DE60221519T2

DE60221519T2 - Verfahren und zusammensetzung für hauttransplantate

Info

Publication number: DE60221519T2
Application number: DE60221519T
Authority: DE
Inventors: B. Lynn Madison ALLEN-HOFFMANN
Original assignee: Wisconsin Alumni Research Foundation
Current assignee: Wisconsin Alumni Research Foundation
Priority date: 2001-04-24
Filing date: 2002-04-24
Publication date: 2008-04-17
Anticipated expiration: 2022-04-25
Also published as: DE60221519D1; JP2005509456A; JP4669206B2; WO2002086510A1; IL158526A0; EP1390754A4; CA2444699A1; ES2291470T3; ATE368856T1; DK1390754T3; JP2008043772A; AU2002303457B2; IL158526A; EP1390754A1; NZ529035A; CA2444699C; PT1390754E; EP1390754B1; CY1106955T1

Description

Hintergrund der Erfindung
Die Haut stellt das größte Organ des menschlichen Körpers dar und dient als schützende Barriere gegen Mittel, wie infektiöse Mittel, in der äußeren Umgebung sowie als wasserdichte Barriere, die die Flüssigkeitshomöostase aufrechterhält und eine Verdampfung von Gewebefeuchtigkeit verhindert. Intakte Haut verhindert eine lokale Infektion der Dermis oder eines anderen darunter liegenden Gewebes durch Mikroorganismen. Wenn derartige lokale Infektionen nicht bekämpft werden, können sie invasiv werden und zu einer Sepsis oder systemischen Infektion führen.
Der zeitweilige Verlust von Haut führt häufig zu Todes- oder Krankheitsfällen. Sehr häufig tritt bei schweren Verbrennungen ein weitgehender Verlust der Unversehrtheit der Haut auf. Die Bedeutung der Barrierefunktion der Haut wird durch die Tatsache belegt, dass für ein gegebenes Alter die Mortalität in direktem Zusammenhang mit dem Ausmaß der Verbrennung steht. Gemäß den derzeitigen Versorgungsstandards wird es empfohlen, so rasch wie möglich die Hautoberfläche des Patienten wiederherzustellen, um die Flüssigkeitshomöostase und die Barrierefunktion wieder zu gewährleisten.
Bei Patienten mit Verbrennungen wird sehr häufig die Wiederherstellung der Oberfläche mit autologen Hauttransplantaten vorgenommen. Autologe Hauttransplantationstechniken werden in breitem Umfang eingesetzt, schlagen aber häufig fehl. Beispielsweise verfügt möglicherweise ein Patient mit großflächigen Verbrennungen nicht über ausreichende Spenderhaut, um die Empfängerstelle zu bedecken.
Derzeit stehen zwei hauptsächliche alternative Techniken zur Rettung von Patienten zur Verfügung. Eine Technik besteht darin, das gesamte verbrannte Gewebe vollständig auszuschneiden und den Patienten mit einer temporären Epidermis zu bedecken. INTEGRA (Johnson and Johnson, New Brunswick, New Jersey) ist eine Neodermis-Doppelschicht mit einer inneren Schicht aus Rinderkollagen und Chondroitin-6-sulfat sowie einer äußeren Schicht aus Silicon. Im Anschluss an die neodermale Angiogenese wird 14 bis 21 Tage später die äußere Siliconschicht chirurgisch entfernt und der Patient wird einer Oberflächenabdeckung mit dünnen, weitmaschigen Autotransplantaten unterzogen. Die dünnen Autotransplantate bieten den besonderen Vorteil, dass sie begrenzten Donatorstellen eine Heilung ermöglichen und seriell geerntet werden können. Obgleich INTEGRA von Verbrennungsfachleuten akzeptiert wurde, ist sein Einsatz aufgrund seiner Empfindlichkeit gegenüber Infektionen bei Patienten mit verschmutzten oder infizierten Verbrennungswunden eingeschränkt (1). Der andere hauptsächliche Einschränkungsfaktor besteht in der Verfügbarkeit von Donatorstellen. Patienten mit katastrophalen Verbrennungsverletzungen weisen möglicherweise keine ausreichende Verfügbarkeit an Donatorstellen auf, und zwar trotz des offensichtlichen Vorteils, dass nur wesentlich dünnere Autotransplantate benötigt werden.
Die zweite üblicherweise angewandte Technik besteht im Ausschneiden der Verbrennungswunde und in der Bereitstellung einer temporären dermalen/epidermalen Abdeckung mit Leichenhaut, um die Hautbarrierefunktion wiederherzustellen. Autologe Keratinozyten werden geerntet und gezüchtet. EPICEL (Genzyme Corporation, Cambridge, Massachusetts), das einzige, handelsübliche, permanente Hautersatzprodukt, bildet Keratinozyten in einer Dicke von 2 bis 6 Zellschichten, die an feinmaschiger Gaze haften. Diese Autotransplantate sind 3 bis 4 Wochen nach der Biopsie verfügbar. Im Fall von großen Verbrennungen fällt dieser zeitliche Rahmen häufig mit der Entwicklung der Sepsis von Verbrennungswunden zusammen. Eine bakterielle Verunreinigung und andere Faktoren bewirken hohe Ausfallraten bei EPICEL, die bei herkömmlichen Hauttransplantaten mit Spaltungsdicke nicht auftreten (2).
Weitere Fortschritte bei der Versorgung von Verbrennungswunden können sich auf dem Gebiet der Gewebemanipulation ergeben. Ein Vorschlag bestand darin, die Barrierefunktion mit chimären Kulturen von autologen Keratinozyten im Gemisch mit eingeführten allogenen Zellkulturen wiederherzustellen (3, 4). Dadurch könnte eine frühere Wundabdeckung erreicht werden, indem die für eine endgültige Kulturbildung erforderliche Zeitspanne erheblich verkürzt wird. Eine langsamere permanente Oberflächenbildung der Haut würde sich bei autologen Keratinozyten bei der Abstoßung der allogenen Zellen ergeben. Ein Haupthindernis besteht darin, dass eine eingeführte, gezüchtete und getestete allogene Keratinozytenlinie benötigt wird. Diese stand bisher in der Praxis nicht zur Verfügung, da Keratinozyten in Kultur altern und ständig neue Keratinozytenlinien eingeführt und getestet werden müssten.
Haut besteht aus zwei Schichten, nämlich der Dermis und der Epidermis. Bei der Dermis handelt es sich um ein Bindegewebe mit einem Gehalt an Fibroblasten, die in eine Matrix aus Kollagen und elastischen Fasern eingebettet sind. Die Epidermis besteht im Gegensatz dazu vorwiegend aus Zellen mit wenig Bindegewebe.
Keratinozyten stellen die Hauptzellkomponente der Epidermis dar und machen etwa 80 % der Zellen in adulter humaner Haut aus. Sie stellen die epidermale Komponente dar, die für die Erzielung der Barriere-, Reparatur- und Regenerationseigenschaften der Haut verantwortlich sind. Ihr Name leitet sich von ihrer überwiegenden zytoskelettalen Komponente, den Keratinen, ab. Keratine sind die Untereinheiten von Keratinfilamenten und werden in zwei Typen eingeteilt: (saure) Keratine vom Typ I und (basische oder neutrale) Keratine vom Typ II. Sämtliche Epithelien exprimieren Keratine vom Typ I und vom Typ II, die im Molekulargewichtsbereich von 40 kDa bis 70 kDa liegen. Verschiedene Epithelgewebe exprimieren spezifische Paare von Keratinen. Heterodimere Keratine vom Typ I und II bilden Zwischenfilamente, die den Zellen und dem sich ergebenden Epithelgewebe Zugfestigkeit verleihen und eine strukturelle Stütze bieten.
Die Epidermis besteht aus vier morphologisch und biochemisch verschiedenen Schichten. Die Grundschicht von Keratinozyten steht in Kontakt mit der Grundmembran, die die Epidermis von der Dermis trennt. Die basalen Zellen stellen die einzigen Keratinozyten in intakter Haut dar, die zur Mitose befähigt sind und somit eine Quelle für sämtliche anderen Keratinozyten in der Epidermis darstellen. Sie haften über Hämidesmosomen am Substrat und über Desmosomen an benachbarten Zellen und Haftverbindungsstellen (Übersichtsartikel von Jensen und Wheelock, 1996). Zellen der Grundschicht weisen eine säulenartige Form auf und erzeugen die Keratine K5 und K14.
Bei der ersten suprabasalen Keratinozytenschicht handelt es sich um das Stratum spinosum, das seinen Namen aufgrund des "stacheligen" Erscheinungsbilds der zahlreichen desmosomalen Kontakte zwischen benachbarten Zellen trägt. Keratinozyten in dieser Schicht produzieren nicht mehr K5 und K14, sondern synthetisieren die differenzierungsspezifischen Keratine K1 und K10. Zellen beginnen mit der Erzeugung von Involucrin und epidermisspezifischen Transglutaminasen im oberen Stratum spinosum. Morphologisch sind spinöse Zellen größer und abgeflachter als basale Zellen (Überblick bei Holbrook, 1994).
Die Expression von Involucrin ist im Zytoplasma von suprabasalen und granulären Zellen (Mansbridge und Knapp, 1987; Murphy et al., 1984) von normaler Haut lokalisiert. Ferner wurde gezeigt, dass Involucrin in diesen Schichten perizellulär lokalisiert ist, wobei aber die für diese immunohistochemischen Experimente verwendeten Gewebe nicht fixiert waren und angenommen wurde, dass das Protein während oder nach dem Schneidevorgang zu den Zellrändern diffundierte (Smola et al., 1993; Watt, 1983).
Transglutaminasen sind eine Familie von calciumabhängigen Enzymen, die die kovalente Vernetzung von Proteinen miteinander oder mit Polyaminen katalysieren (Übersicht bei Rice et al., 1994). Das Keratinozyten-Transglutaminase-Isozym TG_K ist in der suprabasalen Epidermis membrangebunden und katalysiert die Vernetzung von Involucrin und von mindestens sechs weiteren Membranproteinen unter Bildung der verhornten Hülle (CE) (Übersicht bei Rice et al., 1994). Die CE stellt eine hochgradig stabile, unlösliche Proteinstruktur dar, die unterhalb der Plasmamembran gebildet ist und gegenüber Detergentien und Reduktionsmitteln beständig ist und den endgültig differenzierten Zellen der obersten Epidermisschicht Festigkeit und Steifigkeit verleiht. Zahlreiche CE-Komponenten, einschließlich TG_K, werden im Stratum spinosum synthetisiert, obgleich die Hülle nicht gebildet wird, bevor der Übergang der Zellen vom Stratum granulosum zum Stratum corneum erfolgt ist. TG_K findet sich auch in allen anschließenden Schichten der Epidermis (Michel et al., 1997; Mansbridge et al., 1987; Asselineau et al., 1989). Das Enzym ist inaktiv, bis in der letzten Differenzierungsstufe eine Verringerung des Zusammenhalts der Membran zu einem Einströmen von Calcium in die Zelle führt (Aeschlimann und Paulsson, 1994).
