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Gebiet der Erfindung
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Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Diagnose sowie Medikamente zur Behandlung von Erkrankungen des Zellwachstums, insbesondere krankhaftes Zellwachstum mit einer genetischen Ursache, einschließlich Störungen, die mit dem Verlust von Tumor-Suppressor-Funktionen verbunden sind. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die Diagnose, Früherkennung und Behandlung von Erkrankungen der Neurofibromatose Typ 1 (NF1) sowie NF1 assoziierter Tumore.
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Hintergrund der Erfindung
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Die Neurofibromatose Typ 1 (NF1) ist eine autosomal-dominant vererbbare Multiorganerkrankung mit unterschiedlich stark ausgeprägten Symptomen innerhalb der Haut, des Knochens und/oder des Nervensystems und der Neigung zu benignen und malignen Tumoren des Nervensystems. NF1 basiert auf Mutationen des NF1-Gens, welches für Neurofibromin, ein Tumorsuppressorgen (negativer Regulator des Ras-Signalwegs) kodiert und auf dem Chromosom 17/g11.2 lokalisiert ist. Die Krankheit zeigt eine vollständige Penetranz, das heißt, dass alle Personen mit einer NF1-Mutation auch klinische Symptome entwickeln [1–4]. NF1 ist eine seltene Erkrankung mit einer Prävalenz von 30–40 Fällen pro 100000 Einwohner; ein Kind von 3000 bis 4000 Geburten ist betroffen. Es wird geschätzt, dass 50% der Fälle durch eine Neumutation im NF-1-Gen verursacht wird.
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Die Diagnose von NF1 erfolgt bisher größtenteils mittels klinischer Diagnostik anhand von Kardialsymptomen (> 5 Cafe-au Lait-Flecken bei 95% der Patienten, kutane Tumore bei > 90% der Patienten), jedoch ist gerade bei Kinder mit wenig ausgeprägten Symptomen oder bei Patienten mit NF1-Sonderformen eine klinische Diagnosestellung oft sehr schwierig.
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Eines der bezeichnensten Eigenschaften von NF1 ist die Entwicklung eines beginnenden peripheren Nervenscheidentumors, welcher an jeder beliebigen Stelle des Körpers auftreten kann. Während kutane Neurofibrome (cNF) zumeist sichtbar und tastbar sind, sind subkutane Neurofibrome, interne plexiform Neurofibrome (PNF) und maligne periphere Nervenscheidentumore (MPNST) zumeist schwierig zu detektieren, zu quantifizieren oder zu überwachen [4]. 4,6–10% aller Patienten mit einer NF-1 können maligne periphere Nervenscheidentumoren (MPNST) entwickeln (Stark et al., 2002, Tumoren peripherer Nerven, Deutsches Ärzteblatt).
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MPNST sind die häufigste Ursache für eine verkürzte Lebensdauer von NF1 Patienten und führen zum Tod, wenn sie nicht frühzeitig entdeckt und behandelt werden. Dieser bösartige Tumor entwickelt sich bei NF1-Patienten aus vorbestehenden gutartigen plexiformen Neurofibromen. Die erste Form der Behandlung ist die selektive Resektion von beginnenden PNF, und die radikale operative Entfernung von MPNST [5–8]. Auf Grund des invasiven Wachstumsmusters von MPNST wird häufig die komplette Entfernung des Tumors verhindert, besonders wenn dieser erst spät diagnostiziert wird. Darüber hinaus können Chemo- und Radiotherapie die Wiederkehr des Tumors zwar verzögern, jedoch hat diese Behandlung nur einen geringen Effekt auf das Langzeitüberleben [7, 9]. Das lebenslange Risiko einen MPNST zu entwickeln wurde bei NF1 Patienten mit 8–13% bestimmt und ist mehr als 100-mal höher in NF1 Patienten gemessen an der Normalbevölkerung.
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Darüber hinaus entwickeln viele NF1 Patienten in einem sehr jungen Alter von ungefähr 30 Jahren [10, 11] einen malignen peripheren MPNST, verglichen zu dem Durchschnittsalter von 62 Jahren nach Diagnosestellung in der Normalbevölkerung [12]. Da MPNST sich durch den malignen Verlauf eines vorher existierenden PNF entwickelt, steigt das Risiko von NF1 Patienten mit PNF um bis zu 50% [12, 13].
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Darüber hinaus kann die Diagnosestellung sehr lange dauern, bei Kindern einige Jahre oder sogar erst im Erwachsenenalter erfolgen, je nach Wissens- und Erfahrungsstand der diagnostizierenden Ärzte (Kinderärzte, Hautärzte, Neurologen). Eine NF1-Gendiagnostik (Nachweis von Mutationen im NF1-Gen (derzeit sind über 100 verschiedene Mutationen bekannt) ist möglich, jedoch sehr kostspielig, auch ist keine 100%ige Sensitivität möglich, (siehe auch Leitlinien zur Diagnostik, A15 Neurofibromatose Typ I, D. Horn, J. Kunze, Stand: Januar 2002). Größe des Gens, multiple Mutation Sites und mehrere Pseudogene haben eine direkte molekulare Analyse des NF1-Gens zudem technisch schwierig gemacht und begrenzen so den Nutzen und die Praktikabilität der Gen-basierten diagnostischen Techniken und Behandlungsmethoden.
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Dermale und oberflächliche Neurofibrome unterliegen direkten Messungen durch optische oder Ultraschallverfahren [14], während PNF und MPNST zumeist nur nach dem Auftreten klinischer Symptome diagnostiziert werden. Systematische Analysen der internen Tumorlast von NF1 Patienten bei Ganzkörper-Magnetresonanztomographie (MRT) weisen zudem auf einen Zusammenhang zwischen dem Risiko einen MPNST zu entwickeln und der internen PNF Tumorlast hin [15]. Weiterhin lassen sich Mithilfe von bildgebenden Verfahren wie der Positronen-Emissions-Tomographie (PET) bösartige von gutartigen Tumoren unterscheiden, jedoch nicht mit 100% Spezifität. Diese bildgebenden Verfahren können zwar hilfreich sein bei der Differenzierung gutartiger und bösartiger Tumore, sind aber auf Grund der hohen Kosten und der Strahlenbelastung als regelmäßige Früherkennungsmaßnahme ungeeignet. Hinzu kommt, dass die Gefahr einer Tumorinduktion durch Bestrahlung bei NF1-Patienten größer ist als in der Normalbevölkerung.
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Aufgrund der schwierigen klinischen Diagnostik wäre eine Unterstützung der NF1 Diagnose durch Biomarker sinnvoll. Bisher wurde die Suche nach Ersatz-Biomarkern, um frühzeitig das Risiko für eine maligne Transformation eines Patienten identifizieren zu können auf der Grundlage der Annahme durchgeführt, dass die Überexpression von Proteinen in PNF und MPNST zu einer erhöhten systemischen Konzentration führen würden [16–19]. In
Tabone-Eglinger et al., Sarcoma (2008), 1–7 wurde beschrieben, dass in humanen MPNST-Tumoren eine erhöhte Expression von EGFR-Transkripten vorliegt. In der internationalen Anmeldung
WO 2010/022166 A2 , werden verschiedene miRNAs (MicroRNA (MiRNA)) als Markerkandidaten zur Diagnose von NF1 und MPNST vorgeschlagen. Nukleinsäure basierende Nachweistechniken haben allerdings den Nachteil, dass die Aufarbeitung der Probe aufwendig ist und meist eine Biopsie erfordert sowie mRNAs und miRNAs schnellerem Abbau unterliegen was zu verfälschten Ergebnissen führen kann.
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Als eine mögliche Alternative werden Proteine als Biomarker diskutiert, deren Vorliegen in Körperflüssigkeiten einen einfacheren Nachweis erlauben würde. Beispielsweise wurde beschrieben, dass das Serumlevel für die Wachstumsfaktoren Midkine (MK) und dem Stammzellfaktor (SCF) signifikant in einer Kohorte von 39 NF1 Patienten erhöht vorlag, jedoch wurde keine Korrelation mit der Tumorlast zu MPNST gefunden [20]; siehe auch die internationale Patentanmeldung
WO 00/31541 A2 , welche Midkine als Marker zur Prognose für NF1 vorschlägt.
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Kürzlich wurde das Meloma inhibierende Aktivität/cd-rap (MIA) Protein als ein Marker für die interne Tumorlast in einer Kohorte von 42 NF1 Patienten [21] identifiziert. MIA wurde bereits früher als ein Biomarker für maligne neuroektotermale Tumore postuliert [22]. In einer anderen Studie wurden 92 Gene, die für putativ sekretierte Proteine in Neurofibrome und MPNST kodieren, als mögliche Marker analysiert [23]. Nur für eines von diesen, Adrenomedullin (ADM), konnte bestätigt werden, dass es differenziell exprimiert und erhöht im Serum von NF1 Patienten vorlag. Eine weitere noch erhöhtere Serumkonzentration wurde in einer kleinen Gruppe von MPNST Patienten gefunden (n = 5).
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Daher gibt es zwar Ansätze, die Expression von Markerproteinen zur Diagnose von Neurofibromatose Typ 1 zu nutzen, jedoch lassen sowohl die bisherigen Nukleinsäure-basierenden Verfahren wie auch die jüngsten Protein-gestützten Nachweisverfahren zur Diagnose von NF1 und assoziierten Tumoren noch keine Aussage zu, die ähnlich verlässlich wie die klinische Diagnose ist. Daher besteht Bedarf an einem technisch einfach durchzuführenden, zuverlässigen und vorzugsweise kostengünstigen Verfahren zur Diagnose und Früherkennung für NF1 und NF1 assoziierter Tumore.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Die vorliegende Erfindung betrifft das technische Gebiet der neurokutanen Tumorerkrankungen, insbesondere den Nachweis von bestimmten Biomarkern, welche charakteristisch für NF1 Erkrankungen sind. Durch die vorliegende Erfindung wird ein einfaches, schnelles, zuverlässiges und kostengünstiges Verfahren zur Diagnose/Früherkennung dieser Erkrankungen bereitgestellt sowie neue Zielmoleküle als Angriffspunkte zu deren Behandlung.
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Die vorliegende Erfindung beruht auf der erfolgreichen Identifizierung von einem Set von Biomarkern in Serum, mit deren Nachweis es möglich ist NF1 und assoziierte Tumore frühzeitig zu diagnostizieren, und vorteilhafterweise zwischen der Ausprägung bzw. Vorhandensein von NF1, NF1 assoziierten malignen peripheren Nervenscheidentumoren (MPNST) und plexiformen Neurofibromen (PNF) zu differenzieren und zudem die Tumorlast in NF1-Patienten zu bestimmen, was beispielweise hilfreich in der Dosierung einer Chemotherapie ist. Das erfindungsgemäße Set von Bio- bzw. Serummarker umfasst Tumor Nekrose Faktor alpha (TNFalpha), Interferon gamma (IFNgamma), Epidermaler Wachstumsfaktorrezeptor (EGFR), Insulin ähnlicher Wachstumsfaktor Bindungsprotein-1 (IGFBP-1), Regulated an Activation, Normal T cell Expressed and Secreted (RANTES) und humaner Platelet-Derived Growth Faktor-BB (PDGF-BB) sowie Fragmente davon.
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Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein in vitro-Verfahren zur Diagnose und/oder Früherkennung einer Neurofibromatose Typ 1 (NF1) und/oder eines NF1 assoziierten Tumor, umfassend den Nachweis mindestens eines Proteins ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus TNFalpha, IFNgamma, EGFR, IGFBP-1, RANTES und PDGF-BB oder eines Fragments einer dieser Proteine in einer Probe von einem Patienten, wobei das Vorliegen einer dieser Proteine oder Fragmente davon in veränderter Konzentration im Vergleich zu deren Konzentration in einer Referenzprobe das Vorliegen und/oder die Entwicklung einer NF1 oder eines NF1 assoziierten Tumor anzeigt. Vorteilhafterweise werden 2, 3, 4, 5 oder alle Serummarker zum Nachweis ausgewählt. Alternativ oder zusätzlich kann das erfindungsgemäße Verfahren den Nachweis weiterer, im Stand der Technik beschriebene Biomarker umfassen wie Midkine und vorzugsweise Interleukin 6 (IL-6), dass in den erfindungsgemäß durchgeführten Experimenten erstmals als NF1-Marker im Serum validiert werden konnte. Dabei weisen die vier Macker TNF-α, EGFR, IFNγ und IL-6 eine veränderte Serumkonzentration in NF1-Patienten im Vergleich zu gesunden Probanden auf. Die drei Marker IGFBP1, RANTES und PDGF-BB zeigen eine signifikant veränderte Konzentration in NF1-Patienten, die einen malignen peripheren Nervenscheidentumor (MPNST) oder ein plexiformes Neurofibrom (PNF) aufweisen, verglichen zu NF1-Patienten ohne MPNST oder PNF, wobei die IGFBP1 Konzentration zudem mit der Tumorlast in einem NF1-Patienten korreliert.
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In einer besonders bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung in vitro-Verfahren zur Diagnose und/oder Früherkennung einer Neurofibromatose Typ 1 (NF1) und/oder eines NF1 assoziierten Tumor wobei (a) eine erhöhte Konzentration von TNFalpha, IFNgamma, und/oder IL-6 bzw. eine erniedrigte Konzentration von EGFR für NF1; (b) eine erhöhte Konzentration von IGFBP1 und/oder RANTES für einen NF1 assoziierten malignen peripheren Nervenscheidentumor (MPNST); und (c) eine erniedrigte Konzentration von PDGF-BB für ein plexiformes Neurofibrom (PNF) bezeichnend ist; und wobei die Referenzprobe in (a) von einem gesunden Subjekt und in (b und c) von einem NF1 Patienten stammt.
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Da bereits Patienten mit einer NF1 Erkrankung ohne erkennbare klinische Symptome eine veränderte Konzentration von den erfindungsgemäßen Markerproteinen im Blut oder Serum aufweisen, stellt die vorliegende Erfindung zum ersten Mal ein in der Handhabung einfaches und kostengünstiges Frühdiagnoseverfahren bereit.
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Das erfindungsgemäße Verfahren kann vorteilhafterweise mit klassischen immunologischen Material und Methoden durchgeführt werden, beispielsweise mit kommerziell erhältlichen Reagenzien, die jeweils spezifisch für die oben angegebenen Proteine sind, insbesondere mit Antikörpern, vorzugsweise monoklonalen Antikörpern oder äquivalenten Bindungsmolekülen wie Aptamere oder Spiegelmere. Somit umfasst die vorliegende Erfindung auch die Verwendung von solchen Reagenzien, insbesondere anti-TNFalpha, anti-IFNgamma, anti-EGFR, anti-IGFBP1 und/oder anti-RANTES Antikörper oder Fragmente davon sowie Aptamere und/oder Spiegelmere zur Diagnose und/oder Früherkennung einer NF1 und/oder eines NF1 assoziierten Tumor.
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Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Kits in dem erfindungsgemäßen Verfahren, wobei das Kit Reagenzien umfasst, die spezifisch für den Nachweis von mindestens einem Protein ausgewählt aus einer Gruppe bestehend aus IFNgamma, IL-6, TNFalpha, EGFR, IGFBP1, RANTES und PDGF-BB oder Fragmente davon sind, wobei die Reagenzien vorzugsweise Antikörper oder Fragmente davon umfassen.
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Die Erfindung betrifft auch ein Kit umfassend Reagenzien, die spezifisch für den Nachweis von (i) IFNgamma, TNFalpha, und EGFR und/oder (ii) IGFBP1 und RANTES sind; und optional für PDGF-BB und/oder IL-6, wobei der Nachweis bevorzugt mit einem Microarray oder einem Teststreifen durchgeführt wird.
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Basierend auf den Erkenntnissen, dass die vorstehend beschriebenen Proteine in Patienten mit NF1 und/oder einem NF1 assoziieren Tumor in veränderter Konzentration vorliegen und es sich bei den Proteinen um Zytokine bzw. Wachstumsfaktoren handelt, für die bekannt ist, dass sie in der Entstehung bzw. Nährstoffversorgung von Tumoren involviert sind, stellen die erfindungsgemäßen Biomarker auch Angriffspunkte zur Therapie bzw. Prävention von NF1 assoziierten Erkrankungen oder eines NF1 assoziierten Tumors dar. Daher betrifft die vorliegende Erfindung auch die Verwendung eines Wirkstoffs, der ein Modulator eines der Proteine ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus TNFalpha, INFgamma, EGFR, IGFBP1, RANTES, PDGF-BB und IL-6 zur Herstellung eines Medikamentes in der Behandlung eines Patienten mit NF1 und/oder eines NF1 assoziierten Tumors, vorzugsweise wobei der Patient gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren diagnostiziert wurde.
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Ferner betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines anti-Tumorwirkstoffes zur Herstellung eines Medikamentes in der Behandlung eines Patienten mit NF1 und/oder eines NF1 assoziierten Tumors, wobei der Patient gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren diagnostiziert wurde.
