BR112016030458B1

BR112016030458B1 - Método para preparar uma combinação sintética compreendendo uma semente de milho e uma população bacteriana endofítica

Info

Publication number: BR112016030458B1
Application number: BR112016030458-6A
Authority: BR
Inventors: Birgit MITTER; Milica Pastar; Angela SESSITSCH; Karen AMBROSE; Xuecheng Zhang; Guenther REICHENBERGER; Nikolaus PFAFFENBICHLER
Original assignee: Ait Austrian Institute Of Technology Gmbh; Indigo Ag, Inc
Priority date: 2014-06-26
Filing date: 2015-06-26
Publication date: 2024-01-23
Also published as: US11747316B2; US20230288391A1; US20200022373A1; US20190166848A1; US20240110903A1; AU2015279600A1; BR112016030458A2; US20160255844A1; CA2953466A1; EP3161135A4; EP3161135A2; MX2020005244A; US9364005B2; US10362787B2; AR101166A1; US20160330976A1; US10306890B2; BR112016030458A8; WO2015200852A2; MX367428B

Abstract

combinação sintética e seu método de preparação, produto agrícola, método para conferir aptidão a uma planta agrícola, método de obter uniformidade de floração em uma população de plantas monocotiledôneas agrícolas. a descrição refere-se materiais e métodos para conferir traços da planta melhorados ou benefícios sobre as plantas. os materiais podem incluir uma formulação compreendendo uma população bacteriana endofítica exógena, que pode ser disposta sobre uma superfície exterior de uma semente ou muda, tipicamente em uma quantidade eficaz para colonizar a planta. as formulações podem incluir pelo menos um membro selecionado do grupo consistindo em um portador agricolamente compatível, um agente de pegajosidade, um estabilizador microbiano, um fungicida, um agente antibacteriano, um herbicida, um nematicida, um inseticida, um regulador de crescimento de planta, um rodenticida, e um nutriente.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido dos EUA No 14/315.804, depositado em 26 de Junho de 2014, que é por meio deste incorporado em sua totalidade por referência.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[002] O presente pedido contém uma Listagem de Sequências que foi apresentado por intermédio de EFS-Web e é por meio deste incorporado por referência em sua totalidade. A dita cópia de ASCII, criada em 26 de Junho de 2015, é denominada 29254_PCT_CRF_sequence_listing.txt, e é de 22 KB em tamanho.

ANTECEDENTES

[003] Com terra arável limitada ligada à demanda crescente de uma população humana constantemente crescente que pode atingir 9 bilhões até 2050, o fornecimento de alimentos é um desafio global tornando a produção de alimentos economicamente atraentes e de qualidade alta, livres de níveis inaceitáveis de produtos agroquímicos, uma necessidade extrema.

[004] Estratégias cultivo de planta tradicionais para realçar traços da planta são relativamente lentas e ineficientes. Por exemplo, cultivar plantas para tolerância aumentada a estresse abiótico requer linhagens fundadoras tolerantes a estresse abiótico para cruzar com outro germoplasma para desenvolver novas linhagens resistentes a estresse abiótico. Fontes de germoplasma limitadas para tais linhagens fundadoras e incompatibilidade em cruzamentos entre espécies de plantas distantemente relacionadas representam problemas significantes encontrados no cultivo convencional. O cultivo para tolerância ao estresse foi frequentemente inadequado dada a incidência de estresses e o impacto que os estresses têm sobre rendimentos da safra na maioria dos ambientes do mundo.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[005] A presente invenção é fundamentada nos esforços sistemáticos para descobrir espécies bacterianas endofíticas que têm o potencial para melhorar muito a produtividade agrícola. As cepas bacterianas endofíticas extensivamente caracterizadas aqui são capazes de conferir sobre a planta hospedeira vários benefícios de aptidão chaves e, como tal, oferecem a possibilidade de melhorar rendimentos de safras agrícolas sem a necessidade de esforços de cultivo demorados ou modificação genética.

[006] Em um primeiro aspecto, a presente invenção leva em consideração uma planta agrícola ou porção desta compreendendo uma população bacteriana endofítica exógena disposta sobre uma superfície exterior da semente ou muda em uma quantidade eficaz para colonizar a planta, e compreendendo ainda uma formulação que compreende pelo menos um membro selecionado do grupo consistindo em um veículo agricolamente compatível, um agente taquificante, um estabilizador microbiano, um fungicida, um agente antibacteriano, um herbicida, um nematicida, um inseticida, um regulador de crescimento de planta, um rodenticida, e um nutriente. A planta agrícola pode ser uma planta madura. Em outros casos, ela pode ser uma muda. Ainda em outros casos, ela pode ser uma semente de uma planta agrícola. Em uma modalidade particular, a planta agrícola é uma semente ou muda.

[007] Em uma modalidade, a população bacteriana endofítica consiste essencialmente em uma bactéria endofítica compreendendo uma sequência de ácido nucleico rRNA 16S pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, ou pelo menos 99,5 % idêntica a uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 1 a 10.

[008] Em uma modalidade particular, a bactéria endofítica é uma espécie de Agrobacterium, família Rhizobiaceae. Em uma modalidade particular, a espécie de Agrobacterium é identificada na base de sua sequência de rDNA, como esboçado aqui. Em uma modalidade particular, a espécie de Agrobacterium compreende uma sequência de rDNA 16S que é pelo menos 95 % idêntica a SEQ ID NO: 1. Em uma outra modalidade, a espécie de Agrobacterium compreende uma sequência de rDNA 16S que é pelo menos 99 % idêntica a SEQ ID NO: 1. Ainda em uma outra modalidade, a espécie de Agrobacterium compreende uma sequência de rDNA 16S que é idêntica a SEQ ID NO: 1. Ainda em uma outra modalidade, a espécie de Agrobacterium é o isolado FA13.

[009] Em uma outra modalidade, a bactéria endofítica é uma espécie de Pantoea, família Rhizobiaceae. Em uma modalidade particular, a espécie de Pantoea é identificada na base de sua sequência de rDNA, como esboçado aqui. Em uma modalidade particular, a espécie de Pantoea compreende uma sequência de rDNA 16S que é pelo menos 95 % idêntica a SEQ ID NO: 2. Em uma outra modalidade, a espécie de Pantoea compreende uma sequência de rDNA 16S que é pelo menos 99 % idêntica a SEQ ID NO: 2. Ainda em uma outra modalidade, a espécie de Pantoea compreende uma sequência de rDNA 16S que é idêntica a SEQ ID NO: 2. Ainda em uma outra modalidade, a espécie de Pantoea é o isolado FF34.

[0010] Em uma outra modalidade, a bactéria endofítica é uma espécie de Sphingobium, família Rhizobiaceae. Em uma modalidade particular, a espécie de Sphingobium é identificada na base de sua sequência de rDNA, como esboçado aqui. Em uma modalidade particular, a espécie de Sphingobium compreende uma sequência de rDNA 16S que é pelo menos 95 % idêntica a SEQ ID NO: 3. Em uma outra modalidade, a espécie de Sphingobium compreende uma sequência de rDNA 16S que é pelo menos 99 % idêntica a SEQ ID NO: 3. Ainda em uma outra modalidade, a espécie de Sphingobium compreende uma sequência de rDNA 16S que é idêntica a SEQ ID NO: 3. Ainda em uma outra modalidade, a espécie de Sphingobium é o isolado FC42.

[0011] Em uma outra modalidade, a bactéria endofítica é uma espécie de Pseudomonas, família Pseudomonadaceae. Em uma modalidade particular, a espécie de Pseudomonas é identificada na base de sua sequência de rDNA, como esboçado aqui. Em uma modalidade particular, a espécie de Pseudomonas compreende uma sequência de rDNA 16S que é pelo menos 95 % idêntica a SEQ ID NO: 4. Em uma outra modalidade, a espécie de Pseudomonas compreende uma sequência de rDNA 16S que é pelo menos 99 % idêntica a SEQ ID NO: 4. Ainda em uma outra modalidade, a espécie de Pseudomonas compreende uma sequência de rDNA 16S que é idêntica a SEQ ID NO: 4. Ainda em uma outra modalidade, a espécie de Pseudomonas espécie é o isolado FB12.

[0012] Em uma outra modalidade, a bactéria endofítica é uma espécie de Enterobacter, família Enterobacteriaceae. Em uma modalidade particular, a espécie de Enterobacter é identificada na base de sua sequência de rDNA, como esboçado aqui. Em uma modalidade particular, a espécie de Enterobacter compreende uma sequência de rDNA 16S que é pelo menos 95 % idêntica a SEQ ID NO: 5. Em uma outra modalidade, a espécie de Enterobacter compreende uma sequência de rDNA 16S que é pelo menos 99 % idêntica a SEQ ID NO: 5. Ainda em uma outra modalidade, a espécie de Enterobacter compreende uma sequência de rDNA 16S que é idêntica a SEQ ID NO: 5. Ainda em uma outra modalidade, a espécie de Enterobacter é o isolado FD17.

[0013] Em uma outra modalidade, a bactéria endofítica é uma espécie de Micrococcus, família Micrococcaceae. Em uma modalidade particular, a espécie de Micrococcus é identificada na base de sua sequência de rDNA, como esboçado aqui. Em uma modalidade particular, a espécie de Micrococcus compreende uma sequência de rDNA 16S que é pelo menos 95 % idêntica a SEQ ID NO: 6. Em uma outra modalidade, a espécie de Micrococcus compreende uma sequência de rDNA 16S que é pelo menos 99 % idêntica a SEQ ID NO: 6. Ainda em uma outra modalidade, a espécie de Micrococcus compreende uma sequência de rDNA 16S que é idêntica a SEQ ID NO: 6. Ainda em uma outra modalidade, a espécie de Micrococcus é o isolado S2.

[0014] Em uma outra modalidade, a bactéria endofítica é uma espécie de Bacillus, família Bacillaceae. Em uma modalidade particular, a espécie de Bacillus é identificada na base de sua sequência de rDNA, como esboçado aqui. Em uma modalidade particular, a espécie de Bacillus compreende uma sequência de rDNA 16S que é pelo menos 95 % idêntica a SEQ ID NO: 7. Em uma outra modalidade, a espécie de Bacillus compreende uma sequência de rDNA 16S que é pelo menos 99 % idêntica a SEQ ID NO: 7. Ainda em uma outra modalidade, a espécie de Bacillus compreende uma sequência de rDNA 16S que é idêntica a SEQ ID NO: 7. Ainda em uma outra modalidade, a espécie de Bacillus é o isolado S4.

[0015] Em uma outra modalidade, a bactéria endofítica é uma espécie de Pantoea, família Enterobacteriaceae. Em uma modalidade particular, a espécie de Pantoea é identificada na base de sua sequência de rDNA, como esboçado aqui. Em uma modalidade particular, a espécie de Pantoea compreende uma sequência de rDNA 16S que é pelo menos 95 % idêntica a SEQ ID NO: 8. Em uma outra modalidade, a espécie de Pantoea compreende uma sequência de rDNA 16S que é pelo menos 99 % idêntica a SEQ ID NO: 8. Ainda em uma outra modalidade, a espécie de Pantoea compreende uma sequência de rDNA 16S que é idêntica a SEQ ID NO: 8. Ainda em uma outra modalidade, a espécie de Pantoea é o isolado S6.

[0016] Em uma outra modalidade, a bactéria endofítica é uma espécie de Acinetobacter, família Moraxellaceae. Em uma modalidade particular, a espécie de Acinetobacter é identificada na base de sua sequência de rDNA, como esboçado aqui. Em uma modalidade particular, a espécie de Acinetobacter compreende uma sequência de rDNA 16S que é pelo menos 95 % idêntica a SEQ ID NO: 9. Em uma outra modalidade, a espécie de Acinetobacter compreende uma sequência de rDNA 16S que é pelo menos 99 % idêntica a SEQ ID NO: 9. Ainda em uma outra modalidade, a espécie de Acinetobacter compreende uma sequência de rDNA 16S que é idêntica a SEQ ID NO: 9. Ainda em uma outra modalidade, a espécie de Acinetobacter é o isolado S9.

[0017] Em uma outra modalidade, a bactéria endofítica é uma espécie de Paenibacillus, família Paenibacillaceae. Em uma modalidade particular, a espécie de Paenibacillus é identificada na base de sua sequência de rDNA, como esboçado aqui. Em uma modalidade particular, a espécie de Paenibacillus compreende uma sequência de rDNA 16S que é pelo menos 95 % idêntica a SEQ ID NO: 10. Em uma outra modalidade, a espécie de Paenibacillus compreende uma sequência de rDNA 16S que é pelo menos 99 % idêntica a SEQ ID NO: 10. Ainda em uma outra modalidade, a espécie de Paenibacillus compreende uma sequência de rDNA 16S que é idêntica a SEQ ID NO: 10. Ainda em uma outra modalidade, a espécie de Paenibacillus é o isolado S10.

[0018] Em certos casos, a população bacteriana endofítica é disposta em uma quantidade eficaz para ser detectável dentro de um tecido alvo da planta agrícola madura selecionado a partir de um fruto, uma semente, uma folha, ou uma raiz, ou porção desta.

[0019] Em certas modalidades, a semente ou muda compreende pelo menos cerca de 100 CFU, por exemplo, pelo menos cerca de 200 CFU, pelo menos cerca de 300 CFU, pelo menos cerca de 500 CFU, pelo menos cerca de 1.000 CFU, pelo menos cerca de 3.000 CFU, pelo menos cerca de 10.000 CFU, pelo menos cerca de 30.000 CFU, pelo menos cerca de 100.000 CFU, pelo menos cerca de 10A6 CFU, ou mais, da população bacteriana endofítica em sua superfície exterior.

[0020] Em uma outra modalidade, a população bacteriana endofítica é disposta sobre uma superfície exterior ou dentro de um tecido da semente ou muda em uma quantidade eficaz para ser detectável em uma quantidade de pelo menos cerca de 100 CFU, por exemplo, pelo menos cerca de 200 CFU, pelo menos cerca de 300 CFU, pelo menos cerca de 500 CFU, pelo menos cerca de 1.000 CFU, pelo menos cerca de 3.000 CFU, pelo menos cerca de 10.000 CFU, pelo menos cerca de 30.000 CFU, pelo menos cerca de 100.000 CFU ou mais por grama de peso fresco da planta agrícola madura.

[0021] Em uma outra modalidade, a população bacteriana endofítica é disposta sobre a superfície ou dentro de um tecido da semente ou muda em uma quantidade eficaz para aumentar a biomassa do fruto ou sabugo a partir da planta resultante em pelo menos 1 %, pelo menos 2 %, pelo menos 3 %, pelo menos 4 %, pelo menos 5 %, pelo menos 6 %, pelo menos 7 %, pelo menos 8 %, pelo menos 9 %, ou pelo menos 10 % quando comparado com uma planta agrícola de referência.

[0022] Ainda em uma outra modalidade, a população bacteriana endofítica é disposta sobre a superfície ou dentro de um tecido da semente ou muda em uma quantidade eficaz para colonizar detectavelmente o ambiente do solo que circunda a planta agrícola madura quando comparado com uma planta agrícola de referência.

[0023] Em alguns casos, a população bacteriana endofítica é disposta em uma quantidade eficaz para aumentar a biomassa da raiz em pelo menos 1 %, pelo menos 2 %, pelo menos 3 %, pelo menos 4 %, pelo menos 5 %, pelo menos 6 %, pelo menos 7 %, pelo menos 8 %, pelo menos 9 %, ou pelo menos 10 % quando comparado com uma planta agrícola de referência.

[0024] Em algumas modalidades, a população bacteriana endofítica é disposta sobre a superfície ou dentro de um tecido da semente ou muda em uma quantidade eficaz para aumentar a taxa de germinação de semente quando comparado com uma planta agrícola de referência.

[0025] Em uma outra modalidade, a população bacteriana endofítica é disposta sobre a superfície ou dentro de um tecido da semente ou muda em uma quantidade eficaz para detectavelmente induzir a produção de auxina na semente ou muda.

[0026] Em uma modalidade, a população bacteriana endofítica é cultivada antes da disposição sobre a semente ou muda. Em uma modalidade, a população bacteriana endofítica é cultivada em um meio sintético ou semissintético antes da disposição sobre a semente ou muda.

[0027] Em certos casos, a população bacteriana endofítica pode ser modificada. Em uma modalidade, a população bacteriana endofítica é geneticamente modificada. Em uma outra modalidade, a população bacteriana endofítica é modificada tal que ela tenha compatibilidade realçada com um agente antimicrobiano quando comparado com um controle não modificado. O agente antimicrobiano é um agente antibacteriano. Alternativamente, o agente antimicrobiano pode ser um agente antifúngico. Em alguns casos, a população bacteriana endofítica modificada exibe pelo menos 3 vezes mais, por exemplo, pelo menos 5 vezes mais, pelo menos 10 vezes mais, pelo menos 20 vezes mais, pelo menos 30 vezes mais ou mais resistência ao agente antimicrobiano quando comparado com um controle não modificado. Em uma modalidade, o agente antimicrobiano é glifosato.

[0028] A semente ou muda da planta agrícola pode ser uma monocotiledônea. Por exemplo, ela pode ser uma semente ou muda de milho. Alternativamente, ela pode ser uma semente ou muda de trigo. Em outras modalidades, ela pode ser uma semente ou muda de cevada. Ainda em outros casos, ela pode ser uma semente ou muda de arroz.

[0029] Em uma outra modalidade, a semente ou muda é uma dicotiledônea. Por exemplo, ela pode ser uma semente ou muda de algodão, uma semente ou muda de soja, ou uma semente ou muda de tomate.

[0030] Ainda em uma outra modalidade, a semente ou muda pode ser derivada a partir de uma planta transgênica. Em uma outra modalidade, a semente ou muda pode ser uma semente ou muda híbrida.

[0031] Em uma modalidade particular, a semente é uma semente de milho, e compreende ainda pelo menos cerca de 10.000 CFU da população bacteriana endofítica consistindo essencialmente em uma bactéria endofítica compreendendo uma sequência de ácido nucleico rRNA 16S que é pelo menos 95 %, 96 %, 97 %, por exemplo, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, pelo menos 99,5 %, ou 100 % idêntica a uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 1 a 10 disposta sobre a superfície exterior da semente, e compreendendo ainda uma formulação compreendendo um estabilizador microbiano.

[0032] Em um outro aspecto, a invenção leva em consideração uma população substancialmente uniforme de sementes compreendendo uma pluralidade de sementes descritas acima. Uniformidade substancial pode ser determinada em muitos modos. Em alguns casos, pelo menos 10 %, por exemplo, pelo menos 20 %, pelo menos 30 %, pelo menos 40 %, pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou mais das sementes na população, contém a população bacteriana endofítica em uma quantidade eficaz para colonizar a planta disposta sobre a superfície das sementes. Em outros casos, pelo menos 10 %, por exemplo, pelo menos 20 %, pelo menos 30 %, pelo menos 40 %, pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou mais das sementes na população, contém pelo menos 100 CFU em sua superfície, por exemplo, pelo menos 200 CFU, pelo menos 300 CFU, pelo menos 1.000 CFU, pelo menos 3.000 CFU, pelo menos 10.000 CFU, pelo menos 30.000 CFU, pelo menos 100.000 CFU, pelo menos 300.000 CFU, ou pelo menos 1.000.000 CFU por semente ou mais.

[0033] Ainda em um outro aspecto, a presente invenção leva em consideração um saco compreendendo pelo menos 1.000 sementes como descrito aqui acima. O saco compreende ainda um rótulo descrevendo as sementes e/ou a dita população bacteriana endofítica.

[0034] Ainda em um outro aspecto da presente invenção, uma planta ou parte ou tecido da planta, ou progênie desta é divulgada, que é gerada cultivando-se a semente ou muda descrita aqui acima.

[0035] Ainda em um outro aspecto, divulgadas são populações substancialmente uniformes de plantas produzidas cultivando-se uma pluralidade de sementes, mudas, ou progênie destas. Em alguns casos, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou mais das plantas na população compreende uma quantidade da população bacteriana endofítica eficaz para aumentar a biomassa da raiz da planta em pelo menos 1 %, pelo menos 2 %, pelo menos 3 %, pelo menos 4 %, pelo menos 5 %, pelo menos 6 %, pelo menos 7 %, pelo menos 8 %, pelo menos 9 %, ou pelo menos 10 %. Em outros casos, pelo menos 10 %, por exemplo pelo menos 20 %, pelo menos 30 %, pelo menos 40 %, pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou mais das plantas compreendem uma população de micróbios que é substancialmente similar.