Mit der weiteren Differenzierung bilden Keratinozyten das Stratum granulosum. Zellen dieser Schicht sind durch besondere, elektronendichte Keratohyalin-Granalien charakterisiert, die Profilaggrin enthalten, den Proteinvorläufer von Filaggrin (Übersicht bei Dale et al., 1994). Granuläre Zellen enthalten ferner lipidgefüllte Granalien, die im Bereich der Übergangszone zwischen dem Stratum granulosum und dem Stratum corneum mit der Plasmamembran fusionieren und ihren Inhalt in den extrazellulären Raum freisetzen, was der Epidermisoberfläche eine hydrophobe Beschaffenheit verleiht.
Beim Übergang der differenzierenden Keratinozyten von der granulären zur verhornten Schicht wird das Profilaggrin unter Bildung von Filaggrin gespalten, das an der Ausrichtung und Aggregation (über Disulfidbindungen) von Keratinbündeln, die als Makrofibrillen bezeichnet werden, beteiligt ist (Übersicht bei Holbrook, 1994). Makrofibrillen sind die grundlegende Struktureinheit der verhornten Hülle. In normalen Hautschnitten ist Filaggrin in der granulären Schicht lokalisiert, wobei eine gewisse schwache, durchgehende Färbung in den verhornten Lagen vorliegt (Michel et al., 1997; Asselineau et al., 1989; Mansbridge et al., 1987). Es ist darauf hinzuweisen, dass Antikörper gegen Filaggrin sowohl Profilaggrin als auch dessen Spaltungsprodukte nachweisen, was für das starke, getüpfelte Färbemuster der Keratohyalin-Granalien des Stratum granulosum verantwortlich ist.
Bei der obersten Epidermisschicht handelt es sich um das Stratum corneum. Zellen dieser Schicht, bei denen der Differenzierungsvorgang beendet ist, haben ihren Kern und sämtliche Stoffwechselfunktionen verloren. Sie bestehen vorwiegend aus Keratinfilamenten, die von der nunmehr vollständigen CE und der darüber liegenden Plasmamembran eingeschlossen sind. Korneale Zellen sind miteinander durch modifizierte Desmosomen verbunden und werden letztlich in Form von Schichten von der Hautoberfläche abgestreift.
Keratinozyten bilden ferner Cadherin-Haftmoleküle. Die klassischen Cadherine, N-, E- und P-Cadherin, stellen eine Unterfamilie von Cadherinen dar, die an den Haftverbindungsstellen lokalisiert sind und die Zell-Zell-Haftung durch homotypische Wechselwirkungen vermitteln. Diese calciumabhängigen Transmembran-Glycoproteine spielen wichtige regulatorische Rollen bei der Gewebebildung und erleichtern interzelluläre Wechselwirkungen. Von Cadherin-Komplexen wird auch angenommen, dass sie an der Übertragung von intrazellulären Signalen über ihre Assoziation mit dem Actin-Zytoskelett beteiligt sind (Knudsen et al., 1998). Keratinozyten erzeugen sowohl E- als auch P-Cadherine. E-Cadherin tritt in sämtlichen lebenden Schichten der Epidermis auf (Übersicht bei Jensen und Wheelock, 1996), während P-Cadherin im Stratum basale und in den unmittelbaren suprabasalen Zellen auftritt.
Die Haut regeneriert sich alle 28 Tage (Übersicht bei Sams, 1996). Beim Verlust des Kontakts mit der Grundmembran bilden die basalen Keratinozyten Tochterzellen, die letztendlich bei der Wanderung nach oben durch die suprabasalen Schichten zur Hautoberfläche differenzieren. Die terminale Differenzierung beinhaltet eine Reihe von biochemischen und morphologischen Veränderungen, die zu einer Schicht aus toten, abgeflachten Schuppen führen, wobei diese Schicht die Barriereschicht und Schutzfunktionen der Haut ausübt. Die verhornten Zellen werden routinemäßig abgestreift und durch neuerdings differenzierte Zellen ersetzt, wobei das gesteuerte Gleichgewicht zwischen Proliferation und Differenzierung, das an der Gewebe-Homöostase beteiligt ist, aufrechterhalten wird.
Keratinozytenkultur
Seit mehr als zwei Jahrzehnten werden zur Untersuchung des Wachstums und der Differenzierung von Keratinozyten kultivierte Zellen, die aus disaggregierter humaner Haut isoliert worden sind, verwendet (Übersicht bei Leigh et al., 1994). Humane Vorhaut-Keratinozyten, die in Gegenwart einer 3T3-Mäuseembryo-Fibroblasten-Nährschicht oder in serumfreien Medienzubereitungen gezüchtet werden, weisen ein anhaltendes Wachstum für etwa 80 Populationsverdopplungen auf, bevor sie einen Alterungszustand erreichen (Übersicht bei Leigh und Watt, 1994). Unter diesen Bedingungen gezüchtete humane Keratinozyten können differenzierungsspezifische Proteine, wie Involucrin und die Keratine K1 und K10, in einer positionsspezifischen Weise exprimieren (Übersicht bei Fuchs und Weber, 1994).
Obgleich Merkmale einer squamösen Differenzierung und einer begrenzten Stratifizierung übereinstimmend in gezüchteten Keratinozyten-Monolayers beobachtet werden, ist eine normale Gewebearchitektur nicht ersichtlich. Die Feststellung, dass epidermale Zellen in herkömmlicher Submerskultur optimal wachsen, wenn sie oben auf nicht-proliferierende Fibroblasten ausgestrichen werden, stellte einen signifikanten Beitrag zur Untersuchung der Zellbiologie von Keratinozyten dar (Rheinwald, 1980; Übersicht bei Fuchs, 1993). Die Verwendung dieses Kultursystems ermöglichte es den Forschern, Keratinozyten für vielfältige Zwecke seriell zu kultivieren. Ungünstigerweise ermöglicht das submerse Züchtungssystem eine begrenzte, fehlerhafte Stratifizierung, die aus nur wenigen Schichten von Keratinozyten besteht, denen die spezifischen morphologischen und biochemischen Eigenschaften eines einwandfrei stratifizierten Epithels fehlen. Beispielsweise werden mehrere Marker der normalen epidermalen Differenzierung in Submerskultur nicht erzeugt, z. B. die Keratine 1 und 10 und der Marker des späten Stadiums, nämlich Filaggrin (Übersicht bei Fuchs, 1993). Mehrere Faktoren schränken dieses in vitro-System ein. Erstens liegt in vivo die Epidermis auf der Dermis und erhält ihre Nährstoffe und die Wachstumssignale über eine Diffusion aus der Dermis durch die Grundmembran in die darüber liegenden basalen Zellen. Dies führt zu einer Polarität des Gewebes, die bei herkömmlichen submersen Zellkulturen, die über sämtliche oberen Oberflächen des Badmediums versorgt werden, nicht erreicht werden kann. Zweitens erzeugen auf diese Weise gezüchtete Epithelzellen keine Grundmembran und es fehlt ihnen die Einwirkung ihrer normalen mesenchymalen Orientierungspunkte für die normale Differenzierung und das normale Wachstum (Übersicht bei Fusenig, 1994). Drittens fördert die Fibroblasten-"Feeder"-Schicht die Keratinozytenproliferation, wobei die Züchtung von Zellen auf diese Weise zu den gleichen fehlerhaften oder fehlenden Differenzierungseigenschaften führt, wie sie bei auf Kunststoffsubstraten gezüchteten Kulturen auftreten. Dies zeigt, dass Keratinozyten ein komplexeres Mesenchym von Fibroblasten und extrazelluläre Matrixproteine zur Erzeugung einer funktionsfähigen Epidermis benötigen. Demzufolge eignet sich das herkömmliche submerse Kultursystem nur für relativ einfache Untersuchungen.
Mehrere Systeme, die innerhalb der vergangenen 20 Jahre entwickelt und getestet worden sind, zielen auf die Entwicklung von stärker in vivo-artigen Keratinozyten-Züchtungsbedingungen ab. Im Jahre 1979 wurden erstmals Kollagengele als physiologische "Flöße" verwendet, auf denen Keratinozyten an der Luft-Medium-Grenzfläche wachsen (Bell et al., 1979; Übersicht bei Fusenig, 1994; Parenteau et al., 1992). Dadurch wurde es möglich, dass die Nährstoffe und Wachstumsfaktoren aus dem Medium durch das Kollagen zur Grundschicht der Keratinozyten diffundieren und die obersten Keratinozytenschichten der Luft ausgesetzt sind. Diese zusätzlichen in vivo-artigen Bedingungen verbesserten die histologische Architektur der gezüchteten Epidermis. Eine vollständige Stratifizierung und histologische Differenzierung kann unter Verwendung dieser dreidimensionalen "organotypischen" Kulturverfahren erreicht werden, die ständig modifiziert worden sind, um sich der in vivo-Wachstumsumgebung stärker anzunähern.
In späteren organotypischen Systemen wurden lebende Fibroblasten den Kollagengelen einverleibt und Keratinozyten wurden oben auf kontrahierte Kollagen-"Flöße" gesetzt und das gesamte Floß wurde an die Luft-Medium-Grenzfläche angehoben (Übersicht bei Fusenig, 1994), um intakte Haut nachzuahmen, wobei residente dermale Zellen, wie dermale Fibroblasten, an der Signalgebung für Keratinozyten beteiligt sind, um eine Grundmembran und ein Epithel mit einem erheblich verbesserten Differenzierungsprogramm zu erzeugen (Übersicht bei Watt und Hertle, 1994). Die lebensfähigen Fibroblasten sorgen für wertvolle Signale und eine Förderung der Erzeugung von Grundmembranproteinen durch gezüchtete Keratinozyten.
