KR100455006B1 - 향상된불사화사람피부세포계및이의제조에유용한신규한무혈청배지 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 향상된 연속계대성(불사화) 세포계, 특히 정상 사람 피부 조직으로부터 유래된 각질세포 및 멜라닌세포에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 향상된 연속계대성 각질세포 및 멜라닌세포 세포계를 단리, 제조 및 유지하기 위한 신규한 무혈청 배지에 관한 것이다. 본 발명은 또한 임의의 피더 세포 없이 무혈청 조건 하에서 1차 멜라닌세포 및 각질세포를 제조하는 방법에 관한 것이다.
Description
사람의 피부 조직으로부터 유래된 불사화 세포계의 제조는 이미 기재된 바 있다. 일반적으로 상기 방법은, 불사화를 부여하기 위한 제제로 시험관내(in vitro) 배양된 사람 피부 세포, 예컨데, 각질세포 및 멜라닌세포의 트랜스펙션(transfection) 또는 형질전환을 포함한다.
불사화는 오랜 기간 동안, 이상적으로는 무기한으로 시험관에서 배양될 수 있는 세포의 제조를 의미한다. 상기 세포들은 또한 연속계대성 세포계라고도 한다. 반면, 비-불사화 세포는 시험관내에서 세포 분열이 한정된 수로만 성장할 수 있다. 불사화 세포는 규정된 특성을 갖는 세포의 안정하고, 잠재적으로 무수한 공급을 제공하기 때문에 매우 바람직하다. 불사화 세포계 및 불사화 사람 피부 세포계를 제조하기 위한 통상적인 제제로는, 특히, 예컨데, 불사화를 제공하는 바이러스, 재조합 바이러스 및 DNA 서열을 함유하는 플라스미드가 포함된다.
불사화 사람 세포계의 가장 일반적인 제조 방법은, 불사화제로서 SV40 서열 및 더욱 구체적으로는 SV40 라아지 T 항원 DNA 의 사용과 관련된다. 예컨데, 문헌 [Steinberg et al.,J.Cell Phys., 123:117-125(1985); Reddel et al., U.S. Patent No. 4,885,238 issued on December 5, 1989 ; Major, U.S.Patent No. 4,707,448 issued on November 17, 1987 : Stoner et al.,Cancer Res., 51:365-371(1991) ; Chopra et al., In Vitro Cell Dev.Biol., 30A:539-546(1994), Chopra et al., In Vitro Cell Dev.Biol., 27A : 763-765(1991) ; Christian et al.,Cancer Res., 47:6066-6073(1987); Rhim et al.,Science, 227:1250-1252 (1985); 및 Grubman et al.,Gastrointest. Liver Physio., 29:G1060-G1070(1994)]에, SV40 벡터 및 불사화 사람 세포계를 제조하기 위한 벡터를 함유하는 SV40 라아지 T 항원 서열의 사용이 기재되어 있다. 상기 서열의 도입은, 일반적으로, SV40 바이러스를 사용하거나 하이브리드 아데노바이러스-12 SV40 하이브리드 바이러스로의 감염, 또는 라우스 육종 바이러스 긴 말단 반복서열 및 스트론튬 포스페이트 공침전에 의한 Ori-SV40 초기 부위를 함유하는 재조합 플라스미드로의 세포의 트랜스펙션에 의해 수행된다 (Brash et al.,Mol. Cell Biol., 7:2031-2034(1987) 참조).
불사화 세포계, 특히 불사화 사람 각질세포의 공지된 다른 제조 방법은, 사람 파필로마바이러스 DNA 서열로 세포의 트랜스펙션 또는 감염과 관련된다. 예컨데, 1994 년 12 월 27 일에 Schlegel에게 허여된 미국 특허 제 5,376,542 호에,비-발암성 불사화 세포계를 제조하기 위한 단리된 HPV-16, 18, 31, 33 또는 35 E6 및 E7 유전자 또는 E7 유전자만으로 사람 상피 세포의 불사화가 기재되어 있다. 또한, 문헌 [Barbosa et al.,Oncogene, 4:1529-1532(1989); 및 Munger et al.,J. Virol., 63(10):4417-4421(1989)]에, 불사화 사람 각질세포를 제조하기 위한 HPV-16 및 HPV-18 E6 및 E7 유전자의 사용이 기재되어 있다.
그러나, 수 개의 그룹이 불사화 각질세포 세포계 및 시험관내 검정에 있어서 그들의 사용을 보고하였으나, 이전의 불사화 각질세포 세포계 및 멜라닌세포 세포계는 전형적으로 이들의 사용이 불리하게되는 하나 이상의 성질을 나타낸다. 예컨데, 이미 보고된 바 있는 불사화 각질세포는 다음과 같은 특성을 하나 이상 나타낸다 : (i) 분화 표지, 예컨데 정상 분화 각질세포에 의해 발현되는 단백질 발현의 감소 또는 상실, 및 (ii) 조직 배양에 있어서 변형된 성장 특성.
예컨데, 문헌 [Jetten et al,J. Invest. Dermatol.,92:203-209 (1989)]에는 분화될 수 없는 벡터 NHEK-SV40-T8-1을 사용하여 높은 빈도의 계대 배양(> 12회) 후에 수득된 SV40 불사화 각질세포가 보고되어 있다. 유사하게, 문헌 [Bernard et al,Cancer Res., 45:1707-1716(1985)]에는 분화가 거의 완전히 불가능한 것으로 보고된 SVK14로 언급되는 불사화 각질세포 세포계의 단리가 보고되어 있다. 또한, 상기 세포계는 단백질이 분화 각질세포에 의해 정상적으로 발현되는, 케라틴 K1/10(>53 kD) 및 50 kD 케라틴(케라틴 K14)의 발현을 보이지 않는다.
또한, 문헌 [Steinberg et al,J. Cell. Physiol., 123:117-125(1985)]에는 정상 케라틴 세포골격의 특징인 케라틴을 발현할 수 있는 능력을 점차적으로 상실하는 SV40 형질전환된 각질세포가 보고되어 있다. 정상적인 케라틴 발현의 상기 상실은 약 10 내지 15 회 계대 배양 후 나타난다. 또한, 문헌 [Hronis et al,Cancer Res., 44:5797-5804(1984)]에 K5, K6, K14/15, K16 및 K17 케라틴의 생성능력을 상실한 SV40 DNA 불사화 각질세포 및 단백질이 정상 분화 각질세포의 특징인 인볼루크린(involucrin)이 기재되어 있다. 또한, 문헌 [Morris et al,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:8498-8502(1985)]에 더 높은 빈도의 계대 배양(> 14회)에서 강(Class) II 및 강 I 케라틴의 매우 감소된 발현을 나타내는 SV40 불사화 각질세포가 기재되어 있다. 예를 들어, 상기 각질세포는 K13(Id.)의 발현을 거의 나타내지 않는다.
또한, 문헌 [Banks-Schlegel et al,J.Cell.Biol., 96:330-337(1983)]에 조직 배양에서 변형된 성장 특성을 나타내는 SV40 불사화 각질세포가 개시되어 있다.
예컨데, 정상 각질세포와는 달리, 상기 불사화 세포들은 성장을 위해 3T3 피더 층을 필요로 한다.
불사화 사람 각질세포 및 멜라닌세포의 이전에 기재된 제조 방법은 전형적으로 피더 세포 기술(섬유아세포가 정상 "피더"세포로 기능한다)을 사용하고, 일반적으로 혈청 함유 배지에서 세포를 배양한다. 예컨데, 문헌 [Sexton et al., "Stable transfection of human keratinocytes : HPV immortalization," Keratinocyte Methods, eds., Leigh, I.M. et al., University Press, 179-180, (1994); Garlick, "Retroviral Vectors," Keratinocyte methods,(eds.Leigh I.M. et al., Cambridge University Press, 181-183(1994))]에 불사화 각질세포의 단리및 제조에서의 소태아 혈청 함유 배지 및 피더 세포의 사용이 기재되어 있다.
불사화 상피 세포, 특히 사람 각질세포의 단리 및 제조하는 동안 무혈청 배지의 사용은 이미 기재된 바 있다. 예컨데, 문헌 [Barbosa et al., Oncogene,4:1529-1532(1989)]에 전기 천공 또는 리포펙션(lipofection)에 의해 트랜스펙션된 사람 각질세포를 포화밀집(confluence)될 때까지 저칼슘 무혈청 배지에서 초기 배양시키는 것이 기재되어 있다.
그러나, 이전에 보고된 것에도 불구하고, 높은 빈도의 계대 배양 후에조차, 향상된 성질을 갖는, 특히 정상 각질세포 및 멜라닌세포의 잠재적인 분화를 유지하고 분화된 멜라닌세포 및 각질세포의 특성인 분화 단백질을 발현하는 불사화 사람각질세포 및 멜라닌세포에 대한 상당한 필요성이 당 분야에서 여전히 존재한다.
상기 세포들은 다양한 용도, 특히 분화된 피부 세포를 필요로하는 검정에 있어서 매우 유용할 것이다. 더우기, 1차 및 불사화 각질세포 및 멜라닌세포를 유지할 수 있는 향상된 배양 배지, 뿐만 아니라 피더 세포의 사용을 필요로하지 않는 향상된 배양 방법을 위한 필요가 당분야에 존재한다.
