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KR100523991B1 - 신규한 미생물을 이용한 식물 병원균에 대한 항균활성 및 식물 생육 촉진 효과를 갖는 생물학적 제제의 제조방법과 이를 이용한 식물 재배방법 - Google Patents

신규한 미생물을 이용한 식물 병원균에 대한 항균활성 및 식물 생육 촉진 효과를 갖는 생물학적 제제의 제조방법과 이를 이용한 식물 재배방법 Download PDF

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KR100523991B1
KR100523991B1 KR10-2003-0075077A KR20030075077A KR100523991B1 KR 100523991 B1 KR100523991 B1 KR 100523991B1 KR 20030075077 A KR20030075077 A KR 20030075077A KR 100523991 B1 KR100523991 B1 KR 100523991B1
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Abstract

본 발명은 식물의 생물학적 제제의 제조방법 및 이를 이용한 식물재배방법에 관한 것이다.
본 발명은 신규한 균주 브르크호데리아 속 AK-17(Burkhoderia sp.AK-17) KACC91058 균주를 배양하고, 상기 배양물로부터 식물 병원균에 대한 항균활성 및 식물의 생육 촉진 효과를 갖는 생물학적 제제의 제조방법 및 이를 이용한 식물재배방법을 제공한다.
본 발명은 식물 병원균에 대한 항균활성 및 식물의 생육을 촉진하는 작용이 있기 때문에, 농약의 잔류독성에 대한 위험성이 없는 고품질 청정 농산물의 생산이 가능하고, 생육 촉진효과로 출하시기를 단축하고, 수확량도 증대시킬 수 있는 효과가 있다.

Description

신규한 미생물을 이용한 식물 병원균에 대한 항균활성 및 식물 생육 촉진 효과를 갖는 생물학적 제제의 제조방법과 이를 이용한 식물재배방법{Method for preparing biological material having antimicrobial against pathogen and growth stimulator for plant, and for cultivating it thereof}
본 발명은 식물의 생물학적 제제의 제조방법 및 이를 이용한 식물재배방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 신규한 미생물을 이용하여 식물 병원균에 대한 항균 활성 및 식물 생육 촉진의 효과를 갖는 생물학적 제제의 제조방법과 이를 사용한 식물의 재배방법과 이로부터 제조된 생물학적 제제에 관한 것이다.
들깨는 동부 아시아지역이 원산지로 추정되고 있으며, 현재는 인도, 소련 및 미국에 걸쳐 세계적으로 널리 분포, 재배되어지고 작물이며, 우리나라에는 통일신라시대 때부터 재배되어 왔다.
최근 식생활의 변화와 들깻잎의 유효성분들에 대한 생리활성효과가 밝혀짐으로써 들깻잎의 소비가 급증하고 있으며, 전국에 걸쳐 재배면적도 매년 증가하여 재배되고 있는 실정이다.
그러나, 수요의 급증에 따른 안정적 공급을 위해서는 시설재배 등을 이용한 연중재배가 필요하게 되었으며, 화학 비료와 농약의 과다사용이 불가피한 상황이 발생하게 되었다.
이러한 문제점은 재배토양과 수질을 오염시키는 원인뿐만 아니라 시설재배에서 농약의 과다사용은 재배환경 열악으로 생산자의 건강을 해치게 되었으며, 생산된 농산물에는 잔류농약으로 식품의 안전성에 심각한 우려를 낳고 있다.
현재, 농산물에 대한 안전성 문제와 토양환경의 보존을 통한 지속 가능한 농업에 관한 관심으로 유기농업이 전 세계적으로 급격하게 확산되고 있는 실정이다.
이러한 배경 아래 생물학적 방제법을 이용한 안전 농산물을 생산하기 위한 노력으로 다양한 미생물을 농업에 활용하고 있다(Raghavan Charudattan and Amos Dinoor., 2000; Chung, B. K. and Hong, K. S., 1991).