Keratinozytendifferenzierung
Sowohl in intakter Haut als auch in organotypischer Kultur erzeugen differenzierende Keratinozyten Proteine, die für bestimmte Differenzierungsstadien einzigartig sind. Das Vorliegen und die Lokalisierung dieser Proteinmarker kann unter Einsatz von biochemischen und immunohistochemischen Verfahren nachgewiesen werden und zur Feststellung, ob ein Epithelgewebe einer normalen Differenzierung (Stratifizierung) unterliegt, herangezogen werden. Die Expressionsprofile von mehreren derartigen Proteinen sind nachstehend angegeben.
Die am besten untersuchten Proteine zur Bestimmung der epidermalen Differenzierung sind die Keratine, insbesondere K5/14 und K1/10, die das intermediäre Filamentnetzwerk in epidermalen Keratinozyten bilden. Dieses Netzwerk sorgt für ein zelluläres Gerüst, das sich vom Nucleus auf spezifische Haftverbindungsstellen, die als Desmosomen und Hämidesmosomen bezeichnet werden, erstreckt (Übersicht bei Fuchs und Cleveland, 1998). Diese Zell-Zell- und Zell-Substrat-Wechselwirkungen sind bei Verbindung mit Keratinfilamenten für die Verankerung von Keratinozyten aneinander und an der darunterliegenden Grundmembran verantwortlich. Das K5/K14-Paar von Keratinfilamenten wird in den basalen Zellen von stratifizierten squamösen Epithelien exprimiert (Übersicht bei Fuchs, 1993). Erwartungsgemäß ist K14-mRNA nur in der basalen Schicht von normaler humaner Epidermis vorhanden (Stoler et al., 1988). Mit beginnender Differenzierung von basalen Zellen der Epidermis regulieren sie die Expression von K5/14 herunter und beginnen mit der Erzeugung von differenzierungsspezifischen Keratinen. Das K1/K10-Paar von Keratinfilamenten wird in den suprabasalen Schichten der Epidermis exprimiert (Übersicht bei Fuchs, 1993). K1 und K10 stellen frühe Marker der terminalen Differenzierung dar, da sie durch Keratinozyten beim Verlassen der basalen Schicht erzeugt werden. In Proben von intakter humaner Haut stammt K1 aus der ersten suprabasalen Schicht und zwar im Bereich der gesamten Oberfläche des Gewebes (Stoler et al., 1988; Stark et al., 1999; Asselineau et al., 1989; Boukamp et al., 1990).
In primären, humanen, organotypischen Keratinozytenkulturen ist die Initiation der K1-Proteinsynthese im Vergleich zu intakter Haut verzögert. Die Proteinlokalisierung beginnt 5–8 Zellschichten über der Grundmembran, im Gegensatz zu 1–2 Schichten bei normalen Hautproben. Die Induktion der K1-Erzeugung normalisiert sich nach Transplantation der organotypischen Kulturen auf Nacktmäuse (Smola et al., 1993; Stark et al., 1999). Diese Studien prüften nicht die K1-mRNA-Expression.
Involucrin ist in primären, organotypischen Keratinozytenkulturen (sogar in fixiertem Gewebe) an den suprabasalen Zellmembranen lokalisiert (Boukamp et al., 1990; Smola et al., 1993; Stark et al., 1999; Watt et al., 1987) und mehrere Arbeitskreise haben festgestellt, dass das membranartige Muster nach Transplantation auf Nacktmäuse bestehen blieb (Breitkreutz et al., 1997; Watt et al., 1987).
Die TG_K-Expression scheint in organotypischen Kulturen von normalen humanen Keratinozyten zu variieren, wobei sie zunächst entweder im Stratum spinosum oder im Stratum granulosum auftritt und sich nach oben bis zum Stratum corneum fortsetzt (Michel et al., 1997; Stark et al., 1999).
Organotypische Kulturen von normalen humanen Keratinozyten zeigen auch eine Lokalisierung von Filaggrin in den Granalien der obersten Schichten oder des epidermalen Gewebes (Boukamp et al., 1990; Michel et al., 1997; Stark et al., 1999).
Zusätzlich zu Differenzierungsmarkern kann man auch die strukturelle und funktionelle Integrität eines Epithelgewebes bestimmen, indem man das Auftreten und die Lokalisierung von Haftproteinen überwacht.
Bisher wurden weder E- noch P-Cadherin in organotypischer Kultur von primären Keratinozyten untersucht, obgleich E-Cadherin immunohistochemisch in normaler Haut nachgewiesen wurde (Haftek et al., 1996).
Smola und Mitarbeiter (Smola et al., 1998) haben klar nachgewiesen, dass organotypische Kulturen aus normalen dermalen Fibroblasten und Keratinozyten eine Grundmembranzone entwickeln, die dazu befähigt ist, für den Zelltyp spezifische Haftstrukturen, wie Hämidesmosomen, zu stützen.
WO-99/43787 befasst sich mit einem lebenden, chimären Hautersatz. Kurze zusammenfassende Darstellung der Erfindung Die vorliegende Erfindung lässt sich zusammenfassend so definieren, dass eine Kokultur von humanen, immortalisierten Keratinozytenzellen und humanen Donatorzellen in vorteilhafter Weise als eine chimäre Haut bei Hauttransplantationen und anderen Verfahren der plastischen Chirurgie verwendet wird.
Demzufolge wird erfindungsgemäß eine chimäre Haut bereitgestellt, die eine immortalisierte, humane Keratinozytenzelle in Kokultur mit Donator-Keratinozyten umfasst, wobei die Haut eine normale Gewebearchitektur und Differenzierungsmarker von stratifizierten, squamösen Epithelien umfasst, wobei die Expression und Position von Differenzierungsmarkern im späten Stadium typisch für intakte humane Haut sind.
Erfindungsgemäß wird ferner ein Verfahren zur Erzeugung einer chimären Haut bereitgestellt, das die gemeinsame Züchtung von immortalisierten, humanen Keratinozytenzellen und von von einem Patienten erhaltenen Keratinozyten in der Weise umfasst, dass eine chimäre Haut gebildet wird, wobei die Haut eine normale Gewebearchitektur und Differenzierungsmarker von stratifizierten, squamösen Epithelien umfasst, wobei die Expression und Position von Differenzierungsmarkern im späten Stadium typisch für intakte humane Haut sind.
Erfindungsgemäß wird ferner eine organotypische Kokultur bereitgestellt, die immortalisierte, humane Keratinozyten und Donator-Keratinozyten umfasst, wobei die Haut eine normale Gewebearchitektur und Differenzierungsmarker von stratifizierten, squamösen Epithelien umfasst, wobei die Expression und Position von Differenzierungsmarkern im späten Stadium typisch für intakte humane Haut sind.
Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung einer Haut, einer Monolayer oder einer organotypischen Kokultur gemäß der Erfindung bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Verwendung bei einem Verfahren zur Behandlung eines Patienten durch Hauttransplantation.
Weitere Ziele, Merkmale und Vorteile der Erfindung ergeben sich beim Studium der folgenden Beschreibung im Zusammenhang mit den beigefügten Zeichnungen.
Kurze Beschreibung der verschiedenen Darstellungen in den Zeichnungen
1 ist ein Fließdiagramm zur Herstellung einer organotypischen Kultur.
2A–H stellen einen Satz von Querschnitten des Kokulturgewebes dar. 2A und B sind NIKS^GFP-Zellen. 2C und D sind LAW-1-Keratinozyten. 2E und F zeigen ein 1:1-Verhältnis von NIKS^GFP- und LAW-1-EP-Keratinozyten. 2G und H zeigen ein 3:1- Verhältnis. 2A, C, E und G zeigen eine Färbung mit Hämatoxylin und Eosin. 2B, D, F und H zeigen eine Hoescht-Färbung zur Darstellung der Zellkerne.
3 ist ein Balkendiagramm zur Darstellung der Wachstumsgeschwindigkeit einer Monolayer-Kultur.
4 ist ein Balkendiagramm zur Darstellung der normierten Wachstumsgeschwindigkeit in Monolayer-Kultur.
5A–J zeigen einen Satz von Querschnitten zur Darstellung der immunohistochemischen Analyse von Differenzierungsmarkern und Haftmolekülen. 5A und B zeigen Keratin-1. 5C und D zeigen Transglutaminase-1. 5E und F zeigen Filaggrin. 5G und H zeigen E-Cadherin. 5I und J zeigen P-Cadherin. 5A, C, E, G und I zeigen eine Färbung mit Hämatoxylin und Eosin zur Darstellung der Gewebehistologie. 5B, D, F, H und J zeigen eine Darstellung unter Anwendung einer indirekten Immunofluoreszenztechnik.
6 ist ein Diagramm zur Darstellung der durchschnittlichen Wundkontraktionsfläche.
7A–C zeigen einen Satz von Darstellungen von Biopsieschnitten. 7A zeigt das in vivo-Erscheinungsbild. 7B zeigt die Färbung mit Hämatoxylin und Eosin zur Darstellung der Histologie. 7C zeigt die GFP-Expression.
8A und B zeigen einen Satz von Ansichten von Biopsieschnitten 28 Tage nach der Transplantation. 8A zeigt die Histologie. 8B zeigt die GFP-Expression.
9A, B und C zeigen einen Satz von Ansichten zur Analyse des x/y-Centromeren. 9A zeigt ein chimäres Diagramm nach 28 Tagen. 9B und C zeigen eine x/y-Centromeranalyse.
Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung beinhaltet die Verwendung einer Kombination von in vitro-gezüchteten, konditionell unsterblichen, humanen Träger-Keratinozyten und von einem Spenderpatienten abgeleiteten Keratinozyten zur Bildung von Hauttransplantaten. Wir beschreiben hier, dass derartige Träger-Keratinozyten, die von in vitro-Zellkulturquellen abgeleitet sind, in Kokultur mit Spenderpatienten-Keratinozyten unter Anwendung von Monolayer- oder organotypischen Kulturverfahren gezüchtet werden können, um eine für Transplantationszwecke geeignete manipulierte chimäre Haut zu erzeugen. Bei konditionell unsterblichen Keratinozyten handelt es sich um Keratinozyten, die unter definierten Wachstumsbedingungen unsterblich sind. Ein Keratinozyt wird als unsterblich angesehen, wenn er unter den definierten Wachstumsbedingungen für mehr als 20 Passagen, vorzugsweise mehr als 30 Passagen, insbesondere mehr als 40 Passagen und ganz besonders mehr als 50 Passagen gezüchtet werden kann. In der vorliegenden Anmeldung werden die Ausdrücke "konditionell unsterblich" und "unsterblich" in austauschbarer Weise verwendet. Bei den in vitro-gezüchteten, konditionell unsterblichen, humanen Träger-Keratinozyten handelt es sich um Produkte, die für den Transplantatempfänger allogen sind. Die vom Spender oder Patienten abgeleiteten Keratinozyten sind vorzugsweise für den Transplantatempfänger autolog.
