BR112015032423B1

BR112015032423B1 - Combinação sintética e método

Info

Publication number: BR112015032423B1
Application number: BR112015032423-1A
Authority: BR
Inventors: Geoffrey von Maltzahn; Richard Flavell; Gerardo V. Toledo; Slavica Djonovic; Luis Miguel Marquez; David Morris Johnston; Yves Alain Millet; Jeffrey Lyford; Alexander Naydich; Craig Sadowski
Original assignee: Symbiota, Inc
Priority date: 2013-06-26
Filing date: 2014-06-26
Publication date: 2021-11-16
Also published as: MX2020003135A; US20180368419A1; MX2020003136A; AU2017210482A1; IL255685A; MX2019008665A; NZ726116A; US20180368421A1; EP3013134A1; IL267758A; MX2020003138A; IL255682A; US20160150794A1; US9295263B2; EP3013134B1; IL255684A; AU2017200143B2; AU2018282373A1; IL250471A0; AU2017200703B2

Abstract

formulação agrícola, combinação sintética e métodos para tratamento de sementes, de mudas, e para modulação de um traço em uma planta gramineae. o presente pedido se refere a métodos e materiais para conferir um benefício a uma semente ou muda de uma planta agrícola (por exemplo, uma planta agrícola gramínea) ou à planta agrícola derivada a partir das sementes ou mudas. por exemplo, o presente pedido fornece populações bacterianas purificadas que incluem novos endófitos bacterianos originários de semente e combinações sintéticas de sementes e/ou mudas (por exemplo, sementes e/ou mudas de cereais) com endófitos bacterianos originários de semente heteró-logos.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[0001] O presente Pedido reivindica prioridade ao Pedido Provisó rio N°. de Série 61/957.255, depositado em 26 de Junho de 2013; Pedido Provisório N°. de Série 61/959.859, depositado em 04 de Setembro de 2013; Pedido Provisório N°. de Série 61/959.847, depositado em 04 de Setembro de 2013; Pedido Provisório N°. de Série 61/959.858, depositado em 04 de Setembro de 2013; Pedido Provisório N°. de Série 61/959.854, depositado em 04 de Setembro de 2013; Pedido Provisório N°. de Série 61/959.861, depositado em 04 de Setembro de 2013; Pedido Provisório N°. de Série 61/959.870, depositado em 04 de Setembro de 2013; e Pedido Provisório N°. de Série 61/935.761, depositado em 02 de Fevereiro de 2014, as descrições dos quais são incorporadas por referência na íntegra.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIA

[0002] O Pedido de Patente contém uma listagem de sequências a qual foi enviada eletronicamente no formato ASCII e é aqui incorporada por referência na íntegra. A dita cópia ASCII, criada em 23 de Fevereiro de 2015, é nomeada 28726US_CRF_sequencelisting.txt e tem 1.951.930 bytes de tamanho.

CAMPO TÉCNICO

[0003] O presente Pedido se refere a métodos e materiais para conferir um benefício para uma semente ou muda de uma planta agrícola, tal como uma gramínea agrícola, em particular um cereal, ou uma planta agrícola tal como uma gramínea agrícola derivada das sementes ou das mudas. Por exemplo, o presente Pedido fornece populações bacterianas purificadas que incluem novos endófitos bacteria- nos derivados de sementes e combinações sintéticas de sementes e/ou mudas com endófitos bacterianos derivados de sementes heteró- logos. Tais endófitos bacterianos derivados de sementes podem conferir propriedades benéficas às sementes, mudas ou planta agrícola derivada das sementes ou mudas, incluindo metabolismo, transcrição, alterações de proteoma, morfologia e resistência a uma variedade de estresses ambientais e uma combinação de tais propriedades.

ANTECEDENTES

[0004] Abordagens econômica, ambiental e socialmente susten táveis para a agricultura e a produção de alimentos são necessárias para atender às necessidades de uma população mundial em crescimento. Em 2050, a United Nations' Food and Agriculture Organization estimou que a produção total de alimentos deve aumentar em 70% para atender as necessidades da população crescente, um desafio que é agravado por inúmeros fatores, incluindo a diminuição dos recursos de água doce, aumento da concorrência por terras aráveis, elevação de preços da energia, aumento dos custos de insumos, bem como a provável necessidade de que as culturas se adaptem às pressões de um clima global mais seco, mais quente e mais extremo. A necessidade de cultivar quase duas vezes mais alimentos com menos água em climas mais áridos está comandando uma necessidade crítica de inovações na eficiência de uso da água e tolerância à temperatura das culturas.

[0005] Hoje, o desempenho das culturas é otimizado primariamen te por meio de tecnologias voltadas para a interação entre o genótipo das culturas (por exemplo, melhoramento de plantas, culturas geneticamente modificadas (Genetically Modified - GM)) e seu ambiente circundante (por exemplo, fertilizantes, herbicidas sintéticos, pesticidas). Embora estes paradigmas tenham ajudado a dobrar a produção mundial de alimentos nos últimos cinquenta anos, as taxas de crescimento de produtividade têm estagnado em muitas das principais culturas e mudanças no clima têm sido associadas à instabilidade e declínio na produção em culturas importantes, tal como o trigo, comandando uma necessidade urgente de soluções inovadoras para melhora do rendimento das culturas. Além de seu prazo para desenvolvimento e regulamentares, o medo do público de culturas GM e produtos químicos sintéticos tem desafiado seu uso em muitas culturas essenciais e países, resultando em uma ausência completa de aceitação de traços GM no trigo e na exclusão das culturas GM e muitos produtos químicos sintéticos dos mercados europeus. Assim, há uma necessidade significativa de abordagens inovadoras, eficazes, ambientalmente sustentáveis e publicamente aceitáveis para melhorar o rendimento e a resistência das culturas a estresses de estiagem e calor graves.

[0006] A melhora da resistência das culturas ao estresse pelo ca lor e estiagem provou ser desafiador para paradigmas genéticos e químicos convencionais de melhoramento de culturas. Este desafio se deve, em parte, às alterações a nível de rede complexas que podem surgir durante exposição a estes estresses. Por exemplo, plantas sob tal estresse podem sucumbir a uma variedade de danos fisiológicos e de desenvolvimento, incluindo desidratação, espécies reativas de oxigênio elevadas, diminuição da assimilação fotossintética de carbono, inibição da translocação de assimilados, aumento da respiração, redução do tamanho de órgão em virtude de uma diminuição na duração das fases de desenvolvimento, interrupção de desenvolvimento da semente e uma redução na fertilidade.

[0007] Assim como seres humanos, que utilizam um complemen to de simbiontes microbianos benéficos, foi sugerido que as plantas obtêm um benefício a partir da grande variedade de bactérias e fungos que vivem dentro e ao redor de seus tecidos, de modo a sustentar a saúde e crescimento da planta. Conforme descrito aqui em detalhes, endófitos são organismos fúngicos ou bacterianos que vivem dentro de plantas. Endófitos bacterianos, tais como Firmicutes, Pro- teobactérias, Bacteroidetes e Verrucomicróbios, parecem habitar vários tecidos da planta hospedeira e foram isoladas de folhas, caules e raízes de plantas.

[0008] Até o momento, um pequeno número destas relações sim bióticas endófito-hospedeiro foram analisadas em estudos limitados como conferindo benefícios capazes de modelar plantas hospedeiras dentro de ambientes controlados de laboratório, tais como aumento da produção de biomassa (isto é, rendimento) e nutrição, maior tolerância ao estresse, tal como estiagem e pragas. No entanto, foi demonstrado que tais endófitos são ineficazes ou têm eficácia limitada de conferir benefícios a uma variedade de plantas importantes em agricultura, tais como cereais modernos; como tal, eles não abordam adequadamente a necessidade de conferir um melhor rendimento e tolerância a estresses ambientais presentes em muitas situações agrícolas para tais culturas, particularmente estiagem e calor.

[0009] Assim, há uma necessidade de composições e métodos de fornecimento de culturas de cereais com rendimento e resistência aprimorados a várias estresses ambientais. São fornecidas aqui novas composições de simbiontes, endófitos bacterianos e fúngicos, bem como novas composições de simbiontes de plantas, criadas com base na análise das propriedades chave que melhoram a utilidade e comercialização de uma composição endofítica.

SUMÁRIO

[00010] A presente invenção se baseia, em parte, na descoberta surpreendente de que micróbios endofíticos podem ser encontrados em sementes maduras secas de plantas. Os inventores isolaram e caracterizaram extensivamente um grande número de endófitos bacteri- anos e fúngicos originários de semente que são capazes de colonizar gramíneas agrícolas e conferir traços benéficos a estas plantas. Como tal, são fornecidas aqui populações bacterianas e fúngicas purificadas que contêm uma ou mais populações de endófitos originários de semente, particularmente endófitos bacterianos (ditos aqui como endófi- tos bacterianos originários de semente), composições (por exemplo, formulações agrícolas e artigos de manufatura) que incluem tais populações bacterianas purificadas, bem como combinações sintéticas de tais populações bacterianas purificadas em associação com sementes ou mudas de uma planta de cereal agrícola e outros produtos agrícolas, incluindo sementes. Além disso, são fornecidos aqui métodos de uso de tais endófitos bacterianos derivados de sementes para preparar combinações sintéticas, formulações agrícolas, artigos de manufatura ou outros produtos agrícolas e conferir benefícios às plantas de cereal agrícolas. Endófitos derivados de sementes podem conferir vantagens significativas às culturas de cereais, abrangendo de crescimento sob condições normais e sob estresse, expressão alterada de hormônios vegetais chave, expressão alterada de transcritos chave na planta e outras características desejáveis.

[00011] Conforme descrito aqui, micróbios benéficos podem ser robustamente derivados de sementes agrícolas, cultivados, administrados de modo heterólogo às sementes ou mudas de cereais agrícolas e colonizar os tecidos das plantas resultantes com alta eficiência para conferir múltiplas propriedades benéficas, que são retidas de forma durável pelas plantas e sua progênie. Isto é surpreendente, dada a variabilidade histórica observada no isolamento de micróbios a partir de sementes saudáveis e as observações anteriores de colonização ineficiente de tecidos de uma planta hospedeira por patóge- nos de sementes. Além disso, a capacidade de endófitos bacterianos originários de semente heterologamente colocados de colonizar sementes e mudas a partir da superfície externa das sementes é surpreendente, dado que tais endófitos podem ser isolados a partir de tecidos internos da semente e, portanto, podem não requerer nativa- mente a capacidade de penetrar e invadir tecidos internos do hospedeiro em seu estado natural.

[00012] Endófitos bacterianos originários de semente são heterolo- gamente colocados sobre mudas de um cultivar, espécie ou tipo de cultura de cereal distintas e conferem benefícios a esses novos receptores. Por exemplo, endófitos bacterianos derivados de sementes de cultivares de milho são heterologamente fornecidos a cultivares de trigo para conferir um benefício. Isto é surpreendente, dadas as observações anteriores de preferências de microbioma distintas em plantas e hospedeiros mamíferos distintos e, em particular, a probabilidade de que os micróbios derivados de sementes possam ter coevoluído para serem especializados para um hospedeiro particular.

[00013] Em um aspecto, a invenção apresenta um método para o tratamento de sementes. O método inclui contato da superfície de uma pluralidade de sementes de plantas agrícolas Gramineae com uma formulação compreendendo uma população bacteriana purificada em uma concentração de pelo menos cerca de 102 CFU/ml em uma formulação líquida ou cerca de 102 CFU/g em uma formulação não líquida, onde pelo menos 10% das CFUs presentes na formulação compreendem um endófito bacteriano originário de semente preferido, o qual exibe: produção de uma auxina, fixação de nitrogênio, produção de um antimicrobiano, produção de um sideroforo, solubilização de fosfato mineral, produção de uma celulase, produção de uma quiti- nase, produção de uma xilanase ou produção de acetoína, em que o endófito bacteriano originário de semente está presente na formulação em uma quantidade capaz de conferir um benefício às sementes de plantas ou plantas agrícolas derivadas a partir das sementes da planta; e acondicionamento das sementes contatadas em um recipiente. O método pode ainda incluir secagem da semente contatada. O contato pode incluir pulverização, imersão, revestimento, encapsulação ou polvilhamento das sementes ou mudas com a formulação.

[00014] A invenção também apresenta um método para o tratamento de mudas. O método inclui contato da vegetação ou rizosfera de uma pluralidade de mudas de plantas agrícola Gramineae com uma formulação compreendendo uma população bacteriana purificada em uma concentração de pelo menos cerca de 102 CFU/ml em uma formulação líquida ou cerca de 102 CFU/g em uma formulação não líquida, em que pelo menos 10% das CFUs presentes na formulação compreendem um endófito bacteriano originário de semente que exibe produção de uma auxina, fixação de nitrogênio, produção de um anti- microbiano, produção de um sideroforo, solubilização de fosfato mineral, produção de uma celulase, produção de uma quitinase, produção de uma xilanase ou produção de acetoína e em que a endófito bacteri- ano originário de semente está presente na formulação em uma quantidade capaz de conferir um benefício às mudas ou plantas agrícolas derivadas das mudas; e crescimento das mudas contatadas. O contato pode incluir pulverização, imersão, revestimento, encapsulação ou polvilhamento das sementes ou mudas com a formulação.

[00015] Em outro aspecto, é apresentado um método para modulação de um traço em uma planta Gramineae. O método inclui aplicação, à vegetação (por exemplo, mudas de milho, trigo, arroz ou cevada) ou uma área adjacente à vegetação, de uma formulação que inclui uma população bacteriana purificada em uma concentração de pelo menos cerca de 102 CFU/ml em uma formulação líquida ou cerca de 102 CFU/g em uma formulação não líquida, pelo menos 10% das CFUs presentes na formulação compreendendo um endófito bacteriano originário de semente que exibe: produção de uma auxina, fixação de nitrogênio, produção de um antimicrobiano, produção de um siderofo- ro, solubilização de fosfato mineral, produção de uma celulase, produção de uma quitinase, produção de uma xilanase ou produção de ace- toína e combinações de dois ou mais dos mesmos, em que a formulação é capaz de conferir um benefício à vegetação ou uma cultura produzida a partir da vegetação.

[00016] É apresentado um método para modular um traço em uma planta Gramineae que inclui aplicação de uma formulação ao solo, a formulação compreendendo uma população bacteriana purificada em uma concentração de pelo menos cerca de 102 CFU/g, pelo menos 10% das CFUs presentes na formulação compreendendo um endófito bacteriano originário de semente que exibe: produção de uma auxina, fixação de nitrogênio, produção de um antimicrobiano, produção de um sideroforo, solubilização de fosfato mineral, produção de uma celulase, produção de uma quitinase, produção de uma xilanase ou produção de acetoína e combinações de dois ou mais dos mesmos, em que a formulação é capaz de conferir um benefício às sementes plantadas no solo ou a uma cultura produzida a partir de plantas cultivadas no solo.

[00017] Também é apresentado um método de produção de um artigo de manufatura. O método inclui aplicação de uma formulação agrícola às sementes de plantas Gramineae, a formulação incluindo uma população bacteriana purificada e um veículo aceitável em agricultura, a população bacteriana consistindo essencialmente em um endófito bacteriano originário de semente que exibe: produção de uma auxina, fixação de nitrogênio, produção de um antimicrobiano, produção de um sideroforo, solubilização de fosfato mineral, produção de uma celulase, produção de uma quitinase, produção de uma xilanase ou produção de acetoína ou combinações de dois ou mais dos mesmos; e acondicionamento das sementes revestidas em material de embalagem.

[00018] A invenção também apresenta um método de identificação de um modulador de um traço de planta. O método inclui aplicação de uma população bacteriana às sementes de uma planta agrícola, a popu- lação compreendendo bactérias de uma ou mais espécies de endófitos bacterianos derivados de semente; medição de um traço em mudas ou plantas derivadas das sementes, o traço selecionado do grupo que consiste em biomassa radicular, comprimento de raízes, altura, comprimento da parte aérea, número de folhas, eficiência de uso da água, biomassa total, rendimento de grãos, taxa de fotossíntese, tolerância à estiagem, tolerância ao calor, tolerância ao sal, resistência ao estresse por nematoides, resistência a um patógeno fúngico, resistência a um pató- geno bacteriano, resistência a um patógeno viral, nível de um metabóli- to e expressão de proteoma; e identificação de pelo menos um dos traços para os quais a população bacteriana resulta em uma modulação do traço em relação a mudas ou plantas de referência.

[00019] Em outro aspecto, é apresentado um método de identificação de um modulador de um traço de planta. O método inclui aplicação de uma população bacteriana às mudas de uma planta agrícola, a população compreendendo bactérias de uma ou mais espécies de en- dófitos bacterianos derivados de semente; medição de um traço nas mudas ou plantas derivadas das mudas, o traço selecionado do grupo que consiste em biomassa radicular, comprimento das raízes, altura, comprimento da parte aérea, número de folhas, eficiência de uso da água, biomassa total, rendimento de grãos, taxa de fotossíntese, tolerância à estiagem, resistência ao calor, tolerância ao sal, resistência ao estresse por nematoides, resistência a um patógeno fúngico, resistência a um patógeno bacteriano, resistência a um patógeno viral; nível de um metabólito e expressão de proteoma; e identificação de pelo menos um dos traços para os quais a população bacteriana resulta em uma modulação do traço em relação a mudas ou plantas de referência. A modulação pode ser um aumento na biomassa radicular, um aumento no comprimento das raízes, um aumento na altura, um aumento no comprimento da parte aérea, um aumento no número de fo- lhas, um aumento na eficiência de uso de água, um aumento na biomassa total, um aumento no rendimento de grão, um aumento na taxa de fotossíntese, um aumento na tolerância à estiagem, um aumento na tolerância ao calor, um aumento na tolerância ao sal, um aumento na resistência ao estresse por nematoides, um aumento na resistência a um patógeno fúngico, um aumento na resistência a um patógeno bac- teriano, um aumento na resistência a um patógeno viral, uma modulação detectável no nível de um metabolito ou uma modulação detectá- vel no proteoma.

[00020] A presente invenção também apresenta um método para o tratamento de sementes ou mudas de cereais. O método inclui contato da superfície externa de umas sementes ou mudas de cereais com uma formulação que compreende uma população bacteriana purificada, a população bacteriana purificada compreendendo, em um nível de pelo menos 10% das CFUs presentes na formulação, um endófito bac- teriano originário de semente capaz de pelo menos um de: produção de uma auxina, fixação de nitrogênio, produção de um antimicrobiano, produção de um sideroforo, solubilização de fosfato mineral, produção de uma celulase, produção de uma quitinase, produção de uma xila- nase ou produção de acetoína ou uma combinação de dois ou mais dos mesmos sob condições tais que a formulação fica localizada sobre uma superfície externa das sementes ou mudas de cereais de uma maneira eficaz para que o endófito bacteriano originário de semente venha a conferir um benefício às sementes ou mudas de cereais ou a uma planta agrícola de cereal derivada da semente ou muda e em que o endófito bacteriano originário de semente é capaz de colonização do hospedeiro e/ou replicação dentro de um tecido da planta agrícola de cereal; e acondicionamento das sementes ou mudas de cereais contatadas em um recipiente. Em modalidades nas quais a semente de cereal é contatada, o método pode ainda incluir secagem das sementes de cereal contatadas. Em modalidades nas quais a semente de cereal é contatada, o endófito bacteriano derivado de semente pode estar presente em uma concentração de pelo menos 1 CFU/semente sobre a superfície das sementes de cereal contatadas. Contato pode incluir pulverização, imersão, revestimento, polvilhamento ou mergulhar as sementes ou mudas de cereal na formulação. O endófito bacteriano derivado de semente pode ser obtido ou obtenível a partir de um compartimento interno da semente, por exemplo, o endófito bacteriano derivado de semente pode ser obtido ou obtenível a partir de um compartimento interno da semente de uma semente ou muda heteróloga à semente ou muda de cereal contatada ou pode ser obtida ou obtenível a partir de uma superfície externa de uma semente ou muda heterólo- ga à semente ou muda de cereal contatada. O endófito bacteriano originário de semente pode ser heterólogo à população microbiana dentro da semente ou muda de cereal contatada. O endófito bacteriano originário de semente pode ser obtido ou obtenível a partir do compartimento interno de um cultivar, variedade ou cultura diferente comparado com a semente ou muda. O endófito bacteriano originário de semente pode ser obtido ou obtenível a partir de uma superfície externa de um cultivar, variedade ou cultura diferente comparado com a semente ou muda. O benefício pode ser herdado pela progênie da planta de cereal agrícola derivada da semente ou muda de cereal contatada. O endófito bacteriano originário de semente pode incluir uma sequência de ácido nucleico 16S pelo menos 97% idêntica a uma sequência de ácido nucleico 16S de um endófito bacteriano apresentado na Tabela 1. O endófito bacteriano derivado de semente pode ser obtido ou obtenível a partir de uma semente de uma planta de arroz, milho, trigo ou cevada. O endófito bacteriano derivado de semente pode ser capaz de pelo menos dois de: produção de uma auxina, fixação de nitrogênio, produção de um antimicrobiano, produção de um sideroforo, solu- bilização de fosfato mineral, produção de uma celulase, produção de uma quitinase, produção de uma xilanase e produção de acetoína.

[00021] Um método para melhoramento de um traço em uma planta de cereal agrícola cultivada em uma região do solo também é apresentado. O método inclui contato de pelo menos uma parte da região do solo com uma formulação que compreende uma população bacteriana purificada, a população bacteriana purificada compreendendo, em um nível de pelo menos 10% das CFUs presentes na formulação, um en- dófito bacteriano originário de semente capaz de pelo menos um de: produção de uma auxina, fixação de nitrogênio, produção de um anti- microbiano, produção de um sideroforo, solubilização de fosfato mineral, produção de uma celulase, produção de uma quitinase, produção de uma xilanase e produção de acetoína ou uma combinação de dois ou mais dos mesmos sob condições tais que o endófito bacteriano derivado de semente é capaz de conferir um benefício a uma semente ou muda de cereal plantada dentro da região do solo ou a uma planta de cereal agrícola derivada da semente ou muda de cereal. O método pode incluir plantio de uma semente ou muda de cereal na região do solo. O endófito bacteriano derivado de semente pode ser obtido ou obtenível a partir de um compartimento interno da semente, por exemplo, o endófito bacteriano derivado de semente pode ser obtido ou obtenível a partir de um compartimento interno de semente de uma semente ou muda heteróloga à semente ou muda de cereal contatada ou pode ser obtido ou obtenível a partir de uma superfície externa de uma semente ou muda heteróloga à semente ou muda de cereal contatada. O endófito bacteriano originário de semente pode ser exógeno à população microbiana dentro da semente ou muda de cereal contatada.

[00022] A invenção também apresenta um método para plantio de uma região de campo com uma cultura de cereal agrícola. O método inclui obtenção de um recipiente que compreende pelo menos 10 combinações sintéticas, em que cada combinação sintética compreende uma população bacteriana purificada em associação com uma semente ou muda de cereal, em que a população bacteriana purificada compreende um endófito bacteriano originário de semente capaz de pelo menos um de: produção de uma auxina, fixação de nitrogênio, produção de um antimicrobiano, produção de um sideroforo, solubili- zação de fosfato mineral, produção de uma celulase, produção de uma quitinase, produção de uma xilanase ou produção de acetoína ou combinações de dois ou mais dos mesmos e em que o endófito bacte- riano originário de semente está presente em uma quantidade eficaz para conferir um benefício às sementes ou mudas de cereal ou às plantas de cereal agrícolas derivadas das sementes ou mudas de cereal; e distribuição das combinações sintéticas do recipiente na região do campo. Em qualquer um dos métodos, o endófito bacteriano derivado de semente pode ser obtido ou obtenível a partir de um compartimento interno da semente, por exemplo, o endófito bacteriano derivado de semente pode ser obtido ou obtenível a partir de um compartimento interno de semente de uma semente ou muda heteróloga à semente ou muda de cereal contatada ou pode ser obtido ou obtenível a partir de uma superfície externa de uma semente ou muda heterólo- ga à semente ou muda de cereal contatada. O endófito bacteriano originário de semente pode ser exógeno à população microbiana dentro da semente ou muda de cereal contatada.

[00023] Em qualquer um dos métodos, o endófito bacteriano originário de semente pode estar presente em uma concentração de pelo menos 102 CFU/semente sobre a superfície das sementes após contato.

[00024] Em qualquer um dos métodos, o endófito bacteriano originário de semente pode ser obtido a partir de um compartimento interno da semente (por exemplo, cotilédones, plúmula, embrião ou endosperma).

[00025] Em qualquer um dos métodos, o endófito bacteriano originário de semente pode ser obtido a partir de uma outra espécie de planta que não as sementes com as quais a formulação é contatada.

[00026] Em qualquer um dos métodos, o endófito bacteriano originário de semente pode ser obtido a partir de um cultivar de planta diferente do cultivar das sementes com as quais a formulação é contatada.

[00027] Em qualquer um dos métodos, o endófito bacteriano originário de semente pode ser obtido a partir de uma semente cuja superfície foi esterilizada.

[00028] Em qualquer um dos métodos, o benefício pode ser herdado maternalmente pela progênie das sementes de planta contatadas.

[00029] Em qualquer um dos métodos, o endófito bacteriano originário de semente pode incluir uma sequência de ácido nucleico16S tendo pelo menos 97% de identidade de sequência com uma sequência de ácido nucleico 16S de um endófito bacteriano selecionado de um gênero fornecido na Tabela 1 ou uma família fornecida na Tabela 2.

[00030] Em qualquer um dos métodos, o endófito bacteriano originário de semente pode incluir uma sequência de ácido nucleico 16S que é menos de 97% idêntica a qualquer sequência de ácido nucleico 16S mostrada na Tabela 1.

[00031] Em qualquer um dos métodos, a população bacteriana podem incluir um primeiro endófito bacteriano originário de semente tendo uma primeira sequência de ácido nucleico 16S e um segundo endó- fito bacteriano originário de semente tendo uma segunda sequência de ácido nucleico 16S, em que as primeira e segunda sequências de ácido nucleico 16S são menos de 97% idênticas.

[00032] Em qualquer um dos métodos, a população bacteriana pode incluir duas ou mais famílias de endófitos bacterianos originários de semente.

[00033] Em qualquer um dos métodos, a população bacteriana pode incluir duas ou mais espécies de endófitos bacterianos originários de semente.

[00034] Em qualquer um dos métodos, o endófito bacteriano originário de semente pode ser uma espécie que não Bacillus e/ou uma espécie que não Pseudomonas.

[00035] Em qualquer um dos métodos, o endófito bacteriano originário de semente pode ser obtido a partir de uma semente de arroz, milho, trigo ou cevada.

[00036] Em qualquer um dos métodos, o endófito bacteriano originário de semente pode exibir pelo menos dois de: produção de uma auxina, fixação de nitrogênio, produção de um antimicrobiano, produção de um sideroforo, solubilização de fosfato mineral, produção de uma celulase, produção de uma quitinase, produção de uma xilanase ou produção de acetoína ou combinações dos mesmos.

[00037] Em qualquer um dos métodos, o benefício pode ser selecionado do grupo que consiste em: um aumento na biomassa da raiz, um aumento no comprimento de raiz, um aumento da altura, um aumento no comprimento da parte aérea, um aumento no número de folhas, um aumento na eficiência de uso da água, um aumento na biomassa total, um aumento no rendimento, um aumento na taxa de fo- tossíntese, um aumento na tolerância à estiagem, um aumento na resistência ao calor, um aumento na tolerância ao sal, um aumento na resistência ao estresse por nematoides, um aumento na resistência a um patógeno fúngico, um aumento na resistência a um patógeno bac- teriano, um aumento na resistência a um patógeno viral, uma modulação detectável no nível de um metabólito e uma modulação detectável no proteoma em relação a sementes ou plantas agrícolas de referência derivadas das sementes de referência. O benefício pode incluir uma combinação de pelo menos dois de tais benefícios.

[00038] Em outro aspecto, a invenção apresenta uma combinação sintética que inclui uma população bacteriana purificada em associação com uma pluralidade de sementes ou mudas de uma planta agrícola Gramineae, em que a população bacteriana purificada compreende um endófito bacteriano originário de semente capaz de pelo menos um de: produção de uma auxina, fixação de nitrogênio, produção de um antimicrobiano, produção de um sideroforo, solubilização de fosfato mineral, produção de uma celulase, produção de uma quitinase, produção de uma xilanase ou produção de acetoína ou uma combinação de dois ou mais dos mesmos e em que o endófito bacteriano originário de semente está presente na combinação sintética em uma quantidade eficaz para conferir um benefício às sementes ou mudas ou plantas derivadas das sementes ou mudas. Por exemplo, a quantidade eficaz pode ser 1x103 CFU/por semente ou cerca de 1x102 CFU/semente a cerca de 1x108 CFU/semente. O benefício pode ser herdado pela progênie de plantas derivadas das sementes ou mudas. O benefício pode ser selecionado do grupo que consiste em aumento da biomassa da raiz, aumento do comprimento das raízes, aumento da altura, aumento do comprimento da parte aérea, aumento do número de folhas, aumento da eficiência de uso da água, aumento da biomassa em geral, aumento do rendimento de grãos, aumento da taxa de fotossíntese, aumento da tolerância à estiagem, aumento da tolerância ao calor, aumento da tolerância ao sal, aumento na resistência ao estresse por nematoides, aumento na resistência a um patógeno fúngico, aumento na resistência a um patógeno bacteriano, aumento na resistência a um patógeno viral, uma modulação detectável no nível de um metabólito e uma modulação detectável no proteoma em relação a uma planta de referência e combinações de dois ou mais dos mesmos. A combinação sintética ainda pode incluir uma ou mais de espécies de endófitos bacterianos originários de semente adicionais.

[00039] A combinação sintética pode incluir sementes e o endófito bacteriano originário de semente pode estar associado às sementes como um revestimento sobre a superfície das sementes (por exemplo, um revestimento substancialmente uniforme sobre as sementes). A combinação sintética pode incluir mudas e o endófito bacteriano originário de semente pode ser contatado com as mudas como um spray aplicado a uma ou mais folhas e/ou uma ou mais raízes das mudas.

[00040] A combinação sintética pode ser disposta no interior de um material de embalagem selecionado de um saco, caixa, lata, envelope, pacote ou recipiente. A combinação sintética pode incluir uma quantidade em peso de sementes de 1.000 sementes, onde o material de embalagem compreende opcionalmente um secativo e em que a combinação sintética compreende opcionalmente um agente anti- fúngico. A população bacteriana purificada pode estar localizada sobre a superfície das sementes ou mudas. O endófito bacteriano originário de semente pode ser obtido a partir de um compartimento interno da semente.

[00041] Em outro aspecto, a invenção apresenta um produto agrícola que inclui uma quantidade em peso de 1.000 sementes de uma combinação sintética produzida pela etapa de contato de uma pluralidade das sementes de plantas agrícolas Gramineae com uma formulação líquida que compreende uma população bacteriana em uma concentração de pelo menos 1 CFU por semente de planta agrícola, em que pelo menos 10% das CFUs presentes na formulação são um ou mais endófitos bacterianos derivados de sementes, sob condições tais que a formulação seja associada à superfície das sementes de um modo eficaz para que os endófitos bacterianos originários de semente venham a conferir um benefício às sementes ou a uma cultura compreendendo uma pluralidade de plantas agrícolas produzidas a partir das sementes. Os endófitos bacterianos originários de semente podem estar presentes em uma concentração de cerca de 102 a cerca de 105 CFU/ml ou de cerca de 105 a cerca de 108 CFU/semente. A formulação pode ser um líquido e a concentração bacteriana pode ser de cerca de 103 a cerca de 1011 CFU/ml. A formulação pode ser um gel ou um pó e a concentração bacteriana pode ser de cerca de 103 a cerca de 1011 CFU/g.

[00042] A invenção também apresenta uma formulação agrícola que inclui uma população bacteriana purificada e um veículo aceitável em agricultura, a população bacteriana consistindo essencialmente em um endófito bacteriano originário de semente que exibe: produção de uma auxina, fixação de nitrogênio, produção de um antimicrobiano, produção de um sideroforo, solubilização de fosfato mineral, produção de uma celulase, produção de uma quitinase, produção de uma xila- nase ou produção de acetoína ou combinações de dois ou mais dos mesmos, em que o endófito bacteriano originário de semente está presente em uma quantidade eficaz para conferir um benefício a uma semente de plantas agrícolas Gramineae à qual a formulação é aplicada ou a uma muda de plantas agrícolas à qual a formulação é aplicada. O endófito bacteriano originário de semente pode ser obtido a partir de uma semente cuja superfície foi esterilizada, da superfície de uma muda ou uma semente não esterilizada.

[00043] Em ainda outro aspecto, a invenção apresenta um artigo de manufatura que inclui um material de embalagem; sementes de plantas Gramineae dentro do material de embalagem e pelo menos uma espécie de endófito bacteriano originário de semente associado às sementes. O artigo pode incluir duas ou mais espécies de endófitos bacterianos originários de semente.

[00044] Também é apresentada uma combinação sintética que inclui uma população bacteriana purificada em associação com uma semente ou muda de uma planta agrícola de cereal, em que a popula- ção bacteriana purificada compreende um endófito bacteriano originário de semente capaz de pelo menos um de: produção de uma auxina, nitrogênio fixação, produção de um antimicrobiano, produção de um sideroforo, solubilização de fosfato mineral, produção de uma celulase, produção de uma quitinase, produção de uma xilanase e produção de acetoína ou uma combinação de dois ou mais dos mesmos, em que o endófito bacteriano originário de semente está presente na combinação sintética em uma quantidade eficaz para conferir um benefício às sementes ou mudas ou às plantas agrícolas de cereal derivadas das sementes ou mudas. A combinação sintética pode estar contida dentro de um pacote e é estável ao armazenamento. A população bacteriana purificada pode estar localizada sobre a superfície das sementes ou mudas. O endófito bacteriano originário de semente pode estar presente em uma concentração de pelo menos 1 CFU/semente sobre a superfície de uma semente. O endófito bacteriano originário de semente pode ser obtido ou pode ser obtenível a partir de um compartimento interno da semente. O endófito bacteriano originário de semente pode ser obtido ou pode ser obtenível a partir de um compartimento interno da semente de uma semente ou muda heteróloga. O endófito bacteri- ano originário de semente pode ser obtido ou pode ser obtenível a partir de uma superfície externa de uma semente ou muda heteróloga. O endófito bacteriano originário de semente pode ser exógeno à população microbiana no interior da semente ou mudas. O benefício pode ser herdado pela progênie da planta agrícola. O benefício pode incluir pelo menos dois benefícios, em que a combinação sintética compreende dois ou mais endófitos bacterianos originários de semente.

[00045] Em outro aspecto, a invenção apresenta uma combinação sintética de uma população bacteriana purificada em associação com uma semente ou muda de uma planta agrícola de cereal, em que a combinação sintética é produzida pela etapa de contato das sementes ou mudas com uma formulação que compreende uma população bac- teriana purificada, em que a população bacteriana purificada compreende uma quantidade eficaz de um endófito bacteriano originário de semente capaz de conferir um benefício às sementes ou mudas ou planta agrícola de cereal contatada derivada das sementes ou mudas, o benefício selecionado do grupo que consiste em: um aumento da biomassa da raiz, aumento do comprimento das raízes, aumento da altura, aumento do comprimento da parte aérea, aumento do número de folhas, aumento da eficiência de uso da água, aumento da biomassa em geral, aumento do rendimento de grãos, aumento da taxa de fotossíntese, aumento de tolerância à estiagem, aumento na tolerância ao calor, aumento na tolerância ao sal, aumento na resistência ao estresse por nematoides, aumento na resistência a um patógeno fúngico, aumento na resistência a um patógeno bacteriano, aumento na resistência a um patógeno viral, uma modulação detectável no nível de um metabólito e uma modulação detectável no proteoma em relação a uma planta de referência, sob condições tais que a formulação fica localizada sobre uma superfície externa da semente ou muda de maneira eficaz para que o endófito bacteriano originário de semente venha a conferir o benefício à semente ou muda ou planta agrícola de cereal derivada da semente ou muda e em que o endófito bacteriano originário de semente é capaz de colonização do hospedeiro e/ou replicação dentro de um tecido da planta agrícola de cereal.

[00046] Em ainda outro aspecto, a invenção apresenta uma formulação agrícola que compreende uma população bacteriana purificada que consiste essencialmente em um endófito bacteriano originário de semente capaz de conferir a uma semente, muda ou planta agrícola um benefício selecionado de: aumento na tolerância à estiagem, aumento na resistência ao calor e aumento na tolerância ao sal, em que o endófito bacteriano originário de semente está presente em uma quantidade eficaz para conferir o benefício a uma semente ou muda à qual a formulação é administrada ou a uma planta agrícola derivada da semente ou muda à qual a formulação é administrada e um veículo aceitável em agricultura. O endófito bacteriano originário de semente é obtido ou obtenível a partir de um compartimento interno da semente. O endófito bacteriano originário de semente pode ser obtido ou obtenível a partir de uma superfície externa de uma semente. O endófito bacteriano originário de semente pode ser heterólogo à população microbiana dentro da semente ou muda de cereal contatada. O endófito bacteriano originário de semente pode ser obtido ou obtenível a partir do compartimento interno de um cultivar, variedade ou cultura diferente comparado com a semente ou muda. O endófito bacteriano originário de semente pode ser obtido ou obtenível a partir de uma superfície externa de um cultivar, variedade ou cultura diferente comparado com a semente ou muda. O endófito bacteriano originário de semente é capaz de: produção de uma auxina, fixação de nitrogênio, produção de um antimicrobiano, produção de um sideroforo, solubilização de fosfato mineral, produção de uma celulase, produção de uma quitinase, produção de uma xilanase ou produção de acetoína ou uma combinação de dois ou mais dos mesmos. O endófito bacteriano originário de semente pode ser capaz de gerar uma rede bacteriana na planta agrícola derivada da semente ou muda ou na semente ou muda à qual a formulação é administrada ou no ambiente circundante da planta, semente ou muda e em que a rede bacteriana é capaz de provocar uma modulação detectável no nível de um metabólito na semente, muda ou planta ou uma modulação detectável no proteoma da planta agrícola derivada da semente ou muda. A população bacteriana purificada pode consistir essencialmente em dois endófitos bacterianos originários de semente.

[00047] Em qualquer um dos métodos, combinações sintéticas, produtos agrícolas, formulações agrícolas ou artigos de manufatura, a população bacteriana purificada pode consistir essencialmente em duas ou mais espécies de endófitos bacterianos originários de semente. A população bacteriana purificada pode consistir essencialmente em endófitos bacterianos originários de semente tendo uma sequência de ácido nucleico 16S pelo menos 97% idêntica a um endófito bacteriano selecionado a partir de um gênero mostrado na Tabela 1 ou a partir de uma família mostrada na Tabela 2. A população bacteriana purificada pode consistir essencialmente em uma combinação sinérgica de dois endófitos bacterianos originários de semente. A população bacteriana pode ser estável ao armazenamento. O benefício pode ser selecionado do grupo que consiste em: aumento da biomassa da raiz, aumento do comprimento das raízes, aumento da altura, aumento do comprimento da parte aérea, aumento do número de folhas, aumento da eficiência de uso da água, aumento da biomassa em geral, aumento do rendimento de grãos, aumento da taxa de fotossíntese, aumento na tolerância à estiagem, aumento na tolerância ao calor, aumento na tolerância ao sal, aumento na resistência ao estresse por nematoides, aumento na resistência a um patógeno fúngico, aumento na resistência a um patógeno bacteriano, aumento na resistência a um patógeno viral, uma modulação detectável no nível de um metabólito e uma modulação detectável no proteoma em relação a uma planta de referência ou uma combinação de dois ou mais dos mesmos.

[00048] Em qualquer um dos métodos, combinações sintéticas, produtos agrícolas, formulações agrícolas ou artigos de manufatura, o endófito bacteriano originário de semente pode ser uma espécie bacte- riana que não forma esporos. O endófito bacteriano originário de semente pode exibir: produção de auxinas, produção de um antimicrobi- ano, produção de um sideroforo, produção de uma celulase, produção de uma quitinase, produção de uma xilanase ou produção de acetoína ou combinações dos mesmos. O endófito bacteriano originário de semente pode exibir: produção de auxinas, produção de um sideroforo, solubilização de fosfato mineral, produção de uma celulase, produção de uma quitinase, produção de uma xilanase ou produção de acetoína, mas não aumenta a fixação de nitrogênio em relação a uma planta de referência. O endófito bacteriano originário de semente pode ser estável ao armazenamento. O endófito bacteriano originário de semente pode ser uma espécie que não Bacillus e/ou uma espécie que não Pseudomonas.

[00049] Em qualquer um dos métodos, combinações sintéticas, produtos agrícolas, formulações agrícolas ou artigos de manufatura, o endófito bacteriano originário de semente pode ser obtido a partir de uma outra espécie de planta que não as sementes ou mudas da combinação sintética. O endófito bacteriano originário de semente pode ser obtido a partir de um cultivar de planta diferente do cultivar das sementes ou mudas da combinação sintética. O endófito bacteri- ano originário de semente pode ser obtido a partir de um cultivar de planta que é o mesmo que o cultivar das sementes ou mudas da combinação sintética. O endófito bacteriano originário de semente pode ser obtido a partir de uma superfície externa de uma semente ou muda heteróloga.

[00050] Em qualquer um dos métodos, combinações sintéticas, produtos agrícolas, formulações agrícolas ou artigos de manufatura, a população bacteriana pode incluir um endófito bacteriano originário de semente tendo uma sequência de ácido nucleico 16S que é menos de 97% idêntica a qualquer sequência de ácido nucleico 16S mostrada na Tabela 1. A população bacteriana pode incluir um endófito bacteriano originário de semente tendo uma sequência de ácido nucleico 16S que é pelo menos 97% idêntica a uma sequência de ácido nucleico 16S mostrada na Tabela 1. A população bacteriana pode incluir duas ou mais famílias de endófitos bacterianos derivados de sementes. A população bacteriana pode incluir um primeiro endófito bacteriano originário de semente tendo uma primeira sequência de ácido nucleico 16S e um segundo endófito bacteriano originário de semente tendo uma segunda sequência de ácido nucleico 16S, em que as primeira e segunda sequências de ácido nucleico 16S são menos de 97% idênticas.

[00051] Em qualquer um dos métodos, combinações sintéticas, produtos agrícolas, formulações agrícolas ou artigos de manufatura, a população bacteriana pode incluir um primeiro endófito bacteriano originário de semente e um segundo endófito bacteriano originário de semente, em que os primeiro e segundo endófitos bacterianos originários de semente são independentemente capazes de pelo menos um de produção de uma auxina, fixação de nitrogênio, produção de um antimicrobiano, produção de um sideroforo, solubilização de fosfato mineral, produção de uma celulase, produção de uma quitinase, produção de uma xilanase ou produção de acetoína ou uma combinação de dois ou mais dos mesmos.

[00052] Em qualquer um dos métodos, combinações sintéticas, produtos agrícolas, formulações agrícolas ou artigos de manufatura, a população bacteriana pode incluir um primeiro endófito bacteriano originário de semente e um segundo endófito bacteriano originário de semente, em que os primeiro e segundo endófitos bacterianos originários de semente são capazes de aumentar sinergicamente pelo menos um de: produção de uma auxina, fixação de nitrogênio, produção de um antimicrobiano, produção de um sideroforo, solubilização de fosfato mineral, produção de uma celulase, produção de uma qui- tinase, produção de uma xilanase ou produção de acetoína ou uma combinação de dois ou mais dos mesmos, em uma quantidade eficaz para aumentar a tolerância à estiagem em relação a uma planta de referência.

[00053] Em qualquer um dos métodos, combinações sintéticas, produtos agrícolas, formulações agrícolas ou artigos de manufatura, a população bacteriana pode incluir um primeiro endófito bacteriano originário de semente e um segundo endófito bacteriano originário de semente, em que os primeiro e segundo endófitos bacterianos originários de semente são obtidos a partir do mesmo cultivar. A população bacteriana pode incluir um primeiro endófito bacteriano originário de semente e um segundo endófito bacteriano originário de semente, em que os primeiro e segundo endófitos bacterianos originários de semente são obtidos a partir de diferentes cultivares da mesma planta agrícola.

[00054] Em qualquer um dos métodos, combinações sintéticas, produtos agrícolas, formulações agrícolas ou artigos de manufatura, a população bacteriana pode incluir um primeiro endófito bacteriano originário de semente e um segundo endófito bacteriano originário de semente, em que o primeiro endófito bacteriano originário de semente é capaz de colonizar um primeiro tecido de planta agrícola e em que o segundo endófito bacteriano originário de semente é capaz de colonizar um segundo tecido de planta agrícola não idêntico ao primeiro tecido de planta agrícola.

[00055] Em qualquer um dos métodos, combinações sintéticas, produtos agrícolas, formulações agrícolas ou artigos de manufatura, o endófito bacteriano originário de semente pode ser obtido ou pode ser obtenível a partir de uma semente de cevada, arroz, milho ou trigo. Por exemplo, o endófito bacteriano originário de semente pode ser obtido ou pode ser obtenível a partir de um compartimento interno de uma semente de milho, trigo ou cevada. O endófito bacteriano originário de semente pode ser uma espécie bacteriana que não forma esporos. O endófito bacteriano originário de semente pode ser uma espécie que não Bacillus e/ou uma espécie que não Pseudomonas.

[00056] Em qualquer um dos métodos, combinações sintéticas, produtos agrícolas, formulações agrícolas ou artigos de manufatura, o endófito bacteriano originário de semente pode exibir produção de au- xinas, produção de um antimicrobiano, produção de um sideroforo, produção de uma celulase, produção de uma quitinase, produção de uma xilanase ou produção de acetoína ou combinações de dois ou mais dos mesmos. O endófito bacteriano originário de semente pode ser estável ao armazenamento.

[00057] Em qualquer um dos métodos, combinações sintéticas, produtos agrícolas, formulações agrícolas ou artigos de manufatura, o endófito bacteriano originário de semente pode exibir produção de au- xinas, produção de um sideroforo, solubilização de fosfato mineral, produção de uma celulase, produção de uma quitinase, produção de uma xilanase ou produção de acetoína ou combinações de dois ou mais dos mesmos, mas não aumenta a fixação de nitrogênio em relação a uma planta de referência.

[00058] Em qualquer um dos métodos, combinações sintéticas, produtos agrícolas, formulações agrícolas ou artigos de manufatura, a população bacteriana pode incluir duas ou mais famílias de endófitos bacterianos derivados de sementes ou duas ou mais espécies de en- dófitos bacterianos originários de semente.

[00059] Em qualquer um dos métodos, combinações sintéticas, produtos agrícolas, formulações agrícolas ou artigos de manufatura, o endófito bacteriano originário de semente pode ser uma espécie que não Bacillus e/ou uma espécie que não Pseudomonas.

[00060] A menos que de outro modo definido, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado conforme normalmente entendido por aqueles versados na técnica à qual a presente invenção pertence. Embora métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles descritos aqui possam ser usados para a prática da invenção, métodos e materiais adequados são descritos abaixo. Todas as publicações, pedidos de patente, patentes e outras referências citadas aqui são incorporadas por referência na íntegra. Em caso de conflito, o presente relatório descritivo, incluindo definições, prevalecerá. Além disso, os materiais, métodos e exemplos são apenas ilustrativos e não se destinam ser limitativos.

[00061] Os detalhes de uma ou mais modalidades da invenção são apresentados nos desenhos anexos e na descrição abaixo. Outras características, objetivos e vantagens da invenção serão evidentes a partir da descrição e desenhos e das reivindicações. A palavra "compreendendo" nas reivindicações pode ser substituída por "consistindo essencialmente em" ou por "consiste em", de acordo com a prática habitual em direito de patentes.

DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[00062] A Figura 1A é um gráfico de micróbios originários de semente SYM00254 e SYM00284 que foram revestidos sobre o exterior de sementes de milho com superfície esterilizada, plantadas sob condições axênicas e incubadas durante 7 dias para germinar. A dose distribuída à superfície da semente foi quantificada por meio de diluição em série e colocação em placas de inóculo líquido, enquanto que a população microbiana que colonizou as raízes após 7 dias de incubação foi quantificada através de maceração das raízes, diluição em série, colocação em placas e contagem de colônias para obter a CFU por raiz.

[00063] A Figura 1B representa uma abordagem alternativa para observar a colonização de plantas por endófitos originários de semente ao marcar os micróbios com um plasmídeo contendo GFP e resistência à canamicina. Estes micróbios foram revestidos sobre sementes de milho não esterilizadas, as quais foram secas em um tubo cônico de 50 ml e armazenadas em temperatura ambiente durante uma semana antes de serem plantadas em recipientes contendo areia estéril em uma estufa. Após uma semana de crescimento, os brotos e raízes foram macerados usando "bead beating", diluídas em série para 10X e 1000X antes de colocação em placas e contagem de colônias sob UV para determinar as CFUs de fluorescência verde por planta sobre placas de TSA contendo canamicina. Extratos de plantas de controle foram colocados sobre ágar sem canamicina e desenvolveram colônias que não contêm GFP de vários micróbios não descritos.

[00064] A Figura 2 contém fotografias representativas de mudas. As mudas inoculadas com SYM-00052 (direita) superaram as mudas de controle não inoculadas (à esquerda) sob condições de estresse por sal com NaCl a 100 mM em meio. Isto fornece um exemplo de que micróbios originários de semente conferem promoção de crescimento às sementes de trigo cultivadas sob estresse por sal.

[00065] A Figura 3 contém fotografias representativas de mudas. Foi observado melhorou vigor ou crescimento de plantas de trigo (acima) e milho (abaixo) inoculadas com endófitos transmitidos pela semente. Superior esquerda: sementes de trigo foram inoculadas com SYM00033 e germinadas sob condições normais. Superior direita: mudas de trigo inoculadas com SYM00107 mostram aumento de crescimento sob estresse pela estiagem comparado com controles não inoculados. Inferior esquerda: sementes de milho inoculadas com SYM00090 mostram um aumento de crescimento sob estresse pelo calor quando comparado com os controles. Inferior direita: mudas de milho inoculadas com SYM00596 mostram aumento de crescimento sob estresse por sal.

[00066] A Figura 4 contém fotografias representativas que representam sementes de trigo (cultivar Briggs) que foram inoculadas com o endófito SYM00057B e cultivadas sob condições normais (esquerda), cultivadas na presença de NaCl a 100 mM (superior direita) ou sob estresse pelo calor (inferior direita). Há um aumento no comprimento das raízes de plantas de trigo inoculadas com endófitos transmitidos pela semente.

[00067] A Figura 5 contém fotografias representativas que descrevem que sementes de trigo inoculadas com uma combinação de SYM00057B e SYM00016B (fileira inferior) mostram um aumento de crescimento sob condições de estresse pelo sal quando comparado com os controles (fileira superior). Combinações de micróbios originários de semente conferem aumento de vigor ao trigo.

[00068] A Figura 6 contém fotografias representativas de raízes de plantas que germinaram a partir de sementes não inoculadas (controle) e inoculadas (Sym00090) e foram expostas a condições A) normais, B) estiagem e C) frio. Para condições normais, as plantas foram mantidas em uma câmara de crescimento regulada em 22°C, 60% de umidade relativa e um ciclo de 14 h de luz/10 h de escuro durante 15 dias após o plantio. Para a estiagem, a água foi removida do recipiente inferior na caixa Magenta de dois níveis uma semana após o plantio e a areia foi deixada secar. A colheita foi feita 7 dias após a água ter sido removida, quando os sintomas de murcha apareceram. Para o frio, a temperatura do ar foi regulada em 5°C uma semana após o plantio e mantida por 7 dias. As raízes da planta inoculada não são apenas são mais largas, mas também mostram uma maior quantidade de raízes laterais e pelos nas raízes.

[00069] A Figura 7 é um gráfico que ilustra que os micróbios originários de semente mostram efeitos benéficos sobre uma ampla faixa de doses administradas. Sementes de trigo esterilizadas foram inoculadas com 3,0 x 104, 3,0 x 105 e 3,0 x 106 CFU/semente de micróbios endofíticos SYM00011, SYM00033 e SYM00057B. São mostrados os comprimentos de raiz para cada tratamento, representado como uma percentagem de aumento em relação aos controles falsamente inoculados.

[00070] A Figura 8 contém três gráficos que representam a testagem em campo de micróbios originários de semente quanto aos benefícios para emergência da cultura de cereais. Painel superior: Número de plantas de trigo emergentes na 10' seção mediana das duas fileiras de cada lote de teste. Os números reportados são uma média de contagens de 6 lotes repetidos para cada tratamento. Todas as cepas SYM mostram uma melhora na emergência em relação ao controle sem tratamento. Painel mediano: Melhora no número de plantas de milho emergentes nos lotes de teste secos em relação ao controle não tratado. Os números de emergência foram calculados como uma média de contagens de 6 lotes repetidos para cada tratamento. Todas as cepas SYM mostram melhora na emergência em relação ao controle não tratado, com SYM00260, SYM00290 e SYM00254 mostrando todas melhoras de mais do que 15%. Painel inferior: Melhora no número de plantas de milho que emergiram nos lotes de teste irrigados em relação ao controle não tratado. Os números de emergência foram calculados como uma média de contagens de 6 lotes repetidos para cada tratamento. Todas as cepas SYM mostram uma melhora na emergência em relação ao controle não tratado, com SYM00292 mostrando uma melhora de 15%.

DEFINIÇÕES

[00071] Um "endófito" ou "micróbio endofítico" é um organismo que vive dentro de uma planta ou está de outra forma associado à mesma. Os endófitos podem ocupar o espaço intracelular ou extracelular do tecido da planta, incluindo as folhas, caules, flores, frutos, sementes ou raízes. Um endófito pode ser um organismo bacteriano ou fúngico que pode conferir uma propriedade benéfica a uma planta, tal como um aumento no rendimento, biomassa, resistência ou vigor à sua planta hospedeira. Conforme usado aqui, o termo "micróbio" é, algumas vezes, usado para descrever um endófito.

