concentrado por precipitação com 20 % (v/v) de PEG (polietileno glicol)/NaCl, resuspenso em PBS, esterilizado com um filtro de 0,22 μm, e as alíquotas foram preparadas por aderência celular a uma superfície sólida da biblioteca de fago.

[00116] A aderência celular a uma superfície sólida da biblioteca de fago foi então conduzida da maneira resumida na tabela 2.

[00117] Os estímulos de fagos a partir das bibliotecas de fago que exibem Fab (100 μL, cerca de 1011-12 pfu) foram bloqueados com 900 μL de solução de bloqueio (3 % de leite em pó desnatado em PBS) para reduzir a ligação não específica na superfície do fago. As microesferas revestidas com estreptavidina foram preparadas coletando 200 μL da suspensão de microesfera em um separador magnético e removendo os sobrenadantes. As microesferas foram então suspensas em 1 mL de solução de bloqueio e colocadas em um misturador com rotação por 30 minutos. Para remover o fago com ligação não específica à estreptavidina, a biblioteca de fago bloqueado foi misturada com as microesferas bloqueadas revestidas com estreptavidina e colocados em um misturador com rotação por trinta minutos. As suspensões de fago a partir do processo de desseleção foram transferidas para um novo tubo, e 200 μL de antígeno, 10 % de bADDL, foram adicionados e incubados por duas horas para a ligação de anticorpo e antígeno. Após a incubação, a mistura foi adicionada nas microesferas bloqueadas revestidas com estreptavidina e incubada em um misturador com rotação por uma hora para capturar o complexo Ab/Ag nas microesferas de estreptavidina. As microesferas com 10 % de complexos de bADDL capturado/fago foram lavadas cinco vezes com PBS/0,05 % de Tween 20, e a seguir duas vezes apenas com PBS. Os fagos ligados foram então eluídos a partir do bADDL com 200 μL de TEA 100 mM (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) e incubados por vinte minutos. O fago eluído foi então transferido para um tubo de 50 mL, neutralizado com 100 μL de Tris-HCl 1M, pH 7,5, e adicionado a 10 mL de células de E. coli TG1 com uma OD 600 nm entre 0,6-0,8. Após a incubação a 37°C com agitação por uma hora, as alíquotas de cultura foram plaqueadas em placas de ágar LB-carbenicilina (50 μg mL) para titular o rendimento do número de fago, e as bactérias restantes foram centrifugadas e suspensas com 500 μL de meio 2xYT (Teknova, Hollister, CA), plaqueadas em placas de ágar YT para bioensaio (Teknova, Hollister, CA) contendo 100 μg/mL de ampicilina e 1 % de glicose. As placas de bioensaio foram crescidas por toda a noite a 30°C.

[00118] Após cada ciclo de aderência celular a uma superfície sólida, as colônias isoladas foram escolhidas aleatoriamente para produzir fago em placas de 96 poços. Os procedimentos para preparação de fago em placa de 96 poços foram similares àqueles descritos anteriormente, com a exceção de que nenhuma etapa de precipitação de fago foi usada. As placas de cultura contendo colônias crescidas em 120 μL de meio 2xTY, com 100 μg/mL de ampicilina e 0,1 % de glicose, foram incubadas por toda a noite em um agitador HiGro® (Genomic Solutions, Ann Arbor, MI) a 30°C com agitação em 450 rpm. Os sobrenadantes do fago (cerca de 100 μL) foram usados diretamente para análise na ligação de ADDL em ELISA descrita anteriormente. Uma diferença é que a ligação de fago aos ADDLs foi detectada com um anticorpo anti-M13 conjugado em HRP (Amersham Bioscience, GE Healthcare, Waukesha, WI). Exemplo 3 Identificação de anticorpos anti-ADDL

[00119] A partir das tentativas de maturação da afinidade da cadeia leve, um painel de sete clones mostrou atividades de ligação fortes com os ADDLs, quando comparado com h3B3 em um ELISA de fago/Fab (dados não mostrados). Os sete clones foram selecionados para a conversão em IgGs, e os anticorpos monoclonais foram produzidos e purificados para caracterização adicional. A. Seleção de anticorpo anti-ADDL

