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WO2022114727A1 - 칼슘, 상피세포성장인자 및 알부민을 포함하는 각질형성세포 수립 또는 배양용 배지 조성물 - Google Patents

칼슘, 상피세포성장인자 및 알부민을 포함하는 각질형성세포 수립 또는 배양용 배지 조성물 Download PDF

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WO2022114727A1
WO2022114727A1 PCT/KR2021/017263 KR2021017263W WO2022114727A1 WO 2022114727 A1 WO2022114727 A1 WO 2022114727A1 KR 2021017263 W KR2021017263 W KR 2021017263W WO 2022114727 A1 WO2022114727 A1 WO 2022114727A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
medium
keratinocytes
cells
present
calcium
Prior art date
Application number
PCT/KR2021/017263
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
이의일
이주연
강홍석
이지혜
이정언
강민희
Original Assignee
(주)엑셀세라퓨틱스
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by (주)엑셀세라퓨틱스 filed Critical (주)엑셀세라퓨틱스
Priority to US18/039,033 priority Critical patent/US20240002790A1/en
Priority to EP21898553.9A priority patent/EP4239057A4/en
Publication of WO2022114727A1 publication Critical patent/WO2022114727A1/ko

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0625—Epidermal cells, skin cells; Cells of the oral mucosa
    • C12N5/0629—Keratinocytes; Whole skin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C12N2500/12—Light metals, i.e. alkali, alkaline earth, Be, Al, Mg
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/90—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/11—Epidermal growth factor [EGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/50—Proteins
    • C12N2533/54—Collagen; Gelatin

Definitions

  • the present invention relates to a medium composition for culturing keratinocytes, and more particularly, to a medium composition for establishing or culturing keratinocytes comprising calcium, epidermal growth factor and albumin.
  • Keratinocytes present in the basal layer of the epidermis begin to differentiate while migrating upward after division.
  • the differentiation of these keratinocytes is a result of precisely regulated gene expression changes resulting in cell cycle arrest and marked cell morphology. will entail changes in At this time, transglutaminase and involucrin, cornifin, loricrin, filaggrin, and small proline-rich protein (SPR) are representative genes whose expression is increased in relation to differentiation.
  • Factors affecting the differentiation of keratinocytes include calcium, vitamin D, retinoic acid, and 12-o-tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA) (Expert Rev Endocrinol Metab. 2012 Jul; 7(4): 461-472).
  • calcium is best known as a biological factor that promotes the differentiation of keratinocytes, and in particular, it is known that the calcium concentration increases toward the upper part of the epidermis.
  • structural proteins such as involucrin, cornifin, loricrin, and SPR are combined with transglutamiase on the inside of the cell membrane to form a cornified cell envelope, a hard structure that is not soluble in water.
  • calcium is one of the indispensable elements in cell culture because it is involved in the survival and metabolic activity of cells, regulates the energy required, and is involved in the proliferation and differentiation of cells.
  • various concentrations of calcium have been used from 0.03 mM to 0.1 mM, which is fatal in research and product development using keratinocytes.
  • Epidermal Growth Factor was discovered by Dr. Stanley Cohen, an American biologist, and is known as a kind of protein that promotes the growth of new cells by binding to a receptor on the skin surface.
  • epidermal growth factor it is used in many studies and products for culturing keratinocytes.
  • Various concentrations are also used, but according to recent literature, high concentrations of epithelial growth factors induce transforming growth factor- ⁇ (TGF- ⁇ ), resulting in a mechanism to inhibit the growth of keratinocytes. is known
  • the present inventors have prepared a keratinocyte culture medium having a high cell proliferation rate and activity while maintaining the characteristics of keratinocytes. Based on this, the present invention has been completed.
  • an object of the present invention is to provide a medium additive for establishing or culturing keratinocytes, including calcium, epidermal growth factor, and albumin.
  • Another object of the present invention is to provide a medium composition for establishing or culturing keratinocytes, including the medium additive and the basal medium.
  • Another object of the present invention is to provide a method for culturing keratinocytes, comprising the step of culturing keratinocytes in the medium composition.
  • the present invention provides a medium additive for establishment or culture of keratinocytes, including calcium, epidermal growth factor (Epidermal growth factor) and albumin.
  • a medium additive for establishment or culture of keratinocytes including calcium, epidermal growth factor (Epidermal growth factor) and albumin.
  • the keratinocytes may be human skin-derived keratinocytes.
  • the calcium may be included in a concentration of 0.03 to 0.1mM.
  • the epidermal growth factor may be included in a concentration of 0.001 to 1 ng/ml.
  • the albumin may be included in a concentration of 0.001 mg/ml or more and less than 1 mg/ml.
  • the culture may be proliferation.
  • the present invention provides a medium composition for establishing or culturing keratinocytes, comprising the medium additive and the basal medium.
  • the basal medium is DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium); Minimal Essential Medium (MEM); BME (Basal Medium Eagle); RPMI 1640; DMEM/F-10 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium: Nutrient Mixture F-10); DMEM/F-12 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium: Nutrient Mixture F-12); a-MEM (a-Minimal essential Medium); G-MEM (Glasgow's Minimal Essential Medium); IMDM (Isocove's Modified Dulbecco's Medium); KnockOut DMEM (GIBCO, USA); And it may be any one selected from the group consisting of MCDB.
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium
  • MEM Minimal Essential Medium
  • BME Base Medium Eagle
  • RPMI 1640 DMEM/F-10 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium: Nutrient Mixture F-10
  • the medium composition can inhibit the extension of the population doubling time (PDT) of keratinocytes for at least 5 passages or more.
  • PDT population doubling time
  • the present invention also provides a method for culturing keratinocytes, comprising the step of culturing keratinocytes in the medium composition.
  • the culture medium of the present invention when keratinocytes are cultured using the medium of the present invention, keratinocytes can be effectively proliferated within a short time, so that a desired number of cells can be obtained more quickly in the development of a therapeutic agent using the cells, Since the activity of keratinocytes is improved, the culture medium of the present invention can be usefully used in the fields of keratinocyte research and therapeutic development.
  • FIG. 1 is a result of analyzing the effect of calcium concentration on the morphology and proliferation of human keratinocytes.