[0036] Ainda em um outro aspecto da presente invenção, divulgado é um campo agrícola compreendendo a população descrita acima. O campo geralmente compreende pelo menos 100 plantas, por exemplo, pelo menos 1.000 plantas, pelo menos 3.000 plantas, pelo menos 10.000 plantas, pelo menos 30.000 plantas, pelo menos 100.000 plantas ou mais no campo. Em certos casos, a população de plantas ocupa pelo menos cerca de 100 pés quadrados de espaço, e pelo menos cerca de 10 %, por exemplo, pelo menos 20 %, pelo menos 30 %, pelo menos 40 %, pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 80 %, pelo menos 90 % ou mais do que 90 % da população compreende uma quantidade da população bacteriana endofítica eficaz para aumentar a biomassa da raiz da planta em pelo menos 1 %, pelo menos 2 %, pelo menos 3 %, pelo menos 4 %, pelo menos 5 %, pelo menos 6 %, pelo menos 7 %, pelo menos 8 %, pelo menos 9 %, ou pelo menos 10 %. Em uma outra modalidade, a população de plantas ocupa pelo menos cerca de 100 pés quadrados de espaço, em que pelo menos cerca de 10 %, por exemplo, pelo menos 20 %, pelo menos 30 %, pelo menos 40 %, pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 80 %, pelo menos 90 % ou mais do que 90 % da população compreende o micróbio em tecido reprodutivo. Em uma outra modalidade, a população de plantas ocupa pelo menos cerca de 100 pés quadrados de espaço, e pelo menos cerca de 10 %, por exemplo, pelo menos 20 %, pelo menos 30 %, pelo menos 40 %, pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 80 %, pelo menos 90 % ou mais do que 90 % da população compreende pelo menos 100 CFUs, 1.000 CFUs, 10.000 CFUs,100.000 CFUs ou mais da população bacteriana endofítica.

[0037] Em um outro aspecto da invenção, fornecidas são preparações compreendendo uma população de bactérias endofíticas descritas aqui e compreendendo ainda pelo menos um agente selecionado do grupo consistindo em um veículo agricolamente aceitável, um agente taquificante, um estabilizador microbiano, um fungicida, um agente antibacteriano, um herbicida, um nematicida, um inseticida, um regulador de crescimento de planta, um rodenticida, e um nutriente, e em que a população compreende uma quantidade de endófitos suficiente para melhorar um traço agronômico da população de sementes. Em uma modalidade, a população bacteriana endofítica consiste essencialmente em uma bactéria endofítica compreendendo uma sequência de ácido nucleico rRNA 16S pelo menos 95 % idêntica a uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 1 a 10.

[0038] Em uma modalidade, a preparação é substancialmente estável em temperaturas entre cerca de 4 oC e cerca de 45 oC por pelo menos cerca de sete dias.

[0039] Em uma outra modalidade, a preparação é formulada para fornecer pelo menos 100 endófitos por semente, por exemplo, pelo menos 300 endófitos, pelo menos 1.000 endófitos, pelo menos 3.000 endófitos, pelo menos 10.000 endófitos, pelo menos 30.000 endófitos, pelo menos 100.000 endófitos, pelo menos 300.000 endófitos, ou pelo menos 1.000.000 endófitos por semente.

[0040] Em uma outra modalidade, a preparação é formulada para fornecer uma população de plantas que demonstra uma taxa de crescimento substancialmente homogênea quando introduzida na produção agrícola.

[0041] Ainda em um outro aspecto, a presente invenção leva em consideração um método de produzir um produto de planta de mercadoria. O método geralmente compreende obter uma planta ou tecido da planta a partir da planta agrícola compreendendo as bactérias endofíticas como descrito aqui acima, e produzir o produto de planta de mercadoria a partir desta. Em certos casos, o produto de planta de mercadoria é selecionado do grupo consistindo em grão, farinha, amido, óleo de semente, xarope, farinha, farinha, óleo, película, empacotamento, produto nutracêutico, uma ração para animal, uma forragem de peixe, um produto de cereal, um produto de alimento humano processado, um açúcar ou um álcool e proteína.

[0042] Em um aspecto relacionado, a presente invenção leva em consideração um produto de planta de mercadoria compreendendo uma planta ou parte desta e compreendendo ainda a população bacteriana endofítica ou uma porção desta em um nível detectável.

[0043] Ainda em um outro aspecto da presente invenção, fornecido é um método para preparar uma planta agrícola ou uma porção desta compreendendo uma população bacteriana endofítica. O método geralmente compreende aplicar à semente ou muda uma formulação compreendendo uma população bacteriana endofítica consistindo essencialmente em uma bactéria endofítica compreendendo uma sequência de ácido nucleico rRNA 16S pelo menos 95 % idêntica, por exemplo, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 % idêntica, pelo menos 99 % idêntica, pelo menos 99,5 % idêntica, ou 100 % idêntica a uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 1 a 10. Em uma modalidade, a formulação compreende ainda pelo menos um membro selecionado do grupo consistindo em um veículo agricolamente compatível, um agente taquificante, um estabilizador microbiano, um fungicida, um agente antibacteriano, um herbicida, um nematicida, um inseticida, um regulador de crescimento de planta, um rodenticida, e um nutriente. Em alguns casos, a planta agrícola pode ser uma muda. Em outros casos, a planta agrícola pode ser uma semente. Em uma modalidade particular, a planta agrícola é uma semente ou uma muda. Em uma outra modalidade, o método compreende ainda aplicar pelo menos um membro selecionado do grupo consistindo em um veículo agricolamente compatível, um agente taquificante, um estabilizador microbiano, um fungicida, um agente antibacteriano, um herbicida, um nematicida, um inseticida, um regulador de crescimento de planta, um rodenticida, e um nutriente.

[0044] Em um aspecto final, a presente invenção leva em consideração um método para conferir um ou mais benefícios de aptidão a uma planta agrícola. O método geralmente compreende fornecer uma planta agrícola ou porção desta, contatar a dita planta ou porção desta com uma formulação compreendendo uma população bacteriana endofítica exógena consistindo essencialmente em uma bactéria endofítica compreendendo uma sequência de ácido nucleico rRNA 16S pelo menos 95 % idêntica, por exemplo, em pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 % idêntica, pelo menos 99 % idêntica, pelo menos 99,5 % idêntica, ou 100 % idêntica a uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 1 a 10, disposta sobre uma superfície exterior em uma quantidade eficaz para colonizar a planta madura, em que a formulação compreende ainda pelo menos um membro selecionado do grupo consistindo em um veículo agricolamente compatível, um agente taquificante, um estabilizador microbiano, um fungicida, um agente antibacteriano, um herbicida, um nematicida, um inseticida, um regulador de crescimento de planta, um rodenticida, e um nutriente, e permitir que a semente ou muda cresçam sob condições que permitem que a bactéria endofítica colonize a planta. Em alguns casos, a planta agrícola pode ser uma muda. Em outros casos, a planta agrícola pode ser uma semente. Em uma modalidade particular, a planta agrícola é uma semente ou uma muda.

[0045] Em uma modalidade, o um ou mais dos benefícios de aptidão são selecionados do grupo consistindo em germinação aumentada, biomassa aumentada, tempo de floração aumentado, biomassa aumentada do fruto ou grão, rendimento aumentado do grão ou fruto, e tolerância à seca aumentada.

DESCRIÇÃO DETALHADA BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0046] A Figura 1A mostra os aumentos em biomassa da raiz em plantas de milho inoculadas com as populações de endófito bacteriano quando comparado com plantas de controle não inoculadas.

[0047] A Figura 1B mostra os aumentos em biomassa de broto em plantas de milho inoculadas com as populações de endófito bacteriano quando comparado com plantas de controle não inoculadas.

[0048] A Figura 1C mostra os aumentos na biomassa total em plantas de milho inoculadas com as populações de endófito bacteriano quando comparado com plantas de controle não inoculadas.

[0049] A Figura 2 mostra os aumentos na condutância estomática em plantas de milho inoculadas com as populações de endófito bacteriano quando comparado com plantas de controle não inoculadas.

[0050] A Figura 3 mostra o aumento em taxas fotossintéticas em plantas de milho inoculadas com as populações de endófito bacteriano quando comparado com plantas de controle não inoculadas.

[0051] A Figura 4 mostra os aumentos em eficiência fotoquímica PS II (Fv/Fm) em plantas de milho inoculadas com as populações de endófito bacteriano, quando comparado com plantas de controle não inoculadas.

[0052] A Figura 5 mostra os aumentos na área da folha em plantas de milho inoculadas com as populações de endófito bacteriano, quando comparado com plantas de controle não inoculadas.

[0053] A Figura 6 mostra os aumentos no teor de clorofila em plantas de milho inoculadas com as populações de endófito bacteriano, quando comparado com plantas de controle não inoculadas.

DEFINIÇÕES

[0054] Uma "combinação sintética" inclui uma combinação de uma planta hospedeira e um endófito. A combinação pode ser obtida, por exemplo, revestindo-se a superfície da semente de uma planta, tal como uma planta agrícola, ou tecidos da planta hospedeira com um endófito.

[0055] Como usado aqui, uma "semente agrícola" é uma semente usada para cultivar uma planta em agricultura (uma "planta agrícola"). A semente pode ser de uma planta monocotiledônea ou dicotiledônea, e é plantada para a produção de um produto agrícola, por exemplo grão, alimento, fibra, etc. Como usado aqui, uma semente agrícola é uma semente que é preparada para plantio, por exemplo, em fazendas para cultivo.

[0056] Um "endófito", ou "micróbio endofítico" inclui um organism capaz de viver dentro de uma planta ou associado com esta. Um endófito pode referir-se a um organismo bacteriano ou fúngico que pode conferir um aumento no rendimento, biomassa, resistência, ou aptidão em sua planta hospedeira. Endófitos podem ocupar os espaços intracelulares ou extracelulares de tecido da planta, incluindo as folhas, caules, flores, frutos, sementes ou raízes. Um endófito pode ser um fungo, ou uma bactéria. Como usado aqui, o termo "micróbio" é algumas vezes usado para descrever um endófito.

[0057] Em algumas modalidades, a invenção considera o uso de micróbios que são "exógenos" a uma semente ou planta. Como usado aqui, um micróbio é considerado exógeno à semente ou planta se a semente ou muda que é não modificada (por exemplo, uma semente ou muda que não é tratada com a população bacteriana endofítica descrita aqui) não contém o micróbio.

[0058] Em outros casos, a invenção considera as combinações sintéticas de plantas agrícolas e uma população de micróbios endofíticos, em que a população de micróbios é "heterogeneamente disposta" sobre a superfície de ou dentro de um tecido da planta agrícola. Como usado aqui, um micróbio é considerado "heterogeneamente disposto" sobre a superfície ou dentro de uma planta (ou tecido) quando o micróbio é aplicado ou disposta sobre a planta em um número ou dentro de um tecido em um número que não é encontrado nesta planta antes da aplicação do micróbio. Como tal, um micróbio é julgado heterogeneamente disposto quando aplicado sobre a planta que não tem naturalmente o micróbio em sua superfície ou dentro do tecido particular ao qual o micróbio é disposto, ou não tem naturalmente o micróbio em sua superfície ou dentro do tecido particular no número que está sendo aplicado. Para se evitar dúvida, "heterogeneamente disposto" considera o uso de micróbios que são "exógenos" a uma semente ou planta.

[0059] Em alguns casos, a presente invenção considera o uso de micróbios que são "compatíveis" com produtos químicos agrícolas por exemplo, um fungicida, um composto antibacteriano, ou qualquer outro agente amplamente usado na agricultura que tem o efeito de interferir com o crescimento ideal de micróbios. Como usado aqui, um micróbio é "compatível" com um produto químico agrícola, quando o micróbio é modificado ou de outro modo adaptado para cultivar em, ou de outro modo sobreviver, a concentração do produto químico agrícola usado na agricultura. Por exemplo, um micróbio disposto sobre a superfície de uma semente é compatível com o fungicida metalaxil se ele for capaz de sobreviver às concentrações que são aplicadas sobre a superfície da semente.

[0060] "Biomassa" significa a massa ou peso total (fresco ou seco), em um tempo dado, de um tecido da planta, tecidos da planta, uma planta inteira, ou população de plantas, usualmente dado como peso por área unitária. O termo também pode referir-se a todas as plantas ou espécies na comunidade (biomassa da comunidade).

[0061] Algumas das composições e métodos descritos aqui envolvem micróbios endofíticos em uma quantidade eficaz para colonizar uma planta. Como usado aqui, um micróbio é dito "colonizar" uma planta ou semente quando ele pode existir em uma relação endofítica com a planta no ambiente da planta, por exemplo dentro da planta ou uma parte ou tecido desta, incluindo a semente.

[0062] Algumas composições descritas aqui consideram o uso de um veículo agricolamente compatível. Como usado aqui um "veículo agricolamente compatível" é intencionado a referir-se a qualquer material, exceto água, que pode ser adicionado a uma semente ou uma muda sem causar/ter um efeito adverso sobre a semente, a planta que cresce a partir da semente, germinação de semente, ou semelhantes.

[0063] Uma "planta transgênica" inclui uma planta ou progênie da planta de qualquer geração subsequente derivada a partir desta, em que o DNA da planta ou progênie desta contém um segmento de DNA exógeno introduzido não naturalmente presente em uma planta não transgênica da mesma cepa. A planta transgênica pode conter adicionalmente sequências que são nativas à planta sendo transformada, mas em que o gene "exógeno" foi alterado de modo a alterar o nível ou padrão da expressão do gene, por exemplo, pelo uso de um ou mais elementos reguladores heterólogos ou outros elementos.

[0064] Como usado aqui, um ácido nucleico tem "homologia" ou é "homólogo" a um segundo ácido nucleico se a sequência de ácido nucleico tem uma sequência similar à segunda sequência de ácido nucleico. Os termos "identidade", "porcentagem de identidade de sequência" ou "idêntico" no contexto de sequências de ácido nucleico referem-se aos resíduos nas duas sequências que são os mesmos quando alinhados para correspondência máxima. Existem vários algoritmos diferentes conhecidos na técnica que podem ser usados para medir a identidade de sequência de nucleotídeo. Por exemplo, sequências de polinucleotídeo podem ser comparadas usando FASTA, Gap ou Bestfit, que são programas no Wisconsin Package Versão 10.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wis. FASTA fornece alinhamentos e porcentagem de identidade de sequência das regiões da melhor sobreposição entre as sequências de consulta e de pesquisa. Pearson, Methods Enzymol. 183:63 - 98 (1990). O termo "homologia substancial" ou "similaridade substancial," quando referindo-se a um ácido nucleico ou fragmento deste, indica que, quando idealmente alinhado com inserções ou supressões nucleotídeo apropriadas com uma outro ácido nucleico (ou sua filamento complementar), existe identidade de sequência de nucleotídeo em pelo menos cerca de 76 %, 80 %, 85 %, ou pelo menos cerca de 90 %, ou pelo menos cerca de 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % das bases de nucleotídeo, como medido por qualquer algoritmo de identidade de sequência bem conhecido, tal como FASTA, BLAST ou Gap, como debatido acima.

[0065] A presente invenção é dirigida a métodos e composições de endófitos bacterianos, e combinações de planta-endófito que conferem um benefício de aptidão em plantas agrícolas.

ENDÓFITO BACTERIANO

[0066] Em um primeiro aspecto, divulgada é uma composição compreendendo uma cultura pura de um endófito bacteriano.

[0067] Em uma modalidade, a bactéria endofítica é uma espécie de Agrobacterium. Em uma modalidade particular, a espécie de Agrobacterium é identificada na base de sua sequência de rDNA, como esboçado aqui. Em uma modalidade particular, a espécie de Agrobacterium compreende uma sequência de rDNA 16S que é pelo menos 95 % idêntica a SEQ ID NO: 1. Em uma outra modalidade, a espécie de Agrobacterium compreende uma sequência de rDNA 16S que é pelo menos 99 % idêntica a SEQ ID NO: 1. Ainda em uma outra modalidade, a espécie de Agrobacterium compreende uma sequência de rDNA 16S que é idêntica a SEQ ID NO: 1. Ainda em uma outra modalidade, a espécie de Agrobacterium é o isolado FA13.

[0068] Em uma outra modalidade, a bactéria endofítica é uma espécie de Pantoea. Em uma modalidade particular, a espécie de Pantoea é identificada na base de sua sequência de rDNA, como esboçado aqui. Em uma modalidade particular, a espécie de Pantoea compreende uma sequência de rDNA 16S que é pelo menos 95 % idêntica a SEQ ID NO: 2. Em uma outra modalidade, a espécie de Pantoea compreende uma sequência de rDNA 16S que é pelo menos 99 % idêntica a SEQ ID NO: 2. Ainda em uma outra modalidade, a espécie de Pantoea compreende uma sequência de rDNA 16S que é idêntica a SEQ ID NO: 2. Ainda em uma outra modalidade, a espécie de Pantoea é o isolado FF34.

[0069] Em uma outra modalidade, a bactéria endofítica é uma espécie de Sphingobium. Em uma modalidade particular, a espécie de Sphingobium é identificada na base de sua sequência de rDNA, como esboçado aqui. Em uma modalidade particular, a espécie de Sphingobium compreende uma sequência de rDNA 16S que é pelo menos 95 % idêntica a SEQ ID NO: 3. Em uma outra modalidade, a espécie de Sphingobium compreende uma sequência de rDNA 16S que é pelo menos 99 % idêntica a SEQ ID NO: 3. Ainda em uma outra modalidade, a espécie de Sphingobium compreende uma sequência de rDNA 16S que é idêntica a SEQ ID NO: 3. Ainda em uma outra modalidade, a espécie de Sphingobium é o isolado FC42.

[0070] Em uma outra modalidade, a bactéria endofítica é uma espécie de Pseudomonas. Em uma modalidade particular, a espécie de Pseudomonas é identificada na base de sua sequência de rDNA, como esboçado aqui. Em uma modalidade particular, a espécie de Pseudomonas compreende uma sequência de rDNA 16S que é pelo menos 95 % idêntica a SEQ ID NO: 4. Em uma outra modalidade, a espécie de Pseudomonas compreende uma sequência de rDNA 16S que é pelo menos 99 % idêntica a SEQ ID NO: 4. Ainda em uma outra modalidade, a espécie de Pseudomonas compreende uma sequência de rDNA 16S que é idêntica a SEQ ID NO: 4. Ainda em uma outra modalidade, a espécie de Pseudomonas é o isolado FB12.

[0071] Em uma outra modalidade, a bactéria endofítica é uma espécie de Enterobacter. Em uma modalidade particular, a espécie de Enterobacter é identificada na base de sua sequência de rDNA, como esboçado aqui. Em uma modalidade particular, a espécie de Enterobacter compreende uma sequência de rDNA 16S que é pelo menos 95 % idêntica a SEQ ID NO: 5. Em uma outra modalidade, a espécie de Enterobacter compreende uma sequência de rDNA 16S que é pelo menos 99 % idêntica a SEQ ID NO: 5. Ainda em uma outra modalidade, a espécie de Enterobacter compreende uma sequência de rDNA 16S que é idêntica a SEQ ID NO: 5. Ainda em uma outra modalidade, a espécie de Enterobacter é o isolado FD17.

[0072] Em uma outra modalidade, a bactéria endofítica é uma espécie de Micrococcus. Em uma modalidade particular, a espécie de Micrococcus é identificada na base de sua sequência de rDNA, como esboçado aqui. Em uma modalidade particular, a espécie de Micrococcus compreende uma sequência de rDNA 16S que é pelo menos 95 % idêntica a SEQ ID NO: 6. Em uma outra modalidade, a espécie de Micrococcus compreende uma sequência de rDNA 16S que é pelo menos 99 % idêntica a SEQ ID NO: 6. Ainda em uma outra modalidade, a espécie de Micrococcus compreende uma sequência de rDNA 16S que é idêntica a SEQ ID NO: 6. Ainda em uma outra modalidade, a espécie de Micrococcus é o isolado S2.

[0073] Em uma outra modalidade, a bactéria endofítica é uma espécie de Bacillus. Em uma modalidade particular, a espécie de Bacillus é identificada na base de sua sequência de rDNA, como esboçado aqui. Em uma modalidade particular, a espécie de Bacillus compreende uma sequência de rDNA 16S que é pelo menos 95 % idêntica a SEQ ID NO: 7. Em uma outra modalidade, a espécie de Bacillus compreende uma sequência de rDNA 16S que é pelo menos 99 % idêntica a SEQ ID NO: 7. Ainda em uma outra modalidade, a espécie de Bacillus compreende uma sequência de rDNA 16S que é idêntica a SEQ ID NO: 7. Ainda em uma outra modalidade, a espécie de Bacillus é o isolado S4.