발명의 목적
상기 목적을 위하여, 본 발명의 목적은 정상 사람 피부 조직으로부터 유래된 향상된 연속계대성(불사화) 세포계, 특히 높은 빈도의 계대 배양 후에도 분화능 및 분화 단백질의 발현능을 유지하는 정상 사람 피부 조직으로부터 유래된 불사화 각질세포 및/또는 멜라닌세포로 세포계를 제조하는 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명의 목적은 케라틴, 시토크롬, 뿐만 아니라 다른 분화 단백질, 예컨데, 통상적인불사화 각질세포 세포계에 의해 발현되지 않거나 거의 발현되지 않는 인블루크린, 필라그린 및 로리크린의 발현능을 보유하는 불사화 각질세포를 수득하는 것이다. 본 발명의 또다른 목적은 분화 각질세포 및 멜라닌세포에 의해 정상 발현되는 효소, 특히, 글루타치온-S-트랜스페라아제와 같은 II 상 효소 뿐만 아니라 세포성 산화 및 염증 반응과 관련된 효소 및/또는 단백질을 발현하는 불사화 각질세포 및 멜라닌세포를 수득하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은, 조직 배양에서 정상 또는 연속계대성 각질세포 및/또는 멜라닌세포를 배양, 제조 및 유지하기 위한 신규한 무혈청 배지를 제공하는 것이다. 이러한 신규한 무혈청 배지는, 또한 본 발명에 따른 연속적인 멜라닌 세포 및 각질세포를 수득하기 위한 사람 피부 세포의 단리, 주화 및 불사화에 유용하다. 따라서, 본 발명의 특수한 목적은, 놀랍게도 무혈청 배지 내에서 정상의 각질세포의 강한 성장 강화제로 밝혀진 에피네프린을 함유하는 피더 세포가 없는 각질세포를 배양하기 위한 완전히 정의된 (비공지 또는 비특정 공급물이 없는)배양배지를 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은, 정상 피부 조직에서 유래한 연속계대성 멜라닌세포 및 각질세포 세포계를 얻기 위해 사람 피부 세포를 단리, 주화 및 불사화시키는 새로운 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 무혈청 배지, 특히 본 발명에 따른 배지, 및 피브로넥틴, BSA 및 "피더 세포"(예컨데 섬유아세포)가 없는 I 형 콜라겐을 함유하는 세포 부착 칵테일(cocktail)을 사용한다.
본 발명의 또다른 목적은 임의의 피더 세포를 사용하지 않고 무혈청 조건 하에 제조된, 피부 이식 및 엑스 비보(ex vivo) 유전자 요법에서 사용되는 1차 각질 세포 또는 멜라닌세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은, 예컨데, 면역학적, 약리학적, 광- 및 화학독성학적 피부 반응 검정 및 이종 유전자의 발현을 위한 신규의 향상된 연속계대성 각질 세포 및 멜라닌세포 세포계의 사용 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 정상적인 사람의 피부 조직, 특히 높은 빈도의 계대 배양에서도, 분화된 멜라닌세포(melanocyte) 또는 각질세포(keratinocyte)의 분화 단백질의 발현능을 갖는 각질세포 및 멜라닌세포로부터 유래된 향상된 연속계대성(불사화) 세포계에 관한 것이다. 본 발명은 또한 피더 세포(feeder cell)의 사용이 필요없는 신규한 무혈청 배지에 관한 것이다.
도 1 은 3 개의 다른 배지, 즉, NR-3, 에피네프린-추가공급된 변형된 MCDB 153 및 6 일 후의 MCDB 153 내에서 비-불사화 DKO-NR 각질세포의 성장(세포수의 관점에서)을 비교한다.
도 2a 는 본 발명의 멜라닌세포 및/또는 각질세포를 불사화하는데 바람직하게 사용되는 SV40 레트로바이러스성 구축 pLXSHD+SV40(#328)을 나타낸다.
도 2b 는 HPV16 레트로바이러스성 구축 pLXSHD+E6/E7을 나타낸다.
본 발명은 분화능을 유지하고 높은 빈도의 계대 배양에서도 정상 각질세포 또는 멜라닌세포에 의해 발현되는 분화 단백질의 발현능을 유지하는, 정상 사람 피부 조직으로부터 유래된 연속계대성(불사화) 세포계, 예컨데, 불사화 각질세포 및 멜라닌세포를 제공한다. 높은 빈도의 계대 배양이란, 배양 중 10 회 이상의 계대 배양, 바람직하게는 적어도 20 내지 30 회의 계대 배양, 더욱 바람직하게는 50회 이상의 계대 배양, 및 이상적으로는 무한수의 계대 배양을 의미한다. 예컨데, 본 발명에 따라 제조된 불사화 각질세포는, 조직 배양 중 높은 빈도의 계대 배양 후에도 분화 단백질 케라틴 K1/10, 케라틴 K14, 인블루크린, 필라그린 및 로리크린을 발현한다. 이는 상기 분화 단백질을 발현하지 않거나 거의 발현하지 않는 이미 보고된 바 있는 불사화 각질세포와는 현저히 다르다.
또한, 본 발명은 분화능 및 분화된 멜라닌세포 및 각질세포의 특징인 단백질의 발현능을 유지하는, 무혈청 조건 하에서 피더 세포 없이 제조된 1차 각질세포 및 멜라닌세포를 제공한다.
본 발명의 불사화 각질세포는 정상 각질세포와는 동일 또는 유사한 시토크롬 p450 프로필(CYP450)을 갖는다. 예컨데, 상기 세포는 CYP450 3A5을 발현하고 CYP450 3A4 는 발현하지 않는다. 또한, 본 발명의 불사화 각질세포는 상(phase) II 효소, 예컨데, 글루타치온-S-트랜스퍼라아제(GST) 및 더욱 구체적으로는 정상 비-불사화 각질세포에 비교해서 GSTα, GSTμ 및 GSTπ를 발현한다.
게다가, 본 발명의 불사화 각질세포는 정상 분화 각질세포와 유사하게 또는 동일하게 포볼 에스테르로 처리한 후 세포성 산화 및 염증 반응에 관련된 단백질 및 효소, 예컨데, 수퍼옥시드 디스무타아제(SOD), 및 I 형 콜라게나아제 및 종양괴사인자 알파(TNFα )를 발현한다. 상기 성질에 따르면, 상기 세포계들은 면역학적, 약리학적, 염증, 광- 및 화학독성학적 피부 반응 연구를 위한 높은 안정성, 재생가능한 세포 공급원을 제공한다.
게다가, 본 발명의 불사화 멜라닌세포는 내인성 멜라닌 연관 단백질을 발현한다(실시예 14 - 15 참조).
또한, 유기형 배지에서 배양될 때, 본 발명의 불사화 각질세포 세포계 및 멜라닌세포 세포계는 각질화된 표재층(각질층)을 갖는 층상 및 분극된 상피를 형성한다. 이는 통상적인 배양 조건 하, 즉, 혈청을 함유하는 배지에서 피더 층 기술로 이미 수행하였다(Lechner et al,Virology, 185:536-571,1991 참조).
게다가, 본 발명의 불사화 각질세포 및 멜라닌세포는 임의의 피더 세포를 사용하지 않고 무혈청 조건하에서 정상적인 피부로부터 얻어진다. 일반적으로, 본 발명의 각질세포 및 멜라닌세포는 하기 단계에 의해 수득된다 :
(i) 사람 피부 조직 샘플을 채취하고 ;
(ii) 시험관내 배양을 위한 상기 피부 샘플을 제조하고 ;
(iii) 상기 제조된 피부 샘플로부터 각질세포 및/또는 멜라닌세포를 얻고 상기 각질세포 및/또는 멜라닌세포를, 세포 부착 및 세포 성장을 촉진하는 코팅제가 도포된 배양 플레이트 상의 무혈청 성장 배지, 바람직하게는 NR-3 배지 또는 NR-4(멜라닌세포 용)(하기 기재)에 종균하고, 상기 코팅제는 피브로넥틴, I 형 콜라겐 및 BSA를 함유한다 ;
(iv) 배양 플레이트 상에 코팅을 연속적으로 유지하면서 배양된 세포의 밀집 성장을 최적화하는데 필요한대로 배지를 교환하고 ;
(v) 각질세포 또는 멜라닌세포를 유사하게 예비 코팅된 배양 플레이트 상에 선별 배지, 바람직하게는 무혈청 배지로 이식하고 ;
(vi) 각질세포 또는 멜라닌세포를 레트로바이러스성 구축물, 바람직하게는 시미안 바이러스 40 의 라아지 T 항원(T Ag)을 함유하는 SV40 플라스미드 pLXSHD+SV40(#328) 또는 또는 파필로마 바이러스 16(HPV 16)의 E6/E7 유전자를 함유하는 플라스미드 pLXSHD+E6/E7 과 같은 SV40 또는 파필로마 바이러스 16 기재 구축물로 감염시키고 (하기 기재) ;
(vii) 생성된 불사화 각질세포 또는 멜라닌세포를, 유사하게 예비 코팅된 배양 플레이트 상의, 불사화 각질세포 또는 멜라닌세포를 증식시키기에 적합한 증식 배지, 바람직하게는 NR-2 또는 NR-3 배지(하기 기재) 및 멜라닌세포 배지 M2(M.01sson, Inst. of Dermatology, Uppsala, Sweden에서 입수 가능)에 이식하고 ; 및
(viii) 생성된 증식된 각질세포를, 유사하게 예비 코팅된 배양 디스크(Boyce et al., J. Tissue Cult. Meth., 9:83-93, 1985;Pittlekow et al., J. Invest. Dermatol., 86:410-417,1986)상의 분화 배지, 바람직하게는 NR-2(하기 기재) 또는 칼슘을 많이, 바람직하게는 1.5 mM 함유하는, 변형된 MCDB 153 배지(하기 기재)에 이식한다.
