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KR20210121271A - 식물에 유익한 특성을 부여하는 미생물에 대한 스크리닝 방법 - Google Patents

식물에 유익한 특성을 부여하는 미생물에 대한 스크리닝 방법 Download PDF

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KR20210121271A
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plant
plants
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seeds
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KR1020217030272A
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피터 존 위글리
수잔 제인 터너
카롤린 엘리자베스 조지
Original Assignee
바이오디스커버리 뉴질랜드 리미티드
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Publication date
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Abstract

본 발명은 식물에 유익한 특성을 부여하는 미생물의 스크리닝, 확인 및/또는 적용 방법 및/또는 이용 조성물, 및 그로부터 확인되는 미생물 및 조성물에 관한 것이다.

Description

식물에 유익한 특성을 부여하는 미생물에 대한 스크리닝 방법{METHODS OF SCREENING FOR MICROORGANISMS THAT IMPART BENEFICIAL PROPERTIES TO PLANTS}
본 발명은 식물에 유익한 특성을 부여하는 이용 미생물의 스크리닝, 확인 및/또는 적용 방법에 관한 것이다.
식물에 유익한 특성을 부여하는 공지된 절차, 예컨대 선택적 교배는 매우 비용이 높고, 느리며, 범위가 제한되고, 규제 어려움이 많을 수 있다. 상기 기술에 대한 20여년에 걸친 대규모 투자로부터의 상업적 성공은 소수에 불과했다.
고생산성 농작물의 통상적 교배 및 유전자삽입 농작물의 개발에 대한 수십 년의 성공적인 과학적 연구에도 불구하고, 다른 수단을 통한 식물 형질 개발에 대한 연구 시도는 상대적으로 거의 없었다.
본원에서 언급되는 공보의 참고문헌 목록의 상세내용은 기재 말미에 모아 두었다.
본 발명의 목적은 공지된 방법의 적어도 하나의 단점을 극복하거나 완화하는 식물에 대해 하나 이상의 유익한 특성을 부여하는데 이용되는 하나 이상의 미생물 및/또는 조성물의 선택 방법을 제공하는 것이다.
대안적으로 본 발명의 목적은 하나 이상의 식물의 개선 보조 방법 및/또는 시스템을 제공하는 것이다.
대안적으로, 적어도 공중에 유용한 선택을 제공하는 것이 목적이다.
본 발명의 제1의 광의의 측면에서, 적어도 하기 단계를 포함하는, 식물에 하나 이상의 유익한 특성을 부여할 수 있는 하나 이상의 미생물의 선택 방법이 제공된다:
a) 하나 이상의 식물(예를 들어 종자, 묘목, 절단물, 및/또는 이들의 번식체 포함)에 제1 세트의 하나 이상의 미생물의 존재 하에 성장 배지를 가하는 단계;
b) 단계 a) 후 하나 이상의 식물을 선택하는 단계;
c) 단계 b)에서 선택된 상기 하나 이상의 식물에 식물내생생물된 제2 세트의 하나 이상의 미생물을 획득하는 단계;
d) 단계 a) 내지 c)를 1회 이상 반복하는 단계로, 단계 c)에서 획득된 제2 세트의 하나 이상의 미생물은 임의의 후속 반복의 단계 a)에서 제1 세트의 미생물로 이용되는 단계.
하나의 구현예에서, 제2 세트의 하나 이상의 미생물은 단계 c)에서 상기 하나 이상의 식물로부터 단리된다.
하나의 구현예에서, 제1 세트의 하나 이상의 미생물 및/또는 제2 세트의 하나 이상의 미생물은 이후 본원에 상세히 나타낸 미생물로부터 선택된다.
하나의 구현예에서, 성장 배지는 이후 본원에 상세히 나타낸 성장 배지로부터 선택된다.
하나의 구현예에서, 하나 이상의 식물에 성장 배지를 가하는 단계에는 식물의 성장 또는 증식이 관여된다.
하나의 구현예에서, 둘 이상의 식물에 하나 이상의 미생물의 존재 하에 성장 배지가 가해진다. 다른 구현예에서, 10 내지 20 식물에 제1 세트의 미생물의 존재 하에 성장 배지가 가해진다. 다른 구현예에서, 20 이상, 100 이상, 300 이상, 500 이상, 또는 1000 이상의 식물에 제1 세트의 미생물의 존재 하에 성장 배지가 가해진다.
하나의 구현예에서, 하나 이상의 식물은 하나 이상의 선택 기준에 기반하여 선택된다. 하나의 구현예에서, 하나 이상의 식물은 하나 이상의 표현형 형질에 기반하여 선택된다. 하나의 바람직한 구현예에서, 하나 이상의 식물은 바람직한 표현형 형질의 존재에 기반하여 선택된다. 하나의 구현예에서, 표현형 형질은 이후 본원에 상세히 나타낸 것들 중 하나이다. 하나의 구현예에서, 하나 이상의 식물은 하나 이상의 유전형 형질에 기반하여 선택된다. 하나의 바람직한 구현예에서, 하나 이상의 식물은 바람직한 유전형 형질의 존재에 기반하여 선택된다. 하나의 구현예에서, 하나 이상의 식물은 하나 이상의 유전형 및 하나 이상의 표현형 형질의 조합에 기반하여 선택된다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 방법의 상이한 반복에서 상이한 선택 기준이 이용될 수 있다.
하나의 구현예에서, 제2 세트의 하나 이상의 미생물은 선택된 하나 이상의 식물의 뿌리, 줄기 및/또는 잎(생식 포함) 조직으로부터 단리된다. 대안적으로, 제2 세트의 하나 이상의 미생물은 선택된 하나 이상의 식물의 전체 식물 조직으로부터 단리된다. 다른 구현예에서, 식물 조직이 표면 멸균된 후, 하나 이상의 미생물이 하나 이상의 식물의 임의 조직으로부터 단리될 수 있다. 상기 구현예는 식물내생생물(endophyte) 미생물의 표적화된 선택을 허용한다. 다른 구현예에서, 제2 세트의 하나 이상의 미생물은 선택된 식물 주변의 성장 배지로부터 단리될 수 있다.
다른 구현예에서, 제2 세트의 하나 이상의 미생물은 조정제 형태로 획득된다.
하나의 구현예에서, 하나 이상의 미생물은 발아 후 임의 시점에 단계 c)에서 획득된다.
둘 이상의 미생물이 단계 c)에서 획득되는 하나의 구현예에서, 방법은 둘 이상의 미생물을 개별 단리물로 분리하는 단계, 둘 이상의 개별 단리물을 선택하는 단계, 이어서 선택된 둘 이상의 단리물을 조합하는 단계를 추가로 포함한다.
다른 구현예에서, 방법은 단계 a) 내지 c)를 1회 이상 반복하는 것을 추가로 포함하며, 여기서 둘 이상의 미생물이 단계 c)에서 획득되는 경우, 둘 이상의 미생물은 개별 단리물로 분리되고, 둘 이상의 개별 단리물이 선택된 후 조합되며, 조합된 단리물이 후속 반복의 단계 a)에서 제1 세트의 하나 이상의 미생물로 이용된다. 따라서, 단계 c)에서 획득된 하나 이상의 미생물을 방법의 단계 a)에서 이용하는 것에 대해 언급되는 경우, 본 발명의 상기 구현예의 조합 단리물의 이용을 포함하는 것으로 간주되어야 한다.
다른 구현예에서, 본 발명의 둘 이상의 방법이 별도로 수행되고, 각각의 별도 방법의 단계 c)에서 획득된 제2 세트의 하나 이상의 미생물이 조합될 수 있다. 하나의 구현예에서, 조합된 미생물은 본 발명의 방법의 임의의 후속 반복의 단계 a)에서 제1 세트의 하나 이상의 미생물로 이용된다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 제1 측면의 방법은 또한 식물에 하나 이상의 유익한 특성을 부여할 수 있는 하나 이상의 식물내생생물 미생물의 확인 및/또는 선택에 유용할 수 있다.
하나의 구현예에서, 식물 재료(예를 들어 종자, 묘목, 절단물, 및/또는 이들의 번식체 포함)는 단계 a)를 위한 미생물원으로 이용될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 단계 a)에서 미생물원으로 이용되는 식물 재료는 종자 재료이다. 바람직하게는, 식물 재료가 표면 멸균된다.
다른 구현예에서, 본 발명의 제1 측면의 방법은 식물에 하나 이상의 유익한 특성을 부여할 수 있는 하나 이상의 배양할 수 없는 미생물의 확인 및/또는 선택에 유용할 수 있다. 상기 구현예에서, 식물 재료(예를 들어 종자, 묘목, 절단물, 및/또는 이들의 번식체 포함)는 단계 a)를 위한 미생물원으로 이용될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 단계 a)에서 미생물원으로 이용되는 식물 재료는 외식편 재료(예를 들어, 식물 절단물)이다. 바람직하게는, 식물 재료가 표면 멸균된다.
제2의 광의의 측면에서, 하나 이상의 미생물 및/또는 조성물의 존재 하에 상기 식물(들)의 평가를 위한 배열을 포함하는, 본원에 기재된 바와 같은 방법에 따른 하나 이상의 식물의 개선 보조 방법이 제공된다. 방법은 바람직하게는 적어도 본 발명의 제1, 제7(및/또는 관련) 측면, 및/또는 제8(및/또는 관련) 측면의 방법의 단계를 포함한다.
하나의 구현예에 따르면, 식물(들)은 제1 영역에서 성장시키기 위한 것이다. 미생물(들)은 제1 영역에 존재할 수도 존재하지 않을 수도(또는 적어도 유의미한 정도로 존재할 수도 존재하지 않을 수도) 있다.
"영역" 및 "제1 영역"은 토지의 하나 이상의 영역을 의미하는 것으로 광의적으로 해석되어야 한다. 토지 영역은 지리적/정치적/사적 토지 경계에 의해 또는 유사한 특성, 예컨대 기후, 토양 특성, 특정 해충의 존재 등을 갖는 토지 영역에 의해 정의될 수 있다.
바람직하게는 평가는 미생물(들)이 존재하는 제2 영역에서 수행되지만, 이것이 결코 필수적인 것은 아니다. 미생물이 미생물 기탁처를 포함하는 다른 원천에서 수득되고 식물 재료 및/또는 토양에 인공적으로 식물내생생물될 수 있다. 또한, 식물(들)은 본질적으로 통상적 방식으로 배양될 수 있지만, 보통 식물(들)에 연관되지 않는 미생물을 갖는 영역, 적어도 제1 영역에서는 당분야 숙련가에 의해 이해될 바와 같이 인공적인 성장 환경이 대안적으로 이용될 수 있다. 따라서 반드시 일반적으로 이용되지는 않을 가능한 유익 미생물/식물 상관관계가 확인될 수 있다.
바람직하게는 배열 단계는 하기 중 하나 이상의 배열을 포함한다:
- 평가될 하나 이상의 식물의 정체 또는 식물 유형의 수령 또는 전송;
- 평가될 하나 이상의 식물 또는 식물 유형으로부터의 식물 재료의 수령 또는 전송;
- 미생물(들) 및/또는 조성물(들)의 확인 및/또는 선택;
- 미생물(들) 및/또는 조성물(들)의 획득; 및
- 미생물(들) 및/또는 조성물(들)과 식물 재료의 연관화.
바람직하게는 본 방법은 상기 미생물(들) 및/또는 조성물(들)의 존재 하에 상기 식물(들)의 평가(또는 상기 평가를 위한 배열) 단계를 포함한다.
평가 단계는 바람직하게는 본원에 기재된 방법, 특정 구현예에서 본 발명의 하나 이상의 제1 측면, 제7(및/또는 관련) 측면 또는 제8(및/또는 관련) 측면의 방법의 하나 이상의 단계 수행을 포함한다.
상기 확인된 다양한 단계는 요청을 하는 제1 및 요청에 대응하는 제2의 적어도 2 당사자가 관여되는 것이 바람직하지만, 단일 단체에 의해 수행될 수도 있다. 다양한 에이전트가 하나 또는 두 당사자로 작용할 수 있으며, 다양한 수준의 자동화가 이용될 수 있음을 주지하라. 예를 들어, 특정 요청에 반응하여, 운영자가 요구하는 입력이 거의 또는 전혀 없이, 해당 또는 유사 식물(들)에 대해 공지된 미생물 연관성에 기반한 데이터베이스의 프로세서 문의에 의해 미생물(들)이 선택될 수 있다.
또한, 평가는 요청 당사자에 의해 및/또는 제1 영역에서 수행될 수 있다. 제1 영역에서의 평가 수행은 평가가 정확하고 식물(들) 또는 미생물(들)에 영향을 줄 수 있는 고려되지 않은 예측하지 못한 환경적 요인이 없음을 더 확실히 한다.
평가 이후 또는 이들의 과정 동안, 방법은 바람직하게는 하기 중 하나 이상을 추가로 포함한다:
- 식물 재료와의 조합을 포함하여, 하나 이상의 미생물(또는 적어도 이들의 정체) 및/또는 조성물(들)을 제1 영역으로 수령 또는 송부하는 단계; 및
- 상기 미생물(들) 및/또는 조성물(들)의 존재 하에 제1 영역에서 상기 식물(들) 또는 다른 식물(바람직하게는 유사한 특성을 가짐)을 성장시키는 단계.
제2 측면의 방법은 제1 당사자에 의해 구현될 수 있다:
- 식물(들)에서 개선의 필요성을 확인하는 단계;
- 임의의 관련 정보와 함께 제2 당사자에게 이들의 정체 및/또는 관련 식물 재료를 송부하는 단계, 및
- 식물 재료 및/또는 하나 이상의 미생물 및/또는 이들의 정체 및/또는 조성물(들)을 수령하는 단계.
수령 단계는 바람직하게는 식물/미생물 및/또는 식물/조성물 연관성 평가에 따라 또는 그 결과 수행된다. 바람직하게는 평가는 본원에 기재된 방법, 특정 구현예에서 제1 측면, 제7(및/또는 관련) 측면 또는 제8(및/또는 관련) 측면의 방법을 이용하여 수행된다.
제2 측면의 방법은 추가적으로 또는 대안적으로 제2 당사자에 의해 구현될 수 있다:
- 임의의 관련 정보와 함께 제1 당사자로부터 식물(들)의 정체 및/또는 관련 식물 재료를 수령하는 단계, 및
- 식물 재료 및/또는 하나 이상의 미생물(들) 및/또는 이들의 정체 및/또는 조성물(들)을 제1 당사자에게 송부하는 단계.
송부 단계는 바람직하게는 식물/미생물 및/또는 식물/조성물 연관성 평가에 따라 또는 그 결과 수행된다. 바람직하게는 평가는 본원에 기재된 방법, 특정 구현예에서 제1 측면, 제7(및/또는 관련) 측면 또는 제8(및/또는 관련) 측면의 방법을 이용하여 수행된다.
제3 측면에 따르면, 제2 측면의 방법을 실시하기 위한 시스템이 제공된다.
제3 측면의 시스템에는 바람직하게는 하기 중 하나 이상이 포함된다:
- 평가될 하나 이상의 식물의 정체 또는 식물 유형의 수령 또는 전송 수단;
- 평가될 하나 이상의 식물 또는 식물 유형으로부터 식물 재료의 수령 또는 전송 수단;
- 미생물(들) 및/또는 조성물(들)의 확인 및/또는 선택 수단;
- 미생물(들) 및/또는 조성물(들)의 획득 수단;
- 미생물(들) 및/또는 조성물(들)과 식물 재료의 연관 수단;
- 상기 미생물(들) 및/또는 조성물(들)의 존재 하에 상기 식물(들)의 평가 수단;
- 식물 재료와의 조합을 포함하여, 하나 이상의 미생물(또는 적어도 이들의 정체) 및/또는 조성물(들)의 제1 영역으로의 수령 또는 송부 수단; 및
- 상기 미생물(들) 및/또는 조성물(들)의 존재 하에 제1 영역에서 상기 식물(들) 또는 다른 식물(바람직하게는 유사한 특성을 가짐)의 성장 수단.
당분야 숙련가에게 공지된 수단을 이용하여 제3 측면의 시스템에 필요한 기능성을 제공할 수 있다. 예를 들어, 인터넷을 포함하는 통상적인 커뮤니케이션 수단을 이용하여 식물/미생물의 정체를 전달할 수 있다; 통상적 캐리어 수단을 이용하여 식물 재료/미생물/조성물(들)을 전달할 수 있다; 통상적 수단 및 절차를 이용하여 미생물 및/또는 조성물을 식물 재료와 연관시킬 수 있고, 상기 식물(들) 및/또는 식물/미생물 및/또는 식물/조성물 연관성 평가를 위해 통상적 수단이 이용될 수 있다.
바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 시스템은 바람직하게는 식물/미생물 연관성의 평가에 따라 또는 그 결과, 식물(들)의 개선을 위한 요청(들)을 전송하고, 이어서 식물 재료 및/또는 하나 이상의 미생물 및/또는 이들의 정체를 수령하기 위해 배치된 시설에 의해 구현된다. 바람직하게는, 평가는 본원에 기재된 방법, 특정 구현예에서 제1 측면, 제7(및/또는 관련) 측면, 또는 제8(및/또는 관련) 측면의 방법을 이용하여 수행된다.
제2 측면의 시스템은 추가적으로 또는 대안적으로, 바람직하게는 식물/미생물 또는 식물/조성물 연관성 평가에 따라 또는 그 결과, 임의의 관련 정보와 함께 식물(들)의 정체 및/또는 관련 식물 재료를 수령하고; 및 식물 재료 및/또는 하나 이상의 미생물 및/또는 이들의 정체 및/또는 조성물(들)을 송부하기 위해 배치된 시설에 의해 구현될 수 있다. 바람직하게는, 평가는 본원에 기재된 방법, 특정 구현예에서 제1 측면, 제7(및/또는 관련) 측면 또는 제8(및/또는 관련) 측면의 방법을 이용하여 수행된다.
본 발명의 제4의 광의의 측면에 따르면, 본원에서 이전에 기재된 바와 같은 방법에 의해 획득되거나, 선택되거나 또는 단리되는 미생물이 제공된다. 하나의 구현예에서, 미생물은 식물내생생물이다. 하나의 구현예에서, 미생물은 배양할 수 없다.
본 발명의 제5의 광의의 측면에 따르면, 식물 성장, 품질 및/또는 건강을 지지하기 위한 조성물 및/또는 식물의 성장, 품질 및/또는 건강을 억제 또는 저해하기 위한 조성물의 제조 방법이 제공되며, 방법은 본원에서 이전에 기재된 방법의 단계 및 방법에 의해 선택되는 하나 이상의 미생물과 하나 이상의 추가 성분을 조합하는 추가 단계를 포함한다.
본 발명의 제6의 광의의 측면에 따르면, 제4의 광의의 측면의 또는 제5 광의의 측면의 방법에 의해 제공되는 바와 같은 하나 이상의 미생물을 포함하는 조성물이 제공된다.
본 발명의 제7의 광의의 측면에서, 식물에 하나 이상의 유익한 특성을 부여할 수 있는 조성물의 선택 방법이 제공되며, 방법은 적어도 하기 단계를 포함한다:
a) 하나 이상의 배지 중 본 발명의 제1 측면의 방법에 의해 선택되는 하나 이상의 미생물을 배양하여 하나 이상의 배양물을 제공하는 단계;
b) 일정 시기 후 하나 이상의 배양물 중 하나 이상의 배지로부터 하나 이상의 미생물을 분리하여 실질적으로 미생물이 없는 하나 이상의 조성물을 제공하는 단계;
c) 하나 이상의 식물(예를 들어 종자, 묘목, 절단물, 및/또는 이들의 번식체 포함)에 단계 b)의 하나 이상의 조성물을 가하는 단계;
d) 하나 이상의 식물에 하나 이상의 유익한 특성을 부여하는 것이 관찰되는 경우, 단계 c)로부터 하나 이상의 조성물을 선택하는 단계.
본 발명의 제7의 광의의 측면에 관련된(그러나 이와는 다른) 본 발명의 하나의 측면에서, 식물에 하나 이상의 유익한 특성을 부여할 수 있는 조성물의 선택 방법이 제공되며, 방법은 적어도 하기 단계를 포함한다:
a) 하나 이상의 배지 중 본 발명의 제1 측면의 방법에 의해 선택되는 하나 이상의 미생물을 배양하여 하나 이상의 배양물을 형성하는 단계;
b) 단계 a)의 하나 이상의 배양물을 불활성화하여 하나 이상의 불활성화된 미생물을 함유하는 하나 이상의 조성물을 제공하는 단계;
c) 하나 이상의 식물(예를 들어 종자, 묘목, 절단물, 및/또는 이들의 번식체 포함)에 단계 b)의 하나 이상의 조성물을 가하는 단계;
d) 하나 이상의 식물에 하나 이상의 유익한 특성을 부여하는 것이 관찰되는 경우, 단계 c)로부터 하나 이상의 조성물을 선택하는 단계.
본 발명의 제8의 광의의 측면에서, 식물에 하나 이상의 유익한 특성을 부여할 수 있는 조성물을 제조할 수 있는 하나 이상의 미생물의 선택 방법이 제공되며, 방법은 적어도 하기 단계를 포함한다:
a) 하나 이상의 배지 중 본 발명의 제1 측면의 방법에 의해 선택되는 하나 이상의 미생물을 배양하여 하나 이상의 배양물을 제공하는 단계;
b) 일정 시기 후 단계 a)로부터 하나 이상의 배양물 중 하나 이상의 배지로부터 하나 이상의 미생물을 분리하여 실질적으로 미생물이 없는 하나 이상의 조성물을 제공하는 단계;
c) 하나 이상의 식물(예를 들어 종자, 묘목, 절단물, 및/또는 이들의 번식체 포함)에 단계 b)의 하나 이상의 조성물에 가하는 단계;
d) 하나 이상의 식물에 하나 이상의 유익한 특성을 부여하는 것이 관찰된 하나 이상의 조성물에 연관된(또는 다른 용어로는 이를 제조하기 위해 이용되는) 하나 이상의 미생물을 선택하는 단계.
본 발명의 제8의 광의의 측면에 관련된(그러나 이와는 다른) 하나의 측면에서, 식물에 하나 이상의 유익한 특성을 부여할 수 있는 조성물을 제조할 수 있는 하나 이상의 미생물의 선택 방법이 제공되며, 방법은 적어도 하기 단계를 포함한다:
a) 하나 이상의 배지 중 하나 이상의 미생물을 배양하여 하나 이상의 배양물을 제공하는 단계;
b) 일정 시기 후 하나 이상의 배양물 중 하나 이상의 배지로부터 하나 이상의 미생물을 분리하여 실질적으로 미생물이 없는 하나 이상의 조성물을 제공하는 단계;
c) 하나 이상의 식물(예를 들어 종자, 묘목, 절단물, 및/또는 이들의 번식체 포함)에 단계 b)의 하나 이상의 조성물을 가하는 단계;
d) 하나 이상의 식물에 하나 이상의 유익한 특성을 부여하는 것이 관찰된 하나 이상의 조성물에 연관된(또는 다른 용어로는 이를 제조하기 위해 이용되는) 하나 이상의 미생물을 선택하는 단계; 및
e) 단계 d)에서 선택된 하나 이상의 미생물을 본 발명의 제1, 제8 또는 제9 측면의 방법의 단계 a)에서 이용하는 단계.