[00120] Após a aderência celular a uma superfície sólida e seleção da biblioteca descrita no exemplo 2, sete clones Fab principais (tabelas 3-5) foram selecionados para conversão de IgG. A tabela 3 mostra a similaridade de aminoácido com os clones selecionados a partir da biblioteca de maturação da afinidade cadeia leve, com relação ao anticorpo parental, h3B3. A tabela 4A resume o número de diferenças no aminoácido na CDR3 da cadeia leve dos clones selecionados, a partir da CDR3 da cadeia leve para o anticorpo parental, h3B3. A tabela 4B resume o número de diferenças no aminoácido na CDR1 da cadeia leve dos clones selecionados, a partir da CDR3 de cadeia leve para o parental anticorpo, 19.3. A tabela 4C resume o número de diferenças no aminoácido na CDR2 de cadeia leve dos clones selecionados, a partir da CDR3 de cadeia leve para o anticorpo parental, 19.3. A tabela 5 é um alinhamento de uma porção (posições 21-117) das regiões variáveis de cadeia leve para os clones selecionados e o anticorpo parental, h3B3. A CDR3 de cada clone é mostrada em negrito.

B. Conversão em IgG

[00121] Os IgGs convertidos podem ser expressos usando vetores a base de plasmídeo. Os vetores de expressão foram construídos de maneira tal que pudessem conter todos os componentes necessários, com a exceção das regiões variáveis. Nos vetores básicos, a expressão tanto de cadeias leves quanto pesadas foi direcionada pelo promotor humano CMV e pelo sinal de poliadenilação do hormônio de crescimento bovino. Para os sete clones selecionados para a conversão de IgG, a região variável de cadeia pesada foi fundida em alinhamento com uma região constante de cadeia pesada de IgG2 humana (SEQ ID NOS: 20 e 21), enquanto a região variável de cadeia leve foi fundida em alinhamento com a região constante de cadeia leve kappa (SEQ ID NOS: 18 e 19). As sequências principais pesadas (SEQ ID NOS: 29 e 30) e leves (SEQ ID NOS: 31 e 32), que medeiam a secreção dos anticorpos nos meios de cultura, também foram fundidas em alinhamento com as regiões variáveis dessa maneira. Para os vetores de expressão de cadeia pesada, a região constante pode ser selecionada a partir de um isotipo de subclasse diferente, por exemplo, IgG1 ou IgG2. Entre a sequência principal e a região constante, as sequências intergênicas contêm sequências de clonagem para a fusão em alinhamento contínua da nova região variável com a sequência principal em sua extremidade 5’, e a região constante em sua extremidade 3’, usando a estratégia de clonagem In-Fusion (Clontech, Mountain View, CA). Os kits de clonagem por PCR In-Fusion™ Dry-Down (Clontech, Mountain View, CA) foram usados para a amplificação por PCR das regiões variáveis. O kit de clonagem Dry-down contém todos os componentes necessários para a reação de PCR. Os oligonucleotídeos iniciadores para PCR e os DNAs molde foram adicionados. Os vetores de expressão carregam oriP a partir do genoma viral EBV. O par oriP/EBNA1 é frequentemente usado para prolongar a presença do vetor de expressão dentro das células transfectadas, e é amplamente usado para a extensão da duração da expressão (Lindner, et al., 2007, Plasmid 58:1-12) na expressão prolongada em células 293EBNA, nas sequências bacterianas para um marcador de seleção de canamicina, e em uma origem de replicação em E. coli. Quando as regiões variáveis foram inseridas, as IgGs foram expressam diretamente em células de mamífero. Todas as regiões variáveis de cadeia pesada aqui foram clonadas em um vetor de expressão IgG1 (pV1JNSA-BF-HCG1), e as regiões variáveis de cadeia leve foram clonadas em um vetor de expressão de alinhamento kappa ou lambda (pV1JNSA-GS-FB-LCK). C. Clonagem de anticorpo

[00122] O procedimento de clonagem para os vetores de expressão de anticorpo resultante foi da maneira a seguir. As regiões variáveis foram amplificadas por PCR, nas quais as reações de PCR foram realizadas em um volume de 25 μL contendo mistura principal de PCR de alta fidelidade, volume do molde 1 μL e oligonucleotídeos iniciadores sentido e reverso: 1 μL cada. As condições de PCR foram: 1 ciclo de 94°C, 2 minutos; 25 ciclos de 94°C, 1,5 minuto; 60°C, 1,5 minuto; 72°C, 1,5 minuto e 72°C, 7 minutos; 4°C até a remoção. Os produtos de PCR foram então digeridos com Dpnl e purificados com o kit QIAquick Plate (Qiagen, Venlo, Holanda). 100 ng dos vetores correspondentes de cadeia pesada ou cadeia leve linearizados previamente anelaram em 10 ng do fragmento de PCR com uma reação InFusion (Kit de clonagem IN-Fusion Dry-Down, Clontech, Mountain View, CA). A mistura da reação foi transformada em células competentes XL2 Blue MRF* e plaqueada por toda a noite em placas de ágar contendo 50 μg/mL de canamicina. Os construtos de cadeia leve foram digeridos com HindIII + NotI e os construtos de cadeia pesada foram digeridos com Aspl + HindIII para verificar a estrutura por análise de restrição. As sequências de DNA para todos os clones foram confirmadas por sequenciamento. D. Expressão de anticorpo em células de mamífero e purificação