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Weitere Ausführungsformen und Vorteile der vorliegenden Erfindung gehen aus der folgenden Beschreibung und den Beispielen hervor.
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Legende zu den Abbildungen
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: Schematische Darstellung der Kandidatenauswahl und des Screening-Ablaufs. Die ursprüngliche Anzahl von 115 möglichen Serummarkern für NF1 Tumore bestanden aus Proteinen, die überexprimiert in PNF oder MPNST vorliegen sowie das Tumorwachstum verstärken (n = 79) oder immunmodulatorische Zytokine sind (n = 36). Die 115 Proteine wurden aus veröffentlichten Daten ausgewählt. 56 der 115 ursprünglich ausgewählten Proteine wurden in zwei Schritten gescreent, einmal zusammen mit Seren von 60 NF1-Patienten, wobei 5 Proteine mit signifikanten Unterschieden zwischen den Gruppen aufgefunden wurden. Diese 5 Proteine wurden mit 26 neuen Proteinen an insgesamt 104 NF1-Patienten untersucht. Insgesamt wurden bei dieser Untersuchung 6 Proteine aufgefunden, die signifikante Unterschiede zur Vergleichsgruppe zeigten.
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: IL-6, IFNgamma und TNFalpha weisen signifikant erhöhte und EGFR signifikant erniedrigte Konzentrationen in Seren von NF1 Patienten auf. Quantitative Proteinarray Ergebnisse von Seren von 104 NF1-Patienten (NF1total) verglichen zu 41 gesunden Kontrollen (Co) für (a) IL-6, (B) IFN-γ, (c) EGFR, (D) TNFα. Die Unterschiede sind hochsignifikant für (a) bis (d). Keiner der anderen getesteten Proteine zeigt einen signifikanten Unterschied zwischen den beiden Gruppen. Statistische Unterschiede werden durch nicht-parametrische Tests (Mann-Whitney U) umfassend der Bonferroni-Methode ausgewertet.
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: Seren von NF1 Patienten weisen verglichen zu Kontrollpatienten einen signifikanten Unterschied der IFNgamma- und EGFR-Konzentration auf. Unterschiede der einzelnen Gruppen mit unterschiedlichen Tumorentitäten im Vergleich zu den Kontrollpatienten sind vorhanden, erreichen aber kein Signifikanzniveau.
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: Seren von NF1 Patienten weisen verglichen zu gesunden Kontrollpatienten einen signifikanten Unterschied der IL-6- und TNFalpha-Konzentration auf. Signifikante Unterschiede der einzelnen NF1-Gruppen mit unterschiedlichen Tumorentitäten im Vergleich zu den Kontrollpatienten sind nicht vorhanden.
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: Die PDGF-BB Serumkonzentration in NF1 Patienten ist verglichen zu der Kontrollgruppe grenzwertig signifikant (p = 0,052). NF1 Patienten mit PNF Tumoren haben eine geringere PDGF-BB Konzentration verglichen zu NF1 Patienten ohne PNF (p = 0,013).
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: IGFBP1 und RANTES weisen signifikant erhöhte Konzentrationen in dem Serum von NF1 Patienten mit einem MPNST auf. Quantitative Proteinarray Ergebnisse von 41 gesunden Kontrollen und 104 NF1-Patienten Seren unterteilt in drei Gruppen: 35 NF1-Patienten ohne PNF und ohne MPNST (cNF), 39 NF1-Patienten mit PNF aber ohne MPNST und 30 NF1-Patienten mit MPNST. (A) IGFBP1 und (B) RANTES; (C) IGFBP1 Serumkonzentrationen in NF1-Patienten mit unterschiedlichen internen Tumorlasten bestimmt durch MRI-basierende Volumetrie (Nichts: 0 cm3, niedrig: 1–99 cm3; moderat: 100–500 cm3; hoch: ≥ 500 cm3). Statistische Unterschiede werden bei nicht-parametrischen Tests (Mann-Whitney U) getestet umfassend der Bonferroni-Methode.
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: Der MPNST-Marker RANTES wird sowohl von MPNST Zellen selbst als auch von den infiltrierenden Lymphozyten produziert. Lichtmikroskopische Aufnahme eines immunhistochemisch angefärbten MPNST Paraffingewebeschnitts (Tumor ID 28044). Das RANTES Protein wurde mit Hilfe eines polyklonalen Kaninchen anti-humanen RANTES Antikörpers (1:100, ab9679, Abcam Inc.) nachgewiesen. Nach erneutem Waschen erfolgte die Inkubation mit dem biotinyliertem Sekundärantikörper, Streptavidin Peroxidase und DAB unter Nutzung des ”Dako REALTM Detection system” (Dako REALTM Detection system, peroxidase/DAB+, Rabbit/Mouse, code K5001, Dako, Denmark A/S) für automatisiertes Färben. Schließlich erfolgte eine Gegenfärbung der Zellkerne mit Hämatoxylin.
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: IGFBP1 wird von MPNST Tumoren exprimiert. ELISA Assay zum Nachweis von humanem IGFBP1 in Zellkulturüberständen der MPNST Zelllinien ST88-14, 1507-2, 5462, T462 T265 und STS26T: Das in das Medium sekretierte IGFBP1 wird mittels HRP-gebundenem Streptavidin nachgewiesen, wobei die gemessene Farbintensität proportional zur Menge an IGFBP1 in der Probe ist. IGFBP1 Konzentrationen wurden nach 24, 36 und 48 Stunden nach dem Aussäen der Zellen bestimmt.
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: T Lymphozyten produzieren TNFalpha und IFNgamma. Phorbol Myristat Acetat(PMA)-Ionomycin-induzierte Sektretion der intrazelluläre Zytokine wurde mittels FACS Analyse an CD3+/CD4+ bzw. CD3+/CD8+ positiven T-Zellen von Kontrollpatienten (KO) und NF1 Patienten (NF1) untersucht. Die Menge des produzierten Zytokins wurde mittels anti-TNFalpha Antikörper (A) bzw. anti-IFNgamma Antikörper (B) bestimmt. Es zeigte sich, das CD8+ T-Zellen von NF1-Patienten mehr TNFalpha und IFNgamma produzieren als entsprechende Vergleichszellen von nicht-NF1 Personen. Die Unterschiede waren aber nicht signifikant (TNFalpha p = 0,102 und IFNgamma p = 0,233).
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: IL-6, IFNγ, TNFα, EGFR, IGFBP1 und RANTES weisen diagnostisches Potential auf. ROC-Kurven hinsichtlich der Unterscheidung zwischen NF1-Gruppen und Kontrollgruppen für (A) IL-6, (B) IFNγ, (C) TNFα und (D) EGFR; die ROC-Kurven zur Unterscheidung zwischen NF1-Patienten mit oder ohne MPNST sind in (E) für IGFBP1 und (F) für RANTES gezeigt.
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Tab. 1: Charakteristika der Patienten- und Kontrollkohorten. Angabe von Anzahl, Alter, Geschlecht und Ganzkörper MRT je Gruppe.
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Tab. 2: Überblick über die Serummarkereigenschaften bei 90%iger Sensitivität. Die Prävalenz der NF1 Marker wurde bei 0.5 gesetzt, da nur ausgewählte Personen untersucht werden wie z. B. Kinder von NF1-Eltern. Diese haben ein 50%iges Risiko eine NF1 Mutation zu tragen. Die Prävalenz für MPNST bei NF1 Patienten wurde auf 10% geschätzt (der geschätzte Wert bezieht sich auf erwachsene NF1 Patienten mit PNF).
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Definitionen
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Wenn nicht anders bezeichnet, werden die hierverwendeten Begriffe gemäß ihrer Definitionen, wie in dem Oxford dictionary of biochemistry and molecular biology, Oxford University Press, 1997, wiederaufgelegt 2003, ISBN 0 19 850673 2, verwendet.
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Soweit nachfolgend der Kontext nicht eindeutig etwas anderes ergibt, ist bei der Verwendung von Singular-Formen bzw. Plural-Formen stets sowohl die Mehr- als auch die Einzahl umfasst.
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Der Begriff ”Patient oder NF1 Patient”, ”Erkrankter oder NF1 Erkrankter” oder ”Betroffener oder NF1 Betroffener” wird im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung in austauschbarerweise verwendet und umfasst Menschen als auch Tiere, vorzugsweise aber Menschen.
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Der Begriff ”Probe” bezeichnet eine biologische Probe, die für die ex vivo oder in vitro Untersuchung verwendet wird. Die Patienten und die Kontrollprobe können nach der Untersuchung vernichtet werden oder für weitere Untersuchung adäquat aufbewahrt werden.
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Der hier verwendetet Begriff ”Körperflüssigkeit” kann jede Flüssigkeit des Körpers darstellen, wie beispielsweise, Blut, Spuktum, Urin, Gehirn- oder Lymphflüssigkeit, Speichel, Samen, Extremente, Zellen oder Proteine und dessen Fragmente, katalytische Produkte und Vorstufen die in einer Körperflüssigkeit gelöst vorliegen und innerhalb des Körpers zirkulieren. Vorzugsweise handelt es sich bei der Probe um Serum.
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Die Begriffe ”Marker”, ”Proteinmarker” oder ”Biomarker”, werden im Kontext der vorliegenden Erfindung in austauschbarer Weise verwendet und bezeichnen allgemein die erfindungsgemäßen Proteine oder Fragmente davon. ”Proteine oder Fragmente davon” im Sinne der Erfindung können alle Markerproteine oder Fragmente davon, die in vivo vorkommen oder die in vitro erzeugt werden können (z. B. durch Mischen einer Probe mit einer Protease oder chemische Substanzen, wie CNBr).
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Die Begriffe ”Fragment”, ”Peptid” und ”Protein” werden hier austauschbar verwendet, um ein Polymer von Aminosäureresten zu beschreiben. Die Begriffe beziehen sich auf Aminosäurepolymere, in denen ein oder mehr Aminosäurereste ein künstliches chemisches Mimetikum einer entsprechenden natürlich vorkommenden Aminosäure ist, sowie auch auf natürlich vorkommende Aminosäurepolymere und nicht natürlich vorkommende Aminosäurepolymere. Wie hier verwendet, umfassen die Begriffe Aminosäureketten jeder Länge, einschließlich Volllängenproteine (d. h., Antigene), wobei die Aminosäurereste über kovalente Peptidbindung gebunden sind.
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Der Begriff ”Behandlung”, ”behandeln”, ”lindern” ”bekämpfen” und Ähnliches wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung in austauschbarer Weise verwendet und bedeutet, dass ein pharmakologischer Effekt und/oder physiologischer Effekt erzielt werden soll. Dieser Effekt kann prophylaktisch sein, im Sinne dass die Ausprägung der NF1 Krankheit oder assoziierte Symptome vollständig oder teilweise unterbunden werden oder der Effekt kann therapeutischer Natur sein, so dass eine vollständige oder teilweise Genesung von einem NF1 assoziierten Tumor oder anderer NF1 assoziierten Symptome erzielt wird.
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”Inhibitor” ist jede Substanz, welche eine physiologische Aktion oder Antwort verhindert oder vermindert.
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Die Begriffe ”induzieren”, ”inhibieren”, ”erhöhen”, ”erniedrigen”, ”sinken” oder Vergleichbares, beziehen sich auf einen quantitativen Unterschied zwischen zwei Werten/Leveln/Konzentrationen und bezeichnen zumindest einen signifikanten Unterschied zwischen diesem beiden Werten/Leveln/Konzentrationen. Zum Beispiel drückt die Bezeichnung ”wobei das Vorliegen einer dieser Proteine oder Fragmente davon in veränderter Konzentration im Vergleich zu deren Konzentration in einer Referenzprobe ...” aus, dass das der Wert/Level/Konzentration oder Expression eines der erfindungsgemäßen Proteine oder Fragmente davon in einer zu untersuchenden Probe statistisch signifikant unterschiedlich ist im Vergleich zu dem Wert/Level/Konzentration oder Expression des eines der erfindungsgemäßen Proteine oder Fragmente davon zu einem gesunden bzw. nicht NF1 Patienten.
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Unter den Begriff ”Reagenzien, die spezifisch für den Nachweis von mindestens einem Protein sind”, ”Reagenz, das spezifisch für ein Protein ist” bzw. ”spezifisches Reagenz oder Mittel” werden gemäß der vorliegenden Erfindung vorzugsweise ”Bindungsmoleküle” bzw. ein Bindungsmolekül wie Antikörper und deren Antigen-bindende Fragmente verstanden, die spezifisch an ein Zielprotein oder Fragment davon binden. Ebenso umfasst sind aber auch äquivalente, nicht auf Antikörper beruhende Bindungsmoleküle die an die hier beschriebenen Proteine, d. h. Biomarker binden, einschließlich aber nicht beschränkt auf Hormone, Rezeptoren und deren Bindungsdomänen, Liganden, Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) Moleküle, Chaperone wie Hitzeschockproteine (HSPs) sowie Zell-Zelladhäsionsmoleküle wie Mitglieder der Cadherin, Intergrin, C-type Lektin and Immunoglobulin (Ig) Superfamilien. Neben Protein-basierenden Bindungsmolekülen kommen auch Nukleinsäuren, beispielsweise RNA-Moleküle in Betracht, die so genannten Aptamere, die zur Bindung an biologische Moleküle dienen können und aufgrund der Affinität und Spezifität zu therapeutischen oder diagnostischen Zwecken eingesetzt werden können, wie dies auch mit Hilfe von Antikörper der Fall ist. Genauso wie Antikörper und ähnliche Bindungsmoleküle können Aptamere in vitro und/oder in silico auf ein besseres Bindungsverhalten optimiert werden. Eine bevorzugte RNA-Spezies als Bindungsmolekül werden Spiegelmere eingesetzt, die spiegelverkehrte RNA-Abschnitte und daher resistent gegen enzymatischen Abbau sind. Ansonsten kommen aufgrund der im Stand der Technik entwickelten kombinatorischen Substanzbibliotheken und Screeningverfahren grundsätzlich natürlich auch andere Molekülklassen in Betracht, die auf die Bindung eines der in der vorliegenden Anmeldung beschriebenen Proteine selektioniert werden können. In einer Ausführungsform werden unter den vorgenannten Begriffen auch Mittel zum Nachweis der Genexpression beispielsweise der mRNA des betreffenden Proteins umfasst, d. h. Nukleinsäure-Sonden wie DNA oder RNA Oligonukleotide, sofern deren Nachweis zu vergleichbaren, d. h. im Wesentlichen identischen oder ähnlichen Ergebnissen wie der Nachweis des entsprechenden Proteins führt. Grundsätzlich werden allerdings unter den Begriffen ”Reagenz” und ”Mittel” besonders bevorzugt Bindungsmoleküle verstanden, die Nachweis des Proteins oder Fragmenten davon geeignet sind.
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Der Klarheit wegen werden zur Erläuterung der vorliegenden Erfindung deren nachfolgenden Ausführungsformen wie auch die Beispiele im Wesentlichen anhand von Antikörpern illustriert, ohne dass dies als Einschränkung auf diese Klasse von Bindungsmolekülen verstanden wird.
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Der Ausdruck ”bindet spezifisch” oder ”spezifisch für den Nachweis”, wenn auf ein Protein bzw. Biomarker oder Fragmenten davon bezogen bezieht sich auf eine Bindungsreaktion, die bestimmend ist für das Vorhandensein des Proteins in Anwesenheit einer heterogenen Population von Proteinen und anderen biologischen Wirkstoffen. Daher, unter bestimmten Immunoassay-Bedingungen, binden die näher beschriebenen Antikörper oder Fragmente davon, Aptamere oder Spiegelmere an ein bestimmtes Protein und binden nicht in einer signifikanten Menge an andere Markerproteine oder Fragmente davon, die in der Probe vorhanden sind. Typischerweise wird eine spezifische oder selektive Reaktion mindestens dem zweifachen Hintergrundsignal oder Rauschen entsprechen, und noch typischerweise mehr als dem 10- bis 100-facher Hintergrund.
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Der Begriff ”Konzentration” oder ”veränderte Konzentration” wird gleichbedeutend mit dem Begriff ”Wert”, ”Referenzwert”, oder ”Level” der erfindungsgemäßen Proteine oder Fragmente davon bezeichnet und meint die Menge eines Proteins oder Fragment davon in einer Probe, wobei eine veränderte Konzentration signifikant ist, wenn sie eine Abweichung in Bezug auf den Referenzwert von mindestens 5%, 10%, 20% 30% 40% 50% 60% oder 70% aufweist, bevorzugt eine Abweichung von mindestens 5% verglichen zu einem Referenzwert aufweist.
