CZ287296B6 - Antibody construct and structural kit for selective preparation thereof - Google Patents

Description

Oblast techniky

Vynález se týká protilátkového konstruktu a konstrukčního kitu pro jeho selektivní přípravu. Obecně se vynález opírá o novou třídu antigen vázajících molekul, která obsahuje Fv - fragmenty protilátky, ale nepoužívá konstantní protilátkové domény. Tyto látky mohou také dimerizovat sjinými molekulami fragmentů protilátek nebo s molekulami neprotilátkového fragmentu za vzniku bi- nebo multifunkčních fuzních proteinů protilátkových fragmentů a takzvaných miniprotilátek. Nové fiizní proteiny mohou být užity v široké oblasti diagnostické a terapeutické medicíny.

Dosavadní stav techniky

V následujícím textu se používá těchto zkratek:

Fv scFv

V_L V_H

MW

AA

Ch

C_l

ELISA

RIA

Fab

F(ab)2

IgG

SDS-PAGE

OD280

PBS

BSA nekovalentně asociované heterodimery V_L a Vh jednořetězcová Fv oblast variabilní doména lehkého řetězce variabilní doména těžkého řetězce molekulová hmotnost aminokyselina těžký řetězec konstantního regionu lehký řetězec konstantního regionu enzymově spřažené imunochemické stanovení na pevném povrchu radioimunoanalýza fragment protilátky získaný zpracováním papainem fragment protilátky získaný zpracováním pepsinem imunoglobulin G elektroforéza na polyakrylamidovém gelu s dodecylsulfonanem sodným optická denzita při 280 nm roztok chloridu sodného pufrovaný fosforečnanem hovězí sérový albumin

Již několik let existuje zvýšený zájem v oblasti biotechnologie o modifikaci přirozeně se vyskytujících protilátek za účelem získání specifičtějších a individuálnějších druhů protilátek. Proto byla pozornost zaměřena na výrobu (modifikovaných) fragmentů protilátek.

Všechny přirozeně se vyskytující protilátky všech tříd mají alespoň dvě vazebná místa. To jim umožňuje vázat se k povrchu s větší funkční afinitou (takzvanou aviditou) než monovalentní fragmenty, jako jsou Fab fragmenty. Během posledních několika let byly popsány metody (Skerra a Pluckthun, 1988, Science 240, 1038-1040, Better a spol., 1988, Science 240, 1041— 1043), kterými mohou být funkční protilátkové fragmenty produkovány v Escherichia coli. Tyto fragmenty zahrnují Fv fragment (heterodimer, obsahující Vh a V_L) a Fab fragment (obsahující kompletní lehký řetězec s doménou V_L a Cl, jakož i první dvě domény těžkých řetězců Vh a Cm).

Fv fragment má však sklon disociovat na V_H a V_L a proto je výhodné připojit kovalentně dvě domény. Jednou z cest jejich připojení je vytvoření peptidového linkeru mezi nimi, buď v orientaci VH-linker-V_L nebo V_L-linker-N_H (Bird a spol., 1988, Science 242, 423, Huston a spol., 1988, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 85, 5879). Výsledné fragmenty jsou nazývány jednořetězcové Fv fragmenty.

-1 CZ 287296 B6

Všechny tyto fragmenty jsou však monovalentní. Tento vynález poskytuje metodu, jak konstruovat malou dimerizací domény na bázi peptidů, tvořících amfípatické helixy. Tyto peptidy budou nazývány jako interkalační, ale tento výraz vyjadřuje pouze schopnost cíleného spojení a ne omezení, týkajícího se jednotlivé struktury dimerizačního rozhraní.

I když je metoda zde popsaná v zásadě aplikovatelná jak na Fab, Fv nebo scFv fragmenty, jsou to tyto posledně uvedené, pro které je její použití nejvýhodnější. V tomto případě mohou být konstruovány bivalentní fragmenty velmi malé velikosti a může být zabráněno i disociaci na V_L a V_H jakož i špatnému spojení fragmentových řetězců, např. V_L - V_L.

Protilátkové fragmenty malé velikosti jsou zvláště výhodné v mnoha aplikacích. V diagnostických aplikacích (např. ELISA, RIA atd.), snižují menší molekuly povrchu problémy nespecifických interakcí, které často jak známo, vyvolávají konstantní domény. Totéž platí o použití protilátkových fragmentů jako ligandů v afinitní chromatografii. V diagnostikách nebo terapii tumorů je důležité, že významný podíl injikované protilátky penetruje tkání a lokalizuje se do tumoru a toto je závislé na rozměrech molekul (Colcher a spol., 1990, J. Nati. Cancer Inst. 82, 1191-1197). Výtěžky exprese a účinnost sekrece rekombinantních proteinů jsou také funkcí velikosti řetězce (Skerra - Plůckthun, 1991, Protein Eng. 4, 971) a z tohoto hlediska jsou preferovány malé proteiny. Z mnoha důvodů jsou tedy výhodné molekuly malé velikosti.

Dosud snížení rozměrů molekul protilátky znamená přípravu proteolytických fragmentů. Nejmenší bivalentní fragmenty (Fab)'₂ fragmenty, jsou ještě dvojnásobkem velikosti fragmentů podle předloženého vynálezu. Nové fragmenty tedy kombinují tři rysy: a) malou velikost, b) bivalentnost nebo bifunkčnost a c) schopnost funkční exprese v E. coli.

V mnoha oblastech existuje velký zájem o bifunkční protilátky. Bifunkční protilátky mohou být definovány jako mající dvě rozdílné specifity buď pro dva rozdílné antigeny nebo pro dva epitopy na stejném antigenu.

V současnosti existuje mnoho metod pro produkci bifunkčních protilátek. Avšak žádná z existujících metod neposkytuje produkci bifunkčních protilátek in vivo, ale spíše poskytují směs druhů molekul, která vždy vyžaduje komplikované a nákladné dělicí postupy.

Lze rozlišit čtyři základní metody. V první se používá chemické zesítění, které může výhodně užívat heterobifunkční zesíťovadla. Při této metodě byly celé protilátky (Staerz - a spol., 1985, Nátuře 314, 628, Perez a spol., 1985, Nátuře 316, 354-356), Fab fragmenty (Carter a spol., 1992, Biotechnology 10, 163) a scFv fragmenty (Cumber a spol., 1992, J. Immunol. 149, 120) chemicky zesítěny po čistění.

Druhá z uvedených metod zahrnuje fůzi dvou hybridomů za vzniku takzvaného heterohybridomu nebo „quadromu“. Při této metodě se jakýkoliv lehký řetězec může párovat s jakýmkoliv těžkým řetězcem a dva těžké řetězce mohou poskytovat homodimery nebo heterodimery za vzniku velmi komplikovaných směsí produktu (Milstein - Cuello, 1983, Nátuře 305, 537).

Třetí metoda se podobá druhé a zahrnuje transfekci dvou expresních plazmidů kódujících těžký a lehký řetězec druhé protilátky do hybridomové buňky (Lenz - Weidle, 1990, Gene 87, 213) nebo retrovirálního vektoru (De Monte a spol., 1990, Acad. Sci. 87, 2941-2945). Avšak po zavedení je směs produktů identická s druhým postupem.

Konečně byly protilátky redukovány, míšeny a reoxidovány (Staerz - Bevan, 1986, Immunology Today 7). Opět byly získány velmi komplikované směsi produktů vyžadující náročné postupy dělení a kontroly kvality.

Je tedy stále zapotřebí vyvinout postup umožňující přímou izolaci výlučně heterodimemích protilátek bez komplikované přípravy vyžadované po chemickém zesítění. Podle předloženého

-2CZ 287296 B6 vynálezu je tento problém řešen (i) kovalentním navázáním odpovídající V_H a V_L domény do scFV fragmentu a (ii) použitím dimerizačních domén umožňujících pouze tvorbu heterodimerů, jako jsou určité leucinové zippery a deriváty.

Dalším důležitým ohledem, který byl brán v úvahu při tomto vynálezu, byla snaha co nejvíce snížit molekulovou hmotnost bispecifícké protilátky z důvodů podrobně uvedených výše. Toho bylo dosaženo za použití scFv fragmentů.

Až dosud bylo popsáno mnoho použití bispecifíckých protilátek a při většině z nich by bylo možno dosáhnout užitku z této nové technologie. Například bispecifícké protilátky jsou velmi zajímavé v terapii tumorů. Jedno raménko protilátky se může vázat k tumorovému markéru, druhé raménko kT-buněčnému epitopu, toxinu nebo radionuklid vázajícímu peptidu nebo proteinu pro přenos zabíječské funkce co nejblíže k tumorové buňce. V diagnostice se může jedno raménko vázat k analyzované látce, jež je předmětem zájmu, a druhé k základu, který může být snadno kvantifikován, například enzymu. Konečně při buněčných aplikacích může být výhodné dosáhnout vyšší selektivity vazby, když dva rozdílné epitopy nebo komplex stejného proteinu mohou být rozpoznány nebo když dva různé proteiny mohou být rozpoznány na témže buněčném povrchu.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu je protilátkový konstrukt, skládající se ze dvou monomemích fúzních proteinů, které jsou spojeny nekovalentní interakcí, kde každá monomemí jednotka se skládá z

i) jednořetězcovéhoFv fragmentu, scFV, (ii) linkerového peptidu nebo peptidu pantového regionu (hinge region) nebo jeho fragmentu a (iii) amfifilního helikálního peptidu, obsahujícího leucinovou zipper sekvenci, ve který každým sedmým aminokyselinovým zbytkem je leucinový zbytek nebo sekvenci, nesoucí alespoň dva negativně nebo pozitivně nabité aminokyselinové zbytky, přičemž uvedený helikální peptid je schopen dimerizovat s helikálním peptidem jiného monomemího fúzního proteinu nekovalentní interakcí, přičemž scFV fragment (i) je fúzován přes peptid linkeru/pantu (ii) s amfifilním peptidem (iii) k jeho C-konci.

Ve výhodném provedení je předmětem vynálezu bivalentní protilátkový konstrukt definovaný výše, kde scFV fragmenty (i) mají různou antigenní specifitu.

Helikálním peptidem (iii) je výhodně helixový svazek, skládající se zhelixu, obrátky a dalšího helixu.

V jednom provedení vynálezu může být k C-konci amfifilního peptidu (iii) fúzován druhý protein (iv). Tímto druhým proteinem (iv) je přednostně toxin, chelátorový peptid, protein vázající kov nebo peptid obsahující specifické vazebné místo enzymu, T-buňky nebo jejich fragmentů.

Předmětem vynálezu je dále také konstrukční kit pro selektivní přípravu individuálního protilátkového konstruktu definovaného výše, který zahrnuje odděleně uspořádané jednotlivé monomemí fúzní proteiny definované výše.

-3 CZ 287296 B6

Vynález se opírá o zjištění, že protilátkové fragmenty fuzních proteinů, obsahujících Fvfragmenty, by mohly být produkovány metodami genetického inženýrství se specifickými a zlepšenými vlastnostmi.

Výraz „nekovalentní interakce“ zahrnuje každé za normálních podmínek existující stabilní spojení, které nezahrnuje kovalentní vazbu, například spojení Van der Waalovými silami, (sterická) interdigitace amfifilních peptidů, zejména peptidových helixů nebo peptidů nesoucích opačné náboje aminokyselinových zbytků. Odpovídající účinné peptidy jsou výše a dále označovány názvem interaktivní nebo interkalační peptidy.

Amfifílní peptidy obsahují až 50 aminokyselin. Výhodně obsahují 10 až 30 aminokyselin. Ve výhodném provedení vynálezu je interaktivní peptid svazkem peptidových helixů (obsahujících helix, obrátku a další helix, viz výše). V dalším provedení je interaktivním peptidem leucinový zipper, obsahující peptid, mající několik opakujících se aminokyselin, kde každou sedmou aminokyselinou je leucinový zbytek. V jiném případě podle vynálezu nese peptid pozitivně nebo negativně nabité zbytky, například lysin (pozitivně nabitý) nebo kyselinu glutamovou (negativně nabitá) tak, že se tento peptid může vázat na další peptid (druhé monomemí jednotky) nesoucí opačné náboje.

Fv - fragment a interkalační peptid jsou spojeny spolu buď přímo nebo linkerovým peptidem, výhodně linkerovým peptidem. Ve výhodném provedení je linkerovým peptidem sekvence pantového regionu protilátky.

Jak je definováno, Fv - fragment obsahuje V_L a V_H region protilátky. Fv - fragment podle vynálezu je výhodně jednořetězcový fragment. Jednořetězcové fragmenty mohou být získány standardními technikami, využívajícími molekul standardních linkerů.