Bei einigen bevorzugten Ausführungsformen wird die spontan immortalisierte NIKS-Zelllinie (Near-Diploid Immortalized Keratinocytes) als Quelle für Träger-Keratinozyten verwendet. NIKS-Zellen (ATCC CRL-12191) sind nicht mutagenen Mitteln ausgesetzt worden, besitzen Wildtyp-p53- und Rb-Gene, behalten ihre Zelltyp-spezifischen Wachstumsanforderungen und Differenzierungseigenschaften, sind bei Nackt- und SCID-Mäusen nicht-tumorigen, sind frei von Virus und bilden die Architektur von vollständiger Haut in Monolayer- und organotypischer Kultur ab und reagieren auf Wachstumsfaktoren, die das Keratinozyten-Wachstum regulieren, wie EGF und TGF-β1. Dies steht im Gegensatz zu HaCaT-Zellen (Boelsma et al., 1999; Schoop et al., 1999), die in späteren Passagen ein verankerungsunabhängiges Wachstum zeigen, einen hohen Kolonienbildungswirkungsgrad aufweisen, hohe Sättigungsdichten erreichen und für die serielle Züchtung keine zelltypspezifischen Kulturbedingungen benötigen (Fusenig und Boukamp, 1998).
Im Gegensatz zu anderen spontan immortalisierten Keratinozyten-Zelllinien, wie HaCaT, differenzieren NIKS-Keratinozyten im gleichen Umfang und mit der gleichen Geschwindigkeit wie die parentalen BC-1-Ep-Keratinozyten in organotypischer Kultur mit dermalen Fibroblasten unter Bildung eines stratifizierten Epithels, das histologisch identisch mit den BC-1-Ep-Zellen und mit anderen normalen Keratinozytenstämmen ist. Das mehrschichtige, keratinisierende Epithel ist hochgradig organisiert und weist Merkmale auf, die typisch für intakte Haut sind, wie Hämidesmosomen, Desmosomen, Keratin-Tonofilamente und Keratohyalin-Granalien. Sowohl die parentalen als auch die NIKS-Keratinozyten erzeugen Hämidesmosomen in organotypischer Kultur, was darauf schließen lässt, dass die Synthese, die Abscheidung und der Zusammenbau von extrazellulären Matrix-Glycoproteinen eingetreten ist.
In einer üblichen Monolayer- oder organotypischen Kokultur wachsen NIKS-Zellen nicht über die humanen Keratinozyten, zeigen keine fehlerhaften Differenzierungsprotein-Expressionsmuster (unter den getesteten Mustern) und befolgen die Gewebe-Kompartimentgrenzen, indem sie weder unter die Grundmembran gelangen noch ähnlich wie eine Tumorzelle wirken. NIKS-Zellen verursachen keine fehlerhafte Replikation von dermalen Fibroblasten im Kollagengel.
NIKS wurden ursprünglich aus neonataler Vorhaut gezüchtet und entwickelten anschließend eine spontane, stabile, genetische Addition des langen Arms von Chromosom 8, der es ermöglicht, dass diese Zellen in Kultur einen erheblichen Überlebensvorteil besitzen. Die US-Patente 5 989 837 und 6 214 567 beschreiben die Erzeugung und die Verwendung von NIKS-Zellen; es wird auch auf B. L. Allen-Hoffmann et al., "Normal Growth and Differentiation in a Spontaneously Immortalized Near-Diploid Human Keratinocyte Cell Line, NIKS", J. Invest. Dermatol., Bd. 114 (2000), S. 444–455, verwiesen, die geeignete Monolayer- und organotypische Züchtungsbedingungen für die konditionell unsterbliche Aufrechterhaltung der NIKS-Zellen beschreiben.
Derartige, manipulierte, chimäre Monolayer- und organotypische Zellkulturen und/oder manipulierte, chimäre, hautäquivalente Gewebetransplantate würden über besondere Eigenschaften zur Erzielung einer unmittelbaren Wundbedeckung und auch zur Bereitstellung von autologen Zellen für einen späten formalen Wundverschluss verfügen. Das neue, hautäquivalente Gewebe kann beispielsweise als Hautersatzprodukt unter Verwendung eines autologen (NIKS + Patientenzellen), allogenen (NIKS + nicht-verwandte Zellen an einem Patienten) oder xenogenen Transplantats (NIKS + Schweinezellen oder Primatenzellen) z. B. für einen Wundverschluss (diabetische Geschwüre, Hautverbrennungen, nekrotisierende Hautkrankheiten und dergl.) oder für kosmetische Zwecke (Gesichtsliftung, andere Verfahren der plastischen Chirurgie), verwendet werden. Das chimäre hautäquivalente Gewebe der Erfindung kann in Größen und Dicken bereitgestellt werden, die sich zur Verwendung bei Transplantationsverfahren und bei anderen Verfahren in der Weise eignen, in der der Fachmann bei derartigen Verfahren vorhandene Transplantate und Gewebe einsetzen würde.
Die vorliegende Erfindung ist jedoch nicht auf die Verwendung von NIKS-Zellen in chimärer Kokultur beschränkt. Tatsächlich betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung einer Vielzahl von weiteren konditionell unsterblichen, nicht-tumorigenen Trägerzellen und Zelllinien, die verhornte Hüllen bilden, wenn sie zur Differenzierung induziert werden, und die einer normalen squamösen Differenzierung unterliegen und zelltypspezifische Wachstumsanforderungen aufrechterhalten. Folgende weitere Quellen für derartige Zellen lassen sich erwähnen: Keratinozyten und dermale Fibroblasten, die durch Biopsie beim Menschen und verstorbenen Spendern gewonnen worden sind (Auger et al., In Vitro Cell. Dev. Biol.-Animal, Bd. 36, S. 96-103; US-Patente 5 968 546 und 5 693 332 ) sowie aus neonataler Vorhaut (Asbill et al., Pharm. Research, Bd. 17 (9) (2000), S. 1092-1097; Meana et al., Burns, Bd. 24 (1998), S. 621-630; US-Patente 4 485 096 , 6 039 760 und 5 536 656 , und immortalisierten Keratinozyten-Zelllinien, wie NM1-Zellen (Baden, In Vitro Cell. Dev. Biol., Bd. 23 (3) (1987), S. 205-213) und HaCaT-Zellen (Boucamp et al., J. Cell. Biol., Bd. 106 (1988), S. 761-771). Jede dieser Zelllinien kann gezüchtet oder genetisch modifiziert werden, wie es nachstehend ausführlich beschrieben wird. Der Umfang der Erfindung erstreckt sich auch auf die Verwendung von Zellen und Zelllinien, die direkt oder indirekt von den vorerwähnten geeigneten Zelltypen, einschließlich Derivaten von NIKS-Zellen, abgeleitet sind, wobei derartige Zellen und Zelllinien die Fähigkeit behalten, im erfindungsgemäßen Verfahren ihre Funktion zu erfüllen.
Allgemein ist das erfindungsgemäße Verfahren durch die folgenden Stufen gekennzeichnet: Man erhält eine in vitro-Träger-Keratinozytenkultur, vorzugsweise eine organotypische Kultur von immortalisierten Keratinozyten, wie NIKS-Zellen. Möglicherweise besteht der Wunsch zur genetischen Manipulation der gezüchteten Keratinozyten. Beispielsweise können die Zellen so manipuliert werden, dass sie ein Protein oder ein anderes Genprodukt exprimieren oder die Expression verstärken oder dass sie ein Protein oder Genprodukt unterdrücken. Zu weiteren Manipulationen können das Knock-in oder Knock-out (Ablation) eines Gens oder eine Mutation eines vorhandenen Gens oder Genprodukts gehören. Beispielsweise werden in einigen bevorzugten Ausführungsformen entweder die Träger-Keratinozytenzellen oder die vom Patienten abgeleiteten Zellen mit einem Gen von Interesse transfiziert oder transformiert (beispielsweise mit dem Gen, das für den humanen Krüppel artigen Faktor (GKLF) 4) kodiert. In weiteren bevorzugten Ausführungsformen ist das Gen von Interesse funktionell mit einem Promotor in einem geeigneten Vektor verknüpft. In einigen bevorzugten Ausführungsformen werden gewebespezifische Promotoren, wie die Involucrin- oder Transglutaminase 3-Promotoren verwendet. In weiteren Ausführungsformen wird die Expression von GKLF durch das induzierbare Promotorsystem des pTetOn-Plasmids (Clontech, Palo Alto, CA) gesteuert. In weiteren bevorzugten Ausführungsformen kann ein konstitutiver Promotor verwendet werden. Es kommt in Betracht, dass auch andere Säugetier-Expressionsvektoren für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, einschließlich (ohne Beschränkung hierauf) pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, PXT1, pSG (Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG und pSVL (Pharmacia). Beliebige weitere Plasmide oder Vektoren können verwendet werden, sofern sie im Wirt replizieren und lebensfähig bleiben können. Bei einigen bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfassen die Säugetier-Expressionsvektoren eine Replikationsursprungsstelle, einen geeigneten Promotor und Enhancer und etwaige erforderliche Ribosomenbindungsstellen, Polyadenylierungsstellen, Spleißdonator- und -akzeptorstellen, transkriptionelle Terminationssequenzen und 5'-flankierende, nicht-transkribierte Sequenzen. Bei anderen Ausführungsformen können DNA-Sequenzen, die sich von SV40-Spleißstellen und Polyadenylierungsstellen ableiten, zur Bereitstellung der erforderlichen, nicht-transkribierten, genetischen Elemente verwendet werden. Ferner kann das KLF 4-Gen über einen retroviralen Vektor inseriert werden. Eine Transfektion kann durch beliebige bekannte Verfahren erreicht werden, einschließlich (ohne Beschränkung hierauf) die Calciumphosphat-Kopräzipitation, die Elektroporation, das Mikroteilchen-Bombardement, die durch Liposomen vermittelte Transfektion oder die retrovirale Infektion.