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”Zytokine” sind von Zellen gebildete Substanzen, die als Vermittler die Aktivität anderer Zellen beeinflussen. Dazu gehören beispielsweise Wachstumsfaktoren. Weiterhin gibt es Zytokine, die die Entzündungsreaktion hemmen und Zytokine, die die Entzündungsreaktion fördern. Entzündungsreations-fördernde Zytokine, auch entzündliche/inflammatorische Zytokine genannt sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung der Interferon gamma (IFNgamma), Tumornekrosefaktor apha (TNFalpha), Interleukin 6 (IL-6) und Regulated an Activation, Normal T cell Expressed and Secreted (RANTES) die dem Fachmann gut bekannt und ausführlich in der der Literatur beschrieben sind; siehe beispielsweise in den Referenzen [51] für IFNgamma, [46, 48] für TNFalpha, [54] für IL-6 und [58] für RANTES.
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”Wachtumsfaktoren” sind gemäß der vorliegenden Erfindung Insulin-ähnlicher Wachstumsfaktor Bindungsprotein-1 (IGFBP-1), human Platelet-Derived Growth Factor-BB (PDGF-BB), Der epidermaler Wachstumsfaktorrezeptor (EGFR), kann mit EGF sowie TNFalpha interagieren. Diese Faktoren die dem Fachmann gut bekannt und ausführlich in der der Literatur beschrieben sind; siehe beispielsweise in den Referenzen [52] für IGFBP-1, [59] für PDGF-BB, und [46] für EGFR.
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”Inhibitoren”, ”Aktivatoren”, und ”Modulatoren” von Zytokinrezeptoraktivität werden verwendet, um inhibierende, aktivierende, bzw. modulierende Moleküle zu beschreiben, die durch die Verwendung von in vitro- und in vivo-Assays für Zytokinrezeptorbindung oder Signalweiterleitung identifiziert wurden, z. B., Liganden, Agonisten, Antagonisten, und deren Homologe und Mimetika.
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Der Begriff ”Wirkstoff” schließt Inhibitoren und Aktivatoren ein. Inhibitoren sind Wirkstoffe, die z. B., an Zytokinrezeptoren binden, teilweise oder vollständig die Stimulation blocken, deren Aktivierung erniedrigen, verhindern, die Aktivität verzögern, inaktivieren, desensitivieren, oder herunter regulieren, z. B., Antagonisten. Aktivatoren sind Wirkstoffe, die, z. B., an Zytokinrezeptoren binden, deren Aktivierung stimulieren, erhöhen, öffnen, aktivieren, erleichtern, verstärken, die Aktivität sensitivieren, oder hochregulieren, z. B., Agonisten. Modulatoren schließen Wirkstoffe ein, die z. B. die Wechselwirkung von Zytokinrezeptoren mit: Proteinen, die Aktivatoren oder Inhibitoren binden, Rezeptoren, einschließlich G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs), Kinasen, etc., verändern. Wirkstoffe schließen genetisch modifizierte Versionen von natürlich vorkommenden Zytokinrezeptor-Liganden ein, z. B., mit veränderter Aktivität, sowie natürlich vorkommende und synthetische Liganden, Antagonisten, Agonisten, kleine chemische Moleküle und Ähnliches. Proben oder Assays, die Zytokinrezeptoren umfassen, die mit einem potentiellen Aktivator, Inhibitor oder Modulator behandelt sind, werden mit Kontrollproben ohne den Inhibitor, Aktivator, oder Modulator verglichen, um das Ausmaß der Inhibition zu bestimmen. Kontrollproben (nicht mit den Inhibitoren behandelt) wird ein relativer Zytokinrezeptor-Aktivitätswert von 100% zugeordnet. Inhibierung eines Zytokinrezeptors ist erreicht, wenn der Zytokinrezeptor-Aktivitätswert im Vergleich zur Kontrolle ungefähr 80%, 70% 60% gegebenenfalls 50% oder 25-0% beträgt. Aktivierung eines Zytokinrezeptors ist erreicht, wenn der Zytokinrezeptor-Aktivitätswert im Vergleich zur Kontrolle 110%, gegebenenfalls 150%, gegebenenfalls 200–500%, oder 1000–3000% höher ist.
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Ausführliche Beschreibung der Erfindung
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Im Allgemeinen betrifft die vorliegende Erfindung diagnostische Mittel und Medikamente zur Diagnose, Prävention und Behandlung der Neurofibromatose Typ 1 (NF1) und zur Früherkennung bzw. Prognoseabschätzung sowie Behandlung von NF1 assoziierten Tumoren.
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Wie in den Beispielen gezeigt, wurde in Experimenten, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung durchgeführt wurden mittels Antikörper-basierter Microarray-Technologie 58 nach erfindungsgemäß zusammengestellten Kriterien ausgewählte Proteine, die potentiell vom Körper sekretiert werden auf ihr diagnostisches Potential bei NF1 Patienten untersucht. In diesen Experimenten konnten im Blutserum von NF1 Betroffenen mehrere Proteine identifiziert werden, die im Vergleich zu nicht NF1-Erkrankten eine signifikant veränderte Serumkonzentration aufwiesen: EGFR, IFNgamma, IL-6, TNFalpha. Bis auf EGFR zeigten diese Proteine eine erhöhte Serumkonzentration bei NF1-Patienten. Die Proteine IGFBP1 und RANTES zeigten bei NF1-Patienten mit MPNST eine signifikant höhere Serumkonzentration im Vergleich zu NF1-Patienten ohne MPNST und das Protein PDGF-BB zeigt bei NF1-Patienten mit plexiformen Neurofibromen eine signifikant niedrigere Serumkonzentration im Vergleich zu NF1-Patienten ohne plexiforme Neurofibrome. Dementsprechend wird gemäß der vorliegenden Erfindung erstmals ein Set von Biomarkern bereitgestellt, mit deren Nachweis es möglich ist NF1 und assoziierte Tumore frühzeitig zu diagnostizieren, und vorteilhafterweise zwischen der Ausprägung bzw. Vorhandensein von NF1, NF1 assoziierten malignen peripheren Nervenscheidentumor (MPNST) und plexiformen Neurofibrom (PNF) zu differenzieren und zudem die Tumorlast in NF1-Patienten zu bestimmen, was beispielweise hilfreich in der Dosierung einer Chemotherapie ist. Da die vorgenannten Biomarker in Serum nachgewiesen werden, das einfach zu gewinnen und reproduzierbare Ergebnisse erlaubt, stellt die vorliegende Erfindung Serummarker zur frühzeitigen, zuverlässigen und kostengünstigen Diagnose von NF1 und NF1 assoziierter Tumore, insbesondere MPNST zu Verfügung. Es wird davon ausgegangen, dass das erfindungsgemäße Verfahren große Relevanz in der klinischen Praxis erlangen wird, da besonders bei NF1-Sonderformen und Kindern mit wenigen Symptomen die Diagnosestellung bisher schwierig ist, da bisher keine Serummarker zur Diagnose von NF1 bzw. MPNST oder anderweitige, nicht-invasive und praktizierbare Nachweisverfahren zur Verfügung stehen. Da eine frühzeitige Operation die derzeit einzige therapeutische Option darstellt, könnte die Überlebenschance eines MPNST Patienten (Überlebenszeit bisher 17 Monate) durch eine frühzeitige Diagnosestellung extrem verbessert werden.
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Daher wird ein in vitro Verfahren bereit gestellt zur Diagnose und/oder Früherkennung einer Neurofibromatose Typ 1 (NF1) und/oder eines NF1 assoziierten Tumor, umfassend den Nachweis mindestens eines Proteins ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Tumor Nekrose Faktor alpha (TNFalpha), Interferon gamma (IFNgamma), Epidermaler Wachstumsfaktorrezeptor (EGFR), Insulin ähnlicher Wachstumsfaktor Bindungsprotein-1 (IGFBP-1), Regulated an Activation, Normal T cell Expressed and Secreted (RANTES) und humaner Platelet-Derived Growth Factor-BB (PDGF-BB) oder eines Fragments einer dieser Proteine in einer Probe von einem Patienten, wobei das Vorliegen einer dieser Proteine oder Fragmente davon in veränderter Konzentration im Vergleich zu deren Konzentration in einer Referenzprobe das Vorliegen und/oder die Entwicklung einer NF1 oder eines NF1 assoziierten Tumor anzeigt. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße Verfahren auch den Nachweis von Interleukin 6 (IL-6).
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So stellt die vorliegende Erfindung ein Nachweisverfahren bereit, das sich zur Früherkennung und/oder Diagnose von NF1 Störung in einem Individuum eignet. In Ausführungsformen umfasst das erfindungsgemäße Verfahren das Auffinden der Werte der TNFalpha, IFNgamma, EGFR, RANTES, PDGF-BB, IGFBP-1 sowie IL-6 Proteinen oder Fragmenten davon in einer Körperflüssigkeitsprobe eines Individuums und des Vergleichens zu einer Referenzprobe, wobei die Anwesenheit von einer veränderten Menge der Markerproteine oder Fragmente davon als die der vorbestimmten Menge die Wahrscheinlichkeit einer Neurofibromatose Typ 1 Störung anzeigt.
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Die Vielseitigkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens zeigt sich in den experimentellen Daten, die in Verbindung mit der vorliegenden Erfindung durchgeführt wurden. So deuten die experimentellen Daten der vorliegenden Erfindung darauf hin, dass der Grad der immunologischen Deregulation indirekt das Risiko für Tumorwachstum und maligne Transformation erhöht. Wie aus Beispiel 2 und ersichtlich, sind die Serumkonzentration der vier Proteine IL-6, TNFalpha, IFNgamma, EGFR zwischen NF1-Patienten und gesunden Subjekten unterschiedlich. Dabei sind die Konzentration des epithelialen Wachstumsfaktorrezeptors (EGFR) signifikant geringer in NF1-Patienten verglichen zu gesunden Subjekten, wobei die inflammotrischen Zytokine IFγ, TNF-α und IL-6 einen signifikant höheren Serumlevel in NF1-Patienten zeigen.
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So kann mit dem erfindungsgemäßen Verfahren durch den Nachweis eines veränderten Wertes der TNFalpha, IFNgamma, EGFR sowie zusätzlich des IL-6 Proteins oder Fragments davon in einer Probe eines Individuums, verglichen zu Werten, die für Nicht-NF1-Betroffene charakteristisch sind, eine Aussage darüber getroffen werden, ob das zu untersuchende Individuum eine NF1 Erkrankung aufweist. Wobei ein erhöhter Wert für TNFalpha, IFNgamma und IL-6 und ein erniedrigter Wert für EGFR in einer zu untersuchenden Probe verglichen zu Referenzwerten, auf eine NF1 Erkrankung hindeutet. In diesem Zusammenhang ist der Nachweis von mindestens zwei der erfindungsgemäßen Markerproteine besonders vorteilhaft um eine zuverlässige Aussage darüber zu erhalten ob ein Individuum eine NF1 Störung aufweist.
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Kürzlich wurde in der Veröffentlichung von Lasater et al., Journal of Clinical Investigation 120 (2010), 859–70 gezeigt, dass NF1-Patienten Anzeichen einer chronischen Entzündung aufweisen und es wurde vermutet, dass das vermehrte Einwandern entzündlicher Zellen in die Gefäßwände bei NF1-Patienten für häufigere Gefäßverschlüsse verantwortlich ist. In diesem Zusammenhang wurde an einer sehr kleinen Kohorte (N = 6) von NF1-Patienten gezeigt, dass der IL-6 Zytokinlevel im Blutplasma erhöht vorlag. Allerdings lässt die Anzahl der untersuchen Proben (n = 6) keine signifikante Aussage dieses Ergebnis zu. Weiterhin wurde von den Autoren in Lasater et al diese Untersuchungen im Kontext von vaskulären Störungen, die bei NF1 Patienten beobachtet werden, durchgeführt, so dass die Autoren sich auf die Untersuchung von diesbezüglich spezifischen Markern spezialisiert haben. Zudem wurde die Probe in dem Plasma von Patienten untersucht, dass im Gegensatz zu Serum, wie in der vorliegenden Erfindung verwendet, der fast zellenfreie Überstand nach Zentrifugation von dem Vollblut ist. Dies führt dazu, dass signifikante diagnostische Konzentrationsunterschiede in einer Plasmaprobe verglichen zu einer Serumprobe vorherrschen und nicht miteinander korrelieren müssen. Dies wird beispielsweise dadurch deutlich, dass obwohl die Autoren neben IL-6 auch andere Zytokine wie TNFalpha, IFNgamma untersucht haben, wie aus dem Methodenteil auf Seite 869 linke Spalte, zweiter Abschnitt ersichtlich, keine Unterschiede in der Plasmakonzentration festgestellt haben, da die Autoren zu diesen Experimenten schweigen.
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Weiterhin kann mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens die Diagnose und/oder Früherkennung der Anwesenheit eines Tumors in einem Individuum, insbesondere Tumoren des Nervensystems gestellt werden. Wie in Beispiel 4 erläutert und in dargestellt, zeigen die Proteine IGFBP1 und RANTES einen signifikanten Unterschied zwischen NF1-Patienten mit MPNST und denen ohne MPNST. Dabei kann kein Unterschied für die beiden Proteine zwischen den Kontrollgruppen und den NF1-Patienten ohne MPNST (n = 74) detektiert werden ( , B). Interessanterweise korreliert die Konzentration von IGFBP1 mit der internen Tumorlast ( ) und der IGFBP1 Level in einer Probe mit dem Vorhandensein von MPNST ( ). Zusammengenommen zeigen diese Daten dass IGFBP1 ein neuer Risikomarker für maligne Transformation in NF1 Patienten ist. Darüber hinaus wird in Beispiel 3 und gezeigt, dass PDGF-BB sich als Marker für plexiforme Neurofibrome (PNF) eignet. Zudem zeigt PDGF-BB eine erhöhte Konzentration in NF1 Patienten mit MPNST Tumoren wie ersichtlich.
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Daher umfasst das erfindungsgemäße Verfahren einen Nachweis in einer Blut- oder Serumprobe von dem Individuum, wobei die Menge von RANTES, PDGF-BB sowie IGFBP-1 Protein in der Probe festgestellt wird und anschließend mit einem Referenzwert verglichen, wobei ein veränderter bzw. erhöhter oder erniedrigter Wert eines, zwei oder drei der Proteine oder Fragmente davon oder einer Kombinationen von ein bis drei der Proteine oder Fragmente davon im Vergleich zu der Referenzprobe darauf hindeutet, dass das zu testende Individuum einen Tumor, der mit einer NF1 Störung assoziiert ist, aufweist.
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Bei der Durchführung dieses Testverfahrens, ist es natürlich nicht erforderlich, dass die Probe von der zu testenden Person, gleichzeitig mit einer Probe einer Nicht-NF1 betroffenen Person bzw. einer NF1 betroffenen Person, die keine NF1-assoziierten Tumore aufweist jeweils getestet wird. Stattdessen kann der Vergleich auch anhand zuvor festgelegter Werte von Personen, die nicht über eine Neurofibromatose Typ 1 Störung bzw. NF1 betroffenen Person, die keine NF1-assoziierte Tumore aufweisen, erfolgen. Solche Referenzwerte können entweder von dem individuell zu behandelnden Patienten im Laufe der Therapie gewonnen werden oder sind das Ergebnis von großflächigen Studien. Üblicherweise stammt ein Referenzwert aus einer so genannten gesunden Kontrollgruppe. Der Fachmann in diesem Bereich ist ohne weiteres in der Lage, geeignete Protokolle auszuwählen um so geeignete Referenzwerte erhalten zu können. Diesbezüglich weiß der Fachmann, dass der Spender der Referenzprobe auch ansonsten gesund ist, d. h. insbesondere frei von Entzündungen und anderweitiger Störungen ist, die durch unkontrolliertes Zellwachstum bedingt sind.
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Wenn nicht anders angegeben, stellen die hierfür beschriebenen Ausführungsformen gleichermaßen Ausführungsformen, in denen die verwendeten TNFalpha, IFNgamma, EGFR, IL-6, RANTES, PDGF-BB, IGFBP-1 sowie Proteine oder Fragmente davon, Alternativen bzw. äquivalente Proteine/Peptid-Isoformen oder dessen mRNA Transkripte, dar und können anstatt der Proteine oder Fragmente davon in dem erfindungsgemäßen Verfahren nachgewiesen werden. Ferner versteht sich, dass eine hier beschriebene Ausführungsform der vorliegenden Erfindung bzw. deren Merkmale mit einer oder mehreren anderen hierin beschriebenen Ausführungsformen und deren Merkmalen kombiniert werden können, sofern sich die jeweiligen Ausführungsformen nicht ausschließen.
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Wie bereits vorstehend erläutert, liegt der vorliegenden Erfindung die überraschende Beobachtung zugrunde, dass (a) eine erhöhte Konzentration von TNFalpha, IFNgamma, und/oder IL-6 bzw. eine erniedrigte Konzentration von EGFR für NF1; (b) eine erhöhte Konzentration von IGFBP1 und/oder RANTES für einen NF1 assoziierten malignen peripheren Nervenscheidentumor (MPNST); und (c) eine erniedrigte Konzentration von PDGF-BB für plexiforme Neurofibrome (PNF) bezeichnend ist; und wobei die Referenzprobe in (a) und von einem gesunden Subjekt und in (b und c) von einem NF1 Patienten stammt.