  • FIG. 1a shows keratinocytes in calcium according to the present invention, in the case of culturing keratinocytes using the medium of the present invention. Since keratinocytes can be effectively proliferated in a short time, a desired number of cells can be obtained more quickly in the development of a therapeutic agent using the cells, and the activity of keratinocytes is improved. It can be usefully used in research and therapeutic development fields. It is a microscopic image showing the cell morphology on the 4th day after culturing in 4 types of media with different concentrations (0.024, 0.07, 0.14, 0.26 mM), and FIG. 1b is the 4th day of culture. The results are shown by measuring the number of cells and the degree of aggregation.
  • Figure 2 is the result of analyzing the effect of epidermal growth factor (EGF) and albumin on the morphology and proliferation of human keratinocytes. It is a microscopic image showing the cell morphology on the fourth day after culturing in the medium containing the concentration, and FIG. 2B is a result of measuring the number of cells on the fourth day of culture.
  • EGF epidermal growth factor
  • FIG. 3 is a result of confirming the establishment performance of keratinocytes in the mixed medium according to the present invention to which the component ratios of basal medium, calcium, epidermal growth factor (EGF), and albumin are applied. It is an image observed under a microscope of cells cultured in a mixed medium with a commercial medium (Lonza KGM) as a positive control on the 1st and 6th days of culture while the establishment is in progress, and FIG. 3b is an image of the cells cultured with each medium on the 5th day of culture These are the results shown by measuring the number of cells, cell viability, and cell size.
  • basal medium calcium, epidermal growth factor (EGF), and albumin
  • Figure 4 is the result of culturing human skin tissue-derived keratinocytes in the mixed medium and the commercial medium according to the present invention until passage 5.
  • Figure 4a is a microscopic image result of cells cultured in passage 5 in each medium
  • 4b is the population doubling time (PDT) of cells cultured from passages 1 to 5. It is the result of measuring the cell diameter and cell viability.
  • FIG. 5 is a result of analyzing and comparing the expression level of a keratinocyte-specific marker protein by performing a Western blot using the three-passage human keratinocytes cultured using each medium in FIG. 4 .
  • FIG. 6 is a result of analyzing and comparing the expression level of keratinocyte-specific marker mRNA by performing PCR using the 3rd and 5th passage human keratinocytes cultured using each medium in FIG. 4 .
  • calcium including epidermal growth factor (Epidermal growth factor) and albumin
  • epidermal growth factor epidermal growth factor
  • albumin it is achieved by a medium additive for establishment or culture of keratinocytes.
  • the present invention relates to a medium composition for establishing or culturing keratinocytes having a high cell proliferation rate and activity while maintaining the characteristics of keratinocytes.
  • It provides a medium additive for establishment or culture of keratinocytes, including calcium, epidermal growth factor and albumin.
  • keratinocyte refers to cells of the epidermis and oral epithelial layer that produce keratin in the process of differentiation into the stratum corneum of the skin, and accounts for 95% of the epidermal cells of the skin.
  • the origin of the keratinocytes is not particularly limited, but may preferably be derived from a human.
  • calcium may be included in a concentration of 0.03 to 0.1mM, preferably in a concentration of 0.03 to 0.7mM, but is not limited thereto.
  • the epidermal growth factor may be included at a concentration of 0.001 to 1 ng/ml, preferably, it may be included at a concentration of 0.01 to 0.1 ng/ml, but is not limited thereto.
  • albumin may be included in a concentration of 0.001 mg/ml or more and less than 1 mg/ml, preferably in a concentration of 0.01 to 0.1 mg/ml, but is not limited thereto.
  • the culture may preferably be to proliferate keratinocytes.
  • the present invention provides a medium composition for establishing or culturing keratinocytes, comprising the medium additive and the basal medium.
  • the basal medium may be a conventional cell culture medium, and may include all components essential for cell culture.
  • the basal medium is, for example, DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium); Minimal Essential Medium (MEM); BME (Basal Medium Eagle); RPMI 1640; DMEM/F-10 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium: Nutrient Mixture F-10); DMEM/F-12 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium: Nutrient Mixture F-12); a-MEM (a-Minimal essential Medium); G-MEM (Glasgow's Minimal Essential Medium); IMDM (Isocove's Modified Dulbecco's Medium); KnockOut DMEM (GIBCO, USA); And it may be any one selected from the group consisting of MCDB, but is not limited thereto.
  • the excellent quality of the medium of the present invention is obtained by culturing each keratinocyte using the medium composition according to the present invention and a commercially available conventional keratinocyte culture medium, and analyzing the establishment, proliferation, characteristics and activity of the cells. Cell establishment and culture performance were confirmed.
  • the present invention provides a method for culturing keratinocytes, comprising the step of culturing the keratinocytes in the medium composition.
  • conditions other than the medium composition for culturing keratinocytes such as temperature, carbon dioxide concentration, humidity, incubation time, culture vessel, etc., are not specifically limited, and those skilled in the art can appropriately You can choose to apply it.
  • Example 1 Thaw and culture of human keratinocytes
  • the human skin keratinocytes used in the present invention were transferred to a cell preservation nitrogen tank in the laboratory in a cryopreserved state. After thawing the cryopreserved cells, the supernatant is removed by centrifugation, and the cell precipitate is suspended in a commercially available keratinocyte culture medium (LONZA, Gold), inoculated in a T-flask, and then incubated at 37°C for the first passage. Cells were stabilized during the process.
  • a commercially available keratinocyte culture medium LONZA, Gold
  • Example 2 Comparison of morphology and proliferation ability of human keratinocytes according to calcium concentration
  • Example 1 the keratinocytes cultured in Example 1 were treated with a trypsin-based enzyme (GibcoTM TrypLETM), and then the cells were recovered and centrifuged at 1000 rpm for 5 minutes. Then, the supernatant was discarded and the cells were well released by adding the medium for each condition in Table 1 below, and then the number of cells was measured using NC-250TM (chemometec, Denmark). Cells were seeded in a 6-well plate at 1 ⁇ 10 4 cells per well and cultured in an incubator at 37° C. for 4 days, and a photograph of the cells on the 4th day of culture is shown in FIG. 1A .
  • a trypsin-based enzyme GibcoTM TrypLETM
  • the cells were treated with a trypsin-based enzyme (GibcoTM TrypLETM), and then the cells were recovered and centrifuged at 1000 rpm for 5 minutes. After discarding the supernatant of the centrifuged cells and adding the medium for each condition in Table 1 below to release the cells, the number of cells was measured using NC-250TM. The degree of cell aggregation was analyzed when the number of cells was measured, and the results are shown in FIG. 1B .