더욱 구체적으로는, 단계(i)은 예컨데 외과 또는 소아과에서 수득되는 것과 같이 전형적으로 사람 공여자로부터 사람 피부 조직 샘플을 채취하는 것을 포함한다. 단일 피부 세포 샘플, 예컨데, 자가유래 피부 세포 샘플의 불사화는, 특정 성질, 예컨데, 특정 공여자의 특성인 특정 수용자 프로필을 나타내는 불사화 각질 세포 및 멜라닌세포 세포계의 제조를 가능케 한다.
피부 샘플은 이어서 시험관내 배양에 적합한 단계(ii)에서 제조될 것이다. 이는 예컨데, 배양에 사용되는 동일한 배지를 사용하여 피부 샘플을 초기 세척함으로서 바람직하게 수행될 것이다. 바람직하게는 이는 무혈청 배지인 NR-2 배지에서수행되고, 이의 정확한 조성은 하기에 개시되고, 이는 정상 각질세포 및 멜라닌세포를 배양하는데 유리한 것으로 밝혀졌다. 세척한 후에, 피부 샘플을 바람직하게는, 예컨데 더마톰으로 면도한 다음 작은 조각으로 자른다.
수득한 피부 절편을 바람직하게는 진피 및 표피로 분리시킨다. 이는 물리적 및/또는 효소적 수단에 의해서 수행될 수 있다. 예컨데, 이는 트립신화, 예컨데, 세포 분리를 수행하는데 충분한 시간 동안, 예컨데 37 ℃에서 약 30 내지 60 분 또는 4 ℃에서 하룻밤 동안 EDTA(예컨데 약 0.1%)을 함유하는 트립신 용액(예컨데 약 0.5%) 중에 피부 조각을 플로팅(floating)함으로서 수행될 수 있다.
진피를 분리하고(섬유아세포를 단리하기 위하여, 실시예 2 참조) 표피를 현탁 배지 중에 위치시킨다. 바람직하게는, 현탁 배지는 대두 트립신 저해제 용액(SBTI)을 함유하여, 충분한 시간, 전형적으로는 약 5분 동안 세포와 접촉하므로써 트립신을 불활성화시켜 세포를 방출시킬 것이다. 그리고, 조직 배양 배지에, 바람직하게는 무혈청 NR-2 배지(하기 기술) 및 필터(예컨데, 10 mm 필터)을 가하여 목적하는 세포, 즉, 각질세포 및/또는 멜라닌세포를 수득한다.
단계 (ii)에서 수득되는 생성된 1 차 각질세포/멜라닌세포 배양액을 예비 코팅된 배양 플레이트 상에, 적절한 세포 농도, 바람직하게는 약 1.2 x 104세포수/cm2를 갖는 무혈청 배지, 바람직하게는 NR-3 배지(하기 기재)에 종균시킨다. 그러나, 상기 세포 농도는 넓은 범위에서 다양할 수 있다. 배양 플레이트는 바람직하게는 놀랍게도 각질세포 및 멜라닌세포의 부착 및 성장 모두를 향상시키는 것으로 밝혀진 조성물, 특히 피브로넥틴, BSA 및 콜라겐 I 형의 용액으로 연속적으로 코팅되어 있다. 상기 세포 코팅 조성물은 기관지 세포에의 용도로 이미 기재된 바 있다(Lechner et al,J.Tissue Cult. Meth.9:43-48(1985)), 이 문헌은 본 발명에서 참고되어진다.
단계(iv)에서, 배양 배지는 세포 성장의 최적화에 필요한 대로 교환된다. 바람직하게는, 배지는 약 매 이틀 간격으로 교환될 것이다. 그러나, 이는 특정 피부 샘플에 따라 다를 수 있다. 거의 전체가 포화밀집된, 예컨데, 약 90 % 의 밀집도에 도달한 후에, 전형적으로 이는 약 10 내지 14 일 후에 발생하는데, 각질 세포 및 멜라닌세포를 이어서 분리시킨다. 이는 멜라닌세포 및/또는 각질세포에 부작용을 미치지 않고 적절하게 세포를 분리할 수 있는 임의의 방법으로 수행될 수 있다. 예컨데, 이는 분별 트립신화에 의해 수행될 수 있다. 바람직하게는, 멜라닌세포 또는 각질세포를 트립신/EDTA 용액으로 처리한 다음 선별 배지로 이식한다. 각질세포의 경우에, 바람직하게는 세포들을 트립신/EDTA 용액(0.025%/0.01%)으로 약 5 내지 10 분 동안 처리한 다음, 단계(v)에서 예비 코팅된 플레이트상의 NR-3 배지에 종균한다. NR-3 배지가 멜라닌세포와 대비해서 각질 세포의 성장을 촉진시킨다는 것을 주목하는 것은 중요하다. 멜라닌세포의 경우, 세포들을 트립신/EDTA 용액(0.025%/0.01%)으로 약 2 내지 4 분 동안 바람직하게 처리하고, 단계(v)에서 유사하게 예비 코팅된 배양 플레이트 상의 NR-4 배지에 종균한다. NR-4 배지가 특이적으로 각질세포의 성장을 저해한다는 것을 주목하는 것은 중요하다.
그리고나서 상기 세포들을 불사화제로 처리한다. 이와는 달리, 불사화가 실행될 때까지 세포를, 예컨데, 액체 N2중에서 동결시킬 수 있다. 감염 및 불사화는, 도 2a에서 묘사되고 문헌 [Stockshlaeder et al., GeneBank, n° accession M64753; Stockshlaeder et al., Human Gen Therapy, 2, 33-39, 1991]에 기재된 pLXSHD+SV40(#328)으로 규명된 SV40 구축물을 사용하거나, 또는 도 2b 에서 묘사된 pLXSHD+E6/E7 으로 규명된 HPV16 구축물을 사용하여 바람직하게 수행된다. pLXSHD+SV40(#328) 구축물은, SV40 T-Ag 서열, SV40 의 5' 및 3' LTR 서열,E.Coli에서의 복제를 위한 pBR322 서열, 멀티플 클로닝 사이트, SV40 폴리아데닐화 서열, 기타 서열들을 함유한다. pLXSHD+E6/E7 구축물은, T-Ag 대신, 사람 파필로마 바이러스 16 의 E6/E7 유전자의 NcoI/CfoI 단편을 함유한다. E6/E7 -플라스미드를 구축하는 방법은 Durst 등 [Durst et al. 1987, Oncogene 1:251-256]에 기초한다. 불사화 후에, 세포들을 배양하는 동안 필요에 따라 계대 배양하고, 생성된 불사화 세포들을 단계(vii)에서 증식 배지로 이식한다. 각질세포의 경우, 이러한 이식은 2 대 계대 배양에서 수행하는 것이 바람직하다.
과정 (viii)에서, 불사화 세포를, 무혈청 배지를 포함하고 바람직하게는 NR-2 또는 NR-3 및 멜라닌세포용 M2-배지(하기 기재)를 포함하는 불사화 각질세포 또는 멜라닌세포용 증식 배지에서 증식시킨다. 불사화 세포를, 피브로넥틴, BSA 및 I 형 콜라겐의 용액을 함유하는 코팅제로 연속적으로 예비 코팅된 배양 플레이트 상에서 다시 배양한다.
불사화 세포를 증식 배지에서 증식시킨 후에, 이들을 단계 (viii)에서 정상및 불사화 각질세포를 분화시키는 배지에 이식한다. 바람직하게는, 상기 배지는 높은 농도의 칼슘, 바람직하게는 약 1.5 mM 칼슘을 함유하는, NR-2 또는 변형된 MCDB 153 배지로 이루어지며, 피브로넥틴, BSA 및 I 형 콜라겐의 용액으로 연속적으로 코팅된 배양 플레이트 상에 다시 배양을 수행한다.
상기 언급한 바와 같이, 본 발명의 방법에 따라 제조된 불사화 각질세포 및 멜라닌세포 세포계가, 분화능 및 조직 배양에서 높은 빈도, 10 회 이상의 계대 배양 후에도 정상 분화된 각질세포 및 멜라닌세포의 특징인 분화 단백질의 발현능을 유지한다는 것을 놀랍게도 발견하였다. 예컨데, 본 발명의 불사화 각질세포는 케라틴 뿐만 아니라 그외의 다른 단백질, 예컨데, 높은 빈도의 계대 배양 후에도 이미 보고된 SV40 불사화 각질세포에 의해 발현되지 않거나 거의 발현되지 않는 인볼루크린, 필라그린 및 로리크린을 발현한다.
더욱 구체적으로는, 본 발명에 따라 제조된 수 개의 불사화 각질세포 세포계, DK2-NR, DK3-NR 및 FK2-NR(하기 표 7 및 8 참조)는 높은 빈도의 계대 배양(>30회) 후에 조차도 분화 단백질인 케라틴 K1/10, 케라틴 K14, 인볼루크린, 필라그린 및 로리크린을 발현한다.