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Ein wesentlicher Aspekt sowie Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens wird durch das Nachweisverfahren der Erfindung bereitgestellt. Denn der Nachweis ob ein zu untersuchendes Individuum an einer NF1-Erkrankung leidet oder sich ein MPNST Tumor in einem frühen Stadium befindet, der aber noch keine klinischen Symptome zeigt, ermöglicht es einerseits erstmals eine verlässliche Diagnose zu stellen, was für die Beteiligten als auch Angehörigen als ein bedeutender Schritt gewertet wird, da zumeist Kinder die Betroffenen sind und schon im frühen Alter bzw. ab Geburt körperliche als auch geistige Auffälligkeiten, wie Lernschwächen oder auch veränderte Gliedmaßen aufweisen können. Zudem kann die Frühdiagnose eines MPNST maßgeblich dafür verantwortlich sein, dass eine erfolgreiche Behandlung des NF1 assoziierten Tumors stattfinden kann und somit die Lebenserwartung eines NF1 Patienten maßgeblich erhöht, da wie vorstehend erwähnt, eine MPNST-spezifische Behandlung nur wenn es in einem sehr frühen Stadium diagnostiziert wird, erfolgsversprechend ist.
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Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens begründet sich in den Nachweis der erfindungsgemäßen Marker in einer leicht zugänglichen Blutprobe, die im Gegensatz zu einer Biopsie, wie eine Tumor- oder Stanzbiopsie, routinemäßig bei einem Arztbesuch entnommen werden kann. Zum Anderen ist das erfindungsgemäße Verfahren, wie nachfolgend in den Beispielen noch ausführlich beschrieben, gegenüber den im Stand der Technik eingesetzten Verfahren, wie psychometrischen Verfahren, neuro-bildgebenden Verfahren oder dergleichen, deutlich vereinfacht und kostengünstig durchzuführen, wobei es den erstaunlichen Vorteil aufweist, dass mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahren zum ersten Mal die Früherkennung bzw. das Vorhandensein eines NF1 assoziierten Tumors bestimmt werden kann bevor dieser klinisch auffällig wird bzw. ohne die Entnahme einer Gewebeprobe, wodurch die Chancen zur erfolgreichen Behandlung, besonders bei einem MPNST Tumor, deutlich verbessert werden. Die Ergebnisse, welche mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens erhalten werden, können jedoch zur Sicherung der Diagnose mit bildgebenden Verfahren sowie einer Biopsie validiert werden.
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Die Proben, die in dem Verfahren gemäß der Erfindung verwendet werden, umfassen flüssige Proben, wie z. B. Blut, Urin, Speichel oder Gewebeflüssigkeiten, die gegebenenfalls auch weiter fraktioniert werden können. Falls bereits Gewebeproben, wie z. B. Gewebeschnitte auffälliger oder veränderter/entarteter Hautpartien oder Tumorbiopsien vorhanden sind, kann das erfindungsgemäße Verfahren auch an diesen Gewebeproben durchgeführt werden. Wie in den Beispielen 5 und 6 sowie in den und gezeigt, sekretieren die Lymphozyten, welche in einen MPNST Tumor einwandern als auch die Tumorzellen selbst das RANTES Protein. Bei Bedarf können die Proben in geeigneter Weise hergestellt bzw. aufbereitet werden um die Probe zu analysieren und die Konzentration der erfindungsgemäßen Marker darin zu bestimmen. Zur Aufbereitung der Proben können gängigen Methoden verwendet werden, die dem Fachmann bekannt sind. Die so erhaltenden Fraktionen einer flüssigen Probe oder durch Homogenisierung aufbereitete Gewebeproben können in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Probe eine menschliche Probe, beispielsweise eine Körperflüssigkeit, wie Blut, Speichel, Urin, einer Gewebeflüssigkeit wobei die Probe aus der Gruppe bestehend aus einer Blutprobe, einer Serumprobe und einer Plasmaprobe ausgewählt ist. Vorzugsweise handelt es sich bei der Probe um Serum.
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Der Nachweis der erfindungsgemäßen Markerproteine kann mittels jedem gängigen Verfahren, dass sich zum Proteinnachweis eignet, durchgeführt werden. Erfindungsgemäß bevorzugt erfolgt der Nachweis der Markerproteine oder Fragmente davon durch ein immunologisches Verfahren.
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Durch die Bindung mindestens einen Antikörpers, der mindestens ein erfindungsgemäßes Markerprotein erkennt, oder wenigstens einem weiteren Antikörper, Antikörper-Chip-, Protein Chip-Microrarray, beschichteter Mikrotiterplatte oder Lateral-Flow-Vorrichtungen/immunochormatographischer Schnelltest/Teststreifen, können eine Vielzahl an Nachweisreagenzien bereitgestellt werden, die in einer Vielzahl von Verfahren eingesetzt werden. Um die Spezifität des erfindungsgemäßen Diagnoseverfahrens zu gewährleisten, wird bevorzugt der Nachweis von mindestens einem zweiten erfindungsgemäßen Markerprotein in einer Probe untersucht. Diese Verfahren sind dem Fachmann ausreichend bekannt, siehe beispielsweise die Veröffentlichung
"Bioanalytik" (Lottspeich und Zorbas, Spektrum Verlag 1998).
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In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das erfindungsgemäße immunologische Nachweisverfahren ausgewählt aus einer Gruppe bestehend aus direkter ELISA, indirekter ELISA, Sandwich ELISA, Zellkultur ELISA, Durchflusszytometrie (FACS), immunochromatographischer Schnelltest und Protein-Chip Microarray.
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Insbesondere immuncytochemische Verfahren, wie die Bestimmung durch die Durchflusszytometrie (FACS), die Bestimmung durch einen ”Enzyme linked Immunosorbent Assay” (ELISA) oder mit Hilfe eines Protein Chip-Microarray haben sich als besonders geeignet erwiesen. Als hervorragende Alternative ist ein Test auf einem Testträger mit möglichst geringem Volumenbedarf, z. B. auf einem Teststreifen wie dem immunochromatographischen Schnelltest auch ”Lateral Flow Assay” (LFA) genannt, zu verwenden wie beschrieben z. B. in den internationalen Patentameldungen
WO 2003/068398 A2 WO 2007/055712 A2 , Lateral-Flow-Geräte (LFD, Teststreifen) sind in der internationalen Anmeldung
WO 02/059567 A2 beschrieben.
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Die LFA basieren auf dem gleichen Prinzip wie andere immunologische Assays (ELISA, Magnetic Bead Assays usw.), sie nützen den Effekt der Antikörper-Antigen Reaktion aus. Zusätzlich haben sie chromatographische Eigenschaften, da die Antikörper auf einer Membran gebunden sind. Die zu analysierende Probe (Lösung) wird durch die Kapillarkräfte über den ganzen Streifen gezogen und führt zu einem schnell sichtbaren Resultat. Aus den erwähnten Gründen wird der LFA auch als Immun-Chromatographie bezeichnet. Die überschüssige Flüssigkeit mit den an der Test- bzw. Kontrolllinie nicht gebundenen Goldpartikeln strömt weiter durch das Membransystem, bis sie von einem Filterpapier aufgesaugt wird und somit einen Rückfluss verhindert.
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Auch der Nachweis der erfindungsgemäßen Proteine oder Fragmente davon können unter Verwendung radioaktiv markierter Antigene oder Antikörper Radioimmunoassay (RIA) durchgeführt werden, beispielsweise in W. M. Hunter in "Handbook of Experimental Immunology, Kapitel 17, Oxford, Blackwell Scientific Publications, 1973 beschreiben. Die Durchführung selbst kann als kompetitiver RIA oder als Immunoradiometrischer Assay (IRMA) erfolgen.
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Wie vorstehend erwähnt, kann der Nachweis mit Enzym-markierten Antigenen oder Antikörpern Enzyme Immunoassay (EIA) erfolgen, vgl. U. Göbel Wehrmed. Mschr. 12, 354 (1979). Bekannt sind Enzyme-Linked-Immunosorbent-Assay (ELISA), Enzyme-Multiplied-Immunoassay-Technique (EMIT) oder auch der Nachweis mit fluorochrommarkierten Antigenen oder Antikörpern Fluoreszenzimmunoassay (FIA), vgl. B. Viel, MTA-Journal 1, 56 (1979), Grundlagen der Immunfluoreszenz. Weitere Informationen und Protokolle sind beispielsweise in Raem, Arnold M. Immunoassays. 1. Auflage, München; Heidelberg: Elsevier, Spektrum Akademischer Verlag., 2007; David Wild (Ed.): The Immunoassay Handbook. 3rd ed. Elsevier Science Publishing Company, Amsterdam, Boston, Oxford 2005 beschrieben. Weiterführende Informationen und Protokolle für die Durchführung verschiedener ELISA Assays sind in dem Fachmann im Bereich der Diagnostik gut bekannt, siehe beispielsweise Kapitel 11 von Ausubel (Ed) Current Protocols in Molecular Biology, fünfte Ausgabe, John Wiley & Sons, Inc, NY, 2002.
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In den oben aufgeführten Verfahren wird mindestens ein Antikörper mit einem Label markiert, dies kann beispielsweise ein Enzym, wie die Peroxidase, insbesondere Meerrettich-Peroxidase, Biotin, ein fluoreszierender Farbstoff, insbesondere Fluorescein (FITC, DFTF), R-Phycoerythrin (PE), Peridinium-Chlorophyll-Protein (PerCP) und Tandem-Konjugate, wie PE-Cy5 oder PE-Texas-Rot, Gold-Kolloid oder Rodionuclide sein. Zudem kann ein weiterer Antikörper an eine feste Phase gebunden werden. Durch eine solche Kennzeichnung eines Antikörpers ist es möglich, direkt die Anwesenheit und Konzentration des markierten Antikörpers qualitativ und quantitativ zu bestimmen und darüber das daran gebundene Epitop eines der Markerproteine.
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Wie bereits zu Anfang erwähnt, wurden die erfindungsgemäßen Markerproteine durch einen beim Hersteller in Auftrag gegebenen ”custumized” Protein Micro-Chip Array, ein sogenannter Quantibody® Array aufgefunden. Daher eignen sich Microarray-Chip Array ebenfalls sehr gut für das erfindungsgemäße Verfahren sowie zu Diagnosezwecken, da minimale Mengen an einer Blut oder Serumprobe oder Kulturüberstände von Tumorzellen oder Biopsiematerial eines Patienten verwendet werden können. Zudem werden die Proben Daten zumeist mindestens in einer Doppelbestimmung wenn nicht sogar in einer Dreifachbestimmung ausgewertet und somit werden Fehler minimiert. Zusätzlich bietet die Protein Chip Technologie den Vorteil in Diagnostischen Labors gleichzeitig mehrere Proben von Patienten sowie von Kontrollen durchzuführen und damit auch gleichzeitig Vergleichsdaten bereitzustellen, die Aussagen über die Qualität des durchgeführten Assay einerseits zu lassen, als auch wertvolle zusätzliche Vergleichswerte zwischen den einzelnen untersuchten Patienten zu lassen. Vom relevanten Zellmaterial können oft nur kleinste Mengen gewonnen werden, was den Umfang der Untersuchungsmöglichkeiten einschränkt. Um eine zielgerichtete Behandlung des Patienten durchführen zu können, ist eine umfangreiche Untersuchung des Biopsiematerials jedoch unerlässlich. Deswegen ist es wichtig, dass die Biopsie des Patienten zu Analysezwecken optimal genutzt wird und als Ausgang für so viele Microarray-Chips wie möglich dient. Üblicherweise werden die Chips mit Mikrodispensersystemen hergestellt.
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Microarrays sind in der Lage die schnelle und hochparallele Detektion einer Vielzahl spezifisch bindender Moleküle in einem einzigen Experiment zu ermöglichen. Oligonukleotid- und cDNA-Microarrays, welche eine Vielzahl individueller Gene auf Filter- oder Glasoberflächen repräsentieren, sind dem Fachmann gut bekannt und beispielsweise in der europäischen Patentanmeldung
EP 2 189 791 A1 oder
WO 95/35505 beschrieben. Neben den Oligonukleotid-basierenden Microarrays gibt es auch Protein-basierte Microarrays. Ein Vorteil gegenüber DNA-Microarrays ist die schnellere Analyse von Proben, da man auf eine Vermehrung des genetischen Materials sowie die Hybridisierung verzichten kann. Zudem lassen Protein-Microarrays eine Analyse des tatsächlichen Proteinlevels zu. Die ist besonders wichtig, da mRNA- und Proteinmenge nicht immer miteinander korrelieren, und man daher aus den DNA-Microarray-Ergebnissen nicht unbedingt auf die Höhe der Proteinexpression schließen kann.
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Bei Protein-Microarrays werden statt der DNA-Kopien kleine Proteinmengen auf dem Trägermaterial aufgebracht. Diese auch Chips genannt, werden mit einer proteinhaltigen Probe, zum Beispiel einem Antikörper, inkubiert, wobei dieser dann an einige der auf dem Chip befindlichen Protein-Spots bindet. Nach der Durchführung eines Waschschritts, bei dem ungebundener Antikörper entfernt wird, kann die Stärke des Signals jedes Spots und damit die Menge des dort gebundenen Antikörpers aus der Probe ermittelt werden. Das Signal entsteht beispielsweise durch einen weiteren Antikörper, der an einen fluoreszierenden Farbstoff gebunden ist und wiederum an den ersten Antikörper bindet. Man kann die verschiedenen Protein-Microarray-Arten nach der Art der Interaktion (Antigen-Antikörper, Enzym-Substrat, Rezeptor-Protein oder allgemeine Protein-Protein Interaktion) unterscheiden. Bei einem Sandwich Immunoassay werden Antikörper, die hochspezifisch an die zu untersuchenden Proteine binden, auf dem Trägermaterial immobilisiert. Die Ziel-Proteine werden auf das Array gegeben und binden an die zuvor immobilisierten Antikörper. Im dritten Schritt werden die gebundenen Proteine durch markierte Antikörper identifiziert. Antigen Capture Immunoassays: Wie bei der Sandwich-Methode werden spezifisch bindende Antikörper auf dem Array immobilisiert. Allerdings wird hier auf einen zweiten Antikörper zur Detektion verzichtet, die Proteine werden direkt mit einem Fluorophor markiert. Direkte Immunoassays: Hier werden die Zielmoleküle selber immobilisiert, als Detektoren fungieren wieder mit Fluorophoren markierte Antikörper. Es kann auch differenziert werden, ob Proteine der Probe am Array fixiert werden und dann mit einer Vielzahl von spezifischen, bekannten Testproteinen geprüft wird – oder ob die Testproteine in den Testflächen fixiert werden und dann die Reaktion mit den Probenproteinen erfolgt. Diese Techniken sind dem Fachmann bekannt und beispielsweise in MacBeath Nature Genetics 32 (2002), 526–532 beschrieben.
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Die Microarrays können auf einer Vielzahl von festen Oberflächen, wie Kunststoffen (z. B. Polycarbonat), komplexe Kohlenhydrate (z. B. Agarose und Sepharose), Acrylharze (z. B. Polyacrylamid und Latexkügelchen) und Nitrocellulose erstellt werden. Bevorzugte feste Trägermaterialien schließen Objektträger, Wafer, und positiv geladene Nylonmembran ein. Verfahren zur kovalenten Bindung der Antikörper an einen festen Träger sind in der Technik bekannt. Beispiele für solche Verfahren finden sich in
Bhatia et al, Anal. Biochem. 178 (1989), 408–413;
Ahluwalia, et al, Biosens. Bioelectron. 7 (1992), 207–214;
Jonsson, et al, Biochem. J. 227 (1985), 373–378 und
Freij-Larsson, et al, Biomaterials 17 (1996), 2199–2207. Alternativ können auch direkt Proteine oder Peptide an einen festen Träger gebunden werden oder zusätzlich Proteine an die bereits an den festen Träger gebundene Antikörper gekoppelt werden. Diesbezügliche Techniken sind dem Fachmann geläufig und beispielsweise in der
EP 218 9791 A1 oder
WO 95/35505 beschrieben.
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Substanzen, die zum Nachweisen von Proteinen in einem Microarray verwendet werden können, schließen fluoreszierende Farbstoffe, wie Fluoresceinisothiocyanat (FITC), Fluorescein, Rhodamin, Tetramethyl-Rhodamin-5-(und 6)-(TRITC), Texas-Rot-, Cyanin-Farbstoffe (Cy3 und Cy5, zum Beispiel) und dergleichen sowie Enzyme, die mit kolorimetrischen Substraten, wie z. B. Meerrettich-Peroxidase reagieren, ein. Die Verwendung von Fluoreszenzfarbstoffen wird im Allgemeinen in der Praxis der Erfindung bevorzugt, da diese in sehr geringen Mengen nachgewiesen werden können. Ferner erlaubt die Verwendung von Fluoreszenzfarbstoffen den gleichzeitigen Nachweis mehrere Antigene, die mit einem einzigen Array umgesetzt werden können, da jedes Antigen mit einer unterschiedlichen fluoreszierenden Verbindung markiert werden kann.