미생물의 이용은 크게 미생물 비료와 미생물 농약으로 농업에 활용할 수 있는데, 미생물농약은 자연계에 존재하는 미생물 그 자체, 또는 미생물이 생산하는 2차대사산물을 이용해 식물병을 억제하는 것으로, 사람이나 가축, 어패류 등에 무해하며 환경오염과 생태계 교란의 우려성이 없다는 특징을 갖고있어 세계적으로 많은 연구가 이루어지고 있다. 따라서, 미생물제제의 사용은, 비료와 농약의 사용을 줄여 토양환경을 지속적으로 보존하고 장기적인 생산성을 확보할 수 있으며, 농작물에 대한 잔류농약의 위험성을 제거해 농산물의 안전성을 확보할 수 있는 일거양득의 효과를 가질 수 있을 것으로 예상된다.
한편, 잎들깨의 재배에 있어 가장 문제시되는 병충해를 보면, 녹병, 잿빛곰팡이병, 균핵병, 심식충, 응애류, 콩잎마름이 나방, 진딧물을 들 수 있다. 이러한 병충해를 방제하기 위하여 현재까지는 농약의 사용과 병의 내성을 극복하기 위해서는 윤작이나 약제의 혼용을 권장하고 있는 실정이다.
이에, 잎들깨의 재배에 있어 가장 문제가 되는 병원균인 잿빛곰팡이병원균인 B. cinerea와 균핵병원균인 S. sclerotiorum를 방제할 수 있는 길항세균을 분리, 동정했으며, 분리한 길항균을 각종 식물병원균에 대한 생물학적방제 효과를 검정하여 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 잎들깨의 재배에 있어 가장 문제가 되는 병원균인 잿빛곰팡이병원균인 B. cinerea와 균핵병원균인 S. sclerotiorum를 방제할 수 있는 길항세균인 신규한 브르크호데리아 속(Burkhoderia sp.) AK17 균주를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 균주를 배양하여, 이로부터 균주 및 배양추출물의 제조방법 및 이로부터 생물학적 제제를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 생물학적 제제를 이용한 식물재배방법을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 신규한 균주 브르크호데리아 속 AK-17(Burkhoderia sp.AK-17) KACC91058를 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기의 브르크호데리아 속 AK-17(Burkhoderia sp.) 균주를 배양하고, 상기 배양물로부터 식물 병원균에 대한 항균활성 및 식물 생육 촉진 효과를 갖는 생물학적 제제의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기의 방법으로 제조된 생물학적 제제를 제공한다.
더 나아가 본 발명은 신규한 브르크호데리아 속 AK-17(Burkhoderia sp.AK-17) 균주 또는 상기 균주의 배양 추출물을 생물학적 제제로 사용하는 식물재배방법을 제공한다.
본 발명은 특히 잎들깨, 상추, 배추 및 시금치와 같은 엽채류와 딸기, 고추, 오이 등의 재배에 사용하면 더 효과적이다.
본 발명에 따라 제조된 배양여액은 그 자체로도 식물 병원균에 항균활성 및 식물 생육 촉진 제제로서 사용할 수 있지만, 여기에 농업분야에서 사용하는 보조제, 또는 담체를 적절히 혼합하여 생물학적 제제로 사용하면 상승효과를 얻을 수 있다.
이때, 혼합제로 만들어지는 제제들은 분말, 입제, 수분산입제, 습윤성 분말, 액제 등으로 유화농축제제, 용액제제, 현탁제제, 유화제제등을 사용할 수 있다. 액체 담체는 일반적인 유기용매와 같은 톨루엔, 자일렌, 아세톤, 에탄올, 메탄올 등을 사용하여 본 발명의 배양여액을 농축하고, 이를 물로 희석하여 사용할 수 있게 한다. 고체 담체로는 탈크, 점토, 실리카, 쵸크, 규조토, 라임, 벤토나이트, 콩가루, 목재가루 등을 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 엽면과 토양처리를 통하여, 병원균의 감염 예방과 치료효과를 얻을 수 있으며, 식물권근의 생활환경을 개선시켜 영양분 흡수를 촉진시켜 생육 촉진을 유도하는 재배방법으로 사용할 수 있다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명하자면 다음과 같다.