관련 측면에서, 제8(및/또는 관련) 측면의 방법의 단계 b)는 단계 a)의 하나 이상의 배양물을 불활성화하는 단계 b)로 치환되어 하나 이상의 불활성화된 미생물을 함유하는 하나 이상의 조성물을 제공한 뒤, 상기 조성물을 방법의 단계 c)에서 이용할 수 있다.
제1, 제7(및/또는 관련) 및 제8(및/또는 관련) 측면의 방법은 방법이 임의 수의 반복으로 동시에 또는 순차적으로 수행되는 것을 포함하는 임의 조합으로 조합될 수 있고, 방법으로부터 선택되거나 단리된 조성물 및/또는 미생물은 개별적으로 이용되거나 조합되어 임의의 한 방법의 반복 라운드에서 이용되는 것이 이해되어야 한다. 예로서, 제7(및/또는 관련) 측면의 방법이 수행되고 조성물이 선택될 수 있다. 조성물의 선택은 단계 b)에서 배지로부터 분리된 하나 이상의 미생물이 하나 이상의 식물에 유익한 특성을 부여하기 위해 바람직하다는 것을 나타낸다(하나 이상의 미생물이 선택된 조성물을 제조할 수 있으므로). 이어서 하나 이상의 미생물은 제1 측면, 제7(및/또는 관련) 측면 또는 제8(및/또는 관련) 측면의 방법의 또 다른 라운드에서 이용될 수 있다. 대안적으로, 방법의 조합은 역순으로 수행될 수 있다. 이는 임의 순서 및 조합으로 임의 횟수가 반복될 수 있다. 따라서 본 발명은 본 발명의 임의의 다른 방법에서 본 발명의 방법에 의해 획득되거나, 선택되거나 또는 단리된 하나 이상의 미생물, 조성물 또는 식물의 용도를 제공한다.
본 발명의 제9의 광의의 측면에서, 본 발명의 제7(및/또는 관련) 또는 제8(및/또는 관련)의 광의의 측면의 방법의 결과 수득되는 조성물이 제공된다.
본 발명의 제10의 광의의 측면에서, 본원에서 이전에 기재된 바와 같은 방법에 의해 획득되거나, 선택되거나 또는 단리된 둘 이상의 미생물의 조합이 제공된다.
다른 측면에서, 본 발명은 하나 이상의 식물에 하나 이상의 유익한 특성을 부여하기 위한 본 발명의 방법에 의해 획득되거나, 선택되거나 또는 단리된 하나 이상의 조성물 및/또는 미생물의 용도를 제공한다.
본 발명의 방법이 하나의 종에 긍정적 유익성을 그리고 다른 종에 부정적 유익성을 동시에 부여할 수 있는 미생물 조합을 확인하기 위해, 식물의 둘 이상의 상이한 종에 제1 측면의 방법의 단계 a) 내지 d)를 적용하는 것이 또한 관여될 수 있음이 이해되어야 한다. 예를 들어, 식품 농작물의 성장 및 생존을 개선하고 동시에 경쟁 농작물 또는 잡초의 성장을 억제하거나 저해할 수 있는 미생물 그룹을 확인하고자 할 수 있다. 이는 단계 a)에서 둘 이상의 상이한 식물종을 이용하거나 상이한 종에 대해 별도 방법을 수행하고, 적절한 시점에 이들 방법에서 획득된 미생물을 조합하여 추가 반복을 수행함으로써 달성될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 방법에서 선택된 식물을 제공한다.
본 발명은 또한 식물 육종 프로그램에서 본 발명의 방법의 용도를 제공하며, 식물 육종 프로그램은 본 발명의 방법을 수행하는 것을 포함한다.
다른 측면에서, 본 발명은 표 4에 열거된 하나 이상의 미생물을 포함하는 조성물을 제공한다. 하나의 구현예에서, 하나 이상의 미생물은 식물내생생물이다.
다른 측면에서, 본 발명은 표 3에 열거된 하나 이상의 미생물을 포함하는 조성물을 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은 표 2에 열거된 하나 이상의 미생물을 포함하는 조성물을 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은 식물 생물량을 증가시키기 위한 표 4에 열거된 하나 이상의 미생물 또는 이를 포함하는 조성물의 용도를 제공한다. 하나의 구현예에서, 식물은 옥수수이다. 하나의 구현예에서, 하나 이상의 미생물은 식물내생생물이다.
다른 측면에서, 본 발명은 하나 이상의 식물에서 탄수화물 농도를 증가시키기 위한 표 3에 열거된 하나 이상의 미생물 또는 이를 포함하는 조성물의 용도를 제공한다. 하나의 구현예에서, 하나 이상의 식물은 바질이다.
다른 측면에서, 본 발명은 식물 생물량을 증가시키기 위한 표 2에 열거된 하나 이상의 미생물 또는 이를 포함하는 조성물의 용도를 제공한다. 하나의 구현예에서, 하나 이상의 식물은 호밀풀이다.
본 발명은 또한 광의적으로 개별적으로 또는 종합적으로 둘 이상의 부분, 요소 또는 특징의 임의 또는 모든 조합으로 출원 명세서에서 언급되거나 나타내는 부분, 요소 및 특징으로 구성된 것으로 말할 수 있고, 본 발명이 관련된 분야에서 공지된 균등물을 갖는 구체적 정수가 본원에서 언급되는 경우, 이러한 공지된 균등물은 개별적으로 나타낸 것과 마찬가지로 본원에 포함된 것으로 간주된다.
모두 그 신규한 측면에서 고려되어야 하는 본 발명의 이들 및 다른 측면은 단지 예로서 제공되는 하기 기재로부터 다음과 같은 첨부 도면을 참조하여 자명해질 것이다:
도 1: 본 발명의 하나의 구현예에 따른 시스템을 나타낸다;
도 2: 본 발명의 하나의 구현예의 방법의 순서도를 나타낸다.
하기는 일반 용어로 제공되는 본 발명의 바람직한 형태의 설명이다. 본 발명은 이후 제공되는 실시예로부터 추가 규명될 것이다.
본 발명자(들)은 본 발명의 방법의 이용을 통해 하나 이상의 식물에 하나 이상의 유익한 특성을 부여할 수 있는 미생물을 쉽게 확인할 수 있음을 발견하였다. 방법은 광의적으로는 이용되는 식물 및 미생물 모집단에서 변동성(예컨대 유전적 변동성, 또는 예를 들어 표현형의 변동성)의 존재에 기반한다. 본 발명자는 상기 변동성이 식물에 대한 용도의 하나 이상의 미생물 선택의 유도된 방법을 지지하기 위해 그리고 특정 목적을 위해 유익하고 통상적 기법을 이용해서 절대 인식되지 않았을 수 있는 특정 식물/미생물 조합을 확인하기 위해 이용될 수 있음을 확인하였다.
본 발명의 방법은 식물 육종 프로그램의 일환으로 이용될 수 있다. 방법은 하나 이상의 식물에 하나 이상의 특성을 부여할 수 있는 미생물 및/또는 조성물을 확인하는 것에 부가하여, 미생물 총에 의해 영향을 받는 특정 유전형/표현형을 갖는 식물 선택을 허용하거나 적어도 이를 보조할 수 있다.
하나의 측면에서, 본 발명은 식물에 하나 이상의 유익한 특성을 부여할 수 있는 하나 이상의 미생물(들)의 선택 방법에 관한 것이다. 본원에서 "식물에 유익한 특성"으로 언급되는 것은 임의 단체 또는 시스템에 대한 상업적 유익성 또는 임의의 다른 유익성을 갖는, 인간, 다른 동물, 환경, 서식지, 생태계, 경제에 유익할 수 있는 특성을 포함하는 임의의 특정 목적을 위해 유익한 임의의 특성을 의미하는 것으로 광의적으로 해석되어야 함이 이해되어야 한다. 따라서, 이 용어는 식물의 성장 또는 성장 속도의 억제, 감소 또는 저해를 포함하여, 식물의 하나 이상의 특징을 억제하거나, 감소시키거나 또는 차단할 수 있는 특성을 포함하는 것으로 간주되어야 한다. 본 발명은 단지 예로서, 하나 이상의 식물에 대한 긍정적 유익성을 확인하거나 식물을 개선하는 관점에서 본원에 기재될 수 있다. 그러나 발명이 식물에 부여될 수 있는 부정적 유익성의 확인에도 동등하게 적용 가능함이 이해되어야 한다.
이러한 유익한 특성에는 비제한적으로 예를 들어 하기가 포함된다: 특정 목적, 구조, 색상, 화학적 조성 또는 프로필, 맛, 냄새, 개선된 품질을 위한 식물의 개선된 성장, 건강 및/또는 생존 특징, 적합성 또는 품질. 다른 구현예에서, 유익한 특성에는 비제한적으로 예를 들어 하기가 포함된다; 잡초로 확인된 식물의 성장 감소, 억제 또는 저해; 식물의 키 및 너비를 바람직한 원예 크기로 제한; 지상 커버 적용, 예컨대 차로 및 길가 강둑 및 침식 제어 돌출부에서 이용되는 식물의 키 제한; 잔디밭 적용, 예컨대 풀베기의 필요성을 감소시키기 위한 정원, 정원 볼링장 및 골프 코스에서 이용되는 식물의 성장 둔화; 원예 화훼 관목에서 잎/꽃의 비 감소; 식물 페로몬의 생산 및/또는 이에 대한 반응 조절(주변 식물계에서 증가된 탄닌 생산 및 수렵 채집종에 대한 매력 감소를 일으킴).
본원에서 이용되는 "개선된"은 본 발명의 적용 전에 식물 또는 식물들에 이미 존재할 수 있는 식물 특징의 개선 또는 본 발명의 적용 전에 식물 또는 식물들에 존재하지 않았던 특징의 존재를 포괄하는 것으로 광의적으로 간주되어야 한다. 예로서, "개선된" 성장은 식물이 관련 조건 하에 성장하는 것으로 이전에 알려지지 않았던 식물의 성장을 포함하는 것으로 간주되어야 한다.
본원에서 이용되는 "저해 및 억제" 등의 용어는 광의적으로 간주되어야 하며, 일부 구현예에서 바람직할 수 있더라도 완전한 저해 또는 억제를 필요로 하는 것으로 간주되어서는 안 된다.
본 발명의 설명을 돕기 위해, 용어 "제1 세트의 하나 이상의 미생물" 및 "제2 세트의 하나 이상의 미생물"은 본원에서 본 발명의 방법의 단계 a)에 적용된 미생물(들)의 세트 또는 그룹과 단계 c)에서 획득된 미생물(들)의 세트 또는 그룹을 구별하기 위해 이용될 수 있다. 특정 구현예에서, 미생물 세트는 다를 것이다; 예를 들어, 제2 세트는 제1 세트를 식물과 조합한 뒤 하나 이상의 선택 기준에 기반하여 하나 이상의 식물을 선택한 결과로서의, 제1 세트의 서브세트일 수 있다. 그러나 이것이 항상 해당되지는 않을 수 있음이 이해되어야 하며, 따라서 이 용어의 이용이 이처럼 제한된 방식으로 간주되어서는 안 된다.
특정 구현예에서, 본 발명의 방법은 식물에 하나 이상의 유익한 특성을 부여할 수 있는 하나 이상의 미생물의 선택에 관한 것이다. 이후 본원에서 추가 기재되는 바와 같이, 이러한 미생물(들)은 식물 내, 식물 상 및/또는 식물 근권 내에 함유될 수 있다. 따라서, 식물로"부터" 제2 세트의 하나 이상의 미생물의 획득에 대해 본원에 나타내는 경우, 문맥 상 달리 요구되지 않는 한 식물 내, 식물 상 및/또는 식물 근권 내에 함유된 제2 세트의 미생물의 획득에 대한 언급을 포함하는 것으로 간주되어야 한다. 언급의 용이성을 위해, "에 연관된"이라는 언어는 식물 내, 식물 상 및/또는 식물 근권 내에 함유된 미생물(들)을 언급하는 것과 동의어로 이용될 수 있다.
광의적으로, 방법은 적어도 a) 제1 세트의 하나 이상의 미생물의 존재 하에 성장 배지 중 하나 이상의 식물을 성장시키는 단계; b) 단계 a) 이후 하나 이상의 식물을 선택하는 단계, 및 c) 단계 b)에서 선택된 상기 하나 이상의 식물에 연관된 제2 세트의 하나 이상의 미생물을 획득하는 단계를 포함한다. 하나 이상의 식물, 성장 배지 및 하나 이상의 미생물은 단계 a) 이전에 임의의 적절한 순서로 별도 제공되고 조합될 수 있다. 특히, 본 발명은 단계 a) 내지 c)가 1회 이상 반복될 수 있는 반복 방법을 제공하며, 단계 c)에서 획득된 하나 이상의 미생물은 방법의 다음 사이클의 단계 a)에서 이용된다. 하나의 구현예에서, 단계 a) 내지 c)는 1회 반복된다. 다른 구현예에서, 단계 a) 내지 c)는 2회 반복된다. 다른 구현예에서, 단계 a) 내지 c)는 3회 반복된다. 다른 구현예에서, 단계 a) 내지 c)는 적어도 원하는 유익한 특성이 관찰될 때까지 반복된다.
단계 a) 내지 c)의 원하는 수의 반복 후, 방법은 단계 c)로부터 한 세트의 하나 이상의 미생물 획득으로 종결될 수 있음이 이해될 것이다.
방법이 단계 c)에서 획득된 모집단에서 미생물의 확인을 필요로 하거나 획득된 개별 미생물 또는 미생물의 조합의 특성 결정을 필요로 하지 않음이 이해되어야 한다. 그러나 필요한 경우 유익한 특성의 평가, 확인 및/또는 결정이 수행될 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에서 본 발명의 방법의 최종 단계에서 미생물을 단리하고 확인하여 상업적 이용을 위한 이들의 안전성을 결정하고 규제 요건을 충족하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 경우, 유전적 및/또는 표현형 분석이 수행될 수 있다.
하나의 구현예에서, 단계 a)는 적어도 2 식물을 이용하여 수행된다. 다른 구현예에서, 10 내지 20 식물이 이용된다. 다른 구현예에서 20 이상, 50 이상, 100 이상, 300 이상, 500 이상 또는 1000 이상의 식물이 이용된다. 이후 주지되는 바와 같이, 2 이상의 식물이 본 발명의 특정 방법에서 이용되는 경우, 이들이 동일한 변종 또는 종일 필요는 없다. 예를 들어, 하나의 구현예에서 하나의 식물 변종 또는 종에 긍정적 유익성을 그리고 다른 식물 변종 또는 종에 부정적 유익성을 부여할 수 있는 미생물을 선택하는 것이 바람직할 수 있다.
하나의 구현예에서, 단계 c)에서 2 이상이 미생물이 획득된 경우, 방법은 2 이상의 미생물을 개별 단리물로 분리하는 단계, 2 이상의 개별 단리물을 선택하는 단계, 이어서 선택된 2 이상의 단리물을 조합하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 이는 본 발명의 방법의 결론에서 획득되는 미생물 세트를 생성할 수 있다. 그러나 하나의 구현예에서, 조합된 단리물은 이후 방법의 후속 라운드의 단계 a)에서 이용될 수 있다. 예로서, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 개별 단리물이 조합될 수 있다. 본 발명자들은 이들 추가적인 분리, 선택 및 조합 단계를 방법의 각 반복과 함께 이용하여 단계 a) 내지 c)가 1회 이상 반복되거나 사이에 배치되거나 달리 개별 단리물이 선택되지 않고 조합되는 방법과 조합되는 반복 방법을 고려한다.
이들 조합은 미생물 간 상승적 상호작용(예컨대 식물 성장)을 촉진하는 이전에 공지되지 않은 바람직한 특성을 검출할 것으로 예상된다. 반복 단계 a) 내지 c)의 이용은 둘 이상의 미생물의 원 모집단을 바람직한 특성 또는 특징을 부여하기 위해 식물과 상호작용하는 미생물로 유도할 것이다. 다시 말하면, 방법은 식물 미생물 그룹집 내에서 적합한 미생물의 농축을 허용할 것이다.
개별 단리물의 선택은 임의의 적절한 선택 기준에 기반하여 일어날 수 있다. 예를 들어 무작위일 수도 있고, 본 발명의 방법을 수행하여 관찰되는 유익한 특성 또는 특성들에 기반할 수도 있고, 또는 미생물 정체에 대한 정보가 공지된 경우, 미생물이 특정한 유익한 특성을 갖는 것으로 이전에 인식된 기반 하에 있을 수 있다.
또한 본 발명의 2 이상의 방법은 별도로 또는 병렬 수행될 수 있고, 각 방법에서 생성되는 미생물은 단일 조성물로 조합될 수 있다. 예를 들어, 하나는 하나 이상의 제1의 유익한 특성을 투여할 수 있는 미생물을 확인하기 위해, 그리고 다른 하나는 하나 이상의 제2의 유익한 특성을 부여할 수 있는 미생물을 확인하기 위해 2 별도의 방법이 수행될 수 있다. 별도의 방법은 동일한 유익한 특성을 갖는 또는 다른 유익한 특성을 갖는 미생물을 확인하기 위한 것일 수 있다. 별도의 방법에서 이용되는 미생물 및 식물은 동일하거나 상이할 수 있다. 미생물의 추가 최적화가 필요한 경우, 미생물의 단일 조성물이 본 발명의 하나 이상의 추가 라운드에 적용될 수 있다. 대안적으로, 미생물의 단일 조성물은 필요에 따라 추가 최적화 없이 식물 농작물에 관련 특성을 부여하기 위해 이용될 수 있다. 상기 방식의 본 발명의 2 이상의 방법의 조합은 통상 특정 환경에서 시간 및/또는 공간으로 분리될 수 있는 미생물의 선택 및 조합을 허용한다.
본 발명의 특정 구현예에서, 방법은 본 발명의 결론 시 또는 방법의 임의의 후속 반복의 단계 a)에서 제2 세트의 하나 이상의 미생물을 이용하기 전에, 선택된 하나 이상의 식물에 연관된 제2 세트의 하나 이상의 미생물의 모집단을 성장시키기 위해, 방법의 단계 c)에서 선택된 하나 이상의 식물의 성장 또는 증식을 포함할 수 있다. 하나 이상의 식물(또는 연관 미생물)이 본 발명의 결론 시 성장되거나 증식된 경우, 이들은 그 형태로 이용되거나 판매될 수 있다. 대안적으로, 하나 이상의 미생물이 하나 이상의 식물로부터 단리될 수 있거나, 미생물에 연관된 하나 이상의 식물 조직 및/또는 하나 이상의 식물 부분이 본 발명의 임의의 후속 반복에서 하나 이상의 미생물의 조정제 원천으로 또는 방법의 결론 시 임의의 다른 목적을 위해 이용될 수 있다. 하나의 구현예에서, 성장되거나 증식된 하나 이상의 식물의 종자(미생물에 연관된)는 방법의 임의의 후속 반복에서 하나 이상의 미생물의 원천으로 수득되고 이용될 수 있다. 대안적으로 본 발명의 방법의 결론 시 수득되는 경우, 종자 및 연관 미생물은 임의의 다른 목적을 위해 판매되거나 이용될 수 있다.
본 발명의 추가 방법 및 측면이 이후 본원에 기재된다.
미생물
본원에서 이용되는 용어 "미생물"은 광의적으로 간주되어야 한다. 여기에는 비제한적으로 두 원핵생물 도메인인 박테리아와 원시세균뿐만 아니라 진핵생물인 진균 및 원생생물이 포함된다. 예로서, 미생물에는 프로테오박테리아(예컨대 슈도모나스, 엔테로박터, 스테노트로포모나스, 부르크홀데리아, 리조비움, 헤르바스피릴룸, 판토에아, 세라티아, 라넬라, 아조스피릴룸, 아조리조비움, 아조토박터, 두가넬라, 델프티아, 브라디리조비운, 시노리조비움 및 할로모나스), 피르미쿠테스(예컨대 바실러스, 패니바실러스, 락토바실러스, 미코플라즈마 및 아세토박테리움), 액티노박테리아(예컨대 스트렙토마이세스, 로도코쿠스, 마이크로박테리움, 및 쿠르토박테리움), 및 진균 아스코마이코타(예컨대 트리코더마, 암펠로마이세스, 코니오타이리움, 패코엘로마이세스, 페니실리움, 클라도스포리움, 하이포크레아, 뷰베리아, 메타리지움, 베르티쿨리움, 코르디셉스, 피케아 및 칸디다), 바시디오마이코타(예컨대 코프리누스, 코르티시움 및 아가리쿠스) 및 오오마이코타(예컨대 피티움, 무코르 및 모르티에렐라)가 포함될 수 있다.
특히 바람직한 구현예에서, 미생물은 식물내생생물 또는 착생식물 또는 식물 근권에 서식하는 미생물이다. 하나의 구현예에서, 미생물은 종자-매개 식물내생생물이다.
특정 구현예에서, 미생물은 배양할 수 없다. 이는 미생물이 배양 가능한 것으로 공지되지 않았거나 당분야 숙련가에게 공지된 방법을 이용하여 배양하기 어려운 것을 의미하는 것으로 간주되어야 한다.
본 발명의 방법에서의 이용 미생물(예를 들어, 제1 세트의 하나 이상의 미생물)은 임의 원천에서 수집 또는 수득되거나 또는 임의 원천에서 수집된 재료 내에 함유되고/되거나 이에 연관될 수 있다.
하나의 구현예에서, 제1 세트의 하나 이상의 미생물은 그 토양, 식물, 진균, 동물(무척추동물 포함) 및 퇴적물, 물 및 호수와 강의 생물군을 포함하는 다른 생물군을 포함하는 임의의 일반 육지 환경으로부터; 해양 환경, 그 생물군 및 퇴적물(예를 들어 해수, 해양 진흙, 해양 식물, 해양 무척추동물(예를 들어 해면동물), 해양 척추동물(예를 들어 어류))로부터; 육지 및 해양 지각(표토 및 암석, 예를 들어 분쇄된 지각하 암석, 모래 및 점토); 극권 및 그 용융수; 대기(예를 들어 여과된 공기 분진, 구름 및 빗방울); 도시, 산업 및 기타 인공적인 환경(예를 들어 콘크리트 상의 축적된 유기 및 광물 물질, 길가 도랑, 지붕 표면, 도로 표면)으로부터 수득된다.