[00072] Em algumas modalidades, um endófito bacteriano é um en- dófito bacteriano originário de semente. Conforme usado aqui, um "endófito bacteriano originário de semente" se refere a uma população de bactérias associadas com ou derivadas da semente de uma planta gramínea. Por exemplo, um endófito bacteriano originário de semente pode ser encontrado, por exemplo, sementes maduras, secas, intactas (sem fendas visíveis, infecção fúngica ou prematuramente germinadas). As bactérias podem estar associadas com ou ser derivadas da superfície da semente; alternativamente ou além disso, elas podem estar associadas com ou ser derivadas do compartimento interno da semente (por exemplo, uma semente com superfície esterilizada). Em alguns casos, um endófito bacteriano originário de semente é capaz de se replicar dentro do tecido da planta, por exemplo, o interior da semente. Além disso, em alguns casos, o endófito bacteriano originário de semente é capaz de sobreviver à seca.

[00073] Originário de semente significa que a entidade bacteriana é obtido direta ou indiretamente a partir da superfície da semente ou compartimento interno da semente ou é obtenível de uma superfície da semente ou compartimento interno da semente. Por exemplo, uma entidade bacteriana originária de semente pode ser obtida direta ou indiretamente de uma superfície ou compartimento interno da semente quando ela é isolada, ou isolada e purificada, a partir de um preparado de sementes; em alguns casos, a entidade bacteriana originária de semente que foi isolada, ou isolada e purificada, pode ser cultivada sob condições adequadas para produzir uma população bacteriana purificada que consiste essencialmente em um endófito bacteriano originário de semente. Um endófito bacteriano originário de semente pode ser considerado como sendo obtenível da superfície de uma semente ou compartimento interno de uma semente se as bactérias podem ser detectadas sobre ou dentro, ou isoladas, de uma superfície da semente ou compartimento interno de uma planta.

[00074] As composições fornecidas aqui são, de preferência, estáveis. O endófito bacteriano originário de semente é opcionalmente estável ao armazenamento, em que pelo menos 10% das CFUs são viáveis após armazenamento na forma seca (isto é, teor de umidade de 30% ou menos) durante 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais do que 10 semanas a 4°C ou em temperatura ambiente. Opcionalmente, uma formulação estável ao armazenamento é uma formulação seca, uma formulação em pó ou uma formulação liofilizada. Em algumas modalidades, a formulação é formulada para conferir estabilidade à população de endófitos bacterianos. Em uma modalidade, a formulação é substancialmente estável em temperaturas entre cerca de 0°C e cerca de 50°C durante pelo menos cerca de 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 dias ou 1, 2, 3 ou 4 semanas ou 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 meses ou um ou mais anos. Em outra modalidade, a formulação é substancialmente estável em temperaturas entre cerca de 4°C e cerca de 37°C durante pelo menos cerca de 5, 10, 15, 20, 25, 30 ou mais do que 30 dias.

[00075] Uma planta agrícola pode ser uma monocotiledônea (isto é, uma "planta gramínea agrícola") ou uma planta dicotiledônea tipicamente usada em agricultura. Uma planta gramínea agrícola inclui, porém sem limitações, milho (Zea mays), trigo comum (Triticum aestivum), es- pelta (Triticum spelta), trigo espelta (Triticum monococcum), trigo em- mer (Triticum dicoccum), trigo duro (Triticum durum), arroz Asiático (Oryza sativa), arroz Africano (Oryza glaberrima), arroz silvestre (Zizania aquatica, Zizania latifolia, Zizania palustris, Zizania texana), cevada (Hordeum vulgare), sorgo (Sorghum bicolor), painço Finger (Eleusine coracana), painço Proso (Panicum miliaceum), painço Pearl (Pennise- tum glaucum), painço Foxtail (Setaria italic), aveia (Avena sativa), tritica- le (Tritico secale), centeio (Secale cereal), centeio selvagem Russo (Psathyrostachys juncea), bambu (Bambuseae) ou cana-de-açúcar (por exemplo, Saccharum arundinaceum, Saccharum barberi, Saccharum bengalense, Saccharum edule, Saccharum munja, Saccharum offici- narum, Saccharum procerum, Saccharum ravennae, Saccharum robus- tum, Saccharum sinense ou Saccharum spontaneum).

[00076] Uma "planta hospedeira" inclui qualquer planta, particularmente uma planta agrícola, que um micróbio endofítico, tal como um endófito bacteriano originário de semente, pode colonizar. Conforme usado aqui, um micróbio é dito como "colonizador" de uma planta ou semente quando ele pode ser estavelmente detectado dentro da planta ou semente ao longo de um período de tempo, tal como um ou mais dias, semanas, meses ou anos; em outras palavras, um micróbio colonizador não está transitoriamente associado à planta ou semente. A planta hospedeira preferida é uma planta de cereal.

[00077] Conforme usado aqui, uma "planta agrícola de referência" é uma planta agrícola da mesma espécie, cepa ou cultivar ao qual um tratamento, formulação, composição ou preparado de endófito conforme descrito aqui não é administrado/contatado. Plantas agrícolas de referência exemplificativas são cereais. Uma planta agrícola de referência, portanto, é idêntica à planta tratada, exceto quanto à presença do endófito e pode servir como um controle para detecção dos efeitos que o endófito confere à planta.

[00078] "Biomassa" significa a massa ou peso total (fresco ou seco), em um determinado momento, de um tecido de planta, tecidos de planta, uma planta inteira ou uma população de plantas. A biomassa é usualmente fornecida como peso por área unitária. O termo também pode se referir a todas as plantas ou espécies na comunidade (biomassa na comunidade).

[00079] Uma "rede bacteriana" significa uma pluralidade de entidades de endófitos (por exemplo, bactérias, fungos ou combinações dos mesmos) colocalizados em um ambiente, tal como sobre ou dentro de uma planta de cereal agrícola. De preferência, uma rede bacteriana inclui dois ou mais tipos de entidades endofíticas que interagem de forma sinérgica, tais populações endofíticas sinérgicas capazes de conferir um benefício à semente agrícola, muda ou planta derivada das mesmas.

[00080] Um "aumento no rendimento" pode se referir a qualquer aumento no peso da biomassa ou sementes ou frutas, tamanho da semente, número de sementes por planta, número de sementes por área unitária, alqueires por acre, toneladas por acre, quilo por hectare ou rendimento de carboidratos. Tipicamente, a característica particular é designada quando de referência a um aumento da produtividade, por exemplo, aumento da produção de grãos ou aumento no tamanho da semente.

[00081] Uma "planta transgênica" inclui uma planta ou progênie da planta de qualquer geração subsequente derivada da mesma, em que o DNA da planta ou progênie contém um DNA exógeno não naturalmente presente em uma planta não transgênica da mesma cepa. A planta transgênica pode, adicionalmente, conter sequências que são nativas à planta a ser transformada, mas em que o gene "exógeno" tenha sido alterado de modo a alterar o nível ou padrão de expressão do gene, por exemplo, ao usar um ou mais elementos reguladores he- terólogos ou outros.

[00082] Os termos "patógeno" e "patogênico", em referência a uma bactéria, inclui qualquer organismo que é capaz de causar ou afetar uma doença, transtorno ou condição de um hospedeiro que contém o organismo.

[00083] Um "esporo" ou uma população de "esporos" se refere a bactérias que são geralmente viáveis, mais resistentes a influências ambientais, tais como calor e agentes bactericidas, do que as formas vegetativas das mesmas bactérias e, tipicamente, capazes de germinação e crescimento. Bactérias que são "capazes de formação de esporos" são aquelas bactérias que contêm os genes e outras qualidades necessárias para produzir esporos sob condições ambientais adequadas.

[00084] Conforme usado aqui, uma "semente agrícola" é uma semente usada para crescer uma planta tipicamente usada em agricultura (uma "planta agrícola"). A semente pode ser de uma planta monoco- tiledônea ou dicotiledônea e pode ser plantada para produção de um produto agrícola, por exemplo, grão, alimento, fibra, etc. Conforme usado aqui, uma semente agrícola é uma semente que é preparada para plantio, por exemplo, em fazendas para cultivo.

[00085] Em alguns casos, a presente invenção considera o uso de micróbios que são "compatíveis" com produtos químicos agrícolas, por exemplo, um fungicida, um composto antibacteriano ou qualquer outro agente amplamente usado em agricultura, o qual tem o efeito de matar ou de outro modo interferir com o crescimento ideal de micróbios. Conforme usado aqui, um micróbio é "compatível" com um produto químico agrícola quando o micróbio é modificado, tal como por modificação genética, por exemplo, contém um transgene que confere resistência a um herbicida ou é adaptado para crescer, ou de outra forma sobreviver, na concentração do produto químico agrícola usada em agricultura. Por exemplo, um micróbio colocado sobre a superfície de uma semente é compatível com o fungicida metalaxil se ele é capaz de sobreviver às concentrações que são aplicadas sobre a superfície da semente.

[00086] Em algumas modalidades, um veículo agricolamente compatível pode ser usado para formular uma formulação agrícola ou outra composição que inclui um preparado bacteriano purificado. Conforme usado aqui, um "veículo agricolamente compatível" se refere a qualquer material, com exceção da água, o qual pode ser adicionado a uma semente ou muda sem causar ou ter um efeito adverso sobre a semente (por exemplo, redução de germinação da semente) ou a planta que cresce a partir da semente ou similar.

[00087] Conforme usado aqui, uma "porção" de uma planta se refere a qualquer parte da planta e pode incluir tecidos e/ou órgãos distintos e é usada alternadamente com o termo "tecido" por toda parte.

[00088] Uma "população" de plantas, conforme usado aqui, pode se referir a uma pluralidade de plantas que foram submetidas aos mesmos métodos de inoculação descritos aqui ou uma pluralidade de plantas que são a progênie de uma planta ou grupo de plantas que foram submetidas aos métodos de inoculação. Além disso, uma população de plantas pode ser um grupo de plantas que são cultivadas a partir de sementes revestidas. As plantas dentro de uma população serão, tipicamente, da mesma espécie e, tipicamente, também compartilharão uma derivação genética em comum.

[00089] Um "ambiente de referência" se refere ao ambiente, tratamento ou condição da planta na qual uma medição é feita. Por exemplo, a produção de um composto em uma planta associada a uma população bacteriana purificada (por exemplo, um endófito bacteriano originário de semente) pode ser medida em um ambiente de referência de estresse pela estiagem e comparada com os níveis do composto em uma planta agrícola de referência sob as mesmas condições de estresse pela estiagem. Alternativamente, os níveis de um composto em planta associada a uma população bacteriana purificada (por exemplo, um endófito bacteria- no originário de semente) e a planta agrícola de referência podem ser medidos sob condições idênticas de nenhum estresse.

[00090] Conforme usado aqui, um ácido nucleico tem "homologia" ou é "homólogo" a um segundo ácido nucleico se a sequência de ácido nucleico tem uma sequência similar à segunda sequência de ácido nu- cleico. Os termos "identidade", "identidade de sequência percentual" ou "idênticas", no contexto de sequências de ácido nucleico, se referem aos resíduos nas duas sequências que são iguais quando alinhadas para correspondência máxima. Há uma série de diferentes algoritmos conhecidos na técnica que podem ser usados para medir a identidade de sequências de nucleotídeos. Por exemplo, sequências de polinucleo- tídeos podem ser comparadas usando o FASTA, Gap ou Bestfit, os quais são programas no Wisconsin Package Versão 10.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wis. O FASTA fornece alinhamentos e a identidade de sequência percentual das regiões de melhor sobreposição entre as sequências de consulta e pesquisa. Pearson, Methods Enzymol. 183: 63-98 (1990). O termo "homologia substancial" ou "similaridade substancial", quando de referência a um ácido nucleico ou fragmento do mesmo indica que, quando otimamente alinhado com inserções ou eliminações de nucleotídeos apropriadas com outro ácido nu- cleico (ou sua cadeia complementar), há identidade das sequências de nucleotídeos em pelo menos cerca de 76%, 80%, 85% ou pelo menos cerca de 90% ou pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ou 100% das bases de nucleotídeo, camundongo medido por qualquer algoritmo de identidade de sequência bem conhecido, tal como FASTA, BLAST ou Gap, conforme discutido acima.

[00091] Conforme usado aqui, os termos "unidade taxônomica operacional", "OTU", "táxon", "agrupamento hierárquico" e "agrupamento" são usados alternadamente. Uma unidade taxônomica operacional (Operational Taxon Unit - OTU) se refere a um grupo de um ou mais organismos que compreende um nó em uma árvore de agrupamento. O nível de um agrupamento é determinado por sua ordem hierárquica. Em uma modalidade, uma OTU é um grupo assumido, por tentativa, como sendo um táxon válido para fins de análise filogenética. Em outra modalidade, uma OTU é qualquer uma das unidades taxonômicas sob estudo. Em ainda outra modalidade, é atribuído uma OTU um nome e um valor. Por exemplo, uma OTU pode representar um domínio, um subdomínio, um reino, um sub-reino, filo, um subfilo, uma classe, uma subclasse, uma ordem, uma subordem, uma família, uma subfa- mília, um gênero, um subgênero ou uma espécie. Em algumas modalidades, OTUs podem representar um ou mais organismos do reinos eubactérias, protistas ou fungos em qualquer nível de uma ordem hierárquica. Em algumas modalidades, uma OTU representa uma ordem procariota ou fúngica.

[00092] Conforme usado aqui, uma "unidade formadora de colônias" ("Colony Forming Unit - cfu") é usado como uma medida de micro-organismos viáveis em uma amostra. Uma CFU é uma célula viável individual capaz de formação sobre um meio sólido, uma colônia visível cujas células individuais são derivadas por divisão celular de uma célula parental.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[00093] Conforme demonstrado aqui, plantas agrícolas, em particular cereais, parecem se associar a micro-organismos simbióticos denominados endófitos, em particular fungos e bactérias, que podem ter sido importantes durante a evolução e podem contribuir para a sobrevivência e desempenho da planta. No entanto, os processos agrícolas modernos podem ter perturbado esta relação, resultando em um aumento de perdas de culturas, diminuição na resistência a estresse, perda de biodiversidade e aumento da dependência de substâncias químicas externas, fertilizantes e outras práticas agrícolas insustentáveis. Há uma necessidade de novos métodos para a geração de plantas com novas propriedades de microbioma que possam aumentar de forma sustentável o rendimento, resistência ao estresse e diminuir o uso de fertilizantes e produtos químicos.

[00094] Atualmente, a visão geralmente aceita de comunidades en- dofíticas de planta se concentra em sua derivação homóloga, predominantemente das comunidades no solo nas quais as plantas são cul- tivadas (Hallman, J. et al., (1997) Canadian Journal of Microbiology 43 (10): 895-914). Ao observar a sobreposição taxonômica entre a microbiota endofítica e o solo em A. thaliana, foi dito: "Nossa definição rigorosa de um microbioma de compartimento endofítico deve facilitar a dissecção controlada de interações planta-micróbio derivados de comunidades complexas no solo" (Lundberg et al. (2012) Nature 488, 8690). Há um forte suporte na técnica para o solo que representa o repositório a partir do qual são derivados endófitos de planta. New Phytolo- gist (2010) 185: 554-567. Interações planta-micróbio notáveis, tais como fungos micorrizais e rizóbios bacterianos, se adaptam ao paradigma de colonização com base no solo de plantas hospedeiras e parecem se estabelecer primariamente independente das sementes. Como um resultado de focar atenção sobre a derivação de endófitos do solo nos quais a planta agrícola alvo está crescendo atualmente, houve uma incapacidade de atingir melhoras comercialmente significativas nos rendimentos das plantas e outras características das plantas, tais como aumento da biomassa das raízes, aumento de comprimento das raízes, aumento da altura, aumento no comprimento da parte aérea, aumento no número de folhas, aumento da eficiência de uso da água, aumento da biomassa em geral, aumento no rendimento de grãos, aumento na taxa de fotossíntese, aumento na tolerância à estiagem, aumento na tolerância ao calor, aumento na tolerância ao sal, aumento na resistência ao estresse a nematoide, aumento na resistência a um patógeno fúngico, aumento na resistência a um patógeno bacteriano, aumento na resistência a um patógeno viral, uma modulação detectá- vel no nível de um metabólito e uma modulação detectável no pro- teoma em relação a uma planta de referência.

[00095] Em parte, a presente invenção descreve novos preparados de endófitos derivados de sementes e a criação de combinações sintéticas de sementes e/ou mudas de cerais com endófito derivados de semente heterólogos e formulações que contêm as combinações sintéticas, bem como o reconhecimento de que tais combinações sintéticas exibem uma diversidade de propriedades benéficas presentes nas plantas agrícolas e populações de endófitos associadas recém-criadas pelos presentes inventores. Tais propriedades benéficas incluem metabolismo, transcrição, alterações do proteoma, morfologia e resistência a uma variedade de estresses ambientais e a combinação de uma pluralidade de tais propriedades.

[00096] Pouca atenção tem sido dada na técnica à compreensão do papel das sementes como reservatórios para micróbios que podem povoar eficientemente a endosfera de plantas de cereais. Embora o conceito de que as sementes podem ser portadoras de patógenos de plantas tenha sido promovido por Baker e Smith (Annu Rev Phytopa- thol 14: 311-334 (1966)) e o entendimento de que patógenos bacteria- nos e fúngicos são conhecidos por serem capazes de infectar a semente, a capacidade de aproveitar endófitos derivados de um largo espectro de sementes para conferir heterologamente vantagens individuais ou múltiplas às culturas de cereais foi era anteriormente reconhecida. Uma vez que a presença de patógenos detectáveis em um lote de sementes pode requerer a destruição de um grande número de germoplasma agrícola (Gitaitis, R. e Walcott, R. (2007) Annu Rev. Phytopathol 45: 371-97), as preocupações com a segurança cercaram a consideração de micróbios associados à semente ou endófitos que não do solo. Além disso, quando são detectados patógenos de sementes, sua transferência para a planta em crescimento pode ser altamente ineficiente. Por exemplo, um estudo de transmissão com base em sementes do patógeno de semente Pantoea stewartii, descobriu que a semente produzida a partir de uma população de plantas infectadas com patógenos deu origem a mudas infectadas em apenas 0,0029% dos casos (1 de 34.924 plantas) e grãos artificialmente infectados de ram origem a mudas infectadas em apenas 0,022% dos casos (Block, C.C. et al., (1998). Plant Disease 82 (7): 775-780). Assim, acredita-se anteriormente que a eficiência com a qual as plantas introduzem micróbios em suas sementes e com a qual os micróbios dentro das sementes se propagam dentro dos tecidos das plantas resultantes era baixa e, muitas vezes, substancialmente variável. Assim, o potencial para que o conteúdo microbiano dentro das sementes de cereais povoasse a planta resultante não era claro.

[00097] O potencial para que sementes de cereais agrícolas sirvam como reservatórios para micróbios não patogênicos também permanece controverso (Hallman, J. et al., (1997) Canadian Journal of Microbiology 43 (10): 895-914). Sato et al. não detectaram quaisquer bactérias no interior de sementes de arroz ((2003), em Morishima, H. (ed.) The Natural History of Wild Rice - Evolution Ecology of Crop, páginas 91-106) e Mundt e Hinkle obtiveram endófitos apenas de amostras de sementes onde os envoltórios das sementes tenham sido quebrados ou fraturados em 29 tipos de sementes de plantas (Appl. Environ Microbiol. (1976) 32 (5): 694-8). Outro grupo detectou populações bacte- rianas simplesmente dentro de sementes de arroz que variam, quanto ao tamanho da população, de 102 a 106 CFU/g de peso fresco (Oku- nishi, S. et al., (2005) Microbes and Environment. 20: 168-177). Ro- senblueth et al. descreveram sementes que abrigam comunidades microbianas muito simples com variabilidade significativa das comunidades microbianas entre as sementes de milho individuais, incluindo variabilidade substancial entre sementes colhidas na mesma espiga (Ro- senblueth, M. et al., Seed Bacterial Endophytes: Common Genera, Seed-to-Seed Variability and Their Possible Role in Plants; Proc. XXVIIIth IHC - IS on Envtl., Edaphic & Gen. Factors; Affecting Plants, Seeds and Turfgrass; Eds.: G.E. Welbaum et al. Acta Hort. 938, ISHS 2012).

[00098] Estes resultados demonstram limitações reconhecidas na técnica em relação à tentativa de uso de endófitos derivados de sementes; isto é, sementes de milho parecem conter diversidade taxo- nômica limitada e a microbiota de sementes individuais produzidas por plantas é, muitas vezes, distinta, indicando que pode não existir simbiontes individuais derivados de sementes capazes de conferir benefícios através de uma grande população de plantas agrícolas e, especificamente, o uso de endófitos nas sementes. Por exemplo, a caracterização de ~ 15 sementes reunidas de diversos cultivares do gênero Zea mostrou que as populações de sementes de milho tendem a abrigar um número muito limitado de grupos taxonômicos que parecem ser conservados através de variantes modernas e ancestrais e que o conteúdo das sementes de milho de tais grupos ta- xonômicos é baixo e substancialmente variável. Não está claro se a presença de tais grupos taxonômicos limitados resultou de condições comuns de armazenamento, contaminação ambiental ou um potencial de transmissão vertical de micróbios através das sementes e também não se conhecia a aplicabilidade de tais grupos taxonômicos limitados no aumento da produção agrícola. Notavelmente, foi mostrado que 99% destas cepas conferem efeitos prejudiciais ou carecem de efeitos benéficos sobre plantas agrícolas, por exemplo, quando testadas em um ensaio de crescimento com batatas (isto é, uma cultura que não cereal) (Johnston-Monje D., Raizada M.N. (2011) Conservation and Diversity of Seed Associated Endophytes in Zea across Boundaries of Evolution, Ethnography and Ecology. PLoS ONE 6(6): e20396. doi:10.1371/journal.pone.0020396). Além disso, alguns dos micróbios isolados trazem relação evolutiva com patógenos de plantas, tornando possível que tais micróbios representem um reservatório latente de patógenos, em vez de constituintes potencialmente benéficos.

[00099] Surpreendentemente, descobriu-se aqui que endófitos derivados de sementes pode conferir vantagens significativas às culturas de cereais, abrangendo de crescimento sob condições normais e sob estresse, expressão alterada de hormônios chave na planta, expressão alterada de transcritos chave na planta e outras características desejáveis. São fornecidas novas composições, métodos e produtos relacionados à capacidade da nossa invenção de superar as limitações do estado da técnica, de modo a conferir aumentos confiáveis no rendimento de cereais, biomassa, germinação, vigor, resistência ao estresse e outras propriedades às culturas agrícolas.

[000100] A invenção descrita aqui é surpreendente por várias razões, com base nas demonstrações anteriores na técnica. Notavelmente, há uma falta de clareza relacionada ao fato se endófitos estão associados a sementes de cereais saudáveis, se micróbios isolados a partir de sementes de cereal poderiam colonizar eficientemente o cereal hospedeiro se colocados sobre o exterior de uma semente ou muda e se tais micróbios confeririam um efeito benéfico ou efeitos prejudiciais ao cereal hospedeiro. Ainda, não está claro se a aplicação heteróloga de tais micróbios às sementes de cereais diferentes daquelas das quais eles foram derivados poderia conferir efeitos benéficos.

[000101] Conforme descrito aqui, micróbios benéficos podem ser robustamente derivados de sementes agrícolas, opcionalmente cultivados, administrados heterologamente às sementes ou mudas de cereais agrícolas e colonizar os tecidos de plantas resultantes com alta eficiência para conferir várias propriedades benéficas. Isto é surpreendente, dada a variabilidade observada na técnica quanto ao isolamento de micróbios de sementes saudáveis e as observações anteriores de colonização ineficiente de tecidos da planta hospedeira por patóge- nos de semente. Além disso, a capacidade de endófitos derivados de sementes heterologamente colocados de colonizar sementes e mudas a partir do exterior das sementes é surpreendente, dado que tais endó- fitos podem ser isolados de tecidos internos da semente e, portanto, não requerem originalmente a capacidade de penetrar externamente e invadir os tecidos do hospedeiro.

[000102] Caracterização prévia do teor microbiano de sementes indicou que as concentrações microbianas em sementes pode ser variável e são, em geral, muito baixas (isto é, menos de 10, 100, 103, 104, 105 CFU/semente). Como tal, não estava claro se concentrações alteradas ou aumentadas de micróbios associados às sementes poderiam ser benéficas. Foi descoberto que os micróbios podem conferir propriedades benéficas através de uma faixa de concentrações.

[000103] Foi descoberto que endófitos derivados de sementes podem ser colocados heterologamente sobre mudas de um cultivar, espécie ou tipo de cultura de cereal distinto e conferir benefícios a estes novos receptores. Por exemplo, os endófitos derivados de sementes de cultivares de milho são heterologamente fornecidos a cultivares de trigo para conferir um benefício. Isto é surpreendente, dadas as observações de preferências de microbioma distintos em plantas mamíferos hospedeiros distintos e, em particular, a probabilidade de que os micróbios derivados de sementes tenham coevoluído para serem especializados para um hospedeiro particular.

[000104] Foi descoberto ainda que combinações de endófitos derivados de sementes heterologamente colocados conferem vantagens aditivas às plantas, incluindo várias propriedades funcionais, e resultam em sementes, mudas e plantas hospedeiras que exibem propriedades agronômicas individuais ou múltiplas aprimoradas.

[000105] Em geral, o presente Pedido fornece métodos e materiais para conferir um benefício a uma semente ou muda de uma planta gramínea agrícola usando populações bacterianas purificadas que incluem novos endófitos originários de semente que são únicos pelo fato de que eles foram isolados de sementes de gramíneas. Tais endófitos bacterianos derivados de sementes podem conferir propriedades benéficas à semente, muda ou planta gramínea agrícola derivada das sementes ou mudas, incluindo benefícios para o metabolismo, transcrição, alterações de proteoma, morfologia e resistência a uma variedade de estresses ambientais e combinações de tais propriedades.

[000106] Conforme descrito aqui, combinações sintéticas que incluem uma planta hospedeira, tal como uma planta gramínea agrícola, associada a uma população bacteriana purificada que contém um en- dófito, por exemplo, um endófito bacteriano originário de semente, podem ser usadas para conferir o benefício a uma semente, muda ou planta agrícola derivada da semente ou muda. A combinação sintética pode ser produzida, por exemplo, por meio de inoculação, aplicação à folhagem (por exemplo, através de pulverização) ou às sementes (por exemplo, revestimento de sementes), enxertia, imersão da raiz, en- charcamento do solo ou infecção de uma planta hospedeira, tecido de uma planta hospedeira ou uma semente ou combinações dos mesmos, conforme descrito aqui. Em qualquer um dos métodos, qualquer uma de tais técnicas pode ser usada para fazer as combinações sintéticas. Inoculação, aplicação à folhagem ou sementes ou infecção pode ser particularmente útil.

[000107] Em algumas modalidades, a invenção usa micróbios que são heterólogos a uma semente ou planta quando de produção das combinações sintéticas ou formulações agrícolas. Um micróbio é considerado heterólogo à semente ou planta se a semente ou muda que é não modificada (por exemplo, uma semente ou muda que não é tratada com uma população de endófitos bacterianos descrita aqui) não contém níveis detectáveis do micróbio. Por exemplo, a invenção considera combinações sintéticas de sementes ou mudas de plantas agrícolas (por exemplo, plantas gramíneas agrícolas) e uma população de micróbios endófitos (por exemplo, um endófito bacteriano originário de semente), em que a população microbiana é "heterologamente colocada" sobre a superfície externa ou dentro de um tecido da semente ou muda agrícola em uma quantidade eficaz para colonizar a planta. Um micróbio é considerado "heterologamente colocado" sobre a superfície ou dentro de uma planta (ou tecido) quando o micróbio é aplicado ou colocado sobre a planta em um número que não é encontrado na planta antes de aplicação do micróbio. Por exemplo, uma população de endófitos bacterianos que é colocada sobre em uma superfície externa ou dentro da semente pode ser uma bactéria endofítica que pode estar associada à planta madura, mas não é encontrada sobre a superfície ou dentro da semente. Como tal, um micróbio é considerado heterologamente colocado quando aplicado sobre a planta que não têm naturalmente o micróbio sobre a sua superfície ou dentro do tecido particular ao qual o micróbio é colocado ou não tem naturalmente o micróbio sobre sua superfície ou dentro do tecido particular no número que está sendo aplicado. Na verdade, vários dos micróbios endofíticos descritos aqui não foram detectados, por exemplo, em qualquer uma das sementes de milho coletadas, conforme determinado por meio de métodos altamente sensíveis.

[000108] Em algumas modalidades, um micróbio pode ser "endógeno" a uma semente ou planta. Conforme usado aqui, um micróbio é considerado "endógeno" a uma planta ou semente se o micróbio é derivado, ou de outro modo encontrado, da semente ou planta ou qualquer planta ou semente da mesma espécie. Em modalidades nas quais um micróbio endógeno é aplicado, o micróbio endógeno é aplicado em uma quantidade que difere dos níveis normalmente encontrados na planta. ENDÓFITOS BACTERIANOS ORIGINÁRIOS DE SEMENTE

[000109] Em algumas modalidades, o presente Pedido se refere a populações bacterianas purificadas que contêm endófitos bacterianos derivados de sementes, por exemplo, de milho, trigo, arroz ou cevada, composições tais como formulações agrícolas ou artigos de manufatura que incluem tais populações bacterianas purificadas, bem como métodos de uso de tais populações bacterianas para fazer combinações sintéticas ou produtos agrícolas. Um endófito bacteriano originário de semente usado em uma composição ou usado para fazer uma composição sintética pode ser obtido do mesmo cultivar ou espécie de planta agrícola à qual a composição está sendo aplicada ou pode ser obtido de um cultivar ou espécie de planta agrícola diferente.

[000110] Muitas espécies de bactérias são sensíveis às condições de secagem e desidratação. Surpreendentemente, os endófitos bacte- rianos descritos aqui foram isolados a partir de sementes maduras secas de gramíneas, incluindo sementes de milho, arroz e trigo. A recuperação de endófitos bacterianos viáveis a partir destas sementes maduras secas demonstra que, ao contrário da maioria das outras bactérias, estes endófitos bacterianos derivados de sementes são capazes de sobreviver sob condições de estiagem. Portanto, em uma modalidade, a população bacteriana purificada contendo endófitos bacteria- nos originários de semente é tolerante à estiagem. Por exemplo, uma porção substancial da população (por exemplo, pelo menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 ou mais do que 99%) dos endófitos bacterianos originários de semente podem sobreviver em níveis de teor de umidade de 30% ou menos, por exemplo, 25% ou menos, 20% ou menos, 15% ou menos, 12% ou menos, 10% ou menos ou 8% ou menos, por um período de pelo menos 1 dia, por exemplo, pelo menos 3 dias, pelo menos 5 dias, pelo menos 7 dias, pelo menos 10 dias, pelo menos 14 dias, pelo menos 21 dias, pelo menos 30 dias, pelo menos 45 dias, pelo menos 60 dias ou mais, dentro das sementes de uma planta gramínea que são armazenadas em entre 1°C e 35°C.

[000111] Em outra modalidade, o endófito bacteriano originário de semente é capaz de formar esporos. Em ainda outra modalidade, pelo menos 1% da população de endófitos bacterianos originários de semente, por exemplo, pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% ou mais são usados na forma de esporos.

[000112] Em algumas modalidades, o endófito bacteriano originário de semente pode ser cultivado em um meio de cultura ou pode ser adaptado para cultura em um meio de cultura.

[000113] Em algumas modalidades, é usada uma população bacteri- ana purificada que inclui dois ou mais (por exemplo, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ou mais do que 25) endófitos bacterianos originários de semente diferentes, por exemplo, obtidos a partir de diferentes famílias ou diferentes gêneros de bactérias ou do mesmo gênero, mas diferentes espécies de bactérias. As sementes dos diferentes endófitos bacte- rianos podem ser obtidas do mesmo cultivar de planta agrícola (por exemplo, mesma planta de milho, trigo, arroz ou cevada), diferentes cultivares da mesma planta agrícola (por exemplo, dois ou mais cultivares de milho, dois ou mais cultivares de trigo, dois ou mais cultivares de arroz ou dois ou mais cultivares de cevada) ou diferentes espécies do mesmo tipo de planta agrícola (por exemplo, duas ou mais diferentes espécies de milho, duas ou mais diferentes espécies de trigo, duas ou mais espécies diferentes de arroz ou duas ou mais diferentes espécies de cevada). Em modalidades nas quais dois ou mais endófitos bacterianos derivados de sementes são usados, cada endófito bacteri- ano originário de semente pode ter diferentes propriedades ou atividades, por exemplo, produzir diferentes metabólitos, produzir diferentes enzimas, tais como diferentes enzimas hidrolíticas, conferir diferentes traços benéficos ou colonizar diferentes partes de uma planta (por exemplo, folhas, caules, flores, frutos, sementes ou raízes). Por exemplo, um endófito bacteriano originário de semente pode colonizar um primeiro tecido e um segundo endófito bacteriano originário de semente pode colonizar um tecido que difere do primeiro tecido. Combinações de endófitos bacterianos são discutidas em detalhes abaixo.

[000114] Em uma modalidade, o endófito é um micróbio endofítico isolado de uma planta diferente da planta inoculada. Por exemplo, em uma modalidade, o endófito é um endófito isolado de uma planta diferente da mesma espécie que a planta inoculada. Em alguns casos, o endófito é isolado de uma espécie relacionada à planta inoculada.

[000115] A criação de plantas para a agricultura, bem como as práticas culturais usadas para combater patógenos microbianos, podem ter resultado na perda, em cultivares modernos, dos endófitos presentes em seus ancestrais selvagens ou tais práticas podem ter, inadvertidamente, promovido outras interações planta-endófito novas ou raras ou, de outra forma, alterado a população microbiana. Nossa hipótese de que uma diversidade e titulação alterada de endófitos no ancestral poderia se correlacionar com uma faixa alterada de respostas fisiológicas decorrentes da simbiose que permite que a planta se adapte melhor ao ambiente e tolere estresses. De modo a examinar grupos de plantas quanto a endófitos potencialmente úteis, sementes de seus ancestrais selvagens, parentes selvagens, variedades primitivas, variedades modernas, linhagens modernas e variedades agronômicas modernas de elite são rastreadas quanto aos endófitos microbianos por meio de cultura e métodos independentes de cultura, conforme descrito aqui.

[000116] Em alguns casos, as plantas são inoculadas com endófitos que são heterólogos à semente da planta inoculada. Em uma modalidade, o endófito é derivado de uma planta de outra espécie. Por exemplo, um endófito que é normalmente encontrado em dicotiledó- neas é aplicado a uma planta monocotiledônea (por exemplo, inoculação de milho com um endófito derivado de feijão ou soja) ou vice- versa. Em outros casos, o endófito a ser inoculado em uma planta é derivado de uma espécie relacionada à planta que está sendo inoculada. Em uma modalidade, o endófito é derivado de um táxon relacionado, por exemplo, de uma espécie relacionada. A planta de outra espécie pode ser uma planta agrícola. Por exemplo, um endófito derivado de Hordeum irregulare pode ser usado para inocular uma planta Hor- deum vulgare L. Alternativamente, ele é derivado de uma planta "selvagem" (isto é, uma planta não agrícola). Por exemplo, os endófitos normalmente associados ao algodão selvagem Gossypium klotzschia- num são úteis para inocular variedades comerciais de plantas Gos- sypium hirsutum. Como um exemplo alternativo de derivação de um endófito de uma planta "selvagem", endófitos bacterianos isolados da orquídea do Sudeste Asiático, Cymbidium eburneum, podem ser isolados e testados quanto à sua capacidade de beneficiar o desenvolvimento de mudas e a sobrevivência de culturas agrícolas, tais como o trigo, milho, soja e outros (Faria, D.C. et al., (2013) World Journal of Microbiology and Biotechnology. 29 (2). páginas 217-221). Em outros casos, o endófito pode ser isolado de uma espécie ancestral da planta inoculada. Por exemplo, um endófito derivado de Zea diploperennis pode ser usado para inocular uma variedade comercial de milho moderna ou Zea mays.

[000117] Em algumas modalidades, uma população bacteriana purificada contém endófitos bacterianos derivados de sementes de uma ou mais (por exemplo, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez ou mais) famílias selecionadas do grupo que consiste em Aci- dithiobacillaceae, Actinosynnemataceae, Aerococcaceae, Aeromona- daceae, Alcaligenaceae, Alteromonadaceae, Bacillaceae, Bdellovibrio- naceae, Bradyrhizobiaceae, Brucellaceae, Burkholderiaceae, Car- nobacteriaceae, Caulobacteraceae, Cellulomonadaceae, Chitinopha- gaceae, Chromatiaceae, Clostridiaceae, Comamonadaceae, Coriobac- teriaceae, Corynebacteriaceae, Deinococcaceae, Ectothiorhodospira- ceae, Enterobacteriaceae, Flavobacteriaceae, Halomonadaceae, Hyphomicrobiaceae, Lachnospiraceae, Lactobacillaceae, Methylobac- teriaceae, Microbacteriaceae, Micrococcaceae, Moraxellaceae, Myco- bacteriaceae, Neisseriaceae, nocardiaceae, Oxalobacteraceae, Paeni- bacillaceae, Planococcaceae, Propionibacteriaceae, Pseudonocardia- ceae, Rhizobiaceae, Rhodospirillaceae, Sphingobacteriaceae, Sphin- gomonadaceae, Streptomycetaceae, Tissierellaceae, Weeksellaceae, Xanthobacteraceae e Xanthomonadaceae.

[000118] Em uma modalidade, a população bacteriana purificada inclui endófitos bacterianos derivados de sementes de uma ou mais famílias selecionados do grupo que consiste em Xanthomonadaceae, Sphingomonadaceae, Weeksellaceae, Microbacteriaceae, Micrococ- caceae, Methylobacteriaceae, Xanthomonadaceae, Rhizobiaceae, Pa- enibacillaceae, Staphylococcaceae, Enterobacteriaceae, Pseudomo- nadaceae e Bacillaceae.

[000119] Em algumas modalidades, a população bacteriana purificada inclui endófitos bacterianos derivados de sementes de um ou mais (por exemplo, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez ou mais) dos gêneros selecionados do grupo que consistem em Achro- mobacter, Acidithiobacillus, Acidovorax, Acidovoraz, Acinetobacter, Aerococcus, Aeromonas, Agromyces, Ancylobacter, Arthrobacter, Azospirillum, Bacillus, Bdellovibrio, Bosea, Bradyrhizobium, Brevibaci- llus, Brevundimonas, Burkholderia, Cellulomonas, Cellvibrio, Chryse- obacterium, Citrobacter, Clostridium, Corynebacterium, Cupriavidus, Curtobacterium, Curvibacter, Deinococcus, Desemzia, Devosia, Dok- donella, Dyella, Enhydrobacter, Enterobacter, Enterococcus, Erwinia, Escherichia, Finegoldia, Flavisolibacter, Flavobacterium, Frigoribacte- rium, Hafnia, Halomonas, Herbaspirillum, Klebsiella, Kocuria, Lactobacillus, Leclercia, Lentzea, Luteibacter, Luteimonas, Massilia, Methylo- bacterium, Microbacterium, Micrococcus, Microvirga, Mycobacterium, Neisseria, Nocardia, Oceanibaculum, Ochrobactrum, Oxalophagus, Paenibacillus, Panteoa, Pantoea, Plantibacter , Propionibacterium, Propioniciclava, Pseudomonas, Pseudonocardia, Pseudoxanthomo- nas, Psychrobacter, Rheinheimera, Rhizobium, Rhodococcus, Rosea- teles, Ruminococcus, Sediminibacillus, Sediminibacterium, Serratia, Shigella, Shinella, Sphingobacterium, Sphingomonas, Sphingopyxis, Sphingosinicella, Staphylococcus, Stenotrophomonas, Strenotropho- monas, Streptomyces, Tatumella, Tepidimonas, Thermomonas, Thiobacillus, bactéria não cultivada, Variovorax e Xanthomonas.

[000120] Em algumas modalidades, a população bacteriana purificada não inclui pelo menos um de Acetobacter sp., Acidovorax facilis, Azospirillum brasilense, Azospirillum lipoferum, Azospirillum sp., Azo- tobacter sp., Azotobacter vinelandii, Bacillus amyloliquefaciens FZB42, Bacillus amyloliquefaciens cepa D747, Bacillus amyloliquefaciens TJ1000, Bacillus amyloliquefaciens TM45, Bacillus chitinosporus, Bacillus firmus, Bacillus firmus NCIM 2637, Bacillus firmus I-1582, Bacillus laterosporus, Bacillus licheniformis, Bacillus licheniformus, Bacillus ma- rinus, Bacillus megaterium, Bacillus megaterium var. phosphaticum, Bacillus megatherium, Bacillus oleronius, Bacillus pumilus, Bacillus pumilus QST 2808, Bacillus sp., Bacillus subtilis, Bacillus subtilis FZB24, Bacillus subtilis MBI 600, Bacillus subtilis BSF4, Bacillus subti- lis MBI600, Bacillus subtilis QST 713, Bacillus thuringensis var Kurstaki (NCIM 2514), Bacillus thuringiensis aizawai, Bacillus thuringiensis ku- rstaki, Bacillus thuringiensis kurstaki cepa EG7841, Bacillus thuringien- sis kurstaki cepa SA-11, Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki ABTS- 351, Bacillus thuringiensis SV kurstaki EG 2348, Bacillus thuringiensis var Israelensis, Bacillus thuringiensis, variedade Kurstaki, serotipo 3A 3B, Bacillus thuringiensis, subsp. aizawai cepa ABTS-1857, Bacillus thuringiensis, subsp. israelensis, cepa AM 65-52, Chromobacterium subtsugae cepa PRAA4-1, Delftia acidovorans, Frateuria aurantia, Lactobacillus casei, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus plantarum, Lactococcus lactus, Methylobacterium mesophilicum, Methylobacterium organophilum, Me- thylobacterium extorquens, Paenibacillus polymyxa, Pasteuria spp., Pseudomonas spp., Pseudomonas fluorescens, Rhizobium sp., Rho- dococcus rhodochrous, Rhodopseudomonas palustris, Streptomyces lydicus WYEC 108, Streptomyces ray ou Thiobacillus thiooxidans.

[000121] Em algumas modalidades, a população fúngica purificada não inclui pelo menos um de Acremonium butyri, Ampelomyces quis- qualis, Ampelomyces quisqualis (DSM 2222), Ampelomyces quisqualis M-10, Arthrobotrys oligospora, Aspergillus oryzae, Beauvaria bassiana cepa ATCC 74040, Beauveria bassiana, Beauveria bassiana (NCIM 1216 ATCC 26851), Beauveria bassiana cepa GHA, Beauveria bassia- na cepa GHA 1991, Candida utilis, Chaetomium cupreum (CABI 353812), Chaetomium globosum, Clonostachys rosea 88-710, Fusarium oxysporum IF23, Fusarium proliferatum (NCIM 1101), Gliocladium, Glio- cladium catenulatum cepa J1446, Gliocladium virens GL-21, Glomus fasciculatum, Glomus intraradices, Hirsutella rhossiliensis, Isaria fumo- sorosea Apopka cepa 97, Metarhizium anisopliae, Metarhizium aniso- pliae (NCIM 1311), Metschnikowia fructicola, Myrothecium verrucaria, Neotyphodium lolii AR1, Neotyphodium lolii AR37, Neotyphodium lolii AR6, Neotyphodium lolii NEA2, Neotyphodium uncinatum, Pae- cilomyces fumorosoroseus cepa FE 9901, Paecilomyces fumosoroseus, Paecilomyces lilacinus, Paecilomyces lilacinus (IIHR PL-2), Penicillium bilaii, Saccharomyces cerevisiae, Sclerotinia minor, Trichoderma aspe- rellum TV1, Trichoderma asperellum cepa ICC 012, Trichoderma gamsii cepa ICC 080, Trichoderma harzianum, Trichoderma harzianum (IIHR- Th-2), Trichoderma harzianum Rifai cepa T22, Trichoderma koningii, Trichoderma lignorum, Trichoderma polysporum, Trichoderma sp., Tri- choderma virens Gl-3, Trichoderma viride, Trichoderma viride (TNAU), Verticillium lecanii ou Verticillium lecanii (NCIM 1312).

[000122] Em algumas modalidades, a população bacteriana purificada inclui endófitos bacterianos originários de semente de um gênero que não Bacillus e/ou não Pseudomonas e/ou não Rhizobium, por exemplo, um ou mais de Achromobacter, Acidithiobacillus, Acidovorax, Acidovoraz, Acinetobacter, Aerococcus, Aeromonas, Agromyces, Ancylobacter, Ar- throbacter, Azospirillum, Bdellovibrio, Bosea, Bradyrhizobium, Brevibaci- llus, Brevundimonas, Burkholderia, Cellulomonas, Cellvibrio, Chryseobac- terium, Citrobacter, Clostridium, Corynebacterium, Cupriavidus, Curtobac- terium, Curvibacter, Deinococcus, Desemzia, Devosia, Dokdonella, Dyel- la, Enhydrobacter, Enterobacter, Enterococcus, Erwinia, Escherichia, Fi- negoldia, Flavisolibacter, Flavobacterium, Frigoribacterium, Hafnia, Ha- lomonas, Herbaspirillum, Klebsiella, Kocuria, Lactobacillus, Leclercia, Lentzea, Luteibacter, Luteimonas, Massilia, Methylobacterium, Microbacterium, Micrococcus, Microvirga, Mycobacterium, Neisseria, Nocardia, Oceanibaculum, Ochrobactrum, Oxalophagus, Paenibacillus, Panteoa, Pantoea, Plantibacter , Propionibacterium, Propioniciclava, Pseudonocardia, Pseudoxanthomonas, Psychrobacter, Rheinheimera, Rhodococ- cus, Roseateles, Ruminococcus, Sediminibacillus, Sediminibacterium, Serratia, Shigella, Shinella, Sphingobacterium, Sphingomonas, Sphin- gopyxis, Sphingosinicella, Staphylococcus, Stenotrophomonas, Streno- trophomonas, Streptomyces, Tatumella, Tepidimonas, Thermomonas, Thiobacillus, Bactéria não cultivada, Variovorax ou Xanthomonas.

[000123] Em algumas modalidades, a população bacteriana purificada inclui endófitos bacterianos derivados de sementes de um gênero selecionado do grupo que consiste em Luteibacter, Sphingobium, Chryse- obacterium, Curtobacterium, Micrococcus, Sphingomonas, Microbacte rium, Methylobacterium, Stenotrophomonas, Xanthomonas, Agrobacterium, Paenibacillus, Staphylococcus, Enterobacter, Pantoea, Pseudomonas e Bacillus. Em algumas modalidades, a população bacteriana purificada inclui endófitos bacterianos originários de semente de um gênero que não Bacillus e/ou não Pseudomonas e/ou não Rhizobium, por exemplo, um ou mais de Luteibacter, Sphingobium, Chryseobacterium, Curtobacterium, Micrococcus, Sphingomonas, Microbacterium, Me- thylobacterium, Stenotrophomonas, Xanthomonas, Agrobacterium, Pa- enibacillus, Staphylococcus, Enterobacter ou Pantoea.

[000124] Em algumas modalidades, o endófito bacteriano originário de semente inclui uma sequência de ácido nucleico 16S que é pelo menos 97% idêntica a pelo menos uma das sequências de ácidos nu- cleicos citadas na Tabela 1 ou na Tabela 2 (SEQ ID N°s: 1-1448, por exemplo, SEQ ID N°s: 521-1448). Por exemplo, o endófito bacteriano originário de semente pode incluir uma sequência de ácido nucleico 16S que é pelo menos 98% idêntica, pelo menos 99% idêntica ou pelo menos 99,5% idêntica a uma sequência de ácido nucleico 16S citada na Tabela 1 ou na Tabela 2 ( SEQ ID N°s: 1-1448, por exemplo, SEQ ID N°s: 521-1448). Em algumas modalidades, o endófito bacteriano originário de semente compreende uma sequência de ácido nucleico 16S que é 100% idêntica a uma sequência de ácido nucleico 16S citada na Tabela 1 ou na Tabela 2 (SEQ ID N°s: 1-1448, por exemplo, SEQ ID N°s: 521 -1448). Em modalidades nas quais dois ou mais en- dófitos bacterianos derivados de sementes são usados, a sequência de ácido nucleico 16S de cada endófito bacteriano originário de semente pode ter mais do que 97% de identidade de sequência umas com as outras ou pode ter menos de 97% de identidade de sequência umas com as outras. Além disso, em modalidades nas quais dois ou mais endófitos bacterianos derivados de sementes são usados, a sequência de ácido nucleico 16S de um endófito bacteriano originário de semente pode ter mais do que 97% de identidade de sequência com uma das sequências de nucleotídeos apresentadas em SEQ ID N°s: 11448 e um endófito bacteriano originário de semente pode ter menos de 97% de identidade de sequência com uma das sequências de nu- cleotídeos 16S apresentadas em SEQ ID N°s: 1-1448.

[000125] Em algumas modalidades, o endófito bacteriano originário de semente inclui uma sequência de ácido nucleico 16S que tem menos de 97% de identidade de sequência com pelo menos uma das sequências de ácido nucleico citadas na Tabela 1 ou na Tabela 2 (SEQ ID N°s: 1-1448). Tabela 1. Endófitos representativos de sementes de gramíneas, incluindo suas sequências de 16 rRNA atribuição dentro de números OTU, gênero, espécie, informações sobre cepas, bem como números de Acesso GenBank.

Tabela 2. Bactérias endofíticas isoladas de sementes de mi ho, arroz e trigo, incluindo a atribuição de OTUs específicas, números de ID de sequência correspondentes, família, gênero, informação taxonômica e planta de origem da qual o micróbio foi derivado. Legenda: Para a "Fonte de micróbio originário de semente", "sementes cuja superfície foi esterilizada" = micróbios originários de semente isolados de sementes cuja superfície foi esterilizada conforme descrito nos Exemplos; "Lavagem de superfície de semente" = micróbios derivados da superfície de sementes, conforme descrito nos Exemplos; "Raízes" = micróbios originários de semente isolados de raízes de sementes que foram germinadas em meio estéril; "Raízes & Sementes" = micróbios originários de semente isolados de material residual de raízes e sementes que foi gerado por sementes em germinação sob condições estéreis; "Folhas" = micróbios originários de semente isolados de brotos e folhas que emergiram a partir de sementes que foram germinadas sob condições estéreis.

[000126] Conforme usado aqui, endófitos bacterianos originários de semente podem ser obtidos a partir de sementes de muitas plantas diferentes. Em uma modalidade, o endófito pode ser obtido a partir da semente da mesma ou uma cultura diferente e podem ser da mesma ou uma variedade ou cultivar diferente da semente sobre a qual ele será revestido. Por exemplo, endófitos de semente de uma variedade particular de milho podem ser isolados e revestidos sobre a superfície de uma semente de milho da mesma variedade. Em uma modalidade particular, as sementes da primeira planta que tem de ser revestida com o endófito podem compreender uma quantidade detectável do mesmo endófito no interior da semente. Em outra modalidade, a semente da primeira planta que tem de ser revestida com o endófito pode compreender uma quantidade detectável do mesmo no endófito no exterior da semente. Por exemplo, uma semente de referência não revestida pode conter uma quantidade detectável do mesmo endófito dentro de sua semente. Em ainda outra modalidade, o endófito a ser revestido sobre a semente da planta é um micro-organismo ou de um táxon microbiano que está detectavelmente presente no interior e exterior da semente a partir da qual o endófito é derivado.

[000127] Em outra modalidade, o endófito pode ser obtenível de uma espécie relacionada (por exemplo, um endófito isolado de Triticum monococcum (trigo espelta) pode ser revestido sobre a superfície de uma semente de T. aestivum (trigo comum); ou um endófito de Hor- deum vulgare (cevada) pode ser isolado e revestido sobre a semente de um membro da família Triticeae, por exemplo, sementes da planta de centeio, Secale cereale). Em ainda outra modalidade, o endófito pode ser isolado da semente de uma planta que é distantemente relacionada à semente sobre a qual o endófito tem de ser revestido. Por exemplo, um endófito derivado de tomate é isolado e revestido sobre uma semente de arroz.

[000128] Em algumas modalidades, a presente invenção considera o uso de endófitos que podem conferir um traço agronômico benéfico à semente ou planta resultante sobre a qual ele é revestido. Em outra modalidade, os endófitos de sementes úteis para a presente invenção podem também ser isolados de sementes de plantas que estão adaptadas a um ambiente particular incluindo, porém sem limitações, um ambiente com deficiência de água, salinidade, estresse pelo calor agudo e/ou crônico, estresse pelo frio agudo e/ou crônico, solos privados de nutrientes incluindo, porém sem limitações, solos privados de micronutrientes, solos privados de macronutrientes (por exemplo, potássio, fosfato, nitrogênio), estresse por patógenos, incluindo estresse por patógenos fúngicos, nematoides, insetos, virais, bacterianos. Em um exemplo, o endófito é isolado da semente de uma planta que cresce em meio deficiente em água.

[000129] A combinação sintética da presente invenção considera a presença de um endófito sobre a superfície das sementes da primeira planta. Em uma modalidade, a semente da primeira planta é revestida com pelo menos 10 CFU do endófito por semente, por exemplo, pelo menos 20 CFU, pelo menos 50 CFU, pelo menos 100 CFU, pelo menos 200 CFU, pelo menos 300 CFU, pelo menos 500 CFU, pelo menos 1.000 CFU, pelo menos 3.000 CFU, pelo menos 10.000 CFU, pelo menos 30.000 ou mais por semente. Em outra modalidade , a semente é revestida com pelo menos 10, por exemplo, pelo menos 20, pelo menos 50, pelo menos 100, pelo menos 200, pelo menos 300, pelo menos 500, pelo menos 1000, pelo menos 3000, pelo menos 10.000, 30.000, pelo menos pelo menos 100.000, pelo menos 300.000 ou pelo menos 1.000.000 ou mais dos endófitos, conforme detectado pelo número de cópias de um gene de endófito detectado em particular, por exemplo, por PCR quantitativa.