[00123] O sequenciamento confirmou que os constructos de DNA de cadeia leve e cadeia pesada foram transfectados em células 293 Freestyle (Invitrogen, Carlsbad, CA). As células 293 Freestyle foram transfectadas usando transfectina 293 (Invitrogen, Carlsbad, CA). As células EBNA em monocamada foram transfectadas usando os reagentes de transfecção a base de PEI. As células transfectadas foram incubadas a 37°C/5 % de CO2 por sete dias em meio Opti-MEM sem soro (Invitrogen, Carlsbad, CA). O meio foi coletado, centrifugado, filtrado por meio de sistema de filtração de 0,22 μm (Millipore, Billerica, MA), e a seguir concentrado por um filtro de centrífuga Centricon® (Millipore, Billerica, MA). O meio concentrado foi misturado 1:1 com tampão de ligação (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL), e a seguir foi preenchido em coluna A/G pré-equilibrada com proteína (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL) ou HI trap rProtein A FF da GE Healthcare, Waukesha, WI. A coluna preenchida foi lavada com tampão de ligação e eluída com tampão de eluição (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL). O anticorpo eluído foi neutralizado imediatamente e dialisado contra o tampão PBS por toda a noite. O anticorpo dialisado foi concentrado com um filtro de centrífuga Amicon (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL) e a concentração de proteína foi determinada por OD280nm com o coeficiente de extinção de 1,34 mg/mL. O anticorpo purificado foi analisado usando SDS-PAGE (Invitrogen, Carlsbad, CA), ou proteína Labchip (Caliper LifeSciences, Hopkinton, MA). SDS-PAGE correu em condições não reduzidas.

[00124] A mutagênese da asparagina na posição 33 (N33) da CDR1 de cadeia leve para o anticorpo 19.3 em N33S (SEQ ID NO: 55), N33T (SEQ ID NO: 56), N33E (SEQ ID NO: 67) ou N33D (SEQ ID NO: 68) foi realizada por mutagênese sítio direcionada, a partir do vetor de expressão WT de pV1JASN-GS-19.3-LCK usando o kit de mutagênese sítio direcionada QuikChange II XL (Agilent Technologies, La Jolla, CA). O códon AAT para N foi mutado para AGT para S em 19.3S33 (SEQ ID NO: 55), ACT para T em 19.3T33 (SEQ ID NO: 56), GAA para E em 19.3E33 (SEQ ID NO: 67), ou GAT para D em 19.3D33 (SEQ ID NO: 68), e os novos códons nesta posição foram confirmados por sequenciamento de DNA. Para gerar os anticorpos IgG de tamanho completo para estes mutantes, os respectivos plasmídeos de cadeia leve foram pareados com o plasmídeo de cadeia pesada cognato, pVlJNSA-19.3-HCG2, para a transfecção transiente em células 293 FreeStyle (Invitrogen, Carlsbad, CA). Os métodos de expressão e purificação foram descritos anteriormente neste exemplo. As alíquotas de anticorpos mutantes purificados junto com o anticorpo parental 19.3 (SEQ ID NO: 1) foram incubadas em várias condições a 4°C, 25°C ou 40°C por um mês antes de serem submetidas á análise de ELISA mostrada nas figuras 4A-4C. Exemplo 4 Caracterização de anticorpos anti-ADDL