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Mittel zum Detektieren von Markierungen sind dem Fachmann gut bekannt. Daher, wo beispielsweise die Markierung eine radioaktive Markierung ist, schließen die Mittel zur Detektion einen Scintillationszähler oder fotographischen Film ein, wie bei der Autoradiographie. Wenn die Markierung eine Fluoreszenzmarkierung ist, kann durch Anregung des Fluorochroms mit der geeigneten Wellenlänge, die resultierende Fluoreszenz detektiert. Die Fluoreszenz kann visuell detektiert werden, durch fotographische Filme, durch die Verwendung eines elektronischen Detektors, wie beispielsweise charge coupled devices (CCDs) oder Fotomultipliern und ähnlichem. In ähnlicher Weise können enzymatische Markierungen detektiert werden durch Bereitstellung des geeigneten Substrats für das Enzym und Detektieren des resultierenden Reaktionsprodukts. Schließlich können einfache kolorimetrische Markierungen direkt durch Beobachtung der Farbe die mit der Markierung assoziiert ist, detektiert werden. Daher erscheint in verschiedenen Dipstick-Assays konjugiertes Gold oftmals pink, wobei verschieden konjugierte Beads in der Farbe der Beads erscheinen.
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Manche Assayformate benötigen keine Verwendung von markierten Komponenten. Zum Beispiel Agglutinationsassays können verwendet werden, um die Anwesenheit von Zielantikörpern zu detektieren. In diesem Fall werden Antigen-beschichtete Partikel durch Proben agglutiniert, die die Zielantikörper umfassen. In diesem Format braucht keiner der Komponenten markiert zu werden und das Vorhandensein des Zielantikörpers wird durch einfache visuelle Kontrolle detektiert.
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Wie vorstehend ausführlich beschrieben werden üblicherweise diagnostische Verfahren unter Verwendung von Antikörpern durchgeführt und können mittels leicht zu detektierenden signalerzeugenden Wirkstoffen in Verbindung mit den besagten Antikörpern oder Fragmente davon verwendet werden.
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Daher erstreckt sich die vorliegende Erfindung natürlicherweise auf die Verwendung eines TNFalpha, IFNgamma, EGFR, IGFBP1 und/oder RANTES spezifischen Reagenz oder Mittel zur Diagnose und/oder Früherkennung von NF1 und/oder eines NF1 assoziierten Tumor, wobei das Reagenz oder Mittel vorzugsweise ausgewählt ist aus einer Gruppe von einem Antikörper oder Fragment davon, Aptamer und Spiegelmer; siehe auch die vorstehende Definition des Begriffs ”Reagenz”. In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung auch die Verwendung eines anti-IL-6 und/oder PDGF-BB Antikörpers oder äquivalenten Reagenzien.
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Naturgemäß erstreckt sich die vorliegenden Erfindung somit auch auf die Verwendung von (i) IFNgamma, TNFalpha, EGFR, IGFBP1, RANTES, PDGF-BB und/oder IL-6 als Serummarker oder (ii) einem Reagenz zum Nachweis eines dieser Proteine in Serum zur Diagnose und/oder Früherkennung von NF1 und/oder eines NF1 assoziierten Tumors.
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Gemäß der Erfindung können Antikörper, die gegen die erfindungsgemäßen Proteine oder Fragmente davon gerichtet sind, verwendet werden um in einem Nachweisverfahren spezifisch an ein Epitop der Markerproteine zu binden. Dafür eignen sich kommerziell erhältliche Antikörper, die auch in den Experimenten zu der vorliegenden Erfindung verwendet wurden, welche in den unten aufgeführten Beispielen im Material und Methodenteil aufgelistet sind. Die Herstellung von polyklonalen oder monoklonalen Antikörpern sind dem Fachmann bekannt und in der Literatur gut beschrieben, siehe beispielsweise
Köhler G. und Milstein C. Nature 256 (1975), 495; oder
Galfre et al., Nature 266 (1977), 550). Gemäß der Erfindung können die Antikörper auch rekombinant hergestellt werden. Verfahren zur Herstellung von rekombinanten Antikörpern sind dem Fachmann aus dem Stand der Technik bekannt (vgl. z. B. bekannt,
Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Laboratory Press, 2001). Die Erzeugung von chimären Antikörpern ist beispielsweise beschrieben in
WO 89/09622 . Verfahren zur Erzeugung humanisierter Antikörper sind beispielsweise beschrieben in
EP-A1 0 239 400 und
WO 90/07861 .
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Gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst das erfindungsgemäße Verfahren natürlich auch funktionelle Varianten von vollständigen Antikörpern sowie deren Fragmente oder Derivate, die dem Fachmann auf dem Gebiet der Diagnostik bekannt sind und äquivalent zu den Antikörpern eine Bindung zu den Markerproteinen eingehen können.
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Bei dem Antigen-bindenden Fragment des monoklonalen Antikörpers kann es sich um ein einkettiges Fv-Fragment, ein F(ab')-Fragment, ein F(ab)-Fragment sowie ein F(ab')2-Fragment oder um ein beliebiges anderes Antigen bindendes Fragment handeln.
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Die Antikörper der vorliegenden Erfindung oder deren korrespondierende Immunglobulinkette(n) können unter Verwendung konventioneller im Stand der Technik bekannter Verfahren weiter modifiziert werden, beispielsweise durch Deletion(en), Insertion(en), Substitution(en), Addition(en) und/oder Rekombination(en) von Aminosäuren und/oder durch beliebige andere im Stand der Technik bekannte Verfahren, entweder alleine oder in Kombination. Verfahren zum Einfügen solcher Modifikationen in die DNA-Sequenz, die der Aminosäuresequenz einer Immunglobulinkette zu Grunde liegt, sind dem Fachmann wohl bekannt; siehe beispielsweise Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y. und Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1994). Modifikationen des erfindungsgemäßen Antikörpers schließen ein: chemische und/oder enzymatische Derivatisierungen an einer oder mehreren konstituierenden Aminosäuren, einschließlich Modifikationen der Seitenkette, Modifikationen des Rückgrats sowie N- und C-terminale Modifikationen einschließend Acetylierung, Hydroxylierung, Methylierung, Amidierung sowie die Anbindung von Kohlenhydrat- oder Lipidresten, Cofaktoren und dergleichen. Erfindungsgemäß können ebenfalls bi- oder multifunktionelle Moleküle zur Diagnose oder Früherkennung einer NF1 und/oder eines NF1 assoziierten Tumors verwendet werden, die eine Bindungsdomäne eines Antikörpers, eine Immunglobulinkette oder ein Bindungsfragment, die gemäß der vorliegenden Erfindung an das erfindungsgemäße Protein oder Fragment davon bindet sowie mindestens eine weitere funktionelle Domäne, umfassen.
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Der Antikörper kann mit einer markierenden Substanz bzw. Label markiert werden. Dies kann ein Enzym, ein Radioisotop, ein fluoreszierender Farbstoff, Biotin, Digoxigenin oder dergleichen sein. Das Enzym ist nicht besonders beschränkt, solange die Stabilität in dem Antikörper-bindenden Zustand erhalten bliebt sowie die Fähigkeit des Labels bzw. des daran gekoppelten Substrats eine Nachweisreaktion, wie z. B. der Wiedergabe des Substrats eine bestimmte Farbe erhalten bleibt. Zum Beispiel können Peroxidasen in den allgemein bekannten EIA (Enzymimmunoassay), β-Galactosidase, alkalische Phosphatase, Glucoseoxidase, Acetylcholin-Esterase, Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase, Malat-Dehydrogenase oder dergleichen verwendet werden. Darüber hinaus ist es auch möglich, ein inhibierendes Enzym, ein Coenzym oder dergleichen zu verwenden. Diese Enzyme können an den Antikörper durch ein bekanntes Verfahren unter Verwendung einer Maleimid-Verbindung oder eines solchen Vernetzungsmittels gebunden werden. Wie für das Substrat ist es möglich, eine bekannte Substanz nach der Art des zu verwendenden Enzyms zu verwenden. Zum Beispiel kann 3,3' oder 5,5'-Tetramethylbenzidin als Substrat, wenn Peroxidase als ein Enzym verwendet wird, oder Paranitrophenol als Substrat, wenn alkalische Phosphatase als Enzym verwendet wird, benutzt werden.
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Solche detektierbaren Markierungen sind im Bereich von Immunoassays gut entwickelt und allgemein können die meisten Markierungen, die nützlich in solchen Verfahren sind, in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Daher ist eine Markierung irgendeine Zusammensetzung, die durch spektroskopische, fotochemische, biochemische, immunochemische, elektrische, optische oder chemische Methoden detektierbar ist. Nützliche Markierungen in der vorliegenden Erfindung schließen ein, magnetische Beads (z. B., DynabeadsTM), Fluoreszenzfarbstoffe (z. B., Fluoroeszein-Isothiocyanat, Texasrot, Rhodamin, und ähnliches), Radiomarkierungen (z. B., 3H, 125I, 35S, 14C oder 32P), Enzyme (z. B., Meerrettich-Peroxidase, alkalische Phosphatase und andere, die üblicherweise in einem ELISA verwendet werden) und kolorimetrische Markierungen wie z. B. kolloidales Gold oder gefärbtes Glas oder Plastik (z. B. Polystyrol, Polypropylen, Latex, etc.) Beads.
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Die Markierung kann entsprechend im Fachbereich gut bekannter Methoden direkt oder indirekt an die gewünschte Komponente des zu verwendenden Assays gekoppelt werden. Wie oben angezeigt, kann eine breite Vielfalt von Markierungen verwendet werden, wobei die Wahl der Markierung abhängt von der erforderlichen Sensitivität, die einfache Konjugation mit der Verbindung, Stabilitätserfordernisse, verfügbare Geräteausstattung und Entsorgungsvorkehrungen
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Nicht-radioaktive Markierungen werden oft durch indirekte Mittel angehängt. Die Moleküle können ebenfalls direkt an die signalerzeugende Verbindung konjugiert werden, z. B., durch Konjugation mit einem Enzym oder fluoreszierender Verbindung. Eine Vielfalt von Enzymen und fluoreszierenden Verbindungen kann in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden und sind dem Fachmann gut bekannt (zur Übersicht verschiedener Markierungs- oder signalproduzierende Systeme, die verwendet werden können, siehe, z. B.,
U.S. Patent Nr. 4,391,904 ).
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Daher ist die vorliegende Erfindung auch nicht auf Antikörper beschränkt. Auch Agentien, die an die Markerproteine oder Fragmente davon direkt oder indirekt binden können sind Bestandteil der Erfindung. So können beispielsweise interagierende Proteine oder Peptide oder Antikörper-abgeleitete Moleküle wie Fab, Fv oder scFv Fragmente verwendet werden. Die Herstellung solcher Moleküle sind beispielsweise in
Harlow and Lane "Antibodies, A Laboratory Manual", CSH Press, Cold Spring Harbor, 1988 oder
EP-A 0 451 und
EP 1 100 830 B1 beschrieben. Darüber hinaus ist dem Fachmann bekannt, dass gegen die bereits bekannten Proteine IFNgamma, TNFalpha, EGFR, IL-6, IGFBP1, RANTES und PDGF-BB eine Vielzahl an kommerziell erhältlichen Antiköper gibt, die entsprechend verwendet oder modifiziert werden können.
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Ebenfalls stellt die vorliegende Erfindung Reagenzien wie Aptamere und Spiegelmere oder ähnliches bereit, die gegen die jeweiligen Makerproteine gerichtet sind, vorzugsweise gegen IFNgamma, TNFalpha, IGFBP1, RANTES, PDGF-BB, EGFR oder IL-6 oder eine Mutante, ein Fragment oder eine Variante hiervon.
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Aptamere sind künstliche DNA- oder RNA-Moleküle, die ein anderes Molekül, z. B. eine Nukleinsäure, ein Protein, kleine organische Verbindungen und sogar ganze Organismen, spezifisch binden können, siehe beispielsweise die europäischen Patentanmeldungen
EP 2 467 167 A1 oder
EP 2 402 016 A1 . Bei hoher Spezifität und Affinität sowie chemischer Stabilität weisen Aptamere im Vergleich zu Antikörpern eine niedrige Immunogenität auf. Aptamere können zum Beispiel mit Hilfe eines Verfahrens selektiert werden, das als SELEX (systematic evolution of ligands by exponential enrichment) bezeichnet wird (
Ellington und Szostak (1990), Nature 346, 818–822; Gopinath (2007), Anal. Bioanal. Chem. 387, 171–182;
WO 91/19813 ). Daher eignen sich Aptamere als therapeutische und diagnostische Mittel, siehe beispielsweise
Osborne et al. (1997), Curr. Opin. Chem. Biol. 1, 5–9.
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Zu der Gruppe der künstlichen RNA- oder DNA Moleküle gehören auch die Spiegelmere. Diese sind spiegelverkehrte RNA-Abschnitte, die resistent gegen enzymatischen Abbau sind, siehe beispielsweise die europäische Patentanmeldungen
EP 2 431 377 A1 . Sie besitzen damit neben der hohen Spezifität und Affinität eine längere Lebensdauer und Effizienz und können zudem sehr wirksame Inhibitoren Ihrer Zielmoleküle darstellen, zudem vereinen sie die Vorzüge von niedermolekularen Substanzen und Biopharmazeutika, siehe beispielsweise die interantionalen Anmeldungen
WO 2012/025251 A2 und
WO 2004/013274 . Aufgrund ihrer spiegelbildlichen Struktur werden Spiegelmere in Stoffwechselprozessen nicht abgebaut und binden nicht an die natürlich vorkommenden Nukleinsäuren. Im Gegensatz zu einer Reihe von konventionellen Oligonukleotiden lösen Spiegelmere nicht die angeborene Immunantwort über Toll-like Rezeptoren (TLR) aus. Darüber hinaus zeigten sie in präklinischen Versuchsreihen ein überaus vorteilhaftes Immunogenitätsprofil.
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Wie in den Beispielen dargelegt, korreliert das Vorhandensein der erfindungsgemäßen Markerproteine TNFalpha, IFNgamma und EGFR, mit einer NF1 Erkrankung (Beispiele 2 und 3, – ) oder im Falle von IGFBP1 und/oder RANTES mit dem Vorhandensein eines NF1 assoziierten Tumors, dem malignen MPNST (siehe Beispiele 4 und 6 sowie die und ). Zusätzlich liegt eine veränderte die Konzentration von PDGF-BB in plexiformen Neurofibromen vor (siehe Beispiel 3 sowie ). Ebenfalls wird eine veränderte, d. h. erhöhte Konzentration von PDGF-BB in NF1 Patienten sowie in NF1 Patienten mit MPNST Tumoren beobachtet (Siehe ). Somit sind diese Proteine gewissermaßen Indikatoren für pathologische Vorgänge im Rahmen der NF1 Erkrankung in einem zu untersuchenden Patienten.
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Daher umfasst die vorliegende Anmeldung ebenfalls die Verwendung eines Kits in dem erfindungsgemäßen Verfahren wie vorstehend aufgeführt, wobei das Kit Reagenzien umfasst, die spezifisch für den Nachweis von mindestens einem Protein ausgewählt aus einer Gruppe bestehend aus IFNgamma, IL-6, TNFalpha, EGFR, IGFBP1, RANTES und PDGF-BB oder Fragmente davon sind, wobei die Reagenzien vorzugsweise Antikörper oder Fragmente davon umfassen.
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Die Verwendung solcher Kits sind für eine Vielzahl von Zwecken nützlich, einschließend forensische Analysen, diagnostische und Anwendungen sowie epidemiologische Studien an NF1 Krankheiten und deren damit verbundenen Symptomen, jedoch nicht auf diese beschränkt. Ein derartiges Kit würde typischerweise markierte oder unmarkierte Antikörper oder Fragmente davon, Aptamere, Spiegelmere oder Ähnliches enthalten.
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Weiterhin kann das Kit auch Puffer, ein spezifisches Konjugat nebst Enzym, eine Waschlösung, eine Substratlösung zum Nachweis der Immunreaktion und/oder eine Stopplösung umfassen. Die Puffer, das spezifische Konjugat nebst Enzym, die Waschlösung, die Substratslösung zum Nachweis der Enzymreaktion und die Stopplösung sind dem Fachmann bekannt. Es wäre beispielsweise ausreichend, dass das Kit Antikörper oder Fragmente davon, Aptamere, Spiegelmere, spezifisch für die erfindungsgemäßen Markerproteine umfasst und erst kurz vor der Testung des biologischen Materials die Puffer und anderen Lösungen hinzugegeben werden. Es ist jedoch auch möglich, Antikörper oder Fragmente davon, Aptamere, Spiegelmere an eine feste Phase gebunden im Kit vorzugeben. Für den Nachweis der erfindungsgemäßen Marker müssten dann spezifische Konjugate, Waschlösung, Substratlösung und Stopplösung, die Bestandteile des Kits sein können, nach einem dem Fachmann bekannten Modus zugegeben werden.