Bei weiteren Ausführungsformen wird das Transplantat so manipuliert, dass es für ein Subjekt ein therapeutisches Mittel ergibt. Die vorliegende Erfindung ist nicht auf die Abgabe beliebiger spezieller therapeutischer Mittel beschränkt. Tatsächlich kommt es in Betracht, dass eine Vielzahl von therapeutischen Mitteln an das Subjekt abgegeben werden kann, einschließlich (ohne Beschränkung hierauf) Enzyme, Peptide, Peptidhormone, andere Proteine, ribosomale RNA, Ribozyme und antisense-RNA. Diese therapeutischen Mittel können für eine Vielzahl von Zwecken abgegeben werden, einschließlich (ohne Beschränkung hierauf) zur Korrektur von genetischen Defekten. Bei einigen speziellen, bevorzugten Ausführungsformen wird das therapeutische Mittel mit dem Ziel der Detoxifizierung eines Patienten mit einem ererbten, angeborenen Stoffwechselfehler (z. B. Aminoacidopathese) abgegeben, wobei das Transplantat als Wildtypgewebe dient. Es kommt in Betracht, dass die Abgabe des therapeutischen Mittels den Defekt korrigiert. Bei einigen Ausführungsformen umfassen die zur Bildung des Hautäquivalents verwendeten Keratinozyten ein Polynucleotid, das für ein therapeutisches Mittel (z. B. Insulin, Gerinnungsfaktor IX, Erythropoetin und dergl.) kodiert, wobei das Hautäquivalent dem Subjekt transplantiert wird. Das therapeutische Mittel wird sodann in den Blutkreislauf des Patienten oder an Gewebe aus dem Transplantat abgegeben. Bei bevorzugten Ausführungsformen ist das Polynucleotid, das für das therapeutische Mittel kodiert, funktionell mit einem geeigneten Promotor verknüpft. Die vorliegende Erfindung ist nicht auf die Verwendung eines speziellen Promotors beschränkt. Tatsächlich kommen eine Vielzahl von Promotoren in Betracht, einschließlich (ohne Beschränkung hierauf) induzierbare, konstitutive, gewebespezifische und keratinozytenspezifische Promotoren. In einigen Ausführungsformen wird die Nucleinsäure, die für das therapeutische Mittel kodiert, direkt in Keratinozyten eingeführt (d. h. durch Calciumphosphat-Kopräzipitation oder über Liposomentransfektion). Bei weiteren bevorzugten Ausführungsformen wird die Nucleinsäure, die für das therapeutische Mittel kodiert, als Vektor bereitgestellt und der Vektor wird in die Keratinozyten nach bekannten Verfahren eingeführt. Bei einigen Ausführungsformen handelt es sich beim Vektor um einen episomalen Vektor, z. B. um ein Plasmid. Bei weiteren Ausführungsformen integriert sich der Vektor in das Genom der Keratinozyten. Zu Beispielen für integrierende Vektoren gehören (ohne Beschränkung hierauf) retrovirale Vektoren, Adeno-assoziierte Virusvektoren und Transposon-Vektoren.
Bei einigen weiteren Ausführungsformen können Techniken, z. B. eine homologe Rekombination, zum Knock-in oder Knock-out von Genen verwendet werden. Bei besonders bevorzugten Ausführungsformen werden die Gene für α-2-Makroglobulin oder die Gene für den Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) deletiert oder inaktiviert. Techniken und Reagenzien für die homologe Rekombination sind in den US-Patenten 5 416 260 , 5 965 977 und 5 981 214 beschrieben.
Anschließend wird ein Patient identifiziert und Zellen für die Kokultur werden isoliert. Zur Züchtung von humanen Keratinozyten in Monolayerkultur wird eine Gewebeprobe gewonnen. Keratinozyten werden aus humaner Haut oder anderen stratifizierten squamösen Epithelien isoliert. Keratinozytenkulturen werden gebildet, indem man Aliquotanteile einer Einzelzellsuspension in Gegenwart von mit Mitomycin C behandelten Swiss-Mäuse-3T3-Fibroblasten gemäß Literaturangaben ausstreicht (Allen-Hoffmann und Rheinwald, 1984). Das übliche Keratinozyten-Kulturmedium besteht aus einem Gemisch von Ham F-12-Medium und Dulbecco-modifiziertem Eagle-Medium (DME) (3:1, endgültige Calciumkonzentration 0,66 mM), das mit 2,5 % fötalem Kälberserum (FCS), 0,4 μg/ml Hydrocortison (HC), 8,4 ng/ml Cholera-Toxin (CT), 5 μg/ml Insulin (Ins), 24 μg/ml Adenin (Ade), 10 ng/ml epidermalem Wachstumsfaktor (EGF), 100 Einheiten Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin (P/S) ergänzt ist. Die Zellen werden routinemäßig in wöchentlichen Abständen in Mengen von 3 × 10⁵ Zellen pro 100 mm-Gewebekulturschale (Aufteilung etwa 1:25) einer Subkultur mit einer mit Mitomycin C behandelten Feeder-Layer unterzogen. Rekombinanter humaner EGF und transformierender Wachstumsfaktor-β1 (TGF-β1) werden von R & D Systems (Minneapolis, MN) bezogen.
Zur Herstellung einer chimären Kultur von Donator-Keratinozyten und Träger-Keratinozyten, vorzugsweise NIKS-Keratinozyten, wird das angestrebte Verhältnis von Donator-Keratinozyten und Träger-Keratinozyten zum Zeitpunkt der Subkultur oder zu einem beliebigen anderen Zeitpunkt während des Züchtungsvorgangs angewandt. Beispielsweise können NIKS-Zellen zu einer adhärenten Donator-Keratinozyten-Kultur gegeben werden, Donator-Keratinozyten können zu einer adhärenten NIKS-Monolayer-Kultur gegeben werden oder die Trägerzellen und die Donator-Keratinozyten können zum Zeitpunkt der Subkultur miteinander vermischt werden.
Bei einigen bevorzugten Ausführungsformen für die Züchtung der Träger-Keratinozytenzellen (z. B. NIKS-Zellen) und der Patienten-Keratinozyten in organotypischer Kultur, wird eine Kollagen-Grundlage durch Vermischen von normalen humanen Fibroblasten mit Typ I-Kollagen in Ham F-12-Medium mit einem Gehalt an 10 % FCS und P/S gebildet. Die Kollagen-Grundlage überlässt man einer 5-tägigen Kontraktion, um kontrahierte Kollagen-Flöße zu bilden. Die Patienten-Keratinozyten und die NIKS-Keratinozyten werden auf den kontrahierten Kollagen-Flößen in einer Menge von 3,5 × 10⁵ Zellen in 50 μl eines Gemisches aus Ham F-12 und DME (3:1, endgültige Calciumkonzentration 1,88 mM), das mit 0,2 % FCS, 0,4 μg/ml HC, 8,4 ng/ml CT, 5 μg/ml Ins, 24 μg/ml Ade und P/S ergänzt ist, ausgestrichen. Man lässt die Zellen 2 Stunden anhaften, bevor die Kulturkammer mit Medium geflutet wird (Tag 0). An den Tagen 1 und 2 werden die Zellen erneut versorgt. Am Tag 4 werden die Zellen mit Wattebäuschen an die Luftgrenzfläche angehoben und auf ein Verhornungsmedium mit einem Gehalt an Ham F-12 und DME (3:1, endgültige Calciumkonzentration 1,88 mM), das mit 2 % FCS, 0,4 μg/ml HC, 8,4 ng/ml CT, 5 μg/ml Ins, 24 μg/ml Ade und P/S ergänzt ist, übertragen. Zellen werden alle 3 Tage mit Verhornungsmedium versorgt, bis eine vollständige Stratifizierung erreicht ist (etwa 15 Tage). Eine erfolgreiche Monolayer-Kultur lässt sich visuell aufgrund der Anwesenheit von Keratinozyten in der Kulturschale feststellen. Eine erfolgreiche organotypische Kultur wird durch Feststellung der Verhältnisse von von Patienten abgeleiteten Keratinozyten zu Träger-Keratinozyten identifiziert.
Die hier beispielhaft aufgeführten Verhältnisse von von Patienten abgeleiteten Keratinozyten zu Träger-Keratinozyten sollen keine Beschränkung darstellen. Tatsächlich ist es auf der Grundlage der hier aufgeführten Richtlinien klar, dass eine Vielzahl von Verhältnissen bei der Ausübung der vorliegenden Erfindung angewandt werden können. Demzufolge beträgt in einigen Ausführungsformen ein geeignetes Verhältnis von von Patienten abgeleiteten Keratinozyten zu Träger-Keratinozyten etwa 0,5 %:99,5 % bis etwa 80 %:20 %, vorzugsweise etwa 10 %:90 % bis etwa 60 %:40 % und insbesondere etwa 20 %:80 %.
Ein erfindungsgemäßes Hauttransplantat weist die Gewebearchitektur und die Differenzierungs- und Adhäsionsmarker von normaler Haut auf. Vorzugsweise kann ein erfindungsgemäßes Hauttransplantat rascher gezüchtet werden, als Hauttransplantate, die aus vom Patienten abgeleiteter Haut hergestellt werden.
Organotypische, chimäre Kokulturen von Donator- und Träger-Keratinozyten und die sich ergebenden erfindungsgemäßen Hauttransplantate zeigen eine Gewebearchitektur, die eine enge Ähnlichkeit mit der Architektur von normaler Haut und mit organotypischen humanen Keratinozyten-Kulturen aufweist, und zwar im wesentlichen gemäß den vorstehenden Angaben über den Hintergrund der Erfindung und gemäß der Darstellung in 5, wobei die typischen Variationen, die in organotypischen Kulturen beobachtet werden, berücksichtigt werden. Beispielsweise wurden organotypische, chimäre Kokulturen von primären humanen Keratinozyten und NIKS-Zellen in Paraffin eingebettet, geschnitten und mit Hämatoxylin und Eosin für die histologische Prüfung gefärbt. Die Kokulturen weisen ein diskretes Stratum basale, das aus säulenförmigen basalen Zellen besteht, auf. Das darüber liegende Stratum spinosum ist aus mehreren größeren, progressiv abgeflachten Zellschichten zusammengesetzt. Die oberen Schichten zeigen eine granuläre Schicht mit Hämatoxylin-gefärbten Keratohyalin-Granalien.
Die Kulturen weisen eine normale Verteilung von zelltypspezifischen Proteinen in Assoziation mit verschiedenen Stadien der squamösen Differenzierung auf. Die Lokalisierung von Differenzierungsmarkern wurde unter Anwendung von indirekter Immunofluoreszenz sichtbar gemacht. Der Differenzierungsmarker des frühen Stadiums Keratin 1 erscheint als eine diffuse zytoplasmatische Färbung in sämtlichen Zellkulturen, wobei die Expression in der ersten oder zweiten suprabasalen Zellschicht initiiert wird und sich nach oben durch das Stratum fortsetzt.