[00125] Os anticorpos anti-ADDL selecionados, isto é, aqueles derivados do anticorpo parental, h3B3, foram primeiro avaliados em um ELISA Aβ de três pontos para avaliar a ligação do anticorpo ao monômero Aβ, ADDLs e Aβ fibrilar. Da maneira mostrada na figura 1, com a exceção do anticorpo 9.2, todos os anticorpos anti-ADDL mostraram ligação preferencial aos ADDLs com relação ao h3B3, comparadores seletivos (Comp 1 e 3: ligam-se apenas aos ADDLs), não seletivos (Comp 2: ligam-se a todas as formas de Aβ avaliadas) e um controle (sem anticorpo). O anticorpo 9.2 mostrou menos ligação com todas as formas de Aβ, o que sugere que sua afinidade de ligação foi afetada de maneira adversa durante a conversão de IgG e/ou produção de anticorpo. Uma curva de titulação completa (Figura 2) foi gerada para cada anticorpo e h3B3 para determinar sua afinidade de ligação com os ADDLs, da maneira comparada com o monômero Aβ. Apesar de que seis dos sete anticorpos com afinidade madura mostraram ligação preferencial aos ADDLs, os requerentes mostraram previamente que alguns anticorpos anti-ADDL com ligação preferencial aos ADDLs não são capazes de prevenir a ligação de ADDL aos neurônios hipocampais primários (Shughrue, et al., 2010, Neurobiol. Aging, 31: 189-202, Figura 1).

[00126] Esta ligação preferencial apenas aos ADDLs pode não ser uma previsão exata de eficiência, pode ser desejável identificar os anticorpos anti- ADDL que também bloqueiam a ligação de ADDL aos neurônios, o que pode ser avaliado em um ensaio de ligação a base de células da maneira a seguir. Os anticorpos foram pré-incubados com ADDLs e a seguir adicionados às células hipocampais primárias para avaliar seu bloqueio de ligação ao ADDL. Os resultados deste estudo mostram que os anticorpos anti-ADDL aqui, especificamente o anticorpo 19.3, reduzem muito a ligação de ADDL aos neurônios (Figura 3). Entretanto, uma redução acentuada na atividade do anticorpo neste ensaio foi observada quando os anticorpos foram desnaturados pelo calor (Figura 3).

[00127] Determinação de EC50. As placas de muita ligação de proteína (Costar, Corning, Lowell, MA) foram revestidas com ligante alvo em PBS por toda a noite a 4°C. A concentração de proteína no revestimento foi 100 pmol/poço para Aβ40 (American Peptide, Sunnyvale, CA) e 50 pmol/poço apara os ADDLs. Os ADDLs foram gerados da maneira descrita no exemplo 1B. No dia seguinte, as placas foram lavadas cinco vezes com PBS + 0,05 % de Tween-20 (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) e bloqueadas por toda a noite com tampão de bloqueio com caseína (Thermo Scientific, Waltham, MA) e 0,05 % de Tween-20. Três anticorpos representativos, 19.3 (Fig. A), 19.3S33 (Fig. 4B), e 19.3T33 (Fig. 4C), gerados da maneira descrita no exemplo 3, foram testados em 15 μg/mL a 0 μg/mL em uma diluição seriada em três vezes de 12 pontos. Após 2 horas de incubação em temperatura ambiente as placas foram lavadas e a fosfatase alcalina conjugada com IgG anti-humano (ThermoScientific, Waltham, MA) foi adicionada em 0,08 μg/mL. Após 45 minutos de incubação em temperatura ambiente, as placas foram lavadas e o substrato quimioluminescente Tropix® CDP®-Star (Life Technologies™, Carlsbad, CA) foi adicionado. A luminescência foi detectada após 30 minutos em um leitor de placas EnVision® (PerkinElmer, Waltham, MA). Os ajustes das curvas foram realizados usando o software GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA). Exemplo 5 Ligação ao FcRn in vitro de anticorpos anti-ADDL

[00128] Para caracterizar a capacidade dos anticorpos anti-ADDL de se ligar e dissociar à FcRn humana imobilizada, os sete anticorpos anti-ADDL foram aqui avaliados em um ensaio de ligação à FcRn Biacore, um sistema substituto usado para avaliar o PK do anticorpo e prever a meia vida final (t/) dos anticorpos em primatas não humanos.

[00129] Resumidamente, a proteína FcRn humana purificada foi imobilizada em um chipe biossensor Biacore CM5 e PBSP (NaPO4 50 mM, NaCl 150 mM e 0,05 % (v/v) de agente tensoativo 20) pH 7,3 foi usado como o tampão de corrida. Os mAbs foram diluídos com PBSP pH 6,0 a 100 nM, se ligaram naturalmente à FcRn por 3 minutos para atingir o equilíbrio e foram seguidos por dissociação em tampão de corrida em pH 7,3. Um ponto de controle (estabilidade) foi inserido em 5 segundos após o final da ligação de mAb e o “% ligado” foi calculado como RUestabilidade/RUligação (%). Os requerentes observaram que os anticorpos monoclonais (mAbs) com sequência Fc idênticas, mas com domínios Fab diferentes podem se ligar e dissociar de FcRn com diferenças consideráveis (dados não mostrados). Além do mais, uma correlação evidente entre a dissociação em pH neutro e farmacocinética in vivo foi observada, na qual os mAbs com frações com dissociação lenta (isto é, maior “% ligado”) tendem a exibir menor t/ in vivo. Esta característica foi usada como uma ferramenta de seleção in vitro para a farmacocinética do anticorpo.