[0074] Em uma outra modalidade, a bactéria endofítica é uma espécie de Pantoea. Em uma modalidade particular, a espécie de Pantoea é identificada na base de sua sequência de rDNA, como esboçado aqui. Em uma modalidade particular, a espécie de Pantoea compreende uma sequência de rDNA 16S que é pelo menos 95 % idêntica a SEQ ID NO: 8. Em uma outra modalidade, a espécie de Pantoea compreende uma sequência de rDNA 16S que é pelo menos 99 % idêntica a SEQ ID NO: 8. Ainda em uma outra modalidade, a espécie de Pantoea espécie compreende uma sequência de rDNA 16S que é idêntica a SEQ ID NO: 8. Ainda em uma outra modalidade, a espécie de Pantoea é o isolado S6.

[0075] Em uma outra modalidade, a bactéria endofítica é uma espécie de Acinetobacter. Em uma modalidade particular, a espécie de Acinetobacter é identificada na base de sua sequência de rDNA, como esboçado aqui. Em uma modalidade particular, a espécie de Acinetobacter compreende uma sequência de rDNA 16S que é pelo menos 95 % idêntica a SEQ ID NO: 9. Em uma outra modalidade, a espécie de Acinetobacter compreende uma sequência de rDNA 16S que é pelo menos 99 % idêntica a SEQ ID NO: 9. Ainda em uma outra modalidade, a espécie de Acinetobacter compreende uma sequência de rDNA 16S que é idêntica a SEQ ID NO: 9. Ainda em uma outra modalidade, a espécie de Acinetobacter é o isolado S9.

[0076] Em uma outra modalidade, a bactéria endofítica é uma espécie de Paenibacillus. Em uma modalidade particular, a espécie de Paenibacillus é identificada na base de sua sequência de rDNA, como esboçado aqui. Em uma modalidade particular, a espécie de Paenibacillus compreende uma sequência de rDNA 16S que é pelo menos 95 % idêntica a SEQ ID NO: 10. Em uma outra modalidade, a espécie de Paenibacillus compreende uma sequência de rDNA 16S que é pelo menos 99 % idêntica a SEQ ID NO: 10. Ainda em uma outra modalidade, a espécie de Paenibacillus compreende uma sequência de rDNA 16S que é idêntica a SEQ ID NO: 10. Ainda em uma outra modalidade, a espécie de Paenibacillus é o isolado S10.

[0077] Em alguns casos, o micróbio endofítico pode ser modificado. Por exemplo, o micróbio endofítico pode ser geneticamente modificado por introdução de um transgene que estavelmente integra no genoma bacteriano. Em uma outra modalidade, o micróbio endofítico pode ser modificado para abrigar um plasmídeo ou epissoma contendo um transgene. Ainda em uma outra modalidade, o micróbio pode ser modificado por passagem repetida sob condições seletivas.

[0078] O micróbio pode ser modificado para exibir características alteradas. Em uma modalidade, o micróbio endofítico é modificado para exibir compatibilidade aumentada com produtos químicos comumente usados em agricultura. Plantas agrícolas são frequentemente tratadas com um vasto arranjo de produtos agroquímicos, incluindo fungicidas, biocidas (agentes antibacterianos), herbicidas, inseticidas, nematicidas, rodenticidas, fertilizantes, e outros agentes. Muitos de tais agentes podem afetar a capacidade de uma bactéria endofítica de cultivar, dividir, e/ou de outro modo conferir traços benéficos à planta.

[0079] Em alguns casos, pode ser importante que o micróbio seja compatível com produtos agroquímicos, particularmente aqueles com propriedades fungicidas ou antibacterianas, de modo a persistir na planta embora, como mencionado mais no início, existem muitos de tais agentes fungicidas ou antibacterianos que não penetram na planta, pelo menos em uma concentração suficiente para interferir com o micróbio. Portanto, onde um agente fungicida ou antibacteriano sistêmico é usado na planta, a compatibilidade do micróbio a ser inoculado com tais agentes será um critério importante.

[0080] Em uma modalidade, isolados espontâneos de micróbios que são compatíveis com produtos agroquímicos podem ser usados para inocular as plantas de acordo com os métodos descritos aqui. Por exemplo, micróbios fúngicos que são compatíveis com fungicidas agricolamente utilizados pode ser isolados plaqueando-se uma cultura dos micróbios em uma placa de petri contendo uma concentração eficaz do fungicida, e isolando colônias do micróbio que são compatíveis com o fungicida. Em uma outra modalidade, um micróbio que é compatível com um fungicida é usado para os métodos descritos aqui. Ainda em uma outra modalidade, um micróbio que é compatível com um composto antibacteriano é usado para os métodos descritos aqui. Micróbios compatíveis com o fungicida também podem ser isolados por seleção em meio líquido. A cultura de micróbios pode ser plaqueada em placas de petri sem quaisquer formas de mutagênese; alternativamente, os micróbios podem ser mutagenizados usando quaisquer meios conhecidos na técnica. Por exemplo, culturas microbianas podem ser expostas à luz UV, radiação gama, ou agentes mutagênicos químicos tais como etilmetanossulfonato (EMS) antes da seleção em meios contendo fungicida. Finalmente, onde o mecanismo de ação de um fungicida particular é conhecido, o gene alvo pode ser especificamente mutado (por supressão de gene, substituição de gene, mutagênese sítio-dirigida, etc.) para gerar um micróbio que é resiliente contra este fungicida particular. É observado que os métodos descritos acima podem ser usados para isolar fungos que são compatíveis tanto com compostos fungistáticos quanto fungicidas.

[0081] Também será avaliado por uma pessoa habilitada na técnica que uma planta pode ser exposta a tipos múltiplos de fungicidas ou compostos antibacterianos, simultaneamente ou em sucessão, por exemplo em diferentes estágios de crescimento da planta. Onde a planta alvo provavelmente deve ser exposta a agentes fungicidas e/ou antibacterianos múltiplos, um micróbio que é compatível com muitos ou todos destes produtos agroquímicos pode ser usado para inocular a planta. Um micróbio que é compatível com vários agentes fungicidas pode ser isolado, por exemplo, por seleção serial. Um micróbio que é compatível com o primeiro agente fungicida é isolado como descrito acima (com ou sem mutagênese anterior). Uma cultura do micróbio resultante depois pode ser selecionada quanto à capacidade de cultivar em meios líquidos ou sólidos contendo o segundo composto antifúngico (novamente, com ou sem mutagênese anterior). Colônias isoladas da segunda seleção são depois testadas para confirmar sua compatibilidade a ambos os compostos antifúngicos.

[0082] Do mesmo modo, micróbios bacterianos que são compatíveis a biocidas (incluindo herbicidas tais como glifosato ou compostos antibacterianos, se bacteriostáticos ou bactericidas) que são agricolamente utilizados podem ser isolados usando métodos similares àqueles descritos para isolar micróbios compatíveis a fungicida. Em uma modalidade, a mutagênese da população microbiana pode ser realizada antes da seleção com um agente antibacteriano. Em uma outra modalidade, a seleção é realizada na população microbiana sem mutagênese anterior. Ainda em uma outra modalidade, seleção serial é realizada em um micróbio: o micróbio é primeiro selecionado quanto à compatibilidade a um primeiro agente antibacteriano. O micróbio compatível isolado é depois cultivado e selecionado quanto à compatibilidade ao segundo agente antibacteriano. Qualquer colônia assim isolada é testada quanto à compatibilidade a cada um, ou ambos os agentes antibacterianos para confirmar a compatibilidade com estes dois agentes.

[0083] O processo de seleção descrito acima pode ser repetido para identificar isolados do micróbio que são compatíveis com uma grande quantidade de agentes antifúngicos ou antibacterianos.

[0084] Isolados candidatos podem ser testados para garantir que a seleção quanto à compatibilidade agroquímica não resultasse em perda de uma bioatividade microbiana desejada. Isolados do micróbio que são compatíveis com fungicidas comumente utilizados podem ser selecionados como descrito acima. O micróbio compatível resultante pode ser comparado com o micróbio precursor em plantas em sua capacidade para promover a germinação.

COMBINAÇÕES DE PLANTA-ENDÓFITO

[0085] Em um outro aspecto, a presente invenção leva em consideração combinações de endófitos e plantas. Em uma modalidade, divulgada é uma semente ou muda de uma planta agrícola compreendendo uma população bacteriana endofítica exógena que é disposta sobre uma superfície exterior de ou dentro da semente ou muda em uma quantidade eficaz para colonizar a planta, e compreendendo ainda uma formulação que compreende pelo menos um membro selecionado do grupo consistindo em um veículo agricolamente compatível, um agente taquificante, um estabilizador microbiano, um fungicida, um agente antibacteriano, um herbicida, um nematicida, um inseticida, um regulador de crescimento de planta, um rodenticida, e um nutriente. Em uma outra modalidade, a presente invenção divulga uma semente ou muda de uma planta agrícola compreendendo uma população bacteriana endofítica que é heterogeneamente disposta sobre uma superfície exterior de ou dentro da semente ou muda em uma quantidade eficaz para colonizar a planta, e compreendendo ainda uma formulação que compreende pelo menos um membro selecionado do grupo consistindo em um veículo agricolamente compatível, um agente taquificante, um estabilizador microbiano, um fungicida, um agente antibacteriano, um herbicida, um nematicida, um inseticida, um regulador de crescimento de planta, um rodenticida, e um nutriente.

[0086] A população bacteriana endofítica consiste essencialmente em uma bactéria endofítica descrita aqui. Em uma modalidade, a bactéria endofítica compreende uma sequência de ácido nucleico rRNA 16S que é pelo menos 95 % idêntica, por exemplo, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 % idêntica a uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 1 a 10. Em uma outra modalidade, a bactéria endofítica compreende uma sequência de ácido nucleico rRNA 16S que é pelo menos 99 % idêntica a uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 1 a 10. Ainda em uma outra modalidade, a bactéria endofítica compreende uma sequência de ácido nucleico rRNA 16S que é idêntica a uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 1 a 10.

[0087] Em uma modalidade de acordo com este aspecto, divulgada é uma semente de uma planta agrícola compreendendo uma população bacteriana endofítica exógena que é disposta sobre uma superfície exterior de ou dentro da semente em uma quantidade eficaz para colonizar a planta. A população bacteriana é considerada exógena à semente se esta semente particular não contém inerentemente a população bacteriana. De fato, vários dos micróbios endofíticos descritos aqui não foram detectados, por exemplo, em qualquer uma das sementes de milho experimentada, como determinado por métodos altamente sensíveis.

[0088] Em outros casos, a presente invenção divulga uma semente de uma planta agrícola compreendendo uma população bacteriana endofítica que é heterogeneamente disposta sobre uma superfície exterior de ou dentro da semente em uma quantidade eficaz para colonizar a planta. Por exemplo, a população bacteriana endofítica que é disposta sobre uma superfície exterior ou dentro da semente pode ser uma bactéria endofítica que pode ser associada com a planta madura, mas não é encontrada sobre a superfície da semente ou dentro da mesma. Alternativamente, a população bacteriana endofítica pode ser encontrada na superfície da semente ou dentro da mesma, mas em um número muito mais baixo do que é disposto.

[0089] Em algumas modalidades, uma população de endófitos purificada é usada que inclui dois ou mais (por exemplo, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ou mais do que 25) endófitos diferentes, por exemplo, obtidos a partir de diferentes famílias de planta ou fungo, ou diferentes gêneros de planta ou fungo, ou a partir dos mesmos gêneros mas espécies diferentes de planta ou fungo.

[0090] Os endófitos diferentes podem ser obtidos a partir do mesmo cultivar de planta agrícola (por exemplo, da mesma planta de milho, trigo, arroz, ou cevada), cultivares diferentes da mesma planta agrícola (por exemplo, dois ou mais cultivares de milho, dois ou mais cultivares de trigo, dois ou mais cultivares de arroz, ou dois ou mais cultivares de cevada), ou espécies diferentes do mesmo tipo de planta agrícola (por exemplo, duas ou mais espécies diferentes de milho, duas ou mais espécies diferentes de trigo, duas ou mais espécies diferentes de arroz, ou duas ou mais espécies diferentes de cevada). Em modalidades em que dois ou mais endófitos são usados, cada um dos endófitos pode ter diferentes propriedades ou atividades, por exemplo, produzir diferentes metabólitos, produzir diferentes enzimas tais como diferentes enzimas hidrolíticas, conferir diferentes traços benéficos, ou colonizar diferentes elementos de uma planta (por exemplo, folhas, caules, flores, frutos, sementes ou raízes). Por exemplo, um endófito pode colonizar um primeiro e um segundo endófito pode colonizar um tecido que difere do primeiro tecido.

[0091] Combinações de endófitos podem ser selecionadas por qualquer um ou mais de vários critérios. Em uma modalidade, endófitos compatíveis são selecionados. Como usado aqui, "compatibilidade" refere-se a populações de endófitos que não interferem significativamente com o crescimento, propagação, e/ou produção de substâncias benéficas da outra. Populações de endófitos incompatíveis podem surgir, por exemplo, onde uma das populações produz ou secreta um composto que é tóxico ou deletério ao crescimento da(s) outra(s) população(ões). A incompatibilidade que surge a partir da produção de compostos/agentes deletérios pode ser detectada usando métodos conhecidos na técnica, e como descrito aqui em outra parte. Similarmente, as populações distintas podem competir por recursos limitados em um modo que torna a coexistência difícil.

[0092] Em uma outra modalidade, combinações são selecionadas na base de compostos produzidos por cada população de endófitos. Por exemplo, a primeira população é capaz de produzir sideróforos, e uma outra população é capaz de produzir compostos antifúngicos. Em uma modalidade, a primeira população de endófitos ou componentes endofíticos é capaz de uma função selecionada do grupo consistindo em produção de auxina, fixação de nitrogênio, produção de um composto antimicrobiano, produção de sideróforo, solubilização de fosfato mineral, produção de celulase, produção de quitinase, produção de xilanase, e produção de acetoína. Em uma outra modalidade, a segunda população de endófitos ou componente endofítico é capaz de uma função selecionada do grupo consistindo em produção de auxina, fixação de nitrogênio, produção de um composto antimicrobiano, produção de sideróforo, solubilização de fosfato mineral, produção de celulase, produção de quitinase, produção de xilanase, e produção de acetoína. Em certas combinações, um dos endófitos é capaz de usar arabinose como uma fonte de carbono. Ainda em uma outra modalidade, as primeiras e segundas populações são capazes de pelo menos uma função diferente.

[0093] Ainda em uma outra modalidade, as combinações de endófitos são selecionadas quanto à sua localização distinta na planta depois da colonização. Por exemplo, a primeira população de endófitos ou componentes endofíticos pode colonizar, e em alguns casos preferencialmente colonizar, o tecido da raiz, enquanto uma segunda população pode ser selecionada na base de sua colonização preferencial das partes aéreas da planta agrícola. Portanto, em uma modalidade, a primeira população é capaz de colonizar um ou mais dos tecidos selecionados do grupo consistindo em uma raiz, broto, folha, flor e semente. Em uma outra modalidade, a segunda população é capaz de colonizar um ou mais tecidos selecionados do grupo consistindo em raiz, broto, folha, flor e semente. Ainda em uma outra modalidade, as primeiras e segundas populações são capazes de colonizar um tecido diferente dentro da planta agrícola.

[0094] Ainda em uma outra modalidade, combinações de endófitos são selecionadas quanto à sua capacidade de conferir um ou mais traços de aptidão distintos na planta agrícola inoculada, individualmente ou em associação sinérgica com outros endófitos. Alternativamente, dois ou mais endófitos induzem a colonização de um terceiro endófito. Por exemplo, a primeira população de endófitos ou componentes endofíticos é selecionada na base que ela confere aumento significante na biomassa, enquanto a segunda população promove tolerância à seca aumentada na planta agrícola inoculada. Portanto, em uma modalidade, a primeira população é capaz de conferir pelo menos um traço selecionado do grupo consistindo em tolerância térmica, tolerância a herbicida, resistência à seca, resistência a insetos, resistência a fungo, resistência a vírus, resistência a bactérias, esterilidade masculina, tolerância ao frio, tolerância a sal, rendimento aumentado, eficiência de uso de nutriente realçada, eficiência de uso de nitrogênio aumentada, teor de carboidrato fermentável aumentado, teor de lignina reduzido, teor de antioxidante aumentado, eficiência de uso de água realçada, vigor aumentado, eficiência de germinação aumentada, floração mais precoce ou aumentada, biomassa aumentada, razão de biomassa de raiz-para-broto alterada, retenção de água no solo realçada, ou uma combinação destes. Em uma outra modalidade, a segunda população é capaz de conferir um traço selecionado do grupo consistindo em tolerância térmica, tolerância a herbicida, resistência à seca, resistência a insetos, resistência a fungo, resistência a vírus, resistência a bactérias, esterilidade masculina, tolerância ao frio, tolerância a sal, rendimento aumentado, eficiência de uso de nutriente realçada, eficiência de uso de nitrogênio aumentada, teor de carboidrato fermentável aumentado, teor de lignina reduzido, teor de antioxidante aumentado, eficiência de uso de água realçada, vigor aumentado, eficiência de germinação aumentada, floração mais precoce ou aumentada, biomassa aumentada, razão de biomassa de raiz-para- broto alterada, e retenção de água no solo realçada. Ainda em uma outra modalidade, cada uma da primeira e segunda população é capaz de conferir um traço diferente selecionado do grupo consistindo em tolerância térmica, tolerância a herbicida, resistência à seca, resistência a insetos, resistência a fungo, resistência a vírus, resistência a bactérias, esterilidade masculina, tolerância ao frio, tolerância a sal, rendimento aumentado, eficiência de uso de nutriente realçada, eficiência de uso de nitrogênio aumentada, teor de carboidrato fermentável aumentado, teor de lignina reduzido, teor de antioxidante aumentado, eficiência de uso de água realçada, vigor aumentado, eficiência de germinação aumentada, floração mais precoce ou aumentada, biomassa aumentada, razão de biomassa de raiz-para- broto alterada, e retenção de água no solo realçada.

[0095] As combinações de endófitos também podem ser selecionadas com base em combinações dos critérios acima. Por exemplo, a primeira população de endófitos pode ser selecionada na base do composto que ela produz (por exemplo, sua capacidade de fixar nitrogênio, fornecendo assim uma fonte de nitrogênio potencial para a planta), enquanto a segunda população pode ser selecionada na base de sua capacidade de conferir resistência aumentada da planta a um patógeno (por exemplo, um patógeno fúngico).

[0096] Em alguns aspectos da presente invenção, é considerado que combinações de endófitos podem fornecer um benefício aumentado à planta hospedeira, quando comparado àquele conferido por um único endófito, em virtude de efeitos aditivos. Por exemplo, uma cepa de endófito que induz um benefício na planta hospedeira pode induzir tal benefício igualmente bem em uma planta que também é colonizada com uma cepa de endófito diferente que também induz o mesmo benefício na planta hospedeira. A planta hospedeira exibe assim o mesmo benefício total da pluralidade de cepas de endófito diferentes como o benefício aditivo a plantas individuais colonizadas com cada endófito individual da pluralidade. Em um exemplo, uma planta é colonizada com duas cepas de endófito diferentes: uma fornece um aumento de 1X em biomassa quando associada com a planta, e a outra fornece um aumento de 2X em biomassa quando associada com uma planta diferente. Quando ambas as cepas de endófito são associadas com a mesma planta, esta planta experienciaria um aumento de 3X (aditivo de efeitos únicos de 1X + 2X) na biomassa de auxina. Efeitos aditivos são um aspecto surpreendente da presente invenção, visto que a não compatibilidade de endófitos pode resultar em um cancelamento dos efeitos benéficos de ambos os endófitos.

[0097] Em alguns aspectos da presente invenção, é considerado que uma combinação de endófitos pode fornecer um benefício aumentado à planta hospedeira, quando comparado àquele conferido por um único endófito, em virtude de efeitos sinérgicos. Por exemplo, uma cepa de endófito que induz um benefício na planta hospedeira pode induzir tal benefício além de efeitos aditivos em uma planta que também é colonizada com uma cepa de endófito diferente que também induz este benefício na planta hospedeira. A planta hospedeira exibe assim o benefício total maior da pluralidade de cepas de endófito diferentes do que seria esperado do benefício aditivo de plantas individuais colonizadas com cada endófito individual da pluralidade. Em um exemplo, uma planta é colonizada com duas cepas de endófito diferentes: uma fornece um aumento de 1X na biomassa quando associada com uma planta, e a outra fornece um aumento de 2X na biomassa quando associada com uma planta diferente. Quando ambas as cepas de endófito são associadas com a mesma planta, esta planta experienciaria um aumento de 5X (maior do que um aditivo de efeitos únicos de 1X + 2X) na biomassa. Efeitos sinérgicos são um aspecto surpreendente da presente invenção.