  • a trypsin-based enzyme GibcoTM TrypLETM
  • Example 3 Comparison of morphology and proliferation ability of human keratinocytes according to the composition ratio of epidermal growth factor and albumin
  • EGF epidermal growth factor
  • albumin albumin
  • the keratinocytes cultured in Example 1 were treated with a trypsin-based enzyme, and then the cells were recovered and centrifuged at 1000 rpm for 5 minutes. Then, the supernatant was discarded and the cells were well released by adding the medium for each condition in Table 2 below, and then the number of cells was measured using NC-250TM.
  • Cells were seeded in a 6-well plate at 1 ⁇ 10 4 cells per well and cultured in an incubator at 37° C. for 4 days. A photograph of the cells on the 4th day of culture is shown in FIG. 2A . Then, on the fourth day of culture, the cells were treated with a trypsin-based enzyme, and the cells were recovered and centrifuged at 1000 rpm for 5 minutes. After discarding the centrifuged cell supernatant and adding the medium for each condition in Table 2 below to release the cells, the number of cells was measured using NC-250TM. The results are shown in Figure 2b.
  • FIGS. 2a and 2b it was confirmed that the cell morphology and yield improved at a concentration of 0.01 ⁇ 0.1ng/ml for epidermal growth factor and 10 ⁇ 100ug/ml for albumin. .
  • the appropriate effective concentrations of epidermal growth factor and albumin were 0.01 - 0.1ng/ml and 10 - 100ug/ml, respectively.
  • Group Albumin ug/ml
  • Epidermal growth factor ng/ml
  • Example 4 Confirmation of establishment of keratinocytes derived from mouse skin tissue in a mixed medium to which the composition ratio of basal medium, calcium, epidermal growth factor, and albumin is applied
  • the present inventors cultivated the KGM gold medium of LONZA, a product used for use, in order to confirm the cell establishment performance of the mixed medium to which the component ratios of basal medium, calcium, epidermal growth factor, and albumin are applied.
  • the experiment was carried out as a control group.
  • a mixed medium having a calcium concentration of 0.07 mM, albumin 100 ug/ml, and epithelial cell growth factor 0.1 ng/ml was used in the basal medium.
  • the skin tissue of the tail of the mouse was isolated, and the separated tail tissue was placed in saline or DMEM (Dulbecco Modified Eagle Medium) medium and transferred to the laboratory.
  • the tail tissue was washed twice with sterile physiological saline in a clean bench, the washed tail tissue was put in a Petri dish, and the skin of the tail was peeled off. More specifically, first, the middle of the tail was cut from the bottom to the tip using a blade, and the skin was cut to a length of about 2-3 cm along the center line. Then, the cut skin tissue was put in a 100-pi Petri dish, and 15 ml of PBS was added to perform rinsing.
  • Each skin was placed in a 2ml tube, filled with cold dispaseII digestion buffer (4mg/ml, basic medium for each medium), and then the tube containing the tissue was placed on a rotator and incubated overnight (12-18h) at 4°C. After incubation, the DispaseII solution and each skin tissue were transferred together to a 100-pi Petri dish, and the remaining dispaseII was washed away with 15ml of PBS. Then, holding the skin using forceps, the epidermis side down and the dermis side facing up was transferred to a new Petri dish, the skin was carefully stretched completely, and the cells were separated using a trypsin-based enzyme.
  • the cells were filtered using a 100 ⁇ m cell strain filter, placed in a 50 ml conical tube, and centrifuged at 180 x g for 5 minutes with a 100 ⁇ m cell strain filter fixed. After removing the supernatant by suction, the cell pellet was resuspended using cold KC culture medium, and the number of cells was measured using NC-250TM. Next, cells were aliquoted at 1 ⁇ 10 4 per well using each medium in a 6-well plate coated with collagen, and cultured in an incubator at 37° C. for 5 days. The photos on the 1st and 5th days of the culture are shown in FIG.
  • Example 5 Verification of growth of keratinocytes derived from human skin tissue in a mixed medium to which the composition ratio of basal medium, calcium, epidermal growth factor, and albumin is applied
  • the present inventors In order to confirm the growth ability of keratinocytes derived from human skin tissue by the mixed medium to which the composition ratio of basal medium, calcium, epidermal growth factor, and albumin is applied, the present inventors passaged the KGM gold medium of LONZA, a product for use, as a positive control group. Passage culture was performed from passage 1 to passage 5. As the mixed medium of the present invention used in this Example, a medium having the same composition as in Example 4 was used.
  • cryopreserved cells were thawed and centrifuged to remove the supernatant, and the cell precipitate was suspended in each medium and inoculated in a 25T flask coated with collagen typeIV at a concentration of 7.5 ⁇ 10 4 /flask at 37°C 5% It was cultured under CO 2 conditions. Each medium was changed once every 2 or 3 days during culture, and passages were performed whenever the cell density increased to 80% or more of the culture area. During subculture, each cell was removed from the bottom of the flask by treatment with a trypsin-based enzyme, and the cells were centrifuged, the supernatant was discarded, and a medium for each condition was added to the remaining cells. was measured.
  • the cell morphology exhibited a cobblestone shape characteristic of keratinocytes, similar to the positive control medium (LONZA KGM).
  • the mixed medium of the present invention was more stable in PDT of the cells than in the positive control medium during culture until passage 5, and it was confirmed that the size and viability of the cells were also stably maintained.
  • Example 6 Identification of the characteristics of keratinocytes in a mixed medium to which the composition ratio of basal medium, calcium, epidermal growth factor, and albumin is applied
  • the present inventors verified the characteristics of keratinocytes cultured in the mixed medium according to the present invention using the cells cultured in Example 5.
  • the protein was transferred to the membrane using a membrane transfer kit (Invitrogen, USA), and then primary and secondary antibodies were sequentially added to react. After the reaction, the expression level of the protein was checked using HRP-ECL solution (Thermo fisher scientific, USA) and iBright (Thermo fisher scientific, USA), and GAPDH (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) protein was used as a control.
  • HRP-ECL solution Thermo fisher scientific, USA
  • iBright Thermo fisher scientific, USA
  • GAPDH glycose dehydrogenase
  • a 1% agarose gel was made with 1X TAE buffer, and the PCR product corresponding to each primer was added to each well, followed by electrophoresis at 100V. The gel after DNA separation by electrophoresis was observed under iBright (Thermo fisher scientific, USA) to confirm the expression level, and 18s ribosomal RNA was used as a control.
  • Example 7 Confirmation of the activity of keratinocytes in the mixed medium to which the component ratios of basal medium, calcium, epidermal growth factor, and albumin were applied
  • the present inventors tried to confirm the activity of keratinocytes cultured in the mixed medium according to the present invention using the cells cultured in Example 5.