다른 구현예에서, 제1 세트의 하나 이상의 미생물은 적절한 미생물의 선택을 선호할 수 있는 원천에서 수득된다. 예로서, 원천은 다른 식물이 성장하기 바람직하거나 떼루아와 연관된 것으로 고려되는 특정 환경일 수 있다. 다른 예에서, 원천은 하나 이상의 바람직한 형질을 갖는 식물, 예를 들어 특정 환경에서 또는 특정한 관심 조건 하에 자연적으로 성장하는 식물일 수 있다. 예로서, 특정 식물은 모래 토양 또는 고염도 모래에서 또는 극한 온도 하에서 또는 거의 물이 없이도 자연적으로 성장할 수 있거나, 환경에 존재하는 특정 해충 또는 질환에 내성이 있을 수 있고, 특히 예를 들어 특정한 지리적 위치에서만 있을 수 있는 조건인 경우, 이러한 조건 하에서 성장시킬 상업적 농작물에 바람직할 수 있다. 추가 예로서, 미생물은 이러한 환경에서 성장한 상업적 농작물, 또는 보다 구체적으로는 임의의 특정 환경에서 성장한 농작물 중 관심 형질을 가장 잘 나타내는 개별 농작물 식물; 예를 들어, 함염 제한 토양에서 성장한 농작물 가운데 가장 빨리 성장하는 식물 또는 중증 곤충 손상 또는 질환 유행에 노출된 농작물 중 손상이 가장 적은 식물, 또는 섬유 함량, 오일 함량 등을 포함하여 원하는 양의 특정 대사물질 및 다른 화합물을 갖는 식물, 또는 바람직한 색상, 맛 또는 냄새를 나타내는 식물에서 수집될 수 있다. 미생물은 관심 식물 또는 이전에 언급된 바와 같이 진균 및 다른 동물 및 식물 생물군, 토양, 물, 퇴적물 및 다른 환경 요소를 포함하여 관심 환경에서 생기는 임의의 재료로부터 수집될 수 있다.
특정 구현예에서, 미생물은 단계 c)에서 단리된 제2 세트의 미생물로부터 분리된 개별 단리물의 조합 또는 2 이상의 별도로 수행된 본 발명의 방법에서 생성된 미생물의 조합을 포함하여, 이전에 수행된 본 발명의 방법으로부터 공급될 수 있다(예를 들어 방법의 단계 c)에서 획득되는 미생물).
본 발명에서는 특정 식물종에 대한 미생물의 바람직한 특성에 대한 기존 지식의 필요성이 요구되지 않지만, 하나의 구현예에서 본 발명의 방법에서의 이용 미생물 또는 미생물의 조합은 식물에 대한 이들의 가능하거나 예측되는 유익성의 일부 지식에 기반하여 개별 미생물종 또는 계통의 기존 수집으로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 미생물은 질소 고정을 개선하거나; 토양 유기 물질로부터 포스페이트를 배출하거나; 무기 형태의 포스페이트(예로 암석 포스페이트)로부터 포스페이트를 배출하거나; 뿌리 미소구체에서 "탄소를 고정"하거나; 식물의 근권에 살아서 식물의 주변 토양으로부터 영양분 흡수를 보조한 뒤 이를 식물에게 보다 쉽게 제공하거나; 식물 뿌리 상의 혹 수를 증가시켜 식물 별로 공생 질소 고정 박테리아(예로 리조비움종)의 수 및 식물에 의해 고정되는 질소의 양을 증가시키거나; 식물이 병원성 미생물의 침입 및 확산에 저항하는 것을 돕는 식물 방어 반응, 예컨대 ISR(유도된 전신 내성) 또는 SAR(전신 획득 내성)을 유발하거나; 자원, 예컨대 영양분 또는 공간의 경쟁적 이용 또는 길항작용에 의해 식물 성장 또는 건강에 해로운 미생물과 경쟁하거나; 식물의 하나 이상의 부분의 색상을 변경하거나 식물의 화학적 프로필, 그 냄새, 맛 또는 하나 이상의 다른 품질을 변경할 것으로 예측될 수 있다.
하나의 구현예에서, 미생물 또는 미생물의 조합(제1 세트의 하나 이상의 미생물)은 식물에 대한 이들의 가능하거나 예측되는 유익성에 대한 지식을 제공하지 않는 개별 미생물종 또는 계통의 기존 수집으로부터 선택된다. 예를 들면, 식물 성장 또는 건강을 개선하는 이들의 능력에 대한 임의 지식이 없는 식물 조직으로부터 단리된 미확인 미생물의 수집 또는 약학 약물의 개발로 이어질 수 있는 화합물을 제조하는 이들의 능력을 탐색하기 위해 수집된 미생물의 수집.
하나의 구현예에서, 미생물은 이들이 천연 서식하는 원천 재료(예를 들어 토양, 암석, 물, 공기, 분진, 식물 또는 다른 개체)로부터 단리된다. 미생물은 본 발명에서 그 목적 용도에 대한 임의의 적합한 형태로 제공될 수 있다. 그러나 단지 예로서, 미생물은 수성 현탁액, 겔, 균질물, 과립, 분말, 슬러리, 살아있는 개체 또는 건조 재료로서 제공될 수 있다. 미생물은 실질적으로 순수한 또는 혼합 배양물에서 단리될 수 있다. 이들은 농축되거나, 희석되거나, 또는 이들이 원천 재료에서 발견되는 천연 농도로 제공될 수 있다. 예를 들어, 함염 퇴적물로부터의 미생물은 퇴적물을 신선한 물에 현탁하고 퇴적물이 바닥으로 떨어지게 두어 본 발명에서의 이용을 위해 단리될 수 있다. 벌크 미생물을 함유하는 물은 적합한 침강 시기 후 경사분리에 의해 제거되고, 식물 성장 배지에 직접 적용되거나 또는 여과 또는 원심분리에 의해 농축되고, 적절한 농도로 희석되고 염이 제거된 벌크가 식물 성장 배지에 적용될 수 있다. 추가 예로서, 미네랄화 또는 독성 원천으로부터의 미생물을 유사하게 처리하여 식물에 대한 손상 가능성을 최소화하기 위해 식물 성장 재료에 적용하기 위한 미생물을 회수할 수 있다.
다른 구현예에서, 미생물(제1 세트의 하나 이상의 미생물 및/또는 제2 세트의 하나 이상의 미생물 포함)은 조정제 형태로 이용되며, 여기서 이들은 천연 서식하는 원천 재료에서 단리되지 않는다. 예를 들어, 미생물은 이들이 서식하는 원천 재료와의 조합으로; 예를 들어 식물의 토양, 또는 뿌리, 종자 또는 잎으로 제공된다.
상기 구현예에서, 원천 재료에는 미생물의 하나 이상의 종이 포함될 수 있다.
미생물의 혼합 모집단이 본 발명의 방법에서 이용되는 것이 바람직하다.
미생물이 원천 재료(예를 들어 미생물이 천연 서식하는 재료)로부터 단리되는 본 발명의 구현예에서, 숙련가에서 쉽게 공지될 임의의 하나 또는 여러 표준 기법의 조합이 이용될 수 있다. 그러나 예로서, 이들은 일반적으로 단일 미생물의 고체 또는 액체 배양물이 보통 고체 미생물 성장 배지의 표면 상의 물리적 분리에 의해 또는 액체 미생물 성장 배지 내로의 부피 희석 단리에 의해 실질적으로 순수한 형태로 수득될 수 있는 방법을 채용한다. 이들 방법에는 재료가 적절한 고체 겔 성장 배지에 걸쳐 박층으로 확산되거나 또는 재료의 연속 희석물이 멸균 배지 내에 제조되고 액체 또는 고체 배양 배지 내로 접종되는 건조 재료, 액체 현탁액, 슬러리 또는 균질물로부터의 단리가 포함될 수 있다.
필수적인 것은 아니지만, 하나의 구현예에서 미생물을 함유하는 재료는 재료 내의 모든 미생물을 증식시키거나 미생물 모집단의 일부를 선택하기 위해, 재료를 미생물 영양분(예를 들어, 니트레이트, 당 또는 식물, 미생물 또는 동물 추출물)으로 농축하여, 또는 재료 내 미생물 다양성의 일부만의 선택적 생존을 보장하는 수단을 적용하여(예를 들어, 열 노출에 내성이 있는 미생물(예를 들어 바실리)을 선택하기 위해 표본을 10-20분 동안 60℃-80℃에서 파스퇴르 처리하여 또는 액티노마이세트 및 포자-형성 또는 용매-내성 미생물의 생존을 증강시키기 위해 표본을 저농도의 유기 용매 또는 멸균제(예를 들어 10분 동안 25% 에탄올)에 노출시켜서) 단리 절차 전에 사전 처리될 수 있다. 이어서 미생물은 농축 재료 또는 상기에서와 같이 선택적 생존을 위해 처리된 재료로부터 단리될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 식물내생생물 또는 착생식물 미생물은 식물 재료로부터 단리된다. 당분야에 공지된 임의 수의 표준 기법이 이용될 수 있고 미생물은, 예를 들어 뿌리, 줄기 및 잎, 그리고 식물 생식 조직을 포함하는 식물 중 임의의 적절한 조직으로부터 단리될 수 있다. 예로서, 식물로부터의 단리를 위한 통상적 방법에는 전형적으로 관심 식물 재료(예로 뿌리 또는 줄기 길이, 잎)의 멸균 절제, 식물 재료가 미생물 성장을 위해 영양분 배지 상에 배치된 후 적절한 용액(예로 2% 나트륨 하이포클로라이트)을 이용한 표면 멸균(예를 들어, Strobel G and Daisy B(2003) Bioprospecting for microbial endophytes and their natural products. Microbiology and Molecular Biology Reviews 67(4): 491-502; Zinniel DK et al.(2002) Isolation and characterisation of endophytic colonising bacteria from agronomic crops and prairie plants. Applied and Environmental Microbiology 68(5): 2198-2208 참고)이 포함된다. 본 발명의 하나의 바람직한 구현예에서, 미생물은 뿌리 조직으로부터 단리된다. 식물 재료로부터 미생물을 단리하기 위한 추가 방법론을 이후 본원에 상세히 나타낸다.
본원에서 이용되는 "단리물", "단리된" 등의 용어는 광의적으로 간주되어야 한다. 이들 용어는 하나 이상의 미생물(들)이 특정 환경(예를 들어 토양, 물, 식물 조직)에 연관되는 적어도 하나의 재료로부터 적어도 부분적으로 분리되었음을 의미하려는 것이다. "단리물", "단리된" 등의 용어는 미생물(들)이 정제된 정도를 나타내는 것으로 간주되어서는 안 된다.
본원에서 이용되는 "개별 단리물"은 하나 이상의 다른 미생물로부터의 분리 후 미생물의 단일 속, 종 또는 계통의 우세를 포함하는 조성물 또는 배양물을 의미하는 것으로 간주되어야 한다. 어구는 미생물이 단리되거나 정제된 정도를 나타내는 것으로 간주되어서는 안 된다. 그러나 "개별 단리물"은 바람직하게는 실질적으로 미생물의 단 하나의 속, 종 또는 계통을 포함한다.
하나의 구현예에서, 미생물 모집단은 궁극적으로 선택된 식물이 원하는 특성을 가질 수 있는 미생물 집합을 가질 개연성을 증강시키기 위해 선택적인 압력에 노출된다(방법 이전에 또는 방법의 임의 단계에서). 예를 들어, 식물 성장 배지(바람직하게는 멸균)에 대한 이들의 첨가 전 파스퇴르화에 대한 미생물의 노출은 원하는 형질에 대해 선택된 식물이 부정적 조건에서, 상업적 보관에서, 또는 종자에 코팅으로 적용되는 경우, 부정적 환경에서 더 쉽게 생존할 수 있는 포자 형성 미생물에 연관될 개연성을 증강시킬 수 있다.
본 발명의 방법의 단계 c)에서 획득된 제2 세트의 미생물은 비제한적으로 본원에 기재된 기법을 포함하여 당분야에 공지된 임의의 적절한 기법을 이용하여 선택된 식물에 연관된 식물 또는 식물 재료, 표면 또는 성장 배지로부터 단리될 수 있음이 이해되어야 한다. 그러나 이전에 본원에 언급된 바와 같은 특정 구현예에서, 미생물(들)은 조정제 형태로 이용될 수 있고, 식물 또는 배지로부터 단리되어야 하는 것은 아니다. 예를 들어, 선택된 식물에 대해 유익한 것으로 확인된 미생물을 포함하는 식물 재료 또는 성장 배지가 수득되고 방법의 다음 라운드를 위한 미생물의 조정제 원천으로 또는 방법의 결론 시 미생물의 조정제 원천으로 이용될 수 있다. 예를 들어, 전체 식물 재료가 수득되고 선택적으로 처리, 예컨대 피복되거나 분쇄될 수 있다. 대안적으로, 선택된 식물의 개별 조직 또는 부분(예컨대 잎, 줄기, 뿌리, 및 종자)이 식물로부터 분리되고 선택적으로 처리, 예컨대 피복되거나 분쇄될 수 있다. 특정 구현예에서, 제2 세트의 하나 이상의 미생물에 연관된 식물의 하나 이상의 부분은 하나 이상의 선택된 식물로부터 제거될 수 있고, 방법의 임의의 연속 후복이 수행될 경우, 단계 a)에서 이용되는 하나 이상의 식물 상에 이식될 수 있다.
본 발명의 방법은 이들의 원천 재료로부터 단리된 제2 세트의 하나 이상의 미생물의 관점에서 본원에 기재될 수 있다. 그러나 문맥 상 달리 요구되지 않는 한, 이는 또한 원천 재료로부터 단리되지 않은 조정제 형태의 미생물의 이용에 대한 언급을 포함하는 것으로 간주되어야 한다.
식물
이끼 및 태선 그리고 조류를 포함하는 임의 수의 다양하고 상이한 식물이 본 발명의 방법에서 이용될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 식물은 경제적, 사회적 및/또는 환경적 가치를 갖는다. 예를 들어, 식물에는 하기 용도의 것들이 포함될 수 있다: 식품 농작물로서; 섬유 농작물로서; 오일 농작물로서; 임업에서; 펄프 및 제지 산업에서; 바이오연료 제조를 위한 공급원료로서; 및/또는 원예 식물로서. 다른 구현예에서, 식물은 잡초와 같이, 경제적으로, 사회적으로 및/또는 환경적으로 바람직하지 않을 수 있다. 다음은 본 발명의 방법이 적용될 수 있는 식물 유형의 비제한적 예의 목록이다:
식품 농작물:
- 곡물 (옥수수, 쌀, 밀, 보리, 사탕수수, 기장, 귀리, 호밀, 라이밀, 메밀);
- 잎 식물 (십자화과 식물, 예컨대 양배추, 브로콜리, 청경채, 큰 장대; 샐러드용 야채, 예컨대 시금치, 큰 다닥냉이, 상추);
- 과실 및 화훼 식물 (예로 아보카도, 스위트 콘, 아티초크, 조롱박, 예로 호박, 오이, 멜론, 주키니, 늙은 호박; 가지과 식물/과일, 예로 토마토, 가지, 고추);
- 꼬투리 식물 (호두, 땅콩, 완두콩, 대두, 콩, 렌틸콩, 병아리콩, 오크라);
- 구근 및 줄기 식물 (아스파라거스, 셀러리, 파속 농작물, 예로 마늘, 양파, 리크);
- 뿌리 및 덩이줄기 식물 (당근, 비트, 죽순, 카사바, 얌, 생강, 뚱딴지, 파스닙, 래디쉬, 감자, 고구마, 타로, 순무, 고추냉이);
- 사탕무(베타 불가리스), 사탕수수(사카룸 오피시나룸)를 포함하는 당 농작물 ;
- 비알코올성 음료 및 각성제 (커피, 홍차, 허브차, 및 녹차, 코코아, 담배) 의 제조를 위해 키운 농작물 ;
- 과일 농작물 , 예컨대 트루 베리 과일(예로 키위, 포도, 건포도, 구스베리, 구아바, 파인애플구아바, 석류), 시트러스 과일(예로 오렌지, 레몬, 라임, 자몽), 자방하위 과일(예로 바나나, 크랜베리, 블루베리), 밀집 과일(블랙베리, 라즈베리, 보이젠베리), 다화과(예로 파인애플, 무화과), 핵과 농작물(예로 살구, 복숭아, 체리, 자두), 씨-과일(예로 사과, 배) 및 기타, 예컨대 딸기, 해바라기 종자;
- 요리 및 의약용 허브 , 예로 로즈마리, 바질, 월계수, 고수, 박하, 딜, 하이페리쿰, 디기탈리스, 알로베라, 로즈힙);
- 향신료 제조 농작 식물 , 예로 흑후추, 쿠민 계피, 너트맥, 생강, 정향, 사프론, 소두구, 육두구, 파프리카, 마살라스, 붓순나무;
- 너트 제조용으로 키운 농작물 , 예로 아몬드 및 호두, 브라질 너트, 캐슈넛, 코코넛, 밤, 마카다미아 너트, 피스타치오 너트; 땅콩, 피칸 너트;
- 맥주, 와인 및 다른 알코올성 음료 제조용으로 키운 농작물 , 예로 포도, 홉;
- 지방종자 농작물 , 예로 대두, 땅콩, 면실, 올리브, 해바라기, 참깨, 루핀종 및 십자화과 농작물(예로 캐놀라/오일종자 유채); 및,
- 식용 진균 , 예로 흰 버섯, 표고 및 느타리 버섯;
목축 농업에 이용되는 식물:
- 콩과 : 트리폴리움종, 메디카고종, 및 로투스종; 백색 클로버(T. 레펜스); 적색 클로버(T. 프라텐스); 코카서스 클로버(T. 앰비굼); 지하 클로버(T. 서브테라늄); 알팔파/루체른(메디카고 사티붐); 1년생 메딕(medic); 배럴 메딕; 블랙 메딕; 사인포인(오노브리키스 비시이폴리아); 버드풋 트레포일(로투스 코르니쿨라투스); 그레이터 버드풋 트레포일(로투스 페둔쿨라투스);
- 종자 콩과/콩류 , 예컨대 완두콩(피숨 사티붐), 일반 콩(파설루스 불가리스), 광의의 콩(비시아 파바), 녹두(비그나 라디아타), 동부(비그나 운귀쿨라타), 병아리콩(사이서 아리에툼), 루핀스(루피너스종);
- 곡물 , 예컨대 옥수수/콘(제아 매이스), 사탕수수(스로굼종), 기장(파니쿰 밀리아슘, P. 수마트렌스), 쌀(오리자 사티바 인디카, 오리자 사티바 자포니카), 밀(트리티쿰 사티바), 보리(호르듐 불가레), 호밀(세칼레 세레알레), 라이밀(트리티쿰 X 세칼레), 귀리(아베나 파투아);
- 사료 및 편의용 풀 : 온대 풀, 예컨대 롤리움종; 페스투카종; 아그로스티스종, 다년생 호밀풀(롤리움 페렌); 하이브리드 호밀풀(롤리움 하이브리둠); 1년생 호밀풀(롤리움 멀리플로럼), 큰 김의털(페스투카 아룬디나세아); 초원 김의털(페스투카 프라텐시스); 적색 김의털(페스투카 루브라); 페스투카 오비나; 페스툴로리움(롤리움 X 페스투카 교배); 오리새(닥틸리스 글로메라타); 켄터키 블루그래스 포아 프라텐시스; 포아 팔루스트리스; 포아 네모랄리스; 포아 트리비알리스; 포아 콤프레사; 브로무스종; 팔라리아(플레움종); 아르헤나테룸 엘라티우스; 아그로파이론종; 아베나 스트리고사; 세타리아 이탤릭;
- 열대 풀 , 예컨대 팔라리스종; 브라키아리아종; 에라그로스티스종; 파니쿰종; 바하이 풀(파스팔룸 노타툼); 브라키포디움종; 및
- 바이오연료 제조를 위해 이용되는 풀, 예컨대 스위치그래스(파니쿰 비르가툼) 및 억새종;
섬유 농작물:
- 면실, 대마, 황마, 코코넛, 사이잘, 아마(리눔종), 삼실난초(포리미움종); 종이 및 가공 목재 섬유 제품용으로 수확되는 조림지 및 천연림종, 예컨대 침엽수 및 활엽수종;
조림지 임업 및 바이오연료 농작물에 이용되는 나무 및 관목종 :
- 소나무(피너스종); 전나무(슈도츄가종); 가문비나무(피세아종); 사이프레스(쿠프레수스종); 와틀(아카시아종); 오리나무(알누스종); 참나무종(쿠에르쿠스종); 미국삼나무(세쿠오이아덴드론종); 버드나무(살릭스종); 자작나무(베툴라종); 참죽나무(세두루스종); 서양물푸레나무(프락시누스종); 낙엽송(라릭스종); 유칼립투스종; 대나무(뱀부세애종) 및 포플러(포풀루스종).
추출, 생물학적, 물리적 또는 생화학적 처리에 의한 에너지, 바이오연료 또는 산업용 제품으로의 전환을 위해 키운 식물 :
- 오일 제조 식물, 예컨대 기름 야자, 자트로파, 대두, 면실, 아마인;
- 라텍스 제조 식물, 예컨대 파라 고무 나무, 헤베아 브라실리엔시스 및 파나마 고무 나무 카스틸라 엘라스티카;
- 바이오연료 제조를 위해, 즉 바이오연료, 산업용 용매 또는 화학적 제품, 예로 에탄올 또는 부탄올, 프로판 디올, 또는 다른 연료 또는 산업용 재료의 제조 동안 화학적, 물리적(예로 열적 또는 촉매적) 또는 생화학적(예로 효소적 전처리) 또는 생물학적(예로 미생물 발효) 변환 후 직접적 또는 간접적 공급원료로 이용되는 식물, 예컨대 당 농작물(예로 사탕무, 사탕수수), 전분 제조 농작물(예로 C3 및 C4 곡물 농작물 및 덩이줄기 농작물), 셀룰로스계 농작물, 예컨대 숲 나무(예로 소나무, 유칼립투스) 및 목초 및 벼과 식물, 예컨대 대나무, 스위치 풀, 억새;
- 바이오차(biochar)의 제조를 포함하거나 포함하지 않고, 기체의 바이오연료 또는 다른 산업용 원료, 예컨대 용매 또는 플라스틱으로의 가스화 및/또는 미생물 또는 촉매적 전환을 통한 에너지, 바이오연료 또는 산업용 화학적 제조에 이용되는 농작물(예로 생물량 농작물, 예컨대 침엽수, 유칼립투스, 열대 또는 활엽수림 나무, 목초 및 벼과 농작물, 예컨대 대나무, 스위치 풀, 억새, 사탕수수 또는 대마 또는 연질목재, 예컨대 포플러, 버드나무; 및
- 바이오차 제조에 이용되는 생물량 농작물;
약학, 농업, 기능식품 및 미용 산업에 유용한 천연 제품을 생산하는 농작물 :
- 약학 전구체 또는 화합물 또는 기능식품 및 미용 화합물 및 재료를 생산하는 농작물, 예를 들어 붓순나무(시키미산), 일본 마디풀(레스베라트롤), 키위(가용성 섬유, 단백분해 효소);
이들의 미적 또는 환경적 특성을 위해 키운 화훼, 원예 및 편의 식물 :
- 꽃, 예컨대 장미, 튤립, 국화;
- 원예 관목, 예컨대 북서스, 헤베, 로자, 로도덴드론, 헤데라;
- 편의 식물, 예컨대 플라타너스, 코이샤, 에스칼로니아, 등대풀, 사초
- 이끼, 예컨대 물이끼
생물학적 환경정화를 위해 키운 식물 :
- 해바라기, 브라시카, 버드나무속, 포플러, 유칼립투스
식물은 성장할 수 있는 종자, 묘목, 절단물, 번식체, 또는 임의의 다른 식물 재료 또는 조직의 형태로 제공될 수 있음이 이해되어야 한다. 하나의 구현예에서, 종자는 표면 오염 미생물을 제거하기 위해 재료, 예컨대 나트륨 하이포클로라이트 또는 수은 클로라이드로 표면 멸균될 수 있다. 하나의 구현예에서, 번식체는 식물 성장 배지에 놓이기 전에 무균 배양, 예를 들어 조직 배양 중 멸균 묘목으로 성장된다.