[0098] Como mostrado na seção de Exemplos abaixo, as populações bacterianas endofíticas descritas aqui são capazes de colonizar a planta hospedeira. Em certos casos, a população bacteriana endofítica pode ser aplicada à planta, por exemplo à semente da planta, ou por aplicação foliar, e a colonização bem-sucedida pode ser confirmada detectando-se a presença da população bacteriana dentro da planta. Por exemplo, depois de aplicar as bactérias às sementes, títulos altos das bactérias podem ser detectados nas raízes e brotos das plantas que germinam a partir das sementes. Além disso, quantidades significantes das bactérias podem ser detectadas na rizosfera das plantas. Portanto, em uma modalidade, a população de micróbios endofíticos é disposta em uma quantidade eficaz para colonizar a planta. A colonização da planta pode ser detectada, por exemplo, detectando-se a presença do micróbio endofítico dentro da planta. Isto pode ser realizado medindo-se a viabilidade do micróbio depois da esterilização da superfície da semente ou da planta: colonização endofítica resulta em uma localização interna do micróbio, que o torna resistente a condições de esterilização de superfície. A presença e quantidade do micróbio também podem ser estabelecidas usando outros meios conhecidos na técnica, por exemplo, microscopia de imunofluorescência usando anticorpos específicos de micróbio, ou hibridização in situ de fluorescência (ver, por exemplo, Amann et al. (2001) Current Opinion in Biotechnology 12:231-236, incorporado aqui por referência em sua totalidade). Alternativamente, sondas de ácido nucleico específicas que reconhecem sequências conservadas a partir da bactéria endofítica podem ser utilizadas para ampliar uma região, por exemplo por PCR quantitativa, e correlacionadas a CFUs por meio de uma curva padrão.

[0099] Em uma outra modalidade, o micróbio endofítico é disposto em uma quantidade eficaz para ser detectável na planta agrícola madura. Em uma modalidade, o micróbio endofítico é disposto em uma quantidade eficaz para ser detectável em uma quantidade de pelo menos cerca de 100 CFU, pelo menos cerca de 200 CFU, pelo menos cerca de 300 CFU, pelo menos cerca de 500 CFU, pelo menos cerca de 1.000 CFU, pelo menos cerca de 3.000 CFU, pelo menos cerca de 10.000 CFU, pelo menos cerca de 30.000 CFU, pelo menos cerca de 100.000 CFU ou mais na planta agrícola madura.

[00100] Em alguns casos, o micróbio endofítico é capaz de colonizar tipos particulares de tecido da planta. Em uma modalidade, o micróbio endofítico é disposto sobre a semente ou muda em uma quantidade eficaz para ser detectável dentro de um tecido alvo da planta agrícola madura selecionada a partir de um fruto, uma semente, uma folha, ou uma raiz, ou porção desta. Por exemplo, o micróbio endofítico pode ser detectado em uma quantidade de pelo menos cerca de 100 CFU, pelo menos cerca de 200 CFU, pelo menos cerca de 300 CFU, pelo menos cerca de 500 CFU, pelo menos cerca de 1.000 CFU, pelo menos cerca de 3.000 CFU, pelo menos cerca de 10.000 CFU, pelo menos cerca de 30.000 CFU, pelo menos cerca de 100.000 CFU ou mais, no tecido alvo da planta agrícola madura.

[00101] Em alguns casos, os micróbios dispostos sobre a semente ou muda podem ser detectados na rizosfera. Isto pode ser devido à colonização bem-sucedida pelo micróbio endofítico, onde certas quantidades do micróbio são expelidas da raiz, colonizando desse modo a rizosfera. Em alguns casos, o micróbio localizado na rizosfera pode secretar compostos (tais como sideróforos ou ácidos orgânicos) que ajudam com a aquisição de nutriente pela planta. Portanto, em uma outra modalidade, o micróbio endofítico é disposto sobre a superfície da semente em uma quantidade eficaz para colonizar detectavelmente o ambiente do solo que circunda a planta agrícola madura quando comparado com uma planta agrícola de referência. Por exemplo, o micróbio pode ser detectado em uma quantidade de pelo menos 100 CFU/g DW, por exemplo, pelo menos 200 CFU/g DW, pelo menos 500 CFU/g DW, pelo menos 1.000 CFU/g DW, pelo menos 3.000 CFU/g DW, pelo menos 10.000 CFU/g DW, pelo menos 30.000 CFU/g DW, pelo menos 100.000 CFU/g DW, pelo menos 300.000 CFU/g DW, ou mais, na rizosfera.

[00102] As populações bacterianas endofíticas descritas aqui também são capazes de fornecer muitos benefícios de aptidão à planta hospedeira. Como mostrado na seção de Exemplos, plantas inoculadas com endófito exibem germinação de semente aumentada, vigor aumentado, biomassa aumentada (por exemplo, biomassa da raiz ou broto aumentada), eficiência fotoquímica aumentada. Portanto, em uma modalidade, a população bacteriana endofítica é disposta sobre a superfície ou dentro de um tecido da semente ou muda em uma quantidade eficaz para aumentar a biomassa da planta, ou uma parte ou tecido da planta cultivada a partir da semente ou muda. A biomassa aumentada é útil na produção de produtos de mercadoria derivados a partir da planta. Tais produtos de mercadoria incluem uma ração para animal, uma forragem de peixe, um produto de cereal, um produto de alimento humano processado, um açúcar ou um álcool. Tais produtos podem ser um produto de fermentação ou um produto fermentável, um tal produto exemplar é um biocombustível. O aumento na biomassa pode ocorrer em uma parte da planta (por exemplo, o tecido da raiz, brotos, folhas, etc.), ou pode ser um aumento na biomassa global. A produção de biomassa aumentada, tal como um aumento significando pelo menos cerca de 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, ou maior do que 100 % quando comparado com uma planta agrícola de referência. Tal aumento na biomassa global pode ser sob condições relativamente isentas de estresse. Em outros casos, o aumento na biomassa pode ser em plantas cultivadas sob qualquer número de estresses abióticos ou bióticos, incluindo estresse por seca, estresse por sal, estresse por calor, estresse por frio, estresse por baixo teor de nutriente, estresse por nematoide, estresse por herbivoria de inseto, estresse por patógeno fúngico, estresse por patógeno bacteriano, e estresse por patógeno viral. Em uma modalidade particular, a população bacteriana endofítica é disposta em uma quantidade eficaz para aumentar biomassa da raiz em pelo menos 1 %, pelo menos 2 %, pelo menos 3 %, pelo menos 4 %, pelo menos 5 %, pelo menos 6 %, pelo menos 7 %, pelo menos 8 %, pelo menos 9 %, ou pelo menos 10 %, por exemplo, pelo menos 20 %, pelo menos 30 %, pelo menos 40 %, pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 75 %, pelo menos 100 %, ou mais, quando comparado com uma planta agrícola de referência.

[00103] Em uma outra modalidade, a população bacteriana endofítica é disposta sobre a superfície ou dentro de um tecido da semente ou muda em uma quantidade eficaz para aumentar a taxa de germinação de semente quando comparado com uma planta agrícola de referência. Por exemplo, o aumento na germinação de semente pode ser pelo menos 1 %, pelo menos 2 %, pelo menos 3 %, pelo menos 4 %, pelo menos 5 %, pelo menos 6 %, pelo menos 7 %, pelo menos 8 %, pelo menos 9 %, ou pelo menos 10 %, por exemplo, pelo menos 20 %, pelo menos 30 %, pelo menos 40 %, pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 75 %, pelo menos 100 %, ou mais, quando comparado com uma planta agrícola de referência.

[00104] Em outros casos, o micróbio endofítico é disposto sobre a semente ou muda em uma quantidade eficaz para aumentar a biomassa ou rendimento médios do fruto ou sabugo a partir da planta resultante em pelo menos 1 %, pelo menos 2 %, pelo menos 3 %, pelo menos 4 %, pelo menos 5 %, pelo menos 6 %, pelo menos 7 %, pelo menos 8 %, pelo menos 9 %, ou pelo menos 10 %, por exemplo, pelo menos 15 %, pelo menos 20 %, pelo menos 30 %, pelo menos 40 %, pelo menos 50 %, pelo menos 75 %, pelo menos 100 % ou mais, quando comparado com uma planta agrícola de referência.

[00105] Como destacado na seção de Exemplos, plantas inoculadas com a população bacteriana endofítica também mostram um aumento na altura da planta global. Portanto, em uma modalidade, a presente invenção leva em consideração uma semente compreendendo uma população bacteriana endofítica que é disposta sobre a superfície ou dentro de um tecido da semente ou muda em uma quantidade eficaz para aumentar a altura da planta. Por exemplo, a população bacteriana endofítica é disposta em uma quantidade eficaz para resultar em um aumento na altura da planta agrícola tal que seja pelo menos 1 %, pelo menos 2 %, pelo menos 3 %, pelo menos 4 %, pelo menos 5 %, pelo menos 6 %, pelo menos 7 %, pelo menos 8 %, pelo menos 9 %, ou pelo menos 10 % maior, por exemplo, pelo menos 20 % maior, pelo menos 30 % maior, pelo menos 40 % maior, pelo menos 50 % maior, pelo menos 60 % maior, pelo menos 70 % maior, pelo menos 80 % maior, pelo menos 90 % maior, pelo menos 100 % maior, pelo menos 125 % maior, pelo menos 150 % maior ou mais, quando comparado com uma planta agrícola de referência, a planta. Tal aumento na altura pode ser sob condições relativamente isentas de estresse. Em outros casos, o aumento na altura pode ser em plantas cultivadas sob qualquer número de estresses abióticos ou bióticos, incluindo estresse por seca, estresse por sal, estresse por calor, estresse por frio, estresse por baixo teor de nutriente, estresse por nematoide, estresse por herbivoria de inseto, estresse por patógeno fúngico, estresse por patógeno bacteriano, e estresse por patógeno viral.

[00106] As plantas hospedeiras inoculadas com a população bacteriana endofítica também mostram melhoras dramáticas em sua capacidade de utilizar água mais eficientemente. Eficiência de uso de água é um parâmetro frequentemente correlacionado com tolerância à seca. Eficiência de uso de água (WUE) é um parâmetro frequentemente correlacionado com tolerância à seca, e é a taxa de assimilação de CO2 por água transpirada pela planta. Um aumento na biomassa em baixa disponibilidade de água pode ser devido à eficiência relativamente melhorada de crescimento ou consumo de água reduzido. Em selecionar traços para melhorar safras, uma diminuição no uso de água, sem uma mudança no crescimento teria mérito particular em um sistema agrícola irrigado onde custos de entrada de água foram altos. Um aumento no crescimento sem um salto correspondente no uso de água teria aplicabilidade a todos os sistemas agrícolas. Em muitos sistemas agrícolas onde o fornecimento de água não é limitante, um aumento no crescimento, mesmo se ele entrasse no custo de um aumento no uso de água também aumenta o rendimento.

[00107] Quando água do solo é suprimida ou se água não estiver disponível durante períodos de seca, rendimentos da safra são restritos. O déficit de água na planta desenvolve se a transpiração das folhas excede o fornecimento de água a partir das raízes. O fornecimento de água disponível é relacionado à quantidade de água mantida no solo e à capacidade da planta de atingir esta água com seu sistema de raiz. A transpiração de água a partir de folhas é ligada à fixação de dióxido de carbono por fotossíntese através dos estomas. Os dois processos são positivamente correlacionados de modo que alto influxo de dióxido de carbono através da fotossíntese é intimamente ligado à perda de água por transpiração. Visto que a água transpira a partir da folha, o potencial de água na folha é reduzido e os estomas tendem a fechar em um processo hidráulico que limita a quantidade de fotossíntese. Visto que o rendimento da safra é dependente da fixação de dióxido de carbono na fotossíntese, a captação e transpiração da água são fatores contribuintes para o rendimento da safra. Plantas que são capazes de usar menos água para fixar a mesma quantidade de dióxido de carbono ou que são capazes de funcionar normalmente em um potencial de água mais baixo têm o potencial de conduzir mais fotossíntese e desse modo produzir mais biomassa e rendimento econômico em muitos sistemas agrícolas. Uma eficiência de uso de água aumentada da planta refere- se em alguns casos a um tamanho ou número de fruto/grão aumentado.

[00108] Portanto, em uma modalidade, as plantas descritas aqui exibem uma eficiência de uso de água aumentada quando comparado com uma planta agrícola de referência cultivada sob as mesmas condições. Por exemplo, as plantas cultivadas a partir das sementes compreendendo a população bacteriana endofítica podem ter pelo menos 1 % mais alto de WUE, por exemplo, pelo menos 1 %, pelo menos 2 %, pelo menos 3 %, pelo menos 4 %, pelo menos 5 %, pelo menos 6 %, pelo menos 7 %, pelo menos 8 %, pelo menos 9 %, ou pelo menos 10 % mais alto, pelo menos 20 % mais alto, pelo menos 30 % mais alto, pelo menos 40 % mais alto, pelo menos 50 % mais alto, pelo menos 60 % mais alto, pelo menos 70 % mais alto, pelo menos 80 % mais alto, pelo menos 90 % mais alto, pelo menos 100 % mais alto de WUE do que uma planta agrícola de referência cultivada sob as mesmas condições. Um tal aumento em WUE pode ocorrer sob condições sem déficit de água, ou sob condições de déficit de água, por exemplo, quando o teor de água do solo é menos do que ou igual a 60 % de solo saturado de água, por exemplo, menos do que ou igual a 50 %, menos do que ou igual a 40 %, menos do que ou igual a 30 %, menos do que ou igual a 20 %, menos do que ou igual a 10 % de solo saturado de água em uma base em peso.

[00109] Em uma modalidade relacionada, a planta compreendendo o endófito bacteriano endofítico pode ter pelo menos 1 %, pelo menos 2 %, pelo menos 3 %, pelo menos 4 %, pelo menos 5 %, pelo menos 6 %, pelo menos 7 %, pelo menos 8 %, pelo menos 9 %, ou pelo menos 10 % mais alto de teor de água relativo (RWC), por exemplo, pelo menos 20 % mais alto, pelo menos 30 % mais alto, pelo menos 40 % mais alto, pelo menos 50 % mais alto, pelo menos 60 % mais alto, pelo menos 70 % mais alto, pelo menos 80 % mais alto, pelo menos 90 % mais alto, pelo menos 100 % mais alto de RWC do que uma planta agrícola de referência cultivada sob as mesmas condições.

[00110] Os endófitos descritos aqui também podem conferir à planta uma capacidade aumentada de cultivar em condições limitantes de nutriente, por exemplo por solubilização ou de outro modo tornando disponível às plantas macronutrientes ou micronutrientes que são complexados, insolúveis, ou de outro modo em uma forma não disponível. Em uma modalidade, uma planta é inoculada com um endófito que confere capacidade aumentada para liberar e/ou de outro modo fornecer à planta com nutrientes selecionados do grupo consistindo em fosfato, nitrogênio, potássio, ferro, manganês, cálcio, molibdênio, vitaminas, ou outros micronutrientes. Uma tal planta pode exibir crescimento aumentado no solo contendo quantidades limitantes de tais nutrientes quando comparado com planta agrícola de referência. Diferenças entre a planta associada a endófito e planta agrícola de referência podem ser medidas comparando-se a biomassa, ou outros parâmetros físicos descritos acima, dos dois tipos de plantas cultivados sob condições limitantes. Portanto, em uma modalidade, a planta contendo o endófito capaz de conferir tolerância aumentada a condições limitantes de nutriente exibe uma diferença em um parâmetro fisiológico que é pelo menos cerca de 5 % maior, por exemplo pelo menos cerca de 5 %, pelo menos cerca de 8 %, pelo menos cerca de 10 %, pelo menos cerca de 15 %, pelo menos cerca de 20 %, pelo menos cerca de 25 %, pelo menos cerca de 30 %, pelo menos cerca de 40 %, pelo menos cerca de 50 %, pelo menos cerca de 60 %, pelo menos cerca de 75 %, pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 90 %, ou pelo menos 100 %, pelo menos cerca de 200 %, pelo menos cerca de 300 %, pelo menos cerca de 400 % ou maior do que uma planta agrícola de referência cultivada sob as mesmas condições de estresse de nutriente. Em uma outra modalidade, a planta contendo o endófito é capaz de ser cultivada sob condições de estresse de nutriente enquanto não exibindo nenhuma diferença no parâmetro fisiológico comparado a uma planta que é cultivada sem estresse de nutriente. Em algumas modalidades, uma tal planta não exibirá nenhum diferença no parâmetro fisiológico quando cultivada com 2 a 5 % menos nitrogênio do que práticas de cultivo médias em terra agrícola normal, por exemplo, pelo menos 5 a 10 % menos nitrogênio, pelo menos 10 a 15 % menos nitrogênio, pelo menos 15 a 20 % menos nitrogênio, pelo menos 20 a 25 % menos nitrogênio, pelo menos 25 a 30 % menos nitrogênio, pelo menos 30 a 35 % menos nitrogênio, pelo menos 35 a 40 % menos nitrogênio, pelo menos 40 a 45 % menos nitrogênio, pelo menos 45 a 50 % menos nitrogênio, pelo menos 50 a 55 % menos nitrogênio, pelo menos 55 a 60 % menos nitrogênio, pelo menos 60 a 65 % menos nitrogênio, pelo menos 65 a 70 % menos nitrogênio, pelo menos 70 a 75 % menos nitrogênio, pelo menos 80 a 85 % menos nitrogênio, pelo menos 85 a 90 % menos nitrogênio, pelo menos 90 a 95 % menos nitrogênio, ou menos, quando comparado com plantas de safra cultivadas sob condições normais durante uma estação de crescimento média. Em algumas modalidades, o micróbio capaz de fornecer tolerância ao estresse por nitrogênio a uma planta é diazotrófico. Em outras modalidades, o micróbio capaz de fornecer tolerância ao estresse por nitrogênio a uma planta é não diazotrófico.

[00111] Muitos dos micróbios descritos aqui são capazes de produzir o hormônio auxina da planta ácido indol acético (IAA) quando cultivados em cultura. Auxina pode desempenhar um papel chave em alterar a fisiologia da planta, incluindo a extensão do crescimento da raiz. Portanto, em uma outra modalidade, a população bacteriana endofítica é disposta sobre a superfície ou dentro de um tecido da semente ou muda em uma quantidade eficaz para induzir detectavelmente a produção de auxina na planta agrícola. Por exemplo, o aumento em produção de auxina pode ser pelo menos 1 %, pelo menos 2 %, pelo menos 3 %, pelo menos 4 %, pelo menos 5 %, pelo menos 6 %, pelo menos 7 %, pelo menos 8 %, pelo menos 9 %, ou pelo menos 10 %, por exemplo, pelo menos 20 %, pelo menos 30 %, pelo menos 40 %, pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 75 %, pelo menos 100 %, ou mais, quando comparado com uma planta agrícola de referência. Em uma modalidade, a produção de auxina aumentada pode ser detectada em um tipo de tecido selecionado do grupo consistindo na raiz, broto, folhas e flores.

[00112] Em uma outra modalidade, a população bacteriana endofítica da presente invenção pode causar uma modulação detectável na quantidade de um metabólito na planta ou parte da planta. Tal modulação pode ser detectada, por exemplo, medindo-se os níveis de um metabólito dado e comparando-se com os níveis do metabólito em uma planta agrícola de referência cultivada sob as mesmas condições.

PLANTAS UTEIS PARA A PRESENTE INVENÇÃO

[00113] Os métodos e composições de acordo com a presente invenção podem ser implantados para qualquer espécie de planta de semente. Espécies de plantas monocotiledôneas assim como dicotiledôneas são particularmente adequadas. Os métodos e composições são preferencialmente usados com plantas que são importantes ou interessantes para agricultura, horticultura, para a produção de biomassa usada na produção de moléculas de combustível líquido e outros produtos químicos, e/ou silvicultura.

[00114] Assim, a invenção tem uso sobre uma faixa ampla de plantas, preferencialmente plantas superiores que pertencem às classes de Angiospermae e Gymnospermae. Plantas das subclasses da Dicotylodenae e da Monocotyledonae são particularmente adequadas. Plantas dicotiledôneas pertencem às ordens da Aristochiales, Asterales, Batales, Campanulales, Capparales, Caryophyllales, Casuarinales, Celastrales, Cornales, Diapensales, Dilleniales, Dipsacales, Ebenales,Ericales, Eucomiales, Euphorbiales, Fabales, Fagales, Gentianales, Geraniales, Haloragales, Hamamelidales, Middles, Juglandales, Lamiales, Laurales, Lecythidales, Leitneriales, Magniolales, Malvales, Myricales, Myrtales, Nymphaeales, Papeverales, Piperales, Plantaginales, Plumb aginales, Podostemales, Polemoniales, Poligalales, Poligonales, Primulales, Proteales, Rafflesiales, Ranunculales, Rhamnales, Rosales, Rubiales, Salicales, Santales, Sapindales, Sarraceniaceae, Scrophulariales, Theales,Trochodendrales, Umbellales, Urticales, e Violates. Plantas monocotiledôneas pertencem às ordens da Alismatales, Arales, Arecales, Bromeliales, Commelinales, Cyclanthales, Cyperales, Eriocaulales, Hydrocharitales, Juncales, Lilliales, Najadales, Orchidales, Pandanales, Poales, Restionales, Triuridales, Typhales e Zingiberales. Plantas que pertencem à classe da Gymnospermae são Cycadales, Ginkgoales, Gnetales e Pinales.