[000130] Em alguns casos, o endófito originário de semente é de ori- gem monoclonal, permitindo elevada uniformidade genética da população de endófitos em uma formulação agrícola ou dentro de uma combinação sintética da semente ou planta com o endófito.

[000131] Em alguns casos, os endófitos bacterianos descritos aqui são capazes de se mover de um tipo de tecido para outro. Por exemplo, a detecção e isolamento de endófitos originários de semente no interior dos tecidos de plantas maduras de cereais após o revestimento sobre o exterior de uma semente da presente invenção demonstram sua capacidade de se deslocar do exterior da semente para os tecidos vegetativos de uma planta em maturação. Portanto, em uma modalidade, a população de endófitos bacterianos é capaz de se mover do exterior da semente para os tecidos vegetativos de uma planta gramí- nea. Em uma modalidade, o endófito de semente que é revestido sobre a semente de uma planta é capaz, após germinação da semente em um estado vegetativo, de se localizar em um tecido diferente da planta. Por exemplo, o endófito pode ser capaz de se localizar em qualquer um dos tecidos da planta, incluindo: a raiz, raízes adventícias, raiz seminal, pelos da raiz, caule, folha, flor, borla, meristema, pólen, pistilo, ovários, estame, fruta, estolões, rizoma, nódulos, tubérculos, tricomas, células-guarda, hidatódio, pétala, sépala, glume, ra- que, câmbio vascular, floema e xilema. Em uma modalidade, o endófi- to é capaz de se localizar na raiz e/ou nos pelos da raiz da planta. Em outra modalidade, o endófito é capaz de se localizar nos tecidos fotos- sintéticos, por exemplo, folhas e brotos da planta. Em outros casos, o endófito está localizado nos tecidos vasculares da planta, por exemplo, no xilema e floema. Em ainda outra modalidade, o endófito é capaz de se localizar nos tecidos reprodutivos (flor, pólen, pistilo, ovários, estame, fruta) da planta. Em outra modalidade, o endófito é capaz de se localizar na raiz, brotos, folhas e tecidos reprodutivos da planta. Em ainda outra modalidade, o endófito coloniza um tecido de frutos ou sementes da planta. Em ainda outra modalidade, o endófito é capaz de colonizar a planta de forma tal que ele esteja presente sobre a superfície da planta (isto é, sua presença é detectavelmente presente no exterior da planta ou episfera da planta). Em ainda outras modalidades, o endófito é capaz de se localizar em substancialmente todos, ou todos, os tecidos da planta. Em determinadas modalidades, o endófito não está localizado na raiz de uma planta. Em outros casos, o endófito não está localizado nos tecidos fotossintéticos da planta.

[000132] Em alguns casos, os endófitos bacterianos são capazes de se replicar dentro da planta gramínea hospedeira e colonizar a planta gramínea.

[000133] Além disso, os endófitos bacterianos descritos aqui conferem diversas vantagens significativas em relação a outros micróbios associados a plantas.

[000134] Diferentes ambientes podem conter populações de microorganismos endofíticos significativamente diferentes e, assim, podem constituir reservatórios para endófitos originários de semente desejados. Uma vez que um ambiente de escolha é selecionado, as sementes da planta escolhida a serem colhidas podem ser identificadas pelo seu crescimento saudável e/ou robusto e podem, então, ser colhidas pelo menos 5 de cada vez ao escavar as plantas inteiras mais o pequeno torrão de raízes, incluindo as raízes e solo associado, e todas as sementes ou frutos presentes na planta. O material escavado pode ser colocado em um local fresco (meio 4 °C) para armazenamento e posterior extração de endófitos e DNA pode ser realizada usando os métodos descritos aqui. A identificação de ambientes ou ecossistemas escolhidos para bioprospecção de endófitos associados a plantas de quaisquer plantas selvagens ou plantas cultivadas que crescem em ambientes ou ecossistemas de escolha segue os protocolos descritos aqui.

[000135] Em uma modalidade, a planta associada ao endófito é colhida de um tipo de solo diferente do tipo de solo normal no qual a planta de cultura é cultivada, por exemplo, a partir de um gelissolo (solos com gelo permanente dentro de 2 m da superfície), por exemplo, de um histossolo (solo orgânico), por exemplo, de um espodossolo (solos florestais ácidos com um acúmulo na subsuperfície de complexos de metal-húmus), por exemplo, de um andissolo (solos formados em cinzas vulcânicas), por exemplo, de um oxissolo (solos com condições climáticas intensas de ambientes tropicais e subtropicais), por exemplo, de um vertissolo (solos argilosos com elevada capacidade de retração/intumescimento), por exemplo, de um aridissolo (solos contendo CaCO3 de ambientes áridos com o desenvolvimento de horizonte na subsuperfície), por exemplo, de um argissolo (solos fortemente lixiviados com uma zona de acúmulo de barro na subsuperfície e <35% de saturação por bases), por exemplo, de um molissolo (solos de pastagem com um estado de elevado teor de base), por exemplo, de um alfissolo (solos moderadamente lixiviados com uma zona de acúmulo de barro na subsuperfície e >35% de saturação por bases), por exemplo, de um inceptissolo (solos com horizontes na subsuperfí- cie fracamente desenvolvidos) ou, por exemplo, de um neossolo (solos com pouco ou nenhum desenvolvimento morfológico).

[000136] Em outra modalidade, a planta associada ao endófito é colhida a partir de um ecossistema onde a planta agrícola não é normalmente encontrada, por exemplo, um ecossistema de tundra em oposição a uma fazenda agrícola de clima temperado, por exemplo, de florestas de folhosas úmidas tropicais e subtropicais (tropical e subtropical, úmido), por exemplo, de florestas de folhosas secas tropicais e subtropicais (tropical e subtropical, semiúmido), por exemplo, de florestas de coníferas tropicais e subtropicais (tropical e subtropical, semiúmido), por exemplo, de florestas mistas e folhosas tempe- radas (temperado e úmido), por exemplo, de florestas temperadas de coníferas (temperado, úmido a semiúmido), por exemplo, de florestas boreais/taiga (subártico, úmido), por exemplo, de pastagens, savanas e matagais tropicais e subtropicais (tropical e subtropical, semiárido), por exemplo, de campos, savanas e matagais temperados (temperado, semiárido), por exemplo, de terras e savanas inundadas (temperado a tropical, inundadas com água doce ou salobra), por exemplo, de pastagens e matagais de montanha (clima alpino ou de montanha), por exemplo, de florestas mediterrânicas, florestas madeireiras e florestas de arbustos ou esclerofilos (temperado quente, semiúmido a semiárido, com chuvas de inverno), por exemplo, de florestas de mangue e, por exemplo, de desertos e matagais secos (temperado a tropical, árido).

[000137] Em outra modalidade , a planta associada ao endófito é colhida de um solo com uma faixa média de pH que é diferente da faixa de pH do solo ideal da planta de cultura, por exemplo, a planta pode ser colhida de um solo ultra ácido (<3,5), de um solo ácido extremo (3,5-4,4), de um solo ácido muito forte (4,5-5,0), de um solo ácido forte (5,1-5,5), de um solo ácido moderado (5,6-6,0), de um solo levemente ácido (6,1-6,5), de um solo neutro (6,6-7,3), de um solo ligeiramente alcalino (7,4-7,8), de um solo moderadamente alcalino (7,9-8,4), de um solo fortemente alcalino (8,5-9,0) ou de um solo muito fortemente alcalino (> 9,0).

[000138] Em uma modalidade, a planta associada ao endófito é colhida a partir de um ambiente com temperaturas médias do ar mais baixas do que a temperatura normal de crescimento da planta de cultura, por exemplo, 2-5°C mais frio do que a média, por exemplo, pelo menos 5-10°C mais frio, pelo menos 10-15°C mais frio, pelo menos pelo menos 15-20°C mais frio, pelo menos 20-25°C mais frio, pelo menos 25-30°C mais frio, pelo menos 30-35°C mais frio, pelo menos 35- 40°C mais frio, pelo menos 40-45°C mais frio, pelo menos 45-50°C mais frio, pelo menos 50-55°C mais frio ou mais, quando comparado com plantas de cultura cultivadas sob condições normais durante uma estação de crescimento média.

[000139] Em uma modalidade, a planta associada ao endófito é colhida a partir de um ambiente com temperaturas médias do ar mais elevadas do que a temperatura normal de crescimento da planta de cultura, por exemplo, 2-5°C mais quente do que a média, por exemplo, pelo menos 5-10°C mais quente, pelo menos 10-15°C mais quente, pelo menos pelo menos 15-20°C mais quente, pelo menos 20-25°C mais quente, pelo menos 25-30°C mais quente, pelo menos 30-35°C mais quente, pelo menos 35-40°C mais quente, pelo menos 40-45°C mais quente, pelo menos 45-50°C mais quente, pelo menos 50-55°C mais quente ou mais, quando comparado com plantas de cultura cultivadas sob condições normais durante uma estação de crescimento média.

[000140] Em outra modalidade, a planta associada ao endófito é colhida a partir de um ambiente com precipitação média mais baixa do que a precipitação média ideal da planta de cultura, por exemplo, 2-5% menos de precipitação do que a média, por exemplo, pelo menos 510% menos precipitação, pelo menos 10-15% menos precipitação, pelo menos 15-20% menos precipitação, pelo menos 20-25% menos precipitação, pelo menos 25-30% menos precipitação, pelo menos 3035% menos precipitação, pelo menos 35 -40% menos precipitação, pelo menos 40-45% menos precipitação, pelo menos 45-50% menos precipitação, pelo menos 50-55% menos precipitação, pelo menos 5560% menos precipitação, pelo menos 60-65% menos precipitação, pelo menos 65-70% menos precipitação, pelo menos 70-75% menos precipitação, pelo menos 80-85% menos precipitação, pelo menos 8590% menos precipitação, pelo menos 90-95% menos precipitação ou menos, quando comparado com plantas de cultura cultivadas sob condições normais durante uma estação de crescimento média.

[000141] Em uma modalidade, a planta associada ao endófito é colhida a partir de um ambiente com precipitação média mais elevada do que a precipitação média ideal da planta de cultura, por exemplo, 2-5% mais precipitação do que a média, por exemplo, pelo menos 5-10% mais precipitação, pelo menos 10-15% mais precipitação, pelo menos 15-20% mais precipitação, pelo menos 20-25% mais precipitação, pelo menos 25-30% mais precipitação, pelo menos 30-35% mais precipitação, pelo menos 35- 40% a mais de chuva, pelo menos 40-45% mais precipitação, pelo menos 45-50% mais precipitação, pelo menos 5055% mais precipitação, pelo menos 55-60% mais precipitação, pelo menos 60-65% mais precipitação, pelo menos 65-70% mais precipitação, pelo menos 70-75% mais precipitação, pelo menos 80-85% mais precipitação, pelo menos 85-90% mais precipitação, pelo menos 9095% mais precipitação, pelo menos 95-100% mais precipitação ou até mesmo 100% mais precipitação ou até mesmo 200% mais precipitação ou até mesmo 300% mais precipitação ou até mesmo 400% mais precipitação ou até mesmo 500% mais precipitação, quando comparado com plantas de cultura cultivadas sob condições normais durante uma estação de crescimento média.

[000142] Em outra modalidade, a planta associada ao endófito é colhida a partir de um tipo de solo com uma classificação de umidade do solo diferente do tipo de solo normal sobre o qual a planta de cultura é cultivada, por exemplo, um solo aquíco (solo saturado com água e praticamente livre de oxigênio gasoso por períodos de tempo suficiente, de modo que não há evidência de má aeração), por exemplo, um solo údico (umidade do solo é suficientemente alta durante todo o ano na maioria dos anos para satisfazer os requisitos da planta), por exemplo, um solo ústico (umidade do solo é intermediária entre regimes údico e arídico; geralmente, umidade disponível para as plantas durante a estação de crescimento, mas períodos graves de estiagem podem ocorrer), por exemplo, um solo arídico (solo está seco por pelo menos metade da estação de crescimento e úmido por menos de 90 dias consecutivos), por exemplo, um solo xérico (regime de umidade do solo é encontrado em climas de tipo mediterrânico, com invernos frescos, úmidos e verões quentes e secos).

[000143] Em uma modalidade, a planta associada ao endófito é colhida a partir de um ambiente com precipitação média menor do que a média de precipitação ideal da planta de cultura, por exemplo, 2-95% menos precipitação do que a média, por exemplo, pelo menos 5-90% menos precipitação, pelo menos 10-85% menos precipitação, pelo menos 15-80% menos precipitação, pelo menos 20-75% menos precipitação, pelo menos 25-70% menos precipitação, pelo menos 30-65% menos precipitação, pelo menos 35- 60% menos precipitação, pelo menos 40-55% menos precipitação, pelo menos 45-50% menos precipitação, quando comparado com plantas de cultura cultivadas sob condições normais durante uma estação de crescimento média.

[000144] Em uma modalidade, a planta associada ao endófito é colhida a partir de um ambiente com precipitação média mais elevada do que a média de precipitação ideal da planta de cultura, por exemplo, 25% mais precipitação do que a média, por exemplo, pelo menos 510% mais precipitação, pelo menos 10-15% mais precipitação, pelo menos 15-20% mais precipitação, pelo menos 20-25% mais precipitação, pelo menos 25-30% mais precipitação, pelo menos 30-35% mais precipitação, pelo menos 35- 40% a mais de chuva, pelo menos 4045% mais precipitação, pelo menos 45-50% mais precipitação, pelo menos 50-55% mais precipitação, pelo menos 55-60% mais precipitação, pelo menos 60-65% mais precipitação, pelo menos 65-70% mais precipitação, pelo menos 70-75% mais precipitação, pelo menos 80- 85% mais precipitação, pelo menos 85-90% mais precipitação, pelo menos 90-95% mais precipitação, pelo menos 95-100% mais precipitação ou até mesmo mais de 100% mais precipitação ou até mesmo mais de 200% mais precipitação ou até mesmo mais do que 300% mais precipitação ou até mesmo mais de 400% mais precipitação ou até mesmo mais de 500% mais precipitação, quando comparado com plantas de cultura cultivadas sob condições normais durante uma estação de crescimento média.

[000145] Em outra modalidade, a planta associada ao endófito é colhida a partir de um ambiente agrícola com um rendimento de colheita menor do que o rendimento de colheita médio esperado para a planta de cultura cultivada sob práticas de cultivo comuns em terra agrícola normal, por exemplo, um rendimento 2-5% menor do que o rendimento médio, por exemplo, um rendimento pelo menos 5-10% menor, um rendimento pelo menos 10-15% menor, um rendimento pelo menos 1520% menor, um rendimento pelo menos 20-25% menor, um rendimento pelo menos 25-30% menor, um rendimento pelo menos 30-35% menor, um rendimento pelo menos 35-40% menor, um rendimento pelo menos 40-45% menor, um rendimento pelo menos 45-50% menor, um rendimento pelo menos 50-55% menor, um rendimento pelo menos 55-60% menor, um rendimento pelo menos 60-65% menor, um rendimento pelo menos 65-70% menor, um rendimento pelo menos 70-75% menor, um rendimento pelo menos 80-85% menor, um rendimento pelo menos 8590% menor, um rendimento pelo menos 90-95% menor ou menos, quando comparado com plantas de cultura cultivadas sob condições normais durante uma estação de crescimento média.

[000146] Em uma modalidade relacionada, a planta associada ao endófito é colhida a partir de um ambiente agrícola com um rendimento de colheita menor do que o rendimento de colheita médio esperado para a planta de cultura cultivada sob práticas de cultivo comuns em terras agrícolas normais, por exemplo, um rendimento 2-95% menor do que a média, por exemplo, um rendimento pelo menos 5-90% menor, um rendimento pelo menos 10-85% menor, um rendimento pelo menos 15-80% menor, um rendimento pelo menos 20-75% menor, um rendimento pelo menos 25-70% menor, um rendimento pelo menos 30-65% menor, um rendimento pelo menos 35-60% menor, um rendimento pelo menos 40-55% menor, um rendimento pelo menos 45-50% menor, quando comparado com plantas de cultura cultivadas sob condições normais durante uma estação de crescimento média.

[000147] Em uma modalidade, a planta associada ao endófito é colhida a partir de um ambiente de cultura média com rendimento maior do que o rendimento de colheita médio ideal para a planta de cultura, por exemplo, um rendimento 2-5% maior do que a média, por exemplo, um rendimento pelo menos 5-10% maior, um rendimento pelo menos 10-15% maior, um rendimento pelo menos 15-20% maior, um rendimento pelo menos 20-25% maior, um rendimento pelo menos 2530% maior, um rendimento pelo menos 30-35% maior, um rendimento pelo menos 35-40% maior, um rendimento pelo menos 40-45% maior, um rendimento pelo menos 45-50% maior, um rendimento pelo menos 50-55% maior, um rendimento pelo menos 55-60% maior, um rendimento pelo menos 60-65% maior, um rendimento pelo menos 65-70% maior, um rendimento pelo menos 70-75% maior, um rendimento pelo menos 80-85% maior, um rendimento pelo menos 85-90% maior, um rendimento pelo menos 90-95% maior, um rendimento pelo menos 95 -100% maior ou até mesmo um rendimento mais de 100% maior ou até mesmo um rendimento mais de 200% maior ou até mesmo um rendimento mais de 300% maior ou até mesmo um rendimento mais de 400% maior ou até mesmo um rendimento mais de 500% maior, quando comparado com plantas de cultura cultivadas sob condições normais durante uma estação de crescimento média.

[000148] Em uma modalidade relacionada, a planta associada ao endófito é colhida a partir de um ambiente com um rendimento de colheita médio maior do que o rendimento de colheita médio ideal para a planta de cultura, por exemplo, 2-5% mais rendimento do que a média, 2-400% mais rendimento do que a média, 2-300% mais rendimento do que a média, 2-200% mais rendimento do que a média, 2-95% mais rendimento do que a média, por exemplo, pelo menos 5-90% mais rendimento, pelo menos 10-85% mais rendimento, pelo menos 15 - 80% mais rendimento, pelo menos 20-75% mais rendimento, pelo menos 25-70% mais rendimento, pelo menos 30-65% mais rendimento, pelo menos 35-60% mais rendimento, pelo menos 40-55% mais rendimento, pelo menos 45-50% mais rendimento, quando comparado com plantas de cultura cultivadas sob condições normais durante uma estação de crescimento média.

[000149] Em outra modalidade, a planta associada ao endófito é colhida a partir de um ambiente onde o solo contém menos nitrogênio total do que os níveis ideais recomendados para atingir rendimentos de colheita médios de uma planta cultivada sob práticas de cultivo comuns em terra agrícola normal, por exemplo, 2-5% menos nitrogênio do que a média, por exemplo, pelo menos 5-10% menos nitrogênio, pelo menos 10-15% menos nitrogênio, pelo menos 15-20% menos nitrogênio, pelo menos 20-25% menos nitrogênio, pelo menos 25-30% menos nitrogênio, pelo menos 30-35% menos nitrogênio, pelo menos 35-40% menos nitrogênio, pelo menos 40-45% menos nitrogênio, pelo menos 45-50% menos nitrogênio, pelo menos 50-55% menos nitrogênio, a pelo menos 55-60% menos nitrogênio, pelo menos 60-65% menos nitrogênio, pelo menos 65-70% menos nitrogênio, pelo menos 7075% menos nitrogênio, pelo menos 80-85% menos nitrogênio, pelo menos 85-90% menos nitrogênio, pelo menos 90-95% menos nitrogênio ou menos, quando comparado com plantas de cultura cultivadas sob condições normais durante uma estação de crescimento média.

[000150] Em outra modalidade, a planta associada ao endófito é colhida a partir de um ambiente onde o solo contém mais nitrogênio total do que os níveis ideais recomendados para atingir rendimentos de colheita médios de uma planta cultivada sob práticas de cultivo comuns em terra agrícola normal, por exemplo, 2-5% mais nitrogênio do que a média, por exemplo, pelo menos 5-10% mais nitrogênio, pelo menos 10-15% mais nitrogênio, pelo menos 15-20% mais nitrogênio, pelo menos 20-25% mais nitrogênio, pelo menos 25-30% mais nitrogênio, pelo menos 30-35% mais nitrogênio, pelo menos 35-40% mais nitrogênio, pelo menos 40-45% mais nitrogênio, pelo menos 45-50% mais nitrogênio, pelo menos 50-55% mais nitrogênio, pelo menos 55-60% mais nitrogênio, pelo menos 60-65% mais nitrogênio, pelo menos 6570% mais nitrogênio, pelo menos 70-75% mais nitrogênio, pelo menos 80-85% mais nitrogênio, pelo menos 85-90% mais nitrogênio, pelo menos 90-95% mais nitrogênio, pelo menos 95-100% mais nitrogênio ou até mesmo mais do que 100% mais nitrogênio ou até mesmo mais do que 200% mais nitrogênio ou até mesmo mais do que 300% mais nitrogênio ou até mesmo mais de 400% mais nitrogênio ou até mesmo mais de 500% mais nitrogênio, quando comparado com plantas de cultura cultivadas sob condições normais durante uma estação de crescimento média.

[000151] Em outra modalidade, a planta associada ao endófito é colhida a partir de um ambiente onde o solo contém menos fósforo total do que os níveis ideais recomendados para atingir rendimentos de colheita médios de uma planta cultivada sob práticas de cultivo comuns em terra agrícola normal, por exemplo, 2-5% menos do que a média de fósforo, por exemplo, pelo menos 5-10% menos fósforo, pelo menos 10-15% menos fósforo, pelo menos 15-20% menos fósforo, pelo menos 20-25% menos fósforo, pelo menos 25-30% menos fósforo, pe- lo menos 30-35% menos fósforo, pelo menos 35-40% menos fósforo, pelo menos 40-45% menos fósforo, pelo menos 45-50% menos fósforo, pelo menos 50-55% menos fósforo, em pelo menos 55-60% menos fósforo, pelo menos 60-65% menos fósforo, pelo menos 65-70% menos fósforo, pelo menos 70-75% menos fósforo, pelo menos 80-85% menos fósforo, pelo menos 85-90% menos fósforo, pelo menos 9095% menos fósforo ou menos, quando comparado com plantas de cultura cultivadas sob condições normais durante uma estação de crescimento média.

[000152] Em outra modalidade, a planta associada ao endófito é colhida a partir de um ambiente onde o solo contém mais fósforo total do que os níveis ideais recomendados para atingir rendimentos de colheita médios de uma planta cultivada sob práticas de cultivo comuns em terra agrícola normal, por exemplo, 2-5% mais fósforo do que a média, mesmo mais do que 200% mais fósforo ou até mesmo mais do que 300% mais fósforo ou até mesmo mais do que 400% mais fósforo ou até mesmo mais do que 500% mais fósforo, quando comparado com plantas de cultura cultivadas sob condições normais durante uma estação de crescimento média.

[000153] Em outra modalidade, a planta associada ao endófito é co- lhida a partir de um ambiente onde o solo contém menos potássio total do que os níveis ideais recomendados para atingir rendimentos de colheita médios de uma planta cultivada sob práticas de cultivo comuns em terra agrícola normal, por exemplo, 2-5% menos potássio do que a média, por exemplo, pelo menos 5-10% menos potássio, pelo menos 10-15% menos potássio, pelo menos 15-20% menos potássio, pelo menos 20-25% menos potássio, pelo menos 25-30% menos potássio, pelo menos 30-35% menos potássio, pelo menos 35-40% menos potássio, pelo menos 40-45% menos potássio, pelo menos 45-50% menos potássio, pelo menos 50-55% menos potássio, a pelo menos 5560% menos potássio, pelo menos 60-65% menos potássio, pelo menos 65-70% menos potássio, pelo menos 70-75% menos potássio, pelo menos 80-85% menos potássio, pelo menos 85-90% menos potássio, pelo menos 90-95% menos potássio ou menos, quando comparado com plantas de cultura cultivadas sob condições normais durante uma estação de crescimento média.

[000154] Em outra modalidade, a planta associada ao endófito é colhida a partir de um ambiente onde o solo contém mais potássio total do que os níveis ideais recomendados para atingir rendimentos de colheita médios de uma planta cultivada sob práticas de cultivo comuns em terra agrícola normal, por exemplo, 2-5% mais potássio do que a média, por exemplo, pelo menos 5-10% mais potássio, pelo menos 1015% mais potássio, pelo menos 15-20% mais potássio, pelo menos 20-25% mais potássio, pelo menos 25-30% mais potássio, pelo menos 30-35% mais potássio, pelo menos 35-40% mais potássio, pelo menos 40-45% mais potássio, pelo menos 45-50% mais potássio, pelo menos 50-55% mais potássio, a pelo menos 55-60% mais potássio, pelo me nos 60-65% mais potássio, pelo menos 65-70% mais potássio, pelo menos 70-75% mais potássio, pelo menos 80-85% mais potássio, pelo menos 85-90% mais potássio, pelo menos 90-95% mais potássio, pelo menos 95-100% mais potássio ou até mesmo mais do que 100% mais potássio ou até mesmo mais do que 200% mais potássio ou até mesmo mais do que 300% mais potássio ou até mesmo mais do que 400% mais potássio ou até mesmo mais do que 500% mais potássio, quando comparado com plantas de cultura crescidas sob condições normais durante um período de crescimento médio.

[000155] Em outra modalidade, a planta associada ao endófito é colhida a partir de um ambiente onde o solo contém menos enxofre total do que os níveis ideais recomendados para atingir rendimentos de colheita médios de uma planta cultivada sob práticas de cultivo comuns em terra agrícola normal, por exemplo, 2-5% menos enxofre do que a média, por exemplo, pelo menos 5-10% menos enxofre, pelo menos 10-15% menos enxofre, pelo menos 15-20% menos enxofre, pelo menos 20-25% menos enxofre, pelo menos 25-30% menos enxofre, pelo menos 30-35% menos enxofre, pelo menos 35-40% menos enxofre, pelo menos 40-45% menos enxofre, pelo menos 45-50% menos enxofre, pelo menos 50-55% menos enxofre, em pelo menos 55-60% menos enxofre, pelo menos 60-65% menos enxofre, pelo menos 65-70% menos enxofre, pelo menos 70-75% menos enxofre, pelo menos 8085% menos enxofre, pelo menos 85-90% menos enxofre, pelo menos 90-95% menos enxofre ou menos, quando comparado com plantas de cultura cultivadas sob condições normais durante uma estação de crescimento média.

[000156] Em outra modalidade, a planta associada ao endófito é colhida a partir de um ambiente onde o solo contém mais enxofre total do que os níveis ideais recomendados para atingir rendimentos de colheita médios de uma planta cultivada sob práticas de cultivo comuns em terra agrícola normal, por exemplo, 2-5% mais enxofre do que a média, por exemplo, pelo menos 5-10% mais enxofre, pelo menos 1015% mais enxofre, pelo menos 15-20% mais enxofre, pelo menos 20- 25% mais enxofre, pelo menos 25-30% mais enxofre, pelo menos 3035% mais enxofre, pelo menos 35-40% mais enxofre, pelo menos 4045% mais enxofre, pelo menos 45-50% mais enxofre, pelo menos 5055% mais enxofre, pelo menos 55-60% mais enxofre, pelo menos 6065% mais enxofre, pelo menos 65-70% mais enxofre, pelo menos 7075% mais enxofre, pelo menos 80-85% mais enxofre, pelo menos 8590% mais enxofre, pelo menos 90-95% mais enxofre, pelo menos 95 100% mais enxofre ou até mesmo mais do que 100% mais enxofre ou até mesmo mais do que 200% mais enxofre ou até mesmo mais do que 300% mais enxofre ou até mesmo mais do que 400% mais enxofre ou até mesmo mais do que 500% mais enxofre, quando comparado com plantas de cultura cultivadas sob condições normais durante uma estação de crescimento média.

[000157] Em outra modalidade, a planta associada ao endófito é colhida a partir de um ambiente onde o solo contém menos cálcio total do que os níveis ideais recomendados para atingir rendimentos de colheita médios de uma planta cultivada sob práticas de cultivo comuns em terra agrícola normal, por exemplo, 2-5% menos cálcio do que a média, por exemplo, pelo menos 5-10% menos cálcio, pelo menos 1015% menos cálcio, pelo menos 15-20% menos cálcio, pelo menos 2025% menos cálcio, pelo menos 25-30% menos cálcio, pelo menos 3035% menos cálcio, pelo menos 35-40% menos cálcio, pelo menos 4045% menos cálcio, pelo menos 45-50% menos cálcio, pelo menos 5055% menos cálcio, em pelo menos 55-60% menos cálcio, pelo menos 60-65% menos cálcio, pelo menos 65-70% menos cálcio, pelo menos 70-75% menos cálcio, pelo menos 80-85% menos cálcio, pelo menos 85-90% menos cálcio, pelo menos 90-95% menos cálcio ou menos, quando comparado com plantas de cultura cultivadas sob condições normais durante uma estação de crescimento média.

[000158] Em outra modalidade, a planta associada ao endófito é co- lhida a partir de um ambiente onde o solo contém menos magnésio total do que os níveis ideais recomendados para atingir rendimentos de colheita médios de uma planta cultivada sob práticas de cultivo comuns em terra agrícola normal, por exemplo, 2-5% menos magnésio do que a média, por exemplo, pelo menos 5-10% menos magnésio, pelo menos 10-15% menos magnésio, pelo menos 15-20% menos magnésio, pelo menos 20-25% menos magnésio, pelo menos 25-30% menos magnésio, pelo menos 30-35% menos magnésio, pelo menos 35-40% menos magnésio, pelo menos 40-45% menos magnésio, pelo menos 45-50% menos magnésio, pelo menos 50-55% menos magnésio, pelo menos 55-60% menos magnésio, pelo menos 60-65% menos magnésio, pelo menos 65-70% menos magnésio, pelo menos 70-75% menos magnésio, pelo menos 80-85% menos magnésio, pelo menos 85-90% menos magnésio, pelo menos 90-95% menos magnésio ou menos, quando comparado com plantas de cultura cultivadas sob condições normais durante uma estação de crescimento média.

[000159] Em outra modalidade, a planta associada ao endófito é colhida a partir de um ambiente onde o solo contém mais cloreto de sódio total (sal) do que os níveis ideais recomendados para atingir rendimentos de colheita médios de uma planta cultivada sob práticas médios de cultivo em terra agrícola normal, por exemplo, 2-5% mais sal do que a média, por exemplo, pelo menos 5-10% mais sal, pelo menos 10-15% mais sal, pelo menos 15-20% mais sal, pelo menos 20-25% mais sal, em menos 25-30% mais sal, pelo menos 30-35% mais sal, pelo menos 35-40% mais sal, pelo menos 40-45% mais sal, pelo menos 45-50% mais sal, pelo menos 50-55% mais sal, pelo menos 5560% mais sal, pelo menos 60-65% mais sal, pelo menos 65-70% mais sal, pelo menos 70-75% mais sal, pelo menos 80-85% mais sal, pelo menos 85-90% mais sal, pelo menos 90-95% mais sal, pelo menos 95100% mais sal ou até mesmo mais do que 100% mais sal ou até mesmo mais do que 200% mais sal ou até mesmo mais do que 300% mais sal ou até mesmo mais de 400% mais sal ou até mesmo mais de 500% mais sal, quando comparado com plantas de cultura cultivadas sob condições normais durante uma estação de crescimento média. PLANTAS ÚTEIS PARA A PRESENTE INVENÇÃO

[000160] Em algumas modalidades, um endófito bacteriano originário de semente pode ser introduzido em uma planta gramínea agrícola, isto é, uma planta da família Graminae (gramas). As plantas gramí- neas nas quais o endófito bacteriano originário de semente pode ser introduzido podem ser qualquer das gramíneas úteis pertencentes aos gêneros Agropyron, Agrostis, Andropogon, Anthoxanthum, Arrhenathe- rum, Avena, Brachypodium, Bromus, Chloris, Cynodon, Dactylis, Elymus, Eragrostis, Festuca, Glyceria, Hierochloe, Hordeum, Lolium, Oryza, Panicum, Paspalum, Phalaris, Phleum, Poa, Setaria, Sorghum, Triticum, Zea e Zoysia.

[000161] Em outra modalidade, a planta alvo é selecionada dos trigos, incluindo Triticum monococcum, Triticum durum, Triticum turgi- dum, Triticum timopheevi (trigo Timopheevs) e Triticum aestivum (trigo de pão).

[000162] Em outra modalidade, a planta alvo é um milho do gênero Zea. Zea é um gênero da família Graminae (Poaceae), comumente conhecido como a família das gramíneas. O gênero consiste em cerca de quatro espécies: Zea mays, milho cultivado e teosinto; Zea diplope- rennis, Iltis et al., teosinto diploperene; Zea luxurians (Durieu e Asch.) Bird; e Zea perennis (Hitchc.) Reeves e Mangelsd., teosinto perene.

[000163] Consequentemente, em uma modalidade, a planta é selecionada do grupo de Graminae (gramíneas), incluindo gramíneas dos gêneros Agropyron, Agrostis, Andropogon, Anthoxanthum, Arrhenathe- rum, Avena, Brachypodium, Bromus, Chloris, Cynodon, Dactylis, Elymus, Eragrostis, Festuca, Glyceria, Hierochloe, Hordeum, incluindo Hordeum vulgare L., Hordeum distichon L. e Hordeum irregulare, Lolium, Oryza, Panicum, Paspalum, Phalaris, Phleum, Poa, Setaria, Sorghum, Triticum, Zea, especialmente Zea mays, milho cultivado e teosinto, Zea diploperennis, Iltis et al., teosinto diploperene; Zea luxuri- ans (Durieu e Asch.) Bird; e Zea perennis (Hitchc.) Reeves e Man- gelsd., teosinto perene e Zoysia; trigos, incluindo Triticum monococ- cum, Triticum turgidum, Triticum timopheevi (trigo Timopheevs) e Triti- cum aestivum (trigo de pão); gramíneas de centeio e bluegrass, especialmente bluegrass do Kentucky, bluegrass do Canadá, gramínea do prado áspera, gramínea do prado bulbosa, gramínea do prado alpina, gramínea do prado ondulada, gramínea do prado amadeirada, gramí- nea do prado Balforth, gramínea do prado do pântano, gramínea do prado de folhas largas, gramínea do prado de folhas estreitas, gramí- nea do prado lisa, gramínea do prado espalhada e gramínea do prado achatada.

[000164] Cultivares comerciais de plantas agrícolas podem ser usados nos métodos e composições conforme descrito aqui. Exemplos não limitativos de cultivares comerciais são fornecidos abaixo. Milho

[000165] Cultivares de Zea exemplificativos fornecidos aqui incluem 39V07, 38H03AM1, P9675, P9675YXR, P9630AM1, P9990AM1, P9917, P9917AM1, P9910AM1, P9910AMRW, P9910AMX, P9910XR, P0062AMX, P0062XR, P0193AM, P0193HR, P0216HR, P0210HR, 36V51, 36V52, 36V53, 36V59, P0313AM1, P0313XR, P0463AM1, P0461AMX, P0461EXR, P0461XR, P0453AM, P0453HR, P0448, P0448AMRW, P0448AMX, P0448E, P0448EHR, P0448R, P0413AM1, P0413E, P0407AMXT, P0533AM1, P0533EXR, P0528AMX, P0528YXR, 35F40, P0652AMX, P0636AM1, P0636HR, P0621HR, P0621R, P0717HR, P0832AM1, P0832E, P0832EXR, P0832XR, 34F29, P0993AM1, P0993HR, P0993XR, P0987AM1, P0987HR, P0916EHR, 34R6, 7P1023AM-R, P1018EHR, P1018HR, 34F06, 34F07, P1184, P1162AM1, P1162AMRW-R, P1162AMX-R, P1162EXR, P1162XR, P1151AM, P1151AM1, P1151R, P1142AMX, 33W80, 33W82, 33W84, 33W88AM1, P1281HR, P1253E, P1248AM, P1221AMX, P1221AMXT, P1215AM1, P1395, P1395AM1, P1395HR, P1395R, P1376XR, P1365AMX, P1360CHR, P1360HR, P1339AM1, P1324HR, 33Z74, 33T56, 33T57, 33M16, P1498, P1498AM, P1498HR, P1498R, P1480HR, P1477WHR, P1431W, P1431WR, P1420HR, 33G61, 33F12, P1555CHR, 33D42, 33D46, 33D49, P1659W, P1659WHR, 32D78, P1745HR, 32B16, P1995W e P2088HR da Pioneer Hi-Bred, os quais são cultivados em entidades geográficas que incluem o Iowa.

[000166] Cultivares de Zea exemplificativos fornecidos aqui incluem P0115AM1, P0392AMX, P0496AMX, P0432AM1, P0413AM1, P0413AMRW, P0413E, P0413R, P0533AM1, P0636AM1, P0636YXR, 35K01,35K02, 35K08, 35K09AM1, 35K10AMRW, 34M78, P0858AMX, P0832AMRW, P0832AMX, P0832E, P0832EXR, P0832R, P0993AM1, P0993HR, P0987AM1, P0987YXR, P0945YXR, P0916EHR, 34R65, P1023AM-R, P1023AMX-R, P1018AM, P1018AM1, P1018AMX, P1018E, P1018R, P1184, P1184AM, P1184AM1, P1184AMRW, P1184R, P1162AM1, P1162AMRW-R, P1162AMX-R, P1162EXR, P1151AM, P1151AM1, 34P91, P1292AMX, P1241AMX, P1221AMX, P1221AMXT, P1215AM1, P1395AM1, P1395AMRW, P1376XR, P1360CHR, P1360HR, P1352AMX, P1339AM1, P1319, P1319AM1, P1319HR, 33T55, 33T56, P1498, P1498AM, P1498CHR, P1498HR, P1498R, P1477W, P1477WHR, P1449XR, P1431W, P1431WR, 33F12, 33D42, P1690HR, P1659W, 32B09, 32B10, 32B16, P1995W, P1995WR e P2088AM da Pioneer Hi-Bred, os quais são cultivados em entidades geográficas que incluem Illinois.

[000167] Cultivares de Zea exemplificativos fornecidos aqui incluem P8917XR, P9690AM, P9690HR, P0125R, P0231HR, P0365YHR, P0302CHR, P0474AM1, P0461EXR, P0591AM1, P0541AM1, P0541HR, 35F37, 35F38, 35F48AM1, 35F50AM, P0636AM1, P0636HR, P0636YXR, P0621HR, 35K01, P0876AM, P0876CHR, P0876HR, P0987, P0987AM, P0987AM1, P0987HR, P0987R, P0987YXR, P0916EHR, P0902AM1, P1023AM-R, P1023AMX-R, P1018EHR, P1173AM, P1173CHR, P1173HR, P1173R, P1151AM, P1151AM1, P1151HR, P1151R, P1151YXR, P1105YHR, P1292ER, P1266YHR, P1395AM, P1395AM1, P1395R, P1376XR, P1360HR, P1324HR, P1498AM, P1498AM1, P1498HR, P1498R, P1477W, P1477WHR, P1449XR, P1431W, 33G60, 33G61, 33F12, P1508CHR, 32T16, 33D42, 33D46, 33D47, 33D49, 33D53AM-R, 32T82, 32T84, P1690AM, P1690CHR, P1690HR, P1659W, P1659WHR, P1625CHR, P1625HR, P1768AMX, 32N74AM1, 32B09, 32B10, 32B11, 32B16, P1995W, P1995WR, 31G67AM1, 31G71, P2088AM, P2088YHR e P2088YXR da Pioneer Hi-Bred, os quais são cultivados em entidades geográficas que incluem Nebraska.

[000168] Cultivares de Zea exemplificativos fornecidos aqui incluem P9690HR, P0115AM1, P0216HR, P0448E, P0432AM1, P0413AM1, P0413E, P0636AM1, P0636HR, P0636YHR, P0621HR, 35K01, 35K02, 35K08, 35K09AM1, 35K10AMRW, 34M78, P0858AMX, P0832AMX, P0832E, P0832R, P0993AM1, P0993HR, P0987, P0987AM, P0987AM1, P0987HR, P0987YXR, P0945YXR, P0916EHR, P1023AM-R, R-P1023AMX, P1018AM, P1018AM1, P1018AMX, P1018E, P1018R, P1184, P1184AM, P1184AM1, P1184R, P1162AM1, P1162AMRW-R, P1162AMX- R, P1151AM, P1151AM1, P1105YHR, 34P91, P1253E, P1221AMX, P1221AMXT, P1395, P1395AMRW, P1395HR, P1395R, P1376XR, P1360AM, P1360HR, P1352AMX, P1339AM1, P1319, P1319AM1, P1319HR, 33T54, 33T55, 33T56, 33T57, 33N58, P1498, P1498AM, P1498CHR, P1498HR, P1498R, P1477W, P1477WHR, P1449XR, P1431W, P1431WR, 33G60, 33F12, P1659W, P1659WHR, P1646YHR, P1636AM, P1636YHR, P1602YHR, 32D78, 32D79, P1745HR, 32B09, 32B10, 32B16, P1995W, P1995WR, 31P41 e P2088AM da Pioneer Hi-Bred, os quais são cultivados em entidades geográficas que incluem Indiana.

[000169] Cultivares de Zea exemplificativos fornecidos aqui incluem Gentry® SmartStax® RIB Complete®, incluindo DKC48-12RIB Brand, DKC49-29RIB Brand, DKC53-56RIB Brand, DKC62-08RIB Brand, DKC63-33RIB Brand; DEKALB® Genuity® DroughtGard™ Hybrids, incluindo DKC47-27RIB Brand, DKC50-57RIB Brand, DKC51-20RIB Brand, DKC63-55RIB Brand, DKC65-81RIB Brand; < 89 Relative Maturity, incluindo DKC31-10RIB Brand, DKC32-92RIB Brand, DKC33- 78RIB Brand, DKC38-03RIB Brand, DKC39-07RIB Brand; 90-99 Relative Maturity, incluindo DKC43-10RIB Brand, DKC44-13RIB Brand, DKC46-20RIB Brand, DKC48-12RIB Brand, DKC49-29RIB Brand; 101103 Relative Maturity, incluindo DKC51-20RIB Brand, DKC52-30RIB Brand, DKC53-56RIB Brand, DKC53-58RIB Brand, DKC53-78RIB Brand; 104-108 Relative Maturity, incluindo DKC54-38RIB Brand, DKC57-75RIB Brand, DKC57-92RIB Brand, DKC58-87RIB Brand, DKC58-89RIB Brand; 110-111 Relative Maturity, incluindo DKC60- 63RIB Brand, DKC60-67RIB Brand, DKC61-16RIB Brand, DKC61- 88RIB Brand, DKC61-89RIB Brand; 112-113 Relative Maturity, incluindo DKC62-08RIB Brand, DKC62-97RIB Brand, DKC63-07RIB Brand, DKC63-33RIB Brand, DKC63-55RIB Brand; 114-116 Relative Maturity, incluindo DKC64-69RIB Brand, DKC64-87RIB Brand, DKC65-19RIB Brand, DKC65-79RIB Brand, DKC66-40RIB Brand; 117+ Relative Maturity, incluindo DKC67-57RIB Brand, DKC67-58RIB Brand, DKC67- 88RIB Brand, DKC68-05 Brand e DKC69-29 Brand da DEKALB®, os quais são cultivados em entidades geográficas que incluem os Estados Unidos. Trigo

[000170] Cultivares de Triticum exemplificativos fornecidos aqui incluem Everest, TAM 111, Armour, TAM 112, Fuller, Duster, T158, Postrock, Endurance, Jagger, Winter Hawk, Art, Overley, Jagalene, Jackpot, Hatcher, Santa Fe, Danby, Billings, T81, TAM 110, AP503 CL2, Aspen, 2137, TAM 113, Hitch, TAM 101, CJ, Centerfield, SY Gold e Above, os quais são cultivados em entidades geográficas que incluem Kansas.

[000171] Cultivares de Triticum exemplificativos fornecidos aqui incluem Barlow, Glenn, SY Scren, Faller, Prosper, Kelby, Brennan, RB07, Vantage, WB Mayville, Freyr, Jenna, Mott, Select, Steele-ND, Briggs, Howard, Reeder, Alsen, Rollag, Divide, Alkabo, Mountrail, Tioga, Lebsock, Grenora, Dilse, Ben, DG Max, Pierce, Monroe, DG Star, Jerry, Decade, Hawken, Wesley, Overland, CDC Falcon, SY Wolf, Harding, Darrell, WB Matlock, Millennium e Boomer, os quais são cultivados em entidades geográficas que incluem N. Dakota.

[000172] Cultivares de Triticum exemplificativos fornecidos aqui incluem Yellowstone, Genou, CDC Falcon, Rampart, Ledger, Jerry, AP503 CL2, Hawken, Norris, Pryor, Jagalene, Carter, Morgan, Decade, WB Quake, Tiber, Willow Creek, Radiant, Neeley, Vanguard, Promontory, Overland e Redwin, os quais são cultivados em entidades geográficas que incluem Montana.

[000173] Cultivares de Triticum exemplificativos fornecidos aqui incluem Duster, Endurance, Jagger, Fuller, OK Bullet, Jackpot, Everest, Billings, TAM 112, TAM 111, Big Max, Overley, Doans, Armour, Santa Fe, Garrison, Deliver, TAM 110, CJ, 2157, Custer, 2137, Scout, Centerfield, Triumph varieties, Dumas, TAM 401, Gallagher, Cutter, T-158, Ike, WB Hitch, Greer, AP 503 CL2, Ruby Lee, Pioneer 2548, Pioneer 2571 e Coker 762, os quais são cultivados em entidades geográficas que incluem Oklahoma.

[000174] Cultivares de Triticum exemplificativos fornecidos aqui incluem UI Stone, Diva, Petit, Jubilee, Louise, Alturas, Whit, Babe, Cataldo, Alpowa, BrundageCF, Brundage96, Bitterroot, Kaseberg, Amber, Bruneau, AP Legacy, Salute, Ladd, Junction, ORCF101, Mary, Masami, SY Ovation, Skiles, Rod, WB523, Legion, Eltan, WB528, Stephens, Otto, ORCF103, Rosalyn, Madsen, AP Badger, LCS Artdeco, ORCF102, Lambert, Goetze, WB456, WB1020M, AP700CL, Xerpha, Tubbs06, WB1066CL, Eddy, Finley, Juniper, Whetstone, Sprinter1, Paladin, DW, Buchanan, Farnum, Northwest 553, Peregrine, Rimrock, Declo, Esperia, Boundary, Bauermeister, Residence, Symphony e Estica, os quais são cultivados em entidades geográficas que incluem o Estado de Washington.

[000175] Cultivares de Triticum exemplificativos fornecidos aqui incluem Wesley, Overland, Expedition, Clearfield, Smoky Hill, Arapahoe, Lyman, Hawken, Millennium, Jagalene, CDC Falcon, Alliance, Nekota, Briggs, RB07, Brick, Faller, Howard, Select, Traverse, Steele ND, Forge, Barlow, Butte86/Butte, Granger, Brennan, os quais são cultivados em entidades geográficas que incluem Dakota do Sul. Cevada

[000176] Cultivares de cevada exemplificativos fornecidos aqui incluem Azure, Beacon, Bere, Betzes, Bowman, Celebration, Centennial, Compana, Conlon, Diamant, Dickson, Drummond, Excel, Foster, Glenn, Golden Promise, Hazen, Highland cevada, Kindred, Kindred L, Larker, Logan, Lux, Manchurian, Manscheuri, Mansury, Maris Otter, Morex, Nordal, Nordic, Optic, Park, Plumage Archer, Pearl, Pinnacle, Proctor, Pioneer, Rawson, Robust, Sioux, Stark, Tradition, Traill, Tre- gal, Trophy, Windich e Yagan, os quais são cultivados no mundo todo.

[000177] Cultivares de cevada exemplificativos fornecidos aqui incluem Tradition, Lacey, Robust, Celebration, Conlon, Pinnacle, Haybet, Legacy, Stellar-D, Innovation, Hays, Quest, Bowman e Logan, os quais são cultivados em entidades geográficas que incluem Dakota do Norte.

[000178] Cultivares de cevada exemplificativos fornecidos aqui incluem AC METCALFE, HARRINGTON, CONRAD (B5057), LEGACY (B2978), MORAVIAN 69 (C69), MERIT (B4947), TRADITION (B2482), MORAVIAN 83 (C83) e CHARLES, os quais são cultivados em entidades geográficas que incluem Idaho.

[000179] Cultivares de cevada exemplificativos fornecidos aqui incluem Harrington, Haybet, B 1202, Moravian, Baronesse, Hector, Bowman, Westford, B Merit, Gallatin, Horsford, Lewis, Stark, Piroline, Valier, B 2601, Legacy, Menuet, Robust, Chinook e Clark, os quais são cultivados em entidades geográficas que incluem Montana.

[000180] Cultivares de cevada exemplificativos fornecidos aqui incluem Champion, Bob, Baronesse, Radiant, Haybet, Belford, Camelot, BG, Camas, Gallatin, Copeland, AC Metcalfe e Harrington, os quais são cultivados em entidades geográficas que incluem o Estado de Washington.

[000181] Cultivares de cevada exemplificativos fornecidos aqui incluem Moravian 69, C-115, C-128, Scarlett, Baronesse, Hays e Steptoe, os quais são cultivados em entidades geográficas que incluem o Colorado. Plantas Transgênicas

[000182] Os métodos descritos aqui podem também ser usados com plantas transgênicas que contêm um ou mais transgenes exógenos, por exemplo, para conferir traços benéficos adicionais conferidos pelos micróbios endofíticos recentemente introduzidos. Portanto, em uma modalidade, uma semente ou muda de uma planta transgênica de milho, trigo, arroz ou cevada é contatada com um micróbio endofítico. MÉTODOS DE USO DOS ENDÓFITOS BACTERIANOS ORIGINÁRIOS DE SEMENTE

[000183] Conforme descrito aqui, as populações bacterianas purifi- cadas que incluem um ou mais de endófitos bacterianos derivados de sementes e composições contendo o mesmo (por exemplo, formulações agrícolas) podem ser usados para conferir características benéficas para a planta hospedeira, incluindo, por exemplo, um ou mais dos seguintes procedimentos : aumento da biomassa da raiz, Aumento no comprimento das raízes, aumento da altura, Aumento no comprimento da parte aérea, aumento do número de folhas, aumento da eficiência de uso da água, aumento da biomassa em geral, aumento do rendimento de grãos, aumento da taxa de fotossíntese, aumento na tolerância à estiagem, aumento na tolerância ao calor, tolerância ao sal aumentou, aumento na resistência ao estresse por nematoides, aumento na resistência a um patógeno fúngico, aumento na resistência a um patógeno bacteriano, aumento na resistência a um patógeno viral, uma modulação detectável no nível de um metabólito e uma modulação detectável no proteoma em relação a uma planta de referência. Por exemplo, em algumas modalidades, uma população bac- teriana purificada, que inclui um endófito bacteriano originário de semente pode melhorar a duas ou mais dessas características benéficas, por exemplo, a eficiência de uso da água com uma aumento na tolerância à estiagem. Tais características podem ser hereditárias pela progênie da planta agrícola a que o endófito bacteriano originário de semente foi aplicada ou pela progênie da planta agrícola que foi crescida a partir da semente associada à endófito bacteriano originário de semente.

[000184] Em alguns casos, o endófito bacteriano originário de semente pode produzir um ou mais compostos e/ou têm uma ou mais atividades que são benéficos para a planta, por exemplo, um ou mais dos seguintes: a produção de um metabólito, a produção de uma fi- tormônio, tais como auxina, produção de acetoína, a produção de um composto antimicrobiano, produção de um sideroforo, produção de uma celulase, produção de uma pectinase, a produção de uma quiti- nase, produção de uma xilanase, fixação de nitrogênio ou solubiliza- ção de fosfato mineral, por exemplo, uma sementes de origem bacteri- ano endófito pode produzir fitormônios selecionados do grupo que consiste de uma auxina, uma citoquinina, uma giberelina, etileno, um brassinosteroide e ácido abscísico. Em uma modalidade especial, as endófitos bacterianos originários de semente produz auxina (por exemplo, o ácido indole-3-acético (IAA)). Produção de auxina pode ser ensaiada conforme descrito aqui. Muitos dos micróbios descritos aqui são capazes de produzir o ácido indole-3-acético planta hormona au- xina (IAA) quando crescidos em cultura. Auxina desempenha um papel chave em alterar a fisiologia da planta, incluindo a extensão do crescimento da raiz. Portanto, em outra modalidade, a população bacteria- no endófito é disposta sobre a superfície ou dentro de um tecido das sementes ou mudas, em uma quantidade eficaz para induzir a produção detectável de auxina na planta agrícola. Por exemplo, o aumento da produção de auxina poderá ser de pelo menos 10%, por exemplo, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 75%, pelo menos 100% ou mais, quando comparada com uma planta agrícola referência. Em uma modalidade, o aumento da produção de auxina poderá ser detectada em um tipo de tecido selecionado de entre o grupo que consiste em a raiz, caule, folhas e flores.

[000185] Em algumas modalidades, o endófito bacteriano originário de semente pode-se produzir um composto com propriedades antimi- crobianas. Por exemplo, o composto pode ter propriedades antibacte- rianas, como determinado pelos ensaios de crescimento aqui proporcionados. Em uma modalidade, o composto com propriedades antibac- terianas mostra a atividade bacteriostática ou bactericida contra E. coli e/ou Bacillus sp. Em outra modalidade, a origem das sementes endófi- to bacteriano produz um composto com propriedades antifúngicos, por exemplo, atividade fungicida ou fungistático contra S. cerevisiae e/ou Rhizoctonia.

[000186] Em algumas modalidades, o endófito bacteriano originário de semente é capaz de fixação de nitrogênio e é, assim, capaz de produzir a partir de nitrogênio de amónio atmosférica. A capacidade das bactérias para fixar o nitrogênio pode ser confirmada através de testes de crescimento das bactérias em meios de crescimento isentos de nitrogênio, por exemplo, meios LGI, conforme descrito aqui.

[000187] Em algumas modalidades, a origem bacteriano endófito semente pode produzir um composto que aumenta a solubilidade do fosfato mineral no meio isto é, o mineral de fosfato de solubilização, por exemplo, usando os ensaios de crescimento descritos aqui. Em uma modalidade, a endófito bacteriano originário de semente n produz um composto que permite a bactéria a crescer em meio de crescimento contendo Ca3HPO4 como a fonte de fosfato sola.