Do rozsahu vynálezu spadají dimemí fuzní proteiny, skládající se ze dvou monomemích fúzovaných proteinů, kde je spojení monomemích jednotek uskutečněno na základě nekovalentní interakce identických nebo rozdílných peptidů, kde alespoň jednou monomemí jednotkou je fuzní protein protilátka - Fv - fragment.

Jestliže dimer obsahuje dva Fv - fragmenty, mohou být Fv - fragmenty stejné (identická antigenová vazebná místa) nebo rozdílné (rozdílná antigenová vazebná místa). V takových případech mohou být získány mono- a bispecifícké (Fv) - miniprotilátky. Podle vynálezu jsou preferovány bispecifické miniprotilátky.

Interaktivní peptidy mohou být stejné nebo rozdílné, výhodně jsou identické. Interkalační peptidy mohou být spojeny v paralelním nebo v antiparalelním uspořádání.

Do rozsahu vynálezu tedy především spadá dimemí fuzní protein, skládající se ze dvou Fv fragmentů s rozdílnou specifítou (antigenovými vazebnými místy) a identických interkalačních helixových peptidů, přičemž protilátkové fragmenty a peptidy jsou spolu spojeny sekvencí pantového regionu.

Do rozsahu vynálezu spadá i dimer, skládající se z monomemí jednotky obsahující Fv - fragment a další monomemí jednotky, kde Fv - fragment je nahrazen neprotilátkovým peptidem. Neprotilátkovým peptidem může být toxin podobný ricinu, chelátorový nebo kov vázající peptid nebo enzym (například markerový enzym) nebo peptid nesoucí detegovatelné značení (například radioizotop).

Neprotilátkový peptid může také nést odpovídající vazebné místo pro uvedené skupiny, zahrnující vazebná místa cílená k T - buňkám nebo fragmentům T - buněk.

-4CZ 287296 B6

Do rozsahu vynálezu spadají i monomery a dimery, jak jsou definovány výše, kde interaktivní peptid(y) jefjsou) dále fuzován(y) na C - konci k cíleným proteinům/peptidům, jak jsou uvedeny výše, obsahujících odpovídající vazebná místa. Výsledné funkční proteiny a miniprotilátky jsou tak více funkční.

Monomemí protilátkový fúzní protein definovaný výše lze získat postupem, při němž jsou geny, kódující Fv- fragment, interaktivní peptid a, je-li to žádoucí, spojovací (linkerový) peptid klonovány do jednoho expresního plazmidu, hostitelská buňka je transformována uvedeným plazmidem a kultivována v živném roztoku a monomemí fuzní protein je exprimován v buňce nebo sekretován do média.

Výše definovaný dimemí fuzní protein lze získat postupem, při němž jsou geny, kódující kompletní monomemí fuzní proteiny nebo jejich části, klonovány alespoň do jednoho expresního plazmidu, hostitelská buňka je transformována uvedeným(i) expresním(i) plazmidem(y) a kultivována v živném roztoku a buď je kompletní dimemí fuzní protein exprimován v buňce nebo do média nebojsou monomemí fuzní proteiny separátně exprimovány a nekovalentní spojení mezi dvěma monomemími jednotkami se uskuteční v médiu nebo in vitro a v případě, že byly klonovány pouze části fuzních proteinů, jsou další stupně konstrukce proteinů provedeny obvyklými standardními technikami.

Dimemí Fv - fragmenty, obsahující fuzní proteiny podle vynálezu vykazují vysokou aviditu vůči odpovídajícím antigenům a dostatečnou stabilitu. Tyto nové bivalentní nebo bifunkční molekuly mohou být připraveny jako složené a sestavené molekuly v E.coli. Tyto miniprotilátky jsou kompatibilní s funkční expresí při sekreci.

Oligomerizační domény byly vybrány jako mající malou molekulovou hmotnost a tak, aby byly kompatibilní s transportem fuzního proteinu membránou. Jsou založeny na dvou rozdílných typech amfífílních helixů.

Amfífílní helixy jsou známé zejména ale ne výlučně, pro spojení ve dvou rozdílných molekulárních strukturách: čtyřhelixových svazcích a spletených klubkách (coiled coil). Dezén a tvorba helixových svazků byly studovány dříve (Eisenberg a spol., 1986, Proteins 1, 16-22, Ho adeGrado, 1987, J. Am. Chem. Soc. 109, 6751-6758, Regan a deGrado, 1988, Science 241, 976-978, Hill a spol, 1990, Science 294, 543-546). Tyto molekuly jsou také známy z přírodních proteinů (Richardson, 1981, Adv. Prot. Chem. 34,167).

Čtyřhelixový svazek může být vytvořen buď čtyřmi separátními molekulami (každá tvořená jedním helixem), dvěma molekulami, obsahujícími každá dva helixy (spojené jako helix otáčka - helix) nebo jednou molekulou, obsahující motiv helix - otáčka - helix - otáčka - helix otáčka - helix. Pro demerizaci nebo multimerizaci jsou vhodné pouze první dvě.

Tři variance tohoto posledního tématu byly testovány. Nejprve byl použit jeden helix sekvence udávané Eisenbergem a spol. (1986) (Proteins 1,16-22). V druhém provedení byla tato sekvence prodloužena malým hydrofilním peptidem končícím cysteinem. Jakmile byly helixy spojeny, byly hydrofílní peptidy udržovány v dostatečně těsném kontaktu tak, že mohou kolidovat a může být vytvořena disulfídová vazba za oxidačních podmínek, jako v periplazmě E.coli. Ve třetí variaci byly použity dva helixy v tandemu, odděleně od krátkou otočku kódujícího peptidů.

Ve druhém dezénu se použijí peptidy, které mohou tvořit tak zvané struktury „coiled-coil“. Takové peptidy se objevují v transkripčních faktorech jako je např. GCN4 z kvasinky a byly nazvány leucinové zipy („zipper“) (Landschulz a spol., 1988, Science 240, 1759-1764). Krystalová struktura těchto látek byla vyřešena nedávno (O'Shea a spol., 1991, Science 254, 539-544) a vykazuje paralelní uspořádání helixů.

-5CZ 287296 B6

Kovalentní spojení helixů je možné velmi malým prodloužením peptidu, obsahujícím opět cystein. Protože helixy jsou nyní paralelní, může být peptidové prodloužení mnohem kratší, protože vzdálenost je mnohem menší.

Různé dimerizační prostředky (interkalační helixy) nicméně nejsou fúzovány k doméně protilátky přímo. Je výhodně zavést flexibilní peptid mezi konec scFv fragmentu a začátek helixu. Například byla použita spodní pantová oblast vyššího IgG3. Může však být použito mnoho pantů. Není to vyžadováno dimerizací jako takovou, ale poskytuje se spojení dvou scFv domén podobné antigenním vazebným místům celé protilátky. Tímto způsobem dvě vazebná místa zabírají větší vzdálenosti v prostoru a tím mohou dosáhnout okolních antigenů na pevném povrchu.

Přirozeně se vyskytující panty protilátek jsou výhodnými provedeními pantů v bivalentních miniprotilátkách. V případě bifunkčních miniprotilátek mohou být kratší panty, protože jsou molekuly z různých povrchů zesítěny tak těsně, jak je to možné, a flexibilita dimerů není nezbytná. Volba pantu je řízena požadovaným zbytkem sekvence, délkou (Argos, 1990, J. Mol. Biol. 211, 943-958), kompatibilitou se svinutím a stabilitou amfífílních helixů (RichardsonRichardson, 1988, Science 240, 1648-1652), sekrecí a rezistencí vůči proteásám.

Předložený vynález pracuje s peptidy jako dimerizačními prostředky, které by měly být co nejmenší. Jedním preferovaným provedením je použití peptidů, které mohou tvořit amfipatické helixy. Tyto helixy chrání hydrofobní povrch při dimerizaci nebo i multimerizaci. Helixy tohoto typu jsou charakterizovány tím, že mají hydrofobní místa na lícní straně helixu a obsahují dostatečný počet helix - tvořících zbytků. Pravidla pro takové peptidy jsou popsány Eisenbergem a spol. 1986,0'Shea-ou a spol. 1991 (Science 254, 539-549), 1992 (Cell 68, 699-708).

Přírodní peptidy tohoto typu byly shledány tak zvanými leucinovými zippery, které se vyznačují periodickým výskytem leucinu (každý sedmý zbytek) a jiných hydrofílních zbytků (např. valinu) také každý sedmý zbytek. Jak jsou nyní tyto principy chápány (O'Shea a spol. 1991, 1992, cit. lit.), může být sekvence měněna pro inkorporaci zbytků, které činí asociaci homodimerů nežádoucí, ale preferují asociaci heterodimerů. Taková změna sekvence například může zahrnovat inkorporaci nábojových můstků, jako v homodimerech, stejné náboje se odpuzují a v heterodimerů opačné náboje je přitahují (viz dále).

Předložený vynález může být také rozšířen na bifunkční miniprotilátky. V takovém případě dimerizační prostředky (interkalační peptidy) se používají jen pro tvorbu heterodimerů, ale ne homodimerů. Výhodným provedením této části vynálezu jsou dva rozdílné „coiled-coil“ helixy, jako jsou přirozeně se vyskytující leucinové zippery, např. z transkripčních faktorových proteinů jun a fos (O'Shea a spol., 1989, Science 245, 646-648).

V dalším provedení vynálezu může být konstantní scFv - pant - helix prodloužen na c-konci za vzniku fuzního proteinu. Např. fuze k enzymu může být provedena použitím takových bivalentních konstruktů v diagnostikách. Takovými enzymy jsou např. alkalická fosfatása, luciferása nebo křenová perixidása. Výhodou takového protilátka-enzym fuzního proteinu by mělo být, že bivalentnost protilátky by měla vést k zvýšené vazbě k povrchem vázanému antigenů. Výhodou proti fuznímu proteinu připravenému konvenční technologií (tj. chemickou kopulací protilátky ke zdroji enzymu) by měla být větší konzistence vsádka-vsádka, homogenita produktu a mnohem jednodušší způsob přípravy, zejména z E-coli v jediném stupni.

Stejný model lze užít i u miniprotilátek, které mohou být prodlouženy na C-konci pro inkorporaci toxinu. Takové imunotoxiny by měly být bivalentní nebo i bispecifické a kombinovat tak výhody výše uvedených protilátkových fragmentů spojených výše s výhodami imunotoxinů známých v terapii nádorů. Podobně peptid nebo protein, vázající kov, by měl být geneticky spojen pro použití v radioimunoterapii nebo zobrazení nádorů. Stejné výhody pro jakýkoliv geneticky kódovaný hybridní protein platí i pro fuze protilátka - enzym.

-6CZ 287296 B6

V dalším provedení vynálezu může být vytvořen konstrukt typu scFv - pant - helix k dimerizaci s dalším proteinem fúzovaným k dimerizační doméně, zcela analogicky jak je popsáno výše pro tvorbu bispecifických miniprotilátek. V takovém postupu by scFv fragment měl být např. spojen s helixem fos proteinu. Takový cizí protein, který by mohl byl zpracován za vzniku heterodimerů s scFv fragmentem, zahrnuje enzymy vhodné v diagnózách, toxiny, peptidy vázající kovy nebo proteiny vhodné v radioterapii nebo radiozobrazení.

Použitím principů tohoto vynálezu mohou přítomné dimerizační domény také sloužit pro účely čistění. Rekombinantní protein jakéhokoliv typu může být fúzován k dimerizační doméně např. kpant -fos-zipper. Po koexpresi s scFv-pan-jun může být heterodimer čištěn v jednom stupni afinitní kolonou na scFv - specifitu.

V alternativním provedení „opačný“ zipper připojený ke kolonovému nosiči, zachycuje proteinpant-zipper, když prochází kolonou jako surový buněčný extrakt.

Eluce čistého fuzního proteinu z kolony je možná použitím nesvinující teploty zipperu. Následné oddělení od dimerizační domény je proveditelné zavedením proteolytického místa, např. pro faktor Xa srážení krve, do pantu (Nagai Thogerson, 1987, Meth. Enzymol. 152, 461-481).

Zvláštní výhodou miniprotilátek popsaných v tomto vynálezu, je schopnost komplexní funkčnosti v Escherichia coli. V případě homobivalentních konstruktů se použije dimerizační princip, který umožňuje tvorbu homodimerů. Příklady, popsané výše, zahrnují „coiled-coil“ helix (leucinový zipper) kvasinkového proteinu GCN4 nebo helixy z antiparalelního 4 - šroubovicového svazku.