또한, 본 발명에 따라 제조된 불사화 각질세포는 정상 사람 각질세포와 동일하지는 않으나 유사한 CYP450 프로필을 갖는다. 예컨데, 본 발명의 불사화 각질세포는 CYP450 1A1, 2C, 2E1 및 3A5를 발현하지만, 정상 각질세포의 시토크롬 450 프로필의 특성인 CYP450 1A2, 2A6, 2B6 및 2D6을 발현하지는 않는다. 이는 정상 및 불사화된 사람 각질세포가 CYP450 3A5를 발현하고 CYP450 3A4를 발현하지 않는 것을 증명한 최초의 경우였다.
또한, 본 발명의 불사화 각질세포 세포계는 정상 분화된 각질세포와 비교하여 II 상 효소, 예컨데 글루타치온-S-트랜스퍼라제(GST)를 발현한다. 더욱 구체적으로는, 본 발명의 불사화 각질세포 세포계는 정상 각질세포와 비교하여 GSTα , GSTμ 및 GSTπ를 발현한다.
게다가, 본 발명의 불사화 각질세포는 정상 각질세포와 비교하여 세포성 산화 및 염증 반응과 관련된 효소 및 다른 단백질을 발현한다. 예컨데, 본 발명에 따라 제조된 불사화 각질세포는 수퍼옥시드 디스무타아제(SOD)를 발현한다. 또한, 포볼 에스테르에 대한 반응으로, 본 발명에 따라 제조된 불사화 각질세포는 I 형 콜라게나아제(염증의 매개자) 및 TNF-α (종양괴사인자 알파)를 발현한다.
본 발명의 멜라닌세포는 단백질 및 비멘틴과 관련된 멜라닌의 발현능을 가지고 있다.
더욱이, 본 발명의 불사화 세포계는, 유기형 배양에서 성장할 때, 높은 빈도의 계대 배양(>20 계대 배양)에서조차 각질화된 표재층(각질층)을 갖는 상당히 층상 및 분극된 상피를 형성한다. 이는 통상적인 배양 조건 하, 즉 혈청 함유 배지에서 피더 층을 사용하여 주화된 불사화 각질세포 세포계가 이미 보고된 바가 있다.
배양하는 동안 임의의 피더 층을 사용하지 않고 전체 혈청이 없는 조건 하에서 본 발명의 불사화 세포계를 얻는다.
더구나, 하기에서 보다 상세하게 기술된 바와 같이, 무혈청 배지 중에 사용될 때 에피네프린은 정상 각질세포의 강한 성장 인자임이 놀랍게도 밝혀졌다. 구체적으로, 하기 기술된 NR-3 배지는 정상 각질세포의 성장을 증진시키는 것으로 밝혀진 에피네프린을 함유한다(도 1 참조). 에피네프린이 각질세포의 성장을 저해하거나(Halprin,J. Invest. Dermatol.,81:553-557(1983)) 각질세포 세포 성장에 온화한 영향만을 미친다는 것(Koizumi et al,J. Invest. Dermatol., 96:234-237, 1991)이 이미 보고된 것은 다소 놀라운 사실이다.
또한, 특히 코팅제 또는 피브로넥틴, BSA 및 I 형 콜라겐을 함유하는 "칵테일"로, 1차 및 불사화 각질세포 및/또는 멜라닌세포를 배양하는데 사용되는 배양 접시 또는 플레이트의 연속적인 코팅이 배양 플레이트 또는 배양 접시에 대한 각질 세포 및 멜라닌세포 모두의 부착을 향상시킬 뿐 아니라 세포 성장을 증가시키는 것으로 놀랍게도 밝혀졌다. 상기 코팅 물질의 용도는 불사화 각질세포 및/또는 멜라닌세포에 대한 용도로는 아직 기재된 바 없다.
언급한 바와 같이, 본 발명은 NR-3 배지라 하는 신규한 무혈청 배지를 특별히 추가로 제공한다. 상기 배지는 피더층을 사용하지 않고 무혈청 조건 하에 사람 피부로부터의 정상 각질세포 및/또는 멜라닌세포의 배양 및 단리를 가능케한다. 상기 배지는 혈청 또는 피더 세포와의 어떠한 접촉도 없이 정상 각질세포의 성장을 향상시키고 정상 각질세포 배양의 주화를 가능케 하는 것으로 밝혀졌다.
NR-3 배지의 정확한 조성이 표 1 에 기재되어 있다. 상기 배지는 다양한 아미노산, 미량 원소로서 무기염, 비타민, 성장 인자 및 다른 치환체들을 함유한다. 예컨데, 상기 배지는 성장 인자로서 표피 성장 인자(EGF 재조합), 인슐린, 히드로코르티손, 트랜스페린(사람), 소 뇌하수체 추출물, 및 에피네프린을 함유한다. 언급한 대로, 에피네프린은 조직 배양에 있어서, 1차 각질세포의 성장을 향상시키는 것으로 놀랍게도 밝혀졌다.
아미노산으로서, 상기 배지는 L-알라닌, L-알기닌-HCl, L-아스파라긴-H2O, L-아스파르트산, L-시스테인-HCl-H2O, L-글루탐산, 글루타민, 글리신, L-히스티딘-HCl-H2O, L-이소류신, L-류신, L-리신-HCl, L-메티오닌, L-페닐알라닌, L-프롤린, L-세린, L-트레오닌, L-트립토판, L-티로신 및 L-발린을 함유한다.
상기에 함유된 무기 염은, 암모늄 메타바나데이트, 암모늄 몰리브데이트, 염화 칼슘, 황산 구리, 황산 철, 염화 마그네슘, 염화 망간, 황산 니켈, 염화 칼륨, 소듐 아세테이트, 소듐 바이카르보네이트, 염화 나트륨, 인산 나트륨 이염기, 소듐피루베이트, 소듐 셀레나이트, 소듐 실리케이트, 염화 주석 및 황산 아연이다.
NR-3 배지에 함유된 비타민은, d-비오틴, d-칼슘 판토테네이트, 콜린 클로라이드, 시안코크알부민, 엽산, i-이노시톨, 니코틴아미드, 피리독신 및 리보플라빈 이다.
배지는 아데닌, 에탄올아민, 포스포에탄올아민, 페놀 레드 Na, 푸트레신 2 HCl, 티아민 HCl, 티옥트산, 티미딘, 글루코오스, HEPES 및 항생제(펑기존(fungizone), 페니실린 및 스트렙토마이신)을 추가로 포함한다.
NR-3 배지의 바람직한 조성이 표 12 에 기재되어 있다. 그러나, NR-3 배지 중에 함유되어 있는 치환체의 농도는 넓은 범위에서 다양할 수 있음이 예측된다. 더욱 구체적으로는, 다양한 치환체의 양은 표 12 에 개시된 농도로부터 ± 50 내지± 0.1%, 더욱 바람직하게는 ± 10 내지 ± 0.1%로 다양할 수 있음이 예측된다. 더구나, 각질세포 또는 멜라닌세포 1차 세포 배양 및 불사화 세포계의 단리 및 주화에 실질적으로 부작용이 되지 않으면 하나 이상의 인용된 치환체는 삭제될 수 있고 다른 치환체가 첨가될 수 있는 것으로 예측된다. 이는 당업자의 시행 착오에 의해서 결정될 수 있다.
언급한 대로, 본 발명의 NR-3 무혈청 배지의 중요한 치환체는 에피네프린이다. 에피네프린은 1차 사람 각질세포에 있어서 매우 강한 성장 촉진 활성을 갖는 것으로 알려져 있다.
에피네프린이 각질세포의 증식을 향상시키는 이유는 분명하지 않다. 사람 각질세포가 에피네프린 합성을 위한 효소를 발현시키고 또한 높은 밀도로 베타 2-아드레노수용체를 발현시킴이 보고되어 있다 (Schallreuther et al., "Production of catecholamines in the human epidermis,"Biochem. & Biophys. Res. Commun., 189:72-78(1992)). 상기 효소들은 카테콜아민 생합성 경로, 특히 페닐에탄올아민-N-메틸트랜스퍼라아제 및 바이오프테린 의존성 티로신 히드록실라아제와 관련된다. 반면, 상기 효소 활성은 멜라닌세포 및 섬유아세포에서는 검출될 수 없다. 따라서, 상기 효소 활성 및/또는 수용체 발현은 에피네프린의 각질세포의 증식 조절능을 설명할 수 있다.
본 발명자들은, NR-3 배지가 정상 분화된 각질세포 및 멜라닌세포에 의해 발현되는 단백질 및 효소를 분화 및 발현시킬 수 있는 능력을 유지하는 세포의 증균을 유도하는 세포 분화를 억제하기 때문에 NR-3 배지가 1차 세포 배양 및 세포계의단리 및 주화를 향상시킨다고 가정한다.
더욱 상세하게는, 혈청 함유 배지 중의 각질세포 또는 멜라닌세포의 성장은 1차 계대 배양에서 분화하는 경향이 있다고 여겨진다. 그러나, 분화된 세포는 잘 성장하지 않기 때문에 이것은 불리하다(초기 배양 기간 동안). 이는 오히려 약한 분화능만을 갖는 증식 피부 세포의 과증식 및 선별을 하게된다. 결과적으로, 불사화 전에 혈청을 배지에 가하면 높은 분화능을 갖는 세포수는 감소된다.