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Neben den Mitteln zur Durchführung der genannten erfindungsgemäßen Verfahren kann das Kit weiterhin gegebenenfalls weitere geeignete Komponenten und/oder Hilfsstoffe umfassen. Geeignete pharmazeutische Hilfsstoffe sind in Remington's Pharmaceutical Sciences beschrieben.
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Die erfindungsgemäße Konzeption ist zum Einen besonders aussagekräftig, da sie auf der Analyse definierter Biomarker in einer definierten Probe basiert, welche im direktem Zusammenhang mit einer NF1 Erkrankung stehen, wobei die Anwesenheit oder eine erhöhte Menge von TNFalpha, IFNgamma und optional IL-6 bzw. erniedrigte Menge von EGFR in einer wie oben definierten Probe bezeichnend für die Anwesenheit einer NF1 Erkrankung ist und eine erhöhte Menge an IGFBP1, RANTES und/oder erniedrigte Menge an PDGF-BB bezeichnend für die Anwesenheit eines NF1 assoziierten Tumors ist. Es ist bekannt, dass sich ein MPNST durch den malignen Verlauf von vorher existierenden PNF entwickelt, wodurch das Risiko von NF1 Patienten mit PNF bis zu 50% ansteigt einen MPNST Tumor zu entwickeln [12, 13]. Somit kann mit Hilfe der erfindungsgemäßen Marker zum ersten Mal ein umfassendes Diagnoseverfahren bereitgestellt, mit dem es ermöglicht wird ohne invasive Verfahren von der Diagnosestellung einer NF1 Erkrankung den weiteren Verlauf der Krankheit, beispielsweise der Entstehung von PNF Tumoren zu überwachen und bei Beginn/Auftreten eines MPNST therapeutische Maßnahmen einzuleiten.
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Daher betrifft die vorliegende Erfindung ebenfalls ein Kit umfassend Reagenzien, die spezifisch für den Nachweis von (i) IFNgamma, TNFalpha, und EGFR und/oder (ii) IGFBP1 und RANTES sind; und optional für PDGF-BB und/oder IL-6.
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Beschreibungsgemäß wird das Kit vorzugsweise zur Diagnose und/oder der Früherkennung von einer NF1 Erkrankungen oder eines NF1 assoziierten Tumors und/oder zur Überwachung der Entwicklung der NF1 Erkrankung und die damit assoziierten klinischen Symptome verwendet. Diesbezüglich ist es durchaus möglich, dass das Kit in zwei Teilen, getrennt oder gemeinsam vertrieben wird. Wobei ein Teil des Kits derart ausgestaltet ist, dass es eine NF1 Erkrankung durch Nachweis mindestens einem der erfindungsgemäßen Marker IFNgamma, TNFalpha, order EGFR umfasst und einen zweiten Teil eines Kits, derart ausgestaltet ist, dass es einen NF1 assoziierten Tumor durch Nachweis von mindestens einem der erfindungsgemäßen Marker IGFBP1 und RANTES umfasst. Weiterhin könnte in einer bevorzugten Ausführungsform der erste Teil des Kits Reagenzien, die spezifisch für den Nachweis von IL-6 und der zweite Teil des Kits Reagenzien, die spezifisch für den Nachweis von PDGF-BB sind, enthalten.
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In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst die Verwendung eines Kits oder das Kit wie vorstehend definiert Reagenzien, die an einem Träger gebunden sind, vorzugsweise auf einem Microarray oder einem Teststreifen. Beispielsweise können Antikörper oder Fragmente davon an einer festen Phase immobilisiert werden.
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Wie vorstehend erläutert sind die gängigsten diagnostischen Nachweisverfahren die FACS Analyse, die verschiedenen Arten von Protein-Chip Microarrays sowie der Streifentest/Lateral Flow Immunotest/Teststreifen. Der Teststreifen kann beispielsweise in Serum – oder andere biologische Proben – eingetaucht und inkubiert werden. Anhand einer spezifischen biochemischen Reaktion auf dem Teststreifen nach Bildung der erfindungsgemäßen Markerprotein-Antikörperkomplexes kann dann eine spezifische Farbreaktion ausgelöst werden, mit deren Hilfe die Markerproteine detektiert werden können. In Analogerweise kann auch ein Microarray, bevorzug ein Protein Chip Microarray, wie vorstehend beschreiben, verwendet werden.
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Der Fachmann weiß, dass sich andere Reagenzien wie Aptamere, Spiegelmere oder Derivate dieser Nachweismoleküle ebenfalls bestens zum Nachweis der erfindungsgemäßen Marker eignen und in analogerweise verwendet werden können.
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Die experimentellen Daten der vorliegenden Erfindung im Lichte der Erkenntnisse des Stand der Technik zeigen, dass eine permanente Entzündungsreaktion in NF1 Patienten, hervorgerufen durch die erhöhte Ras Aktivität aufgrund der NF1 Haploinsuffizienz aller Körperzellen zu den wesentlichen klinischen Manifestationen bzw. Symptomen der NF1 Erkrankung beiträgt. In diesem Zusammenhang ist es interessant, dass die erfindungsgemäßen Markerproteine (IFNgamma, TNFalpha) den Th1 pro-inflamatorischen Zytokinen und (IL-6 sowie TNFalpha) den Th17 Zytokinen zugeordnet werden können, wobei aus der Literatur bekannt ist, dass die Th1-Zytokin vermittelte Immunantwort eine Th2-Antwort unterbindet und hauptsächlich zu Entzündungsvorgängen führt. Der Th17-Reaktionsweg ist wichtig für die Entstehung von Autoimmunerkrankungen, dabei unterdrückt IL-17 effizient Th1-Reaktionen und chronifiziert damit Entzündungsprozesse, siehe beispielsweise Alber et al. Current Immunology Reviews 3 (2007), 3–16 sowie Weaver et al. Annu Rev Immunol 25 (2007), 821–852. Experimentelle und epidemiologische Studien belegen, dass eine chronische Entzündung mit der Tumorgenese einhergeht und ein wichtiger Faktor für dessen Wachstum ist. Dabei stehen zwei Signaltransduktionswege in wechselseitiger Beziehung zueinander: i) Genetisch-bedingte Auslöser welche zu einer neoplastischen Transformation führen und ein entzündliche Umgebung schaffen, ii) Tumor-infiltrierende Leukozyten sind die Initial-Regulatoren von krebsbedingter Entzündung, siehe beispielsweise Allavena Immunol Rev. 222 (2008), 155–61.
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Daher ist eine Blockierung/Neutralisierung der erfindungsgemäßen Markerproteine ein vielversprechender therapeutischer Ansatz für NF1 Patienten. Zudem sind die erfindungsgemäßen Marker in der Früherkennung von der malignen Umwandlung extrem nützlich, da therapeutische Eingriffe frühzeitig initiiert werden können, bevor der Tumor sich weiter entwickelt und zu streuen beginnt, so dass Metastasen entstehen. Dem entsprechend betrifft die vorliegende Erfindung in einer Ausführungsform auch die Verwendung eines Wirkstoffs, der ein Modulator eines der Proteine ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus TNFalpha, INFgamma, EGFR, IGFBP1, PDGF-BB, IL-6 und RANTES zur Herstellung eines Medikamentes in der Behandlung eines Patienten mit NF1 und/oder eines NF1 assoziierten Tumors, vorzugsweise wobei der Patient gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren wie vorstehend beschrieben diagnostiziert wurde.
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Im Sinne der vorliegenden Erfindung bezeichnet der Begriff ”Wirkstoff” einen Modulator, wie vorstehend definiert, der sowohl ein Agonist oder Antagonist, welche als Inhibitoren oder auch als Aktivatoren wirken können, sein kann. Diesbezüglich geeignete inhibierende Modulatoren bzw. Wirkstoffe schließen ein: anti-TNFalpha, anti-IFNgamma, anti-IGFBP1 anti-RANTES und/oder anti-PDGF-BB-Antikörper, anti-IL-6, Antigen-bindende Fragmente davon und lösliche Rezeptormoleküle, die spezifisch an diese Proteine binden sowie Verbindungen, die die Synthese, Freisetzung oder Wirkung auf Targetzellen der genannten Proteine verhindern und/oder inhibieren. Diese Verbindungen sind dem Fachmann bekannt. Beispielsweise wird in
Michiels, J. Biochem Cell Biol. 30 (1998), 505) der lösliche IFNgamma Rezeptor als ein Inhibitor für IFNgamma beschrieben, weitere Inhibitoren sind in der internationalen Anmeldung
WO 2011069141 A1 oder
EP 2211905 A1 enthalten. Für TNFalpha sind beispielsweise Thalidomid, Tenidap, Phosphodiesterase-Inhibitoren (z. B. Pentoxifyllin und Rolipram), A2b-Adenosinrezeptor-Agonisten und A2b-Adenosinrezeptor-Enhancer bekannt; für IGFBP1 wird Lithium Chlorid, Insulin als auch humane anti-IGFBP1 Antikörper in der Literatur beschrieben, siehe beispielsweise
Lewitt et al., Journal of Endocrinology 171 (2001), R11–R15 sowie die internationale Anmeldung
WO 96/001125 . Für RANTES sind beispielsweise TGF-β1, Staurosporin, Wortmannin, oder Pertussis Toxin bekannt, siehe beispielsweise
Kapp et al., J Invest Dermatol. 102 (1994), 906–14. Für PDGF-BB ist beispielsweise Lycopene in
WU et al., Biochem Soc Trans. 35 (2007), 377–8 als auch Imatinib beschrieben.
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Es können erfindungsgemäß auch andere Entzündungsvermittler als die beschriebenen Wirkstoffe anstatt der oder zusätzlich zu diesen Wirkstoffen verwendet werden. Gemäß der vorliegenden Erfindung bezieht sich der Begriff ”Entzündungsvermittler” auf einen Wirkstoff bzw. inhibierend-wirkenden Modulator, der die pro-entzündliche Vermittleraktivität verringert, blockiert, inhibiert, außer Kraft setzt oder stört. Typische Entzündungshemmer, die im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, schließen Wirkstoffe ein, die die IL-1-Aktivität, -synthese oder die -Rezeptorsignalgebung verringern, blockieren, inhibieren, außer Kraft setzen oder stören, wie anti-IL-1-Antikörper, lösliches IL-1R, IL-1-Rezeptorantagonist oder andere geeignete Peptide und kleine Moleküle; Wirkstoffe, die die Aktivität, Synthese oder Rezeptorsignalgebung anderer pro-entzündlicher Vermittler, wie GM-CSF und Mitglieder der Zytokin-IL-8-Familie, verringern, blockieren, inhibieren, außer Kraft setzen oder stören; und Zytokine mit anti-entzündlichen Eigenschaften, wie IL-4, IL-10, IL-13 und TGFβ. Zusätzlich können andere anti-entzündliche Wirkstoffe, wie der anti-rheumatische Wirkstoff Methotrexat, ggf. in Verbindung mit dem IL-12-Antagonisten und/oder dem TNF-Antagonisten verabreicht werden. Entzündungsvermittler und anti-entzündliche Wirkstoffe sind auch in dem
US Patent Nr. 6270766 beschrieben.
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Erste Versuche der Erfinder plexiforme Neurofibrome mit Imatinib (Glivec oder STI571, ein 2-Phenylaminopyrimidinderivat) zu behandeln, haben bei einigen Patienten gutes Ansprechen gezeigt. Imatinib ist ein Inhibitor strukturell verwandter Rezeptortyrosinkinasen zu denen auch der Rezeptor, welcher ein Tyrosinkinaserezeptor ist, für PDGF (PDGFR) gehört. PDGF-BB ein Wachstumsfaktor, der auf gliale Zellen wie zum Beispiel Schwannzellen wirkt. Nervenscheidentumore wie MPNST und Neurofibrome gehen aus Schwannzellen hervor. Die Blockierung des PDGF/PDGFR Systems ist daher vielversprechend zur Behandlung von Nervenscheidentumoren.
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Daher eignen sich besonders Wirkstoffe, wie vorstehend definiert sowie neutralisierende Antikörper oder Fragmente davon, die gegen IGFBP1 und RANTES und/oder PDGF-BB gerichtet sind zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung eines NF1 assoziierten Tumors, insbesondere eines malignen peripheren Nervenscheidentumor (MPNST) oder eines plexiformen Neurofibroms (PNF), vorzugsweise wobei der Patient gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren wie vorstehend beschrieben diagnostiziert wurde. Besonders bevorzugt ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung die Verwendung einer Kombination von IGFBP1 und RANTES spezifischen Wirkstoffen zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung eines MPNST. Weiterhin besonders bevorzugt ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung die Verwendung von einem PDGF-BB spezifisch inhibierenden Modulator (Antagonist) oder Wirkstoff zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung eines PNF in einem NF1 Patienten oder eines PDGF-BB inhibierenden Modulators zur Behandlung eines MPNST. Wie weiterhin aus ersichtlich, ist das PDGF-BB Level in NF1 Patienten im Vergleich zu gesunden Pateinten erhöht und somit eignen sich PDGF-BB Antagonisten ebenfalls zur Behandlung von NF1 assoziierten Symptomen.
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Da wie in den Beispielen 2 und 3 sowie den und aufgeführt, das PDGF-BB Level in PNF erniedrigt verglichen zu NF1 Patienten ohne PNF, als auch das EGFR Level in Seren von NF1 Patienten verglichen zu nicht NF1 Betroffenen signifikant erniedrigt vorliegt, umfasst die vorliegende Erfindung auch die Verwendung eines PDGF-BB und/oder EGFR-spezifisch aktivierenden Modulators (Agonist) als Wirkstoff zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung eines NF1 Patienten, vorzugsweise wobei der Patient gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren wie vorstehend beschrieben diagnostiziert wurde. Agonisten des PDGF-BB Rezeptors sind dem Fachmann bekannt und umfassen beispielsweise PDGF-BB oder PDGF-Rezeptor-aktivierende Substanzen, wie Tyrosinkinaserezeptoragonisten. Bevorzugt ist der Agonist derart ausgestaltet, dass er als duales Molekül verabreicht wird, wobei ein Teil des Moleküls spezifisch PNF Zellen erkennt und somit zu einer spezifischen Erhöhung von PDGF-BB in PNF Zellen führt. Obwohl bisher die Aktivierung insbesondere des EGFR Levels und/oder PDGF-BB aus bisheriger Sicht eines Fachmanns nicht wünschenswert erschien, so sind allgemein Agonisten von der vorliegenden Erfindung explizit umfasst, da erwartet werden kann, dass in naher Zukunft solche Agonisten im Sinne der vorliegenden Erfindung in vorteilhafter Weise Verwendung finden.
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Ferner betrifft die vorliegende Erfindung somit auch die Verwendung eines anti-Tumorwirkstoffs zur Herstellung eines Medikamentes in der Behandlung eines Patienten mit NF1 und/oder eines NF1 assoziierten Tumors, wobei der Patient gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren wie vorstehend beschrieben diagnostiziert wurde.
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Die erfindungsgemäßen Wirkstoffe können einem Individuum prophylaktisch oder therapeutisch verabreicht werden. Weiterhin können alle TNFalpha, IFNgamma, EGFR, IL-6, IGFBP1, RANTES und/oder PDGF-BB-spezifische Wirkstoffe gemeinsam, gleichzeitig oder nur in einer Kombination aus einem, zwei, drei, vier oder fünf (in der gleichen oder anderen Zusammensetzungen) oder sequentiell verabreicht werden.
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Die erfindungsgemäßen Wirkstoffe der vorliegenden Erfindung können einem Individuum auf verschiedenen Wegen verabreicht werden. Die Verabreichungswege schließen ein intradermale, transdermale (z. B. in Slow-Release-Polymeren), intramuskuläre, intraperitoneale, intravenöse (einschließend Infusion und/oder Bolus-Injektion), subkutane, orale, topische, epidurale, buccale, rektale, vaginale und intranasale Wege. Andere geeignete Verabreichungswege können auch verwendet werden, beispielsweise um Absorption durch epitheliale oder mucokutane Deckschichten zu erreichen. Zur parenteralen (z. B. intravenös, subkutan, intramuskulär) Verabreichung können TNFalpha, IFNgamma, EGFR, IL-6, IGFBP1, RANTES und/oder PDGF-BB-Wirkstoffe der vorliegenden Erfindung als Lösung, Suspension, Emulsion oder gefriergetrocknetes Pulver formuliert werden zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen parenteralen Vehikel. Beispiele für solche Vehikel sind Wasser, Kochsalzlösung, Ringersche Lösung, Dextroselösung und 5%-Humanserum-Albumin. Liposomen und nicht-wässrige Vehikel wie fixierte Öle können auch verwendet werden. Das Vehikel oder gefriergetrocknete Pulver kann Additive enthalten, die die Isotonie (z. B. Natriumchlorid, Mannitol) oder die chemische Stabilität (z. B. Puffer und Konservierungsstoffe) aufrecht erhalten. Die Formulierung wird mit üblicherweise verwendeten Techniken sterilisiert.