성장 배지
본원에서 이용되는 용어 "성장 배지"는 식물 성장을 지지하기 적합한 임의의 배지를 의미하는 것으로 광의적으로 간주되어야 한다. 예로서, 배지는 비제한적으로 토양, 화분용 혼합물, 나무껍질, 질석, 수경 용액을 단독으로 포함하는 천연의 또는 인공적인 것일 수 있고, 고체 식물 지지 시스템 및 조직 배양 겔에 적용될 수 있다. 배지는 단독으로 또는 하나 이상의 다른 배지와의 조합으로 이용될 수 있음이 이해되어야 한다. 또한 외인성 영양분 및 뿌리와 잎을 위한 물리적 지지 시스템의 추가를 포함하거나 포함하지 않고 이용될 수 있다.
하나의 구현예에서, 성장 배지는 천연 생성 배지, 예컨대 토양, 모래, 진흙, 점토, 부엽토, 표토, 암석 또는 물이다. 다른 구현예에서, 성장 배지는 인공적인 것이다. 이러한 인공적인 성장 배지는 천연 생성 배지의 조건을 모사하기 위해 구축될 수 있으나, 이것이 반드시 필요한 것은 아니다. 인공적인 성장 배지는 모래, 미네랄, 유리, 암석, 물, 금속, 염, 영양분, 물을 포함하는 하나 이상의 임의 수의 조합 재료로부터 제조될 수 있다. 하나의 구현예에서, 성장 배지는 멸균인 것이다. 다른 구현예에서, 성장 배지는 멸균이 아닌 것이다.
배지는 추가 화합물 또는 성분, 예를 들어 특정 그룹의 미생물과 식물 및 각각의 상호작용 및/또는 선택을 보조할 수 있는 성분으로 수정되거나 농축될 수 있다.
본 발명의 특정 구현예에서, 성장 배지는 특정 미생물의 생존 및/또는 선택을 보조하기 위해 전처리될 수 있다. 예를 들어, 배지는 내부에 존재할 수 있는 내인성 미생물의 증식을 촉진하기 위해 농축 배지 중에 인큐베이션하여 전처리될 수 있다. 추가 예로서, 배지는 특정 그룹의 미생물의 증식을 촉진하기 위해 선택적 배지 중에 인큐베이션하여 전처리될 수 있다. 추가 예에는 내부에 미생물 조합물의 특정 성분을 배제하기 위해 전처리된; 유기 용매, 예를 들어 파스퇴르화(포자 형성 박테리아 및 진균을 제거하기 위해) 또는 이들 재료에 감수성이 있는 미생물을 제거하지만 예를 들어 액티노마이세트 및 포자 형성 박테리아의 생존은 허용하는 다양한 알코올을 이용해 처리된 성장 배지가 포함된다.
전처리 또는 농축을 위한 방법은 존재하는 미생물 또는 미생물들 그룹의 정체에 대한 정보를 제공하는 배양 독립적 미생물 커뮤니티 프로파일링 기법에 의해 정보를 얻을 수 있다. 이들 방법에는 비제한적으로 고처리량 서열분석 및 계통유전학적 분석을 포함하는 서열분석 기법, 또는 rRNA 오페론 또는 다른 분류학적으로 정보를 제공하는 유전자위의 성분을 코딩하는 핵산의 마이크로어레이 기반 스크리닝이 포함될 수 있다.
성장 조건
본 발명의 방법에 따라, 하나 이상의 식물에 하나 이상의 미생물 및 성장 배지를 가한다. 식물은 바람직하게는 하나 이상의 미생물(들) 및 성장 배지의 존재 하에 성장시키거나 증식하도록 둔다. 미생물(들)은 추가 미생물의 첨가 없이 자연적으로 성장 배지에, 예를 들어 천연 토양에 존재할 수 있다. 성장 배지, 식물 및 미생물은 서로 임의의 적절한 순서로 조합되거나 노출될 수 있다. 하나의 구현예에서, 식물, 종자, 묘목, 절단물, 번식체 등은 이전에 하나 이상의 미생물이 접종된 성장 배지 내로 심어지거나 파종된다. 대안적으로, 하나 이상의 미생물은 식물, 종자, 묘목, 절단물, 번식체 등으로 적용된 후 성장 배지(추가 미생물을 함유하거나 함유하지 않을 수 있음) 내로 심어지거나 파종된다. 다른 구현예에서, 식물, 종자, 묘목, 절단물, 번식체 등은 먼저 성장 배지 내로 심어지거나 파종되고, 성장하도록 둔 뒤 이후 시점에 하나 이상의 미생물이 식물, 종자, 묘목, 절단물, 번식체 등에 적용되고/되거나 성장 배지 자체에 하나 이상의 미생물이 접종된다.
미생물은 당분야에 공지된 임의의 적절한 기법을 이용하여 식물, 묘목, 절단물, 번식체 등 및/또는 성장 배지로 적용될 수 있다. 그러나 예로서 하나의 구현예에서, 하나 이상의 미생물은 분무 또는 분진화에 의해 식물, 묘목, 절단물, 번식체 등에 적용된다. 다른 구현예에서, 미생물은 파종 전에 종자에(예를 들어 코팅으로) 직접 적용된다. 추가 구현예에서, 미생물 또는 미생물로부터의 포자는 과립 내로 제형화되고, 파종 동안 종자와 함께 적용된다. 다른 구현예에서, 미생물은 뿌리 또는 줄기를 절단하고 식물 표면을 액체 미생물 현탁액, 또는 겔, 또는 분말의 분무, 침지 또는 다른 적용에 의해 미생물에 노출시킴으로써 식물 내로 접종될 수 있다. 다른 구현예에서, 미생물(들)은 잎 또는 뿌리 조직 내로 직접 주사되거나, 또는 잎 또는 뿌리 절단물, 또는 다르게는 절제된 배아 또는 소근 또는 떡잎집 내로 또는 상으로 달리 접종될 수 있다. 이들 접종된 식물은 추가 미생물을 함유하는 성장 배지에 추가 노출될 수 있으나, 이것이 반드시 필요한 것은 아니다. 특정 구현예에서, 미생물은 식물 재료(예를 들어, 미생물이 연관된 식물 재료)에 연관된 식물, 묘목, 절단물, 번식체 등 및/또는 성장 배지로 적용된다.
다른 구현예에서, 특히 미생물을 배양할 수 없는 경우, 미생물은 이식, 외식편의 삽입, 흡입, 전기천공, 상처형성, 뿌리 전지, 기공 개방 유도 또는 미생물이 식물 세포 또는 세포간 공간으로 들어갈 기회를 제공하는 임의의 물리적, 화학적 또는 생물학적 처리 중 임의 하나 또는 조합에 의해 식물로 전달될 수 있다. 당분야 숙련가는 이용될 수 있는 여러 대안적 기법을 쉽게 이해할 수 있다.
이러한 기법은 방법의 후속 반복의 단계 a)에서 이용되는 경우 제1 세트의 하나 이상의 미생물 및 제2 세트의 미생물의 적용에 동일하게 적용 가능함이 이해되어야 한다.
하나의 구현예에서, 미생물은 식물 부분, 예컨대 뿌리, 줄기, 잎 및/또는 생식 식물 부분을 침윤(식물내생생물이 됨)고/자라거나 뿌리, 줄기, 잎 및/또는 생식 식물 부분의 표면 상에서 자라(착생식물이 됨)되고/되거나 식물 근권에서 자란다. 하나의 바람직한 구현예에서, 미생물(들)은 식물과 공생 상관관계를 형성한다.
이용되는 성장 조건은 당분야 숙련가에게 이해될 바와 같이, 식물종에 따라 변할 수 있다. 그러나 예로서, 클로버에 있어서 성장실에서는 전형적으로 약 1/3의 토탄 형태의 유기 물질, 1/3의 퇴비 및 1/3의 체질 경석을 함유하고 전형적으로 니트레이트, 포스페이트, 칼륨 및 마그네슘염과 미량영양분을 함유하고 pH 6~7인 비료가 보강된 토양에서 식물을 성장시킬 것이다. 식물은 22-24℃의 온도 및 16:8의 명:암 주기로 자동 급수되며 성장시킬 수 있다.
예를 들어, 주로 북반부에 파종되는 겨울 밀 변종의 경우, 조기 새싹형성이 겨울 생존, 성장 및 여름에 결과적인 낟알 수율에 관련된 형질이므로, 북반구에서 겨울 밀 종자가 겪는 것과 유사한 빛 및 온도 조건 하에 미생물을 함유하는 성장 배지에 종자를 노출한 후 조기 새싹형성을 나타내는 식물을 선택하는 것이 중요할 수 있다. 또는 이들 형질이 본 발명을 이용하여 비실용적인 기간의 제품 개발인 10년 이후 나무의 건강 및 성장 속도와 크기에 관련되므로, 나무 종이 4-6월령에 개선된 성장 및 건강에 대해 선택될 수 있다.
선택
전형적으로 하나 이상의 미생물의 존재 하에 하나 이상의 식물의 성장에 뒤따라, 하나 이상의 식물이 하나 이상의 선택 기준에 기반하여 선택된다. 하나의 구현예에서, 식물은 하나 이상의 표현형 형질에 기반하여 선택된다. 숙련가는 이러한 형질에 예를 들어 성장 속도, 키, 중량, 색상, 맛, 냄새, 식물에 의한 하나 이상의 화합물(예를 들어 대사물질, 단백질, 약물, 탄수화물, 오일 및 임의의 다른 화합물 포함)의 생산 변화를 포함하는 식물의 임의의 관찰 가능한 특징이 포함됨을 쉽게 이해할 것이다. 유전형 정보에 기반한 식물 선택도 고려된다(예를 들어, 미생물, 유전형, 유전적 마커의 존재에 반응하는 식물 유전자 발현 패턴을 포함). 특정 구현예에서, 식물은 특정 특징 또는 형질(예컨대 바람직한 특징 또는 형질)의 존재와는 대비되는 특정 특징 또는 형질(예컨대 바람직하지 못한 특징 또는 형질)의 부재, 억제 또는 저해에 기반하여 선택될 수 있음이 이해되어야 한다.
하나 이상의 유전적 마커의 존재가 평가되는 경우, 하나 이상의 마커가 이미 공지되고/되거나 식물의 특정 특징; 예를 들어 증가된 성장 속도 또는 대사물질 프로필에 연관되는 마커 또는 마커들에 연관될 수 있다. 상기 정보는 바람직할 수 있는 상이한 식물 특징의 조합을 선택하기 위해 본 발명의 방법에서 다른 특징에 기반한 평가와 조합 이용될 수 있다. 이러한 기법은 바람직한 식물 형질을 특정 미생물 총과 연관시키는 신규한 QTL-예를 들어 미생물 그룹집 유형에 대한 식물 유전형 매칭을 확인하기 위해 이용될 수 있다.
예로서, 식물은 이전에 본원에 기재된 바와 같은 다른 특징뿐만 아니라 성장 속도, 크기(비제한적으로 중량, 키, 잎 크기, 줄기 크기, 가지화 패턴 또는 식물의 임의 부분의 크기를 포함), 일반 건강 및 생존에 기반하여 선택될 수 있다. 추가적인 비제한적 예에는 하기에 기반한 식물 선택이 포함된다: 종자 발아 속도; 생산되는 생물량의 양; 증가된 수율(초본부 또는 낟알 또는 섬유 또는 오일) 또는 생물량 생산으로 이어지는 증가된 뿌리, 및/또는 잎/가지 성장; 특히 곡물 농작물, 예컨대 밀, 보리, 귀리, 호밀, 옥수수, 쌀, 사탕수수, 오일종자 농작물, 예컨대 대두, 캐놀라, 면실, 해바라기, 및 콩과 종자, 예컨대 완두콩, 콩에 관련될 수 있는 농작물에 대해 증가된 종자 수율을 일으키는 식물 성장에 대한 효과; 특히 오일 종자 농작물, 예컨대 대두, 캐놀라, 면실, 자트로파 및 해바라기에 관련될 수 있는 증가된 오일 수율을 일으키는 식물 성장에 대한 효과; 증가된 섬유 수율(예로 면실, 아마 및 아마인에서)을 일으키는 식물 성장에 대한 효과 또는 농작물, 예컨대 감자 및 사탕무에서 증가된 덩이줄기 수율을 일으키는 효과; 특히 사료 농작물, 예컨대 콩과 사료(알팔파, 클로버, 메딕), 사료 풀(롤리움종; 페스투카종; 파스팔럼종; 브라키아리아종; 에라그로스티스종), 저장 목초를 위해 키운 사료 농작물, 예컨대 옥수수 및 사료 곡물(밀, 보리, 귀리)에 관련될 수 있는 생물량의 증가된 소화 가능성을 일으키는 식물 성장에 대한 효과; 특히 씨 과일 나무(예컨대 사과, 배 등), 베리 과일(예컨대 딸기, 라즈베리, 크랜베리), 핵과(예컨대 승도복숭아, 살구) 및 시트러스 과일, 포도, 무화과, 너트 나무에 관련될 수 있는 증가된 과일 수율을 일으키는 식물 성장에 대한 효과; 감소된 잎 증상, 예컨대 박테리아 또는 진균 병소의 발생율, 또는 손상된 잎 면적, 또는 식물 뿌리 상의 선충 포낭 또는 혹의 수 감소에 의해 손상이 측정되는 진균, 바이러스 또는 박테리아성 질환을 포함하는 질환 또는 해충, 예컨대 곤충, 진드기 또는 선충에 대한 증가된 내성 또는 관용성 또는 이러한 식물 해충 및 질환의 존재 하 식물 수율의 개선으로 이어지는 식물 성장에 대한 효과; 예를 들어, 특히 항-인플루엔자 약물 아셀타미비르의 제조를 위해 중추적인 시키미산의 제조를 위해 키운 붓순나무 또는 레스베라트롤의 추출을 위한 일본 마디풀의 생산, 또는 키위로부터 가용성 섬유 및 식이 효소 제품의 제조를 위해 키우는 식물에 관련될 수 있는 약학, 기능식품 또는 미용 목적으로 키운 식물에서 증가된 대사물질 수율 또는 방목 동물에서 메탄과 같은 온실 기체의 생산을 저해하는데 유용한 "응축 탄닌" 또는 다른 대사물질의 증가된 수율로 이어지는 식물 성장에 대한 효과; 특히 이들의 형태, 색상 또는 맛을 위해 키운 식물, 예를 들어 원예용 꽃의 색상 강도 및 형태, 과일 또는 식물의 맛, 또는 미생물로 처리된 포도 덩굴로부터의 와인의 맛에서 중요할 수 있는 개선된 미적 어필로 이어지는 식물 성장에 대한 효과; 및 생물학적 환경정화 목적으로 키운 식물에 의해 섭취되거나 탈독화되는 독성 화합물의 개선된 농도로 이어지는 식물 성장에 대한 효과.
표현형 또는 유전형 정보에 기반한 식물의 선택은 예컨대 비제한적으로 하기 기법을 이용하여 수행될 수 있다; 식물 기원의 화학적 성분의 고처리량 스크리닝, 유전적 재료의 고처리량 서열분석을 포함하는 서열분석 기법, 시차 디스플레이 기법(DDRT-PCR, 및 DD-PCR 포함), 핵산 마이크로어레이 기법, RNA-seq(전체 트랜스크립톰 샷건 서열분석), qRT-PCR(정량적 실시간 PCR).
본 발명의 특정 구현예에서, 식물 형질의 조합에 대한 선택이 바람직할 수 있다. 이는 여러 방식으로 달성될 수 있다. 하나의 구현예에서, 허용가능한 수준의 성장이 달성될 때까지 하나의 형질, 예로 더 우수한 성장을 위한 여러 라운드의 반복 개선이 유지된다. 적어도 상이한 바람직한 형질, 예를 들어 개선된 꽃 색상을 부여할 수 있는 미생물을 확인하기 위해 유사한, 그러나 완전히 별도 라운드의 선택이 수행된다. 이러한 별도 라운드의 선택은 반복적 또는 적층적 접근을 이용하여 수행될 수도 있고, 또는 별도 방법의 조합이 이용될 수 있으며, 이들 별도 라운드 또는 방법에서 생성되는 미생물이 단일 조성물 내로 조합된다. 상기 시점에서, 미생물(들)은 각각 상이한 식물 특성을 개선하는 것으로 나타난 별도로 발효된 미생물의 조합을 함유하는 제품으로 개발될 수 있다. 추가 구현예에서, 별도 선택된 세트의 미생물은 둘 이상의 세트로 조합되고 본 발명의 추가적인 방법에서 이용될 수 있다. 다른 구현예에서, 별도 선택된 세트의 미생물은 개별 단리물로 분리된 후 개별 단리물이 둘 이상의 세트로 조합되고 본 발명의 추가적인 방법에서 이용될 수 있다. 하나의 구현예에서, 조합된 미생물은 동일한 반복 사이클에서 식물 및/또는 성장 배지로 적용된다. 예를 들어 하나의 조합에서, 식물 성장을 개선할 수 있는 미생물이 꽃 색상을 증강시킬 수 있는 미생물과 조합된다. 이어서 조합된 미생물은 적합한 조건 하에 식물이 적합한 기간 동안 성장되는 식물 성장 배지로 첨가된다. 성장 및 꽃 색상 정도가 평가되고, 미생물이 후속 반복에서 이용하기 위한 최적 성능 식물로부터 단리된다. 허용 가능한 수준의 식물 성장 및 꽃 색상이 달성될 때까지 유사한 반복 라운드가 계속될 수 있다. 상기 접근은 식물 성능을 상승적으로 개선하는; 비제한적 예로서, 미생물이 두 별도로 선택된 세트의 조합으로 단순 적용되는 경우 달성되는 것보다 더 우수한 정도로 식물 성장 및 꽃 색상을 개선하는 미생물의 선택을 보조할 것이다.
수확
선택 후, 하나 이상의 식물이 수확되고 식물 조직이 조사되어 식물과의 연관성을 형성하는 미생물(예를 들어, 식물내생생물, 착생식물 또는 근권 연관성)을 검출할 수 있다.
본원에 기재된 기법은 본 발명의 방법의 결론 시 또는 본 발명의 방법의 임의의 후속 반복에 이용하기 위한 제2 세트의 미생물 획득에 이용될 수 있다.
하나 이상의 미생물은 선택된 식물의 임의의 적절한 조직; 예를 들어, 전체 식물, 잎 조직, 줄기 조직, 뿌리 조직, 및/또는 종자로부터 단리될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 미생물은 선택된 하나 이상의 식물의 뿌리 조직, 줄기 또는 잎 조직 및/또는 종자로부터 단리된다.
본 발명의 특정 구현예에서, 미생물은 조정제 형태로 획득될 수 있고, 여기서 이들은 서식하는 원천 재료(예컨대 식물 조직 또는 성장 배지)로부터 단리되지 않는다.
미생물의 단리가 일어나는 경우, 이들은 당분야에 공지된 임의의 적절한 방법을 이용하여 식물로부터 단리될 수 있다. 그러나 예로서, 식물내생생물 미생물의 단리 방법에는 관심 식물 재료(예로 뿌리, 줄기 길이, 종자)의 멸균 절제, 적절한 용액(예로 2% 나트륨 하이포클로라이트)으로의 표면 멸균이 포함될 수 있고, 그 후 식물 재료는 미생물 파생물, 특히 필라멘트성 진균에 대한 영양분 배지 상에 배치된다. 대안적으로, 표면 멸균된 식물 재료는 적합한 고체 한천 배지 또는 선택적일 수도 또는 선택적이 아닐 수도 있는(예로 인의 원천으로 피트산만을 함유하는) 배지의 표면에 걸쳐 전개된 분쇄 식물 재료의 소편을 포함하여, 멸균 액체(보통 물) 및 액체 현탁액 중에 분쇄될 수 있다. 상기 접근은 특히 단리된 집락을 형성하는 박테리아 및 효모에 있어 특히 유용하며 개별적으로 골라져서 영양분 배지 플레이트를 분리하고 널리 공지된 방법에 의해 단일종으로 추가 정제될 수 있다. 대안적으로, 식물 뿌리 또는 잎 표본은 표면 멸균되지 않고 부드럽게 세척되기만 하여 단리 절차에 표면 서식 착생식물 미생물을 포함할 수 있거나, 또는 착생식물 미생물은 식물 뿌리, 잎 줄기의 조각을 한천 배지의 표면 상으로 각인 및 옮긴 뒤 상술된 바와 같이 개별 집락을 단리하여 별도로 단리될 수 있다. 상기 접근은, 예를 들어 특히 박테리아 및 효모에 있어 유용하다. 대안적으로 뿌리는 뿌리에 부착된 소량의 토양을 세척 제거하지 않고 처리되어 식물 근권에 집락하는 미생물을 포함할 수 있다. 다르게는 뿌리에 부착한 토양이 제거되고 희석되고 근권 미생물의 개별 집락을 단리하기 위해 적합한 선택적 및 비선택적 배지의 한천 상에 전개될 수 있다. 추가적인 예시적 방법론은 [Strobel G and Daisy B(2003) Bioprospecting for microbial endophytes and their natural products. Microbiology and Molecular Biology Reviews 67(4): 491-502; Zinniel DK et al.(2002) Isolation and characterisation of endophytic colonising bacteria from agronomic crops and prairie plants. Applied and Environmental Microbiology 68(5): 2198-2208; Manual of Environmental Microbiology, Hurst et al., ASM Press, Washington DC]에서 찾아볼 수 있다.
단리 방법은 주어진 표본에 존재하는 미생물의 정체 및 활성에 대한 정보를 제공하는 배양 독립적 커뮤니티 프로파일링 기법에 의해 정보를 얻을 수 있다. 이들 방법에는 비제한적으로 고처리량 서열분석 및 계통유전학적 분석을 포함하는 서열분석 기법, 또는 rRNA 오페론 또는 다른 분류학적으로 정보를 제공하는 유전자위의 성분을 코딩하는 핵산의 마이크로어레이 기반 스크리닝이 포함될 수 있다.