[000188] Em algumas modalidades, o endófito bacteriano originário de semente pode produzir um sideroforo. Os sideroforos são agentes de quelação de ferro pequenas elevada afinidade secretadas por micro-organismos que aumentam a biodisponibilidade do ferro. Produção de sideroforos pelo endófito bacteriano pode ser detectada, por exemplo, usando os métodos descritos aqui, bem como em outra parte (Perez-Miranda et al, 2007, J Métodos Microbiol. 70: 127-31, aqui incorporado por referência na íntegra ).

[000189] Em algumas modalidades, o endófito bacteriano originário de semente pode produzir uma enzima hidrolítica. Por exemplo, em uma modalidade, um endófito bacteriano pode produzir uma enzima hidrolítica selecionado do grupo que consiste de uma celulase, uma pectinase, uma quitinase e uma xilanase. Enzimas hidrolíticas podem ser produzidas através dos métodos descritos aqui (ver também, celu- lase: Quadt-Hallmann et al, (1997) Can J. Microbiol., 43: 577-582; pectinase: Soares et al (1999) Revista de. Microbiology 30 (4): 299-303; quitinase: Li et al. (2004) Mycology 96: 526-536; e xilanase: Suto et al, (2002) J Biosci. Bioeng. 93: 88-90, cada um dos que é aqui incorporada por referência na íntegra).

[000190] Em algumas modalidades, as populações bacterianas purificadas contêm populações endofíticas sinérgicos, por exemplo, endó- fitos bacterianos derivados de sementes sinérgicos. Conforme usado aqui, as populações ENDOFÍTICAS sinérgicos referem-se a duas ou mais populações de endófitos que produzem um ou mais efeitos (por exemplo, dois ou mais ou três ou mais) efeitos que são maiores do que a soma dos seus efeitos individuais. Por exemplo, em algumas modalidades, uma população bacteriana purificada contém dois ou sementes de origem mais diferente endófitos bacterianos que são capazes de aumentar sinergicamente pelo menos um de, por exemplo, a produção de fitormônios, tais como auxina, produção de acetoína, a produção de um composto antimicrobiano, produção de um sideroforo, produção de uma celulase, produção de uma pectinase, a produção de uma quitinase, produção de uma xilanase, fixação de nitrogênio ou so- lubilização de fosfato mineral em um gramínea agrícola. Aumentando sinergicamente um ou mais de tais propriedades podem aumentar uma característica benéfica em uma planta gramínea agrícola, tal como um aumento na tolerância à estiagem.

[000191] Em algumas modalidades, uma população bacteriana purificada contendo uma ou mais endófitos bacterianos derivados de sementes podem aumentar uma ou mais propriedades, tais como a produção de fitormônios, tais como auxina, produção de acetoína, a produção de um composto antimicrobiano, produção de um sideroforo, produção de uma celulase, produção de uma pectinase, a produção de uma quitinase, produção de uma xilanase ou solubilização de fosfato mineral em uma grama planta agrícola., sem aumentar a fixação de nitrogênio na grama planta agrícola.

[000192] Em algumas modalidades, metabólitos em plantas da grama pode ser modulada fazendo combinações sintéticas de populações bacterianas purificadas contendo micróbios endofíticas, como endófi- tos bacterianos originários de semente e uma semente ou muda de um grama planta agrícola. Por exemplo, um endófito bacteriano descrito aqui pode causar uma modulação detectável (por exemplo, um aumento ou redução) no nível de vários metabólitos, por exemplo, indol- 3-carboxico, trans-zeatina, ácido abscísico, ácido faseico, indol-3- acético, ácido indole-3-butírico, ácido indol-3-acrílico, ácido jasmônico, metil éster de ácido jasmônico, ácido di-hidrofaseico, Giberelina A 3, o ácido salicílico, em cima de uma planta colonização grama.

[000193] Em algumas modalidades, o micróbio endófito modula o nível do metabólito diretamente (por exemplo, o próprio micróbio produz o metabólito, o que resulta em um aumento geral do nível do me- tabólito encontrada na planta). Em outros casos, a planta gramínea agrícola, como um resultado da associação com o micróbio endófito (por exemplo, uma endófito bacteriano originário de semente), exibe um nível modulado do metabólito (por exemplo, a planta reduz a expressão de um biossintética enzima responsável para a produção do metabólito como resultado da inoculação micróbio). Em ainda outros casos, a modulação do nível do metabólito é uma consequência da atividade de tanto o micro-organismo e a planta (por exemplo, a planta produz quantidades aumentadas do metabólito, quando comparado com uma planta agrícola de referência e o micróbio endófito igualmente produz o metabólito). Portanto, conforme usado aqui, uma modulação do nível de um metabólito pode ser uma alteração no nível metabólito através das ações do micro-organismo e/ou da planta inoculada.

[000194] Os níveis de um metabólito pode ser medido em uma unidade agrícola e comparado com os níveis de metabólito em uma planta agrícola de referência e cultivadas sob as mesmas condições que a planta inoculada. A planta não inoculado que é usado como uma referência de plantas agrícolas é uma planta que não tenha sido aplicada com uma formulação com o micróbio endófito (por exemplo, uma formulação compreendendo uma população de endófitos bacterianos purificadas). A planta não inoculado usado como planta agrícola de referência é geralmente a mesma espécie e cultivar como e é a isogênico, a planta inoculada.

[000195] O metabólito cujos níveis são modulados (por exemplo, aumento ou diminuição) na planta associada ao endófito pode servir como um nutriente primário (isto é, fornece a nutrição para os seres humanos e/ou animais que consomem a planta, tecido de planta ou a planta de mercadoria produtos derivados dos mesmos, incluindo, porém sem limitações, um açúcar, um amido, um hidrato de carbono, uma proteína, um óleo, um ácido gordo ou uma vitamina). O metabó- lito pode ser um composto que é importante para o crescimento das plantas, desenvolvimento ou homeostase (por exemplo, uma fitormô- nios, tais como a auxina, citoquinina, giberelinas, brassinosteroides, etileno ou ácido abscísico, uma molécula de sinalização ou um antio- xidante). Em outras modalidades, o metabólito pode ter outras funções. Por exemplo, em uma modalidade, um metabólito pode ter bac- teriostática, bactericida, fungicida e, fungicida ou propriedades antivi- rais. Em outras modalidades, o metabólito pode ter repelente de insetos, inseticida, repelente de nematoides ou propriedades nematicidas. Em ainda outras modalidades, o metabólito pode desempenhar um papel na proteção da planta de tensões, pode ajudar a melhorar o vigor da planta ou o estado geral de saúde da planta. Em ainda outra concretização, o metabólito pode ser um composto útil para a produ- ção industrial. Por exemplo, o metabólito pode ser ele próprio um composto útil, que é extraída para uso industrial ou servir como um intermediário para a síntese de outros compostos usados na indústria. Um nível de um metabólito pode ser aumentada de 1%, por exemplo, pelo menos 10%, por exemplo, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 75%, pelo menos 100%, pelo menos 150%, pelo menos 200% ou mais, pelo menos 300%, quando comparada com uma planta agrícola referência. Em uma modalidade particular, o nível do metabólito é aumentada dentro da planta agrícola ou uma sua porção tal que ele está presente em uma concentração de pelo menos 0,1 μg /g de peso seco, por exemplo, pelo menos de 0,3 μg /g de peso seco, 1,0 μg/g de peso seco, 3,0 μg /g de peso seco, 10 μg /g de peso seco, 30 μg /g de peso seco, de 100 μg /g de peso seco, de 300 μg /g de peso seco, de 1 mg/g de peso seco, 3 mg/g de peso seco, 10 mg/g de peso seco, 30 mg/g de peso seco, de 100 mg/g de peso seco ou mais, da planta ou parte da mesma.

[000196] Do mesmo modo, a modulação pode ser uma diminuição do nível de um metabólito. A redução pode ser um metabólito de afetar o sabor de uma planta ou de uma planta produto comercial derivado de uma planta (por exemplo, um composto de sabor amargo) ou em um metabólito que faz com que uma planta ou o produto vegetal produto resultante de outra forma menos valioso (por exemplo, redução do teor de oxalato em certas plantas ou compostos que sejam prejudiciais para a saúde animal) humano e/ou. O metabólito cujo nível deve ser reduzido pode ser um composto que afeta a qualidade de um produto vegetal de mercadorias (por exemplo, redução dos níveis de le- nhina). O nível de metabólito na planta gramínea agrícola ou parte da mesma pode ser, por exemplo, redução de pelo menos 1%, por exemplo, pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 99% ou mais, quando comparada com uma planta agrícola referência em uma referência ambiente.

[000197] Em algumas modalidades, o endófito bacteriano originário de semente é capaz de gerar uma rede bacteriana na gramínea agrícola ou circundante ambiente da planta, que rede é capaz de provocar uma modulação detectável no nível de um metabólito na planta hospedeira.

[000198] Em uma modalidade particular, o metabólito pode servir como uma molécula de sinalização ou de regulamentação. A via de sinalização pode ser associada com uma resposta a uma tensão de, por exemplo, uma das condições de tensão selecionado do grupo que consiste de tensão seca, salinidade, o estresse de calor, o estresse frio, baixa tensão de nutrientes, estresse nematoide, estresse por insetos, estresse fúngica patógeno, estresse patógeno bacteriano e estresse patógeno viral.

[000199] A planta agrícola inoculada é cultivada sob condições tais que o nível de um ou mais metabólitos é modulado na planta, em que a modulação é indicativo de maior resistência a uma tensão selecionado do grupo que consiste de tensão seca, salinidade, o estresse de calor, frio estresse, baixa tensão de nutrientes, estresse nematoide, estresse por insetos, fungo patogênico estresse, estresse patógeno bacteriano e estresse patógeno viral. O aumento na resistência pode ser medida a cerca de 10 minutos após a aplicação da pressão, por exemplo cerca de 20 minutos, 30 minutos, cerca de 45 minutos, cerca de uma hora, cerca de 2 horas, cerca de 4 horas, cerca de 8 horas, cerca de 12 horas, cerca de 16 horas, cerca de 20 horas, cerca de 24 horas, cerca de 36 horas, cerca de 48 horas, cerca de 72 horas, cerca de 96 horas, cerca de 120 horas ou cerca de uma semana após a aplicação da tensão.

[000200] Os metabólitos ou outros compostos descritos aqui podem ser detectados usando qualquer método adequado, incluindo, porém sem limitações eletroforese em gel, líquido e cromatografia em fase gasosa, quer sozinho ou acoplado a espectrometria de massa (ver, por exemplo, as secções de Exemplos a seguir), RMN ( Ver, por exemplo, a publicação de patente US 20070055456, a qual é aqui incorporada por referência na íntegra), imunoensaios ligados a enzimas (ensaios imunoabsorventes (ELISA)), espectroscopia de ensaios químicos e assim por diante. Em algumas modalidades, são usados sistemas comerciais para análise por RMN e cromatografia.

[000201] Em outras modalidades, metabólitos ou outros compostos são detectadas usando técnicas de imagiologia óptica, tais como espec- troscopia de ressonância magnética (MRS), imagiologia por ressonância magnética (MRI), tomografia computadorizada, ultrassom, imagiolo- gia de tecido com base em MS ou métodos de detecção de raios-X (por exemplo, energia raios-x por dispersão detecção de fluorescência).

[000202] Qualquer método adequado pode ser usado para analisar a amostra biológica (por exemplo, semente ou tecido de planta) de modo a determinar a presença, ausência ou nível de um ou mais me- tabólitos ou outros compostos na amostra. Os métodos adequados incluem a cromatografia (por exemplo, HPLC, cromatografia gasosa, cromatografia líquida), espectrometria de massa (por exemplo, MS, MS-MS), LC-MS, ELISA, anticorpo de ligação, outras técnicas imuno- químicas, bioquímica ou reações enzimáticas ou ensaios e combinações dos mesmos. Os níveis de um ou mais dos compostos ou meta- bólitos citados pode ser determinada nos métodos da presente invenção. Por exemplo, o nível (s) de um metabólitos ou os compostos, duas ou mais metabólitos, três ou mais metabólitos, quatro ou mais metabólitos, cinco ou mais metabólitos, seis ou mais metabólitos, sete ou mais metabólitos, oito ou mais metabólitos, nove ou mais meta- bólitos, dez ou mais metabólitos ou compostos, etc., incluindo uma combinação de alguns ou de todos os metabólitos ou compostos, incluindo porém sem limitações aqui divulgado pode ser determinada e usada em tais métodos.

[000203] Conforme mostrado nos exemplos e em contrário, as plantas inoculadas com endófitos exibir aumento na tolerância térmica, tolerância a herbicida, resistência à seca, resistência a insetos, a resistência do fungo, a resistência ao vírus, a resistência das bactérias, a esterilidade masculina, tolerância ao frio, tolerância ao sal, aumento da produtividade, o reforço de nutrientes usar a eficiência, aumentar a eficiência de uso de nitrogênio, aumento do teor de proteínas, aumento do teor de carboidrato fermentável, reduzido teor de lignina, maior teor de antioxidantes, o reforço da eficiência de uso da água, maior vigor, o aumento da eficiência de germinação, mais cedo ou aumento da floração, o aumento da biomassa, alteradas relação de biomassa, maior retenção de água do solo ou uma combinação destes. Portanto, em uma modalidade, a população dos endófitos bacterianos está disposta sobre a superfície ou dentro de um tecido das sementes ou mudas, em uma quantidade eficaz para aumentar a biomassa da planta ou uma parte ou tecido da planta crescida a partir da semente ou muda. O aumento da biomassa é útil na produção de produtos de base derivados da planta. Tais produtos de base incluem uma ração para animais, uma forragem de peixe, um produto de cereal, de um produto alimentar processado-humano, um açúcar ou um álcool. Tais produtos podem ser um produto de fermentação ou de um produto fermentável, um tal produto é uma exemplificativa biocombustível. O aumento da biomassa pode ocorrer em uma parte da planta (por exemplo, o tecido da raiz, rebentos, folhas, etc.) ou pode ser um aumento da biomassa total. Produção de biomassa aumentou, tal aumento significado, pelo menos cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% ou superior a 100% quando comparado com um referência planta agrícola. Tal aumento da biomassa global pode ser sob condições relativamente livre de estresse. Em outros casos, o aumento da biomassa pode ser em plantas cultivadas em qualquer número de estresses abióticos ou bióticos, incluindo estresse hídrico, estresse por sal, o estresse térmico, estresse causado pelo frio, baixo estresse de nutrientes, estresse nematoide, estresse por insetos, estresse fungo patogênico, estresse patógeno bacteriano e estresse patógeno viral. Em uma modalidade particular, a população dos endófitos bacterianos está disposta em uma quantidade eficaz para aumentar a biomassa da raiz em pelo menos 10%, por exemplo, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 75%, pelo menos 100% ou mais, quando comparada com uma planta agrícola referência.

[000204] Em outra modalidade, a população bacteriano endófito é disposta sobre a superfície ou dentro de um tecido das sementes ou mudas, em uma quantidade eficaz para aumentar a taxa de germinação de sementes quando comparado com uma planta agrícola referência. Por exemplo, o aumento da germinação de sementes pode ser de pelo menos 10%, por exemplo, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 75%, pelo menos 100% ou mais, quando comparada com uma planta agrícola referência.

[000205] Em outros casos, o micróbio endófito é disposta sobre as sementes ou mudas, em uma quantidade eficaz para aumentar a biomassa média do fruto ou da espiga a partir da planta, resultando em pelo menos 10%, por exemplo, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 75%, pelo menos 100% ou mais, quando comparada com uma planta agrícola referência.

[000206] Como destacado na seção Exemplos, plantas inoculadas com uma população dos endófitos bacterianos também mostram um aumento na altura geral da planta. Portanto, em uma modalidade, a presente invenção proporciona uma semente que compreende uma população bacteriana endófitos que está disposta sobre a superfície ou dentro de um tecido das sementes ou mudas, em uma quantidade eficaz para aumentar a altura da planta. Por exemplo, a população dos endófitos bacterianos está disposta em uma quantidade eficaz para resultar em um aumento da altura da planta agrícola tal que é, pelo menos 10% maior, por exemplo, pelo menos 20% maior, pelo menos 30% maior, pelo menos 40% maior, pelo menos 50% maior, pelo menos 60% maior, pelo menos 70% maior, pelo menos 80% maior, pelo menos 90% maior, pelo menos 100% maior, pelo menos 125% maior, pelo menos 150% maior ou mais, quando comparada com uma planta agrícola de referência. Tal aumento na altura pode ser sob condições relativamente livre de estresse. Em outros casos, o aumento da altura pode ser nas plantas cultivadas com qualquer número de estresses abióticos ou bióticos, incluindo estresse hídrico, estresse por sal, o estresse térmico, estresse causado pelo frio, baixo estresse de nutrientes, estresse por nematoide, estresse por insetos, estresse fungo patogênico, estresse patógeno bacteriano ou estresse patógeno viral.

[000207] As plantas hospedeiras inoculados com a população dos endófitos bacterianos também mostram melhoras dramáticas na sua capacidade de usar a água de forma mais eficiente. Eficiência de uso da água é um parâmetro frequentemente correlacionados com tolerância à estiagem. Eficiência de uso da água (EUA) é um parâmetro frequentemente correlacionados com tolerância à estiagem e é a taxa de assimilação de CO2 por água transpirada pela planta. Um aumento na biomassa na baixa disponibilidade de água pode ser devido a uma maior eficiência relativamente do crescimento ou a redução do consu- mo de água. Na seleção de características para melhorar as culturas, uma diminuição no uso de água, sem uma mudança no crescimento teria especial mérito em um sistema agrícola irrigada em que os custos de entrada de água foram elevadas. Um aumento no crescimento sem um salto correspondente no uso da água teria aplicabilidade a todos os sistemas agrícolas. Em muitos sistemas agrícolas onde o abastecimento de água não é limitativa, um aumento do crescimento, mesmo que veio à custa de um aumento do uso da água também aumenta o rendimento.

[000208] Quando a água do solo se esgotar ou se a água não está disponível durante períodos de seca, as colheitas são restritas. Déficit hídrico planta se desenvolve se transpiração das folhas excede o abastecimento de água a partir das raízes. O abastecimento de água disponível está relacionada com a quantidade de água retida no solo e a capacidade da planta para atingir essa água com o seu sistema de raiz. A transpiração de água a partir de folhas está ligada à fixação de dióxido de carbono através da fotossíntese através dos estomas. Os dois processos são positivamente correlacionados, de modo que o influxo de dióxido de carbono através da fotossíntese alta está intimamente ligada à perda de água por transpiração. Como a água transpira a partir da folha, potencial hídrico da folha é reduzida e os estômatos tendem a fechar em um processo hidráulico limitando a quantidade de fotossíntese. Desde o rendimento da cultura é dependente da fixação de dióxido de carbono na fotossíntese, a absorção de água e transpiração são fatores que contribuem para o rendimento da cultura. As plantas que são capazes de usar menos água para corrigir a mesma quantidade de dióxido de carbono ou que são capazes de funcionar normalmente em um potencial de água inferior têm o potencial para realizar mais fotossíntese e, assim, para produzir mais biomassa e rendimento econômico em muitos sistemas agrícolas. Um aumento da eficiência de uso da água da planta refere-se, em alguns casos a um aumento do tamanho ou número de frutas/grão.

[000209] Portanto, em uma modalidade, as plantas descritos aqui exibem um aumento na eficiência de uso da água (EUA), quando comparado com uma planta agrícola referência cultivadas sob as mesmas condições. Por exemplo, as plantas crescidas a partir das sementes que constituem a população endófito bacteriano pode ter, pelo menos 5% superior a EUA, por exemplo, pelo menos 10% maior, pelo menos 20% maior, pelo menos 30% maior, pelo menos 40% maior, pelo menos 50% maior, pelo menos 60% maior, pelo menos 70% maior, pelo menos 80% maior, pelo menos 90% mais, pelo menos 100% superior do que uma planta agrícola referência cultivadas sob as mesmas condições. Tal aumento na WUE pode ocorrer sob condições sem défice de água ou sob condições de défice de água, por exemplo, quando o conteúdo de água no solo é inferior ou igual a 60% de saturados de água no solo, por exemplo, inferior ou igual a 50%, menos do que ou igual a 40%, inferior ou igual a 30%, inferior ou igual a 20%, inferior ou igual a 10% de água no solo saturado com base no peso.

[000210] Em uma modalidade relacionada, a planta que compreende o endófito bacteriano pode ter, pelo menos 10% maior conteúdo de água relativo (RWC), por exemplo, pelo menos 20% maior, pelo menos 30% maior, pelo menos 40% maior, pelo menos 50% mais elevada, pelo menos 60% maior, pelo menos 70% maior, pelo menos 80% maior, pelo menos 90% maior, pelo menos 100% maior do que uma planta RWC agrícola referência cultivadas sob as mesmas condições. Combinações Sintéticas e Métodos de Produção

[000211] Como se mostra na secção de Exemplos a seguir, as populações bacterianas endofíticas descritos aqui são capazes de colonizar um hospedeiro planta. Colonização bem sucedida pode ser confirmada através da detecção da presença da população de bactérias no interior da planta. Por exemplo, após a aplicação das bactérias para as sementes, os títulos elevados de bactérias podem ser detectadas nas raízes e rebentos das plantas que germinam a partir das sementes. Além disso, quantidades significativas de bactérias podem ser detectadas na rizosfera das plantas. A detecção da presença do micróbio endófito no interior da planta pode ser conseguido medindo a viabilidade do micróbio após a esterilização da superfície da semente ou da planta: resultados de colonização endofíticas em uma localização interna do micróbio, tornando-a resistente às condições de esterilização superficial. A presença e quantidade de micro-organismo pode também ser estabelecido através de outros meios conhecidos na técnica, por exemplo, microscopia de imunofluorescência usando anticorpos específicos micróbio ou hibridação in situ fluorescente (ver, por exemplo, Amann et al. (2001) Current Opinion in Biotechnology 12: 231-236, aqui incorporada por referência na íntegra). Alternativamente, as sondas de ácidos nucleicos específicos que reconhecem sequências conservadas do endófito pode ser empregue para amplificar uma região, por exemplo, por PCR quantitativa e correlacionado com CFUs por meio de uma curva padrão.

[000212] Em outra modalidade, o micróbio endófito é disposta, por exemplo, sobre a superfície de uma semente de uma gramínea agrícola, em uma quantidade eficaz para ser detectável na planta madura agrícola. Em uma modalidade, o micróbio endófito é disposta em uma quantidade eficaz para ser detectável em uma quantidade de pelo menos cerca de 100 CFU, pelo menos cerca de 200 CFU, pelo menos cerca de 300 CFU, pelo menos cerca de 500 CFU, pelo menos cerca de 1000 CFU, pelo menos cerca de 3000 CFU, pelo menos cerca de 10.000 CFU, pelo menos cerca de 30.000 CFU, pelo menos cerca de 100.000 ou mais CFU na planta madura agrícola.

[000213] Em alguns casos, o micróbio endófito é capaz de colonizar determinados tipos de tecido da planta. Em uma modalidade, o micróbio endófito é disposta sobre as sementes ou mudas, em uma quantidade eficaz para ser detectável dentro de um tecido alvo da planta madura agrícola selecionado a partir de um fruto, uma semente, uma folha ou uma raiz ou uma sua porção. Por exemplo, o micróbio endófi- to pode ser detectada em uma quantidade de pelo menos cerca de 100 CFU, pelo menos cerca de 200 CFU, pelo menos cerca de 300 CFU, pelo menos cerca de 500 CFU, pelo menos cerca de 1000 CFU, pelo menos cerca de 3000 CFU, em menos cerca de 10.000 CFU, pelo menos cerca de 30.000 CFU, pelo menos cerca de 100.000 CFU ou mais, no tecido alvo da planta madura agrícola. Endófitos Compatíveis com Agrotóxicos

[000214] Em certas modalidades, o endófito é selecionado com base na sua compatibilidade com os produtos agroquímicos e vulgarmente usados. Como mencionado anteriormente, as plantas, particularmente plantas agrícolas, pode ser tratado com uma vasta faixa de produtos agroquímicos, incluindo fungicidas, biocidas (agentes antibacterianos), herbicidas, inseticidas, nematicidas, rodenticidas, fertilizantes e outros agentes.

[000215] Em alguns casos, pode ser importante para o endófito para ser compatível com agroquímicos, particularmente aqueles com propriedades fungicidas ou bactericidas, de modo a persistir na planta apesar de, tal como mencionado anteriormente, existem muitos desses agentes fungicidas ou bactericidas que não penetram a planta, pelo menos em uma concentração suficiente para interferir com o endófi- to. Portanto, quando um fungicida sistêmico ou agente antibacteriano é usado na planta, o grau de compatibilidade de endófito deve ser inoculados com tais agentes vai ser um critério importante.

[000216] Em uma modalidade, isolados naturais de endófitos que são compatíveis com produtos agroquímicos podem ser usados para inocular as plantas de acordo com os métodos descritos aqui. Por exemplo, fungos endófitos que são compatíveis com os fungicidas agricolamente usados podem ser isolados através do plaqueamento de uma cultura de as endófitos em uma placa de Petri contendo uma concentração eficaz do fungicida e isolar colônias do endófito que são compatíveis com o fungicida. Em outra modalidade, um endófito que é compatível com um fungicida é usado para os métodos descritos aqui. Por exemplo, o endófito pode ser compatível com, pelo menos um dos fungicidas selecionados do grupo que consiste em: 2-(tiocianatome- tiltio)-benzotiazol, 2-fenilfenol, sulfato de 8-hidroxiquinolina, ametoctra- din, amisulbrom, antimicina, Ampelomices quisqualis, azaconazol, azoxistrobina, Bacillus subtilis, benalaxil, benomil, bentiavalicarbe- isopropílico, benzilaminobenzeno-sulfonato (BABS) sal, bicarbonatos, bifenilo, bismerthiazol, bitertanol, bixafeno, blasticidina-S, bórax, mistura Bordeaux, boscalide, bromuconazol, bupirimato, polisulfide cálcio, captafol, captano, carbendazim, carboxina, carpropamida, carvona, cloroneb, clorotalonil, clozolinato, Coniothirium minitans, hidróxido de cobre, octanoato de cobre, oxicloreto de cobre, sulfato de cobre, sulfato de cobre (tribásico), óxido de cobre, ciazofamida, ciflufenamida, ci- moxanil, ciproconazol, ciprodinilo, dazomet, debacarb, diammonium etilenobis-(ditiocarbamato), diclofluanida, diclorfena, diclocimet, diclo- mezina, dicloran, dietofencarbe, difenoconazol, difenzoquat ion, diflu- metorim, dimetomorfe, dimoxistrobina, diniconazol, diniconazol-M, di- nobuton, dinocap, difenilamina, ditianona, dodemorfe, acetato dode- morfe, dodina, base livre dodina, edifenfos, enestrobina, epoxiconazol, etaboxame, etoxiquina, etridiazol, famoxadona, fenamidona, fenarimol, fenbuconazol, fenfuram, fenehexamida, fenoxanil, fenpiclonil, fenpropi- din, fenepropimorfe, fentina, fentin acetato, hidróxido de fentina, fer- bam, ferimzone, fluaziname, fludioxonil, flumorf, fluopicolida, fluopira- me, fluoroimida, fluoxastrobina, fluquinconazol, flusilazol, flusulfamida, flutianil, flutolanil, flutriafol, fluxapiroxade, folpete, formaldeído, fosetil, fosetil-alumínio, fuberidazol, furalaxil, furametpir, guazatina, acetatos guazatina, GI-81, o hexaclorobenzeno, hexaconazol, himexazol, ima- zalil, sulfato de imazalil, imibenconazol, iminoctadina, triacetato iminoc- tadina, iminoctadina tris(albesilato), ipconazol, iprobenfos, iprodiona, iprovalicarbe, isoprotiolana, isopirasame, isotianil, kasugamicina, kas- ugamicina hidrato de cloridrato de, cresoxime-metilo, mancobre, man- cozebe, mandipropamida, manebe, mepanipirime, mepronil, cloreto de mercúrio, óxido de mercúrio, cloreto mercuroso, metalaxil, mefenoxam, metalaxil-M, metam, metam-amônio, metame-potássio, metame-sódio, metconazol, metasulfocarbe, iodeto de metilo, isotiocianato de metilo, metiram, metominostrobina, metrafenona, mildiomicina, miclobutanil, nabam, nitrotal-isopropílico, nuarimol, octilinona, ofurace, ácido oleico (ácidos graxos), orisastrobina, oxadixil, oxina-cobre, fumarato oxpoco- nazol, oxicarboxina, pefurazoato, penconazol, pencicuron, penflufeno, pentaclorofenol, pentaclorofenilo laurato, pentiopirad, acetato fenilmer- cúrio, ácido fosfónico, ftalida, picoxistrobina, polioxina B, polioxinas, polioxorim, bicarbonato de potássio, sulfato de hidroxiquinolina, probe- nazol, procloraz, procimidona, propamocarbe, cloridrato de propamo- carbe, propiconazol, propinebe, proquinazida, protioconazol, piraclos- trobina, pirametostrobina, piraoxistrobina, pirazofos, piribencarbe, piri- buticarbe, pirifenox, pirimetanil, piroquilona, quinoclamina, quinoxifeno, quintozeno, extrato de Reinoutria sachalinensis, sedaxano, siltiofame, simeconazol, sódio 2-phenilphenoxide, bicarbonato de sódio, pentaclo- rofenóxido de sódio, espiroxamina, enxofre, SIP-Z071, SIP-Z048, óleos de alcatrão, tebuconazol, tebufloquina, tecnazeno, tetraconazol, tiabendazol, tifluzamida, tiofanato-metila, tirame, tiadinil, tolclofos- metilo, tolilfluanida, triadimefão, triadimenol, triazoxida, triciclazol, tridemorfe, trifloxistrobina, triflumizol, triforina, triticonazol, validamicina, valifenalate, valifenal, vinclozolina, zineb, ziram, zoxamida, Candida oleophila, Fusarium oxisporum, Gliocladium spp., Phlebiopsis gigan- tea, Streptomices griseoviridis, Trichoderma spp., (RS)-N-(3,5- diclorofenil)-2-(metoximetil)-succinimida, 1,2-dicloropropano, 1,3- dicloro-1,1,3,3-tetrafluoroacetona hidratada, 1-cloro-2,4-dinitrona- ftaleno, 1-cloro-2-nitropropano, 2-(2-heptadecil-2-imidazolin-1-il)etanol, 2,3-di-hidro-5-fenil-1,4-ditino-1,1,4,4-tetraóxido, acetato de 2- metoxietilmercuri, cloreto de 2-metoxietilmercuri, silicato de 2- metoxietilmercúrio, 3-(4-clorofenil)-5-metil-rodanina, 4-(2-nitroprop-1- enil)fenil tiocianatemo, ampropilfos, anilazina, azitiram, polissulfeto de bário, Bayer 32.394, benodanil, benquinox, bentaluron, benzamacril; benzamacril-isobutila, benzamorf, para matar ácaros, Sulfato de bis(metilmercúrio), óxido de bis(tributilestanho), butiobato, cádmio e zinco cobre sulfato de cálcio cromato, carbamorfe, CECA, clobentiazo- na, cloraniformetano, clorfenazol, clorquinox, climbazol, ciclafuramida, cipendazol, ciprofuram, decafentina, diclona, diclozolina, diclobutrazol, dimetirimol, dinocton, dinosulfon, dinoterbon, dipirithione, ditalimfos, dodicina, drazoxolon, EBP, ESBP, etaconazol, ETEM, ethirim, fenaminosulf, fenapanil, fenitropan, 5-fluorocitosina e profungicides dos mesmos, fluotrimazol, furcarbanil, furconazol, furconazol-cis, furmeciclox, furophanate, gliodina, griseofulvina, halacrinato, Hercules 3944, hexil- tiofos, ICIA0858, isopanfos, isovalediona, mebenil, mecarbinzid, meta- zoxolon, methfuroxam, metilmercúrio diciandiamide, metsulfovax, mil- nebe, anidrido mucoclórico, miclozolina, N-3,5-diclorofenil-succinimida, N-3-nitrofenilitaconimide, natamicina, N-etilmercurio-4-toluenossulfo- nanilida, níquel bis (dimetilditiocarbamato), OCH, dimetilditiocarbamato de fenilmercúrio, nitrato de fenilmercúrio, fosdifeno, picolinamida UK- 2A e seus derivados, protiocarbe; cloridrato protiocarbe, piracarbolida, piridinitril, piroxiclor, piroxifur, quinacetol; quinacetol sulfato, quinaza- mid, quinconazol, rabenzazol, salicilanilida, SSF-109, sultropeno, teco- ram, tiadifluor, ticiofeno, tiochlorfenphim, tiofanato, thioquinox, tioximi- de, triamifos, triarimol, triazbutil, trichlamide, urbacid, DRX-563 e zari- lamida, IK-1140.

[000217] Em ainda outra modalidade, um endófito que é compatível com um composto antibacteriano é usado para os métodos descritos aqui. Por exemplo, o endófito pode ser compatível com, pelo menos um dos antibióticos escolhidos do grupo que consiste em: amicacina, gentamicina, canamicina, neomicina, netilmicina, tobramicina, paro- momicina, espectinomicina, geldanamicina, herbimicina, rifaximina, estreptomicina, loracarbefe, ertapenem, doripenem, imipenem/cilasta- tina, meropenem, cefadroxil, cefazolin, cefalotin ou cefalotina, cefalexin, cefaclor, cefamandole, cefoxitina, cefprozil, cefuroxime, cefixime, cefdinir, cefditoreno, cefoperazona, cefotaxima, cefpodoxime, ceftazidime, ceftibuteno, ceftizoxima, ceftriaxona, cefepime, ceftarolina fosa- mil, ceftobiprol, teicoplanina, vancomicina, telavancina, clindamicina, lincomicina, daptomicina, azitromicina, claritromicina, diritromicina, eri- tromicina, roxithromicina, troleandomicina, telitromicina, espiramicina, aztreonam, furazolidonae, nitrofurantoin, linezolida, posizolida, radezo- lida, torezolida, amoxicilina, ampicilina, azlocilina, carbenicilina, cloxa- cilina, dicloxacilina, mezlocilina, meticilina, nafcilina, oxacilina, penicilina g, penicilina v, piperacilina, penicilina g, temocilina, ticarcilina, amo- xicilina/clavulanato, ampicilina/sulbactam, piperacilina/tazobactam, ti- carcllina/clavulanato, bacitracina, colistina, polimixina b, ciprofloxacina, enoxacina, gatifloxacina, levofloxacina, lomefloxacina, moxifloxacina, ácido nalidíxico, norfloxacina, ofloxacina, trovafloxacina, grepafloxaci- na, esparfloxacina, temafloxacina, mafenida, sulfacetamida, sulfadiazina, sulfadiazina de prata, sulfadimetoxina, sulfametizol, sulfametoxa- zol, sulfanilimida (arcaico), sulfassalazina, sulfisoxazol, sulfametoxa- zol-trimetoprim (co-trimoxazol) (TMP-SMX), sulfonamidocrisoidina (arcaico), demeclociclina, doxiciclina, minociclina, oxitetraciclina, tetraci- clina, clofazimina, dapsona, capreomicina, cicloserina, etambutol, etio- namida, isoniazida, pirazinamida, rifampicina (rifampicina nos EUA), rifabutina, rifapentina estreptomicina, arsfenamina, cloranfenicol, fos- fomicina, ácido fusídico, metronidazol, mupirocina, platensimicina, qui- nupristina/dalfopristina, tianfenicol, tigeciclina, tinidazol e trimetoprima. Endófitos fungicidas compatíveis também pode ser isolado por seleção em meio líquido. A cultura de endófitos podem ser colocadas em placas de Petri, sem quaisquer formas de mutagênese; Alternativamente, os endófitos pode sofrer mutagênese usando qualquer meio conhecido na técnica. Por exemplo, as culturas microbianas podem ser expostos a luz UV, a radiação faixa ou agentes mutagênicos químicos tais como o etilmetanossulfonato (EMS) antes da seleção em meios contendo fungicida. Finalmente, onde o mecanismo de ação de um fungicida particular é conhecida, o gene alvo pode sofrer mutação especificamente (quer por deleção do gene, do gene de substituição, a mutagê- nese dirigida ao local, etc.) para gerar um endófito que é resiliente contra esse fungicida particular. Note-se que os métodos acima descritos podem ser usados para o isolamento de fungos que são compatíveis com ambos os compostos fungistáticos e fungicidas.

[000218] Também será apreciado por um perito na técnica que uma planta pode ser exposto a vários tipos de fungicidas ou os compostos antibacterianos, simultaneamente ou em sucessão, por exemplo, em diferentes estágios de crescimento das plantas. Sempre que é susceptível de ser exposta ao fungicida múltipla e/ou agentes antibacte- rianos, um endófito que é compatível com muitos ou todos estes produtos agroquímicos e a planta alvo pode ser usada para inocular a planta. Um endófito que é compatível com vários agentes fungicidas podem ser isolados, por exemplo, por seleção de série. Um endófito que é compatível com o primeiro agente fungicida é isolado conforme descrito acima (com ou sem mutagênese antes). Uma cultura de en- dófito resultante pode então ser selecionado quanto à sua capacida- de para crescer em meios líquidos ou sólidos contendo o segundo composto antifúngico (de novo, com ou sem prévio de mutagênese). Colônias isoladas a partir da segunda seleção são então ensaiadas para confirmar a sua compatibilidade de ambos os compostos anti- fúngicos.

[000219] Da mesma forma, os endófitos bacterianos que são compatíveis com biocidas (incluindo herbicidas, tais como glifosato ou compostos antibacterianos, se bacteriostáticos ou bactericidas) que são agricolamente usados podem ser isoladas usando métodos semelhantes aos descritos para o isolamento de endófitos compatíveis fungicida. Em uma modalidade, a mutagênese da população microbiana pode ser realizado antes da seleção com um agente antibacteri- ano. Em outra modalidade, a seleção é realizada na população microbiana sem mutagênese antes. Em ainda outra modalidade, a seleção é realizada em série em um endófito: o primeiro endófito é selecionado para compatibilidade com um primeiro agente antibacteriano. O endófito compatível isolado é então cultivada e selecionada para compatibilidade com o segundo agente antibacteriano. Qualquer colônia assim isolada é testada para compatibilidade de cada um ou ambos os agentes antibacterianos para confirmar a compatibilidade com esses dois agentes.

[000220] Compatibilidade com um agente antimicrobiano pode ser determinada por um número de meios conhecidos na técnica, incluindo a comparação da concentração inibitória mínima (MIC) do endófito não modificada e modificada. Portanto, em uma modalidade, a presente invenção descreve um endófito modificado isolado derivado de um endófito isolada a partir de uma planta ou tecido das mesmas, em que o endófito é modificado de tal modo que ele apresenta pelo menos três vezes maior, por exemplo, pelo menos 5 vezes maior, pelo menos 10 vezes maior, pelo menos 20 vezes maior, pelo menos 30 vezes maior ou mais MIC a um agente antimicrobiano comparado com o endófito não modificado.

[000221] Em um aspecto particular, são descritos aqui endófitos bac- terianos com compatibilidade melhorada com o herbicida glifosato. Em uma modalidade, o endófito bacteriano tem um tempo de duplicação em meio de crescimento contendo, pelo menos 1 mM de glifosato, por exemplo, pelo menos 2 mM de glifosato, pelo menos glifosato 5 mM, pelo menos 10 mM de glifosato, pelo menos glifosato 15 mM ou mais, que existe mais do que 250%, por exemplo, não mais do que 200%, não mais do que 175%, não mais do que 150% ou não mais do que 125%, do tempo de duplicação do endófito no mesmo meio de crescimento que não contém glifosato. Em uma modalidade particular, o en- dófito bacteriano tem um tempo de duplicação em meio de crescimento contendo 5 mM de glifosato, que é não mais do que 150% do tempo de duplicação do endófito no mesmo meio de crescimento que não contém glifosato.

[000222] Em outra modalidade, o endófito bacteriano tem um tempo de duplicação em um tecido de planta contendo, pelo menos 10 ppm de glifosato, por exemplo, pelo menos 15 ppm de glifosato, pelo menos 20 ppm de glifosato, pelo menos 30 ppm de glifosato, pelo menos 40 ppm de glifosato ou mais, que é não mais do que 250%, por exemplo, não mais do que 200%, não mais do que 175%, não mais do que 150% ou não mais do que 125%, do tempo de duplicação do endófito em um tecido de referência planta contendo sem glifosato. Em uma modalidade particular, o endófito bacteriano tem um tempo de duplicação em um tecido de planta contendo 40 ppm de glifosato, que é não mais do que 150% do tempo de duplicação do endófito de uma planta de tecido de referência não contendo glifosato.

[000223] O processo de seleção descrito acima pode ser repetido para identificar isolados do endófito que são compatíveis com uma grande variedade de agentes antibacterianos ou antifúngicos.

[000224] Isolados candidatos podem ser testados para garantir que a seleção para a compatibilidade agroquímico não resultar na perda de uma bioatividade microbiano desejado. Os isolados do endófito que são compatíveis com os fungicidas normalmente empregues podem ser selecionados conforme descrito acima. O endófito compatível resultante pode ser comparado com o endófito parental sobre as plantas na sua capacidade para promover a germinação.

[000225] Os endófitos compatíveis agroquímicas gerados conforme descrito acima pode ser detectado em amostras. Por exemplo, onde um transgene foi introduzido para processar o endófito compatível com o agroquímico (s), o transgene pode ser usado como um gene alvo para a amplificação e detecção por PCR. Além disso, onde as mutações pontuais ou deleções a uma porção de um gene específico ou de um número de genes resulta na compatibilidade com o agroquímico (s), as mutações pontuais únicas pode também ser detectada por PCR ou por outros meios conhecidos na técnica. Tais métodos permitem a detecção do micróbio mesmo se ele deixa de ser viável. Assim, produtos vegetais mercadoria produzidos usando os micróbios agroquímicas compatíveis descritas aqui podem ser prontamente identificados empregando estes e outros métodos de detecção de ácido nucleico. Atributos benéficos de combinações sintéticas de sementes de cereais e endófitos originários de semente

[000226] Atributos aprimorados conferidos pelo endófito. A presente invenção considera o estabelecimento de um simbionte microbiana em uma planta. Em uma modalidade, a associação microbiana resulta em uma mudança detectável na semente ou planta. A mudança detectável pode ser uma melhora em uma série de características agronômicas (por exemplo, a melhora da saúde geral, o aumento da resposta a estresses abióticos, bióticos ou propriedades melhoradas da planta ou uma parte da planta, incluindo frutas e grãos). Alternativamente, a alteração detectável pode ser uma alteração do estado fisiológico ou biológico que pode ser medida por métodos conhecidos na técnica. As alterações detectáveis são descritas em mais detalhe nas secções que se seguem. Conforme usado aqui, um endófito é considerada ter conferido uma característica agrícola melhorada ou não a característica melhorada surgiu a partir da planta, o endófito ou a uma ação concertada entre a planta e endófito. Portanto, por exemplo, se uma hormona benéfico ou química é produzida pela planta ou endófito, para os fins da presente invenção, o endófito será considerada para ter conferido uma característica agronômica melhorado da planta hospedeira.

[000227] Em alguns aspectos, aqui proporcionados, os métodos para a produção de uma semente de uma planta com uma característica hereditariamente alteradas. A característica de que a planta pode ser alterado sem que conhecido de modificação genética no genoma da planta e compreende os seguintes passos. Em primeiro lugar, um preparado de um endófito isolada que é exógeno à semente da planta é fornecida, e, opcionalmente, processada para produzir um preparado microbiana. A preparo microbiana é então contatada com a planta. As plantas são então deixadas a ir para sementes e as sementes, as quais contêm os endófitos na e/ou na semente são coletados. As en- dófitos contidos no interior da semente de modo viável são incorporados na semente.

[000228] O método da presente invenção pode facilitar a produtividade da cultura, aumentando a germinação, o vigor e biomassa comparado com um controle não tratado. Além disso, a introdução de micro-organismos benéficos para dentro da semente, em vez de por, por exemplo, revestimento de sementes, faz com que os endófitos menos sensíveis à perturbação ambiental e mais compatíveis com revestimentos químicos de sementes (por exemplo, pesticidas e herbicidas). Usando endófitos colonizado sementes, o crescimento da planta e aumento de biomassa são estatisticamente assim por diante aos obtidos usando técnicas convencionais, por exemplo métodos de inoculação, embeber as sementes exógeno e inoculação do solo (que está mais laborioso e menos possível, em certas circunstâncias).

[000229] Saúde geral melhorada. Também descritos aqui são as plantas e os campos de plantas, que estão associados com/endófitos benéficos bacterianas e ou de fungos, de tal modo que a aptidão geral, a produtividade ou a saúde da planta ou uma porção do mesmo, é mantida, o aumento e/ou melhorados ao longo de um período de tempo. Melhora na saúde geral da planta pode ser avaliada através de vários parâmetros fisiológicos, incluindo, porém sem limitações, altura, biomassa total, raiz e/ou biomassa da parte aérea, a germinação das sementes, a sobrevivência das mudas, eficiência fotossintética, taxa de transpiração, semente de número ou massa/frutas, grão planta ou produção de frutos, teor de clorofila de folhas, taxa fotossintética, comprimento de raiz ou qualquer combinação destes. A melhora da saúde da planta ou a melhora da saúde de campo, também pode ser demonstrada através de uma melhor resistência ou resposta a um determinado estresse, seja o estresse biótica ou abiótica ou uma combinação de um ou mais estresses abióticos, como aqui fornecidas.

[000230] Outros estresses abióticos. São descritas aqui plantas associado com endófitos com o aumento na resistência a um estresse abiótico. Estresse abiótico exemplificativos incluem, mas não estão limitados a:

[000231] Tolerância à estiagem e calor. Em alguns casos, uma planta resultante de sementes contendo o endófito pode exibem uma alteração fisiológica, tais como uma diminuição da mudança de atividade fotossintética (expressos, por exemplo, como ΔFv/Fm) após a exposição ao calor condições de choque ou seca, comparado com um cor- respondente controle, planta geneticamente idênticas que não contém os endófitos cultivadas nas mesmas condições. Em alguns casos, a planta associada ao endófito, conforme descrito aqui pode exibir um aumento de mudança de atividade fotossintética ΔFv (ΔFv/Fm) após a choque de calor ou tratamento de estresse de seca, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 dias ou mais após o tratamento de choque de calor ou estresse hídrico ou até que a fotossíntese cessa, comparado com a planta do estágio de desenvolvimento semelhante de controle correspondente, mas não contendo os endófitos. Por exemplo, uma planta tendo um endófito capaz de conferir calor e/ou tolerância à estiagem pode apresentar uma ΔFv/Fm de cerca de 0,1 a cerca de 0,8, após exposição a choque de calor ou de estresse de seca ou um intervalo ΔFv/Fm de cerca de 0,03 a cerca de 0,8 sob um dia ou 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou mais de 7 dias após o choque térmico ou tratamento estresse hídrico ou até que a fotossíntese cessa. Em algumas modalidades, as reduções induzidas pelo estresse em atividade fotossintética pode ser reduzida em pelo menos cerca de 0,25% (por exemplo, pelo menos cerca de 0,5%, pelo menos cerca de 1%, pelo menos cerca de 2%, pelo menos cerca de 3, pelo menos cerca de 5%, pelo menos cerca de 8%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 99% ou, pelo menos 100%) como comparado à diminuição da atividade fotossintética da planta uma referência agrícola correspondente seguinte condições de choque térmico. Signi- ficância da diferença entre as plantas agrícolas associada à endofíti- cos e de referência pode ser estabelecida em cima de demonstrar sig- nificância estatística, por exemplo p <0,05 com um paramétrico ade- quado ou estatística não paramétrica, por exemplo, o teste do qui- quadrado, t de Student, Mann teste -Whitney ou F-teste com base na suposição ou fatos que a planta associada o endófito e referência planta agrícola têm genomas idênticas ou próximos conhecida.

[000232] Em algumas modalidades, as plantas contêm endófitos capaz de conferir nova calor e/ou tolerância à estiagem em quantidade suficiente, de tal modo que o aumento do crescimento, sob condições de calor ou a seca e observado. Por exemplo, uma população de calor e/ou tolerância à estiagem endófito descrito aqui pode estar presente em quantidade suficiente de uma planta, o que resulta em um aumento do crescimento, comparado com uma planta que não contém o endófi- to, quando cultivada sob condições secas ou condições de choque de calor ou na sequência de tais condições. O crescimento pode ser avaliado com parâmetros fisiológicos, incluindo, porém sem limitações, altura, biomassa total, raiz e/ou biomassa da parte aérea, a germinação das sementes, a sobrevivência das mudas, eficiência fotossintéti- ca, taxa de transpiração, semente de número ou massa/fruta, planta grãos ou produção de frutos, teor de clorofila de folhas, taxa fotossinté- tica, comprimento de raiz ou qualquer combinação destes.

[000233] Em alguns casos, uma planta resultante a partir de sementes que contêm um endófito que inclui um livro de calor e/ou população endófito tolerância à estiagem descrito aqui apresenta uma diferença no parâmetro fisiológico que é pelo menos cerca de 5% maior, por exemplo pelo menos cerca de 5%, pelo menos cerca de 8%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90% ou pelo menos 100%, pelo menos cerca de 200%, pelo menos cerca de 300%, pelo menos cerca de 400% ou maior do que uma planta agrícola referência cultivadas sob condições semelhantes.

[000234] Em várias modalidades, os endófitos introduzidos na microbiota semente alterada pode conferir na tolerância resultante usinas térmicas, a tolerância a herbicida, resistência à seca, resistência a insetos, a resistência do fungo, a resistência ao vírus, a resistência das bactérias, a esterilidade masculina, tolerância ao frio, tolerância ao sal, aumento da produtividade, maior eficiência no uso de nutrientes, aumento da eficiência no uso de nitrogênio, aumento do teor de proteínas, aumento do teor de carboidrato fermentável, reduzido teor de lig- nina, maior teor de antioxidantes, o aumento da eficiência de uso da água, maior vigor, o aumento da eficiência de germinação, mais cedo ou aumento da floração, o aumento da biomassa, raiz- alterada biomassa, maior retenção de água do solo ou uma combinação destes. Uma diferença entre a planta associada ao endófito e uma planta agrícola de referência pode também ser medido usando outros métodos conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Haake et al. (2002) Plant Physiol. 130: 639-648)

[000235] Estresse por sal. Em outras modalidades, os endófitos capaz de conferir uma aumento na tolerância ao estresse salinidade pode ser introduzido em plantas. As plantas resultantes contendo os en- dófitos podem apresentar maior resistência ao estresse por sal, se medido em termos de sobrevivência sob condições de salinidade ou o crescimento global durante ou após estresse por sal. Os parâmetros fisiológicos da saúde da planta exposto acima, incluindo a altura, a biomassa total, raiz e/ou biomassa da parte aérea, a germinação das sementes, mudas sobrevivência, eficiência fotossintética, taxa de transpiração, semente/número de frutos ou de massa, planta grãos ou produção de frutos, teor de clorofila folha, taxa fotossintética, comprimento de raiz ou qualquer combinação dos mesmos, pode ser usado para medir o crescimento e comparados com a taxa de crescimento de plantas agrícolas de referência (por exemplo, plantas isogênicas sem os endófitos) cultivadas sob condições idênticas. Em alguns casos, uma planta resultante a partir de sementes que contêm um endófito capaz de conferir tolerância ao sal descrito aqui apresenta uma diferença no parâmetro fisiológico que é pelo menos cerca de 5% maior, por exemplo pelo menos cerca de 5%, pelo menos cerca de 8%, em menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90% ou pelo menos 100%, pelo menos cerca de 200%, pelo menos cerca de 300%, pelo menos cerca de 400% ou maior do que uma referência agrícola planta cultivada sob a mesma concentração de sódio no solo.

[000236] Em outros casos, as plantas associado com endófitos e referência plantas agrícolas podem ser cultivadas no solo ou crescimento meio contendo diferentes concentrações de sódio para determinar a concentração inibidora de sódio (expressa, por exemplo, como a concentração em que o crescimento da planta é inibido pela 50%, quando comparado com plantas cultivadas em nenhum estresse de sódio). Portanto, em outra modalidade, uma planta resultante a partir de sementes que contêm um endófito capaz de conferir tolerância ao sal descrito aqui apresenta um aumento na concentração de sódio inibido- ra de, pelo menos 10 mm, por exemplo pelo menos 15 mm, pelo menos 20 mm, pelo menos 30 mM, pelo menos 40 mM, 50 mM, pelo menos pelo menos 60 mm, 70 mm, pelo menos pelo menos 80 mM, 90 mM, pelo menos pelo menos 100 mM ou mais, quando comparado com os de referência plantas agrícolas.

[000237] Alto teor de metal. As plantas são organismos sésseis e, portanto, têm que lidar com o ambiente em que eles são colocados. Enquanto as plantas se adaptaram muitos mecanismos para lidar com produtos químicos e substâncias que podem ser prejudiciais à sua saúde, metais pesados representam uma classe de toxinas que são altamente relevantes para o crescimento das plantas e da agricultura. As plantas usam uma série de mecanismos para lidar com níveis tóxicos de metais pesados (por exemplo, níquel, cádmio, chumbo, mercúrio, arsênio ou alumínio) no solo, incluindo a excreção e sequestro interno. Para fins agrícolas, é importante dispor de plantas que são capazes de tolerar as condições de outro modo hostis, por exemplo, os solos que contêm níveis elevados de metais pesados tóxicos. Endófitos que são capazes de conferir uma aumento na tolerância a metais pesados podem fazê-lo através do reforço sequestro do metal em certos compartimentos. O uso de tais endófitos em uma planta permitiria o desenvolvimento de novas combinações planta com endófitos para fins de recuperação do meio ambiente (também conhecido como fitorremediação). Portanto, em uma modalidade, a planta contendo o endófito capaz de conferir tolerância a metais aumentou exibe uma diferença de um parâmetro fisiológico que é pelo menos cerca de 5% maior, por exemplo pelo menos cerca de 5%, pelo menos cerca de 8%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90% ou pelo menos 100%, pelo menos cerca de 200%, pelo menos cerca de 300%, pelo menos cerca de 400% ou maior do que uma planta agrícola referência crescido sob a mesma concentração de metais pesados no solo.