1. 길항 세균의 분리 및 동정
들깨 재배지로부터 병징을 나타내는 식물체의 뿌리, 줄기, 잎, 그리고 토양으로부터 균주들을 분리하고, 분리된 균주는 플레이트(plate) 대치배양법으로 들깨의 병원성 균주들에 대한 항균력을 비교분석하여, 그중 효과가 뛰어난 길항 세균을 선정하고, 선정된 길항세균은 버기 메뉴얼(Bergey's Manual)을 이용하여 생리, 생화학적인 특성을 분석하고, 16S rRNA 서열 검색에 의한 분자 유전학적인 방법에 의해 분석하여 동정한 결과, 본 발명은 들깨 병원균에 대한 항균력이 뛰어난 브르크호데리아 속에 속하는 신규한 균주임을 알 수 있었다.
이를, 본 발명자는 이 균주를 브르크호데리아 속 (Burkhoderia sp.)AK17 라 명명하였으며, 2003년 7월 11일 농업생명공학연구원에 기탁하여 KACC91058 수탁번호를 부여 받았다.
2. 브르크호데리아 속 AK-17( Burkhoderia sp. AK-17) 균주의 항균 스펙트럼
본 발명의 브르크호데리아 속 (Burkhoderia sp.)AK17 균주는 잎들깨 주요병원균인 잿빛곰팡이병원균과 균핵병원균에 대한 항균활성이 우수하며, 시들음병원균에도 양호한 항균활성을 나타낸다.
3. 브르크호데리아 속 AK-17( Burkhoderia sp.AK-17) 균주의 생육 특성
본 발명의 브르크호데리아 속 AK-17 균주는 세균 배양용 배지(pH 6.5), 30℃에서 가장 좋은 생육을 나타낸다.
이때, 세균 배양용 배지는 NB, LB, BHI 배지를 사용하고, BHI 배지가 더욱 바람직하다.
상기와 같은 조건에서, 브르크호데리아 속 AK-17 균주는 접종한 후 12∼22시간에 걸쳐 대수증식기가 형성되고, 최대생육은 접종한 지 28시간에 나타난다.
4 . 들깨의 생육 촉진 효과
본 발명인 브르크호데리아 속 AK-17 균주의 배양 여액을 들깨에 사용하면, 들깨의 생육을 촉진한다.
이때, 사용되는 브르크호데리아 속 AK-17 균주의 배양 여액은 2일 배양한 균배양액을 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 브르크호데리아 속 AK-17 균주의 배양 여액을 사용한 들깨 잎의 전장(全長)은 일반 들깨잎에 비해 128%가 신장되었고, 들깨의 생체량(wet weight)과 건물량(dry weight)도 각각 164%와 163%를 증가 시켰다.
본 발명의 브르크호데리아 속 AK-17 균주의 배양 여액은 잎들깨의 주요병원균에 대한 항균 성분과 더불어 전반적으로 들깨의 지상부 생육을 촉진하기 때문에, 들깨의 생물학적 방제제와 생육 촉진제로서 사용한다.
이하, 본 발명의 구체적인 방법을 실시예를 통하여 설명하고자 하나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
[실시예 1] 길항 세균의 분리 및 동정
(1) 길항 세균의 분리
본 발명의 균주는 경상도 밀양지역의 잎들깨 재배지로부터 병징(病徵)을 나타내는 식물체와 정상식물체, 그리고 토양을 채취하여 길항균분리의 시료로 사용하였다. 식물체의 줄기와 잎의 절편과 토양을 살균 증류수로 10-1∼10-9까지 희석하는 물질희석 아가 방법(material dilution agar methods)으로 PDA배지(potato dextrose agar media)와 NA 플레이트(nutrient agar plate)에 30℃에서 배양하면서 근접미생물의 생육을 저해시키는 수종의 곰팡이와 세균을 선별하여 1차 분리하였다. 그런다음, 선별된 곰팡이와 세균에서 가장 항균활성이 큰 균주를 단일 콜로니(colony)가 얻어질 때까지 NA배지로 계대배양을 하면서 순수분리를 하였다.