  • the cells cultured in Example 5 were treated with a trypsin-based enzyme, then the cells were harvested and centrifuged at 1000 rpm for 5 minutes. After discarding the centrifuged cell supernatant, adding a medium for each condition to release the cells, the number of cells was measured using NC-250TM. Subsequently, 5 ⁇ 10 2 cells per well were seeded in a 6-well plate and cultured in an incubator at 37° C. for 7 days.
  • the cells were fixed with 4% formalin solution at room temperature for 30 minutes, and then the cells were fixed with a 0.1% crystal violet-concentrated solution at room temperature. stained for 30 min. Colonies formed of 50 or more cells were counted and the number of colonies formed per well was analyzed.
  • the colony size of the cells cultured in the mixed medium condition of the present invention was generally larger than that of the cells cultured with the used medium (LONZA KGM), and the number of colonies was larger. This means that cell activity is further increased in the mixed medium to which the composition ratio of basal medium, calcium, epithelial cell growth factor (EGF), and albumin is applied.
  • the composition ratio of basal medium, calcium, epithelial cell growth factor (EGF), and albumin is applied.

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Abstract

본 발명은 각질형성세포의 배양을 위한 배지 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 칼슘, 상피세포성장인자 및 알부민을 포함하는 각질형성세포의 수립 또는 배양을 위한 배지 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 본 발명의 배지를 이용하여 각질형성세포를 배양하는 경우 각질형성 세포를 빠른 시간 내에 효과적으로 증식시킬 수 있어 상기 세포를 이용한 치료제 개발에서 원하는 수의 세포를 보다 빠르게 획득할 수 있으며, 각질형성 세포의 활성도를 향상시키는바, 본 발명의 배양 배지를 각질형성세포 연구 및 치료제 개발 분야에서 유용하게 활용할 수 있다.

Description

칼슘, 상피세포성장인자 및 알부민을 포함하는 각질형성세포 수립 또는 배양용 배지 조성물
본 발명은 각질형성세포의 배양을 위한 배지 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 칼슘, 상피세포성장인자 및 알부민을 포함하는 각질형성세포의 수립 또는 배양을 위한 배지 조성물에 관한 것이다.
표피의 기저층에 존재하는 각질형성세포 (keratinocyte)는 분열 후 위쪽으로 이동하면서 분화가 일어나기 시작하는데, 이러한 각질형성세포의 분화는 정교하게 조절 받는 유전자 발현 변화의 결과로서 세포주기의 정지 및 현저한 세포 형태의 변화를 수반하게 된다. 이때 분화와 관련되어 발현이 증가 하는 유전자로 transglutaminase 및 involucrin, cornifin, loricrin, filaggrin 그리고 small proline-rich protein (SPR) 등이 대표적이다. 각질형성세포의 분화에 영향을 미치는 인자로는 칼슘, vitamin D, retinoic acid, 12-o-tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA) 등이 알려져 있다 (Expert Rev Endocrinol Metab. 2012 Jul; 7(4): 461-472).
이 중 칼슘은 각질형성세포의 분화를 촉진하는 생체 인자로 가장 잘 알려져 있으며, 특히 표피의 위쪽으로 갈수록 칼슘 농도가 증가하는 것으로 알려져 있다. 각질형성세포의 분화가 진행되면 세포 막의 안쪽에 involucrin, cornifin, loricrin, SPR 등의 구조단백질을 transglutamiase와 결합시켜 물에 녹지 않는 단단한 구조물인 각질세포막 (cornified cell envelope)을 형성하게 된다. 특히 칼슘은 세포의 생존과 대사활동에 관여하며, 필요한 에너지를 조절하고 세포의 증식과 분화에 관여하기 때문에 세포 배양에 있어 필수 불가결의 요소 중 하나이다. 기존의 각질형성세포 배지의 경우 칼슘의 농도가 0.03 mM 부터 0.1 mM까지 다양하게 사용되어 왔으며, 이는 각질형성세포를 이용한 연구 및 제품 개발에 있어 치명적이라 할 수 있다.
상피세포성장인자 (Epidermal Growth Factor; EGF)는 미국의 생물학자 스탠리 코헨 박사에 의해 발견되었으며, 피부표면에 있는 수용체와 결합하여 새로운 세포의 성장을 촉진 시키는 단백질의 일종으로 알려져 있다. 실제로 상피세포성장인자의 경우 각질형성세포를 배양하는 많은 연구 및 제품들에서 사용되고 있다. 이 또한 다양한 농도가 사용되고 있지만 최근 문헌에 따르면 고농도의 상피세포성장인자의 경우 전환성장인자 베타 (Transforming Growth Factor-β; TGF-β)를 유도하여 각질형성세포의 성장을 저해시키는 메커니즘을 일으킨다는 결과가 알려져 있다.
상기와 같은 배경 하에, 본 발명자들은 각질형성세포의 특성을 유지하면서도 높은 세포 증식률 및 활성도를 갖는 각질형성세포 배양용 배지를 제조하였는바, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명은 칼슘, 상피세포성장인자 (Epidermal growth factor) 및 알부민을 포함하는, 각질형성세포의 수립 또는 배양용 배지 첨가제를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 배지 첨가제 및 기본 배지를 포함하는, 각질형성세포의 수립 또는 배양용 배지 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 배지 조성물에서 각질형성세포를 배양하는 단계를 포함하는, 각질형성세포의 배양방법을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 칼슘, 상피세포성장인자 (Epidermal growth factor) 및 알부민을 포함하는, 각질형성세포의 수립 또는 배양용 배지 첨가제를 제공한다.
본 발명의 일구현예로, 상기 각질형성세포는 인간 피부 유래 각질형성세포일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 칼슘은 0.03 내지 0.1mM의 농도로 포함되는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 상피세포성장인자는 0.001 내지 1ng/ml 농도로 포함되는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 알부민은 0.001mg/ml 이상 1mg/ml 미만의 농도로 포함되는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 배양은 증식인 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 배지 첨가제 및 기본배지를 포함하는, 각질형성세포의 수립 또는 배양용 배지 조성물을 제공한다.