V tomto případě je scFv fragment exprimován za přítomnosti bakteriální signální sekvence a nese na konci genu scFv fragmentu kodomů pro pant a dimerizační helix nebo helix - otočku - helix. Helixy jsou kompatibilní se sekrecí k periplazmatickému prostoru, kde probíhá svinutí proteinu, tvorba disulfidu a komplexace. Za těchto podmínek se homodimemí proteiny tvoří samy a mohou být přímo izolovány v dimemí formě.

Jsou-li požadovány heterobivalentní konstrukty, je nutné spojit dva rozdílné scFv fragmenty nebo jeden scFv fragment s odlišným proteinem. Ve výhodném provedení vynálezu jsou oba spojované proteiny exprimovány ve stejné buňce, výhodně stejným plazmidem, výhodně jako dicistronní operon. Dezén umělých dicistronních operonů je vysvětlen např. v práci (Skerra aspol. 1991, Protein Eng. 4, 971). Protože spojení musí probíhat v periplazmě, protože scFv fragment může být svinut pouze v oxidačním prostředí, musí být oba proteiny transportovány a oba musí být opatřeny signální sekvencí. Dimerizační peptidy musí být zvoleny tak, že promotují spojení dvou rozdílných proteinů, ale brání spojení případných homodimerů.

Příklady takových proteinů jsou leucin zipper peptidy proteinů fas a jun (viz výše).

Jestliže nejsou exprimovány ve stejné buňce, měly by scFv - pant - zipper konstrukty být spolu míšeny jako surový buněčný extrakt nebo čištěný protein a zpracovány zvýšenou teplotou.

V nepřítomnosti opačného zipperu, např. scFv - pant - jun - zipper konstrukt je schopen tvořit homodimeiy. Po krátkém zahřívání na teplotu tání kolem 40 °C, se zippery neočekávaného homodimerů svinují a tvoří stabilnější heterodimer (O'Shea a spol., 1992, Cell 68, 699-708). Bez zvýšení teploty není tvorba heterodimerů in vitro možná, jak je prokázáno experimentálně.

Popis obrázků na připojených výkresech

Obr. 1 scFv - expresní vektor pLISC-SE, obsahující scFv - fragment

Obr. 2 dicistronní scFv - pant - zipper expresní vektor pACKxFyJ

-7CZ 287296 B6

Obr. 3	Funkční ELISA Koncentrace afinitně čištěných proteinů, měřeno jako OD28o (vertikální osa), vztaženo k molámímu počtu vazebných míst na jamku (horizontální osa). ELISA plotny byly pokryty fosfocholin - BSA a čištěné fosfocholin - specifická protilátka - proteiny byly navázány a detegovány anti - McP603 antisérem. a) Porovnání různých protilátek b) Porovnání protilátky scHLXc s ScFV a celým IgA.
Obr. 4	Funkční anti-lysozom ELISA, PC - afinitně čištěné vzorky koexprimované anti - PC - anti - lysozom bispecifické miniprotilátky. + a - na horizontální ose znamená: plus inhibitor (+) a bez inhibitoru (-).

Připojený seznam sekvencí je číslován následovně:

S.I.N.l:	Celá nukleotidová a aminokyselinová sekvence pLISC-vektoru.
S.I.N.2:	Genová kazeta interkalačního GCNL-leucin zipperu (nukleotidová a aminofselinová sekvence).
S.I.N.3:	Genová kazeta, kódující interkalační antiparalelní helix-otočka-helix (nukleotidová a aminofselinová sekvence).
S.I.N.4:	Genová kazeta, kódující interkalační jun-zipper a IgG3-pant oblast.
S.I.N.5:	Genová kazeta, kódující interkalační fos-zipper a IgG3-pant oblast.
S.I.N.6:	Genová kazeta, kódující interkalační jun-zipper a označený linker.
S.I.N.7:	Genová kazeta, kódující interkalační fos-zipper a označený linker.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1 Konstrukce vektorů pro sekretované jednořetězcové fragmenty, obsahující restrikční místo pro zavedení genů pro interkalační peptidy.

Rekombinantní DNA-techniky byly provedeny podle Sambrooka a spol. (1989, Molecular Cloning: A laboratory manual. Druhé vydání. Cold Spring Harbor Laboratory, New York). Funkční exprese jednořetězcových Fv-fragmentů a miniprotilátek vE. coli JM83 byla provedena s vektory podobnými pASK-lisc (Skerra a spol., 1991, Protein Eng. 4, 971). Místně řízená mutageneze byla přímo provedena v těchto vektorech podle Kunkela a spol. (1987, Meth. Enzymol. 154, 367-382) a Geisselsodera a spol. (1987, Biotechniques 5, 786-791) použitím helper fága M13KO7 (Vieira Messing, 1987, Meth. Enzymol. 153, 3-11). Byla provedena SDSPAGE podle Flinga a Gregersona (1986, Anal. Biochem. 155, 83-88). Koncentrace afinitně čištěných proteinů byly měřeny jako OD₂so za použití vypočtených extinkčních koeficientů (Gill a van Hippel, 1989, Anal. Biochem. 1982, 319-326). Použije se vektor jako pASK40 (Skerra a spol., 1991, Protein Eng. 4, 971), který obsahuje počátek replikace, regulující promotor, bakteriální signální sekvenci následovanou násobným klonovacím místem, transkripční terminátor a počátek pro jednořetězcové fágy. Gen pro jednořetězcový Fv fragment je sestaven následovně: nukleotidová sekvence V_H domény je přímo následována linkerovou sekvencí kódující výhodně asi 15 zbytků, výhodně sekvencí (Gly₄Ser)3, následovanou přímo sekvencí V_L domény. Alternativně sekvence Vl domény může být přímo následována sekvencí linkeru, následovanou sekvencí V_H domény.

Jestliže protilátka má známou sekvenci, může být kompletní gen scFv fragmentu sestaven ze syntetických oligonukleotidů. Podrobně je experimentální postup pro takovou syntézu protilátkového genu uveden např. v práci Pluckthuna a spol. (1987, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 52, 105-112).

-8CZ 287296 B6

Jsou-li geny V_H V_L domén přítomny vjiných vektorech, může být gen pro scFv fragment kompletován z restrikčních fragmentů. Například restrikční fragment kódující většímu V_H domény může být vyříznut z jiného plazmidu a fragment, kódující V_L doménu může být vyříznut z plazmidu. Zbylé kusy V_L a V_H a linker pro scFv fragment mohou být poskytnuty kazetami syntetických oligonukleotidů, které je nutno ligovat standardní metodou (Sambrook a spol., 1989, cit. literatura). Směs fragmentů je ligována do vektoru pASK40 nebo podobného plazmidu, obsahujícího pár vhodných restrikčních míst.

Jestliže geny protilátky nebyly předem klonovány, mohou být přímo získány zhybridomové buňky produkující protilátku polymerásovou řetězcovou reakcí (PCR, PCR metoda je popsána v práci McPherson a spol., 1991, PCR-A Practical Approach Oxford University Press, New York). Primery vhodné pro amplifikaci V_H a Vl domén byly uvedeny v pracech (Orlandi a spol., 1989, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86, 3833-3837, Huse a spol., 1989, Science 246, 1275-1281, Larrick a spol., 1989, Bio-technology 7, 934-938). Metoda získání mRNA zhybridomu je v těchto pracech rovněž popsána. Separátní V_H a V_L geny mohou být klonovány do separátních vektorů a scFv gen sestaven podle zásad vysvětlených dříve.

Jestliže ligované fragmenty nevedou ke správnému čtecímu rámečku scFv fragmentu, precizní fuze se signální sekvencí kodonů umístěna na plazmidu může být generována místně řízenou mutagenezí. Sestavení oligonukleotidů a realizace jsou možné pro každého odborníka v oboru.

Takto získaný scFv expresní plazmid obsahuje dva kodony pro bakteriální signální sekvenci, přímo následované první variabilní doménou (V_H nebo V_L), linker a druhou variabilní doménu (V_L nebo V_H) pod kontrolou řízeného promotoru.

Na 3' konci tohoto genu, odpovídajícímu C-konci scFv proteinu, je zavedeno unikátní restrikční místo do expresního plazmidu, umožňující inzerci kazet kódujících interkalační peptidy. Restrikční místo je zavedeno místně řízenou mutagenezí metodou podle Kunkela (1987, Meth. Enzymol. 154, 367-382).

Příklad kompletní sekvence vhodného jednořetězcového Fv expresního plazmidu pLISC-SE pro příjem interkalačního peptidu je uveden na obr. 1 a sekvence id. čísla (S.I.N.) 1 (viz seznam sekvencí).

Příklad 2 Dezén a konstrukce genové kazety kódující interkalační peptidy leucinového zipperu.

Genová kazeta, opatřená restrikčními místy kompatibilními s restrikčním místem na 3'konci scFv fragmentu genu, musí kodovat sekvenci pantu (připojení scFv fragmentu k interkalačnímu peptidu) a samotný interkalační peptid. Pantová oblast může však být vynechána.

Jako příklad se horní pantová oblast myšího IgG3 (Dangl a spol., 1988, EMBO J.7, 1989-1994), s následovanou sekvencí leucinové zipperové sekvence kvasinkového proteinu GCN4 (Oas a spol., 1990, Biochemistry T29, 2891-2894), zpětně translatuje do často užívaných E.Coli kodonů (S.I.N.:2). Oligonukleotidy jsou syntetizovány a ligovány do vektoru pLISC-SE předem štěpeného pomocí EcoRi a Hind ΙΠ.

Příklad 3 Dezén a konstrukce genové kazety, kódující interkalační peptidy čtyřšroubovicového svazku.

Analogicky příkladu 2 se sekvence horní pantové oblasti myšího IgG3, následovaná sekvencí helix-otáčka-helix čtyřšroubovicového svazku (Eisenberg a spol., 1986, citovaná literatura)

-9CZ 287296 B6 zpětně translatuje do často užívaných E.coli kodonů (S.I.N.:3). Oligonukleotidy jsou syntetizovány a ligovány do vektoru pLISC-SE předem štěpeného pomocí EcoRI a Hind III.

Příklad 4 Dezén a konstrukce dvou genových kazet, kódujících interkalační peptidy leucinového zipperu a jejich ko-expresi.

Analogicky příkladu 2 se sekvence horní pantové oblasti myšího IgG3 následovaná sekvencí zipperové sekvence jun proteinu (O'Shea a spol., 1992, citovaná literatura) zpětně translatuje do často používaných E.coli kodonů (S.I.N.:4). Syntetizují se oligonukleotidy a ligují do vektoru pLISC-SE, předem štěpeného EcoRI a Hind III.

V paralelní reakci se sekvence horní pantové oblasti myšího IgG3, následovaná sekvencí zipper sekvence fos proteinu (O'Shea a spol., 1992, Cell 68, 699-708) zpětně translatuje do nejčastěji užívaných E.coli kodonů (S.I.N.:5). Oligonukleotidy se syntetizují a ligují do vektoru pLISC-SE předem štěpeného EcoRI a Hind ΠΙ. Tyto dva vektory tak kódují každý jiný protilátkový scFv fragment, následovaný pantovým peptidem a rozdílným leucin zipperovým peptidem. Pro koexpresi dvou scFv fragmentů je celý scFv-pant-zipper gen fos- obsahujícího produktu vyříznut z vektoru jako Xba I-Hind ΠΙ fragment a ligován do vektoru, pLISC-SE-scFv-jun, obsahujícího vždy scFv gen jiné protilátky.

Nově získaný vektor pak exprimuje scFvi-linkeri-fos-zipper a scFv₂-linker₂-jun-zipper z jediného promotoru jako dicistronní operon.

Zlepšená sekvence pro pantovou oblast v kontextu fos a jun zipperů je uvedena v S.I.N.:6 a 7. Pant je kratší a není proto náchylný k proteolýze. V případech, kdy je vzdálenost mezi dvěma vazebnými místy méně důležitá, mohou být takové kratší panty výhodné. V takovém případě byl „konec“ scFv fragmentu zkrácen a EcoRI místo, které obdrží geny pro interkalační peptidy bylo posunuto čtyři zbytky proti směru.

Příklad 5 Čištění bivalentní miniprotilátky z E.coli.

E.coli JM83 nesoucí plazmid konstruovaný jako v příkladech 2 a 3 rostou na O.D. 550 rovnou 0,5 a indukují se IPTG na konečnou koncentraci 1 mM. Buňky se odstředí, resuspendují v BBS pufru (200 mM boritan sodný, 160 mM NaCl, pH 8,0) a suspenze se nechá projít French-lisem.

V tomto příkladu se použije fosforylcholin vázající miniprotilátka. Miniprotilátka se čistí fosforylcholin afinitní chromatografií (Chesebro a Metzger, 1972, Biochemistiy 11, 766-771).