둘 이상의 미생물이 식물 재료로부터 단리된 후 개별 단리물로 분리되는 본 발명의 구현예에서, 각각으로부터 하나 이상의 미생물을 분리하기 위한 임의의 적절한 방법론이 이용될 수 있다. 그러나 예로서, 식물 재료로부터 제조되는 미생물 추출물은 한천 플레이트 상에 전개되고, 적합한 시기 동안 적절한 온도에서 성장되고, 생성 미생물 집락이 후속적으로 선택되고 적절한 배지 중에 성장될 수 있다(예를 들어, 새 플레이트 상에 스트리킹되거나 액체 배지 중에 성장됨). 집락은 당분야에 이해될 바와 같은 형태 또는 임의의 다른 적절한 선택 기준에 기반하여 선택될 수 있다. 추가 예로서, 선택적 배지가 이용될 수 있다.
하나 이상의 미생물은 임의의 적절한 시점에 식물(이전에 본원에 기재된 바와 같은 근권 포함)로부터 수확될 수 있다(단리 또는 조정제 형태 포함). 하나의 구현예에서, 이들은 식물의 발아 후 임의 시점에 수확된다. 예를 들어, 이들은 발아 직후 기간에(발아 후 최초 수일 내 생존이 중요한 경우, 예를 들어 박테리아 및 진균 뿌리 및 줄기 역병에서), 이어서 식물 모집단으로부터의 그 선택을 가능케 하는 차별적 유익성을 보이기 위해(예를 들어 200개 식물 중 상위 10개를 구별하기 위해) 식물에 성장하는데 필요한 시간에 따라 그 후 임의 단계에 단리될 수 있다.
본 발명자(들)은 상이한 미생물이 식물 수명의 상이한 단계에서 식물에 연관될 수 있음을 관찰하였다. 따라서 상이한 시점에서의 식물 수확은 미생물의 상이한 모집단 선택을 야기할 수 있다. 이러한 미생물은 그 수명 동안 중요 시점에 식물 상태, 생존 및 성장 개선에 특히 유익할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에서, 한 세대 또는 번식체로부터 다음 세대로의 수직 전파를 허용하는 식물과의 연관성(예를 들어 종자-식물내생생물 또는 -착생식물의 연관성 또는 무성 증식된 식물/번식체와의 식물내생생물 및 착생식물 연관성)을 형성하는 미생물의 경우, 미생물은 식물(들)로부터 단리되지 않을 수 있다. 본 발명의 방법의 결론 시, 표적 또는 선택된 식물 자체는 다음 세대 또는 증식상의 "딸" 식물에게 유익성(들)을 부여하기 위해 종자에 의해 또는 무성적으로(연관 미생물과 함께) 증식될 수 있다. 유사하게 방법의 후속 반복이 바람직한 경우, 하나 이상의 미생물 세트를 포함하는 식물 재료(전체 식물, 식물 조직, 식물 부분)가 임의의 후속 반복의 단계 a)에서 이용될 수 있다.
적층
본 발명자(들)는 본 발명의 방법의 반복 라운드에서 식물의 선택 수단(또는 선택 기준)을 적층하여 수득되는 장점을 고려한다. 이는, 예를 들어 여러 상이한 바람직한 형질을 갖는데 있어서 식물을 보조할 수 있는 미생물 모집단의 획득을 허용할 수 있다.
본 발명의 상기 구현예에서, 상술된 바와 같이 선택된 하나 이상의 식물로부터 획득되는 하나 이상의 미생물은 방법의 두 번째 라운드 또는 사이클에 이용된다. 첫 번째 라운드에서, 하나 이상의 식물이 생물량에 기반하여 선택될 수 있다. 두 번째 라운드에서, 하나 이상의 식물이 특정 화합물의 생산에 기반하여 선택될 수 있다. 이어서 방법의 두 번째 라운드에서 단리된 미생물이 후속 라운드에서 이용될 수 있는 등이다. 임의 수의 상이한 선택 기준이 필요에 따라 또는 적절한 바에 따라 방법의 후속 라운드에 채용될 수 있다.
하나의 구현예에서, 방법의 각 반복에 적용되는 선택 기준은 상이하다. 그러나 본 발명의 다른 구현예에서, 각 라운드에 적용되는 선택 기준은 동일할 수 있다. 또한 각 라운드에서 동일할 수 있지만 상이한 강도로 적용될 수 있다. 예를 들어, 선택 기준은 섬유 수준일 수 있고, 식물이 선택되기 위해 필요한 섬유 수준은 방법의 후속 라운드에 따라 증가할 수 있다. 선택적 기준은 선형, 단계식 또는 곡선식일 수 있는 패턴의 후속 라운드에서 증가하거나 감소할 수 있다.
하나 이상의 미생물(들)이 한 세대 또는 번식체로부터 다음 세대로의 수직 전파를 허용하는 식물과의 식물내생생물 또는 착생식물 상관관계를 형성하는 본 발명의 특정 구현예에서, 미생물이 식물(들)로부터 단리될 필요가 없음이 또한 이해되어야 한다. 본 발명의 방법의 결론 시, 표적 또는 선택된 식물 자체는 다음 세대 또는 증식상의 "딸" 식물에 유익성(들)을 부여하기 위해 종자에 의해 또는 무성적으로(연관된 미생물과 함께) 증식될 수 있다. 유사하게 방법의 후속 반복이 필요한 경우, 하나 이상의 미생물 세트를 포함하는 식물 재료(전체 식물, 식물 조직, 식물 부분)가 후속 반복의 단계 a)에서 이용될 수 있다.
또한 둘 이상의 선택 기준이 방법의 각 반복과 함께 적용될 수 있음이 추가로 이해되어야 한다.
미생물 및 이를 함유하는 조성물
이전에 본원에 기재된 방법에 부가하여, 본 발명은 이러한 방법에 의해 선택되거나 획득되거나 또는 단리된 미생물 및 이러한 미생물을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 그 가장 단순한 형태에서, 하나 이상의 미생물을 포함하는 조성물에는 살아 있는 미생물, 또는 냉동, 동결건조 또는 건조 배양물을 포함하여 살아 있지만 비활성 상태(들)에 있는 미생물의 배양물이 포함된다. 그러나 조성물은 후술되는 바와 같이 다른 성분을 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 식물 성장, 품질 및/또는 건강을 지지하기 위한 조성물 또는 식물 성장, 품질 및/또는 건강을 억제하거나 저해하기 위한 조성물의 제조 방법, 본원에서 이전에 기재된 방법 단계 및 하나 이상의 미생물과 하나 이상의 추가 성분을 조합하는 추가 단계를 포함하는 방법을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
"식물 성장, 건강, 및/또는 품질을 지지하기 위한 조성물"은 식물의 성장, 일반 건강 및/또는 생존, 식물 상태를 보조하거나 또는 임의의 바람직한 특징, 품질, 및/또는 형질의 유지 또는 촉진을 보조할 수 있는 조성물을 포함하는 것으로 광의적으로 간주되어야 한다. 이는 유전자 발현 등의 변경뿐만 아니라 식물에 의한 하나 이상의 대사물질 또는 다른 화합물의 생산 유지 또는 변경을 포함하는 것으로 간주되어야 한다. 이 어구는 조성물이 독자적으로 식물 성장, 품질 및/또는 건강을 지지할 수 있음을 시사하는 것으로 간주되어서는 안 된다. 그러나 하나의 구현예에서, 조성물은 상기 목적을 위해 적합하다. 본 발명의 상기 측면의 예시적인 조성물에는 비제한적으로 식물 성장 배지, 식물 미네랄 보강물 및 미량영양분, 퇴비, 비료, 화분용 혼합물, 살충제, 살진균제, 해충 및 질환의 감염 또는 만연에 대해 보호하기 위한 배지, 조직 배양 배지, 종자 코팅, 수경 배지, 가뭄 또는 비생물적 스트레스, 예컨대 금속 독성에 대한 관용성을 부여하는 조성물, 토양 pH를 개질하는 조성물이 포함된다.
"식물 성장, 건강, 및/또는 품질을 저해 또는 억제하기 위한 조성물"은 그 성장, 일반 건강 및/또는 생존을 포함하는 식물의 하나 이상의 특징, 품질 및/또는 형질을 억제하거나 저해하는 것을 보조할 수 있는 조성물을 포함하는 것으로 광의적으로 간주되어야 한다. 이는 유전자 발현 등의 변경뿐만 아니라 식물에 의한 하나 이상의 대사물질 또는 다른 화합물의 생산 유지 또는 변경을 포함하는 것으로 간주되어야 한다. 이 어구는 조성물이 독자적으로 식물 성장, 품질 및/또는 건강을 억제하거나 저해할 수 있음을 시사하는 것으로 간주되어서는 안 된다. 그러나 하나의 구현예에서, 조성물은 상기 목적을 위해 적합하다. 본 발명의 상기 측면의 예시적인 조성물에는 비제한적으로 식물 성장 억제 배지, 잡초 사멸제, 비료, 화분용 혼합물, 식물 미네랄 보강물 및 미량영양분, 퇴비, 혼합물, 살충제, 살진균제, 조직 배양 배지, 종자 코팅, 수경 배지, 가뭄 또는 비생물적 스트레스, 예컨대 금속 독성에 대한 관용성을 부여하는 조성물, 토양 pH를 개질하는 조성물이 포함된다.
숙련가는 제조될 조성물의 성질, 이용될 미생물 및/또는 식물 또는 그 환경에 대한 조성물의 전달 방법에 관해 하나 이상의 미생물과 조합될 수 있는 추가 성분의 유형을 쉽게 이해할 것이다. 그러나 예로서, 성분에는 액체 및/또는 고체 담체, 미생물 보존제, 특정 대사 활성을 유도하는 미생물 활성화제, 미생물 수명을 연장시키는 첨가제(예컨대 겔 및 점토), 수화 분말, 과립화된 담체, 토양, 모래, 미생물 생존 및 식물의 성장과 일반 건강에 유익한 것으로 공지된 제제, 토탄, 유기 물질, 유기 및 무기 충전제, 다른 미생물, 수화제, 유기 및 무기 영양분, 및 미네랄이 포함될 수 있다.
이러한 조성물은 이용될 성분의 성질에 관한 표준 방법론을 이용하여 제조될 수 있다.
본 발명의 방법에서 개발된 조성물은 당분야 숙련가에게 공지된 임의 수의 방법에 의해 식물에 적용될 수 있다. 이들에는 예를 들어 하기가 포함된다: 스프레이; 분진; 과립; 종자-코팅; 적용시 종자 분무 또는 분진화; 묘목 옮겨심기 및 발아 전에 적합한 농도의 조성물을 함유하는 층에서의 종자 발아; 파종 또는 심기 동안 종자 또는 식물 옆에 적용되거나 직접적 드릴링과 같은 절차를 통해 기존 농작물에 적용되는 구슬 또는 과립; 심기 전에 액체 또는 분말화 미생물 기재 내로 절단 표면 또는 번식체를 침지함으로써 식물 절단물 또는 다른 무성 번식체에 대한 적용; 농작물의 파종 또는 심기 이전 또는 이후 식물 비료와 적용될 수 있거나 적용될 수 없는 분무, 분진, 과립 또는 퇴비화 조성물 형태의 "토양 처리"와 같은 토양으로의 적용; 수경 성장 배지로의 적용; 식물에 유익성(들)을 제공하는 식물내생생물 미생물과 함께 식물이 통상적 농경 관례를 통해 증식될 수 있도록, 종자 또는 증식성 조직으로 연장되는 식물과 식물내생생물 상관관계의 후속 구축을 위한 조성물의 주사 또는 다르게는 상기 조직 내 절단을 통해 접종되는 무균 조건 하 식물 조직 내로의 접종.
하나의 구현예에서, 본 발명은 표 4에 기재된 하나 이상의 미생물을 포함하는 조성물을 제공한다. 다른 구현예에서, 본 발명은 표 3에 기재된 하나 이상의 미생물을 포함하는 조성물을 제공한다. 다른 구현예에서, 본 발명은 표 2에 기재된 하나 이상의 미생물을 포함하는 조성물을 제공한다.
대안적 조성물의 제조 방법
미생물이 배양되는 경우, 이들은 서식하는 배지 내로 통과되는 하나 이상의 대사물질을 생산할 수 있다. 이러한 대사물질은 식물에 유익한 특성을 부여할 수 있다.
따라서 본 발명은 식물에 하나 이상의 유익한 특성을 부여할 수 있는, 예를 들어 식물 성장, 품질 및/또는 건강을 지지하거나 또는 예를 들어 식물의 성장, 품질 및/또는 건강을 저해 또는 억제하거나 또는 이러한 조성물을 제조할 수 있는 미생물을 확인하기 위한 조성물의 선택 또는 제조 방법을 또한 제공한다. 하나의 구현예에서, 조성물에는 실질적으로 미생물이 없다.
하나의 구현예에서, 방법은 식물에 하나 이상의 유익한 특성을 부여할 수 있는 조성물의 선택을 위한 것이며, 적어도 하기 단계를 포함한다:
a) 하나 이상의 배지 중에 본원에서 이전에 기재된 바와 같은 방법에 의해 선택되는 하나 이상의 미생물을 배양하여 하나 이상의 배양물을 제공하는 단계;
b) 일정 시기 후 하나 이상의 배지로부터 하나 이상의 미생물을 분리하여 실질적으로 미생물이 없는 하나 이상의 조성물을 제공하는 단계;
c) 하나 이상의 식물(예를 들어 종자, 묘목, 절단물, 및/또는 이들의 번식체 포함)에 단계 b)로부터의 하나 이상의 조성물을 가하는 단계;
d) 하나 이상의 식물에 하나 이상의 유익한 특성을 부여하는 것으로 관찰되는 경우, 단계 c)의 하나 이상의 조성물을 선택하는 단계.
다른 구현예에서, 방법은 식물에 하나 이상의 유익한 특성을 부여할 수 있는 조성물의 선택을 위한 것이며, 하기 단계를 포함한다:
a) 하나 이상의 배지 중 본 발명의 제1 측면의 방법에 의해 선택된 하나 이상의 미생물을 배양하여 하나 이상의 배양물을 형성하는 단계;
b) 단계 a)의 하나 이상의 배양물을 불활성화하여, 하나 이상의 불활성화된 미생물을 함유하는 하나 이상의 조성물을 제공하는 단계;
c) 하나 이상의 식물(예를 들어 종자, 묘목, 절단물, 및/또는 이들의 번식체 포함)에 단계 b)의 하나 이상의 조성물을 가하는 단계;
d) 하나 이상의 식물에 하나 이상의 유익한 특성을 부여하는 것으로 관찰되는 경우, 단계 c)의 하나 이상의 조성물을 선택하는 단계.
하나의 구현예에서, 방법은 식물에 하나 이상의 유익한 특성을 부여할 수 있는 조성물을 제조할 수 있는 하나 이상의 미생물의 선택을 위한 것이며, 적어도 하기 단계를 포함한다:
a) 하나 이상의 배지 중 본 발명의 제1 측면의 방법에 의해 선택되는 하나 이상의 미생물을 배양하여 하나 이상의 배양물을 제공하는 단계;
b) 일정 시기 후 단계 a)로부터의 하나 이상의 배양물 중 하나 이상의 배지로부터 하나 이상의 미생물을 분리하여 실질적으로 미생물이 없는 하나 이상의 조성물을 제공하는 단계;
c) 하나 이상의 식물(예를 들어 종자, 묘목, 절단물, 및/또는 이들의 번식체 포함)에 단계 b)의 하나 이상의 조성물을 가하는 단계;
d) 하나 이상의 식물에 하나 이상의 유익한 특성을 부여하는 것으로 관찰되는 하나 이상의 조성물에 연관된(또는 달리 말하면 이를 제조하기 위해 이용된) 하나 이상의 미생물을 선택하는 단계.
본 발명의 또 다른 방법은 적어도 하기 단계를 포함한다:
a) 하나 이상의 배지 중 하나 이상의 미생물을 배양하여 하나 이상의 배양물을 제공하는 단계;
b) 일정 시기 후 하나 이상의 배양물 중 하나 이상의 배지로부터 하나 이상의 미생물을 분리하여 실질적으로 미생물이 없는 하나 이상의 조성물을 제공하는 단계;
c) 하나 이상의 식물(예를 들어 종자, 묘목, 절단물, 및/또는 이들의 번식체 포함)에 단계 b)의 하나 이상의 조성물을 가하는 단계;
d) 하나 이상의 식물에 하나 이상의 유익한 특성을 부여하는 것으로 관찰된 하나 이상의 조성물에 연관된(또는 달리 말하면 이를 제조하기 위해 이용된) 하나 이상의 미생물을 선택하는 단계; 및
e) 단계 d)에서 선택된 하나 이상의 미생물을 본 발명의 제1 또는 제8(및/또는 관련) 측면의 방법의 단계 a)에서 이용하는 단계.
이전 두 단락의 방법의 하나의 구현예에서, 방법의 단계 b)는 b) 단계 a)의 하나 이상의 배양물을 불활성화하여 하나 이상의 불활성화된 미생물을 함유하는 하나 이상의 조성물을 제공한 후, 상기 조성물을 방법의 단계 c)에서 이용하는 단계로 치환될 수 있다.
본원에서 이용되는 하나 이상의 배양물의 "불활성화" 및 "불활성화된 미생물" 등의 용어는 미생물이 실질적으로 불활성화되거나, 고정되거나, 사멸되거나 또는 달리 파괴되는 것을 의미하는 것으로 광의적으로 간주되어야 한다. 이 용어는 모든 미생물이 불활성화되거나, 사멸되거나 또는 달리 파괴되는 것을 의미하는 것으로 간주되어서는 안 되지만, 이것이 바람직할 수 있다. 하나의 구현예에서, 미생물은 자가 지속 복제가 당분야 숙련가에게 공지된 기법을 이용하여 더 이상 측정 가능하지 않은 정도로 불활성화되거나, 고정되거나, 사멸되거나 또는 파괴된다.
미생물은 당분야에 공지된 임의의 적절한 기법을 이용하여 불활성화되거나, 고정되거나, 사멸되거나 또는 파괴될 수 있다. 그러나 예로서, 이를 수행하기 위해 화학적 제제 및/또는 물리적 수단을 이용할 수 있다. 하나의 구현예에서, 세포는 용해된다. 다른 구현예에서, 세포는 개체가 비생활성이 되지만 이들의 구조적 온전성을 보유하도록 화학적 수단에 의해 고정된다.
본원에서 이용되는 "실질적으로 미생물이 없는 조성물"은 광의적으로 간주되어야 하며, 이것이 바람직할 수는 있지만 미생물이 존재하지 않음을 의미하는 것으로 간주되어서는 안 된다.
이들 방법의 특정 구현예에서, 미생물은 광범위한 미생물 성장을 지지할 수 있는 배지를 이용하여 2 이상(바람직하게는 다수, 예를 들어 적어도 약 10부터 최대 약 1000)의 혼합 배양물에서 배양된다. 당분야에 공지된 임의의 적절한 배지가 이용될 수 있다. 그러나 예로서, 성장 배지에는 TSB(트립틱 콩 배지), Luria-Bertani(LB) 배지, 또는 R2A 배지가 포함될 수 있다. 다른 구현예에서, 별도의 그러나 바람직한 특성 어레이로 이용하여 미생물의 성장을 지지할 수 있는 선택적 또는 농축 배지가 이용될 수 있다. 예로서, 본원에서 다른 곳에서 언급되는 농축 배지가 이용될 수 있다.
미생물은 임의의 바람직한 기간 동안 배지 중에 배양될 수 있다. 배양 후, 미생물은 배지로부터 분리되고 이후 이용을 위해 보관된다. 별개 조성물도 얻어진다. 이어서 적합한 성장 배지 중 하나 이상의 식물에 조성물을 가한다(임의의 공지된 방법론 또는 이전에 본원에 기재된 바와 같은 방법론을 이용하여). 일정 시기 후, 식물 성장이 평가되고 식물이 선택된다(예를 들어 이전에 본원에 기재된 바와 같이). 식물은 바람직하게는 크기에 기반하여 선택된다. 그러나 본원에서 언급되는 다른 선택 기준이 이용될 수 있다.
하나의 구현예에서, 선택된 식물에 연관된 조성물 서브세트를 제조하는 미생물(들)이 저장으로부터 회수된다. 이어서 미생물의 2 이상의 별도 배양물이 함께 혼합되고, 2 이상의 상이한 배지 중에 성장시킨 2 이상의 2차 배양물로 분리될 수 있다.
상기 절차는 유효한 것으로 간주되는 만큼 많은 횟수로 반복적으로 반복될 수 있고, 성장 식물에 대한 바람직한 효과가 조성물 제조를 위한 표준 원료 접종물로서 확인되고, 무한정으로 성장되고 및 보관될 수 있는 미생물의 혼합물로 달성될 때까지 진행 단계를 더 적은 배지 그리고 더 좁은 다양성의 미생물로 정련한다.
본 발명의 상기 측면의 조성물은 이들 자체로 이용되거나 제형화되거나, 하나 이상의 추가 성분과 조합될 수 있다.
이전에 본원에 기재된 일반적 방법론은 비제한적으로 성장 배지, 식물, 미생물, 시점, 반복 처리 및 이들의 조합을 포함하는 본 발명의 상기 측면에 적용 가능할 수 있음이 이해되어야 한다.
추가적 방법론
하기 방법론은 본원에서 이전에 기재된 바와 같이 하나 이상의 미생물을 확인하기 위한 본 발명의 방법에 적용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 구현예에 따른 시스템 10을 나타낸다. 시스템 10에는 요청자 11, 요청 처리자 12, 성장 시설 13, 데이터베이스 또는 라이브러리 14 및 기탁처 15가 포함된다.
도 2는 본 발명의 구현예에 따른 방법 20을 예시하는 순서도를 제공한다. 도 2에 나타낸 단계는 도 1에 나타낸 시스템 10을 참조하여 기재될 것이다.
본 발명의 상기 측면은 특히 본 발명의 제1, 또는 제8(및/또는) 관련 측면을 참조하여, 하나 이상의 식물에 하나 이상의 바람직한 특성을 부여할 수 있는 하나 이상의 미생물 확인의 관점에서 기재된다. 그러나 본원에서 이전에 기재되고 본 발명의 제7(및/또는 관련) 및 제8(및/또는 관련) 측면에 요약된 바와 같이, 하나 이상의 식물에 하나 이상의 바람직한 특성을 부여할 수 있는 하나 이상의 조성물, 또는 하나 이상의 식물에 하나 이상의 바람직한 특성을 부여할 수 있는 조성물을 제조하는 하나 이상의 미생물의 확인에 동일하게 적용 가능함이 이해되어야 한다. 따라서 문맥 상 달리 요구되지 않는 한, 명세서의 본 섹션에서 본 발명의 구현예를 기재하는 경우, 본 발명의 제1 측면에 대한 언급은 또한 본 발명의 제7(및/또는 관련) 및 제8(및/또는 관련) 측면에 대한 언급을 포함하는 것으로 간주되어야 하며, 하나 이상의 미생물에 대한 언급은 하나 이상의 조성물에 대한 언급은 포함하는 것으로 간주되어야 한다.