반면, 본 발명에서, 각질세포 및 멜라닌세포는 멜라닌세포 및 각질세포의 분화를 저해하는 조건 하에 무혈청 배지 중에서 배양된다. 본 발명에서, 무혈청 배지는 불사화 전 및 그 동안, 뿐만 아니라 증식 및 분화 동안인 전 배양기동안 바람직하게 사용된다.
언급한 바와 같이, 본 발명의 NR-3 무혈청 배양 배지는 각질세포의 분화를 저해하고, 따라서 이로부터 유래된 각질세포 1 차 세포 배양 및 불사화 세포계의 단리를 향상시킬 수 있다. 더구나, 상기 무혈청 배지는 낮은 칼슘 농도를 함유하며 공단리된 섬유아세포의 성장을 선택적으로 저해한다. 이로인해 멜라닌세포 및 각질세포를 현저하게 함유하는 배양물의 제조를 촉진하는 매우 선별적인 성장 배지를 생성한다. 따라서, 본 발명의 무혈청 NR-3 배지는 각질세포 분화를 저해하고 또한 섬유아세포 성장을 저해하기 때문에 유리하다.
언급한 대로, 해리된 멜라닌세포, 각질세포 및 섬유아세포를 함유하는 단일 피부 샘플로부터 제조된 세포 현탁액은, 본 발명의 NR-3 배지에서 배양되는 것이 바람직하다. 이는 부착을 용이하게 하는 조성물로 연속적으로 코팅되는 배양 접시상에 상기 세포를 종균함으로서 수행될 것이다. 바람직하게는, 이 코팅제는 피브로넥틴, 소 혈청 알부민 및 1 형 콜라겐의 혼합물을 포함할 것이다. 상기 코팅제 또는 "칵테일"코팅제는 기관지 세포에 대해서 이미 기재된 바 있다(Lechner et al.,J.Tiss.Cult.Meth., 9:43-48(1985)). 본 발명자들은 상기 칵테일이 각질세포 및 멜라닌세포의 플라스틱 배양 접시에의 부착을 향상시킨다는 것을 발견하였다. 더구나, 1차 및 불사화 각질세포의 배양에 사용되는 배양 플레이트의 상기 연속적인 코팅은 세포 성장을 더욱 증진시킨다는 것을 놀랍게도 발견하였다. 배양 플레이트의 연속적인 코팅이 불사화 각질세포 또는 멜라닌세포에 대해서는 기재된 적이 없다.
배양하는 동안, 1차 세포 배양액이 포화밀집에 도달하거나 실질적으로 도달할 때, 이들을 바람직하게는 분할한 다음, 다른 코팅된 배양 접시에 펼친다. 전형적으로, 세포 배양은 매 10 내지 14 일 마다 분할된다.
1 차 멜라닌세포 및/또는 각질세포를 기술된 코팅된 배양 접시를 사용하여 NR-3 무혈청 배지 중에 목적하는 세포수로 배양 및 펼친 후에, 이들을 불사화시킨다. 바람직하게는, 가장 우수한 성장을 나타내는 멜라닌세포 및 각질세포를 불사화시킨다. 그러나, 이와는 달리 펼쳐진 1차 멜라닌세포 또는 각질세포를 불사화 전에, 예컨데, 검정에서, 피부 이식 또는 유전자 치료에서 사용할 수 있다.
멜라닌세포 및 각질세포의 불사화는 SV40 T-항원의 발현 또는 사람 파필로마 바이러스 16(HPV16)의 E6/E7 유전자 발현을 제공하는 벡터로 수행될 수 있다. 바람직하게는, 불사화는 SV40 T-항원 또는 HPV16 의 E6/E7 유전자의 발현으로 제공되는 레트로바이러스성 구축물로 멜라닌세포 또는 각질세포를 감염시키므로서 수행된다.세포성 T-항원 감염은 문헌 [Pfeifer et al. Meth. Cell Sci. 17:83-89, 1995]의 프로토콜을 기초로 한다(DMEM, 10 % 소태아 혈청 중에 형성된 패키징 세포계로부터 바이러스를 수합하는 것은 제외한다). 감염 동안, 혈청 함유 배지를 사용할 수 있다. 그러나, 무혈청 배지가 멜라닌세포 및 각질세포에 바람직하고, 바람직하게는, 예컨데, 참고로 포함된 문헌 [Pfeifer et al.,Meth.Cell.Sci., 14, 83-89(1995)]에 기재된 PC-1 배지가 바람직하다. 가장 바람직하게는, 불사화는 문헌 [Pfeifer et al. and Stockshlaeder et al.(GeneBank, n° accession M64753)]에 기초한 도 2a에 나타낸 pLXSHD+SV40(#328), 또는 문헌[Durst et al. 1987, Oncogene 1, 251-256]에 기초한 도 2b 에 나타낸 pLXSHD+E6/E7로 언급되는 레트로바이러스성 구축물을 사용하여 수행된다.
불사화한 후에, 불사화된 세포계를 증식 배지, 바람직하게는 NR-2 또는 NR-3, 또는 예비 코팅된 배양 접시를 사용한 M2(멜라닌세포 용)에 이식시킨다. 세포를 목적한 세포 수로 증식시킨 후에, 상기 세포들을 정상 및 불사화 각질세포의 배양에 적합한 분화 배지로 이식시킨다. 바람직하게는, 이는 NR-2 또는 높은 칼슘 농도(1.5 mM)를 갖는 변형된 MCDB 153 또는 예비 코팅된 배양 플레이트(동일한 BSA, I 형 콜라겐, 피브로넥틴 코팅)을 사용한 M2(멜라닌세포용으로)을 포함한다.
미리 언급한 바와 같이, 본 발명에 따라 제조된 분화된 불사화 각질세포 및 멜라닌세포 세포계는, 상기 세포계가 분화된 사람 피부 세포를 필요로하는 검정에서의 사용에 매우 적합하도록하는 향상된 성질을 나타낸다. 특히, 상기 세포계는 높은 빈도의 계대 배양 후에도 정상 분화 멜라닌세포 및 각질세포의 특징인 단백질을 발현하는 것으로 밝혀졌다.
예컨데, 본 발명에 따라 제조된 불사화 각질세포를 웨스턴 블럿 및 RT-PCR에 의해 검정할 때, 이들은 정상 각질세포와 동일 또는 유사한 시토트롬 p450(CYP450) 프로필을 갖는다. 더욱 구체적으로는, 본 발명에 따라 제조된 불사화 각질세포는 CYP450 1A1, 2C, 2E1, 3A5을 발현하고, CYP450 1A2, 2A6, 2B6 및 2D6을 발현하지 않는다. 상기 CYP450 프로필은 정상 각질세포와 일치한다. 상기 대사 프로필은 이전에 불사화 각질세포에 대해서 기재된 바 없다. 실제로, 정상 및 불사화 각질세포가 CYP450 3A5를 발현하고 CYP450 3A4를 발현하지 않는다는 것이 증명된 것이 처음이다. 또한, 본 발명에 따라 제조된 불사화 각질 세포는, 분화 마커에 특이적인 항체를 사용하여 분석했을 때, 높은 빈도의 계대 배양 후에조차 다른 분화 단백질을 발현하는 것으로 밝혀졌다. 더욱 특징적으로는, 본 발명의 세포계는 높은 빈도의 계대 배양에서조차, 즉 10 회 및 실질적으로는 그 이상 빈도의 계대 배양에서조차 분화 단백질인 K1/10, 케라틴 K14, 인볼루크린, 필라그린 및 로리크린을 발현한다.
본 발명의 불사화 각질세포 및 멜라닌세포는 또한 외인성 필수 지방산(EFA)을 섭취하고, 정상 멜라닌세포 및 각질세포와 상당히 일치하는 EFA 의 불포화 및 사슬 연장을 나타낸다.
게다가, 하기에 보다 상세히 기재되는 바와 같이, 정상 각질세포와 비교하여 포볼 에스테르로 처리되었을 때, 본 발명의 불사화 각질세포는 TNFα 및 염증 매개 콜라게나아제 I 형을 발현한다. 또한, 본 발명의 불사화 각질세포는, 정상 분화된 각질세포와 유사한 세포성 산화와 관련된 효소인 수퍼옥시드 디스무타아제를 발현한다.
또한, 멜라닌생성 유도자(예컨데, 테오필린 및 티로신) 및 멜라닌생성 저해제(코지산)으로 처리된, 본 발명에 따라 제조된 불사화 멜라닌세포는 정상 멜라닌 세포에 유사하게 반응한다.
상기 성질로, 본 발명의 불사화 각질세포 및 멜라닌세포는 면역학적, 약리학적, 광- 및 화학독성학적 피부 반응 연구에 적합하다.
예컨데, 본 발명의 불사화 각질세포 및 멜라닌세포 세포계 및 1 차 멜라닌세포 및 각질세포는, 분화된 피부 세포를 필요로하는 검정, 예컨데, 복원 피부의 장벽-작용 연구(각질화), 분화된 각질세포의 대사 연구(지방산 대사, 항산화 대사), 피부 세포에 대한 자외선 조사의 영향과 관련된 연구, 피부 세포에 대한 잠재적 피부 자극물 및 감작제의 영향과 관련된 연구, 멜라닌 제조에 있어서 화합물의 영향을 측정하는 검정, 지질-대사 연구, 이물질(예컨데, 화장품 오일, 광보호제와 같은 보호 추정 화합물을 위한 스크리닝)로 국소 처리, 피부 염증 및 자극 연구 등에 사용된다.