Příklad 6 Čištění bispecifické miniprotilátky z E.coli.

E.coli JM83 nesoucí plazmid konstruovaný jako v příkladech 2 a 3 a obsahující dicistronní strukturální gen pro dva různé scFv (obr. 2) rostou na O.D. 550 rovnou 0,5 a indukují se IPTG na konečnou koncentraci 1 mM. Buňky se odstředí, resuspendují v BBS pufru (200 mM boritan sodný, 160 mM NaCl, pH 8,0) a suspenze se nechá projít French lisem).

V tomto příkladu se použije bispecifická protilátka, obsahující jak specifitu pro fosforylcholin, tak benzoylampicillin. Miniprotilátka se čistí pomocí fosforylcholin afinitní chromatografie jak je popsáno (Chesebro a Metzger, 1972, citovaná literatura).

-10CZ 287296 B6

Příklad 7 Povrchová vazba bivalentní miniprotilátky.

ELISA-platny (Nunc, Macrosorp) byly potaženy asi 400 g/ml fosfocholin-BSA v PBS pufru (20 mM fosfát, pH 7,2, 115 mM NaCl). Haptenové činidlo bylo připraveno znitrofenylfosfocholinu (Sigma), který byl redukován a diazotován v podstatě jak je popsáno (Chesebro Metzger, 1972, citovaná literatura) a azokopulací byl připojen kBSA (Sigma) v pufru boritansalinický roztok (52,5 mM boritan sodný, pH 9, 120 mM NaCl) při asi 4 °C po 48 hodin s následující dialýzou proti PBS. Po blokování nepotaženého povrchu ploten 5 % odstředěným mlékem (Nestle) v PBS pufru po alespoň 2 hodiny, byl periplazmatický extrakt nebo čištěný protein inkubován v BBS pufru na plotně po 90 min při teplotě místnosti. Po pečlivém promytí (3krát) byly zbývající funkční protilátkové fragmenty detegovány standardními postupy (Harlow a Lané, 1988, „Antibodies, A Laboratory Mannual“, Cold Spring Harbor Laboratory, 555-592) použitím králičí anti-McPC603 séra a anti-králičího imunoglobulinu, připojeného k peroxidáse (Sigma) podle Gallatiho(1979, Clin. Chem. Clin. Biochem. 17, 1-4).

Enormní zvýšení vazby a tím citlivosti je pozorováno u všech miniprotilátkových konstruktů ve srovnávání s monomemím scFv fragmentem. Toto je v souladu se současnou vazbou dvou nebo i více vazebných míst ke stejnému povrchu. Tato avidita fuzního proteinu scHLXc je srovnatelná s přirozenou protilátkovou McP603, která by mohla být detegována antigenem potaženou ELISA, zatímco monomemí scFv fragment by mohl být detegován stonásobně vyššími koncentracemi (obr. 3a, b). Celková vazba je téměř úplně inhibovatelná rozpustným haptenem, s výjimkou monomemího scFv fragmentu. Termodynamická afinita přirozené protilátky k rozpustnému fosfocholinu je asi 1,6x10⁵M^_1 a tak relativně slabá (Metzger a spol., 1971, Proceedings of the I^st Congress of Imunology, Academie Press, New York, str. 253-267), a je tak zjevně nevhodný pro komplex monomemí fragment-hapten k přečkání opakovaných promývacích stupňů funkční ELISA (Kemeny a Challacombe, 1988, „ELISA and other solid phase immunoassays“, Wiley - Sons, New York).

Příklad 8 Povrchová vazba bifunkčních miniprotilátek.

Koexprimované bifunkční miniprotilátky rozpoznávající fosfocholin jedním raménkem a lysozym druhým raménkem byly čištěny fosfocholin (PC) afínitní chromatografií a testovány na lysozymovou specifitu. ELISA-plotna byla potažena lysozymem a byla provedena ELISA jak je popsáno výše v příkladu 7. Tři různé přípravky vykazují vazbu k antigen-povrchu, která je kompletně inhibovatelná rozpustným lysozymem. (obr. 4).

-11 CZ 287296 B6

8EQ ID NO: 1

ACCCGACACC ATCGAATGGC GCAAAACCTT TCGCGGTATG GCATGATAGC50

GCCCGGAAGA GAGTCAATTC AGGGTGGTGA ATGTGAAACC AGTAACGTTA100

TACGATGTCG CAGAGTATGC CGGTGTCTCT TATCAGACCG TTTCCCGCGT150

GGTGAACCAG GCCAGCCACG TTTCTGCGAA AACGCGGGAA AAAGTGGAAG200

CGGCGATGGC GGAGCTGAAT TACATTCCCA ACCGCGTGGC ACAACAACTG250

GCGGGCAAAC AGTCGTTGCT GATTGGCGTT GCCACCTCCA GTCTGGCCCT300

GCACGCGCCG TCGCAAATTG TCGCGGCGAT TAAATCTCGC GCCGATCAAC350

TGGGTGCCAG CTGTGTGGTG TCGATGGTAG AACGAAGCGG CGTCGAAGCC400

TGTAAAGCGG CGGTGCACAA TCTTCTCGCG CAACGCGTCA GTGGGCTGAT450

CATTAACTAT CCGCTGGATG ACCAGGATGC CATTGCTGTG GAAGCTGCCT500

GCACTAATGT TCCGGCGTTA TTTCTTGATG TCTCTGACCA GACACCCATC550

AACAGTATTA TTTTCTCCCA TGAAGACGGT ACGCGACTGG GCGTGGAGCA600

TCTGGTCGCA TTGGGTCACC AGCAAATCGC GCTGTTAGCG GGCCCATTAA650

GTTCTGTCTC GGCGCGTCTG CGTCTGGCTG GCTGGCATAA ATATCTCACT700

CGCAATCAAA TTCAGCCGAT AGCGGAACGG GAAGGCGACT GGAGTGCCAT750

GTCCGGTTTT CAACAAACCA TGCAAATGCT GAATGAGGGC ATCGTTCCCA800

CZGCGATGCT GGTTGCCAAC GATCAGATGG CGCTGGGCGC AATGCGCGCCíso

ATTACCGAGT CCGGGCTGCG CGTTGGTGCG GATGTCTCGG TAGTGGGATA900

CGCAGATACC GAAGACAGCT CATGTTATAT CCCGCCGTTA ACCACCATCA950

AACAGGATTT TCGCCTGCTG GGGCAAACCA GCGTGGACCG CTTGCTGCAA1000

CTCTCTCAGG GCCAGGCGGT GAAGGGCAAT CAGCTGTTGC CCGTCTCACT1050

GGTGAAAAGA AAAACCACCC TGGCGCCCAA TACGCAAACC GCCTCTCCCC1100

GCGCGTTGGC CGATTCATTA ATGCAGCTGG CACGACAGGT TTCCCGACTGH50

GAAAGCGGGC AGTGAGCGCA ACGCAATTAA TGTGAGTTAG CTCACTCATT1200

AGGCACCCCA GGCTTTACAC TTTATGCTTC CGGCTCGTAT GTTGTGTGGA1250

ATTGTGAGCG GATAACAATT TCACACAGGA AACAGCTATG ACCATGATTA1300

CGAATTTCTA GATAACGAGG GCAAAAA---ATG AAA AAG ACA GCT ATC1345

Met Lys Lys Thr Ala Ile

GCG ATT GCA GTG GCA CTG GCT GGT TTC GCT ACC GTA GCG CAG1387

Ala Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala Thr Val AlaGin

1520

GCC GAA GTT AAA CTG GTA GAG TCT GGT GGT GGT CTG GTA CAG1423

Ala Glu val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu ValGin

2530

CCG GGT GGA TCC CTG CGT CTG TCT TGC GCT ACC TCA GGT TTC1471

Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser GlyPhe

4045

ACC TTC TCT GAC TTC TAC ATG GAG TGG GTA CGT CAG CCC CCG1513

Thr Phe Ser Asp Phe Tyr Met Glu Trp Val Arg Gin ProPro

SO 5560

GGT AAA CGT CTC GAG TGG ATC GCA GCT AGC CGT AAC AAA GGT1555

Gly Lys Arg Leu Glu Trp Ile Ala Ala Ser Arg Asn LysGly «5 7075

AAC AAG TAT ACC ACC GAA TAC AGC GCT TCT GTT AAA GGT CGT1597

Asn Lys Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala Ser Val Lys Gly Arg

-12CZ 287296 B6

TTC ATC GTT TCT CGT GAC ACT AGT

CAA TCG ATC CTG

TAC CTG

1639

Phe

Ile

Val

Ser

Arg 95

Asp

Thr

Ser

Gin

Ser 100

Ile

Leu

Tyr

Leu

CAG

ATG

AAT

GCA

TTG

CGT

GCT

GAA

GAC

ACC

GCT

ATC

TAC

TAC

1681

Gin 105

Met

Asn

Ala

Leu

Arg 110

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala 115

Ile

Tyr

Tyr

TGC

GCG

CGT

AAC

TAC

TAT

GGC

AGC

ACT

TGG

TAC

TTC

GAC

GTT

1723

Cys

Ala 120

Arg

Asn

Tyr

Tyr

Gly 125

Ser

Thr

Trp

Tyr

Phe 130

Asp

Val

TGG

GGT

GCA

GGT

ACC

ACC

GTT

ACC

GTT

TCT

TCT

GGT

GGT

GGT

1765

Trp

Gly

Ala 135

Gly

Thr

Thr

Val

Thr 1«

Val

Ser

Ser

Gly

Gly 145

Gly

GGT

TCT

GGT

GGT

GGT

GGT

TCT

GGT

GGT

GGT

GGT

TCT

GAT

ATC

1807

Gly

Ser

Gly

Gly 150

Gly

Gly

Ser

Gly

Gly 155

Gly

Gly

Ser

Asp

Ile 160

GTT

ATG

ACC

CAG

TCT

CCG

AGC

TCT

CTG

TCT

GTA

TCT

GCA

GGT

1849

Val

Met

Thr

Gin

Ser 165

Pro

Ser

Ser

Leu

Ser 170

Val

Ser

Ala

Gly

GAA

CGT

GTT

ACC

ATG

TCT

TGC

AAA

TCT

TCT

CAG

TCT

CTG

CTG

1891

Glu 175

Arg

Val

Thr

Met

Ser 160

cys

Lys

Ser

Ser

Gin 165

Ser

Leu

Leu

AAC

TCT

GGT

AAC

CAG

AAA

AAC

TTC

CTG

GCG

TGG

TAT

CAG

CAA

1933

Asn

Ser 190

Gly

Asn

Gin

Lys

Asn 195

Phe

Leu

Ala

Trp

Tyr 200

Gin

Gin

AAG

CCT

GGC

CAA

CCG

CCG

AAA

CTG

CTG

ATC

TAC

GGT

GCG

TCG

1975

Lsy

Pro

Gly 205

Gin

Pro

Pro

Lys

Leu 210

Leu

Ile

Tyr

Gly

Ala 215

Ser

ACC

CGT

GAA

TCT

GGT

GTT

CCG

GAC

CGT

TTT

ACC

GGT

AGC

GGT

2017

Thr

Arg

G1U

Ser 220

Gly

Val

Pro

Asp

Arg 225

Phe

Thr

Gly

Ser

Gly 230

AGC

GGT

ACC

GAC

TTC

ACT

CTG

ACC

ATC

TCT

TCT

GTA

CAG

GCT

2059

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe 235

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser 2«

Ser

Val

Gin

Ala

GAA

GAT

CTG

GCT

GTT

TAC

TAC

TGT

CAA

AAC

GAC

CAC

TCT

TAC

2101

Glu 245

Asp

Leu

Ala

Val

Tyr 250

Tyr

Cys

Gin

Asn

Asp 255

His

Ser

Tyr

CCG

CTG

ACC

TTT

GGC

GCC

GGC

ACC

AAA

CTG

GAA

CTG

AAG

CGC

2143

Pro

Leu 260

Thr

Phe

Gly

Ala

Gly 265

Thr

Lys

Leu

Glu

Leu 270

Lys

Arg

GCT AAC GGT GAA TTC-TGATAAGCTTGA CCTGTGAAGT GAAAAATGGC 2190 Ala Asn Gly Glu Phe *

275

GCACATTGTG CGACATTTTT TTTGTCTGCC GTTTACCGCT ACTGCGTCAC22«

GGATCCCCAC GCGCCCTGTA GCGGCGCATT AAGCGCGGCG GGTGTGGTGG2290

TTACGCGCAG CGTGACCGCT ACACTTGCCA GCGCCCTAGC GCCCGCTCCT23«

TTCGCTTTCT TCCCTTCCTT TCTCGCCACG TTCGCCGGCT TTCCCCGTCA2390

AGCTCTAAAT CGGGGCATCC CTTTAGGGTT CCGATTTAGT GCTTTACGGC2«o

ACCTCGACCC CAAAAAACTT GATTAGGGTG ATGGTTCACG TAGTGGGCCA2490

TCGCCCTGAT AGACGGTTTT TCGCCCTTTG ACGTTGGAGT CCACGTTCTT25«

TAATAGTGGA CTCTTGTTCC AAACTGGAAC AACACTCAAC CCTATCTCGG2590

TCTATTCTTT TGATTTATAA GGGATTTTGC CGATTTCGGC CTATTGGTTA26«

-13 CZ 287296 B6

AAAAATGAGC AACGTTTACA CTATTTGTTT CAATAACCCT TATTCAACAT TTCCTGTTTT GATCAGTTGG TAAGATCCTT CTTTTAAAGT CAAGAGCAAC GTACTCACCA AATTATGCAG CTTCTGACAA CATGGGGGAT AAGCCATACC ACAACGTTGC GCAACAATTA TGCGCTCGGC GGTGAGCGTG GCCCTCCCGT ATGAACGAAA TGGTAACTGT ACTTCATTTT TCATGACCAA CCCGTAGAAA AATCTGCTGC TGCCGGATCA AGAGCGCAGA CCACTTCAAG TGTTACCAGT GACTCAAGAC GGGTTCGTGC GATACCTACA AAGGCGGACA GAGGGAGCTT TTCGCCACCT CGGAGCCTAT CTTTTGCTGG