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TNFalpha, IFNgamma, EGFR, IL-6, IGFBP1, RANTES und/oder PDGF-BB-spezifische Wirkstoffe der vorliegenden Erfindung können auch durch Gentherapie verabreicht werden, wobei dem Patienten ein DNA-Molekül, das ein bestimmtes therapeutisches Protein oder Peptid kodiert, verabreicht wird, z. B. mittels eines Vektors, der die Expression und Sekretion des bestimmten Proteins oder Peptids in therapeutischen Mengen in vivo veranlasst. Zusätzlich können TNFalpha, IFNgamma, EGFR, IL-6, IGFBP1, RANTES und/oder PDGF-BB-spezifische Wirkstoffe der vorliegenden Erfindung zusammen mit anderen Komponenten wie Hilfsstoffen verabreicht werden, beispielsweise pharmazeutisch verträgliche oberflächenentspannende Hilfsstoffe (z. B. Glyzeride), Korrigenzien (z. B. Laktose), Träger, Verdünnungsmittel und Vehikel. Falls gewünscht, können ebenfalls bestimmte Süßungs-, Geschmacks- oder Farbstoffe hinzugefügt werden.
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Der Offenbarungsgehalt der vor- und nachstehend zitierten Dokumente aus dem Stand der Technik ist hiermit durch Bezugnahme in dieser Anmeldung enthalten, insbesondere betreffend die Herstellung von erfindungsgemäßen Proteinen, damit beladene Chips und Arrays, Vektoren, Wirtszellen, Antikörper, transgene Tiere, etc. Diese und andere Ausführungsformen sind dem Fachmann offenbart und offensichtlich und umfasst durch die Beschreibung und die Beispiele der vorliegenden Erfindung. Weiterführende Literatur zu einer der oben angeführten Werkstoffen und elektronischen Hilfsmitteln, die im Sinne der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, können dem Stand der Technik entnommen werden, z. B. aus öffentlichen Bibliotheken unter z. B. der Benutzung elektronischer Hilfsmittel. Zudem bieten sich andere öffentliche Datenbanken an wie die ”Medline”, die über das Internet zur Verfügung stehen.
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Techniken zur Ausführung der Erfindung sind dem Fachmann bekannt und können der einschlägigen Literatur entnommen werden, siehe beispielsweise
Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed., ed. by Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989);
DNA Cloning, Volumes I and II (D. N. Glover ed., 1985);
Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed., 1984); Mullis et al.
U.S. Pat. No. 4,683,195 ;
Nucleic Acid Hybridization (B. D. Harnes & S. J. Higgins eds. 1984);
Transcription And Translation (B. D. Harnes & S. J. Higgins eds. 1984);
Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987);
Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986);
B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984);
the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.);
Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller and M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory);
Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155 (Wu et al. eds.), Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987);
Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I–IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986);
Extracting information from cDNA arrays, Herzel et al., CHAOS 11, (2001), 98–107.
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BEISPIELE
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Material und Methoden
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Patienten und Serumentnahme
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Serumproben von NF1 Patienten wurden von der Abteilung Mund-Kiefer und Gesichtschirurgie, Universitätsklinik Eppendorf, Hamburg bezogen. Alle NF1 Patienten wurden klinisch nach den veröffentlichen Richtlinien und Kriterien diagnostiziert [31]. Serumproben von gesunden Probanden wurden von dem Institut für medizinische Immunologie, Charité-Universitätsmedizin Berlin bezogen. Alle Seren wurden mittels IRB-bestätigten Protokollen gesammelt. Detaillierte Informationen zu den Patienten Kohorten sind Tabelle 1 zusammengestellt. Venöses Blut (1 bis 10 ml) wurde gesammelt, innerhalb von 2 Stunden zentrifugiert und anschließend wurden die Serumproben aliquotiert und bei –80°C bis zur Verwendung gelagert. Frische Aliquots wurden für jede Analyse verwendet. Tabelle 1: Charakteristika der Patientenkohorten.
Tabelle 2: Überblick über die Serummarkereigenschaften bei 90%iger Sensitivität. A) NF1-Marker
Analyt | Sensitivität | Spezifität | NF1 | Nicht-NF1 |
Richtig positiv Anzahl (%) | Falsch negativ Anzahl (%) | Falsch positiv Anzahl (%) | Richtig negativ Anzahl (%) |
IFNg | 90,4 | 70,7 | 94 (90,4) | 10 (9,6) | 12 (29,3) | 29 (70,7) |
EGFR | 90,4 | 14,6 | 94 (90,4) | 10 (9,6) | 35 (85,4) | 6 (14,6) |
IL-6 | 90,4 | 51,2 | 94 (90,4) | 10 (9,6) | 20 (48,8) | 21 (51,2) |
TNFa | 90,4 | 68,3 | 94 (90,4) | 10 (9,6) | 13 (31,7) | 28 (68,3) |
Gesamt N-Zahl: 145; N-Zahl Kontrollen: 41, N-Zahl NF1 Patienten: 104 (30 mit MPNST, 39 mit plex. Neurofibrom, 35 nur mit kutanen Neurofibromen) B) MPNST Marker (nur NF1 Patienten)
Analyt | Sensitivität | Spezifität: | MPNST | Nicht-MPNST |
Richtig positiv Anzahl (%) | Falsch negativ Anzahl (%) | Falsch positiv Anzahl (%) | Richtig negativ Anzahl (%) |
IGFBP1 | 90,0 | 50,0 | 27 (90,0) | 3 (10,0) | 37 (50,0) | 37 (50,0) |
Rantes | 90,0 | 25,7 | 27 (90,0) | 3 (10,0) | 55 (74,3) | 19 (25,7) |
Aussagen zu richtig/falsch positiv und richtig/falsch negativ. Die vordere Zahl ist n, die Anzahl der Patienten. Dahinter in Klammern ist die Prozentzahl der richtig/falsch positiven bzw. negativen Patienten angegeben.
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Kandidatenmarker Auswahl
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Das Auswählen von Kandidatenmarkern basierte auf einer manuellen Literatursuche in Veröffentlichungen und Datenbanken, welche in (i) Serum, Plasma oder Zellüberständen Proteinlevels von Patienten mit Nerventumoren oder Epitheltumoren oder Zelllinien beschreiben, und in (ii) differenzieller Genexpression zwischen den normalen peripheren Nervensystem, Neurofibromen und MPNST sowie (iii) immunmodulatorische Zytokine. Die so aufgestellte Kandidatenfaktorliste basiert auf der Genontologie (GO) und den Genkarteninformationen [32, 33] weiter reduziert indem solche Faktoren, die bereits eine bekannte Funktion in der Tumorgenese wie beispielsweise Wachstumsbeschleunigung, Migration und Metastasierung, Angiogenese und Immunmodulation aufweisen, ausgewählt wurden. Die abschließende Auswahl der Kandidatenfaktoren wurde anhand der Verfügbarkeit geeigneter Screening Plattformen ausgewählt. Von den 115 ausgewählten möglichen Serumproteinen wurde basierend auf der Verfügbarkeit von Antikörpern für eine individuell angepasste Array-Analyse eine Liste von 56 Kandidatenfaktoren zusammengestellt, die zum Screening von Serumproben ( ) verwendet wurde.
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Serum screening
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Individuell hergestellte humane Quantibodys® Arrays (Raybiotech, Inc., GA, USA) wurden verwendet um die Serumproteinkonzentration zu bestimmen. Die Analyse wurde gemäß den Herstellerangaben durchgeführt. Das Imaging wurde mittels Quantibody® Array Testing Software (Raybiotech, Inc., GA, USA) durchgeführt. Potenzielle Markerproteine wurden zuerst bei einem Screening von 30 Proteinkandidaten unter Verwendung von 60 NF1 Seren identifiziert. Eine weitere zweite Validierung wurde mit den 5 Proteinen, welche signifikante Unterschiede in der ersten Screening Runde aufzeigten, zusammen mit weiteren 26 Kandidatenproteinen durchgeführt. In der zweiten Runde wurden 104 NF1- und 41 Kontrollseren verwendet. Insgesamt wurden 56 Kandidatenproteine gescreent sowie 104 NF1- und 41 Kontrollsera verwendet. Die Kandidatenproteine wurden gleichzeitig mittels multiplexer Erfassung in Dreier-Spots pro Array gescreent. Das heißt, dass alle Seren mindestens dreifach analysiert wurden. Eine Übersicht des Screenings-Verfahrens ist in dargestellt. Serumfaktoren, welche ein signifikant unterschiedliches Level zwischen den einzelnen Gruppen aufwiesen, wurden mittels Festphasenenzymimmunoassays (ELISA) (Abcam, Cambridge, UK) für Insulin ähnliche Wachstumsfaktoren bindende Proteine 1 (IGFBP1), und zytometischen Kügelchen/Beads-Arrays (CBA) (BD Bioscience, Heidelberg, Deutschland) für RANTES (Regulated upon Activation, Normal T-cell Expressed, and Secreted), Interferon γ (IFNγ), Interleukin 6 (IL-6) und Tumornekrosefaktor α (TNFα), in einer ausgewählten Teilgruppe von Serumproben (n = 11) verifiziert. Die Analysen wurden gemäß den Herstellerangaben durchgeführt. Die ”Einfang”-Kügelchen (Capture beads) wurden mit einem FACS-Calibur Durchflusszytometer analysiert (BD Biosciences, Heidelberg, Deutschland). Die Durchflusszytometriedaten wurden mittels FCAP Array Analysis Software evaluiert (Soff Flow, Inc., MN, USA).
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Datenauswertung
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Serumlevel der Markerkandidaten in den NF1 und Kontrollobjekten wurden mittels der Medianebene und des Quartilabstands analysiert. Um alle Daten einer normalen Verteilung zu verifizieren, wurde der Kolmogorow-Smirnow Test verwendet. Ausdifferenzierte Patientengruppen wurden mittels des Mann-Whitney U Test für kontinuierliche nicht-parametrische Variablen verglichen. Um die Aussagefähigkeit der individuellen Marker zu prüfen wurden die Receiver Operating Characteristics (ROC) der Kurven und die Fläche unter dieser Kurve (AUC) berechnet. Es wurde eine Bonferroni Korrektur durchgeführt. Die P-Werte < 0,05 wurden als signifikant angenommen. Statistische Auswertungen wurden mittels SPSS Softwareversion 18 (SPSS, Inc.; IL, USA) und GraphPad Prism Software 5.0 (GraphPad Software Inc., CA, USA) durchgeführt. Detektion der Zytokinenproduktion von T-Lymphozyten mittels Cytometric Bead Array
BD | 560112 | Human TNF FlexSet (Bead C4) |
BD | 558324 | Human RANTES Flex Set (Bead D4) |
BD | 558276 | Human IL-6 Flex Set (Bead A7) |
BD | 560111 | Human IFN-a Flex Set (Bead) |
BD | 560005 | Cell Signaling Master Buffer Kit |
Die Bestimmung von TNFalpha, IL-6, IFNgamma und RANTES mit einem CBA (Cytometric Bead Array) der Firma BD Bioscience.
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Das Prinzip beruht auf der Bindung von spezifischen Antikörpern an sogenannte ”Einfang-Beads” und auf der zeitgleichen Detektion von Zytokinen durch das aus mit Phycoerythrin(PE)-konjugierten Antikörpern bestehende Detektions-Reagenz. Nach Anregung dieses Reagenz entsteht ein fluoreszierendes Signal, welches proportional zur Menge des gebundenen Zytokins ist.
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Zur Bestimmung der Zytokinkonzentration können 20 μL von jedem Überstand eingesetzt werden. Je 20 μL Probe können je 4 μL der 4 Capture Beads zugegeben werden. Die Inkubation erfolgt für 3 Stunden bei Raumtemperatur im Dunkeln. Anschließend werden die Ansätze mit je 400 μL Waschpuffer 5 Minuten (300 × g, Raumtemperatur) zentrifugiert und die Überstände bis auf ein Restvolumen von 100 μL abgenommen. Die Analyse erfolgt mit dem FACSCanto von BD Bioscience und der BDTM CBA Software.
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Beispiel 1: Auffindung und Auswahl der Kandidatenmarkerproteine
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Neurofibromatose Typ 1 (NF1) ist eine erbliche Tumorerkrankung, die durch die Entwicklung von beginnenden Nervenscheidentumoren gekennzeichnet ist, welches in 8 bis 13% der NF1 Patienten in einen peripheren malignen Nervenscheidentumor (MPNST) transformiert. MPNST sind invasive Sarkome mit extrem schlechter Prognose und ihre Entwicklung korreliert mit der internen Tumorlast in NF1-Patienten. Da die Früherkennung von NF1 Patienten, die einen MPNST entwickeln, deutlich den klinischen Erfolg dieser Patienten verbessern würde, ist das Ziel der vorliegenden Erfindung, Serumbiomarker für die Tumorfrüherkennung zu identifizieren und ihre Korrelation mit den Tumorarten und der internen Tumorlast zu analysieren.
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Wie vorstehend im Material und Methodenteil beschrieben wurden Antikörper Arrays verwendet um Serummarker allgemein für NF1 und spezifisch für NF1-assozierten Nervenscheidentumor zu identifizieren. Händisch ausgesuchte Daten förderten eine Liste von 115 Proteinen als potenzielle Serummarker für NF1 zu Tage. 79 dieser Proteine werden in PNS und MPNST exprimiert oder werden als tumorgenerische Serumfaktoren beschrieben.
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Die anderen 36 Proteine sind immunmodulatorische Zytokine. Diese wurden ausgewählt, weil es Hinweise darauf gibt, dass die systemische NF1 Haploinsuffizienz in NF1-Patienten möglicherweise zu einer Überexpression von Zytokinen führt [34, 35].
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Daher scheint der Grad der immunologischen Deregulation möglicherweise indirekt das Risiko für Tumorwachstum und maligne Transformation zu erhöhen. Seren von 104 NF1-Patienten mit unterschiedlichen Tumortypen und 41 ausgesuchten Kontrollsubjekten (Tabelle 1) wurden gemeinsam analysiert und 56 von den 115 zuerst identifizierten Kandidatenproteinen wurden gescreent ( ). Die statistische Auswertung wurde mittels nicht-parametrischem Mann-Whitney U Test, gefolgt von einer Bonferroni-Korrektur, durchgeführt.
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Beispiel 2: Die inflammatorischen Zytokine IFNγ, TNF-α und IL-6 zeigen signifikant erhöhte und EGFR ein erniedrigtes Serumlevel in NF1-Patienten.
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Wie vorstehend im Abschnitt Material und Methoden aufgeführt, werden die Serumfaktoren, welche ein signifikant unterschiedliches Level zwischen den einzelnen Gruppen aufweisen, mittels Festphasenenzymimmunoassay (ELISA) (Abcam, Cambridge, UK) für Insulin ähnliche Wachstumsfaktoren bindende Proteine 1 (IGFBP1), und zytrometischen Kügelchen/Beads-Arrays (CBA) (BD Bioscience, Heidelberg, Deutschland) für RANTES (Regulated upon Activation, Normal T-cell Expressed, and Secreted), interferon γ (IFNγ), interleukin 6 (IL-6) und Tumornekrosefaktor α (TNFα), gemäß den Herstellerangaben in einer ausgewählten Teilgruppe von Serumproben (n = 11) verifiziert und ausgewertet. Für PDGF-BB kann ebenfalls ein Festphasenenzymimmunoassa von Abcam (PDGF BB Human ELISA Kit (ab100624)) verwendet werden.
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Es lag ein signifikanter Unterschied für sechs Proteine zwischen den jeweiligen Kohorten vor. Die Serumkonzentrationen von allen sechs Markerkandidaten waren unabhängig vom Alter und Geschlecht beobachtet worden. Signifikante Unterschiede in den Serumkonzentrationen von vier Proteinen wurden in NF1-Patienten verglichen zu gesunden Subjekten gefunden ( ). Die Konzentration des epithelialen Wachstumsfaktorrezeptors (EGFR) ist signifikant geringer in NF1-Patienten verglichen zu gesunden Subjekten, wobei die inflammotrischen Zytokine IFNγ, TNF-α und IL-6 einen signifikant höheren Serumlevel in NF1-Patienten zeigen.