[000238] Alternativamente, a concentração inibidora de o metal pe- sado pode ser determinada para a planta associada ao endófito e comparado com uma planta de referência agrícola sob as mesmas condições. Portanto, em uma modalidade, as plantas resultantes de sementes que contêm um endófito capaz de conferir tolerância a metais pesados descritos aqui exibem um aumento na concentração de sódio inibidora de, pelo menos 0,1 mM, por exemplo, pelo menos 0,3 mM, pelo menos 0,5 mM, pelo menos 1 mM, pelo menos 2 mm, pelo menos 5 mm, pelo menos 10 mm, pelo menos 15 mm, pelo menos 20 mM, 30 mM, pelo menos pelo menos 50 mm ou mais, quando comparado com os de referência plantas agrícolas.

[000239] Finalmente, as plantas inoculadas com endófitos que são capazes de conferir tolerância a metais aumentou exibe um aumento na acumulação de metal geral em pelo menos 10%, por exemplo pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 75%, pelo menos 100%, pelo menos 150%, pelo menos 200% ou mais, pelo menos 300%, quando comparado com plantas não inoculadas cultivadas sob as mesmas condições.

[000240] Estresse por baixo teor de nutrientes. Os endófitos descritas aqui podem também conferir à planta de um aumento da capacidade de crescer sob condições limitantes de nutrientes, por exemplo através da solubilização ou outra forma de disponibilizar para os ma- cronutrientes plantas ou micronutrientes que são complexados, insolúvel ou de outra forma em uma forma indisponíveis. Em uma modalidade, uma planta é inoculada com um endófito que confere capacidade aumentada para libertar e/ou fornecer de outro modo para a planta com nutrientes selecionados do grupo que consiste em fosfato, nitrogênio, potássio, ferro, manganês, cálcio, molibdénio, vitaminas ou outros micronutrientes. Essa planta pode apresentar aumento do crescimento no solo contendo limitantes quantidades de tais nutrientes, quando comparado com referência planta agrícola. As diferenças entre a planta associada ao endófito e referência planta agrícola pode ser medida através da comparação da biomassa dos dois tipos de plantas crescidas sob condições limitantes de ou através da medição dos parâmetros físicos descritos acima. Portanto, em uma modalidade, a planta contendo o endófito capaz de conferir uma aumento na tolerância ao nutriente condições limitantes exibe uma diferença de um parâmetro fisiológico que é pelo menos cerca de 5% maior, por exemplo pelo menos cerca de 5%, pelo menos cerca de 8%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90% ou pelo menos 100%, pelo menos cerca de 200%, pelo menos cerca de 300%, pelo menos cerca de 400% ou maior do que uma referência planta agrícola cultivadas sob a mesma concentração de metais pesados no solo.

[000241] Estresse pelo frio. Em alguns casos, os endófitos pode conferir à planta a capacidade de tolerar o estresse frio. Existem muitos métodos conhecidos para a medição da tolerância de uma planta ao estresse frio (tal como revisto, por exemplo, em Thomashow (2001) Plant Physiol 125:. 89-93 e Gilmour et al. (2000) Plant Physiol 124: 1854- 1865, ambas as quais são aqui incorporadas por referência na íntegra). Conforme usado aqui, o estresse frio se refere tanto ao estresse induzido pelo frio (0°C - 15oC) e congelamento (<0°C). Algumas cultivares de plantas agrícolas podem ser particularmente sensíveis ao estresse pelo frio, mas características de tolerância a frio pode ser multigênico, tornando o processo de criação difícil. Endófitos capaz de conferir tolerância ao frio, potencialmente, reduzir os danos sofridos pelos agricultores em uma base anual. Resposta melhorada ao estres- se de frio pode ser determinado pela sobrevivência das plantas, a quantidade de necrose de partes da planta ou uma mudança na perda de rendimento da cultura, bem como os parâmetros fisiológicos usados em outros exemplos. Portanto, em uma modalidade, a planta contendo o endófito capaz de conferir tolerância ao frio aumentou exibe uma diferença de um parâmetro fisiológico que é pelo menos cerca de 5% maior, por exemplo pelo menos cerca de 5%, pelo menos cerca de 8%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90% ou pelo menos 100%, pelo menos cerca de 200%, pelo menos cerca de 300%, pelo menos cerca de 400% ou maior do que uma planta agrícola referência crescido sob as mesmas condições de estresse frio.

[000242] Estresse biótico. Em outras modalidades, o endófito bacte- riano protege a planta a partir de um estresse biótico, por exemplo, a infestação de insetos, infestação de nematoides, infecção bacteriana, infecção fúngica, infecção oomiceto, infecção protozoária, infecção virai e herbívoros pastoreio ou uma combinação dos mesmos.

[000243] Insetos herbívoros. Há uma abundância de espécies de pragas de insetos que infestam ou infectam uma grande variedade de plantas. Infestação por parasitas pode levar a danos significativos. Pragas de insetos que infestam espécies vegetais são particularmente problemáticas na agricultura como eles podem causar sérios danos às culturas e reduzir significativamente os rendimentos das plantas. Uma ampla variedade de diferentes tipos de plantas são susceptíveis à infestação das pragas, incluindo as culturas comerciais tais como algodão, soja, trigo, cevada e milho.

[000244] Em alguns casos, os endófitos descritos aqui podem confe- rir à planta hospedeira a capacidade de repelir insetos herbívoros. Em outros casos, os endófitos podem causar ou induzir a produção na fábrica de, compostos que são repelente inseticida ou inseto. O inseto pode ser qualquer um dos insetos patogênicos comuns que afetam as plantas, particularmente plantas agrícolas. Exemplos incluem, mas não estão limitados a: Leptinotarsa spp. (por exemplo, L. decemlineata (escaravelho da batateira), L. juncta (falso besouro de batata) ou L. texana (besouro de batata falso)); Nilaparvata spp. (por exemplo, N. lugens (gafanhoto castanho)); Laode/phax spp. (por exemplo, L. stria- tellus (pequeno gafanhoto castanho)); Nephotettix spp. (por exemplo, N. virescens ou N. cincticeps (cigarrinha verde) ou N. nigropictus (ci- garrinha arroz)); Sogatella spp. (por exemplo, S. furcifera (gafanhoto branco)); Chilo spp. (por exemplo, C. suppressalis (arroz caule listrado broca), C. auricilius (haste da broca-franja ouro) ou C. polychrysus (com cabeça de broca do caule escuro)); Sesamia spp. (por exemplo, S. inferens (broca do arroz-de-rosa)); Tryporyza spp. (por exemplo, T. innotata (broca do arroz branco) ou T. incertulas (broca arroz amarelo)); Anthonomus spp. (por exemplo, A. grandis (bicudo)); Phaedon spp. (por exemplo, P. cochleariae (mostarda folha besouro)); Epi- lachna spp. (por exemplo, E. varivetis (besouro de feijão mexicano)); Tribolium spp. (por exemplo, T. castaneum (besouro chão vermelho)); Diabrotica spp. (por exemplo, D. virgifera (larva de besouro ocidental), D. Barberi (larva de besouro do norte), D. undecimpunctata howardi (larva de besouro sul), D. virgifera zeae (larva de besouro mexicano);. Ostrinia spp (por exemplo, O. nubilalis (broca europeia do milho)); Anaphothrips spp. (por exemplo, A. obscrurus (tripes grama)); Pecti- nophora spp. (por exemplo, P. gossypiella (lagarta-rosada)); Heliothis spp. (por exemplo, H. virescens (lagarta do tabaco) );. Trialeurodes spp. (por exemplo, T. abutiloneus (mosca-branca com faixas de asas) T. vaporariorum (mosca-branca)); Bemisia spp (por exemplo, B. argen- tifolii (mosca-branca)); Aphis spp (por exemplo, A. gossypii (pulgão do algodoeiro)); Lygus spp (por exemplo, L. lineolaris (mancha da planta) ou L. hesperus (ocidental manchada de planta)); Euschistus spp. (por exemplo, E. conspersus (percevejo consperso)); Chlorochroa spp. (por exemplo, C. sayi ); Nezara spp. (por exemplo, N. viridula (percevejo verde sul)); Thrips spp. (por exemplo, T. tabaci (tripes de cebola)); Fran- kliniella spp. (por exemplo, F. fusca (tripes do tabaco) ou F. occidentalis (tripes flor ocidental)); Acheta spp. (por exemplo, A. domesticus (grilo casa)); Myzus spp. (por exemplo, M. persicae (pulgão-verde)); Macrosiphum spp. (por exemplo, M. euphorbiae (piolho da batateira)); Blissus spp. (por exemplo, B. leucopterus (percevejo)); Acrosternum spp. (por exemplo, A. hilare (percevejo verde)); Chilotraea spp. (por exemplo, C. polychrysa (arroz haste broca)); Lissorhoptrus spp. (por exemplo, L. oryzophilus (gorgulho do arroz aquático)); Rhopalosiphum spp. (por exemplo, R. maidis (pulgão da folha do milho)); e Anuraphis spp. (por exemplo, A. maidiradicis (pulgão da raiz do milho)).

[000245] A planta associada ao endófito pode ser testado quanto à sua capacidade para resistir ou de outra forma repelir, insetos patogênicos através da medição, por exemplo, biomassa total da planta, a biomassa do fruto ou grão, percentagem de folhas intactas ou outros parâmetros fisiológicos descritos aqui e comparando com uma planta agrícola de referência. Em uma modalidade, a planta associada ao endófito exibe, pelo menos 5% maior biomassa, por exemplo, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 75%, pelo menos 100% ou mais da biomassa, que a planta agrícola referência cultivadas sob as mesmas condições (por exemplo, cultivadas lado-a-lado ou adjacente a, as plantas associado com endófitos). Em outras modalidades, a planta associada ao endófito exibe, pelo menos 5% maior do fruto ou de grãos, por exemplo, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo me- nos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 75%, pelo menos 100% ou mais de frutos ou de grãos de rendimento, do que a planta agrícola referência cultivadas sob as mesmas condições (por exemplo, cultivadas lado-a-lado ou adjacente a, as plantas associado com endófitos).

[000246] Nematoides. Nematoides são vermes microscópicos que se alimentam das raízes, fluidos, folhas e caules de mais de 2.000 plantações em fileiras, legumes, frutas e plantas ornamentais, causando um número estimado de $ 100.000.000.000 perda da colheita em todo o mundo e responsável por 13% das perdas de colheitas globais devido à doença. Uma variedade de espécies de nematoides parasitas infectam plantas de cultivo, incluindo nematoides das galhas (RKN), cisto e nematoides formadores de lesões. Nematoide das galhas, que são caracterizadas por causando a formação da vesícula de raízes em locais de alimentação, têm uma faixa de hospedeiros relativamente amplo e, portanto, são parasitas de um grande número de espécies de culturas. As espécies de nematoides e formação de lesão tem uma faixa de hospedeiros mais limitado, mas ainda causar perdas consideráveis de culturas suscetíveis.

[000247] Sinais de danos por nematoide incluem nanismo e amare- lecimento das folhas e murcha das plantas durante os períodos quentes. Infestação de nematoides, no entanto, podem causar perdas de rendimento significativas, sem quaisquer sintomas de doença acima do solo óbvias. As principais causas de redução da produção são devido a danos raiz subterrânea. Raízes infectadas pelo SCN são anão ou atrofiado. Infestação de nematoide também podem diminuir o número de nódulos fixadores de nitrogênio nas raízes e pode tornar as raízes mais suscetíveis a ataques de outros nematoides das plantas com origem no solo.

[000248] Em uma modalidade, a planta associada ao endófito tem um aumento na resistência a um nematoide, quando comparado com uma planta agrícola referência. Como antes com herbívoros insetos, biomassa da planta ou uma porção da planta ou qualquer um dos outros parâmetros fisiológicos mencionados noutro local, pode ser comparado com a planta agrícola referência cultivadas sob as mesmas condições. Medições particularmente úteis incluem biomassa vegetal total, biomassa e/ou tamanho dos frutos ou grãos e biomassa da raiz. Em uma modalidade, a planta associada ao endófito exibe, pelo menos 5% maior biomassa, por exemplo, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 75%, pelo menos 100% ou mais da biomassa, que a planta agrícola referência cultivadas sob as mesmas condições (por exemplo, cultivadas lado-a-lado ou adjacente a, as plantas associado com endófitos, sob condições de desafio de nematoides). Em outra modalidade, a planta associada ao endófito exibe, pelo menos 5% maior biomassa da raiz, por exemplo, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 75%, pelo menos 100% ou mais biomassa da raiz, do que a planta agrícola referência cultivadas sob as mesmas condições (por exemplo, cultivadas lado-a-lado ou adjacente a, as plantas associado com endófitos, sob condições de desafio nematoi- de). Em ainda outra modalidade, a planta associada ao endófito exibe, pelo menos 5% maior do fruto ou de grãos, por exemplo, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 75%, pelo menos 100% ou mais de frutos ou de grãos de rendimento, do que a planta agrícola referência cultivadas sob as mesmas condições (por exemplo, cultivadas lado-a-lado ou adjacente a, as plantas associado com endófitos, sob condições de desafio nematoide).

[000249] Fungos patogênicos. Doenças fúngicas são responsáveis por perdas anuais de mais de US $ 10 bilhões em colheitas agrícolas em os EUA, representam 42% das perdas de colheitas globais devido à doença e são causadas por uma grande variedade de diversidade biológica patógenos. Diferentes estratégias têm sido tradicionalmente usada para controlá-los. Características de resistência foram criados em variedades agricolamente importantes, proporcionando, assim, vários níveis de resistência contra um intervalo estreito de patógenos isolados ou raças ou contra uma faixa mais ampla. No entanto, isso envolve o processo longo e trabalhoso de introdução de características desejáveis em linhas comerciais por cruzamentos genéticos e, devido ao risco de pragas evoluem para superar a resistência natural da planta, um esforço constante para produzir novas características de resistência em linhas comerciais é necessária. Alternativamente, as doenças fúngicas têm sido controladas através da aplicação de fungicidas químicos. Esta estratégia resulta geralmente no controle eficiente, mas também está associada com o desenvolvimento possível de patóge- nos resistentes e podem ser associados com um impacto negativo sobre o ambiente. Além disso, em certas culturas, tais como trigo e cevada, o controle de patógenos fúngicos por fungicidas químicos é difícil ou pouco prático.

[000250] A presente invenção considera o uso de endófitos que são capazes de conferir resistência a fungos patogênicos para a planta hospedeira. O aumento na resistência à inoculação fúngica pode ser medido, por exemplo, usando qualquer dos parâmetros fisiológicos apresentados acima, por comparação com plantas agrícolas de referência. Em uma modalidade, a planta associada ao endófito exibe, pelo menos 5% maior biomassa, por exemplo, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 75%, pelo menos 100% ou mais da biomassa, que a planta agrícola referência cultivadas sob as mesmas condições (por exemplo, cultivadas lado-a-lado ou adjacente a, as plantas associado com endófitos, infectados com o fungo patogênico). Em ainda outra modalidade, a planta associada ao endófito exibe, pelo menos 5% maior do fruto ou de grãos, por exemplo, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 75%, pelo menos 100% ou mais de frutos ou de grãos de rendimento, do que a planta agrícola referência cultivadas sob as mesmas condições (por exemplo, cultivadas lado-a-lado ou adjacente a, as plantas associado com endófitos, infectados com o fungo patogênico). Em outra modalidade, a planta associada ao endófito exibe pelo menos uma redução de 5% de crescimento de hifas, por exemplo, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 75%, pelo menos uma redução de 90% ou mais, no crescimento de hifas, do que a planta agrícola referência cultivadas sob as mesmas condições (por exemplo, cultivadas lado-alado ou adjacente a, as plantas associado com endófitos, infectados com o fungo patogênico).

[000251] Patógenos virais. Vírus de plantas se estima representarem cerca de 18% das perdas de colheitas globais devido à doença. Existem inúmeros exemplos de patógenos virais que afetam a produtividade agrícola. Exemplos incluem o vírus americana mosaico estriado do trigo (AWSMV) (trigo estriado mosaico), Cevada vírus listra mosaico (BSMV), vírus do nanismo amarelo de cevada (BYDV), vírus mosaico Brome (BMV), vírus clorótico do cereal (CCMV), vírus clorótico dos veios de milho (CCVBV), vírus do mosaico do milho brasileiro, milho necrose letal complexo de vírus clorótico do milho, (MCMV), Milho vírus anão mosaico (MDMV), A ou B trigo vírus da risca do mosaico (WSMV), vírus mosaico do pepino ( CMV), Cynodon vírus da risca (CCSV), vírus mosaico de milho (JGMV), vírus de enfezamento (MLO), vírus clorótico do milho anão (MCDV), vírus clorótico do milho (MCMV), Milho vírus anão mosaico (MDMV), cepas A, D e F, milho vírus folha (MLFV), vírus da linha de milho (MLV), milho em mosaico (folha listra milho, vírus milho mosaico (MMV), nanismo rajado) e vírus conluio clorótico, milho vírus da mancha anelar transparente (MPRV), vírus rajado do milho (MRGV), milho fino rajado (distribuição fina) do vírus (MRFV), milho vírus listra vermelha (MRSV), milho vírus anel mosqueado (MRMV), Milho vírus Rio Cuarto (MRCV), Milho vírus anão bruto (MRDV), Cereal perfilhamento vírus da doença, Milho vírus conluio estéril, cevada vírus estriado amarelo, vírus da listra do milho (MSV), Milho vírus listra, Milho vírus, vírus do nanismo de milho; Milho borla vírus aborto (MTAV), milho vírus veia (MVEV), milho vírus orelha (MWEV), milho vírus da folha branca, vírus mosaico do milho branco (MWLMV), vírus folha vermelha de painço (MRLV), cereais Norte vírus do mosaico (NCMV), o vírus da aveia, (zakukliva- nie), aveia vírus anão estéril (OSDV), Arroz vírus anão preto com mechas (RBSDV), Arroz vírus listra (RSV), vírus mosaico do sorgo (SrMV), vírus mosaico da cana de açúcar (SCMV) linhagens H, 1 e M, o vírus da doença Fiji de cana de açúcar (FDV), vírus mosaico de cana de açúcar (SCMV) cepas A, B, D, E, SC, BC, Sabi e MB (anteriormente MDMV-B) e vírus mosaico do trigo ( WSMV). Em uma modalidade, a planta associada ao endófito proporciona proteção contra patógenos virais de tal modo que existe, pelo menos 5% maior biomassa, por exemplo, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 75%, pelo menos 100% ou mais da biomassa, que a planta agrícola referência cultivadas sob as mesmas condições. Em ainda outra modalidade, a planta associada ao endófito exibe, pelo menos 5% maior do fruto ou de grãos, por exemplo, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 75%, pelo menos 100% ou mais frutos ou grãos rendimento quando desafiados com um vírus, que a planta agrícola referência cultivadas sob as mesmas condições. Em ainda uma outra modalidade, a planta associada ao endófito exibe título viral, pelo menos 5% inferior, por exemplo, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 75%, título virai pelo menos 100% mais baixa quando desafiados com um vírus, que a planta agrícola referência cultivadas sob as mesmas condições.

[000252] Patógenos Bacterianos. Da mesma forma, patógenos bac- terianos são um problema significativo que afeta negativamente a produtividade agrícola e respondendo por 27% das perdas de colheitas globais devido a doenças de plantas. Em uma modalidade, a planta associada ao endófito descrito aqui fornece proteção contra patógenos bacterianos tais que existe, pelo menos 5% maior biomassa, por exemplo, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 75%, pelo menos 100% ou mais da biomassa, que a planta agrícola referência cultivadas sob as mesmas condições. Em ainda outra modalidade, a planta associada ao endófito exibe, pelo menos 5% maior do fruto ou de grãos, por exemplo, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 75%, pelo menos 100% ou mais frutos ou grãos rendimento quando desafiados com um patógeno bacteriano, do que a planta agrícola referência cultivadas sob as mesmas condições. Em ainda uma outra modalidade, a planta associada ao endófi- to exibe contagem de, pelo menos 5% inferior bacteriana, por exemplo, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 75%, contagem de bactérias, pelo menos 100% menor quando desafiado com uma bactéria, do que a planta agrícola referência cultivadas sob as mesmas condições.

[000253] Melhora de outros traços. Em outras modalidades, o inoculado endófito pode conferir outras características benéficas para a planta. Características melhoradas podem incluir um conteúdo nutricional melhorada da planta ou parte da planta usada para consumo humano. Em uma modalidade, a planta associada ao endófito é capaz de produzir uma alteração detectável no teor de pelo menos um nutriente. Exemplos de tais nutrientes incluem aminoácidos, proteínas, óleos (incluindo qualquer um de ácido oleico, ácido linoleico, ácido alfa-linolênico, ácidos gordos saturados, ácido palmítico, ácido esteárico e ácidos gordos trans), hidratos de carbono (incluindo açúcares tais como sacarose, glicose e frutose, amido ou fibra dietética), vitamina A, Tiamina (Vit. B1), riboflavina (vit. B2), nia- cina (Vit. B3), ácido pantotênico (B5), vitamina B6, folato (Vit. B9), A colina, vitamina C, vitamina E, vitamina K, cálcio, ferro, magnésio, manganês, fósforo, potássio, sódio, zinco. Em uma modalidade, a planta ou parte associada-endófito mesma contém, pelo menos 10% mais nutrientes, por exemplo, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 100%, pelo menos 150%, pelo menos 200% ou mais, pelo menos 300%, dos nutrientes quando comparado com os de referência plantas agrícolas.

[000254] Em outros casos, a característica melhorada pode incluir conteúdo reduzido de uma substância prejudicial ou indesejável quando comparado com plantas agrícolas de referência. Tais compostos incluem aqueles que são prejudiciais, quando ingeridos em grandes quantidades ou de sabor amargo são (por exemplo, ácido oxálico, amigdalina, tais como certos alcaloides cafeína, nicotina, quinina e morfina, taninos, cianeto). Como tal, em uma modalidade, a planta ou parte associada-endófito mesma contém, pelo menos 10% menos da substância indesejável, por exemplo, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% menos da substância indesejável quando comparado com plantas agrícolas referência. Em uma concretização relacionada, a característica melhorada pode incluir sabor melhorado da planta ou parte da planta, incluindo a de frutos ou sementes. Em uma concretização relacionada, a característica melhorada pode incluir a redução de compostos indesejáveis produzidas por outros endófitos em plantas, tais como a degradação de Fusarium desoxinivalenol produzido (também conhecido como vomi- toxina e um fator de virulência envolvido na Fusarium cabeça praga do milho e do trigo) em uma parte da planta, incluindo a de frutos ou sementes.

[000255] Em outros casos, o traço pode ser melhorada um aumento da biomassa total da planta ou uma parte da planta, incluindo a sua frutos ou sementes.

[000256] A planta associada ao endófito também pode ter um estado hormonal alterado ou níveis alterados de produção de hormônio quando comparada com uma planta agrícola de referência. Uma alteração no status hormonal pode afetar muitos parâmetros fisiológicos, incluindo a época de floração, a eficiência da água, a dominância apical e/ou filmagem de lateral ramificação, aumento na raiz do cabelo e alteração na maturação dos frutos.

[000257] A associação entre o endófito e a planta também pode ser detectada através de outros métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, os bioquímicos, metabolômica, proteômica, genômica, epi- genômicos e/ou perfis de transcrição de plantas associado com endófi- tos podem ser comparadas com as plantas agrícolas de referência nas mesmas condições.

[000258] Diferenças metabolômicas entre as plantas podem ser detectados usando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, uma amostra biológica (tecido inteiro, o exsudado, seiva floema, xilema, exsudato de raiz, etc.) a partir das plantas agrícolas e associada com endófitos de referência pode ser analisada essencialmente conforme descrito no Fiehn et al., (2000) Nature Biotechnol., 18, 1157-1161 ou Roessner et al., (2001) Plant Cell, 13, 11-29. Tais métodos metabolô- micos podem ser usados para detectar diferenças de níveis de hormona, nutrientes, metabólitos secundários, exsudatos de raízes, seiva floema conteúdo, teor de seiva, teor de metais pesados e assim por diante. Tais métodos são também úteis para a detecção de alterações no teor microbiano e status; Por exemplo, a presença e os níveis de fungos moléculas sinalizadoras bacterianas/(por exemplo, autoinduto- res e ferôrmonios), que podem indicar o estado do comportamento à base de grupo de endófitos com base em, por exemplo, a densidade de população (ver, por exemplo Daniels et al. (2006) PNAS 103: 14965-14970 Eberhard et al., (1981) Biochemistry 20 (9): 2444-2449). Análise do transcriptoma (revisto, por exemplo, em Usadel & Fernie, (2013). Frontal Plant Sci. 4: 48) de plantas agrícolas associada com endófitos e de referência também pode ser realizado para detectar alterações na expressão de pelo menos um transcrito ou um definir ou rede de genes mediante associação endófito. Do mesmo modo, as alterações epigenética pode ser detectada usando DNA metilado imu- noprecipitação seguido de sequenciamento de alto rendimento (Vining et al., (2013) Planta BMC Biol. 13:92). Combinações de micróbios endofíticos

[000259] As combinações de micróbios endofíticos tais como endófi- tos bacterianos originários de semente podem ser selecionadas por qualquer um ou mais de vários critérios. Em uma modalidade, as populações endofíticas compatíveis são selecionados. Conforme usado aqui, se refere a compatibilidade populações microbianas que não interferem significativamente com o crescimento e propagação do outro. Populações microbianas incompatíveis podem surgir, por exemplo, onde uma das populações ou segredos produz um composto que é tóxico ou prejudicial para o crescimento da população outro (s). A incompatibilidade resultante da produção de compostos deleté- rios/agentes podem ser detectadas usando métodos conhecidos na técnica e conforme descrito aqui noutro local. Da mesma forma, as populações distintas podem competir por recursos limitados de uma forma que torna coexistência difícil.

[000260] Em outra modalidade, as combinações são selecionadas em função dos compostos produzidos por cada população. Por exemplo, a primeira população é capaz de sideroforos de produção e uma outra população é capaz de produzir compostos antifúngicos. Em uma modalidade, a primeira população de endófitos bacterianos é capaz de uma função selecionada do grupo que consiste de produção de auxina, fixação de nitrogênio, produção de um composto antimicrobiano, produção de sideroforos, solubilização de fosfato mineral, a produção de celulase, produção quitinase, produção de xilanase e produção de acetoína. Em outra modalidade, a segunda população de endófitos bacterianos é capaz de uma função selecionada do grupo que consiste de produção de auxina, fixação de nitrogênio, produção de um composto antimicrobia- no, produção de sideroforos, solubilização de fosfato mineral, a produção de celulase, produção quitinase, produção de xilanase e produção de acetoína. Em ainda outra modalidade, as primeira e segunda populações são capazes de pelo menos uma função diferente.

[000261] Em ainda outra modalidade, as combinações são selecionados que exibem localização distinta na planta após a colonização. Por exemplo, a primeira população pode colonizar e, em alguns casos colonizar preferencialmente, o tecido da raiz, enquanto que uma se- gunda população pode ser selecionada com base na sua colonização preferencial das partes aéreas da planta agrícola. Portanto, em uma modalidade, a primeira população é capaz de colonizar um ou mais dos tecidos selecionados do grupo que consiste de uma raiz, caule, folha, flor e sementes. Em outra modalidade, a segunda população é capaz de colonizar um ou mais tecidos selecionados de entre o grupo que consiste de raiz, caule, folha, flor e sementes. Em ainda outra modalidade, as primeira e segunda populações são capazes de colonizar tecido diferente dentro de uma gramínea agrícola.

[000262] Em ainda outra modalidade, as combinações de endófitos são selecionados que conferem um ou mais distintas características de saúde sobre a planta agrícola inoculada, quer individualmente ou em associação sinérgica com outros endófitos. Alternativamente, dois ou mais endófitos induzir a colonização de um terceiro endófito. Por exemplo, a primeira população é selecionado com base que confere aumento significativo na biomassa, enquanto a segunda população promove o aumento na tolerância à estiagem na planta agrícola inoculada. Portanto, em uma modalidade, a primeira população é capaz de conferir pelo menos uma característica selecionada do grupo que consiste de tolerância térmica, tolerância a herbicidas, resistência à seca, resistência a insetos, resistência a fungos, resistência a vírus, resistência a bactérias, a esterilidade masculina, a tolerância ao frio, tolerância ao sal, aumento da produtividade, o aumento da eficiência de uso de nutrientes, aumento da eficiência no uso de nitrogênio, aumento do teor de carboidrato fermentável, reduzido teor de lignina, maior teor de antioxidantes, o aumento da eficiência de uso da água, maior vigor, o aumento da eficiência de germinação, mais cedo ou aumento da floração, o aumento da biomassa, alteradas relação raiz-parte aérea biomassa, maior retenção de água do solo ou uma combinação destes. Em outra modalidade, a segunda população é capaz de confe- rir uma característica selecionada do grupo que consiste de tolerância térmica, tolerância a herbicidas, resistência à seca, resistência a insetos, resistência a fungos, resistência a vírus, resistência a bactérias, a esterilidade masculina, a tolerância ao frio, tolerância ao sal, aumentou rendimento, aumento da eficiência de uso de nutrientes, aumento da eficiência no uso de nitrogênio, aumento do teor de carboidrato fer- mentável, reduzido teor de lignina, maior teor de antioxidantes, o aumento da eficiência de uso da água, maior vigor, o aumento da eficiência de germinação, mais cedo ou aumento da floração, o aumento da biomassa, alteradas-to-raiz atirar relação de biomassa, maior retenção de água do solo ou uma combinação destes. Em ainda outra modalidade, cada uma das primeira e segunda população é capaz de conferir uma característica diferente selecionado de entre o grupo que consiste de tolerância térmica, tolerância a herbicidas, resistência à seca, resistência a insetos, resistência a fungos, resistência a vírus, resistência a bactérias, a esterilidade masculina, tolerância ao frio, tolerância ao sal, aumento da produtividade, aumento da eficiência de uso de nutrientes, aumento da eficiência no uso de nitrogênio, aumento do teor de carboidrato fermentável, reduzido teor de lignina, maior teor de antioxidantes, o aumento da eficiência de uso da água, maior vigor, o aumento da eficiência de germinação, mais cedo ou aumento da floração, o aumento da biomassa, proporção alterada raiz-a- disparar biomassa, aumentou a retenção de água no solo ou uma combinação dos mesmos.

[000263] As combinações de endófitos pode também ser selecionado com base em combinações dos critérios acima. Por exemplo, a primeira população pode ser selecionada em função do composto que produz (por exemplo, a sua capacidade para fixar nitrogênio, proporcionando assim uma fonte de nitrogênio potencial para a planta), enquanto que a segunda população é selecionado com base na sua ca- pacidade de conferir um aumento de resistência da planta a um pató- geno (por exemplo, um patógeno fúngico). Formulações/composições de revestimento de semente

[000264] As populações bacterianas purificadas descritas aqui podem ser formuladas usando um veículo agricolamente compatível. A formulação útil para estas modalidades geralmente tipicamente incluem pelo menos um membro selecionado do grupo que consiste de um agente de aderência, um estabilizante microbiana, um fungicida, um agente antibacteriano, um herbicida, um nematicida, um inseticida, um regulador do crescimento de plantas, um rodenticida, um dessecante e um nutriente.

[000265] Em alguns casos, a população bacteriana purificado é misturado com um veículo agricolamente compatível. O veículo pode ser um veículo sólido ou veículo líquido e em várias formas, incluindo mi- croesferas, pós, emulsões e assim por diante. O veículo pode ser qualquer um ou mais de um número de veículos que conferem uma variedade de propriedades, tais como o aumento da estabilidade, mo- lhabilidade, dispersibilidade ou. Agentes umectantes tais como tensoa- tivos naturais ou sintéticos, que podem ser agentes tensoativos não iónicos ou iónicos ou uma sua combinação podem ser incluídos em uma composição da invenção. Emulsões água-em-óleo pode também ser usado para formular uma composição que inclui a população bac- teriana purificada (ver, por exemplo, Patente dos Estados Unidos No. 7.485.451, que é aqui incorporado por referência na íntegra). As formulações adequadas que podem ser preparados incluem pós molháveis, grânulos, géis, tiras de ágar ou pellets, espessantes e assim por diante, partículas microencapsuladas e assim por diante, tais como líquidos escoáveis aquosas, suspensões aquosas, emulsões água-em- óleo, etc. A formulação pode incluir grãos de leguminosas ou produtos, por exemplo, grão ou feijão ou caldo de farinha de derivados de grãos ou feijão, amido, açúcar ou óleo.

[000266] Em algumas modalidades, o veículo agrícola pode ser o solo ou em um meio de crescimento da planta. Outros veículos agrícolas que podem ser usados incluem água, fertilizantes, óleos à base de plantas, umectantes ou combinações dos mesmos. Alternativamente, o veículo agrícola pode ser um sólido, tal como terra de diatomáceas, barro, sílica, alginato, argila, bentonita, vermiculita, casos de sementes, outros produtos vegetais e animais ou de combinações, incluindo grânulos, pellets ou suspensões. Misturas de qualquer um dos ingredientes acima mencionados são também consideradas como veículos, tais como, porém sem limitações, farinha e argila de caulim, ágar ou granulados à base de farinha em marga, areia, argila ou, etc. As formulações podem incluir fontes de alimento para os organismos cultivados, como cevada, arroz ou outros materiais biológicos, tais como sementes, partes de plantas, bagaço de cana, casca ou talos de processamento de grãos, material terra vegetal ou madeira de local de construção recusar, serragem ou pequenas fibras de reciclagem de papel, tecido ou madeira. Outras formulações adequadas serão conhecidas por aqueles versados na técnica.

[000267] Em uma modalidade, a formulação pode incluir um agente de aderência ou aderente. Tais agentes são úteis para a combinação da população bacteriana da invenção com veículos que podem conter outros compostos (por exemplo, agentes de controle biológico são que não), para se obter uma composição de revestimento. Tais composições ajudar a criar revestimentos ao redor da planta ou semente de manter contato entre o micro-organismo e outros agentes com a parte da planta ou planta. Em uma modalidade, os aderentes são selecionados do grupo que consiste em: alginato, gomas, amidos, lecitinas, for- mononetina, álcool polivinílico, formononetinato alcalino, hesperitina, acetato de polivinila, cefalinas, goma arábica, goma xantana, óleo mi neral, polietileno-glicol (PEG), polivinil pirrolidona (PVP), arabinogalac- tana, metil celulose, PEG 400, quitosana, poliacrilamida, poliacrilato, poliacrilonitrilo, glicerol, trietileno glicol, acetato de vinilo, goma gelana, poliestireno, polivinila, carbóxi metil celulose, goma Ghatti e polioxieti- leno-polioxibutileno copolímeros em bloco. Outros exemplos de composições aderentes que podem ser usados na preparo sintética incluem aqueles descritos no documento EP 0818135, CA 1229497, WO 2013090628, EP 0192342, WO 2008103422 e CA 1041788, cada uma das quais é aqui incorporada por referência na íntegra.

[000268] A formulação pode também conter um surfactante. Exemplos não limitantes de surfactantes incluem as misturas de nitrogênio- agente tensoativo, tal como Prefere 28 (Cenex), Surf-N (EUA), Inhance (Brandt), P-28 (Wilfarm) e patrulha (Helena); óleos de sementes esterifi- cados incluem Sun-It II (AmCy), MSO (UAP), Scoil (Agsco), Hasten (Wilfarm) e Mes-100 (Drexel); e tensoativos de organo-silicone incluem Silwet L77 (UAP), Silikin (Terra), Dyne-Amic (Helena), Kinetic (Helena), Sylgard 309 (Wilbur-Ellis) e Century (Precision). Em uma modalidade, o tensoativo está presente em uma concentração compreendida entre 0,01% v/v para 10% v/v. Em outra modalidade, o tensoativo está presente em uma concentração compreendida entre 0,1% v/v a 1% v/v.

[000269] Em certos casos, a formulação inclui um estabilizador microbiana. Um tal agente pode incluir um dessecante. Conforme usado aqui, um "dessecante" pode incluir qualquer composto ou mistura de compostos que podem ser classificadas como um dessecante, independentemente de o composto ou compostos são usados em concentrações que, de facto, têm um efeito de dessecação no inóculo líquido. Tais dessecantes são idealmente compatíveis com a população bacte- riana usada e deve promover a capacidade da população microbiana para sobreviver aplicação sobre as sementes e para sobreviver à dessecação. Exemplos de dessecantes adequados incluem um ou mais de trealose, sacarose, glicerol e glicol de metileno. Outros dessecantes adequados incluem, mas não estão limitados a, não açúcares redutores e álcoois de açúcar (por exemplo, manitol ou sorbitol). A quantidade de dessecante introduzidos na formulação pode variar desde cerca de 5% a cerca de 50% em peso/volume, por exemplo, entre cerca de 10% a cerca de 40%, entre cerca de 15% e cerca de 35% ou entre cerca de 20% e cerca de 30%.

[000270] Em alguns casos, é vantajoso para a formulação de conter agentes tais como um fungicida, um agente antibacteriano, um herbicida, um nematicida, um inseticida, um regulador do crescimento de plantas, um rodenticida ou um nutriente. Tais agentes são idealmente compatíveis com a semente agrícola ou mudas sobre a qual a formulação é aplicada (por exemplo, não devem ser prejudiciais para o crescimento ou a saúde da planta). Além disso, o agente é de preferência uma que não causa problemas de segurança para o ser humano, animal ou fins industriais (por exemplo, não há problemas de segurança ou o composto é suficientemente lábil que a planta produto comercial derivado da planta contém quantidades negligenciáveis do composto).

[000271] Na forma líquida, por exemplo, soluções ou suspensões, as populações bacterianas endofíticas da presente invenção podem ser misturadas ou suspensas em água ou em soluções aquosas. Diluentes líquidos ou veículos adequados incluem água, soluções aquosas, destilados de petróleo ou outros veículos líquidos.

[000272] As composições sólidas podem ser preparadas por dispersão dos populações endofíticas bacterianas da invenção e em um veículo sólido adequadamente dividido, tal como turfa, trigo, farelo, vermi- culita, argila, talco, bentonita, terra diatomácea, solo pasteurizado e o Como. Quando estas formulações são usadas na forma de pós molháveis, dispersantes agentes biologicamente compatíveis, tais como agentes não iónicos, aniônicos, anfotéricos ou catiônicos e agentes dispersantes emulsionantes podem ser usadas.

[000273] Veículos sólidos usados para formulação incluem, por exemplo, portadores minerais, tais como argila de caulim, pirofilita, bentonita, montmorilonita, terra diatomácea, terra branco ácido, vermi- culita e perlita e sais inorgânicos, tais como sulfato de amônio, fosfato de amônio, nitrato de amônio, ureia, cloreto de amónio e carbonato de cálcio. Além disso, podem ser usados pós finos orgânicos tais como farinha de trigo, farelo de trigo e farelo de arroz. Os veículos líquidos incluem óleos vegetais tais como óleo de soja e óleo de algodão, glice- rol, etileno glicol, polietileno glicol, propileno glicol, polipropileno glicol, etc.

[000274] Em uma modalidade particular, a formulação é adequada para o revestimento de população microbiano endófito em sementes. As populações bacterianas endofíticas descritos na presente invenção são capazes de conferir muitos benefícios de aptidão para as plantas hospedeiras. A capacidade para conferir benefícios tais revestindo as populações bacterianas sobre a superfície de sementes tem muitas vantagens potenciais, em particular quando usados em uma escala (agrícola) comercial.

[000275] As populações bacterianas endofíticas desta invenção podem ser combinados com um ou mais dos agentes descritos acima, para se obter uma formulação adequada para combinação com uma semente agrícola ou muda. A população bacteriana pode ser obtidos a partir de crescimento em cultura, por exemplo, usando um meio de crescimento sintético. Além disso, o micróbio pode ser cultivado em meio sólido, por exemplo, em placas de Petri, raspadas e suspensas em preparo. Micróbios em diferentes fases de crescimento podem ser usados. Por exemplo, os micróbios na fase de latência, a fase log precoce, a fase log mediana, fase tardia de log-, fase estacionária, fase inicial de morte ou fase de morte pode ser usado.

[000276] As formulações que compreendem a população endófito bacterianos da presente invenção contém tipicamente entre cerca de 0,1 a 95% em peso, por exemplo, entre cerca de 1% e 90%, entre cerca de 3% e 75%, entre cerca de 5% e 60%, entre cerca de 10% e 50% em peso húmido da população bacteriana da presente invenção. É preferível que a formulação contém pelo menos cerca de 103 CFU por ml de formulação, por exemplo, pelo menos cerca de 104, pelo menos cerca de 105, pelo menos cerca de 106, pelo menos 107 CFU, pelo menos 108 CFU por ml de formulação. POPULAÇÃO DE SEMENTES

[000277] Em um outro aspecto, a invenção proporciona uma população substancialmente uniforme de sementes compreendendo uma pluralidade de sementes que constituem a população bacteriana endófito, conforme descrito aqui acima. Uniformidade substancial pode ser determinada de muitas maneiras. Em alguns casos, pelo menos 10%, por exemplo, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou mais das sementes na população, contém a população bacteriana no endó- fito de uma quantidade eficaz de colonizar a planta disposta sobre a superfície das sementes. Em outros casos, pelo menos 10%, por exemplo, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou mais das sementes na população, contém, pelo menos 1, 10 ou 100 CFU sobre a superfície das sementes ou por grama de semente, por exemplo, pelo menos 200 CFU, pelo menos 300 CFU, pelo menos 1.000 CFU, pelo menos 3.000 CFU, pelo menos 10.000 CFU, pelo menos 30.000 CFU, pelo menos 100.000 CFU, pelo menos 300.000 CFU ou pelo menos 1.000.000 de CFU por semente ou mais.

[000278] Em uma modalidade particular, a população de sementes é acondicionado em um saco ou recipiente adequado para venda comercial. Um tal saco contém uma unidade de peso ou contagem das sementes que constituem a população bacteriano endófito conforme descrito aqui e compreende ainda uma etiqueta. Em uma modalidade, o saco ou recipiente contém pelo menos 1000 sementes, por exemplo, pelo menos 5000 sementes, pelo menos 10.000 sementes, pelo menos 20000 sementes, pelo menos 30.000 sementes, pelo menos 50.000 sementes, pelo menos 70.000 sementes, pelo menos 80.000 sementes, pelo menos 90.000 ou mais sementes. Em outra modalidade, o saco ou recipiente pode compreender um peso discreto de sementes, por exemplo, pelo menos uma libra, pelo menos duas libras, pelo menos de 5 libras, de pelo menos 10 libras, pelo menos 30 libras, de pelo menos 50 quilogramas, em menos 70 libras ou mais. O saco ou recipiente compreende uma etiqueta que descreve as sementes e/ou a referida população bacteriana endófitos. A etiqueta pode conter informação adicional, por exemplo, a informação selecionada do grupo que consiste em: peso líquido, número de lote, a origem geográfica das sementes, data do teste, a taxa de germinação, teor de matéria inerte e a quantidade de ervas daninhas nocivas, se houver. Os recipientes adequados ou pacotes incluem os tradicionalmente usados na comercialização de sementes de plantas. A invenção também considera outros recipientes com capacidades de armazenamento mais sofisticados (por exemplo, com os invólucros microbiologicamente herméticos ou à prova de água).

[000279] Em alguns casos, uma subpopulação de sementes que constituem a população bacteriano endófito é ainda selecionado em função do aumento da uniformidade, por exemplo, com base na uniformidade da população microbiana. Por exemplo, as sementes individuais de piscinas coletados a partir de espigas de indivíduo, plantas individuais, lotes individuais (representando plantas inoculadas no mesmo dia) ou campos individuais podem ser testados para a uniformidade da densidade microbiana e apenas as especificações de reunião piscinas (por exemplo, pelo menos 80% de sementes testadas têm densidade mínima, como determinado por métodos quantitativos descritos em outra parte) são combinados para fornecer o subpopula- ção de semente agrícola.

[000280] Os métodos descritos aqui podem também compreender um passo de validação. A etapa de validação pode implicar, por exemplo, crescendo algumas sementes coletadas a partir das plantas inoculadas em plantas agrícolas maduros e testando essas plantas individuais para a uniformidade. Tal passo de validação pode ser realizada em sementes individuais coletados a partir de plantas individuais, espigas, lotes individuais (representando plantas inoculadas no mesmo dia) ou campos individuais e testado conforme descrito acima para identificar os conjuntos que satisfaçam as especificações exigidas.

[000281] Em algumas modalidades, os métodos descritos aqui incluem o plantio de uma combinação sintética descritos aqui. Plantadores adequados incluem um semeador de ar e/ou aparelho de fertilizante usado em operações agrícolas para aplicar materiais em partículas, incluindo um ou mais dos seguintes, sementes, fertilizante e/ou inócu- los, para o solo durante a operação de plantação. Dispositivos semea- dora/fertilizantes pode incluir uma barra de ferramentas com abridores de terra de engate no mesmo, por trás da qual é rebocado um carrinho com rodas que inclui um ou mais tanques de contenção ou caixas de medição associados e meios para conter e metros dali materiais parti- culados respectivamente. Vide, por exemplo, Patente dos Estados Unidos N.o 7.555.990.

[000282] Em certas modalidades, uma composição descrita aqui pode ser na forma de um líquido, uma suspensão, um sólido ou um pó (pó molhável ou de pó seco). Em outra modalidade, uma composição pode estar na forma de um revestimento de semente. As composições no estado líquido, suspensão ou pó (por exemplo, pó molhável) forma podem ser adequados para o revestimento de sementes. Quando usado para revestir sementes, a composição pode ser aplicada às sementes e deixou-se secar. Em modalidades em que a composição é um pó (por exemplo, um pó molhável), um líquido, tal como água, pode necessitar de ser adicionada ao pó antes da aplicação a uma semente.

[000283] Em ainda outra modalidade, os métodos podem incluir a introdução no solo de um inoculo de uma ou mais das populações en- dófitos descritos aqui. Tais métodos podem incluir a introdução no solo uma ou mais das composições descritas aqui. O inoculo (s) ou composições podem ser introduzidos no solo de acordo com métodos conhecidos dos peritos na técnica. Os exemplos não limitativos incluem a introdução no sulco, pulverização, revestimento de sementes, introdução foliar, etc. Em uma modalidade particular, a etapa de introdução compreende introdução no sulco do inoculo ou composições descritas aqui.

[000284] Em uma modalidade, as sementes podem ser tratadas com a composição (s) descrito aqui de várias maneiras mas, de preferência por meio de pulverização ou gotejamento. Spray e tratamento de gote- jamento pode ser conduzida através da formulação de composições descritas aqui e pulverizando ou gotejando a composição para uma semente através de um sistema de tratamento contínuo (o qual é calibrado para aplicar tratamento a uma velocidade pré-definida em relação ao fluxo contínuo de sementes), tal como um tambor do tipo de tratador. Sistemas de lote, em que um tamanho de lote de semente pré-determinado e a composição, conforme descrito aqui são entregues em um misturador, podem também ser empregues. Sistemas e aparato para realizar estes processos estão comercialmente disponí- veis a partir de inúmeros fornecedores, por exemplo, Bayer CropScience (Gustafson).

[000285] Numa outra modalidade, o tratamento envolve as sementes de revestimento. Um tal processo envolve o revestimento da parede interior de um recipiente redondo com a composição descrito aqui, a adição de sementes, então, rodando o recipiente para fazer com que as sementes de tocar a parede e a composição, um processo conhecido na técnica como "recipiente de revestimento". As sementes podem ser revestidos por meio de combinações de processos de revestimento. Embeber tipicamente implica o uso de formas líquidas das composições descritas. Por exemplo, as sementes podem ser embebidas durante cerca de 1 minuto até cerca de 24 horas (por exemplo, durante pelo menos 1 min, 5 min, 10 min, 20 min, 40 min, 80 min, 3 h, 6 h, 12 h, 24 h ). POPULAÇÃO DE PLANTAS/CAMPOS AGRÍCOLAS

[000286] Um dos principais focos dos esforços de melhora de culturas tem sido a de selecionar variedades com características que dão, além de maior retorno, a maior homogeneidade e uniformidade. Enquanto endogamia pode produzir plantas com identidade genética substancial, a heterogeneidade em relação à altura da planta, época de floração e tempo para semear, permanecem obstáculos à obtenção de um campo homogêneo de plantas. A variabilidade inevitável planta- a-planta são causados por uma multiplicidade de fatores, incluindo condições ambientais irregulares e práticas de gestão. Outra fonte possível de variabilidade pode, em alguns casos, ser devido à heterogeneidade da população microbiana habitam as plantas. Ao proporcionar as populações bacterianas endofíticas para sementes e mudas, as plantas resultantes gerados pela germinação das sementes e mudas têm uma composição microbiana mais consistente, e, assim, espera- se produzir uma população mais uniforme das plantas.

[000287] Portanto, em outro aspecto, a invenção proporciona uma população substancialmente uniforme de plantas. A população pode incluir pelo menos 100 plantas, por exemplo, pelo menos 300, pelo menos plantas, plantas, 1.000, pelo menos 3.000 plantas, pelo menos 10.000 plantas, pelo menos 30.000 plantas, pelo menos 100.000 ou mais plantas. As plantas são cultivadas a partir das sementes que constituem a população bacteriano endófito conforme descrito aqui. O aumento da uniformidade das plantas pode ser medido em um número de maneiras diferentes.

[000288] Em uma modalidade, há um aumento da uniformidade no que diz respeito aos micróbios dentro da população de plantas. Por exemplo, em uma modalidade, uma porção substancial da população de plantas, por exemplo, pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou mais das sementes ou plantas em uma população, contém um número de limiar da população bacteriana endófitos. O número de limiar pode ser pelo menos de 10 CFU, pelo menos 100 CFU, por exemplo pelo menos 300 CFU, pelo menos 1.000 CFU, pelo menos 3.000 CFU, pelo menos 10.000 CFU, pelo menos 30.000 CFU, pelo menos 100.000 CFU ou mais, em da planta ou parte da planta. Alternativamente, em uma porção substancial da população de plantas, por exemplo, em pelo menos 1%, pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou mais das plantas na população, a população endófito bacteriano que é fornecida à semente ou muda representa, pelo menos 0,1%, pelo menos 1%, pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 99% ou 100% da população total micróbio na planta/semente.

[000289] Em uma modalidade, há um aumento da uniformidade genética de uma parte substancial ou todos os micróbios detectáveis nos taxa, gênero, espécie ou do micróbio-originário de semente em relação a um controle não inoculado. Esta maior uniformidade pode ser um resultado de o micróbio originário de semente ser de origem monoclonal ou outro processo de obter a partir de uma população microbiana de sementes-origem compreendendo uma sequência de genoma mais uniforme e repertório plasmídeo do que estaria presente na população microbiana uma planta que deriva o seu microbiana comunidade em grande parte através da assimilação diversas simbiontes do solo. A uniformidade

[000290] Em outra modalidade, há um aumento da uniformidade no que diz respeito a um parâmetro fisiológico das plantas dentro da população. Em alguns casos, pode haver uma maior uniformidade na altura das plantas, quando comparado com uma população de referência plantas agrícolas cultivadas sob as mesmas condições. Por exemplo, pode haver uma redução do desvio padrão na altura das plantas na população de pelo menos 5%, por exemplo, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60% ou mais, quando comparado com uma população de referência plantas agrícolas cultivadas sob as mesmas condições. Em outros casos, pode haver uma redução do desvio-padrão no período de floração das plantas na população de pelo menos 5%, por exemplo, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60% ou mais, quando comparado com uma população de referência plantas agrícolas cultivadas sob as mesmas condições. Produto Vegetal

[000291] A presente invenção proporciona um produto de planta de mercadorias, bem como métodos para a produção de um produto vegetal de mercadorias, que é derivado de uma planta da presente invenção. Conforme usado aqui, um "produto da planta mercadoria" se refere a qualquer composição ou um produto que é composta de material derivado de uma planta, semente, célula de planta ou parte de planta da presente invenção. Produtos vegetais podem ser vendidos aos consumidores e pode ser viável ou inviável. Produtos de base não viáveis incluem, mas não estão limitados a sementes não viáveis e grãos; sementes industrializados, partes de sementes e partes de plantas; tecido desidratado vegetal, tecido vegetal congelado e tecido vegetal transformado; sementes e partes de plantas transformadas para a alimentação animal para consumo terrestre e/ou animal aquático, óleo, farinha, farinha, flocos, farelo de trigo, fibras, papel, chá, café, silagem, esmagado de grão inteiro e qualquer outro alimento para humano ou animal consumo; e biomassas e produtos de combustível; e matéria-prima na indústria. Usos industriais de óleos derivados de plantas agrícolas os descritos aqui incluem ingredientes para tintas, plásticos, fibras, detergentes, cosméticos, lubrificantes e biodiesel. O óleo de soja pode ser dividido, esterificados, sulfurados, epoxidado, polimerizada, etoxilado ou clivada. Concepção e produção de derivados de óleo de soja com melhor funcionalidade e melhora oligo química é um campo em rápido crescimento. A mistura típica de triglicerí- deos é geralmente dividido e separado em ácidos gordos puros, os quais são, então, combinados com os álcoois derivados do petróleo ou ácidos, de nitrogênio, sulfonatos, cloro ou com álcoois gordos derivados de gorduras e óleos para produzir o tipo desejado de óleo ou gorda. Produtos de base de plantas também incluem compostos industriais, tais como uma ampla variedade de resinas usadas na formulação de adesivos, filmes, plásticos, tintas, revestimentos e espumas.

[000292] A invenção será ainda descrita nos exemplos seguintes, que não limitam o âmbito da invenção descrita nas reivindicações. EXEMPLOS Exemplo 1 - Isolamento de endófitos bacterianos de sementes, mudas e plantas

[000293] De modo a compreender melhor o papel desempenhado por micróbios endofíticos transmitidas por sementes em melhorar o vigor, estado geral de saúde e estresse resistência das plantas hospedeiras, uma tela sistemático foi iniciado para isolar e caracterizar os micróbios endofíticos de sementes de plantas gramíneas comercialmente significativos.