TGATTTAACA ATTTCAGGTG ATTTTTCTAA GATAAATGCT TTCCGTGTCG TGCTCACCCA GTGCACGAGT GAGAGTTTTC TCTGCTATGT TCGGTCGCCG GTCACAGAAA TGCTGCCATA CGATCGGAGG CATGTAACTC AAACGACGAG GCAAACTATT ATAGACTGGA CCTTCCGGCT GGTCTCGCGG ATCGTAGTTA TAGACAGATC CAGACCAAGT TAATTTAAAA AATCCCTTAA AGATCAAAGG TTGCAAACAA AGAGCTACCA TACCAAATAC AACTCTGTAG GGCTGCTGCC GATAGTTACC ACACAGCCCA GCGTGAGCTA GGTATCCGGT CCAGGGGGAA CTGACTTGAG GGAAAAACGC CCTTTTGCTC

AAAATTTAAC GCACTTTTCG ATACATTCAA TCAATAATAT CCCTTATTCC GAAACGCTGG GGGTTACATC GCCCCGAAGA GGCGCGGTAT CATACACTAT AGCATCTTAC ACCATGAGTG ACCGAAGGAG GCCTTGATCG CGTGACACCA AACTGGCGAA TGGAGGCGGA GGCTGGTTTA TATCATTGCA TCTACACGAC GCTGAGATAG TTACTCATAT GGATCTAGGT CGTGAGTTTT ATCTTCTTGA AAAAACCACC ACTCTTTTTC TGTCCTTCTA CACCGCCTAC AGTGGCGATA GGATAAGGCG GCTTGGAGCG TGAGAAAGCG AAGCGGCAGG ACGCCTGGTA CGTCGATTTT CAGCAACGCG ACATG

GCGAATTTTA GGGAAATGTG ATATGTATCC TGAAAAAGGA

TGAAAGTAAA GAACTGGATC ACGTTTTCCA TATCCCGTAT TCTCAGAATG GGATGGCATG ATAACACTGC CTAACCGCTT TTGGGAACCG CGATGCCTGT CTACTTACTC TAAAGTTGCA TTGCTGATAA GCACTGGGGC GGGGAGTCAG GTGCCTCACT ATACTTTAGA GAAGATCCTT CGTTCCACTG GATCCTTTTT GCTACCAGCG CGAAGGTAAC GTGTAGCCGT ATACCTCGCT AGTCGTGTCT CAGCGGTCGG AACGACCTAC CCACGCTTCC GTCGGAACAG TCTTTATAGT TGTGATGCTC GCCTTTTTAC

ACAAAATATT CGCGGAACCC GCTCATGAGA AGAGTATGAG GCATTTTGCC AGATGCTGAA TCAACAGCGG ATGATGAGCA TGACGCCGGG ACTTGGTTGA ACAGTAAGAG GGCCAACTTA TTTTGCACAA GAGCTGAATG AGCAATGGCA TAGCTTCCCG GGACCACTTC ATCTGGAGCC CAGATGGTAA GCAACTATGG GATTAAGCAT TTGATTTAAA TTTGATAATC AGCGTCAGAC TTCTGCGCGT GTGGTTTGTT TGGCTTCAGC AGTTAGGCCA CTGCTAATCC TACCGGGTTG GCTGAACGGG ACCGAACTGA CGAAGGGAGA GAGAGCGCAC CCTGTCGGGT GTCAGGGGGG GGTTCCTGGC

2690 2740 2790 2840 2890 2940 2990 3040 3090 3140 3190 3240 3290 3340 3390 3440 3490 3540 3590 3640 3690 3740 3790 3840 3890 3940 3990 4040 4090 4140 4190 4240 4290 4340 4390 4440 4490 4515

- 14CZ 287296 B6

SEQ ID NO: 2

GGT Gly

AAA Lys

GAA Glu f

CAG Gin

TTC Phe

CTG

Leu

CCC AAA CCT AGT ACT CCC Pro Lys Pro ser Thr Pro 5 t— -------IgG3~hinge —GAA GAT AAA GTT GAA GAG Glu Asp Lys Val Glu Glu 20

CCT GGC AGC AGC CGC ATG 45 Pro Gly Ser Ser Arg Met is

-----------------11_______

CTT CTT TCG AAA AAC TAC 90 Leu Leu Ser Lys Asn Tyr

30

------------------------ GCN4-zipper -----------------------CAC CTC GAA AAT GAA GTT GCG CGC CTC AAA AAA CTT GTT GGT GAA 135 His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Lys Lys Leu Val Gly Glu

40 45

CGC TGATAAGCTT GAC ^9, f ---^stop

151

SEQ	ID NO: :	3
GGT	GAA	TTC	CCC	AAA CCT	AGC	ACC	CCC CCT	GGC AGC AGT	GGT	GAA 45
Gly	Glu	Phe	Pro	Lys Pro	Ser	Thr	Pro Pro Gly	Ser Ser	Gly Glu
1	f			5			10				15
		L_		----------	—	________1	L___
CTG	GAA	GAG	CTG	CTT AAG	CAT	CTT	AAA GAA	CTT	CTG AAG	GGC	CCC 30
Leu	Glu	Glu	Leu	Leu Lys	His	Leu	Lys Glu	Leu	Leu Lys	Gly	Pro
				20			25				30
			* i 1 4	A —				___ J	{___
			- wUAuXe’nellX
CGC	AAA	GGC	GAA	CTC GAG	GAA	CTG	CTG AAA	CAT	CTG AAG	GAG	CTG 135
Arg	Lys	Gly	Glu	Leu Glu	Glu	Leu	Leu Lys	His	Leu Lys	Glu	Leu
				35			40				45
	J	L		—------- bundle-	a 4 -
curn			íieliA B
CTT	AAA	GGT	GAA	TTC TGATAAGCTT GACCTGTGAA GTGAAAAAAT G	191
Leu	Lys	Gly	G1U	Phe

f 50 f

------jstop

- 15CZ 287296 B6

8EQ ID NO: 4

GGT GAA TTC CCC AAA CCT AGT ACT CCC CCT GGC AGC AGC CGT ATC<s

Gly Glu Phe Pro Lys Pro Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser ArgIle

5 to15

1-------IgG3-hinge~-“—--- —-----J—

GCT CGT CTC GAG GAA AAA GTT AAA ACC CTG AAA GCT CAG AAC TCC90

Ala Arg Leu Glu Glu Lys Val Lys Thr Leu Lys Ala Gin AsnSer

2530 ———jun-zipper ——-—.——-— . GAA CTG GCT TCC ACC GCT AAC ATG CTG CGT GAA CAG GTT GCT CAG 135 Glu Leu Ala Ser Thr Ala Asn Met Leu Arg Glu Gin Val Ala Gin

4045 —— jun-zipper

CTG AAA CAG AAA GTT ATG AAC TAC TGATAAGCTT GACCTGTGAA G180

Leu Lys Gin Lys Val Met Asn Tyr *

--------— -----------------—I stop

SBQ ID NO: 5

GGT GAA

Gly Glu ¹ I

GAC ACC Asp Thr

TTC	CCC	AAA	CCT	AGT ACT	CCC	CCT	GGC	AGC	AGC	CTG	ACC
Phe	Pro	Lys	Pro	Ser Thr	Pro	Pro Gly	ser	Ser	Leu	Thr
		5				10					15
	L___				-—	——	——	-___1	1___	—
CTG	CAG	GCT	GAA	ACC GAC	CAG	CTG	GAA	GAC	AAA	AAA	TCC
Leu	Gin	Ala	Glu	Thr Asp	Gin	Leu	Glu	Asp	Lys	Lys	Ser
		20				25					30

— fos-zipper ———————_— GCT CTG CAG ACC GAA ATC GCT AAC CTG CTG AAA GAA AAA GAA AAA tas Ala Leu Gin Thr Glu Ile Ala Asn Leu Leu Lys Glu Lys Glu Lys

4045 ——----— -------------- fos-zipper---------———---—---CTG GAA TTT ATC CTG GCT GCT TAC TGATAAGCTT GACCTGTGAA Glío

Leu Glu Phe ile Leu Ala Ala Tyr .

so' —--------------—-------J stop

- 16CZ 287296 B6

SEQ ID NO: 6

GGT

GAA

TTC

CCG

TCT

GGT

AAC GAA GCT

CGT

ATC

GCT

CGT

CTC

GAG

45

Gly

Glu

Phe

Pro

Ser Gly

Asn Glu Ala

Arg

Ile

Ala

Arg

Leu

Glu

1

t

5

10

15

1____

— linker

---------W.J

(____

---—

---—

—----

GAA

AAA

GTT

AAA

ACC

CTG

AAA GCT CAG

AAC

TCC

GAA

CTG

GCT

TCC

90

G1U

Lys

Val

Lys

Thr

Leu

Lys Ala Gin

Asn

Ser

G1U

Leu

Ala

Ser

20

25

30

• jun—zxpper ···

ACC

GCT

AAC

ATG

CTG

CGT

GAA CAG GTT

GCT

CAG

CTG

AAA

CAG

AAA

135

Thr

Ala

Asn

Met

Leu Arg

Glu Gin Val

Ala

Gin

Leu Lys

Gin Lys

35

jun-zipper —

40

45

GTT ATG AAC TAC TGATAAGCTT GACCTGTGAA GTGAAAAATG GCG 180

Val Met Asn Tyr f -----------——* stop

SEQ	ID NO! '	7
GGT	GAA	TTC	GGT	CCG	TCT GGT AAC	GAA	CTG ACC GAC	ACC	CTG	CAG 45
Gly	G1U	Phe	Gly	Pro	Ser Gly Asn	Glu	Leu Thr Asp	Thr	Leu	Gin
1	f			5			10			15
			1____	linker ---------	----1	t- fos-zipper
GCT	GAA	ACC	GAC	CAG	CTG GAA GAC	AAA	AAA TCC GCT	CTG	CAG	ACC 90
Ala	Glu	Thr	Asp Gin	Leu Glu Asp	Lys	Lys Ser Ala	Leu	Gin	Thr

2530

-----—-—------fos-zipper-----—--------------------—

GAA ATC GCT AAC CTG CTG AAA GAA AAA GAA AAA CTG GAA TTT ATC 135 Glu He Ala Asn Leu Leu Lys Glu Lys Glu Lys Leu Glu Phe Ile

4045 ——-----------—----foa-zipper — -----*·---—-----~——

CTG GCT GCT TAC TGATAAGCTT GACCTGTGAA GTGAAAAATGGCG130

Leu Ala Ala Tyr f —---------—-1 _stop

- 17CZ 287296 B6

Seznam sekvencí:

(1) Obecná informace:

i) přihlašovatel:

A) jméno: Měrek Patent GmbH

B) ulice: Frankfúrter Str. 250

C) město: D-6100 Darmstadt 1

E) země. Německo

F) poštovní kod (ZIP): 4119

G) telefon: 06151 72 7022

H) telefax: 0615172 7191 ii) název vynálezu: Monomemí a dimemí fragmenty protilátkových fúzních proteinů iii) počet sekvencí: 14 iv) počítačová čtecí forma:

A) typ média: floppy disk

B) počítač: IBM P kompatibilní

C) operační systém: PC-DOS/MS-DOS

D) Software: Patent In Release č. 1,0, Version č. 1,25 (EPO)

v) údaje o přihlášce:

č. přihlášky: WO 93-00082 (2) Informace o sekvenci SEQ ID NO: 1:

i) charakteristiky sekvence:

A) délka: 4515 párů bází

B) typ: nukleová kyselina

C) řetězec: dvojitý

D) topologie: cirkulámí ii) typ molekuly: DNA (genomová) iii) hypotetická: ne iv) anti-sense: ne

v) typ fragmentu: N-terminální vi) originální zdroj:

A) organismus: syntetická, E.coli- a myší původ vii) bezprostřední zdroj:

B) klon: pLISC-SE ix) rysy:

A) jméno/klíč: CDS

B) lokace: 1328..2158

D) jiné informace: /produkt = Jediný řetězec Fv fragmentu (protilátky)“ /pozn.= „kompletní sekvence pLISC-SE vektoru“

-18CZ 287296 B6

x) publikační informace:

A) autoři: Plack Peter

Plueckthun, Andreas

B) název: Miniprotilátky: použití amfipatických helixů k produkci funkčních, flexibilně spojených dimemích Fv fragmentů s vysokou aviditou v E.coli

C) časopis: Biochemistiy

D) svazek: 31

E) vydání: 6

F) strany: 1579-1584

G) datum: 1992 xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 1:

ACCCGACACC	ATCGAATGGC	GCAAAACCTT	TCGCGGTATG	GCATGATAGC	GCCCGGAAGA	60
GAGTCAATTC	AGGGTGGTGA	ATGTGAAACC	AGTAACGTTA	TACGATGTCG	CAGAGTATGC	120
CGGTGTCTCT	TATCAGACCG	TTTCCCGCGT	GGTGAACCAG	GCCAGCCACG	TTTCTGCGAA	180
AACGCGGGAA	AAAGTGGAAG	CGGCGATGGC	GGAGCTGAAT	TACATTCCCA	ACCGCGTGGC	240
ACAACAACTG	GCGGGCAAAC	AGTCGTTGCT	GATTGGCGTT	GCCACCTCCA	GTCTGGCCCT	300
GCACGCGCCG	TCGCAAATTG	TCGCGGCGAT	TAAATCTCGC	GCCGATCAAC	TGGGTGCCAG	360
CTGTGTGGTG	TCGATGGTAG	AACGAAGCGG	CGTCGAAGCC	TGTAAAGCGG	CGGTGCACAA	420
TCTTCTCGCG	CAACGCGTCA	GTGGGCTGAT	CATTAACTAT	CCGCTGGATG	ACCAGGATGC	480
CATTGCTGTG	GAAGCTGCCT	GCACTAATGT	TCCGGCGTTA	TTTCTTGATG	TČTCTGACCA	540
GACACCCATC	AACAGTATTA	TTTTCTCCCA	TGAAGACGGT	ACGCGAGTGG	GCGTGGAGCA	600
TCTGGTCGCA	TTGGGTCACC	AGCAAATCGC	GCTGTTAGCG	GGCCCATTAA	GTTCTGTCTC	660
GGCGCGTCTG	CGTCTGGCTG	GCTGGCATAA	ATATCTCACT	CGCAATCAAA	TTCAGCCGAŤ	720
AGCGGAACGG	GAAGGCGACT	GGAGTGCCAT	GTCCGGTTTT	CAACAAACCA	TGCAAATGCT	780
GAATGAGGGC	ATCGTTCCCA	CTGCGATGCT	GGTTGCCAAC	GATCAGATGG	CGCTGGGCGC	840
AATGCGCGCC	attaccgagt	CCGGGCTGCG	CGTTGGTGCG	GATGTCTCGG	TAGTGGGATA	900
CGCAGATACC	GAAGACAGCT	CATGTTATAT	CCCGCCGTTA	ACCACCATCA	AACAGGATTT	960
TCGCCTGCTG	GGGCAAACCA	GCGTGGACCG	CTTGCTGCAA	CTCTCTCAGG	GCCAGGCGGT	1020
GAAGGGCAAT	CAGCTGTTGC	CCGTCTCACT	GGTGAAAAGA	AAAACCACCC	TGGCGCCCAA	1080

-19CZ 287296 B6

TACGCAAACC GCCTCTCCCC GCGCGTTGGC

TTCCCGACTG GAAAGCGGGC AGTGAGCGCA

AGGCACCCCA GGCTTTACAC TTTATGCTTC

GATAACAATT TCACACAGGA AACAGCTATG

CGATTCATTA ATGCAGCTGG CACGACAGGT1140

ACGCAATTAA TGTGAGTTAG CTCACTCATT1200

CGGCTCGTAT GTTGTGTGGA ATTGTGAGCG1260

ACCATGATTA CGAATTTCTA GATAACGAGG1320

GCAAAAA ATG AAA AAG ACA GCT ATC GCG ATT GCA GTG GCA CTG GCT GGT

1369

Met 1

Lys Lys

Thr Ala S

Ile Ala

Ile Ala

Val Ala Leu 10

Ala Gly

TTC

GCT

ACC

GTA

GCG

CAG

GCC

GAA

GTT

AAA

CTG

GTA

GAG

TCT

GGT

GGT

1417

Phe

Ala

Thr

Val

Ala

Gin

Ala

Glu

Val

Lys

Leu

Val

Glu

Ser

Gly Gly

15

20

25

30

GGT

CTG

GTA

CAG

CCG

GGT

GGA

TCC

CTG

CGT

CTG

TCT

TGC

GCT

ACC

TCA

1465

Gly

Leu

val

Gin

Pro

Gly

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

ser

Cys

Ala

Thr

Ser

35

40

45

GGT

TTC

ACC

TTC

TCT

GAC

TTC

TAC

ATG

GAG

TGG

GTA

CGT

CAG

CCC

CCG

1513

Gly

Phe

Thr

Phe

Ser

A8p

Phe

Tyr

Met

Glu

Trp

Val

Arg

Gin

Pro

Pro

50

55

60

GGT

AAA

CGT

CTC

GAG

TGG

ATC

GCA

GCT

AGC

CGT

AAC

AAA

GGT

AAC

AAG

1561

Gly Lys

Arg

Leu

Glu

Trp

Ile

Ala

Ala

Ser

Arg

Asn

Lys

Gly

Asn

Lys

65

70

75

TAT

ACC

ACC

GAA

TAC

AGC

GCT

TCT

GTT

AAA

GGT

CGT

TTC

ATC

GTT

TCT

1609

Tyr

Thr

Thr

Glu

Tyr

Ser

Ala

Ser

Val

Lys

Gly

Arg

Phe

Ile

val

Ser

80

85

90

CGT

GAC

ACT

ACT

CAA

TCG

ATC

CTG

TAC

CTG

CAG

ATG

AAT

GCA

TTG

CGT

1657

Arg

Asp

Thr

Ser

Gin

Ser

Ile

Leu

Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

Ala

Leu

Arg

95

100

105

110

GCT

GAA

GAC

ACC

GCT

ATC

TAC

TAC

TGC

GCG

CGT

AAC

TAC

TAT

GGC

AGC

1705

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

Ile

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Asn

Tyr

Tyr

Gly

Ser

115

120

125

ACT

TGG

TAC

TTC

GAC

GTT

TGG

GGT

GCA

GGT

ACC

ACC

GTT

ACC

GTT

TCT

1753

Thr

Trp

Tyr

Phe

Asp

Val

Trp

Gly

Ala

Gly

Thr

Thr

Val

Thr

Val

Ser

130

135

140

TCT

GGT

GGT

GGT

GGT

TCT

GGT

GGT

GGT

GGT

TCT

GGT

GGT

GGT

GGT

TCT

1801

Ser

Gly

Gly

Gly Gly

Ser

Gly Gly Gly Gly

Ser

Gly Gly Gly Gly

Ser

145

150

155

GAT

ATC

GTT

ATG

ACC

CAG

TCT

CCG

AGC

TCT

CTG

TCT

GTA TCT

GCA

GGT

1849

Asp

Ile

Val

Met

Thr

Gin

Ser Pro

Ser

Ser

Leu

Ser

Val Ser Ala

Gly

160 165 170

-20CZ 287296 B6

GAA CGT GTT ACC ATG

TCT TGC AAA

TCT TCT CAG TCT CTG CTG AAC TCT

1897

Glu Arg 175

Val

Thr

Met

Ser 180

Cys

Lys

Ser Ser

Gin 185

Ser Leu

Leu

Asn Ser 190

GGT

AAC

CAG

AAA

AAC

TTC

CTG

GCG

TGG

TAT

CAG

CAA

AAG

CCT

GGC

CAA

1945

Gly

Asn

Gin

Lys

Asn

Phe

Leu

Ala

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Gin

195

200

205

CCG

CCG

AAA

CTG

CTG

ATC

TAC

GGT

GCG

TCG

ACC

CGT

GAA

TCT

GGT

GTT

1993

Pro

Pro

Lys

Leu

Leu

Ile

Tyr

Gly

Ala

Ser

Thr

Arg

Glu

Ser

Gly

Val

210

21S

220

CCG

GAC

CGT

TTT

ACC

GGT

AGC

GGT

AGC

GGT

ACC

GAC

TTC

ACT

CTG

ACC

2041

Pro

Asp

Atg

Phe

Thr

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

225

230

235

ATC

TCT

TCT

GTA

CAG

GCT

GAA

GAT

CTG

GCT

GTT

TAC

TAC

TGT

CAA

AAC

2089

Ile

Ser

ser

Val

Gin

Ala

Glu

Asp

Leu

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Asn

240

245

250

GAC

CAC

TCT

TAC

CCG

CTG

ACC

TTT

GGC

GCC

GGC

ACC

AAA

CTG

GAA

CTG

2137

Asp

His

ser

Tyr

Pro

Leu

Thr

Phe

Gly

Ala

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

Leu

255

260

265

270

AAG

CGC

GCT

AAC

GGT

GAA

TTC

TGATAAGCTT GACCTGTGAA GTGAAAAATG

2188

Lys

Arg

Ala

Asn

Gly

Glu

Phe

275

GCGCACATTG	TGCGACATTT	TTTTTGTCTG	CCGTTTACCG	CTACTGCGTC	ACGGATCCCC	2248
ACGCGCCCTG	TAGCGGCGCA	TTAAGCGCGG	CGGGTGTGGT	GGTTACGCGC	AGCGTGACCG	2308
CTACACTTGC	CAGCGCCCTA	GCGCCCGCTC	CTTTCGCTTT	CTTCCCTTCC	TTTCTCGCCA	2368
CGTTCGCCGG	CTTTCCCCGT	CAAGCTCTAA	ATCGGGGCAT	CCCTTTAGGG	TTCCGATTTA	2428
GTGCTTTACG	GCACCTCGAC	CCCAAAAAAC	TTGATTAGGG	TGATGGTTCA	CGTAGTGGGC	2488
CATCGCCCTG	ATAGACGGTT	TTTCGCCCTT	TGACGTTGGA	GTCCACGTTC	TTTAATAGTG	2548
GACTCTTGTT	CCAAACTGGA	ACAACACTCA	ACCCTATCTC	GGTCTATTCT	TTTGATTTAT	2608
AAGGGATTTT	GCCGATTTCG	GCCTATTGGT	TAAAAAATGA	GCTGATTTAA	CAAAAATTTA	2668
ACGCGAATTT	TAACAAAATA	TTAACGTTTA	CAATTTCAGG	TGGCACTTTT	CGGGGAAATG	2728
TGCGCGGAAC	CCCTATTTGT	TTATTTTTCT	AAATACATTC	AAATATGTAT	CCGCTCATGA	2788
GACAATAACC	CTGATAAATG	CTTCAATAAT	ATTGAAAAAG	GAAGAGTATG	AGTATTCAAC	2848
ATTTCCGTGT	CGCCCTTATT	CCCTTTTTTG	CGGCATTTTG	CCTTCCTGTT	TTTGCTCACC	2908
CAGAAACGCT	GGTGAAAGTA	AAAGATGCTG	AAGATCAGTT	GGGTGCACGA	GTGGGTTACA	2968