또한, 본 발명에 따라 제조된 불사화 각질세포 및 멜라닌세포 세포계 및 1차 멜라닌세포 및 각질세포는 잠재적인 항암 치료 화합물 및 피부 질환 치료 화합물을 스크리닝하는 데 유용하다. 이는 세포계 또는 1 차 세포를 상기 화합물에 일정 기간 노출시키고, 이들의 임의의 부작용, 예컨데, 유전자 독성, DNA 부가물 형성, 변이 유발성, 세포 형질전환 또는 세포 독성을 유발하는 지를 확인하는 것과 전형적으로 관련된다.
또한, 본 발명의 멜라닌세포 및 각질세포 세포계는, 재조합 단백질, 예컨데, 사람 단백질 및 폴리펩타이드의 발현, 뿐만 아니라, RNA 및 DNA 의 제조에 적합하다.
게다가, 본 발명의 불사화 세포계는 엑스 비보 유전자 치료에 잠재적인 유용성을 갖는다. 본 발명의 세포계는 예컨데 치료적·용도 또는 세포 독성/변이 유발성 연구를 위한 목적 유전자 산물을 발현하는 유전자적 조작 세포를 유전자적으로 표적 및 개발하는데 유용한 도구를 제공할 것이다. 더구나, 본 발명의 세포계가 정상 피부 세포와 매우 유사하다는 사실로 인해 이들은 생감수성 검정에 매우 적합할 것이다.
추가로, 무혈청 조건 하에서 제조되면, 본 발명에 따라 제조되는 1차 각질세포 및 멜라닌세포는, 유전자 치료에서 유용할 수 있다. 본래, 상기 세포는 혈청, 예컨데, 소 또는 다른 동물의 혈청(바이러스 감염 동안 및 액체 질소 중에 저장은 제외)에 노출되지 않으므로, 바이러스 또는 다른 병원성 제제에 의해 거의 오염되지 않는다. 따라서, 유전자 치료 동안 상기 세포들의 병원성 또는 감염성 인자를 이동시키는 위험성을 최소화시켜야 한다. 상기 엑스 비보 유전자 치료는 표피수포증(케라틴 변이 장애), 백반증(멜라닌 합성 유전자에 관련된 장애), 암종 및 흑색종, 알러지성 장애 및 염증 관련 장애와 같은 장애의 치료에 잠재성을 갖는다. 치료적 처리의 관점에서, 유일한 잠재적 오염원은, 소 뇌하수체 추출물, 소 인슐린, 소 콜라겐, 소 혈청 알부민 또는 사람 피브로넥틴 및 사람 트랜스페린이다.
또한, 본 발명의 불사화 멜라닌세포 및 각질세포 세포계 및 1차 멜라닌세포및 각질세포는, DNA 변이 유발 검정, 피부 변이유발소 스크리닝 검정, 크로모솜에 위해를 가하는 제제의 규명을 위한 검정, 악성 형질 전환 연구, 세포성 생화학 연구(예컨데, CYP450 활성 분석), 화합물 및 조성물, 예컨데, 염증 및 알러지 반응과 관련된 필수 지방산 칵테일의 스크리닝, TNFα , 인터류킨 검출과 관련된, 콜라게나아제 활성 분석(염증과 관련)에 유용성을 갖는다.
유용성 및 제조 방법에 있어서, 본 발명에 따라 제조된 1차 각질세포 또는 멜라닌세포는 피부 이식에 상당히 가능성 있는 용도를 갖는다. 상기 1 차 각질 세포 및 멜라닌세포는 무혈청 조건에서 제조되기 때문에, 병원체(예컨데, 바이러스) 및 감염성 제제에 의해 오염될 위험이 가장 적다. 더구나, 본 발명의 멜라닌세포 및 각질세포는 자가유래 숙주, 즉, 큰 상처가 있는 환자로부터 유래될 수 있기 때문에, 피부 이식의 거부 반응, 또는 다른 면역학적 부작용의 위험을 최소화 또는 제거할 뿐만 아니라 감염의 위험을 최소화 한다.
본 발명에 따라 제조된 특이적 불사화 각질세포 세포계인 FK2-NR, DK2-NR 및 DK3-NR는, 1995 년 10 월 5 일자로, 기탁기관 [데에스엠-도이체 잠룽 폰 미크로오르가니즈멘 운트 첼쿨투렌 게엠베하 ; 독일 데-38124 마셔로더 벡 1 베]에 기탁되었고, 각각 기탁 번호 DSM ACC2240, DSM ACC2238, 및 DSM ACC2239 을 부여받았다. 더구나, 본 발명에 따라 제조된 특이적 불사화 사람 멜라닌세포계의 예인 DM2-NR은 1996 년 12 월 11 일자로, 기탁기관 [빠스뙤르 인스티튜 ; 프랑스 파리 75724 뤼 드 독떼르 루와 25]에 기탁되었고, 기탁 번호 CNCM I-1796 을 부여받았다. 상기 기탁은 부다페스트 조약에 의한 것이다. 상기 세포계의 유용성에 관한 모든 제한은본 출원 또는 본 출원에 우선권을 주장하는 다른 출원에 대해서 변경될 수 없다.
본 발명의 다른 특성들은, 본 발명을 설명하기 위한 예시적인 구현예를 하기에 서술하는 과정에서 명백하게 될 것이고, 이에 국한되는 것은 아니다.
실시예 1 : 주화 피부 세포의 특성
표 1 에 바이러스성 감염을 갖는 모든 피부 샘플을 기재하였다. 가장 우수한 세포 성장을 나타내는 단리 각질세포를 불사화하는데 사용하였다.
[표 1]
NR-3-배지 중 세포 단리에 사용되는 피부 샘플
사람 섬유아세포를 피부 샘플 FKO-NR, GKO-NR, DKO-NR 로부터 단리한다. 진피 및 표피 구획을 분리한 후에, 진피를 작은 조각 0.2 x 0.2 mm로 자르고 혈청으로 6 cm 배양 플레이트상에서 고정시킨다. DMEM(Dulbecco's minimal essential medium, 10 % FCS)을 2 - 4 시간 후에 가한다. 상기 외식편 배양을 섬유아세포의 성장이 육안으로 확인될 때까지 배양한다. 포화밀집된 섬유아세포 배양을 분리하고 냉동주로 분주시킨다.
실시예 2
1)무혈청 배지 중 각질세포 성장의 특성화: 1차 세포 배양균을 변형된 MCDB 153 [Boyce et al.,J. Tissue Cult. Meth., 9:83-93(1985); and Pittlekow et al.,J. Invest. Dermatol., 86:410-417, 1986] 및 NR-3 배지에 배양한다. 가장 우수한 세포 성장은 NR-3 배지에서 관찰된다(도 1). 향상된 세포 성장이 BPE(소 뇌하수체 추출물)가 없는 변형된 MCDB 153 와 비교하여 완전히 정의된 NR-3 배지(BPE가 없는 NR-3)에서 또한 관찰된다.
도 1 은 6 일 후 NR-3 및 에피네프린-보충 변형된 MCDB 153 (각질세포 성장 배지)에서 세포 성장을 나타낸다. 변형된 MCDB 153 배지는 변형된 MCDB 153 에 관한 것이다. 각질세포를 트립신/EDTA(0.05%/0.01%) 중에서 회수하고 혈구 측정계로 수를 센다. 도 1 에 나타난 결과는 3회 평균이다.
2)세포성 부착 및 세포 성장에의 코팅 효과: 배양 플레이트를 코팅하는 것이 정상 각질세포의 세포 부착 및 세포 성장을 향상시킴을 발견하였다. 특히, 표 2 에 나타난 결과는 코팅된 및 코팅되지 않은 배양 플레이트에서의 각질세포의 성장을 비교한다. 100,000 개의 각질세포를 NR-3 배지를 함유하는 3.5 cm 플레이트에종균한다.
[표 2]
세포 부착에 있어서 표면 코팅의 효과
실시예 3 :
1)각질세포의 불사화: 해리된 멜라닌세포, 각질세포 및 섬유아세포를 함유하는, 실시예 1 에 기재된 피부 샘플로부터 제조된 세포 현탁액을 본 발명의 NR-3 배지에서 배양한다. 이는 기관지 세포에 대해 이미 기재된 바 있는 "칵테일"코팅제로 연속적으로 코팅된 배양 접시상에 상기 세포를 종균함으로서 수행된다(Lechner et al., J.Tiss. Cult. Meth., 9:43-48(1985)). 이들이 포화밀집에 도달 또는 실질적으로 도달할 때 1차 세포 배양균을 배양하는 동안, 세포를 트립신/EDTA(0.025%/0.01%)로 4분 동안 처리한다. 상기 처리를 하는 동안, 멜라닌세포가 각질세포 배양으로부터 탈리되고, 그들을 따로 수집한다. 따라서 1차 멜라닌세포 및 각질세포는 이 단계에서 분리된다. 기술된 코팅 배양 접시(멜라닌 세포에 대비해서 각질세포의 성장을 촉진시킴)를 사용하여 1차 각질세포를 무혈청 NR-3 배지 중에 배양하고 목적하는 세포수로 편 후에 이들을 불사화시킨다. 각질세포의 불사화는, SV40 T-항원을 발현하는 레트로바이러스성 구축물 pLXSHD+SV40(#328)로 수행된다(Pfeifer et al. Meth.Cell Sci. 17:83-89, 1995 참조 ; 바이러스가 DMEM, 10% 소태아 혈청 중 형성된 패키징 세포계로부터 바이러스를 수집하는 것은 제외한다). 감염되는 동안, 문헌 [Pfeifer et al., Meth.Cell.Sci., 14,83-89(1995)]에 기재된 무혈청 PC-1 배지를 사용한다. 불사화한 후에, 불사화된 세포계를 예비 코팅된 배양 접시를 사용한 NR-2 또는 NR-3 증식 배지로 이식시킨다. 세포를 목적하는 세포수로 증식시킨 후에, 세포를 정상 및 불사화 각질세포를 배양하기에 적합한 분화 배지에 이식시킨다.