[00130] Foi realizada aqui uma comparação dos sete anticorpos anti- ADDL, junto com h3B3, dois anticorpos com preferência por ADDL (Comp 1 e 3) e um comparador não seletivo (Comp 2: se liga a todas as formas Aβ avaliadas) no ensaio de ligação de FcRn. Um sensorgrama foi gerado (Figura 5), mostrando a ligação inicial do anticorpo em pH 6,0 e a seguir a dissociação do anticorpo em pH 7,3, a partir de 180 segundos. Da maneira mostrada na figura 5, ocorreu uma diferença notável entre h3B3 e os outros anticorpos avaliados. Embora h3B3 apresente uma ligação percentual elevada com FcRn, os sete anticorpos anti-ADDL da presente invenção, bem como os dois anticorpos de comparação, exibiram ligação consideravelmente menor. Exemplo 6 Caracterização de anticorpo anti-ADDL 19.3

[00131] O anticorpo com afinidade maturada 19.3 foi selecionado para caracterização adicional. A sequência completa de DNA e a sequência de aminoácidos deduzida para a região variável de cadeia leve foram determinadas como SEQ ID NOS: 14 e 15, respectivamente. O alinhamento das regiões variáveis de cadeia pesada (SEQ ID NO: 17) e leve (SEQ ID NO: 15) é mostrado na figura 6A, junto com a sequência da linhagem germinal mais próxima (SEQ ID NO: 47). Um modelo 3D de regiões variáveis de cadeia pesada e leve e o local das seis regiões de determinação complementar (CDRs) são mostrados na figura 6B.

[00132] As análises Biacore™ (GE Healthcare, Waukesha, WI) e KinExA (Sapidyne, Boise, ID) foram realizadas para garantir a afinidade de ligação de anticorpo anti-ADDL 19.3 com os ADDLs, e determinar a seletividade de 19.3 com os ADDLs versus o monômero Aβ. As tecnologias baseadas em Biacore™ e KinExA são amplamente usadas para a medição da afinidade de ligação entre macromoléculas tais como anticorpo e proteína alvo. Na tecnologia de ressonância de plasma de superfície (SPR), que baseia- se em Biacore™, as medições quantitativas da interação de ligação entre uma ou mais moléculas são dependentes da imobilização de uma molécula alvo na superfície do chipe sensor. Os parceiros de ligação no alvo podem ser capturados quando passam pelo chipe. A ressonância de plasma de superfície (SPR) detecta mudanças em massa na camada aquosa próxima à superfície do chipe sensor medindo mudanças no índice refratário. Quando as moléculas na solução teste se ligam a uma molécula alvo a massa aumenta (ka), quando se dissociam a massa diminui (kd). Este princípio simples forma a base do sensorgrama-a contínuo, de monitoramento em tempo real da associação e dissociação das moléculas que interagem. O sensorgrama fornece informação quantitativa em tempo real na especificidade de ligação, concentração ativa da molécula em uma amostra, cinética e afinidade.

[00133] A tecnologia KinExA de Sapidyne Instruments, Boise, Idaho, mede as constantes de ligação para caracterizar os eventos de ligação biomolecular na fase de solução, não nos eventos de ligação entre uma fase de solução e uma fase sólida. Em solução, os parceiros de ligação atingem o equilíbrio após a incubação suficiente. As moléculas não ligadas são quantificadas com uma titulação, o que refletirá a porção de moléculas ligadas aos parceiros. O método KinExA não exige modificação de moléculas em estudo. Com KinExA, a reação a ser medida ocorre entre moléculas não modificadas em solução. Portanto, diz respeito a como a modificação que altera as reações de ligação “natural” é eliminada. O método KinExA permite uma ampla faixa de constantes de ligação o mais próximo possível a 10-13 M. O software KinExA realiza análise de dados que baseiam-se nas soluções exatas de equações clássicas de ligação (matemática kd), e não nas pseudo aproximações de primeira ordem. KinExA não exige manipulações arbitrárias de dados ou seleções de faixa.