[00115] Espécies adequadas podem incluem membros do gênero Abelmoschus, Abies, Acer, Agrostis, Allium, Alstroemeria, Ananas, Andrographis, Andropogon, Artemisia, Arundo, Atropa, Berberis, Beta, Bixa, Brassica, Calendula, Camellia, Camptotheca, Cannabis, Capsicum, Carthamus, Catharanthus, Cephalotaxus, Chrysanthemum, Cinchona, Citrullus, Coffea, Colchicum, Coleus, Cucumis, Cucurbita, Cynodon, Datura, Dianthus, Digitalis, Dioscorea, Elaeis, Ephedra, Erianthus, Erythroxilum, Eucalipto, Festuca, Fragaria, Galanthus, Glicina, Gossypium, Helianthus, Hevea, Hordeum, Hyoscyamus, Jatropha, Lactuca, Linum, Lolium, Lupinus, Lycopersicon, Lycopodium, Manihot, Medicago, Mentha, Miscanthus, Musa, Nicotiana, Oryza, Panicum, Papaver, Parthenium, Pennisetum, Petunia, Phalaris, Phleum, Pinus, Poa, Poinsettia, Populus, Rauwolfia, Ricinus, Rosa, Saccharum, Salix, Sanguinaria, Scopolia, Secale, Solanum, Sorghum, Spartina, Spinacea, Tanacetum, Taxus, Theobroma, Triticosecale, Triticum,Uniola, Veratrum, Vinca, Vitis, e Zea.

[00116] Os métodos e composições da presente invenção são preferencialmente usados em plantas que são importantes ou interessantes para agricultura, horticultura, biomassa para a produção de moléculas de biocombustível e outros produtos químicos, e/ou silvicultura. Exemplos não limitantes incluem, por exemplo, Panicum virgatum (switchgrass), Sorghum bicolor (sorgo, sudangrass), Miscanthus giganteus (miscanthus), Saccharum sp. (cana energética), Populus balsamifera (choupo), Zea mays (milho), Glicina max (soja), Brassica napus (canola), Triticum aestivum (trigo), Gossypium hirsutum (algodão), Oryza sativa (arroz), Helianthus annuus (girassol), Medicago sativa (alfalfa), Beta vulgaris (beterraba-sacarina), Pennisetum glaucum (mexoeira), Panicum spp., Sorghum spp., Miscanthus spp., Saccharum spp., Erianthus spp., Populus spp., Secale cereale (centeio), Salix spp (salgueiro), Eucalipto spp. (eucalipto), Triticosecale spp. (trítio — trigo X centeio), Bambu, Carthamus tinctorius (cártamo), Jatropha curcas (Jatrofa), Ricinus communis (mamona), Elaeis guineensis (óleo de palma), Phoenix dactylifera (tamareira), Archontophoenix cunninghamiana (palmeira real), Syagrus romanzoffiana (palmeira jerivá), Linum usitatissimum (linho), Brassica juncea, Manihot esculenta (mandioca), Lycopersicon esculentum (tomate), Lactuca saliva (alface), Musa paradisiaca (banana), Solanum tuberosum (batata), Brassica oleracea (brócolis, couve-flor, couve-de-bruxelas), Camellia sinensis (chá), Fragaria ananassa (morango), Theobroma cacao (cacau), Coffea arabica (café), Vitis vinifera (uva), Ananas comosus (abacaxi), Capsicum annum (pimenta malagueta & pimentão-doce), Allium strain (cebola), Cucumis melo (melão), Cucumis sativus (pepino), Cucurbita maxima (abóbora), Cucurbita moschata (abóbora), Spinacea oleracea (espinafre), Citrullus lanatus (melancia), Abelmoschus esculentus (quiabo), Solanum melongena (beringela), Papaver somniferum (papoila-dormideira), Papaver orientale, Taxus baccata, Taxus brevifolia, Artemisia annua, Cannabis saliva, Camptotheca acuminate, Catharanthus roseus, Vinca rosea, Cinchona officinalis, Coichicum autumnale, Veratrum californica, Digitalis lanata, Digitalis purpurea, Dioscorea spp., Andrographis paniculata, Atropa belladonna, Datura stomonium, Berberis spp., Cephalotaxus spp., Ephedra sinica, Ephedra spp., Erythroxilum coca, Galanthus wornorii, Scopolia spp., Lycopodium serratum (Huperzia serrata), Lycopodium spp., Rauwolfia serpentina, Rauwolfia spp., Sanguinaria canadensis, Hyoscyamus spp., Calendula officinalis, Chrysanthemum parthenium, Coleus forskohlii, Tanacetum parthenium, Parthenium argentatum (guaiúle), Hevea spp. (borracha), Mentha spicata (hortelã), Mentha piperita (hortelã), Bixa orellana, Alstroemeria spp., Rosa spp. (rosa), Dianthus caryophyllus (cravo), Petunia spp. (petúnia), Poinsettia pulcherrima (poinsétia), Nicotiana tabacum (tabaco), Lupinus albus (tremoço), Uniola paniculata (aveia), Hordeum vulgare (cevada), e Lolium spp. (azevém).

[00117] Os métodos descritos aqui também podem ser usados com plantas geneticamente modificadas, por exemplo, para produzir benefícios de traço adicionais a uma planta. Por exemplo, uma planta geneticamente modificada que é, por meio do transgene, otimizada com respeito a um certo traço, pode ser aumentada ainda com benefícios de traço adicionais conferidos pelo micróbio recentemente introduzido. Portanto, em uma modalidade, uma planta geneticamente modificada é contatada com um micróbio.

FORMULAÇÕES/COMPOSIÇÕES DE REVESTIMENTO DE SEMENTE

[00118] Em algumas modalidades, a presente invenção considera sementes compreendendo uma população bacteriana endofítica, e compreendendo ainda uma formulação. A formulação útil para estas modalidades geralmente compreende pelo menos um membro selecionado do grupo consistindo em um veículo agricolamente compatível, um agente taquificante, um estabilizador microbiano, um fungicida, um agente antibacteriano, um herbicida, um nematicida, um inseticida, um regulador de crescimento de planta, um rodenticida, e um nutriente.

[00119] Em alguns casos, a população bacteriana endofítica é misturada com um veículo agricolamente compatível. O veículo pode ser um veículo sólido ou veículo líquido. O veículo pode ser qualquer um ou mais de vários veículos que conferem uma variedade de propriedades, tais como estabilidade aumentada, umectabilidade ou dispersabilidade. Agentes umectantes tais como tensoativos naturais ou sintéticos, que podem ser tensoativos não iônicos ou iônicos, ou uma combinação destes podem ser incluídos em uma composição da invenção. Emulsões de água-em-óleo também podem ser usadas para formular uma composição que inclui a população bacteriana endofítica da presente invenção (ver, por exemplo, Patente dos EUA No 7.485.451, que é incorporada aqui por referência em sua totalidade). Formulações adequadas que podem ser preparadas incluem pós umedecíveis, grânulos, géis, tiras de ágar ou pelotas, espessantes, e semelhantes, partículas microencapsuladas, e semelhantes, líquidos tais como fluíveis aquosos, suspensões aquosas, emulsões de água-em-óleo, etc. A formulação pode incluir produtos de grão ou legume, por exemplo, grão ou feijões moídos, caldo ou farinha derivados a partir de grão ou feijões, amido, açúcar ou óleo.

[00120] Em algumas modalidades, o veículo agrícola pode ser solo ou meio de crescimento da planta. Outros veículos agrícolas que podem ser usados incluem fertilizantes, óleos com base em planta, umectantes, ou combinações destes. Alternativamente, o veículo agrícola pode ser um sólido, tal como terra diatomácea, argila, sílica, alginato, argila, bentonita, vermiculita, caixas de sementes, outros produtos vegetais e animais, ou combinações, incluindo grânulos, pelotas ou suspensões.Misturas de qualquer um dos ingredientes anteriormente mencionados também são consideradas como veículos, tais como mas não limitadas a, pasta (farinha e argila de caulim), ágar ou pelotas com base em farinha em argila, areia, ou argila, etc. Formulações podem incluir fontes alimentícias para os organismos cultivados, tais como cevada, arroz, ou outros materiais biológicos tais como semente, partes de plantas, bagaço de cana-de-açúcar, cascas ou talos a partir de processamento de grão, material vegetal ou madeira moídos a partir de resíduo de local de construção, serragem ou fibras pequenas a partir da reciclagem de papel, tecido, ou madeira. Outras formulações adequadas serão conhecidas àqueles habilitados na técnica.

[00121] Em uma modalidade, a formulação pode compreender um agente taquificante ou aderente. Tais agentes são úteis para combinar a população bacteriana da invenção com veículos que podem conter outros compostos (por exemplo, agentes de controle que não são biológicos), para produzir uma composição de revestimento. Tais composições ajudam a criar revestimentos em torno da planta ou semente para manter contato entre o micróbio e outros agentes com a planta ou parte da planta. Em uma modalidade, aderentes são selecionados do grupo consistindo em: alginato, gomas, amidos, lecitinas, formononetina, álcool polivinílico, formononetinato alcalino, hesperetina, acetato de polivinila, cefalinas, goma arábica, Goma Xantana, Óleo mineral, Polietilenoglicol (PEG), Polivinilpirrolidona (PVP), Arabino-galactana, Metil Celulose, PEG 400, Quitosana, Poliacrilamida, Poliacrilato, Poliacrilonitrila, Glicerol, Trietileno glicol, Acetato de vinila, Goma gelana, Poliestireno, Polivinila, Carboximetil celulose, Goma Ghatti, e copolímeros em bloco de polioxietileno- polioxibutileno. Outros exemplos de composições aderentes que podem ser usadas na preparação sintética incluem aqueles descrito em EP 0818135, CA 1229497, WO 2013090628, EP 0192342, WO 2008103422 e CA 1041788, cada um dos quais é incorporado aqui por referência em sua totalidade.

[00122] A formulação também pode conter um tensoativo. Exemplos não limitantes de tensoativos incluem combinações de nitrogênio- tensoativo tais como Prefer 28 (Cenex), Surf-N(US), Inhance (Brandt), P-28 (Wilfarm) e Patrol (Helena); óleos de sementes esterificados incluem Sun-It II (AmCy), MSO (UAP), Scoil (Agsco), Hasten (Wilfarm) e Mes-100 (Drexel); e tensoativos de organo-silicona incluem Silwet L77 (UAP), Silikin (Terra), Dyne-Amic (Helena), Kinetic (Helena), Sylgard 309 (Wilbur-Ellis) e Century (Precision). Em uma modalidade, o tensoativo está presente em uma concentração entre 0,01 % v/v e 10 % v/v. Em uma outra modalidade, o tensoativo está presente em uma concentração entre 0,1 % v/v e 1 % v/v.

[00123] Em certos casos, a formulação inclui um estabilizador microbiano. Um tal agente pode incluir um dessecante. Como usado aqui, um "dessecante" pode incluir qualquer composto ou mistura de compostos que podem ser classificados como um dessecante apesar de se o composto ou compostos são usados em tais concentrações de modo que eles de fato tenham um feito dessecante sobre o inoculante líquido. Tais dessecantes são idealmente compatíveis com a população bacteriana usada, e devem promover a capacidade da população microbiana de sobreviver à aplicação sobre as sementes e sobreviver à dessecação. Exemplos de dessecantes adequados incluem um ou mais de trealose, sacarose, glicerol, e metileno glicol. Outros dessecantes adequados incluem, mas não são limitados a açúcares não redutores e álcoois de açúcar (por exemplo, manitol ou sorbitol). A quantidade de dessecante introduzido na formulação pode variar de cerca de 5 % a cerca de 50 % em peso/volume, por exemplo, entre cerca de 10 % a cerca de 40 %, entre cerca de 15 % e cerca de 35 %, ou entre cerca de 20 % e cerca de 30 %.

[00124] Em alguns casos, é vantajoso que a formulação contenha agentes tais como um fungicida, um agente antibacteriano, um herbicida, um nematicida, um inseticida, um regulador de crescimento de planta, um rodenticida, e um nutriente. Tais agentes são idealmente compatíveis com a semente ou muda agrícola sobre a qual a formulação é aplicada (por exemplo, isto não deve ser deletério ao crescimento ou saúde da planta). Além disso, o agente é idealmente um que não causa preocupações de segurança para uso humano, animal ou industrial (por exemplo, nenhum problema de segurança, ou o composto é suficientemente lábil de modo que o produto de planta de mercadoria derivado da planta contenha quantidades negligenciáveis do composto).

[00125] Na forma líquida, por exemplo, soluções ou suspensões, as populações bacterianas endofíticas da presente invenção podem ser misturadas ou colocadas em suspensão em soluções aquosas. Diluentes ou veículos líquidos adequados incluem soluções aquosas, destilados de petróleo, ou outros veículos líquidos.

[00126] Composições sólidas podem ser preparadas dispersando-se as populações bacterianas endofíticas da invenção dentro e sobre um veículo sólido apropriadamente dividido, tal como turfa, trigo, farelo, vermiculita, argila, talco, bentonita, terra diatomácea, terra de fuller, solo pasteurizado, e semelhantes. Quando tais formulações são usadas como pós umedecíveis, agentes dispersantes biologicamente compatíveis tais como agentes dispersantes e emulsificadores não iônicos, aniônicos, anfóteros, ou catiônicos podem ser usados.

[00127] Os veículos sólidos usados durante a formulação incluem, por exemplo, veículos minerais tais como argila de caulim, pirofilita, bentonita, montmorilonita, terra diatomácea, solo branco ácido, vermiculita, e perlita, e sais inorgânicos tais como sulfato de amônio, fosfato de amônio, nitrato de amônio, ureia, cloreto de amônio, e carbonato de cálcio. Também, pós finos orgânicos tais como farinha de trigo, farelo de trigo, e farelo de arroz podem ser usados. Os veículos líquidos incluem óleos vegetais tais como óleo de soja e óleo de caroço de algodão, glicerol, etileno glicol, polietilenoglicol, propileno glicol, polipropileno glicol, etc.

[00128] Em uma modalidade particular, a formulação é idealmente adequada para o revestimento da população microbiana endofítica sobre as sementes. As populações bacterianas endofíticas descritas na presente invenção são capazes de conferir muitos benefícios de aptidão às plantas hospedeiras. A capacidade de conferir tais benefícios revestindo-se as populações bacterianas sobre as superfícies das sementes tem muitas vantagens potenciais, particularmente quando usadas em uma escala comercial (agrícola).

[00129] As populações bacterianas endofíticas aqui podem ser combinadas com um ou mais dos agentes descritos acima para produzir uma formulação adequada para combinação com uma semente agrícola ou muda. A população bacteriana pode ser obtida a partir do crescimento em cultura, por exemplo, usando um meio de crescimento sintético. Além disso, o micróbio pode ser cultivado sobre meios sólidos, por exemplo sobre placas de petri, raspado e colocado em suspensão na preparação. Micróbios em diferentes fases de crescimento podem ser usados. Por exemplo, micróbios em fase de latência, fase lógica inicial, fase lógica intermediária, fase lógica tardia, fase estacionário, fase de morte precoce, ou fase de morte podem ser usados.

[00130] As formulações compreendendo a população bacteriana endofítica da presente invenção tipicamente contêm entre cerca de 0,1 a 95 % em peso, por exemplo, entre cerca de 1 % e 90 %, entre cerca de 3 % e 75 %, entre cerca de 5 % e 60 %, entre cerca de 10 % e 50 % em peso úmido da população bacteriana da presente invenção. É preferido que a formulação contenha pelo menos cerca de 103 por ml de formulação, por exemplo, pelo menos cerca de 104, pelo menos cerca de 105, pelo menos cerca de 106, pelo menos 107 CFU, pelo menos 108 CFU por ml de formulação.

[00131] Como descrito acima, em certas modalidades, a presente invenção considera o uso de bactérias endofíticas que são heterogeneamente dispostas sobre a planta, por exemplo, a semente. Em certos casos, a planta agrícola pode conter bactérias que são substancialmente similares a, ou ainda geneticamente indistinguíveis das bactérias que estão sendo aplicadas à planta. É observado que, em muitos casos, as bactérias que estão sendo aplicadas sejam substancialmente diferentes das bactérias já presentes em vários modos significantes. Primeiro, as bactérias que estão sendo aplicadas à planta agrícola foram adaptadas à cultura, ou adaptadas para serem capazes de cultivar em meios de crescimento em isolamento da planta. Segundo, em muitos casos, as bactérias que estão sendo aplicadas são derivadas de uma origem clonal, ao invés de uma origem heteróloga e, como tal, podem ser distinguidas das bactérias que já estão presentes na planta agrícola pela similaridade clonal. Por exemplo, onde um micróbio que foi inoculado por uma planta também está presente na planta (por exemplo, em um tecido ou porção diferente da planta), ou onde o micróbio introduzido é suficientemente similar a um micróbio que está presente em algumas das plantas (ou porção da planta, incluindo sementes), ainda é possível distinguir entre o micróbio inoculado e o micróbio nativo distinguindo-se entre os dois tipos de micróbio na base de seu estado epigenético (por exemplo, as bactérias que são aplicadas, assim como sua progênie, seriam esperados ter um padrão muito mais uniforme e similar de metilação de citosina de seu genoma, com respeito à extensão e/ou local de metilação).

POPULAÇÃO DE SEMENTES

[00132] Em um outro aspecto, a invenção leva em consideração uma população substancialmente uniforme de sementes compreendendo uma pluralidade de sementes compreendendo a população bacteriana endofítica, como descrito aqui acima. Uniformidade substancial pode ser determinada em muitos modos. Em alguns casos, pelo menos 1 %, pelo menos 2 %, pelo menos 3 %, pelo menos 4 %, pelo menos 5 %, pelo menos 6 %, pelo menos 7 %, pelo menos 8 %, pelo menos 9 %, ou pelo menos 10 %, por exemplo, pelo menos 20 %, pelo menos 30 %, pelo menos 40 %, pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou mais das sementes na população, contém a população bacteriana endofítica em uma quantidade eficaz para colonizar a planta disposta sobre a superfície das sementes. Em outros casos, pelo menos 1 %, pelo menos 2 %, pelo menos 3 %, pelo menos 4 %, pelo menos 5 %, pelo menos 6 %, pelo menos 7 %, pelo menos 8 %, pelo menos 9 %, ou pelo menos 10 %, por exemplo, pelo menos 20 %, pelo menos 30 %, pelo menos 40 %, pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou mais das sementes na população, contém pelo menos 100 CFU em sua superfície, por exemplo, pelo menos 200 CFU, pelo menos 300 CFU, pelo menos 1.000 CFU, pelo menos 3.000 CFU, pelo menos 10.000 CFU, pelo menos 30.000 CFU, pelo menos 100.000 CFU, pelo menos 300.000 CFU, ou pelo menos 1.000.000 CFU por semente ou mais.

[00133] Em uma modalidade particular, a população de sementes é empacotada em um saco ou recipiente adequado para venda comercial. Um tal saco contém um peso unitário ou contagem das sementes compreendendo a população bacteriana endofítica como descrito aqui, e compreende ainda um rótulo. Em uma modalidade, o saco ou recipiente contém pelo menos 1.000 sementes, por exemplo, pelo menos 5.000 sementes, pelo menos 10.000 sementes, pelo menos 20.000 sementes, pelo menos 30.000 sementes, pelo menos 50.000 sementes, pelo menos 70.000 sementes, pelo menos 80.000 sementes, pelo menos 90.000 sementes ou mais. Em uma outra modalidade, o saco ou recipiente pode compreender um peso diferente de sementes, por exemplo, pelo menos 1 lb, pelo menos 2 lb, pelo menos 5 lb, pelo menos 10 lb, pelo menos 30 lb, pelo menos 50 lb, pelo menos 70 lb ou mais. O saco ou recipiente compreende um rótulo descrevendo as sementes e/ou a dita população bacteriana endofítica. O rótulo pode conter informação adicional, por exemplo, a informação selecionada do grupo consistindo em: peso líquido, número do lote, origem geográfica das sementes, data de teste, taxa de germinação, teor de matéria inerte, e a quantidade de ervas daninhas nocivas, se alguma. Recipientes ou embalagens adequados incluem aqueles tradicionalmente usados na comercialização de sementes de plantas. A invenção também considera outros recipientes com capacidades de armazenamento mais sofisticadas (por exemplo, com embalagens microbiologicamente rígidas ou com contenções à prova de gás ou água).