-21 CZ 287296 B6

TCGAACTGGA	TCTCAACAGC	GGTAAGATCC	TTGAGAGTTT	TCGCCCCGAA	GAACGTTTTC	3028
CAATGATGAG	CACTTTTAAA	GTTCTGCTAT	GTGGCGCGGT	ATTATCCCGT	ATTGACGCCG	3088
GGCAAGAGCA	ACTCGGTCGC	CGCATACACT	attctcagaa	TGACTTGGTT	GAGTACTCAC	3148
CAGTCACAGA	AAAGCATCTT	ACGGATGGCA	TGACAGTAAG	AGAATTATGC	AGTGCTGCCA	3208
TAACCATGAG	TGATAACACT	GCGGCCAACT	TACTTCTGAC	AACGATCGGA	GGACCGAAGG	3268
AGCTAACCGC	TTTTTTGCAC	AACATGGGGG	ATCATGTAAC	TCGCCTTGAT	CGTTGGGAAC	3328
CGGAGCTGAA	TGAAGCCATA	CCAAACGACG	AGCGTGACAC	CACGATGCCT	GTAGCAATGG	3388
CAACAACGTT	GCGCAAACTA	TTAACTGGCG	AACTACTTAC	TCTAGCTTCC	CGGCAACAAT	3448
TAATAGACTG	GATGGAGGCG	GATAAAGTTG	CAGGACCACT	TCTGCGCTCG	GCCCTTCCGG	3508
CTGGCTGGTT	TATTGCTGAT	AAATCTGGAG	CCGGTGAGCG	TGGGTCTCGC	GGTATCATTG	3568
CAGCACTGGG	GCCAGATGGT	AAGCCCTCCC	GTATCGTAGT	TATCTACACG	ACGGGGAGTC	3628
AGGCAACTAT	GGATGAACGA	AATAGACAGA	TCGCTGAGAT	AGGTGCCTCA	CTGATTAAGC	3688
ATTGGTAACT	GTCAGACCAA	GTTTACTCAT	ATATACTTTA	GATTGATTTA	AAACTTCATT	3748
TTTAATTTAA	AAGGATCTAG	GTGAAGATCC	TTTTTGATAA	TCTCATGACC	AAAATCCCTT	3808
AACGTGAGTT	TTCGTTCCAC	TGAGCGTCAG	ACCCCGTAGA	AAAGATCAAA	GGATCTTCTT	3868
GAGATCCTTT	TTTTCTGCGC	GTAATCTGCT	GCTTGCAAAC	AAAAAAACCA	CCGCTACCAG	3928
CGGTGGTTTG	TTTGCCGGAT	CAAGAGCTAC	CAACTCTTTT	TCCGAAGGTA	ACTGGCTTCA	3988
GCAGAGCGCA	GATACCAAAT	ACTGTCCTTC	TAGTGTAGCC	GTAGTTAGGC	CACCACTTCA	4048
AGAACTCTGT	AGCACCGCCT	ACATACCTCG	CTCTGCTAAT	CCTGTTACCA	GTGGCTGCTG	4108
CCAGTGGCGA	TAAGTCGTGT	CTTACCGGGT	TGGACTCAAG	ACGATAGTTA	CCGGATAAGG	4168
CGCAGCGGTC	GGGCTGAACG	GGGGGTTCGT	GCACACAGCC	CAGCTTGGAG	CGAACGACCT	4228
ACACCGAACT	GAGATACCTA	CAGCGTGAGC	TATGAGAAAG	CGCCACGCTT	CCCGAAGGGA	4288
GAAAGGCGGA	CAGGTATCCG	GTAAGCGGCA	GGGTCGGAAC	AGGAGAGCGC	ACGAGGGAGC	4348
TTCCAGGGGG	AAACGCCTGG	TATCTTTATA	GTCCTGTCGG	GTTTCGCCAC	CTCTGACTTG	4408
AGCGTCGATT	TTTGTGATGC	TCGTCAGGGG	GGCGGAGCCT	ATGGAAAAAC	GCCAGCAACG	4468
CGGCCTTTTT	ACGGTTCCTG	GCCTTTTGCT	GGCCTTTTGC	TCACATG		4515

(2) Informace o SEQ ID NO: 2:

i) charakteristiky sekvence:

A) délka: 277 aminokyselin

B) typ: aminokyselina

C) topologie: lineární ii) typ molekuly: protein

-22CZ 287296 B6 xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 2:

Met 1

Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala 5

Val Ala Leu Ala 10

Gly Phe Ala 15

Thr

Val

Ala

Gin 20

Ala

Glu

Val

Lys

LeU 25

Val

Glu

Ser

Gly

Gly 30

Gly

Leu

Val

Gin

Pro 35

Gly

Gly

Ser

Leu

Arg 40

Leu

Ser

Cys

Ala

Thr 45

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe 50

Ser

Asp

Phe

Tyr

Met 55

Glu

Trp

Val

Arg

Gin 60

Pro

Pro

Gly Lys

Arg 63

Leu

Glu

Trp

Ile

Ala 70

Ala

Ser

Arg

Asn

Lys 75

Gly

Asn

Lys

Tyr

Thr 80

Thr

Glu

Tyr

Ser

Ala 85

Ser

Val

Lys

Gly

Arg 90

Phe

Ile

Val

Ser

Arg 95

Asp

Thr

Ser

Gin

ser 100

Ile

Leu

Tyr

Leu

Gin 105

Met

Asn

Ala

Leu

Arg 110

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala 115

Ile

Tyr

Tyr

Cys

Ala 120

Arg

Asn

Tyr

Tyr

Gly 125

Ser

Thr

Trp

Tyr

Phe 130

Asp

Val

Trp Gly

Ala 135

Gly

Thr

Thr

val

Thr 140

Val

Ser

Ser

Gly

Gly Glv 145

Gly

Ser

Gly

Gly 150

Gly

Gly

Sér

Gly

Gly 155

Gly

Gly

Ser

Asp

Ile 160

Val

Met

Thr

Gin

Ser 165

Pro

Ser

Ser

Leu

Ser 170

Val

Ser

Ala

Gly

Glu 175

Arg

Val

Thr

Met

Ser 180

Cys

Lys

Ser

Ser

Gin 185

Ser

Leu

Leu

Asn

Ser 190

Gly

Asn

Gin

Lys

Asn 195

Phe

Leu

Ala

Trp

Tyr 200

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly 205

Gin

Pro

Pro

Lys

Leu

Leu

I le

Tyr

Gly

Ala

ser

Thr

Arg

Glu

Ser

Gly

Val

Pro

Asp

210 215 220

-23CZ 287296 B6

Arg 225

Phe

Thr

Gly

Ser

Gly 230

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe 23S

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser 240

Ser

Val

Gin

Ala

Glu 245

Asp

Leu

Ala

Val

Tyr 250

Tyr

Cys

Gin

Asn

Asp 255

His

Ser

Tyr

Pro

Leu 260

Thr

Phe

Gly

Ala

Gly 265

Thr

Lys

Leu

Glu

Leu 270

Lys

Arg

Ala

Asn

Gly 275

Glu

Phe

(2) Informace o SEQ ID NO: 3:

i) charakteristiky sekvence:

A) délka: 151 párů bází

B) typ: nukleová kyselina

C) řetězec: dvojitý

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: DNA (genomová) iii) hypotetická: ne iv) anti-sense: ne

v) typ fragmentu: N-terminální vi) originální zdroj:

A) organismus: syntetický (dedukován z kvasinkových + myších sekvencí) ix)rysy:

A) jméno/klíč: CDS

B) lokace: 1..138

D) jiná informace: /produkt=„interkalační peptid“ /pozn.=„genová kazeta interkalaěního GCN4-leucinového zipperu“ ix)rysy:

A) jméno/klíč: směs.rysy

B) lokace: 10..39

D) jiná informace: /produkt=„imunoglobulinová spojovací oblast“ /poznámka=„IgG3-pant“ ix)rysy:

A) jméno/klíč: směs.rysy

B) lokace: 40..138

D) jiná informace: /produkt=„GCN4-zipper“

-24CZ 287296 B6 ix) popis sekvence: SEQ ID NO: 3 :

GGT GAA TTC CCC AAA CCT

AGT Ser

ACT CCC CCT GGC

AGC AGC CGC ATG

AAA Lys

Gly 1

Glu

Phe

Pro

Lys 5

Pro

Thr

Pro Pro 10

Gly

Ser

Ser Arg

Het 15

CAG

CTG

GAA

GAT

AAA

GTT

GAA

GAG

CTT

CTT

TČG

AAA

AAC

TAC

CAC

CTC

Gin

Leu

Glu

Asp

Lys

Val

Glu

Glu

Leu

Leu

Ser

Lys

Asn

Tyr

His

Leu

20

25

30

GAA

AAT

GAA

GTT

GCG

CGC

CTC

AAA

AAA

CTT

GTT

GGT

GAA

CGC

Glu

Asn

Glu

val

Ala

Arg

Leu

Lye

Lys

Leu

Val

Gly

Glu

Arg

35

40

45

TGAŤAAGCTT GAC

138

151 (2) Informace o SEQ ID NO: 4:

i) charakteristiky sekvence:

A) délka: 46 aminokyselin

B) typ: aminokyselina D) topologie: lineární ii) typ molekuly: protein xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 4:

Gly Glu 1

Phe Pro

Lys Pro Ser Thr Pro Pro

Gly

Ser Sér

Arg Met 15

Lys

5

10

Gin

Leu

Glu

Asp

Lys

Val

Glu

Glu

Leu

Leu

Ser

Lys

Asn

Tyr

His

Leu

20

25

30

Glu

Asn

Glu

Val

Ala

Arg

Leu

Lys

Lys

Leu

Val

Gly

Glu

Arg

40 45 (2) Informace o SEQ ID NO: 5:

i) charakteristiky sekvence:

A) délka: 181 párů bází

B) typ: nukleová kyselina

C) řetězec: dvojitý

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: DNA (genomická) iii) hypotetická: ne iii)anti-sense: ne

v) typ fragmentu: N-terminální vi) originální zdroj:

A) organismus: syntetický

-25CZ 287296 B6 ix) rysy:

A) jméno/klíč: CDS

B) lokace: 1..150

D) jiná informace: /produkt=„interkalační peptid“ /pozn.= ,genová kazeta kódující interkalační antiparalelní helix-otáčka-helix“ ix)rysy:

A) jméno/klíč: směs-rysy

B) lokace: 10.39

D) jiná informace: /produkt=„iminoglobulin spojovací oblast“ /pozn.=„IgG3-pant“ ix) rysy:

A) jméno/klíč: směs-rysy

B) lokace: 40..87

D) jiná informace: /produkt=„helix peptid“ /pozn.=„spletený-helix A“ ix) rysy:

A) jméno/klíč: směs-rysy

B) lokace: 88..150

D) jiná informace: /produkt=„helix peptid“ /pozn.=„spletený-helix B“ xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 5:

GGT GAA TTC CCC AAA CCT AGC ACC CCC CCT GGC AGC AGT GGT GAA CTG

Gly 1

Glu Phe Pro

Lys 5

Pro Ser

Thr

Pro Pro Gly Ser Ser Cly Glu

Leu

10

15

GAA

GAG

CTG

CTT

AAG

CAT

CTT

AAA

GAA

CTT

CTG

AAG

GGC

CCC

CGC

AAA

GLu

Glu

Leu

Leu

Lys

His

Leu

Lys

Glu

Leu

Leu

Lys

Gly

Pro

Arg

Lys

20

25

30

GGC

GAA

CTC

GAG

GAA

CTG

CTG

AAA

CAT

CTG

AAG

GAG

CTG

CTT

AAA

GGT

Gly

Glu

Leu

Glu

Glu

Leu

Leu

LyS

HiS

Leu

Lys

Glu

Leu

Leu

Lys

Gly

35

40

45

GAA TTC TGATAAGCTT GACCTGTGAA GTGAAAAAAT G

Glu Phe

144

181 (2) Informace o sekvenci SEQ ID NO: 6:

i) charakteristiky sekvence:

A) délka: 50 aminokyselin

B) typ: aminokyselina D) topologie: lineární ii) typ molekuly: protein

-26CZ 287296 B6 xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 6:

Gly

Glu

Phe

Pro

Lys

Pro

Ser

Thr

Pro

Pro

Gly

Ser

Ser

Gly

Glu

Leu

1

5

10

15

Glu

Glu

Leu

Leu

Lys

His

Leu

Lys

Glu

Leu

Leu

Lys

Gly

Pro

Arg

Lys

20

23

30

Gly

Glu

Leu

Glu

Glu

Leu

Leu

Lys

His

Leu

Lys

Glu

Leu

Leu

Lys

Gly

35

40

45

Glu Phe

SO (2) Informace o sekvenci SEQ ID NO: 7:

i) charakteristiky sekvence:

A) délka: 180 párů bází

B) typ: nukleová kyselina

C) řetězec: dvojitý

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: DNA (genomická) iii) hypotetický: ne iii)anti-sense: ne

v) typ fragmentu: N-terminální vi) původní zdroj:

A) organismus: syntetický, dedukován z lidských a myších sekvencí ix)rysy:

A) jméno/klíč: CDS

B) lokace: 1..159

D) jiná informace: /produkt=„interkalační peptid“ /pozn.=„genová kazeta kódující interkalační jun-zipper a IgG3-pant obl...“ ix)rysy:

A) jméno/klíč: směs-rysy

B) lokace: 10..39

D) jiná informace: /produkt=„imunoglobulinová spojovací oblast“ /pozn.=„IgG3-pant oblast (myší)“ ix)rysy:

A) jméno/klíč: směs-rysy

B) lokace: 40..159

D) jiná informace: /produkt=, jun-zipper“

-27CZ 287296 B6 xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 7:

GGT GAA TTC CCC AAA CCT AGT ACT CCC CCT GGC AGC AGC CGT ATC GCT

48

Gly 1

Clu Phe Pro

Lys 5

Pro Ser

Thr

Pro Pro Gly Ser Ser Arg ILe Ala

10

15

CGT

CTC

GAG

GAA

AAA

GTT

AAA

ACC

CTG

AAA

GCT

CAG

AAC

TCC

GAA

CTG

96

Arg

Leu

Glu

Glu

Lys

Val

Lys

Thr

Leu

Lys

Ala

Gin

Asn

Ser

Glu

Leu

20

25

30

GCT

TCC

ACC

GCT

AAC

ATG

CTG

CGT

GAA

CAG

GTT

GCT

CAG

CTG

AAA

CAG

144

Ala

Ser

Thr

Ala

Asn

Met

Leu

Arg

Glu

Gin

Val

Ala

Gin

Leu

Lys

Gin

35

40

45

AAA GTT ATG AAC TAC TGATAAGCTT GACCTGTGAA G tys Val Mec Asn Tyr iao (2) Informace o SEQ ID NO: 8:

i) charakteristiky sekvence:

A) délka: 53 aminokyselin

B) typ: aminokyselina D) topologie: lineární ii) typ molekuly: protein xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 8:

Gly 1

Glu

Phe

Pro

Lys 5

Pro

Ser

Thr

Pro

Pro 10

Gly

Ser

Ser

Arg

Ile 15

Ala

Arg

Leu

Glu

Glu 20

Lys

Val

Lys

Thr

Leu 25

Lys

Ala

Gin

Asn

Ser 30

Glu

Leu

Ala

Ser

Thr

Ala

Asn

Met

Leu

Arg

Glu

Gin

Val

Ala

Gin

Leu

Lys

GLn

40 45

Lys Val Met Asn. Tyr (2) Informace o SEQ ID NO: 9:

i) charakteristiky sekvence:

A) délka: 180 párů bází

B) typ: nukleová kyselina

C) řetězec: dvojitý

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: DNA (genomová) iii) hypotetická: ne

-28CZ 287296 B6 iii)anti-sense: ne

v) typ fragmentu: N-terminální vi) originální zdroj:

A) organismus: syntetický, dedukovaný z lidských a myších sekvencí ix) rysy:

A) jméno/klíč: CDS

B) lokace: 1..159

D) jiná informace: /produkt=„interkalační peptid“ /pozn.=„genová kazeta kódující interkalační fos-zipper a IgG3-pant“ ix)rysy:

A) jméno/klíč: směs-rysy

B) lokace: 10..39

D) jiná informace:/produkt=„imunoglobulin spojovací oblast“ /pozn.=„IgG3-pant (myší)“ ix) rysy:

A) jméno/klíč: směs-rysy

B) lokace: 40..159

D) jiná informace: /produkt=„fos-zipper“ xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 9:

GGT GAA

TTC ccc

AAA Lys 5

CCT AGT ACT CCC CCT GGC AGC AGC CTG ACC GAC

48

Gly 1

Glu

Phe

Pro

Pro Ser

Thr

Pro

Pro 10

Gly

ser

Ser

Leu Thr Asp 15

ACC

CTG

CAG

GCT

GAA

ACC

GAC

CAG

CTG

GAA

GAC

AAA

AAA

TCC

GCT

CTG

96

Thr

Leu

Gin

Ala

Glu

Thr

Asp

Gin

Leu

Glu

Asp

Lys

Lys

Ser

Ala

Leu

20

25

30

CAG

ACC

GAA

ATC

GCT

AAC

CTG

CTG

AAA

GAA

AAA

GAA

AAA

CTG

GAA

TTT

144

Gin

Thr

Glu

Ile

ALa

Asn

Leu

Leu

Lys

Glu

Lys

Glu Lys

Leu

Glu

Phe

35

40

45

ATC CTG GCT GCT TAC TGATAAGCTT GACCTGTGAA G 180

Ile Leu Ala Ala Tyr (2) Informace o SEQ ID NO: 10:

i) charakteristiky sekvence:

A) délka: 53 aminokyselin

B) typ: aminokyselina

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: protein

-29CZ 287296 B6 xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 10:

Gly 1

Glu

Phe

Pro Lys Pro Ser Thr Pro Pro

Gly Ser

Ser Leu

Thr 15

Asp

5

10

Thr

Leu

Gin

Ala

Glu

Thr

Asp

Gin

Leu

Glu

Asp

Lys

Lys

Ser

Ala

Leu

20

25

30

Gin

Thr

Glu

lle

Ala

Asn

Leu

Leu

L¥s

Glu

Lys

Glu

Lys

Leu

Glu

Phe

35

40

45

lle Leu Ala Ala Tyr (2) Informace o SEQ ID NO: 11:

i) charakteristiky sekvence:

A) délka: 180 párů bází

B) typ: nukleová kyselina

C) řetězec: dvojitý

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: DNA (genomický) iii) hypotetická: ne iii)anti-sense: ne

v) typ fragmentu: N-terminální vi) originální zdroj:

A) organismus: syntetický, dedukovaný z lidských sekvencí ix) rysy:

A) jméno/klíč: CDS

B) lokace: 1..147

D) jiná informace: /produkt=„interkalační peptid“ /pozn.=„genová kazeta kódující interkalační jun-zipper a linker“ ix)iysy:

A) jméno/klíč: směs-rysy

B) lokace: 10..27

D) jiná informace: /produkt=„syntetický linker“ ix) rysy:

A) jméno/klíč: směs-rysy

B) lokace: 28..147

D) jiná informace: /produkt^, jun-zipper“

-30CZ 287296 B6 xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 11:

GGT GAA TTC CCG TCT GGT AAC GAA

GCT Ala

CGT ATC GCT CGT CTC GAG

GAA Glu

48

Gly Glu Phe Pro Ser

Gly

Asn

Glu

Arg 10

Ile

Ala

Arg

Leu

Glu 15

1

5

AAA

GTT

AAA

ACC

CTG

AAA

GCT

CAG

AAC

TCC

GAA

CTG

GCT

TCC

ACC

GCT

96

Lys

Vál

Lys

Thr

Leu

Lys

Ala

Gin

Asn

Ser

Glu

Leu

Ala

Ser

Thr

Ala

20

25

30

AAC

ATG

CTG

CGT

GAA

CAG

GTT

GCT

CAG

CTG

AAA

CAG

AAA

GTT

ATG

AAC

144

Asn

Mat

Leu

Arg

Glu

Gin

Val

Ala

Gin

Leu

Lys

Gin

Lys

Val

Met

Asn

35

40

45

180

TAC TGATAAGCTT GACCTGTGAA GTGAAAAATG GCG Tyr (2) Informace o SEQ ID NO: 12:

i) charakteristiky sekvence:

A) délka: 49 aminokyselin

B) typ: aminokyselina

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: protein xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 12:

Gly Glu 1

Phe

Pro Ser S

Gly Asn

Glu Ala Arg 10

Ile Ala Arg

Leu

Glu 15

Glu

Lys

Val

Lys

Thr

Leu

Lys

Ala

Gin

Asn

Ser

Glu

Leu

Ala

Ser

Thr

Ala

20

25

30

Asn

Met

Leu

Arg

Glu

Gin

Val

Ala

Gin

Leu

Lys

Gin

Lys

Val

Met

Asn

35

40

45

Tyr (2) Informace pro SEQ ID NO: 13:

i) charakteristiky sekvence:

A) délka: 180 párů bází

B) typ: nukleová kyselina

C) řetězec: dvojitý

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: DNA (genomická) iii) hypotetická: ne iii)anti-sense: ne

v) fragment typ: N-terminální

-31 CZ 287296 B6 vi) originální zdroj:

A) organismus: syntetický, dedukovaný z lidských sekvencí ix) rysy:

A) jméno/klíč: CDS

B) lokace: 1..147

D) jiná informace: /produkt=„interkalační peptid“ /pozn.=„genová kazeta kódující interkalační fos-zipper a linker“ ix)rysy:

A) j méno/klíč: směs-rysy

B) lokace: 10..27

D) jiná informace: /produkt=„syntetický linker“ ix) rysy:

A) jméno/klíč: směs-rysy

B) lokace: 28..148

D) jiná informace: /produkt=„fos-zipper“ xi)popis sekvence: SEQ ID NO: 13:

GGT GAA TTC GGT CCG TCT GGT AAC GAA CTG ACC GAC ACC CTG CAG GCT

48

Gly 1

Glu Phe

Gly

Pro 5

Ser Gly

Asn

Glu Leu Thr 10

Asp

Thr

Leu Gin 15

Ala

GAA

ACC

GAC

CAG

CTG

GAA

GAC

AAA

AAA

TCC

GCT

CTG

CAG

ACC

GAA

ATC

96

Glu

Thr

Asp

Gin

Leu

Glu

Asp

Lys

Lys

Ser

Ala

Leu

Gin

Thr

Glu

Ile

20

25

30

GCT

AAC

CTG

CTG

AAA

GAA

AAA

GAA

AAA

CTG

GAA

TTT

ATC

CTG

GCT

GCT

144

Ala

Asn

Leu

Leu

Lys

Glu

Lys

Glu

Lys

Leu

Glu

Phe

Ile

Leu

Ala

Ala

35

40

45

TAC TGATAAGCTT GACCTGTGAA GTGAAAAATG GCG 180

Tyr (2) Informace o SEQ ID NO: 14:

i) charakteristiky sekvence:

A) délka: 49 aminokyselin

B) typ: aminokyselina D) topologie: lineární ii) typ molekuly: protein

-32CZ 287296 B6 xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 14:

Gly Glu Phe Gly 1

Pro 5

Ser

Gly Asn Glu Leu 10

Thr

Asp Thr

Leu

Gin 15

Ala

Glu

Thr

Asp

Gin

Leu

Glu

Asp

Lys

Lys

Ser

Ala

Leu

Gin

Thr

Glu

Ile

20

25

30

Ala

Asn

Leu

Leu

Lys

Glu

Lys

Glu

Lys

Leu

Glu

Phe

Ile

Leu

Ala

Ala

40 45

Claims (6)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Protilátkový konstrukt, skládající se ze dvou monomemích fúzních proteinů, které jsou spojeny nekovalentní interakcí, kde každá monomemí jednotka se skládá z (i) jednořetězcového Fv fragmentu, scFV, (ii) linkerového peptidů nebo peptidů pantového regionu nebo jeho fragmentu a (iii) amfifílního helikálního peptidů, obsahujícího leucinovou zipper sekvenci, ve které každým sedmým aminokyselinovým zbytkem je leucinový zbytek nebo sekvenci, nesoucí alespoň dva negativně nebo pozitivně nabité aminokyselinové zbytky, přičemž uvedený helikální peptid je schopen dimenzovat s helikálním peptidem jiného monomemího fuzního proteinu nekovalentní interakcí, přičemž scFV fragment (i) je fúzován přes peptid linkeru/pantu (ii) s amfífílním peptidem (iii) k jeho C-konci.
2. 2. Protilátkový konstrukt podle nároku 1, kde scFV fragmenty (i) mají různou antigenní specifitu, který je bivalentní.
3. 3. Protilátkový konstrukt podle nároku 1 nebo 2, kde helikální peptid (iii) je helixový svazek, skládající se z helixů, obrátky a dalšího helixů.
4. 4. Protilátkový konstrukt podle nároků 1 až 3, kde k C-konci amfifílního peptidů (iii) je fúzován druhý protein (iv).
5. 5. Protilátkový konstrukt podle nároku 4, kde druhým proteinem (iv) je toxin, chelátorový peptid, protein vázající kov nebo peptid obsahující specifické vazebné místo enzymu, T-buňky nebo jejich fragmentů.
6. 6. Konstrukční kit pro selektivní přípravu individuálního protilátkového konstruktu podle nároků laž5, vyznačující se tím, že zahrnuje odděleně uspořádané jednotlivé monomemí fuzní proteiny definované v kterémkoliv z nároků 1 až 5.