본 발명의 일구현예로, 상기 기본 배지는 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium); MEM (Minimal Essential Medium); BME (Basal Medium Eagle); RPMI 1640; DMEM/F-10 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium: Nutrient Mixture F-10); DMEM/F-12 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium: Nutrient Mixture F-12); a-MEM (a-Minimal essential Medium); G-MEM (Glasgow's Minimal Essential Medium); IMDM (Isocove's Modified Dulbecco's Medium); KnockOut DMEM (GIBCO, USA); 및 MCDB로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 배지 조성물은 적어도 5계대 (passage) 이상 각질형성세포의 집단 배가 시간 (population doubling time; PDT) 연장을 억제할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 배지 조성물에서 각질형성제포를 배양하는 단계를 포함하는, 각질형성세포의 배양방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 본 발명의 배지를 이용하여 각질형성세포를 배양하는 경우 각질형성 세포를 빠른 시간 내에 효과적으로 증식시킬 수 있어 상기 세포를 이용한 치료제 개발에서 원하는 수의 세포를 보다 빠르게 획득할 수 있으며, 각질형성 세포의 활성도를 향상시키는바, 본 발명의 배양 배지를 각질형성세포 연구 및 치료제 개발 분야에서 유용하게 활용할 수 있다.
도 1은 칼슘 농도가 인간 각질형성세포의 형태 및 증식에 미치는 영향을 분석한 결과로서, 도 1a는 각질형성세포를 칼슘 본 발명에 따르면, 본 발명의 배지를 이용하여 각질형성세포를 배양하는 경우 각질형성 세포를 빠른 시간 내에 효과적으로 증식시킬 수 있어 상기 세포를 이용한 치료제 개발에서 원하는 수의 세포를 보다 빠르게 획득할 수 있으며, 각질형성 세포의 활성도를 향상시키는바, 본 발명의 배양 배지를 각질형성세포 연구 및 치료제 개발 분야에서 유용하게 활용할 수 있다.농도가 상이 (0.024, 0.07, 0.14, 0.26mM)한 4종류의 배지에서 배양하고 4일째에 세포 형태를 보여주는 현미경 이미지이고, 도 1b는 배양 4일째의 세포 수 및 응집 (aggregation)된 정도를 측정하여 나타낸 결과이다.
도 2는 상피세포성장인자 (EGF) 및 알부민이 인간 각질형성세포의 형태 및 증식에 미치는 영향을 분석한 결과로서, 도 2a는 각질형성세포를 상피세포성장인자 및 알부민이 표 2와 같이 각각 다른 농도로 포함된 배지에서 배양하고 4일째에 세포 형태를 보여주는 현미경 이미지이고, 도 2b는 배양 4일째의 세포 수를 측정하여 나타낸 결과이다.
도 3은 기본배지, 칼슘, 상피세포성장인자 (EGF), 알부민의 성분비를 적용한 본 발명에 따른 혼합배지의 각질형성세포의 수립 성능을 확인한 결과로서, 도 3a는 마우스 피부조직 유래 각질형성세포의 수립을 진행하면서 배양 1일 및 6일째에 양성 대조군인 시판 배지 (Lonza KGM)와 혼합배지로 배양된 세포를 현미경으로 관찰한 이미지이고, 도 3b는 배양 5일차에 상기 각 배지로 배양된 세포의 세포 수, 세포생존율 및 세포 크기를 측정하여 나타낸 결과이다.
도 4는 인간 피부조직 유래 각질형성세포를 본 발명에 따른 혼합배지 및 시판 배지에서 5 계대까지 배양을 진행한 결과로서, 도 4a는 상기 각 배지에서 배양된 5 계대 세포의 현미경 이미지 결과이고, 도 4b는 1 계대부터 5 계대까지 배양된 세포의 집단 배가 시간 (PDT). 세포 직경 및 세포생존율을 측정한 결과이다.
도 5는 도 4에서 각 배지를 이용해 배양된 3 계대 인간 각질형성세포를 이용해 웨스턴 블롯을 수행하여 각질형성세포 특이적 마커 단백질의 발현수준을 분석 및 비교한 결과이다.
도 6은 도 4에서 각 배지를 이용해 배양된 3 계대 및 5 계대 인간 각질형성세포를 이용해 PCR을 수행하여 각질형성세포 특이적 마커 mRNA의 발현수준을 분석 및 비교한 결과이다.
도 7은 도 4에서 각 배지를 이용해 배양된 3 계대 인간 각질형성세포를 크리스탈 바이올렛으로 염색하여 콜로니 형성 정도를 확인한 결과이다.
상기한 목적을 달성하기 위하여, 칼슘, 상피세포성장인자 (Epidermal growth factor) 및 알부민을 포함하는, 각질형성세포의 수립 또는 배양용 배지 첨가제에 의해 달성된다.
본 발명은 각질형성세포의 특성을 유지하면서도 높은 세포 증식률 및 활성도를 갖는 각질형성세포의 수립 또는 배양용 배지 조성물에 관한 것이다.
칼슘, 상피세포성장인자 (Epidermal growth factor) 및 알부민을 포함하는, 각질형성세포의 수립 또는 배양용 배지 첨가제를 제공한다.
본 발명의 대상 세포인, “각질형성세포 (keratinocyte)”란 피부의 각질층으로 분화하는 과정에서 케라틴을 생성하는 표피와 구강 상피층의 세포를 말하며, 피부 표피 세포의 95%를 차지한다. 본 발명에 있어서, 각질형성세포의 기원은 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게는 인간에서 유래된 것일 수 있다.
본 발명에서, 칼슘은 0.03 내지 0.1mM의 농도로 포함되는 것일 수 있고, 바람직하게는 0.03 내지 0.7mM의 농도로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상피세포성장인자는 0.001 내지 1ng/ml 농도로 포함될 수 있고, 바람직하게는 0.01 내지 0.1ng/ml의 농도로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 알부민은 0.001mg/ml 이상 1mg/ml 미만의 농도로 포함될 수 있으며, 바람직하게는 0.01 내지 0.1mg/ml의 농도로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 배양은 바람직하게는 각질형성세포를 증식시키는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 상기 배지 첨가제 및 기본배지를 포함하는, 각질형성세포의 수립 또는 배양용 배지 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 기본 배지는 통상의 세포 배양용 배지일 수 있고, 세포 배양에 필수적으로 필요한 성분을 모두 포함할 수 있다. 상기 기본 배지는 예컨대 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium); MEM (Minimal Essential Medium); BME (Basal Medium Eagle); RPMI 1640; DMEM/F-10 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium: Nutrient Mixture F-10); DMEM/F-12 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium: Nutrient Mixture F-12); a-MEM (a-Minimal essential Medium); G-MEM (Glasgow's Minimal Essential Medium); IMDM (Isocove's Modified Dulbecco's Medium); KnockOut DMEM (GIBCO, USA); 및 MCDB로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나인 것일 수 있으나, 이것으로 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서는 구체적인 실시예를 통해 칼슘, 상피세포성장인자 및 알부민이 각질형성세포의 형태 및 증식에 미치는 영향을 분석하고, 세포의 형태를 변화시지 않으면서 증식에 유효한 최적의 농도를 도출하였다 (실시예 2 및 3 참조).