[000294] Diversos tipos de milho, trigo, arroz e outras sementes foram adquiridos e rastreados para micróbios cultiváveis. 49 cultivares distintas de milho e teosinto acessos foram originados a partir do USDA via GRIN (Programa Nacional de Recursos Genéticos em http://www.ars-grin.gov/) ou comprados a partir da empresa de sementes Sustentável (Covelo, CA). Da mesma forma, cinco cultivares de trigo distintos e parentes de trigo foram adquiridos a partir do USDA via GRIN (Programa Nacional de Recursos Genéticos em http://www.ars-grin.gov/) ou comprado de um Whole Foods em Cambridge, MA. Sementes do arroz e parentes (23 no total) foram adquiridos a partir do USDA via GRIN (Programa Nacional de Recursos Genéticos em http://www.ars-grin.gov/) ou comprado de um Whole Foods em Cambridge, MA. Sementes de várias outras espécies de plantas, incluindo sorgo, painço, aveia, centeio, turfa, etc., foram adquiridos a partir do USDA via GRIN (National Genetic Resources Program na world wide web em ars-grin.gov/), Sustainable Seed Company ou comprado da Whole Foods em Cambridge, MA.

[000295] Reservatórios de 5 sementes foram embebidos em 10 mL de água estéril contidos em tubos de 15 ml estéreis cónicos durante 24 horas. Foram amostrados alguns acessos milho e arroz para os micróbios da superfície das sementes. Nestes casos, após 24 horas de imersão, alíquotas de 50 μL de não diluído, 100X diluir e 10000x diluir a água de maceração foi em R2A ágar [Proteose peptona (0,5 g/L), casaminoácidos (0,5 g/L), extrato de levedura ( 0,5 g/l), dextrose (0,5 g/L) de amido solúvel (0,5 g/L), fosfato de dipotássio (0,3 g/L), Sulfato de magnésio 7H2O (0,05 g/L), piruvato de sódio (0,3 g/L), ágar (15 g/L), pH final de 7 ± 0,2 @ 25°C] para cultura de bactérias oligotrofis- mo, enquanto os mesmos volumes e diluições foram também em ágar de dextrose de batata (PDA) [batata de infusão de 200 g/L, dextrose a 20 g/L, ágar 15 g/L, pH final: 5,6 ± 0,2 a 25°C] para bactérias e fungos cultura. Foram amostradas todas as sementes no estudo de endófitos por esterilização superficial, trituração e cultura da erva-benta. As sementes foram cuja superfície foi esterilizada por lavagem com EtOH a 70%, lavagem com água, então lavar com uma solução a 3% de hipo- clorito de sódio seguido por 3 lavagens em água esterilizada. Todos lavar e enxaguar passos eram 5 minutos com agitação constante a 130rpm. As sementes foram depois riscados sobre ágar R2A que foi incubada a 30°C durante 7 dias, de modo a confirmar a esterilização da superfície bem sucedido. Seguindo o processo de esterilização, os lotes de sementes foram triturados com um almofariz estéril e pilão em caldo R2A estéreis, enquanto que as sementes de milho, arroz e soja foram também cultivados sob condições estéreis e as raízes ou rebentos de mudas (sem qualquer outra esterilização) foram esmagados pela batimento grânulo em uma máquina Fastprep24 com grânulos de carboneto de 3, 1 mL de caldo de R2A em um tubo Falcon de 15 ml com agitação a 6 m/s durante 60 segundos. Extratos de lavagens de superfície, sementes trituradas ou tecido das mudas maceradas foram diluídas em série por fatores de 1 a 10-3 e espalhado em quadrantes R2A, PDA, LGI ou suco de ágar V8, de modo a isolar os micro- organismos transmitidos pela semente cultiváveis. As placas foram incubadas a 28°C durante 7 dias, o acompanhamento para o aparecimento de colônias ao dia. Depois de uma semana, as placas foram fotografadas e as colônias foram identificadas e rotuladas. Estes foram então selecionados para a identificação por sequenciamento, apoiando-se por congelação a -80πC como estoque de glicerol e ensaiando para funções benéficas conforme descrito aqui. Colocação em placas e classificação de micróbios

[000296] Após 7 dias de crescimento, a maioria das colônias bacteri- anas tinha crescido grande e suficientemente distintos para permitir a diferenciação com base no tamanho da colônia, cor, forma e textura. Fotografias de cada placa foram tomadas e com base na cor e dos tipos morfológicos, diferentes colônias foram identificadas pelos números de referência para mais tarde. Estas cepas também foram riscados para fora em ambos os R2A ou PDA para verificar a pureza e as culturas foram então limpas raspada com uma ansa de fora da placa, res- suspensas em uma mistura de glicerol e R2A e congelado afastado em quadruplicado a -80°C durante mais tarde. Exemplo 2 - Análise de sequência e atribuição filogenética

[000297] Para caracterizar com precisão os endófitos bacterianos isoladas, colônias foram submetidas a sequenciamento do gene marcador e as sequências foram analisadas para fornecer classificações taxonômicas. As colônias foram sujeitas a amplificação por PCR do rRNA 16S do gene usando um conjunto de iniciadores 27f/1492r e Sanger de sequenciamento de extremidades emparelhadas foi realizada a Genewiz (South Plainfield, NJ). Cromatogramas em bruto foram convertidos em sequências e índices de qualidade correspondentes foram designados usando TraceTuner v3.0.6beta (US 6.681.186, aqui incorporada por referência). Estas sequências foram filtradas usando qualidade PRINSEQ v0.20.3 [Schmieder e Edwards (2011) Bioinformática. 2011; 27: 863-864, aqui incorporada por referência] com limiares de pontuação de qualidade de acabamento esquerdo e direito de 30 e uma janela de 20 pb qualidade. Sequências sem emparelhado leituras foram descartados do processamento adicional. Sequências filtradas qualidade final emparelhados foram fundidos usando USEARCH v7.0 [Edgar (2010) métodos Natureza 10: 996-8]. Classificações taxonômica foram atribuídos às sequências usando o classificador RDP [Wang et ai, (2007) Applied and Environmental Microbiology 73:. 5261-7, aqui incorporado por referência] treinados na base de dados Greengenes [McDonald et al. (2012), ISME Journal 6: 610-8, aqui incorporado por referência]. Os micróbios resultantes 473, representando 44 OTUs distintas (usando um limite de similaridade de 97%) são fornecidos na Tabela 2. Exemplo 3 - Ensaios de endófitos bacterianos in vitro

[000298] Um total de 242 endófitos bacterianos derivados de sementes representando 44 OTUs distinta, conforme descrito acima foram semeadas em placas de 96 cavidades e testadas para diferentes atividades e/ou a produção de compostos, conforme descrito abaixo. As colônias ou cavidades com nenhuma atividade detectável foram pontuadas como "-", baixa atividade como "1," atividade moderada como "2" e forte atividade como "3" Os resultados destes ensaios in vitro encontram-se resumidos na Tabela 3. Produção de auxina (SD)

[000299] Para permitir que os isolados a crescer e acumular auxina, as cepas bacterianas foram inoculadas em 250 μL de caldo suplementado com R2A com L-triptofano (5 mM) em 350 μL de profundidade, de fundo plano transparente, placas de cultura de 96 cavidades. As placas foram seladas com uma membrana respirável e incubadas a 28πC sob condições estáticas durante 3 dias. Após 3 dias a DO600 e DO530 nm foram medidas em um leitor de placas para verificar se o cresci- mento bacteriano. Depois de medir estes OD, 50 μL de reagente de cor amarelada Salkowski (0,01 M de FeCl3 em 35% HCIO4 (ácido perclórico, # 311421, Sigma) foram adicionados a cada cavidade e incubou-se no escuro durante 30 minutos antes de medir a nm DO530 medido para detectar rosa /cor vermelha.

[000300] Auxina é um importante hormônio vegetal, que pode promover o alargamento celular e inibir o desenvolvimento do ramo (atividade meristema) nos tecidos da planta acima do solo, enquanto que abaixo do solo, tem o efeito oposto, promovendo ramificação raiz e crescimento. Curiosamente, planta auxina é fabricado acima do solo e transportado para as raízes. Daqui resulta que planta e raiz especialmente habitam os micróbios que produzem quantidades significativas de auxina será capaz de promover a ramificação e desenvolvimento das raízes, mesmo sob condições onde a planta reduz a sua própria produção de auxina. Tais condições podem existir, por exemplo, quando o solo é inundado e raízes encontram um ambiente anóxico que retarda ou impede o metabolismo raiz.

[000301] Bactérias originárias de semente foram selecionadas por sua capacidade de produzir auxinas possível crescimento da raiz agentes promotores. Um número muito grande de bactérias mostrou um nível detectável de desenvolvimento de cor rosa ou vermelho (o recurso de diagnóstico do ensaio sugerindo auxina ou produção de composto de indol) - 169 de 247. 89 cepas tiveram particularmente forte produção de auxina ou compostos de indol. Erwinia e Pantoea espécies são muito semelhantes, se não idênticas grupos taxonômi- cos e pode, assim, ser consideradas em conjunto - de um total de 38 isolados, 23 tinham produção moderada ou forte de auxina ou compostos de indol in vitro. Muitas destas cepas de Erwinia e Pantoea foram isolados a partir de sementes cuja superfície foi esterilizada interior, sugerindo que eles podem ser capazes de colonizar o inte- rior da raiz emergente (primeira parte da planta a emergir da semente) e estimular o crescimento da raiz para produzindo auxinas no interior da plantar.

[000302] Outro grupo importante de produção de auxina bactérias sementes de origem eram espécies de Pseudomonas, 9 dos 14 isolados apresentaram produção significativa de índoles neste ensaio. Ochrobactrum espécies também foram detectados como fortes produtores de compostos de indol neste ensaio, com 15 dos 18 mostrando moderada a forte mudança de cor (18, embora todos tiveram alteração de cor detectável neste ensaio). Auxina fortemente que produzem cepas de espécies de Pseudomonas e Ochrobactrum foram isolados a partir de superfícies de sementes. Solubilização de fosfato mineral

[000303] Os micróbios foram em meio de fosfato de tricálcio conforme descrito em Rodrigues et ai, (2001) J. Biotechnol. 84: 155-161 (aqui incorporada por referência). Este foi preparado como se segue: 10 g/L de glucose, 0,373 g/L de NH4NO3, 0,41 g/L MgSO4, 0,295 g/L de NaCl, 0,003 FeCl3, 0,7 g/L Ca3HPO4, 100 mM de Tris e 20 g/L de ágar, pH 7, a seguir e vertido em placas de Petri quadradas. Após 3 dias de crescimento a 28°C, no escuro, halos claros foram medidos em torno de colônias capazes de solubilizar foi um ensaio à base de ágar procurando halos em torno de colônias que significam a solubili- zação de fosfato de cálcio tri-opaco, o que resultou em um grande número (95) de isolados que possuem níveis detectáveis solubilização de fosfato (Tabela 3). Destes, pelo menos 36 tinham níveis moderados a elevados de solubilização de fosfato, incluindo várias espécies de En- terobacter e Pantoea. Crescimento em meio LGI sem nitrogênio

[000304] Toda a vidraria foi limpa com 6 M HCl antes da preparo da mídia. Uma nova placa de 96 cavidades (300 μL volume de cavidade) foi preenchida com 250 μL/cavidade de caldo estéril LGI [por L, 50 g de sacarose, 0,01 g FeCl3-6H2O, K3PO4 0,8 g, 0,2 g de CaCl2, 0,2 g de MgSO4-7H2O, 0,002 g Na2MoO4-2H2O, pH 7,5]. As bactérias foram inoculadas em cavidades de 96 simultaneamente com um replica- dor de 96 pinos esterilizadas à chama. A placa foi selada com uma membrana respirável, incubou-se a 28°C sem agitação durante 5 dias e as leituras de OD600 feita com um leitor de placa de 96 bem.

[000305] Uma bactéria que fixa nitrogênio da planta associado é capaz, teoricamente, para adicionar ao metabolismo do nitrogênio do hospedeiro e as bactérias mais famosa planta benéfica associados, rizóbios, são capazes de fazer isso dentro de órgãos especialmente adaptados sobre as raízes das plantas leguminosas. As bactérias de sementes associadas neste estudo pode ser capaz de fixar nitrogênio em associação com a muda em desenvolvimento, se eles colonizam superfícies da planta ou interior e, assim, acrescentar a nutrição nitro- genada da planta.

[000306] No total, das 247 isola havia 34 (14%), que teve um crescimento detectável sob condições limitantes de nitrogênio (Tabela 3). Tabela 3. Ensaios funcionais para examinar o potencial de micróbios originários de semente de conferir novas funções às culturas. Legenda: "-" indica que não há aumento significativo; "1" = baixa atividade; "2" = atividade mediana; "3" = alta atividade

[000307] Todos esses grupos são conhecidos por terem represen- tantes com potencial para fixar o nitrogênio atmosférico; no entanto, os principais deles foram Bacillus, Burkholderia, Enterobacter, Methylo- bacterium e Pseudomonas.

Atividade de deaminase ACC

[000308] Os micróbios foram ensaiadas para o crescimento com ACC como sua única fonte de nitrogênio. Antes da preparo mídia todos os vidros foi limpa com 6 M HCl. Uma solução esterilizada 2 M de filtro ACC (# 1373A, Research Organics, EUA) foi preparada em água. 2 μL/ml de este foi adicionado ao caldo submetido à autoclave LGI (ver acima) e 250 mL alíquotas foram colocadas em um novo (limpo) placa de 96 cavidades. A placa foi inoculada com uma biblioteca de replica- dor de 96 pinos, selada com uma membrana respirável, incubou-se a 28°C sem agitação durante 5 dias e as leituras tomadas DO600. Somente cavidades que foram significativamente mais turva que seus cavidades BIG livre de nitrogênio correspondente foram consideradas para exibir atividade ACC deaminase.

[000309] Reações de estresse da planta são fortemente impactados pela produção própria e superprodução do hormônio etileno gasoso da planta. O etileno é metabolizado a partir do seu precursor 1- aminociclopropano-1-carboxilato (ACC) que pode ser desviada a partir do metabolismo do etileno pelo microbianos de plantas e enzimas que têm atividade desaminase ACC. Como o nome indica, deaminase ACC remove nitrogênio molecular do precursor de etileno, removê-lo como um substrato para a produção do hormônio do estresse da planta e modo de micróbio uma fonte valiosa de nutrição nitrogenada. É um tanto surpreendente, mas esta capacidade microbiana para inibir a produção de etileno é muito importante para a saúde da planta como danos para o crescimento ea produtividade sob várias condições de estresse é acreditado para resultar do próprio excesso de produção da planta de etileno (Jornal de Microbiologia Industrial e Biotecnologia, outubro de 2007, Volume 34, Edição 10, páginas 635-648).

[000310] No total, 247 dos isolados foram 68 (28%), que tiveram um aumento de crescimento em nitrogênio livre mídia BIG suplementadas com ACC, do que em nitrogênio LGI livre. Destes, apenas 11% tinham atividade muito alta deaminase ACC e estes eram em sua maioria cepas de Achromobacter, Burkholderia e Pseudomonas. Chefe entre estes eram espécies de Burkholderia que realizou ACC deaminase como a sua mais marcante característica em vitro - 94% ou 15 de 16 Burkholderia isola teve atividade ACC deaminase. De Burkholderia isolados, 81% apresentaram forte atividade ACC deaminase, enquanto apenas 42% das espécies Achromobacter (5 de 12 isolados) teve forte atividade ACC deaminase e ao lado foram Pseudomonas onde apenas 5 dos 14 isolados (42%) tiveram forte atividade. Muitos isolados pareciam ter atividade ACC deaminase, bem como, no entanto estes foram todos classificados baixo (como 1) e, portanto, de menor interesse do que os grupos precedentes dos isolados.

Produção de acetoína e diacetila

[000311] O método foi adaptado do Philip et al., (1994) J básica Microbiol. 34: 277-280. (aqui incorporada por referência). 250 ml de caldo submetido à autoclave R2A, suplementado com 0,5% de glucose foi separado em alíquotas para placas de 96 cavidades (# 07-200-700, Fisher). As endófitos bacterianas a partir de uma placa de stock de gli- cerol foram inoculados na placa usando um replicador de 96 pinos esterilizadas à chama, selada com uma membrana respirável, então, incubadas durante 3 dias sem agitação a 28°C. No dia 5, 50 μL/cavidade foi adicionado de fresco misturado de reagentes de Barritt A e B [5 g/L de creatina misturado 3:1 (v/v) com recentemente preparada α-naftol (75 g/L em hidróxido de 2,5 M de sódio) ]. Após 15 minutos, as placas foram marcados para coloração rosa ou vermelho em relação a uma cor de cobre controle negativo (medida como 525 absorção nm em um leitor de placa).

[000312] Um grande número de bactérias originárias de semente mostraram um nível detectável de desenvolvimento de cor rosa ou vermelho (126 de 247; Ver Tabela 3). 70 de 247 isolados tinham forte produção de acetoína ou butanodiol como detectado por este ensaio. Bacillus (13 de 33), Enterobacter (8 ou 16) e Microbacterium (12 de 21) espécies foram os produtores mais intensos de acetoí- na/butanodiol nesta coleção. Além disso, dois dos três isolados de Stenotrophomonas incluídos neste estudo foram também fortes produtores acetoína/butanodiol. Produção de sideroforo

[000313] Para garantir que nenhum contaminante de ferro foi realizada através de experimentos anteriores, a vidraria foi limpa com HCl a 6 M e água, antes da preparo de meios [Cox (1994) Methods Enzymol 235: 315-329, aqui incorporado por referência]. Nesta vidraria limpo, R2A caldo de cultura, que é de ferro limitado, foi preparada e vertida (250 μL/cavidade) em placas de 96 cavidades e então a placa inoculada com bactérias usando um replicador de 96 pinos da placa. Após 3 dias de incubação a 28°C, sem agitação, a cada cavidade foram adicionados 100 μL da preparo de O-CAS sem agente [Perez- Miranda et al gelificação. (2007), J Microbiol 70: 127-131 Métodos, aqui incorporado por referência]. Um litro de reagente O-CAS foi preparado usando o vidraria limpo por mistura de 60,5 mg de cromo azurol S (CAS), 72,9 mg de brometo de hexadecil trimetil amônio (HDT- MA), 30,24 g de finamente trituradas piperazina-1,4-bis-2- ácido eta- nossulfônico (PIPES), com 10 ml de 1 mM de FeCl3 • 6H2O em 10 mM de HCl solvente. Os tubos tinham de ser finamente pulverizada e misturou-se cuidadosamente com agitação (não agitando) para evitar a produção de bolhas, até se obter uma cor azul profunda. 15 minutos após adicionar o reagente a cada cavidade, mudança de cor foi marcado por procurando halos roxo (sideroforos de tipo catecol) ou colônias de laranja (sideroforos de hidroxamato) em relação ao azul profundo do O-CAS.

[000314] Produção de sideroforos por bactérias sobre uma superfície da planta ou dentro de uma planta, tanto pode mostrar que um micróbio está equipado para crescer em um ambiente limitado de nutrientes e talvez proteger o ambiente da planta a partir de invasão por outras, micróbios talvez indesejáveis. Tem-se procurado por dois tipos de si- deroforos que resultam em mudança de cor púrpura (sideroforos de tipo catecol) ou mudança de cor laranja (sideroforos de hidroxamato) após a adição do reagente azul O-Cas para placas de 96 cavidades. Um grande número de bactérias mostrou um nível detectável de mudança de cor em relação ao azul profundo do O-CAS; 80 de 247. Notavelmente, 32 de 247 cepas tiveram forte produção de sideroforos. Curiosamente, fortes produtores de sideroforos incluído um grande número (14) dos 16 isolados de Burkholderia. A maioria dos isolados de Achromobacter (9 de 12) e Pantoea (15 de 26) foram capazes de induzir fraco mudança de cor no material O-CAS.

Atividade de pectinase

[000315] Iodo reage com pectina para formar um complexo de cor azul escuro, deixando halos claros, como prova da atividade da enzima extracelular. Adaptando um protocolo anterior, [Soares et al. (1999) Microbiol Rev de 30: 299-303, aqui incorporado por referência] a 0,2% (peso/v) de pectina cítrica (# 76280, Sigma) e Triton X-100 a 0,1% foram adicionadas aos meios R2A, submetido à autoclave e vertido so- bre 150 mm placas. As bactérias foram inoculadas usando um replica- dor de placa com 96 pinos. Após 3 dias de cultura no escuro a 25πC, atividade de pectinase foi visualizado ao inundar a placa com iodo de Gram. As colônias positivas foram rodeados por halos claros. Nesse estudo, um grande número, cerca de 83 dos 247 isolados, tiveram ati- vidade pectinase detectável e 21 destes isolados tiveram de moderados a fortes resultados visualizados como médias e grandes halos - causados por difusão copiosa de enzima longe das bactérias. Atividade de Celulase

[000316] Iodo reage com a celulose para formar um complexo casta- nho/azul de cor escura, deixando halos claros, como prova da atividade da enzima extracelular. Adaptando um protocolo anterior, [Kasana et al. (2008), Curr Microbiol 57: 503-507, aqui incorporado por referência] de 0,2% de carbóxi metil celulose (CMC), sal de sódio (# C5678, Sigma) e Triton X-100 a 0,1% foram adicionados a uma variante de amido livre de meios de R2A, submetido à autoclave e vertido em placas de 150 mm. As bactérias foram inoculadas usando um replicador de placa com 96 pinos. Após 3 dias de cultura no escuro a 25πC, atividade de celulose foi visualizado ao inundar a placa com iodo de Gram. As colônias positivas foram rodeados por halos claros.

[000317] Nesse estudo, um grande número, cerca de 83 dos 247 isolados, tiveram atividade celulose detectável e 21 destes isolados tiveram de moderados a fortes resultados visualizados como médias e grandes halos - causados por difusão copiosa de enzima longe das bactérias. Antibiose

[000318] Resumidamente, as colônias de qualquer DH5a de E. coli (testador bacteriana) ou a cepa de levedura Saccharomyces cerevisiae AH109 (testador fúngica) foram ressuspensas em 1 ml de caldo de R2A para um OD600 de 0,2 e 40 μL desta foi misturado com 40 mL de ágar R2A quentes para despejar um único prato retangular Petri. Semente derivado bactérias foram inoculadas em placas usando uma chama esterilizado de 96 pinos replicador placa, incubadas durante 3 dias a 28πC. Antibiose foi marcada pela observação halos claros ao redor colônias endofíticos.

[000319] Um total de 59 e 72 isolados apresentaram antibiose atividade contra E. coli ou levedura, respectivamente (Tabela 3). Produção de antibióticos por bactérias em uma superfície de planta ou dentro de uma planta pode tanto mostrar que um micróbio é ecologicamente agressivo (um sobrevivente) e isso pode significar que ele pode ajudar a proteger a planta contra patógenos. Curiosamente, três grupos de bactérias, bacilos, Enterobacter e Burkholderia ambos tinham uma grande proporção dos isolados (até 45%, 50% e 88%, respectivamente) que foram inibir o crescimento de E. coli e levedura, sugestivo de um mecanismo comum de antiobiose tais como a produção e secreção de um antibiótico de largo espectro. Como antibiose foram detectados efeitos sobre as mesmas 14 cepas de Burkholderia que produziram sideroforos, antibiose mediada Burkholderia pode ter sido causado por estar localizada inanição ferro, inibindo o crescimento tanto em levedura como de E. coli. Um grande número de Ochrobacterum isolados também teve antagonismo para com o crescimento do fermento. Exemplo 4 - Estabelecimento e persistência de endófito de semente em milho e trigo

[000320] Endófitos de sementes colonizar tecidos vegetais e como parte de seu ciclo de vida podem criar raízes dentro e dispersar siste- micamente em todo o sistema vascular da planta e colonizar caules, folhas, flores e sementes. De modo a rastrear o destino de cepas individuais são marcadas com um marcador, tais como proteínas fluorescentes verdes (GFP) codificados em um plasmídeo de cópia múltiplas. A cepa foi transformada com o plasmídeo que codifica para a expressão de GFP, que pode ser detectada por citometria de fluxo com excitação com um laser azul a 488 nm e a emissão de luz a 530 nm ou microscopia de fluorescência. A cepa transformada fica fluorescente verde e, portanto, pode ser facilmente discriminados da comunidade microbiana nativa como fluorescência verde indígena não ocorre no endófitos de sementes ou espécies microbianas associadas à rizosfera ou solos. As sementes são inoculados com tais bactérias que colonizam a germinação da semente, permitindo o estabelecimento, detecção e contagem da cepa marcada com GFP em tecidos específicos, tais como raízes, caules e flores como as plantas crescem e amadurecem. Através do ciclo de vida da planta e estágio reprodutivo dos tecidos pode ser analisada para a presença da GFP marcado originário de semente endófito. Isto demonstra que a capacidade das bactérias para colonizar e persistir em tecidos de plantas vegetativas, para além de sementes e superfícies interiores em que foi originalmente inoculadas. Endófitos semente vai ser capaz de se propagar fora da semente e deve ser restabelecida em sementes de colonizar novas gerações de plantas.

[000321] Uma cepa de Pantoea representando OTU # 7 e uma Ente- robacter representando OTU # 56 foram eletroporadas com sucesso com a ampla grama de acolhimento negativo plasmídeo faixa, pDSK- GFPuv [Wang et al. (2007), New Phytol 174 (1): 212-23, aqui incorporado por referência]. Esta é uma cópia baixo plasmídeo, a expressão constitutiva de condução muito brilhante GFP fluorescente sob luz UV, além um gene de resistência a canamicina, que expressa constitutivamente pode permitir a seleção de encontro ao fundo, micróbios não marcadas inerentes em amostras de plantas. Estas bactérias pDSK- GFPuv transformadas foram crescidas durante a noite em um volume de 10 ml de TSB a 50% e no dia seguinte, as CFU foram contadas por diluição em série e plaqueamento em placas de TSA 50%. Neste momento, 10 g de 58PM36 semente (rio azul milho híbrido) em um tubo de 50 ml estéril foi inundado com uma mistura de 10 μL de polímero Flo Rite 1706 e 500 μL do plasmídeo GFP contendo OTU # 7 ou OTU # 56 bactérias em caldo de R2A. Após agitação vigorosa para assegurar mesmo o revestimento de sementes com as bactérias, os tubos foram selados e deixados em 25πC durante 7 dias, altura em que as CFU de bactérias ainda sobreviventes sobre as sementes foram avaliadas por carboneto de batimento grânulo com uma máquina Fas- tprep24 durante 60 segundos a 5 m/segundo. Cada tubo Falcon de 15 ml continha 3, 2 sementes grânulos e 1 ml de caldo estéril R2A no. Após agitação, 20 μL do sobrenadante foi então diluída em série e 50 μL de 10X a diluída e 50 μL do 1000X diluído em metades de 50% placas de TSA. Dois de cada tipo de semente, incluindo tratada, OTU # 7- GFP e OTU # 56-GFP sementes inoculadas foram então plantadas 3 cm de profundidade em 70% de etanol panelas limpas contendo calor esterilizado areia de quartzo e regada diariamente com água durante 7 dias como mudas desenvolvido. Neste tempo, as plantas foram removidas e agitou-se livre de areia, cortada em raízes ou rebentos, pesados, colocados em tubos de 15 ml Falcon juntamente com dois grânulos de carboneto e ou 1 mL de 50% TSB para rebentos ou 2 ml de 50% TSB para raízes. Estes foram, então, homogeneizada por agitação no Fastprep24 durante 120 segundos para 5M/segundo. 20 μL de caules e raízes homogeneizados foram então diluídos em série e 50 μL de 10X a diluída e 50 μL do 1000X diluído em metades de 50% placas de TSA. Sementes não inoculadas foram semeadas em placas de TSA antibiótico livre, mas OTU # 7-GFP e OTU # 56-GFP extratos de plantas foram colocadas em placas de TSA contendo 50 μg/ml de ca- namicina. Ver a Figura 1B para um exemplo das duas cepas GFP fluorescente em canamicina contendo placas de TSA.

[000322] Com base na contagem de colônias de diluições em série, OTU # 7-GFP inoculo era a um nível de 2.74x109 CFU/ml (aproximadamente 5.08x107 CFU/semente), quando aplicado a sementes e após 7 dias a temperatura ambiente, cada semente ainda tinha cerca de 4,44 CFU X105 por semente. Após 7 dias de crescimento em uma estufa exposta à variação de luz, calor, umidade e atmosfera, OTU Número 7-GFP sementes inoculadas desenvolvido em uma das mudas com uma média de 1.24x106 CFU/g de tecido de raiz e 7.93x105CFU/g de filmagem tecido. Assim, após o plantio de sementes com aproximadamente 4.44x105 CFU de OTU # 7-GFP cada um, mudas germinaram e cresceram em mudas contendo uma média de 1.02x106 CFU GFP bactérias marcadas. Isto representa um aumento de cerca de três vezes do número de bactérias e sugere crescimento ativo e colonização destas bactérias na planta, em vez de sobrevivência passiva durante uma semana até ao momento da colheita.

[000323] OTU # 56-GFP inóculo foi a um nível de 1.69x109 CFU/ml (aproximadamente 3.13x107 CFU/semente) quando aplicada a sementes e 7 dias mais tarde cada semente ainda tinha cerca de 2.21x106 CFU vivem em sua superfície. Após 7 dias de crescimento em uma estufa exposta à variação de luz, calor, umidade e atmosfera, OTU # 56-GFP sementes inoculadas desenvolvidas em mudas com uma média de 4.71x106 CFU/g de tecido de raiz e 2.03x104 CFU/g de filmagem tecido. Assim, após o plantio de sementes com aproximadamente 2.21x106 CFU de OTU # 7-GFP cada um, mudas germinaram e cresceram em mudas contendo uma média de 6.06x105 CFU GFP bactérias marcadas.

[000324] Tomados em conjunto, estes dois experimentos mostraram com sucesso que as sementes derivados endófitos são capazes de sobreviver em uma superfície de sementes de milho em grandes números em casa de vegetação não estéreis por pelo menos uma semana e são capazes de colonizar e persistem na planta desenvolver ao longo do tempo em que eles terão oportunidades em curso para influenciar e melhorar o crescimento das plantas, saúde e produtividade. Exemplo 5 - Colonização de plantas gramíneas

[000325] O estabelecimento de interações planta-micróbio é contingente em estreita proximidade. O microbioma da planta hospedeira é composto de micro-organismos no interior dos tecidos, bem como aqueles que vivem sobre a superfície e em torno rizosfera. A presente invenção descreve, entre outros métodos, a colonização da planta por aplicação de micróbios endofíticos de superfície da semente. Os experimentos descritos nesta seção são destinados a confirmar colonização bem sucedida de plantas por bactérias por endófitos recuperação direta de colônias viáveis a partir de vários tecidos da planta inoculada. Os experimentos foram concebidos para reduzir os micróbios fundo através do uso de sementes cuja superfície foi esterilizada e plantar as sementes e crescer em um ambiente estéril, para melhorar a colonização observáveis da planta inoculada com a bactéria. Descrição Experimental

[000326] Sementes de milho de cultivar 58PM36 (rio azul híbrido) foram superfície-esterilização por exposição ao cloro gás durante a noite, usando os métodos descritos em outra parte. Sementes estéreis foram então inoculados com submersa em 0,5 OD culturas durante a noite [caldo de soja tríptico] de cepas SYM00254 (Micrococcus sp., OTU 59), SYM00284 (Pantoea sp., OTU 0), SYM00290 (Actinobacter, OTU 154) ou SYM00292 (Paenibacillus sp., OTU 6) e deixou-se secar ao ar com brevidade. As sementes foram depois colocadas em tubos cheios parcialmente com uma areia-vermiculita estéril mistura [(1: 1 p/p)] e cobertas com uma polegada da mistura, regadas com água estéril, selada e incubadas em uma estufa durante 7 dias. Após este período de incubação, os vários tecidos das plantas cultivadas foram coletados e usados como dadores para isolar as bactérias por colocação secção de tecido em um homogeneizador [TSB 20%] e a mistura mecânica. A lama foi, então, diluídos em série em passos de 10 vezes a diluições 10-3 e 10-3 1 a foram semeadas em placas de TSA 20% (1,3% de ágar). As placas foram incubadas durante a noite e as fotografias foram tiradas das placas resultantes, bem como as contagens de colônias de CFU. Resultados Experimentais

[000327] Inoculação bem sucedida de plantas de milho por os endófi- tos bacterianos permitiu a recuperação de, células viáveis, como identificado em placas de ágar TSA. Controles experimentos usando não inoculadas, superfície esterilizada sementes foram realizados e mostraram poucos, se algum, as células bacterianas foram cultiváveisl do interior sugerindo inoculação com micróbios extras seria facilmente detectável por cultura. Não superfície sementes esterilizadas entretanto mostrou uma grande diversidade de tipos de colônias, incluindo bactérias e fungos que afogado o de detecção por cultura de bactérias inoculadas e as plantas crescidas a partir de sementes cuja superfície foi esterilizada demonstrou uma dominância das cepas inoculadas prontamente identificados pela morfologia de colônia.

[000328] Finalmente, quantidades significativas de colônias viáveis foram recuperados a partir de raízes, rebentos ou sementes de plantas de milho inoculados com SYM00254, SYM00284, SYM00290 ou SYM00292 (Tabela 10, Figura 1A), confirmando a colonização bem sucedida destes tecidos de plantas de milho inoculados com o várias cepas. Os micróbios que vivem sobre a superfície da semente pode ser eliminada por esterilização da superfície, como foi feito aqui. A eliminação deste fundo permite a quantificação das células de interesse. Tabela 10. Colonização confirmada de cepas originárias de semente em broto e tecido de raiz de milho em 7 dias após inoculação das sementes

+ - <104 células por tipo de tecido, ++ - 104 a 106 células por tipo de tecido; +++ - >106 células por tipo de tecido Exemplo 6 - Teste de populações de endófitos bacterianos originários de semente em plantas

[000329] Os resultados apresentados acima demonstram que muitas dos endófitos bacterianos descritos aqui possuem atividades que poderiam conferem características benéficas de uma planta sobre a colonização. Em primeiro lugar, muitas das bactérias descritas aqui são capazes de produzir os compostos que poderiam ser benéficos para a planta, tal como detectado usando os ensaios in vitro descritos acima. Além disso, várias bactérias representativos foram testados e verificou-se colonizar com sucesso plantas de milho como demonstrado no exemplo acima. O objetivo dos experimentos na presente secção aborda a capacidade de as endófitos bacterianas para conferir características benéficas de uma planta hospedeira. Vários métodos diferentes foram usadas para verificar este. Primeiro, as plantas foram inoculadas com bactérias testadas sob condições sem qualquer esforço para determinar se o micróbio confere um aumento em vigor. Em segundo lugar, as plantas inoculadas com endófitos foram testados sob condições de estresse específicos (por exemplo, estresse por sal, estresse térmico, estresse seca e combinações dos mesmos) para testar se as bactérias conferir um aumento na tolerância a esses estresses. Estes testes de crescimento foram realizados usando-se três meios diferentes: usando ensaios de crescimento em placas de ágar-água; usando ensaios de crescimento sobre papéis de filtro esterilizados; e ensaios de crescimento em caixas de magenta. Descrição Experimental

[000330] Superfície de esterilização de sementes - tratamento das sementes de milho orgânico (híbridos Blue River, 40R73) e sementes de trigo (Briggs, desenvolvido pelo South Dakota University) foram esterilizadas durante a noite com cloro gasoso como se segue: 200 g de sementes foram pesadas e colocadas em um copo de 250 mL garrafa. A garrafa aberta e o seu tampão foram colocados em um jarro secador. Um copo contendo 100 mL de lixívia comercial (hipoclorito de sódio a 8,25%) foi colocado no frasco secador. Imediatamente antes de selar o frasco, 3 mL de ácido clorídrico concentrado (34-37,5%) foi cuidadosamente adicionado. A esterilização foi deixada prosseguir durante 18-24 h. Após a esterilização, a garrafa foi fechada com a sua tampa esterilizada e reaberto em uma câmara de fluxo estéril. A garrafa foi deixada aberta na capa estéril por algumas horas para arejar as sementes e restos de remover o cloro gás. O frasco foi então fechado e as sementes armazenadas em temperatura ambiente na escuridão até o seu uso. Avaliação de vigor da muda sob condições normais e estresse em ágar com água

[000331] Endófitos bacterianos isoladas a partir de sementes, conforme descrito aqui foram testados quanto à sua capacidade de promover o crescimento das plantas sob condições normais e de estresse através da inoculação de sementes de milho e de trigo com esses en- dófitos e germinando em ágar de água. Para cada endófito bacteriano testado, 5 mL de meio de R2A líquido foi inoculada com uma única colônia e a cultura crescida a temperatura ambiente em um agitador a uma OD (600 nm) de entre 0,8 e 1,2.

[000332] Sementes de milho e trigo esterilizadas foram colocadas em placas de ágar de água (1,3% de ágar Bacto) em uma câmara de fluxo laminar, usando fórceps previamente inflamadas. Uma gota de inóculo, com um diâmetro externo compreendido entre 0,8 e 1,2 (correspondendo a cerca de 108 CFU/ml) foi colocada em cada semente (50 μL de milho, 30 μL de trigo, o que representa cerca de 5.106 e 3.106 CFU para o milho e trigo, respectivamente). Para cada tratamento, 3 placas foram preparadas com 12 sementes cada, dispostas como mostra na Figura 2 para assegurar a uniformidade posição. As placas foram seladas com fita adesiva cirúrgica, ao acaso, para evitar os efeitos da posição e colocadas em um conjunto câmara de crescimento a 22°C, 60% de umidade relativa, no escuro durante quatro dias. Depois de quatro dias, uma imagem de cada placa foi feita e o comprimento de raiz de cada muda foi medido usando o software de formação de imagem ImageJ. A diferença percentual entre as plantas tratadas e o (controle) R2A simuladamente tratados então calculado. Para o crescimento sob estresse por sal, as placas de ágar água foram suplementadas com NaCl 100. Para crescimento sob estresse de calor, as placas foram colocadas a 40°C, 60% de umidade, após dois dias de crescimento e deixado durante mais dois dias. Ensaios de vigor da muda sob condições normais e condições de estresse em papel de filtro

[000333] Os papéis filtro foram submetidos a autoclaves e colocados em placas de Petri, e, então, pré-embebidos com soluções de tratamento. Para simular condições normais, 3-4 mL de água esterilizada foi adicionada aos filtros. As cepas secas e solução salina, foram estimuladas pela adição de 8% 3-4mL solução de PEG 6000 ou 50 ou 100 mM de NaCl para os papéis de filtro. Sementes esterilizadas de superfície foram incubadas em inóculos bacterianos durante pelo menos uma hora antes do plaqueamento. Nove sementes foram colocadas em placas em triplicado para cada uma das condições testadas, incluindo a temperatura ambiente e estresse térmico (40°C) para ambas as condições normais e de solução salina. Durante as fases iniciais do experimento, as placas foram seladas com parafilme para inibir a perda de água por evaporação e secagem prematura dos papéis de filtro. As placas foram incubadas no escuro a temperatura ambiente durante dois dias após o que as placas de tratamento térmico foram mudadas para 40°C durante 4-6 dias. O parafilme foi removido de todas as placas após 3-5 dias. Depois de 5-8 dias, as mudas foram marcados por medir manualmente comprimento de raiz para o comprimento de milho e trigo para filmagem e gravação a massa de mudas agrupados de repetições individuais. Resultados experimentais

[000334] O vigor das plantas e melhora da resistência ao estresse são importantes componentes da aptidão para fornecer uma planta em um ambiente agrícola. Estes podem ser medidos em testes de germinação para testar a melhora no fenótipo da planta como conferida por inoculação microbiana. A recolha de endófitos originários de semente produziu uma resposta mensurável em milho (Tabelas 4A e 4B) e trigo (Tabela 5a e Tabela 5b) quando inoculados comparado com os controles não inoculados. Por exemplo, a partir de 48 cepas de bactérias, o que representa 44 OTUs testadas nestes ensaios de germinação, apenas 2 não produziu um fenótipo favorável em qualquer dos vários parâmetros medidos, tais como o comprimento das raízes, peso, comprimento ou filmar em trigo. Isto sugere que as cepas desempenhar um papel íntimo modular e melhorar vigor da planta, conferindo resistência a estresse da planta hospedeira. No trigo sob condições normais (vigor), 73% das cepas testadas mostrou algum nível de efeito e 43% uma forte resposta da planta sugerindo as fisiologias e ecológicos nichos da coleção cepa pode ser associado a um papel planta benéfica. As respostas de estresse na coleção de cepas pode ser visto pela capacidade de um subgrupo para conferir uma resposta benéfica sob diferentes condições, tais como calor e sal e seca. Estes podem ser aplicáveis a produtos para terras áridas e marginais. Em uma grande parte dos casos, para as cepas testadas, o efeito benéfico foi mensurável em ambas as culturas, indicando que as cepas são capazes de colonizar várias variedades e espécies de plantas. Isto pode desempenhar um papel nos seus mecanismos de dispersão e colonização a partir de uma semente em uma planta madura mas também como par te do ciclo de vida para estabelecer um intervalo amplo de distribuição e persistência ecológico na natureza. Isso pode se traduzir também em aspectos relevantes na agricultura. Para as respostas da seca no milho, verificou-se que 73% das cepas foram melhorando no ensaio de papel de filtro, medida pelo comprimento das raízes e peso. Em alguns casos, foi possível observar efeitos aditivos para comparar respostas de estresse de calor, o sal e a combinação de calor e de sal, no mesmo ensaio, no entanto, nem sempre a um benefício cumulativo. Por vigor no milho 81% das cepas mostraram melhoras quando testado em papel de filtro ou de ágar água ensaios.

[000335] Os fenótipos conferidos pela inoculação e melhora no desenvolvimento da planta são visíveis ao comparar, por exemplo, o comprimento das raízes, comprimento do broto e peso das mudas com os controles não inoculados, conforme ilustrado pelas Figuras 3, 4, 5 e 6.

[000336] Os ensaios de resposta ao estresse para o milho mostraram, em média, que 57% das cepas aumentaram o peso, em relação ao controle, sob condições de calor e sal, 51% para calor-sal e 40% para estiagem. Para o trigo, sob condições de sal de 54% das cepas produziram um efeito sobre o comprimento das raízes, 77% das cepas um efeito sobre o comprimento da parte aérea e 50% sobre o ganho de peso. Testes de estiagem foram classificados pelo comprimento da parte aérea e peso, com 59% das cepas

[000337] Tabela 4. Avaliação sistemática dos efeitos dos micróbios originários de semente sobre o vigor de sementes de milho sob condições normais e estresse. Legenda: "-" indica que não há aumento significativo em relação ao controle não inoculado; "1" = aumento de 05% em relação ao controle não inoculado; "2" = aumento de 5-10% em relação ao controle não inoculado; "3" => aumento de 10% em relação ao controle não inoculado. Tabela 4(a). Ensaio de vigor de mudas sob condições de ágar em água

Tabela 4(b). Ensaio de vigor de mudas em papel filtro

Tabela 5. Ensaio de estresse/vigor em trigo Tabela 5(a). Avaliação de vigor de mudas de trigo usando o ensaio de ágar em água. Legenda: "-" indica que não há aumento significativo em relação ao controle não inoculado; "1" = aumento 0-5% em relação ao controle não inoculado; "2" = aumento de 5-10% em rela- ção ao controle não inoculado; "3" => aumento de 10% em relação ao controle não inoculado

Tabela 5(b). Vigor de mudas de trigo usando o ensaio com papel filtro. Legenda: "-" indica que não há aumento em relação ao controle não inoculado; "1" = aumento de 0-5%; "2" = aumento de 5-10%; ="3" => aumento de 10% em relação ao controle não inoculado

Teste de crescimento de plantas inoculadas em caixas Magenta

[000338] Endófitos representativos isolados de sementes conforme descrito aqui foram testados quanto à sua capacidade de promover o crescimento das plantas sob condições normais através de inoculação de sementes de milho com estes endófitos e cultura das mesmas dentro de câmaras de crescimento Conviron (Conviron Corp., Asheville, NC) em caixas Magenta com nível duplo essencialmente conforme descrito em Rodrigues et al. ISME Journal (2008) 2, 404-416, o qual é aqui incorporado por referência na íntegra. Resumidamente, os dois níveis foram feitos perfurando um orifício de 8 mm de diâmetro no centro de um vaso de cultura de plantas GA-7 (caixas Magenta, Sigma, St. Louis), tampando em cima e passando um cordão de algodão com um comprimento 14 cm para a câmara inferior para atuar como uma mecha e adicionando uma quantidade definida de areia Playground na câmara superior. Solução nutriente para plantas de Peter a 20:20:20 (Peters Fertilizer Co., Fogelsville, PA) é adicionada à câmara inferior e uma tampa hermética é adicionada por cima e todo o sistema é submetido à autoclave e esterilizado antes de plantio com as sementes não inoculadas ou tratadas com endófito.

[000339] A superfície de sementes de milho foi esterilizada com gás cloro, conforme descrito aqui. Sementes de milho esterilizadas foram embebidas durante uma hora sobre a cultura bacteriana apropriada antes de plantio. Cada cultura bacteriana foi cultivada em uma incubadora com agitação a 20% de caldo de soja tríptico (TSB) até atingir uma densidade óptica de ~ 0,5, medida em um comprimento de onda de 600 nm. Controles não inoculados foram embebidos em TSB estéril a 20%. Três sementes foram plantadas em cada caixa Magenta de nível duplo e três caixas foram usadas por tratamento (bactérias endo- fíticas x condição ambiental). Os dois níveis foram colocados dentro de uma câmara de crescimento Conviron com uma configuração de 60% de umidade e mantidos no escuro durante quatro dias até começarem a germinar. Após germinação, as plantas foram cultivadas em um ciclo de luz (~ 400 mE x m-2 x s-1) durante 14 horas e escuro durante 10 horas. Quando as folhas estavam totalmente expandidas, aproximadamente 8 dias após o plantio, as plantas foram atribuídas a uma de três câmaras cujas condições eram as seguintes: para condições de controle, as plantas foram mantidas a 22°C; para o frio, as plantas foram mantidas a 5°C durante a parte clara do ciclo diário e próximo de zero graus durante a parte escura; para estiagem, as plantas foram mantidas na câmara de controle, mas o líquido da parte inferior do nível duplo foi esvaziada e o solo foi deixado secar; para as condições de calor, a intensidade da luz foi ajustada para um máximo de 600 mE x m-2 x s-1, enquanto que a temperatura era ajustada para 40°C durante 12 horas das 14 horas de luz e 45 graus durante duas horas ao meio-dia, durante o ciclo escuro a temperatura foi ajustada para 30°C. A umidade do ar foi mantida a 60% em todas as câmaras. As condições foram mantidas durante uma semana, ao final da qual a condutância foi medida usando um SC-1 Leaf Porometer (Decagon Devices Inc., Pullman, Washington) nas plantas mantidas sob condições de controle e estiagem e todas as plantas foram colhidas, fotografadas e secas em um forno de convenção a 45°C para estimar a biomassa seca. Os comprimentos de broto e raiz foram medidos digitalmente usando o software ImageJ versão 1.48u4 (Rasband http://imagej.nih.gov).

[000340] As medições médias foram comparadas com aquelas para plantas não inoculadas para cada tratamento. Os resultados obtidos com o ensaio de ágar em água são resumidos na Tabela 7. Vários en- dófitos bacterianos conferiram melhora significativa para o crescimento das plantas sob condições normais e/ou sob condições de estresse ao milho. Notavelmente, a cepa SYM90 conferiu melhora de crescimento sob condições normais, de estiagem e frio, principalmente na forma de aumento no comprimento das raízes. As cepas SYM00183, SYM00015, SYM00167 e SYM00168 também aumentaram o comprimento das raízes sob condições de seca em relação ao controle sem inoculação. Quase todos os endófitos bacterianos testados conferiram um aumento no ganho de biomassa sob condições de frio. A magnitude da diferença entre a condutância sob condições normais e condições de estiagem foi significativamente maior nas plantas inoculadas com SYM231 em relação aos controles não inoculados, sugerindo um melhor equilíbrio de água potencialmente associado ao fechamento de estomas.

[000341] Tabela 7. Resumo dos resultados de testes de combinações sintéticas de endófitos originários de semente em milho em testes de crescimento de plantas em caixas Magenta. Legenda: "-" indica que não há aumento significativo em relação ao controle não inoculado; "1" = aumento de 0-5% em relação ao controle não inoculado; "2" = aumento de 5-10% em relação ao controle não inoculado; "3" => aumento de 10% em relação ao controle não inoculado.

Resposta à Dose

[000342] Os experimentos iniciais descritos acima foram conduzidos para determinar se o micróbio conferia traços benéficos à planta colonizada. Em seguida, procurou-se determinar a quantidade do micróbio que era eficaz para conferir qualquer benefício. Neste exemplo, as culturas microbianas selecionadas foram diluídas para OD600 de 1,0, 0,1 e 0,01 (cerca de 108, 107, 106 CFU/ml, respectivamente) e aplicadas a sementes de trigo (Briggs) usando o ensaio de ágar em água anteriormente descrito.

[000343] As culturas de SYM00011, SYM00033 e SYM00057B foram cultivadas a partir de uma colônia isolada em 5 ml de meio R2A líquido em temperatura ambiente em um agitador até a fase estacionária. A ab- sorbância a 600 nm foi medida e ajustada para uma OD600 de 1,0 (~ 108 CFU/ml) em meio R2A. Duas diluições adicionais em OD 0,1 e 0,01 (~ 107 e 106 CFU/ml, respectivamente) foram preparadas por meio de diluição do inóculo inicial 10 e 100 vezes, novamente em meio R2A.

[000344] Sementes de trigo (Briggs) foram esterilizadas durante a noite com gás cloro e colocadas em placas de ágar com água, conforme descrito acima. Uma gota de 30 μL de inóculo foi colocada sobre cada semente, o que representa aproximadamente 3,0 x 106, 3,0 x 105 e 3,0 x 104 CFUs por semente para OD1, OD0,1 e OD0,01 de inóculo, respectivamente. Para cada tratamento, foram preparadas 3 placas com 12 sementes cada. As placas foram seladas com fita adesiva cirúrgica, randomizadas para evitar os efeitos da posição e colocadas em uma câmara de crescimento regulada 22°C, 60% de umidade relativa, no escuro durante quatro dias. Após quatro dias, uma imagem de cada placa foi feita e o comprimento das raízes de cada muda foi medido usando o software de formação de imagem ImageJ (NIH). A diferença percentual entre as plantas tratadas e aquelas simuladamente tratadas (controle com R2A) foi, então, calculada.

[000345] Todas as doses de micróbios em uma concentração diferente conferiram um aumento no comprimento das raízes em relação aos controles simuladamente tratados, conforme mostrado na Figura 7. A dose ideal de micróbios para conferir um benefício de crescimento para o trigo variava para SYM00011, SYM00033 e SYM00057B. Para SYM00011, observou-se uma correlação positiva entre a concentração bacteriana do inóculo e os benefícios de crescimento atribuídos à planta, com ~ 3,0 x 106 CFU/semente (30 μL de OD600 de 1,0) sendo a quantidade bacteriana mais eficaz, com um aumento de 35% no crescimento. Para SYM00057B, as plantas tratadas com as três doses tinham comprimentos de raiz similares, com o inóculo mais concentrado (3 x 104 CFU/semente) sendo a quantidade mais eficaz, sugerindo saturação em uma menor concentração. Similarmente, todas as três concentrações de SYM00033 conferiram benefícios similares, também sugerindo saturação a 3 x 104 CFU/semente. Inoculação com combinações de cepas

[000346] Espécies microbianas que colonizam habitats, tais como os micróbios endofíticos originários de semente descritos aqui, são capazes de interagir com outros micróbios, bem como com o hospedeiro, em troca de carbono, energia e outros metabólitos. O fluxo de elétrons e metabolismo podem envolver múltiplas espécies para transferência completa, o que apoiaria o estabelecimento de comunidades ou conjuntos sinérgicos. Em certos casos, o efeito benéfico de um único inó- culo microbiano originário de sementes pode ser aumentado pela pre- sença de uma segunda cepa sinérgica que favorece o estabelecimento e persistência do agrupamento binário e sua competência. Para criar conjuntos ou combinações de cepas disponíveis em uma coleção, várias abordagens foram seguidas, incluindo:

[000347] Cepas com funcionalidades similares ou diferentes identificadas por testagem in vitro. Atividades de promoção de crescimento de planta abrangem múltiplos mecanismos microbianos que afetam a fisiologia da planta. Estes atributos microbianos podem ser testados in vitro, tal como a produção de auxina, produção de glicosil-hidrolases (tais como atividade de xilanase, celulase, pectinase e quitinase, de- saminase ACC), solubilização de fosfato mineral, produção de sidero- foros, fixação de nitrogênio e antibiose contra patógenos, dentre outros. Ao combinar cepas com funcionalidades similares ou diferentes, os benefícios para as plantas são melhorados comparado com os membros individuais.

[000348] Combinações com base na origem ou co-ocorrência da cepa. Com base em seu isolamento a partir da mesma semente, duas cepas podem formar um conjunto microbiano eficiente que pode ser fornecido de forma heteróloga a novos hospedeiros.

[000349] Cepas com vigor de germinação e/ou resistência ao estresse resiliência demonstrados. Ensaios de germinação de mudas permitem testar o desenvolvimento inicial da planta, estabelecimento dos endófi- tos de sementes na planta e efeito benéfico quantificável sobre o comprimento da raiz, peso ou comprimento do broto, comparado com controles não inoculados e as mesmas cepas inoculadas individualmente.

[000350] Cepas isoladas de diferentes hospedeiros que podem trabalhar em sinergia. Foram isolados endófitos originários de semente de vários hospedeiros vegetais. Os membros deste grupo são capazes de mostrar efeitos benéficos sobre as plantas inoculadas quando combinados, comparado com seus efeitos individuais.