[00134] Em alguns casos, uma subpopulação de sementes compreendendo a população bacteriana endofítica é selecionada ainda na base de uniformidade aumentada, por exemplo, na base de uniformidade da população microbiana. Por exemplo, sementes individuais de misturas coletadas a partir de sabugos individuais, plantas individuais, lotes individuais (representando plantas inoculadas no mesmo dia) ou campos individuais podem ser testados quanto à uniformidade de densidade microbiana, e apenas aquelas misturas que satisfazem as especificações (por exemplo, pelo menos 80 % de sementes testadas têm densidade mínima, como determinado por métodos quantitativos descritos em outra parte) são combinados para fornecer a subpopulação de semente agrícola.

[00135] Os métodos descritos aqui também podem compreender uma etapa de validação. A etapa de validação pode envolver, por exemplo, cultivar algumas sementes coletadas das plantas inoculadas em misturas de planta agrícola, e testar estas plantas individuais quanto à uniformidade. Tal etapa de validação pode ser realizada em sementes individuais coletadas a partir de sabugos, plantas individuais, lotes individuais (representando plantas inoculadas no mesmo dia) ou campos individuais, e testada como descrito acima para identificar misturas que satisfaçam as especificações necessárias.

POPULAÇÃO DE PLANTAS/CAMPOS AGRÍCOLAS

[00136] Um foco principal de esforços de melhoria de safra foi selecionar variedades com traços que fornecem, além do retorno mais alto, a maior homogeneidade e uniformidade. Embora a procriação possa produzir plantas com identidade genética substancial, heterogeneidade com respeito à altura da planta, tempo de floração, e tempo para semear, permanecem impedimentos para obter um campo homogêneo de plantas. A variabilidade de planta-a-planta inevitável é causada por uma grande quantidade de fatores, incluindo condições ambientais e práticas de manejo irregulares. Uma outra fonte possível de variabilidade pode, em alguns casos, ser devido à heterogeneidade da população microbiana que habita as plantas. Fornecendo-se populações bacterianas endofíticas sobre sementes e mudas, as plantas resultantes geradas germinando-se as sementes e mudas têm uma composição microbiana mais compatível, e assim são esperadas produzir uma população mais uniforme de plantas.

[00137] Portanto, em um outro aspecto, a invenção fornece uma população substancialmente uniforme de plantas. A população compreende pelo menos 100 plantas, por exemplo, pelo menos 300 plantas, pelo menos 1.000 plantas, pelo menos 3.000 plantas, pelo menos 10.000 plantas, pelo menos 30.000 plantas, pelo menos 100.000 plantas ou mais. As plantas são cultivadas a partir das sementes compreendendo a população bacteriana endofítica como descrito aqui.A uniformidade aumentada das plantas pode ser medida em vários modos diferentes.

[00138] Em uma modalidade, existe uma uniformidade aumentada com respeito aos micróbios dentro da população de plantas. Por exemplo, em uma modalidade, uma porção substancial da população de plantas, por exemplo pelo menos 1 %, pelo menos 2 %, pelo menos 3 %, pelo menos 4 %, pelo menos 5 %, pelo menos 6 %, pelo menos 7 %, pelo menos 8 %, pelo menos 9 %, ou pelo menos 10 %, pelo menos 20 %, pelo menos 30 %, pelo menos 40 %, pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou mais das sementes ou plantas em uma população, contém um número limiar da população bacteriana endofítica. O número limiar pode ser pelo menos 100 CFU, por exemplo pelo menos 300 CFU, pelo menos 1.000 CFU, pelo menos 3.000 CFU, pelo menos 10.000 CFU, pelo menos 30.000 CFU, pelo menos 100.000 CFU ou mais, na planta ou uma parte da planta. Alternativamente, em uma porção substancial da população de plantas, por exemplo, em pelo menos 1 %, pelo menos 2 %, pelo menos 3 %, pelo menos 4 %, pelo menos 5 %, pelo menos 6 %, pelo menos 7 %, pelo menos 8 %, pelo menos 9 %, ou pelo menos 10 %, pelo menos 20 %, pelo menos 30 %,pelo menos 40 %, pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou mais das plantas na população, a população bacteriana endofítica que é fornecida à semente ou muda representa pelo menos 1 %, pelo menos 2 %, pelo menos 3 %, pelo menos 4 %, pelo menos 5 %, pelo menos 6 %, pelo menos 7 %, pelo menos 8 %, pelo menos 9 %, ou pelo menos 10 %, pelo menos 20 %, pelo menos 30 %, pelo menos 40 %, pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 80 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 99 %, ou 100 % da população total de micróbios na planta/semente.

[00139] Em uma outra modalidade, existe uma uniformidade aumentada com respeito a um parâmetro fisiológico das plantas dentro da população. Em alguns casos, pode haver uma uniformidade aumentada na altura das plantas quando comparado com uma população de plantas agrícolas de referência cultivadas sob as mesmas condições. Por exemplo, pode haver uma redução no desvio padrão na altura das plantas na população de pelo menos 1 %, pelo menos 2 %, pelo menos 3 %, pelo menos 4 %, pelo menos 5 %, pelo menos 6 %, pelo menos 7 %, pelo menos 8 %, pelo menos 9 %, ou pelo menos 10 %, pelo menos 15 %, pelo menos 20 %, pelo menos 30 %, pelo menos 40 %, pelo menos 50 %, pelo menos 60 % ou mais, quando comparado com uma população de plantas agrícolas de referência cultivadas sob as mesmas condições. Em outros casos, pode haver uma redução no desvio padrão no tempo de floração das plantas na população de pelo menos 1 %, pelo menos 2 %, pelo menos 3 %, pelo menos 4 %, pelo menos 5 %, pelo menos 6 %, pelo menos 7 %, pelo menos 8 %, pelo menos 9 %, ou pelo menos 10 %, pelo menos 15 %, pelo menos 20 %, pelo menos 30 %, pelo menos 40 %, pelo menos 50 %, pelo menos 60 % ou mais, quando comparado com uma população de plantas agrícolas de referência cultivadas sob as mesmas condições.

PRODUTO DE PLANTA DE MERCADORIA

[00140] A presente invenção fornece um produto de planta de mercadoria, assim como métodos para produzir um produto de planta de mercadoria, que é derivado de uma planta da presente invenção. Como usado aqui, um "produto de planta de mercadoria" refere-se a qualquer composição ou produto que é compreendido de material derivado de uma planta, semente, célula vegetal, ou parte da planta da presente invenção. Produtos de planta de mercadoria podem ser vendidos aos consumidores e podem ser viáveis ou não viáveis. Produtos de mercadoria não viáveis incluem mas não são limitados a sementes e grãos não viáveis; sementes processadas, partes de semente, e partes de planta; tecido de planta desidratado, tecido de planta congelado, e tecido de planta processado; sementes e partes de planta processadas para ração para animal para consumo de animal terrestre e/ou aquático, óleo, ração, farinha, flocos, farelo, fibra, papel, chá, café, silagem, triturado de grão integral, e qualquer outro alimento para consumo humano ou animal; e biomassas e produtos combustíveis; e matéria-prima na indústria. Usos industriais de óleos derivados das plantas agrícolas descritas aqui incluem ingredientes para tintas, plásticos, fibras, detergentes, cosméticos, lubrificantes, e combustível biodiesel. Óleo de soja pode ser dividido, inter-esterificado, sulfurizado, epoxidado, polimerizado, etoxilado ou clivado. Projetar e produzir derivados de óleo de soja com funcionalidade melhorada e oleoquímica melhorada é um campo rapidamente crescente. A mistura típica de triglicerídeos é usualmente dividida e separada em ácidos graxos puros, que são depois combinados com álcoois ou ácidos derivados de petróleo, nitrogênio, sulfonatos, cloro, ou com álcoois graxos derivados de gorduras e óleos para produzir o tipo desejado de óleo ou gordura. Produtos de planta de mercadoria também incluem compostos industriais, tais como uma variedade ampla de resinas usadas na formulação de adesivos, películas, plásticos, tintas, revestimentos e espumas.

[00141] Em alguns casos, produtos de planta de mercadoria derivados das plantas, ou usando os métodos da presente invenção podem ser identificados facilmente. Em alguns casos, por exemplo, a presença de micróbios endofíticos viáveis pode ser detectada usando os métodos descritos aqui em outra parte. Em outros casos, particularmente onde não existe nenhum micróbio endofítico viável, o produto de planta de mercadoria pode conter ainda pelo menos uma quantidade detectável do DNA específico e único que corresponde aos micróbios descritos aqui. Qualquer método padrão de detecção para moléculas de polinucleotídeo pode ser usado, incluindo métodos de detecção divulgados aqui.

[00142] Por todo o relatório descritivo, o termo "compreendem," ou variações tais como "compreende" ou "compreendendo," será entendido como implicando a inclusão de um número inteiro estabelecido ou grupo de números inteiros mas não a exclusão de qualquer outro número inteiro ou grupo de números inteiros.

[00143] Embora a presente invenção tenha sido descrita em detalhe com referência aos exemplos abaixo, é entendido que várias modificações podem ser feitas sem divergir do espírito da invenção. Por exemplo, embora os exemplos particulares abaixo possam ilustrar os métodos e modalidades descritos aqui usando uma planta específica, os princípios nestes exemplos podem ser aplicados a qualquer safra agrícola. Portanto, será avaliado que o escopo desta invenção seja abrangido pelas modalidades das invenções relatadas aqui e pelo relatório descritivo ao invés dos exemplos específicos que são exemplificados abaixo. Todas as patentes e publicações citadas referidas neste pedido são aqui incorporadas por referência em sua totalidade.

EXEMPLOS Exemplo 1: Caracterização fenotípica e fisiológica de micróbios.

[00144] Cepas bacterianas de culturas noturnas em caldo de soja tríptico foram semeadas em placas de ágar de soja tríptico (TSA) e incubadas a 30 °C. Depois de 24 h, a cor e forma das colônias foram observadas. A motilidade celular e forma da colônia foram observadas sob microscópio óptico (Nikon, Japão).

[00145] Os limites de pH para crescimento bacteriano foram determinados ajustando-se o pH do meio de crescimento a valores entre 5 e 12 em triplicatas. O crescimento bacteriano em diferentes concentrações de sal foi testado em meio TSA contendo 1 a 6 % de NaCl. Além disso, a capacidade dos micróbios de cultivar em metanol/etanol como única fonte de carbono foi analisada substituindo- se a glicose com metanol ou etanol.

[00146] A formação de agregado de cepas bacterianas pode afetar positivamente sua dispersão e sobrevivência no ambiente da planta e adsorção a raízes da planta. A extensão da formação de agregação foi medida em seis réplicas seguindo o método de Madi e Henis (1989) Plant Soil 115:89-98 (incorporado aqui por referência) com algumas modificações. Alíquotas de cultura líquida contendo agregados foram transferidas para tubos de vidro e deixadas repousar por 30 min. Agregados sedimentaram no fundo de cada um dos tubos, e a suspensão foi principalmente composta livre de células. A turvação de cada suspensão foi medida a 540 nm (ODs) com um leitor de microplaca (Synergy 5; BioTek Instrument Inc., Winooski, USA). Culturas depois foram dispersas com um homogeneizador de tecido por 1 min e a turvação total (OD) foi medida. A porcentagem de agregação foi estimada como segue:% de agregação = (ODt - ODs) x 100/ODt

[00147] Ensaios de motilidade (nado, formação de colônia e movimento de contração) foram realizados seguindo os métodos de Rashid e Kornberg (2000). Placas de nado (meio LB continha 0,3 % de agarose) foram inoculadas em triplicatas com bactérias a partir de uma cultura noturna em placas de ágar TSA cultivadas a 30 °C com um palito estéril. Para formação de colônia, placas (meio NB continha 0,5 % de ágar e glicose) foram inoculadas com um palito estéril. Placas de movimento de contração (caldo LB contendo 1 % de ágar granular Difco) foram inoculadas por pontada com um palito afiado ao fundo da placa de petri a partir de uma cultura cultivada durante a noite em placas de ágar TSA.

[00148] A formação de biopelícula foi analisada usando cultura bacteriana cultivada durante a noite em placas microtituladoras de 96 reservatórios por tingimento com 1 % de violeta cristal (CV) por 45 min. Para quantificar a quantidade da biopelícula, CV foi descolorida com 200 μl de etanol a 100 %. A absorbância de 150 μl da CV descolorida, que foi transferida em uma nova placa microtituladora foi medida a 595 nm (modificada de Djordjevic et al. 2002, Appl Environ Microbiol 68:29502958, incorporado aqui por referência). Os caracteres fenotípicos das cepas são mostrados na tabela 1.TABELA 1: Características fenotípicas das cepas:

Caracterização bioquímica

[00149] Testes bioquímicos tais como oxidase, catalase, hidrólise de gelatina e hidrólise de caseína das cepas selecionadas foram realizados. Atividades de oxidase e catalase foram testadas com 1 % (p/v) de tetrametil-p-fenileno diamina e 3 % (v/v) de solução de peróxido de hidrogênio, respectivamente. Hidrólise de gelatina e de caseína foi realizada semeando-se cepas bacterianas sobre uma placa TSA a partir da cultura de estoque. Depois da incubação, ácido tricloroacético (TCA) foi aplicado às placas e feita observação imediatamente por um período de pelo menos 4 min (Medina e Baresi 2007, J Microbiol Methods 69:391-393, incorporado aqui por referência). Um resumo das características bioquímicas das cepas é mostrado abaixo na tabela 2: TABELA 2. Caracterização Bioquímica de Bactérias Endofíticas

Quantificação da produção de auxina

[00150] Produção de auxina por isolados bacterianos tanto na presença quanto na ausência de L-triptofano (L-TRP) foi determinada colorimetricamente e expressada como equivalente de IAA (Sarwar et al. 1992, Plant Soil 147:207-215, incorporado aqui por referência). Células bacterianas de dois dias de idade cultivadas (28 °C a 180 rpm) em caldo de soja tríptico suplementado com solução de L-TRP a 1 % foram colhidas por centrifugação (10.000 g por 10 min). Três mL dos sobrenadantes foram misturados com 2 mL de reagente de Salkowski (12 g L-1 de FeCl3 em 429 ml L-1 de H2SO4). A mistura foi incubada na temperatura ambiente por 30 min para o desenvolvimento de cor e absorbância em 535 nm foi medida usando espectrofotômetro. A concentração de auxina produzida por isolados bacterianos foi determinada usando curvas padrão para IAA preparado a partir de diluições seriais de 10 a 100 μg mL-1.TABELA 3: Produção de Ácido Indol Acético por Bactérias Endofíticas

[00151] Como mostrado na tabela 3 acima, cepas FA13, FF34, FC42, FB12 e FD17 foram todas mostradas produzir auxina (variando de 1,63 a 10,33 μg ml-1 na ausência de L-triptofano), e o nível de produção de auxina foi muito realçado pela presença de L-triptofano no meio de crescimento (pelo menos 7,26 μg ml-1).

Ensaios para solubilização de fósforo e produção de sideróforo

[00152] Cepas bacterianas foram avaliadas quanto à sua capacidade de solubilizar fosfatos (P orgânico/inorgânico). Alíquotas (10 μL) de cultura de crescimento bacteriano noturno em caldo de soja tríptico foram inoculadas por mancha sobre NBRI-PBP (Mehta e Nautiyal 2001) e meio de ágar de fitato de cálcio/sódio (Rosado et al. 1998).Solubilização de fosfatos orgânicos/inorgânicos foi detectada pela formação de uma zona clara em torno da mancha de crescimento bacteriano. A atividade de solubilização de fosfato também foi determinada por desenvolvimento de zona clara em torno do crescimento bacteriano em meio de ágar Pikovskaya (Pikovskaya 1948, Mikrobiologiya 17:362-370, incorporado aqui por referência). Isolados bacterianos foram avaliados quanto a produção de sideróforos no meio de ágar Chrome azurol S (CAS) descrito por Schwyn e Neilands (1987), Curr Microbiol 43:57-58 (incorporado aqui por referência) como positivos para a produção de sideróforo.

Ensaios para produção de exopolissacarídeo, NH3 e HCN

[00153] Para a atividade de exopolissacarídeo (EPS) (qualitativa), cepas foram cultivadas em meio mineral Weaver enriquecido com glicose e a produção de EPS foi avaliada visualmente (modificada de Weaver et al. 1975, Arch Microbiol 105:207-216, incorporado aqui por referência). A produção de EPS foi monitorada como formação de floco (material macio) nas placas depois de 48 h de incubação a 28 ± 2 °C. Cepas foram testadas quanto à produção da amônia (NH3) em água de peptona como descrito por Cappuccino e Sherman (1992), Biochemical activities of microorganisms. Em: Microbiology, A Laboratory Manual. The Benjamin/Cummings Publishing Co. California, USA, páginas 125 a 178, incorporado aqui por referência. Os isolados bacterianos foram triados quanto à produção de cianeto de hidrogênio (HCN) inoculando- se placas de ágar B de King alteradas com 4,4 g L-1 de glicina (Lorck 1948, Physiol Plant 1:142-146, incorporado aqui por referência). Papel de filtro (Whatman no 1) saturado com solução de picrato (Na2CO3 a 2 % em ácido pícrico a 0,5 %) foi colocado na tampa de uma placa de petri inoculada com isolados bacterianos. As placas foram incubadas a 28 ± 2 °C por 5 dias. A produção de HCN foi avaliada pela mudança de cor de papel de filtro amarelo para marrom avermelhado.

Ensaios para produção de poli-hidroxibutirato (PHB) e n-acil- homosserina lactona (AHL)

[00154] Os isolados bacterianos foram testados quanto à produção de PHB (qualitativa) seguindo os métodos de tingimento de colônia viáveis usando vermelho do Nilo e negro de Sudão B (Juan et al. 1998 Appl Environ Microbiol 64:4600-4602; Spiekermann et al. 1999, Arch Microbiol 171:73-80, cada um dos quais é incorporado por referência). As placas de LB com crescimento bacteriano noturno foram inundadas com negro de Sudão B a 0,02 % por 30 min e depois lavadas com etanol (96 %) para remover cepas em excesso a partir das colônias. As colônias de cor azul escuro foram tomadas como positivas para a produção de PHB. Similarmente, placas de LB alterada com vermelho do Nilo (0,5 μL mL-1) foram expostas à luz UV (312 nm) depois de crescimento bacteriano apropriado para detectar a produção de PHB. Colônias de cepas acumuladoras de PHA mostraram fluorescência sob luz ultravioleta. As cepas bacterianas foram testadas quanto à produção de AHL seguindo o método modificado de Cha et al. (1998), Mol PlantMicrobe Interact 11:1119-1129 (incorporado aqui por referência). As placas de LB contendo 40 μg ml-1 de X-Gal foram plaqueadas com cepas repórteres (A. tumefaciens NTL4.pZLR4). As placas de LB foram inoculadas por mancha com 10 μL de cultura bacteriana e incubadas a 28 ± 2 °C por 24 h. A atividade de produção de AHL atividade é indicada por uma zona azul difusa que circunda a mancha de teste da cultura. Agrobacterium tumefaciens NTL1 (pTiC58ΔaccR) foi usado como controle positivo e placa sem cepa repórter foi considerada como controle negativo.TABELA 4. Propriedades Bioquímicas Variadas de Bactérias Endofíticas

[00155] Como mostrado acima, as bactérias descritas aqui exibem graus variados de utilização de fosfato. Por exemplo, cepas FF34, FB12, FD17, S6, e S10 foram capazes de hidrolisar Ca3(PO4)2, CaHPO4, ftato de Ca e ftato de Na. Estas cepas, portanto, podem ser eficazes para aumentar a disponibilidade de fosfato para plantas hospedeiras sob condições de concentrações limitantes de fosfato solúvel no solo.

[00156] Sideróforos são compostos quelantes de ferro de afinidade alta, pequenos secretados por microrganismos tais como bactérias, fungos e sideróforos de gramíneas. Eles ligam-se à forma disponível de ferro Fe3+ na rizosfera, tornando-o assim não disponível aos fitopatógenos e protegendo a saúde da planta (Ahmad et al. 2008, Microbiol Res 163:173-181, incorporado aqui por referência). Sideróforos são conhecidos para mobilizar Fe e torna-lo disponível à planta. Várias das cepas, incluindo FA13, FF34, FC42, FB12, FD17 e S10 foram descobertas produzir níveis significantes de sideróforo quando testadas em meio de ágar contendo Chrom azurol S (CAS). Portanto, em uma modalidade, as cepas descritas acima são eficazes em aumentar a disponibilidade de ferro à planta hospedeira.