(2) 길항세균의 항균 스펙트럼
순수 분리한 단일 콜로니를 길항세균 AK-17로 임시 명명하였으며, 상기 세균은 들깨 주요 병원균인 잿빛곰팡이병원균(Botrytis cinerea), 균핵병원균(Sclerotinia sclerotiorum), 모잘록병원균(Pythium ultimum), 시들음병원균(Fusarium oxysporum), 및 줄기썩음병원균(Rhizoctonia solini)에 대해 PDA 플레이트 대치배양법으로 조사하여, 항균 스펙트럼을 확인하였다. 이때, 조건은 1/5 강도(strength)의 PDA로 각 병원균과 길항세균 AK-17을 동시에 접종하여 28℃에서 2일간 배양하고, 생육 억제 지대(inhibition zone)의 크기를 확인하였다.
그 결과, 표 1과 같이, 길항세균 AK-17은 상기 들깨 병원균 모두에 항균 효과를 나타내었으며, 특히, 균핵병원균(A)과 잿빛곰팡이병원균(B)에 대한 항균효과가 월등히 우수한 것을 알 수 있었다(도 1 참조).
잿빛곰팡이병원균 시들음병원균 균핵병원균 모잘록병원균 줄기썩음병원균
길항균AK-17 ++++ ++ +++ + +++
* 저해크기: ++++ 20㎜ 이상, +++ 15∼20㎜, ++10∼15㎜, + 5∼10㎜
(3) 길항 세균의 동정
길항균 AK-17은 버기 메뉴얼(Bergey's Manual)을 이용하여 생리, 생화학적인 특성을 분석하고, 16S rRNA 유전자 시퀀싱 키트(제품명, 제조사)를 사용하여 서열을 결정하여, 그 결과를 ATCC 표준 균주들의 16S rRNA 분석 라이브러리와 비교하여 동정하였다.
하기 표 1과 도 2에 나타난 바와 같이, 동정결과 본 발명의 길항균 AK-17은 브르크호데리아 속 (Burkhoderia sp.)에 속하는 미생물로, 이 신규한 미생물을 브르크호데리아 속 AK-17 (Burkhoderia sp. AK-17)로 명명하였으며, 2003년 7월 11일 농업생명공학연구원에 기탁하여 KACC91058 수탁번호를 부여 받았다..
생리, 생화학적 특성 길항균 AK-17
카탈라제 -
옥시다제 +
운동성 d+
형태 간균
그람 염색 -
인돌의 생성 -
메틸 레드 -
구연산의 이용 +
O-F 테스트 o/a/n
알기닌의 분해 +
전분의 가수분해 -
카제인의 가수분해 -
젤라틴의 가수분해 -
셀룰로즈의 분해 -
킹 B -
질산염 리덕타제 +
글루코오스 +
아라비노오스 d+
락토스 +
슈크로스 +
말토스 +
솔비톨 +
마니톨 +
베타-알라닌 d+
[실시예 2] 브르크호데리아 속 AK-17 (Burkhoderia sp. AK-17)의 생육 특성
본 발명의 브르크호데리아 AK-1 균주의 생육곡선을 조사하기 위해서, 먼저, BHI 배지(pH 6.5), 30℃에서 상기 균주를 24시간동안을 전배양하였다. 그런다음 NB 배지에서 본 배양을 하면서, 600nm에서 36시간동안 OD값을 측정하였다. 초기 5시간은 매시간 측정을 하고, 그 이후에는 30분마다 OD값을 측정하였다.
그 결과, 생육의 최적 pH는 6.5, 최적 온도는 30℃임을 알 수 있었다. 그리고, 12∼22시간에 걸쳐 대수증식기가 형성되었으며, 최대생육은 28시간이 경과되어서 나타났다.
[실시예 3]
3-1. 브르크호데리아 속 AK-17 균주 배양여액 제조
브르크호데리아 속 AK-17 균주는 NA 배지(pH 6.5), 30℃에서 2일동안 진탕배양하였다. 그런다음, 배양액이 600nm에서 OD 1.0이 될 때까지 희석하고, 필터로 여과하여 본 발명의 배양여액을 완성하였다.