[00134] Da maneira mostrada na tabela 6, o anticorpo 19.3 apresentou uma afinidade de 4,8 nM com os ADDLs comparada a uma afinidade de 150 nM com o monômero Aβ no ensaio Biacore™. A seletividade de trinta vezes do anticorpo 19.3 com ADDLs com relação ao monômero Aβ foi muito melhor do que aquela observada para o anticorpo parental, h3B3, que exibiu apenas uma preferência de 10 vezes com ADDLs versus o monômero Aβ.

[00135] De maneira similar, o anticorpo 19.3 foi avaliado em uma medição de constante de equilíbrio a base de KinExA. Da maneira mostrada na tabela 7, o anticorpo 19.3 apresentou uma constante de equilíbrio de 2,7 nM, o que representa uma preferência de mais de seis vezes por oligômeros ADDL, versus a ligação do monômero Aβ40 no mesmo ensaio.

Exemplo 7 Caracterização biofísica de anticorpo anti-ADDL 19.3

[00136] A caracterização biofísica para avaliar o potencial para a formação de agregados de anticorpo foi realizada para mostrar que os anticorpos anti-ADDL aqui são estáveis em condições de estresse, e são adequados para uso como um terapêutico. O anticorpo anti-ADDL 19.3 foi concentrado em >50 mg/mL e colocado em inúmeras formulações com um pH que varia de 5,0 a 8,0. Dois conjuntos de amostras foram incubados a 37°C e 45°C por uma semana. Um terceiro conjunto de amostras foi colocado a -70°C para iniciar uma série de cinco ciclos de congelamento/descongelamento. A análise da cromatografia por exclusão de tamanho indicou que as preparações de anticorpo estavam predominantemente (>95 %) no estágio de monômero, com pequena quantidade de dímeros, que são típicos para a preparação de anticorpo monoclonal. A quantidade de dímeros e oligômeros de peso molecular elevado não aumentou após o estresse térmico por meio de todos os tampões e nenhuma fragmentação foi observada. Da maneira resumida na tabela 8, a análise da turbidez próxima ao ultravioleta também indicou falta de agregação. As amostras estressadas por congelamento/descongelamento mostraram aumento dependente de tampão na turbidez, o que foi comparável a outros anticorpos monoclonais. A viscosidade em 50 mg/mL foi abaixo de 2 centipoise, indicando uma viscosidade de injeção aceitável, uma vez que o nível de 20 centipoise é considerado em geral como um limite prático para injeções subcutâneas. A varredura diferencial por calorimetria também revelou estabilidade térmica aceitável, com não dobramento de Fab em cerca de 72°C e o não dobramento mínimo do domínio CH2 estável acima de 65°C. Obtidos juntos, o anticorpo 19.3 demonstrou estabilidade estrutural muito boa com propriedades biofísicas compatíveis com a distribuição subcutânea.

Exemplo 8 Análise farmacocinética de 19.3 e eficiência em um modelo de AD A. Estudo de farmacocinética em camundongos com FcRn de humano

[00137] Os camundongos com FcRn de humano (Tg276 heterozigotos) (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) foram sugeridos recentemente como um sistema substituto valioso para avaliar a farmacocinética do anticorpo monoclonal. Para caracterizar a farmacocinética do anticorpo anti-ADDL 19.3 em camundongos com FcRn de humano, três animais receberam uma injeção única intravenosa de anticorpo 19.3 em 10 mg/kg por meio da veia caudal. Uma série de 10 μL de amostras de sangue foram então coletadas nos pontos de tempo 0, 25, 50, 75, 100, 150, 250 e 350 horas após a administração IV de anticorpo 19.3 ou h3B3, e um imunoensaio validado com IgG anti-humano foi usado para determinar os níveis de anticorpo. Da maneira mostrada na figura 7, os níveis sanguíneos para o anticorpo 19.3 diminuíram em uma maneira bifásica, com uma t/ aparente de 77 ± 6 horas, o que foi consideravelmente maior que a meia vida para o anticorpo parental, h3B3, de cerca de 29 + 9 horas. Estas meias vidas estavam de acordo com a diferença prevista pelo ensaio de ligação a FcRn in vitro (Figura 5). A meia vida terminal na fase de eliminação foi determinada usando o modelo não compartimental (WinNonlin®, Pharsight, Sunnyvale, CA) e os pontos de dados entre o dia 3 e o dia 15 após a dose. B. Estudo de farmacocinética em primatas não humanos