[00157] A capacidade das cepas bacterianas de utilizar ou metabolizar diferentes fontes de nitrogênio foi avaliada. Interessantemente, quatro das cepas testadas (FA13, FF34, FD17 e S6) foram capazes de cultivar em meio isento de nitrogênio, demonstrando sua capacidade de fixar nitrogênio. Portanto, em uma modalidade, estas cepas podem ser fornecidas em uma quantidade eficaz para aumentar a utilização de nitrogênio em uma planta hospedeira.

[00158] Sobrevivência e colonização bacterianas no ambiente da planta são necessárias para o crescimento e rendimento da planta. Recentemente, Zúniga e colegas (2013), Mol Plant-Microbe Interact 26:546-553 (incorporado aqui por referência) descreveram que o sistema de comunicação célula-a-célula (QS) mediado por AHL é implicado na competência da rizosfera e colonização de Arabidopsis thaliana por B. phytofirmans PsJN. Motilidade, estabilidade de agregado, e formação de biopelícula são traços importantes para a colonização de superfície de raiz (Danhorn e Fuqua 2007, Annu Rev Microbiol 61:401-422, incorporado aqui por referência). Três cepas (FB12, S6 e S10) foram descobertas produzir AHL. Deve ser observado, entretanto, que as bactérias descritas aqui podem ter outros sistemas de comunicação. Agregação e formação de biopelícula foram traços comuns em todas as cepas testadas. No caso de motilidade, seis cepas (FA13, FF34, FB12, FD17, S6 e S10) foram positivas para nado,enquanto FD17, S6 e S10 também mostraram formação de colônia. Portanto, em uma modalidade, as sementes são fornecidas com uma quantidade destas cepas em uma quantidade eficaz para produzir níveis detectáveis de AHL. Em uma outra modalidade, sementes de uma planta agrícola são fornecidas com uma quantidade da população de endófito bacteriano eficaz para formar biopelículas.

[00159] Bactérias foram testadas quanto à produção de exopolissacarídeo (EPS) e poli-hidroxibutirato (PHB). EPS e PHB bacterianos mostraram fornecer proteção a partir de tais insultos ambientais como dessecação, predação, e os efeitos de antibióticos (Gasser et al. 2009, FEMS Microbiol Ecol 70:142-150; Staudt et al. 2012, Arch Microbiol 194:197-206, cada um dos quais é incorporado por referência). Eles também podem contribuir para a agregação bacteriana, fixação à superfície, e simbiose de planta-micróbio (Laus et al. 2005, Mol Plant-Microbe Interact 18:533-538, incorporado aqui por referência). Cinco cepas (FF34, FB12, FD17, S2 e S6) mostraram produção de PHB, enquanto FA13, FC42, FD17 e S10 foramdescobertas produzir EPS. Portanto, em uma outra modalidade, sementes de uma planta agrícola são fornecidas com uma quantidade da população de endófito bacteriano eficaz para melhorar a tolerância à dessecação na planta hospedeira.

[00160] Compostos voláteis tais como amônia e HCN produzidos por várias rizobactérias foram relatados desempenhar um papel importante no biocontrole (Brimecombe et al. 2001, Em: Pinton R, Varanini Z, Nannipieri P (Eds.) The Rhizosphere, Marcel Dekker, New York, páginas 95 a 140, incorporado aqui por referência). A produção da amônia foi comumente detectada em todos os isolados selecionados. Ao contrário, apenas a cepa FB12 de Pseudomonas sp. foi capaz de produzir HCN. Entre as cepas testadas, apenas FB12 foi capaz de produzir HCN.

Atividades de Hidrólise Enzimática

[00161] Atividades de hidrólise bacteriana devido à amilase, celulase, quitinase, hemolítica, lipase, pectinase, protease e xilanase foram triadas em placas de diagnóstico depois da incubação a 28 °C. A atividade de amilase foi determinada em placas de ágar seguindo o protocolo Mannisto e Haggblom (2006), Syst Appl Microbiol 29:229-243, incorporado aqui por referência. A formação de halo opaco em torno de colônias foi usada como uma indicação da atividade de lipase. Atividades de celulase e xilanase foram avaliadas em placas contendo (por litro) 5 g de carboximetil celulose ou xilano de madeira de bétula, 1 g de peptona e 1 g de extrato de levedura. Depois de 10 dias de incubação, as placas foram imersas em coloração com iodo de gram e lavagem com NaCl 1M para visualizar a zona halo em torno do crescimento bacteriano (modificado de Teather and Wood 1982, Appl Environ Microbiol 43:777-780, incorporado aqui por referência). A atividade de quitinase dos isolados foi determinada como zonas de clarificação em torno de colônias seguindo o método de Chernin et al. (1998) J Bacteriol 180:4435-4441 (incorporado aqui por referência). A atividade hemolítica foi determinada semeando-se isolados bacterianos sobre placas de ágar de sangue de ovelha a 5 % Columbia. A atividade de protease foi determinada usando placas de ágar de leite desnatado a 1 %, enquanto a atividade de lipase foi determinada em meio de ágar de peptona. A formação de zona halo em torno de colônias foi usada como indicação de atividade (Smibert e Krieg 1994, Em: Gerhardt P, Murray R, Wood W, Krieg N (Eds) Methods for General and Molecular Bacteriology, ASM Press, Washington, DC, páginas 615 a 640, incorporado aqui por referência). A atividade de pectinase foi determinada em ágar nutriente suplementado com 5 g L-1 de pectina. Depois de 1 semana de incubação, placas foram inundadas com solução de brometo de hexadecil trimetil amônio a 2 % por 30 min. As placas foram lavadas com NaCl 1M para visualizar a zona halo em torno do crescimento bacteriano (Mateos et al. 1992, Appl Environ Microbiol 58:1816-1822, incorporado aqui por referência).TABELA 5. Atividades Enzimáticas de Bactérias Endofíticas

[00162] Todas as cepas mostraram atividade de lipase, enquanto apenas S10 produziu atividade de amilase. S2 e S4 produziu atividade de protease significante. A atividade de pectinase e fosfatase foi observada com cepas FF34, FB12, FD17, S6 e S10. Todas as cepas foram positivas para celulase e/ou xilanase exceto as cepas FF34 e S9. Quitinase foi produzida por cepas FB12, FD17 e S4, enquanto todas as cepas testadas, exceto para FC42 mostraram atividade hemolítica.

Atividades antagonísticas contra bactérias patogênicas de planta, fungos e oomicetos

[00163] As atividades antagonísticas de isolados bacterianos foram triadas contra bactérias patogênicas de planta (Agrobacterium tumefaciens, Pseudomonas syringae, Streptococcus pneumoniae), fungos (Fusarium caulimons, Fusarium graminarium, Fusarium oxisporum, Fusarium solani, Rhizoctonia solani, Thielaviopsis basicola) e oomicetos (Phytophthora infestans, Phytophthora citricola, Phytophthora cominarum). Para ensaios antibacterianos, os isolados bacterianos e patógeno foram cultivados em caldo de soja tríptico a 30 °C por 24 h. Os isolados bacterianos foram inoculados por mancha (alíquotas de 10 μL) em placas de TSA pré-semeadas com 100 μL de patógeno testado. As placas foram incubadas a 28 °C por 48 h e zonas claras de inibição foram registradas.

[00164] A atividade antagonística dos isolados bacterianos contra fungos e oomicetos foi provada pela técnica de cultura dupla em meios de ágar de dextrose de batata (PDA) e ágar de malte de levedura (YMA) (Dennis e Webster 1971, Trans Brit Mycol Soc 57:25-39, incorporado aqui por referência). Um disco pequeno (5 mm) de fungo/oomicetos alvos foi colocado no centro de placas de petri de ambos os meios. Alíquotas de 10 μL de culturas bacterianas noturnas cultivadas em caldo de soja tríptico foram manchadas 2 cm longe do centro. Placas foram incubadas por 14 dias a 24 °C e zonas de inibição foram registradas.TABELA 6. Atividade Antimicrobiana por Bactérias Endofíticas

Ensaios de auxina, acetoína, e sideróforo para S4, S9 e S10

[00165] Para o ensaio de auxina, 1 μl de culturas cultivadas durante a noite de cepas bacterianas endofíticas foram inoculadas em 750 μl de caldo de R2A suplementado com L-TRP (5 mM) em 2 mL de placas de cultura de 96 reservatórios. As placas foram seladas com a membrana respirável e incubadas a 23 °C com agitação constante a 200 rpm por 4 dias. Depois de 4 dias, 100 μL de cada cultura foram transferidos para uma placa de 96 reservatórios. 25 μL de reagente de Salkowski (1 mL de solução a 0,5 M de FeCl3 a 50 mL de HClO4 a 35 %) foram adicionados em cada reservatório e as placas foram incubadas no escuro por 30 minutos antes de fotografar e medir a absorção a 540 nm usando o leitor de placa SpectraMax M5 (Molecular Devices).

[00166] Para medições de acetoína, cepas microbianas foram cultivadas como descrito acima em caldo de R2A suplementado com glicose a 5 %. Depois de 4 dias, 100 μL de cada cultura foram transferidos para uma placa de 96 reservatórios e misturados com 25 μL de Reagentes de Barritt (Ver o Exemplo 3) e 525 nm de absorção foram medidos.

[00167] Para medições de sideróforo, cepas microbianas foram cultivadas como descrito acima em caldo de R2A. Depois de 3 dias de incubação a 28 °C sem agitação, a cada reservatório foram adicionados 100 ul de preparação de O-CAS sem agente gelificante [Perez-Miranda et al. (2007), J Microbiol Methods 70: 127-131, incorporado aqui por referência]. Novamente usando o artigo de vidro limpo, 1 litro de cobertura de O-CAS foi preparado misturando-se 60,5 mg de Chrome azurol S (CAS), 72,9 mg de brometo de hexadeciltrimetil amônio (HDTMA), 30,24 g de ácido piperazina-1,4-bis-2-etanossulfônico finamente triturado (PIPES) com 10 ml de FeCl3^6H2O a 1 mM em solvente de HCl a 10 mM. O PIPES teve que ser finamente empoado e misturado suavemente com agitação (não vibração) para evitar produzir bolhas, até que uma cor azul escuro fosse obtida. 15 minutos depois de adicionar o reagente a cada reservatório, a mudança de cor foi registrada procurando-se por halos púrpuras (sideróforos do tipo catecol) ou colônias laranjas (sideróforos de hidroxamato) em relação ao azul profundo do O-Cas.

[00168] Os resultados dos ensaios de auxina, acetoína e sideróforo são apresentados na tabela 7.TABELA 7: Produção de auxina, acetoína e sideróforo por bactérias endofíticas

Uso de substrato por bactérias endofíticas S4, S9 e S10

[00169] Além de determinar se as cepas bacterianas produzem auxina, acetoína, e sideróforos, a capacidade das várias cepas de cultivar em vários substratos foi determinada. Culturas líquidas de bactérias foram primeiro sonicadas para obter homogeneidade. 1 mL de cultura de cada cepa foi colhido por centrifugação por 10 minutos a 4500 RPM e subsequentemente lavado três vezes com água destilada estéril para remover quaisquer traços de meios residuais. Amostras bacterianas foram recolocadas em suspensão em estéril água destilada a um OD590 final de 0,2. Medições de absorbância foram tomadas usando um leitor de microplaca SpectraMax M (Molecular Devices, Sunnyvale, CA).

[00170] Ensaios de substrato de carbono único foram feitos usando BIOLOG Phenotype MicroArray (PM) 1 e 2A MicroPlates (Hayward, CA). Uma alíquota de cada cultura de célula bacteriana (2,32 mL) foi inoculada em 20 mL de fluido de inoculação de base estéril SE-0a GN/GP (SE-0), 0,24 mL de Corante F 100X obtido a partir de BIOLOG, e levada a um volume final de 24 mL com água destilada estéril. Ensaios de PM1 e PM2A de controle negativo também foram feitos similarmente menos células bacterianas para detectar reações abióticas. Uma alíquota de cultura fúngica (0,05 mL) de cada cepa foi inoculada em 23,95 mL de meio FF-SE obtido a partir de BIOLOG. Suspensões de célula bacteriana foram agitadas de modo a obter uniformidade. Cem microlitros da suspensão de célula bacteriana foram adicionados por reservatório usando um pipetador de multicanal às MicroPlacas PM1 e PM2A BIOLOG de 96 reservatórios de modo que todas continham 95 fontes de carbono e um reservatório com apenas água (controle negativo).

[00171] MicroPlates foram seladas em fita cirúrgica de papel (Dynarex, Orangeburg, NY) para impedir efeitos de borda de placa, e incubadas estacionárias a 24 °C em um recipiente fechado por 70 horas. A absorbância a 590 nm foi medida para todas as MicroPlates no final do período de incubação para determinar a utilização de substrato de carbono para cada cepa e normalizada em relação ao reservatório de controle negativo (água apenas) de cada placa (Garland e Mills, 1991; Barua et al., 2010; Siemens et al., 2012; Blumenstein et al., 2015). Os ensaios bacterianos também foram calibrados contra os dados de MicroPlates PM1 e PM2A de controle negativo (nenhuma célula) para corrigir quanto a quaisquer desvios introduzidos pelos meios na análise colorimétrica (Borglin et al., 2012). Valores de absorbância corrigidos que foram negativos foram considerados como zero para análise subsequente (Garland e Mills, 1991; Blumenstein et al., 2015) e um valor limiar de 0,1 e acima foi usado para indicar a capacidade de uma cepa bacteriana particular de usar um substrato de carbono dado (Barua et al., 2010; Blumenstein et al., 2015). Adicionalmente, MicroPlates bacterianas foram visualmente examinadas quanto à formação irreversível de cor violeta em reservatórios indicando a redução do corante redox de tetrazólio a formazan que resulta da respiração celular (Garland e Mills, 1991).

[00172] Os resultados destes ensaios são mostrados nas tabelas 8 (MicroPlates PM1 BIOLOG) e 9 (MicroPlates PM2A BIOLOG).TABELA 8: Utilização de substrato de certas cepas endofíticas como determinado por MicroPlates PM1 BIOLOG.

Exemplo 2: Efeito de cepas endofíticas sobre a germinação do milho

[00173] Inoculantes das cepas selecionadas foram preparados em 50 mL de caldo de soja tríptico em frascos Erlenmeyer de 100 mL e incubados a 28 ± 2 °C por 48 h na incubadora de agitação orbital (VWR International, GmbH) a 180 r min-1. A densidade óptica do caldo foi ajustada para 0,5 medida a 600 nm usando espectrofotômetro (Gene Quant Pro, Gemini BV, The Netherlands) para obter uma população uniforme de bactérias (108 a 109 unidades de formação de colônia (CFU) mL-1) no caldo no momento da inoculação. Mais cientificamente, células bacterianas colhidas podem ser recolocadas em suspensão na solução salina tamponada com fosfato. A densidade de inóculo ajusta usando um espectrofotômetro para obter a densidade da população (Pillay e Nowak 1997, Can J Microbiol 43:354-361, incorporado aqui por referência).

[00174] Sementes de milho foram esterilizadas na superfície com etanol a 70 % (3 min), tratadas com NaOHCl a 5 % por 5 min, e seguido por lavagem 3 vezes com água destilada estéril (1 min cada vez). A eficácia da esterilização de superfície foi verificada plaqueando-se a semente, e alíquotas do enxágue final sobre placas de LB. Amostras foram consideradas como sendo esterilizadas quando nenhuma colônia foi observada nas placas de LB depois da inoculação por 3 dias a 28 °C. Sementes desinfectadas na superfície de diferentes cultivares de milho (Helmi, Morignon, Pelicon, Peso e Cesor) foram imersas nas suspensões bacterianas por 30 min. As sementes bacterizadas foram depositadas sobre placas de ágar de água mole (0,8 %, p/v de ágar) e as placas foram colocadas no escuro na temperatura ambiente (24 ± 2 °C). Depois de 96 h a porcentagem das sementes germinadas foi registrada. Sementes esterilizadas na superfície, mas não bacterizadas (tratadas em caldo de soja tríptico), serviram como o controle de germinação.

[00175] A inoculação de sementes de milho com bactérias endofíticas aumentou a taxa de germinação de todos os cultivares em 20 a 40 % comparado ao controle não inoculado. Aumento máximo foi observado por inoculação com a cepa FD17 (40 %) em cv de milho. Morignon seguido por cepas FF34, FA13, FB12 e FC42 (dados não mostrados).

[00176] Em outros experimentos, sementes de diferentes cultivares de milho (Palazzo & die Samba), e Tomate (Red Pear e Gartenfreund) foram usados para testar quanto à promoção da germinação. Os resultados, fornecidos abaixo na tabela 10, mostram que virtualmente todas as cepas mostram um aumento acentuado nas taxas de germinação. Para milho, sementes de Palazzo inoculadas com as cepas FA13, FF34, S2, S6, S9 e S10 mostram mais do que 90 % de germinação depois de quatro dias, como mostraram as sementes de die Samba inoculadas com sementes de FF34 e S9. Para tomate, sementes de Red Pear inoculadas com as cepas FB12, FF34, S6 e S10 mostraram taxa de germinação de 90 % ou maior depois de 12 dias.TABELA 10. Taxa de germinação de sementes de milho e tomate inoculadas com endófitos

Exemplo 3: Triagem in vitro de cepas eficientes em plantas de milho

[00177] Um experimento em câmara de crescimento foi conduzido em milho para triar as cepas selecionadas quanto à sua atividade promotora de crescimento sob condições gnotobióticas. Nós usamos tubos de vidro especialmente projetados com aro de contas (Duran group, DURAN GmbH, Mainz, Germany) para o experimento. Os tubos de vidro foram cobertos com tampa para gerar condições completamente axênicas (nenhuma exposição a nenhum fator ambiental). A produção de inoculante bacteriano e tratamento de semente foram feitos como descrito acima. Como controle, sementes foram tratadas com caldo de soja tríptico esterilizado. Sementes tratadas foram colocadas sobre placas de ágar de água para germinação. Depois de 5 dias, as mudas germinadas (3 a 5 cm de comprimento) foram transferidas nos tubos de vidro esterilizados contendo meio MS (Murashige e Skoog) de 20 ml esterilizado (Duchefa Biochemie, The Netherlands) (4,8 g L-1) e colocadas a 25 ± 2 °C ajustados a um período de iluminação de 16 h e escuridão de 8 h, com uma intensidade luminosa de 350 μmol m-2 s-1. Dados com respeito ao comprimento e biomassa do broto/raiz foram registrados depois de 24 dias. A colonização de cepas inoculantes foi registrada por re-isolamento dos endófitos. Um g de broto de planta foi homogeneizado com um almofariz e pistilo em 4 ml de solução de NaCl a 0,9 % (p/v). O número de endófitos cultiváveis em broto de milho, expressado em CFU por grama (peso fresco), foi determinado difundindose diluição serial até 10-4 (0,1 mL) de material vegetal esterilizado na superfície homogeneizado sobre meio de ágar TSA (DIFCO Laboratories, Detroit, Michigan). Quatro réplicas para cada tratamento foram difundidas nas placas de ágar e incubadas por 5 dias a 28 °C. Vinte colônias por tratamento foram aleatoriamente selecionadas e sua identidade com a cepa inoculante foi confirmada por análise de polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição (RFLP) da região de espaçador intergênico de rRNA 16S-23S (IGS) (Reiter et al. 2001, Appl Environ Microbiol 68:2261-2268, incorporado aqui por referência).

[00178] Todas as cepas aumentaram significativamente o crescimento da muda comparado ao controle. Como mostrado nas Figuras 1A-1C, todas as cepas promoveram significativamente a produção de biomassa, com aumentos tanto em raiz, broto quanto biomassa global. Ainda que as respostas fossem variáveis, as cepas geralmente aumentaram o comprimento da raiz e broto em todos os três cultivares de milho testados.