방법은 식물(또는 식물 클래스 또는 그룹)을 확인하는 요청자 11과 함께 단계 21에서 시작된다. 특정 식물 또는 식물 유형이 확인될 수 있는 이유는 당분야 숙련가에게 자명할 것이다. 그러나 예로서, 일반적으로 높은 성장 속도를 갖는 것으로 주지된 식물이 더 느린 속도로 성장하고 있거나 전혀 성장하지 않는 것이 확인될 수 있고, 단순히 기존 성장 속도를 개선하고자 원할 수 있거나 또는 상이한 기후/환경/지리적 영역으로 식물을 도입하고자 원할 수 있다. 본 발명은 특정 식물(들)에 개선을 부여하는 것에 제한되지 않으며, 식물(들)의 성장을 저해하거나 달리 역효과를 미치기 위해 이용될 수 있다.
단계 22에서, 요청자 11은 식물 및/또는 이들의 정체를 요청 처리자 12에게 송부한다. 요청자 11은 이들이 왜 또는 무슨 특성을 개선하고자 하는지와 같은 추가 관련 정보를 제공할 수 있다. 하나의 요청 처리자 12만 나타내었으나, 시스템 10에서 둘 이상이 제공될 수 있음이 이해될 것이다.
요청자 11이 식물 클래스 또는 그룹을 확인하면, 둘 이상의 식물 변종이 평가될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 하나 이상의 식물 변종의 선택은 본 발명의 방법에 따른 상이한 미생물 이용을 포함하는 상이한 변종의 추가 평가를 포함하여, 확인된 그룹 또는 클래스에 기반하여 시스템 10 내에서 다른 곳에서 수행될 수 있다.
본 발명에 이에 제한되지는 않지만, 요청은 웹 브라우저를 통해 인터넷에 걸쳐 편리하게 수신될 수 있다. 웹 브라우저의 이용은 추가적으로 또는 대안적으로 이용되어 요청자 11이 이들의 요청에 반응하여 수행된 진행에 대한 보고서를 볼 수 있도록 할 수 있다. 예를 들어, 성장 측정치가 제공될 수 있다.
단계 23에서, 요청 처리자 12는 본질적으로 본 발명의 제1 측면에 따른 하나 이상의 미생물의 선택 방법의 수행을 개시함으로써 요청을 수신하고 처리한다. 요청 처리자 12가 제1 측면의 방법을 능동적으로 수행할 수도 수행하지 않을 수도 있고, 또는 이들의 일부만을 수행할 수도 있음을 주지하라. 특정 구현예에 따르면, 요청 처리자 12는 요청자 11 및 제1 측면의 방법을 수행할 수 있는 당사자 사이의 중개자 또는 에이전트로 작용할 수 있다. 또한 상이한 배열이 상이한 요청에 반응하여 수행될 수 있다. 예를 들어 하나의 요청에 있어서, 요청 처리자 12 주변의 환경이 특정 식물을 평가하기에는 적합하지만 다른 것에 대해서는 부적합하여 제3 당사자 시설의 보조를 필요로 할 수 있다. 이는 특정 토양 유형, 고도 또는 기후에서 평가하기를 원하기 때문일 수 있다. "인공적인" 환경이 이용될 수 있음이 이해되지만 다른 인자도 자명할 것이다. 또한 다양한 정도의 사용자 상호작용이 요청 처리자 12에서 일어날 수 있다. 하나의 구현예에 따르면, 컴퓨터 처리자는 요청자 11에 의한 데이터 입력에 기반하여 연구를 위한 파라미터 또는 조건을 선택한다. 이해될 바와 같이, 구조화 정보 요청의 제공은 여기에 영향을 미치는 것을 도울 수 있고, 필요한 경우 데이터베이스 14를 포함하는 데이터베이스에 대한 참조를 수행할 수 있다.
단계 24에서, 평가 절차의 파라미터가 선택된다. 예를 들어, 식물(들)에 바람직한 개선을 제공할 수 있는 미생물에 대한 데이터베이스 14에 대한 참조가 수행될 수 있다. 현재까지 특정 식물 변종에 유익한 연관성을 갖는 미생물에 대해 당분야에 거의 데이터가 제공되지 않았으나, 이는 본 발명의 방법의 진행 중인 운영을 통해 개선되고 데이터베이스 14에 저장될 것이다. 다른 파라미터, 예컨대 식물 유형(들) 및 환경적 조건도 선택될 수 있다.
단계 25에서, 요청(또는 이들의 일부) 및 평가 파라미터는 기탁처 15로부터 적합한 미생물을 수득할 수 있는 성장 시설 13으로 송부된다. 이들은 이전에 확인된 것일 수도 확인되지 않은 것일 수도 있다. 하나의 성장 시설 13 및 하나의 기탁처 15만을 나타내었으나, 본 발명이 이렇게 제한되지 않음이 이해될 것이다.
또한, 임의의 둘 이상의 요청 처리자 12, 성장 시설 13, 데이터베이스 14 및 기탁처 15가 같이 배치되고/되거나 동일한 제어 하에 있을 수 있다.
단계 26에서, 선택 방법은 바람직하게는 제1 측면의 선택 방법에 따라 수행된다.
단계 27에서, 반응이 요청으로 송부된다. 반응은 요청자 11 및/또는 제3 당사자에게 송부될 수 있고, 바람직하게는 단계 26에서 생성된 결과의 적어도 서브세트, 식물(들)의 확인, 식물(들), 미생물(들)의 확인, 미생물(들), 또는 미생물과의 연관성에 제공되는 식물(들), 즉 단계 26에서 유익성을 제공하는 것으로 나타난 것들 중 적어도 하나가 포함된다.
단계 28에서, 데이터베이스 14는 단계 26의 선택 방법 결과로 업데이트될 수 있다. 상기 단계는 주기적으로 또는 선택 방법이 수행되는 다른 다양한 단계에서 단계 27 전에 수행될 수 있다. 바람직하게는 식물(들) 및 미생물 간의 새로운 유익한 연관성의 적어도 세부사항이 기록된다. 비상용성이거나 덜 유익한 연관성도 바람직하게는 기록되어 경시적으로 식물 및 미생물의 지식 틀을 구축할 것임이 이해될 것이다.
도 2의 하나 이상의 단계가 생략되거나 반복될 수 있음이 이해될 것이다. 예를 들어, 성장 시설 13은 단계 26에서 결과를 생성할 수 있고, 이에 반응하여 하나 이상의 단계 21 내지 26이 반복될 수 있다.
따라서 본 발명은 식물(들)(또는 이들의 성장 또는 다른 특징)을 개선하기 위한 수단 및 방법을 제공한다. 이는 요청자 11이 제1 지리적 영역(예로 국가) 또는 달리 한정된(예로 성장 조건에 영향을 미치는 파라미터 또는 특징, 예컨대 토양 염도 또는 산도에 의해) 환경에서 제1 또는 또 다른 영역에서의 식물 개선 목적을 위해 제1 영역에 존재하지 않거나 존재가 제한된 미생물학적 생물 다양성에 접근할 수 있도록 함으로써 달성된다. 다른 영역은 외국이거나 외국에 있을 수 있지만, 다르게는 정치적 경계에 의해 한정되는 것보다는 식물에 영향을 미치는 환경 특징에 의해 한정될 수 있다. 결과적으로, 본 발명은 이러한 미생물(들)이 제1 영역에 존재하지 않을 수 있거나 존재가 제한된 경우에도, 요청자가 제1 영역에서 특정 식물(들)의 특정 미생물(들)의 유익한 효과를 수득하도록 할 수 있다.
본 발명의 예시적 실시를 하기에 제공한다.
1. 뉴질랜드(국내 회사)의 회사가 제2의 외국 회사(외국 회사)와 계약 관계에 들어간다.
2. 외국 회사는 외국 품종과 유익한 식물-미생물 연관성을 형성할 수 있는 뉴질랜드의 육지 및 해양 미생물 생물 다양성 요소에 대한 접근을 획득하기 위해, 그 자국 또는 다른 외국 국가의 환경(들)에 적응된 식물 품종으로부터 국내 회사에 종자, 절단물 또는 다른 식물 번식체(외국 품종)를 송부하기로 동의한다.
3. 유익성의 성질은, 예를 들어 비제한적으로 임의의 하나 이상을 통한 증가된 식물 생산성을 포괄할 수 있다: 증가된 뿌리 또는 잎 질량, 또는 디아조 영양 생물, 예컨대 클레브시엘라 또는 리조비움에 의한 질소 고정을 통한 영양분 이용 효율성 증가를 통해, 또는 토양으로부터 식물 영양분의 배출, 예컨대 미생물 피타아제의 생산을 통해 토양에서 배출되는 포스페이트를 통해, 또는 식물 표현형, 예를 들어 현화일의 개선 또는 식물을 특정 목적을 위해 적합하게 만드는 맛, 냄새 또는 특성에 연관된 화합물을 포함하는 화학적 프로필의 변화를 통해.
4. 뉴질랜드에서, 국내 회사는 종자 코팅, 종자 내로의 직접적 접종 또는 묘목의 발아 및/또는 성장 배지의 오염을 통해 토착 미생물과의 그 성장 동안 식물과 접촉하도록 하는 성장 재료 중 종자 발아 및 식물 성장 방법에 의해, 식물에 대한 이들의 가능한 효과에 대한 지식을 갖거나 갖지 않고, 종자를 미생물에 노출시킴으로써 어느 토착 미생물이 외국 식물과 연관성을 형성할 수 있는지를 확인한다. 본 발명은 상기 배열 또는 방법론에 제한되지 않는다. 예를 들어, 뉴질랜드 이외의 토양에 존재하는 미생물이 유익성을 제공할 수 있고, 평가가 뉴질랜드에 부가하여 또는 그 대신에 이러한 영역에서 수행될 수 있음이 자명할 수 있다. 또한 인공적인 환경이 생성될 수 있다. 바로 앞의 예를 참조하면, 이는 이러한 영역으로부터 토양 및/또는 미생물을 수득하고 뉴질랜드에서 평가를 수행함으로써 달성될 수 있다. 자명할 바와 같이, 이러한 구현예에는 다른 파라미터 중 환경 조건의 인공적 제어의 제공이 포함될 수 있다. 즉, 본 발명은 토착 미생물에 기반한 영역에서의 평가 수행에 제한되지 않는다-미생물은 미생물의 천연 환경 이외에서 평가를 수행하기 위해 인공적으로 유도될 수 있다.
5. 이들이 일어나는 성장 기간 및 물리적 조건은 외국 회사에 의해 특정되거나 바람직한 파라미터에 기반하는 것을 포함하여, 식물종 및 특정 식물 개선 형질에 따라 크게 변할 수 있다. 관련 식물 성장 기간 후, 가능한 식물-미생물 연관성의 성질은 미생물이 외국 농작물과 식물내생생물, 착생식물 또는 근권 연관성을 형성하였는지를 결정하기 위한 미생물학적 평가에 의해 결정될 수 있다.
6. 이러한 연관성(들)이 나타나는 경우, 미생물은 (외국)농작물 또는 식물에 연관될 수 있는 (뉴질랜드 토착)미생물의 수집을 형성한다.
7. 본 발명의 하나의 구현예에서, 수집의 미생물 단리물은, 예를 들어 종자 상에 코팅되거나, 종자 또는 묘목 내로 접종되거나, 또는 멸균되거나 멸균되지 않을 수 있는 성장 배지 내로 접종될 수 있다.
8. 적합한 시기 후, 식물은 외국 회사에 바람직한 방식으로 식물에 유익성을 가장 잘 제공할 수 있는 식물-미생물 연관성을 확인하기 위해 설계된 다른 바람직한 특징 또는 개선된 뿌리 및 잎 성장에 대해 평가된다.
9. 선택 기준의 예는 이전에 본원에 제공되며, 제2의 외국 환경의 동일한 파라미터가 국내 또는 평가 영역(즉, 예에서 뉴질랜드)에 존재하지 않는 경우, 외국 환경에서와 가장 유사하고 외국 회사에 허용 가능한 것으로 간주될 수 있는 유사한 파라미터가 선택될 수 있다. 상기 4에 언급된 바와 같이, 본 발명에는 또한 외국 재료의 도입 또는 국내 또는 평가 영역에서 다른 인공적인 조건을 생성하는 것이 포함된다.
10. 하나 이상의 미생물의 존재 하에 하나 이상의 식물의 성장, 바람직한 특징을 갖는 하나 이상의 식물의 선택, 및 식물과 연관성을 형성하는 미생물(들)의 획득이 관여되는 단계가 1회 이상 반복될 것이다.
11. 외국 품종의 성장에 대해 상업적으로 유의미한 유익성을 제공하는 엘리트 미생물이 상기 방법에 의해 확인되며, 외국 환경에서의 추가 평가 및 선택을 위해 외국 회사로 운송될 수 있다.
12. 추가 구현예에서, 외국 회사는 외국 품종의 종자, 절단물 또는 번식체 상에서 또는 안에서 발견된 미생물이 국내 회사의 수집에 추가되어 다른 회사로부터의 유사한 평가를 위해 수령된 품종 또는 다른 외국 품종에서 모두 이용하기 위한 수집을 확대시킬 것임을 동의할 것이다.
대안적인 구현예에서, 외국 품종과 식물-미생물 연관성을 형성할 수 있는 미생물 단리물, 즉 수집은 상기 항목 7-11이 제2 회사의 영역에 의해 및/또는 영역 내에서 수행되도록 평가 및 선택을 위해 제2 회사로 송부된다. 이는 제1 회사의 제어에 의해 또는 제어 하에 수행될 수 있다.
수집의 소정 미생물(들)의 확인 및 이용 이외의 추가 대안으로, 국내 회사는 예를 들어 종자 코팅, 종자 또는 발아 묘목 내로의 직접적 접종 및/또는 성장 배지의 오염 등을 통한 식물의 그 성장 동안 토착 미생물과의 접촉을 보장하는 성장 재료 중 종자의 발아 및 식물의 성장에 의해, 식물에 대한 이들의 가능한 효과에 대한 지식을 갖거나 갖지 않고 단순히 종자를 토착 미생물에 노출시킬 수 있다. 자명할 바와 같이, 국내 회사는 동일하거나 상이한 미생물이 존재할 수 있는 다른 영역에서 유사한 평가를 위해 추가적으로 또는 대안적으로 배열될 수 있다. 이들이 일어나는 성장 시기 및 물리적 조건은 외국 회사에 바람직한 식물종 및 특정 식물 형질에 따라 크게 변할 수 있다. 식물 성장 시기 후, 가능한 식물-미생물 연관성의 성질은 상술된 바와 유사한 방식으로 결정될 수 있다.
실시예
이제 본 발명을 하기 비제한적 실시예로 추가 설명한다.
실시예 1.
사료 농작물, 예컨대 호밀풀의 당 함량을 개선할 수 있는 미생물을 확인하기 위해:
단계 1. 미처리 호밀풀 종자를 작은 화분에서 다양한 토양에 심는다. 토양에는 순수한 미생물 배양물, 미생물 혼합물 또는 다른 원천에서 유래된 미생물을 함유하는 재료의 혼합물을 포함하는 추가 개질이 포함될 수 있다.
단계 2. 적합한 성장 시기, 즉 1개월 후, 식물에서 토양을 세척해내고, 미생물을 순수한 배양물 중의 개별 단리물로, 또는 혼합 모집단으로, 예로 수성 뿌리 분쇄물 및/또는 줄기/잎 분쇄물로부터의 미생물 현탁액으로 뿌리 및 줄기/잎으로부터 단리한다.
단계 3. 이어서 미생물을 미처리 호밀풀 종자를 심은 식물 성장 배지에 첨가한다. 대안적으로 미생물(들)을 적합한 종자 코팅 재료, 예로 겔 내로 혼합하고 유사한 식물 배지 내로 심기 전에 종자 상에 코팅한다. 대안적으로, 종자를 발아시킨 뒤 단기간(통상 미생물이 발아 식물과 식물내생생물 또는 착생식물 연관성을 형성할 수 있는 기회를 최대화하기 위해 1-24시간) 동안 미생물에 노출시키고 이어서 유사한 성장 배지 내로 심는다. 이들 경우 각각에서, 성장 배지는 초기에 멸균되었을 수 있으나, 이것이 필수적인 것은 아니다.
단계 4. 적합한 성장 기간, 예로 4-6주 후, 잎 성장을 평가하고, 분쇄된 잎의 당 함량을 굴절측정기 또는 당분야 숙련가에게 공지된 다른 방법을 이용하여 결정한다. 잎 수율 및/또는 당 함량 모두에 대해 최고값을 갖는 식물을 선택하고, 이들의 뿌리 및 잎 미생물을 단리하여 단계 2에서와 같이 제조한다. 이어서 단계 2 내지 단계 3의 절차를 잎 수율 대비 당 함량에 대한 선택 기준의 개질을 포함하여 또는 포함하지 않고 반복적으로 반복할 수 있다.
단계 5. 당 함량의 개선이 충분한 것으로 간주되는 시점까지 상기 반복 절차를 수행한 뒤 최고 성능의 식물을 선택하고, 이들에 연관된 미생물을 단리하여 호밀풀의 당 함량을 개선하는 상업적 제품을 개발하기 위해 이용한다.
실시예 2.
낟알 농작물, 예컨대 밀의 새싹형성을 개선할 수 있는 미생물을 확인하기 위해:
주로 북반부에 파종되는 겨울 밀 변종의 경우, 조기 새싹형성이 겨울 생존, 성장 및 여름에 결과적인 낟알 수율에 관련된 형질이므로, 북반구에서 겨울 밀 종자가 겪는 것과 유사한 빛 및 온도 조건 하에 미생물을 함유하는 성장 배지에 종자를 노출한 후 조기 새싹형성을 나타내는 식물을 선택하는 것이 중요할 수 있다.
단계 1. 미처리 밀 종자를 작은 화분에서 다양한 토양에 심는다. 토양에는 순수한 미생물 배양물, 미생물 혼합물 또는 다른 원천에서 유래된 미생물을 함유하는 재료의 혼합물을 포함하는 추가 개질이 포함될 수 있다.
단계 2. 적합한 성장 시기, 즉 1개월 후, 식물에서 토양을 세척해내고, 미생물을 순수한 배양물 중의 개별 단리물로, 또는 혼합 모집단으로, 예로 수성 뿌리 분쇄물 및/또는 줄기/잎 분쇄물로부터의 미생물 현탁액으로 뿌리 및 줄기/잎으로부터 단리한다.
단계 3. 이어서 미생물을 미처리 호밀풀 종자를 심은 식물 성장 배지에 첨가한다. 대안적으로 미생물(들)을 적합한 종자 코팅 재료, 예로 겔 내로 혼합하고 유사한 식물 배지 내로 심기 전에 종자 상에 코팅한다. 대안적으로, 종자를 발아시킨 뒤 단기간(통상 미생물이 발아 식물과 식물내생생물 또는 착생식물 연관성을 형성할 수 있는 기회를 최대화하기 위해 1-24시간) 동안 미생물에 노출시키고 이어서 유사한 성장 배지 내로 심는다. 이들 경우 각각에서, 성장 배지는 초기에 멸균되었을 수 있으나, 이것이 필수적인 것은 아니다.
단계 4. 적합한 성장 기간 후, 새싹형성을 평가한다. 특정 시기에 걸친 최초 새싹형성 및/또는 최대 수의 새싹형성 식물을 선택하고, 이들의 뿌리 및 잎 미생물을 단리하여 단계 2에서와 같이 제조한다. 이어서 단계 2 내지 단계 3의 절차를 결과적인 낟알 수율 대비 새싹형성에 대한 선택 기준의 개질을 포함하여 또는 포함하지 않고 반복적으로 반복할 수 있다.
단계 5. 상기 반복 절차를 새싹형성의 개선이 충분한 것으로 간주되는 시점까지 수행한 뒤, 최고 성능의 식물을 선택하고, 이들에 연관된 미생물을 단리하여 밀 새싹 형성의 속도 및 정도를 개선하는 상업적 제품으로 개발하기 위해 이용한다.
실시예 3:
유익한 농작물 형질을 수반하는 종자-매개 식물내생생물을 선택하기 위한 방법의 이용
종자-매개 진균 네오타이포디움종 계통을 통해 생물학적 및 비생물학적 스트레스 요인 모두에 대해 개선된 관용성 및 곤충 내성과 같은 유익한 형질을 발현하는 사료 풀이 뉴질랜드 및 다른 곳의 농부들에게 널리 채용되어 왔다. 상기 종자 매개 진균 및 진균 패밀리의 다른 유사한 종이 발현하는 것과 유사한 형질의 유익성을 더 넓은 범위의 종자-매개 식물내생생물 미생물로 연장함으로써 훨씬 더 넓은 범위의 유익한 농작물 형질에 대한 접근성을 제공하는 것이 바람직할 것이다.
단계 1. 미처리 호밀풀 종자를 작은 화분에서 다양한 토양에 심는다. 토양에는 순수한 미생물 배양물, 미생물 혼합물 또는 다른 원천에서 유래된 미생물을 함유하는 재료의 혼합물을 포함하는 추가 개질이 포함될 수 있다.
단계 2. 적합한 성장 시기 후, 식물에서 토양을 세척해내고, 에탄올 및 나트륨 하이포클로라이트 또는 당분야 숙련가에게 공지된 다른 방법으로 표면 멸균하고, 식물내생생물 미생물(식물내생생물)을 순수한 배양물 중의 개별 단리물로, 또는 혼합 모집단으로, 예로 수성 뿌리 분쇄물 및/또는 줄기/잎 분쇄물로부터의 미생물 현탁액으로 뿌리 및 줄기/잎 및 종자의 내부 조직으로부터 단리한다.
단계 3. 이어서 식물내생생물 미생물을 사전 발아되고 표면 멸균된 호밀풀 종자를 심은 식물 성장 배지에 첨가한다(종자를 영양분 한천 플레이트 상에서 발아시킴으로써 멸균성에 대해 확인함). 대안적으로 미생물(들)을 적합한 종자 코팅 재료, 예로 겔 내로 혼합하고 유사한 식물 배지 내로 심기 전에 표면 멸균된 종자 상에 코팅한다. 대안적으로, 표면 멸균된 종자를 영양분 한천 플레이트 상에서 발아시키고 멸균성에 대해 확인한 후 단기간(통상 미생물이 발아 식물과 식물내생생물 또는 착생식물 연관성을 형성할 수 있는 기회를 최대화하기 위해 1-24시간) 동안 미생물에 노출시키고 이어서 유사한 성장 배지 내로 심는다. 이들 경우 각각에서, 성장 배지는 초기에 멸균되었을 수 있으나, 이것이 필수적인 것은 아니며 추가적인 미생물이 성장 배지 및/또는 식물에 적용될 수 있다.
단계 4). 적합한 성장 기간, 예로 4-6주 후, 식물을 바람직한 표현형의 발현에 대해 평가한다. 표현형에는 개선된 색상, 식물 형태, 대사물질 발현 등이 포함될 수 있다.