[000351] Um membro de 3 e um membro de 4. Endófitos de semente que mostraram maior vigor e resistência ao estresse da planta são combinados com novas cepas endofíticas de sementes e sua interação sinérgica amplifica as respostas individuais.

[000352] Estas combinações foram testadas com a coleção de endó- fitos de sementes que representam as 44 OTUs em ensaios de vigor e resistência ao estresse de milho (Tabela 6a) e trigo (Tabela 6b).

[000353] Tabela 6. Avaliação dos efeitos da criação de combinações sintéticas de vários endófitos originários de semente com sementes.

[000354] Tabela 6(a). Avaliação de vigor de mudas de milho usando o ensaio de papel de filtro. Legenda: "-" indica que não há aumento significativo em relação ao controle não inoculado; "1" = aumento de 05% em relação ao controle não inoculado; "2" = aumento de 5-10% em relação ao controle não inoculado; "3" => aumento de 10% em relação ao controle não inoculado

Tabela 6(b). Avaliação de vigor de mudas de trigo usando o ensaio de papel de filtro. Legenda: "-" indica que não há aumento significativo em relação ao controle não inoculado; "1" = aumento de 0-5% em relação ao controle não inoculado; "2" = aumento de 5-10% em relação ao controle não inoculado; "3" => aumento de 10% em relação ao controle não inoculado

[000355] Um total de 50 combinações binárias de cepas foi testado quanto ao vigor e resistência ao estresse para calor, sal, calor-sal ou estiagem e classificadas quanto ao vigor e/ou resistência ao estresse aprimorados. Foi observado um aumento visível no comprimento do ramo para o trigo quando os binários foram emparelhados com base em sua origem de sementes para isolamento e também com base na seleção a partir dos ensaios de vigor e resistência ao estresse, sugerindo que efeitos aditivos podem ser observados, comparado com o efeito de cepas individuais. Outra resposta interessante foi observada para o milho, quando inoculado com o binário formado por SYM00090 relacionado a Chryseobacterium, um membro representativo da OTU 62, e SYM00231 relacionado a Sphingobium, um membro representativo da OTU 46, conferiu proteção contra estresse pelo calor-sal no milho e vigor em trigo, conforme medido para o comprimento de raiz em ambos os ensaios. Outras combinações com cepas que se baseavam na produção de auxina para as cepas SYM00011, SYM00017c, SYM00033, SYM00049, SYM00002, SYM00062b, SYM00172 e SYM00231 emparelhadas com a cepa celulolítica e pectinolítica SYM00050 mostraram um aumento na resistência ao estresse pelo calor-sal, comparado com o mesmo conjunto de linhagens produtoras de auxina emparelhadas com SYM00046, onde o estresse pela estiagem foi aumentado, comparado com o conjunto anterior. O aumento de resistência à estiagem observado em fenótipos de mudas de trigo quando comparado com os controles é o resultado da resposta das plantas à inoculação e mecanismos moleculares à interação entre a planta e as bactérias. Um exemplo é a regulação positiva da proteína esterase de pectina em plantas inoculadas e o reconhecimento de que desta proteína em proteção contra estiagem em plantas. Além disso, as combinações de 4 cepas SYM00017b, SYM00049, SYM00057b e SYM00188 em milho aumentou dramaticamente a produção do hormônio vegetal ácido abscísi- co comparado com cepas individuais, indicando um efeito mais benéfico ao nível molecular com os conjuntos. Exemplo 7 - Análise de proteômica de plantas inoculadas

[000356] Conforme mostrado em alguns dos exemplos anteriores, os micróbios endofíticos descritos aqui são capazes de conferir características benéficas significativas à planta agrícola inoculada. De modo a explorar as vias aumentadas ou de outra forma modificadas pelos en- dófitos, foi realizada análise proteômica em extratos de plantas de trigo e milho cultivadas em ágar com água. Sementes de trigo e milho esterilizadas foram simuladamente inoculadas com meio R2A ou inoculadas com endófitos SYM00011, SYM00016, SYM00057B, SYM00218 selecionados usando as condições descritas anteriormente. As sementes foram submetidas aos parâmetros de crescimento, conforme resumido abaixo.

Coleta de amostra

[000357] Após 4 dias de crescimento, 12 plantas inteiras (incluindo raízes, sementes e hipocótilos) por tratamento foram coletadas em um tubo Falcon de 50 mL usando uma pinça estéril e imediatamente congeladas em nitrogênio líquido para minimizar a degradação de proteínas e alterações proteômicas durante a coleta de amostra (tais como respostas a feridas usando a pinça). As amostras congeladas foram, então, homogeneizadas usando um pilão e um almofariz previamente resfriados em nitrogênio líquido e transferidas para um tubo Falcon de 15 mL sobre gelo seco. As amostras homogeneizadas foram armazenadas a -80°C para posterior processamento. Preparo de amostra

[000358] 1 mL de SDS a 5% em DTT a 1 mM foi adicionado a 1 ml de homogeneizado tecidual e as amostras foram fervidas durante 5 minutos. As amostras foram esfriadas em gelo e foram adicionados 2 ml de solução de ureia 8M. As amostras foram centrifugadas durante 20 minutos a 14000 rpm e a fase solúvel recuperada. Um volume de 25% de solução de TCA a 100% foi adicionado à fase solúvel, deixado sobre gelo durante 20 minutos e centrifugado durante 10 minutos a 14000 rpm. O pellet de proteína foi lavado duas vezes com acetona gelada e solubilizado em 125 mL de NaOH a 0,2 M e neutralizado com 125 mL de Tris-Cl a 1 M, pH de 8,0. As soluções de proteínas foram diluídas em tampão TNE (Tris-Cl a 50 mM, pH de 8,0, NaCl a 100 mM, EDTA a 1 mM). Reagente RapiGest SF (Waters Corp., Milford, MA) foi adicionado à mistura em uma concentração final de 0,1% e as amostras foram fervidas durante 5 min. TCEP (Tris-(2-carboxietil)fosfina) foi adicionada a 1 mM (concentração final) e as amostras foram incubadas a 37°C durante 30 min. Subsequentemente, as amostras foram carboximetiladas com 0,5 mg/ml de iodoacetamida durante 30 min a 37°C, seguido por neutralização com TCEP a 2 mM (concentração final). Amostras de proteína preparadas conforme acima foram digeridas com tripsina (tripsina:proteína - 1:50) durante a noite a 37°C. o RapiGest foi degradado e removido por meio de tratamento das amostras com HCl a 250 mM a 37°C durante uma hora, seguido por centrifugação a 14.000 rpm durante 30 min a 4°C. A fração solúvel foi, então, adicionada a um novo tubo e os peptídeos foram extraídos e des- salinizados usando colunas de dessalinização Aspire RP30 (Thermo Scientific). As amostras tripsinizadas foram marcadas com marcadores isobáricos (iTRAQ, ABSCIEX, Ross et al., 2004), onde cada amostra foi marcada com um marcador específico para seus peptídeos. Análise por espectrometria de massa

[000359] Cada conjunto de experimentos (amostras 1 a 6 e as amostras 7 e 8) foi, então, reunido e fracionado usando cromatografia de fase reversa em pH elevado (fase reversa HPRP-Xterra C18, 4,6 mm x 10 mm, partícula de 5 μm (Waters)). As condições cromatográficas foram as seguintes: a coluna foi aquecida a 37°C e um gradiente linear de 5-35% de B (tampão A - formato de amônio aquoso a 20 mM, pH de 10; tampão B - formato de amônio a 20 mM, pH de 10, em ACN a 80% em água) foi aplicada por 80 min em uma taxa de fluxo de 0,5 ml/min. Um total de 30 frações com volume de 0,5 ml foi coletado para análise de LC-MS/MS. Cada uma destas frações foi analisada por cromatografia de líquido de alta pressão (High Pressure Liquid Chromatography - HPLC) acoplada à espectrometria de massa in tandem (LC-MS/MS) usando ionização por nano-pulverização. Os experimentos de ionização por nanopulverização foram realizados usando um espectrômetro de massa híbrido TripleTof 5600 (AB SCIEX Concord, Ontário, Canadá)) com interface para HPLC de fase reversa de nano-escala (Tempo, Applied Biosystems (Life Technologies), CA, EUA) usando uma capilar de vidro ID de10 cm - 180 micra embalado com esferas C18 ZorbaxTM de 5 μ (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Os peptídeos foram eluídos da coluna C18 para o es- pectrômetro de massa usando um gradiente linear (5-30%) de ACN (acetonitrilo) em uma taxa de fluxo de 550 mL/min durante 100 min. Os tampões usados para criar o gradiente de ACN foram: tampão A (98% de H2O, 2% de ACN, ácido fórmico a 0,2% e TFA a 0,005%) e Tampão B (100% de ACN, ácido fórmico a 0,2% e TFA a 0,005%). Os dados de MS/MS foram adquiridos de uma forma dependente dos dados na qual os dados MS1 foram adquiridos durante 250 ms a m/z de 400 a 1250 Da e os dados de MS/MS foram adquiridos a m/z de 50 a 2.000 Da. Para aquisição de dados independente (IDA) os parâmetros MS1-TOF 250 ms, seguido por 50 eventos MS2 de 25 ms cada. Os critérios de IDA, ao longo do limiar de 200 contagens, estado de carga +2-4 com exclusão de 4s. Finalmente, os dados coletados foram analisados usando Protein Pilot 4.0 (AB SCIEX) para identificação e quantificação de peptídeos. Resultados:

[000360] A análise proteômica de trigo inoculado com endófitos bacte- rianos (SYM11, SYM16B e SYM57B) cultivado sob estresse pelo calor e milho inoculado com SYM57B cultivado sob condição normal revelou três principais vias aumentadas ou de outra forma modificadas pelo endófito: promoção de crescimento, resistência ao estresse e mecanismos oxidati- vos envolvidos em aumento de simbiose (Tabela 8 e Tabela 9). Tabela 8. Proteínas que mostram níveis diferenciais de expressão sob estresse pelo calor em mudas de trigo inoculadas com endófitos (var. Briggs) em relação às mudas de controle não inoculadas

Tabela 9. Proteínas que mostram níveis diferenciais de expressão sob condição normal em mudas de milho inoculadas com endófito (40R73) em relação a mudas de controle não inoculadas

Promoção de Crescimento:

[000361] Proteínas envolvidas na ruptura das reservas de sementes armazenadas e que desempenham papéis importantes na estimulação de crescimento contínuo durante a germinação foram positivamente reguladas por endófitos. Esta classe de proteínas inclui beta-frutofurano- sidase, frutano 1-exo-hidrolases e carboxipeptidases envolvidas em mobilização de sacarose, frutanas e proteínas insolúveis, respectivamente, para liberação de glicose, frutose e aminoácidos [Fincher (1989). Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 40: 305-46, aqui incorporado por referência na íntegra]. Estes resultados mostram que os endófitos bacteria- nos induzem a uma liberação mais rápida de nutrientes a partir das sementes, levando a um crescimento aumentado na fase inicial de desenvolvimento da planta. Os níveis de proteínas que desempenham um papel na proliferação e alongamento celular também foram aumentados em mudas inoculadas com endófitos. Esta classe de proteínas inclui dinami- nas, histonas, uma difosfato redutase de ribonucleosídeo, pectina este- rease e vilinas, envolvidas em divisão celular, estrutura da cromatina, síntese de DNA, remodelação e alongamento da parede celular, respectivamente [Hepler et al. (2001) Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 2001. 17: 15987, Kang et al. (2003) The Plant Cell 15: 899-913, Imoto et al. (2005) Plant Mol. Biol. 58: 177-192, aqui incorporados por referência na íntegra). Estes resultados demonstram que, em resposta aos endófitos bacteria- nos testados, os dois tipos de crescimento de plantas, proliferação e alongamento, são promovidos, levando a uma melhora substancial no crescimento. Resistência Contra Estresse:

[000362] Uma série de proteínas envolvidas na resistência contra o estresse estavam significativamente reguladas positivamente em trigo sob indução por estresse e a presença de endófitos. O nível de várias proteínas que desempenham um papel na resistência contra estresse oxidativo por varredura de espécies reativas de oxigênio foi superior nas plantas inoculadas, incluindo glutationa S-transferases (GST) e peroxidase e oxidase de ascorbato [Apel e Hirt (2004) Annu. Rev. Plant Biol. 55: 373-99, aqui incorporado por referência na íntegra]. Estes resultados mostram que, além do crescimento das plantas, os endófitos testados promoveram as vias gerais envolvidas em resistência contra estresse oxidativo. O conjunto de dados de proteômica também revelou a forte indução de pectinesterase por SYM11 e SYM57B em trigo, a qual poderia desempenhar um papel na resistência à estiagem, conforme anteriormente descrito (documento WO2013122473, aqui incorporado por referência na íntegra). Aumento de Simbiose:

[000363] No caso do milho, sob condições normais, apenas GST foi positivamente regulada, enquanto que outras proteínas indutíveis por ácido abscísico (ABA) e estresse foram negativamente reguladas. A regulação negativa de proteínas induzíveis por ABA e estresse em milho estava positivamente correlacionada com a diminuição da regulação de proteínas associadas à morte celular programada, resistência a patóge- nos e resposta de hipersensibilidade. Além disso, o fator de replicação C, subunidade 3, que regula negativamente a defesa da planta foi superex- presso significativamente nas mudas de milho inoculadas com SYM57b. Estes resultados são consistentes com o conhecimento convencional de que, sob condições normais, o estabelecimento de simbioses com micróbios benéficos envolve a diminuição na expressão de genes associados ao sistema de defesa da planta [Samac e Graham (2007) Plant Physiol. 144: 582-587, aqui incorporado por referência na íntegra].

[000364] Além disso, várias proteínas diretamente associadas com simbioses benéficas são positivamente reguladas em trigo e milho. É intrigante que várias destas proteínas sejam homólogas às proteínas envolvidas na formação de nódulos em leguminosas. Muitos dos genes envolvidos em nodulação, tais como quinases receptoras de nodulação, estão amplamente distribuídas no reino vegetal, mesmo em plantas incapazes de formação de nódulos, como é o caso do milho [Endre et al. (2002) Nature 417: 962-966, aqui incorporado por referência na íntegra]. Alguns destes receptores conservados podem detectar sinais de bactérias em outras associações simbióticas que não leguminosas-Rizóbios e isto pode explicar por que os fatores de nodulação de Badyrhizobium ja- ponicum são capazes de melhorar a germinação das sementes e o crescimento das raízes de milho [Suleimanov et al. (2002) J. Exp. Bot. 53: 1929-1934, aqui incorporado por referência na íntegra]. Exemplo 7 - Análise dos níveis de hormônio em plantas inoculadas

[000365] Conforme mostrado em alguns dos exemplos anteriores, os micróbios endofíticos descritos aqui são capazes de conferir características benéficas significativas à planta agrícola inoculada. De modo a explorar a possibilidade de que endossimbiontes de semente aumentam ou modificam os níveis de hormônios na planta, uma análise metabolômica foi realizada para 12 fitôrmonios (ácido indol-3-carboxico, trans-zeatina, ácido abscísico, ácido faseico, ácido indol-3-acético, ácido indol-3- butírico, ácido indol-3-acrílico, ácido jasmônico, metil éster de ácido jas- mônico, ácido di-hidrofaseico, giberelina A3, ácido salicílico) em plantas de trigo e milho cultivadas em ágar com água sob condição normal e inoculadas por SYM57B ou uma mistura de endófitos selecionados (vide tabela abaixo). As misturas de inoculantes endofíticos foram obtidas misturando-se um volume igual das diferentes culturas bacterianas.

Amostras analisadas para caracterização de perfil de hormônios vegetais Métodos Preparo de amostra

[000366] Mudas de trigo e milho de 4 dias de idade (incluindo raízes, sementes e hipocótilo) foram finamente moídas em nitrogênio líquido com um almofariz e pilão, então, divididas em alíquotas em tubos para microcentrífuga de 1,5 mL e pesadas. Fitôrmonios foram extraídos de brotos moídos usando um protocolo de precipitação de proteína em que o solvente de extração gelado (metanol aquoso a 80% com ácido acético a 1%) contendo padrões internos foi adicionado ao material vegetal finamente moído (400 μL de solvente para cada 100 mg de tecido de planta moído). As amostras foram mantidas em gelo durante a adição do solvente de extração. As amostras foram, então, agitadas durante 60 min em velocidade média-alta a 4°C, então, centrifugadas durante 15min a 13.000 g a 4°C. O sobrenadante resultante foi removido e analisado por LC-MS/MS. LC-MS/MS

[000367] Fitormônios foram cromatograficamente separados usando um sistema Waters nanoAcquity UPLC em uma coluna Waters Atlantis dC18 (3 μM, 300 μM x 150 mm) mantida a 40°C. As amostras foram mantidas a 4°C no amostrador automático. Água (tampão A) e acetonitrilo (tampão B), ambos com ácido fórmico a 0,1%, foram usados como tampões. A taxa de fluxo foi de 11,5 μL/min e o volume de injeção de 1 μL. Cada amostra foi injetada duas vezes e a média dos níveis de hormônios calculada. Fitôrmonios foram analisados por monitoramento de reação selecionada (Selected Reaction Monitoring - SRM) em um espectrômetro de massa Waters Xevo TQ-S tanto no modo de íons positivo quanto negativo. O gradiente de UPLC foi como segue: tempo (t) = 0 min, 10% de B; t = 0,5 min, 10% de B; t = 5,5 min, 95% de B; t = 7,5 min, 95% de B; t = 8 min, 10% B. A coluna foi equilibrada durante três minutos antes de cada injeção. Resultados

[000368] A inoculação de trigo e milho com endófitos originários de semente alterou significativamente o nível de várias hormônios vegetais, incluindo o ácido indol-3-carboxico, trans-zeatina, ácido abscísico, ácido faseico e ácido indol-3-acético. Além disso, a combinação de múltiplos endossimbiontes de semente modificou ainda mais o perfil de hormônios vegetais das plantas inoculadas. Em particular, o nível de ácido abscísico e ácido indol-3-carboxílico, a forma descarboxilada de auxina, foi aumentada em 63% e 98%, respectivamente, em milho inoculado com os endófitos mistos. Exemplo 8 - Ensaio de plantio no campo & avaliação de saúde das plantas sob estresse Condições de plantio e configuração de ensaios de campo em condições sob estresse e normais

[000369] Para determinar se um micróbio ou combinação de micróbios é capaz de promover o crescimento das plantas no campo, um ensaio de campo foi conduzido usando micróbios endofíticos representativos descritos aqui. O ensaio envolvia testagem de cepas microbianas individuais e combinações de cepas por tratamento e plantio das sementes de uma variedade de plantas (incluindo, porém sem limitações, milho, trigo, algodão e cevada), com uma ou duas variedades ou cultivares de cada planta testada. Um ensaio típico foi realizado como um design de bloco ran- domizado completo, com tratamento com cada combinação microbiana e variedade planta reproduzido seis vezes no ensaio.

[000370] Os ensaios foram conduzidos em várias geografias, incluindo locais no campo nas principais regiões produtoras de Dakota do Sul, Nebraska, Saskatchewan e na Áustria, em terra seca e irrigada para testar as respostas tanto sob condições de estresse pela estia- gem quanto bem irrigadas. Os ensaios também podem ser conduzidos em regiões com estações de crescimento mais quentes, onde as temperaturas podem atingir até 95°F durante cinco ou mais dias consecutivos, de modo a avaliar as respostas sob estresse pelo calor. Os ensaios também podem ser conduzidos em regiões propensas a níveis mais elevados de patógenos microbianos, nematoides ou insetos de modo a avaliar as respostas sob estresse por patógenos.

[000371] Fertilizantes e herbicidas são aplicados de acordo com os resultados do teste de solo e a prática recomendada localmente. Fertilizante pode ser aplicado a 25%, 50% ou 75% dos níveis recomendados para avaliar as respostas sob estresse por nutrientes.

[000372] No caso do milho, os lotes no campo típicos tinham 10' x 40' com 4 fileiras uniformemente espaçadas, semeadas em uma taxa de aproximadamente 34.000 sementes por acre. Cada ensaio em bloco randomizado incluía um controle não tratado e um controle tratado com formulação placebo, bem como lotes de fronteira não tratados adicionais nas extremidades 40'. Para o trigo, os lotes no campo típicos tinham 5' x 50' com 7 fileiras uniformemente espaçadas semeadas em uma taxa de cerca de 90 libras por acre. Cada ensaio em bloco randomizado incluía um controle não tratado e um controle tratado com formulação placebo. Medição da biomassa

[000373] A biomassa dos lotes no campo é avaliada selecionando 10 plantas por lote para o milho ou 20 plantas por lote para o trigo de forma aleatória a das duas fileiras medianas no momento da colheita, removendo as plantas do solo e limpando qualquer tipo de solo residual. As plantas são, então, divididas em seções aérea e de raiz e pesadas para obtenção do peso fresco. As plantas são, então, secas em um forno de vácuo durante a noite e pesadas novamente para se obter o peso seco. Medição do rendimento, umidade de grãos, peso de teste

[000374] O rendimento dos lotes no campo é medido ao final da estação de crescimento colhendo os lotes com uma colhedora apropriada. No caso do milho, apenas as duas fileiras medianas são colhidas. No caso do trigo, todas as 7 fileiras podem ser colhidas ou apenas a 5a fileira mediana pode ser usada. Peso de teste e umidade de grãos podem ser registrados pela colhedor ou subamostras do grão colhido podem ser usadas para avaliação manual do peso de teste e análise de umidade em um analisador de umidade de grãos DICKEY-john® (Dickey-John Corp., Chatham, IL), usando parâmetros recomendados pelo fabricante. Medição de emergência e altura da planta

[000375] A emergência nos lotes de campo foi avaliada para o trigo contando-se o número de plantas emergidas na 10' seção mediana das duas fileiras medianas e reportando o número total de plantas que emergiram. As contagens de emergência foram realizadas a cada quatro dias, começando com o dia do aparecimento das primeiras plantas e terminando quando 50% ou mais das plantas no lote tinham alcançado 2 na escala de Feekes. A emergência no campo foi avaliada para o milho contando-se todas as plantas que emergiram no lote e reportando o número das plantas que emergiram como uma percentagem do número de sementes plantadas neste lote. Duas contagens de emergência foram feitas, uma com a emergência das primeiras plantas e uma segunda contagem cinco dias depois.

[000376] A emergência do trigo em um experimento de campo em quatro dias diferentes é mostrada na parte superior do painel da Figura 8. Os números reportados são uma média de contagens de emergência de 6 lotes repetidos para cada tratamento. Todas as cepas SYM mostram melhora na emergência em relação ao controle não tratado, com SYM00028 mostrando a maior melhora.

[000377] A emergência do milho em um ensaio de campo é mostrado no painel mediano da Figura 8 (para um ensaio em solo seco) e no painel inferior da Figura 8 (para um ensaio em solo irrigado). Os números são reportados como um aumento de mais de um por cento em relação a um controle não tratado e foram calculados como uma média das contagens de emergência de 6 lotes repetidos para cada tratamento. Todas as cepas SYM mostram melhora na emergência em relação ao controle sem tratamento. SYM00260, SYM00290 e SYM00254 mostraram o melhor desempenho no ensaio em solo seco e SYM00292 mostrou o melhor desempenho no ensaio em solo irrigado. Medição do momento de floração

[000378] O dia da floração para um lote em particular é registrado quando 50% ou mais das plantas no lote atingiram a fase de floração. Medição de SPAD

[000379] Leituras dos valores de clorofila, por exemplo, SPAD, são realizadas em trigo medindo 10 plantas por lote aleatoriamente a partir das duas fileiras medianas. A primeira medição é feita durante floração, com uma segunda medição feita duas semanas mais tarde nas mesmos 10 plantas em cada lote. A leitura de SPAD é feita na folha principal em cada planta, por exemplo, conforme medido com o SPAD502 fornecido pela Minolta Co., Ltda., a aproximadamente três quartos do comprimento da folha a partir da base da folha e evitando a nervura central da folha. Leituras de SPAD são realizadas em milho medindo-se 10 plantas por lote aleatoriamente a partir das duas fileiras medianas. A primeira medição é feita na floração (estágio VT), com uma segunda medição feita duas semanas mais tarde nas mesmas 10 plantas em cada lote. A leitura de SPAD é feita na folha superior sob o pendão, aproximadamente 0,5 polegadas a partir da borda da folha e três quartos do comprimento da folha a partir da base da folha. Contagem de plantas de pé & avaliação de acamamento

[000380] A contagem de plantas de pé e percentual de acamamento são avaliados no trigo contando-se o número total de perfilhos e o número de talos quebradas nas duas fileiras medianas no dia da colheita. contagem de plantas de pé e percentual de acamamento são avaliados em milho verde contando-se o número de plantas que estão de pé e o número de talos quebrados abaixo espiga nas duas fileiras medianas no dia da colheita. Esterilização de superfícies de sementes de micro-organismos usando produtos químicos desinfetantes Descrição do Exemplo

[000381] De modo a isolar e caracterizar micro-organismos endofíti- cos, todos os micro-organismos que vivem sobre a superfície da planta, tecido da planta ou estrutura da planta devem ser removidos. Após uma pré-lavagem para remover todos os micro-organismos fracamente ligados, as superfícies são esterilizadas com produtos químicos desinfetantes e o tecido da planta é testado quanto à esterilidade. Descrição Experimental

[000382] A esterilização da superfície de sementes é realizada conforme descrito por Bacon e Hinton, "Isolation, In Planta Detection and Uses of Endophytic Bacteria for Plant Protection", Capítulo no Manual of Environmental Microbiology, 3a Edição (2007): 638-647, com algumas modificações. Resumidamente, os lotes de sementes são primeiramente pré-lavados para remover tantas bactérias da superfície quanto possível, lavando-as vigorosamente em tampão de fosfato a 0,05M estéril (pH de 7,2). Se as sementes foram tratadas com pesticidas, o tampão de pré-lavagem contém Tween 20 a 0,01% ou Triton X-100 a 0,05%, seguido por 3-5 lavagens em etanol a 75-90%. Elas são, então, deixadas impregnar em 1x solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS) a 4°C durante 24 h (ou em tempos diferentes, dependendo da variedade das sementes). Após impregnação, sua superfície é esterilizada por meio de imersão em etanol a 70% durante 5 min, solução de alvejante a 10% durante 3-15 minutos (dependendo da semente) e lavadas duas vezes com água destilada submetida à autoclave. Alternativamente, a superfície das amostras pode ser esterilizada usando cloramina a 1% durante 3 minutos, seguido por etanol a 70% durante 5 minutos e lavadas duas vezes com água destilada estéril. Alternativamente, as sementes podem ser esterilizadas submergindo-as em pe- róxido de hidrogênio a 10% durante 5 min-1 hora e, então, lavadas duas vezes com água destilada estéril. As amostras são secas com papel absorvente usando papel toalha submetido à autoclave. Uma vez esterilizadas, algumas sementes de cada lote são assepticamente passadas sobre Ágar de Soja Tríptico (Tryptic Soy Ágar - TSA) e Ágar com Dextrose de Batata (Potato Dextrose Ágar - PDA) em uma placa de Petri usando uma pinça estéril: um dos lados da semente é passado primeiro, então, a semente é virada sobre seu outro lado na outra parte da placa e, então, removida. Estas placas são armazenadas no escuro durante cinco dias e verificadas diariamente quanto ao crescimento bacteriano e/ou fúngico. Se o lote de sementes parece reter micróbios, todo o lote deve ser destruído e o experimento reiniciado com novas sementes.

[000383] Outros tecidos de plantas são testados quanto à esterilidade essencialmente conforme descrito para as sementes, com algumas modificações na esterilização de superfície: a. Folhas: As folhas são separadas e pré-lavadas conforme descrito para as sementes. Então, elas são colocadas em clorami- na a 1% durante 30 minutos ou alvejante comercial durante 5 minutos e lavadas 3-5 vezes em água destilada estéril durante 3 minutos. As amostras são secas com papel absorvente usando papel toalha submetido à autoclave. 5 gramas de tecido de folha são, então, transferi- dos para um misturador esterilizado e processados conforme descrito para as sementes com 50 mL de caldo R2A. b. Raízes: As raízes são removidas das plantas e pré- lavadas duas vezes conforme descrito para as sementes para remover todo o solo associado. A superfície das raízes é colocada em solução de cloramina a 1% durante até 30 minutos (ou, alternativamente, alvejante a 10%) e lavada 3-5 vezes em água destilada estéril durante 3 minutos. As raízes são, então, imersas durante 30 minutos em tampão de fosfato estéril a 0,05 M (pH de 7,2) e, então, lavadas várias vezes. 5 g de tecido de raiz são, então, transferidos para um misturador esterilizado e processados conforme descrito para as sementes com 50 mL de caldo R2A.

[000384] 3. Caules: Uma parte do caule da planta é cortado da plan ta pré-lavada conforme descrito para as sementes. Sua superfície é, então, esterilizada, conforme descrito para as raízes e lavada duas vezes em água destilada estéril durante 3 minutos. 5 g do interior do caule são removidos cortando a camada externa com uma lâmina estéril e processados conforme descrito para as sementes. Esterilização da superfície da semente ou planta de bactérias usando agentes antibióticos

[000385] As sementes têm a superfície esterilizada com compostos antibacterianos, tais como hipoclorito de sódio, oxicloreto de cobre, hidróxido de cobre, sulfato de cobre, clorotalonil, óxido cuproso, es- treptomicina, carbonato de amônio-cobre, complexo de diacetato de diamônia/cobre, octanoato de cobre, oxitetraciclina, fosetil-Al ou cloro- picrina. A semente é embebida em uma solução aquosa ou formulação comercial contendo um ou mais destes compostos durante 30 segundos a 12 horas em um recipiente de plástico. A solução pode também ser administrada às mudas ou plantas por meio de pulverização ou imersão das folhas ou outras partes aéreas da planta, após o que os tecidos das plantas são pulverizados ou enxaguados com água para remover o fungicida residual. Após esterilização da superfície, a semente é removida da formulação antibacteriana e lavada 3-5 vezes com água destilada estéril. Esterilização da superfície de sementes ou plantas de fungos usando agentes fungicidas

[000386] As sementes têm a superfície esterilizada usando fungicidas de contato, tais como captano, manebe, tirame, fludioxonil e outros. A semente é embebida em uma solução aquosa ou formulação comercial contendo um ou mais destes compostos durante 30 segundos a 12 horas em um recipiente de plástico. Após esterilização da superfície, a semente é removida da solução fungicida e lavada 3-5 vezes com água destilada estéril. A solução de fungicidas podem também ser administrada às mudas ou plantas por meio de pulverização ou imersão de folhas ou outras partes aéreas da planta, após o que os tecidos da planta são pulverizados ou enxaguados com água para remover o fungicida residual. Fungicidas sistêmicos, tais como azoxis- trobina, carboxin, mefenoxam, metalaxil, tiabendazol, trifloxistrobina, difenoconazol, ipconazol, tebuconazol ou triticonazol, também podem ser usados somente quando é desejável esterilizar também os tecidos internos. Isolamento de bactérias e fungos a partir do interior de sementes Descrição do Exemplo

[000387] O isolamento de bactérias e fungos (incluindo endófitos) a partir de sementes com a superfície esterilizada é realizado usando métodos conhecidos na técnica. Sementes com a superfície esterilizada são moídas, diluídas em meio líquido e, então, esta suspensão é usada para inocular placas com meio sólido. Estas são incubadas sob diferentes condições ambientais em temperatura ambiente. Descrição Experimental

[000388] Aproximadamente cinquenta gramas de sementes com a superfície esterilizada são transferidos assepticamente para um liquidificador e moídos. As sementes moídas foram ressuspensas em 50 mL de caldo R2A estéril e incubadas durante 4 h em temperatura ambiente. Dez alíquotas de 1 ml de homogenatos de sementes são coletadas e centrifugadas, seus sobrenadantes descartados e os pellets suavemente ressuspensos em 1 mL de tampão de fosfato a 0,05 estéril. 0,5 mL de glicerol a 50% são adicionados a cada um dos cinco tubos. Estas são armazenadas a -80°C para possível caracterização adicional (isto é, se as placas se tornam muito cheias com um micro-organismo, as alíquotas congeladas podem ser usadas para fazer diluições menores do homogeneizado). As alíquotas restantes são diluídas duas vezes em diluições de cem vezes a 10-4. Cem microlitros das diluições a 1, 10-2 e 10-4 são usados para inocular três placas de Petri contendo os seguintes meios, de modo a isolar bactérias e/ou fungos: Ágar de soja tríptico Ágar R2A Ágar com dextrose de batata Ágar de Sabouraud Outros meios, dependendo do micro-organismo alvo

[000389] As placas são divididas em três grupos compreendendo cada tipo de meio e incubadas em diferentes ambientes. O primeiro conjunto é incubado sob condições aeróbicas, o segundo sob condições anaeróbicas e o terceiro sob condições microaerofílicas e todos são inspecionados diariamente durante até 5 dias. 1-2 colônias individuais por morfotipo são isoladas e colocadas em novas placas com o mesmo meio/ambiente dos quais o micro-organismo foi isolado para caracterização de pureza. As placas são incubadas em temperatura ambiente durante 2-5 dias. Uma vez que um isolado cresce, ele é colocado mais uma vez em uma nova placa com o mesmo meio para ca- racterização de pureza para assegurar a pureza e incubado sob as mesmas condições ambientais.

[000390] A partir da segunda placa riscada, os isolados são armazenados em caldo de soja tríptico + glicerol a 15% a -80°C para posterior caracterização, raspando primeiro 2-3 colônias (cerca de 10 μL) da placa para um tubo criogênico de 1,5 mL contendo os meios mencionados acima e ressuspendendo suavemente as células. Alternativamente, os isolados são propagados em meio especializado conforme recomendado para o grupo taxonômico de micro-organismos em particular. A coleção de micróbios obtidos representam aqueles que vivem nas sementes das plantas. Isolamento de bactérias e fungos a partir de tecidos internos de plantas Descrição do Exemplo

[000391] O isolamento de bactérias e fungos (incluindo endófitos) a partir de tecidos de plantas com a superfície esterilizada é realizado usando métodos conhecidos na técnica. Tecidos de plantas com a superfície esterilizada são moídos, diluídos em meio líquido e, então, esta suspensão é usada para inocular placas com meio sólido. Estas são incubadas sob diferentes condições ambientais em temperatura ambiente. Descrição Experimental

[000392] Aproximadamente cinquenta gramas de tecido de planta com a superfície esterilizada são transferidos assepticamente para um liquidificador e moídos. O tecido moído foi ressuspenso em 50 mL de caldo R2A estéril e incubado durante 4 h em temperatura ambiente. Dez alíquotas de 1 ml de homogenatos de tecidos de plantas são coletadas e centrifugadas, seus sobrenadantes descartados e os pellets suavemente ressuspensos em 1 mL de tampão de fosfato a 0,05 estéril. 0,5 mL de glicerol a 50% são adicionados a cada um dos cinco tubos. Estas são armazenadas a -80°C para possível caracterização adicional (isto é, se as placas se tornam muito cheias com um microorganismo, as alíquotas congeladas podem ser usadas para fazer diluições menores do homogeneizado). As alíquotas restantes são diluídas duas vezes em diluições de cem vezes a 10-4. Cem microlitros das diluições a 1, 10-2 e 10-4 são usados para inocular três placas de Petri contendo os seguintes meios, de modo a isolar bactérias e/ou fungos: Ágar de soja tríptico Ágar R2A Ágar com dextrose de batata Ágar de Sabouraud Outros meios, dependendo do micro-organismo alvo

[000393] As placas são divididas em três grupos compreendendo cada tipo de meio e incubadas em diferentes ambientes. O primeiro conjunto é incubado sob condições aeróbicas, o segundo sob condições anaeróbicas e o terceiro sob condições microaerofílicas e todos são inspecionados diariamente durante até 5 dias. 1-2 colônias individuais por morfotipo são isoladas e colocadas em novas placas com o mesmo meio/ambiente dos quais o micro-organismo foi isolado para caracterização de pureza. As placas são incubadas em temperatura ambiente durante 2-5 dias. Uma vez que um isolado cresce, ele é colocado mais uma vez em uma nova placa com o mesmo meio para caracterização de pureza para assegurar a pureza e incubado sob as mesmas condições ambientais.

[000394] A partir da segunda placa riscada, os isolados são armazenados em caldo de soja tríptico + glicerol a 15% a -80°C para posterior caracterização, raspando primeiro 2-3 colônias (cerca de 10 μL) da placa para um tubo criogênico de 1,5 mL contendo os meios mencionados acima e ressuspendendo suavemente as células. Alternativamente, os isolados são propagados em meio especializado conforme recomendado para o grupo taxonômico de micro- organismos em particular. A coleção de micróbios assim isolados constitui uma boa representação dos micróbios encontrados nos tecidos de plantas em crescimento. Isolamento de bactérias e fungos das superfícies de plantas ou sementes

[000395] Para coletar material da filosfera, rizosfera ou espermosfera para cultura de micróbios, brotos, raízes ou sementes não lavados são liberados/limpos de qualquer tipo de solo associado e colocados em tubos Falcon de 50 mL estéreis. A estes, 10 ml de tampão de fosfato de sódio a 0,1 M estéril foram adicionados e agitados, seguido de 5 minutos de sonicação para desalojar os micróbios das superfícies das plantas, com a lavagem lamacenta ou turva resultante coletada em um tubo Falcon de 15 ml separado. 100 μL desta lavagem cheia de micróbios podem ser diretamente espalhados sobre placas de ágar ou caldo nutriente e à cultura de enriquecimento ou podem ser diluídos com tampão de fosfato de sódio a 0,1 M estéril para 10X, 100X, 1000X, 10.000X e mesmo 100.000X antes de cultura microbiana sobre placas de ágar ou caldo nutriente. Preparados de estoque em glicerol da solução de lavagem da superfície da planta devem ser feitos neste ponto ao misturar 1 mL da solução de lavagem do solo e 0,5 mL de água, glicerol estéril a 80%, congelamento rápido do preparado em um crio- tubo mergulhado em nitrogênio líquido e armazenamento a - 80°C. O caldo nutriente inoculado com uma mistura de bactérias da superfície da planta formará uma comunidade mista estável de micróbios a qual pode ser usada em experimentos de inoculação de plantas descritos aqui, subcultivadas em incubações de caldo subsequentes ou espalhadas em placas de ágar e separadas em colônias individuais que podem ser testadas através dos métodos descritos aqui. Caracterização de fungos e bactérias isolados Descrição do Exemplo

[000396] A caracterização de fungos e bactérias isolados a partir de tecidos de sementes ou plantas com a superfície esterilizada ou com a superfície não esterilizada é realizada usando métodos conhecidas na técnica. Estes métodos tiram proveito da coloração diferencial de micro-organismos, das características morfológicas de células, esporos ou colônias, de reações bioquímicas que permitem caracterização diferencial e amplificação de DNA e sequenciamento de regiões diagnósticas de genes, dentre outros métodos. Descrição Experimental

[000397] Os isolados de bactérias e/ou fungos separados conforme descrito aqui (incluindo endófitos bacterianos e fúngicos) são classificados em três tipos: isolados bacterianos, isolados fúngicos e isolados desconhecidos (uma vez que colônias de leveduras podem se assemelhar a colônias de bactérias em alguns casos) com base na morfologia da colônia, formação de micélios e/ou formação de esporos visível. Para determinar se um isolado desconhecido é bacteriano ou fúngico, nálise microscópica dos isolados é executada. Algumas das análises conhecidas na técnicas para diferenciar micro-organismos incluem o teste com KOH a 10%, uma coloração positiva com azul algodão lactofenol, coloração de Gram e o crescimento em meios com agentes seletivos. As características distintivas observadas por estes testes são tamanho relativo de células (o tamanho de levedura é muito maior do que o tamanho de bactérias), a formação de hifas e esporos (bactérias filamentosas formam hifas menores do que fungos e não formam estruturas contendo esporos) ou crescimento sob agentes de seleção (a maioria das bactérias podem crescer na presença de compostos antifúngicos, tal como nistatina, enquanto que a maioria dos fungos não pode; similarmente, a maioria dos fungos não são afetados pela presença de antibióticos de amplo espectro, tais como cloranfenicol e espectinomicina).

[000398] Para identificar os isolados, análise da sequência de DNA de regiões genômicas conservadas, tais como os loci de DNA ribos- sômico, é realizada. Para obter DNA para realizar amplificações por PCR, um pouco do crescimento celular em meios sólidos (aproximadamente 5-10 μL) é ressuspenso em 30 μL de tampão de Tris/EDTA estéril (pH de 8,0). As amostras são aquecidas a 98°C durante 10 minutos, seguido por resfriamento a 4°C durante 1 minuto em um termo- ciclador. Este ciclo é repetido duas vezes. As amostras são, então, centrifugadas a 13.000 ~ RCF durante 1-5 minutos e usadas como modelo de DNA para as reações de PCR. Abaixo encontra-se uma série de combinações de iniciadores que podem ser usadas para identificar isolados ao nível de gênero.

[000399] Para diminuir o ruído de fundo em virtude de ligação não específica de iniciadores com DNA, o termociclador é programado para uma PCR Touchdown, a qual aumenta a especificidade da reação em temperaturas mais elevadas e aumenta a eficiência no final ao diminuir a temperatura de recozimento. Abaixo está um exemplo das condições para uma PCR Touchdown típica.

*Ou a temperatura especificada pelo fabricante da DNA polimerase para esta etapa.

[000400] As reações de PCR são purificadas para remover os iniciadores, dNTPs e outros componentes por meio de métodos conhecidos na técnica, por exemplo, através do uso de kits de limpeza para PCR comercialmente disponíveis ou acetato de sódio a 3M e etanol absoluto gelado, conforme descrito abaixo:

[000401] Para cada 20 μL de produto de PCR, a seguinte mistura é preparada e mantida fresca em um tubo de 1,5 ml.

[000402] 2 μL de acetato de sódio (NaOAc) a 3M, pH de 4,5.

[000403] 40 mL de etanol absoluto gelado.

[000404] Transferir o produto de PCR (20 μL) para o tubo que contém a mistura.

[000405] Submeter o tubo a vórtice e, então, armazená-lo a -20 por 30-50 min.

[000406] Centrifugar durante 30 min em uma velocidade máxima de 14.000 rpm.

[000407] Retirar o sobrenadante cuidadosamente, sem perturbar o pellet (Não toque no fundo do tubo).

[000408] Lavar o pellet com 100 μL de etanol a 70% gelado e centrifugar a ~ 13.000 RCF durante 5 min.

[000409] Remover o sobrenadante e, então, secar o pellet usando uma centrífuga de vácuo ou deixando o tubo aberto em uma coifa de biossegurança.

[000410] Ressuspender o pellet em 30 mL de água estéril.

[000411] Os amplicons de DNA são sequenciados usando métodos conhecidos na técnica, por exemplo, sequenciamento de Sanger (Johnston Monje-D., Raizada M.N. (2011) PLoS ONE 6 (6): e20396) usando um dos dois iniciadores usados para amplificação.

[000412] As sequências resultantes são alinhadas como sequências de consulta com os bancos de dados de nucleotídeos GenBank acessíveis ao público RDP (Wang, Q, G. M. Garrity, J. M. Tiedje e J. R. Cole. 2007. Appl Environ Microbiol. 73(16): 5261-7), UNITE (Abarenkov, Nilsson et al. New Phytologist 2010; Volume 186: 281-285) e PlutoF (Evol Bioinform Online. 2010; 6: 189-196). O RDP é especificamente elaborado e usado para classificação de 16s bacteriano. O UNITE e PlutoF são especificamente elaborados e usados para a identificação de fungos. Em todos os casos, as cepas são identificadas ao nível de espécie se as suas sequências são mais de 95% similares a qualquer N.° de acesso identificado em todos os bancos de dados analisados (Zimmerman, Naupaka B. e M. Peter Vitousek 109,32 (2012): 13.02213.027). Quando a percentagem de similaridade está entre 90-97%, a cepa é classificada pelo gênero, família, ordem, classe, subdivisão ou nível de filo, dependendo das informações exibidas nos bancos de dados usados. Isolados com valores de similaridade menores (de 3090%) são classificados como desconhecidos ou não cultivados, dependendo da informação exibida após análise pelo BLAST. Para sustentar a identificação molecular, os grupos taxonômicos de fungos são confirmados por meio de indução de esporulação em placas PDA ou ágar V8 e usando critérios morfológicos reportados para a identificação da estrutura e formato de corpos de frutificação (Ainsworth, G. Geoffrey Clough. Ainsworth and Bisby's Dictionary of the Fungi. CABI, 2008). Os grupos taxonômicos bacterianos são confirmados usando os critérios morfológicos reportados em meios diferenciais especializados para o táxon particular ou através de testes de diferenciação bioquímicos, conforme descrito pelo Bergey's Manual of Systematic Microbiology (Whitman, William B. et al., eds. Bergey's Manual® of Systematic Bacteriology. Vols. 1-5. Springer, 2012). Caracterização independente de cultura das comunidades bacte- rianas e fúngicas em sementes ou plantas Descrição do Exemplo

[000413] Para entender a diversidade de grupos taxonômicos microbianos cultiváveis e não cultiváveis (bacteriana e fúngica) que residem no interior de sementes ou plantas de cultivares agronomicamente relevantes, variedades primitivas e variedades selvagens ancestrais, DNA microbiano é extraído de sementes ou partes de plantas com superfície esterilizada, seguido de amplificação de regiões genômicas conservadas, tais como os loci de DNA ribossômico. DNA amplificado representa um "instantâneo" da comunidade microbiana completa no interior das sementes ou plantas. Descrição Experimental

[000414] Para obter DNA microbiano a partir de sementes, plantas ou partes de plantas, a superfície das sementes, plantas ou partes de plantas é esterilizada sob condições assépticas, conforme descrito aqui. DNA microbiano das sementes, plantas ou partes de plantas é extraído usando métodos conhecidos na técnica, por exemplo, usando kits de extração de DNA de planta ou DNA de semente comercialmente disponíveis ou o método a seguir.

[000415] Uma amostra de cada tipo de semente ou tecido de planta é colocada em um recipiente resistente ao frio e 10-50 mL de nitrogênio líquido são aplicados. As sementes ou tecidos de plantas são, então, macerados em um pó.

[000416] O DNA genômico é extraído de cada preparado de semente ou tecido de planta seguindo um protocolo com clorofórmio:álcool iso- amílico a 24:1 (Sambrook et al., 1989).

[000417] Iniciadores específicos para fungos são usados para amplificar a região do espaçador transcrito interno (Internal Transcribed Spacer - ITS) do DNA ribossômico nuclear (Schoch, Conrad L. et al. Proceedings of the National Academy of Sciences 109.16 (2012): 6241-6246). Iniciadores específicos para bactérias são usados para amplificar a região do gene 16S rDNA do genoma bacteriano (Capora- so, J. Gregory et al. The ISME Journal 6.8 (2012): 1621-1624). Sequências obtidas através de plataformas NGS são analisadas em bancos de dados, tais como aqueles citados aqui.

[000418] Alguns dos pares de iniciadores usados para esta análise são detalhados abaixo:

[000419] Como uma alternativa ao sequenciamento de próxima ge- ração, Polimorfismo de Comprimento de Fragmento Terminal por Restrição (Restriction Terminal Fragment Length Polymorphism - RTFLP) pode ser realizado, essencialmente conforme descrito em Johnston-Monje, D. e Raizada et al. [PLoS ONE (6) 6: e20396 (2011)]. Iniciadores fluorescentemente marcados específicos para grupo são usados para amplificar as regiões diagnósticas de genes na população microbiana. Este produto de PCR fluorescentemente marcado é cortado por uma enzima de restrição escolhida para distribuição heterogênea na população de PCR resultante. A mistura en- zimaticamente cortada fluorescentemente marcada e fragmentos de DNA não marcados é depois submetida à análise de sequência em uma plataforma de sequenciamento de Sanger, tal como o Applied Biosystems 3730 DNA Analyzer. Determinação do potencial patogênico em planta de isolados microbianos

[000420] Uma vez que um micróbio que confere traços positivos a um cultivar pode ser um agente patogênico dentro de diferentes espécies de plantas, um ensaio geral é usado para determinar o potencial de patogenicidade dos isolados. Sementes com a superfície e o interior esterilizado são germinadas em ágar com água e, uma vez que a planta desenvolve seu primeiro conjunto de folhas, são inoculadas com o isolado. Alternativamente, as plantas são inoculadas como sementes. Para inoculação, o isolado microbiano é cultivado em meio sólido e inoculado sobre uma planta ou sobre uma semente por meio de qualquer um dos métodos descritos aqui. As plantas são deixadas crescer sob condições ideais durante 2-3 semanas e qualquer efeito patogênico do micróbio introduzido é avaliado contra plantas de controle não inoculadas. Testagem de traços microbianos in vitro

[000421] Os exemplos abaixo foram adaptados de: Johnston MonjeD., Raizada M.N. (2011) PLoS ONE 6 (6): e20396, o qual é aqui incorporado por referência na íntegra.

[000422] Ensaio para crescimento em meios LGI sem nitrogênio. Toda a vidraria deve ser limpa com HCl a 6 M antes de preparo dos mei- os. Uma nova placa com 96 cavidades profundas (volume de cavidade de 2 mL) é enchida com 1 mL/cavidade de caldo LGI estéril [por L, 50 g de sacarose, 0,01 g de FeCl3-6H2O, 0,8 g de K3PO4, 0,2 g de MgSO4-7H2O, 0,002 g de Na2MoO4-2H2O, pH de 7,5]. As bactérias são inoculadas com um replicador com 96 pinos esterilizado à chama. A placa é selada com uma membrana respirável, incubada a 25°C com agitação suave durante 5 dias e as leituras de OD600 tomadas.

[000423] Ensaio de atividade deaminase ACC. Os micróbios são ensaiados quanto ao crescimento com ACC como sua única fonte de nitrogênio. Antes de preparo dos meios, toda a vidraria é limpa com HCl a 6 M. Uma solução esterilizada em filtro de ACC a 2 M (#1373A, Research Organics, EUA) é preparada em água. 1 μl/ml da mesma é adicionado ao caldo LGI submetido à autoclave (vide acima) e alíquotas de 1 ml são colocadas em uma nova placa com 96 cavidades. A placa é selada com uma membrana respirável, incubada a 25°C com agitação suave durante 5 dias e as leituras de OD600 tomadas. Apenas as cavidades que são significativamente mais turvas do que as cavidades com LGI correspondentes sem nitrogênio são consideradas como exibindo atividade de desaminase ACC.

[000424] Ensaio de solubilização de fosfato mineral. Os micróbios são colocados em meios de fosfato de tricálcio. Este é preparado como segue: 10 g/L de glicose, 0,373 g/L de NH4NO3, 0,41 g/L de MgSO4, 0,295 g/L de NaCl, 0,003 g/L de FeCl3, 0,7 g/L de Ca3HPO4 e 20 g/L de ágar, pH 6, então, submetido à autoclave e vertido em placas de 150 mm. Após 3 dias de crescimento a 25°C no escuro, os halos claros são medidos em torno de colônias capazes de solubilizar o fosfato de tricálcio.

[000425] Ensaio de atividade de RNAse. 1,5 g de RNA de levedura torula (#R6625, Sigma) são dissolvidos em 1 ml de Na2HPO4 a 0,1 M em um pH de 8, esterilizados por filtração e adicionados a 250 ml de meio de ágar R2A esterilizado o qual é vertido em placas de 150 mm. As bactérias de uma placa de estoque de glicerol são inoculadas usando um replicador com 96 pinos esterilizado à chama e incubadas a 25°C durante 3 dias. No terceiro dia, as placas são inundadas com ácido perclórico a 70% (#311421, Sigma) durante 15 minutos e classificadas quanto à produção de um halo claro em torno das colônias.

[000426] Ensaio de produção de acetoína e diacetila. 1 ml de caldo R2A submetido à autoclave suplementado com 0,5% de glicose, é dividido em alíquotas em placas com 96 cavidades profundas (#07-200- 700, Fisher). As bactérias de uma placa de estoque de glicerol são inoculadas usando um replicador de 96 pinos esterilizado à chama, seladas com uma membrana respirável, então, incubadas durante 5 dias com agitação (200 rpm) a 25°C. No dia 5, alíquotas de 100 μl de cultura são removidas e colocadas em uma placa de fluorômetro branco com 96 cavidades, juntamente com 100 μl/cavidade de reagentes de Barritt A e B, os quais são preparados misturando-se 5 g/L de crea- tina misturado a 3:1 (v/v) com alfa-naftol recém preparado (75 g/L em hidróxido de sódio a 2,5 M). Após 15 minutos, as placas são classificadas quanto à coloração vermelha ou rosa contra um controle negativo de cor cobre.

[000427] Ensaio de produção de auxina. Meio de ágar R2A, suplementado com L-triptofano em uma concentração final de 5 mM, é submetido à autoclave e vertido em placas de 150 mm. Usando um replicador de placa com 96 pinos, todos os micróbios são inoculados sobre a placa fresca a partir de um estoque de glicerol em placa com 96 cavidades. A placa é incubada a 25°C durante 3 dias, então, coberta com uma membrana de nitrocelulose e colocada em um refrigerador a 4°C de um dia para o outro, permitindo que as bactérias e seus me- tabólitos infiltrem no papel. No dia seguinte, a membrana de nitrocelu- lose é removida e colocada durante 30 min sobre papéis filtro What- man #2 saturados com reagente de Salkowski (cloreto férrico a 0,01 M em ácido perclórico a 35%, #311421, Sigma). Halos rosa escuros ao redor das colônias são visualizados na membrana ao iluminar o fundo usando uma mesa de iluminação.