Die Immunofluoreszenzfärbung zeigt eine diffuse, zytoplasmatische Proteinlokalisierung von Involucrin, die in den ersten suprabasalen Zellschichten beginnt. NIKS-Kulturen weisen eine identische räumliche Lokalisierung von Involucrin nach 8, 11 und 13 Tagen wie nach 21 Tagen auf (Loertscher et al., 2000). Frühere Analysen von intakten, normalen, humanen Hautproben haben die erwartete zytoplasmatische Lokalisierung von Involucrin gezeigt (Mansbridge und Knapp, 1987; Murphy et al., 1984). Unsere Daten zeigen, dass das Involucrin-Protein erwartungsgemäß im zytoplasmatischen Kompartiment lokalisiert ist. Dieser Befund stützt unsere Aussage über eine normale, in vivo-artige Differenzierung von chimären, organotypischen Kulturen von humanen Keratinozyten und NIKS-Keratinozyten.
Der intermediäre Differenzierungsmarker TG_K zeigt identische Lokalisierungsmuster und eine identische Intensität in chimären, organotypischen NIKS- und humanen Keratinozyten-Kulturen (5). Ihr deutliches, bienenwabenartiges Erscheinungsbild spiegelt die Lokalisierung des membrangebundenen TG_K Enzyms wider.
Der Differenzierungsmarker des späten Stadiums Filaggrin ist in den Keratohyalin-Granalien in den Zellen des Stratum granulosum von NIKS- und primären Keratinozyten-Flößen lokalisiert, wie sich durch das punktförmige Färbungsmuster zeigt (5). Chimäre organotypische Kulturen von humanen Keratinozyten und NIKS-Keratinozyten zeigten eine normale räumliche Lokalisierung von Filaggrin (5) nach 15 Tagen.
Zur Bestimmung der Anwesenheit und Lokalisierung von E- und P-Cadherin bediente man sich ferner der Immunohistochemie. In den erfindungsgemäßen Kokulturen tritt E-Cadherin in den Regionen des Zell-Zell-Kontakts in sämtlichen Kulturen auf, wobei die Expression in der unmittelbaren suprabasalen Schicht beginnt und sich nach oben durch die lebenden Schichten fortsetzt (5). Das Expressionsmuster von P-Cadherin ist ferner in sämtlichen Kulturen ähnlich, wird aber im Stratum basale initiiert und setzt sich nur durch einige der ersten suprabasalen Schichten fort (5). Diese Befunde spiegeln die Befunde wider, die bei intakter Haut beobachtet wurden, und zeigen, dass chimäre, organotypische, humane Keratinozyten- und NIKS-Keratinozyten-Kulturen ein entsprechendes Muster von Cadherin-Molekülen erzeugen, verglichen mit organotypischen Kulturen von humanen Keratinozyten allein und/oder intakter humaner Haut.
Ein vollständigeres Verständnis der vorliegenden Erfindung ergibt sich bei Berücksichtigung der folgenden, nicht beschränkenden Beispiele.
Beispiele Verfahren Zellkulturverfahren
Donator-Keratinozyten (GS-1-EP, LAW-1-EP) wurden aus der Vorhaut von Neugeborenen isoliert. Proben wurden nach Zirkumzision gemäß den Richtlinien des Human Subjects Committee and Institutional Biosafety Committee erhalten. GS-1-EP-, LAW-1-EP- und NIKS-Keratinozyten-Kulturen wurden durch Ausstreichen von Aliquotanteilen einer Einzelzellsuspension in Gegenwart von mit Mitomycin C behandelten Swiss-Mäuse-3T3-Fibroblasten (mito-3T3) gemäß Literaturangaben (6) gebildet. Das übliche Keratinozyten-Kulturmedium bestand aus einem Gemisch von Ham-F-12-Medium und Dulbecco-modifiziertem Eagle-Medium (DME) (3:1, endgültige Calciumkonzentration 0,66 mM), das mit 2,5 % fötalem Kälberserum (FCS), 0,4 μg/ml Hydrocortison (HC), 8,4 ng/ml Cholera-Toxin (CT), 5 μg/ml Insulin (Ins), 24 μg/ml Adenin (Ade), 10 ng/ml epidermalem Wachstumsfaktor (EGF), 100 Einheiten Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin (P/S) ergänzt war. Die Zellen wurden in wöchentlichen Abständen in einer Menge von 3 × 10⁵ Zellen pro 100 mm-Gewebekulturschale (Aufteilung etwa 1:25) einer Subkultur mit einer mito-3T3-Feeder-Layer unterzogen.
Erzeugung von NIKS, die grün fluoreszierendes Protein exprimieren (NIKS^GFP)
Plasmid-DNA wurde unter Verwendung des Endotoxin-Free-Maxiprep-Kits (Qiagen, Valencia, CA) hergestellt. pGreenLantern (Gibco-BRL, Rockville, MD) und pcDNA3neo (Invitrogen, Carlsbad, CA) wurden unter Verwendung der Restriktionsenzyme XmnI bzw. BglII (Promega, Madison, WI) linearisiert. Eine Gesamtmenge von 20 μg DNA (15 μg pGreenLantern und 5 μg pcDNA3neo) wurde für die Transfektion von NIKS-Zellen im Verhältnis von 3:1 pGreenLantern zu pcDNA3neo verwendet. NIKS wurden in einer Dichte von 3 × 10⁵ Zellen auf eine mito-3T3-Feeder-Layer in 100 mm-Schalen ausgestrichen. Man ließ die Zellen 48 Stunden anhaften, wonach die mito-3T3-Schicht mit 0,5 mM EDTA entfernt wurde. NIKS-Zellen nach 30–40 Passagen wurden unter Verwendung des polykationischen Lipids GeneFECTOR (VennNova, Miami, FL) transfiziert. Das Transfektionsgemisch wurde hergestellt, indem man linearisierte Plasmid-DNA und GeneFECTOR zu sterilem milli-Q-Wasser in einem Endvolumen von 500 μl zu jeder 100 mm-Schale gab. Das Transfektionsgemisch wurde vorsichtig aufgewirbelt und 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. NIKS-Zellen wurden 2-mal mit DME gespült und erneut mit 5 ml DME versorgt. 500 μl Transfektionsgemisch wurden tropfenweise zu jeder 100 mm-Platte gegeben und die Zellen wurden 5 Stunden bei 37°C unter 5 % CO₂ inkubiert. Sodann wurde das Medium entfernt und die Zellen wurden 2-mal mit DME gespült und erneut mit serumhaltigem Medium versorgt. 24 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen mit einem invertierten IX-70-Fluoreszenzmikroskop (Olympus, Melville, NY), das mit einem GFP-Kurzband-Passfilter ausgestattet war, betrachtet, um die GFP-Expression vor der Analyse durch fließaktivierte Zellsortierung (FACS) festzustellen.
Bestimmung der Wachstumsgeschwindigkeiten von chimären Kulturen auf Keratinozyten
NIKS^GFP, LAW-1-EP und GS-1-EP wurden getrennt ausgestrichen und in einem Verhältnis von 1:1, 1:10 und 1:100 (NIKS^GFP: GS-1-EP oder LAW-1-EP) vermischt. Die Zellen wurden in einer endgültigen Konzentration von 10⁵ Zellen/60 mm-Schale im Dreifachversuch auf einer 3T3-Feeder-Layer ausgestrichen und nach 4 Tagen ausgezählt. Die Experimente wurden 2-mal mit NIKS^GFP und GS-1-EP und 1-mal mit LAW-1-EP wiederholt. Die Ergebnisse wurden in Bezug auf die Differenzen des Ausstreichwirkungsgrads zwischen verschiedenen Stämmen von Keratinozyten normiert.
Organotypische Züchtungsverfahren
Organotypische Kulturen wurden gemäß Literaturangaben (7) in Transwell-Kulturkammern unter Einhaltung der folgenden Änderungen gezüchtet: eine Kollagengrundlage wurde durch Vermischen von normalen, humanen, neonatalen Fibroblasten, Stamm CI-1-F, mit Rattenschwanz-Sehnen-Kollagen vom Typ I in Ham F-12-Medium mit einem Gehalt an 10 % FCS und P/S gebildet. Die Kollagengrundlage ließ man 4 bis 7 Tage kontrahieren. LAW-1-EP, GS-1-EP und NIKS^GFP (Passage 47) wurden getrennt und in den folgenden Verhältnissen ausgestrichen: (90 % NIKS^GFP, 10 % LAW-1-EP), (87,5 % NIKS^GFP, 12,5 % LAW-1-EP), (75 % NIKS^GFP, 25 % LAW-1-EP), (50 % NIKS^GFP, 50 % LAW-1-EP). Insgesamt 3,5 × 10⁵ Zellen wurden auf die kontrahierte Kollagengrundlage in 50 μl eines Gemisches aus Ham F-12 und DME (3:1, endgültige Calciumkonzentration 1,88 mM), ergänzt mit 0,2 % FCS, 0,4 μg/ml HC, 8,4 ng/ml CT, 5 μg/ml Ins, 24 μg/ml Ade und P/S, ausgestrichen. Mann ließ die Zellen 2 Stunden anhaften, bevor die Kulturkammer mit Medium geflutet wurde (Tag 0). Am Tag 2 wurden die Zellen erneut versorgt. Am Tag 4 wurden die Zellen mit Wattebäuschen an eine Luft/Medium-Grenzfläche angehoben und auf Verhornungsmedium mit einem Gehalt an Ham F-12 und DME (3:1, endgültige Calciumkonzentration 1,88 mM), ergänzt mit 2 % FCS, 0,4 μg/ml HC, 8,4 ng/ml CT, 5 μg/ml Ins, 24 μg/ml Ade und P/S, übertragen. Die Zellen wurden alle 3 Tage mit Verhornungsmedium versorgt und am Tag 16 geerntet (1).