본 발명의 다른 실시예에서는 본 발명에 따른 배지 조성물과 시판되는 기존 각질형성세포 배양 배지를 이용해 각질형성세포를 각각 배양하고, 세포의 수립, 증식, 특징 및 활성을 분석함으로써 본 발명의 배지의 우수한 세포 수립 및 배양 성능을 확인하였다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 배지 조성물에서 각질형성세포를 배양하는 단계를 포함하는, 각질형성세포의 배양방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 각질형성세포의 배양을 위한 배지 조성물 이외의 다른 조건, 예컨대 온도, 이산화탄소 농도, 습도, 배양시간, 배양 용기 등 배양에 필요한 조건들은 구체적으로 한정되지 않으며 당업자가 효율적인 배양을 위해 적절히 선택하여 적용할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 인간 각질형성세포의 해동 및 배양
본 발명에서 이용한 인간 피부 각질형성세포는 냉동보존된 상태에서 연구실의 세포 보존 질소탱크로 옮겼다. 냉동보존된 세포를 해동한 후 원심분리하여 상층액을 제거하고, 시판되고 있는 각질형성세포 배양배지 (LONZA, Gold)로 세포 침전물을 현탁하여 T-플라스크에 접종한 다음 37℃ 인큐베이터에서 1계대가 진행되는 동안 세포를 안정화시켰다.
실시예 2. 칼슘 농도에 따른 인체각질형성세포의 형태 및 증식능 비교
다음으로, 본 발명자들은 칼슘농도가 인간 각질형성세포의 형태 및 증식에 미치는 영향을 알아보고자 하였다.
이를 위해, 상기 실시예 1에서 배양한 각질형성세포에 트립신기반 효소 (Gibco™ TrypLE™)를 처리한 뒤 세포를 회수하여 5분 동안 1000rpm으로 원심분리하였다. 이어서 상층액을 버리고 하기 표 1의 조건별 배지를 첨가하여 세포를 잘 풀어준 후 NC-250™ (chemometec, Denmark)을 이용하여 세포 수를 측정하였다. 6 웰 (well) 플레이트에 세포를 웰 당 1×104 세포로 분주하고 37℃ 인큐베이터에서 4일 동안 배양하였으며, 배양 4일째 세포 사진을 도 1a에 나타내었다. 이후 배양 4일째 세포에 트립신기반 효소 (Gibco™ TrypLE™)를 처리한 뒤 세포를 회수하여 5분 동안 1000rpm으로 원심분리하였다. 원심분리된 세포의 상층액을 버리고 하기 표 1의 조건별 배지를 첨가하여 세포를 잘 풀어준 후 NC-250™을 이용하여 세포 수를 측정하였으며. 세포 수 측정 시 세포의 aggregation 정도를 분석하였고, 결과는 도 1b에 나타 내었다.
실험 결과, 표 1, 도 1a 및 도 1b에 나타낸 바와 같이, 칼슘 농도가 0.1mM 보다 높아질 경우 세포의 형태가 변하며 세포의 회수율도 떨어지는 것으로 나타났다. 또한 칼슘 농도가 0.1mM 보다 높아질 경우 세포의 aggregation 정도가 높아지는 것을 확인할 수 있었다. 결과적으로 칼슘의 농도는 0.03 - 0.1mM 사이에서 유효한 농도임을 확인 할 수 있었다.
Group Detail
Sample 1 0.024mM calcium
2 0.07mM calcium
3 0.14mM calcium
4 0.26mM calcium
실시예 3. 상피세포성장인자 및 알부민 성분비에 따른 인체각질형성세포의 형태 및 증식능 비교
다음으로, 본 발명자들은 상피세포성장인자 (Epidermal growth factor; EGF) 및 알부민 (albumin)이 인간 각질형성세포의 형태 및 증식에 미치는 영향을 알아보고자 하였다.
이를 위해, 상기 실시예 1에서 배양한 각질형성세포에 트립신 기반 효소를 처리한 뒤 세포를 회수하여 5분 동안 1000rpm으로 원심분리하였다. 이어서 상층액을 버리고 하기 표 2의 조건별 배지를 첨가하여 세포를 잘 풀어준 후 NC-250™을 이용하여 세포 수를 측정하였다. 6 웰 (well) 플레이트에 세포를 웰 당 1×104 세포로 분주하고 37℃ 인큐베이터에서 4일 동안 배양하였으며, 배양 4일째 세포 사진을 도 2a에 나타내었다. 이후 배양 4일째 세포에 트립신기반 효소를 처리한 뒤 세포를 회수하여 5분 동안 1000rpm으로 원심분리하였다. 원심분리된 세포의 상층액을 버리고 하기 표 2의 조건별 배지를 첨가하여 세포를 잘 풀어준 후 NC-250™을 이용하여 세포 수를 측정하였으며. 결과를 도 2b에 나타 내었다.
그 결과, 표 2, 도 2a 및 도 2b에 나타낸 바와 같이, 상피세포성장인자의 경우 0.01 ~ 0.1ng/ml 농도, 알부민의 경우 10 ~ 100ug/ml 농도에서 세포의 형태와 수득률이 좋아지는 것을 확인하였다. 결과적으로 상피세포성장인자와 알부민의 적정 유효 농도는 각각 0.01 - 0.1ng/ml 및 10 - 100ug/ml임을 알 수 있었다.
Group
알부민 (ug/ml) 상피세포성장인자 (ng/ml)
0 0, 0.01, 0.1, 1, 10
10 0, 0.01, 0.1, 1, 10
100 0, 0.01, 0.1, 1, 10
1000 0, 0.01, 0.1, 1, 10
실시예 4. 기본배지, 칼슘, 상피세포성장인자, 알부민의 성분비를 적용한 혼합배지에서 마우스 피부조직 유래 각질형성세포의 수립 확인
본 발명자들은 상기 실시예 2 및 3의 결과에 근거하여, 기본배지, 칼슘, 상피세포성장인자, 알부민의 성분비를 적용한 혼합배지의 세포 수립 성능을 확인하기 위하여 기사용 제품인 LONZA사의 KGM gold 배지를 양성대조군으로 하여 실험을 진행하였다. 본 실시예에서는 기본배지에 칼슘농도 0.07mM, 알부민 100ug/ml, 상피세포성장인자 0.1ng/ml의 성분비를 가지는 혼합배지를 사용하였다.