단계 5). 선택된 식물이 종자 세트 시점까지 계속 자라도록 둔다. 이 단계에서, 각 식물로부터의 종자 서브세트를 배양 의존적 또는 독립적 방법을 이용하여 식물내생생물 수반에 대해 스크리닝할 수 있다. 스크리닝에서 양성 결과를 나타낸 식물로부터의 나머지 종자를 발아시키고 식물내생생물 수반 및 단계 3-5에 기재된 바와 같은 바람직한 표현형을 전달하는 능력을 농축하기 위해 추가 선택 라운드에 미생물 첨가 없이 심는다.
대안적으로, 식물내생생물 미생물을 예를 들어 수용액 중에서 표면 멸균된 종자를 분쇄함으로써 제조된 미생물 현탁액으로, 또는 표면 멸균된 종자로부터의 단리물로서 또는 외식편으로서 각 식물로부터의 종자 서브세트에서 획득할 수 있다. 단리물 및 제조물을 단계 3에 기재된 바와 같은 표면 멸균된 종자에서 발생하는 식물에 대한 접종물로 이용한다.
방법의 추가 변형에서, 형질의 종자 전달을 위한 선택은 이전 세대의 선택된 식물로부터의 종자 서브세트를 표면 멸균하고(이전 스크리닝을 포함하여 또는 포함하지 않고) 이들이 발아하여 단계 3 및 4에 일반적으로 기재된 바와 같이 표현형 스크리닝이 수행되는 시기(즉 종자 세트 이전) 동안 자라도록 두어 다음 세대에서 일어날 수 있다. 이 세대에서 바람직한 표현형을 나타내는(즉 종자 전달에 의한) 식물을 선택하고, 조직 외식편을 제조하고/하거나 미생물을 식물 조직으로부터 단리하고/하거나 조정제 미생물 현탁액을 수용액 중에 표면 잎 또는 뿌리를 분쇄함으로써 제조한다. 이들 제조물 중 하나 또는 조합을 단계 3-5에 기재된 바와 같이 성장 및 선택 그리고 종자 수확의 추가 반복 라운드에 대한 접종물로 이용한다. 대안적으로 바람직한 종자-매개 형질을 나타내는 식물의 나머지 종자를 발아시키고 단계 3-5에 기재된 바와 같이 바람직한 표현형을 전달하는 능력 및 식물내생생물 수반을 농축시키기 위해 추가 선택 라운드에서 미생물 첨가 없이 심을 수 있다.
단계 6). 상기 반복 방법의 연속 라운드 말기에, 바람직한 종자-매개 표현형의 세대에 의해 결정되는 바와 같이 최적 종자 라인을 상업적 평가 및 품종 개발을 위해 선택한다.
실시예 4
호밀풀(롤리움 페렌)의 성장을 개선할 수 있는 미생물을 획득하기 위한 방법의 이용.
호밀풀은 종종 비옥한 토양에서 자라며, 사료 생산에서 중요한 농작물이다. 따라서 실험적으로 부여된 선택 압력 없이 비옥한 기재에서 호밀풀의 생물량을 증가시킬 수 있는 미생물 그룹을 확인하기 위해 유도된 선택 방법을 이용하는 것이 바람직할 것이다.
뉴질랜드 북도의 73개 토양 표본(처리군)을 방법의 시작을 위한 미생물 다양성의 원천으로 이용하였다. 토양 표본을 배수와 부피를 증가시키기 위해 필요에 따라 모래:질석(1:1 또는 1:2)과 혼합하였다. 표본의 10 복제물을 28ml 튜브에 넣고, 호밀풀 종자(롤리움 페렌 품종 One50, 닐 식물내생생물)를 심었다. 종자가 발아할 때까지 연무 호스로 급수한 뒤, 묘목이 건조되지 않도록 필요에 따라 추가 급수로 주 3회 포화시까지 샤워시켰다. 표준 성장 조건은 표 1을 참고하라.
표준 성장 조건
변수 조건
급수 주 3회 포화시까지 물 또는 합성 비료로
온도 22-24℃ 항온
일광 조건 16시간 명, 이어서 8시간 암
종자 멸균 Miche and Balandreau(2001)에 기재된 바와 같이 1-2% 나트륨 하이포클로라이트에서 15분, 이어서 나트륨 티오설페이트에서 30분 켄칭
토양/복제물 부피 28ml
무작위화 모든 처리군 복제물 및 대조군을 공간적으로 무작위화했음
1라운드 선택파종 후(DAS) 60일에 각 표본으로부터 4개 식물을 선택하고 처리하여 첫 번째 라운드의 선택을 위한 미생물 접종물을 제공하였다. 기재 위 2cm에서 잎을 잘라 폐기하였다. 뿌리 및 부착된 줄기를 토양이 없도록 흔들고 세척하여 대부분의 토양 단편을 제거하고 흘려보낸 뒤 뿌리 및 줄기를 비닐 백에서 조합하였다. 이어서 뿌리 재료를 현탁하기 위해 첨가된 10ml의 물과 함께 상기 재료를 백 안에서 분쇄하였다. 생성 현탁액의 액체 부분을 초기 미생물 접종물로 이용하였다. 표면 멸균된 종자를 각 표본에 대해 1ml의 뿌리 현탁액 중에 1시간 담가 두었다. 이어서 담가둔 종자를 수돗물로 가습한 화분용 혼합물(Kings Plant Barn, New Zealand; 과립화된 나무껍질, 토탄 이끼, 경석, 및 서방형 비료)을 함유하는 28ml 튜브(각 처리군에 대해 15 복제물씩) 내로 심었다. 나머지 뿌리 현탁액으로 SDW에 충분한 최종 부피를 만들어 2ml을 심은 종자에 걸쳐 피펫팅하였다. 심은 뒤, 종자를 신선한 건조 기재로 얇게 덮었다. 이어서 화분에 수돗물로 주 3회 물을 주었다.
2라운드 선택
파종 후(DAS) 118일에 잎을 수확하고 칭량하고, 두 번째 라운드의 선택을 위한 미생물 접종물을 제공하기 위해 처리군을 선택하였다. 원래 73개의 처리군 중 최대 평균 잎 중량을 갖는 21개 처리군 각각에서 8개의 최대 식물만을 처리를 위해 선택하였다. 또한 각각의 4 식물의 4 복합 처리군을 최대 잎 생물량을 갖는 16개의 개별 식물로부터 생성하였다. 잎을 기재 수준 위 2cm에서 자르고 칭량하였다. 각 식물의 뿌리 및 기저 줄기에서 기재가 없도록 흔든 뒤 헹구고, 비닐 백에서 조합하여 분쇄하고, 각 처리군에 대해 30 복제물을 심고 접종물의 최종 부피가 65ml인 것을 제외하고는, 1라운드 선택에 대해 기재된 것과 동일한 방식으로 두 번째 라운드의 선택을 접종하기 위해 이용하였다.
3라운드 선택
두 번째 라운드의 선택으로부터의 식물을 파종 후(DAS) 39일에 수확하였다. 잎을 기재 위 2cm에서 절단하고 칭량하여 폐기하였다. 상위 15 처리군으로부터의 3 최대 식물을 선택하여 3라운드 선택을 위한 접종물을 생성하였다. 각 처리군의 30 복제물에 대해 뿌리 및 줄기를 상술된 바와 같이 분쇄하고 이용하였다.
미생물 단리
3라운드 선택으로부터의 잎을 파종 후(DAS) 63일에 수확 및 칭량하고, 최대 평균 잎 중량을 갖는 5개 처리군으로부터의 최대 식물을 미생물 단리를 위한 접종물을 제공하기 위해 선택하였다. 뿌리 및 2cm 줄기를 헹군 뒤 상술된 바와 같이 비닐 백에서 분쇄하였다. 작은 부피의 접종물을 인취하여 R2A 상에 플레이팅된 10배 희석 시리즈를 제조하였다. 각 제조물로부터의 분쇄된 뿌리의 소편을 또한 10ml의 N-결핍 반고체 말레이트(NDSM) 배지 내로 접종하였다(Eckford et al, 2002). 실온에서 2-4일 인큐베이션 후, 생성 외피를 인취하여 개별 집락의 단리를 위한 R2A 한천 상에 전개하였다. 에탄올을 25%의 최종 농도로 뿌리 현탁액에 첨가하고, 30분 동안 실온(RT)에서 인큐베이션한 뒤 R2A 상에 플레이팅하는 액티노마이세트에 대한 선택적 단리 단계를 수행하였다. 진균 단리를 위해, 분쇄된 뿌리의 소편을 용융 PDA(45℃로 냉각함)에 임베딩하였다. 25℃에서 24-72시간 인큐베이션 후, R2A 및 PDA 플레이트를 해부 현미경 하에 조사하였다. 박테리아 및 진균 집락을 풍부도에 대해 평가하고, 형태에 따라 그룹화하고, 대표적 단리물을 골라 새로운 R2A 또는 PDA 플레이트 상에 스트리킹하였다. 표준 방법을 이용하여 DNA 추출, PCR 증폭 및 16S rRNA 유전자(박테리아) 또는 ITSS 영역(진균)의 서열분석에 의해 종 수준으로 단리물을 확인하였다.
미생물 평가
풍부도, 다양성 및 종 특징에 기반하여 선택된 61개의 개별 단리물 및 28개의 조합물에 대해 미생물 평가를 수행하였다. 선택된 단리물을 R2A(박테리아) 또는 PDA(진균) 상에 전개하고, 72시간 동안 25℃에서 인큐베이션한 뒤 첨가된 SDW로 한천 표면을 멸균 용기 내로 긁어내었다. 박테리아를 2ml SDW 내로 수확하였다. 진균을 5-10ml SDW로 멸균 차 여과기를 통해 체질하여 균사체 덩어리 및 부착된 한천 소편을 제거하였다. 수확된 세포의 연속 희석물을 플레이팅하고, 24시간 동안 25℃에서 인큐베이션하여 각 현탁액 중 집락 형성 단위(CFU)의 수를 산정하였다. 1ml 당 1x107(박테리아) 및 1x103(진균) CFU에 해당하는 희석 부피를 이들의 플레이트 계수로부터 계산하였다. 호밀풀 종자(One50 닐 식물내생생물)를 미생물 현탁액 중 1시간 동안 담근 뒤 가습된 화분용 혼합물을 함유하는 28ml 튜브에 개별적으로 심었다. 2ml의 단리물 현탁액을 종자에 걸쳐 피펫팅한 뒤 기재로 덮었다. 이어서 모든 식물을 수돗물로 주 3회 물을 급수하였다. 잎을 절단하고, 파종 후(DAS) 41일에 칭량하였다. 뿌리를 세척하고, 블로팅하여 건조하고 칭량하였다. 미생물이 없는 대조군에 비해 적어도 5%의 식물 생물량 획득을 일으킨 미생물 처리군을 표 2에 나타낸다.
증가된 호밀풀 생물량에 연관된 미생물 처리군
처리군 BDNZ# %IOC FW %IOC RW %IOC BM ID
58918 22.9 25.4 23.5 미코박테리움 진셍기테래
58900 25.3 7.7 21.3 바실러스 세레우스
58913 21.5 16.6 20.4 미코박테리움 옥시단스
조합물 18.9 5.1 15.8 리조비움 푸센스, 쿠르토박테리움 진셍기솔리
59084 21.8 -7.4 15.2 페니실리움 달레애
58894 13.3 4.3 11.3 브레분디모나스 베시쿨라리스
58910 13.6 2.3 11.1 애로마이크로비움 폰티
58895 11.2 5.5 9.9 마이크로박테리움 히드로카르본옥시단스
58911 8.9 5.3 8.1 스핑고픽시스 칠렌시스
58950 7.8 8.4 7.9 아르트로박터 키저
59088 13.6 -14.6 7.3 페니실리움 멜리니이
58892 8.4 0.4 6.6 리조비움 그래함미
58948 8.6 -2.2 6.2 브레분디모나스 베시쿨라리스
조합물 5.1 9.7 6.2 리조비움 푸센스, 쿠르토박테리움 진셍기솔리, 헤르바스피릴룸 루브리수발비칸스
58891 6.7 -0.2 5.1 리조비움 에틀리
조합물 4.9 5.6 5.0 엑시구오박테리움 인디쿰, 메소리조비움 아모르패, 브레분디모나스 베시쿨라리스, 아르트로박터 키저
FW=신선한 잎 중량; RW=신선한 뿌리 중량; BM=식물 생물량(뿌리+잎)이탤릭체는 유의미한 IOC(대조군 대비 증가; 피셔 LSD)를 나타낸다.
ID-RDPII 및/또는 NCBI 데이터베이스에서 가장 가까운 서열 매치에 기반한 추정 확인
잎 중량의 유의미한 증가(피셔 LSD)를 나타낸 3 미생물 치료군은 모두 세 번째 선택 라운드에서 잎 중량의 가장 큰 증가를 나타낸 부위로부터 단리되었다.
이들 결과는 본 발명에 의해 기재된 미생물의 유도 선택 방법이 바람직한 조건 하에 키운 호밀풀의 성장을 유의미하게 개선하는 미생물 세트를 확인할 수 있다는 증거를 제공한다.
실시예 5
바질(오시움 바질리쿰)의 수용성 탄수화물 함량을 개선할 수 있는 미생물을 확인하기 위한 방법의 이용.
뉴질랜드 북도의 43개 부위로부터의 토양 표본을 이 방법을 위한 미생물 다양성의 원천으로 이용하였다.
표본을 배수 및 부피를 증가시키기 위해 필요에 따라 모래:질석(1:2)과 혼합하였다. 각각의 표본을 이용하여 튜브 당 3-5개 바질 종자(오시움 바질리쿰, 변종 스위트 제노베스)를 심은 5 복제물의 28ml 튜브를 채웠다. 묘목을 표1에 기재된 조건 하에 식물 성장실에서 발아시켰다. 시드는 것을 방지하기 위해 필요에 따라 수돗물로 급수를 수행하였다.
파종 후(DAS) 약 14일에 식물을 수확하고 잎을 절단하여 폐기하였다. 각 표본에 있어서, 기저 줄기 및 뿌리에서 토양이 없도록 흔들고, 멸균 증류수(SDW) 중에 헹구고 복제물을 비닐 백에서 조합하였다. 이어서 식물 재료를 비닐 백 내에서 철저히 분쇄하였다. 10ml SDW를 분쇄된 뿌리에 첨가하고, 생성 현탁액을 첫 번째 선택 라운드를 위한 미생물 접종물로 이용하였다.
바질 종자를 뿌리 추출물 중에 최소 1시간 동안 담근 뒤 6ml의 액체 비료(Miracle-Gro, Scotts Australia Pty Ltd)로 가습된 화분용 혼합물(40% v/v 토탄, 30% 퇴비화 소나무껍질, 30% 미세 경석, 석회로 pH 6.1로 조정)을 함유하는 28ml 튜브 내로 심었다. 나머지 뿌리 현탁액을 40ml의 SDW로 희석하고 2ml을 종자에 걸쳐 피펫팅하였다. 복제물 튜브를 멸균 증류수에 담근 종자를 이용해서 제조된 20개의 미생물 비함유 대조군 세트와 함께 각 표본에 대해 제조하였다. 모든 튜브를 랙에 걸쳐 무작위화하였다. 묘목을 상술된 바와 같은 조건 하에 식물 성장실에서 발아시켰다. 발아 후, 각 튜브를 솎아내어 하나의 무작위로 선택된 묘목만을 남겼다.
1라운드 선택
파종 후(DAS) 20일에 각 처리군으로부터 식물 절반을 수확을 위해 무작위 선택하였다. 나머지 식물을 두 번째 라운드의 선택을 접종하기 위한 추출물의 제조를 위해 성장실에 보유하였다. 수확을 위해 선택된 식물을 화분에서 꺼내 세척하여 부착된 화분용 혼합물을 제거하고, 종이 타월 상에 건조하고 칭량한 뒤 하나의 스테인리스 스틸 볼 베어링을 함유하는 2ml 튜브 내에 넣었다. 이어서 표본을 수용성 탄수화물에 대한 미정 분석을 위해 -20℃에 냉동시켰다.
식물 추출물 중 수용성 탄수화물(WSC)의 농도를 Yemm and Willis(Biochem. J. 1954, 57: 508-514)에 의해 일반적으로 기재된 안트론(anthrone) 방법을 이용하여 결정하였다. 전체 식물 추출물을 22hz에서 2분 동안 비드 비팅에 의해 제조하였다. 이어서 1ml의 멸균 증류수를 각 표본에 첨가하였다. 혼합 후, 0.5mL의 액체 현탁액을 30분 동안 비등 수조에 놓인 96웰 마이크로튜브 블록으로 옮겼다. 이어서 각각의 블록을 5분 동안 저온 수조로 옮긴 뒤 10분 동안 3000rcf에서 원심분리하여 파편을 펠렛화하였다. 상청액을 회수하여 SDW 중 1:25로 희석하고, 40㎕의 표본을 새로운 96웰 마이크로튜브 블록으로 옮겼다. 이어서 표본에 200㎕의 새로 제조된 안트론 용액(70% 황산 중 2mg/mL)을 오버레이하였다. 블록을 5분 동안 빙냉 수조에서 냉각하고, 역전에 의해 혼합하여 60초 동안 비등 수조에 둔 뒤 바로 저온 수조로 되돌렸다. 냉각된 후, 각 반응물의 100㎕ 표본을 평탄 바닥 마이크로타이터 트레이로 옮기고, 흡광도를 600nm에서 SpectraMax M5e 분광측정기에서 측정하였다. 글루코오스 표준물을 초순수 중에 제조하고 식물 추출물 별로 처리하여 검정 곡선을 생성하였다. 결과를 식물 조직g 당 글루코오스 당량(mg)으로 보고한다.
43 처리군 중 20개는 미생물이 없는 대조군에 비해 중앙값 당 함량의 긍정적 증가를 일으켰다.
2라운드 선택
가장 큰 중앙값 당 함량을 나타낸 13개 처리군을 두 번째 선택 라운드를 위해 선택하였다. 각 처리군에서 나머지 5 식물로부터 미생물 추출물을 제조하고, 복제물의 수를 각 처리군에 대해 30으로 그리고 미생물 비함유 대조군에 대해 60으로 증가시킨 것을 제외하고는 상술된 절차에 따라 바질 종자에 적용하였다.
파종 후(DAS) 15일에 각 처리군으로부터 15개의 식물을 수확하였다. 나머지 식물을 후속 단리 실험을 위해 성장실에 보유하였다. 수확을 위해 선택된 식물을 화분에서 꺼내고, 침전물 형성을 감소시키기 위해 안트론 용액을 80% 황산 중에 제조한 것을 제외하고는 상술된 바와 같이 수용성 탄수화물 분석을 위해 처리하였다.
13 처리군 중 8개에는 미생물 비함유 대조군에 비해 중앙값 당 함량의 긍정적 증가를 일으켰다. 이 시점에서 반복 선택 라운드를 종료하였고, 미생물 단리를 수행하였다.
미생물 단리
박테리아 및 진균을 가장 큰 중앙값 WSC를 갖는 7 치료군 각각에서 최대 5개의 나머지 식물로부터 단리하였다. 각 처리군에 대해, 각 식물로부터의 줄기 재료의 1cm 아래 및 뿌리에서 기재가 없도록 흔들고 멸균 증류수 중에 헹군 뒤 2 부분으로 나누었다. 한 부분을 1분 동안 6.6% Dettol®(활성 성분:클로로자일레놀 4.8%) 중에 표면 멸균한 뒤 각각 1분씩 SDW 중에서 3회 헹구었다. 표면 멸균된 뿌리를 멸균 가위를 이용해서 소편(약 1-2cm 길이)으로 자르고 NDSM 배지(Eckford et al., 2002)를 함유한 시험관 내로 넣었다. 실온에서 2-4일 인큐베이션 후, 튜브를 관찰하고, 뚜렷한 외피를 벗겨 R2A 한천(Difco) 상에서 후속 배양함으로써 정제하였다.
한 부분으로부터의 뿌리를 비닐 백에서 조합하고 첨가된 10ml의 물로 백 내에서 분쇄하여 뿌리 재료를 현탁하였다. 분쇄된 뿌리 소편을 회수하여 PDA 플레이트 상에 두거나 45℃에서 용융 PDA 중에 임베딩하였다. 현탁액의 10배 연속 희석물을 SDW 중에 제조하고 이용하여 R2A 한천(Difco) 상에서 전개된 플레이트를 제조하였다. R2A 및 PDA 플레이트를 25℃에서 인큐베이션하고, 24-72시간 인큐베이션 후 해부 현미경 하에 조사하였다. 집락을 풍부도에 대해 평가하고, 형태에 따라 그룹화하고 대표적 단리물을 골라서 새로운 R2A 또는 PDA 플레이트 상에 순도를 위해 스트리킹하였다. 표준 방법을 이용하여 DNA 추출, PCR 증폭 및 16S rDNA 유전자(박테리아) 또는 ITSS 영역(진균)의 서열분석에 의해 종 수준으로 단리물을 확인하였다.
미생물 평가
풍부도, 다양성 및 종 특징에 기반하여 선택된 단리물 상에서 2 라운드의 미생물 평가를 수행하였다. 첫 번째 평가 라운드에서, 68 개별 단리물 및 12 조합물을 포함하는 80 처리군을 평가하였다.
실시예 4에 일반적으로 기재된 바와 같이 선택된 박테리아 및 진균 단리물을 R2A 및 PDA 플레이트 상에서 각각 배양하고 종자의 접종을 위해 현탁액을 SDW 중에 제조하였다.
현탁액을 개별 처리군으로 이용하기 위해 1ml 당 1x107(박테리아) 및 1x103(진균)으로 희석하였다. 조합물을 각각의 개별 미생물 현탁액의 동일 부피를 이용하여 제조하였다. 바질 종자를 미생물 현탁액 중에 1시간 동안 담근 뒤 6ml의 수돗물로 가습된 상업적 화분용 혼합물(실시예 4에 기재됨)을 함유하는 28ml 튜브 내에 심었다. 2ml의 미생물 현탁액을 각 종자 상부에 걸쳐 피펫팅하였다. 각 처리군에 대해 30 복제물을 제조하였고, 미생물 비함유 대조군에 대해 45 대조군을 제조하였다.
파종 후(DAS) 13일에 각 처리군으로부터의 15개 식물 및 22개의 미생물 비함유 대조군을 수확 및 WSC 결정을 위해 선택하였다. 비드 비팅 후, 0.8ml의 SDW를 각 튜브에 첨가하고 두 번째 라운드의 비드 비팅을 수행한 것을 제외하고는 상술된 바와 같이 표본 제조를 수행하였다. 이어서 생성 혼합 현탁액의 0.5mL 표본을 96웰 마이크로튜브 희석 블록으로 옮기고 -20℃에 보관하였다. 블록을 해동하고 상술된 바와 같이 탄수화물에 대해 분석하였다.