Verfahren der Histologie und Immunohistochemie
Probestücke wurden 2 Stunden mit 1 % Paraformaldehyd fixiert. Bei der Präparation zum Einfrieren wurden Kulturen über Nacht bei 4°C in 20 % Saccharose/PBS submers gehalten, bevor sie in OCT in einem über flüssigem Stickstoff gekühlten Isopentanbad eingefroren wurden. Kryokonservierte Kulturen und Transplantatbiopsien wurden seriell geschnitten (5 μm, auf Glasobjektträgern montiert, mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt und mit einem invertierten Olympus IX-70-Mikroskop betrachtet. Bilder wurden mit einer DEI-750-Kamera (Optronics Engineering) und Image-Pro Plus-Software (Media Cybernetics, Silver Spring, MD) aufgenommen. Für die immunohistochemische Analyse von Differenzierungsmarkern wurden kryokonservierte Gewebe seriell geschnitten (5 μm), auf Glasobjektträger montiert und kurz in Aceton von –20°C fixiert. Die Schnitte wurden mit PBS gewaschen, mit 3 % normalem Ziegenserum (Sigma, St. Louis, MO) blockiert und 1 Stunde mit primärem Antikörper inkubiert. Die primären Antikörper umfassten: anti-Keratinozyten-Transglutaminase (Verdünnung 1:100) (Biomedical Technologies Inc., Stoughton, MA), anti-Filaggrin (Verdünnung 1:250) (Biomedical Technologies Inc., Stoughton, MA), anti-Keratin-1 (Verdünnung 1:50) (Novo Castra, Newcastle upon Tyne, UK), anti-E-Cadherin (Verdünnung 1:80) (Transduction Laboratories, Lexington, KY), anti-P-Cadherin (Verdünnung 1:20) (Transduction Laboratories, Lexington, KY) und anti-Involucrin (Verdünnung 1:5000) (Sheibani, 1994). Die Schnitte wurden sodann mit mit Alexa 594 konjugiertem Immunoglobulin G (Verdünnung 1:1000) (Molecular Probes, Eugene, OR) inkubiert und mit Hoechst 33258 (1 μg/ml) gegengefärbt. Sämtliche Inkubationen wurden bei Raumtemperatur durchgeführt, mit Ausnahme der Inkubation des primären anti-P-Cadherin-Antikörpers, die bei 37°C erfolgte. Die Schnitte wurden mit einem invertierten Olympus IX-70-Mikroskop, das mit FITC und Hoechst-Bandpassfiltern ausgestattet war, betrachtet. Bilder wurden mit einer DEI-750-Kamera (Optronics Engineering) und Image-Pro-Plus-Software (Media Cybernetics, Silver Spring, MD) aufgenommen.
Transplantieren von chimären organotypischen Kulturen
Die Experimente unter Verwendung von athymischen Nu/Nu-Mäusen (Alter 5 Wochen), die von Harlan Sprague Dawley erhalten worden waren, wurden gemäß den Bestimmungen der University of Wisconsin Animal Research und unter Einhaltung der Regeln des Animal Care and Use Committee durchgeführt. Die Mäuse wurden unter Verwendung von 3 % Isofluran zur Einleitung der Anästhesie betäubt und sodann für die Dauer des Vorgangs unter 1,5 %-2,5 % Isofluran gehalten. Bei den Mäusen wurde ein Toe-Pinch durchgeführt, um den Grad der Anästhesie vor Beginn des Transplantationsvorgangs zu bestimmen. Ein postoperatives Schmerzmanagement wurde mit Buprenorphin (0,05 μg/kg subkutan) gelindert. Antibiotika (Sulfamethoxazol und Trimethoprim, 200 mg/40 mg pro 5 ml) wurden während der ersten 3 Tage nach der Operation im Trinkwasser (10 ml/250 ml H₂O) verabreicht. Die Mäuse wurden vor der Inzision mit 4 % Chlorhexidin-gluconat (Zeneca Pharmaceuticals, Wilmington, DE) gereinigt und mit steriler Kochsalzlösung gespült. Hautdefekte wurden am Rücken der Mäuse veranlasst. Die organotypisch gezüchteten Transplantate wurden mit der dermalen Seite nach unten platziert und mit Nylon-Nähten gesichert. Aquaphor-Gaze (Beiersdorf-Jobst Inc, Rutherford College, NC) die mit Bacitracin-zink-(500 Einheiten) und Polymyxin b-sulfat-(10 000 Einheiten)-Salbe (E. Fougera, Melville, NY) imprägniert war, wurde auf den Transplantaten angebracht. Xeroform-Gaze (3 % Wismuth-tribromphenat) (Sherwood Medical, St Louis, MO) wurde oben auf das Transplantat gelegt.
Eine weitere Schicht von Spandex-Gewebe wurde aufgelegt, um die Mäuse von der Entfernung der Bandagen abzuhalten. Die Mäuse wurden während einer 1-wöchigen postoperativen Periode täglich beobachtet. Danach wurden die Mäuse erneut auf die vorstehend angegebene Weise betäubt und die Bandagen wurden entfernt. Transplantat-Biopsien wurden in Abständen von 7, 14 und 28 Tagen nach Einschläferung in einer CO₂-Kammer gewonnen.
Ergebnisse
Erzeugung von NIKS, die grün fluoreszierendes Protein exprimieren (NIKS^GFP)
Wir führten eine gentechnische Manipulation der NIKS-Zellen durch, um das exogene Gen für grün fluoreszierendes Protein (GFP) zu exprimieren. Die Zellen wurden in wöchentlichen Abständen in einer Menge von 3 × 10⁵ Zellen pro 100 mm-Gewebekulturschale zusammen mit einer mito-3T3-Feeder-Layer einer Subkultur unterzogen. NIKS^GFP stellten ein wichtiges zelluläres Reagenz für zahlreiche Gesichtspunkte dieses Projekts dar und ermöglichten die Visualisierung unter dem Fluoreszenzmikroskop (2). NIKS^GFP zeigen Wachstums- und Differenzierungseigenschaften, die identisch mit denen von nicht-transfizierten NIKS-Zellen sind.
Bewertung der Keratinozyten-Wachstumsgeschwindigkeiten bei chimärer Züchtung
Monolayer-Kulturtechniken dokumentierten die Bildung von zusammenhängenden, chimären, epithelialen Lagen von GFP exprimierenden NIKS-Zellen und humanen Donator-Keratinozyten. Eine gemeinsame Züchtung von NIKS^GFP-Zellen mit anderen Stämmen von Keratinozyten beeinflussten die Wachstumsgeschwindigkeit von keinem der Keratinozytenstämme in Monolayer-Kultur. NIKS^GFP-Subkulturen erreichen eine 90%ige Konfluenz mit einer langsameren Geschwindigkeit als LAW-1-EP oder GS-1-EP, d. h. sie weisen eine langsamere Wachstumsgeschwindigkeit in Monolayer-Kultur auf (3). Normierte Ergebnisse zeigen keinen Einfluss der chimären Züchtung bei Verhältnissen von 1:1, 1:10 und 1:100 auf die Wachstumsgeschwindigkeiten in Monolayer-Kultur (4).
Histologische und immunohistochemische Analyse von organotypischen Kulturen
Organotypische in vitro-Kulturen von chimären NIKS^GFP/LAW-1-EP zeigen ein normales Wachstum und eine normale Architektur in Verhältnissen von 1:1 und 3:1 (2). Organotypische Kulturen von NIKS^GFP und GS-1-EP zeigten ebenfalls bei Färbung mit Hämatoxylin und Eosin eine normale Architektur bei Verhältnissen von 1:1, 10:1 und 100:1. Eine immunohistochemische Analyse von Differenzierungsmarkern und Haftmolekülen ist in 5 dargestellt. Keratin 1 und der membranassoziierte Differenzierungsmarker Transglutaminase-1 wurden in einer suprabasalen Position festgestellt. Transglutaminase-1 ist klar in Ringen ersichtlich, die mit der Zellmembran assoziiert sind. Die Filaggrin-Färbung ist in entsprechender Weise auf die granuläre Schicht begrenzt. Eine Analyse von Haftmolekülen zeigt, dass die P-Cadherin-Expression in entsprechender Weise auf die basale Schicht begrenzt ist und die Expression von E-Cadherin in der gesamten Epidermis lokalisiert ist.
Transplantieren von chimären, organotypischen Kulturen
Die gezüchteten Transplantate zeigen bemerkenswerte Anwendungsmöglichkeiten. Sie ließen sich leicht handhaben und konnten leicht auf ein Wundbett übertragen werden. Transplantate rissen bei Näh- oder Stapelvorgängen nicht und wurden in erfolgreicher Weise in Verhältnissen von 2:1 mit einer Nicht-Crushing-Mesher-Vorrichtung (Brennan Medical, St. Paul, MN) einem Meshing unterzogen. Eine erhebliche anfängliche Transplantatkontraktion trat mit einer Stabilisierung der Transplantatgröße nach 20 Tagen auf (6). Transplantatbiopsien zeigten eine normale Gewebearchitektur und normale GFP-Expression nach 7 und 28 Tagen (7, 8). Eine X-Y-Centromer-Analyse bestätigte die Anwesenheit von humanen Zellen (9).
Diskussion
Patienten mit katastrophalen Verbrennungen weisen keine ausreichenden Donatorstellen auf, die zur Bedeckung der Empfängerstellen verfügbar sind. Derartige Techniken zur Hautrestrukturierung können für Verbrennungspatienten lebensrettend sein, obgleich noch erhebliche Probleme bestehen bleiben. Der Haupthinderungsgrund für die Verwendung von autolog gezüchteten Keratinozyten ist die Verzögerung, die sich für die klonale Expansion ergibt. Häufig entwickeln die Patienten eine unkontrollierte Sepsis, bevor gezüchtete Transplantate verfügbar sind. Somit stellt die Verkürzung der Züchtungszeit, die für die Erzeugung von autologen Hauttransplantaten erforderlich ist, eine grundlegende Verbesserung der Patientenversorgung dar.
Die Erfinder haben gezeigt, dass NIKS-Zellen in Kokultur mit humanen Donator-Keratinozyten in einer organotypischen Kultur gezüchtet und als ein manipuliertes Gewebe, das für Hauttransplantationen geeignet ist, verwendet werden können. Ein rasches organotypisches Wachstum unter Verwendung von 90 % allogenen Zellen, in die 10 % autologe Keratinozyten eingestreut sind, ermöglicht eine frühere Wundbedeckung. Eine langsamere permanente Oberflächenwiederherstellung der Haut würde sich mit den autologen Keratinozyten bei Abstoßung der allogenen Zellen ergeben. Derartige Transplantate würden besondere Eigenschaften aufweisen, und zwar in Bezug auf eine sofortige Wundbedeckung und auch in Bezug auf die Bereitstellung von autologen Zellen für einen späten formalen Wundverschluss.