이를 위해, 마우스의 꼬리 부분의 피부 조직을 분리하였으며, 분리된 꼬리조직은 식염수 또는 DMEM (Dulbecco Modified Eagle Medium) 배지에 넣어 연구실까지 옮겼다. 클린 벤치 내에서 꼬리 조직을 2회 멸균생리식염수로 세척하고, 페트리 디쉬에 세척된 꼬리 조직을 넣고 꼬리의 피부를 벗기는 과정을 진행하였다. 보다 구체적으로, 먼저 블레이드를 이용하여 꼬리의 아래부터 끝까지 가운데를 잘라내고, 가운데 선을 따라 2-3cm 정도의 길이로 피부를 잘라내었다. 이어서 100파이 페트리 디쉬에 상기 잘라낸 피부 조직을 넣고 PBS 15ml을 넣어서 rinsing을 진행하였다. 2ml tube에 각 피부를 넣고 차가운 dispaseII digestion buffer (4mg/ml, 각 배지의 기본배지)로 채운 다음 Rotator 위에 조직이 담긴 tube를 올리고 4℃에서 overnight (12-18h) 배양하였다. 배양 후 DispaseII solution과 각 피부 조직을 함께 100파이 페트리디쉬로 옮기고 PBS 15ml로 잔여 dispaseII를 씻어내었다. 이어서 포셉을 이용하여 피부를 잡고, 표피쪽을 아래로 향하게 하고 진피를 위쪽을 보게 새로운 페트리 디쉬로 옮겨준 후 조심스럽게 피부를 완전히 펴지도록하고, 트립신 기반 효소를 이용하여 세포를 분리하였다. 파이펫을 이용하여 세포 덩어리를 부수어준 후, 100μm cell strain filter를 이용하여 세포를 걸러 50ml conical tube에 담고 100μm cell strain filter를 고정한 채로 180 xg에서 5분 동안 원심분리하였다. 상층액을 흡입하여 제거한 후 차가운 KC 배양배지를 이용하여 세포 펠렛을 재현탁하고, NC-250™을 이용하여 세포 수를 측정하였다. 다음으로, 콜라겐 (Collagen)이 코팅된 6 웰 플레이트에 각 배지를 이용하여 세포를 웰 당 1×104로 분주하고 37℃ 인큐베이터에서 5일간 배양하였으며, 배양 1일째, 5일째 사진을 도 3a에 나타냈었다. 배양 5일차에 트립신기반 효소를 처리하여 세포를 회수하고 5분 동안 1000rpm으로 원심분리한 후, 상층액을 버리고 표 2의 조건별 배지를 첨가하여 세포를 잘 풀어준 후 NC-250™을 이용하여 세포 수, 세포의 크기 및 생존율을 분석하여 도 3b에 나타냈다.
실험 결과, 도 3a 및 3b에 나타낸 것처럼 본 발명의 혼합배지를 이용하여 배양한 경우 양성대조군으로 사용한 기사용 배지 (LONZA KGM)와 유사한 세포 형태를 나타내었고, 더 많은 세포 수를 수득할 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 5. 기본배지, 칼슘, 상피세포성장인자, 알부민의 성분비를 적용한 혼합배지에서 인간 피부조직 유래 각질형성세포의 성장 검증
본 발명자들은 기본배지, 칼슘, 상피세포성장인자, 알부민의 성분비를 적용한 혼합배지에 의한 인간 피부조직 유래 각질형성세포의 성장능을 확인하기 위하여 기사용 제품인 LONZA사의 KGM gold 배지를 양성대조군으로 하여 passage 1부터 passage 5까지 계대 배양을 진행하였다. 본 실시예에서 이용한 본 발명의 혼합배지는 상기 실시예 4에서와 동일한 조성의 배지를 사용하였다.
구체적으로, 냉동보존된 세포를 해동 후 원심분리하여 상층액을 제거하고, 각 배지로 세포 침전물을 현탁하여 collagen typeIV로 코팅한 25T 플라스크에 7.5 ×104/플라스크 농도로 접종한 후 37℃ 5% CO2 조건에서 배양하였다. 배양하는 동안 2일 또는 3일에 한 번씩 각 배지를 갈아주었으며, 세포의 밀도가 배양 면적의 80% 이상으로 증식되었을 때마다 계대를 진행하였다. 계대배양 시 트립신 기반 효소를 처리하여 플라스크 바닥에서 각 세포를 떼어낸 후 세포를 원심분리하였고, 상층액을 버리고 남은 세포에 조건별 배지를 첨가하여 잘 풀어준 후 NC-250™을 이용하여 세포 수를 측정하였다. 측정 후 계대 배양은 세포 해동 시 진행한 과정과 동일하게 진행하였다. 세포는 5 계대 (passage 5)까지 계대배양을 진행하였으며, 5 계대 세포의 사진을 도 4a에 나타내었다. 또한, 각 계대에서 획득한 세포 수를 이용하여 집단 배가 시간 (Population Doubling time; PDT), 세포의 크기 및 생존율을 분석하여 도 4b에 나타내었다. 세포의 PDT는 상기 계대 배양시 측정된 세포 수와 배양 시간을 이용하여 아래의 수학식을 통해 계산하였다.
[수학식 1]
PDT (Population Doubling time) = ln(2) X (Δtime between B and A) / ln (count B/ count A)
A= 이전 계대, B= 현 계대
실험 결과, 세포의 형태는 양성 대조군인 기사용 배지 (LONZA KGM)와 유사하게 각질형성세포의 특징인 조약돌 모양을 나타내었다. 또한 5계대까지 배양이 진행되는 동안 세포의 PDT는 양성 대조군 배지에 비해 본 발명의 혼합배지가 더욱 안정적인 것을 확인하였으며, 세포의 크기 및 생존율 또한 안정적이게 유지되는 것을 확인하였다.
실시예 6. 기본배지, 칼슘, 상피세포성장인자, 알부민의 성분비를 적용한 혼합배지에서 각질형성세포의 특징 확인
본 발명자들은 상기 실시예 5에서 배양된 세포를 이용하여 본 발명에 따른 혼합배지에서 배양된 각질형성세포의 특징을 검증하였다.