[00138] Para confirmar a t/ prevista de 19.3 em primatas, um estudo de farmacocinética em primatas foi realizado com o anticorpo anti-ADDL 19.3 em um coorte de cisterna magna conduzido em macacos reso. Seis animais (três machos/três fêmeas) foram dosados com uma injeção de bolo intravenoso única ou subcutânea de anticorpo 19.3 (5 mg/kg), e as amostras de sangue foram coletadas após a administração do anticorpo. Ao mesmo tempo, as amostras de CSF foram coletadas a partir da entrada da cisterna magna em 0, 2, 4, 8, 12, 24, 30, 48, 54 e 72 horas, e a concentração de anticorpo 19.3 no soro e CSF foi determinada com um ensaio de ELISA IgG anti-humano. Quando os animais foram administrados com uma injeção de bolo IV única de anticorpo 19.3, a t/ de 254 + 28 horas foi observada, enquanto a t/ de 204 + 49 horas foi observada após a administração subcutânea (Figura 8). Além disso, os requerentes observaram que o anticorpo 19.3 era capaz de atravessar o CSF de primata, onde aumentou em concentração durante as primeiras 48 horas e atingiu o pico em cerca de 0,1 % do anticorpo dosado (Figura 9). C. Distribuição de anticorpo anti-ADDL 19.3 marcado com 125I no cérebro de camundongo

[00139] Em uma tentativa de determinar a concentração de anticorpo que atingiu o cérebro, os camundongos Tg2576 machos de doze meses (linhagem B6; SJL-TgN APPSWE) foram injetados (veia caudal) com 200 μg de anticorpo 19.3 marcado com 125I (~8 mg/kg), ou um dos dois anticorpos de comparação, e o sangue e CSF coletados duas horas mais tarde. A radioatividade residual foi eliminada dos vasos do cérebro por meio de perfusão cardíaca com PBS antes da remoção do cérebro. Uma amostra de sangue, CSF e o cérebro inteiro foram então colocados em um contador gama para determinar a quantidade de anticorpo rádio-marcado presente em cada amostra. Após a contagem, os cérebros foram fixados em 4 % de paraformaldeído por 48 horas e a seguir processados para imunocitoquímica sem artefatos flutuantes. A localização de anticorpo 19.3 no cérebro do camundongo foi detectada com um anticorpo secundário anti-humano e um método de detecção ABC padrão. Esta imunorreatividade foi então combinada com a coloração com tioflavina S (um corante que detecta placas) para determinar a colocalização de anticorpo com placas no cérebro de camundongo.

[00140] Da maneira mostrada nas figuras 10A e 10B, o anticorpo 19.3 rádio-marcado foi capaz de penetrar a barreira hemato-encefálica no CSF e cérebro do camundongo. Além do mais, os dados indicaram que o anticorpo 19.3 foi enriquecido no cérebro (0,19 %) quando comparado com os níveis observados no CSF (0,02 %). Para determinar se esta concentração no cérebro foi em virtude da associação de anticorpo 19.3 com Aβ, os cérebros foram fixados e processados para imunocitoquímica. A análise de distribuição de anticorpo no cérebro de camundongo Tg2576 velho revelou que o anticorpo 19.3 estava associado com as placas amiloide positivas para tioflavina S no cérebro (Figura 10C e 10D). Estes dados forneceram a primeira evidência de que o anticorpo 19.3 é capaz de penetrar no cérebro de camundongo transgênico e se ligar às espécies Aβ de interesse. Exemplo 9 Modelo de deposição de placa

[00141] Para avaliar adicionalmente a capacidade do anticorpo anti- ADDL 19.3 reduzir a deposição de ADDL nas placas amiloide no cérebro, camundongos Tg2576 machos de doze meses (Taconic, NY) tiveram uma cânula introduzida unilateralmente a cada semana, e bADDLs (50 pmol/μL,) foram infundidos semanalmente durante quatro semanas no hipocampo (Figura 11 A). Uma semana após o último tratamento com bADDL, metade dos camundongos (n=5/tratamento) foram dosados (veia caudal) semanalmente por quatro semanas com PBS, enquanto o restante dos animais foi dosado semanalmente com 200 μg de anticorpo anti-ADDL (cerca de 8 mg kg). Todos os animais foram eutanizados uma semana após o último tratamento e seus cérebros foram processados para imunocitoquímica. Para a detecção de bADDL e placas, as seções do cérebro foram incubadas com estreptavidina Alexa Fluor® 594 (Invitrogen, Carlsbad, CA), montadas em lâminas e as placas foram coradas com tioflavina S. As imagens fluorescentes das placas foram então capturadas com um formador de imagem confocal rápido PerkinElmer com o software UltraVIEW ERS, e a diferença no crescimento da placa foi quantificada. Os detalhes deste modelo foram publicados recentemente (Gaspar et. al., 2010, Exp. Neurol., 223: 394-400). Após um mês de tratamento, uma redução significativa na deposição de novos ADDLs em placas existentes foi observada em animais tratados com anticorpo 19.3 (Figura 11C), quando comparados aos animais tratados apenas com o veículo (Figura 1 IB).