Die Ausführbarkeit dieser besonderen Vorgehensweise wurde früher in Tiermodellen bewiesen. Auf chimäre Weise gezüchtete Keratinozyten aus verschiedenen Stämmen von Mäusen (BALB/c und C3H/He), die auf beide experimentelle Mäusestämme transplantiert worden sind, führten zu einem langzeitigen Überleben von syngenen Keratinozyten und zu einer Abstoßung der allogenen Keratinozyten (3). Dies wurde auch unter Verwendung von chimären Keratinozytenkulturen mit einem Gehalt an 98 % allogenen und nur 2 % syngenen Zellen gezeigt (8). Ferner führten chimäre syngen-xenogen (Maus-Mensch) gezüchtete Keratinozyten, die auf Mäuse transplantiert worden waren, zu einer kompletten Wiederherstellung der Hautoberfläche mit syngenen Zellen bei Beseitigung der xenogenen Zellen (4).
Ein Haupthinderungsgrund der klinischen Fortentwicklung dieser Technik bestand darin, dass keine eingeführte allogene Keratinozytenlinie verfügbar war. Der erhebliche Überlebensvorteil, der mit der NIKS-Zelllinie verbunden ist, macht diese zu einer gut geeigneten allogenen Zelllinie für die chimäre Züchtung zusammen mit autologen Keratinozyten eines Patienten. Autologe Keratinozyten, die einer Passagierung bei einer geringeren Konfluenz unterzogen und zu NIKS in Kultur zugesetzt worden sind, ermöglichen eine erhebliche Zeiteinsparung. Eine chimäre Züchtung von NIKS zusammen mit autologen Keratinozyten eines Patienten würde eine höhere Wundbedeckung mit einem manipulierten Gewebe ergeben, das autologe Zellen für einen späten formalen Wundverschluss bereitstellt.
Wir haben gezeigt, dass bei gemeinsamer Züchtung von Donator-Keratinozyten in einer chimären Weise kein Überwachsen eines Zelltyps durch den anderen stattfindet. Ferner haben wir gezeigt, dass die Expression und Lokalisierung der Differenzierungsmarker des späten Stadiums, nämlich Keratin 1, Transglutaminase 1 und Filaggrin, sowie der Haftmoleküle E-Cadherin und P-Cadherin in identischer Weise wie bei intakter Haut erfolgen. NIKS stellt eine bevorzugte Zelllinie zur Verwendung als permanente, allogene Donator-Keratinozyten-Linie dar.
Bisher wurde die NIKS-Zelllinie nicht in Bezug auf die Expression der Haupthistokompatibilitätskomplex-Antigene (MHC) charakterisiert und ihre Abstoßungseigenschaften sind nicht bekannt. Im Gegensatz zu Hauttransplantaten enthalten organotypische Kulturen keine hochgradig antigenen, epithelialen oder vaskulären Endothelelemente, wie Langerhans-Zellen und Kapillaren. Es ist möglich, dass NIKS bei Platzierung auf den Menschen nicht abgestoßen wird. Chimäre, gezüchtete Hauttransplantate bei einem immunokompetenten Tiermodell führen zu einer Xenotransplantat-Abstoßung, wobei aber nicht definitiv feststeht, ob NIKS-Zellen in einem klinischen Ansatz abgestoßen würden. Wenn NIKS auf passive Weise durch Abstoßung beseitigt würden, würde eine Oberflächenwiederherstellung der Haut mit autologen Zellen erfolgen. Wenn NIKS nicht abgestoßen würden, könnte die Zelllinie potentiell als eine universelle Donator-Haut dienen. Zumindest würden chimär gezüchtete NIKS-Zellen als zeitweise biologische Abdeckung und als Abgabevehikel für autologe Keratinozyten dienen.
Der Mangel an kapillarem Plexus ist ebenfalls signifikant, da die Revaskularisation der gezüchteten Haut nicht durch Inoskulation auf vorher existierende Kapillaren, sondern durch Angiogenese erreicht wird. Die Verzögerung der Revaskularisation kann für die rasche frühe Verringerung der Transplantatgröße, die bei dieser Studie ersichtlich ist, verantwortlich sein, obgleich eine alternative Erklärung darin bestünde, dass die rasche Wundkontraktion für athymische Mäuse charakteristisch ist. Techniken der gentechnischen Manipulation wurden dazu herangezogen, sich mit der Verzögerung der Revaskularisation, die bei gezüchteter Haut naturgegeben ist, zu befassen.
NIKS sind leicht molekulargenetischen Techniken für die Schaffung von stabilen Zelllinien zugänglich, wie sich durch die erfolgreiche Schaffung von NIKS^GFP zeigt. Da die NIKS-Zellen gentechnisch manipuliert werden können, ist es möglich, gentechnisch verarbeitete NIKS-Keratinozyten in chimäre Kulturen einzubauen, um die Wundheilungseigenschaften von chimären Transplantaten zu fördern. Ferner können NIKS-Zelllinien mit spezifischen genetischen Profilen erzeugt werden, z. B. mit einer Expression von Wachstumsfaktoren. Infolgedessen können eine Vielzahl von maßgeschneiderten Gewebeprodukten auf NIKS-Basis erzeugt werden.
Die vorliegende Erfindung ist nicht auf die vorstehende Beschreibung beschränkt, sondern umfasst vielmehr sämtliche Modifikationen und Variationen, die unter den Schutzumfang der beigefügten Ansprüche fallen.
Literatur

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2. Caims, B. A., et al., The biotechnological quest for optimal wound closure, Arch. Surg. 128:1246-1252, 1993.
3. Suzuki, T., Ui, K., Shioya, N. and Ihara, S., Mixed cultures compromising syngeneic and allogeneic mouse keratinocytes as a graftable skin substitute, Transplantation 59:1236-1241, 1995.
4. Rouabhia, M, Permanent skin replacement using chimeric epithelial cultured sheets comprising xenogeneic and syngeneic keratinocytes, Transplantation 61:1290-1300, 1996.
5. Allen-Hoffmann, B. L., et al., Normal growth and differentiation in a spontaneously immortalized near-diploid human keratinocyte cell line, NIKS, J. Invest. Dermatol. 114:444-455, 2000.
6. Allen-Hofmann, B. L. and Rheinwald, J. G., Polycyclic aromatic hydrocarbon mutagenesis of human epidermal keratinocytes in culture, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:7802-7806, 1984.
7. Parenteau, N. L., et al., The organotypic culture of human skin keratinocytes and fibroblasts to achieve form and function, Cytotechnology 9:163-171, 1992.
8. Larochelle, F., Ross, G. and Rouabhia, M., Permanent skin replacement using engineered epidermis containing fewer than 5% syngeneic keratinocytes, Lab. Invest. 78:1089-1099, 1998.
9. Vogt, P. M., et al., Genetically modified keratinocytes transplanted to wounds reconstitute the epidermis, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91:9307-9311, 1994.
10. Supp, D. M., Supp, A. P., Bell, S. M. and Boyce, S. T., Enhanced vascularization of cultured skin substitutes genetically modified to overexpress vascular endothelial growth factor, J. Invest. Dermatol. 114:5-13, 2000.
11. Supp, D. M. and Boyce, S. T., Overexpression of vascular endothelial growth factor accelerates early vascularization and improves healing of genetically modified cultured skin substitutes, J. Burn Care Rehabil. 23:10-20, 2002.

Claims

Chimäre Haut, umfassend eine immortalisierte, humane Keratinozytenzelle in Kokultur mit Donator-Keratinozyten, wobei die Haut eine normale Gewebearchitektur und Differenzierungsmarker von stratifizierten, squamösen Epithelien umfasst, wobei die Expression und Position von Differenzierungsmarkern im späten Stadium typisch für intakte humane Haut sind.
Haut nach Anspruch 1, wobei die immortalisierten Keratinozyten genetisch modifiziert sind.
Verfahren zur Erzeugung einer chimären Haut, umfassend die gemeinsame Züchtung von immortalisierten, humanen Keratinozytenzellen und von von einem Patienten erhaltenen Keratinozyten in der Weise, dass eine chimäre Haut gebildet wird, wobei die Haut eine normale Gewebearchitektur und Differenzierungsmarker von stratifizierten, squamösen Epithelien umfasst, wobei die Expression und Position von Differenzierungsmarkern im späten Stadium typisch für intakte humane Haut sind.
Verfahren nach Anspruch 3, umfassend die Stufe der genetischen Modifikation wenigstens einer der immortalisierten Keratinozyten und der Donator-Keratinozyten.
Organotypische Kokultur, umfassend immortalisierte, humane Keratinozyten und Donator-Keratinozyten, wobei die Haut eine normale Gewebearchitektur und Differenzierungsmarker von stratifizierten, squamösen Epithelien umfasst, wobei die Expression und Position von Differenzierungsmarkern im späten Stadium typisch für intakte humane Haut sind.
Haut nach Anspruch 1 oder 2, Verfahren nach Anspruch 3 oder 4 oder organotypische Kokultur nach Anspruch 5, wobei die Donator-Keratinozyten humanen Ursprungs sind.
Haut nach einem der Ansprüche 1, 2 und 6, Verfahren nach einem der Ansprüche 3, 4 und 6 oder organotypische Kokultur nach Anspruch 5 oder 6, wobei es sich bei den immortalisierten Keratinozyten um spontan immortalisierte Keratinozyten handelt.
Haut nach einem der Ansprüche 1, 2, 6 und 7, Verfahren nach einem der Ansprüche 3, 4, 6 und 7 oder organotypische Kokultur nach einem der Ansprüche 5 bis 7, wobei es sich bei den immortalisierten Keratinozyten um ATCC CRL-12191 handelt.
Haut nach einem der Ansprüche 1, 2 und 6 bis 8, Verfahren nach einem der Ansprüche 3, 4 und 6 bis 8 oder organotypische Kokultur nach einem der Ansprüche 5 bis 8, wobei die immortalisierten Keratinozyten genetisch modifiziert sind.
Haut, Verfahren oder organotypische Kokultur nach Anspruch 9, wobei als Folge der genetischen Modifikation mindestens ein Gen oder Genprodukt exprimiert wird oder dessen Expression verstärkt wird.
Haut, Verfahren oder organotypische Kokultur nach Anspruch 9 oder 10, wobei die Expression von mindestens einem Gen oder Genprodukt als Folge der genetischen Modifikation unterdrückt wird.
Verwendung einer Haut nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 6 bis 11 oder einer organotypischen Kokultur nach einem der Ansprüche 5 bis 11 bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Verwendung eines Verfahrens zur Behandlung eines Patienten durch Hauttransplantation.
Verwendung nach Anspruch 12, wobei das Hauttransplantat zum Wundverschluss dient.
Verwendung nach Anspruch 13, wobei der Wundverschluss zur Behandlung von diabetischen Geschwüren, Hautverbrennungen und/oder nekrotisierender Hauterkrankung dient.