먼저, 웨스턴 블롯을 통해 각질형성세포 마커단백질의 발현수준을 확인하고자 하였다. 실시예 5에서 배양한 세포에 트립신기반 효소를 처리 한 뒤 세포를 회수하여 5분 동안 4000rpm으로 원심분리한 다음, RIPA 용액 (Biosesang, Korea)을 이용하여 단백질을 분리하였고, 단백질 정량 키트 (Thermo fisher scientific, USA)를 사용하여 분리한 단백질을 정량하였다. 이어서 단백질 젤 (Invitrogen, USA)의 웰에 각 단백질을 동일한 양으로 넣은 후 80V 및 100V에서 SDS-폴리아크릴아마이드겔 전기영동 (SDS-PAGE)을 수행하였다. 다음으로 멤브레인 트랜스퍼 키트 (Invitrogen, USA)를 사용하여 단백질을 멤브레인으로 트랜스퍼한 뒤 1차 및 2차 항체를 순차적으로 넣어 반응시켰다. 반응이 끝난 뒤 HRP-ECL 용액 (Thermo fisher scientific, USA)과 iBright (Thermo fisher scientific, USA)을 이용하여 단백질의 발현 수준을 확인하였으며, GAPDH (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) 단백질을 대조군으로 하였다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바왁 같이, 기사용 배지 (LONZA KGM)로 배양한 세포에 비해 본 발명의 혼합배지로 배양한 경우 각질형성세포의 초기 발현 마커인 Cytokeratin 5와 Cytokeratin 14의 발현이 동일하거나 증가한 것을 확인하였다.
이에 더하여, PCR을 통해 각질형성세포 특이적 마커의 mRNA 수준을 비교하기 위해, 실시예 5에서 배양한 세포에 트립신기반 효소를 처리 한 뒤 세포를 수거하여 5분 동안 4000rpm으로 원심분리한 후. easy-BLUE (Intron, Korea)를 사용하여 RNA를 분리하였다. 이어서 역전사 키트 (Promega, USA)를 이용하여 상기 RNA로부터 cDNA를 합성하였고, 이를 SimpliAmp Thermal Cycler (Biosystems, Korea)를 이용하여 증폭하였다. 각 PCR 산물들의 양적 차이를 확인하기 위하여 1X TAE buffer로 1% 아가로오스 겔을 만들고 각 웰 당 각각의 프라이머에 해당하는 PCR 산물을 넣은 후 100V에서 전기영동 하였다. 전기영동으로 DNA 분리가 끝난 겔을 iBright (Thermo fisher scientific, USA) 하에서 관찰하여 발현수준을 확인하였으며, 18s ribosomal RNA를 대조군으로 하였다.
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이 Cytokeratin 5, Cytokeratin 14 및 E-cadherin이 기사용 배지 (LONZA KGM)로 배양한 세포와 동일하게 발현되어있음을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 본 발명에 따른 혼합배지에서 성장한 세포가 계대 배양하는 동안 안정적으로 세포의 특징을 가진다는 것을 입증하는 것이다.
실시예 7. 기본배지, 칼슘, 상피세포성장인자, 알부민의 성분비를 적용한 혼합배지에서 각질형성세포의 활성도 확인
마지막으로, 본 발명자들은 상기 실시예 5에서 배양된 세포를 이용하여 본 발명에 따른 혼합배지에서 배양된 각질형성세포의 활성도를 확인하고자 하였다. 이를 위해, 실시예 5에서 배양한 세포에 트립신기반 효소를 처리한 뒤 세포를 수거하여 5분 동안 1000rpm으로 원심분리하였다. 원심분리된 세포의 상층액을 버리고 조건별 배지를 첨가하여 세포를 잘 풀어준 후 NC-250™을 이용하여 세포 수를 측정하였다. 이어서 6 웰 플레이트에 웰 당 5×102개 세포를 접종하고 37℃ 인큐베이터에서 7일 동안 배양하였다. 7일 후 일정 시간 동안 생성된 세포 군체의 수와 크기를 육안으로 확인하기 위해 배양 배지를 제거 한 후 4% 포르말린 용액으로 실온에서 30분간 세포를 고정시킨 다음 0.1% 크리스탈 바이올렛이 농축된 용액으로 실온에서 30분간 염색하였다. 50개 이상의 세포로 형성된 군체를 하나로하여 각 웰 당 군체 형성 수를 분석하였다.
그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이 기사용 배지 (LONZA KGM)로 배양한 세포보다 본 발명의 혼합배지 조건에서 배양한 세포의 군체 크기가 대체적으로 더욱 컸고, 군체의 수가 더 많이 형성되었음을 확인하였다. 이는 기본배지, 칼슘, 상피 세포 성장인자 (EGF), 알부민의 성분비를 적용한 혼합배지에서 세포의 활성도가 더 증가함을 의미하는 것이다.
상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (10)

  1. 칼슘, 상피세포성장인자 (Epidermal growth factor) 및 알부민을 포함하는, 각질형성세포의 수립 또는 배양용 배지 첨가제.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 각질형성세포는 인간 피부 유래 각질형성세포인 것을 특징으로 하는, 배지 첨가제.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 칼슘은 0.03 내지 0.1mM의 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는, 배지 첨가제.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 상피세포성장인자는 0.001 내지 1ng/ml 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는, 배지 첨가제.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 알부민은 0.001mg/ml 이상 1mg/ml 미만의 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는, 배지 첨가제.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 배양은 증식인 것을 특징으로 하는, 배지 첨가제.
  7. 제1항의 배지 첨가제 및 기본배지를 포함하는, 각질형성세포의 수립 또는 배양용 배지 조성물.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 기본배지는 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium); MEM (Minimal Essential Medium); BME (Basal Medium Eagle); RPMI 1640; DMEM/F-10 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium: Nutrient Mixture F-10); DMEM/F-12 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium: Nutrient Mixture F-12); a-MEM (a-Minimal essential Medium); G-MEM (Glasgow's Minimal Essential Medium); IMDM (Isocove's Modified Dulbecco's Medium); KnockOut DMEM (GIBCO, USA); 및 MCDB로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 배지 조성물.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 배지 조성물은 적어도 5계대 (passage) 이상 각질형성세포의 집단 배가 시간 (population doubling time; PDT)의 연장을 억제하는 것을 특징으로 하는, 배지 조성물.
  10. 제7항의 배지 조성물에서 각질형성세포를 배양하는 단계를 포함하는, 각질형성세포의 배양방법.
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