2)높은 빈도의 계대 배양에서 불사화된 각질세포의 세포 증식: 불사화된 각질세포는 높은 빈도의 계대 배양에서 향상된 세포 성장을 나타냄을 증명한다. 이는 하기 표 3 에 나타난다. 이는 군집배가시간(PDT : 대수성장기 동안 세포수가 배가하는데 걸리는 시간)을 측정하여 증명된다. 방법 : 각질세포를 트립신/EDTA(0.05%/0.01%)에서 회수하고 혈구 측정계를 사용하여 수를 세며, 결과는 3회 평균이다.
[표 3]
NR-3 에서 성장한 각질세포계의 군집배가시간(PDT)
3)불사화 사람 각질세포계에서의 CYP450-발현: 웨스턴 블럿(단백질-발현) 및 RT-PCR(mRNA-발현, 표 4 참조)에 의하여 정상 및 불사화 각질세포 피부 세포에서 CYP4501A1, 1A2, 3A5, 2E1, 2B6, 2A6, 및 2D6 발현을 분석한다. 불사화된 각질세포에서 발현된 CYP450 은 정상 각질세포와 유사하다. 발현의 속도는 약간 감소한다. 그러나 DK2-NR-계는 CYP450-발현의 거의 정상 속도를 나타낸다.
방법 : CYP450(Mace et al. 준비중)에 대한 특이적 프라이머를 갖는 RT-PCR(역 전사효소-폴리머라아제 연쇄 반응).
[표 4]
사람 각질세포에서 CYP mRNA 발현
4)CYP450-유도자에 대한 반응: 세포계는 높은 빈도의 계대 배양에서 조차도 비-불사화 세포와 같이 CYP450-유도자 벤즈(아)피렌에 반응한다(표 5 참조).
상기 유도는 T-Ag 불사화 각질세포에 대해서는 기재되지 않았다.
[표 5]
벤즈피렌(B(a)P)*으로 유도 후의 사람 각질세포에 있어서 7-에톡시레소루핀O-데에틸라아제(EROD; Sigma Inc.) 활성
5)세포 분화: 분화 마커를 특이적 항체를 사용하여 분석한다. 사용된 특이적 항체를 표 6에서 명시하였다. 가장 높은 분화능은 DK2-NR 및 DK1-NR 클론에서 증명될 수 있다(표 7, 8)
[표 6]
각질세포-특이성 단백질을 검출하는데 사용되는 항체
[표 7]
T-Ag 및 표피 각질세포의 분화 산물의 검출
[표 8]
각질세포에서의 케라틴(K)의 검출
6)글루타치온-S-트랜스퍼라아제의 발현: II 상-효소 글루타치온-S-트랜스퍼라아제(GST)를 노던 블럿 및 웨스턴 블럿 기술에 의해 분석한다. 모든 각질 세포계는 GSTπ에 대한 mRNA를 강하게 발현하지만 GSTα 및 GSTμ에 대해서는 발현하지 않는다(표 9: 방법: 노던 블럿). 세포계 중의 GSTα , GSTμ 및 GSTπ의 단백질 발현 프로필은 정상 각질세포와 유사하다.
[표 9]
GST 효소의 단백질-발현
7)필수 지방산(EFA) 대사: 각질세포 중에서 첨가된 EFA의 불포화 및 신장을 분석 및 비교하기 위하여, 불사화(DK1-NR, FK2-NR) 및 정상 각질세포를 리놀레산(LA, 15μ M) 및 α -리놀렌산(LN, 15μM)으로 처리한다. 상기 실험을 위해 EFA-결핍 NR-2(Biofluids Inc.)을 사용하였다. 포화밀집에 도달하고 NR-2 칼슘을 높은 농도(1.5 mM)로 증가시킨 후에 세포 배양물을 처리한다. 세포를 EFA로(2일 후 새로운 EFA로)로 4 일 처리한다.
TLC(박층 크로마토그래피)에 의한 인지질의 추출 및 분리 및 GLC(가스 액체 크로마토그래피)에 의한 지방산-메틸에스테르의 정량화에 의해 EFA 분석을 수행한다. LA(20:4n-6 및 22:4n-6) 및 LN(20:5n-3, 22:5n-3 및 22:6n-3)의 불포화 및 신장 산물 형성을 증명할 수 있다. 상기 대사 프로필은 정상 각질세포에서 관찰된 것과 일치한다.
8)핵형: 모든 세포계는 디플로이드 범위에서의 대부분 크로모좀 계산치를 갖는 하이포디플로이드이다(하이포테트라플로이드 범위에서 또한 크로모좀 계산치를 갖는 DK2-NR 은 제외). 분석된 세포계이외의 세포들은 배양액 중에서 검출되지 않았다. 상기 결과로 세포계의 순도 및 다른 원인으로부터 세포성 오염이 없음을 확인한다.
9)생체내 특성화: 불사화 각질세포의 종양형성은 누드 마우스에 피하 주사(1-2 mio 각질세포)하여 확인된다. 시험된 각질세포계 DK2-NR, DK3-NR, FK2-NR은 누드 마우스(4 개월간 인큐베이션)에 있어서 종양을 형성하지 않는다. 그러나 DK3-NR 은 5 개월간 인큐베이션한 후에 10 마리 중 6 마리에 있어서 약하게 종양을 형성한다.
10)피부 자극물에 대한 반응: 피부 자극제 PMA(포볼-12-미리스테이트-13-아세테이트), SDS(소듐 도데실 술페이트), DMSO(디메틸 술폭시드), IL-1β (인터류킨 1 베타), 및 UV-B(자외선 B)로 처리한 후 "자극-유전자" TNFα (종양괴사인자알파) 의 유도를 노던 블롯 및 생물학적 검정에 의해 분석한다(표 10). 각질세포계는 PMA 및 UV-B 에 반응하고 높은 빈도의 계대 배양에서도 단백질 TNFα를 발현한다.
불사화 각질세포를 포볼 에스테르(PMA)로 처리한 후에, 콜라게나아제(I 형) 발현의 증가가 관찰된다.
[표 10]
피부 자극물로 유도 후에 각질세포에 있어서의 TNFα의 분비
11)유기형 배양: 유기형 조건하에 사람 각질세포(피더셀을 갖는 콜라겐 겔상에 공기 노출되어 성장한 각질세포)의 배양을 또한 수행한다. 모든 각질세포계는 정상적인 각질세포와 비교하여 과증식 형태를 나타낸다. 상기 연구는 혈청이 있는 배양 배지에서 수행되었다. 과증식 세포 성장은 무혈청 조건(콜라겐 겔 및 피더셀이 없는 플라스틱 삽입 배양 접시에 높은 농도의 칼슘(1.5 mM)을 갖는 NR-2)에서 감소된다.
실시예 4 :
1)멜라닌세포의 불사화: 해리된 멜라닌세포, 각질세포 및 섬유아세포를 함유하는, 실시예 1에서 기재된 피부 샘플 DKO-NR 로부터 제조된 세포 현탁액을 본 발명의 NR-3 배지에서 배양한다. 이는 기관지 세포에 대해 이미 기재된 바 있는 "칵테일"코팅제로 연속적으로 코팅된 배양 접시 상에 상기 세포를 종균함으로서 수행된다 (Lechner et al.,J.Tiss.Cult.Meth., 9:43-48(1985)). 1 차 세포 배양액을 배양하는 동안, 포화밀집에 도달 또는 실질적으로 도달할 때, 세포를 트립신/ EDTA(0.025%/0.01%)으로 4 분 동안 처리한다. 이러한 처리 동안, 멜라닌세포가 각질세포 배양균으로부터 분리되고, 그들을 각각 수합한다. 따라서 1차 멜라닌세포 및 각질세포가 이 단계에서 분리된다. 각질세포의 성장을 특이적으로 저해하는 무혈청 NR-4 배지에 수합된 1차 멜라닌세포를 종균한다. 상기 기재된 코팅된 배양액을 사용하는 무혈청 NR-4 배지 중에 1차 멜라닌세포를 배양 및 목적하는 세포수로 증식시킨 후, 불사화시킨다. 각질세포의 불사화는 SV40 T-항원을 발현시키는 레트로바이러스성 구축물 pLXSHD+SV40(#328)로 수행된다 (문헌[Pfeifer et al.Meth.Cell Sci.17:83-89,1995] 참조 ; 바이러스를 DMEM, 10% 소태아 혈청에서 형성된 패키징 세포계로부터 수집하는 것은 제외). 감염되는 동안, 문헌 [Pfeifer et al.,Meth.Cell Sci.14, 83-89,1995]에 기재된 무혈청 PC-1 배지를 사용한다. 불사화 후에 불사화된 세포계를 M2 증식 및 분화 배지로 이식시킨다 (DMEM/F12 배지, Biofluids, No148 ; 또한 M.Olssen, Uppsala, Sweden으로부터 입수 가능).