3-2. 브르크호데리아 속 AK-17의 병발생 억제와 방제효과
병발생(病發生)의 억제효과는 잎들깨의 식물체와 병(pot)에 본 발명의 배양액을 처리하여, 병발생 억제와 방제효과를 아래와 같이 수행하여 확인하였다.
먼저, 6엽기의 잎들깨를 심은 병(pot, 7×15.4×7.4㎝)에 상기 실시예3-1에서 제조한 배양여액 30㎖을 처리한 다음날, PDA 배지상에서 7일간 배양한 균핵 병원균과 잿빛곰팡이 병원균을 각각 다른 병에 1일 간격으로 2일동안 접종하여 병발생 억제 효과를 확인하였으며, 상기 배양한 균핵병원균과 잿빛곰팡이병원균을 들깨 잎에 접종하여, 발병시킨 다음, 상기 배양여액을 1일간격으로 3일동안 처리하여 병발생 방제효과를 확인하였다.
그 결과, 본 발명의 배양여액은 균핵 병원균에 대해서 병발생 억제와 방제효과 모두 우수한 것을 알 수가 있었다.
즉, 균핵 병원균 발생 억제 효과는 대조군의 경우, 균을 처리한지 3일이 경과하면 병징이 나타나기 시작하여 균처리 7일후에는 100% 발병되어져 9일후면 들깨가 완전히 고사하였지만, 본 발명의 배양여액으로 처리한 실험군은 2일째까지 병 발생을 거의 볼 수 없었고, 5일째부터 병징이 나타나기 시작하여 7일째에는 45%의 병발생을 나타내어, 대조군과 비교하여 55%의 병발생 억제효과를 나타내었다(도3-A 참조).
균핵 병원균 방제 효과는 대조군에서는 7일만에 모두 병징이 나타났으나, 실험군 14일까지 생육시킨 결과, 2번에 걸쳐 잎이 새로 나도 병징의 잎은 확인되지 않아, 약 90% 이상의 방제효과를 나타내었다(도 3-B참조).
잿빛곰팡이 병원균 발생 억제 효과는 대조군의 경우, 2일이 경과하면서 병징이 나타나기 시작하여 9일후에는 100% 발병되어 고사하는 반면, 실험군은 2일째까지는 병징이 나타나지 않고, 3일째부터 병징이 나타나기 시작하여 9일이후에도 60%만 발병되어, 대조군과 비교하여 40%의 억제효과를 나타내었다(도 4-A 참조).
잿빛곰팡이 병원균 발생 방제 효과는 대조군에서는 9일만에 모두 발병되었으나, 실험군에서는 9일째에 새잎이 돋아나고, 더 이상의 발병은 진행되지 않고 약 70%의 방제효과를 나타내었다(도 4-B 참조).
또한, 도 5와 같이, 전반적으로 본 발명의 실험군은 대조군보다 매우 잘 생육되고 있는 것을 알 수가 있었다.
[실시예 4] 생육 촉진 효과
4-1. 본 발명의 생육 촉진용 배양액
상기 실시예 3을 통하여 진탕 배양된 배양액을 1×106(CFU)로 희석하고, 균이 살아있는 상태로 유지하면서 생육 촉진용 배양액을 제조하였다.
4-2. 생육 촉진 실험
도 4의 결과, 본 발명으로 처리한 들깨의 생육 상태가 우수한 것으로 확인됨에 따라, 들깨(Perilla ocymoides L.)를 병(Pot)에 심고, 식물 배양기에 35일동안 육종하였다. 그리고, 본 발명의 생육 촉진용 배양액이 들깨 줄기의 전장, 직경, 생체중량(fresh weight), 건물량(dry weight)과 들깨 잎의 엽수, 엽면적, 생체중량, 건물량, 엽록소의 함량에 주는 효과를 비교 분석하였다.
식물 배양기의 조건은, 하루 기준으로 주간(晝間)은 16시간동안 25℃로, 야간(夜間)은 8시간동안 15℃로 유지되도록 세팅하였다.
들깨를 병에 심고, 10일이 지난 후, 상기 실시예 4-1의 생육 촉진용 배양액을 들깨의 잎과 줄기에 촉촉하게 분무하였다. 그리고, 본 발명의 효과를 비교하기 위하여 대조군(물)과 본 발명의 균주를 제외한 배지성분만으로 처리한 배지군을 각각 준비하였다.