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Weiterhin werden die NF1 Kohorten in drei klinische Gruppen (NF1-Patienten mit (i) nur kutanten Neurofibromen (cNF), (ii) mit plexiformen Neurofibromen (PNF) und (iii) mit malignen peripheren Nervenscheidentumoren (MPNST), aufgeteilt, siehe auch Tabelle 1. Zur Identifizierung der Unterschiede zwischen gesunden Probanden und NF1 Betroffenen wird eine Varianzanalyse (ANOVA) mit Bonferroni Korrektur durchgeführt. Wenn ein signifikanter Unterschied zwischen den beiden Gruppen gezeigt werden kann, wird zur Differenzierung eine Multivariate Varianzanalyse (MANOVA) angeschlossen, die zum einen eine Unterscheidung zwischen gesunden Probanden und NF1 Betroffenen mit unterschiedlicher Tumorentitäten, zum Anderen auch Unterschiede zwischen den verschiedenen Tumorentitäten selbst ermöglicht.
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Wie aus der und ersichtlich, zeigt IFNgamma, EGFR, IL-6 sowie TNFalpha zwar einen signifikanten Unterschied in NF1-Patienten verglichen zu den Kontrollpatienten jedoch keinen Unterschied in Patienten mit MPNST verglichen zu denen ohne MPNST.
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Die Ergebnisse deuten ebenfalls darauf hin, dass die erhöhten Zytokinlevel in NF1-Patienten unabhängig von deren Tumorlast sind. Eher legen diese Daten nahe, dass eine systemische NF1-Haploinsuffizienz einen permanenten und systemischen Entzündungsreaktionstatus in NF1-Patienten hervorruft, welcher sich durch eine signifikante Erhöhung von IFNγ, TNFα und IL-6 bemerkbar macht [34].
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Beispiel 3: Die Platelet derived growth factor BB-chain (PDGF-BB) Serumkonzentration in NF1 Patienten mit einem PNF ist signifikant erniedrigt.
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Die Untersuchung der PDGF-BB Konzentration in Serumproben von NF1 Patienten mit PNF (n = 39), sind wie in Beispiel 2 beschrieben, durchgeführt und ausgewertet worden. Wie aus der ersichtlich, weisen die Werte in NF1 Patienten für PDGF-BB einen erhöhten Wert verglichen zu den gesunden Patienten auf. Besonders erhöhte Werte von PDGF-BB zeigen sich in NF1 Pateinten mit MPNST und ohne PNF. Zudem weisen NF1 Patienten mit PNF signifikant erniedrigte Werte von PDGF-BB verglichen zu den Kontrollpatienten, siehe .
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Beispiel 4: IGFBP1, RANTES sind Serummarker für die Anwesenheit eines MPNST Tumors in NF1 Patienten
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Eine weitere Aufteilung der NF1 Kohorten in drei klinische Gruppen (NF1-Patienten mit (i) nur cNF, (ii) mit PNF und (iii) mit MPNST, siehe auch Tabelle 1, fördern zwei weitere Proteine, IGFBP1 und RANTES, welche einen signifikanten Unterschied in NF1-Patienten mit MPNST zu denen ohne MPNST aufzeigen, zu Tage. Jedoch kann kein Unterschied für diese beiden Proteine zwischen den Kontrollgruppen und den NF1-Patienten ohne MPNST (n = 74) festgestellt werden ( , B). Volumetrische Analysen der Ganzkörper MRI Daten der NF1-Patienten deuteten auf eine Korrelation zwischen der internen Tumorlast und dem Risiko für die maligne Transformation von PNF in MPNST hin [4]. Daher wurde versucht, die Serumkonzentration der sechs identifizierten Serumbiomarker mit der internen Tumorlast für die 87 NF1-Patienten, die zur Verfügung standen, zu korrelieren. Überraschenderweise zeigt die Serumkonzentration von IGFBP1, aber nicht einer der anderen fünf Marker eine Korrelation mit der der internen Tumorlast ( ). Dies steht im Einklang mit dem Ergebnis, dass das IGFBP1 Serumlevel mit der Anwesenheit eines MPNST korreliert ( ) und identifiziert IGFBP1 somit als potenziellen Risikomarker für maligne Transformation.
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Beispiel 5: RANTES wird von infiltrierenden Lymphozyten als auch von MPNST Tumorzellen sezerniert
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Die Paraffinschnitte der Tumoren wurden entparaffiniert, rehydriert und gewaschen. Es erfolgte dann eine Vorbehandlung bei einem ph-Wert von 6.1 sowie Kochen, und hiernach eine Kühlung auf Eis für 15 min. Nach einem Waschschritt wurden die Schnitte mit Peroxidase-Blocker-Lösung für 5 min behandelt und dann mit dem primären polyklonalen Kaninchen anti-Rantes (1:100, ab9679, Abcam Inc.) inkubiert. Nach erneutem Waschen erfolgte die Inkubation mit dem biotinyliertem Sekundärantikörper, Streptavidin Peroxidase und DAB unter Nutzung des ”Dako REALTM Detection system” (Dako REALTM Detection system, peroxidase/DAB+, Rabbit/Mouse, code K5001, Dako, Denmark A/S) für automatisiertes Färben. Schließlich erfolgte eine Färbung der Zellkerne mit Hämatoxylin. In sind überwiegend Tumorzellen zu sehen. Es sind die Tumorzellen, die mittels des anti-Rantes Antikörper angefärbt wurden. Aus ist ersichtlich wie die Entzündungszellen in den Tumor einwandern. Es sind hauptsächlich Entzündungszellen, die angefärbt werden können (im unteren Bereich des Bildes sind Entzündungszellen zu sehen (Pfeile), im oberen die Tumorzellen).
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Beispiel 6: IGFBP1 ist ein Marker für die Anwesenheit eines MPNST Tumors
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Zur Bestimmung der IGFBP1 Sekretion von MPNST Zelllinien in serumfreie Kulturüberstände wurden die MPNST Zelllinien ST88-14, 1507-2, S462, T462 T265 und STS26T in DMEM Glutamax-I mit 5% FBS von Invitrogen (Karlsruhe, Deutschland) kultiviert. Die MPNST Zelllinien S462, 1507.2, wurden von V. F. Mautner, University Hospital Eppendorf, Germany hergestellt und zur Verfügung gestellt [60]. Die MPNST Zelllinie STS26T wurde von G. H. De Vries (Hines VA Hospital, Illinois, USA) [61] zur Verfügung gestellt. Weiterhin wurde die MPNST Zelllinie ST88-14 freundlicherweise von J. DeClue (NIH, Bethesda, USA) [62] zur Verfügung gestellt.
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1 × 104 Zellen der jeweiligen Zelllinien werden in eine 24 Well-Platte vorgelegt. Nach 24, 36 und 48 Stunden wird der Zellkulturüberstand zur weiteren Untersuchung abgenommen und bis zur weiteren Verwendung eingefroren. Zur Durchführung eines ELISA zum Nachweis von humanem IGFBP1 in Zellkulturüberständen, Serum oder Plasma wird das Testkit (Abcam: ab100539) verwendet, das eine mit einem Antikörper gegen IGFBP1 beschichtete Mikrotiterplatte enthält. Proben und Standards werden in die Wells pipettiert, sodass darin enthaltenes IGFBP1 fest an die Platte gebunden wird. Nichtgebundenes Material wird durch Waschen entfernt. Anschließend wird ein mit Biotin gekoppelter Antikörper gegen IGFBP1 zugegeben. Nach einem weiteren Waschschritt zur Entfernung des überschüssigen Antikörper-Enzym-Komplexes folgt die Zugabe von HRP-gebundenem Streptavidin. Nach einem letzten Waschschritt wird Substratlösung zugegeben. Das Substrat wird durch das gebundene Enzym umgesetzt und es kommt zu einem Farbumschlag der Lösung. Nach Abstoppen der Reaktion folgt die Messung der Farbintensität, die proportional zur Menge an IGFBP1 in der Probe ist.
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Wie in dargestellt, produzieren die untersuchten MPNST Zelllinien IGFBP1 und sezernieren dies in das Medium.
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Beispiel 7: TNF alpha und Interferon gamma werden von T-Lymphozyten von NF1 Patienten verstärkt exprimiert.
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Zur Untersuchung des erworbenen Zytokinprofils von T-Zellen können die Zellen für 6 Stunden mit 10 ng/mL Phorbol-12-Myristat-13-Acetat (PMA) und 1 μg/mL Ionomycin (Sigma) bei 37°C und 5% CO2 im Brutschrank stimuliert werden. PMA-Ionomycin simuliert die Stimulation des T-Zell-Rezeptor und Costimulation, wodurch sämtliche T-Zellen unabhängig von ihrer Rezeptorspezifität angeregt und zur Zytokinproduktion stimuliert werden. Zur intrazellulären Akkumulation der Zytokine wurde Brefeldin A (5 g/mL) zugesetzt. Die Zellen werden fixiert, anschließend mit BD Perm/WashT-Puffer permeabilisiert und dann intrazellulär mit den entsprechenden Antikörpern angefärbt. Die T-Zellen können mittels FACS Analyse durch das Anfärben der spezifischen Oberflächenrezeptoren CD3, CD4 und CD8 mit kommerziell erhältlichen Antikörpern identifiziert werden. Die intrazellulären Zytokine werden mittels anti-TNFalpha (Maus anti-human TNFalpha) sowie anti-IFNgamma (Maus anti-human IFNgamma) detektiert. Die statistische Darstellung der experimentellen Ergebnisse in zeigt, dass durchschnittlich die CD4+ als auch CD8+ T-Lymphozyten von NF1 Patienten mehr TNFalpha produzieren verglichen zu den T Lymphozyten der Kontrollpatienten. Zudem zeigen die CD8+ T-Zellen von NF1 Patienten im Stimulationstest mehr IFNgamma produzierende Zellen als die CD8+ T-Zellen von Kontrollpatienten.
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Beispiel 8: IL-6, IFNγ, TNF-α und EGFR sowie IGFBP1 und RANTES eignen sich als diagnostische Marker für eine NF1 Erkrankung oder einem malignen peripheren Nervenscheidentumor (MPNST)
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Das diagnostische Potenzial der erfindungsgemäß aufgefunden Faktoren wurde mittels AUC für individuellen ROC-Kurven, wie in Material und Methodenteil beschreiben, bestimmt. Die Spezifität wurde bei einer Sensitivität von 90% bestimmt (Tabelle 2, ). Für alle sechs Kandidaten ist die AUC statistisch signifikant (P < 0,05). Die größte AUC für die NF1 Marker zeigt IFNγ (0,900), gefolgt von TNFα (0,877), IL-6 (0,834) und EGFR (0,728). Allerdings hängen die erhöhten Level der pro-inflammatorischen Zytokine nicht von der Tumorlast ab, da diese Zytokine auch in Patienten mit anderen Tumorarten gefunden wurden [36]. Allerdings zeigen die Daten einen Anstieg des systemischen, proinflammatorischen Status in NF1-Patienten im Vergleich zu Nicht-NF1-Kontroligruppen. Dies unterstreicht die Annahme, dass ein erhöhtes Zytokinlevel in NF1 durch eine systemische NF1+/– Umgebung begünstigt bzw. hervorgerufen wird. Ob dies durch einen Anstieg der Mastzellen und Monozyten-Aktivität oder durch eine generelle Änderung im Immunstatus dieser Patienten induziert wird, bleibt unklar [35, 37].
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In MPNST-Patienten war die AUC von IGFBP1 (0,770) größer als die AUC von RANTES (0,651) ( ). RANTES ist als eines der inflammatorischen Zytokine bekannt, die zytotaktische Aktivität in Immunzellen die T-Zellen Monozyten herstellen [38]. RANTES ist auch dafür bekannt, in Brustkarzinomen exprimiert zu werden [39] und korreliert mit einem weiterfortgeschrittenen Stadium dieser Krankheit, welches auf eine Rolle in der Krebsentwicklung bzw. dessen Verlauf hindeutet. Erhöhte Serumlevel von RANTES und IGFBP1 sind möglicherweise das Ergebnis einer erhöhten Sekretion durch eine Tumorzelle oder durch Immunzellen, in Antwort auf einen neoplastischen Prozess oder durch beide Mechanismen.
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IGFBP1 bindet die Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktoren (IGFs)-I und IGF-II und verstärkt ihre Halbwertszeit. Das Plasmalevel von IGFBP1 wird durch Hormone außerhalb der Wachstumshormonachse reguliert inklusive Insulin-Glucagon und Kortisol [40, 41]. Eine entgegengesetzte Korrelation wurde vor kurzem für die IGFBP1 Level und die Krebsentwicklung nahegelegt [42, 43]. Die Beobachtungen, dass IGF-1 und Wachstumsfaktor-Rezeptoren in PNF und MPNST von NF1-Patienten exprimiert werden sowie das IGF1 Rezeptorlevel mit einem erhöhten Mitoseindex von PNF korrelieren, deutet auf eine Empfindlichkeit dieser Tumore gegen IGFBP1-regulierte Faktoren hin [10, 44]. Zusammenfassend, lässt sich sagen, dass IGFBP1 möglicherweise den IGF-Zugang zu PNF und MPNST moduliert, allerdings sollte dieser Mechanismus erst noch weiter untersucht werden.
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Kürzlich identifizierten zwei Studien, MIA und Adrenomedullin als potenzielle NF1-Tumormarker an Kohorten von n = 42 und 32 [21, 23]. Adrenomedullin zeigt eine Tendenz auch mit MPNST zu korrelieren, obwohl die MPNST Gruppe zu klein war um eine signifikante Aussage zu zulassen (n = 5). Die MIA Konzentration war entweder deutlich erhöht in NF1-Patienten mit PNF oder eine große Anzahl von Neurofibroma korrelierte mit der internen Tumorlast. Beide dieser Faktoren scheinen mit der Tumorlast in NF1 zu korrelieren, obwohl nicht auszuschließen ist, dass dies auch durch eine veränderte systemische Umgebung, bedingt durch die Haploinsuffizienz hervorgerufen wird. Es wäre daher interessant näher zu untersuchen, ob eine systemtische inflammatorische Umgebung während der Früherkennung der Tumorgenese in NF1 -Patienten eine Rolle spielt.
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Beispiel 9: IGFBP1 und RANTES und PDGF-BB als therapeutische Targets zur Behandlung von NF1 assoziierten Tumoren
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Um die therapeutische Fähigkeit von den erfindungsgemäßen Serummarker auf das Wachstum von MPNST zu testen, können beispielsweise MPNST Zelllinien S462, ST88-14, NSF-1, verwendet werden, die in DMEM Glutamax-I mit 5% FBS von Invitrogen (Karlsruhe, Deutschland) kultiviert werden. Als Positivkontrolle wird der inhibierende Effekt von Imatinib Mesylat auf das MPNST Wachstum verwendet, welcher wie folgt durchzuführen und in Holtkamp et al., Carcinogenesis 27 (2006), 664–71 beschrieben ist. Imatinib Mesylat von Novartis Pharma AG (Basel, Schweiz) kann in Dimethyl Sulphoxid (DMSO) gelöst werden. Zellen werden (2 × 103) in 300 μl Medium in 24 Well-Platten ausgesät um adheränt zu werden. Imatinib wird in einer Konzentration von 2 μM und 10 μM in 100 μl einer maximal 0.1%igen DMSO Lösung verwendet. Die Negativkontrollen weisen ebenfalls nicht mehr als eine 0.1%ige DMSO Konzentration auf. 300 μl Medium, die Imatinib oder DMSO enthaltenen Lösungen werden nach Zugabe zu den Zellen am Tag 3 und 5 gewechselt. Die Zellproliferation wird am Tag 4 und Tag 7 nach Imatinab Behandlung mittels CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay von Promega (Mannheim, Deutschland) durch Messung der Absorption bei 490 nm bestimmt. Die Experimente werden mindestens als Doppelbestimmungen durchgeführt und drei Mal wiederholt.
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Schlussfolgerung: Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung durchgeführten Experimente beinhalten die bisher größte Studie bezüglich der Anzahl von NF1-Patienten (n = 104), welche je für potenzielle Serummarker für diese seltene, genetisch bedingte, Tumorerkrankung vorgenommen wurde. Es konnten vier potenzielle Biomarker identifizieren werden, welche in der Diagnose von NF1 eingesetzt werden können und zwei weitere Marker (IGFBP1 und RANTES), die mit der Anwesenheit von MPNST korrelieren. Interessanterweise scheint IGFBP1 auch mit der internen Tumorlast zu korrelieren und deutet auf ein erhöhtes Risiko für eine maligne Transformation in NF1-Patienten hin. Weiterhin zeigen die vorliegenden erfindungsgemäßen Daten, dass NF1-Patienten systemische pro-inflammatorische Profile aufwiesen, welche wahrscheinlich durch eine NF1-Haploinsuffizienz hervorgerufen wird. Serumbiomarker, die bei der Früherkennung der malignen Umwandlung helfen sind extrem nützlich, da therapeutische Eingriffe vorher initiiert werden könnten bevor der Tumor sich weiter entwickelt und Metastasen entstehen.
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