2)T-Ag 발현 사람 멜라닌세포의 특성화: 본 발명에 따라(특히 DM2-NR) 제조된 불사화 멜라닌세포의 멜라닌-관련 단백질의 발현을 정상 멜라닌세포와 비교한다. 불사화 세포가 낮은 발현일지라도 정상 세포와 유사한 멜라닌-관련 단백질, 흑색종 관련 항원(MAA) 및 HMB45을 발현함이 증명된다.
3)멜라닌 합성의 유도: 멜라닌세포 세포계(특히 계 DM2-NR)을 발현하는 T-Ag 의 멜라닌형성을 정상 멜라닌세포와 비교한다. 멜라닌세포를 멜라닌형성 유도제인 티로신 및 테오필린, 및 멜라닌형성 저해제인 코지산으로 처리한다. 멜라닌세포 계(특히 DM2-NR)은 정상 세포와 비교하여 멜라닌형성 조절자에 반응 한다. 멜라닌형성의 유도/저해는 또한 용량 의존적임이 증명된다.
실시예 5 :
실시예 1 에 기재된 주 DKO-NR을, 도 2b 에 묘사된 레트로바이러스성 구축물 pLXSHD+E6/E7 에 기초한 HPV 16 으로 상기 정의와 같이 불사화시킨다. 수개의 연속적인 각질세포 계를 선별한다. 분화 산물(사이토케라틴, GST, TNFα , 인볼루크린, 필라그린, 로리크린, 비멘틴)의 관점에서 상기 계의 분석 결과는 계DK2-NR 및 DK3-NR으로부터 수득된 것과 유사하다.
실시예 6 :
본 발명의 신규한 NK-3 배지의 조성 및 본 발명의 수 개의 다른 무혈청 배지, 즉, NR-1, NR-2 및 NR-4 의 조성이 하기에 비교되어 있다.
1)NR-1 배지의 배지 조성(하기 표 참조)
2)NR-2 배지의 배지 조성: 소 뇌하수체 추출물(Biofluid Inc.) 35 mg/l을 추가 공급하고, 항생물질(Gibco BRL, Life Technologies Inc.) 펑기존(0.25 mg/l), 페니실린(10.000 유니트/l) 및 스트렙토마이신(10 mg/l)을 함유하는 것을 제외하고는 NR-1 과 동일하다.
3)NR-3의 배지 조성: 에피네프린(Biofluid Inc.) 250 μg/l을 추가 공급하는 것을 제외하고는 NR-2와 동일한 대체물.
4)NR-4 의 배지 조성: βFGF(3μg/l)(Sigma Inc. 사에서 생산된 염기성 섬유아세포 성장 인자) 및 포볼12-미리스테이트-13-아세테이트(10μg/l)(PMA)(C.C.R.Inc.)을 추가 공급하는 것을 제외하고는 NR-2와 동일한 대체물.
본 발명은 특정 바람직한 구현화와 관련하여 상당히 상세하게 기술되었으나, 본 발명의 범위 중의 다른 구현예도 가능하다. 따라서, 명세서 및 하기 청구항은 여기에 포함된 바람직한 구현예의 서술에 제한되는 것으로 추정되어서는 안된다.
Claims (22)
- 조직 배양에서 10 회 이상의 계대 배양 후에도 분화능을 가지고, 정상 분화된 각질세포 또는 멜라닌세포에 의해 발현되는 단백질 및 효소의 발현능을 가지며, 정상 분화 각질세포와 동일 또는 유사한 CYP450 프로필을 나타내는 것을 특징으로 하는 불사화 각질세포 세포계.
- 제 1 항에 있어서, 세포계가 케라틴 단백질 및 정상 분화 각질세포에 의해 발현되는 다른 단백질을 발현하는 것을 특징으로 하는 불사화 각질세포 세포계.
- 제 2 항에 있어서, 케라틴 단백질이 케라틴 K1/10, 케라틴 K14 을 포함하고 다른 단백질이 인볼루크린, 필라그린 및 로리크린을 포함하는 것을 특징으로 하는 불사화 각질세포 세포계.
- 제 1 항에 있어서, 세포계가 CYP450 1A1, 2C,2E1 및 3A5를 발현하지만 CYP450 1A2, 2A6, 2B6 및 2D6을 발현하지 않는 것을 특징으로 하는 불사화 각질세포 세포계.
- 제 1 항에 있어서, 피더 세포를 사용하지 않고 무혈청 조건 하에서 제조되는 것을 특징으로 하는 불사화 사람 각질세포 세포계.
- 제 1항에 있어서, 피더 세포를 사용하지 않고 무혈청 조건 하에서 제조되는 것을 특징으로 하는 불사화 사람 멜라닌세포 세포계.
- 각질세포계 DK2-NR(DSM ACC2238), DK3-NR(DSM ACC2239) 및 FK2-NR(DSM ACC2240) 및 멜라닌세포계 DM2-NR(CNCM I-1796)으로 구성되는 군으로부터 선택된 SV40 T-항원 불사화 사람 피부 세포계.
- 제 1 항에 있어서, 글루타치온-S-트랜스퍼라아제 GST-π, GST-μ 및 GST-α를 코딩하는 mRNA 발현하는 것을 특징으로 하는 불사화 각질세포 세포계.
- 제 1 항에 있어서, 유기형 배양액에서 배양될 때, 혈청 또는 피더 세포 없이 각질화된 표재층을 갖는 매우 층상이고 분극된 상피를 형성함을 특징으로 하는 불사화 각질세포 세포계.
- 제 1 항에 있어서, 포볼 에스테르로 처리될 때, 1 형 콜라게나아제 및 TNFα를 발현시키는 것을 특징으로 하는 불사화 각질세포 세포계.
- 하기를 함유하는, 10 회 이상의 계대 배양 후에도 분화능을 가지고, 분화된 사람 각질세포 및 멜라닌세포의 단백질 및 효소의 발현능을 갖는 사람 각질세포 및멜라닌세포의 단리 및 제조에 적합한 신규한 무혈청 배양 배지 ;아미노산 또는 아미노산염 ; 무기염 ; 비타민 ; 아데닌, 에탄올아민, 글루코오스, HEPES, 페놀 레드, 푸트레신 2HCl, 티옥트산, 티아민 HCl, 티미딘, 표피 성장 인자 ; 인슐린 ; 히드로코르티손 ; 트랜스페린 ; 포스포에탄올아민 ; 및 소 뇌하수체 추출물.
- 제 11 항에 있어서, 에피네프린을 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 배지.
- 제 12 항에 있어서, 에피네프린 농도가 각질세포의 성장을 향상시키기에 충분한 것을 특징으로 하는 배지.
- 제 11 항에 있어서, 배지에 함유되는 아미노산이 L-알라닌, L-알기닌-HCl, 아스파라긴-H2O, L-아스파르트산, L-시스테인-HCl-H2O, L-글루탐산, 글루타민, 글리신, L-히스티딘-HCl-H2O, L-이소류신, L-류신, L-리신-HCl, L-메티오닌, L-페닐알라닌, L-프롤린, L-세린, L-트레오닌, L-트립토판, L-티로신, L-발린 및 이의 염으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 배지.
- 제 11 항에 있어서, 무기염이 암모늄 메타바나데이트, 암모늄 몰리브데이트,염화 칼슘, 황산 구리, 황산 철, 염화 마그네슘, 염화 망간, 황산 니켈, 염화 칼륨, 소듐 아세테이트, 소듐 바이카르보네이트, 염화 나트륨, 소듐 포스페이트 이염기, 소듐 피루베이트, 소듐 셀레나이트, 소듐 실리케이트, 염화 주석 및 황산 아연으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 배지.
- 제 11 항에 있어서, 비타민이 d-비오틴, d-칼슘 판토테네이트, 콜린 클로라이드, 시아노코발아민, 엽산, i-이노시톨, 니코틴아미드, 피리독신 및 리보플라빈으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 배지.
- NR-2 배지, NR-3 배지 및 NR-4 배지로 구성되는 군으로부터 선택된, 불사화 각질세포 및/또는 멜라닌세포의 단리, 제조 및/또는 유지를 위한 신규한 무혈청 배지.
- 제 1 항에 따른 불사화된 각질세포, 멜라닌세포, 또는 각질세포 및 멜라닌세포를 사용함으로써 향상되는 것을 특징으로 하는, 분화된 각질세포, 멜라닌세포, 또는 각질세포 및 멜라닌세포를 사용하는 향상된 검정 방법.
- 제 18 항에 있어서, 세포가 DK2-NR(DSM ACC2238), DK3-NR(DSM ACC2239), DM2-NR(CNCM 1-1796) 및 FK2-NR(DSM ACC2240)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 검정 방법.
- 제 18 항 또는 제 19 항에 있어서, 검정이 염증 검정임을 특징으로 하는 방법.
- 단계(iii)에 따라 얻은 1차 멜라닌세포 또는 각질세포를 사용하므로서 향상되는 것을 특징으로 하는, 1차 멜라닌세포 또는 각질세포를 사용하는 향상된 검정 방법.
- 제 21 항에 있어서, 검정이 염증 검정임을 특징으로 하는 검정 방법.
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