그 후, 25일동안 들깨를 육종한 다음, 들깨의 줄기와 잎의 변화를 측정하였다.
그 결과, 들깨 줄기에 있어서는 표 3과 같이, 본 발명의 전장은 대조군보다 120%, 배지군보다는 109%가 신장되었고, 생체중량과 건물량은 대조군에 비해 각각 164%, 163% 증가한 것을 알 수가 있었다.
구분 줄기 전장(㎝) 줄기 직경(㎜) 줄기 생체중량(㎎) 줄기 건물량(㎎)
대조군 4.1 1.5 107 13.9
배지군 4.5 1.6 134 21.5
본 발명 4.9 1.7 175 22.6
또한, 들깨 잎에 있어서는 표 4와 같이, 본 발명의 엽수는 대조군보다 119%, 배지군보다 128%가 증가하였고, 엽면적은 대조군에 비해 221%, 배지군에 비해 194%가 넓어졌으며, 생체중량과 건물량은 대조군과 배지군에 비교하여 180∼210%가 증가함을 알 수가 있었다.
구분 엽수(개) 엽면적(㎠) 엽 생체중량(㎎) 엽건물량(㎎) 엽록소함량(SPAD 값)
대조군 6.2 22.0 414 61.2 20.7
배지군 5.8 25.1 488 69.8 23.1
본 발명 7.4 48.6 895 125.4 23.9
따라서, 본 발명의 생육 촉진용 배양액은 들깨의 생육을 촉진하여, 출하시기를 앞당길 수 있으며, 수확량도 많게 한다.
이와같이, 본 발명은 식물의 병원균에 대한 항균 활성 및 생육을 촉진하기 때문에, 농작물의 품질을 향상시키면서, 출하시기를 단축하고, 수확량도 확대되어, 농민의 소득증대에 큰 영향을 줄 것으로 기대된다.
도 1은 균핵병원균(A)과 잿빛곰팡이병원균(B)에 대한 본 발명의 길항균 AK-17의 항균효과를 고체 배지 상에서 나타낸 것이고,
도 2는 본 발명의 브르크호데리아 속 AK-17 균주의 16S rRNA 염기서열을 나타낸 것이고,
도 3는 균핵 병원균에 대한 본 발명의 브르크호데리아 속 AK-17 균주의 배양여액의 균핵 병원균 발생 억제 효과(A)와 균핵 병원균 방제 효과(B)를 그래프로 나타낸 것이고,
도 4은 잿빛곰팡이병원균에 대한 본 발명의 브르크호데리아 속 AK-17 균주의 배양여액의 잿빛곰팡이병원균 발생 억제 효과(A)와 잿빛곰팡이병원균 방제 효과(B)를 그래프로 나타낸 것이고,
도 5는 재배 조건을 대조군(A), 잿빛곰팡이병원균으로 처리한 군(B), 본 발명의 배양여액으로 처리하고 잿빛곰팡이병원균으로 처리한 군(C), 잿빛곰팡이병원균으로 처리하고 본 발명의 배양여액으로 처리한 군(D), 및 본 발명의 배양여액으로 처리한 군(E)으로 한 후 들깨의 지상부 상태를 사진으로 나타낸 것이다.

Claims (5)

  1. 신규한 균주 브르크호데리아 속 AK-17(Burkhoderia sp.AK-17) KACC91058.
  2. 제 1항의 균주를 배양하고, 상기 배양물로부터 식물병원균에 대한 항균 활성 및 식물 생육 촉진 효과를 갖는 생물학적 제제의 제조방법.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 식물은 잎들깨, 상추, 배추, 시금치,고추, 딸기, 및 오이임을 특징으로 하는 생물학적 제제의 제조방법.
  4. 제 2항의 방법으로 제조된 생물학적 제제.
  5. 신규한 브르크호데리아 속 AK-17(Burkhoderia sp.AK-17) 균주 또는 상기 균주의 배양 추출물을 생물학적 제제로 사용하는 식물재배방법.
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