총 36 미생물 처리군이 미생물 비함유 대조군에 비해 더 큰 중앙값 탄수화물 농도를 일으켰다. 상기 데이터를 이용해서 두 번째 라운드의 미생물 평가를 위해 34 개별 단리물 및 10 조합물을 포함하는 44 처리군의 정련된 세트를 생성하였다. 처리군은 증가된 WSC에 대한 결과에 기반하여 선택하였고, 높은 순위의 미생물로부터 제조된 새로운 조합물뿐만 아니라 조합물로 잘 수행한 개별 단리물을 포함하였다.
미생물 처리군을 제조하여 바질 종자를 담그고, 처리군 복제물의 수를 45로 증가시키고 미생물 비함유 대조군의 수를 90으로 증가시킨 것을 제외하고는 상술된 바와 같이 심었다.
모든 식물을 파종 후 14일에 수확하고, 블록을 최초 30분 가열 단계 후 하룻밤 동안 냉동시킨 것을 제외하고는 상술된 바와 같이 WSC 분석을 위해 처리하였다. 이어서 표본을 해동하고 상술된 바와 같이 처리하였다. 단일 바질 표본의 희석 시리즈를 모든 블록에 로딩하여 내부 대조군으로 작용하도록 하고 블록 간 변동의 정상화를 가능케 했다.
총 20 미생물 처리군이 미생물 비함유 대조군에 비해 더 큰 중앙값 WSC 농도를 일으켰고, 11 처리군은 대조군 대비(IOC; 표 3) 5% 초과 증가를 일으켰다. 가장 높은 중앙값 탄수화물 농도를 일으킨 처리군은 첫 번째 라운드의 미생물 평가로부터 단리된 상위 3 개별 단리물의 새로운 조합물이었다.
라운드 2 미생물 평가에서 미생물 비함유 대조군 대비 더 높은 탄수화물 농도를 일으킨 미생물 처리군.
처리군 BDNZ# ID %IOC
60706, 60784, 61090 스핑고모나스 말리, 플라보박테리움 마이크로마티, 페니실리움종 14.0
60695, 60696, 60697, 60698, 60699, 60700 스핑고비움 클로로페놀리쿰, 마실리아 니아스텐시스, 플라보박테리움 리미콜라, 리조비움 알라미이, 스핑고픽시스종, 펠로모나스 아쿠아티카 12.4
60587 아조스피릴룸 리포페룸 11.4
60732, 60739, 60740, 60744, 61082 메조리조비움 아모르패, 아스티카카울리스 타이휴엔시스, 랄스토니아 솔라나세아룸, 마이크로박테리움 폴리오룸, 트리코더마 10.6
60805 부르크홀데리아 메가폴리타나 10.2
60732 메소리조비움 아모르패 7.9
61043 움벨롭시스종 7.5
60734 아쿠아박테리움 폰티필럼 7.2
60797 로다노박터 테래 7.1
60706 스핑고모나스 말리 7.1
60578, 60580, 60696, 60697, 61043 스핑코비움 제노파검, 슈도모나스 모라비엔시스, 마실리아 니아스텐시스, 플라보박테리움 리미콜라, 움벨롭시스종 5.0
미생물 비함유 대조군 0.0
ID-NCBI 및/또는 RDPII 데이터베이스에서 가장 가까운 매치에 기반한 추정 확인이들 결과는 본 발명에 의해 기재된 미생물의 유도 선택 방법이 바질에서 수용성 탄수화물의 생산을 개선하는 미생물 세트를 제조할 수 있다는 증거를 제공한다.
실시예 6
옥수수(제아 매이스)의 성장을 개선하는 식물내생생물 미생물의 확인.
식물내생생물 미생물은 식물 조직에 가까이 연관되거나 내부에 함유되므로, 식물 근권에 연관된 미생물에 비해 경쟁과 스트레스 인자에 덜 노출될 수 있다. 식물 생물량 또는 낟알 수율의 증가와 같은 수단에 의해 옥수수 성장을 촉진할 수 있는 식물내생생물 미생물 그룹을 생성하는 것이 바람직할 것이다. 본 예에서, 식물내생생물 미생물은 1분 동안 6.6% Dettol®(활성 성분: 클로로자일레놀 4.8%)로 옥수수 식물 조직의 표면 멸균 후에도 여전히 생활성이 있는 것으로 정의된다.
뉴질랜드 북도로부터 73개 토양 표본을 미생물 다양성의 원천으로 이용하였다. 토양 표본(처리군)을 배수 및 부피를 증가시키기 위해 필요에 따라 멸균 모래:질석(1:1 또는 1:2)과 혼합하였다. 생성 혼합물을 28ml 튜브에 넣고, 각 처리군에서 15 복제물의 옥수수(Pioneer 제아 매이스 하이브리드 종자 37Y12)를 심었다. 묘목을 발아 시까지 연무 호스로 급수한 뒤, 필요에 따라 추가 급수를 주 3회 포화시까지 샤워시켰다. 나머지 표준 성장 조건에 대해서는 표 1을 참고하라.
각 처리군으로부터 3 식물을 파종 후(DAS) 60일에 선택했다. 옥수수 식물의 줄기를 토양 위 5cm에서 절단하고 폐기하였다. 뿌리 및 부착된 줄기에서 토양이 없도록 흔들고 세척하여 토양 단편을 제거하고 빠져나가게 한 뒤 뿌리 및 줄기를 비닐 백에서 조합하였다. 이어서 상기 재료를 백 내에서 첨가된 10ml의 물로 분쇄하여 뿌리 재료를 현탁하였다. 생성 현탁액의 액체 부분을 비선택적 농축 라운드를 위한 미생물 접종물로 이용하였다. 이 추가 라운드의 목적은 옥수수 조직 내에서 성장하는 미생물의 풍부도를 증가시키기 위한 것이었다. 표면 멸균된 옥수수(37Y12) 종자를 각 표본에 대해 1ml의 뿌리 현탁액 중에 1시간 동안 담갔다. 이어서 담근 종자를 6ml의 Phostrogen® 가용성 식물 식품(멸균 증류수 중 1/450v/v로 희석됨)으로 가습된 멸균 모래 및 질석을 1:2로 함유하는 28ml 튜브(각 처리군에 대해 15 복제물) 내에 심었다. 잔여 뿌리 현탁액을 멸균 증류수(SDW)를 이용해서 40ml의 최종 부피로 만들고, 2ml을 심은 종자에 걸쳐 피펫팅하였다.
1라운드 선택
파종 후(DAS) 60일에 각 처리군에서 5개의 최대 식물을 선택하고 처리하여 첫 번째 라운드의 선택을 위한 미생물 접종물을 제공하였다. 각각의 선택된 식물의 잎을 기재 수준 위 5cm에서 절단하여 폐기하였다. 잔여 기저 줄기 및 뿌리를 수돗물 중에 철저히 세척하여 임의의 부착 토양을 제거한 뒤 처리군 내에서 비닐 백에서 조합하고, 1분 동안 6.6% Dettol®로 표면 멸균하여 식물내생생물 미생물을 선택하였다. 이어서 뿌리를 1, 5 이어서 10분 동안 진탕하며 SDW 중에 3회 헹구었다. 헹군 뿌리를 상술된 바와 같이 비닐 백 내에서 분쇄하고, 최종 부피 20ml의 SDW 중에 현탁하였다. 생성 현탁액을 이용하여 이들을 1시간 동안 10ml의 접종물 중에 담근 뒤 멸균 합성 비료(Fahraeus, 1957)로 가습된 멸균 모래:질석 1:3에 심어서 15개의 표면 멸균된 옥수수 종자(Pioneer 제아 매이스 P9400)를 접종하였다. 잔여 현탁액을 각 처리군에 대해 40ml의 최종 부피로 만들고, 2ml을 각각의 심은 종자의 상부에 걸쳐 피펫팅하였다. 미생물 비함유 대조군 종자의 30 복제물 튜브를 SDW에 담그고 미생물 접종물이 없는 2회씩의 절차에서 튜브 당 2ml의 물로 피펫팅하였다. 심은 뒤, 종자를 신선한 건조 기재로 덮었다. 화분을 심은 뒤 1주 동안 SDW로 급수하여 멸균 조건을 유지한 뒤 주 3회씩 수돗물로 급수하였다.
2라운드 선택
식물을 파종 후(DAS) 26일에 수확하였다. 잎을 상술된 바와 같이 절단하고 칭량하였다. 각 식물의 잔여 기저 줄기 및 뿌리를 깨끗이 헹구고, 새 종이 타월로 블로팅하여 건조시킨 뒤 칭량하고 개별적으로 백에 넣었다. 모든 처리군으로부터 최대 평균 생물량 및 5개의 최대 개별 식물을 일으킨 20 처리군으로부터 두 번째 라운드의 선택을 위한 접종물을 얻었다. 각각의 선택된 처리군으로부터 10개의 최대 식물의 뿌리 및 기저 줄기를 상술된 바와 같이 풀링하고 표면 멸균하고 분쇄하였다. 5개의 최대 개별 식물을 상기와 같이 개별적으로 처리하였다. 멸균 합성 비료로 가습된 멸균 모래:질석 1:3 중 각각의 25 처리군에 대해 30 복제물(Pioneer P9400 종자)을 심었다.
3라운드 선택
식물을 파종 후(DAS) 26일에 수확하고 앞서 기재된 바와 같이 처리하였다. 최대 평균 생물량을 일으킨 7 처리군으로부터 6개의 최대 식물을 선택하여 세 번째 라운드의 선택을 위한 접종물을 생성하였다. 식물을 28일 동안 키우고, 수확하고, 이전 라운드에 대해 기재된 바와 같이 평가하였다. 상위 3 처리군으로부터의 3 최대 식물의 뿌리 및 기저 줄기를 풀링하고, 실험에서 2 최대 식물을 개별적으로 선택하여 미생물 단리를 위한 접종물을 제공하였다.
미생물 단리
R3 선택을 접종하기 위해 이용된 뿌리 현탁액 및 상기 선택된 R3 식물로부터 제조된 현탁액 상에서 미생물 단리를 수행하였다. 박테리아 및 진균 단리를 R2A, PDA 및 NDSM 배지를 이용하여 일반적으로 상기 기재된 바와 같이 수행하였다. 에탄올을 최종 농도 25%로 뿌리 현탁액에 첨가하고, RT에서 30분 동안 인큐베이션한 뒤 R2A 상에 플레이팅하는 액티노마이세트에 대한 선택적 단리 단계를 수행하였다. 플레이트를 25℃에서 1-7일 인큐베이션 후 조사하였다. 집락을 풍부도에 대해 평가하고, 형태에 따라 그룹화하고, 대표적 단리물을 골라서 R2A 상에 후속 배양하였다. 표준 방법을 이용하여 DNA 추출, PCR 증폭 및 16S rRNA 유전자(박테리아) 또는 ITSS 영역(진균)의 서열분석에 의해 종 수준으로 단리물을 확인하였다.
미생물 평가 라운드
2 라운드의 미생물 평가를 수행하였다. 첫 번째 평가 라운드에서, 79 계통을 풍부도, 다양성 및 종 특징에 기반하여 선택하였다. 박테리아 단리물을 옥수수 종자(P9400)를 이용한 것을 제외하고 실시예 4에 기재된 바와 같이 제조하고 이용하여 표면 멸균된 종자를 접종하였다. 진균 계통을 PDA 상에 플레이팅하고, 7일 동안 25℃에서 인큐베이션한 뒤 5-10ml SDW로 플레이트에서 긁어내어 차 여과기를 통해 체질하여 균사체 덩어리 및 부착된 한천 소편을 제거하였다. 포자/균사의 수를 Neubauer 개선 혈색소계 및 화합물 현미경을 이용해서 결정하고 희석 시리즈 5x102, 1x103　및 2x103을 제조하였다. 이어서 각각의 희석액을 10개의 심은 종자에 걸쳐 피펫팅하여 3 용량 수준에서 각각 복제물 당 총 30개 종자가 되도록 했다. 진균 및 박테리아 모두에 대해, 표면 멸균된 옥수수 종자(Pioneer P9400)를 Fahraeus 용액(Fahraeus, 1957)으로 가습된 멸균 화분용 혼합물(40% 토탄, 30% 퇴비화 소나무 껍질, 30% 미세 경석, 석회로 pH 6.1로 조정)을 함유하는 28ml 튜브에 심은 뒤 새 건조 기재를 덮었다. 이어서 모든 식물을 주 3회 수돗물로 급수하였다.
식물을 파종 후(DAS) 24일에 수확하고 잎 및 뿌리를 모두 칭량하였다. 미생물 비함유 대조군 대비 잎 및/또는 뿌리 중량의 평균 증가를 일으킨 미생물 단리물을 두 번째 라운드의 평가를 위해 선택하였다. 종자를 담그고, 3 희석액 대신 1X103의 농도로 진균 계통과 함께 접종하며, 모든 계통에 대해 15 복제물을 심은 것을 제외하고 선택된 계통을 상술된 바와 같이 처리하여 심었다. 파종 후(DAS) 20일에 잎 및 뿌리를 수확하고 칭량하였다. 결과를 표 4에 나타낸다. 4 단리물은 미생물 비함유 대조군에 비해 유의미하게 더 높은 생물량을 일으켰다.
증가된 옥수수 생물량을 생산하는 식물내생생물 미생물
BDNZ# 카운트 %IOC FW %IOC RW %IOC BM ID
57119 12 13.1 9.9 11.8 헤르바스피릴룸 프리싱겐스
57583 14 14.3 5.1 10.6 아시네토박터종
57122 15 9.6 12.2 10.6 잔토모나스 트랜스루센스
57115 14 14.4 3.9 10.2 슈도모나스 마르기날리스
57535 12 10.7 8.9 10.0 헤르비코니욱스 진셍이
57148 12 10.0 9.8 9.9 부르크홀데리아 세파시아
57531 14 6.4 14.7 9.7 마이크로박테리움 옥시단스
57150 14 11.8 6.1 9.5 슈도모나스 모라비엔시스
57597 15 9.5 8.6 9.1 아조토박터 크루코쿰
57155 14 7.8 10.6 8.9 슈도모나스 프레데릭스베르겐시스
57154 15 6.6 8.4 7.3 스핑고모나스 로사
57602 14 6.2 8.6 7.2 리조비움 엔도피티쿰
57619 15 8.5 4.8 7.0 바실러스 티오파란스
57127 15 4.0 11.0 6.8 테리글로부스 로세우스
57612 15 8.2 3.9 6.5 노보스핑고비움 로사
58016 14 4.7 8.6 6.2 아조스피릴룸 리포페룸
57565 12 5.6 5.1 5.4 스트렙토마이세스 써모카르복시두스
57613 15 7.3 1.6 5.0 헤르바스피릴룸 프링겐스
이탤릭체는 미생물 비함유 대조군으로부터의 유의차를 나타낸다(피셔 LSD); %IOC, 대조군 대비 증가추정 ID는 부분 16S rRNA 서열에 대한 RDPII 데이터베이스의 가장 가까운 서열 매치에 기반함
이들 결과는 본 발명에 의해 기재된 미생물의 유도 선택 방법이 옥수수 성장을 개선하는 식물내생생물 미생물 세트를 제조할 수 있다는 증거를 제공한다.
본 발명은 독자가 과도한 실험 없이 본 발명을 실시할 수 있도록 하기 위해 특정한 바람직한 구현예를 참조로 기재되었다. 그러나 당업자는 여러 성분 및 파라미터가 본 발명의 범위에서 벗어나지 않고 공지된 균등부에 대해 특정 범위까지 변하거나 개질되거나 또는 치환될 수 있음을 쉽게 인지할 것이다. 이러한 개질 및 균등물은 본원에서 개별적으로 나타낸 것과 마찬가지로 도입됨이 이해되어야 한다. 또한 표제, 제목 등은 본 문서의 독자 이해를 증강시키기 위해 제공되며, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 읽혀서는 안 된다.
존재하는 경우, 상기 및 하기에 언급된 모든 출원, 특허 및 공보의 전체 개시는 본원에 참조로 도입된다. 그러나 본 명세서에서 임의 출원, 특허 및 공보에 대한 참조는 이들이 유효한 선행 기술을 구성하거나 세계 어느 국가에서 공통적인 일반 지식의 일부를 형성한다는 인정 또는 임의 형태의 제시가 아니며, 이렇게 간주되어서는 안 된다.
본 명세서 및 후술되는 임의의 특허청구범위에 걸쳐 문맥 상 달리 요구되지 않으면, 단어 "포함하는", "포함하고" 등은 배타적인 개념에 대비되어 포괄적인 개념으로, 즉 "비제한적으로 포함하는" 개념으로 간주되어야 한다.
참고문헌 목록
Pikovskaya RI(1948). Mobilization of phosphorus in soil connection with the vital activity of some microbial species. Microbiologia 17:362-370
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Fahraeus, G.(1957). J. Gen Microbiol. 16: 374-381
Ruth Eckford, R., Cook, F.D., Saul, D., Aislabie J., and J. Foght(2002) Free-living Heterotrophic Bacteria Isolated from Fuel-Contaminated Antarctic Soils. Appl. Environ. Microbiol 68(10):5181
Yemm and Willis(Biochem. J. 1954, 57: 508-514)

Claims (15)

  1. 적어도 하기 단계들을 포함하는, 식물에 하나 이상의 유익한 특성을 부여할 수 있는 하나 이상의 미생물들의 선택 방법:
    a) 제1 세트의 하나 이상의 미생물들의 존재 하에서 종자들, 묘목들, 절단물들, 및/또는 이들의 번식체들을 포함하는 하나 이상의 식물에 성장 배지를 가하는 단계;
    b) 단계 a) 이후에, 유익한 식물 표현형 또는 유전형 형질 선택 기준에 기반하여 하나 이상의 식물을 선택하는 단계로서, 상기 하나 이상의 식물은 상기 식물과 상이한 다른 식물들과 비교하여 하나 이상의 유익한 표현형 또는 유전형 형질을 나타내는 것인 단계;
    c) 단계 b)에서 선택된 상기 하나 이상의 식물 및/또는 상기 하나 이상의 식물의 식물 근권으로부터 제2 세트의 하나 이상의 미생물들, 선택적으로 조정제 형태의 미생물들을 획득하는 단계;
    d) 단계들 a) 내지 c)를 1회 이상 반복하는 단계로, 단계 c)에서 획득된 상기 제2 세트의 하나 이상의 미생물들이 임의의 후속 반복 단계 a)에서 제1 세트의 미생물들로 이용되는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 상기 제2 세트의 하나 이상의 미생물들은 단계 c)에서 상기 하나 이상의 식물로부터 단리되는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 식물에 성장 배지를 가하는 단계에 상기 식물의 성장 또는 증식이 관여되는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법의 상이한 반복들에서 상이한 선택 기준들이 이용되는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 제2 세트의 하나 이상의 미생물들은 상기 선택된 하나 이상의 식물들의 생식 조직을 포함하는 뿌리, 줄기 및/또는 잎 또는 전체 식물 조직으로부터 획득되거나 단리되는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 미생물들은 발아 후 임의 시점에 단계 c)에서 획득되는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 둘 이상의 미생물들이 단계 c)에서 획득되는 경우, 상기 방법은 상기 둘 이상의 미생물들을 개별 단리물들로 분리하는 단계, 둘 이상의 개별 단리물들을 선택하는 단계, 이어서 선택된 둘 이상의 단리물들을 조합하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 조합된 단리물들은 상기 방법의 임의의 후속 반복 단계 a)에서 상기 제1 세트의 하나 이상의 미생물들로 이용되는 방법.
  9. 제1항에 있어서, 본 발명의 둘 이상의 방법들은 별도로 수행될 수 있고, 각각의 별도 방법의 단계 c)에서 획득된 상기 제2 세트의 하나 이상의 미생물들은 조합되는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 조합된 미생물들은 상기 방법의 임의의 후속 반복 단계 a)에서 상기 제1 세트의 하나 이상의 미생물들로 이용되는 방법.
  11. 제1항에 있어서, 종자들, 묘목들, 절단물들, 및/또는 이들의 번식체들을 포함하는 식물 재료가 단계 a)를 위한 미생물원으로 이용되는 방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 방법은 하나 이상의 배양할 수 없는 미생물 또는 하나 이상의 식물내생생물(endophyte)의 선택을 위해 이용되는 방법.
  13. 제1항의 방법의 상기 단계들 및 상기 방법에 의해 선택된 상기 하나 이상의 미생물들과 하나 이상의 추가 성분들을 조합하는 추가 단계를 포함하는, 식물 성장, 품질 및/또는 건강을 지지하거나, 식물 성장, 품질 및/또는 건강을 억제하거나 저해하기 위한 조성물의 제조 방법.
  14. 적어도 하기 단계들을 포함하는, 식물에 하나 이상의 유익한 특성을 부여할 수 있는 조성물의 선택 방법:
    a) 하나 이상의 배지들 중 제1항의 방법에 의해 선택된 하나 이상의 미생물들을 배양하여 하나 이상의 배양물을 제공하는 단계;
    b) 일정 시기 후 상기 하나 이상의 배양물 중 상기 하나 이상의 배지들로부터 상기 하나 이상의 미생물을 분리하여 실질적으로 미생물들이 없는 하나 이상의 조성물을 제공하거나; 단계 a)의 상기 하나 이상의 배양물을 불활성화하여 하나 이상의 불활성화된 미생물들을 함유하는 하나 이상의 조성물을 제공하는 단계;
    c) 종자들, 묘목들, 절단물들, 및/또는 이들의 번식체들을 포함하는 하나 이상의 식물에 단계 b)의 상기 하나 이상의 조성물을 가하는 단계;
    d) 상기 하나 이상의 식물들에 하나 이상의 유익한 특성을 부여하는 것이 관찰되는 경우, 단계 c)로부터 하나 이상의 조성물을 선택하는 단계.
  15. 적어도 하기 단계들을 포함하는, 식물에 하나 이상의 유익한 특성을 부여할 수 있는 조성물을 제조할 수 있는 하나 이상의 미생물들의 선택 방법:
    a) 하나 이상의 배지들 중 제1항의 방법에 의해 선택된 하나 이상의 미생물을 배양하여 하나 이상의 배양물을 제공하는 단계;
    b) 일정 시기 후 단계 a)로부터 상기 하나 이상의 배양물 중 상기 하나 이상의 배지들로부터 상기 하나 이상의 미생물을 분리하여 실질적으로 미생물들이 없는 하나 이상의 조성물을 제공하거나; 단계 a)의 상기 하나 이상의 배양물을 불활성화하여 하나 이상의 불활성화된 미생물들을 함유하는 하나 이상의 조성물을 제공하는 단계;
    c) 종자들, 묘목들, 절단물들, 및/또는 이들의 번식체들을 포함하는 하나 이상의 식물에 단계 b)의 상기 하나 이상의 조성물을 가하는 단계;
    d) 상기 하나 이상의 식물들에 하나 이상의 유익한 특성을 부여하는 것이 관찰된 하나 이상의 조성물에 연관된 상기 하나 이상의 미생물들을 선택하는 단계.
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