[000428] Ensaio de produção de sideroforos. Para garantir que nenhum contaminante de ferro seja transportado a partir de experimentos anteriores, todos os vidros sofrem remoção de ferro com HCl a 6 M e água antes de preparo dos meios. Nesta vidraria limpa, meio de ágar R2A, o qual tem um teor limitado de ferro, é preparado e vertido em placas de Petri de 150 mm e inoculado com bactérias usando um re- plicador de placa com 96 pinos. Após 3 dias de incubação a 25°C, as placas são cobertas com sobreposição O-CAS. Novamente usando a vidraria limpa, 1 litro de sobreposição O-CAS é feito ao misturar 60,5 mg de Chrome azurol S (CAS), 72,9 mg de brometo de hexadeciltrime- til amônio (HDTMA), 30,24 g de ácido piperazina-1,4-bis-2- etanossulfônico (PIPES) finamente triturado com 10 mL de FeCh^6H2O a 1 mM em solvente HCl a 10 mM. O PIPES teve de ser finamente pulverizado e misturado cuidadosamente com agitação (sem sacudir) para evitar a produção de bolhas até que uma cor azul escura seja alcançada. Agarose a 1% derretida é, então, adicionada ao O-CAS pré- aquecido imediatamente antes de verter a sobreposição em uma proporção de 1:3 (v/v). Após 15 minutos, a mudança de cor é classificada ao buscar halos de cor púrpura (sideroforos de tipo catecol) ou colônias de cor laranja (sideroforos de hidroxamato).

[000429] Ensaio de atividade de pectinase. Adaptando um protocolo anterior, pectina cítrica a 0,2% (peso/v) (# 76280, Sigma) e Triton X100 a 0,1% são adicionados ao meio R2A, submetidos à autoclave e vertidos em placas de 150 mm. As bactérias são inoculadas usando um replicador de placa com 96 pinos. Após 3 dias de cultura no escuro a 25°C, a atividade de pectinase é visualizada ao inundar a placa com iodo de Gram. As colônias positivas estão rodeadas por halos claros.

[000430] Ensaio de atividade de celulase. Adaptando um protocolo anterior, carbóxi metil celulose (CMC) de sódio a 0,2% (#C5678, Sigma) e Triton X-100 a 0,1% são adicionados ao meio R2A, submetido à autoclave e vertidos em placas de 150 mm. As bactérias são inoculadas usando um replicador de placa com 96 pinos. Após 3 dias de cultura no escuro a 25°C, a atividade de celulose é visualizada ao inundar a placa com iodo de Gram. As colônias positivas estão rodeadas por halos claros.

[000431] Ensaio de antibiose. As bactérias são inoculadas usando um replicador de placa com 96 pinos sobre placas de Petri de 150 mm contendo ágar R2A, então, cultivadas durante 3 dias a 25°C. Neste ponto, as colônias de E. coli DH5a (testador Gram negativo), Bacillus subtilis sp. Subtilis (testador Gram positivo) ou da cepa de levedura AH109 (testador fúngico) são ressuspensas em 1 mL de tampão de Na2HPO4 a 50 mM em uma OD600 de 0,2 e 30 μl da mesma são misturados com 30 mL de ágar LB morno. Esta é rapidamente vertida completamente sobre uma placa com arranjo microbiano, deixada solidificar e incubada a 37°C durante 16 horas. A antibiose é classificada buscando halos claros ao redor das colônias microbianas. Geração/Isolamento de endófitos compatíveis com agroquímicos

[000432] A aplicação de pesticidas contra os patógenos fúngicos às plantas agricolamente relevantes é uma prática comum na agricultura para assegurar um maior rendimento. Um método de distribuição de pesticidas é cobrir as sementes com um revestimento contendo pesticidas. Embora pesticidas sejam destinados a impedir o crescimento e a propagação de micro-organismos patogênicos, eles podem também afetar as populações de endófitos que residem no interior da semente. Para esta finalidade, mecanismos que conferem compatibilidade aos fungos endofíticos ao conferir propriedades benéficas que são sensí- veis a estes compostos é desejável para manutenção de endófitos nas sementes.

[000433] A compatibilidade com pesticidas pode ser intrínseca (fungos naturalmente compatíveis com pesticidas, por exemplo) ou adquirida (em virtude de mutações no material genético do microorganismo ou introdução de DNA exógeno por meio de transferência natural de DNA).

[000434] Os fungicidas usados como protetores são eficazes apenas sobre a superfície da semente, conferindo proteção contra patógenos na superfície de sementes e fornecendo algum nível de controle de patógenos do solo. Estes produtos têm, em geral, um período residual relativamente curto. Fungicidas protetores, tais como captano, mane- be, tiram ou fludioxonila, ajudam a controlar muitos tipos de patógenos no solo, exceto organismos que apodrecem a raiz. Fungicidas sistêmicos são absorvidos pelas mudas emergentes e inibem ou matam fungos sensíveis dentro dos tecidos da planta hospedeira. Fungicidas sistêmicos usados para tratamento de sementes incluem os seguintes: azoxistrobina, carboxina, mefenoxam, metalaxil, tiabendazol, trifloxis- trobina e diferentes fungicidas de triazol, incluindo difenoconazol, ipco- nazol, tebuconazol e triticonazol. Mefenoxam e metalaxil são usados principalmente para atingir os Oomicetos, tais como espécies Pythium e Phytophthora.

[000435] Análogos de estrobilurina, tal como azoxistrobina, inibem a respiração mitocondrial, bloqueando a transferência de elétrons no complexo de citocromo bc1. Fenilamidas, incluindo metalaxil, interferem com a síntese de RNA em fungos alvo. Fungicidas sistêmicos de oxatiína, tal como carboxina, inibem a incorporação de fenilalanina na proteína e de uracila em RNA. Fungicidas de Azol BAS 480F, flusilazol e tebuconazol são inibidores de esterol 14α-demetilase e bloqueiam a biossíntese de esterol. Determinação de resistência intrínseca contra agroquímicos de bactérias cultivadas a partir de sementes

[000436] Para testar a resistência intrínseca a pesticidas das bactérias isoladas conforme descrito aqui, ensaios de concentração inibido- ra mínima (Minimum Inhibitory Concentration - MIC) são realizados em todas as bactérias isoladas de interesse, conforme descrito em Wiegand, Irith, Kai Hilpert e Robert E.W. Hancock. Nature Protocols 3.2 (2008): 163-175, o qual é aqui incorporado por referência na íntegra. Resumidamente, concentrações conhecidas de células bacterianas ou esporos são usadas para inocular placas contendo meio sólido com diferentes concentrações de pesticida ou inocular meio líquido contendo diferentes concentrações de pesticida (em uma placa com 96 cavidades). Os pesticidas são usados na concentração recomendada pelo fabricante para revestimento de sementes e diluições de duas vezes a 0,000125 (12 diluições de duas vezes). O crescimento é avaliado após incubação durante um período definido de tempo (16-20 horas) e comparado com as culturas cultivadas da mesma maneira sem quaisquer pesticidas como controle. O valor de MIC é determinada conforme descrito em Wiegand, Irith, Kai Hilpert e Robert E.W. Hancock. Nature Protocols 3.2 (2008): 163-175. Determinação de resistência intrínseca contra agroquímicos de fungos cultivados a partir de sementes

[000437] Para testar a resistência intrínseca de pesticidas contra os fungos isolados conforme descrito no presente Pedido, ensaios de concentração inibidora mínima (Minimum Inhibitory Concentration - MIC) são realizados em todos os fungos isolados de interesse, conforme descrito em Mohiddin, F. A. e M. R. Khan. African Journal of Agricultural Research 8.43 (2013): 5331-5334 (incorporado aqui por referência na íntegra), com as alterações a seguir. Resumidamente, ágar com dextrose de batata de dupla intensidade é preparado con- tendo diferentes concentrações de cada pesticida. Os pesticidas são aplicados na concentração recomendada pelo fabricante e também em duas diluições a 0,000125X (12 diluições de duas vezes). Então, as placas são inoculadas centralmente com um disco de 3 mm de cultura de 4 dias de idade de cada fungo que tinha sido centrifugada e enxaguada duas vezes em tampão de fosfato estéril. Placas de PDA sem um fungicida, mas inoculadas com os fungos servem como um controle. As placas inoculadas são incubadas a 25 ± 2°C durante 5 dias. O crescimento radial da colônia de cada tratamento é medido e a percentagem de inibição de crescimento é calculada, conforme descrito por Mohiddin, F. A. e M. R. Khan. African Journal of Agricultural Research 8.43 (2013): 5331-5334 (incorporado aqui por referência na íntegra). Isolados fúngicos são classificados como tendo resistência ao pesticida particular se a sua concentração de tolerância máxima (Maximum Tolerance Concentration - MTC) é de 2x ou acima da concentração de pesticidas que se recomenda usar em revestimentos de sementes. Geração de espécies fúngicas com compatibilidade com pesticidas comerciais revestidos sobre as sementes

[000438] Quando se descobre que uma cepa fúngica de interesse que confere uma propriedade benéfica para a planta hospedeira é sensível a um pesticida comercialmente relevante, variantes das cepas compatíveis com pesticidas precisam ser geradas para o uso no presente pedido. A geração de compatibilidade para vários pesticidas ou coquetéis de pesticidas é obtida selecionando sequencialmente variantes compatíveis para cada pesticida e, então, confirmando a compatibilidade com uma combinação dos pesticidas. Após cada ciclo de seleção, os fungos são testados quanto à sua capacidade de formar relações simbióticas com as plantas e confirmar se eles conferem uma propriedade benéfica à planta conforme eles fazem com a cepa parental, com ou sem aplicação de pesticida, conforme descrito aqui.

[000439] A geração e isolamento de cepas compatíveis com pesticidas derivadas de cepas endofíticas isoladas a partir de sementes e mostrados como conferindo traços benéficos às plantas são realizados conforme descrito por Shapiro-Ilan, David I. et al. Journal of Invertebrate Pathology 81.2 (2002): 86-93 (aqui incorporado por referência na íntegra), com algumas modificações. Resumidamente, os esporos fúngicos isolados são coletados e soluções que contêm entre ~ 1x103 esporos são usadas para inocular placas de ágar com dextrose de batata (PDA) contendo 2, 5 e 10 vezes a MTC da cepa em particular. As placas são incubadas durante 1-5 dias e uma única colônia proveniente da concentração mais elevada de pesticida que permite crescimento é inoculada em uma nova placa com a mesma concentração de pesticida 7 vezes consecutivas. Após a compatibilidade ter sido estabelecida, a cepa é inoculada em placas de PDA 3 vezes consecutivas e, então, inoculada em uma placa PDA contendo o pesticida para confirmar que o traço de compatibilidade é permanente.

[000440] Alternativamente, se este método não consegue fornecer uma cepa compatível, uma suspensão de esporos é tratada com me- tanossulfonato de etila para gerar mutantes aleatórios, similarmente conforme descrito por Leonard, A. Cory, Stacy D. Brown, J. e Russell Hayman. International Journal of Microbiology 2013 (2013), ID do artigo 901.697 (aqui incorporado por referência na íntegra) e os esporos desta cultura são usados no experimento detalhado acima.

[000441] Para desenvolver endófitos fúngicos compatíveis com vários pesticidas ou coquetéis de pesticidas, os esporos de uma cepa compatível com um ou mais pesticidas são usados para selecionar variantes para um novo pesticida, conforme descrito acima. As cepas desenvolvidas desta forma são testadas quanto à retenção dos traços de compatibilidade com pesticidas através de inoculação destas cepas em placas PDA contendo cada pesticida individual ou combinações de pesticidas. Geração de espécies bacterianas com compatibilidade com pesticidas comerciais revestidos sobre sementes

[000442] Quando se descobre que uma cepa bacteriana de interesse é sensível a um pesticida comercialmente relevante, a geração de variantes compatíveis com pesticidas das cepas pode ser realizada para uso no presente Pedido. A geração de variantes compatíveis com vários pesticidas ou coquetéis de pesticidas é realizada primeiro selecionando sequencialmente variantes compatíveis com concentrações progressivamente mais elevadas de cada pesticida (conforme descrito por Thomas, Louise et al., Journal of Hospital Infection 46.4 (2000): 297-303, o qual é aqui incorporado por referência na íntegra). Para desenvolver endófitos bacterianos compatíveis com vários pesticidas ou coquetéis de pesticidas, células bacterianas de uma cepa compatível com um ou mais pesticidas são usadas para selecionar variantes para um novo pesticida, conforme descrito acima. As cepas desenvolvidas desta forma são testadas quanto à retenção dos traços de compatibilidade com pesticidas através de inoculação destas cepas sobre placas PDA contendo cada pesticida individual ou combinações de pesticidas.

[000443] Após cada ciclo de seleção, as bactérias são testadas quanto à sua capacidade de viver dentro das plantas e sua capacidade de conferir a mesma propriedade benéfica à planta conforme elas fazem para a cepa progenitora, com ou sem aplicação de pesticida às plantas, conforme descrito aqui. Geração de bactérias compatíveis com pesticidas através de inserção de um plasmídeo de resistência

[000444] Muitos plasmídeos bacterianos que conferem pesticidas compatíveis foram descritos na literatura (Don, R. H. e J. M. Pemberton. Journal of Bacteriology 145.2 (1981): 681-686; e Fisher, P. R., J. Appleton e J. M. Pemberton. Journal of Bacteriology 135.3 (1978): 798-804), cada um dos quais é aqui incorporado por referência na íntegra).

[000445] Para casos nos quais a obtenção de bactérias compatíveis que ocorrem naturalmente não é viável, o uso de estes plasmídeos é um caminho possível para desenvolver linhagens endofíticas compatíveis com vários pesticidas.

[000446] Por exemplo, uma cepa de Pseudomonas fluorescens que confere propriedades antinematoide às plantas, mas é sensível aos pesticidas ácido 2,4-diclorofenoxiacético e ácido 4-cloro-2- metilfenoxiacético, pode ser transformada com o plasmídeo pJP2 (isolado de Alcaligenes eutrophus) o qual fornece compatibilidade transmissível com estes compostos, conforme descrito por D. e Pemberton, 1981. Resumidamente, os plasmídeos são transferidos através de conjugação a Pseudomonas usando o método descrito em Haas, Dieter e Bruce W. Holloway. Molecular and General Genetics 144.3 (1976): 243-251 (aqui incorporado por referência na íntegra).

[000447] Após a geração de bactérias portadoras de plasmídeos que conferem compatibilidade com pesticida, estes endófitos são testados quanto à sua capacidade de viver no interior dos tecidos de plantas e sua capacidade de conferir a mesma propriedade benéfica à planta, conforme eles fizeram para a cepa progenitora, com ou sem aplicação do produto pesticida às plantas conforme descrito aqui. Crescimento e escalonamento de bactérias para inoculação sobre meios sólidos

[000448] Os isolados bacterianos são cultivados por ciclo-inoculação de uma única colônia em caldo R2A (suplementado com antibióticos apropriados) em frascos de 100 mL. A cultura bacteriana foi incubada a 30 ± 2 0°C durante 2 dias a 180 rpm em uma incubadora com agitação (ou sob temperaturas e velocidades de agitação variadas, conforme apropriado). Esta suspensão líquida é, então, usada para inocular vermiculita em pó termicamente esterilizada que é pré-misturada com o caldo R2A estéril (sem antibióticos), resultando em uma mistura de tipo solo de partículas e líquidos. Este pó microbiano é, então, incubado durante mais dois dias a 30 ± 20°C com agitação manual diária para arejar o pó úmido e permitir o crescimento bacteriano. A vermiculita em pó inoculada está agora pronta para ser espalhada sobre o solo ou sobre partes da planta. Alternativamente, o caldo R2A é usado para inocular placas de Petri contendo R2A ou outro ágar nutriente apropriado onde colônias de bactérias são cultivadas sob condições convencionais e as colônias sólidas raspadas, novamente suspensas em líquido e aplicadas às plantas conforme desejado. Crescimento e escalonamento de fungos para inoculação sobre meios sólidos

[000449] Uma vez que um isolado fúngico foi caracterizado, as condições são otimizadas para crescimento no laboratório e escalonadas para fornecer material suficiente para os ensaios. Por exemplo, o meio usado para isolar o fungo é suplementado com nutrientes, vitaminas, cofatores, extratos de planta e outros suplementos que possam diminuir o tempo necessário para crescimento do isolado fúngico ou aumentar o rendimento de micélio e/ou esporos que o isolado fúngico produz. Estes suplementos podem ser encontrados na literatura ou escolhendo diferentes meios aditivos conhecidos que promovem o crescimento de todos os fungos ou do grupo taxonômico fúngico em particular.

[000450] Para escalonar o crescimento de isolados fúngicos, os isolados são cultivados a partir de um estoque congelado em várias placas de Petri contendo meios que promovem o crescimento do isolado fúngico em particular e as placas são incubadas sob condições ambiente ideais (temperatura, ambiente, luz). Após desenvolvimento do micélio e esporos, o crescimento fúngico é raspado e ressuspenso em tampão de fosfato a 0,05M (pH de 7,2, 10 mL/placa). Placas de poliestireno descartáveis para bioensaio (500 cm2, Thermo Scientific Nunc UX-01929- 00) são preparadas com 225 mL de meio submetido à autoclave com quaisquer suplementos necessários adicionados ao meio e deixadas solidificar. As placas são armazenadas em temperatura ambiente durante 2-5 dias antes de inoculação para confirmar a esterilidade. 5 mL da suspensão fúngica são espalhados sobre a superfície do ágar na placa de bioensaio em uma câmara de segurança biológica, as placas deixadas secar durante uma hora e elas são, então, incubadas durante 2-5 dias ou até que o micélio e/ou esporos se desenvolvam.

[000451] Uma suspensão fúngica líquida é, então, criada através do seguinte. O crescimento fúngico sobre a superfície do ágar nas placas de bioensaio é, então, raspado e ressuspenso em tampão de fosfato a 0,05M (pH de 7,2). Leituras de OD600 são tomadas usando um espec- trômetro e correlacionadas com as contagens de OD600/CFU anteriormente estabelecidas para estimar a densidade da população fúngica e o volume foi ajustado com tampão fosfato de sódio adicional para resultar em alíquotas fúngicas de 100 mL em uma densidade de cerca de 106-1011 esporos/ml. Esta suspensão pode ou não ser filtrada para remover o micélio e pode ser usada para criar uma formulação microbiana líquida, conforme descrito aqui, para aplicar o isolado fúngico sobre uma planta, parte da planta ou semente. Crescimento e escalonamento de bactérias para inoculação em meio líquido

[000452] Cepas bacterianas são cultivadas por meio de ciclo- inoculação de uma única colônia em caldo R2A (suplementado com os antibióticos apropriados) em frascos de 100 L. A cultura bacteriana foi incubada a 30 ± 20°C durante 2 dias a 180 rpm em uma incubadora com agitação (ou sob temperaturas velocidades de agitação variadas, conforme apropriado). As bactérias foram peletizadas por meio de centrifugação e ressuspensas em fosfato de sódio a 0,1 M estéril. Leituras da OD600 são tomadas usando um espectrômetro e correlacionadas com a contagem de OD600/CFU previamente estabelecida para estimar as densidades da população bacteriana e o volume foi ajustado com tampão fosfato de sódio adicional para resultar em alíquotas bacteria- nas de 100 mL em uma densidade de 1x108 células/ml. Para ajudar a romper a tensão superficial, auxiliar a entrada de bactérias em plantas e fornecer aos micróbios alguma energia para crescimento, 10 μL de tensoativo Silwet L-77 e 1 g de sacarose são adicionados a cada alíquota de 100 mL (resultando em concentrações de 0,01% v/v e 1% v/v, respectivamente) de uma maneira similar ao protocolo para transformação genética mediada por Agrobacterium de sementes de Arabi- dopsis thaliana [Clough, S., Bent, A. (1999) The Plant Journal 16 (6): 735-743]. Crescimento e escalonamento de fungos para inoculação em meios líquidos

[000453] Uma vez que um isolado fúngico foi caracterizado, as condições são otimizadas para crescimento no laboratório e escalonadas para fornecer material suficiente para os ensaios. Por exemplo, o meio usado para isolar os fungos é suplementado com nutrientes, vitaminas, cofatores, extratos de planta e/ou outros suplementos que possam diminuir o tempo necessário para crescimento do isolado fúngico e/ou aumentar o rendimento de micélios e/ou esporos que o isolado fúngico produz. Estes suplementos podem ser encontrados na literatura ou escolhendo diferentes meios aditivos conhecidos que promovem o crescimento de todos os fungos ou um grupo taxonômico de fungos em particular.

[000454] Para escalonar o crescimento de isolados fúngicos, os isolados são cultivados a partir de um estoque congelado sobre placas de Petri contendo meio que promove o crescimento do isolado fúngico em particular e as placas são incubadas sob condições ambiente ideais (temperatura, ambiente, luz). Após desenvolvimento de micélio e espo- ros, o crescimento fúngico é raspado e ressuspenso em tampão de fosfato a 0,05M (pH de 7,2, 10 mL/placa). 1 litro de meios líquidos selecionados para crescimento da cultura fúngica é preparado em frascos de vidro de 2L e levado à autoclave e quaisquer suplementos necessários adicionados ao meio. Estes são armazenados em temperatura ambiente durante 2-5 dias antes de inoculação para confirmar a esterilidade. 1 mL da suspensão fúngica é adicionado assepticamente ao frasco com meios, o qual é depois incubado durante 2-5 dias ou até o crescimento no meio líquido atingir a saturação. Leituras da OD600 são tomadas usando um espectrômetro e correlacionadas com as contagens de OD600/CFU anteriormente estabelecidas para estimar a densidade da população fúngica e o volume ajustado com tampão fosfato de sódio adicional para resultar em alíquotas fúngicas de 100 mL em uma densidade de cerca de 106-1011 esporos/ml. Esta suspensão pode ou não ser filtrada para remover o micélio e pode ser usada para criar uma formulação microbiana líquida, conforme descrito aqui, para aplicar o isolado fúngicos sobre uma planta, parte da planta ou semente. Criação de formulações microbianas líquidas ou preparados para aplicação de micróbios às plantas

[000455] Células bacterianas ou fúngicas são cultivadas em meio de caldo nutriente líquido entre 102-1012 CFU/ml. As células são separadas do meio e suspensas em outro meio líquido, se desejado. A formulação microbiana pode conter uma ou mais cepas bacterianas ou fúngicas. A formulação resultante contém células vivas, células liofilizadas ou esporos de cepas bacterianas ou fúngicas. A formulação também pode conter água, nutrientes, polímeros e agentes aglutinantes, tenso- ativos ou polissacarídeos, tal como carbóxi metil celulose, gomas e derivados de poliálcool. Veículos e adjuvantes adequados podem ser sólidos ou líquidos e incluem substâncias minerais naturais ou regeneradas, solventes, dispersantes, umectantes, agentes de adesividade, espessantes, aglutinantes ou fertilizantes. As composições podem tomar a forma de soluções aquosas, emulsões óleo-em-água ou emulsões água-em-óleo. Pequenas quantidades de material insolúvel podem, opcionalmente, estar presentes, por exemplo, em suspensão no meio, mas geralmente é preferido minimizar a presença de tal material insolúvel. Inoculação de plantas por revestimento de micróbios diretamente sobre as sementes

[000456] A semente é tratada por meio de revestimento com uma formulação líquida microbiana (preparada conforme descrito aqui) que compreende células microbianas e outros componentes de formulação diretamente sobre a superfície da semente na taxa de 102-108 CFUs microbianas por semente. As sementes são embebidas em formulação microbiana líquida durante 1, 2, 3, 5, 10, 12, 18 ou 24 horas ou 2, 3 ou 5 dias. Após imersão na formulação microbiana, as sementes são plantadas em recipientes de crescimento ou em um campo ao ar livre. As sementes também podem ser revestidas com a formulação microbiana líquida usando um tratador de parafuso sem fim ou um tratador de lote comercial. Uma ou mais formulações microbianas ou outros tratamentos para sementes são aplicados simultânea ou sequencialmente. O tratamento é aplicado às sementes usando uma variedade de técnicas e dispositivos de tratamento convencionais, tais como técnicas de leito fluidizado, parafusos sem fim, o método por moinho de cilindros, tratadores de sementes rotostáticos e dispositivos de revestimento por tambor. Outros métodos, tais como leitos de jorro, também podem ser úteis. As sementes são pré-dimensionadas antes de revestimento. Opcionalmente, a formulação microbiana é combinada com uma quantidade de inseticida, herbicida, fungicida, bactericida ou regulador de crescimento de planta ou micro- ou macronutrientes para planta antes ou durante o processo de revestimento. Após o revesti- mento, as sementes são, tipicamente, secas e depois transferidas para um dispositivo de dimensionamento para peneiramento antes de plantio. Após inoculação, a colonização das plantas ou sementes produzidas a partir das mesmas é confirmada através de qualquer um dos vários métodos descritos aqui. Os benefícios de promoção de crescimento ou resistência ao estresse conferidos à planta são testados por meio de qualquer um dos métodos de controle de crescimento de plantas descritos aqui. Inoculação das plantas com uma combinação de dois ou mais micróbios

[000457] As sementes podem ser revestidas com endófitos bacteria- nos ou fúngicos. Este método descreve o revestimento de sementes com duas ou mais cepas bacterianas ou fúngicas. O conceito apresentado aqui envolve o revestimento simultâneo de sementes com dois micróbios (por exemplo, tanto uma bactéria endofítica Gram negativa Burkholderia phytofirmans quanto uma bactéria endofítica Gram positiva Bacillus mojavensis). Opcionalmente, ambos os micróbios são geneticamente transformados por meio de integração cromossômica estável, como segue. Bacillus mojavensis são transformadas com um construto com um promotor constitutivo que comanda a expressão de um óperon sintético de genes de resistência à espectinomicina e GFPuv, enquanto que Burkholderia phytofirmans são transformadas com um construto com um promotor constitutivo que comanda a expressão do óperon lac com um gene de resistência à espectinomicina preso. As sementes são revestidas com uma formulação líquida preparada dos dois micróbios através dos vários métodos descritos aqui. Várias concentrações de cada endófito na formulação são aplicadas, a partir de 102/semente a cerca de 108/semente. Após inoculação, a colonização das plantas ou sementes produzidas a partir das mesmas pode ser confirmada através de qualquer um dos vários métodos des- critos aqui. Os benefícios de promoção de crescimento ou resistência ao estresse conferidos à planta são testados por meio de qualquer um dos métodos de controle de crescimento de plantas descritos aqui. Cultura para confirmar a colonização da planta por bactérias

[000458] A presença nas sementes ou plantas de endófitos marcados com GFPuv ou gusA pode ser detectada por meio de contagem de colônias a partir de material de semente triturado e tecido das mudas germinadas usando placas R2A com com 5-bromo-4-cloro-3-indolil β- D-glucuronídeo (X-glcA, 50 μg/ml), IPTG (50 μg/ml) e o antibiótico es- pectinomicina (100 μg/ml). Alternativamente, os endófitos bacterianos ou fúngicos que não tenham recebido os transgenes também podem ser detectados através do isolamento de micróbios das plantas, tecidos de planta ou homogenatos de semente (opcionalmente com a superfície esterilizada) em meios sem antibióticos e identificados visualmente pelo morfotipo da colônia e métodos moleculares descritos aqui. Morfotipos de colônia representativos são também usados em PCR de colônias e sequenciamento para identificação do isolado através de análise de sequência do gene ribossômico, conforme descrito aqui. Estes ensaios são repetidos duas vezes por experimento, com 5 amostras biológicas por tratamento. Métodos independentes de cultura para confirmar a colonização da planta ou sementes por bactérias ou fungos Descrição do Exemplo

[000459] Uma forma de detectar a presença de endófitos em ou dentro das plantas ou sementes é o uso de PCR quantitativa (qPCR). A colonização interna pelo endófito pode ser demonstrada através do uso de tecidos de plantas com a superfície esterilizada (incluindo sementes) para extrair o DNA total e sondas MGB fluorescentes específicas para isolado e iniciadores de amplificação são usados em uma reação de qPCR. Um aumento no produto objetivado pela sonda re pórter em cada ciclo de PCR, portanto, provoca um aumento proporcional na fluorescência em virtude de ruptura da sonda e liberação do repórter. A fluorescência é medida por um instrumento de PCR quantitativa e comparada com uma curva padrão para estimar o número de células bacterianas ou fúngicas dentro da planta. Descrição Experimental

[000460] O design de iniciadores de amplificação específicos para espécie e sondas fluorescentes específicas para isolado é bem conhecidos na técnica. Tecidos de plantas (sementes, caules, folhas, flores, etc.) são pré-lavados e a superfície esterilizada usando os métodos descritos aqui.

[000461] O DNA total é extraído por meio de métodos conhecidos na técnica, por exemplo, usando kits de extração de DNA de planta comercialmente disponíveis ou o método a seguir.

[000462] O tecido é colocado em um recipiente resistente ao frio e 10-50 mL de nitrogênio líquido são aplicados. Os tecidos são, então, macerados em um pó.

[000463] O DNA genômico é extraído de cada preparado tecidual após um protocolo com clorofórmio:álcool isoamílico a 24:1 (Sambro- ok, Joseph, Edward F. Fritsch e Maniatis Thomas, Molecular Cloning Vol 2. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).

[000464] PCR quantitativa é realizada essencialmente conforme descrito por Gao, Zhan, et al. Journal of Clinical Microbiology 48.10 (2010): 3575-3581 com iniciadores e sonda(s) específicos para o isolado desejado usando um instrumento de PCR quantitativa e uma curva padrão é construída usando diluições seriais de produtos de PCR clonados que correspondem ao amplicon de PCR específico para espécie produzido pelos iniciadores de amplificação. Os dados são analisados usando as instruções do fabricante do software do instrumento de PCR quantitativa.

[000465] Como uma alternativa à qPCR, Polimorfismo de Comprimento de Fragmento Terminal por Restrição (Restriction Terminal Fragment Length Polymorphism - RTFLP) pode ser realizado, essencialmente conforme descrito em Johnston-Monje, D. e Raizada et al. [PLoS ONE (6) 6: e20396 (2011)]. Iniciadores fluorescentemente marcados específicos para grupo são usados para amplificar as regiões diagnósticas de genes na população microbiana. Este produto de PCR fluorescentemente marcado é cortado por uma enzima de restrição escolhida para distribuição heterogênea na população de PCR resultante. A mistura enzimaticamente cortada fluorescentemente marcada e fragmentos de DNA não marcados é depois submetida à análise de sequência em uma plataforma de sequenciamento de Sanger, tal como o Applied Biosystems 3730 DNA Analyzer. Métodos imunológicos para detectar micro-organismos em sementes e tecidos vegetativos

[000466] É produzido um anticorpo policlonal contra cepas de bactérias X ou fungos Y específicas através de métodos convencionais. Um anticorpo policlonal também é produzido contra proteínas GFP e GUS específicas através de métodos convencionais. Ensaio imunossorven- te ligado à enzima (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay - ELISA) e imunomarcação também são conduzidos através de métodos convencionais, resumidamente descritos abaixo.

[000467] Procedimentos de microscopia de imunofluorescência envolvem o uso de seções semifinas de sementes ou mudas ou tecidos de plantas adultas transferidos para lâminas objetivas de vidro e incubadas com tampão de bloqueio (cloridrato de tris(hidroximetil)aminometano (TBS) a 20 mM mais albumina de soro bovino a 2%, pH de 7,4) durante 30 min em temperatura ambiente. As seções são primeiro revestidas durante 30 min com uma solução de anticorpos primários e depois com uma solução de anticorpos secundários (anticorpos anti-coelho de ca- bra) acoplados com isotiocianato de fluoresceína (FITC) durante 30 min em temperatura ambiente. As amostras são, então, mantidas no escuro para evitar decomposição do FITC sensível à luz. Após duas lavagens de 5 min com tampão de fosfato de potássio (PB) estéril (pH de 7,0) e uma com água bidestilada, as seções são seladas com tampão de montagem (100 ml de fosfato de sódio a 0,1 M (pH de 7,6) mais 50 ml de glicerina bidestilada) e observadas sob um microscópio luminoso equipado com luz ultravioleta e um filtro Texas Red para FITC.

[000468] Seções ultrafinas (50 a 70 nm) para microscopia TEM são coletadas sobre grades de níquel revestidas com Pioloform e marcadas com anticorpo de cabra anti-coelho marcado com ouro a 15 nm. Após serem lavadas, os cortes são incubados durante uma hora em uma diluição de 1:50 de anticorpo de cabra anti-coelho marcado com ouro a 5 nm em tampão IGL. A marcação com ouro é, então, visualizada por microscopia luminosa usando um kit BioCell Silver Enhancement. Azul de toluidina (0,01%) é usado para contraste leve das seções marcadas com ouro. Em paralelo com as seções usadas para Immunogold Silver Enhancement, seções seriais são coletadas de cortes não revestidos e corados com azul de toluidina a 1%. As seções para microscopia luminosa são vistas sob um microscópio óptico e as seções ultrafinas são vistos por TEM. Caracterização de uniformidade de endófitos em uma população de sementes

[000469] Para testar a homogeneidade de endófitos sobre a superfície ou colonização dos tecidos internos de uma população de sementes, as sementes são testadas quanto à presença de micróbios por meio de métodos independentes de cultura e/ou dependentes de cultura. As sementes são obtidas, a superfície esterilizada e pulverizada e o homogenato de sementes é dividido e usado para inocular meio de cultura ou extrair o DNA e realizar PCR quantitativa. A homogeneidade de colonização em uma população de plantas é avaliada através de detecção de cepas microbianas específicas através destes métodos e comparação dos resultados de dependentes de cultura e independentes de cultura em toda a população de sementes. A homogeneidade de colonização para uma cepa de interesse é classificada com base no número total de plantas de uma população que contém um nível detectável da cepa, com base na uniformidade do número de células em toda a população ou CFUs da cepa presentes no tecido da planta ou com base na presença ou ausência de outras cepas microbianas na planta. Descrição Experimental

[000470] Sementes cuja superfície foi esterilizada são obtidas conforme descrito aqui. Para métodos dependentes de cultura ara confirmação da presença microbiana, bactérias e fungos são obtidos das sementes essencialmente conforme descrito aqui, com a seguinte modificação. Homogenato de tecido de planta é usado para inocular meios contendo aditivos seletivos e/ou diferenciais que permitirão a identificação de um micro-organismo particular.

[000471] Para qPCR, o DNA total de cada semente é extraído usando métodos conhecidos na técnica, conforme descrito aqui. Caracterização de homogeneidade de colonização na população de plantas

[000472] Para testar a homogeneidade de micro-organismos (incluindo endófitos) que colonizam o interior de uma população de plantas, tecidos de planta são, cada um, testados quanto à presença de micróbios por meio de métodos independentes e/ou dependentes de cultura. Os tecidos são obtidos, a superfície esterilizada e pulverizada e o material tecidual é dividido e usado para inocular meio de cultura ou para extrair o DNA e realizar PCR quantitativa. A homogeneidade de colonização em uma população de plantas é avaliada através de detecção de cepas microbianas específicas através destes métodos e comparação dos resultados de dependentes de cultura e independentes de cultura em toda a população de plantas e seus tecidos. A homogeneidade de colonização para uma cepa de interesse é classificada com base no número total de plantas de uma população que contém um nível detectável da cepa, com base na uniformidade do número de células em toda a população ou CFUs da cepa presentes no tecido da planta ou com base na presença ou ausência de outras cepas microbianas na planta. Descrição Experimental

[000473] Tecidos de plantas com a superfície esterilizada são obtidos conforme descrito aqui. Para métodos dependentes de cultura para confirmação da presença microbiana, bactérias e fungos são obtidos a partir de tecidos de planta essencialmente conforme descrito aqui, com a seguinte modificação. Homogenato de tecido de planta é usado para inocular meios contendo aditivos seletivos e/ou diferenciais que permitirão a identificação de um micro-organismo particular.

[000474] Para qPCR, o DNA total de cada tecido de planta é extraído usando métodos conhecidos na técnica, conforme descrito aqui. Testagem quanto aos efeitos benéficos e inibidores de endófitos Testagem de aumento de germinação sob condições normais

[000475] Testes de germinação padrões são usados para avaliar a capacidade do endófito de aumentar a germinação e o crescimento inicial das sementes. Resumidamente, 400 sementes que são revestidas com o endófito conforme descrito em outra parte são colocadas entre papel toalha marrom úmido (8 repetições de 50 sementes cada). Um número igual de sementes obtidas de plantas de controle que não contêm o micróbio é tratado da mesma forma. O papel toalha é colocado por cima de bandejas de plástico de 1 x 2 pés e mantido em uma câmara de crescimento regulada a 25°C e 70% de umidade durante 7 dias. A proporção de sementes que germinam com sucesso é comparada entre as sementes provenientes de plantas colonizadas por micróbio com aquelas provenientes dos controles. Testagem de aumento de germinação sob estresse biótico

[000476] Uma modificação do método desenvolvido por Hodgson [Am. Potato. J. 38: 259-264 (1961)] é usada para testar o aumento de germinação em sementes colonizadas por micróbio sob estresse bióti- co. Estresse biótico é entendido como uma concentração de inóculo na forma de uma suspensão de células (bactérias) ou esporos (fungos) de um patógeno conhecido para uma cultura específica (por exemplo, Pantoea stewartii ou Fusarium graminearum para Zea mays L.). Resumidamente, para cada nível de estresse biótico, 400 sementes, os interiores das quais são colonizados por cepas microbianas, e 400 sementes de controle (sem as cepas microbianas) são colocadas entre papel toalha marrom: 8 repetições com 50 sementes cada para cada tratamento (colonizadas por micróbios e controle). Cada uma das repetições é colocada dentro de uma placa de Petri grande (150 mm de diâmetro). O papel toalha é, então, embebido com 10 ml de suspensão patogênica de células ou esporos em uma concentração de 104 a 108 células/esporos por mL. Cada nível corresponde a uma ordem de magnitude de incremento de concentração (assim, 5 níveis). As placas de Petri são mantidas em uma câmara de crescimento regulada 25°C e 70% de umidade durante 7 dias. A proporção de sementes que germinam com sucesso é comparada entre as sementes provenientes de plantas colonizadas com micróbio com aquelas provenientes dos controles para cada nível de estresse biótico. Testagem de aumento de germinação sob estresse pela estiagem

[000477] Polietileno glicol (PEG) é um polímero inerte de ligação à água com uma cadeia não iônica longa e praticamente impermeável [Couper e Eley, J. Polymer Sci., 3: 345-349 (1984)] que imita com preci- são o estresse pela estiagem sob condições de solo seco. Quanto maior a concentração de PEG, menor o potencial hídrico obtido, assim, induzindo a um maior estresse pela água em um meio aquoso. Para determinar o aumento da germinação de sementes, o interior das quais é colonizado por cepas microbianas, o efeito do potencial osmótico sobre a germinação é testado em uma faixa de potenciais hídricos representativo de condições de estiagem seguindo Perez-Fernandez et al. [J. Environ. Biol. 27: 669-685 (2006)]. A faixa de potenciais hídricos simula aquelas que são conhecidas por causar estresse pela estiagem em uma série de cultivares e plantas silvestres (-0,05 MPa a -5 MPa) [Craine et al., Nature Climate Change. 3: 63-67 (2013)]. A concentração apropriada de polietileno glicol (6000) necessária para atingir um potencial hídrico particular é determinada de acordo com Michel e Kaufmann (Plant Physiol, 51: 914-916 (1973)) e outras modificações por Hardegree e Emmerich (Plant Physiol, 92, 462-466 (1990)). A equação final para determinar as quantidades de PEG é: Φ = 0.130 [PEG]2 T - 13.7 [PEG] 2; onde o potencial osmótico (Φ) é uma função da temperatura (T). Experimentos de germinação são conduzidos em placas de Petri de 90 mm de diâmetro. As repetições consistem em uma placa de Petri revestida com 10 ml da solução apropriada e 20 sementes flutuando na solução. 400 sementes, os interiores das quais são colonizados por cepas microbianas, são testadas, além de 400 sementes (controles sem as cepas microbianas), em um total de 40 placas de Petri. Para evitar grandes variações em Φ, as placas são seladas com parafilme e as soluções de PEG são renovadas semanalmente ao descartar o PEG existente na placa de Petri e adicionar a mesma quantidade de solução fresca. As placas de Petri são mantidas em uma câmara de crescimento regulada a 25°C, um ciclo de claro:escuro de 16: 8 horas, 70% de umidade e uma intensidade de luz de pelo menos 120 μE/m2/s. A proporção de sementes que germinam com êxito após duas semanas é com- parada entre as sementes provenientes de plantas inoculadas e aquelas provenientes dos controles. Testagem de aumento de germinação sob condições de calor

[000478] Testes de germinação são usados para determinar se um micróbio colonizar o interior de uma semente de milho protege contra o estresse de calor durante a germinação. Resumidamente, 400 sementes, os interiores dos quais são colonizados por cepas microbianas são colocados entre molhadas toalhas de papel marrom (8 repetições com 50 sementes cada). Um número igual de sementes obtidas de plantas de controle que não possuem o micróbio é tratado da mesma forma. O papel toalha foi colocado por cima de bandejas de plástico de 1 X 2 pés e mantido em uma câmara de crescimento regulada em um ciclo de cla- ro:escuro de 16:8 horas, 70% de umidade e uma intensidade de luz de pelo menos 120 μE/m2/s durante 7 dias. Uma faixa de temperaturas elevadas (de 35°C a 45°C, com intervalos de 2 graus por ensaio) é testada para avaliar a germinação de sementes colonizadas por micróbios em cada temperatura. A proporção de sementes que germinam com sucesso é comparada entre as sementes provenientes de plantas colonizadas por micróbios e aquelas provenientes dos controles. Testagem de aumento de germinação sob condições de frio

[000479] Testes de germinação padrões são usados para determinar se um micróbio que coloniza o interior de uma semente de milho protege contra o estresse pelo frio durante germinação. Resumidamente, 400 sementes, os interiores das quais são colonizados por cepas microbianas, são colocadas entre papel toalha marrom úmido (8 repetições com 50 sementes cada). Um número igual de sementes obtidas a partir de plantas de controle que não possuem o micróbio é tratado da mesma forma. O papel toalha foi colocado por cima de bandejas de plástico de 1 X 2 pés e mantido em uma câmara de crescimento regulada em um ciclo de claro:escuro de 16:8 horas, 70% de umidade e uma intensidade de luz de pelo menos 120 μE/m2/s durante 7 dias. Uma faixa de temperaturas baixas (de 0°C a 10°C, com intervalos de 2 graus por ensaio) é testada para avaliar a germinação de sementes colonizadas por micróbios em cada temperatura. A proporção de sementes que germinam com sucesso é comparada entre as sementes provenientes de plantas colonizadas por micróbios e aquelas provenientes dos controles. Testagem de aumento de germinação em altas concentrações de sal

[000480] Experimentos de germinação são conduzidos em placas de Petri de 90 mm de diâmetro. As repetições consistem em uma placa de Petri revestida com 10 ml da solução apropriada e 20 sementes flutuando na solução. 400 sementes, os interiores das quais são colonizados pelas cepas microbianas, e 400 sementes de controle (que carecem das cepas microbianas) são testadas desta maneira (40 placas de Petri no total). Para evitar grandes variações na concentração de sal em virtude de evaporação, a placas são seladas com parafilme e as soluções salinas são renovadas semanalmente descartando a solução salina existente na placa de Petri e adicionando a mesma quantidade de solução fresca. Uma faixa de soluções salinas (NaCl a 100-500 mM) é testada para avaliar a germinação de sementes colonizadas por micróbios em níveis de sal variados. As placas de Petri são mantidas em uma câmara de crescimento regulada a 25°C, ciclo de claro:escuro de 16:8 horas, 70% de umidade e uma intensidade de luz de pelo menos 120 μE/m2/s. A proporção de sementes que germinam com sucesso após duas semanas é comparada entre as sementes provenientes de plantas inoculadas e aquelas provenientes dos controles. Testagem de aumento de germinação em solos com elevado teor de metais

[000481] Testes de germinação padrões são usados para determinar se um micróbio que coloniza o interior de uma semente de milho prote ge contra o estresse por elevado teor de metais no solo durante germinação. Resumidamente, 400 sementes de milho, os interiores das quais são colonizados por cepas microbianas, são colocadas entre papel toalha marrom úmido (8 repetições com 50 sementes cada). Um número igual de sementes obtidas de plantas de controle que não possuem o micróbio (sem micróbios) é tratado da mesma forma. O papel toalha foi colocado por cima de bandejas de plástico de 1 X 2 pés com furos para permitir a drenagem da água. O papel toalha é coberto com uma polegada de areia estéril. Para cada metal a ser testado, a areia tem de ser tratada de forma adequada para garantir liberação e biodisponibilidade do metal. Por exemplo, no caso do alumínio, a areia é revestida com ~ 1 g/kg de solo Al+3, pH de 4,0 (-621 μM). As bandejas são mantidas em uma câmara de crescimento regulada 25°C e 70% de umidade durante 7 dias. A proporção de sementes que germinam com sucesso é comparada entre as sementes provenientes de plantas colonizadas por micróbios e aquelas provenientes dos controles. Testagem de promoção de crescimento em câmara de crescimento sob condições normais

[000482] O solo é feito a partir de uma mistura de 60% de Sunshine Mix #5 (Sun Gro;. Bellevue, Washington, EUA) e 40% de vermiculita. Para determinar se um micróbio particular que coloniza o interior de sementes é capaz de promover o crescimento das plantas sob condições normais, 24 vasos são preparados em duas bandejas planas sem furos com 12 vasos com 28 gramas de solo seco em cada vaso e 2 L de água filtrada adicionados a cada bandeja. A água é deixada penetrar no solo e a superfície do solo é aspergida antes de semeadura. Para cada combinação de sementes-micróbio, 12 vasos são semeados com 3-5 sementes colonizadas por micróbio e 12 vasos são semeados com 3-5 sementes sem o micróbio (plantas sem micróbios). Os vasos semeados são cobertos com uma cúpula de umidade e man- tidos no escuro durante 3 dias, após o que os vasos são transferidos para uma câmara de crescimento regulada 25°C, um ciclo de cla- ro:escuro de 16:8 horas, 70% de umidade e uma intensidade de luz de pelo menos 120 μE/m2/s. As cúpulas de umidade são removidas no dia 5 ou quando os cotilédones estão totalmente expandidos. Após remoção das cúpulas, cada vaso é irrigado com 0,5X solução de Hoagland até saturação, então, permitindo que o excesso de solução escorra. As mudas são, então, podadas para 1 por vaso. Nos dias seguintes, os vasos são irrigados até saturação com água filtrada, permitindo que o excesso de água escorra após cerca de 30 minutos de imersão e o peso de cada bandeja plana de 12 vasos é registrado semanalmente. A área de dossel é medida em intervalos semanais. A altura da planta terminal, área foliar média e comprimento foliar médio são medidos ao final da floração. As plantas são deixadas a secar e o peso da semente é medido. A significância da diferença no crescimento entre as plantas colonizadas com micróbio e os controles sem o micróbio é avaliada com o teste estatístico apropriado, dependendo da distribuição dos dados de p <0,05. Testagem de promoção de crescimento em câmara de crescimento sob estresse biótico

[000483] O solo é feito a partir de uma mistura de 60% Sunshine Mix #5 (Sun Gro; Bellevue, Washington, EUA) e 40% de vermiculita. Para determinar se um micróbio particular que coloniza o interior de sementes é capaz de promover o crescimento da planta na presença de estresse biótico, 24 vasos são preparados em duas bandejas planas sem furos com 12 vasos com 28 gramas de solo seco em cada vaso e 2 L de água filtrada são adicionados a cada bandeja. A água é deixada penetrar no solo antes de plantio. Para cada teste de combinação de sementes-micróbio, 12 vasos são semeados com 3-5 sementes colonizadas pelo micróbio e 12 vasos são semeados com 3-5 sementes sem o micróbio (plantas sem micróbios). Os vasos semeados são cobertos com uma cúpula de umidade e mantidos no escuro durante 3 dias, após o que os vasos são transferidos para uma câmara de crescimento regulada a 25°C, um ciclo de claro:escuro de 16:8 horas, 70% de umidade e uma intensidade da luz de pelo menos 120 μE/m2/s. As cúpulas de umidade são removidas no dia 5 ou quando os cotilédones estão totalmente expandidos. Após remoção das cúpulas, cada vaso é irrigado com 0,5X solução de Hoagland até saturação, permitindo que o excesso de solução escorra. As mudas são, então, podadas para 1 por vaso. Nos dias seguintes, os vasos são irrigados até saturação com água filtrada, permitindo que o excesso de água escorra após cerca de 30 minutos de imersão.

[000484] Vários métodos de inoculação são usados dependendo do estilo de vida do patógeno. Para patógenos foliares (por exemplo, Pseudomonas syringeae ou Colletotrichum graminicola), uma suspensão de células para bactérias (108 células/ml) ou esporos para fungos (107 esporos/ml) é aplicada com um aplicador sobre a superfície adaxial de cada uma das folhas mais jovens totalmente expandidas. Alternativamente, para patógenos fúngicos que não formam co- nídios facilmente, dois tampões de ágar contendo micélio (~ 4 mm de diâmetro) são presos à superfície adaxial de cada uma das folhas mais jovens de cada lado da nervura central. Para patógenos vasculares (por exemplo, Pantoea stewartii ou Fusarium moniliforme), a suspensão de células ou esporos é diretamente introduzida na vascu- latura (5-10 μL) através de uma pequena lesão feita com uma lâmina estéril. Alternativamente, as mudas podem ser cultivadas hidroponi- camente na suspensão de células/esporos ou micélio. Para testar a resistência da combinação de planta-micróbios contra estresse por insetos, tais como tripes ou pulgões, as plantas são transferidas para uma câmara de crescimento especialmente concebida contendo os insetos. Insetos abrigados no solo ou patógenos nematoides são misturados ou aplicados topicamente ao solo de envasamento. Em todos os casos, é tomado cuidado para conter o patógeno fúngico, insetos, nematoides ou outro patógeno e evitar a liberação fora da área de teste imediata.

[000485] O peso de cada bandeja plana de 12 vasos é registrado semanalmente. A área de dossel é medida em intervalos semanais. A altura da planta terminal, área foliar média e comprimento foliar médio são medidos ao final da floração. As plantas são deixadas a secar e o peso da semente é medido. A significância da diferença no crescimento entre as plantas colonizadas com micróbio e os controles sem o micróbio é avaliada com o teste estatístico apropriado, dependendo da distribuição dos dados de p <0,05. OUTRAS MODALIDADES

[000486] Deverá ser entendido que embora a invenção tenha sido descrita em conjunto com a descrição detalhada da mesma, a descrição precedente se destina a ilustrar e não limitar o âmbito da invenção, o qual é definido pelo âmbito das reivindicações anexas. Outros aspectos, vantagens e modificações estão dentro do âmbito das reivindicações a seguir.

Claims

1. Combinação sintética, caracterizada pelo fato de que compreende: uma população bacteriana purificada em associação com uma semente de uma planta agrícola de cereais, em que a população bacteriana purificada compreende um endófito bacteriano de semente do gênero Enterobacter que é heterólogo à semente e tem uma sequência de ácido nucleico 16S selecionada dentre o grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 595 e 545, e é capaz de produzir uma auxina ou acetoína, em que o endófito é disposto de maneira heteróloga para a semente e coloniza uma planta germinada a partir da combinação sintética, em que a planta germinada a partir da semente inoculada tem um benefício em comparação com uma planta germinada a partir de uma semente de referência semeada nas mesmas condições, em que o benefício é selecionado dentre o grupo que consiste em: uma maior quantidade de raízes laterais e pêlos radiculares, aumento do comprimento da parte aérea, aumento do peso das plântulas, maior biomassa da parte aérea, maior eficiência no uso de nitrogênio e maior biomassa.

2. Método, caracterizado pelo fato de que compreende: método de tratamento de sementes de uma planta agrícola de cereais, compreendendo inocular mecânica ou manualmente uma pluralidade de sementes de plantas agrícolas de cereais com uma formulação agrícola compreendendo um veículo aceitável em agricultura e uma população bacteriana purificada que compreende um endó- fito bacteriano de sementes do gênero Enterobacter que é heterólogo à semente e tem uma sequência de ácido nucleico 16S selecionada dentre o grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 595 e 545 e é capaz de produzir uma auxina ou acetoína, em que o endófito é disposto de maneira heteróloga à semente e coloniza uma planta germinada a partir da semente inoculada, em que a planta germinada a partir da semente inoculada tem um benefício em comparação com uma planta germinada a partir de uma semente de referência semeada sob a mesmas condições e em que o benefício é selecionado do grupo que consiste em: uma quantidade maior de raízes laterais e pêlos radiculares, aumento do comprimento da parte aérea, aumento do peso das plântu- las, maior biomassa da parte aérea, maior eficiência no uso de nitrogênio e maior biomassa radicular.

3. Combinação sintética, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o endófito bacteriano da semente está presente a uma concentração de pelo menos 104 CFU/semente na superfície de uma semente.

4. Combinação sintética de acordo com a reivindicação 1 ou método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado(a) pelo fato de que a combinação sintética compreende dois ou mais endófitos bacterianos.

5. Combinação sintética de acordo com a reivindicação 1 ou método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado(a) pelo fato de que o endófito bacteriano da semente coloniza as raízes da planta agrícola de cereal ou uma muda germinada a partir da semente tratada.

6. Combinação sintética de acordo com a reivindicação 1 ou método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado(a) pelo fato de que a combinação sintética compreende ainda uma população de fungos purificada.

7. Combinação sintética de acordo com a reivindicação 1 ou método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado(a) pelo fato de que a planta agrícola de cereal é selecionada dentre o grupo que consiste em: milho, arroz, cevada, trigo e aveia.

8. Combinação sintética de acordo com a reivindicação 1 ou método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado(a) pelo fato de que o benefício ocorre sob condições de estresse biótico, em que o estresse biótico é selecionado dentre o grupo que consiste em estresse de nematoide, estresse de herbivoria de insetos, estresse de pató- geno fúngico, estresse de patógeno bacteriano, e estresse por pató- genos virais.

9. Combinação sintética de acordo com a reivindicação 1 ou método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado(a) pelo fato de que o benefício ocorre sob condições de estresse abiótico, em que o estresse abiótico é selecionado dentre o grupo que consiste em estresse hídrico, estresse salino, estresse de calor, estresse de frio, estresse de alto teor de metal e estresse de baixa nutrição.