Claims

1. Anticorpo isolado, ou um fragmento de ligação ao antígeno deste, que se liga a ligantes difusíveis derivados de β-amiloide, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) uma região variável de cadeia leve que compreende, (i) uma CDR1 de SEQ ID NO: 1, (ii) uma CDR2 de SEQ ID NO: 2, e (iii) uma CDR3 de SEQ ID NO: 10; e (b) uma região variável de cadeia pesada que compreende: (i) uma CDR1 de SEQ ID NO: 4, (ii) uma CDR2 de SEQ ID NO: 5, e (iii) uma CDR3 de SEQ ID NO: 6.

2. Anticorpo isolado de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a região variável de cadeia leve do dito anticorpo compreende SEQ ID NO: 15 e a região variável de cadeia pesada do dito anticorpo compreende SEQ ID NO: 17.

3. Anticorpo isolado de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente uma região constante de cadeia pesada de SEQ ID NO: 21.

4. Anticorpo isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo monoclonal.

5. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em mistura com um carreador farmaceuticamente aceitável.

6. Anticorpo isolado ou frafmento de ligação ao antígeno do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que é para uso na preparação de um medicamento para atenuar a ligação de ligantes difusíveis derivados de β amiloide a um neurônio.

7. Método para inibir a montagem de ligantes difusíveis derivados de β-amiloide in vitro, caracterizado pelo fato de que compreende colocar uma amostra contendo peptídeos β amiloide 1-42 em contato com o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, inibindo por meio disso a montagem de ligantes difusíveis derivados de Aβ.

8. Método para inibir a fosforilação de proteína Tau em Ser202/Thr205 in vitro, caracterizado pelo fato de que compreende colocar uma amostra contendo uma proteína Tau em contato com o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno como definido na reivindicação 1, inibindo por meio disso a fosforilação de proteína Tau em Ser202/Thr205.

9. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de ser na preparação de um medicamento para prevenir ou tratar a doença de Alzheimer ou distúrbios relacionados à memória similares associados à acumulação de ADDLs.

10. Método para identificar um suposto agente terapêutico que atenua a ligação de ligantes difusíveis derivados de β-amiloide aos neurônios, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) colocar uma composição que compreende um neurônio em contato com ligantes difusíveis derivados de β-amiloide na presença de um agente; (b) colocar a composição em contato com o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4; e (c) detectar a quantidade de anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno ligado na presença do agente, em que uma diminuição na quantidade de anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno ligado na presença do agente, comparado à quantidade de anticorpo ligado na ausência do agente, indica que o agente é um suposto agente terapêutico para atenuar a ligação de ligantes difusíveis derivados de β-amiloide nos neurônios.

11. Método para detectar ligantes difusíveis derivados de β- amiloide em uma amostra, caracterizado pelo fato de que compreende colocar uma amostra em contato com o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, e determinar a presença de um complexo que compreende os ligantes difusíveis derivados de β-amiloide e o dito anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno.

12. Método para diagnosticar uma doença associada aos ligantes difusíveis derivados de β-amiloide, caracterizado pelo fato de que compreende colocar uma amostra em contato com o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, e determinar a presença de um complexo que compreende os ligantes difusíveis derivados de β-amiloide e o dito anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, em que o complexo é diagnóstico de uma doença associada aos ligantes difusíveis derivados de β-amiloide.

13. Kit para detectar ligantes difusíveis derivados de β- amiloide, caracterizado pelo fato de que compreende o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4 ou uma composição farmacêutica como definida na reivindicação 5 dispostos em um recipiente e instruções para usar o anticorpo, em que os recipientes incluem placas multipoços para a detecção simultânea de ADDLs em amostras múltiplas.