[00179] Em seguida, a colonização de plantas foi testada quanto à todas as cepas bacterianas. Como mostrado na tabela 11, cepas FA13, FF34, FC42, FB12 e FD17 colonizaram com êxito plantas de milho, mostrando colonização bem-sucedida das várias cepas, como detectado no tecido de broto de vários cultivares de milho. A quantidade de bactérias detectáveis no tecido de broto variou, variando de 1,58 x 104 em cultivar de Helmi inoculado com FB12, a 1,83 x 107 CFU encontrado em peso de cultivares inoculados com FF34. Portanto, os micróbios descritos aqui, quando contatados com sementes de plantas, são capazes de colonizar a planta como detectável, neste caso, no tecido de broto. Além disso, a colonização de cultivares de milho Kolea, Mazurka e DaSilvie por cepas S2, S4, S6, S9 e S10 foi confirmada isolando-se as células bacterianas a partir de homogeneizados de tecido de broto esterilizado na superfície de plantas cultivadas a partir de sementes inoculadas em placas de ágar de soja tríptico por dois dias em 28 °C e testando-se a identidade de colônias com sequenciamento de região IGS para confirmar a presença do micróbio. Cepas S2, S4, S6, S9 e S10 foram recuperadas com êxito dos tecidos destes cultivares (dados não mostrados).TABELA 11. Colonização de Plantas de Milho por Bactérias Endofíticas

Taxas de Condutância Estomática e Fotossíntese

[00180] Plantas de milho inoculadas com as cepas descritas aqui foram testadas quanto à fotossíntese e condutância estomática. Como mostrado na Figura 2, plantas de milho inoculadas com as cepas exibem um aumento na condutância estomática quando comparado com controles não inoculados (variando de um aumento de 36 % a 49 %), com cepas S2, S6, S9 exibindo o nível mais alto de condutância. Portanto, existe um aumento apreciável na condutância estomática conferido pelas bactérias da presente invenção.

[00181] Plantas de milho inoculadas com cepa também foram testadas quanto a taxas fotossintéticas. Como mostrado na Figura 3, toda as cepas conferiram taxas de fotossíntese aumentadas quando comparado com plantas de controle em todos os três cultivares de milho testados (cultivares DaSilvie, Mazurka e Kolea; média de três cultivares mostrados), com um aumento variando de 17 % em controles (para cepas S9 e S10) a acima de 23 % em controles (cepa S6). Portanto, as cepas bacterianas endofíticas descritas acima conferem taxas de fotossíntese aumentadas nas plantas hospedeiras.

Exemplo 4: Experimento em estufa com rede

[00182] Na base dos resultados a partir de testes realizados sob condições axênicas no exemplo 3, a cepa FD17 foi selecionada quanto a outra avaliação em uma experiência em vaso, em que plantas foram cultivadas em recipientes grandes expostos a condições ambientais naturais.

[00183] Plantas de milho foram cultivadas em solo coletadas a partir de campos agrícolas (milho) em Fischamend, Lower Austria, Austria. O solo foi franco-argilo-limoso e teve as características seguintes: 12 % de areia, 61 % de limo, 27 % de argila, pH 6,5, 3,3 % de carbono total, 0,18 % de nitrogênio total, 0,13 mg g-1 de fósforo disponível, 0,066 mg g-1 de potássio extraível.

[00184] Sementes desinfetadas na superfície de dois cultivares de milho (Morignon e Peso) foram imersas em suspensão bacteriana (preparada como descrito acima) por 1 h. Para o controle não inoculado, sementes foram tratadas com caldo de soja tríptico esterilizado. Sementes foram semeadas em uma bandeja plástica (limpa com etanol) e mudas de 12 dias de idade foram transferidas em recipientes cheios com 45 kg de solo (2 plantas em cada recipiente) e colocadas em uma estufa com rede e expostas a condições ambientais naturais.

[00185] Condições climáticas, isto é, precipitação, temperatura e umidade relativa foram registradas por ‘Zentralanstalt für Meteorologie und Geodynamik’ (ZAMG) durante o período de crescimento da safra e descritas nas Figuras 1A a 1C. Houve três réplicas e os vasos foram arranjados em um projeto completamente randomizado. A dose recomendada de fertilizantes de NPK [(160-100-60 kg ha-1) foram aplicadas em cada recipiente e água de torneira foi aplicada ao recipiente para irrigação sempre que necessário.

[00186] Dados de eficiência fotoquímica de PSII foram registrados no estágio de floração usando PEA prático (Hansatech Instruments Ltd. England) em meados de Julho onde a temperatura do tempo do dia variou de 30 a 35 °C. A eficiência de PSII em termos de Fv/Fm foi calculada a partir dos dados. Parâmetros que contribuem para o crescimento e rendimento foram registrados em maturidade. As plantas foram colhidas 140 dias depois do plantio. A Figura 4 mostra a eficiência de PS II de plantas de milho inoculadas com as populações de endófito bacteriano descritas aqui.

[00187] Plantas de milho inoculadas com os endófitos bacterianos S2, S4, S6, S9, S10 e FD17 foram testadas quanto à área da folha aumentada. Como mostrado na Figura 5, e na tabela 12, todos as cepas testadas aumentaram a área da folha significativamente sobre os controles.

[00188] Similarmente, plantas de milho inoculadas com as cepas mostraram um aumento dramático no teor de clorofila (Figura 6) sobre plantas de controle, com os níveis mais altos encontrados em plantas inoculadas com S6.

[00189] A Tabela 12 abaixo mostra o efeito de inoculação de FD17 sobre a fisiologia, parâmetros de crescimento e rendimento de dois cultivares de milho cultivados em solo de campo e expostos a condições climáticas naturais. A inoculação com cepa FD17 levou a um aumento significante na área da folha de ambos os cultivares (20 % e 13 %, respectivamente). Similarmente, a biomassa (peso seco da folha) foi aumentada em 27 % e 23 % nos cultivares Peso e Morignon, respectivamente, quando comparado ao controle. Além disso, biomassa seca da planta e raiz e altura da planta foram significativamente realçadas, como foi o peso de sabugo médio (35 % e 42 % de aumento em Peso e Morignon, respectivamente, quando comparado ao controle). A cepa FD17 também afeitou significativamente outras características fisiológicas da planta: por exemplo, houve um aumento significante na fluorescência da clorofila (até um de 9 % no cultivar Peso e Morignon) e um tempo encurtado antes do início da floração (até 10 dias no cultivar Peso e Morignon).TABELA 12: Efeito da inoculação com cepa FD17 endofítica sobre a fisiologia, parâmetros de crescimento e rendimento de dois cultivares de milho cultivados em vasos em solo de campo e expostos a condições climáticas naturais (experimento em estufa com rede)

[00190] Rizosfera e colonização endofítica de raízes, caules e folhas pela cepa inoculante foram determinadas por contagem de placa usando placas de TSA. Amostras de raiz, caule e folha foram lavadas, esterilizadas na superfície (como descrito acima) e usadas para recuperação de cepa inoculante (colonização). Para isto, amostras foram trituradas em solução de NaCl a 0,9 % (p/v), agitadas com um pulsifier (Microgen Bioproducts Ltd., UK) por 30 s e diferentes diluições foram difundidas sobre placas de TSA. Colônias bacterianas foram contadas depois de 4 dias de incubação a 28 ± 2 °C. As colônias selecionadas foram identificadas e confirmadas por análise de RFLP com base em região de IGS.

[00191] A capacidade da cepa FD17 de colonizar vários tecidos da planta hospedeira, assim como a rizosfera que circunda a planta, foi examinada. Como mostrado na tabela 13 abaixo, sementes de dois cultivares de milho diferentes inoculados com a cepa FD17 resultaram em colonização detectável, eficaz no interior da raiz, broto e folha. Portanto, as sementes foram tratadas com uma quantidade da bactéria endofítica que é suficiente para colonizar os tecidos da folha, raiz e broto. Surpreendentemente, a rizosfera também teve níveis significantes de FD17 detectável. Isto sugere que os efeitos benéficos de cepas bacterianas endofíticas tais como FD17 podem estar exercendo efeitos externamente à planta. Como descrito em outra parte, as bactérias descritas aqui são capazes de produzir compostos que permitem a disponibilidade aumenta de nutrientes limitantes tais como fosfato e ferro. As cepas podem estar presentes sobre a superfície das sementes em uma quantidade suficiente para colonizar eficientemente a planta, mas também a rizosfera adjacente. A presença de quantidades significantes de bactérias detectáveis na rizosfera eleva a possibilidade interessante de que as sementes podem ser tratadas com os micróbios em sua superfície ou dentro da semente em uma quantidade suficiente para alterar a rizosfera da planta, desse modo alterando o solo em torno da planta, e que o torna mais hospitaleiro para a planta.TABELA 13. Colonização da cepa FD17 em rizosfera raiz, caule e folhas de dois cultivares de milho (experimento em wire-house)

ANÁLISES ESTATÍSTICAS

[00192] Os dados de parâmetros de crescimento da planta e colonização foram submetidos a análises de variância. As médias foram comparadas pelo teste de Diferença Significante Mínima (LSD) (p < 0,05) para detectar a significância estatística entre o tratamento (Steel et al. 1997, Principles and procedures of statistics: A biometrical approach. 3a ed. McGraw-Hill Book Int. Co., Singapore, incorporado aqui por referência). Todas as análises estatísticas foram conduzidas usando o software SPSS versão 19 (IBM SPSS Statistics 19, USA).

Exemplo 5: Experiências de campo na Áustria Métodos:

[00193] Quatro variedades de milho foram cultivadas em dois locais na Áustria. Seis lotes de réplica foram semeados para cada tratamento e combinação de variedade. Lotes de controle foram plantados com sementes tratadas com formulação (20 mM de tampão de fosfato pH 7, 3 % de sacarose, 1 % de alginato de sódio).

[00194] Sementes foram semeadas em um campo de sequeiro em lotes arranjados em um projeto de bloco completo randomizado. A cor da folha foi visualmente avaliada em um dos dois locais e classificada de 1 a 3 verde claro a verde escuro. Floração tanto masculina quanto feminina foi visualmente classificada de 0 a 2 (0 = não visível, 1 = flor visível, 2 = flor completamente desenvolvida). Milho foi colhido manualmente durante 4 m de filas internas. O peso do grão por e umidade do grão por lote foram registrados assim como o número de espigas colhidas por lote. O rendimento foi calculado como peso de grão por lote dividido pelo número de espigas colhidas e ajustado quanto ao teor de umidade a uma umidade em armazenamento de 14 % (isto é peso seco de grão por espiga em g).

[00195] Resultados: Como mostrado na tabela 14, nenhuma diferença relacionada ao tratamento foi evidente para emergência da muda, LAI, cor, altura e desenvolvimento de flor feminina. Um leve aumento no desenvolvimento de flor masculina foi registrado. Nenhuma diferença relacionada ao tratamento foi evidente para o rendimento medido como grãos secos por espiga em g.Tabela 14. Experiências em campo de sequeiro na Áustria.

Exemplo 6: Experiências de campo nos EUA em milho Métodos:

[00196] Duas variedades de milho foram cultivadas em um local nos Estados Unidos em uma experiência irrigada. Seis lotes de réplica foram semeados para cada tratamento e combinação de variedade. Lotes de controle foram plantados para sementes tratadas com formulação (20 mM de tampão de fosfato pH 7, 3 % de sacarose, 1 % de alginato de sódio).

[00197] Sementes foram semeadas em um campo irrigado em lotes de 10 por 40 ft arranjados em um projeto de bloco completo randomizado com um semeador de cone JD 7100 e plantadores de semeador de caixa respectivamente. Quatro fileiras foram plantadas por lote com um espaçamento de fileira de 30 polegadas. A densidade da semeadura foi de 35.000 sementes por acre. As 2 fileiras interiores foram colhidas por debulhadora e 10 espigas individuais foram colhidas manualmente a partir das fileiras exteriores. O rendimento de grão por lote, umidade de grão, e peso de teste foram avaliados. O rendimento foi ajustado para o teor de umidade do grão para uma umidade em armazenamento de 14 % (isto é, alqueires secos por acre para ceifeira- debulhadora e grãos secos por espiga em g para colheita manual).

[00198] Resultados: Como mostrado na tabela 15, S4, S10, FD17 mostraram impactos positivos sobre o rendimento de colheita manual de até 10 g por espiga. Nenhum dos tratamentos mostrou uma diferença quando colhidos por debulhadora.TABELA 15. Medidas de experiência de campo agregaram sobre ambas as variedades.

Exemplo 7: Experiências de campo nos EUA em trigo de primavera Métodos:

[00199] Uma variedade de trigo de primavera foi cultivada em um local nos Estados Unidos. Seis lotes de réplica foram semeados para cada tratamento e combinação de variedade. Lotes de controle foram plantados para sementes tratadas com formulação (20 mM de tampão de fosfato pH 7, 3 % de sacarose, 1 % de alginato de sódio).

[00200] Sementes foram semeadas com uma perfuração de planície excelente em campo irrigado ou campo de sequeiro em lotes de 10 por 40 ft arranjados em um projeto de bloco completo randomizado. 7 fileiras foram plantadas por lote com um espaçamento de fileira de 17 polegadas e uma densidade de semeadura foi 60 libras por acre para campo de sequeiro. Trigo foi colhido por debulhadora sobre a área de lote inteira. O rendimento de grão por lote, umidade de grão, e peso de teste foram avaliados. O rendimento foi ajustado para teor de umidade do grão para uma umidade em armazenamento de 13 % (isto é, alqueires secos por acre).

[00201] Resultados: Os resultados de rendimento de debulhadora são mostrados na tabela 16. S6, S10 e S4 mostraram leves tendências positivas até 2 alqueires por acre, enquanto S9 mostrou um aumento de rendimento estatisticamente significante de 2 alqueires por acre ou 4 alqueires por acre comparado aos controles de formulação respectivamente.TABELA 16. Unidades: rendimento de Debulhadora (alqueires secos por acre).

Exemplo 8: Experiências de campo na Argentina em milho Métodos:

[00202] Duas variedades de milho foram cultivadas em um local na Argentina. Dez lotes de réplica foram mostrados para cada tratamento e combinação de variedade. Lotes de controle foram plantados para sementes tratadas com formulação (20 mM de tampão de fosfato pH 7, 3 % de sacarose, 1 % de alginato de sódio).

[00203] Sementes foram semeadas com um plantador de cone em um campo irrigado com gotejamento. O campo foi localizado em um ambiente extremamente árido e recebeu irrigação alvejada em 80 % de evapotranspiração de modo a criar um ambiente com estresse por água manejada designado para reduzir o rendimento em torno de 20 %. Lotes foram 5 X 3 m em tamanho e arranjados em blocos retangulares em um projeto de bloco completo randomizado. Quatro fileiras foram plantadas por lote com um espaçamento de fileira de 70 cm e um espaçamento de semente dentro da fileira de 15 cm. A biomassa acima e abaixo do nível do solo foi avaliada quanto a 10 plantas por lote um mês depois da semeadura. A data em que 50 % das plantas por lote atingiram floração foi visualmente avaliada. As duas fileiras interiores foram colhidas por debulhadora. O rendimento de grão por lote, umidade de grão e peso de teste foram avaliados. O rendimento foi ajustado para teor de umidade do grão para uma umidade em armazenamento de 14 % (isto é alqueires secos por acre).

[00204] Resultados: Nesta experiência com estresse de água moderado, S4 e S9 mostraram um impacto positivo sobre a biomassa acima do nível do solo até 30 g comparado ao controle de formulação (Tabela 17). S4 mostrou um aumento positivo na biomassa abaixo do nível do solo comparado ao controle de formulação até 6 g. S4, S9 e S10 mostraram um aumento positivo no rendimento comparado aos controles de formulação de até 19 alqueires por acre.TABELA 17. Experiência de estresse por água moderada manejada. Unidades: Biomassa (g), rendimento de Debulhadora (alqueires secos por acre).

Claims

1. Método para preparar uma combinação sintética compreendendo uma semente de milho e uma população bacteriana endofítica, caracterizado pelo fato de que compreende aplicar a uma superfície exterior da semente de milho uma formulação compreendendo uma população bacteriana endofítica consistindo em uma bactéria endofítica compreendendo uma espécie Acinetobacter compreendendo uma sequência de ácido nucleico de rRNA 16S compreendendo uma sequência de ácido nucleico consistindo em SEQ ID NO: 9; em que a formulação compreende 108 - 109 unidades formadoras de colônia (UFC) mL-1 da população bacteriana endofítica.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a população bacteriana endofítica é aplicada em uma quantidade eficaz para colonizar o tecido da parte aérea de uma planta cultivada a partir da semente, quando comparada com uma planta agrícola de referência cultivada nas mesmas condições.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a população bacteriana endofítica é aplicada em uma quantidade eficaz para aumentar as taxas fotossintéticas de uma planta cultivada a partir de sementes em pelo menos 17% quando comparada com uma planta agrícola de referência cultivada nas mesmas condições.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a população bacteriana endofítica é aplicada em uma quantidade eficaz para aumentar a taxa de germinação de sementes de uma planta cultivada a partir de sementes em pelo menos 20% quando comparada com uma planta agrícola de referência cultivada nas mesmas condições.

5. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a população bacteriana endofítica é aplicada em uma quantidade eficaz para aumentar a taxa de germinação de sementes de cultivares de milho Helmi, Morignon, Pelicon, Peso e Cesor cultivados a partir da semente em pelo menos 20% quando comparadas com uma planta agrícola de referência cultivada nas mesmas condições.

6. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a população bacteriana endofítica é aplicada em uma quantidade eficaz para aumentar a taxa de germinação de sementes de Palazzo e os cultivares de milho Samba cultivadas a partir da semente em pelo menos 32% quando comparadas com uma planta agrícola de referência cultivada sob as mesmas condições.

7. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a população bacteriana endofítica é aplicada em uma quantidade eficaz para aumentar a biomassa radicular de uma planta cultivada a partir da semente em condições gnotobióticas quando comparada com uma planta agrícola de referência cultivada nas mesmas condições.

8. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a população bacteriana endofítica é aplicada em uma quantidade eficaz para aumentar a biomassa total de uma planta cultivada a partir da semente em condições gnotobióticas quando comparada com uma planta agrícola de referência cultivada nas mesmas condições.

9. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a população bacteriana endofítica é aplicada em uma quantidade eficaz para colonizar o tecido de broto dos cultivares Kolea, Mazurka e DaSilvie de milho cultivado a partir da semente quando comparado com uma planta agrícola de referência cultivada nas mesmas condições.

10. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a população bacteriana endofítica é aplicada em uma quantidade eficaz para aumentar a condutância estomática de uma planta cultivada a partir de sementes em 43% quando comparada com uma planta agrícola de referência cultivada sob as mesmas condições.

11. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a população bacteriana endofítica é aplicada em uma quantidade eficaz para aumentar as taxas de fotossíntese em 17% nos cultivares DaSilvie, Mazurka e Kolea cultivados a partir da semente, quando comparadas com uma planta agrícola de referência cultivada nas mesmas condições.

12. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a população bacteriana endofítica é aplicada em uma quantidade eficaz para aumentar a eficiência fotoquímica de uma planta cultivada a partir de sementes em 7% quando comparada com uma planta agrícola de referência cultivada nas mesmas condições.

13. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a população bacteriana endofítica é aplicada em uma quantidade eficaz para aumentar a área foliar de uma planta cultivada a partir de sementes em 18% quando comparada com uma planta agrícola de referência cultivada nas mesmas condições.

14. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a população bacteriana endofítica é aplicada em uma quantidade eficaz para aumentar o teor de clorofila de uma planta cultivada a partir de sementes em 10% quando comparada com uma planta agrícola de referência cultivada nas mesmas condições.

15. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a população bacteriana endofítica é aplicada em uma quantidade eficaz para aumentar a taxa de germinação de sementes de uma planta cultivada a partir da semente, quando comparada com uma planta agrícola de referência cultivada nas mesmas condições; e a população bacteriana endofítica é aplicada em uma quantidade eficaz para aumentar a biomassa radicular de uma planta cultivada a partir da semente em condições gnotobióticas quando comparada com uma planta agrícola de referência cultivada nas mesmas condições; e a população bacteriana endofítica é aplicada em uma quantidade eficaz para aumentar a biomassa total de uma planta cultivada a partir da semente em condições gnotobióticas, quando comparada com uma planta agrícola de referência cultivada nas mesmas condições; e a população bacteriana endofítica é aplicada em uma quantidade eficaz para colonizar o tecido de broto de uma planta cultivada a partir da semente, quando comparada com uma planta agrícola de referência cultivada nas mesmas condições; e a população bacteriana endofítica é aplicada em uma quantidade eficaz para aumentar a condutância estomática de uma planta cultivada a partir da semente, quando comparada com uma planta agrícola de referência cultivada nas mesmas condições; e a população bacteriana endofítica é aplicada em uma quantidade eficaz para aumentar as taxas de fotossíntese em uma planta cultivada a partir da semente, quando comparada com uma planta agrícola de referência cultivada nas mesmas condições; e a população bacteriana endofítica é aplicada em uma quantidade eficaz para aumentar a eficiência fotoquímica de uma planta cultivada a partir da semente, quando comparada com uma planta agrícola de referência cultivada nas mesmas condições; e a população bacteriana endofítica é aplicada em uma quantidade eficaz para aumentar a área foliar de uma planta cultivada a partir da semente, quando comparada com uma planta agrícola de referência cultivada nas mesmas condições; e a população bacteriana endofítica é aplicada em uma quantidade eficaz para aumentar o teor de clorofila de uma planta cultivada a partir da semente, quando comparada com uma planta agrícola de referência cultivada nas mesmas condições.